JP3110452B2 - エンドグルカナーゼ酵素を含んでなるセルラーゼ調製物 - Google Patents

エンドグルカナーゼ酵素を含んでなるセルラーゼ調製物

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は単一成分エンドグルカナーゼを含んでなるセ
ルラーゼ調製物、そのセルラーゼ調製物を含んでなる洗
剤添加剤、そのセルラーゼ調製物を含む洗剤組成物なら
びにそのセルラーゼ調製物によるセルロース含有織物の
処理方法に関する。
発明の背景 当該技術分野では、一般に、綿含有織物の反復洗濯が
織物に非常に不快なごわ付きを起こすことが周知であ
り、そして当該技術分野ではこの問題を解決する数種の
方法が既に提案されてきた。例えば、ユニリーバー社
（Unilever Ltd.）の英国特許第1,368,599号明細書は綿
含有織物のごわ付きを低減するセルロース分解酵素の使
用を教示する。また、米国特許第4,435,307号（ノボイ
ンダストリーA/S）明細書は、ごわ付き低減洗剤添加剤
として、フミコーラ インソレンス（Humicola insole
ns）由来のセルロース分解酵素ならびにACxIと称される
その断片の使用を教示する。
当該技術分野で認識されているセルロース分解酵素の
他の用途としては、織物からよごれの除去およびその色
の澄明化（例えば、ヨーロッパ特許第220,016号参
照）、水吸収性の向上（特公昭52−48236号）および色
の局所的な変化を処理された織物に与える「ストーンウ
ォッシュ（Stone−washed）」外観の提供（ヨーロッパ
特許第307,564号）が挙げられる。さらに、セルロース
分解酵素は、醸造酒業でβ−グルカンの分解に、製パン
業では小麦粉の特性の改善に、製紙業ではセルロースの
非晶質部分を除去してパルプ中の結晶セルロース含有率
の向上のために、そしてパルプの非液特性の改善に、さ
らに飼料業でグルカンの消化の改善に使用される可能性
がある。
セルロース分解酵素の実用上の開発は、ある程度ま
で、複合混合物である既知セルラーゼ調製物の性質によ
り抑制されてきた。複数酵素系の製造の最適化は困難で
あるため、セルロース分解酵素類の工業的に有効なコス
トでの製造の実施が困難であり、そいてそれらの実用化
は、セルロース系織物に対して所望の効果を奏するには
多量のセルロース分解酵素を使用する必要から生じる困
難性によって妨げられてきた。
上記に指摘したセルラーゼ調製物の短所は、多量のエ
ンドグルカナーゼを含む調製物によって改善される可能
性がある。エンドグルカナーゼ活性を増強したセルラー
ゼ調製物は、国際公開第WO89/00069号明細書で公表され
ている。
発明の要約 セルロース含有材料に対して好ましい活性レベルを示
す単一エンドグルカナーゼ成分がここに単離された。
従って、本発明はフミコーラ インソレンス（Humico
la insolens）DSM1800由来の高度に精製された〜43kD
のエンドグルカナーゼに対して産生される抗体と免疫反
応性であるか、またはその〜43kDエンドグルカナーゼに
対する相同体である均一のエンドグルカナーゼを必須の
ものとして含んでなるセルラーゼ調製物に関する。
セルラーゼのこの特定のエンドグルカナーゼ成分は、
相当な実用上の重要性を有するセルロース含有材料の処
理にとって有益であることが見い出された。すなわち、
このことが、例えば前記活性成分の生産に組換えDNA技
術を使用することによってセルラーゼの原価上有効な製
造を可能にし、そしてセルロース系材料に所望の作用を
提供するのに少量のセルラーゼ調製物が必要とされるに
すぎない点で酵素の現実的な使用を可能にする。
発明の詳細な記述 本発明のセルラーゼ調製物は、そのエンドグルカナー
ゼ成分が総合タンパク質当り少なくとも約50CMCエンド
アーゼ単位のCMCエンドアーゼ活性を示す有益なもので
ある。
本明細書の文脈上、「CMCエンドアーゼ活性」の語
は、以下に詳述されるように、本発明のセルラーゼ調製
物とインキュベーション後、カルボキシメチルセルロー
ス（CMC）溶液の粘度の低下によって測定されるよう
な、セルロースのグルコース、セロビオースおよびトリ
ロースへの分解能の観点によるエンドグルカナーゼ成分
のエンドグルカナーゼ活性を意味する。
本発明の好ましいセルラーゼ調製物は、エンドグルカ
ナーゼ成分が総タンパク質1mg当り少なくとも約60の、
特に、少なくとも約90のCMCエンドアーゼ単位のCMCアン
ドアーゼ活性を示すものである。とりわけ好ましいエン
ドグルカナーゼ成分は、総タンパク質1mg当り少なくと
も100CMCエンドアーゼ単位のCMCエンドアーゼ活性を示
す。
CMCエンドアーゼ（エンドグルカナーゼ）活性は、次
のようにCMCの低下する粘度から測定できる。
pH9.0の0.1Mトリス（Tris）衝撃液中35g/LのCMC（Her
cules 7LFD）を含む基質溶液を調整する。分析すべき酵
素試料をこの緩衝液に溶解する。
基質溶液10mLと酵素溶液0.5mLを混合し、40℃に温度
を調節した粘度計（例えば、Haake VT181,NVセンサー,1
81rpm）に移す。
混合直後に粘度を読み取り、30分後に再度粘度を読み
取る。これらの条件下で1/2に粘度を低下する酵素量
を、CMCエンドアーゼ活性１単位と定義する。
当業者に既知の方法でマーカータンパク質と共にSDS
ポリアクリルアミゲル電気泳動（SDS−PAGE）および等
電点電気泳動を行って、本発明のセルラーゼ調製物のエ
ンドグルカナーゼの分子量と等電点（pI）をそれぞれ測
定した。この方法により、特定のエンドグルカナーゼ成
分の分子量は、〜43kDと決定された。このエンドグルカ
ナーゼの等電点は約5.1と決定された。このエンドグル
カナーゼの免疫化学的特性は、実質的に国際公開第WO89
/00069号に記載されるように実施したところ、フミコー
ラ インソレンスDSM1800由来の高度に精製された〜43k
Dのエンドグルカナーゼに対して産出された抗体と免疫
反応性であることが確認された。セロビオヒドロラーゼ
活性は、セロビオースｐ−ニトロフェニルに対する活性
として特定できる。この活性は、37℃およびpH7.0にお
いて１分間当りに放出されるニトロフェニルのマイクロ
モルとして測定される。本発明のエンドグルカナーゼ
は、実質的にはまったくセロビオヒドロラーゼ活性を示
さないことが確認された。
本発明のセルラーゼ調製物のエンドグルカナーゼ成分
は、例えば、米国特許第4,435,307号明細書に記載の粗
フミコーラ インソレンス セルラーゼ混合物の逆相HP
LC精製を始めとする大規模な精製操作により最初のうち
は単離されてきた（後記実施例１を参照）。この操作
は、驚くべきことに、非常に高いエンドグルカナーゼ活
性に起因して、予想外に好ましい特性を有する単一成分
として〜43kDのエンドグルカナーゼの単離物をもたらし
た。
他の態様では、本発明はエンドグルカナーゼ活性を示
す酵素（以下、「エンドグルカナーゼ酵素」と称する）
であって、添付の配列表ID＃２に示されるアミノ酸配列
を有する酵素またはエンドグルカナーゼ活性を示すその
相同体に関する。本明細書における文脈上、「相同体」
の語は、ある特定の限定された条件下〔例えば、５×SS
Cでの予備ソーキングし、20％ホルムアミド、５×デン
ハルト（Denhardt）溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH
6.8、および50μｇの変性超音波処理されたウシ胸線DNA
の溶液中、約40℃で１時間予備ハイブリダイゼーション
し、次いで100μＭのATPを加えた同じ溶液中、約40℃で
18時間ハイブリダイゼーションする〕で、このアミノ酸
配列のエンドグルカナーゼ酵素をコードするDNAと同じ
プローブにハイブリッダイズするDNAによってコードさ
れたポリペプチドを示すことを意図している。この語
は、もとの配列のＣ末端およびＮ末端のいずれかもしく
は両方に１個以上のアミノ酸残基が付加するか、あるい
はもとの配列の１箇所以上の部位における１個以上のア
ミノ酸残基が置換するか、あるいはもとのアミノ酸配列
のいずれかもしくは両末端におけるかまたはもとの配列
内の１箇所以上の部位における１個以上のアミノ酸残基
が欠失するか、あるいはもとの配列における１箇所以上
の部位へ１個以上のアミノ酸残基が挿入することにより
得られる前記配列の誘導体を包含することを意図してい
る。
本発明のエンドグルカナーゼ酵素は、特許手続上の微
生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダ
ペスト条約）の規定に従ってDeutshe Sammlung von Mik
roorganismen,Mascheroder Weg 1B,D−3300 Braunschwe
ig,FRGに1981年10月１日付で寄託され、フミコーライン
ソレンス（Humicola insolens）、例えばDSM1800株の
ようなフミコーラの一の種によって生産可能なものであ
ってもよい。
さらなる態様では、本発明は、添付の配列表ID＃４に
示されるアミノ酸配列を有するエンドグルカナーゼ酵素
またはエンドグルカナーゼ活性を示すその相同体（上記
の定義に同じ）に関する。このエンドグルカナーゼ酵素
は、フザリウム オキシスポラム（Fusarium oxysporu
m）のようなフザリウムの一の種、例えばブダペスト条
約の規定に従いDeutsche Sammlung von Mikroorganisme
n,Mascheroder Weg 1B,D−3300 Braunschweig,FRGに198
3年に６月６日付で寄託されたDSM2672株によって生産可
能なものであってもよい。
さらに、相同的なエドグルカナーゼは他のセルロース
分解酵素産生微生物、例えば、トリコデルマ（Trichode
rma）、ミセリオフトーラ（Myceliophthora）、ファネ
ロシェーテ（Phanerochaete）、シゾフィラム（Schizop
hyllum）、ペニシリウム（Penicillium）、アスペルギ
ルス（Aspergillus）およびゲオトリカム（Geotricum）
の種から誘導されうることも予期されている。
また、本発明は上記のようなエンドグルカナーゼ酵素
またはその酵素の前駆体をコードするDNA配列を含んで
なるDNA構成物にも関する。特に、このDNA構成物は、添
付の配列表ID＃１もしくはID＃３に示されるようなDNA
配列か、またはそれらの変性体を有する。これらのDNA
配列の適当な変性体の例は、上記エンドグルカナーゼの
他のアミノ酸配列を生じないヌクレオチド置換体である
が、DNA構成物が導入される宿主有機体の使用可能なコ
ドンに相当するか、または異なるアミノ酸配列を生じる
ためのもとの酵素と、場合によって異なる特性を有する
エンドグルカナーゼ変異体を生じる可能性のある異なる
タンパク質構造を生じるヌクレオチド置換体である。可
能な変性の別の例は、配列中への１個以上のヌクレオチ
ドの挿入、配列のいずれかの末端における１個以上のヌ
クレオチドの付加、あるいは配列のいずれかの末端また
は配列内での１個以上のヌクレオチドの欠失である。
