DE69132894T3

DE69132894T3 - Methoden zur behandlung baumwolle-enthaltender fasern mit cellulase

Info

Publication number: DE69132894T3
Application number: DE69132894T
Authority: DE
Inventors: Kathleen A. San Francisco CLARKSON; Geoffrey L. San Francisco WEISS; Edmund A. Moss Beach LARENAS
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1990-10-05
Filing date: 1991-10-04
Publication date: 2011-03-03
Anticipated expiration: 2011-10-05
Also published as: ES2170748T3; DK0551386T3; DE69133352T2; WO1992006209A1; DK0553280T4; ATE211773T1; JPH06502223A; FI931495A0; JPH06511379A; EP0553280A1; CA2093424C; EP0551394A1; FI931492A; EP0553280B1; DE69132894T2; EP1416045A1; CA2093428A1; CA2093421A1; EP0553280B2; CA2093428C

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur Behandlung von baumwollhältigen Geweben mit Cellulase, sowie nach diesen Verfahren hergestellte Gewebe. Insbesondere betreffen die verbesserten Verfahren der vorliegenden Erfindung das Zusammenbringen baumwollhältiger Gewebe mit einer wässrigen Lösung, die eine Pilzcellulase-Zusammensetzung enthält, welche frei von jeglichen CBHI-Cellulase-Komponenten ist. Wenn das baumwollhältige Gewebe mit solchen Lösungen behandelt wird, besitzt das resultierende Gewebe im Vergleich zum Gewebe vor der Behandlung die erwarteten Verbesserungen von Griff, Aussehen und/oder Weichheit und besitzt auch verringerten Festigkeitsverlust im Vergleich zu Gewebe, das mit einer Cellulasezusammensetzung behandelt wurde, die CBHI-Cellulasekomponenten enthält.
2. Stand der Technik
Während oder kurz nach ihrer Herstellung können baumwollhältige Gewebe mit Cellulase behandelt werden, um dem Gewebe gewünschte Eigenschaften zu verleihen. Beispielsweise ist Cellulase in der Textilindustrie verwendet worden, um Griff und/oder Aussehen baumwollhältiger Gewebe zu verbessern, Oberflächenfasern von Strickwaren zu entfernen, baumwollhältigen Denim-Geweben ein ”Stone-Washed”-Aussehen zu verleihen und dergleichen.
Insbesondere die Japanischen Patentanmeldungen Nr. 58-36217 und 58-54032 sowie Ohishi et al., ”Reformation of Cotton Fabric by Cellulase”, und JTN-Zeitschriftenartikel ”What's New – Weight Loss Treatment to Soften the Touch of Cotton Fabric” vom Dezember 1988 offenbaren alle, dass die Behandlung baumwollhältiger Gewebe mit Cellulase zu einem verbesserten Griff des Gewebes führt. Es wird im Allgemeinen angenommen, dass diese Cellulasebehandlung Baumwollfusseln und/oder Oberflächenfasern entfernt, was das Gewicht des Gewebes verringert. Die Kombination dieser Effekte verleiht den Geweben verbesserten Griff, d. h. das Gewebe fühlt sich eher wie Seide an.
In der WO 89/09259 wird ein Cellulasepräparat beschrieben, die eine Endoglucanase-Komponente mit hoher Endoase-Aktivität und hoher Affinität gegen Cellulase enthält. Dies wird als Herabsetzung der Rauheit baumwollhältiger Gewebe und der Geschwindigkeit, mit der solche Gewebe rau werden, offenbart.
Zusätzlich war vordem der Wissenschaft bekannt, baumwollhältige Strickwaren mit einer Cellulaselösung unter Bewegung und kaskadierenden Bedingungen, z. B. durch Verwendung eines Strahls, zu behandeln, um gebrochene Fasern und Fäden zu entfernen, die diesen Strickwaren gemein sind. Bei solcher Behandlung werden im Allgemeinen keine Puffer verwendet, da von diesen angenommen wird, dass sie die Farbschattierung bei ausgewählten Farbstoffen nachteilig beeinflussen.
Weiters war der Wissenschaft vordem auch bekannt, baumwollhältige Webstoffe unter Bewegung und kaskadierenden Bedingungen mit einer Cellulaselösung zu behandeln. Bei solcher Behandlung besitzen baumwollhältige Webwaren im Vergleich zum Gewebe vor der Behandlung verbesserten Griff und verbessertes Aussehen.
Schließlich war vordem auch bekannt, dass die Behandlung von baumwollhältigem, gefärbtem Denim mit Cellulaselösungen unter bewegten und kaskadierenden Bedingungen, d. h. in einer rotierenden Trommelwaschmaschine, dem Denim ein ”Stone-Washed”-Aussehen verleiht.
Ein allgemeines, mit der Behandlung solcher baumwollhältiger Gewebe mit einer Cellulaselösung verbundenes Problem ist, dass die behandelten Gewebe einen signifikanten Festigkeitsverlust im Vergleich zum unbehandelten Gewebe zeigen. Festigkeitsverlust tritt auf, weil die Cellulase Cellulose (b-1,4-Glucanbindungen) hydrolysiert, was in der Folge zu einem Zerfall eines Teils des Baumwollpolymers führen kann. Indem mehr und mehr Baumwollpolymere gespalten werden (zerfallen), wird die Zugfestigkeit des Gewebes herabgesetzt.
Da Verfahren, die Bewegung und Kaskadierung von Cellulaselösungen auf Baumwollgeweben umfassen, kürzere Reaktionszeiten erfordern, wird angenommen, dass diese Verfahren zu baumwollhältigen Geweben mit verminderten Festigkeitsverlusten führen als Behandlungsverfahren, die keine Bewegung und Kaskadierung umfassen. Auf jeden Fall führen solche Verfahren trotzdem immer noch zu signifikantem Festigkeitsverlust.
Demgemäß wäre es insbesondere wünschenswert, solche Cellulasebehandlungsverfahren so zu modifizieren, dass sie zu vermindertem Festigkeitsverlust führen, während die gewünschten Verbesserungen an den behandelten, baumwollhältigen Geweben, die aus der Behandlung mit Cellulase hervorgehen, im Vergleich zum Gewebe vor der Behandlung immer noch erzielt werden.
Da Cellulasen pilzlichen Ursprungs außerdem dafür bekannt sind, dass sie sehr große Mengen von Cellulase sekretieren, und da weiters Fermentationsprozesse für solche pilzlichen Quellen sowie Isolierungs- und Reinigungsprozesse zur Isolierung von Cellulase im Fach gut bekannt sind, wäre es zusätzlich insbesondere Vorteilhaft, solche Pilzcellulasen in den Verfahren zur Verbesserung von Griff und/oder Aussehen zu verwenden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass vordem bekannte Verfahren zur Behandlung baumwollhältiger Gewebe mit Pilzcellulase verbessert werden kann, indem eine Zusammensetzung von Pilzcellulase eingesetzt wird, die frei von allen CBHI-Komponenten ist. Es ist überraschenderweise herausgefunden worden, dass EG-Komponenten fähig sind, den behandelten Geweben, im Vergleich zum Gewebe vor der Behandlung mit einer solchen Cellulasezusammensetzung, Verbesserungen bezüglich Griff, Aussehen, Weichheit, Farbverstärkung und/oder Stone-Washed-Aussehen zu verleihen. Zusätzlich ist gefunden worden, dass es die CBHI-Komponenten in Kombination mit den EG-Komponenten sind, die für einen beträchtlichen Anteil des Festigkeitsverlusts im behandelten Gewebe verantwortlich sind.
In einem ersten Aspekt führt die vorliegende Erfindung zu einem Verfahren zur Verminderung von Festigkeitsverlust baumwollhältiger Gewebe bei gleichzeitigem Erreichen der gewünschten Verbesserung von Haptik, Aussehen und/oder Erweichung, die durch die Behandlung mit Cellulase entsteht, gegenüber dem Gewebe vor der Behandlung, wobei das Verfahren die Behandlung der Gewebe mit einer Pilzcellulase-Zusammensetzung umfasst, die eine oder mehrere EG-Cellulasekomponenten beinhaltete und die frei von allen CBHI-Cellulasekomponenten ist, worin das Verfahren zu vermindertem Festigkeitsverlust im Vergleich zur Behandlung mit vollständiger Cellulase führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pilzcellulase-Zusammensetzung frei von jeglichen CBHI- und jeglichen CBHII-Komponenten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, umfasst die Pilzcellulase-Zusammensetzung zumindest etwa 10 Gew.-%, vorzugsweise zumindest etwa 20 Gew.-%, an EG-Komponenten, bezogen auf das Gesamtgewicht von Protein in der Cellulasezusammensetzung.
Vorzugsweise wird das Verfahren unter Bewegung unter solchen Bedingungen durchgeführt, dass eine Kaskadenwirkung der Cellulaselösung auf dem Gewebe erzeugt wird.
Baumwollhältige Gewebe, die durch die Verfahren dieser Erfindung behandelt wurden, besitzen die erwartete(n) Verbesserung(en) im Vergleich zum Gewebe vor der Behandlung, während sie verminderten Festigkeitsverlust im Vergleich zum Gewebe zeigen, das mit einer Cellulasezusammensetzung behandelt wurde, die CBHI-Cellulasekomponenten enthält. Der verminderte Festigkeitsverlust beweist, dass Verfahren dieser Erfindung Festigkeitsverlustbeständig sind.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 ist eine Skizze der Konstruktion von pΔCBHIpyr4.
2 veranschaulicht die Deletion des Gens von T. reesei durch Integration des größeren EcoRI-Fragments von pΔCBHIpyr4 am cubh1-Lotus an einem der T. reesei-Chromosomen.
3 ist ein Autoradiogramm von DNA aus T. reesei-Stamm GC69, transformiert mit EcoRI-verdautem pΔCBHIpyr4 nach Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von ³²P-markiertem pΔCBHIpyr4 als Sonde. Die Größen der Molekulargewichtsmarker sind in Kilobasenpaaren an der linken Seite der Figur gezeigt.
4 ist ein Autoradiogramm von DNA aus T. reesei-Stamm GC69, transformiert mit EcoRI-verdautem pΔCBHIpyr4 nach Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von ³²P-markiertem plntCBHI als Sonde. Die Größen der Molekulargewichtsmarker sind in Kilobasenpaaren an der linken Seite der Figur gezeigt.
5 ist ein Gel zur ioselektrischen Fokussierung und zeigt die von der Wildform und von transformierten Stämmen von T. reesei sekretierten Proteine. Im Speziellen verwendet das isoelektrofokussierte Gel in 5 in Spur A teilweise gereinigte CBHI von T. reesei; Spur B verwendet eine Wildform von T. reesei: Spur C verwendet Protein von einem T. reesei-Stamm mit deletiertem cbh1-Gen und Spur D verwendet Protein von einem T. reesei-Stamm mit deletierten cbh1- und cbh2-Genen. In 5 ist die rechte Seite der Figur markiert um die Position des einzelnen Proteins, das in einem oder mehreren der sekretierten Proteine gefunden wurde, zu bezeichnen. Im Speziellen bezeichnet BG β-Glucosidase, E1 bezeichnet Endoglucanase I, E2 bezeichnet Endoglucanase II, E3 bezeichnet Endoglucanase III, C1 bezeichnet Exo-Cellobiohydrolase I und C2 bezeichnet Exo-Cellobiohydrolase II.
6A ist eine Darstellung des cbh2-Locus von T. reesei, kloniert als 4,1-kb-EcoRI-Fragment an genomischer DNA, und 6B ist eine Darstellung des cbh2-Gendeletionsvektors pPΔCBHII.
7 ist ein Autoradiogramm von DNA aus T. reesei-Stamm P37PΔCBHIPyr^–26, transformiert mit EcoRI-verdautem pPΔCBHII nach Southern-Blot-Analyse unter Verwendung eines ³²P-markierten pPΔCBHII als Sonde. Die Größen der Molekulargewichtsmarker sind in Kilobasenpaaren an der linken Seite der Figur gezeigt.
8 ist eine grafische Darstellung des Plasmids pEGIpyr4.
9 veranschaulicht das RBB-CMC-Aktivitätsprofil einer sauren, EG-angereicherten Pilzcellulasezusammensetzung (CBHI und CBHII deletiert), hergeleitet von Trichoderma reesei, über einen pH-Bereich bei 40°C, sowie das Aktivitätsprofil einer angereicherten, von Trichoderma reesei hergeleiteten EGIII-Cellulasezusammensetzung über einen pH-Bereich bei 40°C.
10 veranschaulicht Ergebnisse des Festigkeitsverlusts nach drei Waschzyklen in einem Launderometer für baumwollhältige Gewebe, die mit Cellulasezusammensetzungen mit unterschiedlichen Mengen an CBH-Komponenten behandelt wurden.
11 veranschaulicht Ergebnisse der Faserentfernung (basierend auf Reihenversuchs-Maßzahlen) für baumwollhältige Gewebe, die mit von der Trichoderma reesei-Wildform sekretierter Cellulase (Vollcellulase) bei verschiedenen pH-Werten behandelt wurden.
12 veranschaulicht Ergebnisse der Faserentfernung (basierend auf Reihenversuchs-Maßzahlen) für baumwollhältige Gewebe, die mit variierenden Konzentrationen (in ppm) von Cellulase behandelt wurden, die von einer Trichoderma reesei-Wildform sekretiert wurden und für baumwollhältiges Gewebe, das mit Cellulase behandelt wurde, die von einem Trichoderma reesei-Stamm sekretiert wurden, der genetisch so manipuliert war, dass er zur Sekretion von CBHI und CBHII unfähig war.
13 veranschaulicht Ergebnisse des Weichheits-Reihenversuchs für unterschiedliche Konzentrationen (in ppm) einer EG-angereicherten Cellulasezusammensetzung, hergeleitet von einem Trichoderma reesei-Stamm, der genetisch so manipuliert war, dass er zur Sekretion von CBHI und CBHII unfähig war.
14 ist eine Darstellung der an den egl1- und cbh1-Genen vorgenommenen ortsgerichteten Veränderungen, um bequeme Restriktionsendonuklease-Spaltstellen zu erzeugen. In jedem einzelnem Fall zeigt die obere Zeile die ursprüngliche DNA-Sequenz, die eingeführten Änderungen sind in der mittleren Zeile gezeigt und die neue Sequenz ist in der unteren Zeile gezeigt.
15 ist eine Darstellung des größeren EcoRI-Fragments, das aus pCEPC1 erhalten werden kann.
16 ist ein Autoradiogramm von DNA von einem untransformierten Stamm von T. reesei RutC30 und von zwei Transformanten, die durch Transformation von T. reesei mit EcoRI-verdautem pCEPC1 erhalten wurden.
17 ist eine Darstellung des Plasmids pEGII::P-1.
18 ist ein Autoradiogramm von DNA aus T. reesei-Stamm P37PΔΔ67P^–1, transformiert mit HindIII- und BamHI-verdautem pEGII::P-1. Ein Southern-Blot wurde angefertigt und die DNA mit einem etwa 4kb PstI-Fragment von radiomarkierter, das egl3-Gen enthaltender T. reesei-DNA hybridisiert. Die Spuren A, C und E enthalten DNA des untransformierten Stamms, während die Spuren B, D und F DNA des untransformierten T. reesei-Stamms enthalten. Die T. reesei-DNA wurde in den Spuren A und B mit BglII, in den Spuren C und D mit EcoRV und in den Spuren E und F mit PstI verdaut. Die Größen der Marker-DNA-Fragmente sind in Kilobasenpaaren an der linken Seite der Figur gezeigt.
19 ist eine Darstellung des Plasmids pPΔEGI-1.
20 ist ein Autoradiogramm eines Southern-Blots von DNA, die aus Transformanten von Stamm GC69 isoliert wurden, erhalten mit HindII-verdautem pΔEGIpyr-3. Das für einen untransformierten Stamm erwartete Hybridisierungsmuster mit der Sonde, radiomarkiertem pΔEGIpyr-3, ist in Spur C gezeigt. Spur A zeigt das für einen Transformanten erwartete Muster, in dem das egl1-Gen zerstört worden ist, und Spur B zeigt einen Transformanten, in dem pΔEGIpyr-3-DNA in das Genom integriert worden ist, jedoch ohne Zerstörung des egl1-Gens. Spur D enthält HindIII-verdautes pΔEGIpyr-3 als geeigneten Größenmarker. Die Größe der Marker-DNA-Fragmente ist in Kilobasenpaaren an der rechten Seite der Figur gezeigt.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Wie oben bemerkt, sind die Verfahren dieser Erfindung Verbesserungen früherer technischer Verfahren zur Behandlung baumwollhältiger Gewebe mit Cellulase. Die Verbesserungen umfassen die Verwendung einer spezifischen Cellulasezusammensetzung, die dem Gewebe die gewünschte(n) Verbesserung(en) verleihen, während der Festigkeitsverlust des Gewebes minimiert ist. Vor der ausführlichen Diskussion dieser Erfindung werden jedoch zunächst die folgenden Begriffe definiert.
Der Begriff ”baumwollhältiges Gewebe” betrifft genähte oder ungenähte Gewebe, die aus reiner Baumwolle oder Baumwollmischungen bestehen, einschließlich Baumwollwebstoffen, Baumwollstrick, Baumwoll-Denimgewebe, Baumwollgarn und dergleichen. Wenn Baumwollmischungen verwendet werden, sollte die Menge an Baumwolle im Gewebe mindestens etwa 40 Gew.-% Baumwolle betragen; vorzugsweise mehr als etwa 60 Gew.-% Baumwolle; insbesondere mehr als etwa 75 Gew.-% Baurnwolle. Falls als Mischungen angewendet, kann das im Gewebe verwendete Begleitmaterial eine oder mehrere Nicht-Baumwollfasern umfassen, einschließlich synthetischer Fasern, wie z. B. Polyamidfasern (z. B. Nylon 6 und Nylon 66), Acrylfasern (z. B. Polyacrylnitrilfasern) und Polyesterfasern (z. B. Polyethylenterephthalat), Polyvinylalkoholfasern (z. B. Vinylon), Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern und Aramidfasern. Es ist vorgesehen, dass regenerierte Cellulose, wie z. B. Rayon, in den Verfahren dieser Erfindung als Ersatz für Baumwolle verwendet werden kann.
Der Begriff ”appretieren”, wie er hierin verwendet wird, bedeutet die Aufbringung einer ausreichenden Menge Appretur auf das baumwollhältige Gewebe, sodass die cellulolytische Aktivität von Cellulase auf das Gewebe im Wesentlichen unterbunden wird. Appreturen werden im Allgemeinen am oder Nahe dem Ende des Herstellungsprozesses des Gewebes aufgebracht, um die Eigenschaften des Gewebes, z. B. Weichheit, Drapierbarkeit usw. zu verbessern, was das Gewebe vor der Reaktion mit Cellulase zusätzlich schützt. Zweckdienliche Appreturen zum Appretieren eines baumwollhältigen Gewebes sind dem Fach gut bekannt und umfassen harzartige Materialien, wie z. B. Melamin, Glyoxal oder Harnstoff-Formaldehyd, sowie Wachse, Silikone, Fluorchemikalien und quaternäre Ammoniumverbindungen. Falls so appretiert ist das baumwollhältige Gewebe im Wesentlichen gegen Cellulase weniger reaktiv.
Der Begriff ”Pilzcellulase” betrifft die Enzymzusammensetzung, die von Pilzen oder von Mikroorganismen herrührt, die genetisch so modifiziert sind, dass sie alle oder Teile der von einem Pilz herrührenden Cellulasegene beinhalten und exprimieren. Pilzcellulasen wirken auf Cellulose und ihre Derivate, um Cellulose zu hydrolysieren und die primären Produkte Glucose und Cellobiose zu bilden. Pilzcellulasen werden von Cellulasen unterschieden, die von nicht-pilzlichen Quellen produziert werden, einschließlich Mikroorganismen, wie z. B. Actinomyceten, sich gleitend bewegende Bakterien (Myxobakterien) und echte Bakterien. Pilze, die zur Produktion von Cellulasen fähig sind, die für die Herstellung hierin beschriebener Cellulasezusammensetzungen nützlich sind, werden im britischen Patent Nr. 2.094.826A offenbart.
Die meisten Pilzcellulasen besitzen im Allgemeinen ihr pH-Optimum im sauren oder neutralen pH-Bereich, obgleich einige Pilzcellulasen bekannt sind, die eine signifikante Aktivität unter neutralen und leicht basischen Bedingungen besitzen, d. h., dass beispielsweise von Humicola insolens hergeleiteter Cellulase bekannt ist, dass sie Aktivität bei neutralen bis leicht alkalischen Bedingungen aufweist.
