ES2371916T3 - Celulasa tolerante a los tensioactivos y procedimiento para convertir la misma. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para suprimir una reducción en la actividad de endoglucanasa en presencia de un tensioactivo, caracterizado por la modificación de una proteína que tiene la actividad de endoglucanasa, en la que el aminoácido N terminal es diferente de ácido piroglutámico, a una proteína que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico.

Description

Celulasa tolerante a los tensioactivos y procedimiento para convertir la misma

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para modificar el extremo N terminal de una proteína que tiene actividad de endoglucanasa (en especial, una celulasa perteneciente a la familia 45 y que tiene actividad de endoglucanasa) a ácido piroglutámico, para convertir la proteína en una celulasa con actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña, y está relacionada con la celulasa.

Antecedentes de la técnica

Se dice que la biomasa de celulosa es el recurso más abundante entre los recursos naturales, y por lo tanto en varios campos resulta deseable una aplicación eficiente de los sistemas de celulasas que descomponen la biomasa de celulosa. En este proceso de desarrollo, se han purificado y caracterizado varias celulasas, y además se han clonado diversos genes de celulasa, que se han clasificado en familias mediante el análisis de la homología de secuencias (véase referencia no relacionada con patentes 1). En otro aspecto, las celulasas se utilizan basándose en sus propiedades, en diversos campos industriales, en particular en el campo de procesamiento de tejidos. Por ejemplo, se lleva a cabo un tratamiento con celulasa para mejorar el tacto y/o el aspecto de tejidos que contienen celulosa, o para un “biolavado” que imparte un aspecto de “lavado a la piedra” a un tejido que contiene celulosa coloreado, proporcionando por consiguiente al tejido variaciones de color localizadas. Además, en el procedimiento para fabricar liocel, la celulasa se usa para retirar la pelusa generada durante el procedimiento de la superficie del tejido. Al respecto, el liocel es un tejido de celulosa regenerado derivado de la pulpa de madera, que recientemente ha atraído la atención por sus propiedades (tales como la alta resistencia o la absorción de agua) y como un procedimiento de producción que provoca menos polución ambiental.

Hasta ahora, se ha considerado que la celulasa decompone la celulosa mediante el efecto colaborativo de varias enzimas, es decir, el efecto sinérgico. El grupo de celulasas que consiste en varias enzimas contiene enzimas que tienen propiedades inadecuadas para el campo del procesamiento de tejidos (tales como una enzima que disminuye la resistencia de la fibra). Por consiguiente, se ha llevado a cabo un intento para separar componentes enzimáticos adecuados para el procesamiento de tejidos del grupo de las celulasas, y para producir los componentes enzimáticos, utilizando técnicas de separación de proteínas y/o técnicas de ingeniería genética. En particular, se han sometido a un estudio serio las celulasas derivadas de microorganismos que pertenecen a los hongos filamentosos tales como el género Trichoderma o el género Humicola. Por ejemplo, como componentes de celulasa, se aislaron CBH I, EG V (véase referencia de patente 1), NCE2, NCE4 y NCE5 en el género Humicola, y CBH I, CBH II, EG II y EG III en el género Trichoderma, y de este modo, se puede producir las preparaciones de celulasa que contienen como componentes principales uno o más componentes de celulasa específicos apropiados para cada propósito mediante la preparación de enzimas sobreexpresadas o enzimas monocomponentes usando técnicas de ingeniería genética. Además, se ha aclarado que las celulasas que pertenecen a la familia 45, tales como NCE4 (véase referencia de patente 2), NCE5 (véase referencia de patente 3), RCE1 (véase referencia de patente 4) o STCE1 (véase Solicitud Internacional Nº PCT/JP2004/15733), son muy útiles en los campos anteriores.

En otro aspecto más, cuando se usan las celulasas como un detergente para la ropa, no solamente se desea una mejora cuantitativa de los componentes de celulasa usados sino también una cualitativa. Más particularmente, un detergente para la ropa contiene diversos tensioactivos, y una disolución obtenida mediante la solubilización del detergente para la ropa en agua es alcalina (pH 10 a pH 11). Por consiguiente, es necesario que las celulasas contenidas en un detergente para la ropa sean resistentes a diversos tensioactivos, en condiciones alcalinas. Como un informe en el que una se suprime la reducción de la actividad en presencia de un tensioactivo, Otzen, D. E. y col. informaron que cuando se introdujo una mutación en la secuencia interna de aminoácidos de Cel45 derivada de Humicola insolens, la actividad de la misma a pH 7 en presencia de benceno sulfonato de alquilo lineal (LAS) era aproximadamente 3,3 veces superior a la del tipo natural (véase referencia no relacionada con patentes 2). Sin embargo, se encontró que la supresión de la reducción de la actividad en presencia del tensioactivo, proporcionada por la mutación, está limitada a Cel45 o a sus proteínas homólogas, y que no es aplicable a las endoglucanasas pertenecientes a la familia 45 que tienen baja homología con Cel45.

(referencia de patente 1) Publicación Internacional WO91/17243.

(referencia de patente 2) Publicación Internacional WO98/0366.

(referencia de patente 3) Publicación Internacional WO01/90375.

(referencia de patente 4) Publicación Internacional WO00/24879.

(referencia no relacionada con patentes 1) Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316: 695-696 (1996).

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(referencia no relacionada con patentes 2) Daniel E. Otzen, Lars Christiansen, Martin Schulein. A comparative study of the unfolding of the endoglucanase Cel45 from Humicola insolens in denaturant and surfactant. Protein Sci. 8: 1878-1887 (1999).

El documento WO 94/07998 se refiere a una variante de celulosa de una celulosa original que comprende un dominio de unión a celulosa, un dominio catalíticamente activo y una región que une los dos dominios mencionados. Para mejorar las propiedades de la variante de celulosa, uno o más restos de aminoácidos neutros en la superficie del dominio catalíticamente activo están sustituidos por uno o más restos de aminoácidos cargados negativamente,

o uno o más restos de aminoácidos cargados positivamente en la superficie del dominio catalíticamente activo están sustituidos por uno o más restos de aminoácidos neutros o cargados negativamente. Además, uno o más restos de aminoácidos hidrófobos están sustituidos por uno o más restos de aminoácidos no hidrófobos, o en el que uno o más restos de aminoácidos están sustituidos por prolina. J. Mol. Biol. (1997) 272, 383-397 describe la estructura cristalina del dominio catalítico central de la endoglucanasa I de Trichoderma reesei y una comparación con enzimas relacionadas.

Un objeto de la presente invención es para proporcionar un procedimiento para convertir una proteína que tiene una actividad de endoglucanasa (en particular, una proteína perteneciente a la familia 45 y que tiene una actividad de endoglucanasa) en una proteína que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña; un vector que se utiliza en el procedimiento; una proteína que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña; y un polinucleótido que codifique la misma. Otro objeto de la presente invención es proporcionar, utilizando lo anterior, un microorganismo que produce de manera eficiente una proteína útil como una enzima para el lavado de ropa.

Medios para solucionar el problema

Los presentes inventores realizaron estudios intensivos, y como resultado, encontraron que las proteínas en las que se añadió ácido piroglutámico (a continuación denominado algunas veces pQ en el presente documento) o un péptido que contenía pQ al extremo N terminal de cada proteína perteneciente a la familia 45 y que tenía una endoglucanasa, es decir, celulasas con adición en el extremo N terminal, tenían una actividad de endoglucanasa que no presentaba una reducción significativa de la actividad en presencia de un tensioactivo, en comparación con las celulasas de tipo natural.

La característica de que se mantenga una actividad de endoglucanasa alta en presencia de un agente tensioactivo aniónico es particularmente útil en el caso de enzimas para el lavado de ropa, pero no se conoce una celulasa de tal tipo. Además, no se ha informado que las funciones inherentes a una enzima puedan mantenerse en presencia de un tensioactivo por medio de la adición a la misma de ácido piroglutámico o de un péptido que lo contenga.

En otro aspecto de la presente invención, con respecto a todas las celulasas en las que el aminoácido N terminal no está protegido y es deseable el mantenimiento de la actividad en presencia de un agente tensioactivo, resulta posible, mediante la adición a la celulasa de ácido piroglutámico o de un péptido que lo contiene, suprimir la reducción de la actividad en presencia de un tensioactivo. Las celulasas a las que se añade ácido piroglutámico o un péptido que lo contiene no están particularmente limitadas, pero resultan de preferencia las celulasas pertenecientes a la familia 45.

Por consiguiente, la presente invención incluye lo siguiente:

(1)

un procedimiento para suprimir la reducción de la actividad de endoglucanasa en presencia de un tensioactivo, caracterizado por la modificación de una proteína que tiene la actividad de endoglucanasa en la que el extremo N terminal es un aminoácido diferente de ácido piroglutámico, a una proteína que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico;

(2)

el procedimiento de (1), en el que la modificación se lleva a cabo mediante la adición de ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, o un péptido que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, al extremo N terminal de la proteína que tiene la actividad de endoglucanasa en la que el extremo N terminal es un aminoácido diferente de ácido piroglutámico;

(3)

el procedimiento de (1), en el que la modificación se lleva a cabo mediante la sustitución del aminoácido N terminal o una región N terminal de la proteína que tiene la actividad de endoglucanasa en la que el extremo N terminal es un aminoácido diferente de ácido piroglutámico, por ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, o un péptido que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico;

(4)

el procedimiento de uno cualquiera de (1) a (3), en el que la proteína que tiene la actividad de endoglucanasa en la que el extremo N terminal es un aminoácido diferente de ácido piroglutámico es una celulasa perteneciente a la familia 45;

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(5)

una proteína modificada que tiene actividad de endoglucanasa en la que el aminoácido N terminal se convierte en ácido piroglutámico por una modificación de aminoácidos;

(6)

la proteína modificada de (5), que se puede obtener por el procedimiento de uno cualquiera de (1) a (4);

(7)

una proteína seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40;

(b)

una proteína modificada que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se han eliminado, sustituido, insertado o añadido en la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, y que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción de presencia de un tensioactivo es pequeña; y

(c)

una proteína homóloga que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de homología con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, y que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña;

Efectos de la invención

De acuerdo con la presente invención, es posible producir de manera eficaz una celulasa nueva que es útil como una enzima para el lavado de ropa y que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Proteína perteneciente a la familia 45 y que tiene actividad de endoglucanasa (denominada a continuación algunas veces en el presente documento “celulasa perteneciente a la familia 45”).

Familia 45

El término “familia 45” como se utiliza en el presente documento, significa una proteína clasificada en la familia 45 según el análisis de grupos hidrófobos de enzimas activadoras de hidratos de carbono por B. Henrissat y A. Bairoch [Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316: 695696 (1996)].

Proteínas que tienen actividad de endoglucanasa

La expresión “proteína que tiene una actividad de endoglucanasa” como se utiliza en el presente documento, significa una enzima que presenta una actividad de endoglucanasa, es decir, endo-1,4-�-glucanasa (EC3.2.1.4), que hidroliza el enlace �-1,4-glucopiranosilo en �-1,4-glucano.

Tensioactivo

El término “tensioactivo”, como se utiliza en el presente documento, es un componente detergente contenido en un detergente para la ropa, y que se clasifica ampliamente en tensioactivos aniónicos, catiónicos y no iónicos. Los tensioactivos aniónicos se utilizan comúnmente. Como tensioactivos aniónicos utilizados de preferencia en la presente invención, se pueden citar, por ejemplo, benceno sulfonato de alquilo lineal (denominado a continuación algunas veces en el presente documento “LAS”).