上記エンドグルカナーゼ酵素をコードする本発明のDN
A構成物は、確立された標準的な方法、例えばS.L.Beauc
ageおよびM.H.Caruthers,Tetrahedron Letters 22,198
1,1859〜1869ページに記載されるホスホアミジト法また
はMatthesら、EMBO Journal ３,1984,801〜805ページに
記載される方法、により合成的に調製できる。ホスホア
ミジト法によれば、例えば、自動DNAシンセサイザーに
より合成され、精製され、アニール化され、連結され、
次いで適当なベクターにクローニングされる。
エンドグルカナーゼ酵素またはその前駆体をコードす
るDNA構成物は、例えば、フミコーラインソレンス（DSM
1800）のようなセルラーゼ産生微生物のcDNAおよびゲノ
ムライブラリーを創製し、次いで標準的な技法（Sambro
okら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2版、C
old Spring Harbor,1989、参照）に従うエンドグルカナ
ーゼの全体もしくは一部のアミノ酸配列に基づき合成さ
れたオリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダ
イゼーション、または適当な酸素活性（すなわち、上記
に定義したようなCMCエンドアーゼ活性）を所持するク
ローンの選択、またはもとのセルラーゼ（エンドグルカ
ナーゼ）に対する抗体と反応性を示すタンパク質産生ク
ローンの選択、などの常用されている操作による陽性ク
ローンのスクリーニングによって単離されうる。
最後に、このDNA構成物は、標準的技法に従う合成起
源のフラグメント、ゲノム起源のフラグメントまたは
（適当なものとして）cDNA起源のフラグメント（これら
のフラグメントは完全なDNA構成物の様々な部分に相当
する）の連結によって調製される合成およびゲノム起源
の混合物、合成およびcDNA起源の混合物またはゲノムお
よびcDNA起源の混合物であってもよい。また、DNA構成
物は、例えば米国特許第4,683,202号明細書またはR.K.S
aikiら、Science 239,1988,487〜491ページに記載され
るような特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖
反応により調製することもできる。
さらに、本発明、本発明の上記DNA構成物が挿入され
た組換え発現ベクターにも関する。これは、組換えDNA
法を行うのに都合のよいいずれかのベクターであること
ができ、ベクターの選択はそれが導入される宿主細胞に
左右されることが多いい。従って、ベクターは、自己複
製ベクター、すなわち染色体外の独立体として存在し、
その複製が染色体の複製に依存しない、例えプラスミド
であることができる。また、ベクターは、宿主細胞に導
入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組込まれ、そ
れが組込まれた染色体と一緒に複製されるものであって
もよい。
ベクターでは、エンドグルカナーゼをコードするDNA
配列が、適当なプロモーターおよびターミネーターと調
節可能に関連付けられている必要がある。プロモーター
は、選んだ宿主細胞において転写活性を示し、そしてそ
の宿主細胞と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質
をコードする遺伝子から誘導されうるいずれかのDNA配
列であることができる。エンドグルカナーゼをコードす
るDNA配列、プロモーターおよびターミネーターをそれ
ぞれ連結し、次いでそれらを適当なベクター中に挿入す
るのに使用する操作は当業者に周知である（例えば、上
記Sambrookら、参照）。
また、本発明は、本発明のDNA構成物または発現ベク
ターで形質転換された宿主細胞にも関する。例えば、宿
主細胞は、アスペルギルス（Aspergillus）のある種、
最も好ましくは、アスペルギルス オリーゼ（Aspergil
lus oryzae）またはアスペルギルス ニガー（Aspergi
llus niger）であることができる。カビ細胞は、それ
自体既知方法によりプロトプラストを形成し、プロトプ
ラストを形質転換し、次いで細胞壁を再生できる。宿主
微生物としてのアスペルギルスの使用は、ヨーロッパ特
許第238,023号明細書（Novo Industri A/S）に記載さ
れており、その内容は引用することにより本明細書の内
容となる。宿主細胞は、酵母細胞、例えばサッカロマイ
セス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の一
菌株であってもよい。
また、宿主有機体は、細菌、特に、ストレプトマイセ
ス（Streptomyces）、バチルス（Bacillus）およびイー
・コリー（E.coli）の１菌株であってもよい。細菌細胞
の形質転換は、例えば、Sambrookら、Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,1989に記
載されるような常法によって行うことができる。
さらに本発明は、本発明のエンドグルカナーゼ酵素の
生産方法であって、そのエンドグルカナーゼ酵素を発現
する条件下で上記のような宿主細胞を適当な培地で培養
する工程、次いで培養物からそのエンドグルカナーゼ酵
素を回収する工程を含んでなる方法に関する。形質転換
された宿主細胞を培養するのに使用する培地は、問題の
宿主細胞を増殖するのに適するいずれかの常用されてい
る培地であってもよい。発現されたエンドグルカナーゼ
は培養物中に分泌されることが都合よく、そして培養物
から周知の手法、例えば、遠心もしくは濾過による培地
からの細胞の分離、硫酸アンモニウムのような塩による
培養物のタンパク質性成分の沈殿、次いでイオン交換ク
ロマトグラフィー、もしくはアフィニティークロマトグ
ラフィーなどのクロマトグラフ法により回収できる。
上述のような組換DNA法ならびに当該技術分野で周知
のタンパク質精製法、発酵法及び変法もしくは他の方法
を使用することにより、高純度のエンドグルカナーゼを
提供できる。
本発明のセルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼ
酵素を、浸漬、洗濯またはすすぎ操作中に他の洗剤と一
緒にセルロース含有織物へ添加することが都合よい。従
って、他の態様では、本発明は本発明のセルラーゼ調製
物またはエンドグルカナーゼ酵素を含んでなる洗剤添加
物に関する。この洗剤添加物は、粉化しない顆粒、安定
化された液体または保護された酵素ので形態あることが
適当である。粉化しない顆粒は、例えば米国特許第4,10
6,991号および同4,661,452号（両者とも、Novo Industr
i A/S）明細書に従って調製でき、そして場合によって
当該技術分野で既知の方法により被覆してもよい。液体
酵素調製物は、例えば、ポリプロピレングリコールのよ
うなポリオール、糖もしくは糖アルコール、乳酸もしく
はホウ酸の確立された方法による添加によって安定化で
きる。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第238,216号
明細書に公表された方法により調製できる。
本発明の洗剤添加物は、本添加物1g当り１〜500mg、
好ましくは５〜250mg、最も好ましくは10〜100mg含むこ
とが適当であろう。この洗剤添加物は、洗剤添加物に通
常含められるプリテアーゼ、リパーゼ、パーオキシダー
ゼまたはアミラーゼのような他の酵素をさらに１種以上
含めることができるものと理解されるであろう。
本発明によれば、プロテアーゼがバチルス レンタス
（Bacillus lentus）セリンプロテアーゼより高い特異
性を示すものである場合には、エンドグルカナーゼ酵素
の向上した貯蔵安定性が得られることが見い出された。
（本発明の目的上、バチルス レンタス セリンプロテ
アーゼより高い特異性を示すプロテアーゼは、Ｂおよび
Ｒ緩衝液（pH9.5）中1mg/mLのヒトインスリン0.5mLを１
リットル当り0.6CPUの酵素溶液75μＬ［Novo Nordisk A
nalysis Methods No.AF228/1、参照〕と37℃で120分間
インキュベーションし、1NのHCl 50μＬで反応を停止す
る条件下でバチルス レンタス セリンプロテアーゼを
使用する場合よりも少ない成分にヒトインスリンを分解
するものである。このようなプロテアーゼの例は、ズブ
チリシン ノボ（Novo）もしくはその変異体（例えば、
米国特許第4,914,031号明細書に記載される変異体）、
ノカルディア ダッソンビレイ（Nocardia dassonvill
ei）NRR18133から誘導されうるプロテアーゼ（国際公開
第WO88/03947号明細書記載）、バチルス リケニホルミ
ス（Bachllus licheniformis）から生産可能な、グル
タミン酸およびアスパラギン酸に特異的なセリンプロテ
アーゼ（このプロテアーゼは同時係属中の国際特許出願
第PCT/DK91/00067号明細書に詳述されている）、または
フザリウム エスピー（Fusarium sp.）DSM2672から生
産可能なトリプシン様プロテアーゼ（このプロテアーゼ
は国際公開第WO89/06270号明細書に詳述されている）で
ある。
さらなる別の態様では、本発明は、本発明のセルラー
ゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵素を含んでなる洗
剤組成物に関する。
本発明の洗剤組成物は、アニオン界面活性剤、非イオ
ン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤ま
たは両性イオン界面活性剤、ならびにこれらの界面活性
剤の混合物であってもよい界面活性剤をさらに含んでな
る。アニオン界面活性剤の代表例としては、直鎖アルキ
ルベンゼンスルホン酸塩（LAS）、アルファオレフィン
スルホン酸塩（AOS）、アルコールエトキシ硫酸塩（AE
S）および天然脂肪酸のアルカリ金属塩が挙げられる。
しかしながら、エンドグルカナーゼはアニオン界面活性
剤の存在下で安定性に乏しく、そして、一方、非イオン
界面活性剤またはポリビニルピロリドン、ポリエチレン
グリコールもしくはポリビニルアルコールのような一定
のポリマー化合物の存在下でより安定であることが見い
出された。従って、本発明の洗剤組成物は、低濃度のア
ニオン界面活性剤および／または一定量の上述のような
非イオン界面活性剤もしくは安定化ポリマーを含むこと
ができる。
本発明の洗剤組成物は、例えば、ビルダー、漂白剤、
漂白活性剤、抗凝集剤、金属イオン封鎖剤、土質再付着
防止剤、香料、酵素安定化剤、などの当該技術分野で既
知の他の洗剤成分を含んでもよい。
本発明の洗剤組成物は、いずれか適当な形状、例えば
粉末または液体状に調製することができる。酵素は、上
記のような酵素安定化剤を含めることにより液体洗剤中
で安定化することができる。一般的に、本発明の洗剤組
成物の溶液pHは、７〜12であり、そしてある例えでは7.