Von Pilzcellulasen ist bekannt, dass sie aus mehreren Enzymklassen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten, enzymatischen Wirkungsmustern und dergleichen bestehen. Zusätzlich können Enzymkomponenten innerhalb jeder Klasse unterschiedliche Molekulargewichte, unterschiedliche Anteile von Glykosylierung, unterschiedliche isoelektrische Punkte, unterschiedliche Substratspezifitäten usw. zeigen. Beispielsweise können Pilzcellulasen Enzymklassen enthalten, die Endoglucanasen (EGs), Exo-Cellobiohydrolasen (CBHs), β-Glucosidasen (BGs) usw. umfassen. Andererseits gibt es, obwohl in der Literatur von bakteriellen Cellulasen berichtet wird, dass sie wenig oder keine CBH-Komponenten enthalten, einige wenige Fälle, in denen berichtet wird, dass von bakteriellen Cellulasen hergeleitete, CBH-ähnliche Komponenten Exo-Cellobiohydrolaseaktivität besitzen.
Eine Pilzcellulase-Zusammensetzung, die von einer natürlich vorkommenden pilzlichen Quelle produziert wird und die eine oder mehrere CBH- und EG-Komponenten beinhaltet, worin jede dieser Komponenten in dem Verhältnis gefunden wird, welches von der pilzlichen Quelle produziert wird, wird hierin manchmal als ein ”vollständiges Pilzcellulasesystem” oder eine ”vollständige Pilzcellulase-Zusammensetzung” bezeichnet, um sie von den daraus isolierten Klassen und Komponenten von Cellulase, von unvollständigen Cellulasezusammensetzungen, die von Bakterien und einigen Pilzen produziert werden, oder von einer Cellulasezusammensetzung zu unterscheiden, die von einem Mikroorganismus erhalten wurde, der genetisch so manipuliert ist, dass er eine oder mehrere der CBH- und/oder EG-Komponenten von Cellulase überproduziert, unterproduziert oder nicht produziert.
Die Fermentationsprozesse zur Kultivierung von Pilzen für die Produktion von Cellulase sind per se fachbekannt. Beispielsweise können Cellulasesysteme entweder durch Feststoff- oder Submersfermentation, einschließlich Batch-, Fed-Batch oder kontinuierlich produziert werden. Die Sammlung und Aufarbeitung der Cellulasesysteme aus der Fermentationsbrühe kann ebenfalls durch per se fachbekannte Verfahren erzielt werden.
”Endoglucanase-(”EG-”)Komponenten” betreffen alle jene Pilzcellulasekomponenten oder Kombinationen von Komponenten, die auf Textilien Aktivitätseigenschaften ähnlich denen der Endocellulasekomponenten von Trichoderma reesei zeigen. In diesem Zusammenhang verleihen die Endoglucanasekomponenten von Trichoderma reesei (im Speziellen EGI, EGII, EGIII und dergleichen, entweder alleine oder in Kombination) den baumwollhältigen Geweben (im Vergleich zum Gewebe vor der Behandlung) verbesserten Griff, verbessertes Aussehen, Weichheit, Farbverstärkung und/oder Stone-Washed-Aussehen, wenn diese Komponenten in ein Textilbehandlungsmedium eingeschlossen werden und das Gewebe mit diesem Medium behandelt wird. Zusätzlich führt die Behandlung baumwollhältiger Gewebe mit Endoglucanasekomponenten von Trichoderma reesei zu Festigkeitsverlust im Vergleich zum Festigkeitsverlust, der bei Behandlung mit einem ähnlichen Medium auftritt, das jedoch zusätzlich CBHI-Komponenten enthält.
Demgemäß sind Endoglucanasekomponenten jene Pilzcellulasekomponenten, die baumwollhältigen Geweben (im Vergleich zum Gewebe vor der Behandlung) verbesserten Griff, verbessertes Aussehen, Weichheit, Farbverstärkung und/oder Stone-Washed-Aussehen verleihen, wenn diese Komponenten in ein Textilbehandlungsmedium eingeschlossen werden, das zur Behandlung der Gewebe verwendet wird, und die baumwollhältigen Geweben verringerten Festigkeitsverlust im Vergleich zum Festigkeitsverlust verleihen, der bei Behandlung mit einer ähnlichen Cellulasezusammensetzung auftritt, die zusätzlich CBHI-Komponenten enthält.
Solche Endoglucanasekomponenten beinhalten nicht Komponenten, die traditionell als Endoglucanasen klassifiziert werden und zwar unter Verwendung von Aktivitätstests, wie z. B. der Fähigkeit der Komponente (a) zur Hydrolyse löslicher Cellulosederivate, wie z. B. Carboxymethylcellulose (CMC), und dadurch herbeigeführten Herabsetzung der Viskosität von CMC-enthaltenden Lösungen, (b) zur glatten Hydrolyse hydratisierter Celluloseformen, wie z. B. in Phosphorsäure gequollene Cellulose (z. B. Walseth-Cellulose) und zur weniger glatten Hydrolyse kristalliner Celluloseformen (z. B. Avicel, Solkafloc usw.). Andererseits wird angenommen, dass nicht alle Endoglucanasekomponenten, die durch solche Aktivitätstests definiert sind, baumwollhältigen Geweben eine oder mehrere Verbesserungen sowie baumwollhältigen Geweben verminderten Festigkeitsverlust verleihen. Demgemäß ist es für die Zwecke hierin genauer, Endoglucanase-Komponenten als diejenigen Komponenten von Pilzcellulasen zu definieren, die ähnliche Aktivitäten an Textilien besitzen, wie sie Endoglucanasekomponenten von Trichoderma reesei besitzen.
Pilzcellulasen können mehr als eine EG-Komponente besitzen. Die verschiedenen Komponenten besitzen im Allgemeinen unterschiedliche isoelektrische Punkte, unterschiedliche Molekulargewichte, unterschiedliche Anteile von Glykosylierung, unterschiedliche Substratspezifität, unterschiedliche enzymatische Wirkungsmuster usw. Die unterschiedlichen isoelektrischen Punkte der Komponenten erlauben deren Trennung über Ionenaustauschchromatographie und dergleichen. Faktisch ist die Isolierung von Komponenten aus verschiedenen pilzlichen Quellen fachbekannt. Siehe beispielsweise Schulein et al., Internationale Anmeldung WO 89/09259 , Wood et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, S. 31–52 (1988); Wood et al., Carbohydrate Research, Bd. 190, S. 279–297 (1989); Schulein, Methods in Enzymology, Bd. 160, S. 234–242 (1988); und dergleichen.
Im Allgemeinen ist vorgesehen, dass Kombinationen von EG-Komponenten zu einer synergistischen Reaktion in der Verleihung von Verbesserungen an baumwollhältige Gewebe sowie in der Verleihung verminderten Festigkeitsverlusts im Vergleich zu einer einzelnen EG-Komponente führen. Andererseits kann eine einzelne EG-Komponente stabiler sein oder ein breiteres Aktivitätsspektrum über einen Bereich von pH-Werten aufweisen. Demgemäß können die in dieser Erfindung angewendeten EG-Komponenten entweder eine einzelne EG-Komponente oder eine Kombination von zwei oder mehreren EG-Komponenten sein. Wenn eine Kombination von Komponenten angewendet wird, kann die EG-Komponente von derselben oder von verschiedenen pilzlichen Quellen hergeleitet sein.
Es ist vorgesehen, dass EG-Komponenten von bakteriell hergeleiteten Cellulasen hergeleitet sein können.
”Exo-Cellobiohydrolase-(”CBH-”)Komponenten” betreffen jene Pilzcellulasekomponenten, die auf Textilien Aktivitätseigenschaften ähnlich denen von CBHI- und/oder CBHII-Cellulasekomponenten von Trichoderma reesei zeigen. In diesem Zusammenhang verleihen die CBHI- und CBHII-Komponenten von Trichoderma reesei alleine, wenn sie in Abwesenheit von EG-Cellulasekomponenten (wie oben definiert) verwendet werden, den so behandelten baumwollhältigen Geweben keinerlei signifikante Verbesserungen in Griff, Aussehen, Farbverstärkung und oder Stone-Washed-Aussehen. Zusätzlich verleiht die CBHI-Komponente von Trichoderma reesei, wenn sie in Kombination mit EG-Komponenten verwendet wird, den baumwollhältigen Geweben erhöhten Festigkeitsverlust.
Demgemäß betreffen CBHI-Komponenten und CBHII-Komponenten jene Pilzcellulasekomponenten, die an Textilien Aktivitätseigenschaften ähnlich denen der CBHI- bzw. CBHII-Komponenten von Trichoderma reesei zeigen. Wie oben für CBHI-Komponenten erwähnt, umfasst dies, wenn in Anwesenheit von EG-Komponenten verwendet, die Eigenschaft der Erhöhung des Festigkeitsverlusts baumwollhältiger Gewebe. In einer bevorzugten Ausführungsform und wenn in Kombination mit EG-Komponenten verwendet, können die CBHI-Komponenten von Trichoderma reesei einen zusätzlichen Reinigungsnutzen vermitteln. Zusätzlich ist vorgesehen, dass die CBHI-Komponenten von Trichoderma reesei, wenn sie alleine oder in Kombination mit EG-Komponenten verwendet werden, einen zusätzlichen Gewinn an Weichheit vermitteln.
Solche Exo-Cellobiohydrolase-Komponenten umfassen bei Verwendung von Aktivitätstests wie z. B. jenen, die zur Charakterisierung von CBHI und CBHII aus Trichoderma reesei verwendet werden, möglicherweise nicht die traditionell als Cellobiohydrolase klassifizierten Komponenten. Beispielsweise sind solche Komponenten (a) durch Cellobiose kompetitiv inhibiert (K_i etwa 1 mM); (b) unfähig zu jeglicher signifikanten Hydrolyse substituierter Cellulosen, wie z. B. Carboxymethylcellulose usw. und (c) zur Hydrolyse Phosphorsäure-gequollener Cellulose und in geringerem Ausmaß hochkristalliner Cellulose. Andererseits wird angenommen, dass einigen pilzliche Cellulasekomponenten, die durch solche Aktivitätstests als CBH-Komponenten charakterisiert sind, wenn sie alleine oder in der Cellulasezusammensetzung verwendet werden, baumwollhältigen Geweben verbesserten Griff, Aussehen, Weichheit, Farbverstärkung und/oder Stone-Washed-Aussehen bei minimalem Festigkeitsverlust verleihen. Demgemäß wird angenommen, dass es für die Zwecke hierin genauer ist, solche Exo-Cellobiohydrolasen als EG-Komponenten zu definieren, da diese Komponenten ähnliche funktionelle Eigenschaften in der Textilverwendung besitzen, wie sie Endoglucanasekomponenten von Trichoderma reesei erfüllt werden.
Hinsichtlich Waschmittel-Zusammensetzungen, die CBHI-defiziente, CBHI-angereicherte oder EGIII-angereicherte Cellulase-Zusammensetzungen enthalten, ist gefunden worden, dass es die Menge von Cellulase und nicht die relativen Hydrolysegeschwindigkeiten der spezifischen enzymatischen Komponenten zur Produktion reduzierender Zucker aus Cellulose ist, welche baumwollhältigen Geweben die gewünschten Wascheigenschaften verleiht, z. B. eine oder mehrere von verbesserter Farbregeneration, verbesserter Weichmachung und verbesserter Reinigung durch die Waschmittelzusammensetzung.
Pilzcellulasen frei von allen CBHI-Komponenten können durch Reinigungstechniken erhalten werden. Im Speziellen kann das vollständige Cellulasesystem zu im Wesentlichen reinen Komponenten gereinigt werden, und zwar durch in der Literatur reichlich publizierte, anerkannte Trenntechniken, einschließlich Ionenaustauschchromatographie bei geeignetem pH-Wert, Affinitätschromatographie, Ausschlusschromatographie und dergleichen. Beispielsweise ist es in der Ionenaustauschchromatographie (für gewöhnlich Anionenaustauschchromatographie) möglich, Cellulasekomponenten durch Elution mit einem pH-Gradienten oder Salzgradienten oder sowohl pH-, als auch Salzgradienten zu trennen. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff ”Cellulasezusammensetzung frei von allen CBHI-Cellulasekomponenten”, dass die Cellulasezusammensetzung, bezogen auf das Gewicht an Protein, weniger als 1 Gew.-% CBHI-Cellulasekomponenten enthält.
Es ist ebenfalls vorgesehen, dass Cellulasezusammensetzungen frei von allen CBHI-Komponenten auf andere Weise als durch Isolierung und Rekombination der Komponenten hergestellt werden kann. Beispielsweise können Rekombinationstechniken verwendet werden, um Mikroorganismen herzustellen, die unfähig zur Produktion jeglicher CBHI-Komponenten sind oder die unfähig zur Produktion jeglicher CBH-Komponenten sind.
Bezüglich dessen ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Cellulasezusammensetzungen frei von CBHI-Komponenten die genetische Modifizierung eines Mikroorganismus in der Weise, dass er unfähig zur Expression von CBHI-Komponenten ist; diese Verfahren exprimieren keinerlei heterologe Proteine. Auf ähnliche Weise ist es auch möglich, Mikroorganismen genetisch so zu modifizieren, dass sie zusätzlich eine oder mehrere EG-Komponenten überexprimieren. Beispielsweise offenbart die WO 92/06221 Verfahren zur genetischen Manipulation von Trichoderma reesei, sodass sie unfähig zur Expression einer oder mehrerer CBH-Komponenten und/oder einer oder mehrerer EG-Komponenten ist. Darüber hinaus erzeugen die Verfahren dieser Anmeldung Trichoderma reesei-Stämme, die keinerlei heterologe Proteine exprimieren. Ähnlich offenbaren Miller et al., ”Direct and Indirect Gene Replacement in Aspergillus nidulans”, Molecular and Cellular Biology, S. 1714–1721 (1985), Verfahren zur Deletion von Genen in Aspergillus nidulans” durch DNA-vermittelte Transformation unter Verwendung eines linearen Fragments von homologer DNA. Die Verfahren von Miller et al. erzielen Gendeletion ohne Produktion jeglicher heterologer Proteine.
In Anbetracht dessen hat die Deletion der für die Produktion von CBHI- und/oder CBHII-Cellulasekomponenten verantwortlichen Gene auch den Effekt der Anreicherung der Menge der in der Cellulasezusammensetzung vorhandenen EG-Komponenten. Auf ähnliche Weise führt die Deletion dieser für die Produktion von CBHI- und CBHII-Komponenten verantwortlichen Gene zu einer Cellulasezusammensetzung frei von CBH-Komponenten.
Es ist weiters vorgesehen, dass hierin Pilzcellulasezusammensetzungen aus pilzlichen Quellen verwendet werden können, die eine unvollständige Pilzcellulasezusammensetzung produzieren. Beispielsweise ist bekannt, dass gewisse Pilze Cellulasezusammensetzungen frei von CBH-Komponenten produzieren. Siehe beispielsweise Coughlan et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, Hubert et al. (Hrsg.), Academic Press, S. 11–30 (1988), die offenbaren, dass Braufäulepilze dem Anschein nach keine CBH-Komponenten produzieren, jedoch ist es möglich, dass eine oder mehrere dieser Komponenten CBHI-Komponenten sind.
”β-Glucosidase-(BG-)Komponenten” betreffen jene Komponenten von Cellulase, die BG-Aktivität aufweisen; das heißt, dass solche Komponenten von nichtreduzierenden Ende von Cellobiose oder anderen löslichen Cellooligosacchariden (”Cellobiose”) her wirken und Glucose als das einzige Produkt bilden. BG-Komponenten adsorbieren nicht an oder reagieren nicht mit Cellulosepolymeren. Darüber hinaus werden solche BG-Komponenten durch Glucose vollständig inhibiert (K_i etwa 1 mM). Obwohl BG-Komponenten streng genommen eigentlich keine Cellulasen sind, da sie Cellulose nicht abbauen können, sind solche BG-Komponenten in der Definition des Cellulasesystems eingeschlossen, da diese Enzyme den Gesamtabbau von Cellulose erleichtern, und zwar durch weiteren Abbau der inhibierenden Celluloseabbauprodukte (insbesondere Cellobiose), die durch die gemeinsame Wirkung von CBH-Komponenten und EG-Komponenten produziert werden. Ohne die Anwesenheit von BG-Komponenten tritt gewöhnlich mäßige oder wenig Hydrolyse kristalliner Cellulose auf. BG-Komponenten werden oft an Arylsubstraten, wie z. B. p-Nitrophenyl-β-D-glucosid (PNPG) charakterisiert und werden folglich oft als Aryl-Glucosidasen bezeichnet. Es sollte angemerkt werden, dass nicht alle Aryl-Glucosidasen BG-Komponenten sind, insofern als einige Cellobiose nicht hydrolysieren.
Es ist vorgesehen, dass die An- oder Abwesenheit von BG-Komponenten in der Cellulasezusammensetzung verwendet werden kann, um die Aktivität jeglicher CBH-Komponenten in der Zusammensetzung zu regulieren (d. h. Nicht-CBHI-Komponenten). Im Speziellen wird die Abwesenheit von BG-Komponenten in der Cellulasezusammensetzung die CBH-Aktivität ”ausschalten” wenn die Cellobiosekonzentration inhibierende Niveaus erreicht, da im Zuge des Celluloseabbaus durch CBH-Komponenten Cellobiose gebildet wird und weil bekannt ist, dass hohe Konzentrationen von Cellobiose die CBH-Aktivität inhibieren, und weiters, weil solche Cellobiose durch BG-Komponenten zu Glucose hydrolysiert wird. Es ist ebenfalls vorgesehen, dass eine oder mehrere Additive (z. B. Cellobiose, Glucose usw.) der Cellulasezusammensetzung zugesetzt werden können um CBHI-Aktivität sowie andere CBH-Aktivitäten effektiv ”auszuschalten”. Wenn solche Additive angewendet werden, wird die resultierende Zusammensetzung als eine Zusammensetzung frei von allen CBHI-Komponenten betrachtet, sofern die Menge des Additivs ausreicht um zu keiner wirksamen CBHI-Aktivität zu führen.
Andererseits kann eine Cellulasezusammensetzung, die zugesetzte Mengen an BG-Komponenten enthält, die Gesamthydrolyse von Cellulose steigern, wenn in Abwesenheit von zugesetzten BG-Komponenten das Niveau der durch CBH-Komponenten gebildeten Cellobiose für eine solche Gesamthydrolyse limitierend wird.
Verfahren, um die Menge von BG-Komponenten in der Cellulasezusammensetzung entweder zu erhöhen oder zu verringern, sind in der EP-A-562.003 offenbart.
Pilzcellulasen können mehr als eine BG-Komponenten enthalten. Die verschiedenen Komponenten besitzen im Allgemeinen verschiedene isoelektrische Punkte, was deren Trennung mittels Ionenaustauschchromatographie und dergleichen erlaubt. Es kann entweder eine einzelne BG-Komponente oder eine Kombination von EG-Komponenten angewendet werden.
In Behandlungslösungen für Textilien eingesetzt wird die BG-Komponente im Allgemeinen in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, um die Inhibierung jeglicher in der Cellulasezusammensetzung vorliegender CBH- und EG-Komponenten zu verhindern. Die Menge an zugesetzter BG-Komponente hängt von der Menge von Cellobiose ab, die in der Textilzusammensetzung produziert wird und die durch den qualifizierten Fachkundigen leicht bestimmt werden kann. Jedoch betragen die Gewichtsprozente der BG-Komponente relativ zu jeglichen, in der Cellulasezusammensetzung vorhandenen CBH-Komponenten vorzugsweise etwa 0,2 bis etwa 10 Gewichtsprozent und noch bevorzugter etwa 0,5 bis zu etwa 5 Gewichtsprozent.
