FI120152B - Pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät CBH-I-tyypin rakenneosien suhteen vajaita sellulaasikoostumuksia - Google Patents

Description

Pesuainekoos tulituksia, jotka sisältävät CBH-I-tyypin rakenneosien suhteen vajaita sellulaasikoastumuksia

Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön aihepiiri

Esillä oleva keksintö koskee pesuainekoostumuksiä, jotka sisältävät spesifisiä sellulaasikoostumuksia. Erityisesti esillä oleva keksintö koskee pesuainekoostumuk-sia, jotka sisältävät (a) puhdistavana tehokkaan määrän 10 yhtä tai useampaa pinta-aktiivista ainetta ja (h) Sellu- N

laasikoöstumusta, joka sisältää yhtä tai useampaa endo-glukanaasi- (EG-) tyypin rakenneosaa ja alle noin 5 .paino-% eksosellobiohydrolaasi- (CBH-) I-tyypin rakenneosia ja edullisesti alle noin 5 paino-% kaikkia ;CBH-tyypin ra-15 kenneosia. Vielä edullisemmin tämän keksinnön mukaisissa pesuainekoostumuksissa käytetyt sellulaasikoostumukset ovat vapaita kaikista CBH-I-tyypin rakenneosista ja edullisesti vapaita kaikista CBH-tyypin rakennesösista. Tällaiset pesuaineköostumukset tuottavat parannuksia pehmey-20 dessä, tunnussa, värin pidätyksessä/palautumisessa ja muissa samankaltaisissa. Lisäksi tällaisten sellulaasi-koostumusten sisältäessä jonkin verran CBH-I-tyypin rakenneosia, tosin alle noin 5 paino-%, havaitaan myös kasvanut puhdistusetu.

25 2. alan tekninen taso

Selluläasit tunnetaan alalla entsyymeinä, jotka hydrolysoivat selluloosaa (S-1,4-glukaanlsidoksia), jolloin seurauksena muodostuu glukoosia, sellobioosia, sello-oli gosakkaride ja ja muita samankaltaisia. Vaikka sellulaa-30 sej a muodostuu (ilmentyy) sienissä, bakteereissa ja muissa vastaavissa, sienten tuottamiin on kohdistettu eniten huomiota, koska tietyt: sienet tuottavat: täydellistä sellulaa-sisysteemiä, joka kykenee hajottamaan selluloosan kiteisiä muotoja, ja tällaisia sellulaaseja voidaan tuottaa helpos-35 ti suurina määrinä fermentointimenettelyillä.

2

Edeltävä huomioon ottaen Wood et ai., Methods in Enzymology 150:25 (1988) 234 et seq., julkistavat, että tietyt sienet tuottavat täydellisiä sellulaasisysteemejä, jotka käsittävät useita erilaisia entsyymiluokituksia mu-5 kaan lukien ne, jotka identifioidaan eksosellobiohydro-laaseiksi (EC 3.2.1.91) ("CBH"}, endoglukanaaseiksi (EC 3.2.1.4) ("EG") ja β-glukosidaaseiks i (EC 3.2.1.21) ("BG"). Toisaalta jotkut sienet eivät kykene tuottamaan täydellisiä seilulaasisysteemejä. Yleensä näistä systee-10 meistä puuttuvat CBH-rakennesosat. Katso esimerkiksi Coughläh et ai., " Biochemistry and Genetics of Cellulose

Degradation", Aubert et ai., toim., Academic Press, 1988, ss, 11 et seq .; ja Wood et ai., Methods in Enzymology 160:25, Academic Press, New York, 1988, ss, 87 et seq.

15 Samoin vaikka bakteerisellulaasien raportoidaan kirjallisuudessa sisältävän vähän tai ei lainkaan CBH-ra-kennaosia, löytyy muutamia tapauksia, joissa bakteerisel-lulaaseista peräisin olevilla CBH:n kaltaisilla rakenneosilla on raportoitu olevan eksosellobiohydrolaäsiaktii-20 visuutta.

CBH:n, EG:n ja BG:n sieniselluiaasiluokituksia voidaan edelleen laajentaa sisältämään möninaisia rakenneosia kunkin luokituksen puitteissa. Esimerkiksi monia CBH- ja EG-tyyppejä on eristetty erilaisista sieniläh-25 teistä, mukaan lukien Trichoderma teeseistä, joka sisältää 2 CBH:ta, eli CBH-I:tä ja CBH-H:ta, ja ainakin 3 EG:tä, eli EG-1:tä, EG~Il:ta ja EG-HX:a.

Täydellistä sellulaasisysteemiä, joka käsittää rakenneosia kustakin CBH-, EG- ja BG-lUokituksesta, tarvi-30 taan muuttamaan kiteinen selluloosa tehokkaasti glukoosiksi . Eristetyt rakenneosat ovat huomattavasti vähemmän, jos lainkaan, tehokkaita kiteisen selluloosan hydroly-soinnissä. Lisäksi selluläasirakeririeosien välillä havaitaan synergistinen suhde etenkin niiden edustaessa eri \ 35 luokituksia. Tämä merkitsee, että täydellisen sellulaasi- 3 systeemin tehokkuus on merkittävästi suurempi kuin saman luokituksen eristettyjen rakenneosien myötävaikutusten summa. Tässä suhteessa alalla tiedetään, että EG-rakenne-osat ja CBH-rakenneosat ovat synergistisessä vuorovaikutu-5 ksessa selluloosan tehokkaammaksi hajottamiseksi. Katso esimerkiksi Wood, Biochem.Soc.Trans. 13 (1985) 407 - 410.

Eri selluiaasirakenneosien substraattispesifisyys ja vaikutustapa vaihtelevat merkittävästi luokituksen mukaan, mikä saattaa selittää yhdistettyjen rakenneosien 10 synergian. Esimerkiksi sellula.asin tällä hetkellä hyväk sytty vaikutustapa on, että endoglukanaasirakenneosat hydrolysoivat sisäisiä β-l,4-glukosidisidoksia, etenkin selluloosan alhaisen kiteisyyden alueilla, ja eksosello-biohydrolaasirakenneosat hydrolysoivat sellöbioösia sel-1:5' luloosan ei-pelkistävästä päästä. Endoglukanaasirakenne- osien vaikutus helpottaa suuresti eksosellobiohydrolaasien vaikutusta luomalla uusia ketjupäitä, jotka eksosellbbio-hydrolaasirakenneosat tunnistavat.

β-glukosidaasirakenneosat vaikuttavat vain sello-20 oligosakkarideihin>. esim. sellobioosiin, muodostaen glu koosia ainoana tuotteena. Ne katsotaan sellulaasisysteemin kokonaisuuteen: kuuluvaksi osaksi, koska ne edistävät ko-konaisreaktiota glukoosiksi ja lievittävät siten sellobi-oosin inhibitiovaikutuksia CBH- ja EG-rakenneosiin.

25 Toisaalta sellulaasien tiedetään niinikään alalla f

Olevan käyttökelpoisia pesuainekoostumuksissa koostumuksen puhdistuskyvyn tehostamistarkoituksissa, käytettäviksi pehmentävänä aineena ja puuvillakankaiden tunnun parantamiseksi ja vastaavissa tarkoituksissa. Vaikka tarkkaa me-30 kanismia, jolla sellulaasiköostumukset pehmentävät vaate kappaleita, ei täysin ymmärretä, sellulassin pehmentävät ja väriä palauttavat ominaisuudet on yhdistetty aikalisiin endoglukänaasirakenneasiin sellulaasikoostumuksissa. Täten esimerkiksi kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa 35 nro WG 89/09259 julkistetaan, että pesuainekoostumukset, ] 4 jotka sisältävät spesifisen aikaiisen endoglukanaasiraken-neosan suhteen rikastettua sellulaasikpostumusta, antavat käsitellyille vaatekappaleille värin palautumista ja parantunutta pehmenemistä verrattuna sellulaasikoostumuk-5 siin, jotka eivät ole rikastuneita tällaisen rakenneosan suhteen. Lisäksi tällaisten alkalisten endoglukanaasira-kenneosien käyttö pesuainekoostumuksissa täydentää pesuai-nekoostumuksen pH-vaatimukset... Tämän julkaisun mukainen endoglukanaasiräkenneosa määritellään rakenneosaksi, joka 10 osoittaa maksimiaktiivisuutta alkalisessa pH:ssa 7,5 - 10 ja jolla on määritelty aktiivisuuskriteeri karboksimetyy-liselluloosan ja Avicel-valmisteen suhteen.

Toisaalta sellulaasikoostumusten tiedetään alalla hajpttavan puuvillaa sisältäviä kankaita (katso esimer-15 kiksi Suzuki et ai,, US-patenttijulkaisu nro 4 822 516), jonka hajoamisen todistaa kankaan alentunut lujuus» Tällainen lujuudenmenetys selittää puolestaan osittain vastahakoisuuden sellulaasikoostumusteh käyttöön kaupallisissa pesuainesovellutuksissa.

20 Täten edeltävä huomioon ottaen sellulaasikoostu- mukset, jotka sisältävät yhtä tai useampaa endpglukanaa-sirakenneösäa ja jotka myös tuottavat alentuneen lujuu-denmenetyksen puuvillaa sisältäville kankaille verrattuna täydelliseen sellulaasisysteemiin, olisivat erityisen 25 edullisia pesuainekoostumuksissa käytettäviksi.

Yhteenveto keksinnöstä

Nyt on todettu, että sienisellulaasikoostumuksia, jotka sisältävät yhtä tai useampaa endoglakanaasityypin rakenneosaa, voidaan yhdistää pesuainekoostumuksissa pa-30 rannUsten tuottamiseksi pehmenemisessä, värin pidätykses-sä/palautumisessa ja tunnussa puuvillaa sisältäville kankaille, jotka on pesty tällaista koostumusta sisältävässä peSuympäristössä. On edelleen todettu, että tällaisten seiiulaasikoQstumusten sisältäessä alle noin 5 paino-% 35 GBH-l-tyypin rakenneosia saadut pesuainekpostumukset ai- 5 heuttavat vähemmän lujuudenmenetystä näin pestyille puuvillaa sisältäville kankaille.

Mitä tulee pesuainekoostumuksiin, jotka sisältävät sellulaasikQostumuksia, jotka ovat CBH-I-vajaita, CBH-I-5 rikastettuja tai EG-III-rikastettuja, on todettu, että juuri sellulaasin määrä, eikä spesifisten entsyymirakenneosien suhteellinen hydrolyysinqpeus pelkistävien sokerien tuottamiseksi selluloosasta, antaa toivotut pesuai-neominäisuudet pesuainekoostuniukselle: puuvillaa sisältä-10 ville kankaille esim. yksi tai useampi aiempaa paremmasta värin palautumisesta, aiempaa paremmasta pehmenemisestä ja aiempaa paremmasta puhdistuksesta.

Täten yhdessä koostumusnäkökohdistaan esillä oleva keksintö koskee pesuainekoostumusta, joka käsittää (a) 15 puhdistavana tehokkaan määrän pinta-aktiivista ainetta tai pinta-ak ti iiristen aideiden seosta,: ja (b) noin 0,01 - noin 5 paino-%, ja edullisesti noin 0,05 - 2 paino-%, sienisel-lulaasikoostumusta laskettuna pesuainekoostumuksen painosta, jolloin sienisellulaasiköostumus käsittää yhtä tai 20 useampaa EG-tyypin rakenneosaa ja alle noin 5 paino-% CBH- \ X-tyypin rakenneosia (laskettuna kokonaisproteiinista sei- j lulaasikoostumuksessa). Edullisessa suoritusmuodossa pesu-ainekoostumuksessa käytetty sienisellulaasiköostumus käsittää yhtä tai useampaa EG-tyypin rakenneosaa ja alle 25 noin 5 paino-% kaikkia CBH-tyypin rakenneosia. Vielä edullisemmin tässä keksinnössä käytetty sienisellulaasikpostu-tnus ei sisällä mitään CBH-X-tyypin rakenneosia ja edelleen edullisemmin ei sisällä mitään CBH-tyypin rakenneosia.

Toisessa edullisessa suoritusmuodossa sellulaasi-30 koostumus saadaan mikro-organismista, jota on modifioitu geneettisesti, siten, ettei se kykene tuottamaan mitään CBH-I-tyypin rakenneosia, ja edullisemmin mitään CBH-tyypin rakenneosia, eli CBH-I-tyypin ja CBH-II-tyypin rakenneosia. Vielä edullisemmassa suoritusmuodossa sellulaasi- I

35 koostumus saadaan mikro-organismista, jota on modifioitu ;j \ \ :|

J

6 geneettisesti siten, ettei se kykene tuottamaan mitään CBH-I-tyypin rakenneosia tai mitään CBH-tyypin rakenneosia eikä ilmennä lainkaan heterologisia proteiineja*

Yhdessä menetelmänäkökohdistaan esillä oleva kek-5 sintö koskee lujuudenmenetystä vastustavaa menetelmää puuvillaa sisältävän kankaan pehmeyden tehostamiseksi, jonka menetelmän mukaan kangas pestään pesuympäristössä, joka on saatu pesuainekoostumuksesta, joka käsittää (a) puhdistavana tehokkaan määrän pinta-aktiivista ainetta tai 10 pintä-aktiivisten aineiden seosta ja (b) noin 0,01 - noin 5, ja edullisesti noin 0,05 - noin 2, paino-% sienisel-lulaasikoostumusta laskettuna pesuainekoQstumuksen painosta, jolloin sellulaasikoQStumus käsittää yhtä tai useampaa E<3-tyypin rakenneosaa ja alle hoin 5 paino-% CBH-I-tyypin 15 rakenneosia laskettuna proteiinin sellulaasikoostumuksessa painosta.

Toisessä menetelmänäkökohdistaan esillä oleva keksintö koskee lujuudenmenetystä vastustavaa menetelmää puuvillaa sisältävän kankaan värin pidättämiseksi/palaut-20 tamiseksi, jonka menetelmän mukaan kangas pestään yhteen j tai useampaan kertaan pesuympäristössä, joka on saatu pesuainekoostumuksesta, joka käsittää (a) puhdistavana tehokkaan määrän pinta-aktiivista ainetta tai pinta-aktiivi s ten aineiden seosta ja (b) noin 0,01 - noin 5, ja edul-25 lisesti noin 0,05 - noin 2, paino-% sienisellulaasikoostu- j musta laskettuna pesuainekoostumuksen painosta, jolloin f sellulaasikoostumus käsittää yhtä tai useampaa EG-tyypin j rakenneosaa ja alle noin 5 paino-% CBH-I-tyypin rakenne- s

osia laskettuna proteiinin sellulaasikoostumuksessa pai- J

30 nosta. f

Suppea kuvaus piirroksista ]

Kuvio 1 on hahmotelma p-delta-CBHIpyr4:n rakenta- ] mxsesta. ; 7

Kuvio 2 esittää T. reesei -geenin deleetiota integroimalla suurempi EcoRI~ fragmentti p-deltaCBHIpyr4: stä cbhl-paikkaan Yhdessä reesei -kromosomissa.

Kuvio 3 on autoradiökuva DNA:sta T_,_ reesei -kan-5 nasta GC69, joka on transformoitu EcoRI:llä pilkotulla p-delta-CBHIpyr4:llä, Southern blot -analyysin jälkeen käyttäen 32P-leimattua p-delta-CBHlpyr4:ää koettimena. Moiekyy-lipainomerkkien koot esitetään kiloemäspareissa kuvion vasemmanpuoleisessa osassa.

10 Kuvio 4 on autoradiokuva DNA: sta reesei -kan nasta GC69, joka on transformoitu EcoRI:llä pilkotulla p-delta~CBHIpyr4:llä käyttäen 32P-leimattua plntCBHI:tä koettimena. Molekyylipainomerkkien koot esitetään kiloemäspareissa kuvion vasemmanpuoleisessa osassa.

15 Kuvio 5 on isoelektrofokusointigeeli, joka esittää villityyppi- ja transformoitujen reesei -kantojen erit-tämiä proteiineja. Spesifisesti kuviossa 5 vyöhykkeessä A isoelektrofokusointigeelissä on käytetty osittain puhdistettua CBH-I:tä jX. ree&eistä; vyöhykkeessä B on käytetty 20 villityypin Ί\ reeseitä; vyöhykkeessä C on käytetty prote iinia reesei -kannasta, josta on cbhl-geeni deletoitu,* ja vyöhykkeessä D on käytetty proteiinia ΊΧ_ reesei -kannasta, josta on cbhl- ja cbh2-geenit deletoitu. Kuviossa 5 kuvion oikeanpuoleinen osa on merkitty yhdessä tai useani -25 massa eritetyistä proteiineista tavattujen yksittäisten \ proteiinien paikan osoittamiseksi. Spesifisesti BG viittaa | β-glukosidaasiin, El viittaa endoglukanaasi-I:een, E2 \ viittaa endoglukanaasi-II:een, E3 viittaa endoglukanääsi- \ XII:een, Cl viittaa eksosellobiohydrolaasi-I:een ja C2 f 30 viittaa eksoseilobiohydrolaasi-IIreen. |

Kuvio 6A on esitys reesei cbh2-paikasta kloo- j naituna 4,1 ke: n EcoRI - fragmenttina gen.omi.-DNA: hän ja kuvio 6B esittää cbh2-geenideleetiovekt0ria pP-delta-CBHIl.

Kuvio 7 on autpradiokuva DNA:sta T. reesei -kannas-35 ta P:37P-delta-CBHIPyr“26, joka on transformoitu EcoRI: llä § 8 pilkotulla pP-delta-CBHII:11a, Southern blot -analyysin jälkeen käyttäen 3ZP-leimattua pP-delta-GBHii:ta koettimena, Molekyylipainomerkkien koot esitetään kiloemäspareissa kuvion vasemmanpuoleisessa osassa.

5 Kuvio 8 on kaavio plasmidista pEGIpyr4.

Kuvio 9 esittää RBB-CMC-aktiivisuusprofiilia eri pH-arvoilla 40 °C:ssa EG-rikastetulle sienisellulaasikoos-tumukselle (CBH-i- ja CBH-II-deletoitu), joka on saatu Trichoderma reeseistä; sekä aktiivisuusprofiilin rikaste-10 tulle EG-III-sellulaasikoostumukselle, joka on saatu Tric hoderma reeseistä, eri pH-arvoilla 40 °C:ssa.

Kuvio 10 esittää lujuudenmenetystuloksia 3 pesusyk-lin jälkeen pesukoneessa puuvillaa sisältäville kankaille, joita on käsitelty sellulaasikoostumuksilla, joissa on 15 vaihtelevia määriä CBH-rakenneosia.

Kuvio 11 esittää kuidunpoistotuloksia (paneelites-tipisteytysten perusteella) puuvillaa sisältäville kan- j kaille, joita on käsitelty villityypin Trichoderma reesein j

erittämällä sellulaasilla (t§yssellalaasi) eri pH-arvoil- I

20 la. |

Kuvio 12 esittää kuidunpoistotuloksia (paneelites- I

tipisteytysten perusteella) puuvillaa sisältäville kan- j kaille, joita on käsitelty vaihtelevilla pitoisuuksilla j (miljoonaosissa) villityypin Trichoderma reesein erittämää | 25 sellulaasia, ja puuvillaa sisältävälle kankaalle, jota on |

käsitelty sellulaasilla, jonka on erittänyt Trichoderma I

reesei -kanta, jota on modifioitu geneettisesti siten, ettei se kykene erittämään CBH-I:tä ja CBH-1I:ta.

Kuvio 13 esittää pehmeyspaneelitestituloksla vaih- | | 30 televille pitoisuuksille (miljoonaosissa) EG-rikastettua | sellulaasikoostumusta, joka on peräisin Trichoderma reesei j -kannasta, jota on modifioitu geneettisesti siten, ettei j se kykene tuottamaan CBH-I:tä ja CBH-il:tä, |

Kuvio 14 on kaavio paikkaspesifisistä muutoksista, j

35 jotka tehtiin egll- ja cbhl-geeneihin kätevien restrik- I

:¾ 9 tioenöonukleaasipilkkomiskeskusten luomiseksi. Kussakin tapauksessa ylemmällä viivalla esitetään alkuperäinen DNA-sekvenssi, tehdyt muutokset esitetään keskimmäisellä viivalla ja uusi sekvenssi esitetään alemmalla viivalla.

5 Kuvio 15 on kaavio suuremmasta EcoKI-fragmentista, joka voidaan saada pCEPCl:stä.

Kuvio 16 on autoradiokuva DNA:sta ei-transformoidusta Tj_ reesei -kannasta RutCSO ja kahdesta transforman-tista, jotka saatiin transformoimalla reesei EcoRl;llä 10 pilkotulla pCEPCl:llä. DNA:ta pilkottiin PstI:llä, tehtiin Southern blot -siirto ja hybridisoitiin 32P-leimattuun pUC4K::cbhl:een. Merkki-DNA-fragmenttien koot esitetään kiloemäspareissa kuvion vasemmanpuoleisessa osassa.

Kuvio 17 on kaavio plasmidista pEGXX::P-l.

15 Kuvio IS on autoradiokuva DNA: sta T_. reesei -kan nasta P37P-deIta~deIta-67P‘l, joka on transformoitu HindiII:11a ja BamHI:llä pilkotulla pEGII::P-1:llä. Valmistettiin Southern blot ja DNA hybridisoitiin noin 4 ke:n PstI-fragmenttiin radioleimattua reesei -DNA:ta, joka 20 sisälsi egl3-geenin. Vyöhykkeet A, c ja E sisältävät DNA:ta ei-transformoidusta kannasta, kun taas vyöhykkeet B, D ja F sisältävät DNA:ta ei-transformoidusta T^_ reesei -kannasta. Tt_ reesei -DNA:ta oli pilkottu Bglll:11a vyö- j hykkeissä A ja B, EcoRV: llä vyöhykkeissä C ja D ja 25 PstI:llä vyöhykkeissä E ja F. Merkki-DNA-fragmenttien koot esitetään kiloemäspareissa kuvion vasemmanpuoleisessa osassa.

Kuvio 19 on kaavio plasmidista pP-delta-EQI-1.

