JP3511381B2 - セルラーゼによる綿含有織物の処理方法 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 発明の背景 1. 産業上の利用分野 本発明は綿含有織物をセルラーゼで処理する改善され
た方法、並びにこれらの方法により製造された織物に関
するものである。特に本発明の改善方法は、綿含有織物
を、実質的に全てのCBH I型のセルラーゼ成分を含まな
い菌類セルラーゼ組成物を含有する水溶液と接触せしめ
ることに関する。その綿含有織物をそのような溶液で処
理する場合、生成した織物は、処理前の織物と比較し
て、例えば肌触り、外観、および／または柔らかさ等に
おいて期待した高品質なものであり、その織物はまた、
CBH I型のセルラーゼ成分を含有するセルラーゼ組成物
で処理した織物と比較して強度の損失が減少したもので
ある。

2. 従来技術 織物の製造中または直後に、綿含有織物は、その織物
に所望の特性を与えるためにセルラーゼで処理すること
ができる。例えば、織物業界において、綿含有織物の肌
触りおよび／または外観を改善するため、綿含有ニット
から表面の繊維を除去するため、そして綿含有デニム等
にストーンウォッシュの外観を与えるためにセルラーゼ
が用いられている。

特に、日本の特願昭58−36217号および58−54032号、
並びに大石らの「セルラーゼによる綿織物の再形成」お
よびJTN1988年12月の雑誌の「新たなこと−−綿織物の
感触を軟化せしめる重量損失処理」はそれぞれ、セルラ
ーゼによる綿含有織物の処理がその織物に改善された肌
触りを与えることを開示している。一般的に、このセル
ラーゼ処理は、綿毛および／または表面の繊維を除去
し、このことは織物の重量を減少させると思われてい
る。これらの効果の組合せにより、その織物に改善され
た肌触り、すなわち絹のような織物の肌触りを与えられ
る。

加えて従来は、これらの織物に通常である折れた繊維
や糸を除去する目的のために、綿含有織物を、撹拌およ
びカスケード条件下で、例えばジェットの使用によりセ
ルラーゼ溶液で処理することが当業者に知られている。
そのように処理する場合、緩衝液は選択した染料で染料
濃淡に不利に影響すると思われているので、緩衝液は通
常用いられない。

今までさらに、撹拌およびカスケード条件下で綿含有
織物をセルラーゼ溶液により処理することが従来技術に
おいて知られている。そのように処理した場合、その綿
含有織物は処理前の織物とひかくして改善された肌触り
と外観を示す。

最後に、これまで、撹拌およびカスケード条件下、す
なわち、回転ドラム洗濯機における綿含有染めデニムの
セルラーゼ溶液による処理はそのデニムに「ストーンウ
ォッシュ」の外観を与えることが知られている。

そのような綿含有織物のセルラーゼ溶液での処理に関
連する通常の問題は、処理した織物が未処理織物と比較
して著しい強度の損失を示すことである。セルラーゼが
セルロース（β−１、４−グルカン結合）を加水分解
し、このことが次々に綿高分子の部分の分断となり得る
ために、強度の損失が生じる。だんだん綿高分子が分裂
（分断）されるに連れ、織物の引張強さが減少する。

綿織物に亘るセルラーゼ溶液の撹拌およびカスケード
を含む方法はより短い反応時間しか必要としないので、
これらの方法は、撹拌およびカスケードを含まないセル
ラーゼ処理法方と比較して減少した強度損失の綿含有織
物を提供するものと思われている。いずれにせよ、その
ような方法ではまだ著しい強度損失となる。

したがって、処理前の織物と比較したセルラーゼによ
る処理により生成した処理綿含有織物において、所望の
高められた性能を達成するが、減少した強度損失を提供
するためにそのようなセルラーゼ処理方法改良すること
が特に望ましい。

加えて、セルラーゼの菌類源は、非常に大量のセルラ
ーゼを分泌することが知られているため、またさらにそ
のような菌類源の発酵方法並びにセルラーゼを単離する
単離および精製方法が従来技術において知られているた
めに、そのような菌類セルラーゼを肌触りおよび／また
は外観を改善する方法に用いることは特に有利である。

発明の概要 本発明は、綿含有織物を菌類セルラーゼで処理するこ
れまでに知られている方法が、実質的に全てのCBH I型
成分を含有しない菌類セルラーゼ組成物を用いることに
より改善できるという発見に基づくものである。驚いた
ことに、EG型成分は、セルラーゼ組成物で処理する前の
織物と比較して、肌触り、外観、柔らかさ、色彩、およ
び／またはストーンウォッシュの外観に関する処理織物
に高められた質を与えられることを発見した。加えて、
処理織物における強度損失のかなりの部分の原因となる
のは、EG型成分と結合したCBH I型成分であることが分
かった。

上記点から見たその方法の１つの面において、本発明
は、綿含有織物の菌類セルラーゼ組成物での処理を行な
う改善された方法に基づき、ここでその改善は、実質的
に全てのCBH I型成分を含有しない菌類セルラーゼ組成
物を利用することを含む。好ましい実施態様において、
菌類セルラーゼ組成物は、全てのCBH I型および全てのC
BH II型成分を含有しない。さらに別の好ましい実施態
様において、菌類セルラーゼ組成物は、セルラーゼ組成
物のタンパク質の総重量に基づいて少なくとも約10重量
パーセント、好ましくは少なくとも約20重量パーセント
のEG型成分からなる。

その方法の別な面において、本発明は、綿含有織物の
菌類セルラーゼ水溶液での処理を行なう改善された方法
に基づき、その方法は、その織物に亘りセルラーゼ溶液
のカスケード効果を生じさせるような条件下で撹拌を行
ない、ここでその改善は、実質的に全てのCBH I型成分
を含有しない菌類セルラーゼ組成物を利用することを含
む。好ましい実施態様において、菌類セルラーゼ組成物
は、全てのCBH I型および全てのCBH II型成分を含有し
ない。さらに別の好ましい実施態様において、菌類セル
ラーゼ組成物は、セルラーゼ組成物のタンパク質の総重
量に基づいて少なくとも約10重量パーセント、好ましく
は少なくとも約20重量パーセントのEG型成分からなる。

本発明の方法により処理された綿含有織物は、CBH I
セルラーゼ成分を含有する菌類セルラーゼ組成物で処理
した織物と比較した減少した強度損失を示すが、処理前
の織物と比較して予期した高められた質を有する。減少
した強度損失は、本発明の方法が強度損失抵抗性である
ことの根拠となる。

その組成物の面において、本発明は、上述した本発明
の方法において処理した綿含有織物に基づく。

図面の簡単な説明 図１は、ｐΔCBH I pyr4の構成の概略図である。

図２は、１つのT.reesei染色体上のcbh1座でのｐΔCB
H I pyr4からの大きなEcoR I断片の組込みによるT.rees
ei遺伝子の削除を説明する図。

図３は、プローブとして³²P標識ｐΔCBH I pyr4を用
いたサザン分析後のEcoR I切断ｐΔCBH I pyr4で転換し
たT.reesei菌株GC69からのDNAのオートラジオグラフで
ある。分子量マーカーのサイズは、図の左側にキロベー
スペアで示す。

図４は、プローブとして³²P標識pIntCBH Iを用いたサ
ザン分析後のEcoR I切断ｐΔCBH I pyr4で転換したT.re
esei菌株GC69からのDNAのオートラジオグラフである。
分子量マーカーのサイズは、図の左側にキロベースペア
で示す。

図５は、T.reeseiの野生型により、そして転換菌株に
より分泌されたタンパク質を示す等電点電気泳動ゲルで
ある。特に、図５において、等電点電気泳動ゲルのレー
ンＡはT.reeseiからの部分的精製CBH Iを用いている；
レーンＢは野生型T.reeseiを用いている；レーンＣはcb
h1遺伝子が欠失されたT.reesei菌株からのタンパク質を
用いている；そしてレーンＤはcbh1遺伝子およびcbh2遺
伝子が欠失されたT.reesei菌株からのタンパク質を用い
ている。図５において、図の右側は、１つ以上の分泌タ
ンパク質に発見された単一のタンパク質の位置を示すよ
うに印を付けたものである。特に、BGはβ−グルコシダ
ーゼを指し、E1はエンドグルカナーゼＩを指し、E2はエ
ンドグルカナーゼIIを指し、E3はエンドグルカナーゼII
Iを指し、C1はエキソ−セロビオヒドロラーゼＩを指
し、そしてC2はエキソ−セロビオヒドロラーゼIIを指
す。

図6Aは、ゲノムDNA上の4.1kb EcoR I断片としてクロ
ーンしたT.reesei cbh2座を示した図であり、図6Bは、
cbh2遺伝子欠失ベクターpPΔCBH IIを示した図である。

図７は、プローブとして³²P標識pPΔCBH IIを用いた
サザン分析後のEcoR I切断pPΔCBH IIで転換したT.rees
ei菌株P37PΔCBH I Pyr26からのDNAのオートラジオグラ
フである。分子量マーカーのサイズは、図の左側にキロ
ベースペアで示す。

図８は、プラスミドpEG I pyr4のダイヤグラムであ
る。

図９は、40℃でのpH範囲に亘るTrichoderma reesei
から誘導された酸性EG豊富菌類セルラーゼ組成物（CBH
IおよびIIを欠失した）のRBB−CMC活性プロフィール、
並びに40℃でのpH範囲に亘るTrichoderma reeseiから
誘導された豊富EG IIIセルラーゼ組成物の活性プロフィ
ールを説明する図である。

図10は、様々な量のCBH成分を有するセルラーゼ組成
物で処理した綿含有織物のランダロメータ（launderome
ter）中の３回の洗濯後の強度損失の結果を説明する図
である。

図11は、様々なpHでの野生型Trichoderma reeseiに
より分泌されたセルラーゼで処理した綿含有織物の繊維
除去の結果（パネルテストコアに基づく）を説明する図
である。

図12は、野生型Trichoderma reeseiにより分泌され
た様々な濃度のセルラーゼ（ppm）で処理した綿含有織
物、およびCBH IおよびCBH IIを分泌できないように遺
伝学的に設計したTrichoderma reeseiの菌株により分
泌されたセルラーゼで処理した綿織物の繊維除去の結果
（パネルテストスコアに基づく）を説明する図である。

図13は、CBH IおよびCBH IIを分泌できないように遺
伝学的に変更したTrichoderma reeseiの菌株から誘導
した様々な濃度（ppm）のEG豊富セルラーゼ組成物の柔
軟さのパネルテストを説明する図である。

図14は、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ開裂部位
を生成するためにegl1およびcbh1に作られた部位特定交
代のダイヤグラムである。それぞれの場合において、上
側のラインは元のDNA配列を示し、導入された変化を中
ほどのラインに示し、新たな配列は下側のラインに示
す。

図15は、pCEPC1から得られるより大きなEcoR I断片の
ダイヤグラムである。

図16は、T.reesei RutC30の未変換菌株からの、およ
びT.reeseiをEcoR I切断pCEPC1で変換することにより得
られた２つの形質転換株からのDNAのオートラジオグラ
フである。DNAをPst Iで切断して相補性DNA鎖が得ら
れ、³²P標識pUC4K::cbh1で雑種形成した。マーカーDNA
断片のサイズは図の左側にキロベースの組で示す。

図17は、プラスミドpEG II::P−１のダイヤグラムで
ある。

図18は、Hind IIIおよびBamH Iで切断したpEG II::P
−１で変換したT.reesei菌株P37PΔΔ67P1からのDNAの
オートラジオグラフである。相補性DNA鎖を調製し、DNA
は、egl3遺伝子を含有する放射線標識T.reeseiDNAの約4
kb Pst I断片で雑種形成した。ラインＡ、ＣおよびＥ
は、未変換株からのDNAを含有し、一方Ｂ、ＤおよびＦ
は、未変換T.reesei菌株からのDNAを含有する。T.reese
iDNAを、ラインＡ、ＢのBgl IIで、ラインＣ、ＤのEcoR
Vで、そしてラインＥ、ＦのPstOで切断した。マーカー
DNA断片のサイズは図の左側にキロベースペアで示す。

図19は、プラスミドpPΔEG I−１のダイヤグラムであ
る。

図20は、Hind III切断ｐΔEG I pyr−３により得られ
た菌株GC69の形質転換株から単離したDNAの相補性DNA鎖
のオートラジオグラフである。未変換株に予期したプロ
ーブ、放射線標識ｐΔEG I pyr−３による雑種形成の模
様をレーンＣに示す。レーンＡはeql1遺伝子が分裂した
形質転換株に予期された模様を示し、レーンＢはｐΔEG
I pyr−3DNAがゲノム中に組込まれたがeql1遺伝子を分
裂しない形質転換株を示す。レーンＤはHind IIIで切断
したｐΔEG I pyr−３を含有し、適切なサイズのマーカ
ーを提供する。マーカーDNA断片のサイズは図の左側に
キロベースペアで示す。

発明の詳細な説明 上述したように、本発明の方法は、綿含有織物をセル
ラーゼで処理する従来の方法における改良である。その
改良は、所望の高められた質を織物に与えるが、その織
物の強度の損失を最小限にする特定のセルラーゼ組成物
を用いることからなる。しかしながら、本発明を詳細に
述べる前に、以下の用語を最初に定義する。

「綿含有織物」という用語は、純粋な綿または綿織
物、綿ニット、綿デニム、綿より糸等を含む綿ブレンド
から作られた縫ったまたは縫わない織物を指す。綿ブレ
ンドを用いる場合、織物中の綿の量は、少なくとも約40
重量パーセントの綿、好ましくは約60重量パーセントの
綿、最も好ましくは約75重量パーセントの綿であるべき
である。ブレンドとして用いられる場合、その織物中に
用いられる他の材料は、ポリアミド繊維（例えば、ナイ
ロン６およびナイロン66）、アクリル繊維（例えば、ポ
リアクリロニトリル繊維）、およびポリエステル繊維
（例えば、ポリエチレンテレフタレート）、ポリビニル
アルコール繊維（例えば、ビニロン）、ポリ塩化ビニル
繊維、ポリ塩化ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポ
リ尿素繊維、およびアラミド繊維のような合成繊維を含
む１つ以上の非綿繊維を含んでもよい。レーヨンのよう
な再生セルロースが本発明の方法の綿に代替として用い
ることができると考えらる。

ここに用いられた「仕上げ」という用語は、織物上の
セルラーゼのセルロースを加水分解する活性を実質的に
妨げるために十分な量の仕上げ剤を綿含有織物に施すこ
とを意味する。仕上げ剤は一般的に、例えば、柔軟さ、
ドラパビリティー（drapability）等の織物の特性を高
める目的のために、織物の製造工程の最後またはそのあ
たりで施され、それにより、セルラーゼとの反応から織
物を保護する。綿含有織物を仕上げるのに便利な仕上げ
剤は、従来技術において知られており、メラミン、グリ
オキサール、または尿素ホルムアルデヒド、並びにろ
う、シリコン、蛍光化学種、および４原子（quaternari
es）のような樹脂製材料を含む。そのように仕上がった
場合、綿含有織物は実質的にセルラーゼに対する反応性
が低い。