Bevorzugte Pilzcellulasen für die Verwendung zur Herstellung der in dieser Erfindung verwendeten Pilzcellulase-Zusammensetzungen sind jene, die von Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Penicillium sp., Humicola insolens und dergleichen erhalten werden. Bestimmte Pilzcellulasen sind im Handel erhältlich, d. h. CELLUCLAST (erhältlich von Novo Industry, Copenhagen, Dänemark), RAPIDASE (erhältlich von Gist Brocades, N. V., Delft, Holland), CYTOLASE 123 (erhältlich von Genencor International, South San Francisco, California) und dergleichen. Andere Pilzcellulasen können mittels fachbekannter Fermentations- und Isolierungsverfahren leicht isoliert werden.
Der Begriff ”Puffer” betrifft fachbekannte Säure/Basen-Reagenzien, welche die Cellulaselösung gegen unerwünschte pH-Verschiebungen während der Cellulasebehandlung baumwollhältiger Gewebe stabilisiert. In diesem Zusammenhang ist im Fach anerkannt, dass Cellulaseaktivität pH-abhängig ist. Das heißt, dass eine spezifische Cellulasezusammensetzung innerhalb eines definierten pH-Bereichs cellulolytische Aktivität aufweist, wobei optimale cellulolytische Aktivität im Allgemeinen innerhalb eines kleinen Teils dieses definierten Bereichs gefunden wird. Der spezifische pH-Bereich für cellulolytische Aktivität variiert mit jeder Cellulasezusammensetzung. Wie oben angemerkt, gibt es einige Cellulasezusammensetzungen, die cellulolytische Aktivität mit einem alkalischen pH-Profil aufweisen, obgleich die meisten Cellulasen cellulolytische Aktivität innerhalb eines sauren bis neutralen pH-Profils aufweisen.
Während der Cellulasebehandlung des baumwollhältigen Gewebes ist es möglich, dass der pH der eingesetzten Cellulaselösung außerhalb des für Cellulaseaktivität erforderlichen Bereichs liegt. Es ist weiters möglich, dass der pH sich während der Behandlung des baumwollhältigen Gewebes ändert, beispielsweise durch Bildung eines Reaktionsprodukts, das den pH der Lösung verändert. In jedem Fall kann der pH einer ungepufferten Cellulaselösung außerhalb des für cellulolytische Aktivität erforderlichen Bereichs hegen. Wenn dies auftritt, erfolgt eine unerwünschte Herabsetzung oder Stillstand cellulolytischer Aktivität in der Cellulaselösung. Beispielsweise wird der pH der Lösung zu niedrigerer cellulolytischer Aktivität und Möglicherweise zum Stillstand cellulolytischer Aktivität führen, wenn eine Cellulase mit einem sauren Aktivitätsprofil in einer neutralen, ungepufferten wässrigen Lösung angewendet wird. Andererseits sollte die Verwendung einer Cellulase mit neutralem oder alkalischem pH-Profil in neutraler, ungepufferter wässriger Lösung anfänglich eine signifikante cellulolytische Aktivität liefern.
Im Hinblick dessen sollte der pH der Cellulaselösung innerhalb des für cellulolytische Aktivität erforderlichen Bereichs gehalten erden. Ein einfaches Mittel, um dies zu erreichen ist die Beobachtung des pH-Werts des Systems und die Einstellung des erforderlichen pH durch Zusatz von entweder einer Säure oder einer Base. Jedoch wird in einer bevorzugten Ausführungsform der pH des Systems vorzugsweise innerhalb des gewünschten pH-Bereichs gehalten, indem ein Puffer im Cellulasesystem verwendet wird. Im Allgemeinen wird eine ausreichende Menge Puffer angewendet, sodass der pH der Lösung innerhalb des Bereichs, worin die angewendete Cellulase Aktivität aufweist, gehalten wird. Soweit unterschiedliche Cellulasezusammensetzungen unterschiedliche pH-Bereiche zur Entfaltung von Cellulaseaktivität aufweisen, wird der spezifisch angewendete Puffer in Beziehung zur spezifisch angewendeten Cellulasezusammensetzung ausgewählt. Der/die zur Verwendung mit der angewendeten Cellulasezusammensetzung ausgewählte(n) Puffer kann unter Berücksichtigung des pH-Bereichs und dem Optimum für die angewendete Cellulasezusammensetzung sowie dem pH der Cellulaselösung vom geübten Fachkundigen leicht bestimmt werden. Vorzugsweise ist der angewendete Puffer einer, der mit der Cellulasezusammensetzung kompatibel ist und der den pH der Cellulaselösung innerhalb des für optimale Aktivität erforderlichen pH-Bereichs hält. Geeignete Puffer umfassen Natriumcitrat, Ammoniumacetat, Natriumacetat, Dinatriumphosphat und jeder andere fachbekannte Puffer.
Die Zugfestigkeit baumwollhältiger Gewebe kann in Ketten- und Schuss-Richtung gemessen werden, die im rechten Winkel zueinander stehen. Demgemäß betrifft der Begriff ”Kett-Zugfestigkeit”, wie hierin verwendet, die gemessene Zugfestigkeit des baumwollhältigen Gewebes längsseitig des baumwollhältigen Gewebes, während der Begriff ”Schuss-Zugfestigkeit” die gemessene Zugfestigkeit des baumwollhältigen Gewebes quer über die Breite des baumwollhältigen Gewebes betrifft. Die Zugfestigkeit des erhaltenen Gewebes, das mit einer Cellulaselösung behandelt wurde, wird mit dessen Zugfestigkeit vor der Behandlung mit der Cellulaselösung verglichen, um den die Zugfestigkeit herabsetzenden Effekt der Behandlung zu bestimmen. Wenn die Zugfestigkeit zu stark herabgesetzt wird, reißt das erhaltene baumwollhältige Gewebe leicht und/oder bildet Löcher. Demgemäß ist es wünschenswert, eine Zugfestigkeit (sowohl von Kette als auch Schuss) nach der Behandlung aufrecht zu erhalten, die zumindest etwa 50% der Zugfestigkeit vor der Behandlung entspricht.
Die Zugfestigkeit baumwollhältiger Gewebe ist durch Befolgung des ASTM D1682-Testverfahrens leicht durchzuführen. Geeignete Geräte zum Testen der Zugfestigkeit solcher Gewebe umfassen Scott-Prüfgerät oder Instron-Prüfgerät, wovon beide im Handel erhältlich sind. Bei der Prüfung der Zugfestigkeit baumwollhältiger Gewebe, die mit Cellulaselösungen behandelt worden sind, sollte darauf geachtet werden, Gewebeschrumpfung nach Behandlung und vor der Prüfung zu verhindern. Eine solche Schrumpfung führt zu falschen Zugfestigkeitsdaten.
Verbesserungen an baumwollhältigen Geweben wird durch jene Verfahren erzielt, die vordem verwendet wurden. Beispielsweise können baumwollhältige Gewebe mit verbessertem Griff gemäß den japanischen Patentanmeldungen Nr. 58-36217 und 58-54032 sowie Ohishi et al., ”Reformation of Cotton Fabric by Cellulase” und JTN-Zeitschriftenartikel ”What's New – Weight Loss Treatment to Soften the Touch of Cotton Fabric” vom Dezember 1988 erhalten werden.
Auf ähnliche Weise umfassen Verfahren zur Verbesserung von sowohl Griff als auch Aussehen baumwollhältiger Gewebe das Zusammenbringen des Gewebes mit einer wässrigen, Cellulase enthaltenden Lösung unter solchen Bedingungen, dass die Lösung gerührt und dass ein Kaskadeneffekt der Cellulaselösung auf dem baumwollhältigen Gewebe erzielt wird. Solche Verfahren führen zu verbessertem Griff und Aussehen der so behandelten baumwollhältigen Gewebe und sind in der EP-A-553.270 beschrieben.
Verfahren zur Verbesserung baumwollhältiger Strickwaren sind im International Textile Bulletin, Dyeing/Printing/Finishing, S. 5ff (2. Quartal 1990) beschrieben.
Desgleichen sind Verfahren zur Verleihung von Stone-Washed-Aussehen an baumwollhältige Denimgewebe in der US-A-4.832.864 beschrieben.
Andere Verfahren zur Verbesserung baumwollhältiger Gewebe durch Behandlung mit einer Cellulasezusammensetzung ist gut fachbekannt. Vorzugsweise wird in solchen Verfahren die Behandlung des baumwollhältigen Gewebes vor der Appretur des baumwollhältigen Gewebes durchgeführt.
Wie oben angemerkt ist die vorliegende Erfindung insofern eine Verbesserung früherer technischer Verfahren zur Behandlung baumwollhältiger Gewebe, als die vorliegende Erfindung eine spezifische Cellulasezusammensetzung anwendet, die Festigkeitsverlust der behandelten Faser minimiert. Die hierin angewendete Cellulasezusammensetzung ist eine Pilzcellulase-Zusammensetzung, die im Wesentlichen frei von CBHI-Komponenten und vorzugsweise im Wesentlichen frei von allen CBH-Komponenten ist.
Zusätzlich führt die Verwendung der hierin beschriebenen Cellulasezusammensetzungen auch zur Gewebe/Farbverstärkung von belasteten baumwollhältigen Geweben. Im Speziellen kann das Gewebe während der Herstellung baumwollhältiger Gewebe belastet werden, und bei derartiger Belastung enthält es gebrochene und desorientierte Fasern. Solche Fasern verleihen dem Gewebe ein nachteiliges abgetragenes, mattes Aussehen. Wenn sie jedoch nach dem Verfahren der der vorliegenden Erfindung behandelt wird, wird die so belastete Faser einer Gewebe/Farbverstärkung unterworfen. Es wird angenommen, dass dies aus der Entfernung einiger der gebrochenen und desorientierten Fasern resultiert, was den Effekt der Wiederherstellung des Aussehens des Gewebes vor der Belastung hat.
Zusätzlich ist vorgesehen, dass durch Anwendung der hierin beschriebenen Cellulasezusammensetzung auf pigmentartig gefärbte Gewebe (z. B. Denimgewebe) diese Cellulasezusammensetzungen eine verringerte Wiederablagerung von Farbstoff bewirken. Es ist ebenfalls vorgesehen, dass diese Anti-Wiederablagerungseigenschaften für eine oder mehrere spezifische EG-Komponente(n) im Vergleich zu anderen Komponenten verstärkt werden kann.
Die oben beschriebenen Pilzcellulase-Zusammensetzungen werden in einer wässrigen Lösung angewendet, die Cellulase und andere, optionale Inhaltsstoffe, die beispielsweise einen Puffer, ein Waschmittel, ein Scheuermittel und dergleichen umfassen, enthält. Die Konzentration der in dieser Lösung angewendeten Cellulasezusammensetzung ist im Allgemeinen eine Konzentration, die für deren beabsichtigten Zweck ausreicht. Das heißt, dass eine Menge der Cellulasezusammensetzung angewendet wird, die zu der/den gewünschten Verbesserung(en) des baumwollhältigen Gewebes führt. Die Menge der angewendeten Cellulasezusammensetzung ist hängt auch von der angewendeten Anlage, den angewendeten Prozessparametern (die Temperatur der Cellulaselösung, die Einwirkzeit auf die Cellulaselösung und dergleichen), der Cellulaseaktivität (z. B. wird eine Cellulaselösung im Vergleich zu einer weniger aktiven Cellulasezusammensetzung, eine niedrigere Konzentration einer aktiveren Cellulasezusammensetzung erfordern) und dergleichen ab. Die genaue Konzentration der Cellulasezusammensetzung kann basierend auf den obigen Faktoren sowie den gewünschten Effekten vom geübten Praktiker leicht bestimmt werden. Vorzugsweise beträgt die Konzentration der Cellulasezusammensetzung in der hierin angewendeten Cellulaselösung etwa 0,01 g/Liter Cellulaselösung bis zu etwa 10 g/Liter Cellulaselösung; und noch bevorzugter etwa 0,05 g/Liter Cellulaselösung bis zu etwa 2 g/Liter Cellulaselösung. (Die oben angeführte Cellulasekonzentration bezieht sich auf das Gewicht an Gesamtprotein).
Wenn in der Cellulaselösung ein Puffer angewendet wird, ist die Konzentration des Puffers in der wässrigen Cellulaselösung jene, die ausreicht, um den pH der Lösung innerhalb des Bereichs zu halten, in dem die angewendete Cellulase Aktivität aufweist, die ihrerseits von der Art der angewendeten Cellulase abhängt. Die genaue Konzentration des angewendeten Puffers hängt von mehreren Faktoren ab, die der geübte Praktiker leicht berücksichtigen kann. Beispielsweise werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Puffer sowie die Pufferkonzentration so gewählt, dass der pH der Cellulaselösung innerhalb des für optimale Cellulaseaktivität erforderlichen Bereichs gehalten wird. Im Allgemeinen beträgt die Pufferkonzentration in der Cellulaselösung etwa 0,005 N und höher. Vorzugsweise beträgt die Pufferkonzentration in der Cellulaselösung von etwa 0,01 bis etwa 0,5 N und noch bevorzugter von etwa 0,05 bis etwa 0,15 N. Es ist möglich, dass erhöhte Pufferkonzentrationen in der Cellulaselösung die Geschwindigkeit des Zugfestigkeitsverlustes des behandelten Gewebes erhöht.
Zusätzlich zur Cellulase und einem Puffer kann die Cellulaselösung optional eine kleine Menge eines Tensids, d. h. weniger als etwa 2 Gewichtsprozent und vorzugsweise etwa 0,01 bis etwa 2 Gewichtsprozent enthalten. Geeignete Tenside umfassen jedes Tensid, das mit der Cellulase und dem Gewebe kompatibel ist, einschließlich z. B. anionische, nichtionische und amphotere Tenside.
Zur Verwendung hierin geeignete anionische Tenside umfassen lineare oder verzweigte Alkylbenzolsulfonate; Alkyl- oder Alkenylethersulfate mit linearen oder verzweigten Alkylgruppen oder Alkenylgruppen; Alkyl- oder Alkenylsulfate; Olefinsulfonate; Alkansulfonate und dergleichen. Geeignete Gegenionen für anionische Tenside umfassen Alkalimetallionen, wie z. B. Natrium und Kalium; Erdalkalimetallionen, z. B. Calcium und Magnesium; Ammoniumion und Alkanolamine mit 1 bis 3 Alkanolgruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 oder 3.
Amphotere Tenside umfassen quaternäre Ammoniumsalzsulfonate, Betain-artige amphotere Tenside und dergleichen. Solche amphotere Tenside besitzen sowohl positiv als auch negativ geladene Gruppen an demselben Molekül.
Nichtionische Tenside umfassen im Allgemeinen Polyoxyalkylenether, sowie höhere Fettsäurealkanolamide oder Alkylenoxid-Addukt davon, Fettsäureglycerinmonoester und dergleichen.
Mischungen solcher Tenside können auch verwendet werden.
Die hierin verwendeten Flottenverhältnisse, d. h. das Verhältnis des Gewichts der Cellulaselösung zum Gewicht des Gewebes, ist im Allgemeinen eine Menge, die ausreicht, um die gewünschten Verbesserungen im baumwollhältigen Gewebe zu erzielen und hängt vom verwendeten Prozess und der zu erzielenden Verbesserung ab. Vorzugsweise liegen die Flottenverhältnisse im Allgemeinen bei etwa 0,1:1 und höher und noch bevorzugter höher als etwa 1:1 und noch bevorzugter höher als etwa 10:1. Der Einsatz von Flottenverhältnissen über etwa 50:1 ist für gewöhnlich von einem wirtschaftlichen Standpunkt aus nicht bevorzugt.
Die Reaktionstemperaturen für die Cellulasebehandlung sind durch zwei in Konkurrenz stehende Faktoren bestimmt. Erstens entspricht höhere Reaktionstemperatur im Allgemeinen einer erhöhten Reaktionskinetik, d. h. schnelleren Reaktionen, welche verminderte Reaktionszeiten im Vergleich zu erforderlichen Reaktionszeiten bei niedrigeren Temperaturen erlaubt. Demgemäß sind Reaktionstemperaturen im Allgemeinen zumindest etwa 30°C und höher. Zweitens ist Cellulase ein Protein, das jenseits einer gegebenen Temperatur an Aktivität verliert. Diese Temperatur ist von der Art der verwendeten Cellulase abhängig. Folglich geht die cellulolytische als ein Ergebnis der Denaturierung von Cellulase verloren, wenn ein zu hohes Ansteigen der Reaktionstemperatur erlaubt wird. Aufgrund dessen sind die hierin verwendeten maximalen Reaktionstemperaturen im Allgemeinen etwa 65°C. Angesichts des obigen sind die Reaktionstemperaturen im Allgemeinen von etwa 30°C bis etwa 65°C; vorzugsweise von etwa 35°C bis etwa 60°C; und noch bevorzugter von etwa 35°C bis etwa 50°C.
Die Reaktionszeiten betragen im Allgemeinen etwa 0,1 Stunden bis etwa 24 Stunden und vorzugsweise etwa 0,25 Stunden bis etwa 5 Stunden.
Die mit den oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Cellulasezusammensetzungen behandelten, baumwollhältigen Gewebe besitzen herabgesetzte Festigkeitsverluste im Vergleich mit demselben baumwollhältigen Gewebe, das in derselben Weise mit einer vollständigen Pilzcellulase-Zusammensetzung behandelt wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann zur Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren ein Konzentrat hergestellt werden. Solche Konzentrate enthalten für gewöhnlich konzentrierte Mengen der oben beschriebenen Cellulasezusammensetzungen, Puffer und Tensid, vorzugsweise in wässriger Lösung. Wenn so formuliert, kann das Konzentrat leicht mit Wasser verdünnt werden, um so schnell und genau Cellulaselösungen mit den notwendigen Konzentrationen dieser Additive herzustellen. Vorzugsweise bestehen solche Konzentrate aus etwa 0,1 bis etwa 20 Gewichtsprozent einer oben beschriebenen Cellulasezusammensetzung (Protein); etwa 10 bis etwa 50 Gewichtsprozent Puffer; etwa 10 bis etwa 50 Gewichtsprozent Tensid; und etwa 0 bis 80 Gewichtsprozent Wasser. Wenn wässrige Konzentrate formuliert werden, können diese Konzentrate um Faktoren von etwa 2. bis etwa 200 verdünnt werden, um zur benötigten Konzentration der Komponenten in der Cellulaselösung zu gelangen. Wie ohne weiteres einsichtig ermöglichen solche Konzentrate die einfache Formulierung der Cellulaselösungen und erlauben einen gangbaren Transport des Konzentrats zum Einsatzort. Die Cellulasezusammensetzung, wie sie oben beschrieben ist, kann dem Konzentrat entweder in einem flüssigen Verdünner, in Granulaten, in Emulsionen, in Gelen, in Pasten und dergleichen zugesetzt werden. Solche Formen sind dem geübten Praktiker gut bekannt.
Wenn ein festes Cellulasekonzentrat angewendet wird, ist die Cellulasezusammensetzung im Allgemeinen ein Granulat, ein Pulver, ein Agglomerat und dergleichen. Wenn Granulat verwendet wird, kann das Granulat vorzugsweise so formuliert werden, dass es ein Cellulase-schützendes Agens enthält. Ebenso kann das Granulat so formuliert werden, dass es Materialien enthält, welche die Geschwindigkeit des Auflösens des Granulats in das Waschmedium herabsetzt.
Es ist vorgesehen, dass die hierin beschriebenen Cellulasezusammensetzungen zusätzlich in einer Vorwäsche und als Voreinweichmittel als Flüssigkeit oder Spray verwendet werden können. Es ist weiters vorgesehen, dass die hierin beschriebenen Cellulasezusammensetzungen auch für den Hausgebrauch als alleinstehende Zusammensetzung verwendet werden kann, die zur Verstärkung von Farbe und Aussehen von Geweben geeignet ist. Siehe beispielsweise US-A-4.738.682 .
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und schränken den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise ein.
Beispiele