Kuvio 20 on autoradiokuva Southern blot -määrityk-30 sestä DNA:lle, joka eristettiin kannan GC69 transfqrman-teista, jotka oli saatu Hindlll-pilkotulla p-delta-EGIpyr-3:11a. Ei-transformoidulie kannalle odotettu hybridisaa-tiokuviO koettimeen, radiolelmattuun p-delta-EGIpyr-3keen, esitetään vyöhykkeessä C. Vyöhykkeessä A esitetään kuvio, 35 jota odotetaan transformantille, jossa egll-geeniä on häi- j 10 ritty, ja vyöhykkeessä B esitetään transformantti, jossa p-delta-EGIpyr-3-DNA on integroitunut genomiin kuitenkaan häiritsemättä egll-geeniä. Vyöhyke D sisältää p-delta-EGlpyr-3:n, jota on pilkottu HindiII:11a sopivien koko-5 merkkien saamiseksi. Merkki-DNA-fragmenttien koot esitetään kiloemäspareissa kuvion oikeanpuoleisessa osassa. Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä Kuten edellä mainittiin, esillä oleva keksintö koskee yleisesti pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät 10 sienisellulaäsikoostumuksia, jotka sisältävät yhtä tai useampaa EG-tyypin sellulaasirakenneosaa ja alle noin 5 paino-% GBH-I-tyypin rakenneosia, sekä menetelmiä tällaisten selluiaasikoostumusten käyttämiseksi. Käytettyinä pe-suympäristössä, jonka pH on hapan, neutraali tai alkali-15 nen, tällaiset pesuainekoostumukset tuottavat parannuksia pehmenemisessä, värin pidätyksessä/palautumisessa ja tunnussa tällaisessa ympäristössä pestyille puuvillaa sisältäville kankaille. Lisäksi sellulaaslköostumuksessa esiintyvän pienen määrän CBH-I-tyypin rakenneosia johdosta nämä 20 koostumukset antavat samoin alentuneen lujuudenmenetykSen verrattuna niihin koostumuksiin, jotka sisältävät suurempia määriä CBH-I-tyypin rakenneosia.

Kuitenkin ennen tämän keksinnön yksityiskohtaista | käsittelyä määritellään ensin seuraävat ilmaisut.

25 Ilmaisu ’“•sie^i.sellulaäsi" viittaa entsyymikoostu- mukseen, joka on saatu sienilähteistä tai mikro-organismeista, joita on geneettisesti modifioitu sisältämään ja ilmentämään kaikki sienilähteestä saadut sellulaasigeenit tai osan niistä. Sienisellulaasit vaikuttavat selluloosaan 30 tai sen yhteen tai useampaan hajoamistuotteeseen hydrolysoiden selluloosaa, jolloin muodostuu primaarituotteina glukoosia ja sellobioQsia, Sienisellulaasit ovat erilaisia kuin sellulaasit, joita tuottavat ei-sienilähteet, mukaan lukien sellaiset mikro-organismit kuten Actinomyoetes-la-35 jit, liukuvat bakteerit (myksobakteerit) ja todelliset § | 11 bakteerit. Sieniä, jotka kykenevät tuottamaan sellulaase-ja, jotka ovat käyttökelpoisia tässä kuvatuissa pesuai-nekoostumuksissa käytettyjen sellulaasikoostumusten valmistamiseksi , julkistetaan GB-patenttijulkaisussa nro 5 2 094 826A, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi.

Useimmilla sienisellulaaseilla on yleensä optimi-aktiivisuutensa happamalla tai neutraalilla pH-alueella, vakkka joillakin sienisellulaaseilla tiedetään olevan merkittävää aktiivisuutta neutraalin alapuolella ja lie-10 västi aikalisissä olosuhteissa, eli esimerkiksi Humicola insoiensista peräisin olevalla sellulaasilla tiedetään Olevan aktiivisuutta· olosuhteissa, jotka ovat neutraaleista lievästi aikalisiin.

Sienisellulaasien tiedetään koostuvan useista ent-15 syymiluokituksista, joilla on erilainen substraattispesi-fisyys, erilaiset entsyymivaikutuskuviot ja muuta vastaavaa. Lisäksi entsyymirakenneosat kunkin luokituksen puit- I

teissä voivat osoittaa erilaisia molekyylipainoja, eri- \ \ laisia glykosylaatioasteita, erilaisia isoelektrisiä pis- j 20 teitä, erilaista substraattispesifisyyttä, erilaisia ent- j syymivaikutuskuvioita jne. Esimerkiksi sienisellulaäsit 1 voivat sisältää sellulaasiluokituksia, joihin sisältyy | endoglukanaasej a {EG:t), eksosellobiohydrolaaseja (CBH:t), | Ö-glukosidaäseja (BG:t) jne, Toisaalta vaikka bakteerisel- \ 25 lulaasien raportoidaan kirjallisuudessa sisältävän vähän j tai ei lainkaan CBH-rakenneosia, löytyy muutamia tapauk- | siä, joissa bakteerisellulaaseista saaduilla CBH:n kaitai- ] silla rakenneosilla on raportoitu olevan ek s o s e11obiohyd- \ rolaasiaktiivisuutta. | 30 Sienisellulääsikoostuinusta, joka on tuotettu luon- | nolllsesti esiintyvällä sienilähteellä ja joka käsittää ] yhtä tai useampaa CBH- ja EG-rakenneosaa, jolloin kutakin näistä rakenneosista esiintyy sienilähteen tuottamassa j suhteessa, kutsutaan tässä toisinaan "täydelliseksi sie- ] 35 nisellulaasisysteemiksi" tai "täydelliseksi sienisellu- j , 12 laasikoostumukseksi" sen erottamiseksi siitä eristetyn sellulaasin luokituksista ja rakenneosista, epätäydellisistä sellulaasikoostumuksista, joita tuottavat bakteerit ja jotkut sienet, tai sellulaasikoostumuksesta, joka on 5 saatu mikro-organismista, jota ori geneettisesti modifioitu tuottamaan hyvin runsaasti, hyvin vähän tai ei lainkaan yhtä tai useampaa sellulaasin CBH- ja/tai EG-rakenneosaa.

Fermentointimenettelyt sienten viljelemiseksi ja sellulaasin tuottamiseksi ovat alalla sinänsä tunnettuja.

10 Esimerkiksi sellulaasisysteemejä voidaan tuottaa joko kiinteässä täi subnterssiviljelmässä, mukaan lukien erä-, syötetty erä - ja jatkuvavirtausmenetelmät. Sellu!aasisysteemien talteenotto ja puhdistus fermentointiliemestä voidaan samoin suorittaa alalla sinänsä tunnetuilla menette-15 lyillä.

"Endoglukanaasi- ("EG"-) tyypin rakenneosilla" tarkoitetaan kaikkia niitä sienisöllul.aas.irakenneosia tai j rakenneosien yhdistelmiä, jotka osoittavat samankaltaisia \

pesuaineaktiivisuusominaisuuksia kuin Trlchoderma reesein I

20 endoglukanaasirakenneosat. Tässä suhteessa Trichoder ma j reesein endoglukanaasirakenneosat (spesifisesti EG-I, EG- \ li, EG-III ja muut vastaavat joko yksinään tai yhdistal- j mässä) antavat puuvillaa sisältäville kankaille pehmene- \ inisen, värin pidätyksen/palautumisen ja paremman tunnun \

25 sisällytettäessä näitä rakenneosia pesuympäristöön ja kä- J

siteltäessä kangasta tässä ympäristössä. Täten endogluka- j

naasityypin rakenneosia ovat ne sienisellulaasirakenne- I

osat, jotka antavat puuvillavaatekappaleille pehmenemisen, värin pidätyksen/palautumisen ja paremman tunnun sisälly- 1 30 tettäessä näitä rakenneosia pesuympäristöön. Edullisessa ] suoritusmuodossa tämän keksinnön mukaisissa pesuaineköos- j tumuksissa käytetyt endoglukänaasityypin rakenneosat anta- | i vat myös puuvillaa sisältäville kankaille vähemmän lujuu- | denmenetystä kuin lujuudenmenetys, jonka synnyttää Trlchö- j

35 derma reeseistä saatu täydellinen sellulaasisysteemi. J

| 13 Tällaiset endoglukanaasityypin rakenneosat eivät mahdollisesti sisällä rakenneosia, jotka luokitellaan en-doglukanaaseiksi käyttäen perinteisiä biokemiallisen aktiivisuuden testejä. Esimerkiksi tällaiset perinteiset 5 aktiivisuustestit perustuvat rakenneosan kykyyn (a) hydrolysoida liukoisia selluloosajohdannaisia kuten karbok-simetyyliselluloosa (CMC), jolloin CMC-pitöisten liuosten viskositeetti laskee, (b) helposti, hydrolysoida selluloosan hydratoituja muotoja kuten fosförihapolla turvotettua 10 selluloosaa (esim. Walseth-selluloosa) ja hydrolysoida vähemmän helposti selluloosan kiteisempiä muotoja (esim.

Avicel, SolkafloG jne.). Sitä vastoin arvellaan, etteivät kaikki tällaisilla aktiivisuustesteiilä määritellyt en»· doglukanaasirakenneosat anna aiempaa parempaa pehmeyttä/ 15 tuntua ja värin pidätystä/palautumista, Täten tässä ky seessä oleviin tarkoituksiin on täsmällisempää määritellä endoglukanaasityypih rakenneosiksi ne sienisellulaasin rakenneosat, joilla on samanlaisia ominaisuuksia pesuai-nekoöstumuksissa kuin mitä on Trlchoderma reesein endo-20 glukanaasirakenneosilla.

Sieniselluiaasit voivat sisältää useampaa kuin yhtä EG-tyypin rakenneosaa. Eri rakenneosilla on yleensä erilaiset isoelektriset pisteet, erilaiset molekyylipäinot, erilaiset glykosyiaatiöasteet, erilainen substraattispesl-25 fisyys, erilaiset entsyymivaikutuskuviot jne. Rakenneosien erilaisten isoelektristen pisteiden ansiosta ne voidaan erottaa ioninvaihtokromatografisesti ja vastaavilla tavoilla. Itse asiassa rakenneosien erilaisista sieniläh-teistä eristys tunnetaan alalla. Katso esimerkiksi Björk 30 et ai., US-patenttijulkaisu sarjanro 07/422 814; Schulein et ai,, WO-patenttihakemusjulkaisu 89/09 259; Wood et ai., "Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation", 1988, ss . 31 ~ 52; Wood et ai., Carbohydrate Res. 190 (1989) 279 - 297; Schulein, Methods in Enzymology 160 j 35 (1:988) 234 - 242; ja vastaavat. Kutakin näistä viitteistä j

S

j ] 14 vastaava julkaisu kokonaisuudessaan sisällytetään tähän viitteeksi.

Yleensä ottaen arvellaan, että Eö-tyypin rakenneosien yhdistelmät voivat antaa synergistisen vasteen peh-5 menemisen, värin pidätyksen/palautumisen ja tunnun parantamisessa verrattuna yksittäiseen EG-rakenneosaan. Toisaalta yksittäinen EG-tyypin rakenneosa voi olla stabiilimpi tai sillä voi olla laajempi aktiivisuusspektri eri pH-arvoilla. Täten tässä keksinnössä käytettyinä EG-tyypin 10 rakenneosina voi olla joko yksittäinen EG-tyypin rakenneosa tai kahden tai useamman EG-tyypin rakenneosan yhdistelmä. Käytettäessä rakenneosien yhdistelmää EG-tyypin rakenneosa voi olla peräisin samasta tai eri sienilähtees-tä.

15 "Eksosellobiohydrolaasityypin ("CBH-tyypin") rakenneosilla" tarkoitetaan niitä sienisellulaasirakenne- f osia, jotka osoittavat samankaltaisia pesuaineaktiivi- s suusominaisuuksia kuin Trichoderma reesein CBH-I- ja/tai ! CBH-II-rakenneosat. Tässä suhteessa käytettyinä EG-tyypin j 20 rakenneosien {edellä määritellyn mukaisesti) puuttuessa |

Trichoderma reesein CBH-I- ja CBH-II-rakenneosat yksinään j eivät anna merkittävää värin pidätystä/palautumista ja \

parantunutta tuntua näin käsitellyille puuvillaa sisältäville kankaille. Lisäksi käytettynä EG-tyypin rakenneosiin J

25 yhdistettynä Trichoderma reesein CBH-I-rakenneosa antaa i tehostuneen lujuudenmenetyksen ja kasvaneen puhdistusvai- | kutuksen puuvillaa sisältäville kankaille.

Täten CBH-I-tyypin rakenneosilla ja CBH-II-tyypin I

rakenneosilla viitataan niihin sienisellulaasirakenne- j 30 osiin, jotka osoittavat samankaltaisia pesuaineaktiivi- j suusominaisuuksia kuin Trichoderma reesein CBH-I- ja vas- j taayasti CBH-II-rakenneosat. Kuten edellä mainittiin CBH- j X--’tyypin rakenneosille, tähän sisältyy puuvillaa sisältä- j vien kankaiden lujuudenmenetystä tehostavat ja/tai kasva- j 35 neen puhdistusedun antavat ominaisuudet käytettynä EG- j $ 15 tyypin rakenneosien läsnä ollessa. Edullisessa suoritusmuodossa käytettyinä EG-tyypin rakenneosien läsnä ollessa CBH-I-tyypin rakenneosat antavat samoin kasvaneen pehme-nemisedun.

5 Tällaiset eksosellobiohydrolaasityypin rakenneosat voivat mahdollisesti sisältää rakenneosia, joita ei perinteisesti luokitella eksosellobiohydrolaaseiksi käytettäessä CBH-I:n ja CBH-II:n Triehoderma reeseistä karakterisoi-miseksi käytetä kaltaisia aktiiyisuustestejä. Esimerkiksi 10 käytettäessä tällaisia tavanomaisia luokitustestejä tällaiset rakenneosat (a) tulevat kilpailevasti inhiboiduiksi sellobioosin toimesta noin 1 mMj; <b) eivät kykene hydrolysoimaan missä merkitsevässä määrässä substituoituja selluloosia, kuten karboksimetyyliselluloosaa jne., ja (c) 15 kykenevät hydrolysoimaan fosforihapolla turvotettua selluloosaa ja vähemmässä määrin hyvin kiteistä selluloosaa.

Sitä vastoin arvellaan, että jotkut sienisellulaäsirakenneosat, jatka karakterisoidaän CBH-rakenneosiksi tällai- I

\ silla aktiivisuustesteillä, antaisivat parantuneen pehmey- \ 20 den, tunnun ja värin pidätyksen/palautumisen puuvillaa j

Sisältäville kankaille käytettäessä näitä rakenneosia yk- f sinään pesuainekoostumuksissa. Täten uskotaan olevan täs- f mällisempää tässä kyseessä oleviin tarkoituksiin määritellä tällaiset eksosellobiohydrolaasit EG-tyypin rakenne-25 osiksi, koska näillä rakenneosilla on samankaltaisia funk- | tionaalisia ominaisuuksia pesuainekoostumuksissa kuin mitä i on Triehoderma reesein endoglukanaasirakenneosilla. j EG-tyypin rakenneosien suhteen rikastettuja sieni- 1 seilulaaseja voidaan saada puhdistustekniiköilla. Spesi- | 30 fisesti täydellinen sellulaasisysteemi voidaan puhdistaa ;j j oleellisesti puhtaiksi rakenneosiksi: kirjallisuudessa | runsaasti julkaistuilla tunnetuilla erotustekniikoilla, ] mukaan lukien ioninvaihtqkrbmatografia sopivassa pH:ssa, | affiniteettikromatografia, kokoekskluusio ja muut vastaa- j 35 vat. Esimerkiksi ioninvaihtokromatografiässä {tavallisesti | j 16 anioninvaihtokrqmatGgrafiässä) on mahdollista erottaa sel-lulaasirakehneosat eluoixnalla pH-gradientilla tai suola-gradientilla tai sekä pH- että suolagradientilla.

Arvellaan niinikään, että sellulaasirakenneosien 5 seoksia, joissä on tarvittava EG-tyypin rakenneosien ja GBH-I-tyypin sellulaasirakenneosien välinen suhde, voitaisiin valmistaa muilla keinoilla kuin rakenneosia eristämällä ja yhdistämällä. Tässä suhteessa voi olla mahdollista modifioida luonnollisen mikro-organismin fermen-10 tointiolosuhteita suhteellisen korkeiden EG-/CBH-rakerme-osasuhteiden saamiseksi. Samoin yhdistelmä-DNA-teknisesti voidaan muuttaa EG-rakenneosien ja CBH-rakenneosien suhteellista suhdetta sellulaasirakenneosien seoksen tuottamiseksi, jossa EG-rakenneosien ja CBH-rakenneosien välinen 15 suhde on suhteellisen korkea, tai niillä voidaan tuottaa yhtä tai useampaa EG-rakenneosaa vailla mitään CBH-raken-neosia.

Edeltävä huomioon ottaen edullinen menetelmä EG- j tyypin rakenneosien suhteen rikastettujen sellulaasikoos- j 20 tumusten valmistamiseksi on geneettisesti modifioida mlk- j ro-organismia siten, ettei se kykene tuottamaan yhtä tai j useampaa CBH-tyypin rakenneosaa, jolloin nämä menetelmät j eivät tuota lainkaan heterologista proteiinia. Samoin on | niinikään mahdollista modifioida geneettisesti mikro-ör- j 25 ganismia siten, että se tuottaa hyvin runsaasti yhtä tai \ useampaa EG-tyypin rakenneosaa. Esimerkiksi US-patentti- ] hakemusjulkaisussa sarjanro 07/593 919, joka jätettiin 5. lokakuuta 1990 ja joka sisällytetään tähän kokona!suudes- j saan vi.i. teeksi, julkistetaan menetelmiä Trlchoderma ree- \ 30 sein manipuloimiseksi geneettisesti siten, ettei se kykene | tuottamaan yhtä tai useampaa CBH-rakenneosaa ja/tai että \ se kykenee tuottamaan hyvin runsaasti yhtä tai useampaa EG-rakentteosaa. Lisäksi tuon patenttihakemusjulkaisun mukaisilla menetelmillä luodaan Trlchoderma reesel -kantoja, 35 jotka eivät tuota lainkaan heterologisia proteiineja. Sa- i 17 main Miller et ai., "Direct and Indirect Gene Replacement in Aspergillus nldulans" (suom. "Suora ja epäsuora geeni-korvaus Aspergillus nldulansisSa"), Mol. Cell. Biol. 1985 1714 - 1721, julkistavat menetelmiä geenien deletoimiseksi 5 Aspergillus nidulanslssa DNA-välitteisellä transformoin- rilliä käyttäen lineaarista fragmenttia homologisesta DNA:sta. Millerin et ai:, menetelmillä päästäisiin geeni-deleetioon tuottamatta lainkaan heterologisla proteiineja.

Edeltävä huomioon ottaen geenien, jotka ovat vas-10 tuussa joko CBH-i-tyypin tai CBH~li-tyypin sellulaasira-kenneosien tuotannosta, deleetion vaikutuksena olisi sei-lulaasikoostumuksessa läsnä olevien EG-tyypin rakenneosien määrän rikastaminen. Samoin niiden geenien, jotka ovat vastuussa CBH-I-tyypin ja CBH-II-tyypin rakenneosien tuo-15 tannosta, deleetio johtaisi sellulaasikoostumukseen, joka ei sisällä CBH-tyypin rakenneosia.

Edelleen arvellaan, että tässä voidaan käyttää sie-nisellulaasikoastumuksia slenilähteistä, jotka tuottavat i epätäydellistä sienisellulaasikoostumusta. Esimerkiksi \ 20 tiedetään, että tietyt sienet tuottavat sellulaasikoostu— | muksia, jotka eivät sisällä CBH-rakenneosia. Katso esimer- | kiksi Coughian et ai., "Biochemistry and Genetics of Cel- 1 lulose Degradation", Auhert et ai., toim., Academic Press, ΐ 198B, s. 11 - 30, julkistavat, että ruskea laho sienet eivät 25 ilmeisesti tuota CBH-rakenneosia, mutta voi olla mahdol- | lista, että yksi tai useampi näistä rakenneosista on CBH- f I^tyypin rakenneosa- Toisaalta jos riittävä määrä tällais- \ ten sienten: tuottamista endoglukanaaseista on tarkoituk- ] siin tässä yhteydessä EG-tyypin rakenneosia, niin olisi | 30 mahdollista käyttää tällaista sellulaasia tämän keksinnön: | käytännössä rikastamatta EG-tyypin rakenneosien ja CBH-I- "j ΐΥΥΡίη rakenneosien välisen tarvittavan suhteen saamisek- j si.

Lisäksi tarvittava määrä yhtä tai useampaa tavan- j

35 omaisilla menettelyillä puhdistettua GBH-tyypin rakenne- J

| :·|ί 18 osaa voidaan lisätä seliulaasikoostumukseen, joka on tuotettu mikro-organismilla,, jota on geneettisesti manipuloitu siten, ettei se kykene tuottamaan CBH-tyypin rakenneosia, spesifiseen EG-tyypin rakenneosien ja yhden täi 5 useamman CBH-tyypin rakenneosan väliseen suhteeseen pääsemiseksi, eli sellulaasikoostumus, joka ei sisällä mitään CBH-tyypin rakenneosia ollakseen rikastettu EG-tyypin rakenneosien suhteen, voidaan koostaa sisältämään 1 painp-% CBH-i-tyypin rakenneosaa peikästään lisäämällä tämä määrä 10 puhdistettua CBH-I-tyypin rakenneosaa sellulaasikoostumuk-seen.