Actividad de endoglucanasa

La expresión “actividad de endoglucanasa (denominada a continuación en el presente documento ‘EGU’)” como se utiliza en el presente documento se define como una actividad enzimática obtenida por medio de la medición de la disminución de la viscosidad de una disolución de carboximetilcelulosa según el siguiente procedimiento. Como disolución de sustrato, se disolvió carboximetilcelulosa (Hercules) en un tampón Tris-HCl 0,1 mol/l (pH 10,0) (concentración final = 3,5%). A la disolución de sustrato (5 ml) previamente calentada a 40 ºC durante 10 minutos, se le añadieron 0,15 ml de una disolución de la enzima, y a continuación se mezcló todo bien para llevar a cabo la reacción a 40 ºC durante 30 minutos. La viscosidad de la mezcla de reacción se midió mediante un viscosímetro de tipo R (RE100; TOKI Sangyo Co., LTD) a 40 ºC. Se define “1 unidad” de la actividad enzimática como una cantidad de enzima que reduce la viscosidad inicial al 1/2, en cada condición de la reacción. Como tensioactivo aniónico se utilizó benceno sulfonato de alquilo lineal (Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd.) y se añadió a la disolución de carboximetilcelulosa hasta una concentración final de 800 ppm.

Supresión de la reducción de la actividad de endoglucanasa en presencia de tensioactivo

“Que tiene actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña”, como se utiliza en el presente documento, significa que, cuando la proteína en la que está modificado el extremo N terminal (proteína del tipo modificación N terminal) de acuerdo con la presente invención se compara con la proteína original antes de realizar la modificación (denominada a continuación en el presente documento simplemente proteína

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original) con respecto a la actividad de endoglucanasa en presencia del tensioactivo, la actividad de endoglucanasa de la proteína del tipo modificación N terminal es mayor que la de la proteína original.

Proteína original

La proteína original que se puede aplicar al procedimiento de la presente invención no está particularmente limitada, con la condición de que se trate de una proteína que tiene una actividad de endoglucanasa en la que el extremo N terminal es un aminoácido diferente de ácido piroglutámico. Como la proteína original, se pueden citar, por ejemplo, una celulasa (por ejemplo, endoglucanasa, celobiohidrolasa o -glucosidasa) y resulta de preferencia una celulasa perteneciente a la familia 45. En este sentido, siempre que la proteína original tenga al menos una actividad de endoglucanasa, puede ser una proteína que tenga sólo la actividad de endoglucanasa, o una proteína que tenga otra u otras actividades enzimáticas además de la actividad de endoglucanasa. Además, la proteína original puede ser una proteína de origen natural o una proteína modificada genéticamente.

Fuente original de la celulasa perteneciente a la familia 45

La celulasa perteneciente a la familia 45 puede generarse por medio de técnicas de ingeniería genética de uso común, tales como técnicas de ADN recombinante o técnicas de síntesis de polipéptidos, o se pueden obtener a partir de una cepa natural aislada. Además, las celulasas incluyen variantes de celulasas de tipo natural pertenecientes a la familia 45. La celulasa perteneciente a la familia 45 se puede obtener a partir de un microorganismo tal como los hongos filamentosos o zygomycetes. Como hongos filamentosos, se pueden citar, por ejemplo, microorganismos pertenecientes al género Humicola (tal como Humicola insolens), al género Trichoderma (tal como Trichoderma viride), al género Staphylotrichum (tal como Staphylotrichum coccosporum) o del género Myriococcum (tal como Myriococcum thermophilum). Más concretamente, las celulasas derivadas de género Humicola incluyen, por ejemplo, CBH I, EG V, NCE2, NCE4 y NCE5; las celulasas derivadas del género Trichoderma incluyen, por ejemplo, CBH I, CBH II, EG II y EG III; las celulasas derivadas del género Staphylotrichum incluyen, por ejemplo, STCE1 y STCE3; y las celulasas derivadas del género Myriccoccum incluyen, por ejemplo, MTE1. Como zygomycetes, se pueden citar, por ejemplo, microorganismos pertenecientes al género Rhizopus (tal como Rhizopus oryzae), al género Mucor (tal como Mucor circinelloides) o al género Phycomyces (tal como Phycomyces nitens). Más concretamente, se pueden citar, por ejemplo, RCE I, RCE II o RCE III derivadas de Rhizopus oryzae, MCE I o MCE II derivadas de Mucor circinelloides; o PCE I derivada de Phycomyces nitens (documento WO 00/24879).

Ácido piroglutámico o péptido que contiene ácido piroglutámico

El término “ácido piroglutámico” como se utiliza en el presente documento significa ácido piroglutámico generado por ciclación de la glutamina o el ácido glutámico del extremo N terminal de una proteína madura. El ácido piroglutámico tiene la característica de que el grupo amino N terminal no está expuesto. La formación de piroglutamato se puede realizar in vivo o in vitro. In vivo, un polinucleótido que codifica una proteína modificada, que está genéticamente diseñada para que el extremo N terminal de una proteína madura sea glutamina o ácido glutámico, puede expresarse en una célula huésped para obtener una proteína de ciclación de piroglutamato. In vitro, una proteína que tiene el extremo N terminal de glutamina o ácido glutámico pueden ser tratada con una disolución ácida tal como una disolución de ácido fórmico para obtener una proteína que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico.

El término “péptido” como se utiliza en el presente documento, significa un compuesto que consiste en uno o en varios aminoácidos en el que los aminoácidos están polimerizados por medio de enlaces peptídicos. Por lo tanto, la expresión “péptido que contiene ácido piroglutámico” como se utiliza en el presente documento, significa un péptido en el que el aminoácido N terminal es ácido piroglutámico. El péptido que contiene ácido piroglutámico consiste en dos o más (varios) aminoácidos reticulados, por ejemplo, de 2 a 40 aminoácidos, de preferencia de 2 a 30 aminoácidos, de más preferencia de 2 a 20 aminoácidos, de más preferencia aún de 2 a 10, y de más preferencia aún de 2 a 5, de mayor preferencia de 2 a 4 aminoácidos. Los aminoácidos no están particularmente limitados, con la condición de que puedan ser utilizados por los expertos en la técnica para el propósito indicado.

En el procedimiento de la presente invención, un procedimiento para modificar una proteína original a una proteína que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico no está particularmente limitado, con la condición de que la modificación de la proteína pueda llevarse a cabo. Como procedimiento, se pueden citar, por ejemplo, técnicas de ingeniería genética o técnicas químicas.

De acuerdo con las técnicas de ingeniería genética, una proteína original puede ser modificada, por ejemplo, mediante la realización de una adición y/o sustitución de un aminoácido o secuencia de aminoácidos adecuada por ingeniería genética. La modificación de proteínas puede llevarse a cabo por la adición por ingeniería genética de ácido piroglutámico o de un péptido que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico, al extremo N terminal de una proteína original (es decir, una proteína que tiene una actividad de endoglucanasa en la que el extremo N terminal no es ácido piroglutámico). Más particularmente, la adición por medio de ingeniería genética puede comprender, por ejemplo, las etapas de:

(1) añadir un polinucleótido que codifica un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico (tal como ácido glutámico o glutamina) o un polinucleótido que codifica un péptido que tiene el extremo N terminal de un

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aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, al extremo 5' terminal de un polinucleótido que codifica una proteína original, y

(2) expresar el polinucleótido resultante en un huésped en el que puede llevarse a cabo la formación del piroglutamato del aminoácido N terminal.

La modificación de proteínas puede llevarse a cabo por la sustitución por ingeniería genética del aminoácido N terminal o de una región N terminal de una proteína original por ácido piroglutámico o un péptido que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico. Más particularmente, la sustitución por medio de ingeniería genética puede comprender, por ejemplo, las etapas de:

(1)

sustituir el extremo 5' terminal o una región que contiene el mismo de un polinucleótido que codifica una proteína original por un polinucleótido que codifica un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico (tal como ácido glutámico o glutamina) o un polinucleótido que codifica un péptido que tiene el extremo N terminal de un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, y

(2)

expresar el polinucleótido resultante en un huésped en el que puede llevarse a cabo la formación del piroglutamato del aminoácido N terminal.

Como formas de realización mediante el uso de técnicas químicas, se pueden citar, por ejemplo,

(a)

una forma de realización en la que el ácido piroglutámico (o un péptido que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico) se añade directamente al extremo N terminal de una proteína original;

(b)

una forma de realización en la que un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico (o un péptido que tiene el extremo N terminal de un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico) se añade químicamente al extremo N terminal de una proteína original, y a continuación se lleva a cabo químicamente la formación del piroglutamato del aminoácido N terminal; o

(c)

una forma de realización en la que el aminoácido N terminal de una proteína original que tiene el extremo N terminal de un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico se convierte químicamente en ácido piroglutámico.

Procedimiento para añadir ácido piroglutámico o un péptido que contiene ácido piroglutámico al lado N terminal de la celulasa perteneciente a la familia 45

El procedimiento de modificación se ilustrará además por medio de una forma de realización que utiliza celulasa perteneciente a la familia 45. Un procedimiento para añadir ácido piroglutámico o un péptido que contiene ácido piroglutámico al lado N terminal de la celulasa perteneciente a la familia 45 puede llevarse a cabo mediante técnicas de ingeniería genética. En una producción de celulasas de uso común, se puede unir una región codificadora de un polinucleótido que codifica la celulasa deseada de manera operativa entre un promotor y un terminador funcionable en un huésped, tal como un hongo filamentoso, y a continuación puede introducirse la cassette de expresión resultante en el huésped. Además, se puede añadir un polinucleótido que codifica una secuencia señal de secreción funcionable en la célula huésped en la cassette. Cuando se introduce la cassette en la célula huésped, la celulasa deseado es secretada en un medio, y se puede recoger fácilmente. En este caso, puede añadirse un aminoácido deseado al extremo N terminal de la celulasa, mediante la adición de un polinucleótido que codifica el aminoácido inmediatamente secuencia abajo de la secuencia señal de secreción. Además, la modificación del grupo amino del aminoácido N terminal se puede llevar a cabo utilizando una secuencia señal de secreción en un huésped. Por ejemplo, en cbh1 o cbh2 derivadas de Trichoderma viride, o NCE2 o NCE5 derivadas de Humicola insolens, el extremo N terminal es piroglutamato formado, la modificación puede llevarse a cabo mediante el uso de estas secuencias señal para la secreción y la expresión en Trichoderma viride o Humicola insolens. De acuerdo con la forma de realización de preferencia, la celulasa modificada perteneciente a la familia 45 preparada como se describió anteriormente presenta una característica ventajosa, es decir, tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña.

Según otra forma de realización, todo puede ser sintetizado químicamente, dentro del ámbito de los conocimientos técnicos comunes de los expertos en la técnica. En este caso, la síntesis puede llevarse a cabo utilizando parte de una proteína de origen natural.

Proteína de la presente invención

La proteína de la presente invención se prepara mediante la modificación del extremo N terminal de una proteína original que tiene una actividad de endoglucanasa a ácido piroglutámico [por ejemplo, preparada por la obtención de celulasa perteneciente a la familia 45 y la adición de ácido piroglutámico (pQ) o un péptido que contiene ácido piroglutámico a un lado del aminoácido N terminal de la proteína madura de la misma] y tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña. Además, la presente invención incluye una proteína que se puede preparar por el procedimiento descrito anteriormente y tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña.

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Más concretamente, la proteína de la presente invención incluye una proteína seleccionada del grupo que consiste en las siguientes proteínas:

(a)

una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40;

(b)

una proteína modificada que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se han eliminado, sustituido, insertado o añadido en la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, y que tener una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña; y

(c)

una proteína homóloga que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de homología con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, y que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña.

La secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2 es la secuencia de aminoácidos de NCE4 modificada en el extremo N terminal (véase Ejemplo A2) en la que se añadió un péptido que consiste en cinco aminoácidos (N terminal: ácido piroglutámico) al extremo N terminal de la endoglucanasa NCE4 derivada de Humicola insolens MN200-1.

La secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 4 es la secuencia de aminoácidos de STCE1 modificada en el extremo N terminal (véase Ejemplo B2) en la que se sustituyó el aminoácido N terminal (Ala) de la endoglucanasa STCE1 derivada de Staphylotrichum coccosporum IFO 31817 por un péptido que consiste en cuatro aminoácidos (N terminal: ácido piroglutámico).

La secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 38 es la secuencia de aminoácidos de la STCE1 modificada en el extremo N terminal (véase Ejemplo B3) en la que se añadió ácido piroglutámico al extremo N terminal de la endoglucanasa STCE1 derivada de Staphylotrichum coccosporum IFO 31817.

La secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 40 es la secuencia de aminoácidos de la STCE1 modificada en el extremo N terminal (véase Ejemplo B4) en la que se añadió un péptido que consiste en cuatro aminoácidos (N terminal: ácido piroglutámico) al extremo N terminal de la endoglucanasa STCE1 derivada de Staphylotrichum coccosporum IFO 31817.

El término “proteína modificada”, como se utiliza en el presente documento, significa una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o una pluralidad de aminoácidos (por ejemplo, uno o varios aminoácidos) se han eliminado, sustituido, insertar o añadido en la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, y que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña. El número de aminoácidos a modificar, tal como “eliminar, sustituir, insertar o añadir”, es de preferencia de 1 a 30, de más preferencia de 1 a 10, de mayor preferencia de 1 a 6.

Además, la proteína modificada incluye una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos son sustituidos de manera conservadora en la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, y que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña. La expresión “sustitución conservadora”, como se utiliza en el presente documento, significa que uno o varios restos de aminoácidos contenidos en una proteína son sustituidos con diferentes aminoácidos que tienen propiedades químicas similares de modo que las actividades de la proteína no se modifican sustancialmente. Como sustitución conservadora, se pueden citar, por ejemplo, la sustitución de un resto de aminoácido hidrófobo por otro resto de aminoácido hidrófobo, o la sustitución de un resto de aminoácido polar por otro resto de aminoácido polar que tiene la misma carga. Los aminoácidos que tienen propiedades químicas similares y que pueden ser sustituidos de manera conservadora entre sí son conocidos por los expertos en la técnica. Más en particular, como aminoácidos no polares (hidrófobos), se pueden citar, por ejemplo, alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptófano, fenilalanina

o metionina. Como aminoácidos polares (neutros), se pueden citar, por ejemplo, glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina o cisteína. Como aminoácidos básicos que tienen una carga positiva, se pueden citar, por ejemplo, arginina, histidina o lisina. Como aminoácidos ácidos que tienen una carga negativa, se pueden citar, por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico.

La expresión “proteína homóloga”, como se utiliza en el presente documento, significa una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% (de preferencia el 90% o más, de mayor preferencia el 95% o más) de homología (identidad de secuencia) con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, y que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña. La homología como se utiliza en el presente documento se muestra como el valor (identidad) calculado por FASTA3 [Science, 227, 1435-1441 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2498 (1988); http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html], un programa de búsqueda de homología conocido, de conformidad con los parámetros por defecto.

Como se describió anteriormente, en la “proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2” de la presente invención, la porción excepto el péptido N terminal que consiste en cinco aminoácidos deriva de la endoglucanasa NCE4. Además, en la “proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 4, 38

o 40” de la presente invención, la porción excepto el aminoácido o péptido N terminal deriva de la endoglucanasa

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STCE1. Las endoglucanasas NCE4 y STCE1 pertenecen a la familia 45. Como endoglucanasa conocida perteneciente a la familia 45, se pueden citar, por ejemplo, NCE5 derivada del género Humicola (documento WO01/90375).

En las figuras 1 y 2, se muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de la endoglucanasa STCE1 [péptido señal (ID. SEC. Nº 43) y proteína madura (ID. SEC. Nº 44)], la endoglucanasa NCE4 [péptido señal (ID. SEC. Nº 45) y proteína madura (ID. SEC. Nº 46)] y la endoglucanasa NCE5 [péptido señal (ID. SEC. Nº 47) y proteína madura (ID. SEC. Nº 48)]. La figura 1 muestra la alineación de la mitad N terminal, y la Figura 2 muestra la mitad C terminal. El símbolo “*” en las figuras 1 y 2 indica un aminoácido común al de STCE1.

Como se muestra en las figuras 1 y 2, las endoglucanasas pertenecientes a la familia 45 contienen el dominio catalítico (1º a 207º) como un dominio común, y a veces contienen la región conectora (208º a 258º) y/o el dominio de unión a la celulosa (CDB) (259º a 295º). En este sentido, los números entre paréntesis después de los dominios anteriores representan el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos (ID. SEC. Nº 44) de la endoglucanasa STCE1.

En cada región, hay muchos aminoácidos conservadores entre dos o más endoglucanasas en el dominio catalítico y el dominio de unión a la celulosa, pero no se observa ninguna región conservadora notable en la región del conector. Las regiones que contienen muchos aminoácidos conservadores (por ejemplo, el dominio catalítico o el dominio de unión a la celulosa, en particular, el dominio catalítico), o aminoácidos comunes contenidos en las regiones son consideradas regiones o aminoácidos importantes para la actividad enzimática de las endoglucanasas (tales como STCE1 o NCE4). Por lo tanto, cuando se lleva a cabo una modificación de aminoácidos (por ejemplo, supresión, sustitución, inserción y/o adición, en particular, sustitución conservadora) en una región o un aminoácido distinto de regiones o aminoácidos tan importantes, puede obtenerse con una alta posibilidad y sin excesiva experimentación una proteína modificada u homóloga que mantiene la actividad de la enzima.

Además, incluso cuando tiene lugar en las regiones que contienen muchos aminoácidos conservadores, una modificación de un aminoácido o aminoácidos no comunes entre dos o más endoglucanasas a aminoácido(s) diferente(s) [de preferencia aminoácido(s) que son similares y que pueden ser sustituidos de manera conservadora] probablemente podrá mantener la actividad de la enzima. Por lo tanto, por una de tales modificaciones, puede obtenerse con una alta probabilidad y sin excesiva experimentación una proteína modificada u homóloga que mantiene la actividad de la enzima.

En este sentido, aunque uno o más aminoácidos comunes en la región que contiene muchos aminoácidos conservadores se modifican a aminoácido(s) diferente(s), la actividad de la enzima a veces se mantiene. En particular, en una modificación a aminoácido(s) que son similares y que pueden ser sustituidos de manera conservadora, la posibilidad es mayor. La proteína modificada u homóloga de la presente invención incluye una proteína en la que uno o más aminoácidos contenidos en cualquier región, tal como el dominio catalítico, la región conectora o el dominio de unión a la celulosa, se han modificado, con la condición de que presente una actividad de endoglucanasa .

Polinucleótido que codifica la proteína de la presente invención

Se puede proporcionar un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, o una de sus proteínas modificadas u homólogas (a continuación, en el presente documento denominada como la proteína de la presente invención). Cuando se da la secuencia de aminoácidos de una proteína, se puede seleccionar fácilmente una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos, y por lo tanto pueden seleccionarse varias secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de la presente invención. El término “polinucleótido” como se utiliza en el presente documento, incluye ADN y ARN, y resulta de preferencia el ADN.

El polinucleótido incluye un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los siguientes polinucleótidos:

(a)

un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la ID. SEC. Nº 1, 3, 37 o 39;

(b)

un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos en el que uno o varios nucleótidos se han eliminado, sustituido, insertado o añadido en la secuencia de nucleótidos de la ID. SEC. Nº 1, 3, 37 o 39, y que codifica una proteína con una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña; y

(c)

un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la ID. SEC. Nº 1, 3, 37 o 39, y que codifica una proteína con una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña.

En la secuencia de nucleótidos que se describe en el punto anterior (b), el número de nucleótidos a eliminar, sustituir, insertar o añadir, es por ejemplo, de 1 a 90, de preferencia de 1 a 30, de más preferencia de 1 a 18, de mayor preferencia de 1 a 9.

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La expresión “condiciones rigurosas”, como se utiliza en el presente documento, significa las siguientes condiciones. De acuerdo con un protocolo adjunto de un sistema de detección y marcación directa de ADN/ARN ECL (Amersham), después de que un polinucleótido a probar se prehibrida a 42 ºC durante una hora, se añade un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la ID. SEC. Nº 1, 3, 37 o 39, y la hibridación se lleva a cabo a 42 ºC durante 14 a 16 horas. Después de la hibridación, se repite dos veces un tratamiento de lavado con 0,5 X SSC (1 X SSC; citrato de sodio 15 mmol/l, cloruro de sodio 150 mmol/l) con SDS al 0,4% y urea 6 mol/l a 42 ºC durante 20 minutos, y se lleva a cabo dos veces un tratamiento de lavado con 5 X SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos.

El polinucleótido incluye un polinucleótido de origen natural. Además, se puede sintetizar en su totalidad. Por otra parte, la síntesis puede llevarse a cabo utilizando parte del polinucleótido de origen natural. Por lo general, el polinucleótido de la presente invención pueden obtenerse por selección de una biblioteca genómica derivada de un microorganismo deseado según un procedimiento habitual de uso común en la ingeniería genética, por ejemplo, utilizando una sonda de ADN adecuada en base a la información de una secuencia de aminoácidos parcial.

Producción de la proteína de la presente invención

La proteína de la presente invención se pueden producir en células huésped mediante la transformación de la célula huésped con una molécula de polinucleótido (en particular, en forma de vector de expresión) que comprende un fragmento de polinucleótido que codifica la proteína de manera que la molécula de polinucleótido pueda ser replicada y el gen se pueda expresar en la célula huésped.

Se proporciona un vector de expresión que comprende un fragmento de polinucleótido que codifica la proteína de la presente invención, para que el fragmento de polinucleótido pueda ser replicado y la proteína se pueda expresar en un microorganismo huésped.

El vector de expresión se puede construir en base a un vector auto-replicante (tal como un plásmido), que existe como un elemento extracromosómico y que puede replicarse de manera independiente de la replicación de los cromosomas. Como alternativa, el vector de expresión puede ser un vector que está integrado en el cromosoma del microorganismo huésped y que se replica junto con los cromosomas, cuando el huésped se transforma con el vector. La construcción del vector de la presente invención puede llevarse a cabo por procedimientos habituales o procedimientos comúnmente utilizados en la ingeniería genética.

Para expresar una proteína que tiene una actividad deseada mediante la transformación de un microorganismo huésped con el vector de expresión de la presente invención, es preferible que el vector de expresión contenga, por ejemplo, un polinucleótido capaz de controlar la expresión, o un marcador genético para seleccionar los transformantes, además del fragmento de polinucleótido.

Como polinucleótido capaz de regular la expresión genética, se pueden utilizar varias señales para la regulación de la transcripción o de la traducción, tales como un promotor, un terminador o un polinucleótido que codifica un péptido señal para la secreción. La unión de estos polinucleótidos y la inserción de los mismos a un vector pueden llevarse a cabo por un procedimiento habitual.

El promotor no está particularmente limitado, con la condición de que muestre actividad transcripcional en un microorganismo huésped. El promotor se puede obtener como un polinucleótido que regula la expresión de un gen que codifica una proteína igual o diferente de la que deriva del microorganismo huésped. Por ejemplo, se puede usar un promotor tal como un operón de lactosa o un operón de triptófano en Escherichia coli; un promotor de un gen de la alcohol deshidrogenasa, un gen de la fosfatasa ácida, un gen de utilización de la galactosa o un gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa en una levadura; y un promotor de un gen de la a amilasa, un gen de la glucoamilasa, un gen de la celobiohidrolasa o un gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa en un hongo filamentoso.

