FI116529B - Menetelmiä oleellisesti puhtaan EG III -sellulaasin tuottamiseksi alkoholia käyttäen - Google Patents
Menetelmiä oleellisesti puhtaan EG III -sellulaasin tuottamiseksi alkoholia käyttäen Download PDFInfo
- Publication number
- FI116529B FI116529B FI944560A FI944560A FI116529B FI 116529 B FI116529 B FI 116529B FI 944560 A FI944560 A FI 944560A FI 944560 A FI944560 A FI 944560A FI 116529 B FI116529 B FI 116529B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- iii
- cellulase
- process according
- supernatant
- alcohol
- Prior art date
Links
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 title claims description 327
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 93
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 title claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 87
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 96
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 40
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 29
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 claims description 23
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 23
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 12
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 11
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 9
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 9
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 claims description 7
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 claims description 3
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 2
- 235000013904 zinc acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims 2
- 101710101924 Endo-1,4-beta-xylanase 1 Proteins 0.000 claims 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 70
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 41
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 101150089778 pyr-4 gene Proteins 0.000 description 22
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 20
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 101150052795 cbh-1 gene Proteins 0.000 description 12
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101150114858 cbh2 gene Proteins 0.000 description 11
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 11
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 11
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 11
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 10
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 10
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 9
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 9
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 8
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 8
- 101710098247 Exoglucanase 1 Proteins 0.000 description 8
- 229920006184 cellulose methylcellulose Polymers 0.000 description 8
- 238000012710 chemistry, manufacturing and control Methods 0.000 description 8
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 8
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 7
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 7
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 101710098246 Exoglucanase 2 Proteins 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 5
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 4
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- 101710112457 Exoglucanase Proteins 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 4
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 CBH Proteins 0.000 description 3
- 101710126559 Endoglucanase EG-II Proteins 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100032401 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pyr-4 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023514 Barrett esophagus Diseases 0.000 description 2
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 2
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010091371 endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010091384 endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000899859 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) Endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001164374 Calyx Species 0.000 description 1
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000518994 Conta Species 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108010022769 Glucan 1,3-beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HSRJKNPTNIJEKV-UHFFFAOYSA-N Guaifenesin Chemical compound COC1=CC=CC=C1OCC(O)CO HSRJKNPTNIJEKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000617808 Homo sapiens Synphilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100382629 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) cbh1 gene Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021997 Synphilin-1 Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 229940040526 anhydrous sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 101150048033 cbh gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011153 ceramic matrix composite Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009264 composting Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 108010092450 endoglucanase Z Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 108010000165 exo-1,3-alpha-glucanase Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- KUIXZSYWBHSYCN-UHFFFAOYSA-L remazol brilliant blue r Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C(N)=C2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1NC1=CC=CC(S(=O)(=O)CCOS([O-])(=O)=O)=C1 KUIXZSYWBHSYCN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000004460 silage Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013042 solid detergent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
116529
Menetelmiä oleellisesti puhtaan EG III -sellulaasin tuottamiseksi alkoholia käyttäen
Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön ala Tämä keksintö koskee menetelmiä oleellisesti puhdasta EG III -sellulaasikomponenttia sisältävän vesiliuoksen tuottamiseksi. Erityisesti tämän keksinnön menetelmät koskevat osaksi sellulaasiproteiinien, paitsi EG III -sello lulaasikomponentin, poistamista vesipohjaisesta sellulaasiproteiinien seoksesta, joka sisältää EG III:a, lisäämällä matalamolekyylipainoista alkoholia vesipohjaiseen seokseen orgaanisen suolan ollessa läsnä. Edullisessa suoritusmuodossa vesipohjaisen seoksen pH säädetään ainakin 15 noin pH-arvoon 7 ennen alkoholin lisäämistä. Toisessa edullisessa suoritusmuodossa epäorgaanista suolaa lisätään EG III -rikkaaseen supernatanttiin jäljellä olevien epä-puhtausproteiinien saostamiseksi, tuloksena oleellisesti puhdas EG III -koostumus. Tämän keksinnön menetelmät kos-20 kevät myös osaksi ksylanaasin rikastamista ksylanaasia sisältävästä vesiliuoksesta.
2. Tekniikan taso
Sellulaasit tunnetaan alalla entsyymeinä, jotka hydrolysoivat selluloosaa (βΙ-4-glukaanisidoksia), mikä 25 johtaa glukoosin, sellobioosin, sello-oligosakkaridien ja vastaavien muodostumiseen. Vaikka sellulaaseja tuotetaan : .* (ekspressoidaan) sienissä, bakteereissa ja vastaavissa, ·* tiettyjen sienten ja erityisesti sieniluokan Trichoderma spp. (varsinkin Trichoderma reesein) tuottamaan sellulaa- «·; , 30 siin on kohdistettu eniten huomiota, koska täydellinen * * ♦ sellulaasisysteemi, joka kykenee hajottamaan selluloosan . , kiteisiä muotoja, tuotetaan helposti fermentaatiomenetel- millä.
'Edellistä koskien Schulein, "Methods in Enzymolo-. : 35 gy", 160, 25, s. 234 ja seuraavat (1988), paljastaa, että 2 116529 sienillä täydellinen sellulaasisysteemi käsittää useita eri entsyymiluokituksia, mukaan luettuina ne, joista käytetään nimityksiä eksosellobiohydrolaasit (EC 3.2.1.91) ("CBH"), endoglukanaasit (EC 3.2.1.4) ("EG") ja B-glu- 5 kosidaasit (EC 3.2.1.21) ("BG"). Sienten CBH-, EG- ja BG-sellulaasiluokitukset voidaan edelleen laajentaa sisältämään useampia komponentteja kunkin luokituksen sisällä. Esimerkiksi joukosta eri sienilähteitä on eristetty useampia CBH:itä ja EG:itä.
10 Täydellinen CBH-, EG- ja BG-komponentteja käsittävä sellulaasisysteemi tarvitaan kiteisen selluloosaan muuttamiseksi glukoosiksi tehokkaasti. Eristetyt komponentit ovat paljon vähemmän, jos lainkaan, tehokkaita hydrolysoimaan kiteistä selluloosaa. Lisäksi sellulaasikomponenttien 15 välillä havaitaan synergistinen suhde, erityisesti jos ne ovat eri luokituksista.
Toisaalta sellulaasien ja niiden komponenttien, joko yksin tai yhdistelmänä käytettynä, tiedetään alalla myös olevan hyödyllisiä pesuainekoostumuksissa. Esimerkik-20 si sienten sellulaasien endoglukanaasikomponentteja on käytetty tehostamaan pesuainekoostumusten puhdistuskykyä, pehmennysaineena ja parantamaan puuvillakankaiden tuntua ja vastaaviin tarkoituksiin. Kuitenkin Trichoderma spp:stä ja erityisesti Trichoderma Teeseistä peräisin olevien EG 25 I- ja EG II -komponenttien käytössä pesuainekoostumuksissa » on ongelma. Erityisesti tällaisilla komponenteilla on · maksimiaktiivisuutensa happamissa pH-arvoissa, kun taas Ί* useimmat pyykinpesuainekoostumukset formuloidaan käytet- · täviksi neutraaleissa tai aikalisissä (pH > 7 noin 10:een 30 asti) olosuhteissa. Joskin US-hakemusjulkaisussa sarjanro 07/668 640 paljastetaan, että yhden tai useamman ; . Trichoderma reesein happaman endoglukanaasikomponentin käyttö pesuainekoostumuksissa tuottaa puuvillaa sisältäville kankaille parannuksia pehmenemisessä, värin pysymi-: 35 sessä/palautumisessa ja tunnussa jopa aikalisissä olo- 3 116529 suhteissa käsiteltynä, US-hakemusjulkaisussa sarjanro 07/707 647 paljastetaan, että Trichodezrma reesein EG III -komponentti tarjoaa pesuainekoostumuksissa parempia ja odottamattomia etuja Trichoderma reesein EG I- ja EG II 5 -komponentteihin verrattuna.
EG III -sellulaasikomponentilla on erityisesti havaittu olevan merkittävä entsyymiaktiivisuus aikalisissä olosuhteissa, ja se on erityisen sopiva käytettäväksi pyy-kinpesuolosuhteissa, joissa käytetään neutraalia tai alka-10 lista pesuainetta.
Pyykinpesuaineissa käyttönsä lisäksi tässä kuvattavaa oleellisesti puhdasta EG III -sellulaasikomponenttia voidaan lisäksi käyttää esipesuvaiheena sopivassa liuoksessa, jossa on sellainen välikorkuinen pH, jossa on riit-15 tävästi aktiivisuutta haluttujen värin säilymisen/palautu- misen, pehmenemisen ja tunnun parantumisten saamiseksi, kuten kuvataan US-hakemusjulkaisussa sarjanro 07/707 647, jätetty 30. toukokuuta 1991, ja joka liitetään tähän viitteeksi .
20 On myös ajateltu, että tässä kuvattavaa oleellises ti puhdasta EG III -sellulaasikomponenttikoostumusta voidaan käyttää kotikäytössä omana koostumuksenaan, joka sopii haalistuneiden kankaiden värin palauttamiseen (katso esimerkiksi US-patenttijulkaisu nro 4 738 682, joka liite-25 tään tähän viitteeksi kokonaisuudessaan), sekä myös käyt- tää tahranpoistoaineena.
:,· · Lisäksi ajatellaan vielä, että EG III -sellulaasi- > ‘!· komponentin neutraaleissa - aikalisissä olosuhteissa kor- ··* kea aktiivisuus olisi edullinen puuvillaa sisältävien kan- 30 kaiden käsittelyn tekstiilimenetelmissä (ks. US-hakemus- julkaisut sarjanro 07/677 385 ja 07/678 865, jotka liite-: tään tähän viitteeksi kokonaisuudessaan) sekä myös säilö- rehu- ja/tai kompostointimenetelmissä.
Edellä esitetylle vastakohtana tämä keksintö koskee : 35 tehokkaita menetelmiä EG III -sellulaasikomponentin puh- i * , 4 116529 distamiseksi vesipohjaisista entsyymiseoksista, erityisesti täydellisestä sellulaasikoostumuksesta ja erityisti EG III -sellulaasikomponentin tuottamiseksi kaupallisessa mittakaavassa.
5 Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee erityisesti menetelmää oleellisesti puhdasta EG III -sellulaasikomponenttia sisältävän vesiliuoksen tuottamiseksi vesipohjaisesta seoksesta, joka sisältää sellulaasiproteiineja, mukaan luettuna EG III 10 -sellulaasikomponenttia. Niinpä erään menetelmiä koskevan puolensa osalta tämä keksintö koskee menetelmää oleelli sesti kaikkien sellulaasiproteiinien, paitsi EG III -sellulaasikomponentin, poistamista selektiivisesti vesipohjaisesta sellulaasiproteiineja, mukaan luettuna EG III 15 -sellulaasikomponenttia, sisältävästä seoksesta, jolle menetelmälle on tunnusmerkillistä, että vesipohjaiseen seokseen lisätään tehokas määrä matalamolekyylipainoista alkoholia orgaanisen suolan ollessa läsnä olosuhteissa, joissa oleellisesti kaikki muut sellulaasiproteiinit saos-20 tuvat liuoksesta, ja että sakka poistetaan. Edullisessa suoritusmuodossa vesipohjaisen seoksen pH säädetään ainakin noin pH-arvoon 7 ennen alkoholin lisäämistä. Toisessa edullisessa suoritusmuodossa epäorgaanista suolaa lisätään EG III -rikkaaseen supernatanttiin, ja kaikki jäljellä '··' 25 olevat muut sellulaasiproteiinit kuin EG III saostuvat.
Tämän keksinnön menetelmät koskevat myös osaksi ·.: I sellaisen vesiliuoksen eristämistä, joka sisältää oleelli- , '·* sesti puhdasta Trichoderma spp: stä saatua ksylanaasia.
·;· Vesipohjainen seos voi olla suodatettu kokosolu- 30 uutos tai edullisemmin kokonaissellulaasikoostumus villi-tyyppisestä Trichoderma spp. -kannasta, geneettisesti muunnetusta Trichoderma spp. -kannasta, tai mikä tahansa muu vesipohjainen seos, joka on yhteensopiva tämän keksinnön mukaisten menetelmien kanssa ja sisältää sellulaasi-: 35 proteiineja, mukaan luettuna EG III:a.
5 116529
Piirrosten lyhyt kuvaus
Kuvio 1 esittää RBB-CMC-aktiivisuusprofiilia eräällä pH-alueella 40 °C:n lämpötilassa EG-rikastetulle sieniperäiselle sellulaasikoostumukselle, joka on saatu sel-5 laisesta Trichoderma reesei -kannasta, joka on transformoitu niin, ettei se kykene ekspressoimaan CBH I:tä eikä CBH II:ta, sekä myös aktiivisuusprofiilia Trichoderma reesei -kannasta saadulle rikastetulle EG III -sellulaasikoostumukselle eräällä pH-alueella 40 °C:n lämpötilassa. 10 Kuviossa 2 nähdään isoelektrinen fokusointigeeli, jossa kaistalla 1 nähdään villityyppisen Trichoderma ree-sein ekspressoimat proteiinit, kaistalla 2 sellaisen Trichoderma reesei -kannan, joka on transformoitu niin, ettei se kykene ekspressoimaan EG I- eikä EG II-komponentteja, 15 ekspressoimat proteiinit, ja kaistalla 3 oleellisesti puhtaassa EG III -sellulaasissa esiintyvät proteiinit. Tämän kuvion oikeassa marginaalissa on merkinnät, joilla tunnistetaan CBH I:n, CBH II:n, EG I:n, EG II:n, EG III:n ja ksylanaasin tiliin luettavat vyöhykkeet.
20 Kuvio 3 on kahdesta EG III:n fragmentista saatu aminohapposekvenssi.
Kuvio 4 on SDS-PAGE-geeli, jossa kaistalla 11 nähdään sellaisen Trichoderma reesei -kannan, joka on transformoitu niin, ettei se kykene ekspressoimaan EG I- eikä ,,· 25 EG II-komponentteja, ekspressoimat proteiinit, kaistalla 2 esimerkin I osan A mukaisella menetelmällä saadussa oleel-' ; lisesti puhtaassa EG III -sellulaasissa esiintyvät prote- iinit ja kaistalla 12 esimerkin 2 mukaisella menetelmällä *. saatu oleellisesti puhtaassa EG III.
./. 30 Kuvio 5 on kaavamainen esitys pACBHlpyr4:n konst ruktiosta.