0〜10.5である。プロテアーゼ、リパーゼまたはアミラ
ーゼのような他の洗剤酵素を、上記の添加剤と独立にま
たは組み合わせて本発明の洗剤組成物に含めることがで
きる。
本発明のセルラーゼ調製物による柔軟化、土質除去お
よび色の澄明化効果を得るには、洗濯液中のセルラーゼ
調製物濃度が１リットル当り0.0001〜100、好ましくは
0.0005〜60、そして最も好ましくは0.01〜20mgであるこ
とが必要である。
本発明の洗剤組成物は、典型的には、洗濯液中0.5〜2
0g/Lの濃度で使用される。一般的に、この洗剤組成物当
り0.1〜５重量％、または、好ましくは0.2〜２重量％の
量で洗剤添加物を加えることが最も都合がよい。
さらなる別の態様では、本発明は、セルロース含有織
物の手触りが悪くなる速度を低減するか、またはセルロ
ース含有織物の硬さを低減する方法であって、上記のよ
うなセルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵素に
よりセルロース含有織物を処理する工程を含んでなる方
法に関する。さらに本発明は、着色セルロース含有織物
の色の澄明化をもたらす方法であって、セルラーゼ調製
物またはエンドグルカナーゼで着色セルロース含有織物
を処理する工程を含んでなる方法、ならびに着色セルロ
ース含有織物の色の局所的な変化をもたらす方法であっ
て、本発明のセルラーゼ調製物またはエンドグルカナー
ゼにより着色セルロース含有織物を処理する工程を含ん
でなる方法に関する。本発明の方法は、洗濯中にセルロ
ース含有機物を処理することにより実施できる。しかし
ながら、織物の処理は、場合によって、ソーキングもし
くはすすぎ中に、あるいは織物が浸漬されているかもし
くは浸漬されうる水にセルラーゼ調製物もしくはエンド
グルカナーゼ酵素を単に添加することによって実施して
もよい。
本発明によれば、紙パルプの排液特性が強度の著しい
低下を伴うことなく本発明のエンドグルカナーゼによる
処理で有意に改善できることが見い出された。従って、
本発明は、さらに、パルプ排液の特性の改善方法であっ
て、本発明のセルラーゼ調製物またはエンドグルカナー
ゼ酵素で紙パルプを処理する工程を含んでなる方法にも
関する。本発明の方法で処理できるパルプの例として
は、故紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、
亜硫酸パルプまたは加工熱処理パルプおよび他の高収率
パルプが挙げられる。
本発明は、以下の実施例の好ましい態様を参照しなが
らさらに詳細に説明されるが、これらの実施例のいずれ
かの態様に本発明の範囲が限定されることを意図するも
のでない。
実施例 例１ フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）から
〜43kDのエンドグルカナーゼ酵素の単位 1.フミコーラ インソレンス セルラーゼ混合物から精
製れた〜43kDのエンドグルカナーゼと反応性のウサギ抗
体の調製 米国特許第4,435,307号明細書の実施例６に記載され
るようにフミコーラ インソレンスDSM1800を培養する
ことによりセルラーゼを生産した。粗セルラーゼを、珪
藻土による濾過、超遠心、活性含有物の凍結乾燥によっ
て培養ブロスから回収した（米国特許第4,435,307号明
細書の実施例１および６、参照）。
国際公開第89/09259号明細書に記載されるように粗セ
ルラーゼを精製し、得られた画分F1P1C2をマウスの免疫
感作に使用した。免疫感作は２週間の間隔で５回行い、
各毎にフロイントアジュバントを含むタンパク質25μｇ
使用した。Ed HarlowおよびDavid Lane,Antibodies.A L
aboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 198
8に記載されるようにハイブリドーマ細胞系を樹立し
た。この操作は以下のごとく具体的に記載できる。
マウスを放血した後、マウスの血清はF1P1C2画分に存
在するタンパク質と反応することを示したので、脾臓を
採取し、そして均質化し、次いでPEGおよびHyclone（Ut
ah,USA）由来のフォクス・リバー（Fox−river）ミエロ
ーマ細胞と混合した。
これらのハイブリドーマを確立したHATスクリーニン
グ法により選択した。
再クローン化されたハイブリドーマ細胞系を樹立し
た。これらの細胞系によって産生される抗体を、スクリ
ーニングし、市販のマウスモノクローナルタイピングキ
ット（Serotec,Oxford,England由来）を使用してIgG1サ
ブクラスに属するものについて選んだ。次に、常用のEL
ISAによりF1P1C2との反応性について陽性抗体をスクリ
ーニングしたところ、SDS−PAGEで粗フミコーラ イン
ソレンスDSM1800セルラーゼを使用するイムノブロッテ
ィングに異なる応答を示し、次いでウェスターンブロッ
トによりそれらが異なるエピトープを認識することを示
すことが見い出されたが、それらのすべてがELISA応答
に非常に良好であるようなF4,F15およびF41の選択物を
得た。
これら３種の抗体は、CRBF1マウスの腹水中に多量に
産生されていた。セファロースに結合したプロテインＡ
（Kem.En.Tek.,Copenhagen,Denmark）を使用するプロテ
インＡ精製法により腹水からマウスガンマグロブリンを
精製した。
異なるモノクローナルガンマグロブリン類を、捕捉抗
体としてモノクローナル抗体、抗原としてセルチーム
（Celluzyme）の各種HPLC画分、および検出抗体として
セルチーム由来のエンドグルカナーゼＢに対して産生さ
れるウサギ抗体をそれぞれ使用するサンドイッチELISA
での応答について試験した。
ELISAにおけるバインディングを可視化するために、D
akopatts（Copenhagen,Denmark）由来のペルオキシダー
ゼへウサギIgGに対するブタ抗体を共有結合し、次いでO
PD（1,2−フェニレンジアミン塩酸塩）/H2O2で可視化し
た。
最も高いELISA応答は、モノクローナル抗体F41で得ら
れたので、それを免疫アフィニティー精製工程で使用し
た。
精製したマウスガンマーグロブリンF41を、製造者（P
harmacia,Sweden）に説明されるようにCNBr活性化セフ
ァロース4B 43gに結合し、次いで洗浄した。
2.フミコーラ インソレンス セルラーゼ調製物からの
〜43kDのエンドグルカナーゼの免疫アフィニティー精製 フミコーラ インソレンス セルラーゼ混合物（上
記）を３％乾燥物まで希釈し、４℃で15分以内にpHを3.
5に調節した。pHを7.5に調節した後、沈殿物を濾去し
た。次に、40℃で硫酸ナトリウムを加えて活性酵素を沈
殿させた（pH5.5で1kg当り260g）。この沈殿物を水に溶
解して濾過した。酸処理を繰り返した。最後に、10.000
Mwカットオフのポリビニルスルホネート膜を使用する限
外濾過により濃縮した。
次に、セルラーゼ生成物を３％乾燥物になるまで希釈
し、pHを9.0に調節した後、製造元（Pharmacia,Swede
n）により推奨されるようにDEAEセファロースカラムに
よりアニオン交換クロマトグラフィーにかけた。
リン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）にて上記F41ガンマ
グロブリン結合セファロースカラムに上記プロテアーゼ
を含まない生成物をかけた。
カラムにかけた後、0.5Mの塩化ナトリウムを含む同じ
緩衝液で洗浄した。次に、このカラムを0.5Mの塩化ナト
リウムを含有する0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.
5）で洗浄した後、カラムを5mMの酢酸ナトリウム緩衝液
（pH4.5）で洗浄した。最後に、0.1Mのクエン酸で〜43k
Dのエンドグルカナーゼを溶離した。
総収量:1563CMCエンドアーゼ単位のエンドグリカナー
ゼ活性物25mg。
溶離されたタンパク質は、SDS−PAGEにより単一バン
ドでMW〜43kDを示すように泳動し、等電点電気泳動後の
pIは約5.0〜5.2であった。
不活性タンパク質を逆相精製法で除去した。
不活性タンパク質と活性タンパク質を、２−プロパノ
ールのグラージエントを使用するHPLCで分離した。不活
性タンパク質は約25％２−プロパノールで溶解し、そし
て活性の〜43kDのエンドグルカナーゼは30％の２−プロ
パノールで溶離し、この活性エンドグルカナーゼはCMC
−コンゴ−レッド清浄区分によって検出可能である。
この方法で、122CMCエンドアーゼ単位を有する活性タ
ンパク質0.78mgを回収した。この操作を30回繰り返し
た。
〜43kDのエンドグルカナーゼを上記TFAとプロパノー
ルを除去するために凍結乾燥して回収し、次いでリン酸
緩衝液に溶解した。
精製物のエンドグルカナーゼ活性は、タンパク質1mg
当り156CMCエンドアーゼ単位であり、凍結乾燥を含む総
収率は、エンドグルカナーゼ活性の65％であった。
こうして得られた〜43kDの酵素を使用して、N.Axelse
nら、A Manual of Quantitative Immunolelectrophores
is,Blackwell Scientific Publications,1973、第23章
に記載される方法に準じてウサギを免疫感作した。精製
イムノグロブリンは、それ自体既知の、硫酸アンモニウ
ム沈殿、次いで透析、そしてDEAEセファデックスによる
イオン交換クロマトグラフィーにより抗血清から回収し
た。エンドグルカナーゼに対する精製イムノグロブリン
のバインディングを測定し、ウサギイムノグロブリンAS
169をさらなる研究用として選んだ。
3.〜43kDのエンドグルカナーゼの特性決定 アミノ酸組成：完全加水分解によるアミノ酸分析後に
次の組成が得られた。
Asp 17 Asn 15 Thr 25 Ser 29 Glu 6 Gln 13 Pro 21 Gly 32 Ala 23 Cys 20 Val 14 Met 1 Ile 7 Leu 8 Tyr 6 Phe 15 Lys 9 His 2 Trp 9 Arg 12 アミノ酸組成より非グリコシル化タンパク質のMwは3
0,069と推定された。グルコシル化は、 グルコース 10 マンノース 28 と測定され、Mw6,840に相当する。こうして、エンドグ
ルカナーゼの総Mwは36,900（＋／−2,400）であった。
１分子当りの吸収係数は次のように推定された： トリプトファン ９×5690 チロシン ６×1280 システイン 20×120 合 計 １分子当り61290 280nmにおける吸収係数1.66は、1mL当りタンパク質1m
gに相当する（文献:S.C.GillおよびP.Hippel,Anal.Bioc
hemistry 182,312〜326（1989））。
アミノ酸配列を、エドマン分解法によりアプライド・
バイオシステムズ・475A・プロテインシクェネーター
（Applied Biosystems 475A Protein Sequenator）で決
定した。唯一の配列はこのタンパク質が純粋であること
を示した。このアミノ配列を、添付の配列表ID＃２に示
す。
酵素の特性： この酵素はpH3と9.5との間で安定である。
この酵素は、結晶セルロースまたは基質セルビオース
β−ｐ−ニトロフェニル（セロビオヒドロラーゼの基
質）を実質的に分解しないが、非晶質セルロースを主と
してセロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオ
ースに分解するので、この酵素は不溶性非晶質セルロー
スからセロデキストリン類を生産するのに使用できるこ
とを示す。
この酵素は約50℃で最大活性を示すと共にpH6.0と10.