"β-glukosidaasi- (BG-) rakenneosilla" tarkoitetaan niitä selluiaasin rakenriepsia, jotka Osoittavat BG-aktii-visuutta; toisin sanoen itarkoitetaan), että tällaiset 15 rakenneosat vaikuttavat sellobioosin ja muiden liukoisten sello-oligosakkaridien {"sellobioosin"j ei-pelkistävään päähän ja tuottavat glukoosia ainoana tuotteena. BG-rakenneosat eivät imeydy selluloosapolymeereihin tai reagoi niiden kanssa. Lisäksi glukoosi inhiboi kilpailevasti 20 tällaisia BG-rakenneosia (Kt noin 1 mM). Vaikka tiukasti ottaen BG-rakenneosat eivät ole kirjaimellisesti sellu-laasejä, koska ne eivät kykene hajottamaan selluloosaa, tällaiset BG-rakenneosat sisällytetään sellulaasisysteemin määritelmään, koska nämä entsyymit helpottavat selluloosan 25 kokonaishajaarnista hajottamalla edelleen inhiboivat sellu loosatpa j oamistuotteet {etenkin sellobioosin), jotka on tuotettu CBH-rakenneosien ja EG-rakenneosien yhteisvaikutuksella, ilman BG-rakenneosien läsnäoloa tapahtuu kiteisen selluloosan kohtuullista tai vähäistä hydrolyysiä. BG-30 rakenneosia karakterisoidaan usein aryylisubstraateilla j kuten p-nitrofenoli-B-D-glukosidi {PNPG), minkä vuoksi j niitä monasti kutsutaan aryyliglukosiöaaseiksi... Huomatta- | koon, etteivät kaikki aryyligiukosidaasit ole BG-rakenne- \ osia sikäli, että jotkut (niistä) eivät hydrolysoi sello- j 35 bioosia. j $ | 19

Arvellaan, että BG-rakenneo s ien esiintymistä sel-lulaasikoostumuksessa tai puuttumista siitä voidaan käyttää GBH-rakenneosien aktiivisuuden sääntelemiseksi. Spesifisesti koska sellobioosia muodostuu selluloosan hajoa-5 misen aikana CBH-rakenneosien vaikutuksesta ja koska korkeiden sellobioosipitoisuuksien tiedetään inhiboivan CBH-aktiivisuutta ja edelleen koska BG-rakenneosat hydrolysoivat tällaisen sellobioosin glukoosiksi, BG-rakenneosien puuttuminen sellulaasikoostumuksesta kääntää CBH-aktiivi-10 suuden "pois päältä" sellobioosin pitoisuuden saavuttaessa inhiboivat tasot. Samoin arvellaan, että yhtä tai useampaa lisäainetta (esim. sellobioosia, glukoosia jne.) voidaan lisätä sellulaasikoostumukseen osan CBH-I-tyypin aktiivisuudesta tai muusta CBH-aktiivisuudesta tai sen koko-15 naisuudessan tehokkaaksi kääntämiseksi "pois päältä" suoraan tai epäsuorasti. Käytettäessä tällaisia lisäaineita saadun koostumuksen katsotaan olevan tässä keksinnössä käytettäväksi sopiva koostumus, jos käytetty lisäainemäärä on riittävä laskemaan CBH-I-tyypin aktiivisuuden tasoille,

20 jotka ovat yhtä suuret tai alhaisemmat kuin CBH-I-tyypin I

aktiivisuustasot, joihin päästään käytettäessä tässä kuvattuja s e11u1aasikoostumuksia.

Toisaalta sellulaasikoostumus, joka sisältää lisättyjä määriä BG-rakenneosia, saattaa lisätä selluloosan 25 kokonaishydrolyysiä, jos CBH-rakenneosien tuottaman sellobioosin tasosta tulee tällaista kokonaishydrolyysiä rajoittava lisättyjen BG-fakenneosien puuttuessa.

Menetelmiä BG-rakennosien määrän joko nostamiseksi tai laskemiseksi sellulaasikoostumuksessa julkistetaan US-30 patenttihakemusjulkaisussa sarjanro 07/625 140, joka jätettiin 10. joulukuuta 1990 asianajovaltakirjanuinerolla j 010055-056 ja jonka otsikko on "Saccharification of 1

Cellulose by Cloning and Amplification of the β-Glukosid- j

ase Gene of Trichodermareesei" (suom. "Selluloosan soke- I

35 rointi kloonaamalla ja vahvistamalla Trichoderma reesein j

J

20 β-glukosidaasigeeni"), joka patenttihakemusj ulkaisu sisällytetään tähän viitteeksi.

Sienisellulaasit voivat sisältää useampaa kuin yhtä BG-rakenneosaa. Eri rakenneosilla on yleensä erilaiset 5 isoelektriset pisteet, mikä mahdollistaa niiden erotuksen ioninvaihtökromatografisesti ja vastavilla tavoilla. Voidaan käyttää joko yksittäistä BG-rakenneosaa tai BG-rakenneosien yhdistelmää.

Pesuäinekoostumuksessa käytettynä BG-rakennaosaa 10 lisätään yleensä määrä, joka riittää estämään CBH- ja EG-rafcenneosien ja etenkin CBH-I-tyypin sellulaasirakenne-osien inhibition sellobioosin vaikutuksesta. Lisätty BG-rakenneosan määrä riippuu pesuainepesussa muodostuneen sellobioosin määrästä, jonka alan taitaja kykenee helposti 15 määrittämään. Kuitenkin sitä käytettäessä BG-rakenneosan painoprosenttiosuus suhteessa selluXaasikoostumuksen CBH-tyypin rakenneosiin on edullisesti noin 0,2 - noin 10 pai-no-% ja edullisemmin noin 0,5 - noin 5 paino-%.

Edullisia sienisellulaaseja käytettäviksi tässä 20 keksinnössä käytettyjen sienisellulaasikoostumusten valmi st ami seksi ovat Triohoderma reeseistä, Trichoderma ko~ j ningiistä, Pencillum-lajeista. Humicola insolensIs tä ja vastaavista saatavat. Tiettyjä sienisellulaaseja on kaupallisesti saatavana, eli {tuötenimet) "Cellucast" -(.saata-25 vana valmistajalta Novo Industry, Kööpenhamina, Tanska), "Rapidase” (saatavana valmistajalta Gist Brocades, N.V.,

Delft, Hollanti), "Cytolase 123" (säätävänä valmistajalta Genencor International, South San Francisco, Kalifornia) ja vastaavat. Muita sienisellulaaseja voidaan helposti j 30 eristää alalla tunnetuilla fermentointi- ja eristysmenet- j telyillä. i

Ilmaisulla "puuvillaa sisältävä kangas" viitataan j ommeltuihin tai ei-ommeltuihin kankaisiin, jotka on vai- j laistettu puhtaasta puuvillasta tai puuvillasekoitteista, j 35 mukaan lukien kudotut puuvillakankaat, puuvlllaneuleety | ] | i 21 puuvilladenimit ja muut samankaltaiset. Käytettäessä puu-yillasekoitteita puuvillan määrän kankaassa tulisi olla ainakin noin 4Q paino-% puuvillaa; edullisesti enemmän kuin noin 60 paino-% puuvillaa; ja edullisimmin enemmän 5 kuin noin 75 paino-% puuvillaa. Sekoitteissa käytettynä kankaassa käytettyyn kanssamateriääliln voi sisältyä yksi tai useampi ei-puuviliakuitu mukaan lukien synteettiset kuidut kuten polyamldikuidut {esimerkiksi nylon-6 ja ny-lon-66), akryylikuidut (esimerkiksi polyakrylonitriili-10 kuidut), polyesterikuidut (esimerkiksi polyetyleenitere-ftalaatti), p o1yvinyγ1ia1koho!ikuidut (esimerkiksi Vinyl-on), polyvinyy1ik1oridiku idut, polyvinylideenikloridikui-dut, polyuretaanikuidut, polyureakuidut ja aramidikuidut.

Arvellaan, että regeneroitua selluloosaa, kuten raionia, 15 voitaisiin käyttää puuvillan korvikkeena puuvillaa sisäl- f tävissä kankaissa.

Ilmaisulla "pinta-aktiivinen aine'· tarkoitetaan anionisia, ei-ionlsia ja amfpiyyttisiä pinta-aktiivisia aineita, jotka tunnetaan hyvin käytöstään pesuainekoostu-20 muksissa.

Ilmaisulla "pesuympäristö" tarkoitetaan vesipohjaista pesuliuosta, joka on valmistettu lisäämällä tarvittava määrä pesuaine- (pinta-aktiivinen aine) koostumusta veteen, Pesuympäristö sisältää yleensä puhdistavana 25 tehokkaan määrän pesuainetta, I

Pesuympäristö määritellään "happamaksi pesuympä- i| ristöksi", jos ympäristön pH on noin 4:stä alle noin j 7:ään. Pesuympäristö määritellään "neutraaliksi pesuympä- j ristöksi", jos ympäristön pH on noin 7. Pesuympäristö 1 | 30 määritellään "alkaliseksi pesuympäristöksi”, jos ympäris- j tön pH on yli 7:stä noin 10:een. Edullisesti alkalisen j pesuyrnpäristön pH on yli 7:stä noin 9:ään ja vielä edul- j . . | lisemmin yli 7:stä noin 8:aan. Esillä oleva keksintö koh- j distuu havaintoon, jonka mukaan EG-tyypin rakenneosia j 35 voidaan käyttää pesuainekoostumuksissa pehmenemisen sekä | | j .1 22 värin pidätyksen/palautumisen ja tunnun saamiseksi puuvillaa sisältäville kankaille riippumatta siltä, käytetäänkö tällaisia koostumuksia happamassa, neutraalissa vai alkalisessa pesuympärlstössä. Kuitenkin koska pesuaine-5 koostumuksia käytetään yleensä aikalisissä olosuhteissa.,: käytetty sellulaasikoostumus on edullisesti sellainen, jolla on jonkin verran aktiivisuutta tällaisissa olosuhteissa. Edullisia sellulaasikoostumuksia ovat reeseistä ja Humicdla insolensistä saadut. Humloola insolens -sellu-10 laasikoostumusten tiedetään alalla säilyttävän merkittävää aktiivisuutta aikalisissä olosuhteissa.

Vaikka EG-tyypin rakenneosien läsnäolo on välttämätön värin pidätyksen/palautumisen, pehmenemisen ja paremman tunnun saamiseksi, EG-tyypin rakenneosien ja CBH-15 tyypin rakenneosien (mukaan lukien CBH-I-tyypin rakenneosien) spesifiset seokset osoittavat myös samoja etuja tai jopa joitain kasvaneita etuja. Spesifisesti vaikka käyttämällä EG-rakenneosia saadaan jonkinlainen puhdisiusetu, ! kasvanut puhdistusetu havaitaan puuvillaa sisältäville j 20 kankaille, jotka on pesty pesuainekoostumuksel1a, joka j sisältää yhtä tai useampaa EG-tyypin rakenneosaa ja CBH-I-tyypin sellulaasirakenneosia sisältävää sellulaasikoostu-musta. Lisäksi vaikka EG-rakenneosien käytöllä aikaansaadaan pehmenemistä, kasvaneeseen pehrnenemi setuun voidaan j 25 päästä sisällyttämällä joitakin CBH-I-tyypin rakenneosia j EG-tyypin rakenneosien oheen.

Toisaalta merkittävien määrien CBH-I-tyypin rakenneosia läsnäolo yhdessä EG-tyypin rakenneosien kanssa johtaa puuvillaa sisältävien kankaiden lisääntyneeseen j 30 lujuudenmenetykseen verrattuna sellUlaasiködstumuksiin, f

jotka joko ovat vapaita CBH-I-tyypin rakenneosista tai si- I

i sältävät vähentyneitä määriä CBH-I-tyypin rakenneosia. % Täten sellulaasia sisältäville pesuainekoostuinuksille ka- ] rakteristisen lujuudenmenetyksen minimoimiseksi esillä 35 olevan keksinnön mukaisissa pesuainekoostumuksissa käyte- ^ :¾ Λ i i 23 tään sellulaäsikoostumuksiä, jotka sisältävät yhtä täi useampaa EG-tyypin rakenneosaa ja alle noin 5 paino-%, ja edullisesti alle noin 2 paino-%, CBH-I-tyypin rakenneosia.

Tällaisia sellulaasikoostumuksia sisältävät pesuainekoos-5 tumukset tuottavat toivotut parannukset puuvillaa sisältäville kankaille samalla kun ne aikaansaavat alentuneen lujuudenmenetyksen verrattuna pesu ainekoostumuksiin, jotka sisältävät sellulaasikoostumusta, jossa on suurempia määriä CBH-i-tyypin rakenneosia.

10 Edelleen edeltävä huomioon: ottaen spesifinen sellu- laäsikoostumus käytettäväksi tämän keksinnön mukaisessa pesuainekoostumuksessa valitaan vertaamalla toivomusta kasvaneesta puhdistusedusta, johon päästään joidenkin CBH-1-tyypin rakenneosien läsnäololla, toivomukseen vastustuk-15 sesta lujuudenmenetykselle, joka sanelee minimaalisen CBH-I-tyypin rakenneosien käytön tai niiden käytön ei lainkaan, Toisen sanoen (tämä merkitsee), että jos pääpaino sellulaasia pesuainekoos tulitukseen sisällytettäessä on puuvillaa sisältävien kankaiden aiempaa parempi pehmeys, vä-20 rin pidätys/palautuminen ja aiempaa parempi tuntu, johon liittyy pienin mahdollinen lujuudenmenetys puuvillaa si- j Sältävälle kankaalle, niin pesuainekoostumuksessa käytetyn ! j sellulaasin tulisi edullisesti käsittää yhtä tai useampaa j EG-tyypin rakenneosaa vapaana kaikista CBH-l-tyypin raken- j

25 neosista. I

Toisaalta jos pääpaino sellulaasia pesuainekoostu-mukseen sisällytettäessä on puuvillaa sisältävien kankaiden värin pidätys/palautuminen, aiempaa parempi pehmeys ja aiempaa parempi tuntu, johon liittyy kasvanut puhdistus- j 30 etu, niin pesuainekoostumuksessa käytetyn sellulaasin tu- | lisi sisältää sellulaasia, joka käsittää yhtä tai useampaa j EG-tyypin rakenneosaa sekä jonkin verran GBH-I-tyypin ra- ] kerineosaä (joskin alle noin 5 paino-%, edullisesti alle | noin 2 paino-%, laskettuna sellulaäsikoostumuksen koko- | 35 naisprotreiinin painosta). 1 | | ' 5 | | 24

Edeltävä huomioon ottaen sellulaasinmäärä, jota yleensä käytetään tämän keksinnön mukaisissa pesuaine-koostumuksissa, on määrä, joka riittää tuottamaan värin pidätyksen/paiauiumisen ja pehmeyden puuvillavaatteille.

5 Edullisesti sellulaasikoostumuksia käytetään noin 0, 01 pa-ino-% - noin 5 paino-% suhteessa pesuainekoostumuksen kokonaispainoon. Edullisemmin sellulaasikoostumuksia käytetään noin 0,05 paino-% - no in 2 paino-% suhteessa pesuaine-koostumuksen kokonaispainoon. Pesuaine-koostumuksessa käy-10 tetty sellulaasin spesifinen pitoisuus valitaan siten, että pesuympäristöön laimennettaessa EG-tyypin rakenneosien pitoisuus on noin 0,5 - noin 500 miljöonaosaa, ja edullisesti noin 2 - noin 100 miljoonaosaa, Pesuainekoos-tumuksessa käytetty sellulaasin spesifinen määrä riippuu 15 EG-tyypin rakenneosien sellulaasikoostumuksissa määrästä sekä siitä, missä määrin pesuainekoostumusta laimennetaan lisättäessä vettä pesuympäristön muodostamiseksi. Nämä tekijät alan taitaja varmistaa helposti.

Edullisesti tämän keksinnön mukaisissa pesuaine-20 koostumuksissa käytetyt sellulaäsikoostumukset sisältävät ainakin noin 20 paino-% endoglukanaasi tyypin rakenneosia laskettuftä proteiinin sellulaasikoostumuksessa kokonaispainosta, edullisemmin ainakin noin 50 paino-%, ja vielä edullisemmin ainakin noin 70 paino-%, ja edullisimmin ai-25 nakin noin 90 paino-% endoglukänaasityypin rakenneosia laskettuna proteiinin sellulaasikoostumuksessa kokonaispainosta.

Alhaisemmilla sellulaasipitoisuuksilla (eli EG-tyypin rakenneosien pitoisuuksilla alle noin 5 miljoona-30 osaa pesuympäristössä) pehmeys, värin pidätys/palautuminen | ja parantunut tuntu, joihin päästään käyttämällä tämän keksinnön mukaisia pesuainekoostumuksia, ovat selvemmät toistetuissä pesuissa. Korkeammilla pitoisuuksilla (eli EG-tyypin rakenneosien pitoisuudet noin 5 miljoonaosaa ja ::ί·: 25 yli pesuympäristössä) parannukset voivat olla havaittavia yksittäisessä pesussa.

Yksi esillä olevan keksinnön tärkeä näkökohta on, että räätälöimällä sellulaasikoostumus sisältämään yhtä 5 tai useampaa EG-rakenneosaa ja sisältämään minimaalisia määtiä CBH-I-tyypin rakenneosia on mahdollista päästä toivottuihin pehmenemis-, värin pidätys/palautumis ja parempi tuntu -vaikutuksiin samanaikaisesti alentaen lujuu-denmenetystä puuvillaa sisältävälle kankaalle.

10 Lisäksi tällaisten räätälöityjen sellulaasikoostu- musten käyttö mahdollistaa alhaisempien sellulaasipitoi-suuksien pesuainekoostumuksessa käytön. Alhaisempien sel-lulaasipitöisuuksien käytön pesuainekoostumuksissa tulisi puolestaan johtaa aiempaa parempaan kuluttajaturvallisuu-15 teen.

Edellä kuvattu sellulaasikoostumus voidaan lisätä pesuainekoostumukseen joko nestelaimentimessa, rakeina, \

emulsioissa, geeleissä, tahnoissa tai vastaavissa. Alan I

taitaja tuntee hyvin tällaiset muodot. Kiinteää pesuaine- \ 20 koostumusta käytettäessä sellulaasikoostumus koostetaan j edullisesti rakeiksi. Edullisesti rakeet voidaan koostaa sisältämään sellulaasia suo jaavaa ainetta. Katso es inter- j kiksi US-patenttihakemusjulkaisu särjanro 07/642 669, joka jätettiin 17. tammikuuta 1991 asianajovaltakirjalla nro 25 010 055-073 ja jonka otsikko on "Granules Containing Both ^ an Enzyme and an Enzyme Protecting Agent ja Detergent Com- j positions Containing Such Granules" (suora. "Rakeita, jotka j sisältävät sekä entsyymin että entsyymiä suojaavaa ainet- \ ta, sekä tällaisia rakeita sisältäviä pesuainekoostumuk- j 30 siä"), joka patenttihakemusjulkaisu sisällytetään kokonai- | suudessaan tähän viitteeksi. Samoin rakeet voidaan koostaa 1

sisältämään materiaaleja, jotka laskevat rakeiden liukene- I

misnopeutta pesuympäristöön. Tällaisia materiaaleja ja | rakeita julkistetaan US-patenttihakemusjulkaisussa sarja-35 nro 07/642 596, joka jätettiin 17. tammikuuta 1991 asia- 26 valtakirjalla nro GCS-17I-US1 ja jonka otsikko on "Granular Compositions" (suora. "Raekoostumuksia"), ja joka patenttihäkernusjulkaisu sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi.

5 'Tämän keksinnön mukaisissa pesuainekoostumuksissa käytetään pinta-aktiivista ainetta, mukaan lukien anioni-siä, ei-ionisia ja amfolyyttisiä pinta-aktiivisia aineita, jotka tunnetaan hyvin käytöstään pesuainekoostumuksissa.

Sopivia aniönisia pinta-aktiivisia aineita tämän 10 keksinnön mukaisessa pesuainekoostumuksessa käytettäviksi ovat lineaariset tai haarautuneet alkyylibentseenisulfo-naatit; alkyyli- tai alkenyylieetterisulfaatit, joissa on lineaarisia tai haarautuneita alkyyliryhmiä tai alkenyy-liryhmiä; alkyyli- tai alkenyylisulfaatit; olefiinisulfo-15 naatit; alkaanisulfonaatit ja muut samankaltaiset. Sopivia vastaioneja anionisille pinta-aktiivisille aineille ovat alkalimetalli-ionit kuten natrium ja kalium; maa-alkalime-talli-ionit kuten kalsium ja magnesium; ammoniumioni; ja alkanoliamiinit, joissa on 1 - 3 aikana!iryhmää hiilessä 20 nro 2 tai 3. |

Amfolyyttisiä pinta-aktiivisia aineita ovat kva- j törnäarinen ammoniumsuola -sulfonaatit, betaiinityypin |

amföiyyttiset pinta-aktiiviset aineet ja muut samankal- I

i täiset. Tällaisissa amfolyyttisissä pinta-aktiivisissa | 25 aineissa on sekä positiivisesti että negatiivisesti va- j rattUja ryhmiä samassa molekyylissä. Ei~ioniset pinta-aktiiviset aineet käsittävät yleensä polyoksialkyleenieet-tereitä, sekä korkeampi rasvahappo -alkanoliamidej a tai niiden aikyleenioksidiadditiotuotteita, rasvahappoglyse- j 30 riinimonoestereitä ja vastaavia. ] Tässä keksinnössä käytettäviksi sopivia pinta-ak- | tiivisia aineita julkistetaan GB-patenttihakemusjulkai- j sussa nro 2 094 826 A, joka julkaisu sisällytetään tähän ·| viitteeksi. j j | j 5 ] s 27

Voidaan käyttää myös tällaisten pinta-aktiivisten aineiden seoksia.

Pinta-aktiivista ainetta tai pinta-aktiivisten aineiden seosta käytetään yleensä tämän keksinnön mukaisissa 5 pesuainekoostumuksissa määränä noin 1 paino-% - noin 95 paino-% kokonaispesuainekoostumuksesta ja edullisesti noin 5 paino-% - noin 45 paino-% kokona!spesuainekoostumukses-ta. Pesuympäristöön laimennettuna pinta-aktiivisen aineen pitoisuus on yleensä noin 500 miljoonapsaä tai enemmän; ja 10 edullisesti noin 1 000 miljoonaosaa - 15 000 miljoonaosaa.