Kuvio 6 havainnollistaa T. reesein geenin delee-tiota pACBHIpyr4:n suuremman EcoRI-fragmentin integraatiolla chhl-lokukseen yhdessä T. reesein kromosomeista.
6 116529
Kuvio 7 on autoradiografia EcoRI-digestoidulla pACBHIpyr4:llä transformoidun Γ. reesei -kannan GC69 DNA:sta sen jälkeen, kun on tehty "Southern blot" -analyysi käyttäen 32P-leimattua pACBHIpyr4:ää koettimena. Mole-5 kyylipainomerkkien koot esitetään kiloemäspareina kuvion vasemmalla puolella.
Kuvio 8 on autoradiografia EcoRI-digestoidulla pACBHIpyr4:llä transformoidun T. reesei -kannan GC69 DNA:sta sen jälkeen, kun on tehty "Southern blot" -analyy-10 si käyttäen 32P-leimattua plntCBHIrtä koettimena. Molekyy-lipainomerkkien koot esitetään kiloemäspareina kuvion vasemmalla puolella.
Kuvio 9 on isoelektrinen fokusointigeeli, jossa nähdään villityyppisen Trichoderma reesein ja transformoi-15 tujen T. reesei -kantojen ekspressoimat proteiinit. Spesifisesti kuviossa 5 isoelektrisen fokusointigeelin kaistalla A käytetään osittain puhdistettua CBHI:tä Γ. reeseistä, kaistalla B käytetään villityyppistä T. reeseitä, kaistalla C käytetään proteiinia T. reesei -kannasta, josta cbhl-20 geeni on deletoitu, ja kaistalla D käytetään proteiinia T. reesei -kannasta, josta cbhl- ja cbh2-geenit on deletoitu. Kuvion 9 oikealla puolella on merkinnät, jotka osoittavat yhdessä tai useammassa näistä eritetyistä proteiineista löytyvien yksittäisten proteiinien sijainnit. Spesifisesti ' 25 BG viittaa β-glukosidaasiin, El viittaa endoglukanaasi » ' I:een, E2 viittaa endoglukanaasi II:een, E3 viittaa endo- j glukanaasi III:een, Cl viittaa eksosellobiohydrolaasi .*· I:een ja C2 viittaa eksosellobiohydrolaasi Il:een.
• Kuvio 10A on esitys T. reesein cbh2-lokuksesta 30 kloonattuna 4,1 kb:n EcoRI-fragmenttina genomiseen DNArhan ja kuvio 10B on esitys cöh2-geenin deleetiovektorista pPACBHII:sta.
Kuvio 11 on autoradiografia EcoRI-digestoidulla pPACBHII:lla transformoidun T. reesei -kannan P37PACBHI-' 35 Pyr26 DNA:sta sen jälkeen, kun on tehty "Southern blot" 7 116529 -analyysi käyttäen 32P-leimattua pPACBHII:a koettimena. Molekyylipainomerkkien koot esitetään kiloemäspareina kuvion vasemmalla puolella.
Kuvio 12 on kaavamainen esitys pAEGIpyrG-3:n konst-5 ruktiosta.
Kuvio 13 havainnollistaa T. reesein egll-geenin de-leetiota pAEGIpyrG-3:n Hindlll-fragmentin integraatiolla egll-lokukseen yhdessä T. reesein kromosomeista.
Kuvio 14 on kaavamainen esitys pAAEGII-l:n konst-10 ruktiosta.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Kuten edellä huomautettiin, tämä keksintö koskee yleisesti menetelmiä oleellisesti puhtaan EG III -sellu-laasikomponentin tuottamiseksi, yhtä hyvin vesiliuoksessa 15 kuin talteen otettuna proteiinina.
Kuitenkin ennen kuin tätä keksintöä käsitellään vielä yksityiskohtaisemmin, seuraavat termit määritellään ensin.
1. Määritelmiä 20 Kuten niitä tässä käytetään, seuraavilla termeillä on seuraavat merkitykset: "EG III -sellulaasi" viittaa Trichoderma spp:stä, tai mistä tahansa muusta mikro-organismista, joka tuottaa , , Trichoderma spp:n tuottaman EG III:n kanssa ekvivalenttia ’· ’ 25 proteiinia, saatuun endoglukanaasikomponenttiin, jolla on tunnusmerkillisestä pH-optimi noin 5,5 - 6,0, isoelektri- • nen piste (pl) noin 7,2 - 8,0 ja molekyylipaino noin 23 - 28 kDa. Edullisesti EG III -sellulaasi on peräisin joko ;· Trichoderma reeseistä tai Trichoderma viridestä. Tricho- 30 derma reeseistä peräisin olevalla EG III -sellulaasilla on pH-optimi noin 5,5 - 6,0, isoelektrinen piste noin 7,4 ja *. molekyylipaino noin 25 - 28 kDa. Trichoderma viridestä peräisin olevalla EG III -sellulaasilla on pH-optimi noin 5,5, isoelektrinen piste noin 7,7 ja molekyylipaino noin • 35 23,5 kDa. Lisäksi on ajateltu, että EG III -sellulaasin 8 116529 aminohapposekvenssiä voidaan muuttaa. Tämän entsyymin aktiivisten kohtien muuttaminen voi johtaa joukkoon erilaisia muutoksia, kuten erilaiset pH-optimit, erilaiset läm-pötilaoptimit tai muuttuneet affiniteetit substraatille.
5 Korkean pl:nsä takia EG III -komponentti tavataan isoelektrisen fokusointigeelin alueella, jossa yleensä tavataan korkean pl:n ksylanaasit ja muut Trichoderma spp:n ekspressoimat korkean pl:n komponentit. Itse asiassa hypoteesina on esitetty, että EG IIl:ksi kuviossa 2 merit) kitty vyöhyke oli joko EG I:n tai II:n hajoamistuote. Kuitenkin EG I- ja EG II -deletoidun sellulaasin (valmistettu US-hakemusjulkaisujen sarjanro 07/770 049 ja 07/668 640 mukaisella tavalla ja kuten edempänä esimerkeissä 18 ja 19 on kuvattu) isoelektriset fokusointigeelit osoittivat, 15 että tätä vyöhykettä ei voida panna EG I:n eikä EG II:n hajoamistuotteen tiliin. (Ks. myös kuvio 2).
On huomattava, että jotkut kirjoittajat ovat aikaisemmin viitanneet EG IIreen nimikkeellä "EG III", mutta nykyisessä nimistössä käytetään termiä "EG II". Joka ta-20 pauksessa EG II -proteiini poikkeaa oleellisesti EG III -proteiinista molekyylipainoltaan, pl-arvoltaan ja pH-op-timiltaan, kuten edempänä esitettävän esimerkin 2 taulukosta I käy ilmi.
"Oleellisesti puhdas EG III -komponentti" viittaa ,·' 25 sellulaasiproteiinien vesiliuokseen tai koostumukseen, ·’, / joka sisältää EG III -sellulaasikomponenttia ainakin 50 : : paino-%, edullisemmin ainakin 70 paino-%, edullisimmin ainakin 90 paino-% perustuen sellulaasiproteiinien koko-. naispainoon koostumuksessa.
30 "Oleellisesti vapaa muista sellulaasiproteiineista" » » viittaa koostumukseen, josta ainakin 50 paino-%, edullisemmin ainakin 60 paino-% ja edullisimin ainakin 90 pai-’ no-% muista sellulaasiproteiineista kuin EG III on pois tettu alkuperäisestä sellulaasiproteiiniseoksesta.
9 116529 "Ksylanaasin suhteen rikastettu" viittaa vesiliuokseen tai koostumukseen, jossa on tämän keksinnön mukaisten menetelmien vaikutuksesta ainakin nelinkertainen, edullisemmin ainakin kymmenkertainen lisäys ksylanaasipitoisuu-5 dessa.
"Sellulaasiproteiinit" viittaa sellulaasiproteii-neihin, joihin sisältyvät mitkä tahansa ja kaikki eksosel-lobiohydrolaasiproteiinit (CBH), endoglukanaasiproteiinit (EG) ja β-glukosidaasiproteiinit (BG), jotka ovat peräisin 10 sienilähteistä tai mikro-organismeista, joita on geneettisesti muunnettu niin, että niihin on saatu mukaan ja eks-pressoitumaan kaikki tai osa sienilähteestä saaduista sel-lulaasigeeneistä.
Kollektiivisesti kaikkiin tällaisiin proteiineihin 15 (ts. CBH-, EG- ja BG-proteiineihin) viitataan "sellulaasi- proteiineina". Sellulaasiproteiineihin eivät tietenkään sisälly muut Trichoderma spp:n ekspressoimat proteiinit, mukaan lukien ksylanaasit, proteaasit, amylaasit jne.
"Endoglukanaasikomponentit ("EG-komponentit") viit-20 taa Trichoderma spp:n EG-komponentteihin, mukaan lukien Trlchoderma reesein EG I-, EG II- ja/tai EG III -komponentit. Trichoderma spp:n EG-komponentit (esim. Trichoderma reesein EG I-, EG II- ja EG III -komponentit ja vastaava-t), joko yksinään tai yhdistelmissä, antavat paremman tun- • · ’*·’ 25 nun, paremman ulkonäön, pehmenemisen, värin tehostumisen ja/tai kivipestyn ulkonäön puuvillaa sisältäville kankail-· le (verrattuna kankaaseen ennen käsittelyä), kun näitä komponentteja sisällytetään tekstiilinkäsittelyaineeseen ja kangas käsitellään tällä aineella. Edeltävän lisäksi EG , 30 111:11a on oleellinen aktiivisuus aikalisissä pH-arvoissa, joissa monia pesuainekoostumuksia käytetään.
"Eksosellobiohydrolaasikomponentit" ("CBH-komponentit" ) viittaa Trichoderma spp:n CBH-komponentteihin, mukaan lukien Trichoderma reesein CBH I- ja CBH II -kompo-35 nentit. Kun niitä käytetään ilman Trichoderma spp:n EG- 10 116529 komponentteja, Trichoderma spp:n CBH-komponentit yksinään eivät tuo merkittävää värin säilymistä/palautumista ja parempaa tuntua näin käsitellyille puuvillaa sisältäville kankaille. Lisäksi käytettäessä yhdistelmänä tällaisten 5 EG-komponenttien kanssa, Trichoderma reesein CBH I -komponentti voi tuoda tehostuneen vahvuuden menetyksen ja lisääntyneitä puhdistusetuja puuvillaa sisältäville kankaille.
"β-glukosidaasikomponentit (BG-komponentit)" 10 viittaa niihin sellulaasikomponentteihin, joilla nähdään BG-aktiivisuutta; siis tällaiset komponentit toimivat sel-lobioosin ja muiden liukoisten sello-oligosakkaridien ("sellobioosin") pelkistävästä päästä lähtien ja antavat glukoosia ainoana tuotteena. BG-komponentit eivät adsor-15 boidu selluloosapolymeerien pinnalle tai reagoi niiden kanssa. Lisäksi glukoosi inhiboi kompetitiivisesti tällaisia BG-komponentteja (K± noin 1 mM). Vaikkakaan suppeassa mielessä BG-komponentit eivät ole kirjaimellisesti sellu-laaseja, koska ne eivät pysty hajottamaan selluloosaa, ne 20 luetaan mukaan sellulaasisysteemin määritelmään, koska nämä entsyymit edesauttavat selluloosan kokonaishajotusta hajottamalla edelleen inhiboivat selluloosan hajotustuot-teet (erityisesti sellobioosin), joita CBH-komponenttien ja EG-komponenttien yhdistetty toiminta tuottaa. Ilman BG-,·' 25 komponenttien läsnäoloa tapahtuu vain kohtalaisesti tai : : vähän kiteisen selluloosan hydrolyysiä. BG-komponentteja : ; karakterisoidaan usein aryylisubstraateilla, kuten p-nit- j. rofenyyli-B-D-glukosidilla (PNPG), ja siksi niitä usein kutsutaan aryyliglukosidaaseiksi. Täytyy huomata, että , ;'f 30 kaikki aryyliglukosidaasit eivät ole BG-komponentteja, siksi että jotkin eivät hydrolysoi sellobioosia.
2. Menetelmät • Tämä keksintö kohdistuu osaksi siihen löytöön, että ' ·' EG III:n sisältävä vesiliuos oleellisesti vapaana muista ; 35 sellulaasiproteiineista voidaan saada vesipohjaisesta ent- » · » 11 116529 syymiseoksesta lisäämällä matalamolekyylipainoista alkoholia. Yllättävästi näissä olosuhteissa oleellisesti kaikki muut sellulaasiproteiinit paitsi EG III saostuvat liuoksesta, mikä jättää EG III:a sisältävän liuoksen, joka on 5 oleellisesti vapaa muista sellulaasiproteiineista. On myös havaittu, että näissä olosuhteissa oleellisesti kaikki sellulaasiproteiinit paitsi EG III saostuvat, mikä jättää liuoksen rikastuneeksi ksylanaasin suhteen.
Yhdessä tämän keksinnön edullisessa suoritus-10 menetelmässä sellulaasia sisältävä vesipohjainen seos suodatettiin soluriekaleiden ja muiden kiinteiden aineiden poistamiseksi, ja se tuotti nestemäisen suodoksen, joka sisälsi seoksen entsyymejä, mukaan luettuna sellulaasiproteiinit. Edullisemmin käytetään solutonta sellu-15 laasikoostumusta, kuten CYTOLASE 123 (kaupallisesti saatavana yhtiöltä Genencor International, Inc., South San Francisco, CA, USA). Toisessa menetelmässä vesipohjainen seos voitaisiin saada mistä tahansa vesipohjaisesta lähteestä, mukaan luettuina jo EG III:n suhteen rikastetut 20 seokset. Erityisemmin tuloksena saatavaa EG III -liuosta, joka on kuvattu samaan aikaan jätetyssä EP-hakemusjulkai-sussa, sarjanro EP0635057, jätetty asiamiehen merkintänu-merolla 010 055-106, nimeltään "METHODS FOR PRODUCING SUBSTANTIALLY PURE EG III USING POLYETHYLENE GLYCOL" ("Me- • · * » "I 25 netelmiä oleellisesti puhtaan EG III:n tuottamiseksi poly-* ♦ etyleeniglykolia käyttäen"), joka sisällytetään tähän ko-·’·'· konaisuudessaan viitteeksi.