0との間で活性である。
例２ アスペルギルス オリーゼ（Aspergillus oryzae）に
おける〜43kDの上記エンドグルカナーゼのクローニング
と発現 部分cDNA: OkayamaおよびBerg（1982）Mol.Cell.Biol.2,161〜17
0ページの方法に従いフミコーラ インソレンスDSM1800
株のmRNA（Kaplanら、（1979）Biochem.J.183,181〜184
ページ）からcDNAライブラリーを作製した。このライブ
ラリーを放射活性標識オリゴヌクレオチド類とハイブリ
ダイゼーションし、組換え体から不動化したDNAと共に
濾過した（Gergenら、（1979）Nucleic Acids Res.７,2
115〜2136ページ）。これらのヌクレオチドプローブ類
は、精製〜43kDのエンドグルカナーゼの代表的フラグメ
ントのアミノ酸配列に基づき作製した。３種のプローブ
（NOR 1251,2048および2050）にハイブリダイゼーショ
ンする１種のコロニーを見い出し、それを単離した。こ
の配列は、挿入された680bpのcDNAが上記〜43kDのタン
パク質のＣ末端の181アミノ酸をコードし、そして３′
の翻訳されないmRNAであることを示す。このクローン由
来の237bp鎖長のPvu I−Xho Iフラグメントを、フミコ
ーラ インソレンスmRNAとのノーザンブロット法（Samb
rookら、上記、7.40〜7.42ページおよび7.46〜7.48ペー
ジに記載）のプローブに使用したところ、完全な〜43kD
のmRNAは約1100bpの鎖長を有することを示した。同じ菌
株由来のゲノムライブラリーのプローブとして同じ237b
pのフラグメントを使用した。
ゲノムのクローン： フミコーラ インソレンスDSM1800株のゲノムライブ
ラリーを、Yeltonの方法（M.M.Yeltonら、（1984）Pro
c.Natl.Acad.Sci.LISA.81,1470〜1474ページ）により調
製した総DNAから作製し、次いでSau3Aで部分消化した。
4kbを越えるフラグメントをアガロースゲルから単離
し、次いでBam H1で消化しそして脱リン酸化したpBR322
に連結した。この連結生成物を、常法によりr-m+にした
イ．コーリー（E.coli）MC1000（CasadabanおよびCohen
（1980）J.Mol.Biol.,138,179〜207ページ）に導入し
た。40.000個の組換え体を「部分cDNA」の欄に記載した
237bpのPvu I−Xho I部分cDNAフラグメントでスクリー
ニングした。完全な〜43kDのエンドグルカナーゼ配列を
含む２つのコロニーを選び、その遺伝子を製造元の説明
書に従いシークエナーゼ（Sequenase）（商標）キット
（unitedstatus Biochemical Corporation）を使用し
て、ジデオキシ法で配列決定した。この配列は、ゲノム
遺伝子中の１つのイントロンを除き完全鎖長のcDAN遺伝
子（下記「完全鎖長のcDNA」の欄の参照）の配列と同一
であった。
このゲノム遺伝子を、パーキン・エルマー／シータス
DNAアンプリフィケーションシステム（Perkin−Elmer/C
etus DNA Amplification System）を使用し、製造元の
説明書に従うPCR法により増幅した。この遺伝子の５′
末端ではプライマーNOR2378を使用した。このプライマ
ーは、Bcl I部位で１つのＣのＴへの置換が起っている
以外、その遺伝子の５′非翻訳末端とマッチする25mer
である。この遺伝子の３′末端では、プライマーNOR238
9を使用した。このプライマーは、21塩基がその遺伝子
の３′非翻訳末端とマッチし、そしてプライマーの５′
端の５塩基がSal I部位を完成する26merである。
アスペルギルス発現ベクターpToc68は、プラスミドp7
75（この構築はヨーロッパ特許第238,023号明細書に記
載されている）から以下のリンカーを挿入することによ
り構築した。
pTocの構築は、添付の図１に示す。
上記で得られたPCRフラグメントを、Bcl IおよびSal
Iで消化し、次いでBam HIおよびXho Iで消化したpToc68
に挿入した。得られたプラスミド（pDaHj 109）のイン
サートを配列決定したところ、もとのクローンと同一で
あることを示した。
完全鎖長のcDNA: 第一鎖cDNAの既知配列（NOR2153）の特定のプライマ
ーから合成し、そして第二鎖の合成はGublerおよびHoff
man（1983）GENE 25,263〜269ページに記載される方法
に従って行った。ゲノム遺伝子の配列は、mRNAの５′部
をとらえると同時にATG開始コドンの前の右にBamH I部
位を導入するようなPCRプライマー（NOR2334）を設計で
きるようにした。５′末端でこのプライマーを使用し、
３′末端でNOR2153を使用することにより二本鎖cDNA生
成物上でPCRを行った。次に、PCR−cDNAの一部をコード
する完全鎖長を、３′Pvu I−Eco0109と共にPCR反応由
来の５′BamH I−Pvu Iフラグメントを、クレノウポリ
メラーゼでそれをブラント端とするように満たし、BamH
I−Nru Iで切断したアスペルギルスの発現ベクターpTo
C68にクローニングして構築し（図１）、そして挿入さ
れたDNAを検査した（pSX320）（図２参照）。この完全
鎖長cDNAの配列を添付の配列表ID＃１に示す。
使用したオリゴヌクレオチドプライマー類： 略字： Y:ピリミジン（Ｃ＋Ｔ） R:プリン（Ａ＋Ｇ） N:全４種の塩基 太字：もとの配列に対する変化または挿入部。
下線:PCRにより導入された制限部位。
〜43kDのエンドグルカナーゼの発現： アスペルギルス オリーゼ（Aspergillus oryzae）I
FO 4177のプロテアーゼ欠失誘導体であるアスペルギル
ス オリーゼA1560−T40をプラスミドpS×320で形質転
換し、pUC19ベクター（Yannisch−Perronら、（1985）,
GENE 33,103〜119ページ）上に2.7kbのXba Iフラグメ
ントとしてアスペルギルス ニヅランス（Aspergillus
nidulans）由来のamds遺伝子を担うpToC90で同時形質
転換することによりアセトアミドによる選択に使用した
（Corrickら、（1987）,GENE 53,63〜71ページ）。形
質転換は、ヨーロッパ特許出願公開第238,023号明細書
に記載されるように行った。多数の形質転換体を〜43kD
のエンドグルカナーゼの同時発現についてスクリーニン
グした。形質転換体をSDS−PAGE（明細書第４頁参照）
とCMCエンドグルカナーゼ活性により評価した。
ゲノム遺伝子を含有するプラスミド（pCaHj109）で上
記のようにアスペルギルス オリーゼA1560−T40を形質
転換した。これらの形質転換体の評価は、発現レベルが
cDNAの形質転換体のそれと類似であることを示した。
精製された〜43kDのエンドグルカナーゼをそのＮ末端
配列と糖含量について分析した。Ｎ末端配列は、HPLC精
製〜43kDのエンドグルカナーゼのそれと同一であること
を示した。糖含量は、グルコースよりも１モル当り10＋
／−８のガラクトースを組換え酵素が含む点でHPLC精製
43kDの酵素のそれと異なる。
例３ フザリウム オキシスポラム（Fusarium oxysporum）
のゲノムDNAの単離 フザリウム オキシスポラムの凍結乾燥培養物をリン
酸緩衝液で元へ戻し、５枚のフォックス（FOX）培地
（酵母エキス６％,K2HPO41.5％,MgSO4・7H2O 0.75％，
グルコース 22.5％，寒天 1.5％,pH5.6）プレートの
各々に５度スポットし、37℃でインキュベーションし
た。インキュベーションの６日後、プレートからコロニ
ーをかきとり、0.001％のツウィーン（Tween）−80 15m
Lに入れ、濃く曇った懸濁液を得た。
液体フォックス（FOX）培地300mLをそれぞれ含む４個
の１リットルフラスコに上記胞子懸濁液2mLで植菌し、2
40rpmの30℃でインキュベーションした。インキュベー
ションの４日目に培養物を４層の滅菌ガーゼを通して通
過し、滅菌水で洗浄した。菌体をワットマン濾紙上で乾
燥し、液体窒素で凍結し、冷却乳鉢で微粉末にすりつぶ
し、新鮮な溶菌緩衝液（10mM Tris−Cl,pH7.4,1％SDS,5
0mM EDTA,100μL DEPC）75mLに加えた。十分に混合した
懸濁液を１時間65℃の湯浴でインキュベーションし、ベ
ンチトップ型遠心機により５℃4000RPMで10分間回転し
た。上澄をデカントし、エタノールで沈殿させた。氷上
で１時間後、その溶液を20分間19,000rpmで回転させ
た。上澄をデカント後、イソプロパノールで沈殿させ
た。10分間10,000rpmで遠心後、上澄をデカントし、ペ
レットを乾燥させた。
TER液（10mM Tri−HCl,pH7.4,1mM EDTA 2000,100μg
RNA seA）を各チューブに加え、それぞれのチューブを
２日間４℃で貯蔵した。これらのチューブを取り出して
65℃の湯浴中に30分間置き、不溶性のDNAを浮遊させ
た。溶液をフェノール/CHCl3/イソアミルアルコールで
２度、CHCl3/イソアミルアルコールで２度抽出し、次い
でエタノール沈殿した。ペレットを沈殿させ、エタノー
ルを除去した。70％エタノールを加え、DNAを−20℃で
一夜貯蔵した。デカントおよび乾燥後、TER 1mLを加
え、１時間65℃でチューブをインキュベーションするこ
とでDNAを溶解した。こうしたゲノムDNA 1.5mgを得られ
た。
フザリウム オキシスポラム（Fusarium oxysporum）
の〜43kDのエンドグルカナーゼのクローニング フミコーラの〜43kDエンドグルカナーゼに対するフザ
リウムの相同体を単離するために、PCRによる断片の増
幅（米国特許愛4,683,195号および同4,683,202号明細書
に記載されるように）およびクローン化を行った。次
に、この生成物を配列決定し、PCR増幅用プローブのラ
イブラリーとして使用するプライマー類を構築した。こ
れらのオリゴヌクレオチドを使用して、cDNAライブラリ
ーから対応するクローンを単離した。
PCRを使用して43kDの相同体の部分鎖長cDNAとゲノム
のフラグメントを単離した。PCR反応では、鋳型としてc
DNAまたはゲノムDNAのいずれかと共に高変性のオリゴヌ
クレオチド（下記表を参照）の７種の組み合わせを使用
した。ただ１種の組み合わせがフザリウムの43kD相同体
の部分クローンを生成しただけである。２つの個別のセ
