DE69131980T3 - Cellulasezusammensetzungen mit einem defizit an komponenten des typs-cbh i enthaltende reinigungsmittelzusammensetzungen - Google Patents

Description

• 1. Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfidnung betrifft die Verwendung von Waschmittel-Zusammensetzungen, die spezifische Cellulase-Zusammensetzungen enthalten, die bei Verwendung zum Waschen von baumwollhältigen Geweben den Festigkeitsverlust im Vergleich zur Behandlung mit vollständiger Cellulase verringern können.
• 2. Stand der Technik
• Cellulasen sind auf dem Sachgebiet als Enzyme bekannt, die Cellulose (β-1,4-Glucan-Bindungen) hydrolysieren, wodurch Glucose, Cellobiose, Cello-Oligosaccharide und dergleichen gebildet werden. Obwohl Cellulasen in Pilzen, Bakterien und dergleichen produziert (exprimiert) werden, galt den von Pilzen produzierten die meiste Aufmerksamkeit, da bestimmte Pilze ein vollständiges Cellulase-System produzieren, das kristalline Formen von Cellulose abbauen kann, und solche Cellulasen können in großen Mengen durch Fermentationsverfahren problemlos hergestellt werden.
• Dazu offenbaren Wood et al., ”Methods in Enzymology”, 160, 25, S. 234 ff. (1988), dass bestimmte Pilze vollständige Cellulase-Systeme produzieren, die aus mehreren unterschiedlichen Enzymklassen bestehen, z. B. jenen, die als Exo-Cellobiohydrolasen (EC 3.2.1.91) (”CBH”), Endoglucanasen (EC 3.2.1.4) (”EG”) und β-Glucosidasen (EC 3.2.1.21) (”BG”) identifiziert wurden. Einige Pilze hingegen können keine vollständigen Cellulase-Systeme produzieren. Im Allgemeinen mangelt es diesen Systemen an CBH-Komponenten. Siehe z. B. Coughlan et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, Hubert et al. (Hg.), S. 11ff. (Academic Press, 1988); und Wood et al., Methods in Enzymology, 160, 25, S. 87ff., (Academic Press, New York, 1988).
• Obwohl bakterielle Cellulasen in der Literatur als Substanzen beschrieben sind, die wenige oder überhaupt keine CBH-Komponenten enthalten, gibt es einige Fälle, wo CBH-ähnliche Komponenten aus bakteriellen Cellulasen Exo-Cellobiohydrolase-Aktivität besitzen.
• Die Pilzcelullase-Klassen CBH, EG und BG können weiter ausgeweitet werden, um innerhalb jeder Klasse mehrere Komponenten zu enthalten. Beispielsweise wurden mehrere CBHs und EGs aus einer Vielzahl von Pilzquellen wie etwa Trichoderma reesei isoliert, der 2 CBHs, nämlich CBHI und CBHII, und zumindest 3 EGs, nämlich EGI, EGII und EGIII, umfasst.
• Das Komponenten jeder der Klassen CBH, EG und BG enthaltende, vollständige Cellulase-System muss kristalline Cellulose wirksam in Glucose umwandeln. Isolierte Komponenten sind beim Hydrolysieren kristalliner Cellulose viel weniger oder überhaupt nicht effektiv. Außerdem kann man eine synergistische Beziehung zwischen den Cellulase-Komponenten beobachten, insbesondere wenn sie aus unterschiedlichen Klassen stammen. Die Wirksamkeit eines vollständigen Cellulase-Systems ist demnach wesentlich höher als die Summe der Beiträge der isolierten Komponenten der gleichen Klasse. In dieser Hinsicht ist es auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, dass die EG-Komponenten und CBH-Komponenten synergistisch wechselwirken, um Cellulose wirksamer abzubauen. Siehe z. B. Wood, Biochem. Soc. Trans., 13, S. 407–410 (1985).
• Die Substratspezifität und Wirkungsweise der unterschiedlichen Cellulase-Komponenten variiert signifikant je nach Klasse, was die Synergie der kombinierten Komponenten erklären kann. Beispielsweise ist die derzeit anerkannte Funktionsweise von Cellulase, dass Endoglucanase-Komponenten innere glucosidische β-1,4-Bindungen hydrolysieren, insbesondere in Bereichen geringer Kristallinität der Cellulose, und dass Exocellobiohydrolase-Komponenten Cellobiose vom nichtreduzierenden Ende von Cellulose her hydrolysieren. Die Wirkung der Endoglucanase-Komponenten erleichtert die Wirkung von Exocellobiohydrolasen deutlich, indem neue Kettenenden gebildet werden, die von Exocellobiohydrolase-Komponenten erkannt werden.
• β-Glucosidase-Komponenten wirken nur auf Cello-Oligosaccharide, z. B. Cellobiose, um Glucose als einziges Produkt zu liefern. Sie gelten als integraler Bestandteil des Cellulase-Systems, da sie die Gesamtreaktion zu Glucose antreiben und dadurch die inhibitorische Wirkung von Cellobiose auf CBH- und EG-Komponenten erleichtern.
• Andererseits weiß man auf dem Gebiet auch, dass Cellulasen nützliche Waschmittel-Zusammensetzungen zur Erhöhung der Reinigungsfähigkeit der Zusammensetzung, zur Verwendung als Weichmacher und zur Verbesserung des Griffs von Baumwollgeweben und dergleichen sind. Während der genaue Mechanismus, nach dem Cellulase-Zusammensetzungen Kleidungsstücke weich machen, nicht zur Gänze bekannt ist, wurden die Weichmachungs- und Farbwiederherstellungs-Eigenschaften von Cellulase alkalischen Endoglucanase-Komponenten in Cellulase-Zusammensetzungen zugeschrieben. Beispielsweise offenbart WO 89/09259 , dass Waschmittel-Zusammensetzungen, die eine Celluloase-Zusammensetzung enthalten, die mit einer spezifischen alkalischen Endoglucanase-Komponente angereichert ist, die behandelten Kleidungsstücke im Vergleich zu Cellulase-Zusammensetzungen, die nicht mit einer solchen Komponente angereichert sind, weicher macht und ihre Farben besser wiederherstellt. Außerdem erfüllt die Verwendung solcher alkalischer Endoglucanase-Komponenten in Waschmittel-Zusammensetzungen die pH-Erfordernisse der Waschmittel-Zusammensetzung. Die Endoglucanase-Komponente dieser Veröffentlichung ist als eine definiert, die maximale Aktivität bei einem alkalischen pH-Wert von 7,5 bis 10 und definierte Aktivitätskriterien auf Carboxymethyl-Cellulose und Avicel aufweist.
• Es sind auf dem Gebiet Cellulase-Zusammensetzungen bekannt, die baumwollhältige Gewebe abbauen (siehe z. B. Suzuki et al., US-A-4.822.516 ), welcher Abbau sich in verringertem Festigkeitsverlust im Gewebe zeigt. Ein solcher Festigkeitsverlust ist einer der Gründe dafür, weshalb Cellulase-Zusammensetzungen in handelsüblichen Waschmittel-Anwendungen nicht häufig zum Einsatz kommen.
• Angesichts der obigen Ausführungen wären Cellulase-Zusammensetzungen, die eine oder mehrere Endoglucanase-Komponenten enthalten, die im Vergleich zum vollständigen Cellulase-System für verringerten Festigkeitsverlust baumwollhältiger Gewebe sorgen, demnach zur Verwendung in Waschmittel-Zusammensetzungen besonders geeignet.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Es stellte sich nun heraus, dass Pilz-Cellulase-Zusammensetzungen, die eine oder mehrere Endoglucanase-artige Komponenten enthalten, in Waschmittel-Zusammensetzungen kombiniert werden können, um baumwollhältige Gewebe, die in einem eine solche Zusammensetzung enthaltenden Waschmedium gewaschen werden, betreffend Weichheit, Farbechtheit/-wiederherstellung und Griff zu verbessern. Weiters stellte sich Folgendes heraus: Wenn solche Cellulase-Zusammensetzungen weniger als etwa 5 Gew.-% CBHI-Typ-Komponenten enthalten, bewirken die resultierenden Waschmittel-Zusammensetzungen bei den damit gewaschenen baumwollhältigen Geweben weniger Festigkeitsverlust.
• Betreffend die Waschmittel-Zusammensetzungen, die Cellulase-Zusammensetzungen enthalten, die CBHI-arm, CBHI-reich oder EGIII-reich sind, stellte man fest, dass es die Menge an Cellulase ist – und nicht die relative Hydrolyserate der jeweiligen enzymatischen Komponenten, um reduzierende Zucker aus Cellulose zu produzieren – die den baumwollhältigen Geweben die gewünschten Waschmittel-Eigenschaften verleiht, z. B. verbesserte Farbwiederherstellung, verbesserte Weichheit und/oder verbesserte Reinigung durch die Waschmittel-Zusammensetzung.
• In einem Aspekt bietet daher die Erfindung die Verwendung einer Waschmittel-Zusammensetzung zum Waschen eines baumwollhältigen Gewebes, wie in den Ansprüchen definiert, Vorzugsweise umfasst die Waschmittel-Zusammensetzung etwa 0,05 bis etwa 2 Gew.-% der Cellulase-Zusammensetzung.
• In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Cellulase-Zusammensetzung frei von allen Exocellobiohydrolase-Komponenten.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt die Cellulase-Zusammensetzung von einem Mikroorganismus, der genetisch modifiziert wurde, um keine CBHI-Typ-Komponenten und noch bevorzugter keine CBH Typ-Komponenten, d. h. CBHI-Typ und CBHII-Typ-Komponenten, produzieren zu können. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform stammt die Cellulase-Zusammensetzung von einem Mikroorganismus, der genetisch modifiziert wurde, um keine CBH-Typ-Komponenten ohne die Expression irgendwelcher heterologer Proteine produzieren zu können.
• KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• 1 ist ein Schema der Konstruktion von pΔCBHIpyr4.
• 2 zeigt die Deletion des T. reesei-Gens durch Integration des größeren EcoRI-Fragments von pΔCBHIpyr4 am cbh1-Locus auf einem der T. reesei-Chromosomen.
• 3 ist ein Autoradiogramm von DNA aus T. reesei-Stamm GC69, transformiert mit durch EcoRI gespaltenem pΔCBHIpyr4 nach Southern Blot-Analyse mittels eines mit ³²P markierten pΔCBHIpyr4 als Sonde. Die Größen von Molekulargewichtsmarkern sind in Kilobasenpaaren links von der Figur dargestellt.
• 4 ist ein Autoradiogramm von DNA aus einem T. reesei-Stamm GC69, transformiert mit durch EcoRI gespaltenem pΔCBHIpyr4 unter Verwendung von mit ³²P markiertem plngCBHI als Sonde. Die Größen von Molekulargewichtsmarkern sind in Kilobasenpaaren links von der Figur dargestellt.
• 5 ist ein isolektrisches Fokussiergel, das die Proteine zeigt, die von transformierten T. reesei-Stämmen und von T. reesei-Stämmen der Wildform sekretiert werden. Genauer gesagt wurden in 5 in Spur A des isoelektrischen Fokussiergels teilweise gereinigtes CBHI aus T. reesei; in Spur B T. reesei der Wildform; in Spur C Protein von einem T. reesei-Stamm, worin das cbh1-Gen deletiert ist; und in Spur D Protein von einem T. reesei-Stamm, worin das cbh1- und das cbh2-Gen deletiert sind. In 5 ist die rechte Seite der Abbildung markiert, um die Position der Einzelproteine anzuzeigen, die in einem oder mehreren der sekretierten Proteine vorliegen. Genauer gesagt bezieht sich BG auf β-Glucosidase, E1 auf Endoglucanase I, E2 auf Endoglucanase II, E3 auf Endoglucanase III, C1 auf Exocellobiohydrolase I und C2 auf Exocellobiohydrolase II.
• 6A ist eine Darstellung des T. reesei cbh2-Locus, kloniert als 4,1 kb EcoRI-Fragment auf Genom-DNA, und 6B ist eine Darstellung des cbh2-Gen-Deletionsvektors pΔCBHII.
• 7 ist ein Autoradiogramm von DNA aus T. reesei-Stamm P37PΔCBHIPyr26, transformiert mit EcoRI-gespaltenem pPΔCBHII nach Southern Blot-Analyse unter Verwendung von mit ³²P markiertem pPΔCBHII als Sonde. Die Größen der Molekulargewichtsmarker sind in Kilobasenpaaren links von der Abbildung dargestellt.
• 8 ist ein Diagramm des Plasmids pEGIpyr4.
• 9 zeigt das RBB-CMC-Aktivitätsprofil einer EG-angereicherten Pilz-Cellulase-Zusammensetzung (CBHI und -II deletiert), abgeleitet aus Trichoderma reesei, über einen pH-Bereich bei 40°C; sowie das Aktivitätsprofil einer angereicherten EGIII-Cellulase-Zusammensetzung, abgeleitet aus Trichoderma reesei, über einen pH-Bereich bei 40°C.
• 10 zeigt Festigkeitsverlustsergebnisse nach drei Waschzyklen in einem Testwäscher für baumwollhältige Gewebe, die mit Cellulase-Zusammensetzungen mit variierenden Mengen an CBH-Komponenten behandelt wurden.
• 11 veranschaulicht die Ergebnisse der Fasernentfernung (auf der Basis von Bewertungstest-Ergebnissen) für baumwollhältige Gewebe, die mit von Trichoderma reesei der Wildform (vollständige Cellulase) sekretierter Cellulase behandelt wurden, bei verschiedenen pH-Werten.
• 12 zeigt die Ergebnisse der Fasernentfernung (auf der Basis von Bewertungstest-Ergebnissen) für baumwollhältige Gewebe, die mit verschiedenen Konzentrationen (in ppm) von durch Trichoderma reesei der Wildform sekretierter Cellulase behandelt wurden, und für ein baumwollhältiges Gewebe, das mit Cellulase behandelt wurde, die von einem Stamm von Trichoderma reesei sekretiert wird, der genetisch modifiziert wurde, um CBHI und CBHII nicht sekretieren zu können.
• 13 veranschaulicht die Ergebnisse des Weichheits-Bewertungstests für variierende Konzentrationen (in ppm) einer mit EG angereicherten Cellulase-Zusammensetzung aus einem Stamm von Trichoderma reesei, der genetisch modifiziert wurde, um keine CBHI & II produzieren zu können.
• 14 ist ein Diagramm der stellenspezifischen Veränderungen in den egl1- und cbh1-Genen, um geeignete Restriktions-Endonuklease-Spaltstellen zu erzeugen. In jedem Fall zeigt die obere Linie die ursprüngliche DNA-Sequenz, die eingeführten Veränderungen sind in der mittleren Linie dargestellt, und die neue Sequenz ist in der unteren Linie veranschaulicht.
• 15 ist ein Diagramm des größeren EcoRI-Fragments, das von pCEPC1 erhalten werden kann.
• 16 ist ein Autoradiogramm von DNA aus einem untransformierten Stamm von T. reesei RutC30 und aus zwei Transformanten, die man Transformieren von T. reesei mit EcoRI-gespaltenem pCEPC1 erhalten wurden. Die DNA wurde mit PstI gespalten, ein Sounthern Blot erhalten und mit ³²P-markiertem pUC4K::cbh1 hybridisiert. Die Größen der Marker-DNA-Fragmente sind in Kilobasenpaaren links von der Abbildung dargestellt.
• 17 ist ein Diagramm des Plasmids pEGII::P-1.
• 18 ist ein Autoradiogramm von DNA aus T. reesei-Stamm p37ΔΔ67P1, transformiert mit HindIII- und BamHI-gespaltenem pEGII::P-1. Ein Southern Blot wurde erhalten und die DNA mit einem etwa 4 kb großen PstI-Fragment von radiomarkierter T. reesei-DNA hybridisiert, die das egl1-Gen enthielt. Die Spuren A, C und E enthalten DNA des untransformierten Stamms, während die Spuren B, D und F DNA des transformierten T. reesei-Stamms enthalten. In den Spuren A und B wurde die T. reesei-DNA mit BglII gespalten, in den Spuren C und D mit EcoRV und in den Spuren E und F mit PstI. Die Größen der Marker-DNA-Fragmente sind in Kilobasenpaaren links von der Abbildung dargestellt.
• 19 ist ein Diagramm des Plasmids pPΔEGI-1.
• 20 ist ein Autoradiogramm eines Southern Blots von DNA, die aus Transformanten von Stamm GC69 isoliert wurde (mit HindIII-gespaltenem pΔEGIpyr-3 erhalten). Das Muster der Hybridisierung mit der Sonde, radiomarkiertem pΔEGIpyr-3, das für einen untransformierten Stamm erwartet wird, ist in Spur C zu sehen. Spur A zeigt das für einen Transformanten erwartete Muster, worin das egl1-Gen zerstört wurde; Spur B zeigt einen Transformanten, worin pΔEGIpyr-3-DNA in das Genom integriert wurde, jedoch ohne Zerstörung des egl1-Gens. Spur D enthält pΔEGIpyr-3, das mit HindIII gespalten wurde, um Marker geeigneter Größe zu erhalten. Die Größen der Marker-DNA-Fragmente sind in Kilobasenpaaren rechts von der Abbildung zu sehen.
• AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Wie bereits erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung allgemein die Verwendung von Waschmittel-Zusammensetzungen, die Pilz-Cellulase-Zusammensetzungen enthalten, wje in den Ansprüchen definiert ist. Bei Verwendung in Waschmedien mit sauren, neutralen oder alkalischen pH-Werten verleihen solche Waschmittel-Zusammensetzungen den in solchen Medien gewaschenen baumwollhältigen Geweben verbesserte Eigenschaften betreffend Weichheit, Farbechtheit/-wiederherstellung und Griff. Aufgrund der geringen Menge an in der Cellulase-Zusammensetzung enthaltenen CBHI-Typ-Komponenten führen diese Zusammensetzungen zu geringerem Festigkeitsverlust als Zusammensetzungen, die größere Mengen an CBHI-Typ-Komponenten enthalten.
• Vor einer ausführlichen Besprechung der Erfindung werden die folgenden Begriffe definiert.
• Der Ausdruck ”Pilz-Cellulase” bezieht sich auf eine Enzymzusammensetzung aus Pilzquellen oder Mikroorganismen, die genetisch modifiziert sind, um alle oder einige der aus einer Pilzquelle erhaltenen Cellulase-Gene zu integrieren und exprimieren. Pilz-Cellulasen wirken auf Cellulose oder eines oder mehrere ihrer Abbauprodukte, um Cellulose zu hydrolysieren und Primärprodukte, Glucose und Cellobiose zu ergeben. Pilz-Cellulasen unterscheiden sich von Cellulasen, die aus Nicht-Pilz-Quellen stammen, z. B. von Mikroorganismen wie etwa Actinomycetes, Gleitbakterien (Myxobakterien) und echten Bakterien. Pilze, die Cellulasen produzierne können, die sich zur Herstellung von in den erfindungsgemäßen Waschmittel-Zusammensetzungen verwendeten Cellulase-Zusammensetzungen eignen, sind in der GB-A-2.094.826 geoffenbart, die hierin durch Verweis aufgenommen ist.
• Die meisten Pilz-Cellulasen entwickeln im Allgemeinen ihre optimale Aktivität im sauren oder neutralen pH-Bereich, obwohl einige Pilz-Cellulasen bekannt sind, die signifikante Aktivität unter neutralen und leicht alkalischen Bedingungen aufweisen, d. h. beispielsweise Cellulase aus Humicola insolens, die bekanntermaßen Aktivität unter neutralen bis leicht alkalischen Bedingungen aufweist.
• Es ist bekannt, dass Pilz-Cellulasen aus mehreren Enzymklassen mit unterschiedlicher Substratspezifität, enzymatischen Wirkmustern und dergleichen bestehen. Außerdem können Enzymkomponenten innerhalb jeder Klasse unterschiedliche Molekulargewichte, Glykosylierungsgrade, isoelektrische Punkte, Substratspezifität, Enzymwirkmuster usw. aufweisen. Beispielsweise können Pilz-Cellulasen Cellulase-Klassen enthalten, die Endoglucanasen (EG), Exocellobiohydrolasen (CBH), β-Glucosidasen (GB) usw. umfassen. Obwohl bakterielle Cellulasen in der Literatur beschrieben sind, die wenige oder gar keine CBH-Komponenten enthalten, existieren einige wenige Fälle, wo CBH-artige Komponenten aus bakteriellen Cellulasen nachweislich Exocellobiohydrolase-Aktivität aufweisen.
• Eine von einer natürlich vorkommenden Pilzquelle produzierte Pilz-Cellulase-Zusammensetzung, umfassend eine oder mehrere CBH- und EG-Komponenten, worin jede dieser Komponenten im durch die Pilzquelle vorgegebenen Verhältnis vorliegt, wird hierin manchmal als ”vollständiges Pilz-Cellulase-System” oder als ”vollständige Pilz-Cellulase-Zusammensetzung” bezeichnet, um sie von den Klassen und Komponenten von davon isolierter Cellulase, von durch Bakterien und einigen Pilzen produzierten, unvollständigen Cellulase-Zusammensetzungen oder von einer Cellulase-Zusammensetzung zu unterscheiden, die von einem Mikroorganismus erhalten wird, der genetisch modifiziert wurde, um eine oder mehrere der CBH- und/oder EG-Komponenten von Cellulase in zu großer Menge, in zu geringer Menge oder überhaupt nicht zu produzieren.
• Die Fermentationsverfahren zum Kultivieren von Pilzen zur Herstellung von Cellulase sind auf dem Gebiet an sich bekannt. Beispielsweise können Cellulase-Systeme entweder durch Fest- oder Tauch-Kultur erzeugt werden, z. B. Chargen-, Chargenzufuhr- und kontinuierlichen Durchflussverfahren. Die Sammlung und Reinigung der Cellulase-Systeme aus der Fermentationsbrühe kann auch nach auf dem Gebiet an sich bekannten Verfahren erfolgen.
• ”Endoglucanase-Typ-”(”EG-Typ-”)Komponenten beziehen sich auf all jene Pilz-Cellulase-Komponenten oder Kombinationen von Komponenten, die Eigenschaften der Waschmittelaktivität aufweisen, die den Endoglucanase-Komponenten von Trichoderma reesei ähneln. In dieser Hinsicht verleihen die Endoglucanase-Komponenten von Trichoderma reesei (insbesondere EGI, EGII, EGIII und dergleichen entweder alleine oder in Kombination) baumwöllhältigen Geweben verbesserte Eigenschaften betreffend Weichheit, Farbechtheit/-wiederherstellung und Griff, wenn diese Komponenten im Waschmedium enthalten sind und das Gewebe mit diesem Medium behandelt wird. Demzufolge sind Komponenten vom Endoglucanase-Typ jene Pilz-Cellulase-Komponenten, die Baumwollkleidungsstücken Weichheit, Farbechtheit/-wiederherstellung und verbesserten Griff verleihen, wenn diese Komponenten in einem Waschmedium enthalten sind. In einer bevorzugten Ausführungsform führen die in den erfindungsgemäßen Waschmittel-Zusammensetzungen verwendeten Endoglucanase-artigen Komponenten in den baumwoll-hältigen Geweben zu weniger starkem Festigkeitsverlust als das vollständige Cellulase-System aus Trichoderma reesei.