Kun suodos on saatu suodatusvaiheesta, orgaanisia suoloja voidaan lisätä suodokseen ennen kuin suodos saate-ν’ i 30 taan yhteyteen alkoholin kanssa. Rajoittumatta mihinkään teoriaan, uskotaan, että joissakin tapauksissa orgaaninen : suola voi tehostaa EG III -komponentin pysymistä liuokses- < 1 t sa.
t
; Ennen alkoholin lisäystä vesipohjaisen seoksen pH
35 säädetään edullisesti ainakin pH-arvoon noin 7, edullisem- 12 116529 min pH-arvoon noin 7 - 12, ja vielä edullisemmin pH-arvoon noin 7,5 - 10,5, edullisimmin pH-arvoon noin 9,5.
Lisättäessä tehokas määrä matalamolekyylipainoista alkoholia vesipohjaiseen seokseen, muut entsyymit kuin EG 5 III -komponentti saostuvat pois liuoksesta, ja EG III -komponentti etupäässä pysyy liuoksessa. Matalamolekyylipainoista alkoholia lisätään vesipohjaiseen seokseen olosuhteissa, jotka johtavat muiden sellulaasiproteiinien kuin EG III:n saostumiseen, EG III:n pysyessä vesiliuok-10 sessa. Tässä vaiheessa käytetyt aika- ja lämpötilarajoi-tukset eivät ole kriittisiä, mutta riippuvat halutuista puhtausasteesta ja saannon määrästä. Esimerkiksi pidempään pitäminen johtaa korkeampaan puhtausasteeseen kuten myös alempi lämpötila. Spesifinen käytettävä ajan ja lämpötilan 15 yhdistelmä selviää sinänsä tunnetulla tavalla. Edullisessa suoritusmuodossa tällaisiin olosuhteisiin kuuluisi lämpötila välillä noin 10 - 30 °C, edullisemmin noin 15 - 25 °C.
Matalamolekyylipainoista alkoholia sekoitetaan ve-20 sipohjaisen seoksen kanssa edullisessa suoritusmuodossa noin 1 minuutista 5 tuntiin, edullisemmin 1 minuutista 1 tuntiin. Sitten vesipohjainen seos sentrifugoidaan ja suodatetaan saostuneiden kontaminoivien entsyymien poistamiseksi, tuloksena ensimmäinen supernatantti. EG III:n määrä ·' 25 käsittää ainakin noin 50 % ensimmäisen supernatantin ko- : : : konaissellulaasiproteiinista esimerkin 7 geelielektrofo- ; reesimenetelmällä määritettynä.
·· Sitten EG III -komponentti voidaan puhdistaa ensim- mäisestä supernatantista joukolla eri menetelmiä. Edulli-,30 sessa suoritusmuodossa ensimmäiseen supernatanttiin lisä tään sitten yhtä suuri tilavuus kylmää etanolia, ja EG III:n sisältävä sakka kerätään talteen sentrifugoimalla. Vaihtoehtoisesti EG III -komponentti voidaan puhdistaa ioninvaihtokromatografiällä (esim. edempänä esimerkeissä : ; 35 kuvattavilla menetelmillä). Sitten EG III -komponentti 13 116529 suspensoidaan uudestaan sopivaan puskuriliuokseen. Sopivia puskureita voivat olla 10 mM natriumasetaatti, pH 4,5, 10 mM natriumsitraatti, pH 4,0, tai muut sinänsä tunnetut yhteensopivat puskurit (ts. puskurit, jotka eivät denaturoi 5 EG III -sellulaasikomponenttia).
Toisessa edullisessa menetelmässä tämän keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi, yhteensopivaa epäorgaanista suolaa lisätään ensimmäiseen supernatanttiin. Riittävän määrän yhteensopivaa epäorgaanista suolaa lisää-10 minen ensimmäiseen supernatanttiin johtaa oleellisesti kaikkien liuoksessa pysyneiden sellulaasiproteiinien ja ksylanaasin saostumiseen, paitsi EG III -komponentin. Sitten tämä seos sentrifugoidaan ja suodatetaan saostuneiden kontaminoivien proteiinien poistamiseksi, tuloksena toinen 15 supernatantti. EG III käsittää ainakin 80 % toisen super-natantin kokonaissellulaasiproteiinista, geelielektrofo-reesilla määritetyn mukaan. EG III:a voidaan edelleen puhdistaa toisesta supernatantista joukolla eri menetelmiä edellä paljastetun mukaisesti.
20 Yksi menetelmän oleellisista piirteistä on kuiten kin matalamolekyylipainoisen alkoholin käyttö. Alkoholin on havaittu olevan ainutlaatuisen aktiivinen ja selektiivinen muiden sellulaasiproteiinien kuin EG III -komponentin saostamiseksi vesipohjaisista seoksista, jotka sisäl-25 tävät lukuisia muita solun komponentteja. Termi "matalamo-lekyylipainoinen alkoholi", kuten sitä tässä käytetään, * tarkoittaa C1_3-alkoholia [esim. etanoli, metanoli, pro- panoli ja reagenssialkoholi (noin 95 % etanolia ja noin 5 % metanolia)] näiden seosta. "Tehokas määrä matalamole-. 30 kyylipainoista alkoholia" on se vesipohjaiseen seokseen lisättävä määrä, joka on tarpeen riittävän määrän sellu-laasiproteiineja, paitsi EG III -komponenttia, saostami-• seksi selektiivisesti vesipohjaisesta seoksesta oleelli sesti puhtaan EG III -komponentin tuottamiseksi, kun saos-; 35 tuneet proteiinit on poistettu. Edullisesti lisätyn mata- 14 116529 lamolekyylipainoisen alkoholin määrä on noin 1,5 - 2,5 osaa (v/v) vesipohjaisen seoksen tilavuusosaa kohti, edullisemmin määrä on noin 2,0 - 2,4 osaa (v/v), edullisimmin määrä on noin 2,2 osaa (v/v).
5 On havaittu, että lisätyn alkoholin määrään liittyy vaihtokauppa saannon ja puhtauden välillä. 1,5 osan alkoholia kohdalla saadaan suurempi saanto EG III -komponenttia, mutta enemmän kontaminaatiota muilla proteiineilla.
2,5 osan alkoholia kohdalla EG III -komponentti on konta-10 minoitunut vain ksylanaasilla, mutta saanto on alempi. Paras erottuminen ja saanto on havaittu 2,2 osan (v/v) alkoholia kohdalla.
Matalamolekyylipainoisen alkoholin on havaittu olevan erityisen hyödyllinen erotettaessa EG III -sellulaasi-15 komponenttia sellulaasiproteiinien vesipohjaisesta seoksesta, koska vesipohjainen seos sisältää korkean prosenttiosuuden muita sellulaasiproteiineja suhteessa EG III:n prosenttiosuuteen. Esimerkiksi sellulaasikomponenttien tavanomaisen jakauman CYTOLASE 123 -sellulaasisysteemissä 20 uskotaan olevan seuraavanlainen: CBH I 45-55 paino-% CBH II 13 - 15 paino-% EG I 11 - 13 paino-% EG II 8 - 10 paino-% .·' 25 EG III 1-4 paino-% : : BG 0,5-1 paino-% : ; Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan hyödylli- • siä määriä EG III -komponenttia. Menetys EG III -kompo-nentin saannossa tämän keksinnön mukaisella menetelmällä, 30 muihin menetelmiin verrattuna, korvautuu EG III -komponen- « tin saamisen nopeudella. Menetelmä ei vaadi laajoja frak-tiointivaiheita puhdistusta varten, vaikka tällaisia vai- • heitä voidaan haluttaessa seurata jatkopuhdistusta varten. Lisäksi lähtöaineen hinta on mitätön verrattuna puhdiste- 35 tun EG III -komponentin suureen arvoon.
15 116529
Termi "orgaaninen suola", kuten sitä tässä hakemuksessa käytetään, tarkoittaa orgaanista suolaa, joka sisältää ainakin yhden hiiliatomin ja edullisesti 1-7 hiili-atomia, joka, silloin kuin sitä käytetään yhdessä matala-5 molekyylipainoisen alkoholin kanssa, edesauttaa EG III:n puhdistamista. Tällaisiin orgaanisiin suoloihin kuuluvat esimerkiksi natriumasetaatti, sinkkiasetaatti, natriumfor-miaatti ja natriumbetsoaatti ja vastaavat. Orgaanisen suolan pitoisuutta vesipohjaisessa seoksessa voidaan vaihdel-10 la halutun tuloksen saamiseksi. Edullisesti käytetyn or gaanisen suolan määrä on alle noin 30 % (w/v) vesipohjaisen seoksen alkuperäisen tilavuuden mukaan, edullisemmin määrä on noin 5 - 20 % (w/v), edullisimmin määrä on 10 % (w/v). On mahdollista, että orgaanisen suolan lisäys vesi-15 pohjaiseen seokseen ennen matalamolekyylipainoisen alkoholin lisäystä ei ehkä oli välttämätöntä silloin, kun orgaanisia suoloja, kuten natriumbentsoaattia, on jo mukana vesipohjaisessa seoksessa. Kuitenkin ilman orgaanisen suolan lisäystä talteen saatavan EG III -komponentin määrä 20 alenisi.
Termi "epäorgaaninen suola" tarkoittaa yhteensopivaa epäorgaanista suolaa, joka, silloin kuin sitä käytetään yhdessä matalamolekyylipainoisen alkoholin kanssa, edesauttaa EG III:n puhdistamista entsyymiä denaturoimat-. 25 ta. Sopiviin epäorgaanisiin suoloihin kuuluvat suolat, 1 .* joissa on sulfaatti- tai ammoniumioni, edullisemmin am-
moniumsulfaatti. "Tehokas määrä epäorgaanista suolaa" on se määrä, joka alkoholia sisältävään vesipohjaiseen seokseen lisättynä johtaa muiden proteiinien kuin EG III -kom-. , 30 ponentin saostumiseen liuoksesta oleellisesti puhtaan EG
III -komponentin saamiseksi sakan poistamisen jälkeen. Lisätyn epäorgaanisen suolan määrä on edullisesti määrä, joka muodostaa kyllästetyn liuoksen.
EG III -sellulaasikomponentti voidaan puhdistaa 35 ensimmäisestä suodatetusta supernatantista tai toisesta 16 116529 suodatetusta supernatantista sinänsä tunnetulla tavalla. Esimerkiksi yhtä suuren tilavuuden kylmää etanolia lisääminen johtaa EG III -komponentin saostumiseen. Sakka kerätään talteen ja suspendoidaan uudelleen asianmukaiseen 5 puskuriliuokseen. Sopivat puskurit ovat sinänsä tunnettuja, esimerkiksi 10 mM natriumasetaatti, pH 4,5, ja 10 mM natriumsitraatti, pH 4,0. Vaihtoehtoisesti EG III -komponentti voidaan puhdistaa ioninvaihtokromatografialla sinänsä tunnetulla tavalla.
10 Toisessa suoritusmuodossa epäorgaaninen suola voi daan lisätä alkuperäiseen sellulaasia sisältävään vesipohjaiseen seokseen. Matalamolekyylipainoisen alkoholin lisääminen tähän vesipohjaiseen seokseen johtaa muiden entsyymien kuin EG III:n saostumiseen. Sitten tämä seos sent-15 rifugoidaan tai suodatetaan kontaminoivien entsyymien poistamiseksi. EG III -komponentti voidaan puhdistaa supernatantista joukolla eri menetelmiä edellä paljastetun mukaisesti.
Toisessa edullisessa tämän keksinnön mukaisen me-20 netelmän suoritusmuodossa millä tahansa kolmesta edellä kuvatusta menetelmästä saatu EG III -komponentti, poistettuna supernatantista ja uudelleensuspensoituna asianmukaiseen puskuriliuokseen, voidaan edelleen puhdistaa frak-!ti#: tioimalla. Liuoksesta poistetaan suolat käyttäen Sephadex : 25 G-25 -geelisuodatushartsipylvästä, ajoliuoksena 10 mM nat- | riumfosfaattipuskuri pH:ssa 6,8. Sitten liuos, josta suo- lat on poistettu, vietäisiin QA Trisacryl M -anioninvaih-tohartsipylvääseen. Tähän pylvääseen sitoutumaton fraktio sisältäisi EG III:n. Tästä fraktiosta poistettaisiin suo-30 lat käyttäen Sephadex G-25 -geelisuodatushartsipylvästä, joka on tasapainotettu 10 mM natriumsitraatilla, pH 4,5.
* Tämä liuos puolestaan viedään SP Trisacryl M -anionin-,· vaihtohartsipylvääseen, ja EG III -sellulaasikomponentti ; eluoidaan natriumkloridin 200 mM vesiliuoksella. Edeltävä 35 menetelmä on kuvattu samaan aikaan jätetyssä EP-hake- » t » 116529 π musjulkaisussa, sarjanro EP0635057, asiamiehen merkintänu-mero 010 055-106, nimeltään "METHODS FOR PRODUCING SUBSTANTIALLY PURE EG III CELLULASE USING POLYETHYLENE GLYCOL" ("Menetelmiä oleellisesti puhtaan EG III -sellu-5 laasin tuottamiseksi polyetyleeniglykolia käyttäen"), joka sisällytetään tähän kokonaisuudessaan.
Toisessa edullisessa tämän keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuodossa kationinvaihtopylväästä saatu EG III -näyte voidaan edelleen fraktioida. EG III -näytteestä 10 poistetaan suola Sephadex G-25 -pylväällä, joka on edeltä tasapainotettu 10 mM natriumsitraatilla, pH 4. Sitten liuos pannaan FPLC-systeemiin käyttäen Mono-S-HR 5/5 -pylvästä (saatavana yhtiöltä Pharmacia LKB Biotechnology, Pisca-taway, NJ, USA). Pylväs eluoidaan natriumkloridin vesi-15 luoksen gradientilla 0 - 200 mM nopeudella 0,5 ml minuutissa .
On ymmärrettävä, että edeltävät kuvaukset ovat tämän keksinnön mukaisen menetelmän edullisia suoritusmuotoja, ja että lukuisia edeltävien suoritusmuotojen muun-20 nelmia voidaan tehdä menetelmään tämän keksinnön opetuksia noudattaen. Menetelmän eri olosuhteita voidaan muuttaa ja käytettyjä reagensseja vaihtaa, jotta tuotaisiin käytettäviksi erilaisia haluttuja tai optimaalisia talteenotto- * · · _ olosuhteita EG III -sellulaasikomponentille mistä tahansa : 25 sopivasta entsyymien vesipohjaisesta seoksesta, joka si- : sältää EG III -komponenttia.