ットのPCR条件を各オリゴヌクレオチド対について使用
した。第一のセットは非常に少ない生成物を調製するが
非常に高い特異性をもつように設計した。このセットの
28サイクルで各種ファクターが特異性を保持した。65℃
のアニーリング温度はこれらのオリゴヌクレオチドにと
っては非常に高温であった。この温度のアニーリング時
間はほんの30秒間に設定した。反応液100μＬ当り各変
性プライマー混合物20ピコモルを使用した。使用したオ
リゴヌクレオチドは、「クローニング要素（Cloning el
ement）を含まないデジェネレート（degenarate）領域
だけを含み、Amplitaq（商標）（Perkin−Elmer Cetu
s）１単位を反応液100μＬ当りに使用し、そしてEDTAを
最後の10分間の72℃インキュベーションの終りに反応チ
ューブに加えてPCRサイクル後の低温でのミスマッチプ
ライマーによる伸長を防いだ。第一セットのサイクルの
生成物は、高い特異性を確保するのに必要な低い効率の
増幅のためにアガロース電気泳動のエチジウムブロマイ
ド染色により可視化されることは期待できないであろ
う。しかしながら、第二セットの増幅は、第一セットか
らの生成物を効率よく増幅するように設計された。この
ことを達成するファクターとしては、アニーリング温度
を55℃に低下すること、アニーリング時間を１分まで延
長すること、オリゴヌクレオチドの量を反応液100μＬ
当り各混合物を100ピコモルまで増加すること、デジェ
ネレートタンパク質に沿った「プライム（Prime）」ク
ローニング要素を含む別の１組のオリゴヌクレオチド類
を使用すること（溶融温度を極端に高める）、および反
応液100μＬ当りAmplitaq（商標）ポリメラーゼを2.5単
位使用することが挙げられる。
PCR反応は、Perkin−Elmer Cetusにより推奨されるよ
うに行った。マスター混合物を２つのDNA源（ゲノムお
よびcDNA）のそれぞれについて作製した。これは、１×
PCRの緩衝液（10mM Tris−HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM M
gCl2,0.01％ゼラチン、Perkin−Elmer Cetus）,0.2mMの
デオキシヌクレオチド（Ultrapure（商標）dNTPの100mM
溶液、Pharmacia）,1単位のAmplitaq（商標）ポリメラ
ーゼ（Perkin Elmer Cetus）および反応混合物100μＬ
当り0.5μｇのゲノムDNAまたは50ngのcDNAを含んでな
り、そして脱イオン水で反応液100μＬ当り98μＬに容
量を調節した。ラベルを貼った0.5チューブ（エッペン
ドルフ）に各オリゴヌクレオチド混合物（下記参照）20
ピコモル（20ピコモル／μＬ濃度の液１μＬ）を加え
た。これらを、0.5mLチューブ中にまた、マスター混合
物と軽質硬油とを含め、パーキン・エルマー・シータス
（Perkin−Elmer Cetus）サーマルサイクラー（thermoc
ycler）中へ入れた。適当なマスター混合物98μＬと軽
質硬油55μＬをオリゴヌクレオチド類と共に各チューブ
に加えた。次に、順次段階的なサイクル（パラメータに
ついては下記チャートを参照のこと）で反応を開始し
た。最後の72℃インキュベーションの終りに、10mMのED
TA溶液（pH8.0）50μＬを各チューブに加え、72℃でさ
らに５分間インキュベーションした。
43kDの相同体のPCRに使用したオリゴヌクレオチド対
の表： 一連のPCR工程サイクル条件は次のとおりであった。
セット1: セット2: 94℃ １分 94℃ １分 28× 65℃ 30秒 28× 55℃ １分 72℃ ２分 72℃ ２分 72℃ 10分 72℃ 10分 PCRサイクルの第一セット後、イソプロピルアルコー
ル沈殿により反応混合物からDNAを精製し、サイクルの
第二セットで使用した。軽質鉱油の大部分を各試料の上
部から除いた後、試料を新たなラベルを貼ったチューブ
に移した。次に、各チューブを等量のPCI（49％フェノ
ール:49％クロロホルム:2％イソアミルアルコール）
で、次いで等量のクロロホルムで抽出した。次に、反応
液へ7.5Mの酢酸アンモニウム75μＬ、グルコーゲン１μ
Ｌおよびイソプロピルアルコール226μＬを加えてDNAを
沈殿させた。ペレットを脱イオン水20μＬに再懸濁し
た。再懸濁液各２μＬをラベルを貼ったチューブに入
れ、それぞれ新たなプライマー（上記表参照）100ピコ
モル（20ピコモル／μＬ濃度の液５μＬ）と共に第二回
のPCR増幅を行った。マスター混合物は、アレゲノム（A
legenomic）およびcDNA鋳型の除去ならびに反応チュー
ブ中のオリゴヌクレオチドとDNA容量を添加する水の量
を減らすことにより増加するように補足したこと以外上
記のように調製した。反応とサイクルは上記のように設
定した（上記表を参照）。
28サイクルが終了した後、軽質鉱油を試料の上部ら除
去し、次いでPCR混合物を新たなチューブに採取した。
各試料10μＬをパラフィン上にスポットし、約５分間45
℃でインキュベーションして、残存する軽質鉱油をパラ
フィンに吸収させ試料容量を減少させた。次に、これら
の液滴を６倍の色素２μＬと共に１％アガロースゲル
（Seaken GTG（商標）、FMC,Rockland,ME）にのせて電
位泳動を行った。鋳型がcDNAであって反応番号２に約55
0塩基対の単一バンドが見られた。鋳型がゲノムDNAであ
って反応番号12に約620塩基対のバンドが見られた。こ
れらの反応液をオリゴヌクレオチドZC3486およびZC3561
（表１）でプライムした。これは、フミコーラ43kD配列
との比較から予期される。510塩基対PCR生成物と非常に
近似していた。ゲノム鋳型による反応でより大きな生成
物が合成されるのは、この領域内にイントロンが存在す
ることによる。これらの２つのバンドを含むアガロース
を切り出し、製造業者の説明書に従ってPrep−Ａ−Gene
（商標）キット（Bio Rad）を使用することによりDNAを
抽出した。DNAは脱イオン水50μＬで溶離し、3Mの酢酸
ナトリウム、グリコーゲン１μＬおよびエタノール140
μＬで沈殿させた。DNAペレットを乾燥し、TE（10mM Tr
is−HCl,pH8.0,1mM EDTA）７μＬで再懸濁させた。
pBSsk−′ベクターにクローニングしたPCRフラグメン
トを、最初にEco RIと共にpBluescript II sk−（Strat
agene,La Jolla,CA）で消化して調製し、次いで切断プ
ラスミドを0.8％のseaplaque GTG（商標）アガロース
（FMC）からPre−Ａ−Gene（商標）キット（Bio Rad）
を使用し、製造業元の指示に沿って精製した。オリゴヌ
クレオチドZC1773およびZC1774（表１）を、パーキン・
エルマーシータス（Perkin−Elmer Cetus）PCRサーマル
サイクラーにより各オリゴヌクレオチド２ピロモルずつ
混合し、アニーリング緩衝液（200mM Tris−HCl,pH7.6,
50mM MgCl2）0.5μＬを加えた脱イオン水で反応液量を
４μＬまで増量し、次いで30秒間65℃の温度に保持しそ
して20分かけてゆっくり20℃まで冷却することによって
アニーリングした。次に、これらのオリゴヌクレオチド
をEco RI消化pBluescoriptベクターへ次のようにして連
結した。脱イオン水5.5μＬ、アニーリングされたオリ
ゴヌクレオチド２μＬ、消化されたベクターの脱イオン
水による1:3希釈物１μL,10×T4 DNAリガーゼ緩衝液（B
oehringer−Mannheim Biochemicals,Indianapolis IN）
１μＬおよびT4 DNAリガーゼ（Gibco−BRL）0.5μｌを
混合し、次いで2.5時間16℃で混合物をインキュベーシ
ョンした。次に、連結混合物を脱イオン水で100μＬの
容量に調節し、次いでPCIおよびクロロホルムで抽出し
た。電気穿孔法の（エレクトロポレーション）の効率を
高めるために、次に、酢酸アンモニウム50μＬ、グリコ
ーゲン１μＬおよびイソプロパノール151μＬでDNAを沈
殿させた。バイオラッド（Bio−Rad）電気穿孔法装置に
より、製造業元の指示に従って、脱イオン水による再懸
濁液10μＬの１μＬのイ・コリー（E.coli）DH10−Ｂエ
レクトロマックス（electromax）細胞（Gibco−BRL）中
へ電気穿孔法を実施した。電気穿孔法の直後に、キュベ
ットへ２×YTブロス（１リットル当り：トリプトン16
g、酵母エキス10g、NaCl10g）1mLを加えて混合した。各
種希釈物を、100μg/mLのアミピシリンを含み、ジメチ
ルホルムアミド中20mg/mLのＸ−Gal（５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−６−Ｄ−ガラクトロピラノシ
ド、Sigma,st.Louis,MO）100μＬと1MのIPTG（Sigma）2
0μＬを塗布した100mmのLBプレート（１リットル当り：
トリプトン10g、酵母エキス8g、NaCl 5g、寒天14.5g）
上へのせた。１夜生育後、上記バクテリアプラークにつ
いて上述する条件に従って、オリゴヌクレオチドZC3424
（ブルースクリプトリバースプライマー）およびZC3425
（T7プロモータープライマー（表１）を使用する小さな
インサートについてのPCRにより各種青色コロニーと白
色コロニーを解析した。最初に１分45秒94℃で変性後、
45秒間94℃、30秒40℃および１分間72℃を30サイクル行
った。PCR生成物のアガロースゲル電気泳動により、pBl
uescriptクローニング領域中に小さなインサートを含む
PCRバンドを与える１つの青色コロニーを、150μg/mlの
アンピシリンを含むTB（１リットル当り：トリプトン12
g、酵母エキス24g、グリセロール4mLをオートクレーブ
した後、0.17M KH2PO4,0.72M K2HPO4 100mLを加えた。S
ambrockら、Molecular Cloning、第２版、1989,A.2）の
液体培地100mL中で１夜生育した。配列分析は正しくオ
リゴヌクレオチドが挿入されたことを示すが、プロモー
ターのフレームのpBleuscriptベクター中に存在するβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子は保持されたままであった。
DNA調製物の50μｇをEco RIで消化し、PCIとクロロホル
ムで抽出し、次いで酢酸ナトリウムとエタノールで沈殿