• Solche Endoglucanase-artigen Komponenten enthalten möglicherweise keine Komponenten, die unter Anwendung traditioneller Tests betreffend die biochemische Aktivität als Endoglucanasen klassifiziert werden. Beispielsweise basieren solche traditionellen Aktivitätstests auf der Fähigkeit der Komponente, (a) lösliche Cellulose-Derivate wie z. B. Carboxymethylcellulose (CMC) zu hydrolysieren, wodurch die Viskosität von CMC-hältigen Lösungen reduziert wird, und (b) hydratisierte Formen von Cellulose wie etwa gequollene Phosphorsäure-Cellulose (z. B. Walseth-Cellulose) leicht zu hydrolysieren und die kristallineren Formen von Cellulose (z. B. Avicel, Sokafloc usw.) weniger leicht zu hydrolysieren. Im Gegensatz dazu ist man der Ansicht, dass nicht alle Endoglucanase-Komponenten, wie sie durch solche Aktivitätstests definiert sind, für verbesserte Weichheit, Griffeigenschaften und Farbechtheit/-wiederherstellung sorgen. Für die Zwecke der Erfindung ist es genauer, Komponenten des Endoglucanase-Typs als jene Komponenten von Pilz-Cellulase zu definieren, die in Waschmittel-Zusammensetzungen ähnliche Eigenschaften aufweisen wie die Endoglucanase-Komponenten von Trichoderma reesei.
• Pilz-Cellulasen können mehr als eine EG-Typ-Komponente enthalten. Die unterschiedlichen Komponenten besitzen im Allgemeinen unterschiedliche isoelektrische Punkte, Molekulargewichte, Glykosylierungsgrade, Substratspezifität, enzymatische Wirkmuster usw. Die unterschiedlichen isolektrischen Punkte der Komponenten ermöglichen ihre Trennung mittels Ionenaustausch-Chromatographie und dergleichen.
• Die Isolierung von Komponenten aus unterschiedlichen Pilzquellen ist auf dem Gebiet bekannt. Siehe z. B. Bjork et al., US-A-07/422.814 ; Schulein et al., WO 89/09259 ; Wood et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, S. 31–52 (1988); Wood et al., Carbohydrate Research, Bd. 190, S. 279–297 (1989); Schulein, Methods in Enzymology, Bd. 160, S. 234–242 (1988); und dergleichen. Alle diese Veröffentlichungen sind hierin durch Verweis aufgenommen.
• Im Allgemeinen geht man davon aus, dass Kombinationen von EG-Typ-Komponenten eine synergistische Reaktion liefern, um im Vergleich zu einer einzelnen EG-Typ-Komponente die Weichheit, Farbechtheit/-wiederherstellung und Griffeigenschaften zu verbessern. Eine einzelne EG-Typ-Komponente kann jedoch über einen Bereich von pH-Werten stabiler sein oder ein breiteres Aktivitätsspektrum aufweisen. Demzufolge können die in der Erfindung verwendeten EG-Typ-Komponenten entweder eine einzelne EG-Typ-Komponente oder eine Kombination zweier oder mehreren EG-Typ-Komponenten sein. Wenn eine Kombination von Komponenten verwendet wird, können die EG-Typ-Komponenten aus der gleichen oder unterschiedlichen Pilzquellen) stammen.
• Der Ausdruck ”Exocellobiohydrolase-Typ-”(”CBH-Typ-”)Komponenten bezieht sich auf jene Pilz-Cellulase-Komponenten, die ähnliche Eigenschaften der Waschmittelaktivität aufweisen wie CBHI- und/oder CBHII-Komponenten von Trichoderma reesei. Bei Verwendung in Abwesenheit von EG-Typ-Komponenten (oben definiert) sorgen die CBHI- und CBHII-Komponenten von Trichoderma reesei alleine nicht für signifikante Farbechtheit/-wiederherstellung und verbesserten Griff der so behandelten baumwollhältigen Gewebe. Bei Verwendung in Kombination mit EG-Typ-Komponenten führt die CBHI-Komponenten von Trichoderma reesei zu größerem Festigkeitsverlust und schrittweiser Reinigungswirkung baumwollhältiger Gewebe.
• CBHI-Typ-Komponenten und CBHII-Typ-Komponenten sind daher jene Pilz-Cellulase-Komponenten, die ähnliche Eigenschaften der Waschmittelaktivität aufweisen wie CBHI- und CBHII-Komponenten von Trichoderma reesei. Wie bereits erwähnt, umfasst dies für CBHI-Typ-Komponenten die Eigenschaften der Steigerung des Festigkeitsverlusts baumwollhältiger Gewebe und/oder eine schrittweise Reinigungswirkung bei Verwendung in Gegenwart von EG-Typ-Komponenten. In einer bevorzugten Ausführungsform führen die CBHI-Komponenten auch zu schrittweiser Weichmachwirkung bei Verwendung in Gegenwart von EG-Typ-Komponenten.
• Solche Ecocellobiohydrolase-Typ-Komponenten können daher Komponenten enthalten, die traditionellerweise unter Anwendung von Aktivitätstest wie z. B. jener zur Charakterisierung von CBHI und CBHII aus Trichoderma reesei nicht als Exocellobiohydrolasen klassifiziert werden. Bei Anwendung solcher traditioneller Klassifikationstests sind z. B. solche Komponenten: (a) kompetitiv durch Cellobiose gehemmt (K_i etwa 1 mM); (b) nicht imstande, substituierte Cellulosen wie etwa Carboxymethylcellulose usw. signifikant zu hydrolysieren; und (c) imstande, in Phosphorsäure gequollene Cellulose und – in geringerem Ausmaß – hochkristalline Cellulose zu hydrolysieren. Im Gegensatz dazu ist man der Ansicht, dass einige Pilz-Cellulase-Komponenten, die durch solche Aktivitäts-tests als CBH-Komponenten charakterisiert wurden, für verbesserte Weichheit, Griffeigenschaften und Farbechtheit/-wiederherstellung baumwollhaltiger Gewebe sorgen, wenn diese Komponenten alleine in Waschmittel-Zusammensetzungen verwendet werden. Demzufolge geht man davon aus, dass es für die Zwecke der Erfindung präziser ist, solche Exocellobiohydrolasen als EG-Typ-Komponenten zu definieren, da diese Komponenten ähnliche funktionelle Eigenschaften in Waschmittel-Zusammensetzungen aufweisen wie die Endoglucanase-Komponenten von Trichoderma reesei.
• Pilz-Cellulasen, die mit EG-Typ-Komponenten angereichert sind, können durch Reinigungsverfahren erhalten werden. Konkret kann das vollständige Cellulase-System durch anerkannte und in der Literatur ausführlich beschriebene Trennverfahren zu im Wesentlichen reinen Komponenten gereinigt werden, z. B. durch Ionenaustausch-Chromatographie bei geeignetem pH-Wert, Affinitätschromatographie, Größenausschluss und dergleichen. Beispielsweise ist es bei der Ionenaustausch-Chromatographie (üblicherweise Anionenaustausch-Chromatographie) möglich, die Cellulase-Komponenten durch Eluieren mit einem pH-Gradienten, Salzgradienten oder sowohl pH- als auch Salzgradienten aufzutrennen.
• Es ist ferner möglich, dass Gemische von Cellulase-Komponenten mit dem erforderlichen Verhältnis zwischen EG-Typ-Komponenten und CBHI-Typ-Komponenten durch andere Verfahren als Isolierung und Rekombination der Komponenten hergestellt werden. In dieser Hinsicht ist es möglich, die Fermentationsbedingungen für einen natürlichen Mikroorganismus zu modifizieren, um relativ hohe Verhältnisse zwischen EG- und CBH-Komponenten zu ergeben. Rekombinations-Techniken können ebenso das relative Verhältnis von EG-Komponenten zu CBH-Komponenten ändern, um ein Gemisch von Cellulase-Komponenten mit relativ hohem Verhältnis zwischen EG- und CGH-Komponenten zu erhalten oder eine oder mehrere EG-Komponenten zu erhalten, die frei von jeglichen CBH-Komponenten sind.
• Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der mit EG-Typ-Komponenten angereicherten Cellulase-Zusammensetzungen ist das genetische Modifizieren eines Mikroorganismus, damit er nicht imstande ist, eine oder mehrere CBH-Typ-Komponenten zu produzieren, welche Verfahren kein heterologes Protein erzeugen. Es ist auch möglich, einen Mikroorganismus so genetisch zu modifizieren, dass er eine oder mehrere EG-Typ-Komponenten überproduziert. US-A-08/593.919 , eingereicht am 5. Oktober 1990 (hierin zur Gänze durch Verweis aufgenommen) beispielsweise offenbart Verfahren zum genetischen Modifizieren von Trichoderma reesei, damit dieser Stamm nicht eine oder mehrere CBH-Komponenten produzieren und/oder eine oder mehrere EG-Komponenten produzieren kann. Außerdem liefern die Verfahren dieser Anmeldung Trichoderma reesei-Stämme, die keine heterologen Proteine produzieren. Miller et al., ”Direct and Indirect Gene Replacement in Aspergillus nidulans”, Molecular and Cellular Biology, S. 1714–1721 (1985), offenbaren Verfahren zum Deletieren von Genen in Aspergillus nidulans durch DNA-vermittelte Transformation unter Verwendung eines linearen Fragments homologer DNA. Die Verfahren von Miller et al. Führen zu Gendeletion ohne Produktion jeglicher heterologer Proteine.
• Die Deletion der Gene, die zur Produktion von CBHI-Typ- oder CBHII-Typ-Cellulase-Komponenten verantwortlich sind, würde demnach dazu führen, die Menge an EG-Typ-Komponenten in der Cellulase-Zusammensetzung anzureichern. Die Deletion jener Gene, die für die Produktion von CBHI- und II-Typ-Komponenten verantwortlich sind, würde eine Cellulase-Zusammensetzung ergeben, die frei von CBH-Typ-Komponenten ist.
• Es ist ferner möglich, dass hierin Pilz-Cellulase-Zusammensetzungen aus Pilzquellen eingesetzt werden können, die eine unvollständige Pilz-Cellulase-Zusammensetzung ergeben. Beispielsweise ist bekannt, dass bestimmte Pilze Cellulase-Zusammensetzungen frei von CBH-Komponenten produzieren. Siehe z. B. Coughlan et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, Hubert et al. (Hg.), S. 11–30 (Academic Press, 1988); die Autoren offenbaren, dass braune Fäulnispilze offensichtlich keine CBH-Komponenten produzieren, dass es aber möglich ist, dass eine oder mehrere dieser Komponenten CBHI-Typ-Komponenten sind. Wenn hingegen eine ausreichende Menge der von solchen Pilzen produzierten Endoglucanasen für die Zwecke der Erfindung EG-Typ-Komponenten sind, wäre es möglich, solche Cellulase in der Praxis der Erfindung ohne Anreicherung zu verwenden, um das notwendige Verhältnis zwischen EG-Typ-Komponenten und CBHI-Typ-Komponenten zu erzielen.
• Die erforderliche Menge einer oder mehrerer durch herkömmliche Verfahren gereinigter CBH-Typ-Komponenten kann einer Cellulase-Zusammensetzung zugegeben werden, die von einem Mikroorganismus produziert wird, der genetisch modifiziert wurde, um keine CBH-Typ-Komponenten produzieren zu können, sodass ein spezifisches Verhältnis von EG-Typ-Komponenten zu einer oder mehreren CBH-Typ-Komponenten erzielt wird; mit anderen Worten kann eine Cellulase-Zusammensetzung, die frei von jeglichen CBH-Typ-Komponenten ist, damit sie mit EG-Typ-Komponenten angereichert ist, formuliert werden, um 1 Gew.-% einer CBHI-Typ-Komponente zu enthalten, indem diese Menge einer gereinigten CBHI-Typ-Komponente der Cellulase-Zusammensetzung zugegeben wird.
• Der Ausdruck ”β-Glucosidase-(BG-)Komponenten” bezieht sich auf jene Komponenten von Cellulase, die BG-Aktivität aufweisen; d. h. dass derartige Komponenten vom nicht-reduzierenden Ende von Cellobiose und anderen Cellooligosacchariden (”Cellobiose”) aus wirken und Glucose als einziges Produkt liefern. BG-Komponenten adsorbieren nicht an Cellulose-Polymere und reagieren nicht mit diesen. Außerdem werden solche BG-Komponenten kompetitiv durch Glucose gehemmt (K_i etwa 1 mM). Genau genommen sind BG-Komponenten keine Cellulasen, da sie Cellulose nicht abbauen können, doch sie sind in der Definition des Cellulase-Systems enthalten, da diese Enzyme den gesamten Abbau von Cellulose erleichtern, indem die inhibitorischen Cellulose-Abbauprodukte (insbesondere Cellobiose), die durch die kombinierte Wirkung von CBH-Komponenten und EG-Komponenten entstehen, weiter abgebaut werden. Ohne die Anwesenheit von BG-Komponenten tritt eine mäßige oder geringe Hydrolyse kristalliner Cellulose auf. BG-Komponenten werden oft auf Arylsubstraten wie etwa p-Nitrophenol-B-D-glucosid (PNPG) charakterisiert und werden deshalb oft als Arylglucosidasen bezeichnet. Man beachte, dass nicht alle Arylglucosidasen BG-Komponenten sind, da einige Cellobiose nicht hydrolysieren.
• Man geht davon aus, dass die Gegenwart oder Abwesenheit von BG-Komponenten in der Cellulase-Zusammensetzung dazu dienen kann, die Aktivität der CBH-Komponenten zu regulieren. Da Cellobiose während des Cellulose-Abbaus durch CBH-Komponenten produziert wird, da bekannt ist, dass hohe Cellobiose-Konzentrationen die CBH-Aktivität hemmen, und da Cellobiose durch BG-Komponenten zu Glucose hydrolysiert wird, ”beendet” die Abwesenheit von BG-Komponenten in der Cellulase-Zusammensetzung die CBH-Aktivität, wenn die Konzentration von Cellobiose inhibitorische Werte erreicht. Es ist auch möglich, dass ein oder mehrere Additive (z. B. Cellobiose, Glucose usw.) der Cellulase-Zusammensetzung zugegeben werden können, um direkt oder indirekt einen Teil oder die Gesamtheit der CBHI-Typ-Aktivität sowie andere CBH-Aktivität ”abzuschalten”. Bei Verwendung solcher Additive wird die resultierende Zusammensetzung als Zusammensetzung angesehen, die sich zur Verwendung in der Erfindung eignet, wenn die Menge an verwendeten Additiven ausreicht, die CBHI-Typ-Aktivität auf Werte zu senken, die den CBHI-Typ-Aktivitätswerten entsprechen oder darunter liegen, die durch Verwendung der hierin beschriebenen Cellulase-Zusammensetzungen erzielt werden.
• Eine Cellulase-Zusammensetzung, die zugegebene Mengen an BG-Komponenten enthält, kann andererseits die Gesamthydrolyse von Cellulose steigern, wenn die durch die CBH-Komponenten erzeugte Cellobiose-Menge diese Gesamthydrolyse in Abwesenheit zugegebener BG-Komponenten einschränkt.
• Verfahren zur erhöhung oder Verringerung der Menge an BG-Komponenten in der Cellulase-Zusammensetzung werden in der US-A-07/625.140 , eingereicht am 10. Dezember 1990, unter der Nummer 010055-056 und dem Titel ”Saccharification of Cellulose by Cloning and Amplification of the β-Glucosidase Gene of Trichoderma reesei” geoffenbart, welche Anmeldung hierin durch Verweis aufgenommen ist.
• Pilz-Cellulasen können mehr als eine BG-Komponente enthalten. Die unterschiedlichen Komponenten besitzen im Allgemeinen unterschiedliche isoelektrische Punkte, die ihre Trennung mittels Ionenaustausch-Chromatographie und dergleichen ermöglichen. Entweder kann eine einzige BG-Komponente oder eine Kombination von BG-Komponenten verwendet werden.
• Bei Verwendung in der Waschmittel-Zusammensetzung wird die BG-Komponente im Allgemeinen in einer Menge zugegeben, die ausreicht, um die Hemmung der CBH- und EG-Komponenten und insbesondere der CBHI-Typ-Cellulase-Komponenten durch Cellobiose zu verhindern. Die zugegebene Menge der BG-Komponente hängt von der Menge an in der Waschmittel-Waschlösung produzierten Cellobiose ab, die durch Fachleute auf dem Gebiet leicht ermittelt werden kann. Bei Verwendung beträgt jedoch der Prozentsatz der BG-Komponente relativ zu den CBH-Typ-Komponenten in der Cellulase-Zusammensetzung vorzugsweise etwa 0,2 bis etwa 10 Gew.-%, noch bevorzugter etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.-%.
• Bevorzugte Pilz-Cellulasen zur Verwendung bei der Herstellung der Pilz-Cellulase-Zusammensetzungen der Erfindung stammen von Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Penicillum sp., Humicola insolens und dergleichen. Bestimmte Pilz-Cellulasen sind im Handel erhältlich, z. B. CELLUCAST (erhältlich bei Novo Industry, Kopenhagen, Dänemark), RAPIDASE (erhältlich bei Gist Brocades, N. V., Delft, Niederlande), CYTOLASE 123 (erhältich bei Genencor International, South San Francisco, CA, USA) und dergleichen. Andere Pilz-Cellulasen können durch auf dem Gebiet bekannte Fermentations- und Isolierverfahren problemlos isoliert werden.
• Der Ausdruck ”baumwollhältiges Gewebe” bezieht sich auf genähte oder ungenähte Gewebe aus reiner Baumwolle oder Baumwollgemischen, z. B. Baumwollwebstoffe, Baumwollstrick, Baumwolldenimstoffe und dergleichen. Bei Verwendung von Baumwollgemischen sollte der Anteil der Baumwolle im Gewebe zumindest etwa 40 Gew.-% Baumwolle, vorzugsweise mehr als etwa 60 Gew.-% Baumwolle und am bevorzugtesten mehr als etwa 75 Gew.-% Baumwolle ausmachen. Bei Verwendung von Gemischen kann das im Gewebe verwendete Zusatzmaterial eine oder mehrere Nicht-Baumwollfasern wie etwa Kunstfasern, z. B. Polyamidfasern (beispielsweise Nylon 6 und Nylon 66), Acrylfasern (beispielsweise Polyacrylnitrilfasern), Polyesterfasern (beispielsweise Polyethylenterephthalat), Polyvinylalkoholfasern (beispielsweise Vinylon), Polyvinylchlorid-fasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstofffasern und Aramid-fasern, enthalten. Es ist auch möglich, dass regenerierte Cellulose, z. B. Rayon, als Ersatz für Baumwolle in baumwollhältigen Geweben verwendet wird.
• Der Ausdruck ”oberflächenaktiver Stoff oder Tensid” bezieht sich auf anionische, nichtionogene und ampholytische Tenside, die zur Verwendung in Waschmittel-Zusammensetzungen geeignet sind.
• Der Ausdruck ”Waschmedium” bezieht sich auf eine wässrige Waschlösung, die durch Zugabe einer erforderlichen Menge einer Waschmittel-(Tensid-)Zusammensetzung zu Wasser gebildet wird. Das Waschmedium enthält im Allgemeinen eine Reinigung bewirkende Menge des Waschmittels.
• Das Waschmedium ist als ”saures Waschmedium” definiert, wenn der pH-Wert des Mediums von etwa 4 bis weniger als etwa 7 reicht. Das Waschmedium ist als ”neutrales Waschmedium” definiert, wenn der pH-Wert des Mediums etwa 7 beträgt. Das Wasch-medium ist als ”alkalisches Waschmedium” definiert, wenn der pH-Wert des Mediums von etwa 7 bis etwa 10 reicht. Vorzugsweise besitzt das alkalische Waschmedium einen pH-Wert von über 7 bis etwa 9, noch bevorzugter von über 7 bis etwa 8. Die Erfindung betrifft die Entdeckung, dass EG-Typ-Komponenten in Waschmittel-Zusammensetzungen einsetzbar sind, um Weichheit herbeizuführen sowie die Farbechtheit/-wiederherstellung und den Griff von baumwollhältigen Geweben zu verbessern – ungeachtet der Tatsache, ob solche Zusammensetzungen in einem sauren, neutralen oder alkalischen Waschmedium verwendet werden. Da jedoch Waschmittel-Zusammensetzungen im Allgemeinen unter alkalischen Bedingungen eingesetzt werden, ist die verwendete Cellulase-Zusammensetzung vorzugsweise eine, die unter derartigen Bedingungen Aktivität aufweist. Bevorzugte Cellulase-Zusammensetzungen sind z. B. jene, die von T. reesei und Humicola insolens stammen. Cellulase-Zusammensetzungen aus Humicola insolens sind auf dem Gebiet als Substanzen bekannt, die unter alkalischen Bedingungen hohe Aktivität beihalten.
• Obwohl die Gegenwart von EG-Typ-Komponenten notwendig ist, um Farbechtheit/-wiederherstellung, Weichheit und verbesserten Griff zu bewirken, zeigen spezifische Gemische von EG-Typ-Komponenten und CBH-Typ-Komponenten (einschließlich CBHI-Typ-Komponenten) auch die gleichen Vorteile oder sogar einige zusätzliche Vorteile. Während die Verwendung von EG-Komponenten eine gewisse Reinigungswirkung hat, wird inkrementelle Reinigungswirkung bei baumwollhältigen Geweben beobachtet, die mit einer Waschmittel-Zusammensetzung gewaschen wurden, die eine Cellulase-Zusammensetzung enthält, die eine oder mehrere EG-Typ-Komponenten und CBHI-Typ-Cellulase-Komponenten enthält. Während die Verwendung von EG-Komponenten Weichheit bewirkt, kann eine inkrementelle Weichmachwirkung erzielt werden, indem einige CBHI-Typ-Komponenten mit den EG-Typ-Komponenten kombiniert werden.
• Die Gegenwart großer Mengen an CBHI-Typ-Komponenten in Kombination mit den EG-Typ-Komponenten führt zu stärkerem Festigkeitsverlust der baumwollhältigen Gewebe als bei Cellulase-Zusammensetzungen, die entweder frei von CBHI-Typ-Komponenten sind oder kleinere Mengen an CBHI-Typ-Komponenten enthalten.