Sellulaasikoostumuksen ja pinta-aktiivisen aineen (yhden tai useamman) ohella tämän keksinnön mukaiset pesu-ainekoostumukset voivat mahdollisesti sisältää yhtä tai useampaa seuraavista rakenneosista: 15 Muut hydrolaasit kuin sellulaasi Tällaisia hydrolaaseja ovat karboksylaattiesteri-hydrolaasi, tioesterihydroiaasi, fosfaattimonoesterihyd-rolaasi ja fösfaättidiesterihydrolaasi, jotka vaikuttavat esterisidokseen,* glykosidihydrolaasi, joka vaikuttaa gly-20 kosyyliyhdisteisiin; entsyymi, joka hydrolysoi N-glykosyy- i liyhdisteltä; tioeetterihydrolaasi, joka vaikuttaa eette-risidokseen; ja a-aminöäsyylipeptidihydrolaasi, peptidyy-liaminohappohydrolaasi, asyyliaminohappohydrolaasi, dipep-tidihydrolaasi ja peptidyylipeptidihydrolaasi, jotka vai-25 kutiavat peptidisidokseen. Edullisia näistä ovat karboksy-laattiesterihydrolaasi, glykösidihydrolaasi ja peptidyylipeptidihydrolaasi, Sopivia hydrolaaseja ovat (1) peptidyy-lipeptidihydrolaaseihin kuuluvat proteaasit kuten pepsii-ni, pepsiini-B, renniini, trypsiini, kymotrypsiini-A, ky-30 motrypsiini-B, ©lastaasi, enterokinaasi, katepsiini-G, j papaiini, kymopapaiini, fisiini, trombiini, fibrinolysii- ] ni, reniini, subtilisiini, aspergillopeptidaasi-A, köliä- j genaasi, klostridiopeptidaasi-B, kalXikreiini, gastxisii- ] ni, katepsiini-D, bromeliini, keratinaasi, kymotrypsiini- \ 35 C, pepsiini-C, aspergillopeptidaasi-B, urokinaasi, karbok- j ] | 28 sipeptidaasi-A ja -S ja aminopeptidaasi; (2) glykosidihyd-rolaasit (sellulaasi, joka on oleellinen rakenneosa, jätetään pois tästä ryhmästä) α-amylaasi, β-amylaasi, gluko-amylaasi, invertaasi, lysotsyymi, pektinaasi, kitinääsi ja 5 dekstranaasi. Edullisia niistä ovat α-amylaasi ja 8-amylaasi . Ne toimivat happamista neutraaleihin systeemeissä, mutta eräs bakteereista saatu osoittaa korkeaa aktiivisuutta alkalisessa systeemissä; (3) karboksylaatiiesteri-hydfolaasi mukaan lukien karboksyyliesteraasi, lipaasi, 10 pektiiniesteraasi ja klorofyllaasi. Erityisen tehokas näistä on lipaasi·

Seuraavat ovat kaupallisten tuotteiden kauppanimiä ja tuottajien nimiä: "Alkalase", "Esperase", "Savinase”, " AMG", "BAN" , ’’Fungamill", ”Sweetzyme" , "Thermamyl" (Novo 15 Industry, Kööpenhamina, Tanska); "Maksatase", "High-Alkaline Protease", "Amylase THC", "Lipase" (Gist Brocades, N.V., Delft, Hollanti); "Protease B-400", "Protease B-4000", " Protease AP", " Protease AP 2100" (Schweizerische

Ferment A.G., Basel, Sveitsi); "CRD Protease” (Monsanto 20 Company, St. Louis, Missouri); "Piocase" (Piopin Corporation, Monticello, Illinois); "Pronase P", "Pronase AS", "Pronase AF" (Kaken Chemical Co., Ltd., Japani); "Lapidase P-2000" (Lapidas, Secran, Ranska); proteaasituotteet (Tyler-standardiseula, 100 %:n läpäisy 16 meshin seulalla 25 ja 100 % 150 meshin seulalla) (Clington Corn Products,

Division of Standard Brands Corp., New York); "Takamine", "Bromelain 1:10", "HT Protease 200", "Enzyme L-W" (saadaan sienistä, ei bakteereista) (Miles Chemical Company, Elkhart, Ind.}; "Rhozyme P-11 Conc.'1, "Pectinol", "Lipase B", 30 "Rhozyme PF", "Rhozyme J-25" (Rohm & Haas, Genencor, South San Francisco, CA); "Ambrozyme 200" (Jack Wolf & Co.,

Ltd., Nöpco Chemical Companyn, Newark, N.J., tytäryhtiö); "ÄTP 40", "ÄTP 120", ”ATp 160” (Lapidas, Secran, Ranska); "Oripase" (Nagase & Co., Ltd., Japani). \ |

S

j 29

Muuta hydrolaasia kuin sellulaasia sisällytetään pesuainekoostumukseen tarkoitukseen tarvittava määrä. Sitä tulisi edullisesti sisällyttää määrä 0,001 - 5 paino-%, ja edullisemmin 0,02 - 3 paino-% puhdistettuna tuotteena.

5 Tätä entsyymiä tulisi käyttää rakeiden muodossa, jotka on valmistettu pelkästään raakaentsyymistä, tai yhdistettynä muihin ainesosiin pesuainekoostumuksessa. Raakaentsyymi-rakeita käytetään sellaisena määränä, että puhdistettua entsyymiä on 0,001 - SO paino-% rakeissa. Rakeita käyte-10 tään määränä 0,002 - 20 ja edullisesti 0,1 - 10 paino-%.

Kuten sellutaasien kohdalla, nämä rakeet voidaan koostaa sisältämään entsyymiä suojaavaa ainetta ja liukenemista hidastavaa ainetta.

Kationisia pinta-aktiivisia aineita ja pitkäket-15 juisiä rasvahapposuoloja Tällaisiin kationisiin pinta-aktiivisiin aineisiin ja pitkäketjuisiih rasvahapposuoloihin sisältyy tyydyttyneiden tai tyydyttymättömien rasvahappojen suoloja, ai- |

kyyli— tai alkenyylieetterikarboksyylihappojen suoloja, a- I

20 sulforasvahappojen suoloja tai estereitä, aminohappoiyypin | pinta-aktiivisia aineita, fosfaattiesteri-pinta-aktiivisia ΐ aineita, kvaternaarisia ammoniumsuoloja mukaan lukien ne, | joissa on 3 - 4 alkyylisubstituenttia ja korkeintaan 1 j fenyyllsubstituoitu alkyyli -substituentti. Sopivia katio- \ 25 nisiä pinta-aktiivisia aineita ja pitkäketjuisia rasvahap- | posuoloja julkistetaan GB-patenttihakemusjulkaisussa nro j 2 094 826 A, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi.

Koostumus voi sisältää noin 1 - noin 20 paino-% tällaisia I

kationisia pinta-aktiivisia aineita ja pitkäketjuisia ras- I

30 vahapposuoloj a. f

Pesutehonmuodostajat

Ä. Kaksivalenssiset sekvestrointiaineet I

•i

Koostumus voi sisältää noin 0 - noin 50 paino-% 1 yhtä tai useampaa pesutehonmuodostaj a-ainesosaa, joka/jot-35 ka valibaah ryhmästä, jonka muodostavat seuraajien yhdis- j 3 30 teiden alkalimetallisuolat ja alkanoliamiinisuolat: fosfaatit, fosfonaat.lt, fosfonokarboksylaatit, aminohappojen suolat, aminopolyasetaatit, suurimolekyyliset elektrolyytit, ei-dissosioituvat polymeerit, dikarboksyylihapppjen 5 suolat ja aluminosillkaattisuolat. Sopivia kaksivalenssi-sia sekvestrointlaineita julkistetaan GB-patenttihakemus-joikaisussa nro 2 094 Ö26 A, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi.

B. Alkalit tai epäorgaaniset elektrolyytit 10 Koostumus voi sisältää noin 1 - noin 50 paino-%, edullisesti noin 5 - noin 30 paino-%, koostumuksesta laskettuna yhtä täi useampaa seuraavien yhdisteiden alkali-metallisuolaa alkaleina tai epäorgaanisina elektrolyytteinä: silikaatit, karbonaatit ja sulfaatit sekä örgaani-15 set alkalit kuten trietanoliamiini, dietanoliamiini, mo-noetanoliamiini ja tri-isopropanoliamiini.

Redepositiota vastustavat aineet

Koostumus voi sisältää noin 0,1 - noin 5 paino-% yhtä tai useampaa seuraavista yhdisteistä redepositiota f 20 vastustavina aineina: polyetyleeniglykoli, polyvinyylial- kohpli, polyvinyylipyrrolidoni ja karboksimetyyliselluloosa .

Näistä karboksimetyylxselluloosan ja/tai polyety-leeniglykolin yhdistelmästä esillä olevan keksinnön mu-25 kaisen sellulaasikoostumuksen kanssa saadaan erityisen käyttökelpoinen likaa poistava koostumus.

Valkaisuaineet Käyttämällä esillä olevan keksinnön mukaista sel-lulaasia yhdistettynä valkaisuaineeseen kuten natriumper-30 karbonaatti, natriumperboraatti, natriumsulfaattl/vetype- | roksidi-additiotuote ja nätriumkloridi/vetyperoksidi-ad- f ditiotuote ja/tai valolle herkkä valkaiseva väriaine kuten j sulfonöidun ftalosyaniinin sinkki- tai aluminiumsuola pa- | rannetaan edelleen pesuainevaikutuksia, ] * | 31

Sinistysalneet ja fluoresoivat väriaineet

Erilaisia sinistysaineita ja fluoresoivia väriaineita voidaan tarvittaessa sisällyttää koostumukseen. Sopivia sinistysaineita ja fluoresoivia väriaineita julkis-5 tetaan GB-patenttihakemusjulkaisussa nro 2 094 826 A, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi.

Paakkuuniumi s ta estävät aineet

Seuraavia paakkuuntumista estäviä aineita voidaan sisällyttää jauhemaiseen pesuaineeseen: p-tolueenisulfo-10 nihapposuolat, ksyleenisulfonihapposuolat, etikkahappo-suolat, sulfomeripihkahapposuolat, talkki, hienoksi jauhettu piidioksidi, savi, kalsiumsilikaätti (kuten "Micro-Cell’' valmistajalta Johns Manyille Co.), kalsiumkarbo-naatti ja magnesiumoksidi.

15 Peiteaineita sellulaasiaktiivisuutta inhiboiville tekijöille Tämän keksinnön mukainen sellulaasikoostumus deak-tivöituu joissakin tapauksissa kupari-, sinkki-, kromi-, elohopea-, lyijy-, mangaani- tai hopeaionien tai niiden j 20 yhdisteiden läsnä ollessa. Erilaiset metalleja kelatoivat | aineet ja metalleja seostavat aineet ovat tehokkaita näitä j irthibiittafeita vastaan. Niitä ovat esimerkiksi keksivä- j lenssinen metalli-ioni -sekvestrointiaineet kuten luetel- \ ti in edeltävässä kohdassa viitaten mahdollisiin lisäaine!- | 25 siin sekä magnäsiumsilikaatti ja magnesiumsulfaatti. j

Sellobioosi, glukoosi ja glukonolaktoni toimivat 1 '1 joskus inhibiittoreina. Edullisesti vältetään näiden sak- i karidien esiintymistä yhdessä sellulaasin kanssa niin j pitkälle kuin mahdollista. Siinä tapauksessa, että saman- s 30 aikaista esiintymistä ei voida välttää, on välttämätöntä j välttää sakkaridien suora kosketus sellulaasiin eslmerkik- | si päällystämällä ne. j

Pitkäketjuiset rasvahapposuolat ja katloniset pin- ] ta-aktiiviset aineet toimivat inhibiittoreina joissakin j

35 tapauksissa. Kuitenkin näiden aineiden samanaikainen läs- I

\ .] ] | i j | 32 näolo selluiaasin kanssa sallitaan, jos niiden suora kosketus estetään jollain keinolla kuten tabletoimalla tai pä ä11y stämä1lä.

Edellä mainittuja peiteaineita ja -menetelmiä voi-5 öaan tarvittaessa käyttää esillä olevassa keksinnössä.

Sellulaasiaktivaattorit Nämä aktivaattorit vaihtelevat riippuen sellulaa-sien laadusta. Proteiinien, koboltin ja sen suolojen, magnesiumin ja sen suolojen, ja kalsiumin ja sen suolojen, 10 kaliumin ja sen suolojen, natriumin ja sen suolojen tai monosakkaridien kuten mannoosin ja ksyloosin läsnä ollessa sellulaasit aktivoituvat ja niiden pesuainevoimat paranevat merkittävästi.

Hapetuksenestoaineet 15 Hapetuksenestoaineita ovat esimerkiksi t-butyyli- hydroksitolueeni, 4,4'-butylideenibis-(6-t-butyyli-3-me tyyli fenoli ), 2,2'-butylideenibis-(6-t-butyyli-4-metyyli-fenoli), monostyrenoitu kresoli, disiyrenoitu kresoli, monostyrenoitu fenoli, distyrenoitu fenoli ja l,l-bis-(4-20 hydroksifenyyli)sykloheksaani.

Liuottavat aineet

Liuottavia aineilta ovat esimerkiksi alemmat alkoholit kuten etanoli, bentseenisulfonaattisuolat, (alempi alkyyli)bentseenisulfonaattisuolat kuten p-tolueenisulfo-25 naattisuolat, glykolit kuten prOpyleeniglyköli, asetyyli- bentseenisulfonaattisuolat, asetamidit, pyridiinidikar-boksyylihappoamidit, bentsoaattisuolat ja urea.

Esillä olevan keksinnön mukaista pesuainekoostu-musta voidaan käyttää laajalla pH-alueella happamasta ai-30 kaliseen pH:hon. Edullisessa suoritusmuodossa esillä olevan keksinnön mukaista pesuainekoostumusta voidaan käyttää alkalisessa pesuainepesuympäristössä ja edullisenunin alka-lisessa pesuainepesuympäristössä, jonka pH on yli 7:stä korkeintaan noin 8:aan, j | 33

Edeltävien ainesosien ohella tämän keksinnön mukaisten pesuainekoostumusten kanssa voidaan haluttaessa käyttää hajusteita, puskureita, säilytysaineita, värejä ja muita vastaavia. Tällaisia ainesosia käytetään tavanomai-5 eesti alalla tähän asti käytettyinä määrinä.

Kun esillä olevassa keksinnössä käytetty pesuaihe-pohja on jauheen muodossa, se voi olla jauhe, joka on valmistettu millä tahansa tunnetuilla valmistusmenetelmillä mukaan lukien spray-kuivausmenetelmä ja rakeistus-10 menetelmä. Edullisia ovat pesuainepohjat, jotka on saatu etenkin spray-kuivausmenetelmällä jä/tai spray-kuivaus/ rakeistusmenetelmällä. Spray-kuivausmenetelmällä saatua pesuaihepohjaa eivät rajoita valmistusolosuhteet. Spray-kuivausmenetelmällä saatu pesuainepohja on onttoja rakei-15 ta, jotka on saatu sumut tantalla lämpöä vastustavien ainesosien, kuten pinta-aktiivisten aineiden ja pesutehon-muodostajien, vesiliete kuumaan tilaan. Rakeiden koko on 50 - 2 000- pm. Spray-kuivauksen jälkeen voidaan lisätä hajusteet, entsyymit, valkaisuaineet, epäorgaaniset aika- j 20 liset pesutehonmuodostajat. Kun on kyseessä hyvin tiheä, j

rakeinen pesuainepohja, joka on saatu esimerkiksi spray- I

kuiväus/rakeistusinenetelmällä, erilaisia ainesosia voidaan I

j samoin lisätä pohjan valmistuksen jälkeen. j

Silloin kun pesuainepohja on neste, se voi olla j 25: joko homogeeninen liuos tai epähomogeeninen dispersio. j

Karboksimetyylisellulöosan hajoamisen sellulaasin pesuaineessa vaikutuksesta poistamiseksi edullisesti karboksi- j metyyliselluloosa rakeistetaan tai päällystetään ennen j sisällyttämistä koostumukseen.: f 30 Tämän keksinnön mukaisia pesuainekoöstumuksia käy- ;j tetään teollisissa ja kotitalouskäytöissä lämpötiloissa ja | liemisuhteissa, joita tavanomaisesti käytetään näissä ym- | päristöissä. |

Niiden käytön pyykinpesuaiheissa lisäksi tässä ku- | 35 vattuja sellulaasikoöstumuksia voidaan lisäksi käyttää j i i 34 esipesuvalheessä tarkoituksenmukaisessa liuoksessa keskimääräisessä pH:ssa, jossa on riittävää aktiivisuutta haluttu j en parannusten saamiseksi värin pidätyksessä/palautumisessa, pehmenemisessä ja tunnussa. Käytettäessä sel-5 lulaasikoostumusta esiliotus- {esim. esipesu) koostumuksessa joko neste-, spray-, geeli- tai tahnakoostumuksena sellulaasikoostumusta käytetään yleensä noin 0,01 - hoin 20 paino-% laskettuna esiliotuskoostumuksen kokonaispainosta. Tällaisissa koostumuksissa voidaan mahdollisesti 10 käyttää pinta-aktiivista ainetta, ja sitä käytettäessä sitä on yleensä läsnä pitoisuus noin 0,01 - noin 20 paino-% laskettuna esiliotuksen kokonaispainosta. Koostumuksen loppuosa käsittää tavanomaisia esiliotuksessa käytettyjä ainesosia, eli laimentimen, puskureita, muita ent-15 syymejä (proteaaseja) ja vastaavia, niiden tavanomaisissa pitoisuuksissa. Täten tällaiset esiliotuskoostumukset käsittävät noin 0 - noin 20 paInö-% pinta-aktiivista ainetta ja noin 0,01 - noin 20 paino-% sellulaasia, joka käsittää yhtä tai useampaa EG-tyypin rakenneosaa ja alle noin 5 20 paino-% CBE-T-tyypin rakenneosia. }

Samoin arvellaan, että tässä kuvattuja sellulaasi- |

koostumuksia voidaan myös käyttää kotikäytössä yksinään I

käytettävänä koostumuksena, joka sopii värin palauttamiseen haalistuneille kankaille. Katso esimerkiksi US-pa-25 tentti julkaisu nro 4 738 682, joka sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi.

Seuraavat esimerkit esitetään esillä olevan keksinnön havainnollistamiseksi eikä niiden tulisi tulkita mitenkään rajoittavan tämän keksinnön kattavuutta.

30 Esimerkkejä s

Esimerkit .1 - 12 ja 20 - 28 esittelevät sellaisen |

Trlohoderma reesein valmistusta, joka on geneettisesti ma- 1

nipuloitu kykenemättömäfcsi tuottamaan yhtä tai useampaa I

sellulaasirakenneosaa tai tuottamaan hyvin runsaasti spe- 1 j 35 sifisiä sellulaasirakenneosia. j | j 35

Esimerkki 1

Trichoderma teesein pyr4~-johdannaisten suhteen valikointi

Pyr4-geeni koödittäa örotidiini-5'-monofosfaatti-5 dekarboksylaasia, jota entsyymiä tarvitaan uridiinin biosynteesiin. Villityypin solut sisällyttävät uridiiniin myrkyllisen inhibiittorin 5-fluoriorotiinibappn (FOA), mikä myrkyttää solut. Kuitenkin solut, joista pyx4-geeni puuttuu, vastustavat tätä inhibiittoria, mutta tarvitsevat 10 uridiinia kasvuun. Tämän vuoksi on mahdollista valikoida pyr4-johdannaiskanto.ien suhteen FOA: ta käyttäen. Käytännössä reesei -kannan RL-P37 (Sheir-Neiss, G,, ja Won't enecourt , B. S. , Appi.Microbiol.Bioteohnol. 20 (1984) 46 -53) itiöitä levitettiin kiinteytetyn kasvualustan pinnal-15 le, joka kasvualusta sisälsi 2 mg/ml uridiinia ja 1,2 ml/ ml FOA:ta. Spontaaneja FOA-resistenttejä pesäkkeitä ilmaantui 3 - 4 päivässä, jolloin sittemmin oli mahdollista f identifioida ne FOA-resistentit johdannaiset, jotka tar- |

vitsivat uridiinia kasvuun. Niiden johdannaisten identifi- I

20 oimiseksi, joissa spesifisesti oli puutteellinen pyr4-gee- | ni, muodostettiin protoplasteja, jotka transformoitiin j plasmidilla, joka sisälsi villityyppi-pyr4-geenin (katso | esimerkit 3 ja 4), Transformoinnin jälkeen protoplast!t j maljoitettiin kasvualustalle, josta puuttui uridiini. Seu-25 rannut transformoitujen pesäkkeiden kasvu osoitti puut- j teellisen pyr4-eteenin täydennyksen plasmidin kantamalla j pyr4-geenillä. Tällä tavalla kanta GC69 identifioitiin | kannan RL-P37 pyr4~-johdannaiseksi. j

Esimerkki 2 j 30 CBHX-deleetiovektorin valmistus CBHI-proteiinia koodittava cbhl-geeni kloonattiin | T. reesei -kannan RX.-P37 genomi-DNA:sta hybridisoimalla j oligonukleotidikoettimeen, joka oli suunniteltu ja raken- j nettu tämän geenin julkistetun sekvenssin perusteella j 35 käyttäen tunnettuja koetinsynteesimenetelmiä ( Shoemaker et j | s 36 ai., 1983b). Cbhl-geeni on 6,5 ke:n Pstl-fragmentissa ja se insertoitiin Päti:llä leikattuun pUC4K:hon (hankittiin valmistajalta Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) korvaten tämän vektorin Kanr-geeni käyttäen alalla tunnettuja tek-5 niikoita, jotka tekniikat esitetään Maniatiksen et ai. julkaisussa vuodelta 1989 ja sisällytetään tähän viitteeksi. Saatu plasmidi, pUC4K::cbhl, leikattiin Sitten Hindi!I:11a ja suurempi, noin 6 ke:n fragmentti eristettiin ja uudelleenligatoitiln, jolloin saatiin pUC4K: ;cbhl^ 10 delta-H/H (katso kuvio 1). Tällä menettelyllä poistetaan cbhl-koodisekvenssi kokonaisuudessaan ja noin 1,2 ke ylävirran ja 1,5 ke alavirran sivuavista sekvensseistä. Noin 1 ke sivuavaa DNA:ta kummastakin päästä alkuperäistä Peti-fragmenttia jää jäljelle.

15 Ί\_ reessi pyr4~geeni kloonattiin 6,5 ke:n HlndXTX- fragmenttina genomi-DNA:ta pUClStaan, jolloin saatiin pTpyr2 (Smith et ai., 1991) , noudattaen Maniatiksen et ai. menetelmiä, supra. Plasmidi pUC4K::cbhl— delta-H/H leikattiin HindiII:11a ja päät defosforyloitiin vasikansuolen 20 alkaiisella fosfataasilla. Tämä päästä defosforyloitu DNA j ligatoitiin 6, 5 ke:n HindiII-fragmenttiin, joka sisälsi j reesei pyr4~geenin, jolloin saatiin p-delta-CBHipyr4. Ku- | vio 1 havainnollistaa tämän plasmidin rakentamista. j

Esimerkki 3 j 25 Protqplastien eristys j

Myseeli saatiin siirrostamalla 100 mitään YEGttä (0,5 % hlivauutetta, 2 % glukoosia) 500 ml:n kolvissa noin 5 x 107 Ί2_ reesei GC69-itiö±tä (pyr4~-johdannalskanta).