El péptido señal no está particularmente limitado, con la condición de que contribuya a la secreción de proteínas en un microorganismo huésped. El péptido señal se puede obtener como un polinucleótido derivado de un gen que codifica una proteína igual o diferente de la que deriva del microorganismo huésped.

El marcador de selección puede ser adecuadamente seleccionado de acuerdo con el procedimiento de selección de transformantes. Como marcador de selección, en la presente invención se puede utilizar por ejemplo, un gen de resistencia a fármacos o un gen que complementa una mutación auxótrofa. Cuando el huésped es una bacteria, se puede utilizar por ejemplo, un gen de resistencia a la ampicilina, un gen de resistencia a la kanamicina o un gen de resistencia a la tetraciclina. Cuando el huésped es una levadura, se puede utilizar por ejemplo, un gen de biosíntesis de triptófano (trpI, trpC), un gen de biosíntesis de uracilo (ura3), un gen de biosíntesis de leucina (leu2) o un gen de biosíntesis de histidina (his3). Cuando el huésped es un hongo filamentoso, se puede utilizar por ejemplo, un gen de resistencia a la destomicina, un gen de utilización de nitratos (niaD), un gen de biosíntesis de arginina (argB), un gen de biosíntesis de uracilo (pyr4), un gen resistencia a la higromicina, un gen de resistencia a bialafos, un gen de resistencia a la bleomicina o un gen de resistencia a la aureobasidina.

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Un sistema huésped-vector que puede ser utilizado en la presente invención no está particularmente limitado. Por ejemplo, se puede usar un sistema que utiliza E. coli, Actinomycetes, levaduras u hongos filamentosos, o un sistema para la expresión de una proteína de fusión utilizando tales microorganismos. Cuando se utiliza una levadura como huésped, se pueden citar, por ejemplo, un microorganismo que pertenece al género Saccharomyces, Hansenula o Pichia, de preferencia Saccharozrtyces cerevisiae. Cuando se utiliza un hongo filamentoso como huésped, se puede utilizar cualquier hongo filamentoso, de preferencia un microorganismo perteneciente al género Humicola, Trichoderma, Aspergillus, Acremonium o Fusarium, de más preferencia un microorganismo perteneciente al género Humicola o Trichoderma. Más concretamente, se pueden utilizar Humicola insolens, Humicola thermoidea, Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Staphylotrichum coccosporum, Aspergillus niger, Aspergillizs oryzae, Fusarium oxysporum o Acremonium cellulolyticus, de preferencia Humicola insolens o Trichoderma viride.

La transformación de un microorganismo con el vector de expresión puede llevarse a cabo según un procedimiento habitual, tal como un procedimiento que utiliza iones de calcio, un procedimiento que utiliza iones de litio, un procedimiento de electroporación, un procedimiento con PEG, un procedimiento de Agrobacterium o un procedimiento con pistola de partículas, y se puede seleccionar un procedimiento adecuado según el huésped a transformar.

Se cultiva el transformante, y el cultivo resultante se utiliza para obtener la proteína de la presente invención de interés. El transformante se puede cultivar según un procedimiento habitual por medio de selección adecuada, por ejemplo, un medio o condiciones del cultivo.

El medio se puede complementar con, por ejemplo, fuentes de carbono o fuentes de nitrógeno que puede ser anabolizadas o utilizadas, respectivamente, por el transformante de la presente invención, sales inorgánicas, varias vitaminas, varios aminoácidos tales como ácido glutámico o asparagina, oligonutrientes, tales como nucleótidos, o agentes de selección tales como antibióticos. Además, se pueden añadir de manera adecuada sustancias orgánicas y/o inorgánicas que ayudan al crecimiento del transformante de la presente invención, o promueven la producción de la proteína de la presente invención. Además, de ser necesario, se puede utilizar un medio natural o un medio sintético que contenga adecuadamente otros nutrientes.

Se puede utilizar cualquier tipo de fuente de carbono y fuente de nitrógeno en el medio, con la condición de que puedan ser utilizadas por el transformante de la presente invención. Como fuente de carbono anabolizable, se pueden utilizar varios hidratos de carbono, por ejemplo, sacarosa, almidón, glicerina, glucosa, fructosa, maltosa, lactosa, celulosa, celobiosa, dextrina, aceites animales o aceites vegetales, o hidrolizados de los mismos. En general, la concentración de los mismos en el medio es de preferencia del 0,1% al 5%. Como fuente de nitrógeno utilizable, se pueden usar por ejemplo, componentes, animales o vegetales o extractos de los mismos, tales como peptona, extracto de carne, licor de maceración de maíz o polvo de soja desgrasada, sales de amonio de ácidos orgánicos tales como sales de amonio del ácido succínico o sales de amonio del ácido tartárico, urea u otros varios compuestos que contienen nitrógeno, tales como ácidos inorgánicos u orgánicos. Como sales inorgánicas, se pueden utilizar adecuadamente por ejemplo, las que pueden producir sodio, potasio, calcio, magnesio, cobalto, cloro, ácido fosfórico, ácido sulfúrico u otros iones.

Se puede utilizar adecuadamente cualquier medio que contenga otros componentes, por ejemplo, células, exudados

o extractos de microorganismos tales como levaduras o polvos finos de plantas, con la condición de que no interfieran con el crecimiento de los transformantes de la presente invención ni con la producción y acumulación de la proteína de la presente invención. Cuando se cultiva una cepa mutante que tiene un requerimiento nutricional, por lo general se añade al medio una sustancia para satisfacer sus requerimientos nutricionales. En este sentido, es posible que tal nutriente no deba añadirse necesariamente cuando se utiliza un medio que contiene sustancias naturales.

Las condiciones de cultivo, tales como el componente del medio, la fluidez del medio, la temperatura de incubación, la velocidad de agitación o la tasa de aireación, se pueden seleccionar y controlar adecuadamente según el transformante a utilizar y las condiciones externas a fin de obtener los resultados preferibles. Si se formara espuma en un medio líquido, puede utilizarse adecuadamente un agente antiespumante, tal como aceites de silicona, aceites vegetales, aceites minerales o tensioactivos.

La proteína de la presente invención acumulada en el cultivo resultante se encuentra en el transformante y en el filtrado del cultivo. Por consiguiente, es posible recuperar la proteína de la presente invención, tanto del filtrado del cultivo como de las células transformantes mediante la separación del cultivo en cada fracción por medio de centrifugación.

La proteína de la presente invención se puede recuperar del filtrado del cultivo según un procedimiento habitual. Los procedimientos de recuperación de la proteína de la presente invención del cultivo se pueden realizar de manera individual, en combinación en un determinado orden, o en varias veces. Por ejemplo, se pueden utilizar la extracción por filtración, la centrifugación, la diálisis, la concentración, el secado, la congelación, la adsorción y la desorción, también medios para la separación basada en la diferencia de solubilidad en diversos disolventes (tales como la precipitación, el desalado, la cristalización, la recristalización, la disolución inversa o la cromatografía).

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Además, la proteína de la presente invención se puede obtener a partir del cultivo dentro del transformante. Por ejemplo, la extracción del cultivo (por ejemplo, por tratamiento de molienda o alteración irreversible por presión), la recuperación (por ejemplo, filtración o centrifugación) o la purificación (por ejemplo, desalado o precipitación del disolvente) puede llevarse a cabo utilizando un procedimiento habitual.

La sustancia bruta resultante puede ser purificada según un procedimiento habitual, por ejemplo, por medio de una cromatografía en columna utilizando un vehículo tal como el dextrano, la celulosa, agarosa, polímeros sintéticos o gel de sílice. Se puede obtener una proteína pura de la presente invención de interés a partir del cultivo del transformante utilizando los procedimientos anteriormente mencionados, ya sea por separado o en una combinación adecuada.

Como se describió anteriormente, se puede proporcionar el proceso para la producción de la nueva proteína de la presente invención. El cultivo del transformante (incluyendo las condiciones de cultivo) se puede realizar de una manera sustancialmente similar al cultivo del huésped original utilizado para preparar el transformante. Como procedimiento para la recuperación de la proteína de interés después del cultivo del transformante, se pueden llevar a cabo los procedimientos de uso común.

Cepas depositadas

Se depositó la cepa de Escherichia coli JM109 transformada con el vector de expresión pEGD01 de la presente invención (FERM BP-5973) en el país en el Instituto Nacional Depositario de Organismos de Patentes Internacionales de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada [(Nombre anterior) Instituto Nacional de Biocencia y Agencia de Tecnología Humana de Ciencia y Tecnología Industrial (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón)] el 12 de julio de 1996, y fue trasladada a un depósito internacional el 13 de junio de 1997. El número de depósito internacional (un número entre paréntesis [] después del número de depósito internacional se incluye un número de depósito nacional) es FERM BP-5973 [FERM P-15729].

Se depositó la cepa de Escherichia coli JM109 transformada con el vector de expresión pMKD01 de la presente invención (FERM BP-5974) en el país en el Instituto Nacional Depositario de Organismos de Patentes Internacionales de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada [(Nombre anterior) Instituto Nacional de Biocencia y Agencia de Tecnología Humana de Ciencia y Tecnología Industrial (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón)] el 12 de julio de 1996, y fue trasladada a un depósito internacional el 13 de junio de 1997. El número de depósito internacional (un número entre paréntesis [] después del número de depósito internacional se incluye un número de depósito nacional) es FERM BP-5974 [FERM P-15730].

Se depositó la cepa de Escherichia coli JM109 transformada con el vector de expresión pCB1-M2XR (FERM BP6045) en el país en el Instituto Nacional Depositario de Organismos de Patentes Internacionales de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada [(Nombre anterior) Instituto Nacional de Biocencia y Agencia de Tecnología Humana de Ciencia y Tecnología Industrial (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón)] el 9 de septiembre de 1996, y fue trasladada a un depósito internacional el 11 de agosto de 1997. El número de depósito internacional (un número entre paréntesis [] después del número de depósito internacional se incluye un número de depósito nacional) es FERM BP-6045 [FERM P-15840]. Al respecto, el plásmido pCB1-M2 de la presente invención no solo se puede obtener por el procedimiento descrito en los EJEMPLOS, sino también por auto-unión del plásmido pCB1-M2XR previamente digerido con la enzima de restricción XbaI.

Se depositó la cepa de Humicola insolens MN200-1 (FERM BP-5977), que puede ser utilizada como huésped para el vector de expresión de la presente invención, en el país en el Instituto Nacional Depositario de Organismos de Patentes Internacionales de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada [(Nombre anterior) Instituto Nacional de Biocencia y Agencia de Tecnología Humana de Ciencia y Tecnología Industrial (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón)] el 15 de julio de 1996, y fue trasladada a un depósito internacional el 13 de junio de 1997. El número de depósito internacional (un número entre paréntesis [] después del número de depósito internacional se incluye un número de depósito nacional) es FERM BP-5977 [FERM P-15736].

Se depositó la cepa de Trichoderma viride MC300-1 (FERM BP-6047), que puede ser utilizada como huésped para el vector de expresión de la presente invención, en el país en el Instituto Nacional Depositario de Organismos de Patentes Internacionales de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada [(Nombre anterior) Instituto Nacional de Biocencia y Agencia de Tecnología Humana de Ciencia y Tecnología Industrial (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón)] el 9 de septiembre de 1996, y fue trasladada a un depósito internacional el 11 de agosto de 1997. El número de depósito internacional (un número entre paréntesis [] después del número de depósito internacional se incluye un número de depósito nacional) es FERM BP-6047 [FERM P-15842].