「菌類セルラーゼ」という用語は、菌類から得られた
セルラーゼ遺伝子の全てまたは一部を含有し表現するた
めに遺伝学的に変更された菌類源または微生物から誘導
された酵素組成物を指す。菌類セルラーゼはセルロース
とその誘導体に作用し、セルロースを加水分解し、主生
成物、グルコースとセロビオースを与える。菌類セルラ
ーゼは、放射菌、滑走細菌（粘液細菌）および真性細菌
のような微生物を含む非菌類源から生成したセルラーゼ
から区別される。ここに記載したセルラーゼ組成物を調
製するのに都合のよいセルラーゼを生成することのでき
る菌類は、英国特許第2,094,826号に開示されており、
その開示をここに参照文献として用いる。

最良の菌類セルラーゼは一般的に、酸性または中性の
pH範囲において最大の活性を有するが、いくつかの菌類
セルラーゼが、中性およびややアルカリ性の条件下で著
しい活性を有することが知られており、すなわち、例え
ばHumicola insolensから誘導されたセルラーゼは中性
からややアルカリ性条件下で著しい活性を有することが
知られている。

菌類セルラーゼは、異なる基質特異性、酵素的作用パ
ターン等を有するいくつかの酵素分類からなることが知
られている。加えて、各分類内の酵素成分は、異なる分
子量、ことなるグリコシル化度、異なる等電点、異なる
基質特異性等を示し得る。例えば、菌類セルラーゼは、
エンドグルカナーゼ（EG）、エキソ−セロビオヒドロラ
ーゼ（CBH）、β−グルコシダーゼ（BG）等を含むセル
ラーゼ分類を含む。一方、細菌セルラーゼが、ほとんど
または全くCBH成分を含有しないと文献に報告されてい
るが、細菌セルラーゼから誘導されたCBH状成分がエキ
ソ−セロビオヒドロラーゼ活性を有すると報告されたこ
とはまれである。

自然に発生した菌類源により産生されて１つ以上のCB
HおよびEG成分からなる菌類セルラーゼ組成物は、これ
らの成分それぞれが菌類源により産生された比率で発見
され、ここではときどき「完全菌類セルラーゼ系」また
は「完全菌類セルラーゼ組成物」と称され、その組成物
を、そこから単離されたセルラーゼの分類および成分か
ら、細菌とある菌類により産生された不完全セルラーゼ
組成物から、またはセルラーゼのCBHおよび／またはEG
成分を生産しないように、または産生過剰、産生不足と
なるように遺伝学的に修飾した微生物から得たセルラー
ゼ組成物から区別する。

セルラーゼの産生のための菌類を培養する発酵方法
は、従来技術においてそれ自体が知られている。例え
ば、セルラーゼ系は、バッチ、フェド−バッチ（fed−b
atch）および連続流動工程を含む固体または浸水培地の
いずれかにより産生され得る。発酵肉汁（broth）から
のセルラーゼ系の集積および精製はまた、従来技術にお
いてそれ自体が知られている方法により達成される。

「エンドグルカナーゼ（「EG」）型成分」は、それら
全ての菌類セルラーゼ成分またはTrichoderma reesei
のエンドグルカナーゼ成分に似た布地活性特性を示す成
分の組合せを示す。この点に関して、Trichoderma ree
seiのエンドグルカナーゼ成分（特に、EG I、EG II、EG
III等を単一または組合せで）は、これらの成分が布地
処理媒質中に含有され、その織物がこの媒質で処理され
た場合、（処理前の織物と比較して）綿含有織物に、改
良された肌触り、改良された外観、柔軟さ、高められた
色彩、および／またはストーンウォッシュの外観を与え
る。加えて、綿含有織物のTrichoderma reeseiのエン
ドグルカナーゼ成分による処理は、類似の組成物での処
理であるが追加にCBH I型成分を含有する処理により生
じた強度の損失と比較してより少ない強度の損失とな
る。

したがって、エンドグルカナーゼ型成分は、これらの
成分が、織物を処理するのに用いられる媒質中に含有さ
れる場合に、（処理前の織物と比較して）綿含有織物
に、改良された肌触り、改良された外観、柔軟さ、高め
られた色彩、および／またはストーンウォッシュの外観
を与え、そして類似のセルラーゼ組成物での処理である
が追加にCBH I型成分を含有する処理により生じた強度
の損失と比較してより少ない強度の損失を与える菌類セ
ルラーゼ成分である。

そのようなエンドグルカナーゼ型成分は、（ａ）カル
ボキシメチルセルロース（CMC）のような溶性セルロー
ス誘導体を加水分解して、それにより溶液を含有するCM
Cの粘度を減少せしめる、（ｂ）リン酸膨潤セルロース
（例えば、ワルセスセルロース）のようなセルロースの
水和形態を容易に加水分解する、およびセルロースのよ
り高度な結晶性形態（例えば、アビセル、ソルカフロク
等）を容易ではないが加水分解する、成分の能力のよう
な活性試験を用いてエンドグルカナーゼとして因襲的に
分類される成分は含まない。一方で、そのような活性試
験により定義されるような全てのエンドグルカナーゼ成
分が、綿含有織物に、１つ以上の高められた質、並びに
減少した強度損失を与えるわけではないと思われてい
る。したがって、エンドグルカナーゼ型成分を、Tricho
derma reeseiのエンドグルカナーゼ成分により所有さ
れるような類似の布地活性特性を所有する菌類セルラー
ゼの成分として定義することが本発明にとってより正確
である。

菌類セルラーゼは１つより多いEG型成分を含有し得
る。異なる成分は一般的に、異なる等電点、異なる分子
量、異なるグリコシル化度、異なる基質特異性、異なる
酵素活性パターン等を有する。成分の異なる等電点によ
り、イオン交換クロマトグラフィー等による分離が可能
となる。実際、異なる菌類源からの成分の単離は従来技
術において知られている。例えば、ボルクらの米国特許
出願07/422,814、シュラインらの、国際出願WO89/0925
9、ウッドらのセルロース分解の生化学および遺伝学、3
1から52（1988）；ウッドらの炭化水素リサーチ、190
巻、279から297（1988）；シュライン、酵素学における
方法、160巻、234から242（1988）等を参照のこと。こ
れらの各参照文献の完全な開示を、ここに引用する。

一般的に、EG型成分の組合せは、綿含有織物に高めら
れた質を与え、並びに単一のEG成分と比較して減少した
強度損失を与える際に、相乗応答を示すと考えられてい
る。一方では、単一のEG型成分はより安定であり、pH範
囲に亘り広いスペクトルの活性を有する。したがって、
本発明に用いられるEG型成分は、単一のEG型成分または
２つ以上のEG型成分の組合せのいずれかである。成分の
組合せが用いられる場合、EG型成分は同一または異なる
菌類源ら誘導される。

EG型成分は細菌的誘導セルラーゼから誘導され得る。

「エキソ−セロビオヒドロラーゼ型（「CBH型」）成
分」は、Trichoderma reeseiのCBH Iおよび／またはCB
H IIセルラーゼに類似した布地活性特性を示す菌類セル
ラーゼ成分を指す。この点に関して、EG型成分セルラー
ゼ成分の不在下で用いられた場合（上記定義したよう
に）、Trichoderma reeseiのCBH IおよびCBH II成分の
みでは、その処理した綿含有織物に、肌触り、外観、色
彩および／またはストーンウォッシュの外観において著
しい増大を与えない。したがって、EG型成分と組み合わ
せて用いた場合、Trichoderma reeseiのCBH I成分は、
その綿含有織物に高められた強度の損失を与える。

したがって、CBH I型成分およびCBH II型成分は、そ
れぞれTrichoderma reeseiのCBH IおよびCBH II成分と
類似した布地活性特性を示す菌類セルラーゼ成分を指
す。上述したように、CBH I型成分に関して、このこと
は、EG型成分の存在下で用いられる場合、綿含有織物の
強度損失を高める特性を含む。好ましい実施態様におい
てEG型成分と組み合わせて持ちいられる場合、Trichode
rma reeseiのCBH I型成分は増大した洗浄効果を与え
る。したがって、Trichoderma reeseiのCBH I型成分
は、EG型成分と組み合わせてまたは単一で用いられる場
合、増大した柔軟効果を与えられる。

そのようなエキソ−セロビオヒドロラーゼ型成分はど
うしても、Trichoderma reeseiのCBH IおよびCBH IIを
特徴付けるのに用いられたような活性試験を用いてエキ
ソ−セロビオヒドロラーゼとして因襲的に分類された成
分は含まない。例えば、そのような成分は、（ａ）セル
ビオースにより競争的に阻害される（Kiは約1mM）；
（ｂ）カルボキシメチルセルロース等のような置換セル
ロースを著しくは加水分解できない；（ｃ）リン酸膨潤
セルロースを加水分解し、高度な結晶性セルロースはあ
まり加水分解しない。一方では、活性試験によりCBH成
分として特徴付けられたある菌類セルラーゼ成分は、セ
ルラーゼ組成物中で単体で用いられる場合、最小限の強
度損失を有する綿含有織物に、改善された肌触り、外
観、柔軟さ、色彩、および／またはストーンウォッシュ
の外観を与える。したがって、エキソ−セロビオヒドロ
ラーゼ成分は、Trichoderma reeseiのエンドグルカナ
ーゼ成分により所有されるような布地用途の類似の機能
特性を所有するので、そのようなエキソ−セロビオヒド
ロラーゼをEG型成分として定義することが本発明に関し
てより正確であると思われる。

CBH I不足、CBH I豊富またはEG III豊富であるセルラ
ーゼ組成物を含有する洗浄剤成分に関して、セルロース
から還元糖を生成するのはセルラーゼの量であり、特定
の酵素成分の加水分解の相対比率ではなく、このことが
綿含有織物に所望の洗浄剤特性を与える、例えば、１つ
以上の改善された色彩の復元、改善された柔軟さ、およ
び改善された洗浄力をその洗浄剤組成物に与えることが
発見された。

実質的に全てのCBH I型成分を含まない菌類セルラー
ゼは精製技術により得られる。つまり、完全なセルラー
ゼ系は、適切なpHでのイオン交換クロマトグラフィー、
親和力クロマトグラフィー、サイズ排除等を含む、文献
によく発表されている認識された分離技術により実質的
に純粋な成分に精製できる。例えば、イオン交換クロマ
トグラフィーにおいて（通常は陰イオン交換クロマトグ
ラフィー）、pH勾配、または塩勾配、またはpHと塩勾配
により溶出することによりセルラーゼ成分を分離するこ
とができる。ここに用いているように、「実質的に全て
のCBH I型成分を含まないセルラーゼ」という用語は、
タンパク質の重量に基づくセルラーゼ組成物が１重量パ
ーセント未満のCBH I型セルラーゼ成分しか含有しない
ことを意味する。

また、実質的に全てのCBH I型成分を含まないセルラ
ーゼは、単離および成分の組換え以外の方法で調製でき
ると考えられる。例えば、どのようなCBH I型成分も製
造不可能な、またはどのようなCBH型成分を製造不可能
な微生物を調製するために、組換え技術が用いられる。

上述した点に関して、実質的に全てのCBH I型成分を
含まないセルラーゼを調製する好ましい方法は、CBH I
型成分の表現が不可能であるように微生物を遺伝学的に
修飾することによるものであり、それらの方法はどのよ
うな異種タンパク質も表現しない。同様に、１つ以上の
EG型成分を加えて過表現するように微生物を遺伝学的に
修飾することもできる。例えば、1990年10月５日に出願
され、ここに全てを参照文献として含む米国特許出願第
07/593,919号は、１つ以上のCBH成分を表現できないよ
うにおよび／または１つ以上のEG成分を過表現できない
ように、Trichoderma reeseiを遺伝学的に精製する方
法を開示している。さらに、その用途の方法は、どのよ
うな異種タンパク質をも表現しないTrichoderma reese
i菌株を産生する。同様に、ミラーらの、「Asperqillus
nidulans中の直接および非直接遺伝子置換」分子およ
びセルラ生物学、1714−1721（1985）は、異種DNAの線
形断片を用いたDNA媒介転換によりAsperqillus nidula
ns中の遺伝子を削除する方法を開示している。ミラーら
の方法は、どのような異種タンパク質を産生することな
く遺伝子削減を達成する。

上述した点に関して、CBH I型および／またはCBH II
型セルラーゼ成分を産生する責任のある遺伝子の削除は
また、セルラーゼ組成物中に存在するEG型成分の量を豊
富にする効果を有する。同様に、CBH IおよびII型成分
を産生する責任のあるそれらの遺伝子の削除はCBH型成
分を含まないセルラーゼ組成物となる。

菌類セルラーゼ組成物は、不完全な菌類セルラーゼ組
成物を産生する菌類源からここに用いられると考えられ
る。例えば、ある菌類はCBH成分を含まないセルラーゼ
組成物を産生することが知られている。例えば、コーラ
ンらの、セルロース分解の生化学および遺伝学、編集者
オーバートら、11−30（アカデミックプレス、1988）に
は、赤腐れ菌は明確にCBH成分を産生しないことが開示
されているが、これらの成分の１つ以上がCBH I型成分
であることも可能である。

「β−グルコシダーゼ（BG）成分」は、BG活性を示す
セルラーゼ成分を指し、すなわちそのような成分はセロ
ビオースの非還元末端および他のセロオリゴ糖類（「セ
ロビオース」）から作用し、単一産生物としてのグルコ
ースを与える。BG成分はセルロース高分子上に吸着され
ず、または反応しない。さらに、そのようなBG成分は競
争的にグルコースにより阻害される（Kiは約1mM）。厳
密な意味において、BG成分はセルロースを分解できない
ので文字通りにはセルラーゼではないが、そのようなBG
成分は、これらの酵素が、CBH成分およびEG成分の結合
作用により産生された阻害セルロース分解産生物（特に
セロビオース）をさらに分解することによりセルロース
の全体的な分解を促進させるため、セルラーゼ系の定義
内に含まれる。BG成分の存在なくしては、結晶性セルロ
ースの加水分解は緩やかにしかまたはほとんど生じな
い。BG成分はしばしば、ｐ−ニトロフェノールＢ−Ｄ−
グルコシド（PNPG）のようなアリル基質に特徴付けら
れ、それゆえしばしばアリル−グルコシダーゼと呼ばれ
る。全てのアリルグルコシダーゼがBG成分であるわけで
はなく、あるものはセロビオースを加水分解しない。

セルラーゼ組成物中のBG成分の存在または不在は、組
成物中のCBH成分の活性を調整するのに用いられると考
えられる（すなわち、非CBH I型成分）。つまり、セル
ビオースはCBH成分によるセルロース分解中に産生され
るので、そして高濃度のセロビオースがCBH活性を阻害
することが知られているので、さらにそのようなセロビ
オースはBG成分によりグルコースに加水分解されるの
で、セルラーゼ組成物中のBG成分の不在は、セロビオー
スの濃度が阻害水準に達する場合にCBH活性を「消失」
させる。また、１つ以上の添加剤（例えば、セロビオー
ス、グルコース等）を、そのセルラーゼ組成物に加え
て、直接にまたは間接的に、CBH I型活性、並びに他のC
BH活性を効果的に「消失」できると考えられる。そのよ
うな添加剤が用いられた場合、添加剤の量が効果的にCB
H I型活性を失わせるのに十分であれば、精製した組成
物は全てのCBH I型成分を含まない組成物であると考え
られる。