• Um daher den Festigkeitsverlust von Cellulase-hältigen Waschmittel-Zusammensetzungen zu minimieren, verwenden die hierin beschriebenen Waschmittel-Zusammensetzungen Cellulase-Zusammensetzungen, die eine oder mehrere EG-Typ-Komponenten und weniger als etwa 5 Gew.-%, vorzugsweise weniger als etwa 2 Gew.-%, CBHI-Typ-Komponenten enthalten. Waschmittel-Zusammensetzungen, die solche Cellulase-Zusammensetzungen enthalten, verleihen den baumwollhältigen Geweben die gewünschten positiven Eigenschaften, während der Festigkeitsverlust im Vergleich zu Waschmittel-Zusammensetzungen, die eine Cellulase-Zusammensetzung mit größeren Mengen an CBHI-Typ-Komponenten enthalten, verringert wird.
• Die Auswahl der jeweiligen Cellulase-Zusammensetzung zur Verwendung in der Waschmittel-Zusammensetzung der Erfindung erfolgt, indem man den Wunsch nach einer inkrementellen Reinigungswirkung aufgrund der Gegenwart einiger CBHI-Typ-Komponenten mit dem Wunsch nach Beständigkeit gegenüber Festigkeitsverlust, wonach die Verwendung minimaler oder keiner CBHI-Typ-Komponenten notwendig ist, miteinander in Einklang bringt. Wenn daher der Hauptgrund für den Zusatz von Cellulase zur Waschmittel-Zusammensetzung verbesserte Weichmachwirkung, Farbechtheit/-wiederherstellung und Griffeigenschaft der baumwollhältigen Gewebe mit möglichst minimalem Festigkeitsverlust des baumwollhältigen Gewebes ist, sollte die in der Waschmittel-Zusammensetzung verwendete Cellulase eine oder mehrere EG-Typ-Komponenten frei von allen CBHI-Typ-Komponenten umfassen.
• Wenn hingegen der Hauptgrund für den Zusatz von Cellulase zur Waschmittel-Zusammensetzung Farbechtheit/-wiederherstellung, verbesserte Weichmachwirkung und verbesserter Griff der baumwollhältigen Gewebe in Verbindung mit inkrementeller Reinigungswirkung ist, sollte die in der Waschmittel-Zusammensetzung verwendete Cellulase eine Cellulase enthalten, die eine oder mehrere EG-Typ-Komponenten sowie eine CBHI-Typ-Komponente umfasst (wenn auch weniger als etwa 5 Gew.-%, vorzugsweise weniger als etwa 2 Gew.-%, bezogen auf das gesamte Proteingewicht der Cellulase-Zusammensetzung).
• Die Menge an Cellulase, die allgemein in den hierin beschriebenen Waschmittel-Zusammensetzungen verwendet wird, ist eine Menge, die ausreicht, um den Baumwollkleidungsstücken Farbechtheit/-wiederherstellung und Weichheit zu verleihen. Vorzugsweise werden die Cellulase-Zusammensetzungen in einer Menge von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Waschmittel-Zusammensetzung, eingesetzt. Noch bevorzugter werden die Cellulase-Zusammensetzungen in einer Menge von etwa 0,05 Gew.-% bis etwa 2 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Waschmittel-Zusammensetzung, eingesetzt. Die jeweilige Konzentration der in der Waschmittel-Zusammensetzung verwendeten Cellulase wird so gewählt, dass bei Verdünnung in einem Waschmedium die Konzentration der EG-Typ-Komponenten von etwa 0,5 bis etwa 500 ppm, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 100 ppm, reicht. Die jeweilige Menge der in der Waschmittel-Zusammensetzung verwendeten Cellulase hängt von der Menge an EG-Typ-Komponenten in den Cellulase-Zusammensetzungen sowie vom Ausmaß ab, in dem die Waschmittel-Zusammensetzung bei Zugabe zu Wasser verdünnt wird, um ein Waschmedium zu bilden. Diese Faktoren können problemlos von Fachleuten auf dem Gebiet ermittelt werden.
• Vorzugsweise enthalten die in den hierin beschriebenen Waschmittel-Zusammensetzungen eingesetzten Cellulase-Zusammensetzungen zumindest etwa 20 Gew.-% Endoglucanase-Typ-Komponenten, bezogen auf das Gesamtgewicht an Protein in der Cellulase-Zusammensetzung, noch bevorzugter zumindest etwa 50 Gew.-%, noch bevorzugter zumindest etwa 70 Gew.-%, insbesondere zumindest etwa 90 Gew.-%, Endonuklease-Typ-Komponenten, bezogen auf das Gesamtgewicht an Protein in der Cellulase-Zusammen-setzung.
• Bei niedrigeren Cellulase-Konzentrationen (d. h. Konzentrationen von EG-Typ-Komponenten von weniger als etwa 5 ppm im Waschmedium) treten Weichheit, Farbechtheit/-wiederherstellung und verbesserter Griff aufgrund der Verwendung der Waschmittel-Zusammensetzungen der Erfindung bei wiederholten Waschungen deutlicher zu Tage. Bei höheren Konzentrationen (d. h. Konzentrationen von EG-Typ-Komponenten von etwa 5 ppm und mehr im Waschmedium) können die Verbesserungen in einem einzigen Waschvorgang zu Tage treten.
• Einer der wichtigen Aspekte der Erfindung besteht darin, dass man durch geeignete Wahl der Cellulase-Zusammensetzung solcherart, dass sie eine oder mehrere EG-Komponenten und minimale Mengen an CBHI-Typ-Komponenten enthält, die Möglichkeit hat, die gewünschte Weichmachwirkung, Farbechtheit/-wiederherstellung und verbesserten Griff zu erzielen, während der Festigkeitsverlust des baumwollhältigen Gewebes verringert wird.
• Ferner ermöglicht die Verwendung solcher zweckmäßiger Cellulase-Zusammensetzungen den Einsatz niedriger Konzentrationen an Cellulase in der Waschmittel-Zusammensetzung. Der Einsatz niedriger Cellulase-Konzentrationen in den Waschmittel-Zusammensetzungen sollte seinerseits zu höherer Sicherheit für den Verbraucher führen.
• Die oben beschriebene Cellulase-Zusammensetzung kann der Waschmittel-Zusammensetzung entweder in einem flüssigen Verdünner, in Granulat, Emulsionen, Gelen, Pasten und dergleichen zugegeben werden. Solche Formen sind Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt. Wenn eine feste Waschmittel-Zusammensetzung eingesetzt wird, ist die Cellulase-Zusammensetzung vorzugsweise als Granulat formuliert. Vorzugsweise kann das Granulat so formuliert werden, dass es ein Cellulase-Schutzmittel enthält. Siehe z. B. US-A-07/642.669 , eingereicht am 17. Januar 1991 unter der Nummer 010055-073 und dem Ttiel ”Granules Containing both an Enzyme and an Enzyme Protecting Agent and Detergent Compositions Containing such Granules”, welche Anmeldung zur Gänze hierin durch Verweis aufgenommen ist. Das Granulat kann so formuliert sein, dass es Materialien enthält, um die Auflösungsgeschwindigkeit des Granulats im Wasch-medium zu verringern. Solche Materialien und Granulate sind in US-A-07/642.596 , eingereicht am 17. Januar 1991 unter der Nummer GCS-171-US1 und dem Titel ”Granular Compositions” geoffenbart, welche Anmeldung zur Gänze hierin durch Verweis aufgenommen ist.
• Die hierin beschriebenen Waschmittel-Zusammensetzungen verwenden ein oberflächenaktives Mittel, d. h. ein Tensid, beispielsweise anionische, nichtionogene und ampholytische Tenside, die zur Verwendung in Waschmittel-Zusammensetzungen geeignet sind.
• Geeignete anionische Tenside zur Verwendung in der hierin beschriebenen Waschmittel-Zusammensetzung sind z. B. unverzweigte oder verzweigte Alkylbenzolsulfonate; Alkyl- oder Alkenylethersulfate mit unverzweigten oder verzweigten Alkylgruppen oder Alkenyl-gruppen; Alkyl- oder Alkenylsulfate; Olefinsulfonate; Alkansulfonate und dergleichen. Geeignete Gegenionen für anionische Tenside sind Alkalimetallionen, wie z. B. Natrium und Kalium; Erdalkalimetallionen, wie z. B. Calcium und Magnesium; Ammoniumionen; und Alkanolamine mit 1 bis 3 Alkanolgruppen mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen.
• Ampholytische Tenside sind z. B. quaternäre Ammoniumsalzsulfonate, Betain-artige ampholytische Tenside und dergleichen. Solche ampholytischen Tenside weisen im gleichen Molekül sowohl positiv als auch negativ geladene Gruppen auf. Nichtionogene Tenside umfassen im Allgemeinen Polyoxyalkylenether sowie höhere Fettsäurealkanolamide oder Alkylenoxidaddukte davon, Fettsäureglycerinmonoester und dergleichen.
• Geeignete Tenside zur Verwendung in der Erfindung sind in GB-A-2.094.826 geoffenbart, die hierin durch Verweis aufgenommen ist.
• Gemische derartiger Tenside kommen ebenfalls in Frage.
• Das Tensid oder Gemisch von Tensiden wird im Allgemeinen in den erfindungsgemäßen Waschmittel-Zusammensetzungen in einer Menge von etwa 1 Gew.-% bis etwa 95 Gew.-% der gesamten Waschmittel-Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von etwa 5 Gew.-% bis etwa 45 Gew.-% der gesamten Waschmittel-Zusammensetzung, eingesetzt. Bei Verdünnung im Waschmedium beträgt die Tensidkonzentration im Allgemeinen etwa 500 ppm oder mehr; vorzugsweise von etwa 1000 ppm bis 15.000 ppm.
• Neben der Cellulase-Zusammensetzung und dem/den Tensid(en) können die hierin beschriebenen Waschmittel-Zusammensetzungen gegebenenfalls eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten:
• Hydrolasen außer Cellulase
• Zu solchen Hydrolasen zählen Carboxylatester-Hydrolase, Thioester-Hydrolase, Phosphatmonoester-Hydrolase und Phosphatdiester-Hydrolase, die auf Esterbindungen einwirken; Glykosid-Hydrolase, die auf Glykosylverbindungen einwirkt; ein Enzym, das N-Glykosylverbindungen hydrolysiert; Thioether-Hydrolase, die auf Etherbindungen einwirkt; eine α-Aminoacylpeptid-Hydrolase, Peptidylaminosäure-Hydrolase, Acylaminosäure-Hydrolase, Dipeptid-Hydrolase und Peptidylpeptid-Hydrolase, die auf Peptidbindungen einwirken. Bevorzugt davon sind Carboxylatester-Hydrolase, Glykosid-Hydrolase und Peptidylpeptid-Hydrolase. Zu geeigneten Hydrolasen zählen (1) Proteasen, die zur Peptidpeptid-Hydrolase zählen, z. B. Pepsin, Pepsin B, Rennin, Trypsin, Chymotrypsin A, Chymotrypsin B, Elastase, Enterokinase, Cathepsin C, Papain, Chymopapain, Ficin, Thrombin, Fibrinolysin, Renin, Subtilisin, Aspergillopeptidase A, Collagenase, Clostridiopeptidase B, Kallikrein, Gastrisin, Cathepsin D., Bromelin, Keratinase, Chymotrypsin C, Pepsin C, Aspergillopeptidase B, Urokinase, Carboxy-Peptidase A und B und Aminopeptidase; (2) Glykosid-Hydrolasen (Cellulase, die ein wesentlicher Bestandteil ist, ist aus dieser Gruppe ausgenommen) α-Amylase, β-Amylase, Glucoamylase, Invertase, Lysozym, Pectinase, Chitinase und Dextranase. Bevorzugt davon sind α-Amylase und β-Amylase. Sie funktionieren in sauren bis neutralen Systemen, doch die Substanz, die aus Bakterien erhalten wird, weist hohe Aktivität in alkalischen Systemen auf; (3) Carboxylatester-Hydrolase, z. B. Carboxyl-Esterase, Lipase, Pectin-Esterase und Chlorophyllase. Besonders wirksam davon ist Lipase.
• Markennamen handelsüblicher Produkte und Hersteller sind: ”Alkalase”, ”Esperase”, ”Savinase”, ”AMG”, ”BAN”, ”Fungamill”, ”Sweetzyme”, ”Thermamyl” (Novo Industry, Kopenhagen, Dänemark); ”Maksatase”, ”High-alkaline Protease”, ”Amylase THC”, ”Lipase” (Gist Brocades, N. V., Delft, Holland); ”Protease B-400”, ”Protease B-4000”, ”Protease AP”, ”Protease AP 2100” (Schweizerische Ferment A. G., Basel, Schweiz); ”CRD Protease” (Monsanto Company, St. Louis, Missouri, USA); ”Piocase” (Piopin Corporation, Monticello, Illinois, USA); ”Pronase P”, ”Pronase AS”, ”Pronase AF” (Kaken Chemical Co., Ltd., Japan); ”Lapidase P-2000” (Lapidas, Secran, Frankreich); Protease-Produkte (Tyler-Standardsieb, 100% Durchgang bei 16 Mesh und 100% bei 150 Mesh) (Clington Corn Produkts, Division of Standard Brands Corp., New York, USA); ”Takamine”, ”Bromelain 1:10”, ”HT Protease 200”, ”Enzyme L–W” (aus Pilzen, nicht aus Bakterien) (Miles Chemical Company, Elkhart, Indiana, USA); ”Rhozyme P-11 Conc.”, ”Pectinol”, ”Lipase B”, ”Rhozyme PF”, ”Rhozyme J-25” (Rohm & Haas, Genencor, South San Francisco, CA, USA); ”Ambrozyme 200” (Jack Wolf & Co., Ltd., Subsidiary of Nopco Chemical Company, Newark, N. J, USA); ”ATP 40”, ”ATP 120”, ”ATP 160” (Lapidas, Secran, Frankreich); ”Oripase” (Nagase & Co., Ltd., Japan).
• Die Hydrolase mit Ausnahme von Cellulase wird in einer bedarfsgerechten Menge in die Waschmittel-Zusammensetzung eingearbeitet. Sie sollte vorzugsweise in einer Menge von 0,001 bis 5 Gew.-%, noch bevorzugter 0,02 bis 3 Gew.-%, des reinen Produkts eingearbeitet werden. Dieses Enzym sollte in Granulatform aus Rohenzym alleine oder in Kombination mit anderen Komponenten in der Waschmittel-Zusammensetzung eingesetzt werden. Granulat aus Rohenzym wird in einer derartigen Menge eingesetzt, dass das gereinigte Enzym 0,01 bis 50 Gew.-% im Granulat ausmacht. Das Granulat wird in einer Menge von 0,002 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew.-%, eingesetzt. Wie bei Cellulasen kann dieses Granulat so formuliert werden, dass es ein Enzymschutzmittel und Auflösungsverzögerungsmittel enthält.
• Kationische Tenside und langkettige Fettsäuresalze
• Solche kationischen Tenside und langkettigen Fettsäuresalze sind z. B. gesättigte oder ungesättigte Fettsäuresalze, Alkyl- oder Alkenylethercarbonsäuresalze, α-Sulfofettsäuresalze oder -ester, Aminosäure-artige Tenside, Phosphatestertenside, quaternäre Ammoniumsalze, z. B. jene mit 3 bis 4 Alkylsubstituenten und bis zu 1 phenylsubstituiertem Alkylsubstituenten. Geeignete kationische Tenside und langkettige Fettsäuresalze sind in der GB-A-2.094.826 geoffenbart, die hierin durch Verweis aufgenommen ist. Die Zusammensetzung kann bis zu etwa 1 bis etwa 20 Gew.-% solcher kationischen Tenside und langkettigen Fettsäuresalze enthalten.
• Builder
• A. Zweiwertige Sequestriermittel
• Die Zusammensetzung kann etwa 0 bis etwa 50 Gew.-% einer oder mehrerer Builder-Komponenten enhalten, ausgewählt aus der aus Alkalimetallsalzen und Alkanolaminsalzen der folgenden Verbindungen bestehenden Gruppe: Phosphate, Phosphonate, Phosphonocarboxylate, Salze von Aminosäuren, Aminopolyacetate hochmolekularer Elektrolyte, nicht-dissoziierende Polymere, Salze von Dicarbonsäuren und Alumosilikatsalze. Geeignete zweiwertige Sequestriermittel sind in der GB-A-2.094.826 geoffenbart, die hierin durch Verweis aufgenommen ist.
• B. Basen und anorganische Elektrolyte
• Die Zusammensetzung kann etwa 1 bis etwa 50 Gew.-%, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 30 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung einer oder mehrerer Alkalimetallsalze der folgenden Verbindungen, an Basen oder anorganischen Elektrolyten enthalten: Silikate, Carbonate und Sulfate, sowie organische Basen wie etwa Triethanolamin, Diethanolamin, Monoethanolamin und Triisopropanolamin.
• Anti-Redepositionsmittel
• Die Zusammensetzung kann etwa 0,1 bis etwa 5 Gew.-% eine oder mehrere der folgenden Verbindungen als Anti-Redepositionsmittel enthalten: Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose.
• Davon bietet eine Kombination von Carboxymethylcellulose und/oder Polyethylenglykol mit der hierin beschriebenen Cellulase-Zusammensetzung eine besonders geeignete Schmutz-entfernende Zusammensetzung.
• Bleichmittel
• Die Verwendung der hierin beschriebenen Cellulase in Kombination mit einem Bleichmittel wie etwa Natriumpercarbonat, Natriumperborat, Natriumsulfat/Wasserstoffperoxid-Addukt und Natriumchlorid/Wasserstoffperoxid-Addukt und/oder einem lichtempfindlichen Bleichfarbstoff wie etwa Zink- oder Aluminiumsalz von sulfoniertem Phthalocyanin verbessert die Waschwirkung noch weiter.
• Bläuungsmittel und Fluoreszenzfarbstoffe
• Verschiedene Bläuungsmittel und Fluoreszenzfarbstoffe können gegebenenfalls in die Zusammensetzung eingearbeitet werden. Zweckmäßige Bläuungsmittel und Fluoreszenzfarbstoffe sind in der GB-A-2.094.826 geoffenbart, die hierin durch Verweis aufgenommen ist.
• Inhibitoren gegen Balligwerden
• Die folgenden Inhibitoren gegen Balligwerden können im pulverförmigen Waschmittel eingearbeitet sein: p-Toluolsulfonsäuresalze, Xylolsulfonsäuresalze, Essigsäuresalze, Sulfobernsteinsäuresalze, Talk, feinpulverige Kieselsäure, Ton, Calciumsilikat (z. B. Micro-Cell von Johns Manville Co.), Calciumcarbonat und Magnesiumoxid.
• Maskierungsmittel für die Cellulase-Aktivität hemmende Faktoren
• Die hierin beschriebenen Cellulase-Zusammensetzungen werden in einigen Fällen in Gegenwart von Kupfer-, Zink-, Chrom-, Quecksilber-, Blei-, Mangan- oder Silberionen oder ihrer Verbindungen deaktiviert. Verschiedene Metallchelatbildner und Metallfällungsmittel sind gegen diese Inhibitoren wirksam. Dazu zählen z. B. zweiwertige Metallionen-Sequestriermittel, die im obigen Punkt unter Bezugnahme auf optionale Additive aufgelistet wurden, sowie Magnesiumsilikat und Magnesiumsulfat.
• Cellobiose, Glucose und Gluconolacton wirken manchmal als Inhibitoren. Es ist vorzuziehen, die Gegenwart diese Saccharide gemeinsam mit der Cellulase so weit wie möglich zu verhindern. Wenn diese gemeinsame Gegenwart unvermeidlich ist, ist es notwendig, den direkten Kontakt der Saccharide mit der Cellulase z. B. durch Beschichten derselben zu verhindern.
• Langkettige Fettsäuresalze und kationische Tenside wirken in einigen Fällen als Inhibitoren. Die gemeinsame Gegenwart dieser Substanzen mit der Cellulase ist jedoch gestattet, wenn der direkte Kontakt von ihnen durch Tablettenbildung oder Beschichtung verhindert wird.
• Die obigen Maskierungsmittel und Verfahren können in der Erfindung gegebenenfalls zur Anwendung kommen.
• Cellulase-Aktivatoren
• Die Aktivatoren variieren je nach Art der Cellulasen. In Gegenwart von Proteinen, Kobalt und dessen Salzen, Magnesium und dessen Salzen, Calcium und dessen Salzen, Kalium und dessen Salzen, Natrium und dessen Salzen oder Monosacchariden, wie z. B. Mannose und Xylose, werden die Cellulasen aktiviert und ihre Waschkraft deutlich verbessert.
• Antioxidantien
• Zu den Antioxidantien zählen z. B. t-Butylhydroxytoluol, 4,4'-Butylidenbis(6-t-butyl-3-methylphenol), 2,2'-Butylidenbis(6-t-butyl-4-methylphenol), monostyroliertes Kresol, distyroliertes Kresol, monostyroliertes Phenol, distyroliertes Phenol und 1,1-Bis(4-hydroxyphenyl)cyclohexan.
• Solubilisatoren
• Zu den Solubilisatoren zählen z. B. niedere Alkohole wie etwa Ethanol, Benzolsulfonatsalze, niedere Alkylbenzolsufonatsalze wie etwa p-Toluolsulfonatsalze, Glykole wie etwa Propylenglykol, Acetylbenzolsulfonatsalze, Acetamide, Pyridindicarbonsäureamide, Benzoatsalze und Harnstoff.
• Die hierin beschriebene Waschmittel-Zusammensetzung kann in einem breiten pH-Bereich von sauer bis alkalisch eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Waschmittel-Zusammensetzung der Erfindung in alkalischen Waschmittelmedien und noch bevorzugter in alkalischen Waschmittelmedien mit einem pH-Wert von mehr als 7 bis höchstens etwa 8 eingesetzt werden.
• Neben den obigen Bestandteilen können gegebenenfalls mit den Waschmittel-Zusammensetzungen der Erfindung Duftstoffe, Puffer, Konservierungsmittel, Farbstoffe und dergleichen eingesetzt werden. Solche Komponenten werden in auf dem Gebiet üblichen Mengen eingesetzt.
• Wenn eine in der Erfindung eingesetzte Waschmittelbasis in Form eines Pulvers vorliegt, kann es eines sein, das nach bekannten Herstellungsverfahren erzeugt wird, z. B. durch Sprühtrocknen und Granulieren. Die insbesondere durch Sprühtrocknen und/oder Sprühtrocknungs-Granulieren erhaltene Waschmittelbasis wird bevorzugt. Die durch Sprühtrocknen erhaltene Waschmittelbasis ist hinsichtlich der Herstellungsbedingungen nicht eingeschränkt. Die durch Sprühtrocknen erhaltene Waschmittelbasis besteht aus Hohlgranulat, das durch Sprühen einer wässrigen Aufschlämmung wärmebeständiger Bestandteile, z. B. von Tensiden und Buildern, in einen heißen Raum erhalten wird. Das Granulat besitzt eine Größe von 50 bis 2000 μm. Nach dem Sprühtrocknen können Duftstoffe, Enzyme, Bleichmittel und anorganische alkalische Builder zugegeben werden. Mit einer hochdichten, granularen, durch Sprühtrocknungs-Granulieren erhaltenen Waschmittelbasis können verschiedene Bestandteile auch nach Herstellung der Basis zugegeben werden.
• Wenn die Waschmittelbasis eine Flüssigkeit ist, kann sie entweder eine homogene Lösung oder eine inhomogene Dispersion sein. Zur Verhinderung der Zersetzung von Carboxymethylcellulose durch die Cellulase im Waschmittel ist es wünschenswert, dass Carboxymethylcellulose vor der Einarbeitung in die Zusammensetzung granuliert oder beschichtet wird.