• » » ·
Kuten ammattimies ymmärtää, hapot, emäkset ja suo-,lat, joihin edeltävässä tämän keksinnön mukaisen menetel-män kuvauksessa viitataan, voidaan korvata sellaisilla ' 30 vastaavilla hapoilla, emäksillä tai suoloilla, joilla saa daan haluttu pH tai haluttu suolapitoisuus keksinnön toi-: mintaa haittaamatta ja jotka eivät denaturoi EG III -sel- ,,· lulaasi komponenttia.
EG III -sellulaasi voidaan puhdistaa mistä tahansa 35 Trichoderma spp. -kannasta, joka tuottaa EG III:a sopivis- 18 1 1 6529 sa fermentaatio-olosuhteissa, tai mistä tahansa muusta mikro-organisista, joka tuottaa sellulaasiproteiineja, mukaan lukien EG III:a. Joskaan EG III:n tietty lähde ei ole kriittinen, edullisia lähteitä ovat Trichoderma reesei 5 ja Trichoderma viride. Erityisen edullinen lähde Trichoderma reesein EG III:lie on CYTOLASE 123 -sellulaasi, joka on kaupallisesti saatavana yhtiöltä Genencor International, Inc., 180 Kimball Way, South San Francisco, CA 94080.
10 EG III:n eristämisen tehokkuuden parantamiseksi voi olla haluttavaa käyttää Trichoderma reeseitä, joka on geneettisesti muokattu niin, että se yliekspressoi EGIII:a ja/tai on kykenemätön tuottamaan yhtä tai useampaa komponenteista EG I, EG II, CBH I ja/tai CBH II tai ksylanaa-15 siä. Tämä johtaa välttämättä EG III -komponentin tehokkaampaan eristykseen, esimerkiksi edellä kuvatun mukaisesti alkoholiuutolla. Esimerkiksi edempänä esimerkeissä esitetyillä fraktiointimenetelmillä valmistettua oleellisesti puhdasta EG III:a käytettiin proteiinin osien aminohappo-20 järjestyksen määrittämiseen tunnetuilla sekvensointimene-telmillä (esimerkki 4). Tätä tietoa voidaan käyttää synteettisten DNA-koettimien valmistamiseen EG III -sellulaa-sikomponenttia koodittavan geenin kloonaamikseksi. Sitten kun EG III -geeni on kloonattu, sitä voitaisiin manipuloi-25 da sinänsä tunnetulla tavalla ja lopulta sijoittaa eri » ♦ ' Trichoderma spp. -kantoihin tai muihin mikro-organismei- · hin. Ks. esimerkiksi US-hakemusjulkaisu sarjanro ,..07/770 049, jätetty 4. lokakuuta 1991, osittainen jat-kohakemus US-hakemusjulkaisuille sarjanro 07/593 919, jä-; 30 tetty 5. lokakuuta 1990, ja US-hakemusjulkaisu sarjanro 07/668 640, jätetty 13. maaliskuuta 1991, jotka kaikki paljastavat menetelmiä Trichoderma reesein käsittelemiseksi geeniteknologisin menetelmin niin, että muunnettu mikro-organismi ei kykene ekspressoimaan yhtä tai useampaa ·’ * 35 sellulaasigeeneistä tai ksylanaasigeeneistä ja voi itse- 19 116529 asiassa ylituottaa toista sellulaasigeeniä. US-hakemus-julkaisujen sarjanro 07/770 049, jätetty 4. lokakuuta 1991, sarjanro 07/593 919, jätetty 5. lokakuuta 1990, ja sarjanro 07/668 640, jätetty 13. maaliskuuta 1991, paljas-5 tukset sisällytetään tähän viitteinä kokonaisuudessaan.
Käyttäen näissä hakemuksissa kuvattuja menetelmiä Trlchoderma reeseitä voidaan manipuloida geneettisesti niin, että se tuottaa EG III:a yhdessä muiden sellulaasi-proteiinien kanssa tai niitä ilman. Lisäksi näissä hake-10 muksissa kuvatut menetelmät luovat Trlchoderma reesei -kantoja, jotka eivät tuota mitään heterologista proteiinia.
Lisäksi olisi mahdollista ekspressoida EG 111:a koodittavaa geeniä muissa mikro-organismeissa, mukaanluet-15 tuina, mutta näihin rajoittumatta, hiivalajit, kuten
Saccharomyces cerevislae, Pichia pastoris, Hansenula poly-morpha, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schan-niomyces occidentalis jne. Ks. esimerkiksi PCT-hakemusjulkaisu nro W0 85/04 672. Ekspression saamiseksi aikaan 20 näissä vaihtoehtoisissa, Trichodermasta poikkeavissa isännissä, voi olla tarpeen yhdistää funktionaalisesti EG III:a koodittava DNA-sekvenssi kulloisestakin isännästä olevasta geenistä saatujen promoottori- ja terminaattori-,···, sekvenssien kanssa. Voi olla tarpeen korvata EG III:n eri- " 25 tyssignaalisekvenssiä koodittava DNA-sekvenssi vaihtoeh- .toisen isännän erityssignaalisekvenssiä koodattavalla DNA-,”i' sekvenssillä. EG III:n tuotto ja eritys muissa eliöissä • voisi mahdollistaa EG III:n saamisen oleellisesti puhtaas- sa muodossa.
, ·’ 30 Edellä kuvattu oleellisesti puhdas EG III -sellu- laasi voidaan edelleen prosessoida nestemäiseen laimennus-; aineeseen, rakeisiin, emulsioihin, geeleihin, tahtaisiin ja vastaaviin. Ammattimies tuntee tällaiset muodot. Kun halutaan kiinteä pesuainekoostumus, sellulaasikoostumus 35 formuloidaan edullisesti rakeiksi. Edullisesti rakeet for- 20 116529 muloidaan siten, että ne sisältävät sellulaasia suojaavaa ainetta. Ks. esimerkiksi US-hakemusjulkaisu sarjanro 07/642 669, jätetty 17. tammikuuta 1991 asiamiehen merkin-tänumerolla 010 055-073, nimeltään "GRANULES CONTAINING 5 BOTH AN ENZYME AND AN ENZYME PROTECTING AGENT AND DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING SUCH GRANULES" ("Rakeita, jotka sisältävät sekä entsyymiä että entsyymiä suojaavaa ainetta, sekä tällaisia rakeita sisältäviä pesu-ainekoostumuksia"), joka hakemus sisällytetään tähän koko-10 naisuudessaan viitteenä. Rakeet voidaan formuloida yhtälailla niin, että ne sisältävät materiaaleja, jotka alentavat niiden liukenemisnopeutta pesuliuokseen. Tällaisia materiaaleja ja rakeita paljastetaan US-hakemusjulkaisussa sarjanro 07/642 596, jätetty 17. tammikuuta 1991 asiamie-15 hen merkintänumerolla GCS-171-US1, nimeltään "GRANULAR COMPOSITIONS" ("Raemuotoisia koostumuksia"), joka hakemus sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viitteenä.
Seuraavat esimerkit tarjotaan tämän keksinnön havainnollistamiseksi, eikä niitä pidä ymmärtää millään ta-20 valla tämän keksinnön suoja-alaa rajoittaviksi.
Esimerkit
Esimerkki 1 EG III:n suuren mittakaavan puhdistus Cytolase 123 ., -sellulaasista 25 A. Orgaaninen suola ja matalamolekyylipainoinen alkoholi • · Soluttomaan sellulaasisuodokseen CYTOLASE 123 (kau pallisesti saatavana yhtiöltä Genencor International, Inc., South San Fransisco, CA, USA, joka on tuotettu tuo-30 tettu Trichoderma reesein villityypistä), lisättiin 10 % natriumasetaattia (w/v). pH säädettiin arvoon 9,5 lisää-; mällä 50-%:ista NaOH:a. Asetaatin liuettua, yhteen osaan sellulaasisuodosta (tilavuus perustuen suodoksen alkuperäiseen tilavuuteen) lisättiin 2,2 osaa (v/v) etanolia 35 huoneenlämpötilassa. Etanoli-suodos-seos sentrifugoitiin ,, 1 1 6529 21 kiihtyvyydellä 10 000 x g 10 minuuttia, ja ensimmäinen supernatantti kerättiin talteen ja suodatettiin. Ensimmäinen supernatantti sisältää EG III -komponentin. Tähän suodatettuun supernatanttiin lisättiin yhtä suuri tilavuus 5 etanolia -15 °C:n lämpötilassa. Tämä seos sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 10 minuuttia, ja sakka otettiin talteen. Tämä sakka suspensoitiin uudestaan puskuriliuokseen.
Esimerkissä 6 kuvatulla menetelmällä saadun RBB-10 CMC-aktiivisuuden mukaan on määritetty, että noin 21 -100 % EG III:n kokonaismäärästä saadaan talteen tällä menetelmällä sellulaasisuodoksesta. Geelielektroforeesilla, kuten esimerkissä 7 kuvataan, määritettiin, että EG III -komponentti käsittää ainakin noin 50 % sakassa olevasta 15 kokonaissellulaasi proteiinista. Tämän esimerkin mukainen sellulaasisuodos sisältää lisäksi ksylanaasia, jonka pitoisuus on rikastunut tällä menetelmällä (so. ksylanaasi-pitoisuuden nousu ainakin nelinkertaisesti), ja toista tuntemantonta epäpuhtausproteiinia.
20 pH:ta ei tarvitse säätää natriumasetaatin lisäyksen jälkeen, mutta pH:n nosto arvoon noin 9,5 parantaa puhdistumista.
Muita alkoholeja on kokeiltu etanolin paikalla. Metanoli, propanoli ja reagenssialkoholi (95 % etanolia ja 25 5 % raetanolia) antavat hyvin samankaltaiset vaikutukset.
Reagenssialkoholi on yhtä hyödyllinen kuin puhdas etanoli ja halvempaa.
Muita suoloja on kokeiltu natriumasetaatin paikalla: sinkkiasetaattia, natriumformiaattia ja natriumbentso-30 aattia. Sinkkiasetaatti vaikuttaa olevan yhtä tehokas kuin natriumsuola. Formiaatilla ja bentsoaatilla saatiin hieman kohonneita, joskin edelleen hyväksyttäviä epäpuhtausprote-iinien tasoja.
22 116529 B. Epäorgaanisen suolan lisäys
Toisessa kokeessa edellisen menetelmän mukaiseen suodatettuun supernatanttiin lisättiin ammoniumsulfaattia enemmän kuin liuoksen kyllästämiseen tarvittiin huoneen-5 lämpötilassa ja sekoitettiin noin tunnin ajan. Tämä seos sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 10 minuuttia, ja saatu toinen supernatantti kerättiin talteen ja suodatettiin. Toinen supernatantti sisältää EG III -komponentin. Sakka sisältää rikastettua ksylanaasia. Yhtä suuri tila-10 vuus etanolia lisättiin tähän toiseen supernatanttiin -15 °C:n lämpötilassa ja sekoitettiin noin 5 minuuttia, ja sakka kerättiin talteen sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 10 000 x g 10 minuuttia. Sakka suspensoitiin uudelleen puskuriliuokseen.
15 Ammoniumsulfaatin lisääminen vähentää EG III -kom ponentin saannon määrää alkuperäisessä sellulaasisuodok-sessa olleesta EG III -komponentin kokonaismäärästä, mutta lisää Eg III -komponentin puhtaustasoa. EG III -komponentti käsittää ainakin 80 % sakan sellulaasiproteiinien koko-20 naismäärästä geelielektroforeesilla määritetyn mukaisesti.
EG III -sellulaasi muista Trichoderma spp. -kannoista voidaan puhdistaa yhtä lailla. Esimerkiksi Voragen ym., Methods in Enzymology, 160:243-249, ovat kuvanneet Trichoderma viridesta peräisin olevan EG III -sellulaasin. 25 Tämä viite kuvaa EG III -sellulaasin sellaisena, jolla on molekyylipaino noin 23,5 kDa, pH-optimi noin 5,5 ja pl noin 7,7.
EG III:n eristyksen tehokkuuden parantamiseksi voi olla haluttavaa käyttää sillä tavalla geneettisesti muun-
: 30 nettua Trichoderma reeseitä, että se yliekspressoi EG
III:a ja/tai on kykenemätön tuottamaan yhtä tai useampaa ; komponenteista EG I, EG II, CBH I ja/tai CBH II tai ksy- ♦ lanaasikomponentteja.
23 116529
Esimerkki 2 EG III:n puhdistus fraktioimalla Tämän esimerkin kohdassa a mukaisesti saadusta ensimmäisestä supernatantista tai toisesta supernatantista 5 olevaa oleellisesti puhdasta EG III -komponenttia voidaan puhdistaa edelleen fraktioimalla saostamisen ja asianmukaiseen puskuriliuokseen uudelleensuspensoinnin jälkeen. Lisäksi alkuperäinen sellulaasisuodos voidaan puhdistaa tällä menetelmällä. Spesifisesti fraktiointi tehdään käyt-10 täen seuraavia hartseja sisältäviä pylväitä: Sephadex G-25 -geelisuodatushartsi yhtiöltä Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA), QA Trisacryl M -anioninvaihtohartsi ja SP Trisacryl M -kationinvaihtohartsi yhtiöltä IBF Biotechnics (Savage, MD, USA).
15 Tässä esimerkissä CYTOLASE 123 -sellulaasista, 0,5 g, poistettiin suolat käyttäen 3 litran pylvästä Sephadex G-25 -geelisuodatushartsia 10 mM natriumfosfaat-tipuskurin, pH 6,8, kanssa. Sitten liuos, josta suolat oli poistettu, vietiin 20 ml:n pylvääseen QA Trisacryl M -ani-20 oninvaihtohartsia, joka oli tasapainotettu 10 mM natrium-fosfaattipuskurilla, pH 6,8. Tähän pylvääseen sitoutuva fraktio sisälsi CBH I:n ja EG I:n. Tähän pylvääseen sitoutumaton fraktio sisältää CBH II:n, EG II:n ja EG III:n. Näistä fraktioista poistettiin suolat käyttäen pylvästä 25 Sephadex G-25 -geelisuodatushartsia, joka oli tasapaino- * tettu 10 mM natriumsitraattipuskurilla, pH 4,5. Sitten : tämä liuos, 200 ml, vietiin 20 ml:n pylvääseen SP Trisac ryl M -kationinvaihtohartsia. EG III eluoitiin 100 ml:11a natriumkloridin 200 mM vesiliuosta.