一方、CBH成分により生成されたセロビオースの水準
が、添加したBG成分の不在下でそのような全体の加水分
解の制限となる場合、添加した量のBG成分を含有するセ
ルラーゼ組成物は、セルロースの全体の加水分解を増大
させる。

セルラーゼ組成物中のBG成分の量を増加せしめるまた
は減少せしめるいずれかの方法が、事務所明細書番号01
0055−056として1990年12月10日に出願され、「クロー
ニングによるセルロースの糖化およびTRICHODERMA REE
SEIによるβ−グルコシダーゼ遺伝子の増幅」と題され
た米国特許出願第07/625,140号に記載されており、ここ
にその全体を参照文献として含む。

菌類セルラーゼは１つ以上のBG成分を含有できる。異
なる成分は一般的に、イオン交換クロマトグラフィー等
によりそれらの分離を可能にする異なる等電点を有す
る。単体BG成分またはBG成分の組合せのいずれかが用い
られる。

布地処理溶液中で用いられる場合、BG成分は一般的
に、セルラーゼ組成物中に発見されるどのようなCBHお
よびEG成分のセルラーゼによる阻害を防ぐのに十分な量
で加えられる。加えるBG成分の量は、当業者により容易
に決定される布地組成物中に産生されるセロビオースの
量に依存する。しかしながら、使用される場合、セルラ
ーゼ組成物中に存在するいかなるCBH型成分と比較したB
G成分の重量パーセントは、好ましくは約0.2から約10重
量パーセントであり、より好ましくは約0.5から約５重
量パーセントである。

本発明に用いられる菌類セルラーゼ組成物を調製する
のに使用される好ましい菌類セルラーゼは、Trichoderm
a reesei、Trichoderma koningii、Pencillum sp.、
Humicola insolens、等から得られるものである。ある
菌類セルラーゼは市販されている。すなわち、セルキャ
スト（デンマーク、コペンハーゲン、ノボインダストリ
ー社から得られる）、ラピダーゼ（オランダ、デルフ
ト、N.V.、ギストブロケイド社から得られる）、サイト
ラーゼ123（カリフォルニア州、南サンフランシスコ、
ジネンカーインターナショナル社から得られる）等であ
る。他の菌類セルラーゼもまた、周知の発酵および単離
方法により容易に単離できる。

「緩衝溶液」という用語は、綿含有織物のセルラーゼ
処理中に変動する所望ではないpHに対するセルラーゼ溶
液を安定化させる周知の酸／塩基試薬を指す。この点に
関して、セルラーゼ活性はpHに依存することが知られて
いる。すなわち、特定のセルラーゼ組成物が、定義され
たpH範囲内にセルロースを加水分解する活性を示し、そ
の定義された小さな部分内に最適なセルロースを加水分
解する活性が一般的に発見される。セルロースを加水分
解する活性の特定なpH範囲は各セルラーゼ組成物により
変化する。上述したように、ほとんどのセルラーゼは、
酸性から中性pHプロフィール内でセルロースを加水分解
する活性を示すが、アルカリ性のpHプロフィールにおい
てセルロースを加水分解する活性を示すセルラーゼ組成
物もある。

綿含有織物のセルラーゼ処理中に、最初のセルラーゼ
溶液のpHはセルラーゼ活性に要求される範囲の外側にあ
ることもあり得る。さらに、綿含有織物の処理中に、例
えば溶液のpHを変更する反応生成物の生成により、pHが
変化することも有り得る。いずれの場合にも、干渉して
いないセルラーゼ溶液のpHはセルロースを加水分解する
活性に要求される範囲の外側に有り得る。このようなこ
とが生じた場合、セルラーゼ溶液中で所望でない還元ま
たはセルロースを加水分解する活性の停止が生じる。例
えば、産生活性プロフィールを有するセルラーゼが中性
に緩衝されない水溶液中で用いられる場合、溶液のpH
は、より低いセルロースを加水分解する活性およびおそ
らくセルロースを加水分解する活性の停止となる。一
方、中性に緩衝していない水溶液中で中性またはアルカ
リ性のプロフィールを有するセルラーゼの使用は、最初
に著しいセルロースを加水分解する活性を提供する。

上述した観点から見て、セルラーゼ溶液のpHはセルロ
ースを加水分解する活性に要求される範囲内に保持され
るべきである。このことを達成する１つの手段は、単に
その系のpHをモニタして、酸または塩基いずれかの添加
により所望のpHを調製することによるものである。しか
しながら、好ましい実施態様において、系のpHは好まし
くは、セルラーゼ溶液中に緩衝液を使用することにより
所望のpH範囲内に保持される。一般的に、使用したセル
ラーゼが活性を示す範囲内に溶液のpHを保持するため
に、十分な量の緩衝液を使用する。異なるセルラーゼ組
成物がセルロースを加水分解する活性を示す異なるpH範
囲を有する限りは、使用する特定の緩衝液は、使用する
特定のセルラーゼ組成物に関連して選択される。使用す
るセルラーゼへの使用のために選択する緩衝液は、pH範
囲および使用するセルラーゼに最適な条件並びにセルラ
ーゼ溶液のpHを考慮にいれた当業者により容易に決定で
きる。好ましくは、使用する緩衝液は、セルラーゼ組成
物と相溶性であり、セルラーゼ溶液のpHを最適な活性に
要求されるpH範囲内に保持するものである。適した緩衝
液は、クエン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナ
トリウム、リン酸二ナトリウム、および他の従来技術に
おいて知られている緩衝液を含む。

綿含有織物の引張強さは、互いに直角であるたて方向
とよこ方向に関して測定できる。したがって、ここに用
いる「たて引張強さ」という用語は、綿含有織物の長さ
方向に沿って測定された綿含有織物の引張強さを指し、
一方「よこ引張強さ」という用語は、綿含有織物の幅方
向を横切って測定された綿含有織物の引張強さを指す。
セルラーゼ溶液で処理した綿含有織物の引張強さを、処
理の強さ減少効果を決定するために、セルラーゼ溶液に
よる処理の前の引張強さと比較する。その引張強さがあ
まりにも減少せしめられる場合は、生成した綿含有織物
が容易に裂けるおよび／または孔を形成する。したがっ
て、処理の後に、少なくとも処理前の引張強さの約50％
である引張強さを保持することが望ましい（たておよび
よこの両方）。

綿含有織物の引張強さは、ASTM D1682試験方法論に
従って容易に導かれる。そのような織物の引張強さを試
験するのに適した装置は、スコットテスターまたはイン
ストロンテスターを含み、その両方が市販されている。
セルラーゼ溶液で処理した綿含有織物の引張強さを試験
する際に、処理後で試験前の織物の収縮を避けるように
注意しなければならない。そのような収縮は、誤った引
張強さのデータの原因となる。

綿含有織物への高められた質はここに用いられている
方法により達成される。例えば、改善された肌触りを有
する綿含有織物は、日本国特開昭58−36217および58−5
4032並びに大石らの「セルラーゼによる綿織物の再形
成」およびJTN1988年12月ジャーナルアーティクル「新
たなこと、綿織物の感触を柔らかくする重量損失処理」
により達成できる。これらの文献のそれぞれの教示をこ
こに参照文献として含む。

同様に、綿含有織物の肌触りと外観の両者を改良する
方法は、溶液が撹拌され、その綿含有織物に亘りセルラ
ーゼ溶液のカスケード効果が達成されるような条件下で
セルラーゼを含有する水溶液にその織物を接触せしめる
ことを含む。そのような方法により、そのように処理さ
れた綿含有織物の改善された肌触りと外観が導かれ、19
90年10月16日に出願され、ここに全体が参照文献として
含まれる米国特許出願第07/598,506号に記載されてい
る。

綿含有ニットを高める方法が、1990年第２期の国際紡
績会報の５頁の染色／印刷／仕上げにおいて記載されて
おり、ここに参照文献として含まれている。

同様に、ストーンウォッシュの外観を綿含有デニムに
与える方法が、米国特許第4,832,864号に記載されてお
り、ここにその全体が参照文献として含まれる。

セルラーゼ組成物での処理により綿含有織物を高める
他の方法も従来技術において知られている。好ましくは
そのような方法において、セルラーゼによる綿含有織物
の処理は、綿含有織物を仕上げる前に行なわれる。

上述したように、本発明が、処理織物の強さ損失を最
小限にする特定のセルラーゼ組成物を用いる限りは、本
発明は綿含有織物を処理する従来技術の方法より優れた
改善である。ここに用いるセルラーゼ組成物は、実質的
にCBH I型成分を含まない、好ましくは実質的にCBH型成
分を含まない菌類セルラーゼ組成物である。

加えて、ここに記載するセルラーゼ組成物の使用によ
り、応力の加えられた綿含有織物において織物／色彩を
高められたものとする。つまり、綿含有織物の製造中
に、その織物には応力が加えられ、そのように応力が加
えられた場合、その織物は、破壊されて乱れた繊維を含
有する。そのような繊維は、織物にすり切れてさえない
外観を有害に与える。しかしながら、本発明の方法によ
り処理した場合、そのように応力の加えられた織物は織
物／色彩の高められたものとなる。このことは、応力の
加えられる前に織物の外観を復元する効果を有する、破
壊されて乱れた繊維のいくつかを除去することにより生
じると思われる。

加えて、顔料型染色織物（例えば、デニム）に関し
て、ここに記載されたセルラーゼ組成物を用いることに
より、これらのセルラーゼ組成物は、染料の再析出をよ
り少なく生じさせる。また、これらの抗再析出特性は、
他の成分と比較して１つ以上の特定EG型成分について高
められると考えられる。

上述した菌類セルラーゼ組成物は、セルラーゼおよ
び、例えば緩衝液、界面活性剤、精練剤等を含む他の必
要に応じての成分を含む水溶液中で用いられる。この溶
液に用いられるセルラーゼの濃度は、一般的にその意図
する目的に十分な量である。すなわち、セルラーゼ組成
物は、綿含有織物に所望の高められた質を提供する量で
用いられる。使用されるセルラーゼ組成物の量はまた、
用いられる装置、用いられる方法のパラメータ（セルラ
ーゼ溶液の温度、セルラーゼ溶液への露出時間、等）、
セルラーゼ活性（例えば、セルラーゼ溶液は、少ない活
性のセルラーゼ組成物と比較してより高い活性のセルラ
ーゼ組成物では低い濃度を要する）、等に依存する。セ
ルラーゼ組成物の正確な濃度は、上述した要因並びに所
望の効果に基づいて当業者により容易に決定され得る。
好ましくは、ここに使用するセルラーゼ溶液中のセルラ
ーゼ組成物の濃度は、セルラーゼ溶液の0.01グラム／リ
ットルからセルラーゼ溶液の約10.0グラム／リットル；
さらに好ましくは、セルラーゼ溶液の0.05グラム／リッ
トルからセルラーゼ溶液の約２グラム／リットルであ
る。（上述したセルラーゼ濃度は全タンパク質の重量を
指す）。

セルラーゼ溶液中に緩衝液を用いる場合、セルラーゼ
水溶液中の緩衝液の濃度は、使用するセルラーゼが、使
用するセルラーゼの特性に依存する活性を示す範囲内に
溶液のpHを保持するのに十分なものである。使用する緩
衝液の正確な濃度は、当業者が容易に考慮できるいくつ
かの要因に依存する。例えば、好ましい実施態様におい
て、緩衝液並びに緩衝液の濃度は、最適なセルラーゼ活
性に要求されるpH範囲内にセルラーゼ溶液のpHを保持す
るように選択される。一般的に、セルラーゼ溶液中に緩
衝液濃度は約0.005Nかそれより大きい。好ましくは、セ
ルラーゼ溶液中の緩衝液の濃度は、約0.01から約0.5Nで
あり、より好ましくは約0.05から約0.15Nである。セル
ラーゼ溶液中の増大した緩衝液濃度が処理した織物の引
張強さの損失率を高めることも可能である。

セルラーゼと緩衝液に加え、セルラーゼ溶液は必要に
応じて、少量、すなわち、約２重量パーセント未満、好
ましくは約0.01から約２重量パーセントの界面活性剤を
含有できる。適した界面活性剤は、例えば、アニオン界
面活性剤、非イオン界面活性剤および両性電解質界面活
性剤を含む織物およびセルラーゼに相溶性であるどのよ
うな界面活性剤をも含む。

ここに使用する適したアニオン界面活性剤は、直鎖ま
たは枝別れ鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖また
は枝別れ鎖のアルキル基またはアルケニル基を有するア
ルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまは
アルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；アルカン
スルホン酸塩等を含む。アニオン界面活性剤に適した対
イオンは、ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ
金属イオン；カルシウムおよびマグネシウムのようなア
ルカリ土類金属；アンモニウムイオン；および炭素数２
または３の１から３のアルカノール基を有するアルカノ
ールアミンを含む。

両性電解質界面活性剤は、第４アンモニウム塩スルホ
ン酸塩、ベタインタイプ両性電解質界面活性剤等を含
む。そのような両性電解質界面活性剤は同一の分子中に
陽に荷電した基と陰に荷電した基の両方を有する。

非イオン性界面活性剤は一般的に、ポリオキシアルキ
レンエーテル、並びに高級脂肪酸アルカノールアミドま
たはそのアルキレン酸化物付加物、脂肪酸グリセリンモ
ノエステル等からなる。

そのような界面活性剤の混合物もまた用いられる。

ここに用いられる溶液比、すなわち、織物に対するセ
ルラーゼ溶液の重量比は一般的に、綿含有織物に所望の
高められた質を達成するのに十分な量であり、使用され
る方法および達成される質に依存する。好ましくは、溶
液比は一般的に、約0.1:1かそれより大きく、さらに好
ましくは約1:1より大きく、さらにより好ましくは約10:
1より大きい。約50:1より大きな溶液比を使用すること
は、経済的な点から見て通常好ましくはない。

セルラーゼ処理の反応温度は２つの競合因子により決
定される。第１に、より高い温度は一般的に、高められ
た反応速度論、すなわちより速い反応と対応し、このこ
とはより低い温度で要求される反応時間と比較して減少
した反応時間となる。したがって、反応温度は一般的に
少なくとも約30℃かそれより大きい。第２に、セルラー
ゼは、所定の反応温度を超えると活性を失うタンパク質
であり、その温度は、用いられるセルラーゼの特性に依
存する。それゆえ、反応温度が非常に高くなる場合、セ
ルロースを加水分解する活性が、セルラーゼの変性の結
果として失われる。その結果、ここに用いられる最大反
応温度は一般的に約65℃である。上述点に関して、反応
温度は一般的に、約30℃から約65℃であり、好ましくは
約35℃から約60℃であり、さらに好ましくは約35℃から
約50℃である。

反応時間は一般的に、約0.1時間から約24時間であ
り、好ましくは約0.25時間から約５時間である。

そのようなセルラーゼ組成物を用いた上述した方法で
処理した綿含有織物は、完全な菌類セルラーゼ組成物で
同様な方法により処理した同一の綿含有織物と比較して
減少した強さ損失を有する。