• Die hierin beschriebenen Waschmittel-Zusammensetzungen werden im Falle industrieller und privater Verwendungszwecke bei Temperaturen oder Flottenverhältnissen, die für diese Umgebungen typisch sind, eingesetzt.
• Neben ihrer Verwendung als Waschmittel können die hierin beschriebenen Cellulase-Zusammensetzungen auch in einem Vorwaschschritt in der geeigneten Lösung bei einem mittleren pH-Wert eingesetzt werden, wo ausreichende Aktivität besteht, um die gewünschten Verbesserungen betreffend Farbechtheit/-wiederherstellung, Weichheit und Griff herbeizuführen. Wenn die Cellulase-Zusammensetzung in einer Zusammensetzung zum Vorweichen (z. B. Vorwaschen) eingesetzt wird (entweder als Flüssigkeit, Spray, Gel oder Pastenzusammensetzung), wird die Cellulase-Zusammensetzung im Allgemeinen in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 20 Gew.-% bezogen auf das Gesamt-gewicht der Vorweich-Zusammensetzung eingesetzt. In solchen Zusammensetzungen kann gegebenenfalls ein Tensid eingesetzt werden; wenn dies der Fall ist, ist es im Allgemeinen in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Vorweich-Zusammensetzung, enthalten. Der Rest der Zusammensetzung umfasst herkömmliche in einem Vorweichpräparat eingesetzte Komponenten, z. B. Verdünner, Puffer, andere Enzyme (Proteasen) und dergleichen, in ihren üblichen Konzentrationen. Solche Vorweich-Zusammensetzungen umfassen demzufolge etwa 0 bis etwa 20 Gew.-% einer Cellulase, umfassend eine oder mehrere EG-Typ-Komponenten und weniger als etwa 5 Gew.-% CBHI-Typ-Komponenten.
• Es ist ferner möglich, dass die hierin beschriebenen Cellulase-Zusammensetzungen auch Verwendungszwecken im Haushalt zugeführt werden, z. B. als getrennte Zusammensetzung zur Wiederherstellung von Farben ausgebleichter Gewebe. Siehe z. B. US-A-4.738.682 , die zur Gänze hierin durch Verweis aufgenommen ist.
• Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen und ihren Schutzumfang in keiner Weise einschränken.
• BEISPIELE
• Die Beispiele 1–12 und 20–28 beschreiben die Herstellung von Trichoderma reesei, das genetisch modifiziert wurde, um nicht imstande zu sein, eine oder mehrere Cellulase-Komponenten zu produzieren, oder um spezifische Cellulase-Komponenten überzuproduzieren.
• Beispiel 1
• Selektion auf pyr4^–-Derivate von Trichoderma reesei
• Das pyr4-Gen kodiert für Orotidin-5'-monophosphat-Decarboxylase, ein Enzym, das für die Biosynthese von Uridin erforderlich ist. Der toxische Inhibitor 5-Fluororotsäure (FOA) wird durch Zellen der Wildform in Uridin eingebaut und vergiftet somit die Zellen. pyr4-Gen-defiziente Zellen sind jedoch gegenüber diesem Inhibitor resistent, benötigen aber Uridin zur Vermehrung. Es ist daher möglich, unter Verwendung von FOA eine Selektion auf pyr4-Derivatstämme zu treffen. In der Praxis wurden Sporen von T. reesei-Stamm RL-P37 (Sheir-Ness, G. und Montenecourt, B. S., Appl. Microbiol. Biotechnol. 20, 46–53 (1984)) an der Oberfläche eines verfestigten Mediums mit 2 mg/ml Uridin und 1,2 mg/ml FOA verteilt. Spontane FOA-resistente Kolonien traten innerhalb von drei bis vier Tagen auf, wobei es möglich war, anschließend jene FOA-resistenten Derivate zu identifizieren, die Uridin für das Wachstum benötigten. Um jene Derivate zu identifizieren, die spezifisch ein defektives pyr4-Gen aufwiesen, wurden Protoplasten erzeugt und mit einem Plasmid transformiert, das ein pyr4-Gen der Wildform enthielt (siehe die Beispiele 3 und 4). Nach der Transformation wurden Protoplasten auf Medium ohne Uridin aufplattiert. Das anschließende Wachstum transformierter Kolonien zeigte die Komplementierung eines defektiven pyr4-Gens durch das pyr4-Gen des Plasmids. Auf diese Weise wurde Stamm GC69 als pyr4^–-Derivat von Stamm RL-P37 identifiziert.
• Beispiel 2
• Herstellung von CBHI-Deletionsvektor
• Ein für das CBHI-Protein kodierendes cbh1-Gen wurde aus der Genom-DNA von T. reesei-Stamm RL-P37 durch Hybridisierung mit einer Oligonukleotid-Sonde kloniert, die auf der Basis der veröffentlichten Sequenz für dieses Gen mittels bekannter Sondensynthese-Verfahren konstruiert wurde (Shoemaker et al., 1983b). Das cbh1-Gen liegt auf einem 6,5 kb PstI-Fragment und wurde in mit PstI gespaltenen pUC4K insertiert (von Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, USA), wodurch das Kan^r-Gen dieses Vektors mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren ersetzt wurde, welche Verfahren in Maniatis et al. (1989) dargelegt und hierin durch Verweis aufgenommen sind. Das resultierende Plasmid, pUC4K::cbh1, wurde dann mit HindIII gespalten und das größere Fragment mit etwa 6 kb isoliert und religiert, um pUC4K::cbh1ΔH/H zu ergeben (siehe 1). Diese Vorgangsweise entfernt die gesamte cbh1-Kodiersequenz und etwa 1,2 kb stromauf und 1,5 kb stromab an Flankierungssequenzen. Es verbleibt etwa 1 kb flankierende DNA von beiden Enden des ursprünglichen PstI-Framents.
• Das T. reesei pyr4-Gen wurde als 6,5 kb HindIII-Fragment genomischer DNA in pUC18 kloniert, um gemäß den Verfahren von Maniatis et al. (s. o.) pTpyr2 zu erzeugen (Smith et al., 1991). Das Plasmid pUC4K::cbhIΔH/H wurde mit HindIII gespalten, und die Enden wurden mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase dephosphoryliert. Dieses Ende dephosphorylierter DNA wurde mit dem 6,5 kb HindIII-Fragment ligiert, welches das T. reesei pyr4-Gen enthält, um pΔCBHIpyr4 zu liefern. 1 veranschaulicht die Konstruktion dieses Plasmids.
• Beispiel 3
• Isolierung von Protoplasten
• Myzel wurde durch Impfen von 100 ml YEG (0,5% Hefeextrakt, 2% Glucose) in einen 500 ml-Kolben mit etwa 5 × 10⁷ T. resei GC69-Sporen (pyr4^–-Derivatstamm) erhalten.
• Der Kolben wurde dann unter 16-stündigem Schütteln bei 37°C inkubiert. Das Myzel wurde durch Zentrifugation bei 2.750 × g geerntet. Das geerntete Myzel wurde in einer 1,2 M Sorbitlösung gewaschen und in 40 ml einer Lösung resuspendiert, die 5 mg/ml Novozym^® 234-Lösung (ein Markenname für ein Mehrkomponenten-Enzymsystem mit 1,3-α-Glucanase, 1,3-β-Glucanase, Laminarinase, Xylanase, Chitinase und Protease von Novo Biolabs, Danbury, CT, USA), 5 mg/ml MgSO₄·7H₂O, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin und 1,2 M Sorbit enthielt. Die Protoplasten wurden von den Zellresten mittels Filtration durch Miracloth (Calbiochem Corp., La Jolla, CA, USA) entfernt und durch Zentrifugation bei 2.000 × g gesammelt. Die Protoplasten wurden dreimal in 1,2 M Sorbit und einmal in 1,2 M Sorbit, 50 mM CaCl₂ gewaschen, zentrifugiert und in einer Dichte von etwa 2 × 10⁸ Protoplasten pro ml 1,2 M Sorbit, 50 mM CaCl₂ resuspendiert.
• Beispiel 4
• Transformation von Pilz-Protoplasten mit pΔCBHIpyr4
• Zu 200 μl der in Beispiel 3 hergestellten Protoplastensuspension wurden 20 μl von mit EcoRI gespaltenem pΔCBHIpyr4 (erzeugt in Beispiel 2) in TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) und 50 μl einer Polyethylenglykol-(PEG-)Lösung mit 25% PEG 4000, 0,6 M KCl und 50 mM CaCl₂ zugegeben. Dieses Gemisch wurde 20 min auf Eis inkubiert. Nach dieser Inkubationsdauer wurden 2,0 ml der obigen PEG-Lösung zugegeben, die Lösung vermischt und bei Raumtemperatur 5 min lang inkubiert. Nach dieser zweiten Inkubation wurden 4,0 ml einer Lösung mit 1,2 M Sorbit und 50 mM CaCl₂ zugegeben und diese Lösung weiter vermischt. Die Protoplastenlösung wurde dann sofort zu geschmolzenen Aliquoten von Vogel-Medium N (3 g Natriumcitrat, 5 g KH₂PO₄, 2 g NH₄NO₃, 0,2 g MgSO₄·7H₂O, 1 g CaCl₂·2H₂O, 5 μg α-Biotin, 5 mg Citronensäure, 5 mg ZnSO₄·7H₂O, 1 mg Fe(NH₄)₂·6H₂O, 0,25 mg CuSO₄·5H₂O, 50 μg MnSO₄·4H₂O pro l) zugegeben, umfassend weitere 1% Glucose, 1,2 M Sorbit und 1% Agarose. Das Protoplasten/Medium-Gemisch wurde dann auf ein festes Medium gegossen, welches das gleiche Vogel-Medium wie oben enthielt. Im Medium war kein Uridin vorhanden, weshalb infolge der Komplementierung der pyr4-Mutation von Stamm GC69 durch das Wildform-pyr4-Gen-Insert in pΔcBHIpyr4 nur transformierte Kolonien wachsen konnten. Diese Kolonien wurden anschließend übertragen und auf einem festen Vogel-Medium N gereinigt, das als Additiv 1% Glucose umfasste, und stabile Transformanten zur weiteren Analyse ausgewählt.
• In diesem Stadium unterschieden sich stabile Transformanten von instabilen Transformanten durch ihrer höhere Wachstumsrate und Bildung runder Kolonien mit einer glatten statt zackigen Kontur auf einem festen Kulturmedium ohne Uridin. In einigen Fällen wurde ein weiterer Stabilitätstest durchgeführt, indem die Transformanten auf einem festen nicht-selektiven Medium (d. h. umfassend Uridin) gezüchtet, Sporen aus diesem Medium geerntet und der Prozentsatz dieser Sporen bestimmt, die anschließend keimen und auf selektivem Medium ohne Uridin wachsen.
• Beispiel 5
• Analyse der Transformanten
• DNA wurde aus den in Beispiel 4 erhaltenen Transformanten isoliert, nachdem sie in flüssigem Vogel-Medium N mit 1% Glucose gezüchtet worden waren. Diese DNA-Transformanten-Proben wurden mit PstI-Restriktionsenzym gespalten und Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde dann auf einen Nytran-Membranfilter geblottet und mit einer ³²P-markierten pΔCBHIpyr4-Sonde hybridisiert. Die Sonde wurde gewählt, um das native cbh1-Gen als 6,5 kb pstI-Fragment, das native pyr4-Gen und jegliche DNA-Sequenzen des transformierenden DNA-Fragments zu identifizieren.
• Die radioaktiven Banden aus der Hybridisierung wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Das Autoradiogramm ist aus 3 ersichtlich. Fünf Proben wurden – wie oben beschrieben – getestet, sodass die Proben A, B, C, D und E vorlagen. Spur E ist der untransformierte Stamm GC69 und wurde in der vorliegenden Analyse als Vergleich eingesetzt. Die Spuren A–D stellen Transformanten dar, die durch die oben beschriebenen Verfahren erhalten werden. Die Zahlen an der Seite des Autoradiogramms stellen die Größen der Molekulargewichtsmarker dar. Wie aus diesem Autoradiogramm erkennbar, enthält Spur D nicht die 6,5 kb CHBI-Bande – ein Indikator, dass dieses Gen im Transformanten durch Integration des DNA-Fragments aus dem cbh1-Gen vollständig deletiert war. Der cbh1-deletierte Stamm wird als p37PΔCBHI bezeichnet. 2 zeigt die Deletion des T. reesei cbh1-Gens mittels Integration durch ein doppeltes Crossover-Ereignis des größeren EcoRI-Fragments von pΔCBHIpyr4 am cbh1-Locus eines der T. reesei-Chromosomen. Die anderen analysierten Transformanten scheinen mit dem untransformierten Vergleichsstamm identisch zu sein.
• Beispiel 6
• Analyse der Transformanten mit plntCBHI
• Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 5 angewandt, außer dass die eingesetzte Sonde diesmal eine mit ³²P markierte plntCBHI-Sonde war. Diese Sonde ist ein pUC-artiges Plasmid, das ein 2 kb BgIII-Fragment aus dem cbh1-Locus innerhalb des in pUC4K::cbh1ΔH/H deletierten Bereichs enthielt. Zwei Proben wurden in diesem Beispiel getestet – eine Vergleichsprobe A, die der untransformierte Stamm CG69 war, und Probe B, der Transformant p37PΔCBHI. Wie aus 4 ersichtlich, enthielt Probe A das cbh1-Gen (angezeigt durch die Bande mit 6,5 kb); die Transformantenprobe B jedoch enthielt dieses Gen nicht und daher auch nicht das cbh1-Gen oder irgendwelche Sequenzen aus dem pUC-Plasmid.
• Beispiel 7
• Proteinsekretion durch Stamm P37PΔCBHI
• Sporen aus dem produzierten P37PΔCBHI-Stamm wurden in 50 ml eines Trichoderma-Basismediums mit 1% Glucose, 0,14% (NH₄)₂SO₄, 0,2% KH₂PO₄, 0,03% MgSO₄, 0,03% Harnstoff, 0,75% Bactotrypton, 0,05% Tween 80, 0,000016% CuSO₄·5H₂O, 0,001% FeSO₄·7H₂O, 0,000128% ZnSO₄·7H₂O, 0,0000054% Na₂MoO₄·2H₂O, 0,0000007% MnCl·4H₂O eingeimpft. Das Medium wurde unter 48-stündigem Schütteln in einem 250 ml-Kolben bei 37°C inkubiert. Das resultierende Myzel wurde mittels Filtration durch Miracloth (Calbiochem Corp.) gesammelt und zwei- oder dreimal mit 17 mM Kaliumphosphat gewaschen. Das Myzel wurde schließlich in 17 mM Kaliumphosphat mit 1 mM Sophorose suspendiert und 24 Stunden lang bei 30°C unter Schütteln inkubiert. Der Überstand von diesen Kulturen wurde gesammelt und das Myzel verworfen. Proben des Kulturüberstands wurden durch isoelektrisches Fokussieren unter Verwendung eines Pharmacia Phastgel-Systems und vorgefertigter Gele (pH-Wert 3–9) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert. Das Gel wurde mit Silberfarbe gefärbt, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Die dem cbh1-Protein entsprechende Bande fehlte in der Probe aus dem Stamm P37PΔCBHI, wie aus 5 ersichtlich. Das isolektrische Fokussiergel zeigt verschiedene Proteine in unterschiedlichen Kulturüberständen von T. reesei. Spur A ist teilgereinigte CBHI; Spur B ist der Überstand aus einer untransformierten T. reesei-Kultur; Spur C ist der Überstand aus Stamm P37PΔCBHI, der gemäß den Verfahren der Erfindung produziert wird. Die Position verschiedener Cellulase-Komponenten sind markiert: CBHI, CBHII, EGI, EGII und EGIII. Da CBHI 50% des gesamten extrazellulären Proteins ausmacht, handelt es sich um das wesentliche sekretierte Protein und somit um die dunkelste Bande auf dem Gel. Das isoelektrische Fokussiergel zeigt klar das Verschwinden des CBHI-Proteins im P37PΔCBHI-Stamm.
• Beispiel 8
• Herstellung von pPΔCBHII
• Das cbh2-Gen von T. reesei, das für das CBHII-Protein kodiert, wurde als 4,1 kb-EcoRI-Fragment genomischer DNA kloniert, das schematisch in 6A gezeigt wird (Chen et al., Biotechnoogy 5, 274–278 (1987)). Dieses 4,1 kb-Fragment wurde zwischen den EcoRI-Stellen von pUC4XL insertiert. Das letztere Plasmid ist ein pUC-Derivat (konstruiert von R. M. Berka, Genencor International Inc.), das eine Mehrfach-Klonierungsstelle mit einem symmetrischen Muster an Restriktionsendonuklease-Stellen enthält, die in der hier angegebenen Reihenfolge angeordnet sind: EcoRI, BamHI, SacI, SmaI, HindIII, XhoI, BglII, ClaI, BglII, XhoI, HindIII, SmaI, SacI, BamHI, EcoRI. Unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren wurde ein Plasmid, pPΔCBHII (6B), konstruiert, worin ein 1,7 kb großer zentraler Bereich dieses Gens zwischen einer HindIII-Stelle (74 bp 3' von der CBHII-Translationsinitiations-Stelle) und einer ClaI-Stelle (265 bp 3' vom letzten Codon von CBHII) entfernt und durch ein 1,6 kb großes HindIII-ClaI-DNA-Fragment ersetzt wurde, welches das T. reesei pyr4-Gen enthielt.
• Das T. reesei pyr4-Gen wurde aus pTpyr2 (siehe Beispiel 2) auf einem 1,6 kb-NheI-SphI-Fragment herausgespalten und zwischen die SphI- und XbaI-Stellen von pUC219 insertiert (siehe Beispiel 23), um p219M zu bilden (Smith et al., Curr. Genet 19, 27–33 (1991)). Das pyr4-Gen wurde dann als HindIII-ClaI-Fragment mit 7 bp DNA an einem Ende und 6 bp DNA am anderen Ende aus der pUC219-Mehrfach-Klonierungsstelle entfernt und in die HindIII- und ClaI-Stellen des cbh2-Gens insertiert, um das Plasmid pPΔCBHII zu bilden (siehe 6B).
• Die Spaltung dieses Plasmids mit EcoRI setzt ein Fragment mit 0,7 bp flankierender DNA aus dem cbh2-Locus an einem Ende, 1,7 kb flankierender DNA aus dem cbh2-Locus am anderen Ende und dem T. reesei pyr4-Gen in der Mitte frei.
• Beispiel 9
• Deletion des cbh2-Gens in T. reesei-Stamm GC69
• Protoplasten von Stamm GC69 werden erzeugt und mit EcoRI-gespaltenem pPΔCBHII gemäß den in Beispiel 3 und 4 beschriebenen Verfahren transformiert. DNA aus den Transformanten wird mit EcoRI und Asp718 gespalten und Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Die DNA aus dem Gel wird auf einen Membranfilter geblottet und mit ³²P-markiertem pPΔCBHII gemäß den Verfahren in Beispiel 11 hybridisiert. Transformanten werden identifiziert, die eine einzige genau am cbh2-Locus integrierte Kopie des EcoRI-Fragments von pPΔCBHII aufweisen. Die Transformanten werden auch wie in Beispiel 7 in Schüttelkolben gezüchtet und das Protein in den Kulturüberständen durch isoelektrisches Fokussieren untersucht. Auf diese Weise werden T. reesei GC69-Transformanten erzeugt, die kein CBHII-Protein produzieren.
• Beispiel 10
• Erzeugung eines pyr4^–-Derivats von p37PΔCBHI
• Sporen des Transformanten (P37PΔCBHI), aus dem das cbh1-Gen deletiert worden war, wurden auf FOA-hältigem Medium verteilt. Ein pyr4^–-Derivat dieses Transformanten wurde anschließend durch die Verfahren aus Beispiel 1 erhalten. Dieser pyr4^–-Stamm wurde als p37PΔCBHIPyr^–26 bezeichnet.
• Beispiel 11
• Deletion des cbh2-Gens in einem zuvor cbh1-deletierten Stamm
• Protoplasten aus Stamm P37PΔCBHIPyr^–26 wurden erzeugt und mit EcoRI-gespaltenem pPΔCBHII gemäß den in Beispiel 3 und 4 beschriebenen Verfahren erzeugt.
• Gereinigte stabile Transformanten wurden wie in Beispiel 7 in Schüttelkolben kultiviert und das Protein in den Kulturüberständen durch isoelektrisches Fokussieren untersucht. Ein Transformant (als P37PΔΔCBH67 bezeichnet) wurde identifiziert, der kein CBHII-Protein erzeugte. Spur D in 5 zeigt den Überstand eines sowohl cbh1- als auch cbh2-Gen-deletierten Transformanten (erzeugt gemäß den Verfahren der Erfindung).
• DNA wurde aus Stamm p37PΔΔCBH67 extrahiert, mit EcoRI und Asp718 gespalten und Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Die DNA aus diesem Gel wurde auf ein Membranfilter geblottet und mit ³²P-markiertem pPΔCBHII hybridisiert (7). Spur A in 7 zeigt das Hybridisierungsmuster, das für DNA aus einem untransformierten T. reesei-Stamm beobachtet wird. Es wurde das 4,1 kb EcoRI-Fragment beobachtet, welches das cbh2-Gen der Wildform enthielt. Spur B zeigt das für Stamm P37PΔΔCBH67 beobachtete Hybridisierungsmuster. Die einzelne 4,1 kb-Bande war eliminiert und durch zwei Banden von etwa 0,9 bzw. 3,1 kb ersetzt. Dies ist das erwartete Muster, wenn eine einzelne Kopie des EcoRI-Fragments von pPΔCBHII genau am cbh2-Locus integriert war.
• Die gleichen DNA-Proben wurden auch mit EcoRI gespalten und Southern Blot-Analyse wie oben durchgeführt. In diesem Beispiel war die Sonde mit ³²P markiertes plntCBHII. Dieses Plasmid enthält einen Abschnitt der cbh2-Gen-Kodiersequenz aus jenem Segment des cbh2-Gens, das in Plasmid pPΔCBHII deletiert wurde. Es wurde keine Hybridisierung mit DNA aus Stamm P37PΔΔCBH67 festgestellt, was anzeigte, dass das cbh2-Gen deletiert und keine Sequenzen aus dem pUC-Plasmid in diesem Stamm vorhanden waren.
• Beispiel 12
• Konstruktion von pEGIpyr4
• Das T. reesei eglI-Gen, das für EGI kodiert, wurde als 4,2 kb HindIII-Fragment genomischer DNA aus Stamm RL-P37 durch Hybridisierung mit Oligonukletoiden kloniert, die gemäß der veröffentlichten Sequenz synthetisiert wurden (Penttila et al., Gene 45, 253–263 (1986); van Arsdell et al., Bio/Technology 5, 60–64 (1987)). Ein 3,6 kb HindIII-BamHI-Fragment wurde aus diesem Klon genommen und mit einem 1,6 kb-HindIII-BamHI-Fragment ligiert, welches das T. reesei pyr4-Gen aus pTpyr2 (siehe Beispiel 2) und pUC218 (identisch mit pUC219, siehe Beispiel 23, jedoch mit der Mehrfach-Klonierungsstelle in entgegengesetzter Ausrichtung) enthielt, das mit HindIII gespalten war, um das Plasmid pEGIpyr4 zu ergeben (8). Die Spaltung von pEGIpyr4 mit HindIII setzte ein DNA-Fragment frei, das nur T. reesei-Genom-DNA (die egl1- und pyr4-Gene) enthielt – mit Ausnahme von 24 bp sequenzierter synthetischer DNA zwischen den zwei Genen und 6 bp sequenzierter synthetischer DNA an einem Ende (siehe 8).
• Beispiel 13 veranschaulicht die Isolierung der Komponenten von Cytolase 123-Cellulase (einer vollständigen Pilz-Cellulase-Zusammensetzung aus Trichoderma reesei, erhältlich bei Genencor International, Inc., South San Francisco, CA, USA) durch Reinigungsverfahren.
• Beispiel 13
• Reinigung von Cytolase 123-Cellulase zu Cellulase-Komponenten
• CYTOLASE 123-Cellulase wurde in folgender Weise fraktioniert. Die normale Verteilung der Cellulase-Komponenten in diesem Cellulase-System ist wie folgt:

  CBHI	45–55 Gew.-%
  CBHII	13–15 Gew.-%
  EGI	11–13 Gew.-%
  EGII	8–10 Gew.-%
  EGIII	1–4 Gew.-%
  BG	0,5–1 Gew.-%

• Die Fraktionierung erfolgte unter Verwendung von Säulen, welche die folgenden Harze enthielten: Sephadex G-25-Gelfiltrationsharz von der Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA), QA Trisacryl M-Anionenaustauschharz und SP Trisacryl M-Kationen-austauschharz von IBF Biotechnics (Savage, MD, USA). CTYOLASE 123-Cellulase, 0,5 g, wurde unter Verwendung einer Säule aus 3 l Sephadex G25-Gelfiltrationsharz mit 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,8 entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde dann auf eine Säule aus 20 ml QA Triacryl M-Anionenaustauschharz geladen. Die an diese Säule gebundene Fraktion enthielt CBHI und EGI. Diese Komponenten wurden durch Gradientenelution mittels eines wässrigen Gradienten aufgetrennt, der von 0 bis etwa 500 mM Natriumchlorid enthielt. Die nicht an diese Säule gebundene Fraktion enthielt CBHII und EGII. Diese Fraktionen wurden mittels einer Säule aus Sephadex G-25-Gelfiltrationsharz (äquilibriert mit 10 mM Natriumcitrat, pH 3,3) entsalzt. Diese Lösung (200 ml) wurde dann auf eine Säule aus 20 ml SP Triasacryl M-Kationenaustauschharz geladen. CBHII und EGII wurden unter Verwendung eines wässrigen Gradienten, der 0 bis etwa 200 mM Natriumchlorid enthielt, getrennt eluiert.
• Unter Anwendung einer ähnlichen Vorgangsweise wie in Beispiel 13 zählen zu anderen Cellulase-Systeme, die in ihre Komponenten aufgetrennt werden können, CELLUCAST (erhältlich bei Novo Industry, Kopenhagen, Dänemark), RPIDASE (erhältlich bei Gist Brocades, N. V., Delft, Holland) und Cellulase-Systeme, die von Trichoderma koningii, Penicillum sp. und dergleichen abgeleitet wurden.
• Beispiel 14
• Reinigung von EGIII aus Cytolase 123-Cellulase
• Obiges Beispiel 13 veranschaulichte die Isolierung mehrerer Komponenten aus Cytolase 123-Cellulase. Da jedoch EGIII in sehr geringen Mengen in Cytolase 123-Cellulase enthalten ist, wurde die folgende Vorgangsweise gewählt, um diese Komponente zu isolieren.
• A. Extraktion von EGIII-Cellulase-Enzym in großem Maßstab
• 100 l zellfreies Cellulasefiltrat wurden auf etwa 30°C erwärmt. Das erwärmte Material wurde auf etwa 4% (w/v) PEG 8000 (Polyethylenglykol, MG etwa 8000) und etwa 10% (w/v) wasserfreies Natriumsulfat gebracht. Das Gemisch bildete ein zweiphasiges flüssiges Gemisch. Die Phasen wurden mittels einer SA-1-Scheibenstapelzentrifuge getrennt. Die Phasen wurden mittels isoelektrischer Silberfärbungs-Fokussiergele analysiert. Die Fraktionierung und Anreicherung wurden für EGIII und Xylanase durchgeführt. Die gewonnene Zusammensetzung enthielt etwa 20 bis 50 Gew.-% EG III.
• Betreffend das obige Verfahren führte die Verwendung von Polyethylenglykol mit einem deutlich niedrigeren Molekulargewicht als etwa 8000 zu unzureichender Trennung, während die Verwendung von Polyethylenglykol mit einem deutlich höheren Molekulargewicht als etwa 8000 zum Ausschluss der gewünschten Enzyme in der gewonnenen Zusammensetzung führte. In Bezug auf die Menge an Natriumsulfat bewirkten Natriumsulfat-Mengen von deutlich mehr als etwa 10% (w/v) Fällungsprobleme, während Natriumsulfat-Mengen von deutlich weniger als etwa 10% (w/v) eine schlechte Trennung oder das Problem ergab, dass die Lösung in einer einzigen Phase verblieb.
• B. Reinigung von EGIII mittels Fraktionierung
• Die Reinigung von EGIII erfolgt durch Fraktionierung aus einer vollständigen Pilz-Cellulase-Zusammensetzung (CYTOLASE 123-Cellulase, im Handel von Genencor International, South San Francisco, CA, USA, erhältlich), die von Trichoderma reesei der Wildform produziert wird. Genauer gesagt erfolgt die Fraktionierung mit Säulen, welche die folgenden Harze enthielten: Sephadex G-25-Gelfiltrationsharz von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA), QA Trisacryl M-Anionenaustauschharz und SP Trisacryl M-Kationenaustauschharz von IBF Biotechnics (Savage, MD, USA). CTYOLASE 123-Cellulase, 0,5 g, wird unter Verwendung einer Säule aus 3 l Sephadex G-25-Gelfiltrationsharz mit 10 mM Natriumsphosphatpuffer bei pH 6,8 entsalzt. Die entsalzte Lösung wird dann auf eine Säule aus 20 ml QU Trisacryl M-Anionenaustauschharz aufgebracht. Die an diese Säule gebundene Fraktion enthält CBHI und EGI. Die nicht an diese Säule gebundene Fraktion enthält CBHII, EGII und EGIII. Diese Fraktionen werden unter Verwendung einer Säule aus Sephadex G-25-Gelfiltrationsharz (äquilibriert mit 10 mM Natriumcitrat, pH 4,5) entsalzt. Diese Lösung (200 ml) wird dann auf eine Säule aus 20 ml SP Trisacryl M-Kationenaustauschharz geladen. EGIII wurde mit 100 ml einer wässrigen Lösung von 200 mM Natriumchlorid eluiert.
• Um die Effizienz der Isolierung von EGIII zu verbessern, kann es wünschenswert sein, Trichoderma reesei zu verwenden, das genetisch modifiziert wurde, um EGIII überzuexprimieren und/oder nicht imstande zu sein, eine oder mehrere der Komponenten EGI, EGII, CBHI und/oder CBHII zu produzieren. Dies führt unweigerlich zu einer wirksameren Isolierung von EGIII durch beispielsweise Fraktionierung und/oder PEG-Extraktion, wie oben beschrieben.
• Es kann ebenso wünschenswert sein, dass die oben beschriebenen EGIII-Zusammensetzungen weiter gereinigt werden, um im Wesentlichen reine EGIII-Zusammensetzungen zu liefern, d. h. Zusammensetzungen, die EGIII in einer größeren Menge als etwa 80 Gew.-% des Proteins enthalten. Beispielsweise kann ein solches im Wesentlichen reines EGIII-Protein durch Verwendung von Material aus Verfahren A in Verfahren B oder umgekehrt erhalten werden. Die weitere Fraktion erfolgte auf einem FPLC-System unter Verwendung einer Mono-S-HR 5/5-Säule (erhältlich bei Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ, USA). Das FPLC-System besteht aus einem Flüssigchromatographie-Regler, zwei Pumpen, einem Zweiwegmonitor, einem Fraktionssammler und einem Bandschreiber (alle von Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ, USA erhältlich). Die Fraktionierung erfolgte durch Entsalzen von 5 ml der EGIII-Probe (unter Punkt B von Beispiel 14 erzeugt) mit einer 20 ml-Sephadex G-25-Säule, die zuvor mit 10 mM Natriumcitrat, pH 4, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit 0–200 mM wässrigem NaCl-Gradienten mit einer Rate von 0,5 ml/min eluiert, wobei Proben in 1 ml-Fraktionen abgenommen wurden. EGIII wurde in Fraktionen 10 und 11 gewonnen und war laut SDS-Gelelektrophorese zu mehr als 90% rein. EGIII dieser Reinheit eignet sich zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz nach bekannten Verfahren.
• Im Wesentlichen reine EGIII- sowie EGI- und EGII-Komponenten, die gemäß obigem Beispiel 13 gereinigt werden, können in Verfahren der Erfindung einzeln oder in Gemischen eingesetzt werden. Diese EG-Komponenten besitzen die folgenden Eigenschaften:

  	MW	pl	pH-Optimum1
  EGI	~47–49 kD	4,7	~5
  EGII	~35 kD	5,5	~5
  EGIII	~25–28 kD	7,4	~5,5–6,0

  ¹pH-Optimum bestimmt durch RBB-CMC-Aktivität gemäß nachstehendem Beispiel 15
• Die Verwendung eines Gemisches dieser Komponenten in der Praxis der Erfindung kann eine synergistische Reaktion betreffend die Verbesserung von Weichheit, Farbechtheit/-wiederherstellung und/oder Griff gegenüber einer Einzelkomponente bewirw ken. Die Verwendung einer Einzelkomponente in der Praxis der Erfindung kann andererseits stabiler sein oder ein breiteres Aktivitätsspektrum in einem Bereich von pH-Werten aufweisen. Beispielsweise zeigt nachstehendes Beispiel 15, dass EGIII unter alkalischen Bedingungen deutliche Aktivität gegen RBB-CMC aufweist.
• Beispiel 15
• Aktivität von Cellulase-Zusammensetzungen über einen pH-Bereich
• Die folgende Vorgansweise wurde gewählt, um die pH-Profile zweier unterschiedlicher Cellulase-Zusammensetzungen zu bestimmen. Die erste Cellulase-Zusammensetzung war eine CBHI- und II-deletierte Cellulase-Zusammensetzung aus Trichoderma reesei, welcher Stamm in ähnlicher Weise wie oben genetisch modifiziert war, um keine CBHI- und CBHII-Komponenten produzieren zu können. Da diese Cellulase-Zusammensetzung keine CBHI und CBHII enthält, die im Allgemeinen etwa 58 bis 70% einer Cellulase-Zusammensetzung aus Trichoderma reesei umfassen, ist sie notwendigerweise mit EG-Komponenten angereichert, d. h. EGI, EGII, EGIII und dergleichen.
• Die zweite Cellulase-Zusammensetzung war eine etwa zu 20–40% reine Fraktion von EGIII, isoliert aus einer Cellulase-Zusammensetzung aus Trichoderma reesei mittels Reinigungsverfahren ähnlich Punkt B) von Beispiel 14.
• Die Aktivität dieser Cellulase-Zusammensetzungen wurde bei 40°C bestimmt; die Bestimmungen erfolgten unter Anwendung folgender Vorgangsweise.
• Zugabe von 5 bis 20 μl einer geeigneten Enzymlösung mit einer Konzentration, die ausreicht, um die erforderliche Menge an Enzym in der endgültigen Lösung zu liefern. Zugabe von 250 μl 2 Gew.-% RBB-CMC (Remazol Brilliantblau R-Carboxymethylcellulose; im Handel bei MegaZyme, 6 Altona Place, North Rocks, N. S. W., 2151 Australien, erhältlich) in 0,05 M Citrat/Phosphat-Puffer bei pH 4; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5 und 8.
• Starkes Rühren und Inkubieren bei 40°C über einen Zeitraum von 30 min. 5- bis 10-minütiges Kühlen in einem Eisbad. Zugabe von 1000 μl Methylcellosolve, umfassend 0,3 M Natriumacetat und 0,02 M Zinkacetat. 5- bis 10-minütiges starkes Rühren und absetzen Lassen. Zentrifugieren und Überstand in Kuvetten gießen. Bestimmen der relativen Enzymaktivität durch Messen der optischen Dichte (CD) der Lösung in jeder Kuvette bei 590 nm. Höhere Werte der optischen Dichte entsprechen höheren Werten an Enzymaktivität.
• Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 9 dargestellt, welche die relative Aktivität der CBHI- und II-deletierten Cellulase-Zusammensetzung im Vergleich zur EGIII-Cellulase-Zusammensetzung veranschaulicht. Aus dieser Abbildung ist erkennbar, dass die CBHI- und CBHII-deletierte Cellulase-Zusammensetzung optimale cellulolytische Aktivität gegenüber RBB-CMC bei etwa pH 5,5 aufweist und bei alkalischen pH-Werten, d. h. bei pH-Werten von über 7 bis 8, etwas Aktivität aufweist. Die mit EG III angereicherte Cellulase-Zusammensetzung hingegen besitzt optimale cellulolytische Aktivität etwa bei pH 5,5–6 und signifikante Aktivität bei alkalischen pH-Werten.
• Beispiel 16
• Festigkeitsverlust-Assay im Testwäscher
• Cellulase-Zusammensetzungen
• Ziel dieses Beispiels ist es, die Fähigkeit verschiedener Cellulase-Zusammensetzungen zu untersuchen, die Festigkeit baumwollhaltiger Gewebe zu verringern. Da die Aktivität der meisten Cellulase-Komponenten aus Trichoderma reesei bei oder nahe bei pH 5 am höchsten ist, sind die Ergebnisse des Festigkeitsverlusts am auffälligsten, wenn der Assay etwa bei diesem pH-Wert durchgeführt wird. Man geht allerdings davon aus, dass die bei pH 5 erzielten Ergebnisse mit den Ergebnissen des Festigkeitsverlusts korrelieren, die bei anderen pH-Werten erzielt werden, weshalb sie die relative Fähigkeit zu Festigkeitsverlust der analysierten Cellulase-Komponenten anzeigen.
• Genauer gesagt war in diesem Beispiel die erste analysierte Cellulase-Zusammensetzung eine vollständige Pilz-Cellulase-Zusammensetzung (Cytolase 123-Cellulase, im Handel bei Genencor International, South San Francisco, CA, USA, erhältlich), die von Trichoderma reesei der Wildform produziert wird und als GC010 bezeichnet wird.
• Die zweite analysierte Cellulase-Zusammensetzung war eine CBHII-deletierte Cellulase-Zusammensetzung aus Trichoderma reesei, die in ähnlicher Weise wie in den obigen Beispielen 1–12 und nachfolgenden Beispielen 20–28 genetisch modifiziert ist, um CBHII nicht exprimieren zu können, und als CBHIId bezeichnet wird. Da CBHII bis zu etwa 15% der Cellulase-Zusammensetzung ausmacht, führt die Deletion dieser Komponente zu größeren Mengen an CBHII und aller EG-Komponenten.
• Die dritte analysierte Cellulase-Zusammensetzung war eine CBHI- und CBHII-deletierte Cellulase-Zusammensetzung aus Trichoderma reesei, die – in ähnlicher Weise wie oben beschrieben – genetisch modifiziert war, um CBHI und CBHII nicht exprimieren zu können, und als CBHI/IId bezeichnet wird. Da CBHI und CBHII bis zu etwa 70% der Cellulase-Zusammensetzung ausmachen, führt die Deletion dieser Komponente zu größeren Mengen aller EG-Komponenten.
• Die letzte analysierte Cellulase-Zusammensetzung war eine CBHI-deletierte Cellulase-Zusammensetzung aus Trichoderma reesei, die – in ähnlicher Weise wie oben beschrieben – genetisch modifiziert war, um keine CBHI exprimieren zu können, und als CBHId bezeichnet wird. Da CBHI bis zu etwa 55% der Cellulase-Zusammensetzung ausmacht, führt die Deletion dieser Komponente zu größeren Mengen von CBHII und aller EG-Komponenten.
• Die oben beschriebenen Cellulase-Zusammensetzungen wurden hinsichtlich ihres Einflusses auf den Festigkeitsverlust baumwollhaltiger Gewebe in einem Waschautomat untersucht. Die Zusammensetzungen wurden zunächst normalisiert, sodass gleiche Mengen an EG-Komponenten eingesetzt wurden. Jede Cellulase-Zusammensetzung wurde dann getrennten Lösungen von 400 ml eines 20 mM Citrat/Phosphat-Puffers, auf pH 5 titriert, umfassend 0,5 ml eines nichtionogenen Tensids, zugegeben. Jeder der erhaltenen Lösungen wurde in einen eigenen Testwäscher-Kanister gefüllt. In diese Kanister wurden einige Murmeln eingefüllt, um den Festigkeitsverlust zu erhöhen, und auch ein 16 × 20 Zoll großes Baumwollgewebe (100% Baumwollgewebe, erhältlich als Style Nr. 467 bei Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846, USA) zugegeben. Der Kanister wurde dann verschlossen und in ein bei 43°C gehaltenes Testwäscherbad abgesenkt. Der Kanister wurde dann bei einer Geschwindigkeit von fast 40 U/min etwa 1 h lang im Bad gedreht. Danach wurde das Gewebe entfernt, gut gespült und in einem herkömmlichen Trockner getrocknet.
• Um die Ergebnisse des Festigkeitsverlusts zu maximieren, wurde die obige Vorgangsweise zweimal wiederholt; nach der dritten Behandlung wurden die Baumwollgewebe entnommen und hinsichtlich des Festigkeitsverlusts untersucht. Der Festigkeitsverlust wurde durch Bestimmen der Zugfestigkeit in Fertigungsrichtung (”fill-direction tensile strength”, FTS) unter Verwendung eines Instron-Testgeräts gemessen; die Ergebnisse wurden mit der FTS des Gewebes verglichen, das in der gleichen Lösung behandelt wurde, außer dass keine Cellulase zugegeben wurde. Die Ergebnisse dieser Analyse werden als prozentueller Festigkeitsverlust angegeben, der wie folgt berechnet wird: Prozentueller Festigkeitsverlust = 100 × [1 – (FTS mit Cellulase/FTS ohne Cellulase)]
• Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 10 dargestellt, die zeigt, dass Zusammensetzungen mit CBHI, d. h. vollständige Cellulase (GC010) und CBHII-deletierte Cellulase, den größten Festigkeitsverlust ergaben, während die Zusammensetzungen ohne CBHI einen deutlich geringeren Festigkeitsverlust ergaben als vollständige Cellulase und CBHII-deletierte Cellulase. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Gegenwart von CBHI in einer Cellulase-Zusammensetzung für die Zusammensetzung einen höheren Festigkeitsverlust bedeutet als für eine ähnliche Zusammensetzung ohne CBHI.
• Ebenso zeigen diese Ergebnisse, dass CBHII einen bestimmten Einfluss auf den Festigkeitsverlust ausübt.
• Wenn angesichts dieser Ergebnisse Festigkeitsverlust-resistente Cellulase-Zusammensetzungen gewünscht werden, sollten solche Zusammensetzungen frei von allen CBHI-Typ-Cellulase-Komponenten und vorzugsweise allen CBH-Typ-Cellulase-Komponenten sein. In dieser Hinsicht kann man davon ausgehen, dass mit EG angereicherte Cellulase-Zusammensetzungen zu sogar noch geringerem Festigkeitsverlust bei pH ≥ 7 führen als die bei pH 5 beobachteten und in 10 abgebildeten Ergebnisse.
• Beispiel 17
• Farbwiederherstellung
• Die Fähigkeit von mit EG angereicherter Cellulase, Farbe in baumwollhältigen Geweben wiederherzustellen, wurde in den folgenden Versuchen analysiert. Genauer gesagt ergibt sich die Notwendigkeit der Farbwiederherstellung eines getragenen Baumwollgewebes aus der Akkumulierung von Oberflächenfasern auf dem Gewebe im Laufe der Zeit. Diese Fasern führen zu einem verblassten und matten Aussehen des Gewebes, weshalb die Entfernung dieser Fasern eine notwendige Voraussetzung ist, um dem Gewebe die ursprünglichen kräftigen Farben wieder zu verleihen. Die vorliegenden Versuche ermitteln demnach die Fähigkeit einer Cellulase-Zusammensetzung zur Farbwiederherstellung, indem die Fähigkeit der Cellulase-Zusammensetzung gemessen wird, Oberflächenfasern zu entfernen.
• Der erste Versuch misst die Fähigkeit eines vollständigen Cellulase-Systems (CYTOLASE 123-Cellulase, im Handel bei Genencor International, South San Francisco, CA, USA erhältlich), von Trichoderma reesei der Wildform produziert, Oberflächenfasern aus einem baumwollhältigen Gewebe bei verschiedenen pH-Werten zu entfernen. Diese Cellulase wurde auf ihre Fähigkeit getestet, Oberflächenfasern in einem Testwäscher zu entfernen. Die geeignete Menge an Cellulase, um entweder 25 oder 100 ppm Cellulase in der Endzusammensetzung zu ergeben, wurde getrennten Lösungen von 400 ml eines 20 mM Citrat/Phosphat-Puffers, umfassend 0,5 ml eines nichtionogenen Tensids, zugegeben. Proben wurden gezogen und titriert, um Proben bei pH 5, pH 6, pH 7 und pH 7,5 bereitzustellen. Jede der resultierenden Lösungen wurde dann in einen getrennten Testwäscher-Kanister gefüllt. Diesen Kanistern wurden auch Murmeln zwecks Unterstützung der Faserentfernung und ein 7 × 5 Zoll großes Baumwollgewebe (100% Baumwolle, erhältlich als Style Nr. 439W bei Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlexes, NJ 08846, USA) zugegeben.
• Der Kanister wurde dann verschlossen und in ein bei 43°C gehaltenes Testwäscherbad abgesenkt. Der Kanister wurde dann mit einer Geschwindigkeit von zumindest etwa 40 U/min 1 h lang im Bad gedreht. Anschließend wurde das Gewebe entfernt, gut ausgespült und in einem herkömmlichen Trockner getrocknet.
• Die so behandelten Gewebe wurde dann durch Bewertung in einem Bewertungstest hinsichtlich Faserentfernung analysiert. Insbesondere wurden die kodierten (d. h. unmarkierten) Gewebe von 6 Bewertern hinsichtlich Fasermengen beurteilt. Die Gewebe wurden visuell hinsichtlich Oberflächenfasern beurteilt und auf einer Skala von 0 bis 6 eingestuft. Die Skala umfasst 6 Standards, um sinnvolle Vergleiche zu ermöglichen. Die Standards waren wie folgt:

  Bewertung	Standard2
  0	Nicht mit Cellulase behandeltes Gewebe
  1	Mit 8 ppm Cellulase behandeltes Gewebe3
  2	Mit 16 ppm Cellulase behandeltes Gewebe
  3	Mit 20 ppm Cellulase behandeltes Gewebe
  4	Mit 40 ppm Cellulase behandeltes Gewebe
  5	Mit 50 ppm Cellulase behandeltes Gewebe
  6	Mit 100 ppm Cellulase behandeltes Gewebe