Kolvin sisältöä inkuboitiin sitten 37 °G:ssa ravistellen | 30 noin 16 tunnin ajan. Myseeli otettiin talteen sentrifugol- \ maila 2 750 x gtssä. Talteen otettu myseeli pestiin vielä f 1,2 M sorbitöliliuoksessa ja uudelleenlietettiin 40 ml:aan \ liuosta, joka sisäisi 5 mg/ml Novozym* 234 -liuosta (tämä on kauppanimi monikomponenttientsyymisysteemille, joka 35 sisältää 1,3-a-glukanaasiä, 1,3-.6-glukanaasia, laminari- 37 naasia, ksylanaasia, kitinaasia ja proteaasia valmistajalta Novo Biolabs, Danbury, CY); 5 mg/ml MgS04 * 7H20:ta; 0,5 mg/ml nautaseerumialbumiinia; pitoisuuden 1,2 M sorbitoli. Protoplastit poistettiin solujätteestä suodattamalla Mira-5 cloth-kankaan {Calbiochem Corp., La Jolla, CA) läpi ja otettiin talteen sentrifugoimalla 2 000 x g:ssä. Protoplastit pestiin 3 kertaan 1,2 M sorbitoliliuoksella jä kerran liuoksella, jossa olivat pitoisuudet 1,2 M sorbitoli, 50 mM CaCl2, sentrifugoitiin ja uudelleenlietettiin 10 tiheydeksi noin 2 x 108 protoplastia/ml liuokseen, jossa olivat pitoisuudet 1,2 M sorbitoli, 50 mM CaCl2.

Esimerkki 4 S ieniprotoplastien transformointi p-delta-GBHI-pyr4illä 15 200 μΐ esimerkissä 3 valmistettua protoplastilie- tettä lisättiin 20 plraan EcoRI:llä pilkottua p-delta- GBHipyr4:ää (valmistettiin esimerkissä 2) TE-puskurissa (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) ja 50 pl:aan polyetylee- niglykoli- (PEG-) liuosta, joka sisälsi 25 % PEG 4000 20 -valmistetta, pitoisuudet 0,6 M KCl ja 50 mM CaCl2. Tätä j seosta inkuboitiin jäissä 20 minuutin ajan. Tämän inku- 1 . i bointiaikajakson jälkeen siihen lisättiin 2,0 ml edellä j identifioitua PEG-liuosta, liuosta sekoitettiin taas ja | inkuboitiin huoneenlämpötilassa 5 minuutin ajan. Tämän j 25 toisen inkuboinnin jälkeen 4,0 ml liuosta, jossa olivat j pitoisuudet 1,2 M sorbitoli ja 50 mM CaCl2, lisättiin siihen ja tätä liuosta sekoitettiin jälleen. Protoplasti- liuos lisättiin sitten välittömästi sulatettuihin eriin

Vogelin kasvualustaa N (3 g natrlumsitraattia, 5 g j 30 KH2P04: ää, 2 g NH4N03:ea, 0,2 g MgS04 * 7H20: ta, 0,1 g CaCl2- | 2H2p:ta, 5 pg a-biptiinia, 5 mg sitruunahappoä, 5 mg |

ZnS04 * 7H2Ö: ta, 1 mg Fe( NH4 )2 6H20: ta, 0, 25 mg CuS04 ♦ 5H20: ta, 50 pg MnSÖ4 * 4H2D: ta litraa kohden) , joka sisälsi lisäksi 1 %:n glukoosia, pitoisuuden 1,2 M sorbitoli ja 1 %:n aga-35 roosia. Protoplasti/kasvualustäseQS kaadettiin sitten $ 38 kiinteä!le kasvualustalle, joka sisälsi samaa Vogelin kasvualustaa kuin mainittiin edellä. Kasvualusta ei sisältänyt uridiinia, minkä vuoksi vain transformoidut pesäkkeet kykenivät kasvamaan seurauksena kannan GC69 pyr4-5 mutaation täydentymisestä vlliityyppi-pyr4-geeni-inser-tillä p-deltä~CBHIpyr4:ssä. Nämä pesäkkeet siirrettiin sitten ja niitä puhdistettiin kiinteällä Vogelin kasvualustalla M, joka sisälsi lisäaineena 1 %:n glukoosia, ja stabiilit transformantit valittiin jatkoänalyysiin.

10 Tässä vaiheessa stabiilit transformantit erotettiin epästabiileista transformanteista niiden nopeammasta kasvunopeudesta ja siitä, että kiinteällä kasvualustalla, josta puuttui uridiini, muodostui ympyränmuotoisia pesäkkeitä, joiden ulkomuoto oli pikemminkin sileä kuin rosoi-15 nen. Joissain tapauksissa suoritettiin lisästabiiiisuus-testi kasvattamalla transförmantteja kiinteällä ei-selektiivisellä: kasvualustalla (joka siis sisälsi uridiinia), ottamalla talteen itiöitä tästä kasvualustasta ja määrit- { tämällä niiden itiöiden prosentuaalinen osuus, jotka sii- | 20 temmin itivät ja kasvoivat selektiivisellä kasvualustalla, | josta puuttuu uridiini.

Esimerkki 5 |

Transformanttien analyysi j DNA eristettiin esimerkissä 4 saaduista transfer- \

25 mänteistä sen jälkeen, kun niitä oli kasvatettu nestemäi- I

sessä Vogelin kasvualustassa N, joka sisälsi 1 %:ri glu- j

koosia. Näitä transformantti-DNA-näytteitä leikattiin I

edelleen PstI-restriktioentsyymillä ja niille suoritettiin I

agaroosigeelielektroforeesi. Geeli blot-siirrettiin sitten | 30 Nytran-membraanisuodattimelie ja hybridisoitiin 32P-leimat- | tuun p-delta-CBHIpyr4-koettimeen♦ Koetin valittiin identi- ] fioimaan natiivi cbhl-geeni 6,5 ke:n PstI-fragmenttina, natiivi pyr4-geeni ja mitkä tahansa DNA-sekvenssit, jotka saatiin transformoivasta DNA-fragmentista.

39

Radioaktiiviset: nauhat hybridisaatiosta tehtiin näkyviksi ottamalla autoradiokuva. Autoradiokuva esitetään kuviossa 3. Viisi näytettä ajettiin kuten kuvattiin edellä, täten näytteet A, B, C, D ja E. Vyöhyke E on ei-trans-5 formoitu kanta GC69 ja sitä käytettiin kontrollina kysei sessä analyysissä. Vyöhykkeet A - D edustavat transformaatteja-, jotka saatiin edellä kuvatuilla menetelmillä.

Numerot autoradiokuvsn vieressä edustavat molekyylipaino-merkkien kokoja* Kuten voidaan nähdä tästä autoradlokuvas-10 ta, vyöhyke D ei Sisällä 6,5 ke:n CBHI-nauhaa, mikä osoittaa, että tämä geeni on täysin deletoitu transformantista integroimalla DNA-fragmentti cbhl-geeniin. Cbhl-delatortua kantaa kutsutaan FSVP-deita-CBHI:ksi. Kuviossa 2 hahmotellaan lh_ reesel cbhl-geenin deleetio integroimalla kaksois-15 "cross over"-tapahtuman välityksellä suurempi KcoRI-fragmentti p-delta-CBHX-pyryistä cbhl-paikkaan yhdessä tv ree-sei -kromosomeista, Muut analysoidut transformantit vaikuttavat identtisiltä ei-transformoituun verrokkikantaan {

nähden. I

i

20 Esimerkki 6 I

Transformanttien analyysi plntCBHI:llä J

Tässä esimerkissä käytettiin samaa menettelyä kuin j esimerkissä 5 lukuun ottamatta, että käytetty koetin vaih- \ dettiin 3zP-leimatuksi plntCBHI-koettimeksi. Tämä koetin on j 25 pUC-tyypin plasmidi, joka sisältää 2 ke:n Bglll-fragmentin cbhl-paikasta alueella, joka oli deletoitu pUC4K::cbhl-delta-H/H:sta. Kaksi näytettä ajettiin tässä esimerkissä mukaan lukien verrokki, näyte A, joka on ei-transformoitu kanta GC96, ja transformantti P37P-delta~CBHI, näyte B. \

X

30 Kuten voidaan nähdä kuviosta 4, näyte A sisälsi cbhl-gee- | nin, minkä osoitti nauha kohdassa 6,5 ke; kuitenkaan | transformantti, näyte B, ei sisällä tätä 6,5 ke:n nauhaa, j minkä vuoksi se ei sisällä cbhl-geeniä eikä sisällä mitään pUC-plasmidista peräisin olevia sekvenssejä.

40

Esimerkki 7

Proteiinieritys kannalla P37P- delta—CBHI

Itiöitä tuotetusta P37P~deltä-CBHI-kannasta siir-rostettiin 50 ml:aan Trichoderma-peruskasvualustaa, joka 5 sisälsi 1 %:n glukoosia, 0,14 % (NH4)2S04:ää, 0,2 % KH2P04:ää, 0,03 % MgS04:ää, 0,03 % ureaä, 0,75 % bakto-tryptonia, 0,05 % Tween 80 “valmistetta, 0,000016 %

CuS04 * 5H20;ta, 0,001 % FeS04 · 7H20: ta, 0,000128 % ZnS04 · 7H20ita, 0,0000054 % Na2Mo04· 2H20: ta, 0,0000007 % MnGl · 10 4H20:ta). Kasvualustaa inkuboitiin ravistellan 250 ml:n kolvissa 37 °G:ssa noin 48 tunnin ajan. Saatu myseeli otettiin talteen suodattamalla Miracloth-kankaan (Cal-biochem Corp.) läpi ja pestiin kahteen tai kolmeen kertaan 17 mM kaliumfosfaattiliuoksella. Myseeli lietettiin lopuk-15 si 17 mM kaliumfosfaattiliuokseen, jossa oli pitoisuus 1 mM soforoosia, ja inkuboitiin edelleen 24 tunnin ajan j 30 0Gissa ravistellen. Supernatantti otettiin sitten talteen näistä viljelmistä ja myseeli heitettiin pois. Näyt- \

teitä viljelmäsupernatantista analysoitiin isoelektrisellä I

20 fokusoinnilla käyttäen Pharmacia Phastgel -systeemiä ja | i pH:n 3 - 9 esivalettuja geelejä valmistajan ohjeiden mu- 1 kaan. Geeli värjättiin hopeavärillä proteiininauhojen te- | kemiseksi näkyviksi. Cbhl-proteiinia vastaava nauha puuttui näytteestä, joka oli peräisin kannasta P37P-delta~

25 CBHI, kuten esitetään kuviossa 5. Tämä isoelektrinen fokusointi -geeli esittää eri proteiineja eri T_^ reesei -su- J

pernatanttiviljeliaissä. Vyöhyke A on osittain puhdistettu I

CBHI; vyöhyke B on supernatantti ei-transformoidusta Tji j reesei -viljelmästä; vyöhyke G on supernatantti kannasta j 30 P37P-delta-CBHI, joka on tuotettu esillä olevan keksinnön | menetelmien mukaan, Eri sellulaasirakenneosien asemat on j merkitty CBHI, CBHII, EGI, EGII ja EGIII. Koska CBHI muo- j dostaa 50 % solunulkoisesta kokonaisproteiinlsta, se on | tärkein eritetty proteiini ja siten tummin nauha geelissä. j | 41 Tämä isoelektrinen fokusointi -geeli osoittaa selvästi CBHI-proteiinin tyhjentymisen P37P-de.lta-CBHI-kannasta.

Esimerkki 8 pP-delta-CBHXX:n valmistus 5 reesei cbh2-geeni, joka koodittaa CBHII-pro- teiinin, on kloonattu 4,1 kein EcoRI-fragmenttina genomi-DNA:ta, mikä esitetään kaaviollisesti kuviossa 6A (Chen et -ai-., Biotechnol 5 (1987) 274 - 278). Tämä 4,1 ke:n fragmentti insertoitiin EcoRI-keskusten väliin pUC4XL.:ssa.

10 Viimeksi mainittu plasmidi on pUC-johdannainen (jonka rakensi R.M. Berka, Genencor International Inc.), joka sisältää monikloonauskeskuksen, jossa on symmetrinen kuvio restriktioendonukleaaslkeskUksia j ärjestaytyneenä tässä esitetyssä järjestyksessä: EcoRI, BamHI, Saci, Smal, 15 Hindi!I, XhoI, Bglll, Clai, Bglll, XhoI, HindiII, Smal,

Saci, BamHI, EcoRI. Käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä on rakennettu plasmidi, pP-deltä-GBHil (kuvio 6B), jossa 1,7 ke:n keskialue tästä geenistä HindiII-keskuksen (koh- | dassa 74 ep 3'-suuntaan CBHII-luennanaloituskeskuksesta)

20 ja Clal-keskuksen (kohdassa 265 ep 3'-suuntaan CBHII:n I

viimeisestä kodonista) välissä on poistettu ja korvattu 1,6 ke:n HindiII-C1ai-DNA-fragmentilla, joka sisältää T^ | reesei pyr4-geenin. j T. reesei pyr4-geeni leikattiin pTpyr2:sta (katso 25 esimerkki 2) 1,6 ke:n Nhel-Sphl-fragmentissa ja insertoitiin pUC2I9*n (katso esimerkki 23) Sphl- ja Xbal-keskusten väliin, jolloin saatiin p219M (Smith et ai., Cum.Genet.

19 (1991) 27 - 33). Sitten pyr4~geeni poistettiin Hindlll-Clal-fragmenttlna, jossa on 7 ep DNA:ta yhdessä päässä ja 30 6 ep DNA:ta toisessa päässä pUC219-monikloonauskeskukses- ta, ja tämä insertoitiin cbh2-geenin Htndlll- ja Clal-kes- 1 kuksiin plasmidin pP-delta-CBHII muodostamiseksi (katso 1 kuvio 6B). |

Pilkottaessa tätä plasmidia EcoRI:llä vapautuu 35 fragmentti, jossa on 0,7 ke sivuavaa DNA:ta cbh2-paikasta | j 42 yhdessä päässä, 1,7 ke sivuavaa DNA;ta cbh2-palkasta toisessa päässä ja T»_ reesei pyr4-geeni keskellä.

Esimerkki 9 ebh2-geenin deleetio T. reesei -kannasta GC69 5 Muodostetaan kannan GC69 protop!asteja, jotka transformoidaan EcoRI;llä pilkotulla pP-delta-CBHII;11a esimerkeissä 3 ja 4 hahmoteltujen menetelmien mukaan.

DNA;ta transformanteista pilkotaan EcoRI;llä ja Asp?18:11a ja suoritetaan agaroosigeelielektroforeesi. DNA geelistä 10 blot-siirretään membraanisuOdattimelle ja hybridisoidaan 32P-leimattuun pP-delta-CBHII:een esimerkin 11 menetelmien mukaan. Identifioidaan transformantit, joissa on yksi kopio EcoRI-fragmenttia j>P-delta-.CB:H.II :sta integroituneena tarkalleen cbh2-paikkaan > Transformantteja kasvatetaan 15 myös ravistelukolveissa kuten esimerkissä 7 ja proteiinia yiljelmäsupernatanteissa tutkitaan isoelektrisellä fokusoinnilla. Tällä tavalla muodostetaan Th reesei GC69-transformantteja, jotka eivät tuota CBHII-proteiinia.

Esimerkki 10 j 20 P37P~delta-CBHI:n pyr4"-johdannaisen muodostaminen

Itiöitä transformantista (P37P-delta-CBHI), josta I

cbhl-geeni oli deletoitu, levitettiin FOA:ta sisältävälle j kasvualustalle. Tämän transformantin pyr4~-johdannainen saatiin sitten käyttäen esimerkin 1 menetelmiä. Tämä pyr4~

25 kanta nimettiin P37P-delta-CBHIPyr'26:ksi. I

Esimerkki 11

Cbh2-geenin deleetio kannasta, josta on aiemmin deletoitu cbhl

Muodostettiin kannan P37P-äelta-CBHIPyr"26 proto- \ 30 plasteja, jotka transformoitiin EcoRI:llä pilkotulla· pP- ] deltä-CBHIJ;: 11a esimerkeissä 3 ja 4 hahmoteltujen mene- 1 telmien mukaan. j

Puhdistettuja stabiileja transformantteja viljel- ] tiin ravistelukolveissa kuten esimerkissä 7 ja proteiinia 35 viljelmäsupernatantelssa tutkittiin isoelektrisellä foku- j | 43 soinnilla. Identifioitiin yksi transformantti (joka nimettiin P37P-delta~delta-’GBH67: ksi ), joka ei tuottanut lainkaan CBHil-proteiinia, Vyöhykkeessä D kuviossa 5 esitetään supernatantti transformantista, josta on deletoitu 5 sekä cbhl- että cbh2-geeni ja joka on tuotettu esillä olevan keksinnön menetelmien mukaan.

DNA uutettiin kannasta F37P-delta-delta-CBH67, se pilkottiin EcoRJ:llä ja Asp718:11a ja suoritettiin aga-roosigeelielektroföreesi. DNA tästä geelistä blot-siir-10 rettiin membraanisuodattimelle ja hyhriäisoitiin 32p-lei-mattuun pP-delta-GBHlIreen ( kuvio 7). Vyöhykkeessä A kuviossa 7 esitetään hybfiäisaatiokuvio, joka havaittiin DNA;lie ei-transformoidusta reesei -kannasta. Havaitti in 4,1 ke:n EcoRl-fragmentti, joka sisältää villityyppi-15 cbh2-geenin. Vyöhykkeessä B esitetään hybridisaatiokuvio, joka havaittiin kannalle F37P~delta~delta-CBH67. Yksittä!- | nen 4,1 ke:n nauha on eliminoitu ja korvattu kahdella noin \ 0,9 ja 3,1 ke:n nauhalla. Tämä on odotusten mukainen ku- | vio, jos yksittäinen kopio EcoRl-fragmenttia pP-deita- 20 CBHII:sta on integroitunut tarkalleen cbh2-paikkaan. | \

Samoja DNA-näytteitä pilkottiin myös EcoRl:llä ja j }

Southern blot -analyysi suoritettiin kuten edellä. Tässä j esimerkissä koetin oli 32P-leimattu piniCBHXl. Tämä plas- f midi sisältää osan cbh2-geenikoodisekvenssiä siitä cbh2~ j 25 geenisegmentistä, joka oli deletoitu plasmidista pP-delta- j CBHil. Lainkaan hybridisaatiota ei havaittu DNA:11a kan- ] nasta P37P-delta-delta-CBH67, mikä osoitti, että cbh2-gee- j ni oli deletoitu ja ettei tämä kanta sisältänyt mitään | pUC-plasmidista peräisin olevia sekvenssejä. j 30 Esimerkki 12 | pEGXpyr4:n rakentaminen j T. reesei egll-geeni, joka koodittaa EGI:tä, on j

kloonattu 4,2 ke:n HindIII-fragmenttina genomi-DNA:ta I

kannasta RL-P37 käyttäen hybridisaatiota oligonukleoti- I

35 deihin, jotka syntetisoitiin julkistetun sekvenssin mukaan j j i | :¾ 44 ( Penttilä et ai., Gene 45 (1986 ) 253 - 263; van Arsdell et ai., Bio/Technology 5 (1987) 60 - 64). 3,6 ke:n HindXII-BamHI-fragmentti otettiin tästä kloonista ja ligatoitiin 1,6 ke: n Hind 111-BamHI. - f r agmentt iin, joka sisälsi ree-5 sei pyr4-geenin ja joka oli saatu pTpyr2:sta (katso esimerkki 2) ja pUC218:sta (identtinen pUC219:ään nähden, katso esimerkki 23, jolloin siinä kuitenkin monikloonaus-keskus on vastakkaisesti suuntautunut), jota oli leikattu Hindin :11a, plasmidin pEGIpyr4 saamiseksi (kuvio 8).

10 Pilkkomalla pEGIpyr4:ää Hindlll:11a vapautettaisiin DNA-fragmentti, joka sisältää vain T_. reesel -genomi-DNA:ta (eg11- ja pyri-geenit) lukuun ottamatta 24 ep sekventoi-tua, synteettistä DNA;te näiden kahden geenin välissä ja 6 ep sekventoitua, synteettistä DNA;ta yhdessä päässä (katso 15 kuvio 8).

Esimerkki 13 esittelee Cytolase 123 -sellulaasin {täydellinen sienisellulaasikoostumus, joka on saatu Tri-ohoderma teeseistä ja jota on saatavana valmistajalta Ge-nencor International, Inc., South San Francisco, CA) ra-20 kenneosien eristystä puhdistusmenettelyillä.

Esimerkki 13

Cytolase 123 -sellulaasin puhdistaminen sellulaa-s i rakenneos iin

Cytolase; 123 -sellulaasi fraktioitiin searaavalis 25 tavalla. Sellulaasirakenneosien normaali jakauma tässä sellulaasisysteemissä on seuraava: CBH-I 45 - 55 paino-% CBH-II 13 - 15 paino-% 30 EG-! 11 - 13 paino-% EG-II 8-10 paino-% EG-III 1-4 paino-% BG 0,5-1 paino-% | j 45

Fraktiointi suoritettiin käyttäen kolonneja, jotka sisälsivät seuraavia hartseja: Sephadex G-25 -geelisuoda-tushartsi valmistajalta Sigma Chemical Company (St. Louis,

Mb'), QA Trisacryl M -anioninyaihtohartsi ja SF Tri s ac ryi M 5 -kationinvaihtohartsi valmistajalta IBF Biotechnics (Savage, Md.). Cytolase 123 -sellulaasista, 0,5 g, poistettiin suolat käyttäen kolonnia, jossa oli 3 litraa Sephadex G-25 -geelisuodatushartsia, sekä 10 mM natriumfosfaatti-puskuria, pH 6,8. Liuos, josta oli suolat poistettu, palo nostettiin sitten kolonniin, jossa oli 20 ml QA Trisacryl M -anioninvaihtohartsia. Tähän kolonniin sitoutunut fraktio sisälsi CBH-I:n ja EG-I:n. Nämä rakenneosat erotettiin gradienttieluutiolla käyttäen vesigradienttia, joka sisälsi natriumklöridia pitoisuuden 0 - noin 500 mM. Tähän ko~ 15 lonniin ei sitoutunut fraktio sisälsi CBH-II:n ja EG-XI:n.