好ましい実施態様において、上述した方法に使用する
ために、濃縮物を調製することができる。そのような濃
縮物は、好ましくは水溶液中に、濃縮した量の、上述し
たセルラーゼ組成物、緩衝液および界面活性剤を含む。
そのように調合する場合、その濃縮物は、素早くそして
正確にこれらの添加物に必須の濃度を有するセルラーゼ
溶液を調製するために水で容易に希釈できる。好ましく
は、そのような濃縮物は、約0.1から約20重量パーセン
トの上述したセルラーゼ組成物（タンパク質）；約10か
ら約50重量パーセントの緩衝液；約10から約50重量パー
セントの界面活性剤；および約０から80重量パーセント
の水からなる。水性濃縮物が配合される場合、これらの
濃縮物は、セルラーゼ溶液中の成分の必須の濃度に達す
るように約２から約200に因子により希釈される。容易
に明確であるように、そのような濃縮物により、セルラ
ーゼ溶液の容易な調合が行なうことができ、並びに用い
られる場所まで都合のよい濃縮の移送ができる。上述し
たセルラーゼ組成物は、液体希釈物、粒状、エマルジョ
ン、ゲル、ペースト等のいずれの状態の濃縮物にも加え
られる。そのような形態は当業者によく知られている。

固体のセルラーゼ濃縮物が用いられる場合、そのセル
ラーゼ組成物は一般的に粒状、粉末、凝集体、等であ
る。粒状のものが用いられる場合、その粒状物は好まし
くはセルラーゼ保護剤を含むように調合できる。例え
ば、事務所明細書番号010055−073として1991年１月17
日に出願され、「酵素および酵素保護剤の両者を含有す
る粒剤、並びにそのような粒剤を含有する洗浄剤組成
物」と称する米国特許出願第07/642,669号を参照のこ
と。この応用はここにその全体について参照文献として
含まれる。同様に、粒剤は、その粒剤の洗浄媒質への溶
解の速度を減少させる物質を含有するように調合でき
る。そのような物質は、事務所明細書番号GCS−171−US
1として1991年１月17日に出願され、「粒状組成物」と
称する米国特許出願第07/642,596号に開示されており、
その応用はここにその全体について含まれる。

ここに記載されたセルラーゼ組成物は、予備洗浄にお
いても用いられ、そして液体またはスプレーいずれかの
プリソークとして用いられると考えられる。さらに、こ
こに記載したセルラーゼ組成物はまた、高められた色彩
と織物の外観に適した１つの組成物として家庭で使用で
きると考えられる。例えば、米国特許第4,738,682号を
参照のこと。これはここにその全体について参照文献と
して含まれる。

以下の実施例は本発明を説明するために提示されたも
のであり、その視野を限定するように解釈されるべきで
はない。

実施例 実施例１−12および22−30は、１つ以上のセルラーゼ
組成物を産生できないように、または特定のセルラーゼ
組成物を過剰産生するように、遺伝学的に設計したTric
hoderma reeseiの産生を説明する。

実施例１ Trichoderma reeseiのpyr4誘導体の選択 pyr4遺伝子は、ウリジンの生合成に必要とされる酵素
である、オロチジン−５′−モノリン酸塩デカルボキシ
ラーゼをコードする。毒性阻害因子５−フルオロオロチ
ン酸（FOA）が、野生型細胞によりウリジン中に含ま
れ、それゆえ細胞を毒する。しかしながら、pyr4遺伝子
中に検出される細胞はこの阻害因子に対する抵抗を有す
るが、成長のためにウリジンを必要とする。それゆえ、
FOAを用いてpyr4誘導体菌株を選択することが可能であ
る。実際、T.reesei菌株RL−P37の芽胞（シール−ニー
ス、G.およびモンテンコート、B.S.、Appl.Microbiol.B
iotechnol.20、p,46−53（1984））を、2mg/mlのウリジ
ンおよび1.2mg/mlのFOAを含有する固体化した媒質の表
面上に広げた。３または４日以内に、自然なFOA抵抗群
体が現れ、その後に、成長のためにウリジンを必要とす
るそれらのFOA抵抗誘導体を同定することができる。特
異的に欠損pyr4遺伝子を有したそれらの誘導体を同定す
るために、プロトプラストを産生し、野生型pyr4遺伝子
を含有するプラスミドで転換した（実施例３および４参
照）。転換に続いて、プロトプラストを、ウリジンを欠
いた媒質上に展開した。転換群体の続いての成長は、プ
ラスミドボーン（borne）pyr4遺伝子による欠損pyr4遺
伝子の補完を示した。このようにして、菌株GC69を、菌
株RL−P37のpyr4誘導体であると同定した。

実施例２ CBH I欠失ベクターの調製 CBH Iタンパク質をコードするcbh1遺伝子を、既知の
プローブ合成方法を用いた、この遺伝子に関して公表さ
れた配列を元にして設計したオリゴヌクレオチドプロー
ブでの雑型形成により、T.reesei菌株RL−P37のゲノムD
NAからクローンした（シューメーカーら、1983b）。cbh
1遺伝子は、6.5kb Pst I断片上に存在し、当業者に知
られた技術を用いてこのベクターのKan^r遺伝子を置換す
ることによりPst I切断pUC4K（NJ、ピスカタウェイ、フ
ァーマシア社から購入）中に挿入され、この技術はマニ
アチスらにより述べられており（1989）、ここに参照文
献として含む。次いで産生したプラスミド、pUC4K::cbh
1をHind IIIで切断し、約6kbのより大きな断片を単離し
て、再結さつしてpUC4K::cbh1ΔH/Hを与えた（図１参
照）。この方法は、完全なcbh1暗号配列および約1.2kb
上流と1.5kb下流側腹配列を除去する。元来のPst I断片
のいずれかの末端からの、おおよそ1kbの側腹DNAが残
る。

T.reesei pyr4遺伝子を、マニアチスらの方法に従っ
て、pUC18中のゲノムDNAの6.5kb Hind III断片として
クローンし、pTpyr2（スミスら、1991）を形成した。プ
ラスミドpUC4K::cbh1ΔH/HをHind IIIで切断し、その末
端を子牛腸アルカリ性ホスファターゼで脱リンした。こ
の末端脱リンDNAを、T.reesei pyr4遺伝子を含有する
6.5kb Hind III断片と連結し、ｐΔCBH I pyr4を得
た。図１はこのプラスミドの構成を説明している。

実施例３ プロトプラストの単離 500mlのフラスコ中の100mlのYEG（0.5％の酵母抽出
物、２％のグルコース）を約５×10⁷のT.reesei GC69
芽胞（pyr4誘導体菌株）で接種することにより菌糸体を
得た。次いでそのフラスコを振動させながら37℃で約16
時間、培養した。2,750×ｇでの遠心分離により菌糸体
を収穫した。収穫した菌糸体をさらに、1.2Mソルビット
溶液中で洗浄し、5mg/mlのノボザイム234溶液（Ct、ダ
ンバリー、ノボバイオラボから得られる、１、３−アル
ファ−グルカナーゼ、１、３−ベータ−グルカナーゼ、
ラミナリナーゼ、キシラーゼ、キチナーゼおよびプロテ
アーゼを含有する多成分酵素系の商標である）;5mg/ml
のMgSO₄・7H₂O;0.5mg/mlの牛血清アルブミン;1.2Mソル
ビットを含有する40mlの溶液中に再懸濁せしめた。プロ
トプラストを、ミラクロス（CA、ラジョラ、カルビオケ
ム社）を通じての濾過により細胞デブリから除去し、2,
000gでの遠心分離により集積した。そのプロトプラスト
を、1.2Mのソルビット中で３回洗浄して、1.2Mのソルビ
ット、50mMのCaCl₂中で１回洗浄し、遠心分離し、1.2M
ソルビット、50mMのCaCl₂のml当たり約２×10⁸プロトプ
ラストの密度で再懸濁せしめた。

実施例４ 菌類プロトプラストのｐΔCBH I pyr4による転換 実施例３において調製した200μｌのプロトプラスト
懸濁液を、20μｌのTE緩衝液（10ml トリス、pH7.4、1
mM EDTA）中のEcoR I切断ｐΔCBH I pyr4（実施例２に
おいて調製）、および25％PEG 4000、0.6M KClおよび
50mMのCaCl₂を含有する50μｌのポリエチレングリコー
ル（PEG）溶液に加えた。この混合物を20分間、氷上で
培養した。この培養期間の後に、そこに上述のように同
定した2.0mlのPEGを加え、その溶液をさらに混合し、室
温で５分間培養した。この第２の培養後、1.2Mのソルビ
ットおよび50mMのCaCl₂を含有する4.0mlの溶液をそれに
加え、この溶液をさらに混合した。次いでそのプロトプ
ラスト溶液を、追加の１％のグルコース、1.2Mのソルビ
ットおよび１％のアガロースを含有するボゲルス媒質Ｎ
（１リットル当たり、３グラムのクエン酸ナトリウム、
５グラムのKH₂PO₄、２グラムのNH₄NO₃、0.2グラムのMgS
O₄・7H₂O、0.1グラムのCaCl₂・2H₂O、５μｇのα−ビオ
チン、5mgのクエン酸、5mgのZnSO₄・7H₂O、1mgのFe（NH
₄）_２・6H₂O、0.25mgのCuSO₄・5H₂O、50μｇのMnSO₄・4
H₂O）の溶解アリコートに直ちに加えた。次いでプロト
プラスト／媒質混合物を、上述した同一のボゲル媒質を
含有する固体媒質上に注いだ。その媒質中にはウリジン
は全く存在せず、それゆえ、転換群体のみが、ｐΔCBH
I pyr4中に挿入された野生型pyr4遺伝子による菌株GC69
のpyr4突然変異の補完の結果として成長することができ
た。これらの群体を続いて転移せしめ、添加剤として１
％のグルコースを含有する固体ボゲル媒質Ｎ上に精製
し、安定な形質転換体をさらなる分析のために選択し
た。

この段階において、安定な形質転換体を、そのより速
い成長速度およびウリジンを欠いた固体培養媒質上のぎ
ざぎざというよりもむしろ滑らかな輪郭を有する円形の
群体の形成により不安定な形質転換体とは区別した。あ
る場合においては、固体の非選択性媒質（すなわち、ウ
リジンを含有する）上に形質転換体を成長させ、この媒
質から芽胞を収穫し、続いて発芽してウリシンを欠いた
選択性媒質上に成長するこれらの芽胞の百分率を求める
ことにより、さらなる安定性の試験を行なった。

実施例５ 形質転換体の分析 形質転換体が、１％のグルコースを含有する液体ボゲ
ル媒質Ｎ中で成長せしめられた後に、DNAを、実施例４
で得られた形質転換体から単離した。これらの形質転換
体DNA試料をさらにPst I制限酵素で切断し、アガロース
ゲル電気泳動を行なった。次いでそのゲルを、ニトラン
膜フィルタ上にブロットし、³²P標識ｐΔCBH I pyr4プ
ローブで雑種形成した。プローブを選択して、6.5kb P
st I断片としての天然cbh1遺伝子、転換DNA断片から誘
導されたいかなるDNA配列および天然pyr4遺伝子を同定
した。

雑種形成からの放射線活性帯は、オートラジオグラフ
ィーにより顕像化された。そのオートラジオグラフィー
を図３に示す。上述したように５つの試料Ａ、Ｂ、Ｃ、
ＤおよびＥを試験した。Ｅは未転換菌株GC69であり、本
分析において対照として用いた。レーンＡからＤは、上
述した方法により得られた形質転換化体を示す。オート
ラジオグラフィーの横側の数は、分子量マーカーのサイ
ズを示す。このオートラジオグラフィーから分かるよう
に、レーンＤは6.5kb CBH I帯を含まず、この遺伝子が
全体的に、cbh1遺伝子でのDNA断片の組込みにより形質
転換体中に欠失されたことを示す。cbh1欠失菌株はP37P
ΔCBH Iと呼ばれる。図２は、T.reesei染色体の１つのc
bh1座でのｐΔCBH I pyr4からのより大きなEcoR I断片
の二重交さの発生を通じての組込みによるT.reesei cb
h1遺伝子の欠失の概略を示す。分析した他の形質転換体
は、未転換対照菌株と同一であると思われる。

実施例６ pIntCBH Iを有する形質転換体の分析 使用したプローブが³²P標識pIntCBH Iプローブに代わ
ったことを除いては、実施例５と同一の方法を本実施例
において用いた。このプローブは、pUC4K::cbh1ΔH/H中
で欠失された領域内のcbh1座からの2kb Bgl II断片を
含有するpUC−型プラスミドである。この実施例におい
て、対照、未転換菌株GC69である試料Ａ、形質転換体P3
7PΔCBH Iを含む２つの試料を分析した。図４から分か
るように、6.5kbでの帯により示されるように、試料Ａ
はcbh1遺伝子を含有した。しかしながら、形質転換体、
試料Ｂはこの6.5kbでの帯を含有せず、それゆえcbh1遺
伝子を含有せず、pUCプラスミドから誘導されたいかな
る配列をも含有しない。

実施例７ 菌株P37PΔCBH Iによるタンパク質分泌 産生したP37PΔCBH I菌株からの芽胞を、１％のグル
コース、0.14％の（NH₄）₂SO₄、0.2％のKH₂PO₄、0.03％
のMgSO₄、0.03％の尿素、0.75％のバクトトリプトン（b
actotryptone）、0.05％のツイーン（Tween）80、0.000
016％のCuSO₄・5H₂O、0.001％のFeSO₄・7H₂O、0.000128
％のZnSO₄・7H₂O、0.0000054％のNa₂MoO₄・2H₂O、およ
び0.0000007％のMnCl・4H₂Oを含有する50mlのTrichoder
ma基礎媒質中に接種した。その媒質を振動させながら、
250mlのフラスコ中、37℃で約48時間、培養した。産生
した菌糸体わミラクロス（カルバイオケム社）を通過さ
せた濾過により集積し、17mMのリン酸カリウムで２また
は３回洗浄した。その菌糸体は最終的に、1mMのソフォ
ロース（sophorose）を有する17mMのリン酸カリウム中
で懸濁せしめ、さらに振動させながら30℃で24時間、培
養した。次いで上澄みをこれらの培養物から集積し、菌
糸体を捨てた。培養上澄みの試料を、ファーマシアファ
ストゲルシステムおよび製造者の指示に従ったpH3−９
プレキャストゲルを用いた等電点電気泳動により分析し
た。そのゲルは銀染料で染色し、タンパク質帯を顕像化
した。cbh1タンパク質に対応する帯は、図５に示すよう
に、菌株P37PΔCBH Iから誘導した試料には存在しなか
った。この等電点電気泳動ゲルは、T.reeseiの異なる上
澄み培養中の様々なタンパク質を示す。レーンＡは部分
的に精製したCBH Iであり、レーンＢは未転換T.reesei
培養からの上澄みであり、レーンＣは本発明の方法によ
り産生された菌株P37PΔCBH Iからの上澄みである。様
々なセルラーゼ成分の位置を、CBH I、CBH II、EG I、E
G II、およびEG IIIで標識する。CBH Iは全細胞外タン
パク質の50％を構成するので、CBH Iは主な分泌タンパ
ク質であり、それゆえゲル上で最も暗い帯となる。この
等電点電気泳動ゲルは明確に、P37PΔCBH I菌株中のCBH
Iタンパク質の欠失を示す。