Die Beispiele 1–12 und 22–30 zeigen die Herstellung von genetisch so manipulierter Trichoderma reesei, dass sie zur Produktion einer oder mehrerer Cellulasekomponenten unfähig ist, oder so, dass sie spezifische Cellulasekomponenten überproduziert.
Beispiel 1
Selektion bezüglich pyr4^–-Abkömmlingen von Trichoderma reesei
Das pyr4-Gen kodiert für Orotidin-5'-monophosphat_Decarboxylase, ein Enzym, das für die Biosynthese von Uridin benötigt wird. Der toxische Inhibitor 5-Fluororotinsäure (FOA) wird durch Wildform-Zellen in Uridin eingebaut und vergiftet folglich die Zellen. Jedoch sind Zellen mit fehlendem pyr4-Gen gegen diesen Inhibitor resistent, benötigen aber Uridin zum Wachstum. Es ist daher möglich, unter Verwendung von FOA auf pyr4-Stammabkömmlinge zu selektieren. Praktisch wurden Sporen von T. reesei-Stamm RL-P37 (G. Sheir-Neiss und B. S. Montenecourt, Appl. Microbiol. Biotechnol. 20, 46–53 (1984)) auf die Oberfläche eines verfestigten Mediums verteilt, das 2 mg/ml Uridin und 1,2 mg/ml FOA enthielt. Spontane, FOA-resistente Kolonien erschienen innerhalb von drei bis vier Tagen und es war möglich, darauf folgend jene FOA-resistenten Abkömmlinge zu isolieren, die für das Wachstum Uridin benötigten. Um jene Abkömmlinge zu identifizieren, die spezifisch ein defektives pyr4-Gen besaßen, wurden Protoplasten erzeugt und mit einem Plasmid transformiert, das ein Wildform-pyr4-Gen enthielt (siehe Beispiele 3 und 4). Nach der Transformation wurden Protoplasten auf einem Medium ohne Uridin ausplattiert. Darauf folgendes Wachstum transformierter Kolonien demonstriert die Komplementierung eines defektiven pyr4-Gens durch das plasmidübertragende pyr4-Gen. Auf diese Weise wurde der Stamm GC69 als ein pyr4^–-Abkömmling von Stamm RL-P37 identifiziert.
Beispiel 2
Herstellung von CBHI-Deletionsvektor
Ein Gen, das für das CBHI-Gen kodiert, wurde aus der genomischen DNA von T. reesei-Stamm RL-P37 kloniert und zwar durch Hybridisierung mit einer Oligonukleotid-Sonde, konstruiert auf Basis der publizierten Sequenz für dieses Gen unter Verwendung bekannter Sonden-Syntheseverfahren (Shoemaker et al. (1983b)). Das cbh1-Gen befindet sich auf einem PstI-Fragment von 6,5 kb und wurde in PstI-geschnittenes pUC4K (erworben von Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, USA) insertiert – und ersetzte das Kan^r-Gen dieses Vektors – unter Verwendung fachbekannter Verfahren, die in Maniatis et al. (1989) beschrieben sind und hierin durch Verweis aufgenommen sind. Das gebildete Plasmid, pUC4K::cbh1 wurde dann mit HindIII geschnitten und das größere Fragment von etwa 6 kb isoliert und neu ligiert, um zu pUC4K::cbh1ΔH/H (siehe 1) zu führen. Dieses Verfahren entfernt die gesamte cbh1-kodierende Sequenz und etwa 1,2 kb stromauf und 1,5 kb stromab der flankierenden Sequenzen. Es verbleiben etwa 1 kb der flankierenden DNA beider Enden des ursprünglichen PstI-Fragments.
Das pyr4-Gen von T. reesei wurde als ein 6,5 kb-HindIII-Fragment genomischer DNA in pUC18 kloniert, um unter Befolgung der Verfahren von Maniatis et al. (s. o.) pTpyr2 (Smith et al. (1991)) zu bilden. Das Plasmid pUC4K::cbh1ΔH/H wurde mit HindIII geschnitten und die Enden mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert. Diese enddephosphorylierte DNA wurde mit dem 6,5 kb-HindIII-Fragment, welches das pyr4-Gen von T. reesei enthielt, ligiert und führte zu pΔCBHIpyr4. 1 veranschaulicht die Konstruktion dieses Plasmids.
Beispiel 3
Isolierung von Protoplasten
Myzel wurde erhalten, indem 100 ml YEG (0,5% Hefeextrakt, 2% Glucose) in einem 500 ml-Kolben mit etwa 5 × 10⁷ Sporen von T. reesei GC69 (der pyr4-Abkömmlingsstamm) inokuliert wurden. Der Kolben wurde dann unter Schütteln bei 37°C für etwa 16 Stunden inkubiert. Das Myzel wurde durch Zentrifugation bei 2.750 × g geerntet. Das geerntete Myzel wurde in einer 1,2 M Sorbit-Lösung weiter gewaschen und in 40 ml einer Lösung resuspendiert, die 5 mg/ml Novozym^R 234-Lösung (dies ist der Markenname für ein Multikomponenten-Enzymsystem, das 1,3-α-Glucanase, 1,3-β-Glucanase, Laminarinase, Xylanase, Chitinase und Protease enthält, von Novo Biolabs, Danbury, Ct.); 5 mg/ml MgSO₄·7H₂0; 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin; 1,2 M Sorbit enthielt. Die Protoplasten wurden von den Zellbruchstücken durch Filtration durch Miracloth (Calbiochem Corp, La Jolla, CA, USA) entfernt und durch Zentrifugation bei 2.000 × g gesammelt. Die Protoplasten wurden drei Mal in 1,2 M Sorbit und einmal in 1,2 M Sorbit, 50 mM CaCl₂ gewaschen, zentrifugiert und in einer Dichte von etwa 2 × 10⁸ Protoplasten pro ml 1,2 M Sorbit, 50 mM CaCl₂ resuspendiert.
Beispiel 4
Transformation von Pilzprotoplasten mit pΔCBHIpyr4
200 μl der in Beispiel 3 hergestellten Protoplastensuspension wurden 20 μl von EcoRI-verdautem pΔCBHIpyr4 (hergestellt in Beispiel 2) in TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) und 50 μl einer Lösung von Polyethylenglykol (PEG), die 25% PEG 4000, 0,6 M KCl und 50 mM CaCl₂ enthielt, zugegeben. Diese Mischung wurde auf Eis für 20 Minuten inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurden 2,0 ml der oben definierten PEG-Lösung zugegeben, die Lösung wurde weiter gemischt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Nach dieser zweiten Inkubation wurden 4,0 ml einer 1,2 M Sorbit und 50 mM CaCl₂ enthaltenden Lösung zugegeben und diese Lösung wurde weiter gemischt. Die Protoplastenlösung wurde dann sofort zu geschmolzenen Allquoten von Vogel's Medium N (3 Gramm Natriumcitrat, 5 Gramm KH₂PO₄, 2 Gramm NH₄NO₃, 0,2 Gramm MgSO₄·7H₂O, 0,1 Gramm CaCl₂·2H₂O, 5 μg α-Biotin, 5 mg Zitronensäure, 5 mg ZnSO₄·7H₂O, 1 mg Fe(NH₄)₂·6H₂O, 0,25 mg CuSO₄·5H₂O, 50 μg MnSO₄·4H₂O pro Liter) zugesetzt, das zusätzlich 1% Glucose, 1,2 M Sorbit und 1% Agarose enthielt. Die Protoplasten/Medium-Mischung wurde dann auf festes Medium gegossen, welches dasselbe Vogel's Medium enthielt wie oben beschrieben. Im Medium war kein Uridin enthalten und daher waren nur transformierte Kolonien zum Wachstum fähig, und zwar infolge der Komplementation der pyr4-Mutation Stamm GC69 durch das Wildform-pyr4-Geninsert in pΔCBHIpyr4. Diese Kolonien wurden in Folge transferiert und an festem Vogel's Medium N gereinigt, das 1% Glucose als Zusatz enthielt, und stabile Transformanten wurden zur weiteren Analyse ausgewählt.
In diesem Stadium wurden stabile Transformanten von instabilen Transformanten durch ihre höhere Wachstumsgeschwindigkeit und die Bildung kreisrunder Kolonien mit glattem statt ausgefranstem Umriss auf festem Kulturmedium ohne Uridin unterschieden. In einigen Fällen wurde ein weiterer Stabilitätstest durchgeführt, und zwar durch Züchtung der Transformanten auf einem festen, nichtselektiven Medium (d. h. Uridin-enthaltend), Ernte von Sporen von diesem Medium und Bestimmung des Prozentanteils dieser Sporen, die darauf hin auskeimen und auf selektivem Medium ohne Uridin wachsen.
Beispiel 5
Analyse der Transformanten
DNA wurde aus den in Beispiel 4 erhaltenen Transformanten isoliert, nachdem sie in flüssigem, 1% Glucose enthaltendem Vogel's Medium N kultiviert worden waren. Diese Transformanten-DNA-Proben wurden mit einem PstI-Restriktionsenzym weiter geschnitten und Agarosegel-Elektrophorese unterworfen. Das Gel wurde dann auf ein Nytran-Membranfilter geblottet und mit einer ³²P-markierten pΔCBHIpyr4-Sonde hybridisiert. Die Sonde wurde ausgewählt, um das native cbg1-Gen als ein 6,5 bp PstI-Fragment, das native pyr4-Gen und jegliche vom transformierenden DNA-Fragment hergeleitete DNA-Sequenzen zu identifizieren.
Die radioaktiven Banden der Hybridisierung wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Das Autoradiogramm ist in 3 gezeigt. Fünf Proben wurden wie oben beschrieben laufen gelassen, nämlich die Proben A, B, C, D und E. Spur E ist der untransformierte Stamm GC69 und wurde in dieser Analyse als Kontrolle verwendet. Die Spuren A–D stellen Transformanten dar, die durch die oben beschriebenen Verfahren erhalten wurden. Die Zahlen an der Seite des Autoradiogramms stellen die Größen der Molekulargewichtsmarker dar. Wie aus diesem Autoradiogramm ersichtlich ist, enthält Spur D nicht die 6,5 kb-CBHI-Bande, was darauf hinweist, dass dieses Gen im Transformanten durch Integration des DNA-Fragments am cbh1-Gen vollständig deletiert worden ist. Der cbh1-deletierte Stamm wird mit P37PΔCBHI bezeichnet. 2 skizziert die Deletion des cbh1-Gens von T. reesei durch Integration über einen Doppel-Crossing-over-Vorgang des größeren EcoR-Fragments von pΔCBHIpyr4 am cbh1-Locus an einem der T. reesei-Chromosomen. Die anderen analysierten Transformanten stellten sich als identisch zum untransformierten Kontrollstamm heraus.
Beispiel 6
Analyse der Transformanten mit pΔCBHIpyr4
In diesem Beispiel wurde dasselbe Verfahren verwendet wie in Beispiel 5, außer dass die verwendete Sonde durch eine ³²P-markierte plntCBHI-Sonde ersetzt wurde. Diese Sonde ist ein pUC-Typ-Plasmid, das ein 2 kb-Bgl-Fragment aus dem cbh1-Locus innerhalb der Region, die pUC4K::cbh1ΔH/H-deletiert war, enthält. Zwei Proben wurden in diesem Beispiel verarbeitet, einschließlich einer Kontrolle, Probe A, welche der untransformierte Stamm GC69 ist, und des Transformanten pΔCBHIpyr4, Probe B. Wie in 4 zu sehen ist, enthielt Probe A das cbh1-Gen, angezeigt durch die Bande bei 6,5 kb; der Transformant, Probe B, enthält jedoch dies 6,5 kb-Bande nicht, enthält daher nicht das cbh1-Gen und enthält keinerlei vom pUC-Plasmid hergeleitete Sequenzen.
Beispiel 7
Proteinsekretion durch Stamm P37ΔCBHI
Sporen des erzeugten P37ΔCBHI-Stamms wurden in 50 ml eines Trichoderma-Basalmediums inokuliert, das 1% Glucose, 0,14% (NH₄)₂SO₄, 0,2% KH₂PO₄, 0,03% MgSO₄, 0,03% Harnstoff, 0,75% Bactotrypton, 0,05% Tween 80, 0,000016% CuSO₄·5H₂O, 0,001% FeSO₄·7H₂O, 0,000128% ZnSO₄·7H₂O, 0,0000054% Na₂MoO₄·2H₂O, 0,0000007% MnCl·4H₂O enthielt. Das Medium wurde unter Schütteln in einem 250 ml-Kolben bei 37°C für etwa 48 Stunden inkubiert. Das gebildete Myzel wurde mittels Filtration durch Miracloth (Calbiochem Corp.) gesammelt und zwei- oder dreimal mit 17 mM Kaliumphosphat gewaschen. Das Myzel wurde schließlich in 17 mM Kaliumphosphat mit 1 mM Sophorose suspendiert und für 24 Stunden bei 30°C unter Schütteln weiter inkubiert. Der Überstand von diesen Kulturen wurde dann gesammelt und das Myzel verworfen. Proben des Kulturüberstands wurden mittels isoelektrischer Fokussierung unter Verwendung eines Pharmacia Phastgel-Systems und pH 3–9 vorgegossenen Gelen gemäß der Anleitungen des Herstellers analysiert. Das Gel wurde durch Silberfärbung gefärbt, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Die dem cbh1-Protein entsprechende Bande fehlte, wie in 5 gezeigt ist, bei der von Stamm P37PΔCBHI hergeleiteten Probe. Das Gel der isoelektrischen Fokussierung zeigt eine Reihe von Proteinen in unterschiedlichen Kulturüberständen von T. reesei. Spur A ist teilweise gereinigte CBHI; Spur B ist der Überstand einer untransformierten T. reesei-Kultur; Spur C ist der Überstand von Stamm P37PΔCBHI, hergestellt gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung. Die Positionen der verschiedenen Cellulase-Komponenten sind mit CBHI, CBHII, EGI, EGII und EGIII bezeichnet. Da CBHI 50% des gesamten extrazellulären Proteins ausmacht, ist es das hauptsächliche, sekretierte Protein und folglich die dunkelste Bande am Gel. Dieses Gel der isoelektrischen Fokussierung zeigt eindeutig die Verarmung an CBHI-Protein im P37PΔCBHI-Stamm.
Beispiel 8
Herstellung von pPΔCBHII
Das cbh2-Gen von T. reesei, welches für das CBHII-Protein kodiert, ist als ein 4,1 kb-EcoRI-Fragment genomischer DNA kloniert worden und ist schematisch in 6A gezeigt (Chen et al., Biotechnology 5, 274–278 (1987)). Dieses 4,1 kb-Fragment wurde zwischen die EcoRI-Stellen von pUC4XL insertiert. Das letztere Plasmid ist ein pUC-Abkömmling (konstruiert von R. M. Berka, Genencor International Inc.), der eine multiple Klonierungsstelle mit einem symmetrischen Muster von Restriktionsendonukleasestellen besitzt, die in folgender Reihenfolge angeordnet sind: EcoRI, BamHI, SacI, SmaI, HindIII, XhoI, BglIII, ClaI, BglII, XhoI, HindIII, SmaI, SacI, BamHI, EcoRI. Unter Anwendung fachbekannter Verfahren ist ein Plasmid, pPΔCBHII (6B) konstruiert worden, in dem eine 1,7 kb-Zentralregion dieses Gens zwischen einer HindIII-Stelle (am 74 bp, 3' von der CBHII-Translationsinitiationsstelle) und einer ClaI-Stelle (am 265 bp, 3' vom letzten CBHII-Codon) entfernt und durch ein 1,6 kb-HindIII-ClaI-DNA-Fragment, welches das pyr4-Gen von T. reesei enthält, ersetzt worden ist.
Das pyr4-Gen von T. reesei wurde an einem 1,6 kb-NheI-SphI-Fragment aus pTpyr2 herausgeschnitten (siehe Beispiel 2) und zwischen den SphI- und XbaI-Stellen von pUC-219 insertiert (siehe Beispiel 25), um p219M zu erzeugen (Smith et al., Curr. Genet. 19, 27–33 (1991)). Das pyr4-Gen wurde dann als ein HindIII-ClaI-Fragment mit sieben bp von DNA an einem Ende und sechs bp von DNA am anderen Ende, hergeleitet von der multiplen Klonierungsstelle von pUC219, entfernt und in die HindIII- und ClaI-Stellen des cbh2-Gens insertiert und führte zum Plasmid pPΔCBHII (siehe 6B).
Verdau dieses Plasmids mit EcoRI setzt ein Fragment frei, das 0,7 kb flankierender DNA vom cbh2-Locus an einem Ende, 1,7 kb flankierender DNA vom cbh2-Lotus am anderen Ende und das pyr4-Gen von T. reesei in der Mitte besitzt.
Beispiel 9
Deletion des cbh2-Gens im T. reesei-Stamm GC69
Protoplasten von Stamm GC69 werden mit EcoRI-verdautem pPΔCBHII gemäß den in Beispielen 3 und 4 dargelegten Verfahren erzeugt und transformiert. DNA aus den Transformanten werden mit EcoRI und Asp718 verdaut und einer Agarosegelelektrophorese unterworfen. Die DNA vom Gel wird auf ein Membranfilter geblottet und gemäß den Verfahren von Beispiel 11 mit ³²P-markiertem pPΔCBHII hybridisiert. Transformanten mit einer Einzelkopie des genau am cbh2-Locus integrierten EcoRI-Fragments von pPΔCBHII werden identifiziert. Die Transformanten werden auch wie in Beispiel 7 in Schüttelkolben gezüchtet und das Protein der Kulturüberstände mittels isoelektrischer Fokussierung untersucht. Auf diese Weise werden Transformanten von T. reesei GC69 erzeugt, die das CBHII-Protein nicht produzieren.
Beispiel 10
Erzeugung eines pyr4^–-Abkömmlings von P37PΔCBHI
Sporen des Transformanten (P37PΔCBHI), bei dem das cbh1-Gen deletiert war, wurden auf FOA-enthaltendem Medium verteilt. Ein pyr4^–-Abkömmling dieses Transformanten wurde darauf folgend unter Verwendung der Verfahren von Beispiel 1 erhalten. Dieser pyr4^–-Stamm wurde P37PΔCBHIPyr^–26 genannt.
Beispiel 11
Deletion des cbh2-Gens in einem vorher cbh1-deletierten Stamm
Protoplasten von Stamm P37PΔCBHIPyr^–26 wurden gemäß den in den Beispielen 3 und 4 dargelegten Verfahren mit EcoRI-verdautem pPΔCBHII generiert und transformiert.
Gereinigte, stabile Transformanten wurden wie in Beispiel 7 in Schüttelkolben kultiviert und das Protein in den Überständen mittels isoelektrischer Fokussierung untersucht. Ein Transformant (P37PΔΔCBH67 genannt) wurde identifiziert, der keinerlei CBHII-Protein produzierte. Spur D in 5 zeigt den Überstand eines gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Transformanten, bei dem beide Gene, cbh1 und cbh2 deletiert waren.
DNA wurde aus Stamm P37PΔΔCBH67 extrahiert, mit EcoRI und Asp718 verdaut und Agarosegelelektrophorese unterworfen. Die DNA dieses Gels wurde auf ein Membranfilter geblottet und mit ³²-markiertem pPΔCBHII (7) hybridisiert. Spur A aus 7 zeigt das Hybridisierungsmuster, das für DNA aus einem untransformierten T. reesei-Stamm beobachtet wurde. Das Wildform-cbh2-Gen enthaltende 4,1 kb-EcoRI-Fragment wurde beobachtet. Spur B zeigt das Hybridisierungsmuster, das für den Stamm P37PΔΔCBH67 beobachtet wurde. Die einzelne 4,1 kb-Bande ist eliminiert und durch zwei Banden von etwa 0,9 und 3,1 kb ersetzt worden. Dies ist das zu erwartende Muster, wenn eine Einzelkopie des EcoRI-Fragments von pPΔCBHII genau am cbh2-Locus integriert worden wäre.
Dieselben DNA-Proben wurden auch mit EcoRI verdaut und Southern-Blot-Analyse wie oben durchgeführt. In diesem Beispiel war die Sonde ³²P-markiertes plntCBHII. Dieses Plasmid enthält einen Teil der für das cbh2-Gen kodierenden Sequenz innerhalb desjenigen Segments des cbh2-Gens, bei dem das Plasmid P37PΔΔCBHII deletiert war. Keine Hybridisierung wurde mit DNA aus Stamm P37PΔΔCBH67 beobachtet und zeigt, dass in diesem Stamm das cbh2-Gen deletiert und keine vom pUC-Plasmid hergeleiteten Sequenzen vorhanden waren.
Beispiel 12
Konstruktion von pEGIpyr4
Das egl1-Gen von T. reesei, welches für EGI kodiert, ist als ein HindIII-Fragment genomischer DNA aus Stamm RL-P37 durch Hybridisierung mit gemäß publizierter Sequenz (Penttila et al., Gene 45, 253–263 (1986); van Arsdell et al., Bio/Technology 5, 60–64 (1987)) synthetisierten Oligonukleotiden kloniert worden. Ein 3,6 kb-HindIII-BamHI-Fragment dieses Klons wurde mit einem 1,6 kb-HindIII-BamHI-Fragment ligiert, welches das pyr4-Gen aus T. reesei enthielt, welches aus pTpyr2 (siehe Beispiel 2) und pUC218 (identisch mit pUC219, siehe Beispiel 25, jedoch mit der multiplen Klonierungsstelle in umgekehrter Ausrichtung), geschnitten mit HindIII, erhalten wurde und führte zu Plasmid pEGIpyr4 (8). Verdau von pEGIpyr4 mit HindIII setzt üblicherweise eine DNA-Fragment frei, das nur die genomische DNA (die egl1- und pyr-Gene) von T. reesei enthält, mit Ausnahme von 24 bp sequenzierter, synthetischer DNA zwischen den beiden Genen und 6 bp sequenzierter, synthetischer DNA an einem Ende (siehe 8).
Beispiel 13
Reinigung von Cytolase 123-Cellulase in Cellulasekomponenten
CYTOLASE 123-Cellulase wurde auf folgende Weise fraktioniert. Die normale Verteilung der Cellulasekomponenten in diesem Cellulasesystem ist wie folgt:

CBHI 45–55 Gewichtsprozent

CBHII 13–15 Gewichtsprozent

EGI 11–13 Gewichtsprozent

EGII 8–10 Gewichtsprozent

EGIII 1–4 Gewichtsprozent

BG 0,5–1 Gewichtsprozent
Die Fraktionierung wurde unter Verwendung von Säulen durchgeführt, welche die folgenden Harze enthielten: Sephadex G-25 Gelfiltrationsharz von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA), QA Trisacryl M-Anionentauscherharz und SP Trisacryl M-Kationentauscherharz von IBF Biotechnics (Savage, MD). 0,5 g CYTOLASE 123-Cellulase wurde unter Verwendung einer Säule von 3 Litern Sephadex G-25-Gelfiltrationsharz mit 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,8 entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde dann auf eine Säule mit 20 ml QA Trisacryl M-Anionentauscherharz geladen. Die an diese Säule gebundene Fraktion enthielt CBHI und EGI. Diese Komponenten wurden unter Verwendung eines wässrigen Gradienten, der 0 bis etwa 500 mM Natriumchlorid enthielt, mittels Gradientenelution getrennt. Die nicht an diese Säule gebundene Fraktion enthielt CBHII und EGII. Diese Fraktionen wurden mittels einer Säule mit Sephadex G-25-Gelfiltrationsharz, äquilibriert mit 10 mM Natriumcitrat, pH 3,3 entsalzt. Diese Lösung, 200 ml, wurde dann auf eine Säule mit 20 ml SP Trisacryl M-Kationentauscherharz geladen. CBHII und EGII wurden unter Verwendung eines wässrigen Gradienten, der von 0 bis etwa 200 mM Natriumchlorid enthielt, getrennt eluiert.
Andere Cellulasesysteme, die unter Befolgung von Verfahren ähnlich den obigen aus Beispiel 13 in ihre Komponenten getrennt werden können, umfassen CELLUCLAST (erhältlich von Novo Industry, Copenhagen, Dänemark), RAPIDASE (erhältlich von Gist Brocades, N. V., Delft, Holland) und von Trichoderma koningii, Penicillium sp. und dergleichen hergeleitete Cellulasesysteme.
Beispiel 14
Reinigung von EGIII aus Cytolase 123-Cellulase
Das obige Beispiel 13 zeigte die Isolierung von mehreren Komponenten aus Cytolase 123-Cellulase. Da jedoch EGIII in Cytolase 123-Cellulase in sehr kleinen Mengen enthalten ist, wurde das folgende Verfahren angewendet, um diese Komponente zu isolieren.
A. Extraktion von EGIII-Cellulaseenzym im Großmaßstab
Einhundert Liter zellfreies Cellulasefiltrat wurde auf etwa 30°C erhitzt. Das erhitzte Material wurde auf etwa 4% (Gew./Vol.) PEG 8000 (Polyethylenglykol, MG etwa 8000) und etwa 10% (Gew./Vol.) wasserfreies Natriumsulfat gebracht. Die Mischung bildete eine zweiphasige, flüssige Mischung. Die Phasen wurden mittels einer SA-1-Stapelscheibenzentrifuge getrennt. Die Phasen wurden mittels isoelektrischer Fokussierung und Silberfärbung der Gele analysiert. Eine Trennung von EGIII und Xylanase wurde erhalten. Die gewonnene Zusammensetzung enthielt etwa 20 bis 50 Gewichtsprozent EGIII.
Bezüglich des obigen Verfahrens führte die Verwendung eines Polyethylenglykols mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 8000 zu mangelhafter Trennung; wogegen die Verwendung von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von größer als etwa 8000 zum Ausschluss des gewünschten Enzyms in der gewonnenen Zusammensetzung führte. Bezüglich der Menge von Natriumsulfat verursachten Natriumsulfatkonzentrationen von mehr als etwa 10% (Gew./Vol.) Präzipitationsprobleme; wogegen Natriumsulfatkonzentrationen von weniger als etwa 10% (Gew./Vol.) zu schlechter Trennung oder dazu führte, dass die Lösung in einer einzelnen Phase verblieb.
B. Reinigung von EGIII über Fraktionierung
Die Reinigung von EGIII wird durch Fraktionierung aus einer vollständigen Pilzcellulase-Zusammensetzung (CYTOLASE 123-Cellulase, im Handel erhältlich von Genencor International, South San Francisco, CA), die von der Wildform von Trichoderma reesei produziert wird, bewerkstelligt. Im Speziellen wird die Fraktionierung unter Verwendung von Säulen durchgeführt, welche die folgenden Harze enthalten: Sephadex G-25 Gelfiltrationsharz von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), QA Trisacryl M-Anionentauscherharz und SP Trisacryl M-Kationentauscherharz von IBF Biotechnics (Savage, MD, USA). 0,5 g CYTOLASE 123-Cellulase wird unter Verwendung einer Säule von 3 Litern Sephadex G-25-Gelfiltrationsharz mit 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,8 entsalzt. Die entsalzte Lösung wird dann auf eine Säule mit 20 ml QA Trisacryl M-Anionentauscherharz geladen. Die an diese Säule gebundene Fraktion enthielt CBHI und EGI. Die nicht an diese Säule gebundene Fraktion enthält CBHII, EGII und EGIII. Diese Fraktionen werden mittels einer Säule mit Sephadex G-25-Gelfiltrationsharz, äquilibriert mit 10 mM Natriumcitrat, pH 4,5 entsalzt. Diese Lösung, 200 ml, wird dann auf eine Säule mit 20 ml SP Trisacryl M-Kationentauscherharz geladen. Die EGIII wurde mit 100 ml einer wässrigen Lösung von 200 mM Natriumchlorid eluiert.
Um die Effizienz der Isolierung von EGIII zu erhöhen, kann es wünschenswert sein, Trichoderma reesei anzuwenden, die genetisch so manipuliert ist, dass sie nicht in der Lage ist, eines oder mehrere von EGI, EGII, CBHI und/oder CBHII zu produzieren. Die Abwesenheit einer oder mehrerer solcher Komponenten führt notwendigerweise zu effizienterer Isolierung von EGIII.
Desgleichen kann wünschenswert sein, die oben beschriebenen EGIII-Zusammensetzungen weiter zu reinigen, um im Wesentlichen reine EGII-Zusammensetzungen zu erhalten, d. h. Zusammensetzungen, die EGIII mit einem Anteil von mehr als etwa 80% des Proteins. Beispielsweise kann eine solche, im Wesentlichen reine EGIII erhalten werden, indem aus Verfahren A erhaltenes Material in Verfahren B und umgekehrt verwendet wird. Ein besonderes Verfahren zur weiteren Reinigung von EGIII ist die weitere Fraktionierung einer in Teil b) dieses Beispiels 14 erhaltenen EGIII-Probe. Die weitere Fraktionierung wurde an einem FPLC-System unter Verwendung einer Mono-S-HR 5/5-Säule (erhältlich von Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) durchgeführt. Das FPLC-System besteht aus einer Flüssigchromatographie-Steuerung, 2 Pumpen, einem Zweistrahlmonitor, einem Fraktionensammler und einem Schreiber (alle erhältlich von Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Die Fraktionierung wurde durchgeführt, indem 5 ml der in Teil b) dieses Beispiels 14 hergestellten EGIII-Probe mit einer 20 ml-Sephadex G-25-Säule entsalzt wurden, die vorher mit 10 mM Natriumcitrat, pH 4, äquilibriert worden ist. Die Säule wurde dann mit 0–200 mM eines wässrigen NaCl-Gradienten bei einer Flussrate von 0,5 ml/Minute eluiert und Proben als 1 ml-Fraktionen gesammelt. EGIII wurde in den Fraktionen 10 und 11 in einer durch SDS-Gelelektrophorese ermittelten Reinheit von 90% erhalten. EGIII dieser Reinheit ist zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz mittels bekannter Techniken geeignet.
Im Wesentlichen reine, im obigem Beispiel 13 gereinigte EGIII- sowie EGI- und EGII-Komponenten können einzeln oder als Mischungen in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese EG-Komponenten besitzen die folgenden Charakteristika:

MG pl pH-Optimum¹

EGI ca. 47–49 kD 4,7 ca. 5

EGII ca. 35 kD 5,5 ca. 5

EGIII ca. 25–28 kD 7,4 ca. 5,5–6,0

¹) pH-Optimum bestimmt mittels RBB-CMC-Aktivität gemäß Beispiel 15 unten.