Näistä fraktioista poistettiin suolat käyttäen kolonnia, jossa oli Sephadex G-25 -geelisuodatushartsia ja jota oli tasapainoitettu 10 mM natriumsitraattiliuoksella, pH 3,3. I

Tämä liuos, 200 ml, panostettiin sitten kolonniin, jossa 20 oli 20 ml SF Trisacryl M -kationinvaihtöhartsia. CBH-IX ja

EG-li eluoitiin erikseen käyttäen vesigradienttia, joka I

sisälsi natriumklöridia pitoisuuden 0 - noin 200 mM. !

Muita sellulaasisysteemejä, jotka voidaan erottaa j rakenneosikseen noudattaen samankaltaisia menettelyjä kuin | 2.5 edellä esimerkissä 13, ovat "Cellucast" (saatavana valmis- j tajalta Nova Industry, Kööpenhamina, Tanska), "Rapidase" | (saatavana valmistajalta Gist Brocades, N.V., Delft, Hoi- j lanti) ja Trichoderma konlngilstä, Feniclllum-· lajeista ja ] vastaavista peräisin olevat sellulaasisysteemit. f

30 Esimerkki 14 I

EG-XII:n puhdistus Cytolase 123 -sellulaasista j

Esimerkki 13 edellä esitteli useiden rakenneosien :j eristystä Cytolase 123 -sellulaasista. Kuitenkin koska j

Cytolase 123 -sellulaaslssa esiintyy hyvin pieniä määriä j |

S

46 EG-III:ea, tämän rakenneosan eristämiseksi käytettiin seuraavia menetteiyj ä.

Ä. EG-lII-selluIaasientsyymin uuttaminen suuressa mittakaavassa 5 100 litraa soluvapaata sellulaasisuodosta kuumen nettiin noin 30 °C:seen. Kuumennetusta materiaalista tehtiin noin 4-%:ista (w/vj PEG 8000 -valmisteen (polyety-leeniglykpli, mp. noin 8 000) suhteen ja noin 10-%:ista (W/v) kidevedettömän natriumsulfaatin suhteen. Seos «vuo-10 dost! 2-faasίnesteseoksen, Faasit erotettiin käyttäen SA-1-levypakkasentrifugia. Faasit analysoitiin käyttäen ho-peavärjäystä isoelektrinen fokusointi -geeleissä. EG-III ja ksylanaasi saatiin fraktioitua ja rikastettua. Talteen otettu koostumus sisälsi noin 20 - 50 paino-% EG-III;eä> 15 Mitä tulee edeltävään menettelyyn, polyetyleenigly- kolin, jonka molekyylipaino on huomattavasti alle noin 8 000, käyttö antoi epätyydyttävän erotuksen; kun taas po-lyetyleeniglykolin, jonka molekyylipaino on huomattavasti enemmän kuin noin 8 000, käyttö johti toivottujen entsyy-20 mien syrjäytymiseen talteen otetusta koostumuksesta. Mitä tulee natriumsulfaartimäärään, natriumsulfaattitasot, jot- j ka olivat huomattavasti yli noin 10 % (w/v), aiheuttivat saostumisongelmia; kun taas natriumsulfaattitasot, jotka olivat huomattavasti alle noin '10 % (w/v), antoivat huonon 25 erotuksen tai liuos säilyi yhtenä faasina.

B. EG-XII»n puhdistus fraktioimalla EG-III:n puhdistus suoritetaan fraktioimalla täydellisestä sienisellulaasikoostumuksesta (Cytolase 123 -sellulaasi, kaupallisesti saatavana valmistajalta Genen-30 cor International, South San Francisco, CA), jota tuottaa villityypin Trlohoderma reesei. Spesifisesti fraktiointi suoritetaan käyttäen kolonneja, jotka sisältävät seuraavia hartseja: Sephadex G-25 -geelisuodatushartsi valmistajalta

Sigma Chemical Company .(.St. Louis, Mo), QA Trisacryl M | | 35 -anioninvaihtohartsi ja SP Trisacryl M -kationinvaihto- j i 47 hartsi valmistajalta IBF Biotechnics (Savage, Md.}. Cyto-lase 123 -sellulaasista, 0,5 g, poistetaan suolat käyttäen kolonnia, jossa on 3 litraa Sephadex G-25 -geelisuodatus-hartsia, sekä 10 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 6,8. Sit-5 ten liuos, josta on suolat poistettu, panostetaan kolonniin, jossa on 20 ml QA Trisacryl M -anioninvaihtohartsia.

Tähän kolonniin sitoutunut fraktio sisälsi CBH-!:n ja EG-I:n. Tähän kolonniin ei sitoutunut fraktio sisältää CBH-II:n, EG“*II:n ja EG-III:n, Mäistä fraktioista poistetaan 10 suolat käyttäen Sephadex G-25 -geelisuodatushartsikolon-nia, jota on tasapaino!tettu 10 mM natriumsitraattiliuoksella, pH 4,5. Tämä liuos, 200 ml, panostetaan sitten kolonniin, jossa on 20 ml SP Trisacryl M -kationinyaihtö-hartsia. EG-III eluoitiin 100 ml:11a vesiliuosta, jossa 15 oli pitoisuus 200 mM natriumklpridi.

EG-III:n eristyksen tehokkuuden parantamiseksi saattaa olla toivottavaa käyttää Trichoderma reeseita, jota on modifioitu geneettisesti siten, että se ilmentää hyvin runsaasti EG-Ill:a ja/tai että se ei kykene tuotta-20 maan yhtä tai useampaa EG-I-, EG-II-, CBH.-I- ja·/tai GBH-Ii-rakenneosista. Tämä johtaa välttämättä EG-lii:n tehokkaampaan eristykseen esimerkiksi fraktioimalla ja/tai PEG-uutolla kuten kuvattiin edellä.

Samoin saattaa olla toivottavaa puhdistaa edelleen 25 edellä kuvattuja EG-lii“koostumuksia oleellisesti: puhtaiden EG-lii-koostumusten saamiseksi, eli koostumusten, jotka sisältävät EG-XII:ea enemmän kuin noin 80 painö-% proteiinia. Esimerkiksi tällainen oleellisesti puhdas EG-IXI-proteiini voidaan saada käyttäen materiaalia, joka on 30 saatu menettelystä A, menettelyssä B tai päinvastoin. Yksi nimenomainen menetelmä EG-III:n edelleen puhdistamiseksi on edelleen fraktioida tämän esimerkin 14 osassa b) saatua EG-III-näytettä. Jatkofraktiointi suoritettiin FPLC-systeemissä käyttäen Mono-S-HR 5/5 -kolonnia (saatavana vai- 1 35 mistäjalta Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). j Ä j 48 FPLC-systeemi koostuu nestekromatografiakontrolloijasta, 2 pumpusta, duaaliväylämonitotista, fraktiokerääjästä ja piirturista (joita kaikkia on saatavana valmistajalta Pharmacia lkb Biotechnology, Piscataway, NJ). Fraktiointi 5 suoritettiin poistamalla suolat 5 ml:sta tämän esimerkin 14 osassa b) valmistettua EG-III-näytettä käyttäen 20 ml:n Sephadex G-25 -kolonnia, jota oli edeltäpäin tasapalnoi-tettu 10 mM natriumsitraattiliuoksella, pH 4. Kolonnia eluoitiin sitten käyttäen vesigradienttia, jossa oli nat-10 riumkloridia pitoisuus 0 - 200 mM, nopeudella 0,5 ml/min ja keräten 1 ml:n fraktioita. EG-III otettiin talteen fraktioissa 10 ja 11 ja sen puhtausasteeksi määritettiin yli 90 % SDS-geelielektroforeettisesti. Tämän puhtausasteen EG- III sopii N-pään aminohapposekvenssin määritykseen 15 tunnetuilla tekniikoilla.

Oleellisesti puhdasta EG-XII:ea sekä esimerkissä 13 puhdistettuja EG-I- ja EG-II-rakenneosia voidaan käyttää yksittäin tai seoksissa tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä. Näillä EG-rakenneosilla on seuraavat ominais-20 piirteet:

Mp. pl pH-optimi1 EG-I n. 47 - 49 kD 4,7 n. 5 EG-II n. 35 kD 5,5 n. 5 25 EG-III n. 25 - 28 kD 7,4 n. 5,5 - 6,0 1 pH-optimi määritettiin RBB-CMG-aktiiyisuydesta kuten seuraavassa esimerkissä 15- Näiden rakenneosien seosta tämän keksinnön käy-30 tännössä .käyttämällä, voidaan saada Synergistinen vaste pehmenemisen, värin pidäiykseh/palauturaisen ja/tai tunnun paranemisessa verrattuna yhteen rakenneosaan. Toisaalta yhden rakenneosan käyttö tämän keksinnön käytännössä voi olla stabiilimpaa tai sillä voidaan saada laajempi aktii-35 visuusspektri eri pH-arvoilla. Esimerkiksi seuraava esi- 49 merkki 15 osoittaa, että EG-III:lla on huomattavaa aktiivisuutta RBB-GMC:n suhteen aikalisissä olosuhteissa.

Esimerkki 15

Sellulaasikoostumusten aktiivisuus eri pH-arvoissa 5 Seuraavaa menettelyä käytettiin pH~profiilien mää rittämiseksi kahdelle eri sellulaasikoostumukselle. Ensimmäinen sellulaasiköostumus oli CBH-I- ja CBH-II-deletoitu sellulaasiköostumus, joka oli valmistettu Trichoderma reeseistä, jota oli geneettisesti modifioitu edellä kuvattuun 10 nähden samankaltaisella tavalla siten, ettei se kyennyt tuottamaan CBH-I- ja CBH-II-rakenneosia. Koska tämä sel-lulaasikoostumus ei sisällä CBH-I;tä ja CBH-II:ta, jotka yleensä muodostavat noin 58 - 70 % Trichoderma reeseistä peräisin olevasta sellulaasikoostumuksestä, tämä sellu-15 laasikoostumus on välttämättä rikastunut EG-rakenneosien, eli EG-I;n, EG-II:n, EG-IlI:n ja vastaavien, suhteen.

Toinen sellulaasiköostumus oli puhtausasteeltaan | noin 20 - 40 %:n EG-III-fraktio, joka oli eristetty Tri- j choderma reeseistä peräisin olevasta sellulaäsikoostumuk- j 20 sesta samankaltaisilla puhdistusmenetelmillä kuin esimer- | kin 14 osassa b). j Näiden sellulaasikoastumusten aktiivisuus määri- j tettiin 40°C:ssa ja määritykset suoritettiin käyttäen f seuraavia menettelyjä. \ 25 Lisätään 5 - 20 μΐ tarkoituksenmukaista entsyymi- |

liuosta riittävä pitoisuus tuottamaan tarvittava määrä J

entsyymiä lopulliseen liuokseen. Lisätään 250 μΐ RBB-CMC:n ] (Remazol Brilliant Blue R -karboksimetyyliselluloosa, kau- ] pallisesti saatavana valmistajalta MegaZyme, 6 Altana 1 30 Place, North Rocks, N.S.W. 2151, Australia) 2~painopro- | senttistä liuosta 0,05 M sitraatti/fosfaatti-puskurissa j pH: ssa 4, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 ja 8. |

Vortex-sekoitetaan ja inkuboidaan 40 °C:ssa 30 mi- | nuutin ajan. Jäähdytetään jäähauteessa 5 - 10 minuutin .] 35 ajan. Lisätään 1 000 μΐ metyylisellosolvia, joka sisältää j l j :j j 50 pitoisuudet 0,3 M natriumasetaatti ja 0,02 M sinkkiase-taatti, Vortex-sekoitetaan ja jätetään seisomaan 5 - 10 minuutiksi. Sentrifugoidaan ja supernatäntti kaadetaan ky ve.t teihin. Suhteellinen entsyymiaktiivisuus määritettiin 5 mittaamalla kunkin kyvetin liuoksen optinen tiheys (O.D.) 590 nm:ssä. Korkeammat optisen tiheyden tasot vastaavat entsyymiaktiivisuuden korkeampia tasoja.

Tämän analyysin tulokset esitetään kuviossa 9, joka havainnollistaa CBH-I- ja CBH-II-deletoidun sellulaasi-10 koostumuksen suhteellista aktiivisuutta verrattuna EG-III-sellulaasikoostumukseen. Tästä kuviosta nähdään, että CBH-I:n ja CBH-II:n suhteen deletoidulla sellulaasikoostumuk-sella ori optimaalinen sellulolyyttinen aktiivisuus RBB-CMC:tä vastaan lähellä pH:ta 5,5, ja että sillä on jonkin 15 verran aktiivisuutta aikalisillä pH-ärvoilla, eli pH-ar-voilla > 7 - 8. Toisaalta EG-III:n suhteen rikastetulla sellulaaslkoostumuksella on optimaalinen sellulolyyttinen aktiivisuus pH:ssa 5,5 - 5 ja sillä on merkittävää aktii- | visuutta aikalisillä pH-arvoilla. j 20 Esimerkki 16 |

Sellulaasikoostumusten lujuudenmenetyksen pesuko- \ neessa määritys | Tämän esimerkin tarkoituksena on tarkastella eri- ] laisten sellulaasikoostumusten kykyä alentaa puuvillaa 1 25 sisältävien kankaiden lujuutta. Koska useimpien Trichoder- j ma reeseista saatujen sellulaasirakenneosien aktiivisuus on suurimmillaan. pH::ssa 5 tai lähellä sitä, lujuudenmene- | tystulokset ovat selvimpiä, kun määritys suoritetaan suun- j nilleen tässä pH;ssa. Kuitenkin pH:ssa 5 saatujen tulosten j 30 uskotaan korreloivan tuloksiin lujuudehmenetyksistä, jotka f tapahtuisivat muilla p.H-arvoilla, jolloin ne ovat suuntaa | antavia analysoitujen sellulaasirakenneosien suhteellises- \ ta lujuudenmenetystä aiheuttavasta kapasiteetista, ]

Spesifisesti tässä esimerkissä ensimmäinen analy- j 35 soitu sellulaasikoostumus Oli täydellinen sienisellulaa- '\ \ \ \ \ \ \ 5 | 51 sikoostumus (Cytolase 123 -sellulaasi, kaupallisesti saatavana valmistajalta Genencor International, South San Francisco, CA), joka oli tuotettu villltyypin Trichodefma reeseillä, ja se identifioitiin GC010:ksi.

5 Toinen analysoitu sellulaasikoostumus oli CBH-11- deletoltu sellulaasikoostumus, joka oli valmistettu Tri-choderma teeseistä, jota oli modifioitu geneettisesti tavalla/ joka on samankaltainen edeltäviin esimerkkeihin l -12 nähden ja seursaviin esimerkkeihin 20 - 28 nähden, si-10 ten, ettei se kyennyt ilmentämään CBH-II:ta, ja se identifioitiin CBHIId: ksi. Koska·. CBH-II muodostaa aina noin 15 % sei lulaasikpos tulituksesta, tämän rakenneosan deleetio johtaa GBH-I:n ja kaikkien EG-rakenneosien rikastuneisiin tasoihin.

15 Kolmas analysoitu sellulaasikoostumus oli CBH-I- ja CBH-Il-deletoitu sellulaasikoostumus, joka oli valmistettu j

Trichoderma reeseistä, jota oli modifioitu geneettisesti \ . i samalla tavalla kuin kuvattiin edellä siten, ettei se ky- | ennyt ilmentämään CBH-I:tä ja CBH-II:ta, ja se identifioi- { 20 tiin CBHI/lld:ksi. Koska CBH-I ja CBH-II muodostavat aina ! noin 70 % sellulaasikoostumuksesta, tämän rakenneosan de- | leetiö johtaa kaikkien EG-rakenneosien rikastuneisiin ta- j soihin. i

Viimeinen analysoitu sellulaasikoostumus oli CBH-I- I

25 deletoitu sellulaasikoostumus, joka oli valmistettu Tri- \ choderma reeseistä, jota oli modifioitu: geneettisesti sa- | mankaltäisellä tavalla kuin mitä kuvattiin edellä siten, ettei se kyennyt Ilmentämään CBH-I;tä, ja se identifioi- ] tiin CBHIdlksi. Koska CBH-I muodostaa aina noin 55 % sei- j 30 lulaasikoostumuksesta, tämän rakenneosan deleetio johtaa j GBH-II:n ja kaikkien EG-rakenneosien rikastuneisiin täsoi- ;j hin. |

Edellä kuvattujen sellulaasikoostumus ten vaikutusta j puuvillaa sisältävän kankaan iujuudenmenetykseen testat- ] 35 tiin pesukoneessa. Koostumukset normalisoitiin ensin si~ j | 52 ten, että käytettiin samoja määriä EG-rakenneosia. Kutakin sellulaasikoostumusta lisättiin sitten erillisiin liuose-riin, jotka käsittivät 400 ml 20 mM sitraatti/fosfaatti-puskux'ia, joka oli titrattu pH:hon 5 ja sisälsi 0,5 ml ei-5 ionista pinta-aktiivista ainetta. Kutakin saaduista. liuoksista lisättiin sitten erilliseen pesukonekanisteriin.

Näihin kanistereihin lisättiin jokin määrä marmorikuulia edistämään lujuudenmenetystä sekä 40 x 50 cm:n palanen puuvillakangasta (100-%:inen kudottu puuvilla, saatavana 10 tyypplnuraerolla 467 valmistajalta Test Fabrics, Inc., 200 Bladkford Ave., Middlesex, NJ 08846). Sitten kanisteri suljettiin ja se laskettiin pesukonekylpyyn, jota pidettiin 43 °C:ssa. Sitten kanisteria pyöritettiin kylvyssä nopeudella, joka oli ainakin noin 40 kierrosta/min (rpm), 15 noin 1 tunnin ajan. Sitten kangas poistettiin, huuhdottiin hyvin ja kuivattiin tavanomaisessa kuivaajassa.

Lujuudenmenetystulosten maksimoimiseksi edeltävä menettely toistettiin vielä kahdesti, jolloin 3. käsittelyn jälkeen: puuvillakankaat poistettiin ja lujuudenmenetys 20 analysoitiin. Lujuudenmenetys mitattiin määrittämällä vetolujuus kudesuuntaan ("FTS") käyttäen InstrQn-testetiä ja tuloksia verrattiin Sellaisen kankaan FTS:ään, jota oli käsitelty samalla liuoksella lukuun ottamatta sellulaasi-lisäyksen jättämistä pois. Tämän analyysin tulokset il- j 25 moitetaan prosentuaalisena lujuudenmenetyksenä, joka määritetään seuraavasti: 1 - FTS sellulaasin kanssa

Lujuudenmenetys-% = 100 X _ 30 FTS ilman sellulaasia Tämän analyysin tulokset esitetään kuviossa 10, josta ilmenee, että koostumuksilla, jotka sisälsivät CBH-I:tä, eli täyssellullaasi (GC010) ja CBH-lI-deletoitu 35 sellulaasi, oli suurin lujuudenmenetys, kun taas koostumuksilla, jotka eivät sisältäneet CBH-I:tä, oli merkittä- \ j $ 53 västi alentunut luj uudenmenetys verrattuna täyssellulaa-siin ja CBH-II-deletoituun sellulaasiin. Näistä tuloksista nähdään, että CBH-I-tyypin rakenneosien läsnäolo sellulaa-sikoostunvuksessa antaa koostumukselle kasvaneen lujuuden-5 menetyksen verrattuna samanlaiseen koostumukseen, joka ei Sisällä CBH-I:tä.

Samoin nämä tulokset osoittavat, että CBH-I.T.: 11a on jokin osa lujuudenmenetyksessä.

Täten ottaen huomioon nämä tulokset lujuudenmene-10 tystä vastustavia sellulaasikpostumuksia haluttaessa tällaisten koostumusten tulisi olla vapaita kaikista CBH-I-tyypin sellulaasirakenneosista ja edullisesti kaikista CBH-tyypin rakenneosista. Tässä suhteessa arvellaan, että EG: n suhteen rikastetut sellulaasikoostumukseh johtavat 15 jopa alhaisempaan lujuudenmenetykseen pH:ssa, joka on 7 tai yli, kuin pH:ssa 5 havaitut tulokset, jotka esitetään kuviossa 10.

Esimerkki 17 I

i Värin palautuminen | 20 EG-rikastetun sellulaasin kykyä palauttaa väri ! puuvillaa sisältäville kankaille analysoitiin seuraavissa { kokeissa. Spesifisesti käytetyn puuvillakankaan haalistu- j out ulkonäkö syntyy siitä, että kankaalle kerääntyy pin- j takuituja ajan mittaan. Nämä kuidut johtavat kankaan haa- \ 25 liehuneeseen ja takkuiseen ulkonäköön, jolloin näiden j kuitujen poistaminen on välttämätön edellytys kankaan ai- ] kuperäisen terävän värin palauttamiselle. Edeltävä huomioon ottaen nämä kokeet määrittävät sellulaasikoostumuk-sen kyvyn palauttaa väri mitatessaan sellulaasikoostumuk- 1 30 sen kykyä poistaa pinta-kuituja. j

Ensimmäisessä kokeessa mitataan täydellisen sellu- | laasisysteemin (Gytolase 123 -sellulaasi, kaupallisesti | saatavana valmistajalta Genencor International, South San j

Francisco, GA), joka ori tuotettu Villityypin Trlchoderma | 35 reeseillä;, kykyä poistaa pintakuituja puuvillaa sisältä- j | | i 54 västä kankaasta eri pH-arvoissa. Tämän sellulaasin kykyä poistaa pintakuituja testattiin pesukoneessa. Sopiva määrä sellulaasia pitoisuuden joko 25 miljoonaosaa tai 100 mil-jöonaosaa sellulaasia saamiseksi lopulliseen koostumukseen 5 lisättiin erillisiin 400 ml;n liuoseriin, jotka käsittivät 20 mM sitraatti/fosfaattipuskuria ja sisälsivät 0,5 ml eliöni sta. pinta-aktiivista ainetta. Näytteet valmistettiin ja tiirattiin, jotta saatiin näytteet, joiden pH:t olivat 5, 6, 7 ja 7,5. Kukin saatu liuos lisättiin sitten ©rilli-10 seen pesukonekanisteriin. Näihin kanistereihin lisättiin jokin määrä marmorikuulia edistämään kuitujen poistoa sekä 18 x 13 cm:n palanen puuvillakangasta (100-%:inen kudottu puuvilla, saatavana tyyppinumerolla 439W valmistajalta Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 15 08846). Sitten kanisteri suljettiin ja se laskettiin pesu- konekylpyyn, jota pidettiin 43 °G:ssa. Kanisteria pyöritettiin sitten kyiyyssä nopeudella, joka oli vähintään 40 kierrosta minuutissa (rpm), noin 1 tunnin ajan. Sitten kangas poistettiin, huuhdottiin hyvin ja kuivattiin tavan-20 omaisessa kuivaajassa. 1 Näin käsitellyistä kankaista analysoitiin sitten kuidunpoisto arvioimalla paneeli testissä. Erityisesti koodattujen (eli vailla merkkejä olevien) kankaiden kuituta-son arvioi 6 henkilöä. Kankaista arvioitiin silmämääräi— 25 sesti pintakuidut ja ne pisteytettiin asteikolla 0 - 6.