実施例８ pPΔCBH IIの調製 CBH IIタンパク質をコードするT.reeseiのcbh2遺伝子
は、図6Aの図表に示すゲノムDNAの4.1kb EcoR I断片と
してクローンしてある（チェンら、1987、バイオテクノ
ロジー5:274−278）。この4.1kb断片をpUC4XLのEcoR I
部位の間に挿入した。後者のプラスミドは、ここに示す
順番:EcoR I、BamH I、Sac I、Sma I、Hind III、Xho
I、Bgl II、Cla I、Bgl II、Xho I、Hind III、Sma I、
Sac I、BamH I、EcoR I、で配列した制限エンドグルカ
ナーゼ部位の相称的な模様を有する多重クローニング部
位を含有するpUC誘導体（ジネンカーインターナショナ
ル社のR.M.ベーカにより構成された）である。従来技術
において知られている方法を用いて、プラスミド、pPΔ
CBH II（図6B）を構成し、ここで（CBH II翻訳開始部位
の74bp3′での）Hind III部位と（CBH IIの最後のコド
ンの265bp3′での）Cla I部位との間のこの遺伝子の1.7
kb中央領域を除去し、T.reesei pyr4遺伝子を含有する
1.6kb Hind III−Cla I DNAと置換した。

T.reesei pyr4遺伝子を1.6kb Nhe I−Sph I断片上
のpTpyr2（実施例２参照）から切除し、pUC219のSph I
とXba I部位との間に挿入し（実施例25参照）、p219Mを
産生した（スミスら、1991、Curr.Genet 19p.27−3
3）。次いでpyr4遺伝子を、一方の末端にDNAの7bpと、
他方の末端にDNAの6bpを有し、pUC219多重クローニング
部位から誘導されたHind III−Cla I断片として除去
し、cbh2遺伝子のHind IIIおよびCla I部位中に挿入
し、プラスミドpPΔCBH IIを形成した（図6B参照）。

このプラスミドのEcoR Iでの切断は、一方の末端での
cbh2座からの0.7kbの側端DNA、他方の末端でのcbh2座か
らの1.7kbの側端DNAおよび真中のT.reesei pyr4遺伝子
を有する断片を離生する。

実施例９ T.reesei菌株GC69中のcbh2遺伝子の欠失 実施例３および４に略述した方法に従って、菌株のプ
ロトプラストを産生し、EcoR I切断pPΔCBH IIで転換す
る。形質転換体からのDNAを、EcoR IおよびAsp718で切
断し、アガロースゲル電気泳動を行なう。ゲルからのDN
Aを膜フィルタにブロットし、実施例11の方法に従って
³²P標識pPΔCBH IIで雑種形成する。正確にcbh2座で組
み込まれたpPΔCBH IIからのEcoR I断片の単一のコピー
を有する形質転換体を同定する。その形質転換体はま
た、実施例７におけるような振動フラスコ中で成長せし
められ、培養上澄み中のタンパク質は等電点電気泳動に
より試験される。このようにして、CBH IIタンパク質を
産生しないT.reesei GC69形質転換体が産生される。

実施例10 P37PΔCBH Iのpyr4誘導体の産生 cbh1遺伝子に関して欠失された形質転換体の芽胞（P3
7PΔCBH I）を、FOA含有媒質上に展開した。続いて、実
施例１の方法を用いてこの形質転換体のpyr4誘導体を得
た。このpyr4菌株をP37PΔCBH I pyr26と称した。

実施例11 cbh1に関して事前に欠失した菌株中のcbh2遺伝子の欠失 菌株P37PΔCBH I Pyr26を産生し、実施例３および４
において概略を示した方法に従ってEcoT I切断pPΔCBH
IIで転換した。

精製した安定形質転換体を実施例７のように振動フラ
スコ中で培養し、その培養上澄み中のタンパク質を等電
点電気泳動により試験した。どのようなCBH IIタンパク
質も産生しなかった１つの形質転換体P37PΔΔCBH67と
称する）を同定した。図５のレーンＤは、本発明の方法
に従って産生したcbh1およびcbh2遺伝子の両方を欠失し
た形質転換体からの上澄みを示す。

DNAを、EcoR IとAsp718で切断した菌株P37PΔΔCBH67
から抽出し、アガロースゲル電気泳動を行なった。この
ゲルからのDNAを膜フィルターにブロットし、³²P標識pP
ΔCBH IIで雑種形成した（図７）。図７のレーンＡは、
未転換T.reesei菌株からのDNAに関して観察された雑種
形成パターンを示す。野生型cbh2遺伝子を含有する4.1k
b EcoR I断片が観察された。レーンＢは、菌株P37PΔ
ΔCBH67に関して観察された雑種形成パターンを示す。
１つの4.1kb帯が除去され、約0.9および3.1kbの２つの
帯により置換された。これは、pPΔCBH IIからのEcoR I
断片の１つのコピーが正確にcbh2座で組み込まれた場合
に予期されるパターンである。

同一のDNA試料をまたEcoR Iで切断し、サザン分析を
上述したように行なった。この実施例において、プロー
ブは³²P標識pIntCBH IIであった。このプラスミドは、
プラスミドpPΔCBH II中で欠失されたcbh2遺伝子のその
断片内からのcbh2遺伝子暗号配列の一部を含む。どの雑
種形成も菌株P37PΔΔCBH67からのDNAに関して見られ
ず、このことはcbh2遺伝子が欠失されたこと、およびpU
Cプラスミドから誘導されたどの配列もこの菌株中に存
在しなかったことを示す。

実施例12 pEG I pyr4の構成 EG IをコードするT.reesei eql1遺伝子は、公表され
た配列に従って合成されたオリゴヌクレオチドでの雑種
形成による菌株RL−P37からのゲノムDNAの4.2kb Hind
III断片としてクローンされた（ペンチラら、1986、遺
伝子45:253−263;バンアースデルら、1987、バイオ／テ
クノロジー5:60−64）。3.6kb Hind III−BamH I断片
をこのクローンから取り出して、Hind IIIで切断したpU
C218（pUC219と同一であるが、反対の配向において多重
クローニング部位を有する、実施例25参照）およびpTpy
r2から得たT.reesei pyr4遺伝子（実施例２参照）を含
有する1.6kb Hind III−BamH I断片と連結し、プラス
ミドpEG I pyr4を得た（図８）。pEG I pyr4のHind III
での切断は、T.reeseiゲノムDNA（egl1およびpyr4遺伝
子）のみを含有し、２つの遺伝子の間の24bp配列合成DN
Aおよび一方の末端での6bp配列合成DNAを除くDNAの断片
を離生する（図８）。

実施例13 サイトラーゼ123セルラーゼのセルラーゼ成分への精製 サイトラーゼ123セルラーゼを以下のように分画し
た。このセルラーゼ系のセルラーゼ成分の通常の分配は
以下のとおりである： CBH I 45−55重量パーセント CBH II 13−15重量パーセント EG I 11−13重量パーセント EG II ８−10重量パーセント EG III １−4 重量パーセント BG 0.5−１重量パーセント その分画は以下の樹脂を含有するカラムを用いて行な
った：シグマケミカル社（MO、セントルイス）からのセ
ファデックスＧ−25ゲル濾過樹脂、IBFバイオテクニク
ス（MD、サバジ）からのSPトリサクリルＭ陽イオン交換
樹脂およびQAトリサクリルＭ陰イオン交換樹脂。pH6.8
の10mMリン酸ナトリウム緩衝液とセファデックスＧ−25
ゲル濾過樹脂で満たした３リットルのカラムを用いてサ
イトラーゼ123セルラーゼ、0.5gを脱塩した。次いで脱
塩溶液をQAトリサクリルＭ陰イオン交換樹脂の20mlのカ
ラムに装填した。このカラムに結合した分画はCBH Iお
よびEG Iを含有した。これらの成分を、０から約500mM
の塩化ナトリウムを含有する水性勾配を用いて勾配溶出
により分離した。このカラムに結合しなかった分画はCB
H IIおよびEG IIを含有した。これらの分画を、pH3.3の
10mMのクエン酸ナトリウムで均衡化したセファデックス
Ｇ−258ゲル濾過樹脂のカラムを用いて脱塩した。次い
でこの溶液、200mlを、SPトリサクリルＭ陽イオン交換
樹脂の20mlのカラムに装填した。CBH IIおよびEG II
を、０から約200mMの塩化ナトリウムを含有する水性勾
配を用いて別々に溶出した。

上述した実施例13の方法と類似した方法に従って、そ
れらの成分中に分離できる他のセルラーゼ系は、セルキ
ャスト（デンマーク、コペンハーゲン、ノボインダスト
リーから得られる）、ラピダーゼ（オランダ、デルフ
ト、N.V.、ギストブロケイドから得られる）、およびTr
ichoderma koningii、Penicillum sp.等から誘導した
セルラーゼ系を含む。

実施例14 サイトラーゼ123セルラーゼからのEG IIIの精製 上述した実施例13は、サイトラーゼ123セルラーゼか
らのいくつかの成分の単離を示した。しかしながら、EG
IIIはサイトラーゼ123セルラーゼ中に非常に少量した
存在しないので、この成分を単離するのに以下の方法が
用いられた。

A.EG IIIセルラーゼ酵素の大規模な抽出 100リットルの細胞不含有セルラーゼ濾液を約30℃ま
で加熱した。加熱した物質は、約４％重量／容積PEG800
0（約8000の分子量、ポリエチレングリコール）および
約10％重量／容積の無水硫酸ナトリウムから調製され
た。その混合物は２相液体混合物を形成した。この相
を、SA−１ディスクスタック遠心分離機を用いて分離し
た。その相を、銀染色等電点電気泳動ゲルを用いて分析
した。分離によりEG IIIおよびキシラナーゼを得た。取
り出した組成物は、約20から50重量パーセントのEG III
を含有した。

上述した方法に関して、約8000未満の分子量を有する
ポリエチレングリコールの使用は分離に不適切であり、
一方約8000より大きい分子量を有するポリエチレングリ
コールの使用は取り出した組成物中の所望の酵素を排除
することとなる。硫酸ナトリウムの量に関して、10％重
量／容積より大きな硫酸ナトリウムの水準は沈殿問題を
引き起こし、一方10％重量／容積未満の硫酸ナトリウム
の水準では不十分な分離または１つの相中に残留する溶
液となった。

B.分画によるEG IIIの精製 EG IIIの精製は、野生型Trichiderma reeseiにより
産生される完全な菌類セルラーゼ組成物（CA、南サンフ
ランシスコ、ジネンカーインターナショナルから市販さ
れている、サイトラーゼ123セルラーゼ）からの分画に
より行なわれる。つまり、分画は、以下の樹脂：シグマ
ケミカル社（Mo、セントルイス）から得られるセファデ
ックスＧ−25ゲル濾過樹脂、IBFバイオテクニクス（M
D、サバジ）からのSPトリサクリルＭ陽イオン交換樹脂
およびQAトリサクリルＭ陰イオン交換樹脂を含有するカ
ラムを用いて行なわれる。pH6.8の10mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液とセファデックスＧ−25ゲル濾過樹脂で満たし
た３リットルのカラムを用いてサイトラーゼ123セルラ
ーゼ、0.5gを脱塩した。次いで脱塩溶液をQAトリサクリ
ルＭ陰イオン交換樹脂の20mlのカラムに装填した。この
カラムに結合した分画はCBH IおよびEG Iを含有した。
このカラムに結合しない分画は、CBH II、EG IIおよびE
G IIIを含む。これらの分画を、pH4.5の10mMのクエン酸
ナトリウムで均衡化したセファデックスＧ−25ゲル濾過
樹脂のカラムを用いて脱塩した。次いでこの溶液、200m
lを、SPトリサクリルＭ陽イオン交換樹脂の20mlのカラ
ムに装填した。EG IIIを、200mMの塩化ナトリウム100ml
で溶出した。

EG IIIの単離能率を高めるために、１つ以上のEG I、
EG II、CBH Iおよび／またはCBH IIを産生できないよう
に遺伝学的に修飾されたTrichoderma reeseiを使用す
ることが望ましい。１つ以上のそのような成分の不在
は、EG IIIのより能率的な単離を必ず導く。

同様に、上述したEG III組成物をさらに精製して、実
質的に純粋なEG III組成物、すなわち、タンパク質の約
80重量パーセントより多いEG IIIを含有する組成物を提
供することが望ましい。例えば、そのような実質的に純
粋なEG IIIタンパク質は、方法Ｂの方法Ａから得られた
物質を用いることにより得られる。さらにEG IIIを精製
する１つの特定の方法は、この実施例14のパートｂ）で
得られたEG III試料のさらなる分画によるものである。
さらなる分画は、モノ−Ｓ−HR 5/5カラム（NJ、ピス
カタウェイ、ファーマシアLKBバイオテクノロジーから
得られる）を用いたFPLCシステムにより行なわれる。FP
LCシステムは、液体クロマトグラフィーコントローラ、
２つのポンプ、二重通路モニター、分画集積装置および
チャートレコーダー（全てNJ、ピスカタウェイ、ファー
マシアLKBバイオテクノロジーから得られる）からな
る。分画は、実施例14のパートｂ）で調製したEG III試
料、5mlを、以前にpH4の10mMクエン酸ナトリウムで均衡
化した20mlセファデックスＧ−25カラムで脱塩すること
により行なわれた。次いでカラムを、1mlの分画に集積
した試料Ｉ関して、0.5ml/分の速度でのNaClの０−200m
M水性勾配により溶出させた。EG IIIは、分画10および1
1において取り出され、SDSゲル電気泳動により90％より
純粋であると測定された。この純粋なEG IIIは、既知の
技術によるＮ末端アミノ酸配列の測定に適している。

上述した実施例13において精製した実質的に純粋なEG
III並びにEG IおよびEG II成分は、本発明の方法に単
一または混合物で用いられる。これらのEG成分は以下の
特性を有する： MW pI 最適pH¹ EG I 〜47−49kD 4.7 〜５ EG II 〜35 kD 5.5 〜５ EG III 〜25−28kD 7.4 〜5.5−6.0 1.以下の実施例15によるRBB−CMC活性により測定された
最適pH。

本発明の実施にこれらの混合物を使用すると、単一の
成分と比較して、柔らかさ、感触、外観等を改善する相
乗応答が得られる。一方で、本発明の実施に単一の成分
を使用すると、より安定であるか、またはpH範囲に亘り
広い活性のスペクトルを有することとなる。例えば、以
下の実施例15は、EG IIIがアルカリ性条件下のRBB−CMC
に対して著しい活性を有することを示す。

実施例15 pH範囲に亘るセルラーゼ組成物の活性 ２つの異なるセルラーゼ組成物のpHプロフィールを測
定するために以下の方法を用いた。第１のセルラーゼ組
成物は、CBH IおよびCBH II成分を産生することができ
ないように上述した方法と類似の方法で遺伝学的に修飾
したTrichoderma reeseiから調製したCBH IおよびII欠
失セルラーゼ組成物であった。このセルラーゼ組成物
が、一般的にTrichoderma reeseiから誘導されたセル
ラーゼ組成物、約58から70パーセントからなるCBH Iお
よびCBH IIを含有しない限り、このセルラーゼ組成物
は、必ず実質的にCBH I型およびCBH II型セルラーゼ成
分を含まず、したがってEG成分、すなわち、EG I、EG I
I、EG III等が豊富である。