  ²In allen Standards war das Gewebe ein standardisiertes Testgewebe aus 100% Baumwollbahn (Style Nr. 439W; erhältlich bei Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846, USA).
  ³Für alle mit der gleichen Cellulase-Zusammensetzung behandelten Proben. Cellulase-Konzentrationen sind in Gesamt-Protein angegeben. Die Testwäscher-Behandlungsbedingungen sind die gleichen wie in obigem Beispiel 16.
• Das zu beurteilende Gewebe erhielt eine Bewertung, die einem der Standards sehr nahe kam. Nach der vollständigen Analyse der Gewebe wurden die jedem Gewebe von allen Bewertern zugewiesenen Werte addiert und ein Mittelwert berechnet.
• Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 11 angeführt. 11 veranschaulicht, dass beim gleichen pH-Wert eine dosisabhängige Reaktion in der Menge entfernter Fasern festgestellt wird. Beim gleichen pH-Wert lieferten die mit mehr Cellulase behandelten Gewebe höhere Mengen an Faserentfernung als mit weniger Cellulase behandelte Gewebe. Die Ergebnisse dieser Abbildung zeigen, dass auch bei höheren pH-Werten die Faserentfernung möglich ist, indem lediglich höhere Cellulase-Konzentrationen gewählt werden.
• In einem zweiten Versuch wurden zwei unterschiedliche Cellulase-Zusammensetzungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit der Faserentfernung verglichen. Genauer gesagt war die erste analysierte Cellulase-Zusammensetzung ein vollständiges Cellulase-System (CYTOLASE 123-Cellulase, im Handel bei Genencor International, South San Francisco, CA, USA erhältlich), produziert durch Trichoderma reesei der Wildform und als GC010 bezeichnet.
• Die zweite analysierte Cellulase-Zusammensetzung war eine CBHI- und CBHII-deletierte Cellulase-Zusammenstzung aus Trichoderma reesei, die – in ähnlicher Weise wie oben beschrieben – genetisch modifiziert war, um keine CBHI und CBHII produzieren zu können, und als CBHI/IId bezeichnet wird. Da CBHI und CBHII bis zu etwa 70% der Cellulase-Zusammensetzung ausmachen, führt die Deletion dieser Komponente zu größeren Mengen aller EG-Komponenten.
• Die Cellulase-Zusammensetzungen wurden zunächst normalisiert, sodass gleiche Mengen an EG-Komponenten eingesetzt wurden. Diese Zusammensetzungen wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, Oberflächenfasern in einem Testwäscher zu entfernen. Eine geeignete Cellulase-Menge, um die erforderlichen Konzentrationen an EG-Komponenten in den Endzusammensetzungen zu liefern, wurde getrennten Lösungen von 400 ml eines 20 mM Citrat/Phosphat-Puffers, umfassend 0,5 ml eines nichtionogenen Tensids, zugegeben. Proben wurden gezogen und auf pH 5 titriert. Jede der resultierenden Lösungen wurde dann in einen eigenen Testwäscher-Kanister gefüllt. Diesen Kanistern wurden Murmeln zur Steigerung der Faserentfernung sowie ein 7 × 5 Zoll großes Baumwollgewebe (100% Baumwolle, erhältlich als Style Nr. 439W bei Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846, USA) zugegeben. Der Kanister wurde dann verschlossen und in ein bei 43°C gehaltenes Testwäscherbad abgesenkt. Der Kanister wurde dann bei einer Geschwindigkeit von etwa 40 U/min etwa 1 h lang im Bad rotiert. Anschließend wurde das Gewebe entnommen, gut gespült und in einem herkömmlichen Trockner getrocknet.
• Die so behandelten Gewebe wurden dann durch Bewertung im oben beschriebenen Bewertungstest auf Faserentfernung analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 12 dargestellt. Speziell zeigt 12, dass sowohl GC010- als auch CBHI/IId-Cellulase-Zusammensetzungen bei Verwendung gleicher EG-Mengen im Wesentlichen identische Faserentfernungs-Ergebnisse lieferten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die EG-Komponenten für Faserentfernung sorgen. Diese Ergebnisse sowie jene aus 11 machen deutlich, dass EG-Komponenten Fasern sogar unter alkalischen Bedingungen entfernen können.
• Beispiel 18
• Tergotometer-Farbwiederherstellung
• Dieses Beispiel schließt an Beispiel 17 an und bekräftigt, dass CBH-Typ-Komponenten für die Farbwiederherstellung nicht notwendig sind. Ziel dieses Beispiels ist es, die Fähigkeit von Cellulase-Zusammensetzungen ohne CBH-Typ-Komponenten zu untersuchen, die Farbe baumwollhältiger Gewebe wiederherzustellen. Da die Aktivität der meisten von Trichoderma reesei abgeleiteten EG-Komponenten bei oder nahe bei pH 5 am höchsten ist, liefert die Farbwiederherstellung die auffälligsten Ergebnisse, wenn der Assay etwa bei diesem pH-Wert durchgeführt wird. Man ist jedoch der Auffassung, dass die bei pH 5 erzielten Ergebnisse mit den Ergebnissen der Farbwiederherstellung korrelieren, die bei anderen pH-Werten erhalten werden, weshalb sie Indikatoren der relativen Fähigkeit zur Farbwiederherstellung der analysierten Cellulase-Komponenten sind.
• Die in diesem Beispiel eingesetzte Cellulase-Zusammensetzung war eine CBHI- und CBHII-deletierte Cellulase-Zusammensetzung aus Trichoderma reesei, die – in ähnlicher Weise wie oben beschrieben – genetisch modifiziert war, um keine CBHI und CBHII produzieren zu können. Da CBHI und CBHII bis zu etwa 70% der Cellulase-Zusammensetzung ausmachen, bewirkt die Deletion dieser Komponente höhere Mengen aller EG-Komponenten.
• Der Assay wurde durchgeführt, indem eine ausreichende Konzentration dieser Cellulase-Zusammensetzung einem 50 mM Citrat/Phosphat-Puffer zugegeben wurde, um 500 ppm Cellulase zu ergeben. Die Lösung wurde auf pH 5 titriert und enthielt 0,1 Gew.-% nicht-ionogenes Tensid (Grescoterg GL100, im Handel bei Gresco Mfg., Thomasville, NC 27360, USA erhältlich). Ein verblasstes 10 × 10 Zoll großes baumwollhältiges Gewebe wurde in 1 l dieses Puffers gelegt, 30 min lang bei 110°C stehen gelassen und dann 30 min lang bei 100 U/min gerührt. Die Gewebe wurden dann aus dem Puffer entfernt, gewaschen und getrocknet. Die resultierenden Gewebe wurden dann mit dem Gewebe vor der Behandlung verglichen. Die Analysenergebnisse sind wie folgt:

  Baumwollhältiges Material	Ergebnis
  Getragenes Baumwoll-T-Shirt Baumwollstrick	Vorteile ersichtlich Vorteile ersichtlich

• Der Ausdruck ”Vorteile ersichtlich” bedeutet, dass gegenüber dem nichtbehandelten Gewebe die Farbe des behandelten Gewebes besser wiederhergestellt war (d. h. das Gewebe war weniger verblasst). Diese Ergebnisse bekräftigen jene von Beispiel 17, wonach die Gegenwart von CBH-Typ-Komponenten für die Farbwiederherstellung verblasster baumwollhältiger Gewebe nicht notwendig ist.
• Beispiel 19
• Weichheit
• Diese Beispiel veranschaulicht, dass die Gegenwart von CBH-Typ-Komponenten nicht entscheidend ist, um baumwollhältigen Geweben verbesserte Weichheit zu verleihen. Genauer gesagt verwendet dieses Beispiel eine Cellulase-Zusammensetzung aus Trichoderma reesei, die in oben beschriebener Art genetisch modifiziert ist, um keine CBHI- und II-Komponenten produzieren zu können.
• Diese Cellulase-Zusammensetzung wurde auf ihre Fähigkeit untersucht, Frotteetücher weich zu machen. Nicht erweichte Frotteetücher (8,5 Unzen, 14 × 15 Zoll; erhältlich als Style Nr. 420NS bei Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846, USA) wurden in 7 × 7,5 Zoll große Stoffproben geschnitten.
• Die oben beschriebene Cellulase-Zusammensetzung wurde auf ihre Fähigkeit untersucht, diese Stoffproben in einem Testwäscher weich zu machen. Eine geeignete Menge an Cellulase, um 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm und 10 ppm Cellulase in der endgültigen Cellulase-Lösung zu ergeben, wurde getrennten Lösungen von 400 ml eines 20 mM Citrat/Phosphat-Puffers, umfassend 0,025 Gew.-% eines nichtionogenen Tensids (Triton X114), zugegeben. Außerdem wurde eine Blindprobe laufen gelassen, welche die gleiche Lösung, jedoch ohne zugegebene Cellulase enthielt. Die so gezogenen Proben wurden auf pH 5 titriert. Jede der resultierenden Lösungen wurde dann einem eigenen Testwäscher-Kanister zugegeben. Diesen Kanistern wurden zwecks Verbesserung der Weichheit Murmeln sowie Baumwollstoffproben zugegeben. Alle Bedingungen wurden mit zwei Stoffproben pro Kanister je dreimal untersucht. Jeder Kanister wurde verschlossen und in ein bei 37°C gehaltenes Testwäscherbad abgesenkt. Der Kanister wurde dann bei einer Geschwindigkeit von zumindest etwa 40 U/min etwa 1 h lang im Bad rotiert. Danach wurden die Stoffproben entnommen, gut gespült und in einem herkömmlichen Trockner getrocknet.
• Die Stoffproben wurden durch Bewertung in einem Präferenzversuch auf Weichheit analysiert. 6 Bewerter erhielten ihre eigenen Sätze an Stoffproben und wurden gebeten, ihre Weichheit auf der Grundlage von Weichheitskriterien wie z. B. Geschmeidigkeit des gesamten Gewebes zu beurteilen. Mit den fünf unterschiedlichen Enzymkonzentrationen behandelte Stoffproben und die Blindprobe wurden hinter einen Schirm gelegt und die Bewerter gebeten, sie von der härtesten bis zur weichsten zu ordnen. Auf der Basis der relativen Reihenfolge der einzelnen Stoffproben wurden jeder Stoffprobe Noten verliehen, wobei 5 am weichsten und 0 am härtesten ist. Die Beurteilungen aller Bewerter wurden zusammengezählt und dann gemittelt.
• Die Ergebnisse dieser Mittelwertbildung sind in 13 dargelegt. Genauer gesagt zeigen diese Ergebnisse, dass bei höheren Cellulase-Konzentrationen die Weichheit verbessert wird. Man beachte, dass diese verbesserte Weichheit in Abwesenheit von CBH-I oder -II in der Cellulase-Zusammensetzung erzielt wird.
• Im Hinblick auf diese Ergebnisse kann man davon ausgehen, dass sich bei niedrigeren Konzentrationen der Cellulase-Zusammensetzung die verbesserte Weichheit bei wiederholtem Waschen zeigt.
• Hinsichtlich der Beispiele 16–19 könnten mit EG-Typ-Komponenten aus anderen Mikroorganismen als Trichoderma reesei angereicherte Cellulase-Zusammensetzungen anstelle der in diesen Beispielen beschriebenen Cellulase-Zusammensetzungen eingesetzt werden. Insbesondere ist die Quelle der mit EG-Typ-Komponenten angereicherten Cellulase-Zusammensetzung für die Erfindung nicht entscheidend – jede mit EG-Typ-Komponenten angereicherte Pilz-Cellulase-Zusammensetzung kommt in Frage. Beispielsweise können Pilz-Cellulasen zur Verwendung bei der Herstellung der in der Erfindung eingesetzten Pilz-Cellulase-Zusammensetzungen aus Trichoderma koningii, Penicillum sp. und dergleichen oder im Handel erhältliche Cellulasen eingesetzt werden, d. h. CELLUCLAST (erhältlich bei Novo Industry, Kopenhagen, Dänemark), RAPIDASE (erhältlich bei Gist Brocades, N. V., Delft, Holland) und dergleichen.
• Beispiel 20
• Transformanten von Trichoderma reesei mit dem Plasmid pEGIpyr4
• Ein pyr4-defizientes Derivat von T. reesei-Stamm RutC30 (Sheir-Neiss und Montenecourt, Appl. Microbiol. Biotechnol. 20, 46–53 (1984)) wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebene Verfahren gewonnen. Protoplasten dieses Stamms wurden mit ungespaltenem pEGIpyr4 transformiert und stabile Transformanten gereinigt.
• Fünf dieser Transformanten (als EP2, EP4, EP5, EP6, EP11 bzeichnet) sowie untransformierter RutC30 wurden in 40 ml YEG-Medium (Hefeextrakt, 5 g/l; Glucose, 20 g/l) in 250 ml-Schüttelkolben eingeimpft und unter zweitägigem Rühren bei 28°C kultiviert. Das resultierende Myzel wurde mit sterilem Wasser gewaschen und 50 ml TSF-Medium zugegeben (0,05 M Citrat/Phosphat-Puffer, pH 5,0; mikrokristalline Avicel-Cellulose, 10 g/l KH₂PO₄, 2,0 g/l; (NH₄)₂SO₄, 1,4 g/l; Proteose-Pepton, 1,0 g/l; Harnstoff, 0,3 g/l; MgSO₄·7H₂O, 0,3 g/l; CaCl₂, 0,3 g/l; FeSO₄·7H₂O, 5,0 mg/l; MnSO₄·H₂O, 1,6 mg/l; ZnSO₄, 1,4 mg/l; CoCl₂, 2,0 mg/l; 0,1% Tween 80). Diese Kulturen wurden unter Schütteln weiter 4 Tage lang bei 28°C inkubiert. Proben des Überstands wurden aus diesen Kulturen gezogen und Assays zur Messung der Gesamtmenge an Protein und der Endoglucanase-Aktivität wie unten beschrieben durchgeführt.
• Der Endoglucanase-Assay beruhte auf der Freisetzung löslicher gefärbter Oligosaccharide aus Remazol Brilliantblau-Carboxymethylcellulose (RBB-CMC von Mega-Zyme, North Rocks, NSW, Australien). Das Substrat wurde gebildet, indem 2 g trockene RBB-CMC 80 ml gerade aufgekochtem entionisiertem Wasser unter kräftigem Rühren zugegeben wurden. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 5 ml 2 M Natriumacetatpuffer (pH 4,8) zugegeben und der pH-Wert auf 4,5 eingestellt. Das Volumen wurde schließlich mit entionisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt und Natriumazid bis zu einer Endkonzentration von 0,02% zugegeben. Aliquote der T. reesei-Vergleichskultur, pEGIpyr4-Transformantenkultur-Überstand oder 0,1 M Natriumacetat als Blindprobe (10–20 μl) wurden in Röhrchen gefüllt, 250 μl Substrat zugegeben und die Röhrchen 30 min lang bei 37°C inkubiert. Die Röhrchen wurden 10 min lang auf Eis gelegt und 1 ml kaltes Fällungsmittel (3,3% Natriumacetat, 0,4% Zinkacetat, pH 5 mit HCl, 76% Ethanol) zugegeben. Die Röhrchen wurden durchmischt und vor dreiminütigem Zentrifugieren bei etwa 13.000 × g 5 min absetzen gelassen. Die optische Dichte wurde spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 590–600 nm gemessen.
• Der angewendete Proteinassay war der BCA-Assay (Bicinchoninsäure-Assay) unter Verwendung von Reagenzien von Pierce, Rockford, Illinois, USA. Der Standard war Rinderserumalbumin (BSA). BCA-Reagens wurde durch Vermischen von 1 Teil Reagens B mit 50 Teilen Reagens A gebildet. 1 ml des BCA-Reagens wurde mit 50 μl entsprechend verdünntem BSA oder Testkulturüberstand vermischt. Die Inkubation dauerte 30 min bei 37°C, und die optische Dichte wurde schließlich spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 562 nm gemessen.
• Die Ergebnisse der oben beschriebenen Assays sind in Tabelle 1 angführt. Es ist offenkundig, dass einige der Transformanten höhere Endoglucanase-Aktivität bewirkten als der untransformierte Stamm RutC30. Man geht davon aus, dass die Endoglucanasen und Exocellobiohydrolasen, die von untransformiertem T. reesei produziert werden, etwa 20 bzw. 70% der Gesamtmenge an sekretiertem Protein ausmachen. Daher kann man erwarten, dass ein Transformant wie etwa EP5, der etwa viermal soviel Endoglucanase produziert wie Stamm RutC30, etwa gleiche Mengen an Endoglucanase-Typ- und Exocellobiohydrolase-Typ-Proteinen sekretiert.
• Die in diesem Beispiel beschriebenen Transformanten wurden unter Verwendung von intaktem pEGIpyr4 erhalten und enthalten im Genom integrierte DNA-Sequenzen, die vom pUC-Plasmid abgeleitet waren. Vor der Transformation wäre es möglich, pEGIpyr4 mit HindIII zu spalten und das größere, nur T. reesei-DNA enthaltende DNA-Fragment zu isolieren. Die Transformation von T. reesei mit diesem isolierten DNA-Fragment würde die Isolierung von Transformanten ermöglichen, die EGI überproduzieren und mit Ausnahme der zwei kurzen Abschnitte synthetischer DNA aus 8 keine heterologen DNA-Sequenzen enthalten. Es wäre auch möglich, pEGIpyr4 zu verwenden, um einen Stamm zu transformieren, bie dem entweder das cbh1-Gen, das cbh2-Gen oder beide Gene deletiert sind. Auf diese Weise könnte ein Stamm konstruiert werden, der EGI überproduzieren oder entweder begrenzte Mengen von oder überhaupt keine Exocellobiohydrolasen produzieren würde.
• Die Verfahren aus Beispiel 20 könnten dazu dienen, T. reesei-Stämme zu erzeugen, die beliebige andere Cellulase-Komponenten, Xylanase-Komponenten oder andere normalerweise von T. reesei produzierte Proteine überproduzieren würden. TABELLE 1

  Sekretierte Endoglucanase-Aktivität bei T. reesei-Transformanten
  	A	B
  STAMM	ENDOGLUCANASE-AKTIVITÄT (O. D. BEI 590 ml)	PROTEIN (mg/ml)	A/B
  RutC30	0,32	4,0	0,078
  EP2	0,70	3,7	0,189
  EP4	0,76	3,65	0,208
  EP5	1,24	4,1	0,302
  EP6	0,52	2,93	0,177
  EP11	0,99	4,11	0,241