Asteikolla on 5 standardia merkityksellisten vertailujen mahdollistamiseksi. Standardit ovat:

Arvosana Standardi2 30 0 Sellulaasilla ei käsitelty kangas 1 Kangas, jota on käsitelty 8 mil- j Qonaosalläsellulaasia 2 Kangas, jota on käsitelty 16 mil— | 35 joonaosalla sellulaasia j ]

S

55 3 Kangas, jota on käsitelty 20 rail- j oonaosalla sellulaasia 4 Kangas, jota on käsitelty 40 mil-· joonaosal1a sellulaasia 5 5 Kangas, jota on käsitelty 50 mil- joonaosalla sellulaasia 6 Kangas, jota on käsitelty 100 miljoonaosalla sellulaasia 2 Kaikissa standardeissa kankaana oli 100-%:inen 10 puuvillalävystandarditestikangas {tyyppi nro 439W), jota on saatavana valmistajalta Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846.

3 Kaikkia näytteitä käsiteltiin samalla sellulaa-sikoöstumuksellä. Sellulaaslpltoisuudet ovat kokonaispro- 15 teiinista· Käsittelyolosuhteet pesukoneessa ovat samat kuin esitettiin edellä esimerkissä 16.

Arvioitavalle kankaalle, annettiin arvosana, joka lähimmin vastasi yhtä standardeista. Kankaiden täydellisen 20 analyysin jälkeen kaikkien henkilöiden kullekin kankaalle antamat arvot laskettiin yhteen ja muodostettiin keskiarvo.

Tämän analyysin tulokset esitetään kuviossa 11. Spesifisesti kuviosta II ilmenee, että samassa pH:ssa 25 poistettujen kuitujen määrässä nähdään annosriippuvainen vaste. Tämä merkitsee siis, että samassa pH:ssa kankaille, joita oli käsitelty suuremmalla pitoisuudella sellulaasia, saatiin korkeammat kuidunpoistotasot kuin kankaille, joita oli käsitelty alhaisemmalla pitoisuudella sellulaasia. Li-30 säksi tämän kuvion tulokset osoittavat, että korkeammissa pH-arvoissa kuidunpolsto voidaan edelleen suorittaa pelkästään käyttämällä korkeampia sellulaasipitoisuuksla.

Toisessa kokeessa verrattiin kahden erilaisen sel-lulaasikoostumuksen kykyä poistaa kuitua. Spesifisesti 35 ensimmäinen analysoitu sellulaäsikoostumus oli täydellinen | sellulaasisysteemi (Cytolase 123 -sellulaasi, kaupallises- j f •1 j | 56 ti saatavana valmistajalta Genencor International, South San Francisco, CA), joka oli tuotettu villityypin Trlchoderma teeseillä ja joka identifioidaan GCÖlOiksi.

Toinen analysoitu sellulaasikoostumus oli CBH-I- ja 5 CBH-ll-deletoitu sellulaasikoostumus, joka oli valmistettu Trlchoderma reeseistä, jota oli geneettisesti modifioitu samalla tavalla kuin kuvattiin edellä siten, ettei se kyennyt tuottamaan CBH-1:tä ja CBH-II:ta, ja joka identifioidaan CBH1/XIdiksi. Koska CBH-I ja CBH-II muodostavat 10 aina noin 70 % sellulaasikoostumuksesta, tämän rakenneosan deleetio johtaa kaikkien EG-räkenneosien rikastuneisiin tasoihin.

Sellulaasikoostumukset normalisoitiin ensin siten, että käytettiin samoja määriä EG-rakenneosia. Näiden 15 koostumusten kykyä poistaa pintakuituja testattiin, pesukoneessa. Sppiva määrä selluläasia tarvittavien pitoisuuksien EG-rakenneosia saamiseksi lopullisiin koostumuksiin lisättiin erillisiin 400 ml:n liupseriln, jotka käsittivät 20 mM sitraatti/fosfaattipuskuria ja sisälsivät 0,5 ml ei- j 20 ionista pinta-aktiivista aihetta. Näytteet valmistettiin j ja titrattiin pH:hon 5. Kukin saaduista liuoksista lisättiin sitten erilliseen pesukonekanlsteriin. Näihin kani-stereihin lisättiin jokin määrä marmorikualia kuidunpois-ton edistämiseksi sekä 18 x 13 cm:n palanen puuvillakan- j 25 gasta (100-%;inen kudottu puuvilla, saatavana tyyppinume- j rolla 439W valmistajalta Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave,, Middlesex, NJ 08846). Sitten kanisteri suljettiin ja se laskettiin pesukonekylpyyn, jota pidettiin 43 °C:ssa. j

Sitten kanisteria pyöritettiin kylvyssä nopeudella ainakin j 30 noin 40 kierrosta minuutissa (rpm) noin 1 tunnin ajan. f

Sitten kangas poistettiin, huuhdottiin hyvin ja kuivattiin \ tavanomaisessa kuivaajassa. j

Sitten näin käsitellyistä kankaista analysoitiin j kuidunpoisto arvioimalla ne edellä kuvatussa paneelites-35 tissä. Tämän analyysin tulokst esitetään kuviossa 12. Spe- ; Ί ] j 57 sifisosti kuviosta 12 ilmenee, että sekä GCÖ1Q- että GBH-I/IIä-sellulaasikoostumukset antoivat oleellisesti identtiset kuidunpoistotulokset samoja määriä EG:tä käytettäessä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että juuri EG-raken-5 neosat tuottavat kuidunpoiston. Nämä tulokset yhdistettyinä kuvion 11 tuloksiin osoittavat, että EG-rakenneosat voivat poistaa kuituja joka aikalisissä olosuhteissa.

Esimerkki 18 värin palauttaminen tergotometrillä 10 Tämä esimerkki on jatkoa esimerkille 17 ja tukee sitä, että CBH-tyypin rakenneosat eivät ole välttämättömiä värin palautumiselle. Tämän esimerkin tarkoituksena on tutkia vailla CBH-tyypin rakenneosia olevien sellulaasi-koosturftusten kykyä palauttaa puuvillaa sisältävien kan-15 kaiden väri. Koska useimpien Trlchoderma reeseistä saatujen EG-rakenneosien aktiivisuus on suurin pH:ssä 5 tai lähellä sitä, värinpalautumistulokset ovat selvimmät suoritettaessa määritys suunnilleen tässä pHissa. Kuitenkin pH:sää 5 saatujen tulosten uskotaan korreloivan värinpa-20 lautumistuloksiln, jotka saataisiin muilla pH-arvoilla, minkä vuoksi ne ovat suuntaa antavia analysoitujen sel-lulaasirakenneosien värinpalauttainiskapasiteetista.

Spesifisesti tässä esimerkissä käytetty sellulaa-sikoostumus oli CBH-I- ja CÖH-II-deletoitu sellulaasi-25 koostumus, joka oli valmistettu Trlchoderma reeseistä, jota oli modifioitu geneettisesti samalla tavalla kuin kuvattiin edelleen siten, ettei se kyennyt tuottamaan CBH-I:tä ja CBH-II:ta. Koska CBH-I ja CBH-II muodostavat aina noin 70 S sellulaasikoostumuksesta, tämän rakenneosan de-30 leetio johtaa kaikkien EG-rakenneosien rikastuneisiin tasoihin .

Määritys suoritettiin lisäämällä riittävä pitoisuus tätä seilulaasikoostuimista 50 mM sitraatti/fösfaatti-pus-kuriin, jotta saatiin pitoisuus 500 miljoonaosaa sellulaa-35 siä. Liuos tiirattiin pH:hon 5 ja se sisälsi 0,1 paino-% 58 ei-ionista. pinta-aktiivista ainetta (Grescoterg GL1Ö0, kaupallisesti saatavana valmistajalta Gresco Mfg., Thomas-ville, N.C. 273,60'). Sitten 25 cm x 25 cm:n palanen haalistunutta, puuvillaa sisältävää kangasta sijoitettiin 1 lii-5 raan tätä puskuria ja jätettiin 43 C:seen 30 minuutiksi, minkä jälkeen sekoitettiin 30 minuutin ajan nopeudella IQQ kierr./min. Sitten kankaat poistettiin puskurista, pestiin ja kuivattiin. Saatuja kankaita verrattiin sitten kankaaseen ennen käsittelyä. Tämän analyysin tulokset ovat 10 seuraavat:

Puuvillaa sisältävä materiaali Tulos Käytetty puuvilla-T-paita Havaittu hyöty

Fuuvillaneule Havaittu hyöty 15

Ilmaisulla "havaittu hyöty" tarkoitetaan, että käsitelty kangas osoittaa värin palautumista (eli se on vähemmän haalistunut) verrattuna ei-käsiteltyyn kankaaseen.

Nämä tulokset tukevat esimerkin 17 tuloksia, ettei CBH-20 tyypin rakenneosien läsnäolo ole välttämätön haalistunei den puuvillaa sisältävien kankaiden värin palauttamisen suorittamiseksi. j

Esimerkki 19 Pehmeys 25 Tämä esimerkki osoittaa, että CBH-tyypin rakenne osien läsnäolo ei ole oleellinen aiempaa paremman pehmeyden antamiseksi puuvillaa sisältäville kankaille. Spesifisesti tässä esimerkissä käytetään sellulaasikoostumusta, joka on saatu Trlchoöerma reeseistä, jota on manipuloitu 30 geneettisesti edellä kuvatulla tavalla siten, ettei se kykene tuottamaan CBH-I- ja CBH-IΓ-rakenneosia,

Testattiin tämän sellulaasikoostumuksen kykyä pehmentää froteepyyhettä. Spesifisesti 240 g:n ei-pehmitet-tyjä puuvillafroteekangaspalasia, joiden koko oli 36 cm x | 35 38 cm (saatavana tyyppinumerolla 420NS valmistajalta Test ,| j 59

Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08845), leikattiin 18 cm x 19 cm:n tupoiksi.

Testattiin edellä kuvatun sellulaasikoostumuksen kykyä pehmentää näitä tuppoja pesukoneessa. Spesifisesti 5 sopiva määrä sellulaasia pitoisuuden 500, 250, 100, 50 ja 10 miljoonaosaa sellulaasia saamiseksi lopulliseen sellu-laasiliuokseen lisättiin erillisiin 400 ml:n liuoseriin, jotka käsittivät 20 mM sitraatti/fosfaatti-puskuria ja sisälsivät 0,025 paino-% ei-ionista pinta-aktiivista ai-1Ö netta (Triton X114). Lisäksi tehtiin sokeakoe, joka sisälsi samaa liuosta, mutta johon ei ollut lisätty sellu-laasia. Näin valmistetut näytteet titrattiin pH*hon 5.

Kukin saaduista liuoksista lisättiin sitten erilliseen pesukonekanisteriin. Näihin kanistereihin lisättiin jokin 15 määrä marmorikuulia pehmeyden edistämiseksi seka edellä kuvatut puuvillatupot. Kokeet kaikissa olosuhteissa suoritettiin kolminkertaisina käyttäen kaksi tuppoa kanisteria kohden. Sitten kukin kanisteri suljettiin ja kanisteri läskettiin pesukonekylpyyn, jota pidettiin 37 °C:ssa. Sit-20 ten kanisteria pyöritettiin kylvyssä nopeudella ainakin noin 40 kierrosta minuutissa (rpm) noin 1 tunnin ajan.

Sitten tupot poistettiin, huuhdottiin hyvin ja kuivattiin tavanomaisessa kuivaajassa.

Sitten analysoitiin tuppojen pehmeys arvioimalla 25 etusijälleasetustestissä. Spesifisesti 6 panelistille annettiin oma sarjansa tuppoja ja heitä pyydettiin asettamaan ne paremmuusjärjestykseen pehmeyden mukaan pehmeys-kriteerien kuten koko kankaan taipuisuuden perusteella.

Tupot, jotka oli saatu käsittelystä viidellä eri entsyy-30 mipitoisuudella, sekä sokeakoe sijoitettiin verhon taakse ja panelisteja pyydettiin asettamaan ne järjestykseen vähiten pehmeästä pehmeimpään. Kullekin tupolle annettiin arvosana sen järjestyksen suhteessa muihin tuppoihin perusteella, jolloin 5 oli pehmein ja 0 vähiten pehmeä.

60

Kunkin panelistin antamat arvosanat laskettiin yhteen, minkä jälkeen muodostettiin keskiarvo*

Tulokset näistä keskimääräisistä arvoista esitetään kuviossa 13. Spesifisesti nämä tulokset osoittavat, että 5 korkeammilla sellulaasipitoisuuksilla saadaan parantunut pehmeys. Huomataan, että tähän parantuneeseen pehmeyteen päästään ilman joko CBH-I:n tai CBH*-II;n läsnäoloa sellu-1aasikoostumukses sa.

Näiden tulosten osalta arvellaan, että sellulaasi-10 koostumuksen alhaisemmilla pitoisuuksilla parantunut pehmeneminen ilmenee toistetuissa pesuissa.

Esimerkkien 16 - 19 osalta sellulaasikoostumuksia, jotka ovat rikastuneita EG-tyypin rakenneosien suhteen ja jotka on saatu muista mikro-organismeista kuin Trichoderma 15 reeseistä, voitaisiin käyttää näissä esimerkeissä kuvattu jen sellulaasikoQstumusten tilalla. Erityisesti EG-tyypin rakenneosien suhteen rikastuneen sellulaasikoostumuksen lähde ei ole tärkeä tälle keksinnölle ja mitä tahansa EG-tyypin rakenneosien suhteen rikastettua sienisellulaasi-20 koostumusta voidaan käyttää. Esimerkiksi sienisellulaaseja käytettäviksi tässä keksinnössä käytettyjen sienisellulaa-sikoostumusten valmistamiseksi voidaan saada Trichoderma koningiistä, Pencillum-lajeista ja vastaavista tai voidaan käyttää kaupallisesti saatavana olevia sellulaaseja, eli 25 "Gellueast” -valmistetta (saatavana valmistajalta Novo Industry, Kööpenhamina, Tanska), ”Rapidase"-valmistetta (saatavana valmistajalta Gist Brocades, N.V., Delft, Hollanti) ja vastaavia.

Esimerkki 20 30 Trichoderma reesei -transformantteja, jotka sisäl tävät plasmidin pEGIpyr4 T. reesei -kannan Rut3Q (Sheir-Neiss j a Mpntene-court, Appi. Microhiol, Biotechnol. 20 (1984) 46 - 53) pyr4-vajaa johdannainen saatiin esimerkissä 1 hahmotel-35 lulla menetelmällä. Tämän kannan protoplasteja transfor- j j 61 moitiin ei-pilkotulla pE6lpyr4:llä ja stabiilit transfor-mantit puhdistettiin>

Viisi näistä transformanteista {nimeltä EP2, EP4, EPS, EP6 ja EPll) sekä ei-transformoitu RutC30 siirros-5 tettiin 50 ml:aan yEG-kasvualustaa (hiivauute, 5 g/litra; glukoosi, 2Q g/litra) 250 ml:n ravlstelukolvetssä ja kasvatettiin ravistellen 2 päivän ajan 28 °C:ssa. Saatu my-seeli pestiin steriilillä vedellä ja lisättiin 50 ml:aan TSF-kasvualustaa (0,05 M sitraatti/fosfaatti-puskuri, pH 10 5,0; mikrokiteinen Avicel-selluloosa, 10 g/litra; kh2po4, 2.0 g/litra; (NH4)2S04, 1,4 g/litra; proteaasipeptoni, 1.0 g/litra; urea, 0,3 g/litra; MgS04·7H20, 0,3 g/litra;

CaCl2, 0,3 g/litra; FeS04· 7H20, 5,0 mg/litra; MnS04 ·H20, 1,6 mg/litra; ZnS04, 1,4 mg/litra; CoCl2, 2,0 mg/l.itra; 0,1 % 15 Tween 80 -valmistetta). Näitä viljelmiä inkuboitiin ravistellen vielä 4 päivän ajan 28 °C:ssa. Näistä viljelmistä otettiin supernatanttinäytteitä ja määritykset, joilla oli määrä mitata proteiinin ja endoglukanaasiaktiivisuuden kokonaismäärä, suoritettiin kuten kuvataan alla.

20 Endoglukanaasimääritys perustui liukoisten, värill isten oligosakkaridien vapautumiseen Remazol Brilliant Blue -karboksimetyyliselluloosasta (RBB-GMC, saatiin valmistajalta MegaZyme, North Rocks, NSW, Australia}. Substraatti valmistettiin lisäämällä 2 g kuivaa RBB-CMCrtä 25 80 ml:aan juuri keitettyä deionisoitua. vettä samalla kii vaasti sekoittaen. Seoksen jäähdyttyä huoneenlämpötilaan lisättiin 5 ml 2 M natriumasetäattipuskuria {pH 4,8) ja pH säädettiin 4,5:ksi.. Tilavuus säädettiin lopuksi 100 ml:ksi lisäämällä deionisoitua vettä ja natriumatsidia lisättiin 30 loppupitoisuuteen 0,02 %. Näytteitä T. reesei -verrokki-viljelmästä, pEGIpyr4-transformanttlviIjelmäsupernatan-tista tai 0,1 M natriumasetaattia sokeana kokeena (10 -20 pl) sijoitettiin putkiin, 250 pl substraattia lisättiin ja putkien sisältöä inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C.ssa, 35 Putket sijoitettiin jäihin 10 minuutiksi, minkä jälkeen 62 lisättiin 1 ml kylmää saastetta (3,3 % natriumasetaattia, O, 4 % sinkkiasetaattia, pH 5 HC1: llä, 76 % etanolia). Putkien sisältö vortex-sekoitettiin ja niiden annettiin seistä S minuutin ajan, minkä jälkeen sentrifugoitiin 3 minuu-5 tin ajan noin 13 000 x g:ssä. Optinen tiheys niitattiin spektröfotoinetrisesti 590 - 600 nm:n aallonpituudella.

Käytetty proteiinirnääritys oli BGA- (bisinkoniini-happoj määritys käyttäen reagensseja, jotka saatiin valmistajalta Pierce, Rockford, Illinois, USA. Standardina 10 oli nautaseerumialbumiini (BSA), BCA-reagenSsi välmistet-tiin sekoittamalla 1 osa reagenssia B 50 osaan reagenssia A. 1 ml BCA-reagenssia sekoitettiin 50 μΐ:aan tarkoituksenmukaisesti laimennettua BSA:ta tai testiviljelmäsuper-natanttia. Inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C:ssa ja lo-15 puksi mitattiin optinen tiheys spektrofotometrisesti 562 nm:n aallonpituudella.

Edellä kuvattujen määritysten tulokset esitetään taulukossa 1. On selvää, että j otkut transformanteista tuottivat kasvaneita määriä endoglukanaasiaktiivisuutta 20 verrattuna ei-transformoituun kantaan RutC30. Arvellaan, että endoglukanaasit ja eksasellobiohydrolaasit, joita ei-transformoitu reesei tuottaa, muodostavat noin 20 ja vastaavasti 70 % eritetyn proteiinin kokonaismäärästä. j Tämän vuoksi transformaatin, kuten EPS:n, joka tuottaa 25 noin 4 kertaa enemmän endoglukanaasia kuin kanta RutC30, voisi odottaa erittävän likimäärin yhtä suuria määriä en-doglukähaasityypin ja eksosellobiohydrolaasityypin proteiineja.

Tässä esimerkissä kuvatut transformantit saatiin 30 käyttäen ehyttä pEGIpyr4:ää ja he sisältävät genomiin integroituneita DNA-sekvenssejä, jotka saatiin pUG-plasmi-dista. Ennen transformointia olisi mahdollista pilkkoa pEGXpyr4:ää HindHiiliä ja eristää suurempi DNA-fragment-ti, joka sisältää vain T. reesei -DNA:ta. Transformoimalla 35 ΊΝ_ reesei tällä eristetyllä DNA-fragmentilla voitaisiin j ä j 63 eristää transförmantteja, jotka tuottavat hyvin runsaasti EG~I:tä ja jotka eivät sisällä lainkaan heterologisia DNA-sekvenssejä lukuun ottamatta kahta lyhyttä palasta synteettistä DNA:, ta, jotka esitetään kuviossa 8. Olisi samoin 5 mahdollista käyttää pEGIpyr4:ää kannan tränsformöinnissa, josta on deletoitu joko cbhl-geeni tai ebh2-geeni tai molemmat geenit. Tällä tavalla voitaisiin rakentaa kanta, joka tuottaa hyvin runsaasti EG-I:tä ja tuottaa joko rajoitetussa määrin tai ei lainkaan eksosellobiohydrolaase-10 ja.

Esimerkin 20 menetelmiä voitaisiin käyttää T. ree-sei -kantojen tuottamiseksi, jotka tuottaisivat hyvin runsaasti jotain muita sellulaasirakenneosia, ksylanaäsi-rakenneosia tai muita proteiineja, joita reesei nor-15 maalisti tuottaa.