第２のセルラーゼ組成物は、実施例14のパートｂ）と
類似の精製方法によりTrichoderma reeseiから誘導さ
れたセルラーゼ組成物から単離したEG IIIの純粋な分
画、約20から40％であった。

これらのセルラーゼ組成物の活性を、40℃で測定し、
その測定は以下の方法を用いて行なわれた。

最終溶液中に必要な量の酵素を提供するのに十分な濃
度で、適切な酵素溶液、５から20μｌを加える。pH4、
５、5.5、６、6.5、７、7.5および８の、0.05Mクエン酸
塩／リン酸塩緩衝液中で２重量パーセントのRBB−CMC
（オーストラリア、N.S.W.2151、ノースロック、６アル
トナプレイス、メガザイムから市販されているレマゾル
ブリリアントブルーＲ−カルボキシメメチルセルロー
ス）、250μｌを加える。

撹拌し、40℃で30分培養する。氷浴中で５から10分
間、冷却する。0.3Mの酢酸ナトリウムおよび0.02Mの酢
酸亜鉛を含有するメチルセロソルブ、1000μｌを加え
る。撹拌し、５−10分間、放置する。遠心分離し、上澄
みをキュベット中に注ぐ。各キュベット中の溶液の590n
mでの光学濃度（OD）を測定する。より高い水準の光学
濃度が、より高い水準の酵素活性に対応する。

この分析の結果を図９に述べるが、これは、EG IIIセ
ルラーゼ組成物と比較したCBH IおよびII欠失セルラー
ゼ組成物の相対活性を説明している。この図から、CBH
IおよびCBH IIの欠失したセルラーゼ組成物は、pH5.5あ
たりでRBB−CMCに対する最適なセルロースを加水分解す
る活性を有し、アルカリ性pH、すなわち、７より上で８
のpHである程度の活性を有する。一方で、EG IIIの豊富
なセルラーゼ組成物は、pH5.5−６で最適なセルロース
を加水分解する活性を有し、アルカリ性pHで相当な活性
を有する。

上述実施例から、当業者は、セルラーゼ組成物が活性
で、好ましくは最適な活性を有するように、水性布組成
物のpHを調整し、保持することのみが必要である。上述
したように、そのような調整および保持は、適切な緩衝
液の使用を含む。

実施例16 セルラーゼ組成物のランダロメーター強度損失検定 この実施例は、セルラーゼ組成物の、綿含有織物の強
さを減少せしめる能力を試験するものである。Trichode
rma reeseiから誘導されたほとんどのセルラーゼ組成
物の活性はpH5またはそのあたりで最大であり、したが
って、強度損失はその検定がこのpHあたりで行なわれる
ときに最も明確となるので、この実施例は、pH5で保持
された水性セルラーゼ溶液を用いる。

つまり、この実施例において、分析した第１のセルラ
ーゼ組成物は、野生型のTrichoderma reeseiから産生
された完全菌類セルラーゼ系（CA、南サンフランシス
コ、ジネンカーインターナショナルから市販されている
サイトラーゼ123セルラーゼ）であり、GC010と同定され
る。

分析した第２のセルラーゼ組成物は、CBH IIを表現で
きないように、上述した１から12および以下の22から30
の実施例と類似した方法で遺伝学的に修飾したTrichode
rma reeseiから調製したCBH II欠失セルラーゼ組成物
であり、CBH II dと同定される。CBH IIがセルラーゼ組
成物の約15パーセントまでからなる限りは、この成分の
欠失は、CBH I、および全てのEG成分の豊富な水準とな
る。

分析した第３のセルラーゼ組成物は、CBH IおよびCBH
IIを表現できないように、上述した方法と類似した方
法で遺伝学的に修飾したTrichoderma reeseiから調製
したCBH IおよびCBH II欠失セルラーゼ組成物であり、C
BH I/II dと同定される。CBH IおよびCBH IIがこの改良
微生物により産生されない限り、そのセルラーゼは必
ず、全てのCBH I型成分、並びにCBH成分を含まない。

分析した最後のセルラーゼ組成物は、CBH Iを表現で
きないように、上述した方法と類似した方法で遺伝学的
に修飾したTrichoderma reeseiから調製したCBH I欠失
セルラーゼ組成物であり、CBH I dと同定される。この
改良微生物がCBH Iを産生しない限り、このそのセルラ
ーゼ組成物は必ず、全てのCBH I型成分を含まない。

ランダロメーター中で綿含有織物の強度損失の効果に
ついて、上述したセルラーゼ組成物を試験した。その組
成物を、等量のEG成分が用いられるように、最初に標準
化した。各セルラーゼ組成物を加えて、pH5に滴定し、
0.5mlの非イオン界面活性剤を含有する20mMクエン酸塩
／リン酸塩緩衝液、400mlの溶液を分離した。精製した
各溶液を分離ランダロメーターキャニスターに加えた。
これらのキャニスター中に、強度損失を促進させるある
量の大理石、並びに16インチ×20インチの綿織物（NJ08
846、ミドルセックス、ブラックフォード通り200、テス
トファブリック社からのスタイル467番として得られ
る）を加えた。次いでそのキャニスターを閉じて、43℃
に保持されたランダロメーター中に降ろした。次いでそ
のキャニスターを約１時間に亘り、１分間に少なくとも
40回転（rpm）の速度で浴中で回転せしめた。その後、
衣類を取り出してよく濯ぎ、標準乾燥機中で乾燥せしめ
た。

強度損失結果を最大限度にするために、上述した方法
をさらに２回繰り返し、３回目の処理後、綿織物を取り
出し、強度損失の分析を行なった。強度損失は、インス
トロンテスターを用いた横方向の引張り強度（「FT
S」）を測定することにより求め、その結果を、セルラ
ーゼを加えなかったことを除いては同一の溶液で処理し
た織物のFTSと比較した。この分析の結果を、以下の式
により求めた強度損失パーセントとして報告する： この分析の結果を図10に示すが、これは、CBH I、す
なわち全セルラーゼ（GC010）およびCBH II欠失セルラ
ーゼを含有する組成物が最大の強度損失を有し、一方、
CBH Iを含有しない組成物が、全セルラーゼおよびCBH I
I欠失セルラーゼと比較して著しく減少した強度損失を
有することを示す。これらの結果から、セルラーゼ組成
物中のCBH I型成分の存在は、CBH I型成分を含有しない
類似の組成物と比較して、その組成物に増大した強度損
失を与えることが分かった。

同様に、これらの結果は、CBH IIが強度損失において
ある役割を果たすことを示す。

したがって、これらの結果から見て、強度損失抵抗セ
ルラーゼ組成物は、全てのCBH I型セルラーゼ成分およ
び、好ましくは全てのCBH型セルラーゼ成分を含まない
組成物である。この点に関して、そのようなセルラーゼ
組成物は、図10に示すpH5で観察されたそれらの結果よ
りもpH≧７でのより低い強度損失となると考えられる。

綿含有織物の製造中に、その織物は応力が加えられる
ことがあり、そのように応力が加えられた場合、その織
物は破壊され乱れた繊維を含有する。そのような繊維
は、織物にすり切れてさえない外観を与える。しかしな
がら、本発明の方法は織物／色の高まりとなることが分
かった。これは、応力が加えられる前に織物の外観を復
元する効果を有する、破壊され乱れた繊維の除去により
行なわれると思われている。

以下の実施例17および18は、本発明のこの利点を説明
する。これらの実施例には、すり切れた綿のＴシャツ
（ニット）並びに新しい綿ニットを用いたことを述べて
おく。すり切れた綿含有織物の色褪せた外観は、これま
での期間の破壊された繊維および目の粗い表面の繊維が
織物上に蓄積したことにより生じる。これらの繊維は織
物に色褪せて縺れた外観を与え、したがって、これらの
繊維の除去は、その織物に元来の鮮明な色彩を復元する
のに必要な必要条件である。加えて、破壊された表面繊
維の新しい綿ニット上の蓄積は、そのような織物にさえ
ない外観を与える。したがって、これらの実験は、その
両者が織物から表面繊維の除去を含むので、応力の加え
られた綿含有織物の色彩を高めることに必然的に適用で
きる。

実施例17 色彩を高めること 綿含有織物中で色彩を高めるEG成分の能力を以下の実
験において分析した。つまり、最初の実験は、様々なpH
に亘る綿含有織物から表面繊維を除去する、野生型Tric
hoderma reeseiにより産生された完全セルラーゼ系（C
A、南サンフランシスコ、ジネンカーインターナショナ
ルから市販されている、サイトラーゼ123）の能力を測
定する。ランダロメーター中で表面繊維を除去する能力
に関して、このセルラーゼを試験した。最終組成物中で
25ppmまたは100ppmいずれかのセルラーゼを提供する適
切な量のセルラーゼを、0.5mgの非イオン界面活性剤を
含有する20mMのクエン酸塩／リン酸塩緩衝液400mlの分
離溶液に加えた。pH5、pH6、pH7およびpH7.5の試料を提
供するために、試料を調製し滴定した。次いで作成した
各溶液を、分離ランダロメーターキャニスターに加え
た。これらのキャニスター中に、繊維の除去を促進させ
るある量の大理石、並びに７インチ×５インチの綿織物
（NJ08846、ミドルセックス、ブラックフォード通り20
0、テストファブリック社からのスタイル439W番として
得られる、100％織綿）を加えた。次いでそのキャニス
ターを閉じて、43℃に保持されたランダロメーター中に
降ろした。次いでキャニスターを、１分当たり少なくと
も約40回転（rpm）の速度で１時間、浴中で回転せしめ
た。その後に衣類を取り出して、よく濯ぎ、標準乾燥機
中で乾燥せしめる。

次いでそのように処理した織物を、パネル試験の評価
により繊維除去について分析した。特に、織物（マーク
せず）を６つの個々により繊維の水準に関して評価し
た。織物を、表面繊維に関して視覚的に評価し、０から
６のスケールで評価した。このスケールは意義のある比
較を行なうために６つの標準を有する。その標準は： 評価 標準^ａ ０ セルラーゼで処理してない織物 １ 8ppmのセルラーゼで処理た^ｂ織物 ２ 16ppmのセルラーゼで処理した織物 ３ 20ppmのセルラーゼで処理した織物 ４ 40ppmのセルラーゼで処理した織物 ５ 50ppmのセルラーゼで処理した織物 ６ 100ppmのセルラーゼで処理した織物 ａ） 全ての標準におて、織物は、NJ08846、ミドルセ
ックス、ブラックフォード通り200、テストファブリッ
ク社から得た100％綿シート標準化試験織物（スタイル4
39W番）であった。

ｂ） 全ての試料は同一のセルラーゼ組成物で処理し
た。セルラーゼ濃縮物は合計のタンパク質であった。ラ
ンダロメーター処理条件は、上述した実施例16中に示
す。

評価する織物に、その標準の最も厳密に適合した評価
を与えた。織物の完全な分析の後に、個々の全てにより
各織物に与えられた値を加え、平均値を出した。

この分析の結果を図11に示す。つまり、図11は、同一
のpHにおいて、用量依存応答が除去された繊維の量とし
て見られることを示す。すなわち、同一のpHにおいて、
より多いセルラーゼで処理した繊維は、より少ないセル
ラーゼで処理した繊維と比較して繊維除去のより高い水
準を提供した。さらに、この形の結果は、より高いpHに
おいて、繊維の除去はまだ、単により高濃度のセルラー
ゼを用いることにより影響を受けることを示す。

第２の実験において、２つの異なるセルラーゼ組成物
を、繊維を除去する能力について比較した。つまり、分
析した第１のセルラーゼは、野生型Trichoderma reese
iにより産生された完全セルラーゼ系（CA、南サンフラ
ンシスコ、ジネンカーインターナショナルから市販され
ている。サイトラーゼ123）であり、GC010と称される。

分析した第２のセルラーゼ組成物は、その組成をCBH
IおよびCBH IIを表現できないように上述した方法と類
似の方法で遺伝学的に修飾したTrichoderma reeseiに
より調製された全てのCBH型成分（CBH I型成分を含む）
を実質的に含まないセルラーゼ組成物であり、CBH I/II
欠失として同定される。CBH IおよびCBH IIがセルラー
ゼ組成物の約70パーセントまでを構成する限りは、この
成分の欠失は、全てのEG成分の豊富な水準となる。

これらの組成物を、ランダロメーター中の表面繊維を
除去する能力について試験した。最終組成物中にEG成分
の必要な濃度を提供するのに適切な量のセルラーゼを、
0.5mgの非イオン界面活性剤を含有する20mMのクエン酸
塩／リン酸塩緩衝液400mlの分離溶液に加えた。試料を
調製し、pH5に滴定した。次いで作成した各溶液をラン
ダロメーターキャニスター中に加えた。これらのキャニ
スター中に、繊維の除去を促進させるある量の大理石、
並びに７インチ×５インチの綿織物（NJ08846、ミドル
セックス、ブラックフォード通り200、テストファブリ
ック社からのスタイル439W番として得られる、100％織
綿）を加えた。次いでそのキャニスターを閉じて、43℃
に保持されたランダロメーター中に降ろした。次いでキ
ャニスターを、１分当たり少なくとも約40回転（rpm）
の速度で１時間、浴中で回転せしめた。その後に衣類を
取り出して、よく濯ぎ、標準乾燥機中で乾燥せしめる。

次いでそのように処理した織物を上述したパネル試験
の評価により繊維除去の分析を行なった。この分析の結
果を、推測のEG濃度に基づいてプロットした図12に示
す。つまり、図12は、GC010およびCBH I/II欠失セルラ
ーゼ組成物が、実質的に等しいEG濃度で、実質的に同一
の繊維除去結果を与えた。この形の結果は、繊維除去を
提供するのはEG成分であることを示唆している。図11の
結果と関連したこれらの結果は、EG成分が表面繊維を除
去することを示す。

実施例18 テルゴトメーター（Tergotometer）色彩の向上 この実施例はさらに実施例17に関するものであり、CB
H型成分が色彩の向上に必要のないことを実証するもの
であり、本実施例の目的は、CBH型成分の欠失したセル
ラーゼ組成物の綿含有織物に対して色彩を高める能力を
調査することにある。

つまり、本実施例に用いたセルラーゼ組成物が、CBH
IおよびCBH IIを表現することのできないように上述し
た方法と類似の方法で遺伝学的に修飾したTrichoderma
reeseiから調製した限りは、この組成物は、実質的に
全てのCBH型成分（CBH I型成分を含有する）を含まな
い。CBH IおよびCBH IIがセルラーゼ組成物の約70パー
セントまでを構成する限りは、この成分の欠失は、全て
のEG成分の豊富な水準となる。