Se depositó la cepa de Escherichia coli DH5a transformada con el vector de expresión pUC118-STCEex (FERM BP10127) en el país en el Instituto Nacional Depositario de Organismos de Patentes Internacionales de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón) el 1 de diciembre de 2003, y fue trasladado a un depósito internacional el 15 de septiembre de

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2004. El número de depósito internacional (un número entre paréntesis [] después del número de depósito internacional se incluye un número de depósito nacional) es FERM BP-10127 [FERM P-19602]. Al respecto, el plásmido pUC118-STCEex es un plásmido obtenido por la inserción del gen de STCE en el sitio BamHI del plásmido pUC118. El gen de la endoglucanasa STCE1 presente en el fragmento BamHI contiene un intrón y tiene la secuencia de la ID. SEC. Nº 5.

Ejemplos

La presente invención ahora se ilustrará con más detalle por medio de los siguientes ejemplos, pero no significa que esté limitada a los mismos.

Ejemplo A1: Construcción de vectores de expresión para expresar celulasa modificada en su extremo N terminal y celulasa de tipo natural en Humicola insolens

(1) Construcción del vector de expresión pMKD01 para expresar celulasa modificada en su extremo N terminal

El plásmido pUC118 (Takara Bio) fue digerido utilizando la enzima BamHI. Se generaron extremos romos en el fragmento resultante con un DNA blunting kit (Takara Bio) y se auto-unió con un DNA ligation kit (Takara Bio) para obtener pUC118-BN. El pUC118-BN fue digerido con SphI, se generaron extremos romos y se auto-unió para obtener pUC118BSN. A continuación, se obtuvo un fragmento PstI-XbaI de 3,4 kb que comprendía el gen de celulasa NCE2 de Humicola insolens MN200-1 (FERM BP-5977) según el procedimiento descrito en la Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) Nº 8-126492. El fragmento se unió con pUC118BSN previamente digerido con la misma enzima de restricción para obtener pUC118BSN-PX. Se introdujo la mutación dirigida al sitio en pUC118BSN-PX con un sistema de mutagénesis in vitro Sculptor (Amersham Bioscience) para obtener el plásmido pM21. Como oligonucleótidos para la mutagénesis, se usaron los oligonucleótidos MNC-02 y MNC-03.

MNC-02: 5'-GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAATG-3' (SEC. Nº 6)

MNC-03: 5'-TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3' (SEC. Nº 7)

El plásmido pM21 fue digerido utilizando la enzima BamHI y se unió con un fragmento de PCR digerido con BamHI de un gen de celobiohidrolasa (NCE3) derivado de Humicola insolens MN200-1 para obtener el plásmido pKM04. El fragmento de PCR de NCE3 se amplificó utilizando ADN genómico (documento WO98/03640) de Humicola insolens MN200-1 (FERM BP-5977) como molde y los siguientes cebadores MKA-05 y MKA-06.

MKA-05: 5'-GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAGG-3' (SEC. Nº 8)

MKA-06: 5'-TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCAC-3' (SEC. Nº 9)

A continuación, se utilizaron un promotor y un terminador (Mullaney, EJ y col., Mol. Gen. Genet., 199, 37-45, 1985) del gen trpC derivado de Aspergillus nidulans para preparar un gen capaz de expresar un gen de resistencia a la destomicina en Humicola insolens. El gen resultante se unió con el plásmido pKM04 previamente digerido con XbaI para construir el vector de expresión pMKD01 (FERM BP-5974) para expresar la celulasa modificada en el extremo N terminal. En pMKD01, se introdujeron los sitios de reconocimiento de BamHI a 10 pb secuencia abajo del extremo N terminal de la proteína madura del gen de NCE2 y a 3 pb secuencia abajo del codón de parada del mismo, y por lo tanto se pueden añadir cinco restos de aminoácidos al extremo N terminal de una celulasa deseada perteneciente a la familia 45.

(2) Construcción del vector de expresión pJD01 para expresar la celulasa de tipo natural

Se introdujo la mutación dirigida al sitio utilizando el oligonucleótido pMN-Bam en el plásmido pM21 obtenido en el punto anterior (1) para obtener el plásmido pM21-m-A1. pMN-Bam:

5'-GGTCAAACAAGTCTGTGCGGATCCTGGGACAAGATGGCCAAGTTCTTCCTTAC-3' (SEC. Nº: 12) El plásmido pM21-m-A1 fue digerido con las enzimas de restricción HindIII y BamHI, y se recuperó el fragmento resultante de aproximadamente 1 kb. A continuación, el pMKD01 obtenido en el Ejemplo A1(1) fue digerido con HindIII y BamHI, y se recuperó un fragmento de aproximadamente 7 kb. Estos fragmentos se unieron para obtener el

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plásmido pJD01. En este vector, se introdujeron los sitios de reconocimiento de BamHI a 15 pb secuencia arriba del sitio de iniciación de la traducción del gen de NCE2 y a 3 pb secuencia abajo del codón de parada del mismo, y por consiguiente se expresó una celulasa deseada perteneciente a la familia 45 desde el punto de iniciación de la transcripción.

(1) Construcción de los vectores de expresión

Como un vector de expresión para NCE4 de tipo natural, se unió la región codificadora del gen de NCE4 con pJD01 obtenido en el Ejemplo A1(2) para la construcción del pN2EX-N4. En primer lugar, se amplificó la región codificadora del gen de NCE4 por medio de PCR utilizando ADN genómico de Humicola insolens MN200-1 como molde y NCE4-Ne y NCE4-Ce como cebadores. El producto de la PCR resultante, de aproximadamente 0,9 kpb, se digirió con BamHI y se unió con pJD01 previamente digerido con la misma enzima de restricción para la construcción del pN2EX-N4.

NCE4-Ne: 5'-GGGGGGATCCTGGGACAAGATGCGTTCCTCCCCTCTC-3' (SEC. Nº 15)

NCE4-Ce: 5'-GGGGGGATCCCTGCGTTTACAGGCACTGATGG-3' (SEC. Nº 16)

Como un vector de expresión para NCE4 modificada en su extremo N terminal, se unió la región codificadora de la proteína madura, en la que se había eliminado la secuencia señal para la secreción en el gen de NCE4, con el pMKD01 (FERM BP-5974) obtenido en el Ejemplo A1(1) para la construcción del pEGD01 (FERM BP-5973). En primer lugar, se amplificó la región codificadora de la parte de la proteína madura del gen de NCE4 por medio de PCR utilizando ADN genómico de Humicola insolens MN200-1 como molde y NCE4-Ns y NCE4-Cs como cebadores. El producto de PCR resultante, de aproximadamente 0,8 kpb, se digirió con BamHI y se unió con pMKD01 previamente digerido con la misma enzima de restricción para la construcción del pEGD01.

NCE4-Ns: 5'-CCGGTGTTGGCCGGATCCGCTGATGGCAAG-3' (SEC. Nº 17)

NCE4-Cs: 5'-TAAGGCCCTCAAGGATCCCTGCGTCTACAG-3' (SEC. Nº 18)

(2) Transformantes que contienen NCE4 de tipo natural o NCE4 modificada en su extremo N terminal

Se cultivó Humicola insolens MN200-1 en un medio S (glucosa al 3,0%, extracto de levadura al 2,0%, polipeptona al 0,1%, cloruro de calcio al 0,03% y sulfato de magnesio al 0,03%; pH 6,8) a 37 ºC durante 24 horas. Los micelios resultantes se recogieron por centrifugación, se lavaron con sacarosa 0,5 mol/l y se suspendieron en 0,5 mol/l de disolución de sacarosa que contenía -glucuronidasa 3 mg/ml (Sigma), quitinasa 1 mg/ml y zymolyase 20T 1 mg/ml (Seikagaku Corp.). La suspensión se agitó suavemente a 30 ºC durante 60 a 90 minutos para generar protoplastos. Los protoplastos resultantes se recogieron por filtración y centrifugación, se lavaron con un tampón SUTC (sacarosa 0,5 mol/l, cloruro de calcio 10 mmol/l y Tris-HCl 10 mmol/l, pH 7,5) y se resuspendieron en SUTC para preparar una suspensión de protoplastos.

A 100 µl de la suspensión de protoplastos, se le añadieron 10 µl de cada disolución de ADN (pEGD01 o pN2EX-N4). Tras dejar en reposo cada uno en hielo durante 5 minutos, se añadieron 400 µl de una disolución de PEG (polietilenglicol 4000 al 60%, cloruro de calcio 10 mmol/l y Tris-HCl 10 mmol/l, pH 7,5) y todo se dejó en reposo sobre hielo durante 20 minutos. Después de lavar la suspensión de protoplastos resultante con el tampón SUTC, se cubrió la suspensión de protoplastos con un medio YMG (glucosa al 1%, extracto de levadura al 0,4%, extracto de malta al 0,2% y agar al 1%, pH 6,8) que contenía higromicina B 200 µg/ml junto con agar blando YMG. La placa se incubó a 37 ºC durante 5 días para obtener los transformantes como colonias.

(3) Comparación de las actividades de endoglucanasa de NCE4 de tipo natural y NCE4 modificada en su extremo N terminal en los sobrenadantes de los cultivos

Los transformantes resultantes se cultivaron según el procedimiento descrito en el documento WO98/03667, para obtener los sobrenadantes de los cultivos. Los sobrenadantes de los cultivos se sometieron a SDS-PAGE para seleccionar los sobrenadantes de cultivo en los que se detectaba con claridad la banda de NCE4 de aproximadamente 43 kDa. Se midieron las actividades de endoglucanasa en el sobrenadante del cultivo a pH 10 en

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ausencia y con presencia de LAS, y se compararon los grados de reducción en la actividad en presencia de LAS. Los resultados se muestran en la Tabla 3. En la tabla 3, se representan las actividades de endoglucanasa por medio de porcentajes considerando como 100 la actividad de endoglucanasa a pH 10.

Tabla 3

Vector de expresión EGU (%) Sin LAS Con LAS

NCE de tipo natural pN2EX-N4 100 27,1 NCE modificada en su extremo N terminal pEGD01 100 55,6

Como resultado, el sobrenadante del cultivo obtenido a partir del transformante de NCE4 modificada en su extremo N terminal mostró una pequeña reducción de la actividad en presencia de LAS. Tras una comparación de las actividades de endoglucanasa en presencia de LAS, se encontró que la actividad de endoglucanasa de NCE4 modificada en su extremo N terminal fue 2,1 veces mayor que la de NCE4 de tipo natural. Además, la actividad de endoglucanasa de Humicola insolens MN200-1 representó aproximadamente el 4% de los transformantes, por consiguiente se encontró que casi todas las actividades de endoglucanasa derivaron de las enzimas recombinantes expresadas por los vectores de expresión incorporados.

(4) Análisis de las secuencias de aminoácidos del extremo N terminal de NCE4 de tipo natural y NCE4 modificada en su extremo N terminal

Los sobrenadantes de los cultivos de los transformantes anteriores se sometieron a SDS-PAGE y las proteínas sometidas a electroforesis fueron transferidas eléctricamente a una membrana de PVDF (Immobilon-PSQ, Millipore). Las bandas de NCE4 de aproximadamente 43 kDa se recortaron de la mancha y se procesaron con el secuenciador Protein Sequencer Model 492 (Applied Biosystems) para analizar las secuencias de aminoácidos.

Como resultado, se confirmó que la secuencia de NCE4 de tipo natural obtenida del transformante pN2EX-N4 era coherente con la secuencia de ADN de NCE4 derivada de Humicola insolens MN200-1 descrita en el documento WO98/03667. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos de NCE4 modificada en su extremo N terminal obtenida a partir del transformante de pEGD01 no pudo determinarse en el procedimiento anterior. Se utilizó una piroglutamato aminopeptidasa Pfu (Takara Bio) para eliminar el extremo N terminal modificado a partir de NCE4 modificada en su extremo N terminal, y a continuación se determinó el aminoácido (SEC. Nº 2).