させた。DNAペレットを脱イオン水50μＬに再懸濁し
た。消化されたpBS sk−′を、10×T4 DNAポリメラーゼ
緩衝液〔0.33M Tris/酢酸、pH8.0,0.66M 酢酸カリウ
ム、0.1M酢酸マグネシウム、5mMジチオスレイトール、5
mM BSA（New England Biolabs）〕40μＬ、脱イオン水2
60μＬ、1mMのdTTP（Ultrapure（商標）、Pharmacia）4
0μＬおよびT4 DNAポリメラーゼ（1U/μＬ）（Gibco−B
RL）40μＬを1mg/mLのベクターDNAに加えることにより
カットバックした。混合物を15分間12℃でインキュベー
ションし、次いで10分間70℃でインキュベーションし
た。連結に使用するDNAを調製するために、PCIとクロロ
ホルムで抽出し、次いで酢酸ナトリウムとエタノールで
沈殿させた。ペレットを脱イオン水200μＬに再懸濁
し、濃度0.1μg/μＬとした。上記カットバックpBS sk
−′ベクターへの挿入用43kD相同的PCR生成物を調製す
るために、dTTPの代りにdATPを含めた10μＬ容量の反応
液中でT4 DNAポリメラーゼ（Gibco−BRL）によりそれら
をカットバックした。得られたDNA溶液をPCIとクロロホ
ルムで抽出し、次いで酢酸ナトリウム、グリコーゲンお
よびエタノールによって沈殿した。DNAペレットを脱イ
オン水10μＬに再懸濁した。DNA試料7.5μＬを、10×リ
ガーゼ緩衝液（Boehringer−Mannheim）１μＬおよびT4
DNAリガーゼ（Boehringer−Mannheim）0.5μＬで0.1μ
ｇのカットバックpBS sk−′（0.1μg/μＬ）に連結し
た。次に、この連結反応混合物を脱イオン水で150μＬ
容量まで増量し、次いでPCIとクロロホルムで抽出し
た。電気穿孔法の効率を高めるために、次に、酢酸ナト
リウム15μＬ、グリコーゲン１μＬおよびイソプロパノ
ール166μＬでDNAを沈殿させた。脱イオン水再懸濁液10
μＬのうち１μＬを、製造元の指示に従ってBio−Rad電
気穿孔法装置によりイ・コリーDH10−Ｂエレクトロマッ
クス細胞（BRL）中に電気穿孔した。電気穿孔法の直
後、SOBブロス（１リットル当り：トリプトン20g、酵母
エキス5g、1M NaCl 10mL、1M KCl 2.5mLをオートクレー
ブした後、1M MaCl2 10mLと1M MgSO4 10mLを加えた）
をキュベットに加え、次いで細胞混合物を100mlチュー
ブに移し、好気下で１時間37℃にてインキュベーション
した。各種希釈物を、アンピシリン100μg/mLを含み、
ジメチルホルムアミド中20mg/mLのＸ−Gal（Sigma）と1
MのIPTG（Sigma）を塗布した100mmのLBプレート上にの
せた。２種の軽質転換（cDNAとゲノム）のそれぞれ３個
の白色コロニーを採取し、配列決定した。配列分析は、
インサートがフミコーラの43kDセルラーゼと高度に相同
性であることを示した。ゲノムのインサートは、イント
ロンの存在を除きcDNAと同一であった。２つの42merオ
リゴヌクレオチドZC3709およびZC3710（表１）は、ライ
ブラリープローブおよびPCRプライマーと使用する配列
から設計した。これらのオリゴヌクレオチドはPCR生成
物の逆の末端に由来し、DNAの対向する鎖にハイブリッ
ドするように設計されているので、それらはライブラリ
ーのスクリーニングの際に可能性のあるクローンを試験
するためのPCR反応のプライマーとして使用できる。
フザリウム オキシスポラム（Fusarium oxysporum）c
DNAライブラリーの構築 フザリウム オキシスポラムを発酵によって生育し、
いろいろな時間に試料を採取してRNAを抽出し、セルラ
ーゼ活性を分析した。活性の分析には、総セルラーゼ活
性のアッセイと色澄明化のアッセイを含む。最高の色澄
明化を示すフザリウム オキシスポラム試料は、ポリ
（Ａ）＋RNAが単離された全体のRNAから抽出された。
フザリウム オキシスポラムのcDNAライブラリーを構
築するために、第一鎖cDNAを２種の反応液（一つは放射
能標識したdATPで、他の一つは放射能標識しないdATP）
で合成した。2.5×反応混合物を、以下の試薬を次の順
序で混合することにより室温で調製した。５×の逆転写
酵素緩衝液（Gibco−BRL,Gaithersburg,Maryland）10μ
Ｌ、200mMのジチオスレイトール（−70℃で保蔵された
原液由来または新たに調製）2.5μＬおよび各オリゴヌ
クレオチドチド三リン酸（dATP,dGTP,dTTPおよび５−メ
チルdCTP,Pharmacia LKB Biotechnology,Alamada,CA.か
ら得た）10mMを含む混合物2.5μＬ。反応混合物を２つ
のチューブに7.5μＬずつ分注した。10μCi/μＬの32P
α−dATP（Amersham,Arlington Heights,IL）1.3μＬを
一つのチューブに加え、もう一方のチューブには水1.3
μＬを加えた。各混合物の７μＬを最終反応チューブに
移した。それぞれのチューブで、5mMのTris−HCl（pH7.
4）および50μＭのEDTA14μＬ中フザリウム オキシス
ポラムのポリ（Ａ）＋RNA5μｇを、１μg/μＬの第一鎖
プライマー（ZC2938:GACAGAGCACAGAATTCACTAGTGAGCTCT
15）２μＬと混合した。このRNAプライマー混合物を４
分間65℃に加熱し、氷水で冷却し、次いで微量遠心管で
短時間遠心した。RNAプライマー混合物８μＬを最終反
応チューブに加えた。200U/μＬのSuperscript（商
標）、逆転写酵素（Gibco−BRL）５μＬを各チューブに
加えた。ゆるやかに撹拌した後、チューブを30分間45℃
でインキュベーションした。10mMのTris−HCl（pH7.
4）,1mMのEDTA 80μＬを各チューブに加え、試料を回
転させて、簡単に遠心した。各チューブから３μＬを採
取し、TCA沈殿により取り込まれたカウントと反応液中
の総カウントを測定した。各チューブからの試料２μＬ
をゲル電気泳動で分析した。各試料の残りを、オイスタ
ーグリコーゲンの存在下でエタノール沈殿処理した。核
酸を遠心によりペレット化し、次いでこれらのペレット
を80％エタノールで洗浄した。エタノール洗浄後、試料
を10分間通気乾燥した。第一鎖の合成は、ポリ（Ａ）＋
RNAからDNAの転換率33％に相当するフザリウムオキシス
ポラムcDNA1.6μｇを与えた。
第二鎖の合成は、ヘアピンDNAをもたらす第二鎖合成
の第一鎖プライミングを促進する条件下で第一鎖反応液
由来のRNA−DNAハイブリダイゼーションによって行っ
た。２つの第一鎖反応液のれぞれに由来する第一鎖生成
物を、水71μＬに再懸濁した。次の試薬、５×第二鎖緩
衝液（100mM Tris,pH7.4,450mM KCl,23mM MgCl2および5
0mM（NH4）2SO4）20μL,5mMβ−NAD3μＬおよび各10mM
のデオキシヌクレオチド三リン酸混合物５μＬを、室温
で上記反応チューブに添加した。α−32PdATP1μＬを、
第一鎖合成用の末端識dATPを含む反応混合物に加え、一
方、一鎖合成用の標識dATPを含むチューブには水１μＬ
を含めた。次に、各チューブに、7U/μＬのイ・コリーD
NAリガーゼ（Boehringer−Mannheim,Indianapolis,IN）
0.6μＬ、8U/μＬのイ・コリーDNAポリメラーゼＩ（Ame
rsham）3.1μＬおよび2U/μＬのRNase H（Gibco−BRL）
を加えた、反応液を２時間16℃でインキュベーションし
た。インキュベーション後、各反応液由来の２μＬを使
用してTCA沈殿性カウントと反応液の総カウントを測定
し、次いで各反応液由来の２μＬをゲル電気泳動により
分析した。各試料の残りに、2.5μg/μＬのオイスター
グリコーゲン２μＬ、0.5mMのEDTA ５μＬおよび10mM
のTris−HCl（pH7.4）、1mMのEDTA200μＬを加えた。試
料をフェノール−クロロホルムで抽出し、次いでイソプ
ロパノール沈殿させた。遠心後、ペレットを80％エタノ
ール100μＬで洗浄し、通気乾燥した。反応の各々によ
って得られた二本鎖cDNAは、約2.5μｇであった。
ムングビーン（mung been）ヌクレアーゼ処理により
ヘアピンの一本鎖DNAを切り取った。各cDNAペレットを
水15μＬを再懸濁し、次いで各チューブに10×ムングビ
ーン緩衝液（0.3M酢酸ナトリウム、pH4.6、3M NaClおよ
び10mM ZnSO4）2.5μＬ 10mMのDTT2.5μＬ、50％のグ
リセロール2.5μＬおよび10U/μＬのムングビーンヌク
レアーゼ（New England Biolabs,Beverly,MA）2.5μＬ
を加えた。反応液を30分間30℃でインキュベーション
し、各チューブに10mMのTris−HCl（pH7.4）および1mM
EDTA75μＬを加えた。２μＬのアリコートをアルカリ性
アガロースゲル分析により分析した。1MのTris−HCl（p
H7.4）100μＬを各チューブに加え、試料をフェノール
−クロロホルムで２度抽出した。DNAをイソプロパノー
ルで沈殿させ、次いで遠心によりペレット化した。遠心
後、DNAのペレットを80％エタノールで洗浄し、通気乾
燥した。２つの反応のそれぞれからのDNAの収量は、約
２μｇであった。
このcDNAの末端をT4 DNAポリメラーゼで処理して平滑
にした。水24μＬの合計容量で２つの試料に由来するDN
Aを再懸濁した後、合わせた。このDNAに、10×T4緩衝液
（330mM Tris−酢酸塩、pH7.9、670mM KAc、100mM MgAc
および1mg/mLのゼラチン）４μＬ、1mMのdNTP ４μ
Ｌ、50mMのDTT4μＬおよび1U/μＬのT4DNAポリメラーゼ
（Boehringer−Mannheim）４μＬを加えた。これらの試
料を１時間15℃でインキュベーションした。インキュベ
ーション後、10mMのTris−HCl（pH7.4）および1mMのEDT
A160μＬを加え、次いで試料をフェノール−クロロホル
ムで抽出した。DNAをイソプロパノールで沈殿させ、次
いで遠心によりペレット化した。遠心後、DNAを80％エ
タノールで洗浄し、次いで通気乾燥した。
このDNAを水6.5μＬで再懸濁、Eco RIアダプターを平
滑化されたDNAを付加した。このDNAに、１μg/μＬのEc
o RIアダプター（Invitrogen,San Diego,CAカタログ＃4
09−20）１μＬ、10×リガーゼ緩衝液（0.5M Tris,pH7.