: 30 Eräs erityinen menetelmä EG III:n puhdistamiseksi edelleen on tässä esimerkissä 2 saadun EG III -näytteen fraktiominen edelleen. Lisäfraktio tehtiin FPLC-systeemil-, lä käyttäen Mono-S-HR 5/5 -pylvästä (saatavana yhtiöltä
Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). FPLC-systee-35 mi koostuu nestekromatografian säätöyksiköstä, kahdesta 24 116529 pumpusta, kaksitiemonitorista, fraktionkerääjästä ja piirturista (jotka kaikki ovat saatavana yhtiöltä Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Fraktiointi toteutettiin poistamalla suolat 5 mlrsta sitä EG III -näytettä, 5 joka oli valmistettu tässä esimerkissä 2, 20 ml:n Sepha- dex G-25 -pylväällä, joka oli ennalta tasapainotettu 10 mM natriumsitraatilla, pH 4. Liuos vietiin Mono-S-HR 5/5 -pylvääseen, joka oli ennalta tasapainotettu 10 mM natriumsitraatilla, pH 4, ja sitten eluoitiin 0 - 200 mM NaCl-10 gradientilla vedessä nopeudella 0,5 ml minuutissa keräten näytteet 1 ml:n fraktioiksi. EG III saatiin talteen fraktioissa 10 ja 11, ja sen määritettiin olevan yli 90-%:isen puhdasta geelielektroforeesilla. Näin puhdas EG III sopii N-terminaalisen aminohapposekvenssin määrittämiseen sinän-15 sä tunnetulla tavalla.
Oleellisesti puhtaalla EG III:11a on seuraavat ominaispiirteet, joita verrataan muihin Trichoderma Teeseistä eristettyihin endoglukaanaseihin.
20 Taulukko I
MP pl pH-optimi1 EG " 47 - 49 kDa 4,7 '5 EG II ” 35 kDa 5,5 '5 EG III - 25 - 28 kDa 7,4 ~ 5,5 - 6,0 25 1pH-optimi määritettiin RBB-CMC-aktiivisuuden mukaan seu-: raavan esimerkin 3 mukaisesti.
Kuten edeltävästä taulukosta nähdään, EG III:11a on ’ 30 sekä korkeampi pH-optimi että korkeampi pl muihin Tricho derma reesein endoglukanaasikomponentteihin verrattuna. Seuraavassa esimerkissä 3 nähdään, että EG III :11a säilyy merkittävä RBB-CMC-aktiivisuus aikalisissä pH-arvoissa.
EG III -sellulaasi muista Trichoderma spp. -kan-35 noista voidaan puhdistaa yhtä lailla. Esimerkiksi Voragen 25 116529 ym., Methods in Enzymology, 160: 243 - 249, ovat kuvanneet Trichoderma virldesta peräisin olevan EG III -sellulaasin. Tämä viite kuvaa EG III -sellulaasin sellaisena, jolla on molekyylipaino noin 23,5 kDa, pH-optimi noin 5,5 ja pi 5 noin 7,7.
EG III:n eristyksen tehokkuuden parantamiseksi voi olla haluttavaa käyttää sillä tavalla geneettisesti muunnettua Trichoderma reeseitä, että se yliekspressoi EG III:a ja/tai on kykenemätön tuottamaan yhtä tai useampaa 10 komponenteista EG I, EG II, CBH I ja/tai CBH II tai ksy-1anaas ikomponenttej a.
Esimerkki 3
Sellulaasikoostumusten aktiivisuus eräällä pH-alu- eella 15 Seuraavaa menettelyä käytettiin määrittämään kahden erilaisen sellulaasikoostumuksen pH-profiilit. Ensimmäinen sellulaasikoostumus oli CBH I- ja CBH II -deletoitu sellu-laasikoostumus, joka oli valmistettu Trichoderma Teeseistä, jota oli geneettisesti muunnettu samankaltaisesti, 20 kuin edempänä kuvataan, niin että se ei kykene tuottamaan CBH I- ja CBH II -komponentteja. Koska tämä sellulaasikoostumus ei sisällä CBH I:tä ja CBH II:ta, jotka yleensä käsittävät noin 58 - 70 % Trichoderma reeseistä peräisin olevasta sellulaasikoostumuksesta, tämä sellulaasikoostu-25 mus on välttämättä rikastunut EG-komponenttien suhteen.
r i
Koska EG III on vähäisin Trichoderma reesein endoglukanaa-> sikomponenteista, tässä koostumuksessa on pääasiassa EG I- ja EG II -komponentteja.
Toinen sellulaasikoostumus oli noin 20 - 40 % puh-30 das EG III -fraktio, joka oli eristetty Trichoderma reeseistä peräisin olevasta sellulaasikoostumuksesta esimerkin 2 kanssa samankaltaisin puhdistusmenetelmin.
Näiden sellulaasikoostumusten aktiivisuus määritettiin 40 °C:n lämpötilassa, ja määritykset tehtiin seuraa-35 via menettelyjä käyttäen.
26 116529
Lisää 5 - 20 μΐ asianmukaista entsyymiliuosta riittävässä pitoisuudessa, jotta saadaan tarvittava määrä entsyymiä lopulliseen liuokseen. Lisää 250 μΐ 2-%:ista RBB-CMC:tä (Remazol Brilliant Blue R-carboxymethyl-cellulose, 5 saatavana kaupallisesti yhtiöltä MegaZyme, 6 Aitona Place, North Rocks, N.S.W. 2151, Australia) 0,05 M sitraatti/fos-faattipuskurissa, pH:issa 4, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 ja 8.
Vortex-sekoita ja inkuboi 40 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Jäähdytä jäähauteella 5-10 minuuttia. Lisää 10 1 000 μΐ 2-metoksietanolia, joka on 0,3 M natriumasetaatin ja 0,02 M sinkkiasetaatin suhteen. Vortex-sekoita ja seisota 5-10 minuuttia. Sentrifugoi ja kaada supernatantti kyvetteihin.
Suhteellinen entsyymiaktiivisuus määritettiin mit-15 taamalla jokaisessa kyvetissä olevan liuoksen absorbanssi (OD) aallonpituudella 590 nm. Korkeammat absorbanssitasot vastaavat korkempia entsyymiaktiivisuustasoja. Tämän analyysin tulokset esitetään kuviossa 1, joka kuvaa CBH I- ja CBH II -deletoidun sellulaasikoostumukset suhteellista ak-20 tiivisuutta verrattuna EG III -sellulaasikoostumukseen. Tästä kuviosta nähdään, että sellulaasikoostumuksella, josta on deletoitu CBH I ja CBH II, on optimaalinen selluloosaa hajottava aktiivisuus RBB-CMC:tä kohtaan lähellä pHita 5,5, ja sillä on jonkin verran aktiivisuutta alkali-25 sessa pH:ssa, ts. pH-arvoissa 7-8 yläpuolella. Toisaalta sellulaasikoostumuksella, joka on rikastettu EG III:n suh-J · | teen, on optimaalinen selluloosaa hajottava aktiivisuus :· pHrssa noin 5,5 - 6, ja sillä on merkittävää aktiivisuutta j· alkalisessa pHrssa.
30 Esimerkki 4
Isoelektriset fokusointigeelit
Tämän esimerkin tarkoitus on esittää eri EG III
t -sellulaasikoostumusten isoelektrisiä fokusointigeelejä. Erityisesti Trichoderma reesein villityypin tuottama sel-: 35 lulaasi, sellaisesta Trichoderma reesei -kannasta saatu * » 27 116529 sellulaasi, joka oli transformoitu niin, ettei se kyennyt ekspressoimaan EG I- ja EG II -sellulaasiproteiineja, ja oleellisesti puhdas EG III -sellulaasi esimerkkiä 2 muistuttavien puhdistusmenetelmien kautta analysoitiin iso-5 elektrisillä fokusointigeeleillä.
Näytteitä näistä sellulaaseista analysoitiin iso-elektrisillä fokusointigeeleillä käyttäen Pharmacian IEF-systeemiä (FBE-3000, Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, USA) ja pH 3 - 10 esivalettuja geelejä (Servalyt Precote, saa-10 tavana yhtiöltä Serva, Carl-Berg, Saksa) valmistajan oh jeiden mukaisesti. Geelit värjättiin Ephortee™-väriaineella (Serva Blue W, saatavana yhtiöltä Serva Fine Chemicals, Westbury, NY 11590, USA) proteiinivyöhykkeiden visualisoi-miseksi. Tuloksena saatu geeli esitetään kuviossa 2, jossa 15 kuvion 2 kaista 1 esittää Trichoderma reesein villikannas-ta peräisin olevan sellulaasin isoelektristä fokusointi-geeliä, kaista 2 esittää sellaisesta Trichoderma reesei -kannasta peräisin olevan sellulaasin isoelektristä fo-kusointigeeliä, joka on transformoitu niin, ettei se kyke-20 ne ekspressoimaan EG I:tä eikä EG II:ta, ja kaista 3 esittää esimerkin 2 mukaista menetelmää käyttäen saadun oleellisesti puhtaan EG III -sellulaasin isoelektristä foku-sointigeeliä. Tässä kuviossa kaistan 1 viereisessä marginaalissa on merkinnät, joilla identifioidaan sellulaasi-' ···* 25 proteiineja vastaavat vyöhykkeet proteiinien tunnistamisen mahdollistamiseksi.
· Tämä kuvio osoittaa, ettei EG III ole EG I:n eikä j‘ EG II:n hajoamistuote, koska tämän kuvion kaistalla 2 nämä proteiinit eivät esiinny, kun taas EG III esiintyy.
30 Esimerkki 5 EG III:n peptidisekvensointi
Esimerkin 2 mukaisella puhdistusmenetelmällä saatu ‘ oleellisen puhdas EG III -komponentti seostettiin lisää mällä 0,9 ml asetonia 0,1 ml:aan proteiiniliuosta (pitoi- • 35 suudessa 1 mg/ml) ja inkuboimalla -20 °C:n lämpötilassa 10 ♦ 28 116529 minuuttia. Proteiini kerättiin talteen sentrifugoimalla, ja pohjasakka kuivattiin ja suspensoitiin uudelleen 0,01 ml:aan 8 M ureaa 88-%:isessa muurahaishapossa ja 0,01 ml:aan syanogeenibromidia (200 mg/ml) 88-%:isessa muura-5 haishapossa. Seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa neljä tuntia.
Yksittäset peptidit puhdistettiin HPLC-pylväällä (korkeapainenestekromatografiapylväällä). Synchropak RP-4 -pylväs tasapainotettiin deionisoidulla milli-Q-vedellä, 10 jossa oli 0,05 % TEA:ta (trietyyliamiinia) ja 0,05 % TFA:ta (trifluorietikkahappoa). Näyte vietiin HPLC-pylvää-seen ja eluutio suoritettiin 100-%:isella asetonitriilillä ja 0,05-%:isella TEA:11a ja 0,05-%:isella TFA:11a, gradientin ollessa 1 % minuutissa. Eristettyjen peptidien 15 aminoterminaaliset alueet sekvensoitiin Edmanin menetelmällä käyttäen täysiautomaattista laitteistoa. Kahdesta EG III -komponentin fragmentista saatu aminohapposekvenssi esitetään kuviossa 3.
Esimerkki 6 20 EG III -sellulaasin saannon määritys 20 μΐ näytettä (tai standardia) pantiin omaan ep-pendorf-putkeensa. Käyttäen Eppendorf-toistopipettiä (Ep-pendorf Repeat Pipette™), 250 μΐ substraattia lisättiin näytteisiin ja standardeihin. Kaikki eppendorf-putket vor- I · *·** 25 tex-sekoitettiin välittömästi. Sitten putkia inkuboitiin 37 °C:n vesihauteella 30 minuuttia. Inkubaation päätteeksi ;,· jokaiseen putkeen lisättiin 1 ml saostusainetta Eppendorf- toistopipettiä käyttäen. Putkia vortex-sekoitettiin kii- ;· vaasti. Näytteitä sentrifugoitiin 3 minuuttia kiihtyvyy- 30 dellä 5 000 x g. Supernatantti kaadettiin kertakäyttöky- vetteihin, ja absorbanssi aallonpituudella 590 nm määri- *, tettiin käyttäen 0 U/ml-standardia nollausnäytteenä.
> Näytteet laimennettiin niin, että niiden aktiivisuudet tulivat standardien alueelle 1,5 - 6,0 yksikköä/ml.
: 35 Näytteet tehtiin kahtena rinnakkaisena.
29 116529
Standardi oli Genencorin CYTOLASE 123, erä 87111. Tämän on määritelty sisältävän 1 000 RBB-CMC-yksikköä/ml. Asianmukaiset laimennukset tehtiin 0, 1,5, 3,0, 4,5 ja 6,0 yksikköä/ml sisältävien standarditiuosten tekemiseksi. 5 Standardit tehtiin kahtena rinnakkaisena.
Substraatti valmistettiin lisäämällä 2 g kuivaa RBB-CMC:tä (Azo-M-Cellulose, saatu yhtiöltä MegaZyme, Ltd.) 80 ml:aan juuri keitettyä deionisoitua vettä. Seosta sekoitetaan kiivasti sen jäähtyessä huoneenlämpötilaan, 10 kunnes kaikki substraatti oli liuennut. 5,0 ml 2 M natri-umasetaattiliuosta lisättiin, liuoksen pH säädettiin arvoon 4,5 ja tilavuus 100 mlrksi. 1:100 laimennus 2-%:ista natriumatsidiliuosta lisättiin, tuloksena lopullinen kon-sentraatio 200 miljoonasosaa.
15 Sakka valmistettiin lisäämällä 33 g vedetöntä nat- riumasetaattia ja 4 g sinkkiasetaattia 150 ml:aan tislattua vettä. Liuoksen pH säädettiin arvoon 5,0 5 M HCl:lla, ja tilavuus säädettiin 200 ml:ksi, ja 800 ml etanolia lisättiin.
20 Saatiin seuraavat tulokset ja arviot:
Taulukko 11 Näyte EG III:n tiliin Arvioitu pro- laskettavia RBB- senttiosuus '···’ 25 CMC-yksiköitä
Vesipohjainen 2 025 - 10 800 100 % :, * seos
Ensimmäinen su- 2 300 21 - 100 % t t t n pernatantti esi-30 merkistä 1 EG III:11a uskotaan olevan spesifinen aktiivisuus • 15 - 20 RBB-yksikköä milligrammaa proteiinia kohti.
30 116529
Esimerkki 7 EG III -komponentin SDS-PAGE-geelit
Ajettavat näytteet laimennetaan niin, että ne sisältävät noin 1 - 3 mg proteiinia/ml. 100 μΐ näytettä pan-5 naan eppendorf-putkeen yhdessä 25 μ1:η liuosta "5x PDS" kanssa, vortex-sekoitetaan ja kuumennetaan 98 °C:n lämpötilassa 5 minuuttia. Seuraavaksi 12 μΐ kutakin näytettä otetaan ja ladataan kuoppaan. Geeli ajetaan 40 mA:lla va-kiovirralla noin 90 minuuttia ajopuskurissa, joka on lai-10 mennettu lx vahvuuteen tislatulla vedellä.