検定は、十分な濃度のこのセルラーゼ組成物を50mMの
クエン酸塩／リン酸塩緩衝液に加え、500ppmのセルラー
ゼを提供することにより行なった。その溶液をpH5に滴
定し、0.1重量パーセントの非イオン界面活性剤（NC273
60、トーマスビル、グレスコNfg.、から市販されてい
る、グレスコタークGL100）を含有した。10インチ×10
インチの色褪せた綿含有織物、並びに緩んで破壊された
表面繊維を有する10インチ×10インチの新しいニット織
物を、この緩衝液の１リットルの中に配し、110F゜で30
分間放置し、次いで30分間、１分当たり少なくとも100
回転で撹拌した。次いで織物を緩衝液から取り出し、洗
浄し、乾燥せしめた。生じた織物を次いで、処理前の織
物と比較した。この分析の結果を以下に示す： テルゴトメーターを用いた結果として生成した破壊さ
れた表面繊維を含有する破壊された表面繊維の除去を含
む、「利益が見られた」という言葉は、処理織物が、非
処理織物と比較して色彩の復元（すなわち、色褪せて見
えない）を示す。これらの結果は、CBH型成分の存在が
色褪せた綿含有織物の色彩復元をもたらすのに必要ない
という実施例17の結果を実証する。

そのようなセルラーゼ組成物は、織物への有害な強度
損失なくして、加工中に生成される破壊された／緩んだ
繊維を除去するので、その組成物の使用は繊維加工中に
利益をもたらすと考えられる。

実施例19 柔軟さ 本実施例は、CBH型成分の存在が綿含有織物に改善さ
れた柔軟さを与えるのに必要ないことを示す。つまり、
この実施例は、その組成物が、CBH IおよびCBH II成分
を産生することができないように上述した方法により遺
伝学的に製造したTrichoderma reeseiから誘導したも
のである、全てのCBH型成分を含まないセルラーゼ組成
物を用いる。

このセルラーゼ組成物を、テリー織りの洗浄布を柔ら
かくする能力に関して試験した。つまり、14インチ×15
インチの、柔軟化されていない8.5オンスの綿テリー織
り布（NJ08846、ミドルセックス、ブラックフォード通
り200、テストファブリック社からのスタイル420NS番と
して得られる）を、７インチ×7.5インチの切れ端に切
断した。

上述したセルラーゼ組成物を、ランダロメーター中で
これらの切れ端を柔らかくする能力について試験した。
つまり、最終セルラーゼ組成物中に500ppm、250ppm、10
0ppm、50ppm、および10ppmのセルラーゼを提供するよう
に、適切な量のセルラーゼを、0.025重量パーセントの
非イオン界面活性剤（トリトンX114）を含有する20mMク
エン酸塩／リン酸塩緩衝液400mlの分離溶液に加えた。
加えて、同一の溶液を含有するが、セルラーゼの加えら
れていないブランクを作成した。そのように調製した試
料を、pH5に滴定した。次いで作成した各溶液を分離ラ
ンダロメーターキャニスターに加えた。これらのキャニ
スター中に、柔軟さを促進させる量の大理石、並びに上
述した綿の切れ端を加えた。全ての条件は、キャニスタ
ーごとに２つの切れ端で３重に行なった。次いでそのキ
ャニスターを閉じて、37℃に保持されたランダロメータ
ー中に降ろした。次いでキャニスターを、１分当たり少
なくとも約40回転（rpm）の速度で１時間、浴中で回転
せしめた。その後に衣類を取り出して、よく濯ぎ、標準
乾燥機中で乾燥せしめた。

次いでその切れ端を、選択試験における評価により柔
軟さについて試験した。つまり、６人のパネリストに、
各自の一連の切れ端を与え、全体の織物の柔軟性のよう
な柔軟の判定基準に基づいた柔軟さに関してその切れ端
を評価するように指示した。５つの異なる酵素濃度での
処理により得られた切れ端とブランクをスクリーンの背
後に配し、パネリストは最も柔らかくないものから最も
柔らかいものまで順番に並べるように指示した。他の切
れ端に対するその順番に基づいて各切れ端にスコアを付
けた;5が最も柔らかく、０が最も柔らかくない。各パネ
リストからのスコアを累積して、平均した。

この平均の結果を図13に示す。つまり、これらの結果
は、濃度が高ければ高いほど、改善された柔軟さが得ら
れることを示す。この改善された柔軟化は、セルラーゼ
組成物中にCBH IまたはIIのいずれかの存在なくして達
成されることが分かる。

実施例20 感触および外観 本実施例は、CBH型成分の存在が、綿含有織物に改善
された感触と外観を与えるのに必須ではないことを説明
する。つまり、この実施例は、いかなるCBH型成分も産
生することができない（すなわち、CBH IおよびII成分
を産生することができない）ように上述したような方法
で遺伝学的に作られたTrichoderma reeseiから誘導さ
れたセルラーゼ組成物を用いる。

このセルラーゼ組成物を、その綿含有織物の外観を改
善する能力について試験した。つまり、この実施例の外
観面において、適当なおおきさの100％綿シート（NJ088
46、ミドルセックス、ブラックフォード通り200、テス
トファブリック社からのスタイル439W番として得られ
る）を用いた。

上述したセルラーゼ組成物を、ランダロメーター中の
これらの試料の外観を改善する能力について試験した。
つまり、最終セルラーゼ溶液中で25ppm、50ppm、および
100ppmのセルラーゼを提供する適量のCBH IおよびII欠
失セルラーゼを、0.025重量パーセントの非イオン性界
面活性剤（トリトンX114）を含有する20mMクエン酸／リ
ン酸緩衝液400mlの分離溶液に加えた。加えて、同一の
溶液を含むがどのセルラーゼも含まないブランクも作成
した。そのように調製した試料をpH5に滴定した。次い
で作成した各溶液を、分離ランダロメーターキャニスタ
ー中に加えた。次いでそのキャニスターを閉じて、37℃
に保持されたランダロメーター中に降ろした。次いでキ
ャニスターを、１分当たり少なくとも約40回転（rpm）
の速度で１時間、浴中で回転せしめた。その後に衣類を
取り出して、よく濯ぎ、標準乾燥機中で乾燥せしめた。

次いで試料を、選択試験の評価による改善された外観
について分析した。つまり、６人のパネリストに４つの
試料（識別を示さない）を与え、外観に関して評価する
よう求めた。パネリストには、「外観」という用語は、
目に対する綿含有織物の物理的外観を指し、織物の表面
上の、けば、表面繊維等の存在または不在による、並び
に織物の構成（織り）を見分ける能力または無能により
部分的に決定されることを指示した。ほとんどけばおよ
び表面繊維を有さず、その構造（織り）が明確に見分け
られる織物は、けばおよび／または緩い繊維および／ま
たは識別できない織りを有する織物と比較して改善され
た外観を有する。

次いでパネリストは、他の試料と比較しながら、その
順番に基づいて各試料にスコアをつけた:4は最良の外観
であり、１は最低の外観である。各パネリストからのス
コアを集計して平均化した。この試験の結果を以下に示
す： セルラーゼの量 平均外観 無し １ 25ppm ２ 50ppm ３ 100ppm ４ 次いでCBH IおよびII欠失セルラーゼ組成物を、綿含
有織物の感触を改善する能力について試験した。つま
り、この実施例の外観面において、適当な大きさの100
％綿シート（NJ08846、ミドルセックス、ブラックフォ
ード通り200、テストファブリック社からのスタイル439
W番として得られる）を用いた。

上述したセルラーゼ組成物を、ランダロメーター中の
これらの試料の外観を改善する能力について試験した。
つまり、最終セルラーゼ溶液中で500ppm、1000ppm、お
よび2000ppmのセルラーゼを提供する適量のセルラーゼ
を、20mMクエン酸／リン酸緩衝液24Lの分離溶液に加え
た。加えて、同一の溶液を含むがどのセルラーゼも含ま
ないブランクも作成した。全ての試験を、pH5.8で行な
い、工業用洗濯機中で行なった。その洗濯機は50℃、全
容積24L、50:1（重量対重量）の布に対する液体の比率
において操作され、その洗濯機を30分間操作させた。そ
の後、試料を除去し、工業乾燥機中で乾燥せしめた。

次いで試料を、選択試験の評価による改善された感触
について分析した。つまり、５人のパネリストに４つの
試料（識別を示さない）を与え、感触に関して評価する
よう求めた。パネリストに、改善された感触を有する織
物は他の織物より肌触りが滑らかで、絹のようであり、
その感触を、柔らかさ（その感触というよりも織物の柔
軟性を指す）、厚さ、色彩、または織物の滑らかさに含
まれない他の物理的な特性のように質とは区別すること
を支持した。

次いでパネリストは、他の試料と比較しながら、その
順番に基づいて各試料にスコアをつけた:4は最良の感触
であり、１は最低の感触である。各パネリストからのス
コアを集計して平均化した。この試験の結果を以下に示
す： セルラーゼの量 平均外観 無し 1.5±0.5 500ppm 1.7±0.4 1000ppm 3.2±0.4 2000ppm 3.8±0.4 上述した結果は、感触および外観における改善が全て
のCBH型成分を含まないセルラーゼ組成物により達成で
きることを示す。

実施例21 ストーンウォッシュの外観 この実施例は、CBH型成分の存在が綿含有織物にスト
ーンウォッシュの外観を与えるのに必須ではないことを
示すものである。つまり、この実施例は、いかなるCBH
型成分も産生することができない（すなわち、CBH Iお
よびII成分を産生することができない）ように上述した
ような方法で遺伝学的に作られたTrichoderma reesei
から誘導されたセルラーゼ組成物、並びにTrichoderma
reeseiから誘導され、カリフォルニア、南サンフラン
シスコ、ジネンカーインターナショナルからのサイトラ
ーゼ123として得られる完全セルラーゼ組成物を用い
る。

これらのセルラーゼ組成物を、染色綿含有デニムパン
ツにストーンウォッシュの外観を与える能力については
試験した。つまり、以下の条件下で工業洗濯機および乾
燥機を用いて試料を調製した： pH5の10mMクエン酸／リン酸緩衝液 合計容積40L 110F゜ ４組のデニムパンツ １時間の操作 50ppmのCBH IおよびII欠失セルラーゼまたは100ppmの
完全セルラーゼ（すなわち、ほぼEG濃度と等しい） ８人のパネリストにより、試料をそのストーンウォッ
シュの外観について評価した。８人全てのパネリスト
が、良好なストーンウォッシュの外観を有するものとし
て、非酵素処理パンツよりも100ppm全セルラーゼを選択
する。８人のパネリストのうち４人が、良好なストーン
ウォッシュの外観を有するものとして、全セルラーゼよ
りもCBH IおよびII欠失セルラーゼ処理パンツを選択
し、一方では他のパネリストは、良好なストーンウォッ
シュの外観を有するものとして、全セルラーゼ処理パン
ツを選択する。これらの結果は、CBH IおよびII欠失セ
ルラーゼ処理パンツは、全セルラーゼ処理パンツとは区
別できず、CBH Iおよび／またはCBH IIは、綿含有織物
にストーンウォッシュの外観を与えるのに必須ではない
ことを示す。

実施例16から21に関して、CBH I型成分を含まず、Tri
choderma reesei以外の微生物から誘導されたセルラー
ゼ組成物は、これらの実施例に記載されたセルラーゼ組
成物と置き換えて用いることができた。特に、EG型成分
を含有するセルラーゼ組成物の供給源は、本発明にとっ
て重要ではなく、１つ以上のEG型成分を含有し、実質的
に全てのCBH I型成分を含まないいかなる菌類セルラー
ゼ組成物がここに用いられる。例えば、本発明に用いら
れる菌類セルラーゼ組成物を調製するのに用いられる菌
類セルラーゼは、Trichoderma koningii、Pencillum
sp.等から得られ、または市販されているセルラーゼが
用いられる、すなわち、セルキャスト（デンマーク、コ
ペンハーゲン、ノボインダストリーから得られる）、ラ
ピダーゼ（オランダ、デルフト、ギストブロケードから
得られる）等である。

実施例22 プラスミドpEG I pyr4を含有するTrichoderma reesei
の転換 実施例１に概略を示した方法により、T.reesei菌株Ru
tC30のpyr4欠損誘導体（シールニースおよびモンテンコ
ート、（1984）、Appl.Microbiol.Biotechnol.20::46−
53）を得た。この菌株のプロトプラストを、未切断pEG
I pyr4で転換し、安定形質転換体を精製した。

これらの形質転換体の５つ（EP2、EP4、EP5、EP6、EP
11と称する）、奈良真備に未転換RutC30を、250mlの振
動フラスコ中の50mlのYEG媒質に接種し、２日間、28℃
で振動させながら培養した。生成した菌糸体を無菌水で
洗浄し、50mlのTSF媒質（0.05Mのクエン酸−リン酸緩衝
液、pH5.0;アビセルミクロ結晶性セルロース、10g/l;KH
₂PO₄、2.0g/l;（NH₄）₂SO₄、1.4g/l;プロテオースペプ
トン、1.0g/l;尿素、0.3g/l;MgSO₄・7H₂O、0.3g/l;CaCl
₂、0.3g/l;FeSO₄・7H₂O、5.0mg/l;MnSO₄・H₂O、1.6mg/
l;ZnSO₄、1.4mg/l;CoCl₂、2.0mg/l;0.1％ツイーン80）
に加えた。これらの培養物はさらに28℃で４日間、振動
させながら培養した。これらの培養物から上澄み試料を
採取し、タンパク質およびエンドグルカナーゼ活性の合
計量を測定するための検定を以下に記載するようにして
行なった。

エンドグルカナーゼ検定は、レマゾールブリリアント
ブルーカルボキシメチルセルロース（オーストラリア、
NSW、ノースロック、メガザイムから得られる、RBB−CM
C）からの溶性染色オリゴ糖類の解放により行なわれ
る。2gの乾燥RBB−CMCを80mlの激しく撹拌し沸騰したて
の脱イオン水に加えることにより媒質を調製した。室温
まで冷却したときに、5mlの2M酢酸ナトリウム緩衝液（p
H4.8）を加え、pHを4.5に調整した。脱イオン水によ
り、その容積を最終的に100mlに調節し、0.02％の最終
濃度までナトリウムアジ化物を加えた。T.reesei対照培
養物、pEG I pyr4形質転換体培養物上澄みまたはブラン
クとしての0.1M酢酸ナトリウム（10−20μｌ）のアリコ
ートを、管中に配し、250μｌの媒質を加え、その管を3
7℃で30分間培養した。その管を氷上に10分間配し、1ml
の冷たい沈殿剤（3.3％の酢酸ナトリウム、0.4％の酢酸
亜鉛、HClによるpH5、76％エタノール）を加えた。その
管に渦を生じさせ、約13,000×ｇでの３分間の遠心分離
の前に、５分間放置した。光学濃度を、590−600nmの波
長で分光測光的に測定した。

使用したタンパク質検定は、米国イリノイ州、ロック
フォード、ピアースから得られた試薬を用いたBCA（ビ
シンクロニック酸）検定であった。標準は、子牛血清ア
ルブミン（BSA）であった。BCA試薬は、１部の試薬Ｂと
50部の試薬Ａとの混合により調製した。1mlのBCA試薬を
50μｌの適切に希釈したBSAまたは試験培養上澄みと混
合した。培養は37℃で30分間行ない、光学密度は最終的
に562nmの波長で光学測光的に測定した。