8および50mM MgCl2）１μＬ、10mMのATP0.5μＬ、100mM
のDTT 0.5μＬおよび1U/μＬのT4 DNAリガーゼ（Boehr
inger−Mannheim）１μＬを加えた。この試料を室温で
１夜インキュベーションした後、リガーゼを15分間65℃
で変性した。
第一鎖プライマーによってコードされたSsIクローニ
ング部位を、SsIエンドヌクレアーゼで消化することに
より露出させた。このDNAを水33μＬ、10×SsI緩衝液
（0.5M Tris,pH8.0,1M MgCl2および0.5M NaCl）５μＬ
および5U/μＬのSsI2μＬを加え、この試料を２時間37
℃でインキュベーションした。10mMのTris−HCl（pH7.
4）および1mMのEDTA150μＬを加え、試料をフェノール
−クロロホルムで抽出し、次いでDNAをイソプロパノー
ルで沈殿させた。
cDNAをセファロースCL2B（Pharmacia LKB Biotechnol
ogy）カラムでクロマト処理してcDNAのサイズを選択
し、そしてアダプターを含まないものを除去した。セフ
ァロースCL2Bカラム1.1mLを1mLのプラスチック使い捨て
ピペットに流し込み、そのカラムを50倍カラム容量の緩
衝液（10mL Tris,pH7.4および1mM EDTA）で洗浄した。
試料をのせ、１滴ずつ画分を集め、ポイド容積中のDNA
を集めた。画分したDNAをイソプロパノールで沈殿させ
た。遠心後、DNAを80％エタノールで洗浄し、次いで通
気乾燥した。
フザリウム オキシスポラムのcDNAライブラリーを、
Eco RIおよびSst Iで消化したベクターpYcDE8′（国際
公開第WO90/10698号参照）にそのcDNAを連結することに
より樹立した。10×リガーゼ緩衝液８μＬ、10mMのATP4
μＬ、200mMのDTT4μＬおよび１単位のT4 DNAリガーゼ
（Boehringer−Mannheim）を含むリゲーション反応８μ
Ｌ中、cDNA 400ngに390ngのベクターを連結した。室温
で１夜インキュベーション後、オイスターグリコーゲン
５μｇおよび10mMのTris−HClおよび1mMのEDTA120μｇ
を加え、試料をフェノール−クロロホルムで抽出した。
DNAをエタノールで沈殿させ、DNAペレットを80％エタノ
ールで洗浄した。通気乾燥後、DNAを水３μＬを再懸濁
した。電気穿孔法成分DH10B細胞（Gibco−BRL）37μＬ
を上記DNAに加え、Bio−Rad Gene Pulser（Model ＃165
2076）およびBio−Rad Pulse Controller（Model ＃165
2098）エレクトロポレーションユニット（Bio−Rad Lab
oratories,Richmond,CA）により電気穿孔法を完了し
た。SOC（Hanahan,J.Mol.Biol.166（1983）,557〜580）
の4mLをエレクトロポレーション処理した細胞に加え、
次いで細胞懸濁液400μＬを10枚の150mm LBアンピシリ
ンプレートの各々に広げた。１夜インキュベーション
後、LBamp培地10mLを各プレートに加え、細胞を培地か
ら採取した。グリセロール原液とプラスミド調製物を各
プレートから作製した。ライブラリーのバックグランド
（インサートを含まないベクター）を、インサートを伴
わないベクターの連結と電気穿孔法後の数個のクローン
の力価測定によって約１％において樹立した。
45kD相同体の完全鎖長cDNAクローンを単離するため、
1,100,000コロニーのライブラリーを100μg/mLのアンピ
シリンを含む150mmのLBプレート上にまいた。各10枚の
プレート上にグリセロール原液由来の100,000コロニー
をまき、そして各５枚のプレート上に20,000コロニーを
まいた。上記のように釣菌を２度行った。予備ハイブリ
ダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄も
上記のように実施した。ハイブリダイゼーションでは、
２つの末端が標識された42merのオリゴヌクレオチド
類、ZC3709およびZC3710（43kd相同体に特異性である）
を使用した。フィルターは、77℃でTMACLにより20分間
１度洗浄した。複写フィルター上に現われる22個のスポ
ットが観察された。プレートの対応する領域をピペット
の大きい端を使用してそぎ取り、１×PCR緩衝液に入れ
た。単離されたこれらを、各単離物に対して２セットの
オリゴヌクレオチドを使用してPCR分析した。２種の43k
D特異性オリゴヌクレオチドを含む一つのセットを、ハ
イブリダイゼーションプローブとして使用し、そしても
う一つのものは、一つの43kD特異性オリゴヌクレオチド
（ZC3709）と一つのベクター特異性オリゴヌクレオチド
（ZC3634）を含む。PCRは、パーキンエルマーシータス
の指示に従って上記のように行った。各プライマー20ピ
コモルと細胞懸濁液５μＬを、50μＬの各反応液中で使
用した。94℃における１分30秒の最初の変性後、94℃１
分と72℃２分の30サイクルを使用し、最後の伸長は72℃
で10分の時間とした。結果は22個のうち17が上記２つの
43kD特異性オリゴヌクレオチド認識部位を含むことを示
した。残りの５つのクローンは、上記２つの部位の一つ
（ZC3709）を含むが、ベクター特異性プライマーを使用
するPCRにより切り縮められそして十分な長さでないの
で他の部位を含まないことが明らかにされた。９種の最
も長いクローンをスクリーニングの別のレベルで単一コ
ロニーを単離目的で選んだ。各５つの10倍希釈物を、第
一セットのリフト（lift）について上記したような操作
でまいた。９種のすべてが二次レベルのスクリーニング
のオートラジオグラフ上にシグナルを示した。コロニー
は非常に密集していたので、放射能シグナルの領域内の
数個の分離したコロニーを単一コロニーとして70μg/mL
のアンピシリンを含む150mm LBプレート上で単離した。
コロニーをつまようじでそぎ取りマスター混合物25μＬ
に入れたこと以外第一レベルのスクリーニングについて
記載したようにオリゴヌクレオチドZC3709およびZC3710
を使用するPCRによって〜43kDエンドグルカナーゼに対
する相同性を試験した。９個のクローンのうち７個につ
いて予備したサイズのバンドが得られた。これらの培養
を150μg/mLのアンピシリンを含むテリフィック ブロ
ス（Terrific Broth）20mLで開始した。DNAを、上記の
ようなアルカリ溶菌およびPEG沈殿によって単離した。
DNA配列分析 これらのcDNAを、酵母発現ベクターpYCDE8′により配
列決定した。New England Nuclearから35−SdATP（M.D.
Bigginら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,1983,3963〜396
5ページ、参照）を使用するジデオキシチェインターミ
ネーション法（F.Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
74,1977,5463〜5467ページ）を、すべての配列決定反応
に使用した。これらの反応は、Pharmaciaからの変性t7D
NAポリメラーゼ（S.TaborおよびC.C.Richardson,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 84,1987,4767〜4771ページ、参照）
で触媒され、そしてADH1プロモーター（ZC996:ATT GTT
CTC GTT CCC TTT CTT）に相補的なオリゴヌクレオチ
ド、CYC1ターミネーター（ZC3635:TGT ACG CAT CTA ACA
TTA）に相補的なオリゴヌクレオチドまたは目的のDNA
に相補的なオリゴヌクレオチドによりプライムされた。
二本鎖鋳型はNaOHで変性（E.Y.ChenおよびP.H.Seeburg,
DNA ４,1985,165〜170ページ）した後、配列決定用オ
リゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさた。オリ
ゴヌクレオチド類は、Applied Biosystems Model 380A
DNAシンセサイザーにより合成した。配列決定反応に使
用したオリゴヌクレオチド類を下記シーケンシングオリ
ゴヌクレオチド表に列挙する。
例４ 色澄明化試験 フミコーラ（Humicola）〜43kDエンドグルカナーゼ
（30の精製実施物の混合物）を、色澄明試験について米
国特許第4,435,307号の実施例６に記載のフミコーラ
インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ調製物
と比較した。
試験材料として、使い古した黒色綿スワッチを使用し
た。澄明試験は、３回反復洗浄するターゴトメーターで
行った。各洗濯の間にスワッチを１度乾燥した。
条件： 30分間40℃で2g/Lの液体洗剤および水の硬度９゜dH。
スワッチの大きさは10×15cmであり、各ビーカー中に２
枚のワッチを入れる。
洗剤の組成は次のとおりである。
アニオン界面活性剤（Nansa 1169/p） 10％ 非イオン界面活性剤（Berol 160） 15％ エタノール 10％ トリエタノールアミン ５％ 水 60％ （塩酸でpHを8.0に調節した）。
用量： ２種の酵素を63および125CMCエンドアーゼ単位/Lで使
用した。
結果： 結果は、１〜７点の範囲でスワッチを評価する22人のパ
ネラーによって評価された。より高い点数はより良い澄
明化が得られたものである。
本発明の〜43kDエンドグルカナーゼは、従来技術のフ
ミコーラインソレンス（H.insolens）より約30倍優れた
性能を示し、そして国際公開第WO89/09259号に従うセル
ラーゼ調製物より約６倍優れた性能を示すことがわか
る。
例５ プロテアーゼの存在下でのフミコーラ（Humicola）〜43
kDエンドグルカナーゼの安定性 異なるプロテアーゼが存在する液体洗剤中の本発明の
〜43kDエンドグルカナーゼの貯蔵安定性を、以下の条件
下で測定した。
酵素 本発明の〜43kDエンドグルカナーゼ Glu/Asp特異性バチルス リケニフォルミス（B.liche
niformis）セリンプロテアーゼ トリプシン様フザリウムエスピー（Fusarium sp.） DSM2672プロテアーゼ バチルス レンタス（B.lentus）セリンプロテアーゼ Subtilisin Movo 洗剤 乳白剤、香料または酵素（実験で添加されるもの以
外）のどれも含まれていない米国で市販されている液体
洗剤。酵素安定剤として＋１−１％（重量／重量）のホ
ウ酸。
用量 エンドグルカナーゼ：洗剤1g当り12CMCU プロテアーゼ：洗剤1g当り0.2mg インキュベーション 35℃で７日 残存活性 相当するプロテアーゼと共にインキュベーション７日
後のエンドグルカナーゼ残存活性は、そのCMCアーゼ活
性（CMCU）で測定した。CMCアーゼ活性は次のように測
定した。
脱イオン水中30g/LのCMC（Hercules 7LFD）基質溶液
を調製した。測定すべき酵素試料を0.01Mのリン酸緩衝
液（pH7.5）に溶解した。酵素液1.0mLと0.1Mのリン酸緩
衝液（pH7.5）2.0mLを試験管中で混合し、酵素反応はそ
の試験管に基質溶液1.0mLを加えることにより開始し
た。混合液を20分間40℃でインキュベーションし、その
後反応を0.125Mのリン酸三ナトリウム・12H2O 2.0mL添
加するすることにより停止した。ブライド試料はインキ
ュベーションすることなく調製した。
フェリシアニド溶液（脱イオン水1L中フェリシアン化
ナトリウム1.60gおよびリン酸三ナトリウム・12H2O 14.