Ajon mentyä loppuun geeli otetaan pois lasilevyjen välistä ja upotetaan värinpoistoliuokseen 30 minuutiksi kevyessä sekoituksessa proteiinien kiinnittämiseksi. Seuraavaksi geeli värjätään Coomassie Blue -väriaineella jää-15 etikan kanssa tunnin ajan kevyessä sekoituksessa. Tausta-värjäytymistä poistetaan värinpoistoliuoksessa noin 18 tuntia.
Esivaletut geelit saatiin yhtiöltä Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Geeliä, jossa oli akryyliamidigra-20 dientti 10 - 20 %, tai 12,5-%:ista ei-gradienttigeeliä käytettiin. Elektroforeesi suoritettiin Daiichin elektro-foreesikammiossa.
"5x PDS" sisältää 2,5 ml 20-%:ista natriumdodekyli-sulfaattia, 1 ml glyserolia, 0,5 ml 0,5 M natriumfosfaat-’··* 25 tia, pH 6,6, 1 ml tislattua vettä, 0,1 ml β-merkaptoeta- • !,’ nolia ja 10 mg bromifenolisinistä. Ajopuskuri sisältää j j 30,25 g Tris-emästä, 144,5 g ultrapuhdasta glysiiniä, mil- :· li-Q-H20:ta 1 Iraan asti, 5 ml 20-%:ista SDSrää. Värinpois- • toliuos sisältää 82,5 ml jääetikkaa, 200 ml etanolia ja 30 tislattua vettä 1 Iraan asti. Coomassie Blue -väriaine sisältää brilliant blueta (Sigman nro. B-0630) 2,5 g, etanolia 250 ml, tislattua vettä 1 Iraan asti. Ennen käyttöä » sekoita 90 ml Coomassie blue -väriainetta 10 mlrn jääetikkaa kanssa.
> » * » 31 116529
Tulokset esitetään kuviossa 4, jossa nähdään kaistalla 11 proteiinit, joita ekspressoi sellainen Trichoderma reesei -kanta, joka on transformoitu niin, ettei se kykene ekspressoimaan EG I- eikä EG II -komponenttia, ja 5 kaista 2 esittää esimerkin 1 mukaisella menetelmällä sellaisesta Trichoderma reesei -kannasta, joka on transformoitu niin, ettei se kykene ekspressoimaan EG I- eikä EG II -komponenttia, saadussa oleellisesti puhtaassa EG III -sellulaasissa esiintyviä proteiineja, jossa 10 % w/v 10 sinkkiasetaattia ja 2 osaa etanolia lisättiin sellulaasi-seokseen.
Esimerkki 8
Trichoderma reesein Pyr4‘-johdannaisten selektio
Pyr4-geeni koodittaa orotidiini-5' -monofosfaattide-15 karboksylaasia, entsyymiä, joka tarvitaan uridiinin biosynteesiin. Villityyppiset solut liittävät toksisen inhibiittorin 5-fluoriorotiinihapon (FOA) uridiiniin ja siten myrkyttävät solut. Kuitenkin solut, joilla pyr4-geeni on vajavainen, ovat resistenttejä tälle inhibiittorille, mut-20 ta vaativat uridiinia kasvaakseen. Siksi on mahdollista selektoida pyr4-kantojen johdannaisia FOA:ta käyttäen. Käytännössä T. reesei -kannan RL-P47 [Sheir-Neiss, G. ja Montenecourt, B. S., Appi. Microbiol. Biotechnol. 20, s. 46-53 (1984)] itiöitä levitettiin kiinteytyneen elatus- • ' 25 aineen pinnalle, joka sisälsi 2 mg/ml uridiinia ja 1,2 » mg/ml FOA:ta. Spontaaneja FOA-resistenttejä pesäkkeitä ; ilmestyi 3-4 päivän kuluessa, ja sittemmin oli mahdol lista tunnistaa ne FOA-resistentit johdannaiset, jotka vaativat uridiinia kasvaakseen. Niiden johdannaisten tun-30 nistamiseksi, joilla oli spesifisesti viallinen pyr4-gee-ni, muodostettiin protoplasteja ja transformoitiin plasmidilla, joka sisälsi villityyppisen pyr4-geenin (ks. ·’ esimerkit 10 ja 11). Transformaation jälkeen protoplastit maljattiin elatusaineelle, josta puuttui uridiini. Tämän • 35 jälkeinen transformoitujen pesäkkeiden kasvu osoitti vial- - # 32 116529 lisen pyr4-geenin komplementaation plasmidin tuomalla pyr4-geenillä. Tällä tavalla kanta GC69 tunnistettiin kannan RL-P37 pyr4"-johdannaiseksi.
Esimerkki 9 5 CBHI-deleetiovektorin valmistus CBHI-proteiinia koodittava cbhl-geeni kloonattiin T. reesei -kannan RL-P37 genomisesta DNA:sta sellaisella oligonukleotidikoettimella hybridisoimalla, joka oli suunniteltu perustuen tämän geenin julkaistuun sekvenssiin 10 (Shoemaker ym., 1983b), käyttäen tunnettuja koettimen synteesimenetelmiä, cbhl-geeni sijaitsee 6,5 kb:n Pstl-fragmentissa, ja se sijoitettiin Pstlzllä katkaistuun pUC4K:hon (hankittu yhtiöltä Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, USA), mikä korvaa tämän vektorin Kanr-geenin, käyttäen 15 alalla tunnettuja menetelmiä, jotka menetelmät esitetään teoksessa Maniatis ym. (1989) ja liitetään tähän viitteeksi. Tuloksena saatu plasmidi, pUC4K::cbhl, katkaistiin sitten HindIII:lla, ja suurempi, noin 6 kb:n fragmentti eristettiin ja ligoitiin uudelleen, tuloksena 20 pUC4K::cbhlAH/H (ks. kuvio 5). Tämä menettely poistaa koko cbhl:n koodattavan sekvenssin ja noin 1,2 kb ylävirtaan ja 1,5 kb alavirtaan viereisiä sekvenssejä. Noin 1 kb reunustavaa DNA:ta alkuperäisen PstI-fragmentin kummastakin päästä jää jäljelle.
25 T. reesein pyr4-geeni kloonattiin genomisen DNA:n • 6,5 kb:n HindIII-fragmenttina pUC18:aan, tuloksena pTpyr2 * (Smith ym., 1991) Maniatisin ym., em. teos, menetelmiä noudattaen. Plasmidi pUC4K::cbhlAH/H katkaistiin Hindlll:11a ja päät defosforyloitiin vasikan suolen alka- ; ; 30 lisella fosfataasilla. Tämä päistä defosforyloitu DNA li- gatoitiin 6,5 kb:n Hindlll-fragmenttiin, joka sisälsi T. reesein pyr4-geenin, tuloksena pACBHIpyr4. Kuvio 5 havain-' nollistaa tämän plasmidin konstruktiota.
I » S » 33 116529
Esimerkki 10
Protoplastien eristys
Myseeliä saatiin ymppäämällä 100 ml:aan YEG:tä (0,5-%:inen hiivauute, 2-%:inen glukoosi) 500 ml:n pullos-5 sa noin 5 x 107 T. reesei GC69:n itiötä (pyr4-johdannais-kanta). Sitten pulloa inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa ravistelussa noin 16 tuntia. Myseeli kerättiin talteen sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 2 750 x g. Talteen otettua myseeliä pestiin vielä 1,2 M sorbitoliliuoksella ja sus-10 pensoitiin uudelleen 40 ml:aan liuosta, joka sisälsi 5 mg/ml Novozym* 234 -liuosta (joka on kauppanimi monikompo-nenttiselle entsyymisysteemille, joka sisältää 1,3-a-glu-kanaasia, 1,3-B-glukanaasia, laminarinaasia, ksylanaasia, kitinaasia ja proteaasia, yhtiöltä Novo Biolabs, Danbury, 15 CT, USA), 5 mg/ml MgS04.7H20:a, 0,5 mg/ml naudan seerumin albumiinia, 1,2 M sorbitolia. Protoplastit erotettiin so-lujätteiden joukosta suodattamalla Miraclothin (Calbiochem Corp, La Jolla, CA, USA) läpi ja kerättiin talteen sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 2 000 x g. Protoplasteja pestiin 20 kolmesti 1,2 M sorbitolilla ja kerran 1,2 M sorbitolilla, jossa oli 50 mM CaCl2, sentrifugoitiin ja suspensoitiin uudelleen tiheyteen noin 2 x 108 protoplastia/ml liuosta 1,2 M sorbitoli, 50 mM CaCl2.
Esimerkki 11 i » ' · ’ 25 Sieniprotoplastien transformaatio pACBHIpyr4:llä I I » 200 μΐ esimerkissä 10 valmistettua protoplastisus-* pensiota lisättiin 20 pl:aan EcoRI-digestoitua pACBHI-
’ pyr4:ää (valmistettu esimerkissä 9) TE-puskurissa (10 mM
Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA), ja 50 pl:aan polyetyleeniglyko-30 li- (PEG-) liuosta, joka sisälsi 25 % PEG 4 000:ta, 0,6 M KC1 ja 50 mM CaCl2. Tätä seosta inkuboitiin jäillä 20 minuuttia. Tämän inkubaatioajan jälkeen 2,0 ml edellä yk-’ silöityä PEG-liuosta lisättiin siihen, liuosta sekoitet- tiin edelleen ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa. Tämän : 35 toisen inkubaation jälkeen siihen lisättiin 4,0 ml liuos- »
» I
34 116529 ta, joka sisälsi 1,2 M sorbitolin ja 50 mM CaCl2:n, ja tätä liuosta sekoitettiin edelleen. Sitten protoplastiliuos välittömästi lisättiin sulatettuihin eriin Vogelin ela-tusaine N:ää (3 g natriumsitraattia, 5 g KH2P04:a, 2 g 5 NH4N03:a, 0,2 g MgS04.7H20:a, 0,1 g CaCl2.2H20:a, 5 pg a-bio- tiinia, 5 mg sitruunahappoa, 5 mg ZnS04.7H20:a, 1 mg Fe(NH4)2.6H20:a, 0,25 mg CuS04.5H20:a, 50 pg MnS04.4H20:a litraa kohti), joka sisälsi lisäksi 1 % glukoosia, 1,2 M sorbitolia ja 1 % agaroosia. Protoplasti/elatusaineseos 10 kaadettiin sitten kiinteälle elatusaineelle, joka sisälsi samaa edellämainitun mukaista Vogelin elatusainetta. Ela-tusaineessa ei ollut uridiinia mukana, ja siksi vain transformoidut pesäkkeet pystyivät kasvamaan johtuen kannan GC69 pyr4-mutaation komplementaatiosta villityyppisel-15 lä pyr4-geeni-insertillä pACBHIpyr4:ssä. Sen jälkeen nämä pesäkkeet siirrettiin ja puhdistettiin kiinteällä Vogelin elatusaineella N, jossa oli lisäaineena l-%:inen glukoosi, ja stabiilit transformantit valittiin jatkoanalyysiin.
Tässä vaiheessa stabiilit transformantit erottuivat 20 epästabiileista transformanteista suuremman kasvunopeutensa perusteella ja muodostamalla pyöreitä pesäkkeitä, joissa oli ennemmin sileä kuin rosoinen reuna kiinteällä elatusaineella, josta puuttuu uridiini. Joissakin tapauksissa stabiilisuudelle tehtiin vielä lisätesti kasvattamalla 25 transformantteja kiinteällä ei-selektiivisellä elatusai- . ,·. neella (ts. joka sisältää uridiinia), keräämällä itiöt • · » ;tästä elatusaineesta ja määrittämällä niiden itiöiden pro-senttiosuus, jotka myöhemmin itävät ja kasvavat selektii- * »« visellä elatusaineella, josta uridiini puuttuu.
• · » ;; 30 Esimerkki 12
Transformanttien analyysi DNA:ta eristettiin esimerkissä 8 saaduista trans-• formanteista sen jälkeen, kun niitä oli kasvatettu neste- : mäisessä Vogelin elatusaineessa N, joka sisälsi 1 % glu- 35 koosia. Nämä transformantti-DNA-näytteet katkaistiin vielä ? >
t I
35 116529
Pstl-restriktioentsyymillä ja pantiin agaroosigeelielekt-roforeesiin. Sitten geeli blotattiin Nytran-kalvosuodat-timelle ja hybridisoitiin 32P-leimatun pÄCBHIpyr4-koettimen kanssa. Koetin valittiin tunnistamaan natiivi cbhl-geeni 5 6,5 kb:n Pstl-fragmenttina, natiivi pyr4-geeni ja mitkä tahansa transformoivasta DNA-fragmentista peräisin olevat DNA-sekvenssit.
Radioaktiiviset vyöhykkeet hybridisaatiosta visualisoitiin autoradiografiällä. Autoradiogrammi esitetään 10 kuviossa 7. Viisi näytettä ajettiin, kuten edellä on kuvattu, tästä näytteet A, B, C, D ja E. Kaista E on trans-formoimaton kanta GC69, ja sitä käytettiin kontrollina tässä analyysissä. Kaistat A - D edustavat edellä kuvatuilla menetelmillä saatuja transformantteja. Numerot au-15 toradiogrammin sivussa esittävät molekyylipainomerkkien kokoja. Kuten tästä autoradiogrammista voidaan nähdä, kaista D ei sisällä 6,5 kb:n CBHI-vyöhykettä, mikä viittaa siihen, että tämä geeni on täysin deletoitunut transfor-mantissa johtuen DNA-fragmentin integraatiosta cbhl-gee-20 niin. cbhl-deletoitua kantaa kutsutaan P37PACBHI:ksi. Kuviossa 6 hahmotellaan T. reesein cbhl-geenin deleetio integraatiolla, joka johtuu pACBHIpyr4:n suuremman EcoRI-fragmentin kaksinkertaisesta cross-over-tapahtumasta cbhl-lokuksessa yhdessä Γ. reesein kromosomeista. Muut analy- ·”· 25 soidut transformantit vaikuttavat identtisiltä transfor- » · . moimattoman kontrollikannan kanssa.