Die Verwendung einer Mischung dieser Komponenten in der Ausführung dieser Erfindung kann im Vergleich zu einer einzelnen Komponente zu einer synergistischen Reaktion bei der Verbesserung von Weichheit, Griff, Aussehen usw. führen. Andererseits kann die Verwendung einer einzelnen Komponenten in der Ausführung dieser Erfindung stabiler sein oder ein breiteres Spektrum von Aktivität über einen Bereich von pH-Werten besitzen. Beispielsweise zeigt Beispiel 15 unten, dass EGIII unter alkalischen Bedingungen gegen RBB-CMC beträchtliche Aktivität besitzt.
Beispiel 15
Aktivität von Cellulasezusammensetzungen über einen pH-Bereich
Das folgende Verfahren wurde angewendet, um die pH-Profile von zwei unterschiedlichen Cellulasezusammensetzungen zu bestimmen. Die erste Cellulasezusammensetzung war eine CBHI- und II-deletierte Cellulasezusammensetzung, welche aus Trichoderma reesei hergestellt wurde, die in ähnlicher Weise wie oben beschrieben genetisch manipuliert war, sodass sie unfähig zur Produktion von CBHI- und CBHII-Komponenten war. Soweit diese Cellulasezusammensetzung nicht CBHI und CBHII enthält, die im Allgemeinen etwa 58 bis 70% einer von Trichoderma reesei hergeleiteten Cellulasezusammensetzung ausmachen, ist diese Cellulasezusammensetzung notwendigerweise frei von CBHI- und CBHII-Komponenten und demgemäß mit EG-Komponenten angereichert, d. h. EGI, EGII, EGIII und dergleichen.
Die zweite Cellulasezusammensetzung war eine zu etwa 20 bis 40% reine Fraktion von EGIII, die durch Reinigungsverfahren ähnlich Teil b) in Beispiel 14 aus einer von Trichoderma reesei hergeleiteten Cellulasezusammensetzung isoliert wurde.
Die Aktivität dieser Cellulasezusammensetzungen wurde bei 40°C bestimmt und die Bestimmungen wurden unter Verwendung folgender Verfahren durchgeführt.
Zusetzen von 5 bis 20 μl einer geeigneten Enzymlösung in einer Konzentration, die ausreicht, um die erforderliche Enzymmenge in der endgültigen Lösung zu erhalten. Zusetzen von 250 μl von 2 Gewichtsprozentiger RBB-CMC (Remazol Brilliant Blue R-Carboxymethylcellulose, im Handel erhältlich von MegaZyme, 6 Altona Place, North Rocks, N. S. W. 2151, Australien) in 0,05 M Citrat/Phosphatpuffer bei pH 4, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 und 8.
Schütteln mittels Vortex und inkubieren bei 40°C für 30 Minuten. Kühlen in einem Eisbad für 5 bis 10 Minuten. Zusetzen von 1000 μl Methylcellosolve, enthaltend 0,3 M Natriumacetat und 0,02 M Zinkacetat. Schütteln mittels Vortex und stehen lassen für 5–10 Minuten. Zentrifugieren und Abgießen des Überstands in Küvetten. Messung der optischen Dichte (OD) der Lösung in jeder Küvette bei 590 nm. Höhere Werte der optischen Dichte entsprechen höheren Enzymaktivitäten.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 9 dargestellt und veranschaulichen die relative Aktivität der CBHI- und CBHII-deletierten Cellulasezusammensetzung im Vergleich zur EGIII-Cellulasezusammensetzung. Aus dieser Figur ist ersichtlich, dass die CBHI- und CBHII-deletierte Cellulasezusammensetzung optimale Aktivität gegen RBB-CMC nahe bei pH 5,5 und etwas Aktivität bei alkalischen pH-Werten, d. h. bei pH-Werten von über 7 bis 8 besitzt. Andererseits besitzt die EGIII-angereicherte Cellulasezusammensetzung optimale cellulolytische Aktivität bei pH 5,5–6 und besitzt signifikante Aktivität bei alkalischen pH-Werten.
Nach obigem Beispiel müsste ein Fachkundiger lediglich den pH der wässrigen Textilienzusammensetzung einstellen und aufrechterhalten, sodass die Cellulasezusammensetzung aktiv ist und vorzugsweise optimale Aktivität besitzt. Wie oben angemerkt können solche Einstellungen und Aufrechterhaltungen die Verwendung eines geeigneten Puffers beinhalten.
Beispiel 16
Cellulasezusammensetzungen für Launderometer-Festigkeitsverlusts-Test
Dieses Beispiel untersucht die Fähigkeit verschiedener Cellulasezusammensetzungen, die Festigkeit baumwollhältiger Gewebe zu vermindern. Dieses Beispiel verwendet eine wässrige, auf pH 5 gehaltene Cellulaselösung, da die Aktivität der meisten von Trichoderma reesei hergeleiteten Cellulasekomponenten bei oder nahe pH 5 am höchsten ist und demgemäß Festigkeitsverlustergebnisse am augenscheinlichsten sind, wenn der Test bei etwa diesem pH durchgeführt wird.
Im Speziellen war die erste, in diesem Beispiel analysierte Cellulasezusammensetzung ein vollständiges Pilzcellulasesystem (CYTOLASE 123-Cellulase, im Handel erhältlich von Genencor International, South San Francisco, CA), der von der Wildform von Trichoderma reesei produziert und mit GC010 bezeichnet wird.
Die zweite analysierte Cellulasezusammensetzung war eine CBHII-deletierte Cellulasezusammensetzung, die aus Trichoderma reesei hergestellt wurde, die ähnlich wie in dem Beispielen 1 bis 12 oben und 22 bis 30 unten in einer Weise genetisch manipuliert war, sodass sie zur Expression von CBHII unfähig war und die mit CBHIId bezeichnet wird. Soweit CBHII bis zu etwa 15 Prozent der Cellulasezusammensetzung ausmacht, führt die Deletion dieser Komponente zu erhöhten Niveaus von CBHI und von allen EG-Komponenten.
Die dritte analysierte Cellulasezusammensetzung war eine CBHI- und CBHII-deletierte Cellulasezusammensetzung, die aus Trichoderma reesei hergestellt wurde, die ähnlich wie oben beschrieben in einer Weise genetisch manipuliert war, sodass sie zur Expression von CBHI und CBHII unfähig war, und die mit CBHI/IId bezeichnet wird. Soweit CBHI und CBHII durch diesen modifizierten Mikroorganismus nicht produziert werden, ist die Cellulase notwendigerweise frei von allen CBHI-Komponenten sowie allen CBH-Komponenten.
Die letzte analysierte Cellulasezusammensetzung war eine CBHI-deletierte Cellulasezusammensetzung, die aus Trichoderma reesei hergestellt wurde, die ähnlich wie oben beschrieben in einer Weise genetisch manipuliert war, sodass sie zur Expression von CBHI unfähig war und die mit CBHId bezeichnet wird. Soweit der modifizierte Mikroorganismus unfähig zur Expression von CBHI ist, ist diese Cellulasezusammensetzung notwendigerweise frei von allen CBHI-Komponenten.
Die oben beschriebenen Cellulasezusammensetzungen wurden in einem Launderometer auf ihren Effekt auf den Festigkeitsverlust baumwollhältiger Gewebe getestet. Die Zusammensetzungen wurden zunächst so normalisiert, dass gleiche Mengen von EG-Komponenten verwendet wurden. Jede Cellulasezusammensetzung wurde dann getrennten Lösungen von 400 ml eines auf pH 5 titrierten, 20 mM Citrat/Phosphatpuffers zugesetzt, der 0,5 ml eines nichtionischen Tensids enthielt. Jede der sich ergebenden Lösungen wurde dann in einen eigenen Launderometer-Kanister gegeben. Diesen Kanistern wurden 40 × 50 cm (16 Zoll × 20 Zoll) Baumwollgewebe (100% gewobene Baumwolle, erhältlich als Style No. 467 von Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Av., Middlesex, NJ 08846), sowie eine Anzahl von Murmelkugeln zugegeben, um den Festigkeitsverlust zu fördern. Der Kanister wurde dann verschlossen und der Kanister in das Launderometerbad gesenkt, das bei 43°C gehalten wurde. Der Kanister wurde dann im Bad mit einer Geschwindigkeit von mindestens etwa 40 Umdrehungen pro Minute (U/min) für etwa 1 Stunde rotiert. Danach wird der Stoff entfernt, gut gespült und in einem gewöhnlichen Trockner getrocknet.
Um die Festigkeitsverlustergebnisse zu maximieren, wurde obiges Verfahren noch zweimal wiederholt und nach der dritten Behandlung wurden die Baumwollgewebe entfernt und auf Festigkeitsverlust analysiert. Der Festigkeitsverlust wurde durch Bestimmung der Zugfestigkeit unter Verwendung eines Instron-Testers in Schuss-Richtung (”FTS”) gemessen und die Ergebnisse mit dem FTS desjenigen Gewebes verglichen, das mit derselben Lösung, jedoch ohne zugesetzter Cellulase, behandelt wurde. Die Ergebnisse dieser Analyse werden in Prozent Festigkeitsverlust angegeben, der wie folgt berechnet wird. % Festigkeitsverlust = 100 × [1 – (FTS mit Cellulase)/(FTS ohne Cellulase)]
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 10 dargestellt und zeigen, dass CBHI-enthaltende Zusammensetzungen, d. h. Vollcellulase (GC010) und CBHII-deletierte Cellulase, den höchsten Festigkeitsverlust aufwiesen, wogegen Zusammensetzungen, die keine CBHI einhielten, im Vergleich zu Vollcellulase und CBHII-deletierter Cellulase signifikant verminderten Festigkeitsverlust aufwiesen. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass die Anwesenheit von CBHI-Komponenten in einer Cellulasezusammensetzung der Zusammensetzung im Vergleich mit einer ähnlichen Zusammensetzung, die keine CBHI-Komponenten enthält, erhöhten Festigkeitsverlust verleiht.
Desgleichen zeigen diese Ergebnisse, dass CBHII beim Festigkeitsverlust eine gewisse Rolle spielt.
Demgemäß sind angesichts dieser Ergebnisse festigkeitsverlustresistente Cellulasezusammensetzungen jene Zusammensetzungen, die frei von allen CBHI-Cellulasekomponenten und vorzugsweise allen CBH-Cellulasekomponenten sind. In dieser Hinsicht ist zu erwarten, dass solche Cellulasezusammensetzungen bei pH ≥ 7 sogar zu niedrigerem Festigkeitsverlust führen, als jene in 10 gezeigten Ergebnisse, die bei pH 5 beobachtet wurden.
Während der Produktion baumwollhältiger Gewebe kann das Gewebe belastet werden und bei derartiger Belastung wird es gebrochene und desorientierte Fasern enthalten. Solche Fasern verleihen dem Gewebe nachteilig ein abgetragenes, mattes Aussehen. Es ist jedoch gefunden worden, dass die Verfahren dieser Erfindung zu Gewebe/Farbverstärkung führen. Es wird angenommen, dass dies aus der Entfernung einiger der gebrochenen und desorientierten Fasern hervorgeht, was den Effekt der Wiederherstellung des Aussehens des Gewebes vor der Belastung hat.
Die folgenden Beispiele 17 und 18 veranschaulichen diesen Nutzen der vorliegenden Erfindung. Es wird angemerkt, dass in diesen Beispielen abgetragene T-Shirts (Strickwaren) wie auch neue Baumwollstrickwaren verwendet wurden. Das verblasste Aussehen der abgetragenen Baumwollgewebe rührt von der Ansammlung gebrochener und losgelöster Oberflächenfasern auf dem Gewebe über einen Zeitraum her. Diese Fasern bedingen ein blasses und mattes Aussehen des Gewebes und demgemäß ist die Entfernung dieser Fasern eine notwendige Voraussetzung für die Wiederherstellung der ursprünglichen, leuchtenden Farbe des Gewebes. Zusätzlich verleiht die Ansammlung gebrochener Oberflächenfasern an neuen Baumwollstrickwaren solchen Geweben ein mattes Aussehen. Demgemäß sind diese Experimente notwendigerweise für die Farbverstärkung von belasteten, baumwollhältigen Geweben anwendbar, da beide die Entfernung von Oberflächenfasern vom Gewebe umfassen.
Beispiel 17
Farbverstärkung
Die Fähigkeit von EG-Komponenten zur Farbverstärkung in baumwollhältigen Geweben wurde in den folgenden Experimenten analysiert. Im Speziellen misst das erste Experiment die Fähigkeit eines vollständigen Cellulasesystems (CYTOLASE 123-Cellulase, im Handel erhältlich von Genencor International, South San Francisco, CA, USA), das von der Wildform von Trichoderma reesei produziert wird, Oberflächenfasern von einem baumwollhältigen Gewebe bei verschiedenen pH-Werten zu entfernen. Diese Cellulase wurde auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Oberflächenfasern in einem Launderometer zu entfernen. Eine geeignete Menge von Cellulase, die entweder zu 25 ppm oder 100 ppm Cellulase in der endgültigen Zusammensetzung führte, wurde getrennten Lösungen von 400 ml eines 20 mM Citrat/Phosphatpuffers zugesetzt, der 0,5 ml eines nichtionischen Tensids enthielt. Proben wurden so vorbereitet und titriert, dass Proben mit pH 5, pH 6, pH 7 und pH 7,5 erhalten wurden. Jede der sich ergebenden Lösungen wurde dann in einen eigenen Launderometer-Kanister gegeben. Diesen Kanistern wurden 18 × 13 cm (7 Zoll × 5 Zoll) Baumwollgewebe (100% gewobene Baumwolle, erhältlich als Style No. 439W von Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Av., Middlesex, NJ 08846), sowie eine Anzahl von Murmelkugeln zugegeben, um die Faserentfernung zu fördern. Der Kanister wurde dann verschlossen und der Kanister in das Launderometerbad gesenkt, das bei 43°C gehalten wurde. Der Kanister wurde dann im Bad mit einer Geschwindigkeit von mindestens etwa 40 Umdrehungen pro Minute (U/min) für etwa 1 Stunde rotiert. Danach wird der Stoff entfernt, gut gespült und in einem gewöhnlichen Trockner getrocknet.

Die so behandelten Gewebe wurden dann durch Bewertung in einem Reihenversuch auf Faserentfernung analysiert. Insbesondere wurden die Faseranzahl in den Geweben (unbezeichnet) von 6 Einzelpersonen bewertet. Die Gewebe wurden visuell auf Oberflächenfasern bewertet und an einer Skala von 0 bis 6 gemessen. Die Skala hatte sechs Standards, um aussagekräftige Vergleiche zu ermöglichen. Die Standards sind:

Bewertung	Standard^a
0	Gewebe nicht mit Cellulase behandelt
1	Gewebe mit 8 ppm Cellulase behandelt^b
2	Gewebe mit 16 ppm Cellulase behandelt
3	Gewebe mit 20 ppm Cellulase behandelt
4	Gewebe mit 40 ppm Cellulase behandelt
5	Gewebe mit 50 ppm Cellulase behandelt
6	Gewebe mit 100 ppm Cellulase behandelt

^a) In allen Standards war das Gewebe ein standardisiertes 100%-Baumwolltuchstoff-Testgewebe (Style No. 439W), erhältlich von Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846, USA.
^b) Alle Proben wurden mit derselben Cellulasezusammensetzung behandelt. Cellulasekonzentrationen sind als Gesamtprotein angegeben. Die Launderometer-Behandlungsbedingungen sind dieselben wie in obigem Beispiel 16 dargelegt.

Die zu bewertenden Gewebe wurden demjenigen Wert der Skala zugeordnet, der dem eines der Standards am nächsten kam. Nach vollständiger Analyse der Gewebe wurden die durch alle Einzelpersonen jedem Gewebe zugeordneten Werte aufsummiert und ein Mittelwert errechnet.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 11 dargelegt. Im Speziellen veranschaulicht 11, dass bei gleichem pH eine dosisabhängige Entfernung der Menge an Fasern zu beobachten ist. Das heißt, dass bei den mit mehr Cellulase behandelten Geweben im Vergleich zu den mit weniger Cellulase behandelten Geweben beim selben pH höhere Werte von Fasernentfernung erhalten wurden. Außerdem zeigen die Ergebnisse dieser Figur, dass bei höheren pH-Werten Faserentfernung immer noch erzielt werden kann, indem lediglich höhere Konzentrationen von Cellulase verwendet werden.
In einem zweiten Experiment wurden zwei unterschiedliche Cellulasezusammensetzungen bezüglich ihrer Fähigkeit verglichen, Fasern zu entfernen. Im Speziellen war die erste analysierte Cellulasezusammensetzung ein vollständiges Cellulasesystem (CYTOLASE 123-Cellulase, im Handel erhältlich von Genencor International, South San Francisco, CA, USA), die von der Wildform der Trichoderma reesei produziert und als GC010 bezeichnet wird.
Die zweite analysierte Cellulasezusammensetzung war eine Cellulasezusammensetzung frei von CBH-Komponenten (einschließlich CBHI-Komponenten), die aus Trichoderma reesei hergestellt wurde, die wie oben beschrieben in einer Weise so genetisch manipuliert war, dass sie zur Expression von CBHI und CBHII unfähig war und die als CBHI/II-deletiert bezeichnet wird. Soweit CBHI und CBHII bis zu etwa 70 Prozent der Cellulasezusammensetzung ausmachen, führt die Deletion dieser Komponente zu angereicherten Niveaus aber EG-Komponenten.
Diese Zusammensetzungen wurde auf ihre Fähigkeit hin untersucht, in einem Launderometer Oberflächenfasern zu entfernen. Eine geeignete Menge von Cellulase, die zu den erforderlichen Konzentrationen von EG-Komponenten in den endgültigen Zusammensetzungen führte, wurde getrennten Lösungen von 400 ml eines 20 mM Citrat/Phosphatpuffers zugesetzt, der 0,5 ml eines nichtionischen Tensids enthielt. Proben wurden vorbereitet und auf pH 5 titriert. Jede der sich ergebenden Lösungen wurde dann in einen eigenen Launderometer-Kanister gegeben. Diesen Kanistern wurden 18 × 13 cm (7 Zoll × 5 Zoll) Baumwollgewebe (100% gewobene Baumwolle, erhältlich als Style No. 439W von Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Av., Middlesex, NJ 08846), sowie eine Anzahl von Murmelkugeln zugegeben, um die Faserentfernung zu fördern. Der Kanister wurde dann verschlossen und der Kanister in das Launderometerbad gesenkt, das bei 43°C gehalten wurde. Der Kanister wurde dann im Bad mit einer Geschwindigkeit von mindestens etwa 40 Umdrehungen pro Minute (U/min) für etwa 1 Stunde rotiert. Danach wird der Stoff entfernt, gut gespült und in einem gewöhnlichen Trockner getrocknet.
Die so behandelten Gewebe wurden dann durch Bewertung im oben beschriebenen Reihenversuch auf Faserentfernung analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 12 dargestellt, wobei die Auftragung auf abgeschätzte EG-Konzentrationen basiert. Im Speziellen veranschaulicht 12, dass sowohl GC010-, als auch CBHI/II-deletierte Cellulasezusammensetzungen bei im Wesentlichen gleichen EG-Konzentrationen zu im Wesentlichen Faserentfernungsergebnissen führten. Die Ergebnisse dieser Figur wiesen darauf hin, dass es die EG-Komponenten sind, die zu Faserentfernung führen. Diese Ergebnisse, verbunden mit den Ergebnissen von 11 zeigen, dass EG-Komponenten Oberflächenfasern entfernen.
Beispiel 18
Tergotometer-Farbverstärkung
Dieses Beispiel ist eine Weiterführung von Beispiel 17 und beweist, dass CBH-Komponenten für die Farbverstärkung nicht notwendig sind, und der Zweck dieses Beispiels ist es, die Fähigkeit von CBH-Komponenten-defizienten Cellulasezusammensetzungen zu untersuchen, die Farbe an baumwollhältigen Geweben zu verstärken.
Im Speziellen war die in diesem Beispiel angewendete Cellulasezusammensetzung im Wesentlichen frei von allen CBH-Komponenten (einschließlich CBHI-Komponenten), soweit diese Zusammensetzung aus Trichoderma reesei hergestellt wurde, die ähnlich wie oben beschrieben in einer Weise genetisch so manipuliert war, dass sie zur Expression von CBHI und CBHII unfähig war. Soweit CBHI und CBHII bis zu etwa 70 Prozent der Cellulasezusammensetzung ausmachen, führt die Deletion dieser Komponente zu angereicherten Niveaus aller EG-Komponenten.
Der Test wurde durchgeführt, indem eine ausreichende Konzentration dieser Cellulasezusammensetzung einem 50 mM Citrat/Phosphatpuffers zugesetzt wurde, sodass 500 ppm Cellulase erhalten wurden. Die Lösung wurde auf pH 5 titriert und enthielt 0,1 Gewichtsprozent eines nichtionischen Tensids (Grescoterg GL100, im Handel erhältlich von Gresco Mfg., Thomasville, NC 27360). Ein verblasstes, baumwollhältiges Gewebe von 25 × 25 cm (10 Zoll × 10 Zoll) sowie ein neues, gestricktes Gewebe von 25 × 25 cm (10 Zoll × 10 Zoll) mit losgelösten und gebrochenen Fasern wurden dann in 1 Liter dieses Puffers gegeben und bei 110°F für 30 Minuten stehengelassen und dann für 30 Minuten bei 100 Umdrehungen pro Minute bewegt. Die Gewebe wurden dann aus dem Puffer entnommen, gewaschen und getrocknet. Die erhaltenen Gewebe wurden dann mit dem Gewebe vor der Behandlung verglichen. Die Ergebnisse dieser Analyse waren wie folgt:

Baumwollhältiges Gewebe Ergebnis

Abgetragenes Baumwoll-T-Shirt Verbesserung beobachtet

Neues Baumwoll-Strickgewebe Verbesserung beobachtet
Der Begriff ”Verbesserung beobachtet” bedeutet, dass das behandelte Gewebe im Vergleich zum ungehandelten Gewebe Farbwiederherstellung aufweist (d. h., dass es weniger verblasst ist), welche die Entfernung gebrochener Oberflächenfasern umfasst, einschließlich der aufgrund der Verwendung des Tergotometers entstandenen, gebrochenen Fasern. Diese Ergebnisse erhärten die Ergebnisse von Beispiel 17, dass die Anwesenheit von CBH-Komponenten zur Erzielung von Farbwiederherstellung bei verblassten, baumwollhältigen Geweben nicht notwendig ist.
Es ist zu erwarten, dass die Verwendung solcher Cellulasezusammensetzungen während der Gewebeverarbeitung von Vorteil ist, da solche Zusammensetzungen die während der Verarbeitung entstehenden, gebrochenen/losgelösten Fasern ohne nachteiligen Festigkeitsverlust der Fasern entfernen würden.
Beispiel 19
Weichheit
Dieses Beispiel zeigt, dass die Anwesenheit von CBH-Komponenten nicht essentiell ist, um baumwollhältigen Geweben eine verbesserte Weichheit zu verleihen. Im Speziellen verwendet dieses. Beispiel eine Cellulasezusammensetzung frei von allen CBH-Komponenten, wobei die Zusammensetzung von Trichoderma reesei hergeleitet ist, die wie oben beschrieben in einer Weise genetisch so manipuliert ist, dass sie zur Produktion von CBHI- und CBHII-Komponenten unfähig ist.
Diese Cellulasezusammensetzung wurde auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Frottee-Waschlappen weich zu machen. Im Speziellen wurden 36 × 39 cm (14 Zoll × 15 Zoll) große Frottee-Waschlappen (erhältlich als Style No. 420NS von Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846) in 18 × 19 cm (7 Zoll × 7,5 Zoll) große Streifen geschnitten.
Die oben beschriebene Cellulasezusammensetzung wurde auf ihre Fähigkeit hin untersucht, diese Streifen in einem Launderometer weich zu machen. Im Speziellen wurde eine geeignete Menge Cellulase, die zu 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm und 50 ppm Cellulase in der endgültigen Cellulaselösung führte, getrennten Lösungen von 400 ml eines 20 mM Citrat/Phosphatpuffers zugesetzt, der 0,025 Gewichtsprozent eines nichtionischen Tensids (Triton X114) enthielt. Zusätzlich wurde ein Blindwert mitgeführt, der dieselbe Lösung, jedoch ohne zugesetzte Cellulase enthielt. So vorbereitete Proben wurden auf pH 5 titriert. Jede der sich ergebenden Lösungen wurde dann einem eigenen Launderometer-Kanister zugegeben. Diesen Kanistern wurden die oben beschriebenen Streifen sowie eine Anzahl von Murmelkugeln zugegeben, um die Weichmachung zu fördern. Alle Bedingungen wurden dreifach mit zwei Streifen je Kanister durchgeführt. Jeder Kanister wurde dann verschlossen und der Kanister in das Launderometerbad gesenkt, das bei 37°C gehalten wurde. Der Kanister wurde dann im Bad mit einer Geschwindigkeit von mindestens etwa 40 Umdrehungen pro Minute (U/min) für etwa 1 Stunde rotiert. Danach wurden die Streifen entfernt, gut gespült und in einem gewöhnlichen Trockner getrocknet.
Die behandelten Streifen wurden dann durch Bewertung in einem Präferenztest analysiert. Im Speziellen wurden sechs Testteilnehmer, denen jeweils ein eigener Satz von Streifen übergeben wurde, ersucht, diese basierend auf Weichheitskriterien, wie z. B. die Geschmeidigkeit des gesamten Gewebes, bezüglich Weichheit zu bewerten. Die aus der Behandlung mit den fünf verschiedenen Enzymkonzentrationen erhaltenen Streifen wurden hinter einer Schutzwand angebracht und die Testteilnehmer ersucht, diese von am wenigsten weich bis am weichsten zu ordnen. Jedem Streifen wurde basierend auf seine Bewertung relativ zu den anderen Streifen eine Bewertungsziffer zugeordnet; mit 5 für am weichsten und 0 für am wenigsten weich. Die Bewertungsziffern jedes Testteilnehmers wurden aufsummiert und dann gemittelt.
Die Ergebnisse dieser Mittelung sind in 13 dargestellt. Im Speziellen zeigen diese Ergebnisse, dass bei höheren Konzentrationen verbesserte Weichheit erhalten wird. Es wird angemerkt, dass diese verbesserte Weichheit ohne Anwesenheit von entweder CBHI oder CBHII in der Cellulasezusammensetzung erzielt wird.
Beispiel 20
Griff und Aussehen
Dieses Beispiel zeigt, dass die Anwesenheit von CBH-Komponenten nicht essentiell ist, um baumwollhältigen Geweben einen verbesserten Griff und verbessertes Aussehen zu verleihen. Im Speziellen verwendet dieses Beispiel eine von Trichoderma reesei hergeleitete Cellulasezusammensetzung, die in der oben beschriebenen Weise genetisch so manipuliert wurde, dass sie zur Produktion jeglicher CBH-Komponenten unfähig ist (d. h, unfähig zur Produktion von CBHI- und CBHII-Komponenten).
Diese Cellulasezusammensetzung wurde auf ihre Fähigkeit hin getestet, das Aussehen baumwollhältiger Gewebe zu verbessern. Im Speziellen wurden für die Aspekte des Aussehens in diesem Beispiel 100%-Baumwolltücher geeigneter Größe (erhältlich als Style No. 439W von Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846) angewendet.
Die oben beschriebene Cellulasezusammensetzung wurde auf ihre Fähigkeit hin untersucht, das Aussehen dieser Proben in einem Launderometer zu verbessern. Im Speziellen wurde eine geeignete Menge CBHI- und CBHII-deletierte Cellulase, die zu 25 ppm, 50 ppm und 100 ppm Cellulase in der endgültigen Cellulaselösung führte, getrennten Lösungen von 400 ml eines 20 mM Citrat/Phosphatpuffers zugesetzt, der 0,025 Gewichtsprozent eines nichtionischen Tensids (Triton X114) enthielt. Zusätzlich wurde ein Blindwert mitgeführt, der dieselbe Lösung, jedoch ohne zugesetzte Cellulase enthielt. So vorbereitete Proben wurden auf pH 5 titriert. Jede der sich ergebenden Lösungen wurde dann einem eigenen Launderometer-Kanister zugegeben. Diesen Kanistern wurden die oben beschriebenen Baumwollproben sowie eine Anzahl von Murmelkugeln zugegeben, um die Verbesserungen des Aussehens zu fördern. Jeder Kanister wurde dann verschlossen und der Kanister in das Launderometerbad gesenkt, das bei etwa 40°C gehalten wurde. Der Kanister wurde dann im Bad mit einer Geschwindigkeit von mindestens etwa 40 Umdrehungen pro Minute (U/min) für etwa 1 Stunde rotiert. Danach wurden die Proben entfernt, gut gespült und in einem gewöhnlichen Trockner getrocknet.
Die Proben wurden dann durch Bewertung in einem Präferenztest auf verbessertes Aussehen analysiert. Im Speziellen wurden sechs Testteilnehmer, denen die 4 Proben (nicht bezeichnet) übergeben wurden, ersucht, diese bezüglich des Aussehens zu reihen. Die Testpersonen wurden darüber informiert, dass der Begriff ”Aussehen” das dem Auge erscheinende, physikalische Aussehen des baumwollhältigen Gewebes betrifft und teilweise durch die An- oder Abwesenheit von Fusseln, Oberflächenfasern und dergleichen an der Oberfläche des Gewebes sowie die Möglichkeit oder Unmöglichkeit, die Machart (Webart) des Gewebes erkennen zu können, bestimmt wird. Gewebe, die wenig oder gar keine Fusseln und Oberflächenfasern aufweisen und bei denen die Machart (Webart) klar erkennbar ist, besitzen verbessertes Aussehen im Vergleich zu Geweben mit Fusseln und/oder losgelösten Fasern und/oder einer nicht erkennbaren Webart.
Die Testpersonen ordneten dann Bewertungsziffern zu, die jeder Probe aufgrund seiner Bewertung relativ zu den anderen Proben zugeordnet wurde; 4 mit dem besten Aussehen und 1 mit dem schlechtesten Aussehen. Die Bewertungsziffern jeder Testperson wurden aufsummiert und dann gemittelt. Die Ergebnisse dieses Tests waren wie folgt:

Menge Cellulase Gemitteltes Aussehen

keine 1

25 ppm 2

50 ppm 3

100 ppm 4
Die CBHI- und II-deletierte Cellulasezusammensetzung wurde dann auf ihre Fähigkeit hin getestet, den Griff baumwollhältiger Gewebe zu verbessern. Im Speziellen wurden für die Aspekte des Griffs in diesem Beispiel 100%-Baumwolltücher geeigneter Größe (erhältlich als Style No. 439W von Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846, USA) angewendet.
Die oben beschriebene Cellulasezusammensetzung wurde auf ihre Fähigkeit hin untersucht, den Griff dieser Proben in einem Launderometer zu verbessern. Im Speziellen wurde eine geeignete Menge Cellulase, die zu 500 ppm, 1000 ppm und 2000 ppm Cellulase in der endgültigen Cellulaselösung führte, getrennten Lösungen von 24 l eines 20 mM Citrat/Phosphatpuffers zugesetzt. Zusätzlich wurde ein Blindwert mitgeführt, der dieselbe Lösung, jedoch ohne zugesetzte Cellulase enthielt. Alle Tests wurden bei pH 5,8 in einer industriellen Waschmaschine durchgeführt. Die Waschmaschine wurde bei 50°C, einem Gesamtvolumen von 24 l, einem Flüssigkeit/Gewebe-Verhältnis von 50:1 (Gewicht/Gewicht) für 30 Minuten betrieben. Danach wurden die Proben entfernt und in einem industriellen Trockner getrocknet.
Die Proben wurden dann durch Bewertung in einem Präferenztest auf verbesserten Griff analysiert. Im Speziellen wurden fünf Testteilnehmer, denen die 4 Proben (nicht bezeichnet) übergeben wurden, ersucht, diese bezüglich des Griffs zu reihen. Die Testpersonen wurden darüber informiert, dass Gewebe mit verbessertem Griff bei Berührung glatter und seidiger sind und dass der Griff von Eigenschaften, wie z. B. Weichheit (welche die Geschmeidigkeit des Gewebes und nicht dessen Griff betrifft), Dichte, Farbe und anderen physikalischen Charakteristika zu unterscheiden ist, die nicht mit der Glätte des Gewebes verbunden sind.
Die Testpersonen ordneten dann jeder Probe Bewertungsziffern zu, und zwar aufgrund ihrer Reihung relativ zu den anderen Proben; 4 mit dem besten Griff und 1 mit dem schlechtesten Griff. Die Bewertungsziffern jeder Testperson wurden aufsummiert und dann gemittelt. Die Ergebnisse dieses Tests waren wie folgt:

Menge Cellulase Gemittelter Griff

keine 1,5 +/– 0,5

500 ppm 1,7 +/– 0,4

1000 ppm 3,2 +/– 0,4

2000 ppm 3,8 +/– 0,4
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass Verbesserungen im Griff und Aussehen mit Cellulasezusammensetzungen frei von allen CBH-Komponenten erzielt werden kann.
Beispiel 21
Stone-Washed-Aussehen
Dieses Beispiel zeigt, dass die Anwesenheit von CBH-Komponenten nicht essentiell ist, um baumwollhältigen Geweben ein Stone-Washed-Aussehen zu verleihen. Im Speziellen verwendet dieses Beispiel eine von Trichoderma reesei hergeleitete Cellulasezusammensetzung, die in der oben beschriebenen Weise genetisch so manipuliert ist, dass sie zur Produktion jeglicher CBH-Komponenten unfähig ist (d. h. unfähig zur Produktion von CBHI- und CBHII-Komponenten), sowie eine von Trichoderma reesei hergeleitete, vollständige Cellulasezusammensetzung, die als Cytolase 123-Celullase von Genencor International, South San Francisco, California, USA, erhältlich ist.
Diese Cellulasezusammensetzung wurde auf ihre Fähigkeit hin getestet, gefärbten, baumwollhältigen Denim-Hosen ein Stone-Washed-Aussehen zu verleihen. Im Speziellen wurden die Proben mittels einer industriellen Waschmaschine und Trockenmaschine unter folgenden Bedingungen hergestellt.

10 mM Citrat/Phosphat-Puffer, pH 5
40 l Gesamtvolumen
110°F (43°C)
Vier Paar Denim-Hosen
1 Stunde Betriebszeit
50 ppm CBHI- und CBHII-deletierte Cellulase oder 100 ppm Vollcellulase (d. h. bei etwa gleichen EG-Konzentrationen)

Die Proben wurden bezüglich Stone-Washed-Aussehen von 8 Testpersonen bewertet. Alle acht Testpersonen zogen die mit 100 ppm Vollcellulase behandelten Hosen den nicht enzymbehandelten Hosen als diejenigen mit besserem Stone-Washed-Aussehen vor. Vier der 8 Testpersonen zogen die mit CBHI- und II-deletierter Cellulase behandelten Hosen den mit Vollcellulase behandelten Hosen als diejenigen mit besserem Stone-Washed-Aussehen vor; wogegen die anderen Testpersonen die mit Vollcellulase behandelten Hosen als diejenigen mit besserem Stone-Washed-Aussehen bevorzugten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die mit CBHI- und II-deletierter Cellulase behandelten Hosen von mit Vollcellulase behandelten Hosen nicht unterscheidbar waren und dass CBHI und/oder CBHII nicht essentiell sind, um baumwollhältigen Geweben ein Stone-Washed-Aussehen zu verleihen.
Hinsichtlich der Beispiele 16 bis 21 können Cellulasezusammensetzungen frei von CBH-Komponenten, die von anderen Mikroorganismen als Trichoderma reesei hergeleitet sind, anstelle der in diesen Beispielen beschriebenen Cellulasezusammensetzungen verwendet werden. Insbesondere ist der Ursprung der EG-Komponenten enthaltenden Cellulasezusammensetzung für diese Erfindung unwesentlich und es kann hierin jegliche Pilzcellulase-Zusammensetzung verwendet werden, die eine oder mehrere EG-Komponenten enthält und im Wesentlichen frei von allen CBHI-Komponenten ist. Beispielsweise können Pilzcellulasen zur Verwendung in der Herstellung der in dieser Erfindung verwendeten Pilzcellulase-Zusammensetzungen aus Trichoderma koningii, Penicillium sp. und dergleichen erhalten werden oder es können im Handel erhältlichen Cellulasen, d. h. CELLUCLAST (erhältlich von Novo Industry, Copenhagen, Dänemark), RAPIDASE (erhältlich von Gist Brocades, N. V., Delft, Holland) und dergleichen verwendet werden.
Beispiel 22
Transformanten von Trichoderma reesei, die das Plasmid pEGIpyr4 enthalten
Ein pyr4-defektiver Abkömmling von T. reesei-Stamm RutC30 (Sheir-Neiss und Montenecourt, Appl. Microbiol. Biotechnol. 20, 46–53 (1984)) wurde durch das in Beispiel dargelegte Verfahren erhalten. Protoplasten dieses Stamms wurden mit unverdautem pEGIpyr4 transformiert und die stabilen Transformanten gereinigt.
Fünf dieser Transformanten (bezeichnet als EP2, EP4, EP5, EP6, EP11) sowie untransformierter RutC30 wurden in 50 ml von YEG-Medium (Hefeextrakt, 5 g/l; Glucose, 20 g/l) in 250 ml Schüttelkolben inokuliert und unter Schütteln für zwei Tage bei 28°C kultiviert. Das gebildete Myzel wurde mit sterilem Wasser gewaschen und zu 50 ml TSF-Medium (0,05 M Citrat-Phosphat-Puffer pH 5,0; Avicel mikrokristalline Cellulose, 10 g/l; KH₂PO₄, 2,0 g/l; (NH₄)₂SO₄, 1,4 g/l; Proteose-Pepton, 1,0 g/l; Harnstoff, 0,3 g/l; MgSO₄·7H₂O, 0,3 g/l; CaCl₂, 0,3 g/l; FeSO₄·7H₂O, 5,0 mg/l; MnSO₄·H₂O, 1,6 mg/l; ZnSO₄, 1,4 mg/l; CoCl₂, 2,0 mg/l; 0,1% Tween 80) zugegeben. Diese Kulturen wurden unter Schütteln für weitere vier Tage bei 28°C kultiviert. Proben des Überstands wurden aus diesen Kulturen gezogen und Tests, die zur Messung des Gesamtproteins und von Endoglucanaseaktivität ausgelegt waren, wie unten beschrieben durchgeführt.
Der Endoglucanasetest vertraut auf die Freisetzung von löslichen, gefärbten Oligosacchariden aus Remazol-Brilliant-Blue-Carboxymethylcellulose (RBB-CMC, bezogen von MegaZyme, North Rocks, NSW, Australien). Das Substrat wurde hergestellt, indem 2 g trockene RBB-CMC 80 ml frisch gekochtem, entionisiertem Wasser unter heftigem Rühren zugesetzt wurden. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 5 ml von 2 M Natriumacetatpuffer (pH 4,8) zugesetzt und der pH auf 4,5 eingestellt. Das Volumen wurde schließlich mit entionisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt und Natriumazid mit einer Endkonzentration von 0,02% zugesetzt. Aliquote des Überstands von T. reesei-Kontrollkultur, pEGIpyr4-Transformantenkultur oder 0,1 M Natriumacetat als Blindwert (10–20 μl) wurden in Röhrchen gegeben, 250 μl Substrat wurden zugesetzt und die Röhrchen für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Röhrchen wurden für 10 Minuten auf Eis gegeben und 1 ml kaltes Präzipitationsreagens (3,3% Natriumacetat, 0,4% Zinkacetat, pH 5 mit HCl, 76% Ethanol) wurden dann zugegeben. Die Röhrchen wurden mittels Vortex geschüttelt und für fünf Minuten stehengelassen, bevor sie für drei Minuten bei etwa 13.000 g zentrifugiert wurden. Die optische Dichte wurde spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 590–600 nm gemessen.
Der verwendete Proteintest war der BCA-Test (Bicinchoninsäure) unter Verwendung von Reagenzien, die von Pierce, Rockford, Illinois, USA, bezogen wurden. Der Standard war Rinderserumalbumin (BSA). Das BCA-Reagens wurde hergestellt, indem 1 Teil von Reagens B mit 50 Teilen von Reagens A vermischt wurden. Ein ml des BCA-Reagens wurden mit 50 μl von geeignet verdünntem BSA oder Testkulturüberstand vermischt. Die Inkubation dauerte 30 Minuten bei 37°C und die optische Dichte wurde schließlich spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 562 nm gemessen.
Die Ergebnisse der oben beschriebenen Tests sind in Tabelle 1 gezeigt. Es ist offensichtlich, dass einige der Transformanten im Vergleich zum untransformierten Stamm RutC30 erhöhte Mengen von Endoglucanaseaktivität produzierten. Es wird angenommen, dass die Endoglucanasen und Exo-Cellobiohydrolasen, die durch untransformierte T. reesei produziert werden, etwa 20 bzw. 70 Prozent der gesamten, sekretierten Proteinmenge ausmachen. Daher kann erwartet werden, dass ein Transformant wie EP5, der etwa vier mal mehr Endoglucanase produziert als Stamm RutC30, typischerweise gleiche Mengen von Endoglucanase-artigen und Exo-Cellobiohydrolase-artigen Proteinen sekretiert.
Die in diesem Beispiel beschriebenen Transformanten wurden mittels intaktem pEGIpyr4 erhalten und enthalten typischerweise Genom-integrierte DNA-Sequenzen, die vom pUC-Plasmid hergeleitet wurden. Es ist üblicherweise möglich, pEGIpyr4 vor der Transformation mit HindIII zu verdauen und das größere, nur T. reesei-DNA enthaltende DNA-Fragment zu isolieren. Transformation von T. reesei mit diesem isolierten DNA-Fragment erlaubt normalerweise die Isolation von Transformanten, die EGI überproduzieren und keine heterologen DNA-Sequenzen enthalten, mit Ausnahme der in 8 gezeigten, zwei kurzen Stücke synthetischer DNA. Es ist üblicherweise auch möglich, pEGIpyr4 zu verwenden um einen Stamm, bei dem entweder das cbh1-Gen oder das cbh2-Gen oder beide Gene deletiert sind, zu transformieren. Auf diese Weise kann gewöhnlich ein Stamm konstruiert werden, der EGI überproduziert und entweder eine begrenzte Anzahl oder keine Exo-Cellobiohydrolase produziert.