0g）2.0mLを試験試料ならびにブラインド試料に加え、
直ちに沸騰水に浸した後10分間インキュベーションし
た。インキュベーション後、試料を水道水で冷却した。
420nmで吸光度を測定し、標準曲線はグルコース溶液で
作成した。
1 CMCアーゼ単位（CMCU）は、上記に特定される条件
下で、１分間にグルコース１マイクロモルに相当する量
の還元糖を生成する酵素量として定義されている。
結果 本発明のエンドグルカナーゼの貯蔵安定性は、上記条
件下でその残存活性（CMCU％として）として測定され
た。
これらの結果は、Savinaseより高度の特異性をもつプ
ロテアーゼが洗剤組成物に含められた場合に、本発明の
エンドグルカナーゼの液体洗剤中での貯蔵安定性が改善
されることを示す。
例６ デニム織物の色の局所的な変化を付与するためのフミコ
ーラ〜43kDエンドグルカナーゼの使用 「ストーンウォッシュ」の外観に近似するジーンズの
表面の色に局所的な変化を付与するために、12kgの「ウ
ォッシュコーター（Wascator）」FL120洗濯物抽出機中
でデニムジーンズを〜43kDエンドグルカナーゼ処理にか
けた。
機械負荷量当り４本のジーンズを使用した。実験条件
は以下のとおりであった。
糊抜き 40Lの水 100mLのB.amyloliquefaciensアミラーゼ＊,120L 70gのKH2PO4 30gのNa2HPO4 55℃ 10分 pH6.8 ＊Novo Nordisk A/Sより入手可 糊抜きの後排水した。
摩耗 40Lの水 120gのH.insolensセルラーゼ混合物または×ｇの〜
43kDエンドグルカナーゼ 70gのKH2PO4 30gのNa2HPO4 55℃ 75分 pH6.6 摩耗処理後、排水、すすぎ、後洗濯およびすすぎを行
った。
結果は、ジーンズの視覚的外観を判断することにより
評価した。
各種用量の〜43kDエンドグルカナーゼを使用してフミ
コーラインソレンス（H.insolens）セルラーゼ混合物12
0gによって得られるのと等価の摩耗レベルを得た。この
等価のレベルは、〜43kDエンドグルカナーゼ1.0〜1.25g
で得られた。処理被服の引裂強さの測定値は、両酵素処
理間で有意差が示されなかった。
例７ 織物表面の毛羽の除去へのフミコーラ（Humicola）〜43
kDエンドグルカナーゼの使用 新しい織物に対して高度の柔軟性を付与する酵素の効
力を検査するために、12kgの「ウォッシュコーター」FL
120洗濯抽出機中で綿100％の織物を〜43kDエンドグルカ
ナーゼで処理した。
実験条件は次のとおりであった。
織物 綿100％の織物は、Nordisk Textilより漂白済み（NT2
116−ｂ）または未漂白（NT2116−ub）のものを入手し
た。織物400gを機械負荷量当り使用した。
糊抜き 40Lの水 200mLのB.amyloliquefaciensアミラーゼ,120L 60gのKH2PO4 20gのNa2HPO4 60℃ 10分 pH6.4 糊抜き処理後、排水した。
主洗濯 40Lの水 ０−600gのH.insolensセルラーゼ調製物または×ｇ
の〜43kDエンドグルカナーゼ 60gのKH2PO4 40gのNa2HPO4 60℃ 60分 pH6.7 摩耗処理後排水した。
後洗濯 40Lの水 40gのNa2CO3 10gのBerol 08 80℃ 15分 pH10.1 後洗濯後排水した。
〜43kDエンドグルカナーゼを３段階の濃度で主洗濯で
使用した。
織物試料の重量減少を処理前後に測定した。重量減少
を％で表示し、そして糊抜きされた織物と比較した。
織物の厚さを、厚さ測定器Ｌ＆Ｗ、タイプ22/1によっ
て測定した。織物のスワッチ（10×6cm）２枚を測定
し、μｍによる５箇所の測定値を各スワッチについて記
録した。スワッチは、98.07kPaの加圧下で測定された。
保持された厚さを％で表示し、糊抜き織物と比較した。
織物の強度は、引裂試験機（Elemendorf 09）によっ
て測定した。６枚のスワッチ（10×6cm）をたて方向に
切断し、そして６枚のスワッチ（10×6cm）をよこ方向
に切断した。引裂強さは、ASTM D1424に従いmNで測定し
た。酵素処理織物の織物強度は、糊抜き織物との比較に
おいて％で表示される。
織物の剛性は、キングファブリックスティフネステス
ター（King Fabric Stiffness Tester）で測定した。４
枚のスワッチ（10×20cm;たて方向に10cm）を織物から
切り取り、各スワッチを裏返しに折り重（10×10cm）、
そして中央に開口リングを備えたテーブル上に置いた。
織物を、グラムで教示される一定の力のピストンでリン
グを介して押した。ASTM D4032円形折り曲げ試験法（Ci
rcular Bend Test Method）に従い測定を行った。保持
織物曲げ剛性は、糊抜きされた織物と比較において％で
表示される。
これらの試験の結果は、次の表に示される。
例８ 紙パルプの処理へのフミコーラ（Humicola）〜43kDエン
ドグルカナーゼの使用 パルプ排液に対する酵母の効果を検査するために、各
種タイプの紙パルプの処理に〜43kDエンドグルカナーゼ
を使用した。
実験条件は次のとおりであった。
パルプ 1.回収紙混合物：新聞紙33％、雑誌33％およびコンピュ
ーター用紙33％からなる。脱インク薬品の使用または不
使用（それぞれ、WPCまたはWP）。
2.再循環ボール箱（RCC）。
3.漂白クラフトパルプ：マツ製（BK）。
4.未漂白熱砕木パルプ：モミ製（TMP）。
セルラーゼ活性（CEVU）の測定 トリス（Tris）緩衝液（pH9.0）中33.3g/LのCMC（Her
cules 7LFD）含有基質溶液を調製した。測定すべき酵素
試料を上記緩衝液に溶解した。基質溶液10mLと酵素溶液
0.5mLを混合し、40℃に温度調節された粘度計（Haake V
T181,NV sensor,181rpm）に移した。１セルラーゼ粘度
単位（CEVU）は、ノボノルディスクアナリティカルメソ
ッド（Novo Nordisk Analytical Method）No.AF253（ノ
ボノルディスクより入手可）により定義される。
パルプ排液の測定（ショッパー・リーグラー） ショッパー・リーグラー（Schopper−Riegler）（S
R）数は、2g/Lの粘度をもつ均質パルプに対するISOスタ
ンダード5267（パート１）に従って測定した。既知量の
パルプを金属製の篩を通して漏斗中へ流した。この漏斗
には、軸方向の孔と横方向の孔が設けられている。横方
向の孔を通過する濾液量をショッパー・リーグラー単位
が目盛られた容器で測定する。
酵素処理 〜43kDエンドグルカナーゼ調製物を7CEVU/mLに希釈
し、上記パルプ（50g DS、粘度３％）に加えた。酵素用
量は、乾燥パルプ1kg当り2400CEVUであった。酵素処理
は、60分間ゆるやかに撹拌しながらpH7.5および40℃で
行った。試料を30分間後に採取して反応の進行をモニタ
ーした。60分後、反応を停止するためにパルプを冷水
（＋４℃）で粘度0.5％に希釈した。
湿潤パルプの排液を上記のように測定し、ショッパー
・リーグラー（SR）値を求めた。減圧下での排液時間も
測定した。
結果を下記表にまとめる。
上記表から、〜43kDエンドグルカナーゼ処理は、製紙
で使用されるパルプのSR値の著しい低下をもたらし、そ
して排液が有意に改善されることを示す。
ラピッド カーテン（Rapid Kothen）装置により各種
パルプから紙シートを作製し、各種パラメーター（破壊
長を含む）に関する強度を測定した。酵素の作用に起因
する強度特性の低下はみられなかった。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｓ 3/04 Ｄ０６Ｍ 16/00 Ａ Ｄ０６Ｍ 16/00 Ｄ０６Ｐ 5/00 １２１ Ｄ０６Ｐ 5/00 １２１ 5/08 ＤＢＢＡ 5/08 ＤＢＢ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:77） (72)発明者 シューレイン，マルティン デンマーク国，デーコー―2100 ケーベ ンハウン エー，ビーデベルツガーデ 51 (72)発明者 パトカル，シャムカント アナント デンマーク国，デーコー―2800 リング バイ，クリストファーズ アレ 91 (72)発明者 ハーゲン、フレッド アメリカ合衆国、ワシントン 98112, シアトル、レキシントン ウェイ イー スト 1315 (72)発明者 ヨルト、カルステン マイランド デンマーク国 デーコー―4000 ロスキ ルド、スボゲルスレウ ゴーセアゲレン 43 (72)発明者 ハルストプ、スベン デンマーク国、デーコー―2400 ケベン ハブン エンベー、フレデリクスボルグ バイ10 ３ テーホー (56)参考文献 国際公開89／9259（ＷＯ，Ａ１) Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ. （1987）210 ｐ．551−556 Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. （1990）４（５）ｐ．759−767 Ｇｅｎｅ 81 ｐ．83−95（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の性質： （ａ）SDS−PAGEにより測定した見かけ分子量が約43kD
    である； （ｂ）pH6.0〜10.0の範囲で活性である； （ｃ）pH3〜9.5の範囲のpH値において安定である； （ｄ）非晶質セルロースを分解する；及び （ｅ）セロビオースβ−ｐ−ニトロフェニルを実質的に
    分解しない； を有するフミコーラ（Humicola）属微生物由来のエンド
    グルカナーゼ酵素。
  2. 【請求項２】前記フミコーラ属微生物がフミコーラ・イ
    ンソレンス（Humicola insolens）である、請求の範囲
    第１項に記載のエンドグルカナーゼ酵素。
  3. 【請求項３】約50℃で最大活性を示す、請求の範囲第１
    項又は第２項に記載のエンドグルカナーゼ酵素。
  4. 【請求項４】配列番号:2に示す１位のアミノ酸から284
    位のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するエンドグルカ
    ナーゼ酵素。
  5. 【請求項５】請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項
    に記載のエンドグルカナーゼ酵素を含有する洗剤組成
    物。
  6. 【請求項６】プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダー
    ゼおよび／またはアミラーゼのような別の酵素をさらに
    含んでなる請求の範囲第５項に記載の洗剤組成物。
  7. 【請求項７】前記エンドグルカナーゼ酵素が、洗浄液１
    リットル当り0.01〜100mgの酵素タンパク質に相当する
    濃度で存在する請求の範囲第５項又は第６項に記載の洗
    剤組成物。
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