* t »
Esimerkki 13 V Transformanttien analyysi pIntCBHI:llä Tässä esimerkissä käytettiin samaa menettelyä kuin ;;; 30 esimerkissä 12, paitsi että käytetty koetin vaihdettiin 32P-leimattuun plntCBHI-koettimeen. Tämä koetin on pUC-tyyppinen plasmidi, joka sisältää 2 kb:n BglII-fragmentin : cbhl-lokuksesta siltä alueelta, joka deletoitiin pUC4K: :cbhlAH/H: ssa. Kaksi näytettä ajettiin tässä esimer- , :·, 35 kissä, mukaan luettuna kontrolli, näyte A, joka on trans- t » » » 36 116529 formoimaton kanta GC69, ja transformantti P37PACBHI, näyte B. Kuten kuviosta 8 nähdään, näyte A sisälsi cbhl-geenin, kuten vyöhyke 6,5 kb: n kohdalla osoittaa; kuitenkaan transformantti, näyte B, ei sisällä tätä 6,5 kb:n vyöhy-5 kettä eikä siksi sisällä cbhl-geeniä eikä sisällä mitään pUC-plasmidista peräisin olevia sekvenssejä.
Esimerkki 14
Kannan P37PACBHI proteiinisekreetio
Itiöitä tuotetusta P37PACBHI-kannasta ympättiin 50 10 ml:aan Trichoderma-peruselatusainetta, jossa oli 1 % glu koosia, 0,14 % (NH4)2S04:a, 0,2 % KH2P04:a, 0,03 % MgS04:a, 0,03 % ureaa, 0,75 % bacto-tryptonia, 0,05 % Tween 80:tä, 0,000016 % CuS04.5H20:a, 0,001 % FeS04.7H20:a, 0,000128 % ZnS04.7H20: a, 0,0000054 % Na2Mo04.2H20: a, 0,0000007 % 15 MnCl.4H20: a). Elatusainetta inkuboitiin ravistellen 250 ml:n pullossa 37 °C:n lämpötilassa noin 48 tuntia. Tuloksena saatu myseeli kerättiin talteen suodattamalla Mira-clothin (Calbiochem Corp.) ja pestiin kahdesti tai kolmesti 17 mM kaliumfosfaatilla. Lopulta myseeli suspensoitiin 20 17 mM kaliumfosfaattin, jossa oli 1 mM soforoosi, ja inku boitiin vielä 24 tuntia 30 °C:n lämpötilassa ravistellen. Sitten näistä viljelmistä kerättiin supernatantti, ja myseeli heitettiin pois. Näytteitä viljelmien superna-tanteista analysoitiin isoelektrisellä fokusoinnilla käyt-25 täen Pharmacian Phastgel -systeemiä ja pH 3 - 9 esivalet-' '/> tuja geelejä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Geeli vär- : : jättiin hopeavärjäyksellä proteiinivyöhykkeiden visuali- • * soimiseksi, cbhl-proteiinia vastaava vyöhyke puuttui kan nasta P37PACBHI peräisin olevasta näytteestä, kuten ku-30 viossa 9 nähdään. Tämä isoelektrinen fokusointigeeli näyttää monenlaisia proteiineja T. reesexn eri viljelmien supernatanteissa; kaista A on osittain puhdistettu CBHI, kaista B on supernatantti transformoimattomasta T. reesex -viljelmästä, kaista C on supernatantti kannasta 35 P37PACBHI, joka on tuotettu tämän keksinnön mukaisilla
5 I
» »
* I
' ’ * 37 116529 menetelmillä. Eri sellulaasikomponenttien asemat on merkitty tunnuksin CBHI, CBHII, EGI, EGII ja EGIII. Koska CBHI muodostaa 50 % kaikesta solunulkoisesta proteiinista, se on runsain eritettävä proteiini ja siis tummin vyöhyke 5 geelillä. Tämä isoelektrinen fokusointigeeli osoittaa selkeästi CBHI-proteiinin deleetion kannassa P37PACBHI. Esimerkki 15 pPACBHII:n valmistus T. reesein cbh2-geeni, joka koodittaa CBHII-pro-10 teiinia, on kloonattu genomisen DNA:n 4,1 kb:n EcoRI-frag-menttina, joka esitetään kaavamaisesti kuviossa 10A (Chen ym., 1987, Biotechnology, 5: 274 - 278). Tämä 4,1 kb:n fragmentti sijoitettiin pUC4XL:n EcoRI-kohtien väliin. Viimemainittu plasmidi on pUC-johdannainen (jonka on val-15 mistanut R. M. Berka, Genencor International Inc.), joka sisältää moninkertaisen kloonauskohdan, jossa on symmetrinen kuvio restriktioendonukleaasikohtia, jotka on järjestetty tässä esitettävään järjestykseen: EcoRI, BamHI,
Sacl, Smal, Hindlll, XhoI, Bglll, Clal, Bgrlll, XiioI, 20 Hindlll, Smal, Sacl, BamHI, EcoRI. Sinänsä tunnetulla tavalla on konstruoitu plasmidi pPACBHII (kuvio 10B), josta on poistettu 1,7 kb:n keskialue tätä geeniä Bindlll-kohdan (kohdassa 74 bp 3'-suuntaan CBHII:n translaation alkukohdasta) ja Clal-kohdan (kohdassa 255 bp 3'-suuntaan CBHII:n . 25 viimeisestä kodonista) väliltä ja korvattu T. reesein pyr4-geenin 1,6 kb:n ffindlll-Clal-sisältävällä DNA-frag-mentilla.
‘ T. reesein pyr4-geeni leikattiin irti pTpyr2:sta (ks. esimerkki 9) 1,6 kb:n Nhel-Sphl-fragmentissa ja si-30 joitettiin pUC219:n Sphl- ja Xbal-kohtien väliin, millä luotiin p219M (Smith ym., 1991, Curr. Genet 19 s. 27 -33). Sitten pyr4-geeni irrotettiin HindiII-Clai-fragment-• tina, jossa oli pUC219:n moninkertaisesta kloonauskohdasta : peräisin olevaa DNA:ta 7 bp toisessa päässä ja 6 bp toi- 35 sessa, ja sijoitettiin cbh2-geenin Hindlll- ja Clal-koh- » t » · 38 116529 tiin, millä muodostettiin plasmidi pPACBHII (ks. kuvio 10B).
Tämän plasmidin digestio EcoRI:llä vapauttaa fragmentin, jossa on 0,7 kb chh2-lokuksen viereistä DNA:ta 5 toisessa päässä, 1,7 kb cbh2-lokuksen viereistä DNA:ta toisessa päässä ja T. reesein pyr4-geeni keskellä.
Esimerkki 16 P37PACBHI:n pyr4~-johdannaisen muodostaminen
Transformantin (P37PACBHI), josta cbhl-geeni oli 10 deletoitu, itiöitä levitettiin FOA:ta sisältävälle elatus-aineelle. Tämän transformantin pyr4"-johdannainen saatiin sen jälkeen esimerkin 8 mukaisia menetelmiä käyttäen. Tälle pyr4'-kannalle annettiin nimi P37PABHIPyr'26.
Esimerkki 17 15 cbh2-geenin deleetio kannasta, josta aikaisemmin on deletoitu cbhl
Kannan P37PACBHIPyr'26 protoplasteja muodostettiin ja transformoitiin EcoRI-digestoidulla pPACBHII:lla esimerkeissä 10 ja 11 hahmoteltujen menetelmien mukaisesti. 20 Puhdistettuja stabiileja transformantteja viljel
tiin ravistelupulloissa kuten esimerkissä 14, ja viljelmien supernatanteissa olevia proteiineja tarkasteltiin isoelektrisellä fokusoinnilla. Tunnistettiin yksi trans-formantti (jolle annettiin nimi Ρ37ΡΔΔ0ΒΗ67), joka ei , : 25 tuottanut lainkaan CBHII-proteiinia. Kuvion 9 kaistalla D
nähdään tämän keksinnön menetelmien mukaisesti tuotettu ; ; supernatantti sellaisesta transformantista, josta on dele- . toitu sekä cbhl- että cbh2-geenit.
DNA:ta uutettiin kannasta Ρ37ΡΔΔ0ΒΗΙΙ67, digestoi-30 tiin EcoRI:llä ja Asp718:lla ja pantiin agaroosigeelielek-troforeesiin. DNA tästä geelistä blotattiin kalvosuodatti-melle ja hybridisoitiin 32P-leimatun pPACBHII:n kanssa (kuvio 11). Kuvion 11 kaistalla A nähdään transformoimatto-masta T. reesei -kannasta saadulle DNA:lie havaittu hybri-; 35 disaatiokuvio. Villityyppisen c£»h2-geenin sisältävä 4,1 ! ( 39 116529 kb:n EcoRI-fragmentti havaittiin. Kaistalla B nähdään kannalle P37PAACBH67 havaittu hybridisaatiokuvio. Yksittäinen 4,1 kb:n vyöhyke oli eliminoitunut ja korvautunut kahdella noin 0,9 ja 3,1 kb:n vyöhykkeellä. Tämä on odotettu 5 kuvio, jos yksittäinen kopio pPACBHII:sta saatua EcoRI-fragmenttia olisi integroitunut täsmälleen cbh2-lokukseen.
Samat DNA-näytteet digestoitiin myös EcoRI:llä ja "Southern blot" -analyysi suoritettiin kuten edellä. Tässä esimerkissä koetin oli 32P-leimattu plntCBHII. Tämä plasmi-10 di sisältää osan cbh2-geeniä koodittavaa sekvenssiä sen segmentin sisältä cbh2-geenistä, joka deletoitiin plasmi-dissa pPACBHIl. Minkäänlaista hybridisaatiota ei nähty kannasta Ρ37ΡΔΔ0ΒΗ67 saadun DNA:n kanssa, mikä osoittaa, että cbh2-geeni oli deletoitunut ja ettei pUC-plasmidista 15 peräisin olevia sekvenssejä ollut läsnä tässä kannassa.
Esimerkki 18 p^EGIpyr-3:n konstruktio ja pyr4-vajavaisen T. ree- sei -kannan transformaatio T. reesein egll-geeni, joka koodittaa EGI:tä, on 20 kloonattu genomisen DNA:n 4,2 kb:n HindiII-fragmenttina kannasta RL-P37 hybridisaatiolla oligonukleotidien kanssa, jotka oli syntetisoitu julkaistun sekvenssin mukaisesti (Pentillä ym., 1986, Gene 45: 253 - 263, van Arsdell ym., 1987, Bio/Technology 5: 60 - 64).
25 Tämä DNA-fragmentti sijoitettiin pUC100:n Hindlll- kohtaan. Sisäinen 1 kb:n EcoRV-fragmentti, joka ulottui lähellä EGI:tä koodattavan sekvenssin keskikohtaa olevasta asemasta asemaan, joka oli koodittavan sekvenssin 3'-pään toisella puolella, poistettiin entsyymidigestiolla ja kor-30 vattiin ligaatiolla sellaisen 2,2 kb:n BamHI-Hindlll-frag- mentin kanssa, joka sisälsi kloonatun A. nigerin pyrG-gee- nin (Wilson ym., 1988, Nucl. Acids Res. 16 s. 2339), tu-; loksena pAEGIpyrG-3 (kuvio 12). T. reesein pyr4-vajavaisen : kannan (kanta GC69) transformaatio, esimerkeissä 10 ja 11 35 esitetyllä menetelmällä, pAEGIpyr-3:lla sen jälkeen kun se 40 116529 oli digestoitu HindHI: 11a sen fragmentin irrottamiseksi, joka sisältää pyrG-geenin, jossa on egll-lokuksesta olevia viereisiä alueita kummassakin päässä, johti transformant-teihin, joissa genomin egrll-geeni oli pantu poikki kuvios-5 sa 13 hahmotellulla mekanismilla. DNA uutettiin transfor-manteista, digestoitiin ffindlll:11a, pantiin agaroosigee-lielektroforeesiin ja blotattiin kalvosuodattimelle. Suodatin hybridisoitiin radioleimatun pAEGIpyr-3:n kanssa. Transformoimattomassa T. reesei -kannassa egll-geeni 10 esiintyi 4,2 kb:n HindIII-DNA-fragmentissa. Kuitenkin egll-geenin deleetion jälkeen, joka oli tapahtunut halutun pAEGlpyr-3:sta olevan fragmentin integraation vaikutuksesta, tämä 4,2 kb:n Hindlll-fragmentti katosi ja korvautui noin 1,2 kb suuremmalla Hindlll-fragmentilla. Tämä kuvio 15 havaittiin yhdellä transformantilla, jolle annettiin nimi AEGI-3.
Esimerkki 19 PAAEGII-l:n konstruktio ja EGII-geenin deleetio T. reesein egl3-geeni, joka koodittaa EG ll:tä (ai-20 kaisemmin myös EG III:na tunnettu), kloonattiin T. reesei -kannasta RL-P37 genomisen DNA:n 4 kb:n Pstl-fragmenttina hybridisaatiolla oligonukleotidien kanssa, jotka oli syntetisoitu julkaistun sekvenssin mukaisesti (Saloheimo ym., 1988, Gene 63: 11 - 21). Tämä DNA-fragmentti sijoitettiin , · , 25 pUC18:n Pstl-kohtaan. Sitten tämä plasmidi, pEGII, diges toitiin EcoRV:llä koko EG II:ta koodittavan alueen poistamiseksi noin 2 kb:n segmentissä, joka ulottui asemasta, joka oli noin 180 bp EG II:ta koodittavan alueen 5-päästä, asemaan, joka oli muutamia satoja emäspareja koodittavan 30 sekvenssin pään toisella puolella. Tämä segmentti korvat-• tiin Aspergillus nidulansin genomisen DNA:n SspI-fragmen tilla, joka sisälsi amdS-geenin (Corrick ym., 1987, Gene 53: 63-71), plasmidin pAAEGII (ks. kuvio 14).
; T. reesein villityyppiset kannat eivät pysty kasva- 35 maan asetamidi ainoana typenlähteenä. Transformaatio amdS- 41 116529 geenillä antaa tämän kyvyn, ja tämä on perusta tämän geenin sisältävien transformanttien selektiosysteemille.