Los resultados se resumieron en la Tabla 4, para comparar los aminoácidos del extremo N terminal y las secuencias de aminoácidos de extremo N terminal en NCE4 de tipo natural y en NCE4 con el extremo N terminal añadido, y se confirmó a partir de los resultados que cada NCE4 tenía la secuencia de aminoácidos del extremo N terminal esperada del correspondiente vector de expresión construido.

Tabla 4

Aminoácido en el extremo N Secuencia de aminoácidos del extremo N terminal terminal

NCE4 de tipo natural

Alanina (no modificado) ADGKSTR (SEC. Nº 19)

NCE4 modificada en su extremo N

Ácido piroglutámico pQNCGSADGKSTR (SEC. Nº 20)

terminal

(modificado)

Ejemplo B1: Construcción de vectores de expresión para Trichoderma viride para expresar celulasa modificada en su extremo N terminal y celulasa de tipo natural

(1) Construcción de los vectores de expresión

A partir de un fragmento de PstI de 7 kb que contenía el gen cbh1 derivado de Trichoderma viride MC300-1 (obtenido según el documento WO98/11239) se clonaron un fragmento de HindIII de aproximadamente 3,1 kb que contenía una región promotora de cbh1 y un fragmento de SalI de 2,7 kb que contenía una región terminadora de cbh1 en el plásmido pUC119 para construir el plásmido pCB1-H4 y el plásmido pCB1-S1, respectivamente. Se infectó E. coli JM109 que contenía cada plásmido resultante con el fago ayudante M13KO7 para obtener cada ADN de hebra única. A los ADN de hebra única resultantes de los plásmidos pCB1-H4 y pCB1-S1 como moldes, se hibridaron oligonucleótidos fosforilados CBN-Stu y CBC-Xho, y se introdujeron mutaciones con un sistema de mutagénesis in vitro Sculptor (Amersham Bioscience), para la construcción de los plásmidos pCB1H4-19 y pCB1S117, respectivamente. Se unió un fragmento de aproximadamente 6 kb, que se había obtenido mediante la digestión del plásmido pCB1H4-19 con XbaI y XhoI, con un fragmento de aproximadamente 1,2 kb, que se había sido obtenido por digestión del plásmido pCB1S1-17 con XbaI y posteriormente sometiéndolo a digestión parcial con XhoI, para la construcción del pCB1-M.

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CBN-Stu: 5'-GATACATGATGCGCAGGCCTTAGTCGACTAGAATGC-3' (SEC. Nº 21)

CBC-Xho: 5'-GATCCTCAAGCTTTTGCTCGAGTACCTTACAAGCAC-3' (SEC. Nº 22)

A continuación, se clonó un fragmento de aproximadamente 2,7 kb, obtenido por digestión del pCB1-M con SalI, en el plásmido pUC119 para construir el plásmido pCB1-Salm. Al ADN de hebra única obtenido del plásmido pCB1-Salm se le hibridaron los oligonucleótidos fosforilados CB1-SmSph, CB1-Bam, y CB1-Pst, y se introdujeron las mutaciones con un sistema de mutagénesis in vitro Sculptor.

CB1-SmSph: 5'-GGAGGGTGCATGCCGACTGAGCCCGGGCAGTAGCC-3' (SEC. Nº 23)

CB1-Bam: 5'-GCCGGGAGAGGATCCAGTGGAGG-3' (SEC. Nº 24)

CB1-Pst: 5'-GCTCGAGTACCTTACTGCAGGCACTGAGAG-3' (SEC. Nº 25)

A continuación, el plásmido pUC118 fue digerido utilizando las enzimas XbaI y EcoRI, se generaron extremos romos con el DNA blunting kit y se auto-unió para construir el plásmido pUC118-SBN. Al pUC118-SBN digerido con HindIII y SalI, se le insertó el fragmento del promotor de cbh1 de aproximadamente 1,4 kb previamente digerido con las mismas enzimas de restricción. El plásmido resultante fue digerido con SalI, y se unió con la región codificadora de cbh1 con las mutaciones introducidas y la región terminadora de aproximadamente 2,8 kb, para la construcción del pCB1-M2. Las mutaciones introducidas (excluyendo la mutación de BamHI) se muestran en la Tabla 5.

(1) Construcción de los vectores de expresión

Como un vector de expresión para STCE1 de tipo natural, se unió la región codificadora del gen de STCE1 con el plásmido pCB1-M2 obtenido en el Ejemplo B1 para la construcción del pCB-Ste.

En primer lugar, se amplificó la región codificadora del gen de STCE1 por medio de PCR utilizando el plásmido pUC118-STCEex (FERM BP-10127) como molde y la combinación de cebadores STCE1-TNERV y STCE1-TCET22I. El producto resultante de la PCR de aproximadamente 1 kpb se digirió con EcoRV y EcoT22I, y se unió con pCB1-M2 previamente digerido con StuI y PstI para la construcción del PCB-Ste.

STCE1-TNERV: GGGGATATCGCGCATCATGCGTTCCTCCCCCGTCCTC (SEC. Nº 30)

STCE1-TCET22I: GGGATGCATTTAAAGGCACTGCGAGTACCAGTC (SEC. Nº 31)

Como un vector de expresión para STCE1 modificada en el extremo N terminal, la región codificadora de la proteína madura, en la que se había eliminado la secuencia señal para la secreción en el gen de STCE1, se unió con pCB1-M2 obtenido en el Ejemplo B1 para la construcción del PCB-Sts.

En primer lugar, se amplificó la región codificadora de la proteína madura del gen de STCE1 por medio de PCR utilizando el plásmido pUC118-STCEex (FERM BP-10127) como molde y STCE1-TmNSph y STCE1-TCET22I como cebadores. El producto de la PCR resultante de aproximadamente 1 kpb fue digerido con SphI y EcoT22I, y se unió con pCB1-M2 previamente digerido con SphI y PstI para la construcción del PCB-SS.

STCE1-TmNSph: GGGGCATGCGATGGCAAGTCGACCCGCTAC (SEC. Nº 32)

(2) Generación de la cepa 2 de Trichoderma viride

Se irradió una suspensión de esporas (aproximadamente 109 UFC/ml) de Trichoderma viride MC300-1 (FERM BP6047) con UV de dos lámparas UV colocadas a una altura de 30 cm por encima de la misma, mientras que se agitaba suavemente. La suspensión se extendió en un medio de selección y se cultivó a 28 ºC durante 7 días. Las

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cepas cultivadas se seleccionaron obteniéndose la cepa 2 de Trichoderma viride que mostraba requerimiento de uracilo.

Al respecto, el medio de selección era un medio mínimo [dihidrogenofosfato de potasio al 0,2%, sulfato de amonio al 0,4%, urea al 0,03%, sulfato de magnesio heptahidratado al 0,03%, cloruro de calcio al 0,03%, glucosa al 0,5%, agar al 2,5% y oligoelementos al 0,01% (preparados por la disolución de 5 mg de sulfato de hierro heptahidratado, sulfato de manganeso heptahidratado 1,56 mg, sulfato de cinc heptahidratado 1,4 mg y cloruro de cobalto 2 mg en 1 litro de agua)] suplementado con uridina 10 µg/ml y ácido 5-fluoroorótico 1 mg/ml.

(3) Transformantes que contienen STCE1 de tipo natural o STCE1 modificada en su extremo N terminal

Se transformó Trichoderma viride con pCB-Ste o pCB-Sts obtenidos en el Ejemplo B2(1), mediante la realización de un procedimiento de co-transformación utilizando la cepa 2 de Trichoderma viride obtenida en el Ejemplo B2(2) y el plásmido marcador pPYR4 que contenía el gen pyr4 derivado de Neurospora crassa, para obtener los transformantes como cepas cultivadas en el medio mínimo.

En primer lugar, se inoculó la cepa 2 de Trichoderma viride en un matraz cónico de 200 ml que contenía 50 ml de un medio de formación de micelios [extracto de levadura al 1%, extracto de malta al 1%, polipeptona al 2%, glucosa al 2,5%, hidrogenofosfato dipotásico al 0,1%, sulfato de magnesio heptahidratado al 0,05% y uridina al 0,0001% (pH 7,0)] y se cultivó a 28 ºC durante 2 días. Las células resultantes se recogieron por centrifugación, se lavaron con sacarosa 0,5 mol/l y se suspendieron en disolución de sacarosa 0,5 mol/l que contenía -glucuronidasa 3 mg/ml (Sigma), quitinasa 1 mg/ml y zymolyase 20T 1 mg/ml (Seikagaku Corp.). La suspensión se agitó suavemente a 30 ºC durante 60 a 90 minutos para generar protoplastos. Los protoplastos resultantes se recogieron por filtración y centrifugación, se lavaron con tampón SUTC y se resuspendieron en SUTC para preparar una suspensión de protoplastos.

A 100 µl de la suspensión de protoplastos, se le añadieron 10 µl de cada disolución de ADN (pCB-Ste o pCB-Sts). Tras dejar cada una en reposo sobre hielo durante 5 minutos, se añadieron 400 µl de la disolución de PEG, y se dejó todo en reposo sobre hielo durante 20 minutos. Tras lavar la suspensión de protoplastos resultante con el tampón SUTC, se cubrió el medio mínimo que contenía 0,5 mol/l de sacarosa con la suspensión de protoplastos junto con agar blando. La placa se incubó a 28 ºC durante 5 días y a continuación las colonias que se habían desarrollado fueron transferidas al medio mínimo, para obtener los transformantes como colonias desarrolladas en el mismo.

(4) Comparación de las actividades de endoglucanasa de STCE1 de tipo natural y STCE1 modificada en su extremo N terminal en los sobrenadantes de los cultivos

Los transformantes resultantes se cultivaron según el procedimiento descrito en el documento WO98/11239, para obtener los sobrenadantes de cultivo. Los sobrenadantes de los cultivos se sometieron a SDS-PAGE, para seleccionar los sobrenadantes de cultivo en los que se detectaba con claridad la banda de STCE1 de aproximadamente 45 kDa. Se midieron las actividades de endoglucanasa en los sobrenadantes de los cultivos a pH 10 en ausencia y con presencia de LAS, y se compararon los grados de reducción de la actividad en presencia de LAS. Los resultados se muestran en la Tabla 6. En la Tabla 6, se representan las actividades de endoglucanasa por medio de porcentajes considerando como 100 la actividad de endoglucanasa a pH 10.

Tabla 6

Vector de expresión EGU (%) Sin LAS con LAS

STCE1 de tipo natural pCB-Ste 100 14,5 STCE1 modificada en su extremo N terminal pCB-Sts 100 25,9

Como resultado, al comparar las actividades de endoglucanasa en presencia de LAS, se encontró que la actividad de endoglucanasa de STCE1 modificada en su extremo N terminal fue aproximadamente 1,8 veces superior a la de STCE1 de tipo natural. Además, no se detectó la actividad de endoglucanasa de la cepa 2 de Trichoderma viride, y por lo tanto se encontró que las actividades de endoglucanasa derivaban de las enzimas recombinantes expresadas por los vectores de expresión incorporados.