Taulukko 1 T, reesei -transformanttien erittämä endoglukanaa-siakti1vi suus 20

A B

Endoglukanaasi- aktiivisuus Proteiini

Kanta { 0. D. 590 nm:ssä) (rag/ml) A/B

25

RutC3Ö 0,32 4,1 0,078 EP2 0,70 3,7 0,189 EP4 0,76 3,65 0,208 EPS 1,24 4,1 0,302 30 EP6 0,52 2,93 0,177 EP11 0,99 4,11 0,241

Edeltävät tulokset esitetään EG-l-rakenneosän ylituotannon suhteessa kokonaisproteiiniin osoittamistarkoi-35 tuksessa eikä ylituotannon laajuuden osoittamistarkoituk- 64 sessä. Tässä suhteessa ylituotannon laajuuden odotetaan vaihtelevan kokeesta toiseen.

Esimerkki 21 pCEPClin rakentaminen 5 Rakennettiin plasmidi, pCEPCl, jossa EG-1:n koodi- sekvenssi oli funktionaaiisesti fuusioitu promoottoriin cbhl-geenistä. Tähän päästiin käyttämällä paikkaspesifistä muiatointia in vitro cbhl- ja egll-geenien DNA-sekvenssin muuttamiseksi kätevien restriktioendonukleaasipilkkomis-10 keskusten luomiseksi juuri 5'-suuntaan (ylävirtaan) vastaavasti niiden iuennanaloituskeskuksista. Suoritettiin DNA-sekvenssianalyysi odotetun sekvenssin (läsnäolon) varmistamiseksi kyseisten kahden DNA-segmentin liitoskohdassa. Tehdyt spesifiset muutokset esitetään kuviossa 14.

15 DNA-fragmentit, jotka yhdistettiin pCEPCl:n muo dostamiseksi, insertoitiin pUC4K:n EcoRI-keskusten väliin ja ne olivat seuraavat (katso kuvio 15): A) 2,1 ke:n fragmentti cbhl-paikan 5'-sivuavalta alueelta. Tähän sisältyy promoottorialue ja se ulottuu ma-20 nipuloinnilla luotuun Bell-keskukseen eikä siten sisällä cbhl-koodlsekvensslä.

33) 1,9 ke: n fragmentti genomi-DNA: ta egll-paikasta alkaen 5'-päästä manipuloinnilla luodulla BamHl-keskuk- j sella ja ulottuen läpi koodialueen ja sisältäen noin 0,5 25 ke luennanlopetuskodonin toiselta puolelta. Fragmentin 3'-päässä on 18 ep:n palanen, joka on peräisin pUC218-moni-kloonauskeskuksesta, ja 15 ep:n synteettinen oligonukleo-tidi, jota käytetään tämän fragmentin liittämiseksi sen-raavaan fragmenttiin.

30 C ) DNA-fragmentti cbhl-paikan 3?-sivuavalta alueelta ulottuen asemasta noin 1 ke alavirtaan asemaan noin 2,5 ke alavirtaan cbhl-luennanlopetuskodonista.

D) Insertoituna Nhel-keskukseen fragmentissa (C) oli 3,1 ke: n Nhel-Sphl-DNA-fragmentti, joka sisälsi 35 pTpyr2:sta (esimerkki 2) saadun reesei pyr4-geenin ja j j 65 jossa oli 24 ep pUC18-monikloonauskeskuksesta peräisin olevaa DNArta toisessa päässä»

Plasmidi, pCEPCl, suunni1teltiin ja rakennettiin siten, että EG-I-koodisekvenssi integroituisi cbhl-paik-5 ka an korvaten CBH-I-koodisekvenssin lisäämättä mitään vierasta DNA:ta isäntäkantaan. Pilkkomalla tätä plasmidia EcoRI:llä vapautetaan fragmentti, johon sisältyy cbhl-promoot torialue, eg 11 - ko od .1 s ek ven s s i ja kopioinninlope-tuskodoni, _T^ reesei pyri-geeni ja DNA-segmentti cbhl-10 paikan 3'-suunnan (alavirran) sivuavalta alueelta (katso kuvio 15).

Esimerkki 22 pCEPCl-DNA;ta sisältäviä transformantteja Pyri-vajaa kanta reesei RutC30:ea (Sheif-Neissv 15 supra) saatiin esimerkissä 1 hahmotellulla menetelmällä. Tämä kanta transformoitiin pCEPGiillä, jota oli pilkottu EcoRI:llä, Stabiilit transformantit valittiin ja niitä viljeltiin sitten rävistelukolveissa sellulaasin tuottamiseksi kuten kuvattiin esimerkissä 20. Sellulaasipro-20 teiinin visualisoimiseksi suoritettiin isoelektrinen fokusointi -geelielektroföreesi näytteillä näistä viljelmistä käyttäen esimerkissä 7 kuvattua menetelmää. Kaikkiaan 23:siä tällä tavalla analysoidusta transformantista todettiin 12 :n ei tuottavan lainkaan CBH-I-proteiinia, 25 mikä on odotettu tulos CEPCl-DNAm integraatiosta cbhl-paikkaan. Southern blot -analyysiä käytettiin sen varmistamiseksi, että integraatio oli todella tapahtunut cbhl-paikassa joissakin näistä transformanteista, ja ettei mitään bakteerlpläsmidivektorista (pUG4K) peräisin olevia 30 sekvenssejä ollut läsnä (katso kuvio 16). Tätä analyysiä varten DNA:ta transformanteista pilkottiin PstI:llä, minkä jälkeen suoritettiin elektroforeesi ja blot siirto memb-raanisuödattimelle. Saatua Southern blot -kopiota seulottiin radioleimatulla plasmidilla pUC4K::cbhl (katso esi-35 merkki 2). Koetin hybridisoitul obhl-geeniin 6,5 ke:n DNA- 66 fragmentissa ei-transformoidusta verrokkiviljelmästä (kuvio 16, vyöhyke A), CEPC1-DNA-fragmentin integraation cbhl-paikkaan voisi odottaa johtavan tämän 6, 5 ke:n nauhan menetykseen ja kolmen muun nauhan, jotka vastaavat noin 5 1,0 ke:n, 2,0 ke:n ja 3,5 ke:n DNA-fragmentteja, ilmaantu miseen. Tämä on täsmälleen kuvio, joka havaitaan kuviossa 16 esitetylle transformaatille, vyöhyke C. Samoin kuviossa 16 esitettynä vyöhyke B on esimerkki tran&formantista, jossa useita kopioita pCEPGl:stä on integroitunut muihin 10 paikkoihin genomiss a kuin cbhl-paikka·.

Endoglukanaasiaktiivisuusmääritykset suoritettiin näytteillä viljelmäsupernatäntista ei-transformoidusta viljelmästä sekä transformanteista tarkalleen kuten kuvattiin esimerkissä 20 lukuun ottamatta, että näytteitä 15 laimennettiin 50-kertaisesti ennen määritystä siten, että proteiinipitoisuus näytteissä oli noin 0,03 - 0,07 mg/ml.

Tulokset määrityksistä, jotka suoritettiin ei-transfor-moidulla verrokkiviljelmällä ja neljällä eri transforman-tilla (nimettiin CEPC1-101, GEPCI-103, CEPCI-105 ja CEPC1-20 112), esitään taulukossa 2. Transformantit CEPCl-103 ja i GEPCl-112 ovat esimerkkejä, joissa GEPC1-fragmentin integ- j raatio on johtanut CBH-I-tuotannon menetykseen.

Taulukko 2 25 T. reesei -transformanttien erittämä endoglukanaa- siaktiivisuus

A B Ä/B

Endoglukanaasi- aktiivisuus Proteiini 30 Kanta (O.D. 590 nm:ssä) (mg/ml)

RutC300 0,037 2,38 0,016 CEPCl-101 0,082 2,72 0,030 j CEPC1-103 0,099 1,93 0,051 CEPCI-105 0,033 2,07 0,016 j 35 CEPC1-112 0,093 1,72 0,054 j | 67

Edeltävät tulokset esitetään EG~I-rakenneosan ylituotannon suhteessa kokonaisprpteiiniin osoittamistarkoi-tuksessa eikä ylituotannon laajuuden osaittamistarkoituk-sessa. Tässä suhteessa ylituotannon laajuuden odotetaan 5 vaihtelevan kokeesta toiseen.

Olisi mahdollista rakentaa pCEPClreen nähden samankaltaisia plasmideja, mutta siten, että jokin toinen T. reesei -geeni korvaa egll-geenin. Tällä tavalla voitaisiin päästä muiden geenien runsaaseen ilmennykseen ja cbhl-gee-10 nin samanaikaiseen deleetioon.

Olisi samoin mahdollista transformoida Tj_ reesein pyr4-johdannalskantoj a, joista on aiemmin deletoitu muita geenejä, esim. cbh2, pCEPCl:11a transformanttien rakentamiseksi, jotka esimerkiksi eivät tuottaisi eksosellobio-15 hydrolaaseja ja tuottaisivat hyvin runsaasti endogluka- naaseja.

Käyttäen pCEPCl:een nähden samankaltaisia rakenteita, mutta joissa DNA:11a jostain toisesta reesei -paikasta on korvattu DNA cbhl-paikasta, olisi mahdollista 20 insettoida geenejä muun promoottorin kontrolliin toiseen paikkaan T_»_ reesei -genomissa.

Esimerkki 23 pEGII::P~1:n rakentaminen

Egl3-geeni, joka koodittaa EG-II:ta (jota muut ovat 25 aiemmin kutsuneet EG-III :ksi):, on kloonattu reeseistä ja DNA-sekvenssi on julkistettu (Saloheimo et ai., Gene 63 (1988) 11 - 21). Olemme saaneet geenin kannasta RL-P37 noin 4 ke:n Pstl-Xhol-fragmenttina genomi-DNA:ta Inserted. -tuna pUG2l9:n PstI- ja XhoI-keskusten väliin. Viime mai-30 nittU: vektori, pUC219, saadaan pöGll9:stä (kuvataan julkaisussa Wilson et ah, Gene 77 (1989) 69 - 78) laajentamalla monikloonauskeskus sisältämään restriktiokeskukset Bgll:lie, Clal:lie ja XhoI:lie. Käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä ΤΕ_ reesei pyr4-geeni, joka esiintyy 2,7 ke:n 35 Sali-fragmentissa genomi-DNA:ta, insertoitlin Sall-keskuk- | 68 seen EG-ll-koodisekvenssissä, jolloin saatiin plasmidi pEGIl::P-l (kuvio 17), Tämä johti EG-IX-koodisekvenssin häirintään kuitenkaan mitään sekvenssejä deletoimatta. Plasmidi, pEGIl:P-l, voidaan pilkkoa HindiII:11a ja 5 BamHI:llä lineaarisen DNA-fragmentin saamiseksi, joka on peräisin yksinomaan T_. reeseistä lukuun ottamatta 5 ep yhdessä päässä ja 16 ep toisessa päässä, jotka molemmat ovat peräisin pUC2l9:n monikloonauskeskuksesta.

Esimerkki 24 10 T. reesei GC69:n transforraointi pEGIl::P-l:llä kannan luomiseksi, joka ei kykene tuottamaan EG-II: ta T. ;reesei -kanta GC69 transformoidaan pEGIl::P-1:llä, jota on aiemmin pilkottu HindiII:11a ja BamHI:llä, 15 ja valitaan stabiilit transformantit. Kokonais-DNA eristetään transformanteista ja käytetään Southern blot -analyysiä niiden transformanttien identifioimiseksi, joissa pyr4- ja eg13-geenit sisältävä DNA-frägmentti on integroitunut egl3-paikkaan ja siten häirinnyt EG-II-koodisek-20 venssiä. Transformantit eivät kykene tuottamaan EG-II:ta. Olisi samoin mahdollista käyttää pEGIl::P-l.:ta kannan transformoiseksi, josta on deletoitu jokin geeni tai kaikki geenit cbhl, cbh2 tai eg11. Tällä tavalla voitaisiin rakentaa kanta, joka tuottaisi vain tiettyjä sellu-25 läösiräkennepsia eikä EG-II-rakenneosaa.

Esimerkki 25 T. reesein transformointi pEGIl::P-l:llä kannan luomiseksi, joka ei kykene tuottamaan CBH~I:tä, CBH-IItta ja EG-II:ta 30 Kannan P37P-delta-delta-CBH67 (esimerkistä 11) pyr4-vajaa johdannainen saatiin esimerkissä 1 hahmotellulla meneteimällä. Tämä kanta P37P-delta-delta-67P~l transformoitiin pEGIl::P-l:llä, jota oli aiemmin pilkottu HindiII:11a- ja BamHI:llä, ja valittiin stabiilit transfor— 35 mäntit. Kokonais-DNA eristettiin tranSfdrmanteista ja 69

Southern blot -analyysiä käytettiin kantojen identifioimiseksi, joissa pyr4- ja egl3-geenit sisältävä DNA-fragmentti oli integroitunut eg!3-paikkaan ja siten häirinnyt EG-II-koodisekvenssiä. Kuviossa 18 esitettyä Southern blot 5 -kopiota seulottiin noin 4 ke:n Psti-fragmentilla T. ree-sei -DNA:ta, joka sisälsi egi3-geenin, joka oli kloonattu pUGlSrn Psti-keskukseen ja sitten eristetty toistamiseen. Kun kannasta P37F-deita-delta-67P'l eristettyä DNA:ta pilkottiin Psti:llä Southern blot -analyysiä varten, eg!3-10 paikka visualisoitiin sitten yksittäisenä 4 ke:n nauhana autoradiokuvassa (kuvio 18, vyöhyke E). Kuitenkin trans-formantissa, jossa egl3-geeniä oli häiritty, tämä nauha oli menetetty ja korvattu kahdella uudella nauhalla odotusten mukaisesti (kuvio 18, vyöhyke F). Jos DNA:ta pil-15 kottiin EcoRV:llä tai Bglll;lla, egl3-geeniä vastaavan nauhan koko kasvoi noin 2,7 ke:llä (inseriöidun gyx4-fragmentin koko) ei-tränsformoidun P37P-delta-delta-67P"l-ka-nnan (vyöhykkeet A ja C) ja transformantIn, jossa eg13:ea oli häiritty (kuvio 18, vyöhykkeet B ja D), välillä. 20 TransformanttI, joka sisälsi häirityn eg!3-geenin ja joka esitetään kuviossa 18 (vyöhykkeet B, D ja F), nimettiin A22:ksi. Kuviossa 18 identifioitu transformantti ei kykene tuottamaan CSH-Xitä, CBH-II:ta tai EG-IItts.

Esimerkki 26 25 pP-delta-EGi-1:n rakentaminen

Egl1-geeni T. reesei -kannasta EL-P37 saatiin kuten kuvattiin esimerkissä 12 4,2 ke: n HindiII-fragmenttina genomi-DNA:ta, Tämä fragmentti insertoitiin HindiII-keskukseen pUClÖ0:ssa (pUC18:n johdannainen; Yanisch-Perron 30 et ai. , Gene 33 (1985) 103 - 119; monikloonauskeskukseen on insertoitu Qllgpnukleotidi, joka lisää restriktigkes-kukset Bglll:Ile, Clal:lie ja XhoI;lie). Käyttäen alalla tunnettua metodiikkaa noin I ke:n EcoRV-fragmentti, joka ulottuu asemasta lähellä EG-l-koodisekvenssin keskustaa 35 asemaan koodisekvenssin 3'-pään toisella puolella, pois- 70 tettiin ja korvattiin 3,5 ke:n Seal-fragmentilla T. reesei -DNA:ta, joka sisälsi pyr4-geenin. Saatu plasmidi nimettiin pP-delta-EGI-l;ksi (katso kuvio 19),

Plasmidia pP-delta-EGI-1 voidaan pilkkoa 5 Hindin:11a DNA-fragmentin vapauttamiseksi, joka käsittää vain Th reesei -genomi-DNA:ta ja jossa on eglj.-geenisegmentti kummassakin päässä ja pyr4-geeni korvaa osan EG-I-koodisekvenssistä keskellä.

Sopivan T_._ reesei pyr4-vajaan kannan transformointi 10 Hindin.·: 1.1a pilkotulla pP-delta-EGI-l:llä johtaa tämän DNA-fragmentin integraatioon egll-paikkaan jossain osassa transformantteja, Tällä tavalla saadaan kanta, joka ei kykene tuottamaan EG-I:tä.

Esimerkki 27 15 p-delta-EGI-pyr-3:n rakentaminen ja pyr4-vajaan T.

reesei -kaiman transformointi

Sitä odotusta, että EG-I-geeni voitaisiin inakti-volda käyttäen esimerkissä 26 hahmoteltua menetelmää, vahvistaa tämä koe. Tässä tapauksessa rakennettiin plas-20 midi, p-delta-EGI-pyr-3, joka oli samanlainen kuin pP-delta-EGI-l lukuun ottamatta, että Aspergi Uus niger pyr4-geeni korvasi Th_ reesei pyr4-geenin valikointimerkkinä. Tässä tapauksessa egll-geeni esiintyi jälleen 4,2 ke:n Hindlil-fragmenttina, joka oli insertoitu pUCIOOrn 25 HindiII-keskukseen. Sama sisäinen 1 ke:n EcoRV-fragmentti poistettiin samoin kuin pP-delta-EGI-l:n rakentamisen aikana (katso esimerkki 26), mutta tässä tapauksessa se korvattiin 2,2 ke:n fragmentilla, joka sisälsi kloonatun A, niger pyrG-geenin (Wilson et ai., Nucl. Acids Res. 16 30 (1988) 2339). Pyr4-vajaan T. reesei -kannan (kanta GC69) transformointi p-delta-EGI-pyr-3:XIa sen jälkeen, kun sitä oli pilkottu Hindi!I:11a pyrG-geenin sisältävän fragmentin vapauttamiseksi sivuavine alueineen egll-paikasta kummassakin päässä, johti transformantteihin, joissa egll-geeniä 35 oli häiritty. Nämä transformantit tunnistettiin Southern 71 blot -analyysillä transformantti-DNA:sta, jota oli pilkottu HindiII:11a ja seulottu radipleimatulla p-delta-EGIpyr-3:11a. Ei-transformoidussa T_*_ reesei -kannassa egll-geeni esiintyi 4,2 kein HindiII-DNA-fragmentt1na ja tämä hybri-5 disaatiokuvio esitetään kuviossa 20, vyöhyke C. Kuitenkin egll-geenin deleetion integroimalla haluttu fragmentti p~ delta-EGIpyr-3:stä jälkeen tämä 4,2 ke:n fragmentit katosi ja sen oli korvannut kooltaan noin 1,2 ke suurempi fragmentti, kuvio 20, vyöhyke A. Samoin kuten esitetään kuvi-10 ossa 20, vyöhyke B on esimerkki transformantista, jossa yksittäisen pP-deita-EGipyr-3-kppion integraatio on tapahtunut muussa genomipaikassa kuin egll-paikassa.

Esimerkki 28 T„ reesein transformointi pP-delta-EGI~l:llä kannan 15 luomiseksi, joka ei kykene tuottamaan CBH-I:tä, CBH-II:ta, EG-I:tä ja EG-II:ta

Kannan A22 {esimerkistä 25) pyr4-vajaa johdannainen saadaan esimerkissä 1 hahmotellulla menetelmällä, "Tämä kanta transformoidaan pP-delta-EGI-1:llä, jota on aiemmin 20 pilkottu Hindlll:11a DNA-fragmentin vapauttamiseksi, joka käsittää vain reesei -genomi-DNA:ta ja jossa on egll-geenisegmentti kummassakin päässä osan EG-I-koodisekvenssistä ollessa korvattu pyr4-geenlllä.

Stabiileja pyri+-transf ormantte.j a valittiin ja 25 transformanteista eristettiin kokonais-DNA. DNA:ta seulo taan 3ZP-leimatulla pP-delta-EGI-1:llä Southern blot -äna-lyysih jälkeen trans formanttien identifioimiseksi, joissa pyr4-geenin ja egll-sekvenssit sisältävä DNA-fragmentti on integroitunut egll-paikkaan, ja siten häirinnyt EG-I-kqodl-30 sekvenssiä. identifioidut transformantit eivät kykene tuottamaan CBH-I:tä, CBH-II;ta, EG-I:tä ja EG-II:ta.

Claims (8)

1. Pesuainekoostumus, joka käsittää: (a) puhdistavana tehokkaan määrän pinta-aktiivista 5 ainetta tai pinta-aktiivisten aineiden seosta; ja (b) 0,01 - 5 paino-% sienisellulaasikoostumusta laskettuna pesuainekoostumuksen painosta, tunnettu siitä, että mainittu sellulaasikcostu-tnos käsittää yhtä tai useampaa endoglukanaasirakenneosaa ja 10 alle 5 paino-% eksosellobiohydrolaasirakenneosia laskettuna kokona!sproteiinin painosta selluiaasikoostumuksessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että mainittu s e 11 u 1 aa s i koo s t umus käsittää vähintään 20 paino-%, edullisesti vähintään 50 15 paino-%, edullisemmin vähintään 70 paino-% ja edullisimmin vähintään 90 paino-% endogiukanaasityypin rakenneosia laskettuna kokonaisproteiinin painosta sellulaasikoostumukses-sa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen pesUaineköostu- 2. mus, tunnettu siitä, että mainittu s e! 1 u 1 a a s i ko o s t u mu s käsittää 0,0,5 - 2 paino-% mainittua pesuainekoostumusta.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen pesuainekoostu mus, tunnettu siitä, että mainittu s eli ulaasi koostumus ei sisällä mitään eksosellobiohydrolaasin I-tyypin rakenne- 25 osia.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen pesuainekoostu mus, tunnettu siitä,, että mainittu sellulaasikoostumus ei sisällä mitään eksosellobiohydrolaasin rakenneosia. ]

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen pesua.ineköostu- 30 mus, tunnettu siitä, että mainittu sellulaasikoostumus saadaan geneettisesti modifioidusta mikro-organismista, joka ei kykene ilmentämään mitään eksosellobiohydrolaasin I-tyypin rakenneosia ja/tai kykenee ilmentämään hyvin runsaasti yhtä tai useampaa endoglukanaasirakenneosaa. 35

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen pesuainekoostu-mus, tunnettu siitä; että mainittu seilulaasikoostumus saadaan geneettisesti modifioidusta mikro-organismista; joka ei kykene ilmentämään mitään eksosellobiohydrolaasin ra- 5: kenneosia,.

8. Patenttivaatimuksen: 7 mukainen pesuainekoostu-mus, tunnettu siitä, että mainittu seilulaasikoostumus ei sisällä lainkaan 'heterologisia proteiineja.