Kannan AEGI-3 protoplasteja transformoitiin esimerkeissä 10 ja 11 kuvatuilla menetelmillä, pAAEGII-l:llä, 5 joka oli digestoitu HindIII:lla ja EcoRIrllä, ja asetami-dilla kasvamaan kykenevät transformantit selektoitiin. Sen jälkeen DNA uutettiin stabiileista transformanteista, di-gestoitiin Pstl:llä, pantiin agaroosigeelielektroforeesiin ja blotattiin kalvosuodattimelle. Suodatin hybridisoitiin 10 radioleimatun pAAEGII-l:n kanssa. pAAEGIl-l:stä olevan Hindlll-EcoRI-fragmentin, joka sisälsi eg!3:n viereiset alueet ja amdStn, homologinen integraatio genomin eg!3-lokukseen transformantissa johti siihen, että egl3-geenin sisältävä 4 kb:n genominen Pstl-fragmentti korvautui pie-15 nemmillä PstI-fragmenteilla, mukaan luettuina kaksi, jotka olisivat noin 1,0 ja 2,8 kb:tä pituudeltaan. Tämä hybridi-saatiokuvio havaittiin yhdellä transformantilla, jolle annettiin nimi ΔΔϋ-Ι. Tällä kannalla oli deleetiot sekä EGI:tä että EGII:ta koodattavissa geeneissä ja sen seu-20 rauksena se ei kykene tuottamaan kumpaakaan näistä proteiineista.
Esimerkeissä 8 - 19 ja US-hakemusjulkaisussa sar-janro 07/770 049, jätetty 4. lokakuuta 1991 (sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi), kuvattuja menetelmiä : 25 voidaan käyttää sellaisten T. reesei -transformanttien
saamiseksi, jotka ovat kyvyttömiä tuottamaan mitä tahansa tai kaikkia seuraavista sellulaasikomponenteista: EG I, EG
II, CBH I ja CBH II sekä ksylanaasikomponentteja. Lisäksi kuvattuja menetelmiä voidaan käyttää sellaisten T. reesei 30 -transformanttien saamiseksi, jotka yliekspressoivat EG
‘ III -sellulaasikomponenttia.
Vaikka keksintöä on kuvattu erilaisten edullisten ; suoritusmuotojen muodossa, ammattimies ymmärtää, että eri- ; laisia muunnelmia, korvauksia, poisjättöjä ja muutoksia 35 voidaan tehdä poikkeamatta sen hengestä ja suoja-alasta.
> 42 116529
Niinpä on tarkoitus, että tämän keksinnön suoja-alaa rajoittaa vain seuraavien patenttivaatimusten, mukaan lukien niiden ekvivalenttien, suoja-ala.
Claims (17)
116529
1. Menetelmä ksylanaasilla rikastetun vesiliuoksen valmistamiseksi sellulaasiproteiineja ja ksylanaasia sisäl- 5 tävästä vesipohjaisesta seoksesta, joka menetelmä on tunnettu siitä, että: (a) lisätään vesipohjaiseen seokseen orgaanista suolaa määränä noin 5 % - alle 30 % (paino/tilavuus) orgaanista suolaa vesipohjaisen seoksen alkuperäistä tila- 10 vuutta kohti, lisätään vesipohjaiseen seokseen matalamolekyyli-painoista alkoholia noin 1,5 - 2,5 osaa (tilavuus/tilavuus) alkoholia vesipohjaisen seoksen tilavuutta kohti olosuhteissa, joissa oleellisesti kaikki muut sellulaasiproteii-15 nit paitsi EG III saostuvat, ja saadaan näin aikaan vesipohjainen ksylanaasilla rikastettu supernantti, ja (b) että poistetaan sakka edeltävässä kohdassa a tuotetusta supernatantista.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että orgaaninen suola käsittää suolan, joka voi olla natriumasetaatti, sinkkiasetaatti, nat-riumformiaatti tai natriumbentsoaatti.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, edelleen tunnettu siitä, että lisätään tehokas määrä ·. 25 epäorgaanista suolaa vaiheessa b tuotettuun supernatanttiin toisen sakan muodostamiseksi toisessa supernatantissa, ja * ! että kyseinen toinen sakka poistetaan kyseisestä toisesta » supernatantista.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, edel-30 leen tunnettu siitä, että EG III saostetaan supernatantista, ja että EG III -komponentti kerätään talteen.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että matalamolekyylipainoista alko- ; holia lisätään toiseen supernatanttiin EG III:n saostami- 35 seksi. 116529
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että matalamolekyylipainoinen alkoholi on etanoli.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että alussa oleva vesipohjainen seos on suodatettu kokosolu-uutos.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alussa oleva vesipohjainen seos on soluton sellulaasiseos.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, edel leen tunnettu siitä, että vesipohjaisen seoksen pH säädetään pH-arvoon, joka on ainakin noin 7, ennen alkoholin lisäystä.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että vesipohjaisen seoksen pH säädetään arvoon noin 9,5.
11. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epäorgaaninen suola käsittää ammoniumsulfaattia.
12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että matalamolekyylipainoinen alko holi käsittää alkoholin, joka voi olla etanoli, metanoli, propanoli tai reagenssialkoholi.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että matalamolekyylipainoinen alko- , holi käsittää etanolia. . 14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, edel- leen tunnettu siitä, että ksylanaasi saostetaan ’vaiheessa b tuotetusta supernatantista, ja että ksylanaasi 1 « 30 kerätään talteen.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että matalamolekyylipainoista alko- ; : holia lisätään supernatanttiin ksylanaasin saostamiseksi.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että matalamolekyylipainoinen alko- holi on etanoli. * « i 116529
17. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, edelleen tunnettu siitä, että kyseinen toinen sakka suspensoidaan uudelleen ja otetaan talteen rikastettu ksy-lanaasi. * 116529
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/862,641 US5320960A (en) | 1992-04-03 | 1992-04-03 | Method of preparing solution enriched in xylanase using low molecular weight alcohol, organic salt and inorganic salt |
| US86264192 | 1992-04-03 | ||
| PCT/US1993/003255 WO1993020209A1 (en) | 1992-04-03 | 1993-04-05 | Methods for producing substantially pure eg iii cellulase using alcohol |
| US9303255 | 1993-04-05 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI944560A FI944560A (fi) | 1994-09-30 |
| FI944560A0 FI944560A0 (fi) | 1994-09-30 |
| FI116529B true FI116529B (fi) | 2005-12-15 |
Family
ID=25338930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI944560A FI116529B (fi) | 1992-04-03 | 1994-09-30 | Menetelmiä oleellisesti puhtaan EG III -sellulaasin tuottamiseksi alkoholia käyttäen |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5320960A (fi) |
| EP (1) | EP0633938B1 (fi) |
| DE (1) | DE69333060T2 (fi) |
| FI (1) | FI116529B (fi) |
| WO (1) | WO1993020209A1 (fi) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR960016598B1 (ko) * | 1989-05-16 | 1996-12-16 | 재단법인 한국화학연구소 | 고지의 생물학적 탈묵에 의한 재생방법 |
| US5475101A (en) * | 1990-10-05 | 1995-12-12 | Genencor International, Inc. | DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase |
| US5786316A (en) * | 1994-10-27 | 1998-07-28 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions comprising xylanases |
| EP0709452A1 (en) * | 1994-10-27 | 1996-05-01 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions comprising xylanases |
| US6187732B1 (en) * | 1998-09-03 | 2001-02-13 | Genencor International, Inc. | Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same |
| US6579841B1 (en) | 1998-12-18 | 2003-06-17 | Genencor International, Inc. | Variant EGIII-like cellulase compositions |
| US6268328B1 (en) * | 1998-12-18 | 2001-07-31 | Genencor International, Inc. | Variant EGIII-like cellulase compositions |
Family Cites Families (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1368599A (en) * | 1970-09-29 | 1974-10-02 | Unilever Ltd | Softening compositions |
| US4275163A (en) * | 1978-11-20 | 1981-06-23 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Cellulase-producing microorganism |
| DK187280A (da) * | 1980-04-30 | 1981-10-31 | Novo Industri As | Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode |
| GB2095275B (en) * | 1981-03-05 | 1985-08-07 | Kao Corp | Enzyme detergent composition |
| GB2094826B (en) * | 1981-03-05 | 1985-06-12 | Kao Corp | Cellulase enzyme detergent composition |
| JPS5836217A (ja) * | 1981-08-25 | 1983-03-03 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 風合の改良されたセルロ−ス系繊維の製造法 |
| JPS5854082A (ja) * | 1981-09-22 | 1983-03-30 | 倉敷紡績株式会社 | セルロ−ス系繊維の改質方法 |
| US4487831A (en) * | 1982-05-19 | 1984-12-11 | Research Corporation | Process for the conversion of cellulose to glucose |
| GB8306645D0 (en) * | 1983-03-10 | 1983-04-13 | Unilever Plc | Detergent compositions |
| US4472504A (en) * | 1983-03-28 | 1984-09-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Hyperproducing cellulase microorganism |
| CA1338400C (en) * | 1983-08-31 | 1996-06-18 | David H. Gelfand | Recombinant fungal cellulases |
| US4797361A (en) * | 1983-10-24 | 1989-01-10 | Lehigh University | Microorganism and process |
| FR2555603B1 (fr) * | 1983-11-29 | 1986-10-03 | Inst Francais Du Petrole | Procede de production d'enzymes cellulolytiques |
| FI841500A0 (fi) * | 1984-04-13 | 1984-04-13 | Valtion Teknillinen | Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar. |
| GB8421800D0 (en) * | 1984-08-29 | 1984-10-03 | Unilever Plc | Detergent compositions |
| GB8421801D0 (en) * | 1984-08-29 | 1984-10-03 | Unilever Plc | Detergent composition |
| DK163591C (da) * | 1985-10-08 | 1992-08-24 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til behandling af et tekstilstof med en cellulase |
| CA1272150C (en) * | 1985-12-03 | 1990-07-31 | PRODUCTION OF GLUCOSE AND PURIFIED STARCH SYRUPS FROM WHEAT STARCH AND OTHER CEREALS CONTAINING PENTOSANES | |
| US4725544A (en) * | 1986-04-25 | 1988-02-16 | Tan Larry U | Method for purifying xylanase |
| GB8610600D0 (en) * | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
| DE3787866T2 (de) * | 1986-10-28 | 1994-05-19 | Kao Corp | Alkalische Cellulasen und Mikroorganismen zu deren Herstellung. |
| US4822516A (en) * | 1986-12-08 | 1989-04-18 | Kao Corporation | Detergent composition for clothing incorporating a cellulase |
| JPH0240787B2 (ja) * | 1987-08-07 | 1990-09-13 | Kanebo Ltd | Fuainokairyosaretaseruroosukeisenikozobutsunoseizoho |
| US4832864A (en) * | 1987-09-15 | 1989-05-23 | Ecolab Inc. | Compositions and methods that introduce variations in color density into cellulosic fabrics, particularly indigo dyed denim |
| US5116746A (en) * | 1988-03-04 | 1992-05-26 | Institut Armand Frappier | Cellulase-free endo-xylanase enzyme of use in pulp delignification |
| EP0406314B1 (en) * | 1988-03-24 | 1993-12-01 | Novo Nordisk A/S | A cellulase preparation |
| JP2652871B2 (ja) * | 1988-04-25 | 1997-09-10 | 花王株式会社 | アルカリセルラーゼおよびその製造法 |
| US4954447A (en) * | 1988-07-22 | 1990-09-04 | The Regents Of The University Of California | Feraxanase, a highly specific enzyme for hydrolysis of complex polysaccharides |
| US4952505A (en) * | 1988-08-08 | 1990-08-28 | Florida State University | Fermentation of trichoderma reesei and apparatus therefor |
| US5006126A (en) * | 1988-09-15 | 1991-04-09 | Ecolab Inc. | Cellulase compositions and methods that introduce variations in color density into cellulosic fabrics, particularly indigo dyed denim |
| US5120463A (en) * | 1989-10-19 | 1992-06-09 | Genencor International, Inc. | Degradation resistant detergent compositions based on cellulase enzymes |
| JPH0639597B2 (ja) * | 1989-10-19 | 1994-05-25 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | 劣化抵抗洗浄剤組成物 |
| AT394730B (de) * | 1990-05-08 | 1992-06-10 | Voest Alpine Ind Anlagen | Verfahren zur herstellung exo- und endocellulasefreier xylanase |
-
1992
- 1992-04-03 US US07/862,641 patent/US5320960A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-04-05 WO PCT/US1993/003255 patent/WO1993020209A1/en active IP Right Grant
- 1993-04-05 EP EP93909275A patent/EP0633938B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-05 DE DE69333060T patent/DE69333060T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-04-18 US US08/228,988 patent/US5434072A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-30 FI FI944560A patent/FI116529B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0633938B1 (en) | 2003-06-25 |
| FI944560A (fi) | 1994-09-30 |
| DE69333060D1 (de) | 2003-07-31 |
| US5320960A (en) | 1994-06-14 |
| US5434072A (en) | 1995-07-18 |
| DE69333060T2 (de) | 2003-12-18 |
| FI944560A0 (fi) | 1994-09-30 |
| WO1993020209A1 (en) | 1993-10-14 |
| EP0633938A1 (en) | 1995-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5874276A (en) | Cellulase enzymes and systems for their expressions | |
| FI120541B (fi) | Menetelmä pumpulipitoisten kudosten käsittelemiseksi sellulaasilla | |
| FI120152B (fi) | Pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät CBH-I-tyypin rakenneosien suhteen vajaita sellulaasikoostumuksia | |
| JP3554322B2 (ja) | エンドグルカナーゼを利用する布帛をストーンウォッシュするための方法 | |
| CA2158357C (en) | Purification and molecular cloning of eg iii cellulase | |
| US6458928B1 (en) | Microbial swollenin protein, DNA sequences encoding such swollenins and method of producing such swollenins | |
| US20130337542A1 (en) | Cellulase Enzyme Mixtures For Depilling and Uses Thereof | |
| JPH07503026A (ja) | ほぼ純粋なｅｇ３セルラーゼを含有する洗剤組成物 | |
| FI116530B (fi) | Menetelmiä EG III - sellulaasin, ksylanaasin tai näiden seoksen valmistamiseksi käyttäen polyeteeniglykolia | |
| JPH06502205A (ja) | 酸性エンドグルカナーゼ型成分の豊富なセルラーゼ組成物を含有する洗浄剤組成物 | |
| FI116529B (fi) | Menetelmiä oleellisesti puhtaan EG III -sellulaasin tuottamiseksi alkoholia käyttäen | |
| US5668009A (en) | Methods for treating cotton-containing fabrics with CBH I enriched cellulase | |
| US5472864A (en) | Method of preparing solution enriched in EG III using low molecular weight alcohol, organic salt and inorganic salt | |
| JP3522272B6 (ja) | ポリエチレングリコールを用いた実質的に純粋なｅｇ ▲ｉｉｉ▼セルラーゼの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 116529 Country of ref document: FI |
|
| MA | Patent expired |