(5) Análisis de secuencias de aminoácidos del extremo N terminal de STCE1 de tipo natural y STCE1 modificada en su extremo N terminal

A partir de cada sobrenadante de cultivo de los transformantes anteriores, se preparó una disolución de los mismos que contenía Tris-HCl 0,05 mol/l (pH 8,0) / sulfato de sodio 1 mol/l que se adsorbió en un lecho de igual volumen (BV) de TOYOPEARL Butil-650S (Tosoh Corporation). Los vehículos se lavaron con tres BV de Tris-HCl 0,05 mol/l (pH 8,0) / sulfato de sodio 1 mol/l para eliminar los componentes no adsorbidos. La elución se realizó con tres BV de Tris-HCl 0,05 mol/l (pH 8,0) / sulfato de sodio 0,5 mol/l, y la disolución eluida se concentró por medio de Pellicon XL (valor de corte 5000, Millipore) y Ultrafree-15 (valor de corte 5000, Millipore). A partir del concentrado obtenido, se

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preparó una disolución del mismo que contenía fosfato de sodio 0,1 mol/l (pH 5,8) / sulfato de amonio 1 mol/l. La disolución resultante se sometió a una cromatografía hidrófoba utilizando Resource PHE (6 ml, Amersham Bioscience), para recuperar una fracción no adsorbida. La fracción no adsorbida se concentró y se desaló por medio de PD-10 (Amersham Bioscience), y, a partir de la fracción, se preparó una disolución de la misma que contenía disolución de Tris-HCl 0,05 mol/l (pH 7,5). La disolución se sometió a Resource Q (6 ml, Amersham Bioscience), para recuperar una fracción no adsorbida. La fracción no adsorbida se desaló y, a partir de la fracción, se preparó una disolución de la misma que contenía disolución de acetato de sodio 0,05 mol/l (pH 5,0). La disolución se sometió a Resource S (6 ml, Amersham Bioscience), para recuperar una fracción no adsorbida. La fracción no adsorbida se concentró y se sometió a una cromatografía en gel utilizando Superdex 75pg (16 X 60 mm; Amersham Bioscience) para recuperar una fracción con un peso molecular fraccionado de aproximadamente 45.000. Cada fracción (derivada de cada sobrenadante de cultivo de los transformantes anteriores) contenía solo la banda única de 45 kDa.

Las fracciones purificadas se sometieron a SDS-PAGE, y las proteínas sometidas a electroforesis se transfirieron eléctricamente a una membrana de PVDF. Las bandas de STCE1 de aproximadamente 45 kDa se recortaron de la mancha y se procesaron con el secuenciador Protein Sequencer Model 492 (Applied Biosystems) para analizar las secuencias de aminoácidos.

Como resultado, se confirmó que la secuencia de STCE1 de tipo natural obtenida del transformante pCB-Ste era coherente con la secuencia de ADN (SEC. ID Nº 5) de STCE1 derivada de Staphylotrichum coccosporum IFO (nombre actual: NBRC) 31817.

Sin embargo, la secuencia de aminoácidos de STCE1 obtenida del transformante de STCE1 modificada en su extremo N terminal no pudo determinarse en el procedimiento anterior. Se utilizó una piroglutamato aminopeptidasa Pfu (Takara Bio) para eliminar el extremo N terminal de la STCE1 modificada en su extremo N terminal, y a continuación se determinó el aminoácido (SEC. Nº 4).

Los resultados se resumieron en la Tabla 7 para comparar los aminoácidos del extremo N terminal y las secuencias de aminoácidos del extremo N terminal de STCE1 de tipo natural y STCE1 modificada en su extremo N terminal. A partir de los resultados se confirmó que cada STCE1 tenía la secuencia de aminoácidos del extremo N terminal esperada del correspondiente vector de expresión construido.

Tabla 7

Aminoácido del extremo N

Secuencia de aminoácidos del extremo N

terminal

terminal

STCE1 de tipo natural

Alanina (sin modificar) ADGKSTR (SEC. Nº 33)

STCE1 modificada en su extremo N Ácido piroglutámico pQSACDGKSTR (SEC. Nº 34) terminal (modificado)

(6) Comparación de las actividades de endoglucanasa de STCE1 de tipo natural purificada y STCE1 modificada en su extremo N terminal purificada

Se midieron las actividades de endoglucanasa de STCE1 de tipo natural purificada y STCE1 sustituida en su extremo N terminal purificada obtenidas en el Ejemplo B2(5) a pH 10 en ausencia y con presencia de LAS, y se compararon los grados de reducción de la actividad en presencia de LAS. Los resultados se muestran en la Tabla 8. En la Tabla 8, se representan las actividades de endoglucanasa por medio de porcentajes considerando como 100 la actividad de endoglucanasa a pH 10.

Tabla 8

EGU (%) Sin LAS Con LAS

STCE1 de tipo natural purificada 100 16,2 STCE1 modificada en su extremo N terminal purificada 100 30,0

Como resultado, al comparar las actividades de endoglucanasa en presencia de LAS, se encontró que la actividad de endoglucanasa de STCE1 modificada en su extremo N terminal purificada fue aproximadamente 1,9 veces superior a la de la STCE1 de tipo natural purificada.

Ejemplo B3: Cambio de la secuencia añadida al extremo N terminal de STCE1, construcción del vector, transformación de Trichoderma viride con el mismo y evaluación de las actividades

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(1) Construcción del vector de expresión para la adición de ácido piroglutámico solo al extremo N terminal de proteína madura

Como un vector de expresión para STCE1 en la que solamente se añadió ácido piroglutámico, se unió la región codificadora de la proteína madura en la que se había eliminado la secuencia señal para la secreción en el gen de STCE1, con el plásmido pCB1-M2 obtenido en el Ejemplo B1 para la construcción del pCB-Stm11.

En primer lugar, se amplificó la región codificadora de la proteína madura del gen de STCE1 por medio de PCR utilizando el plásmido pUC118-STCEex (FERM BP-10127) como molde y STCE-TmNSma y STCE1-TCET22I como cebadores. El producto de la PCR resultante, de aproximadamente 1 kpb, se digirió con SmaI y EcoT22I y se unió con pCB1-M2, previamente digerido con SmaI y PstI, para la construcción del pCB-Stm11. Trichoderma viride transformado con el vector pCB-Stm11 construido de la manera descrita anteriormente produjo la STCE1 que tiene la secuencia de aminoácidos N terminal del pQADGKSTR (SEC. ID. Nº 41) [es decir, la secuencia en la que se añadió un ácido piroglutámico (pQ) al extremo N terminal de STCE1 de tipo natural].

STCE-TmNSma: GGCCCGGGCTCAGGCCGATGGCAAGTCGACCCG (SEC. Nº 35)

(2) Comparación de la actividad de endoglucanasa de STCE1 a la que se añadió ácido piroglutámico

Se transformó la cepa 2 de Trichoderma viride con pCB-Stm11 según el procedimiento descrito en el Ejemplo B2(3). Los transformantes resultantes se cultivaron de acuerdo con el documento WO98/11239 para obtener los sobrenadantes de cultivo. Los sobrenadantes de los cultivos se sometieron a SDS-PAGE para seleccionar un sobrenadante de cultivo en el que se detectaba con claridad la banda de STCE1 de aproximadamente 45 kDa. Se midió la actividad de endoglucanasa en el sobrenadante del cultivo a pH 10 en ausencia y con presencia de LAS, y se comparó el grado de reducción de la actividad en presencia de LAS con el de la STCE1 de tipo natural en el Ejemplo B2(4). Los resultados se muestran en la Tabla 9. En la Tabla 9, se representan las actividades de endoglucanasa por medio de porcentajes considerando como 100 la actividad de endoglucanasa a pH 10.

Tabla 9

Vector expresión EGU (%) Sin LAS Con LAS

STCE1 de tipo natural pCB-Ste 100 14,5 STCE1 con pQ añadido pCB-Stm11 100 23,0

Como resultado, al comparar las actividades de endoglucanasa en presencia de LAS, se encontró que la actividad de endoglucanasa de la STCE1 a la que se añadió ácido piroglutámico fue aproximadamente 1,6 veces superior a la de la STCE1 de tipo natural.

Ejemplo B4: Cambio de la secuencia añadida al extremo N terminal de STCE1, construcción del vector, transformación de Trichoderma viride con el mismo y evaluación de las actividades

(1) Construcción del vector de expresión para la adición de 4 aminoácidos que contienen pQ al extremo N terminal de la proteína madura

Como vector de expresión para la STCE1 a la que se añadieron cuatro aminoácidos que contenían ácido piroglutámico, se unió la región codificadora de proteína madura, en la que se había suprimido la secuencia señal para la secreción en el gen de STCE1, con el plásmido pCB1-M2 obtenido en el Ejemplo B1 para la construcción del pCB-Stm12.

En primer lugar, se amplificó la región codificadora de la proteína madura del gen de STCE1 por medio de PCR utilizando el plásmido pUC118-STCEex (FERM BP-10127) como molde y STCE-TmNSph-2 y STCE1-TCET22I como cebadores. El producto de la PCR resultante, de aproximadamente 1 kpb, se digirió con SphI y EcoT22I y se unió con pCB1-M2 previamente digerido con SphI y PstI para la construcción del pCB-Stm12. Trichoderma viride transformado con el vector pCB-Stm12 construido como se describió anteriormente produjo la STCE1 que tiene la secuencia de aminoácidos del extremo N terminal del pQSACADGKSTR (SEC. ID. Nº 42) [es decir, la secuencia en la que se añadió un péptido que consiste en 4 aminoácidos (el aminoácido N terminal es ácido piroglutámico) al extremo N terminal de la STCE1N de tipo natural].

STCE-TmNSph-2: GGGCATGCGCCGATGGCAAGTCGACCCGC (SEC. Nº 36)

(2) Comparación de la actividad de endoglucanasa de la STCE1 con 4 aminoácidos añadidos que contiene pQ

La cepa 2 de Trichoderma viride se transformó con pCB-Stm12 según el procedimiento descrito en el Ejemplo B2(3). Los transformantes resultantes se cultivaron de acuerdo con el documento WO98/11239 para obtener los sobrenadantes del cultivo. Los sobrenadantes de los cultivos se sometieron a SDS-PAGE, para seleccionar un sobrenadante de cultivo en el que se detectaba con claridad la banda de STCE1 de aproximadamente 45 kDa. Se

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midió la actividad de endoglucanasa en el sobrenadante del cultivo a pH 10 en ausencia y con presencia de LAS y se comparó el grado de reducción de la actividad en presencia de LAS con el de la STCE1 de tipo natural en el Ejemplo B2(4). Los resultados se muestran en la Tabla 10. En la Tabla 10, se representan las actividades de endoglucanasa por medio de porcentajes considerando como 100 la actividad de endoglucanasa a pH 10.

Tabla 10

Vector de expresión EGU (%) Sin LAS Con LAS

STCE1 de tipo natural pCB-Ste 100 14,5 STCE1 con 4-AAs añadidos que contiene pQ pCB-Stm12 100 22,4

Como resultado, al comparar las actividades de endoglucanasa en presencia de LAS, se encontró que la actividad de endoglucanasa de la STCE1 con 4 aminoácidos añadidos que contiene pQ (STCE1 con 4 AAs añadidos que contiene pQ) fue aproximadamente 1,5 veces superior a la de la STCE1 de tipo natural.

Aplicabilidad industrial

La proteína de la presente invención presenta una pequeña reducción en la actividad de endoglucanasa en presencia de un tensioactivo, en comparación con las celulasas de tipo natural, y por consiguiente es útil como componente de un detergente para la ropa.

Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a formas de realización concretas, es posible realizar diversos cambios y modificaciones obvias para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra los resultados de la comparación entre la secuencia de aminoácidos de la endoglucanasa STCE1 [el péptido señal (ID. SEC. Nº 43) y la proteína madura (ID. SEC. Nº 44)] y las secuencias de aminoácidos de endoglucanasas conocidas pertenecientes a la familia de 45, NCE4 [el péptido señal (ID. SEC. Nº 45) y la proteína madura (ID. SEC. Nº 46)] y NCE5 [el péptido señal (ID. SEC. Nº 47) y la proteína madura (ID. SEC. Nº 48)], con respecto a las secuencias de aminoácidos de la mitad N terminal.