Die Verfahren von Beispiel 22 können gewöhnlich zur Produktion von T. reesei-Stämmen verwendet werden, die jegliche der anderen Cellulasekomponenten, Xylanasekomponenten oder anderen von T. reesei normalerweise produzierten Proteine überproduzieren. Tabelle 1 Sekretierte Endoglucanase-Aktivität von T. reesei-Transformanten

	A	B
Stamm	Endoglucanase aktivität (OD bei 590 nm)	Protein (mg/ml)	A/B
RutC30	0.32	4.1	0.078
EP2	0.70	3.7	0.189
EP4	0.76	3.65	0.208
EP5	1.24	4.1	0.302
EP6	0.52	2.93	0.177
EP11	0.99	4.11	0.241

Die obigen Ergebnisse werden zum Zwecke des Nachweises der Überproduktion von EGI-Komponente bezüglich des Gesamtproteins präsentiert und nicht zu dem Zweck, das Ausmaß der Überproduktion nachzuweisen. In dieser Hinsicht kann man erwarten, dass das Ausmaß der Überproduktion mit jedem Experiment variiert.
Beispiel 23
Konstruktion von pCEPC1
Es wurde ein Plasmid, pCEPC, konstruiert, in dem die für EGI kodierende Sequenz funktionell an einen Promotor aus dem cbh1-Gen fusioniert war. Dies wurde mittels ortsspezifischer in vitro-Mutagenese zur Veränderung der DNA-Sequenz der cbh1- und egl1-Gene erzielt, um bequeme Restriktionsendonuklease-Spaltstellen genau 5' (stromauf) ihrer entsprechenden Translationsinitiationsstellen zu erzeugen. DNA-Sequenzanalyse wurde durchgeführt, um die erwartete Sequenz an der Verbindung zwischen den beiden DNA-Segmenten zu verifizieren. Die durchgeführten, spezifischen Veränderungen sind in 14 gezeigt.
Die zur Bildung von pCEPC1 kombinierten DNA-Fragmente wurden zwischen die EcoRI-Stellen von pUC4K insertiert und waren die folgenden (siehe 15):

A) Ein 2,1 kb-Fragment der 5'-flankierenden Region des cbh1-Locus. Dieses umfasst die Promotorregion und erstreckt sich zur manipulierten BclI-Stelle und enthält so keine cbh1-kodierende Sequenz.
B) Ein 1,9 kb-Fragment genomischer DNA vom egl1-Locus, am 5'-Ende mit der manipulierten BamHI-Stelle beginnend und sich über die kodierende Region erstreckend und etwa 0,5 kb. über das Translations-Stopcodon hinausgehend. Am 3'-Ende des Fragments befinden sich 18 von der multiplen Klonierungsstelle pUC218 hergeleitete Basenpaare und ein synthetisches Oligonukleotid von 15 bp zur Verknüpfung dieses Fragments mit dem unten erwähnten Fragment.
C) Ein DNA-Fragment der 3'-flankierenden Region des cbh1-Locus, das sich von einer Position etwa 1 kb stromab bis zu etwa 2,5 kg stromab des cbh1-Translations-Stopcodons erstreckt.
D) In eine NheI-Stelle im Fragment (C) Ein 3,1 kb-NheI-SphI-DNA-Fragment insertiert, welches das aus pTpyr2 (Beispiel 2) erhaltene pyr4-Gen von T. reesei enthält und an einem Ende 24 von der multiplen Klonierungsstelle pUC18 hergeleitete bp von DNA besitzt.

Das Plasmid pCEPC1 wurde so verdaut, dass die für EGI kodierende Sequenz am cbh1-Locus integriert werden kann und die kodierende Sequenz für CBHI ersetzt, ohne jegliche Fremd-DNA in den Wirtsstamm einzuführen. Verdau dieses Plasmids mit EcoRI setzt ein Fragment frei, das die cbh1-Promotorregion, die für egl1 kodierende Sequenz und Transkriptionsterminationsregion, das pyr4-Gen von T. reesei und ein DNA-Segment der 3'-flankierenden (stromab) Region des cbh1-Lotus umfasst (siehe 15).
Beispiel 24
pCEPC1-DNA-enthaltende Transformanten
Ein pyr4-defektiver Stamm von T. reesei RutC30 (Sheir-Neiss, s. o.) wurde durch das in Beispiel 1 umrissene Verfahren erhalten. Der Stamm wurde mit pCEPC1, das mit EcoRI verdaut worden war, transformiert. Stabile Transformanten wurden selektiert und anschließend, wie in Beispiel 22 beschrieben, zur Cellulaseproduktion in Schüttelkolben kultiviert. Um die Cellulaseproteine sichtbar zu machen, wurden Proben dieser Kulturen unter Verwendung des in Beispiel 7 beschriebenen Verfahrens isoelektrisch fokussierender Gelelektrophorese unterworfen. Von insgesamt 23 auf diese Weise analysierten Transformanten produzierten 12 kein CBHI-Protein; dies ist das erwartete Ergebnis der Integration der pCEPC1-DNA am cbh1-Locus. Southern-Blot-Analyse wurde verwendet, um zu bestätigen, dass die Integration in manchen dieser Transformanten tatsächlich am cbh1-Locus erfolgt ist und dass keine vom bakteriellen Plasmidvektor (pUC4K) hergeleitete Sequenzen vorhanden waren (siehe 16). Für diese Analyse wurde die DNA der Transformanten vor Elektrophorese und Blotting auf ein Membranfilter mit PstI verdaut. Der erhaltene Southern-Blot wurde radiomarkiertem Plasmid pUC4K::cbh1 (siehe Beispiel 2) sondiert. Die Sonde hybridisierte an einem 6,5 kb-DNA-Fragment aus der untransformierten Kontrollkultur mit dem cbh1-Gen (16, Spur A). Es wäre zu erwarten, dass die Integration des pCEPC1-DNA-Fragments am cbh1-Locus zum Verlust dieser 6,5 kb-Bande und zum Auftreten von drei anderen, etwa 1,0 kb-, 2,0 kb- und 3,5 kb-DNA-Fragmenten entsprechenden Banden führt. Dies entspricht exakt dem Muster, das für den in 16, Spur C gezeigten Transformanten beobachtet wurde. Ebenfalls in 16 gezeigt ist Spur B ein Beispiel eines Transformanten, in dem sich multiple Kopien von pCEPC1 an anderen Genomstellen als dem cbh1-Locus integriert haben.

Endoglucanase-Aktivitätstests wurden an Proben des Kulturüberstands der untransformierten Kultur und der Transformanten genau wie in Beispiel 22 beschrieben ausgeführt, mit der Ausnahme, dass die Proben vor dem Test 50-fach verdünnt wurden, sodass die Proteinkonzentration in den Proben zwischen etwa 0,03 und 0,07 mg/ml betrug. Die Ergebnisse der durchgeführten Tests mit der untransformierten Kontrollkultur und vier verschiedenen Transformanten (bezeichnet mit CEPC1-101, CEPC1-103, CEPC1-105, CEPC1-112) sind in Tabelle 2 gezeigt. Transformanten CEPC1-103 und CEPC1-112 sind Beispiele, in denen die Integration des CEPC1-Fragments zum Verlust von CBHI-Produktion geführt hat. Tabelle 2 Sekretierte Endoglucanaseaktivität von T. reesei-Transformanten

	A	B
Stamm	Endoglucanaseaktivität (OD bei 590 nm)	Protein (mg/ml)	A/B
RutC300	0.037	2.38	0.016
CEPC1-101	0.082	2.72	0.030
CEPC1-103	0.099	1.93	0.051
CEPC1-105	0.033	2.07	0.016
CEPC1-112	0.093	1.72	0.054

Die obigen Ergebnisse sind dargelegt, um die Überproduktion der EGI-Komponente in Relation zum Gesamtprotein zu demonstrieren und nicht, um das Ausmaß der Überproduktion zu demonstrieren. In dieser Hinsicht ist zu erwarten, dass das Ausmaß der Überproduktion mit jedem Experiment variiert.
Es wäre möglich, Plasmide zu konstruieren, die dem pCEPC1 ähnlich sind, jedoch mit jedem anderen, das egl1-Gen ersetzenden T. reesei-Gen. Auf diese Weise könnte die Überexpression anderer Gene und gleichzeitige Deletion des cbh1-Gens erreicht werden.
Es wäre auch möglich, pyr4-hergeleitete Stämme von T. reesei, bei denen vorher andere Gene, z. B. cbh2 deletiert worden sind, mit pCEPC1 zu transformieren, um Transformanten zu konstruieren, die beispielsweise keine Exo-Cellobiohydrolasen produzieren und Endoglucanasen überexprimieren.
Unter Verwendung pCEPC1-ähnlicher Konstrukte, bei denen jedoch die DNA vom cbh1-Lotus durch DNA eines anderen Locus von T. reesei ersetzt worden ist, wäre es möglich, Gene unter der Kontrolle eines anderen Promotors an einem anderen Locus im T. reesei-Genom zu insertieren.
Beispiel 25
Konstruktion von pEGII::P-1
Das egl3-Gen, welches für EGII (von anderen früher als EGIII bezeichnet) kodiert, ist aus T. reesei kloniert und die Sequenz publiziert worden (Saloheimo et al., Gene 63, 11–21 (1988)). Die Erfinder haben das Gen aus Stamm RL-P37 als ein 4 kb-PstI-XhoI-Fragment genomischer DNA von etwa 4 kb erhalten, dass zwischen den PstI- und XhoI-Stellen von pUC219 insertiert war. Der letztere Vektor, pUC219, ist von pUC119 hergeleitet (beschrieben in Wilson et al., Gene 77, 69–78 (1989)), und zwar durch Erweiterung der multiplen Klonierungsstelle um Restriktionsstellen für BglII, ClaI und XhoI. Unter Verwendung fachbekannter Verfahren wurde das pyr4-Gen von T. reesei, das an einem 2,7 kbSalI-Fragment genomischer DNA vorliegt, in eine SalI-Stelle innerhalb der für EGII kodierenden Sequenz insertiert, um Plasmid pEGII::P-1 zu erzeugen (17). Dies führte zur Unterbrechung der für EGII kodierenden Sequenz, jedoch ohne Deletion jeglicher Sequenzen. Das Plasmid pEGII::P-1 kann mit HindIII und BamHI verdaut werden und führt zu einem linearen DNA-Fragment, das ausschließlich von T. reesei hergeleitet ist, mit Ausnahme von 5 bp an einem Ende und 16 bp am anderen Ende, wovon beide von der multiplen Klonierungsstelle von pUC219 hergeleitet sind.
Beispiel 26
Transformation von T. reesei GC69 mit pEGII::P-1, um einen Stamm zu erzeugen, der zur Produktion von EGII unfähig ist
T. reesei wird mit pEGII::P-1 transformiert, das vorher mit HindIII und BamHI verdaut worden ist, und stabile Transformanten werden selektiert. Gesamt-DNA wird aus den Transformanten isoliert und es wird Southern-Blot-Analyse verwendet, um jene Transformanten zu identifizieren, in denen sich das die pyr4- und egl3-Gene enthaltende DNA-Fragment am egl3-Locus integriert und folglich die für EGII kodierende Sequenz unterbrochen hat. Die Transformanten sind zur Produktion von EGII unfähig. Es wäre auch möglich, pEGII::P-1 zu verwenden, um einen Stamm zu transformieren, in dem einzelne oder alle der cbh1, cbh2 oder egl1-Gene deletiert worden sind. Auf diese Weise könnte ein Stamm konstruiert werden, der nur gewisse Cellulasekomponenten und keine EGII-Komponente produziert.
Beispiel 27
Transformation von T. reesei GC69 mit pEGII::P-1, um einen Stamm zu erzeugen, der zur Produktion von CBHI, CBHII und EGII unfähig ist
Ein pyr4-defizienter Abkömmling von Stamm P37PΔΔCBH67 (aus Beispiel 11) wurde durch das in Beispiel 1 umrissene Verfahren erhalten. Dieser Stamm P37PΔΔ67P^–1 wurde mit pEGII::P-1 transformiert, welches vorher mit HindIII und BamHI verdaut worden war, und es wurden stabile Transformanten selektiert. Gesamt-DNA wurde aus den Transformanten isoliert und es wurde Southern-Blot-Analyse verwendet, um Transformanten zu identifizieren, in denen sich das die pyr4- und egl3-Gene enthaltende DNA-Fragment am egl3-Locus integriert und folglich die für EGII kodierende Sequenz unterbrochen hatte. Der in 18 erläuterte Southern-Blot wurde mit einem PstI-Fragment von etwa 4 kb der T. reesei-DNA sondiert, welches das egl3-Gen enthielt, das in die PstI-Stelle von pUC18 kloniert und anschließend neu isoliert worden war. Wenn die aus Stamm P37PΔΔ67P^–1 isolierte DNA für die Southern-Blot-Analyse mit PstI verdaut wurde, konnte der egl3-Locus anschließend am Autoradiogramm (18, Spur F) als eine einzelne 4 kb-Bande sichtbar gemacht werden. In einem Transformanten, bei dem das egl3-Gen unterbrochen war, war jedoch diese Bande verschwunden und, wie erwartet, durch zwei neue Banden ersetzt (18, Spur F). Wenn die DNA mit EcoRV und BglII verdaut wurde, nahm die Größe der dem egl3-Gen entsprechenden Bande zwischen untransformiertem P37PΔΔ67P^–1-Stamm und egl3-unterbrochenem Transformanten um etwa 2,7 kb zu (die Größe des insertierten pyr4-Fragments). Der das unterbrochene egl3-Gen enthaltende, in 18 (Spuren B, D und F) abgebildete Transformant wurde A22 benannt. Der in 18 identifizierte Transformant ist unfähig, CBHI, CBHII und EGII zu produzieren.
Beispiel 28
Konstruktion von pPΔEGI-1
Das egl1-Gen von T. reesei-Stamm RL-P37 wurde, wie in Beispiel 12 beschrieben, als 4,2 kb-HindIII-Fragment genomischer DNA erhalten. Dieses Fragment wurde an der HindIII-Stelle von pUC100 insertiert (ein Abkömmling von pUC18; Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103–119 (1985), mit einem in die multiple Klonierungsstelle insertierten Oligonukleotid, das Restriktionsstellen für BglIII, ClaI und XhoI hinzufügt). Unter Verwendung fachbekannter Verfahren wurde ein EcoRV-Fragment von etwa 1 kb, das sich von einer Position nahe der Mitte der für EGI kodierenden Sequenz zu einer über das 3'-Ende hinausgehenden Position der kodierenden Sequenz erstreckt, entfernt und durch ein das pyr4-Gen enthaltende ScaI-Fragment von 3,5 kb der T. reesei-DNA ersetzt. Das erhaltene Plasmid wurde pPΔEGI-1 genannt (siehe 19).
Das Plasmid pPΔEGI-1 kann mit HindIII verdaut werden, um ein DNA-Fragment freizusetzen, das nur genomische DNA von T. reesei umfasst, die an beiden Ende ein Segment des egl1-Gens und in der Mitte das einen Teil der für EGI kodierenden Sequenz ersetzende pyr4-Gen umfasst.
Transformation eines geeigneten, pyr4-defizienten T. reesei-Stamms mit HindIII-verdautem pPΔEGI-1 führt zur Integration dieses DNA-Fragments am egl1-Locus in einem gewissen Teil der Transformanten. Auf diese Weise wird ein Stamm erhalten, der unfähig ist, EGI zu produzieren.
Beispiel 29
Konstruktion von pΔEGIpyr-3 und Transformation eines pyr4-defizienten Stamms von T. reesei
Die Erwartung, dass das EGI-Gen unter Verwendung des in Beispiel 28 umrissenen Verfahrens inaktiviert werden könnte, wird durch dieses Experiment erhärtet. In diesem Fall wurde ein dem pPΔEGI-1 ähnliches Plasmid, pΔEGIpyr-3, konstruiert, mit der Ausnahme, dass das pyr4-Gen von T. reesei durch das pyr4-Gen von Aspergillus niger als selektierbarer Marker ersetzt wurde. In diesem Fall lag das egl1-Gen wiederum als ein an der HindIII-Stelle von pUC100 insertiertes HindIII-Fragment von 4,2 kb vor. Es wurde dasselbe innere 1 kb-EcoRV-Fragment entfernt wie bei der Konstruktion von pΔEGI-1 (siehe Beispiel 28), jedoch wurde es in diesem Fall durch ein 2,2 kb-Fragment ersetzt, welches das klonierte pyrG-Gen von A. niger enthielt (Wilson et al., Nucl. Acids Res. 16, 2339 (1988)). Transformation des pyr4-defizienten T. reesei-Stamms (Stamm GC69) mit pΔEGIpyr-3, nachdem dieses mit HindIII verdaut worden war, um das pyrG-Gen enthaltende Fragment mit den flankierenden Regionen aus dem egl1-Locus an beiden Enden freizusetzen, führte zu Transformanten, in denen das egl1-Gen unterbrochen war. Diese Transformanten wurden durch Southern-Blot-Analyse von HindIII-verdauter und mit radiomarkiertem pΔEGIpyr-3 sondierter Transformanten-DNA erkannt. Im untransformierten T. reesei-Stamm war das egl1-Gen an einem HindIII-DNA-Fragment von 4,2 kb vorhanden, und dieses Hybridisierungsmuster ist durch 20, Spur C repräsentiert. Dieses Fragment ging jedoch im Anschluss an die Deletion des egl1-Gens durch Integration des gewünschten Fragments aus pΔEGIpyr-3 verloren und wurde durch ein um etwa 1,2 kb größeres Fragment (20, Spur A) ersetzt. Ebenfalls in 20 gezeigt ist Spur B ein Beispiel eines Transformanten, in dem die Integration einer Einzelkopie von pPΔEGIpyr-3 an einer anderen Stelle als dem egl1-Lotus im Genom als aufgetreten ist.
Beispiel 30
Transformation von T. reesei mit pPΔEGI-1, um einen Stamm zu erzeugen, der zur Produktion von CBHI, CBHII, EGI und EGII unfähig ist
Ein pyr4-defizienter Abkömmling von Stamm A22 (aus Beispiel 27) wird durch das in Beispiel 1 umrissene Verfahren erhalten. Dieser Stamm wird mit pPΔEGI-1 transformiert, das vorher mit HindIII verdaut worden ist, um eine DNA-Fragment freizusetzen, das nur genomische DNA von T. reesei umfasst, die an beiden Ende ein Segment des egl1-Gens umfasst, wobei ein Teil der für EGI kodierenden Sequenz durch das pyr4-Gen ersetzt ist.
Stabile pyr4+-Transformanten werden selektiert und die Gesamt-DNA aus den Transformanten isoliert. Die DNA wird nach der Southern-Blot-Analyse mit ³²P-markiertem pPAEGI-1 sondiert, um Transformanten zu identifizieren, in denen sich das DNA-Fragment, welches das pyr4-Gen und egl1-Sequenzen enthält, am egl1-Locus integriert und folglich die für EGI kodierende Sequenz unterbrochen hat: Die identifizierten Transformanten sind unfähig, CBHI, CBHII, EGI und EGII zu produzieren.

Claims

Verfahren zum Reduzieren des Festigkeitsverlusts von baumwollhältigen Geweben bei gleichzeitigem Erreichen der gewünschten Verbesserung von Haptik, Aussehen und/oder Erweichung des behandelten Gewebes, die durch die Behandlung mit Cellulase entsteht, gegenüber dem Gewebe vor der Behandlung, wobei das Verfahren das Behandeln des Gewebes mit einer Pilzcellulasezusammensetzung umfasst, die eine oder mehrere Endoglucanase-(EG-)Cellulasekomponenten umfasst und frei von allen Exo-Cellobiohydrolase-I-(CBH-I-)Cellulasekomponenten ist, worin das Verfahren im Vergleich mit einer Behandlung mit vollständiger Cellulase zu geringerem Festigkeitsverlust führt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren eine wässrige Pilzcellulaselösung einsetzt und unter Rühren unter derartigen Bedingungen durchgeführt wird, dass es zu einer Kaskadenwirkung der Cellulaselösung über den Stoff kommt.