• Die obigen Ergebnisse sollen die Überproduktion der EGI-Komponente im Verhältnis zum Gesamtprotein und nicht das Ausmaß der Überproduktion veranschaulichen.
• Man kann im Übrigen davon ausgehen, dass das Ausmaß der Überproduktion je nach Experiment unterschiedlich ist.
• Beispiel 21
• Konstruktion von pCEPC1
• Es wurde ein Plasmid (pCEPC1) konstruiert, in dem die Kodiersequenz für EGI mit dem Promotor aus dem cbh1-Gen funktionell fusioniert war. Dies wurde mittels stellenspezifischer in vitro-Mutagenese erreicht, um die DNA-Sequenz für das cbh1- und egl1-Gen zu verändern und geeignete Restriktionsendonuklease-Spaltstellen 5' stromauf von deren jeweiligen Translationsinitiationsstellen zu schaffen. Die DNA-Sequenzanalyse erfolgte, um die erwartete Sequenz an der Verbindungsstelle zwischen den zwei DNA-Segmenten zu verifizieren. Die jeweils durchgeführten Änderungen sind aus 14 ersichtlich.
• Die DNA-Fragmente, die zur Bildung von pCPC1 kombiniert wurden, wurden zwischen die EcoRI-Stellen von pUC4K insertiert und waren wie folgt (siehe 15):
• A) Ein 2,1 kb-Fragment aus dem 5'-Flankierungsbereich des cbh1-Locus. Es enthält den Promotorbereich und erstreckt sich zur konstruierten BclI-Stelle, weshalb es keine cbh1-Kodiersequenz umfasst.
• B) Ein 1,9 kb-Fragment genomischer DNA aus dem egl1-Locus; es beginnt am 5'-Ende mit der konstruierten BamHI-Stelle und sich erstreckt sich durch den Kodierbereich hindurch (einschließlich etwa 0,5 kb über das Translationsstopcodon hinaus). Am 3'-Ende des Fragments liegen 18 bp aus der pUC218-Mehrfachklonierungsstelle und ein 15 bp großes synthetisches Oligonukleotid, das dazu dient, dieses Fragment mit dem nachstehend angeführten zu verbinden.
• C) Ein DNA-Fragment vom 3'-Flankierungsbereich des cbh1-Locus; es erstreckt sich von einer Position etwa 1 kb stromab bis zu etwa 2,5 kb stromab vom cbh1-Translationsstopcodon.
• D) In eine NheI-Stelle in Fragment (C) wurde ein 3,1 kb großes NheI-SPhI-DNA-Fragment insertiert, umfassend das T. reesei-pyr4-Gen von pTpyr2 (Beispiel 2) und 24 bp DNA an einem Ende, die aus der pUC18-Mehrfachklonierungsstelle stammt.
• Das Plasmid pCEPC1 wurde konstruiert, damit die EGI-Kodiersequenzen am cbh1-Locus integriert werden konnten, wobei die Kodiersequenz für CBHI ohne Einführung von Fremd-DNA in den Wirtsstamm ersetzt wurde. Die Spaltung dieses Plasmids mit EcoRI legt ein Fragment frei, das den cbhl-Promotorbereich, die egl1-Kodiersequenz und den Transkriptionsterminations-Bereich, das T. reesei pyr4-Gen sowie ein DNA-Segment aus dem stromab gelegenen 3'-Flankierungsberiech des cbh1-Locus enthält (siehe 15).
• Beispiel 22
• pCEPC1-DNA enthaltende Transformanten
• Ein pyr4-defizienter Stamm von T. reesei RutC30 (Sheir-Neiss, s. o.) wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten. Dieser Stamm wurde mit pCEPC1, das mit EcoRI gespalten worden war, transformiert. Stabile Transformanten wurden selektiert und anschließend in Schüttelkolben zur Cellulase-Produktion wie in Beispiel 20 kultiviert. Um die Cellulase-Proteine sichtbar zu machen, wurde unter Anwendung des in Beispiel 7 erläuterten Verfahrens isoelektrische Fokussiergel-Elektrophorese an Proben aus diesen Kulturen durchgeführt. Von insgesamt 23 auf diese Weise analysierten Transformanten stellte sich heraus, dass 12 kein CBHI-Protein produzierten – das erwartete Ergebnis der Integration der CEPC1-DNA am cbh1-Locus. Southern Blot-Analyse diente als Bestätigung, dass die Integration am cbh1-Locus in einigen dieser Transformanten tatsächlich stattgefunden hatte und dass keine Sequenzen aus dem bakteriellen Plasmidvektor (pUC4K) vorhanden waren (siehe 16). Für diese Analyse wurde die DNA aus den Transformanten mit PstI gespalten, bevor sie Elektrophorese unterzogen und auf ein Membranfilter geblottet wurde. Der resultierende Southern Blot wurde mit radiomarkiertem Plasmid pUC4K::cbh1 sondiert (siehe Beispiel 2). Die Sonde hybridisierte an das cbh1-Gen auf einem 6,5 kb großen Fragment von DNA aus der untransformierten Vergleichskultur (siehe 16, Spur A). Man kann erwarten, dass die Integration des CEPC1-DNA-Fragments am cbh1-Locus zum Verlust dieser 6,5 kb-Bande und zum Auftreten dreier anderer Banden führt, die DNA-Fragmenten von etwa 1,0 kb, 2,0 kb und 3,5 kb entsprechen. Dies ist genau das Muster, das für den in 16, Spur C gezeigten Transformanten beobachtet wird. Wie ferner aus 16 ersichtlich, ist Spur B ein Beispiel für einen Transformanten, in dem Mehrfachkopien von pCEPC1 an anderen Stellen im Genom als am cbh1-Locus integriert wurden.
• Assays über die Endoglucanase-Aktivität wurden an Proben von Kulturüberstand aus der untransformierten Kultur und Transformanten genau wie in Beispiel 20 durchgeführt, außer dass die Proben vor dem Assay 50-fach verdünnt wurden, sodass die Proteinkonzentration in den Proben zwischen etwa 0,03 und 0,07 mg/ml lag. Die Ergebnisse von Assays mit der untransformierten Vergleichskultur und vier unterschiedlichen Transformanten (als CEPC1-101, CEPC1-103, CEPC1-105 und CEPC1-112 bezeichnet) sind in Tabelle 2 angeführt. Die Transformanten CEPC1-103 und CEPC1-112 sind Beispiele, in denen die Integration des CEPC1-Fragments zum Verlust der CBHI-Produktion geführt hatte. TABELLE 2

  Sekretierte Endoglucanase-Aktivität von T. reesei-Transformanten
  	A	B
  STAMM	ENDOGLUCANASE-AKTIVITÄT (O. D. BEI 590 ml)	PROTEIN (mg/ml)	A/B
  RutC300	0,037	2,38	0,016
  CEPC1-101	0,082	2,72	0,030
  CEPC1-103	0,099	1,93	0,051
  CEPC1-105	0,033	2,07	0,016
  CEPC1-112	0,093	1,72	0,054

• Die obigen Ergebnisse sollen die Überproduktion der EGI-Komponente im Verhältnis zum Gesamtprotein und nicht das Ausmaß an Überproduktion darstellen. Man kann davon ausgehen, dass selbiges vom jeweiligen Experiment abhängt.
• Es wäre möglich, Plasmide zu konstruieren, die pCEPC1 ähneln, jedoch ein beliebiges anderes T. reesei-Gen aufweisen, das an die Stelle des egl1-Gens tritt. Auf diese Weise könnte die Überexpression anderer Gene und die gleichzeitige Deletion des cbh1-Gens erzielt werden.
• Es wäre ferner möglich, pyr4-Derivatstämme von T. reesei, bei denen zuvor andere Gene deletiert worden waren, z. B. für cbh2, mit pCEPC1 zu transformieren, um Transformanten zu konstruieren, die beispielsweise keine Exocellobiohydrolasen produzieren und Encoglucanasen überproduzieren.
• Unter Verwendung ähnlicher Konstruktionen wie pCEPC1, worin jedoch DNA aus einem anderen Locus von T. reesei statt der DNA aus dem cbh1-Locus substituiert wurde, wäre es möglich, Gene unter der Steuerung eines anderen Promotors an einem anderen Locus im T. reesei-Genom zu insertieren.
• Beispiel 23
• Konstruktion von pEGII::P-1
• Das egl3-Gen, das für EGII kodiert (von anderen Forschern als EGIII bezeichnet), wurde aus T. reesei kloniert und die DNA-Sequenz veröffentlicht (Saloheimo et al., Gene 63, 11–21 (1988)). Die Anmelder erhielten das Gen aus Stamm RL-P37 als etwa 4 kb großes PstI-XhoI-Fragment genomischer DNA, das zwischen der PstI- und der XhoI-Stelle von pUC219 insertiert war. Dieser Vektor (pUC219) wird aus pUC119 (beschrieben von Wilson et al., Gene 77, 69–78 (1989)) abgeleitet, indem die Mehrfachklonierungsstelle ausgeweitet wird, um auch Restriktionsstellen für BglII, ClaI und XhoI zu enthalten. Unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren wurde das auf einem 2,7 bp großen SalI-Fragment genomischer DNA vorhandene T. reesei pyr4-Gen in eine SalI-Stelle innerhalb der EGII-Kodiersequenz insertiert, um Plasmid pEGII::P-1 zu erzeugen (17). Dies führt zur Zerstörung der EGII-Kodiersequenz, jedoch ohne Deletion irgendwelcher Sequenzen. Das Plasmid pEGII::P-1 kann mt HindIII und BamHI gespalten werden, um ein lineares DNA-Fragment ausschließlich aus T. reesei zu liefern (mit Ausnahme von 5 bp an einem Ende und 16 bp am anderen Ende – beide Abschnitte stammen aus der Mehrfachklonierungsstelle von pUC219).
• Beispiel 24
• Transformation von T. reesei GC69 mit pEGII::P-1, um einen Stamm zu erzeugen, der keine EGII produzieren kann
• T. reesei-Stamm GC69 wird mit dem zuvor mit HindIII und mit BamHI gespaltenen pEGII::P-1 transformiert, und stabile Transformanten werden selektiert. Vollständige DNA wird aus den Transformanten isoliert und die Southern Blot-Analyse dazu eingesetzt, jene Transformanten zu identifizieren, in denen das DNA-Fragment, das die pyr4- und egl3-Gene enthält, am egl3-Locus integriert wurde und anschließend die EGII-Kodiersequenz zerstörte. Die Transformanten können kein EGII produzieren. Ferner ist es auch möglich, pEGII::P-1 zu verwenden, um einen Stamm zu transformieren, in dem entweder alle oder einzelne der cbh1-, cbh2- oder egl1-Gene deletiert wurden. Auf diese Weise könnte ein Stamm konstruiert werden, der nur bestimmte Cellulase-Komponenten und keine EGII-Komponente produziert.
• Beispiel 25
• Transformation von T. reesei mit pEGII::P-1, um einen Stamm zu erzeugen, der keine CBHI, CBHII und EGII produzieren kann
• Ein pyr4-defizientes Derivat von Stamm P37PΔΔCBH67 (aus Beispiel 11) wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten. Dieser Stamm P37PΔΔ67P^–1 wurde mit dem zuvor mit HindIII und BamHI gespaltenen pEGII::P-1 transformiert, und stabile Transformanten wurden selektiert. Vollständige DNA wurde aus Transformanten isoliert und Southern Blot-Analyse durchgeführt, um Stämme zu identifizieren, in denen das DNA-Fragment mit den pyr4- und egl3-Genen am egl3-Locus integriert wurde und anschließend die EGII-Kodiersequenz zerstörte. Der in 18 gezeigte Southern Blot wurde mit einem etwa 4 kb großen PstI-Fragment von T. reesei-DNA, umfassend das egl3-Gen, das in die PstI-Stelle von pUC18 kloniert und anschließend reisoliert worden war, sondiert. Als die aus Stamm P37PΔΔ67P^–1 isolierte DNA mit PstI zur Southern Blot-Analyse gespalten war, wurde der egl3-Locus anschließend als einzelne 4 kb-Bande auf dem Autoradiogramm sichtbar gemacht (18, Spur E). Bei einem Transformanten mit zerstörtem egl3-Gen ging jedoch diese Bande verloren und wurde – wie erwartet – durch zwei neue Banden ersetzt (18, Spur F). Bei Spaltung der DNA mit EcoRV oder BgIII nahm die Größe der Bande, die dem egl3-Gen entsprach, um etwa 2,7 kb (der Größe des insertierten pyr4-Fragments) zwischen dem untransformierten P37PΔΔ67P^–1-Stamm (Spuren A und C) und dem Transformanten mit zerstörtem egl13 (18, Spuren B und D) zu. Der das zerstörte egl3-Gen enthaltende Transformant (siehe 18, Spuren B, D und F) wurde als A22 bezeichnet. Der in 18 dargestellte Transformant kann kein CBHI, CBHII oder EGII produzieren.
• Beispiel 26
• Konstruktion von pPΔEGI-1
• Das egl1-Gen von T. reesei-Stamm RL-P37 wurde – wie in Beispiel 12 beschrieben – als 4,2 kb großes HindIII-Fragment genomischer DNA erhalten. Dieses Fragment wurde an der HindIII-Stelle von pUC100 insertiert (einem Derivat von pUC18; Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103–119 (1985), wobei ein Oligonukleotid in die Mehrfachklonierungsstelle insertiert ist und Restriktionsstellen für BglI, ClaI und XhoI hinzugefügt werden). Unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren wurde ein etwa 1 kb großes EcoRV-Fragment, das sich von einer Position nahe der Mitte der EGI-Kodiersequenz bis zu einer Position über das 3'-Ende der Kodiersequenz hinaus erstreckt, entfernt und durch ein 3,5 kb ScaI-Fragment von T. reesei-DNA ersetzt, die das pyr4-Gen enthält. Das resultierende Plasmid wurde als pPΔEGI-1 bezeichnet (siehe 19).
• Das Plasmid pPΔEGI-1 kann mit HindIII gespalten werden, um ein DNA-Fragment freizusetzen, das nur genomische T. reesei-DNA umfasst, die ein Segment des egl1-Gens an einem der beiden Enden und das pyr4-Gen, das einen Teil der EGI-Kodiersequenz ersetzt, im Zentrum aufweist.
• Die Transformation eines geeigneten pyr4-defizienten T. reesei-Stamms mit dem mit HindIII gespaltenen pPΔEGI-1 führt bei einem Teil der Transformanten zur Integration dieses DNA-Fragments am egl1-Locus. Auf diese Weise erhält man einen Stamm, der kein EGI produzieren kann.
• Beispiel 27
• Konstruktion von pΔEGIpyr-3 und Transformation eines pyr4-defizienten Stamms von T. reesei
• Die Erwartung, dass das EGI-Gen mittels des in Beispiel 26 erläuterten Verfahrens inaktiviert werden könnte, wird durch diesen Versuch bekräftigt. In diesem Fall wurde ein Plasmid (pΔEGIpyr-3) konstruiert, das pPΔEGI-1 ähnelte, außer dass das Aspergillus niger pyr4-Gen das T. reesei pyr4-Gen als selektierbarer Marker ersetzte. Das egl1-Gen war wiederum als 4,2 kg großes HindIII-Fragment, insertiert an der HindIII-Stelle von pUC100, vorhanden. Das gleiche interne 1 kb EcoRV-Fragment wurde wie bei der Konstruktion von pPΔEGI-1 entfernt (siehe Beispiel 26), doch in diesem Fall wurde es durch ein 2,2 kb großes Fragment ersetzt, welches das klonierte A. niger pyrG-Gen enthält (Wilson et al., Nucl. Acids. Res. 16, 2339 (1988)). Die Transformation eines pyr4-defizienten Stamms von T. reesei (Stamm GC69) mit pΔEGIpyr-3, nachdem die Spaltung mit HindIII erfolgt war, um das Fragment freizusetzen, welches das pyrG-Gen mit Flankierungsbereichen aus dem egl1-Locus an einem der beiden Enden enthält, führt zu Transformanten, in denen das egl1-Gen zerstört war. Diese Transformanten wurden durch Southern Blot-Analyse von DNA-Transformanten erkannt (gespalten mit HindIII und mit radiomarkiertem pΔEGIpyr-3 sondiert). Im untransformierten Stamm von T. reesei war das egl1-Gen auf einem HindII-DNA-Fragment von 4,2 kb vorhanden, wobei dieses Hybridisierungsmuster in 20, Spur C abgebildet ist. Nach der Deletion des egl1-Gens durch Integration des gewünschten Fragments aus pΔEGIpyr-3 jedoch verschwand dieses 4,2 kb-Fragment und wurde durch ein etwa 1,2 kb größeres Fragment ersetzt (20, Spur A). Wie auch aus 20 ersichtlich, ist Spur B ein Beispiel für einen Transformanten, in dem die Integration einer einzelnen Kopie von pPΔEGIpyr-3 an einer anderen Stelle im Genom als dem egl1-Locus auftrat.
• Beispiel 28
• Transformation von T. reesei mit pPΔEGI-1 zur Bildung eines Stamms, der keine CBHI, CBHII, EGI und EGII produzieren kann
• Ein pyr4-defizientes Derivat von Stamm A22 (aus Beispiel 25) wird nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten. Dieser Stamm wird mit dem zuvor mit HindIII gespaltenen pPΔEGI-1 transformiert, um ein DNA-Fragment freizusetzen, das nur T. reesei-Genom-DNA mit einem Segment des egl1-Gens an einem der beiden Enden umfasst, wobei ein Teil der EGI-Kodiersequenz durch das pyr4-Gen ersetzt ist.
• Stabile pyr4+-Transformanten werden selektiert und vollständige DNA aus den Transformanten isoliert. Die DNA wird nach Southern Blot-Analyse mit ³²P-markiertem pPΔEGI-1 sondiert, um Transformanten zu identifizieren, in denen das DNA-Fragment mit dem pyr4-Gen und egl1-Sequenzen am egl1-Locus integriert war und anschließend die EGI-Kodiersequenz zerstörte. Die identifizierten Transformanten können keine CBHI, CBHII, EGI und EGII produzieren.

Claims (6)

1. Verwendung einer Waschmittel-Zusammensetzung zum Waschen von baumwollhältigem Gewebe, wobei die Zusammensetzung umfaßt: (a) eine Reinigung bewirkende Menge eines Tensids oder Tensidgemisches; und (b) etwa 0,01 bis etwa 5 Gew.-% einer Pilz-Cellulase-Zusammensetzung, bezogen auf das Gewicht der Waschmittelzusammensetzung, worin die Cellulase-Zusammensetzung eine oder mehrere Endoglucanase-Komponenten und weniger als etwa 5 Gew.-% an Exocellobiohydralase-Komponenten, bezogen auf das Gewicht des Proteins in der Cellulase-Zusammensetzung, umfaßt; dadurch gekennzeichnet, daß das Waschen des Gewebes mit der Zusammensetzung im Vergleich zu vollständiger Cellulase Verbesserungen bezüglich Weichheit, Farbechtheit/-wiederherstellung und Griff bereitstellt und für einen verringerten Festigkeitsverlust sorgt, mit der Maßgabe, dass die Pilz-Cellulase-Zusammensetzung (b) (i) keine Zusammensetzung ist, die im Wesentlichen reine EG-III-Cellulase enthält, was als Gehalt von zumindest 40 Gew.-% EGIII, bezogen auf das Gesamtgewicht der Cellulaseproteine, definiert ist, und (ii) keine saure Cellulase-Zusammensetzung, d. h. mit einem pH-Optimum unter 7,0, ist, die relativ zu Komponenten vom CBH-Typ eine erhöhte Menge an Komponenten vom sauren EG-Typ enthält.
2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Waschmittel-Zusammensetzung etwa 0,05 bis etwa 2 Gew.-% der Cellulase-Zusammensetzung umfaßt.
3. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Cellulase-Zusammensetzung frei von jeglichen Exocellobiohydrolase-Komponenten ist.
4. Verwendung nach Anspruch 3, worin die Cellulase-Zusammensetzung von einem genetisch modifizierten Mikroorganismus stammt, der nicht zum Exprimieren irgendwelcher Exocellobiohydrase-Komponenten fähig ist und/oder zum Überexprimieren einer oder mehrerer Endoglucanase-Komponenten fähig ist.
5. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Cellulase-Zusammensetzung von einem genetisch modifizierten Mikroorganismus stammt, der nicht zum Exprimieren irgendwelcher CBH-Typ-Komponenten fähig ist.
6. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Cellulase-Zusammensetzung keinerlei heterologe Proteine enthält.

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