La figura 2 muestra los resultados de la comparación que se describe en la figura 1, con respecto a las secuencias de aminoácidos de la mitad C terminal.

Texto libre en el listado de secuencias

Las características de &quot;secuencia artificial&quot; se describen en el identificador numérico <223> en el Listado de secuencias. Cada una de las secuencias de nucleótidos de las ID. SEC. Nº 6-10, 12-13, 15-18, 21-26, 28, 30-32 y 35-36 son: cebador MNC-02, cebador MNC-03, cebador MKA-05, cebador MKA-06, pMKD01, cebador pMN-Bam, pJD01, cebador NCE4-Ne, cebador NCE4-Ce, cebador NCE4-N, cebador NCE4-C, cebador CBN-Stu, cebador CBC-Xho, CB1-SmSph, cebador CB1-Bam, cebador CB1-Pst, pCB1-M2, pCB1-M2, cebador STCE1-TNERV, cebador STCE1-TCET22I, cebador STCE1-TmNSph, cebador STCE1-TmNSma y cebador STCE1-TmNSph-2. Cada una de las secuencias de aminoácidos de las ID. SEC. Nº 11, 14, 27 y 29 son: pMKD01, pJD01, pCB1-M2 y pCB1-M2.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> MEIJI SEIKA KAISHA, LTD.

<120> Celulosa tolerante a los detergentes y procedimiento para modificar la misma

<130> MEJ-719

<150> JP 2003-409692

<151> 08-12-2003

<160> 48

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 870

<212> ADN

<213> Humicola insolens MN200-1

<220>

<221>

CDS 5 <221> (1) .. (870)

<223>

<220>

<221> característica miscelánea

<221>

(1) .. (3) 10 <223> Ácido piroglutámico

<220>

<221> fuente

<222> (16) .. (870)

<223> Humicola insolens MN200-1 15 <400> 1

<210> 2

<211> 289

<212> PRT 5 <213> Humicola insolens MN200-1

<220>

<221>

característica miscelánea

<221>

(1) .. (3)

<223> Ácido piroglutámico 10 <400> 2

<210> 3

<211> 897

<212> ADN 5 <213> Staphylotrichum coccosporum IF0 31817

<220>

<221>

CDS

<221>

(1) .. (897)

<223> 10 <220>

<221>

característica miscelánea

<221>

(1) .. (3)

<223> Ácido piroglutámico

<220> 15 <221> fuente

<222> (13) .. (897)

<223> Staphylotrichum coccosporum IF0 31817

<400> 3

<210> 4

<211> 298

<212> PRT

<213> Staphylotrichum coccosporum IF0 31817

<220>

<221>

característica miscelánea

<221>

(1) .. (3)

<223> Ácido piroglutámico

<400> 4

<210> 5

<211> 1037

<212> ADN

<213> Staphylotrichum coccosporum IF0 31817

<220>

<221>

péptido señal

<221>

(1) .. (63)

<223> 5 <220>

<221>

exón

<221>

(64) .. (333)

<223>

<220> 10 <221> Intrón

<221> (334) .. (419)

<223>

<220>

<221> exón 15 <221> (420) .. (1037)

<223>

<400> 5

<210> 6

<211> 36

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador MNC-02

<400> 6

gagcgccaga actgtggatc cacttggtga gcaatg 36

10 <210> 7

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador MNC-03

<400> 7

tccgccgttc tgagcggatc caggcgtttg gcgcg 35

<210> 8

<211> 36 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador MKA-05

<400> 8 25 gccgcccagc aggcgggatc cctcaccacc gagagg 36

<210> 9

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador MKA-06

<400> 9

tgatcgtcga gtcagggatc cagaatttac aggcac 36

<210> 10 10 <211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: pMKD01 15 <220>

<221>

característica miscelánea

<221>

(24) .. (25)

<223> bases no consecutivas

<400> 10 20 gagcgccaga actgtggatc cctctgcctg taagcggatc cagg 44

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 25 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: pMKD01

<220>

<221> NON_CONS

<221> (8) .. (9) 30 <223>

<220>

<221>

MOD_RES

<221>

(1) .. (1)

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO 35

<400> 11

<210> 12

<211> 53 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador pMN-Bam

<400> 12 10 ggtcaaacaa gtctgtgcgg atcctgggac aagatggcca agttcttcct tac 53

<210> 13

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: pJD01

<220>

<221> característica miscelánea

<221> (24) .. (25) 20 <223> bases no consecutivas

<400> 13

tgcggatcct gggacaagat ggccccgttc tgagcggatc cagg 44

<210> 14

<211> 4 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: pJD01

<220> 30 <221> NON_CONS

<221> (2) .. (3)

<223>

<400> 14

<210> 15

<211> 37 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador NCE4-Ne

<400> 15 10 ggggggatcc tgggacaaga tgcgttcctc ccctctc 37

<210> 16

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador NCE4-Ce

<400> 16

ggggggatcc ctgcgtttac aggcactgat gg 32

<210> 17 20 <211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador NCE4-Ns 25 <400> 17

ccggtgttgg ccggatccgc tgatggcaag 30

<210> 18

<211> 30

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador NCE4-Cs

<400> 18

taaggccctc aaggatccct gcgtctacag 30

35 <210> 19 <211> 7

<212> PRT

<213> Humicola insolens MN200-1

<400> 19

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> Humicola insolens MN200-1 10 <220>

<221>

MOD_RES

<221>

(1) .. (1)

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

<220> 15 <221> MUTÁGENO

<221> (1) .. (5)

<223>

<400> 20

20 <210> 21

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador CBN-Stu

<400> 21

gatacatgat gcgcaggcct tagtcgacta gaatgc 36

<210> 22

<211> 36 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador CBc-Xho

<400> 22

gatcctcaag cttttgctcg agtaccttac aagcac 36

<210> 23

<211> 35 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador CB1-SmSph

<400> 23 10 ggagggtgca tgccgactga gcccgggcag tagcc 35

<210> 24

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador CB1-Bam

<400> 24 gccgggagag gatccagtgg agg 23

<210> 25 20 <211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador CB1-Pst 25 <400> 25

gctcgagtac cttactgcag gcactgagag 30

<210> 26

<211> 66

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: pCB1-M2

<400> 26

<210> 27

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: pCB1-M2

<400> 27

<210> 28

<211> 61

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: pCB1-M2

<210>

<211> característica miscelánea

<212> (24) .. (25) 20 <213> bases no consecutivas

<400> 28

<210> 29

<211> 12 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: pCB1-M2

<220> 30 <221> NON_CONS

<221> (8) .. (9)

<223>

<400> 29

5 <210> 30

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador STCE1-TNERV

<400> 30

ggggatatcg cgcatcatgc gttcctcccc cgtcctc 37

<210> 31

<211> 33 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador STCE1-TCET221

<400> 31 20 gggatgcatt taaaggcact gcgagtacca gtc 33

<210> 32

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador STCE1-TmNSph

<400> 32

ggggcatgcg atggcaagtc gacccgctac 30

<210> 33 30 <211> 7

<212> PRT

<213> Staphylotrichum coccosporum IFO 31817

<400> 33

<210> 34

<211> 10 5 <212> PRT

<213> Staphylotrichum coccosporum IFO 31817

<220>

<221> MOD_RES

<221> (1) .. (1) 10 <223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

<220>

<221>

MUTÁGENO

<221>

(1) .. (4)

<223> 15 <400> 34

<210> 35

<211> 33

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador STCE1-TmNSma

<400> 35

ggcccgggct caggccgatg gcaagtcgac ccg 33

25 <210> 36

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador STCE1-TmNSph-2

<400> 36

gggcatgcgc cgatggcaag tcgacccgc 29

<210> 37

<211> 891

<212> ADN

<213> Staphylotrichum coccosporum IF0 31817

<220>

<221>

CDS 5 <221> (1) .. (891)

<223>

<220>

<221> característica miscelánea

<221>

(1) .. (3) 10 <223> Ácido piroglutámico

<220>

<221> fuente

<222> (4) .. (891)

<223> Staphylotrichum coccosporum IF0 31817 15 <400> 37

<210> 38

<211> 296

<212> PRT 5 <213> Staphylotrichum coccosporum IF0 31817

<220>

<221>

característica miscelánea

<221>

(1) .. (3)

<223> Ácido piroglutámico 10

<400> 38

<210> 39

<211> 900

<212> ADN 5 <213> Staphylotrichum coccosporum IF0 31817

<220>

<221>

CDS

<221>

(1) .. (900)

<223> 10 <220>

<221> fuente

<222> (13) .. (90)

<223> Ácido piroglutámico

<220>

<221>

característica miscelánea

<221>

(1) .. (3)

<223> Ácido piroglutámico

<400> 39

<210> 40

<211> 299

<212> PRT

<213> Staphylotrichum coccosporum IF0 31817

<220>

<221>

característica miscelánea

<221>

(1) .. (3)

<223> Ácido piroglutámico

<400> 40

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> Staphylotrichum coccosporum IFO 31817

<220> 5 <221> MOD_RES

<221> (1) .. (1)

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

<220>

<221> MUTÁGENO 10 <221> (1) .. (1)

<223>

<400> 41

<210> 42 15 <211> 11

<212> PRT

<213> Staphylotrichum coccosporum IFO 31817

<220>

<221>

MOD_RES 20 <221> (1) .. (1)

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

<220>

<221> MUTÁGENO

<221>

(1) .. (4) 25 <223>

<400> 42

<210> 43

<211>

21 30 <212> PRT

<213> Staphylotrichum coccosporum IFO 31817

<400> 43

<210> 44

<211> 295

<212> PRT

<213> Staphylotrichum coccosporum IFO 31817

<400> 44

<210> 45

<211> 20

<212> PRT

<213> Humicola insolens

<400> 45

<210> 46

<211>

286 10 <212> PRT

<213> Humicola insolens

<400> 46

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> Humicola insolens

<400> 47

<210> 48

<211>

206 10 <212> PRT

<213> Humicola insolens

<400> 48

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para suprimir una reducción en la actividad de endoglucanasa en presencia de un tensioactivo, caracterizado por la modificación de una proteína que tiene la actividad de endoglucanasa, en la que el aminoácido N terminal es diferente de ácido piroglutámico, a una proteína que tiene el extremo N terminal de ácido

   5 piroglutámico.
2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la modificación se lleva a cabo añadiendo ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, o un péptido que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, al extremo N terminal de la proteína que tiene la actividad de endoglucanasa en la que el extremo N terminal es un aminoácido diferente de ácido

   10 piroglutámico, en el que el aminoácido que se puede convertir en ácido piroglutámico se selecciona de ácido glutámico y glutamina.
3. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la modificación se lleva a cabo sustituyendo el aminoácido N terminal o una región N terminal de la proteína que tiene la actividad de endoglucanasa en la que el aminoácido N terminal es diferente de ácido piroglutámico por ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido

   15 piroglutámico, o un péptido que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, en el que el aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico se selecciona de ácido glutámico y glutamina.
4. 4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína que tiene la actividad

   de endoglucanasa en la que el extremo N terminal es un aminoácido diferente de ácido piroglutámico es una 20 celulasa perteneciente a la familia 45.
5. 5. Una proteína seleccionada del grupo que consiste en:

   (a)

   una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, en la que el extremo N terminal es ácido piroglutámico;

   (b)

   una proteína modificada que comprende una secuencia de aminoácidos en la que el extremo N terminal es

   25 ácido piroglutámico y en la que se han eliminado, sustituido, insertado o añadido de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, y que tiene una actividad de endoglucanasa; y

   (c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad de secuencia con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, en la que el extremo N terminal es ácido piroglutámico y que tiene una actividad de endoglucanasa.