上述した検定結果を表１に示す。産生した形質転換体
のいくつかは、未転換菌株RutC30と比較してエンドグル
カナーゼ活性の量を増加せしめたことが明確である。未
転換T.reeseiにより産生されたエキソ−セロビオヒドロ
ラーゼおよびエンドグルカナーゼは、分泌されたタンパ
ク質の合計量のそれぞれ70および20パーセントを構成す
ると思われる。それゆえ、菌株RutC30よりもほぼ４倍の
エンドグルカナーゼを産生するEP5のような形質転換体
は、ほぼ等量のエンドグルカナーゼ型およびエキソ−セ
ロビオヒドロラーゼ型タンパク質を分泌すると予期され
る。

本実施例に記載した形質転換体は、完全なpEG I pyr4
を用いて得られ、pUCプラスミドから誘導されたゲノム
中に組み込まれるDNA配列を含有する。転換の前に、Hin
d IIIでpEG I pyr4を切断し、T.reesei DNAのみを含有
するより大きなDNA断片を単離することが可能である。
T.reeseiの、DNAのこの単離断片による転換により、EG
Iを過剰産生し、図８に示す合成DNAの２つの短片を除い
た異種DNA配列をまったく含まない形質転換体の単離が
できる。また、pEG I pyr4を用いて、cbh1遺伝子、また
はcbh2遺伝子、または両方の遺伝子が欠失した菌株を転
換することも可能である。このようにして、EG Iを過剰
産生し、制限範囲のエキソ−セロビオヒドロラーゼを産
生し、またはエキソ−セロビオヒドロラーゼを全く産生
しない菌株が構成される。

実施例22の方法は、他のセルロース組成物、キシラナ
ーゼ成分またはT.reeseiにより通常産生される他のタン
パク質のいずれかを過剰に産生するT.reesei菌株を産生
するのに用いられる。

上述した結果は、合計タンパク質に対するEG I成分の
産生過剰を示す目的にために提示したものであって、産
生過剰の度合いを示す目的のためではない。この点に関
して、産生過剰は各実施例に関して変わるものと思われ
る。

実施例23 pCEPC1の構成 プラスミド、pCEPC1を構成した。ここでEG Iの暗号配
列は、cbh1遺伝子からのプロモーターに機能的に融合さ
れた。これは、それぞれの翻訳開始部位の５′（上流）
の都合のよい制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を生成す
るためにcbh1およびegl1遺伝子のDNA配列を変更する、
生体外の部位特異性突然誘発を用いて行なわれる。DNA
配列分析を行なって、２つのDNA断片の間の接合部での
予期した配列を確認した。行なわれた特異的な変更を図
14に示す。

pCEPC1を形成するように結合されたDNA断片は、pUC4K
のEcoR I部位の間に挿入され、これは以下のようであっ
た： Ａ） cbh1座の５′側腹領域からの2.1kb断片。これは
プロモーター領域を含み、製造したBcl I部位に延び、c
bh1暗号配列を含まない。

Ｂ） 製造したBamH I部位を有する５′末端で開始し、
翻訳停止コードンの向こうに約0.5kbを含むegl1座から
のゲノムDNAの1.9kb断片。その断片の３′末端にはpUC2
18多重クローニング部位から誘導された18bpがあり、15
bp合成オリゴヌクレオチドがこの断片を以下の断片と連
結させるのに用いられる。

Ｃ） cbh1翻訳停止コードンの約1kb下流の位置から約
2.5kb下流に延びる、cbh1座の３′側腹領域からのDNAの
断片。Ｄ）pTpyr2から得られたT.reesei pyr4遺伝子
（実施例２）を含有し、pUC18多重クローニング部位か
ら誘導された１末端でのDNAの24bpを有するDNAの3.1kb
NheO−Sph I断片を、断片（Ｃ）のNhe I部位中に挿入
した。

プラスミド、pCEPC1を、EG I暗号配列がcbh1座で組み
込まれ、いかなる異種DNAをも宿主菌株中に導入せずにC
BH Iの暗号配列を置換するように設計した。このプラス
ミドのEcoR Iによる切断は、cbh1プロモーター領域、eg
l1暗号配列および転写終止領域を含む断片、T.reesei
pyr4遺伝子およびcbh1座の３′（下流）側腹領域からの
DNA断片を離生する（図15参照）。

実施例24 pCEPC1 DNAを含有する形質転換体 T.reesei RutC30のpyr4欠損菌株（シール−ニース、
前述）を、実施例１に概略を説明した方法により得た。
この菌株は、EcoR Iで切断されたpCEPC1により転換され
た。安定な形質転換体を選択し、続いて実施例22に記載
したようにセルラーゼ産生のために振動フラスコ中で培
養した。セルラーゼタンパク質を視覚化するために、実
施例７に記載した方法を用いてこれらの培養物からの試
料上に等電点電気泳動ゲルの電気泳動を行なった。この
方法により分析した合計23の形質転換体のうち12が、CB
H Iタンパク質を全く産生しないことが分かり、これはc
bh1座でのpCEPC1 DNAの組込みの予期した結果である。
サザン法分析を用いて、統合がこらの形質転換体のうち
のいくつかのcbh1座で完全に生じたこと、および細菌プ
ラスミドベクター（pUC4K）から誘導された配列が全く
存在しないこと（図16参照）を確証した。この分析に関
して、形質転換体からのDNAを、電気泳動を行ない、膜
フィルターにブロットする前に、Pst Iで切断した。生
成したサザンブロットは、放射性標識プローブpUC4K::c
bh1でプローブした（実施例２）。そのプローブは、未
転換対照培養物からのDNAの6.5kb断片上のcbh1遺伝子に
雑種形成した（図16、レーンＡ）。cbh1座でのDNAのpCE
PC1断片の組込みは、この6.5kb帯の損失およびほぼ1.0k
b、2.0kbおよび3.0kbのDNA断片と対応する３つの他の帯
の外観となると思われる。これは、図16、レーンＣに示
した形質転換体に観察される正確な模様である。また図
16に示すように、レーンＢは、pCEPC1の多重コピーがcb
h1座以外のゲノム中の部位で組み込まれた形質転換体の
実施例である。

試料中のタンパク質濃度が約0.03と0.07mg/mlの間に
あるように、エンドグルカナーゼ活性検定を、未転換培
養物、および試料が検定の前に50倍に希釈されたことを
除いて実施例22に記載したように形質転換体、からの培
養上澄みの試料に行なった。未転換対照培養物および４
つの異なる形質転換体（CEPC1−101。CEPC1−103、CEPC
1−105およびCEPC1−112と称する）に行なった検定の結
果を表２に示す。形質転換体CEPC1−103およびCEPC1−1
12は、CEPC1断片の統合がCBH I産生の損失となった実施
例である。

上述した結果は、合計タンパク質に対するEG I成分の
産生過剰を示す目的にために提示したものであって、産
生過剰の度合いを示す目的のためではない。この点に関
して、産生過剰は各実施例に関して変わるものと思われ
る。

pCEPC1に類似するが、egl1遺伝子を置換する他のT.re
esei遺伝子を有するプラスミドを構成することが可能で
ある。このようにして、他の遺伝子の表現過剰およびcb
h1遺伝子の同時の欠失を達成できた。

また、事前に他の遺伝子、例えばcbh2が欠失したT.re
eseiのpyr4誘導体菌株をpCEPC1で転換し、例えば全くエ
キソ−セロビオヒドロラーゼを産生せず、エンドグルカ
ナーゼを過剰表現する形質転換体を構成することも可能
である。

pCEPC1に類似の構成物を用いるが、T.reeseiの別の座
からのDNAをcbh1座からのDNAと置換する場合、T.reesei
ゲノム中の別の座での別のプロモーターの制御下で遺伝
子を挿入することも可能である。

実施例25 pEG II::P−１の構成 EG IIをコードする（以前に他者によりEG IIIと称さ
れた）egl3遺伝子が、T.reeseiからクローンされ、その
DNA配列が公表された（サロヘイモら、1988、遺伝子63:
11−21）。菌株RL−P37から、pUC219のPst I部位および
Xho I部位の間に挿入されたゲノムDNAの約4kb Pst I−
Xho I断片として遺伝子を得た。ベクターpUC219は、Bgl
II、Cla IおよびXho Iの制限部位を含むように多重ク
ローニング部位を広げることによりpUC219から誘導され
る（ウィルソンらにより1989年に記載された、遺伝子7
7:69−78）。従来技術において知られている方法を用い
て、ゲノムDNAの2.7kb Sal I断片上に存在するT.reese
i pyr4遺伝子を、EG II暗号配列内のSal I部位中に挿
入し、プラスミドpEG II::P−１を産生した（図17）。
これは、どの配列を欠失することがないがEG II暗号配
列の分断となった。プラスミド、pEG II::P−１は、Hin
d IIIおよびBamH Iで切断でき、その両者がpUC219の多
重クローニング部位から誘導された、一方の末端の5bp
上、および他方の末端の16bpを除いたT.reeseiから排他
的に誘導されたDNAの線形断片を産生できる。

実施例26 EG IIを産生できない菌株を産生するためのT.reesei G
C69のpEG II::P−１による転換 T.reesei菌株GC69は、以前にHind IIIおよびBamH Iで
切断されたpEG II::P−１で転換され、安定な形質転換
体が選択される。全DNAはそれらの形質転換体から単離
され、サザン法分析が、これらの形質転換体を同定する
のに用いられ、ここでpyr4およびegl3遺伝子を含有する
DNAの断片がegl3座で組み込まれ、その結果としてEG II
I暗号配列を分断した。その形質転換体はEG IIを産生す
ることができない。また、pEG II::P−１を用いて、cbh
1遺伝子、cbh2遺伝子、またはegl1遺伝子のいずれか、
または全てが欠失された菌株を転換することもできる。
このようにして、あるセルラーゼ成分を産生し、EG II
成分を全く産生しない菌株を構成できた。

実施例27 CBH I、CBH II、およびEG IIを産生することのできない
菌株を産生するためのT.reeseiのpEG II::P−１による
転換 実施例１に概略を示した方法により、菌株P37PΔΔCB
H67のpyr4欠損誘導体（実施例11から）を得た。この菌
株P37ΔΔ67P1は、以前にHind IIIおよびBamH Iで切断
したpEG II::P−１で転換され、安定な形質転換体が選
択された。全DNAはそれらの形質転換体から単離され、
サザン法分析が、これらの形質転換体を同定するのに用
いられ、ここでpyr4およびegl3遺伝子を含有するDNAの
断片がegl3座で組み込まれ、その結果としてEG II暗号
配列を分断した。図18に説明したサザンブロットを、pU
C18のPst I部位中にクローンされ、続いて再単離された
egl3遺伝子を含有するT.reesei DNAの約4kb Pst I断
片でプローブした。菌株P37ΔΔ67P1から単離したDNA
を、サザン法分析のためにPst Iで切断した場合、egl3
座は続いてオートラジオグラフト上の単一4kb帯として
視覚化された（図18、レーンＥ）。しかしながら、egl3
遺伝子が分断された形質転換体に関して、この帯は失わ
れ、予期したように２つの新たな帯により置換された
（図18、レーンＦ）。DNAがEcoR VまたはBgl IIで切断
された場合、egl3遺伝子に対応する帯のサイズは、未転
換P37ΔΔ67P1菌株（レーンＡおよびＣ）とegl3が分断
した形質転換体（図18、レーンＢおよびＤ）との間の約
2.7kb（挿入pyr4断片のサイズ）により増加した。図18
に示した分断egl3遺伝子を含有する形質転換体（レーン
Ｂ、ＤおよびＦ）は、A22と称した。図18において同定
した形質転換体は、CBH I、CBH IIまたはEG IIを産生で
きない。

実施例28 pPΔEG I−１の構成 実施例12に記載したように、T.reesei菌株RL−P37のe
gl1遺伝子を、ゲノムDNAのHind III断片として得た。こ
の断片をpUC100のHind III部位に挿入した（pUC18の誘
導体、ヤニシュ−ペロンら、1985、遺伝子33:Bgl II、C
la IおよびXho Iの制限部位を加える多重クローニング
部位中に挿入されたオリゴヌクレオチドを有する103−1
19）。従来技術において知られている方法論を用いて、
EG I暗号配列の中央に近い位置からその暗号配列の３′
末端を超えた位置に広がる約1kb EcoR V断片を除去
し、pyr4遺伝子を含有するT.reesei DNAの3.5kb Sca
I断片により置換した。作成したプラスミドをpPΔEG I
−１と称した（図19参照）。

プラスミドpPΔEG I−１は、Hind IIIで切断され、い
ずれの末端にもegl1遺伝子の断片およびその中央でEG I
暗号配列の一部を置換するpyr4遺伝子を有するT.reesei
ゲノムDNAのみからなるDNA断片を放出できる。

適切なT.reesei pyr4欠損菌株のHind IIIで切断した
pPΔEG I−１による転換は、形質転換体のある割合にお
いてegl1座にこのDNAを組み込むことを導く。このよう
にして、EG Iを産生できない菌株が得られる。

実施例29 ｐΔEG I pyr−３の構成およびT.reeseiのpyr4欠損菌株
の転換 EG I遺伝子を、実施例28に概説した方法を用いて不活
化できるという予想が本実験により増強される。この場
合、プラスミド、Aspergillus niger pyr4遺伝子が選
択可能マーカーとしてのT.reesei pyr4遺伝子を置換す
ることを除いてpPΔEG I−１に類似であるｐΔEG I pyr
−３を構成した。この場合、egl1遺伝子は、pUC100のHi
nd III部位に挿入された4.2kb Hind III断片として再
度存在した。pPΔEG I−１の構成中に（実施例28参
照）、同一の内部1kb EcoR V断片を除去したが、この
場合、その断片はクローンされたA.niger pyrG遺伝子
を含有する2.2kb断片により置換された（ウィルソン
ら、1988、Nucl.Acids Res.16p.2339）。ｐΔEG I pyr
−３を有するT.reeseiのpyr4欠損菌株（菌株GC69）の転
換は、その菌株がHind IIIで切断されていずれの末端の
egl1座から側腹領域を有するpyrG遺伝子を含有する断片
を放出した後に、egl1遺伝子が分断された形質転換体に
導かれた。これらの形質転換体は、Hind IIIで切断さ
れ、放射線標識ｐΔEG I pyr−３でプローブされた形質
転換体DNAのサザン法分析により認識された。T.reesei
の未転換菌株において、egl1遺伝子は、DNAの4.2kb Hi
nd III断片上に存在し、この雑種形成のパターンは、図
20、レーンＣとして表される。しかしながら、ｐΔEG I
pyr−３からの所望の断片の組込みによるegl1遺伝子の
欠失に従って、この4.2kb断片は消失し、より大きなサ
イズの約1.2kb、図20、レーンＡの断片により置換され
た。また図20に示すように、レーンＢは、ｐΔEG I pyr
−３の単一コピーの組込みがegl1座以外のゲノム中の部
位で生じた形質転換体の実施例である。

実施例30 CBH I、CBH II、EG IおよびEG IIを産生できない菌株を
産生するT.reeseiのpPΔEG I−１による転換 実施例１に概説した方法により、菌株A22（実施例27
から）のpyr4欠損菌株を得る。この菌株は、以前にHind
IIIで切断され、pyr4遺伝子により置換されたEG I暗号
配列の一部を有するいずれかの末端でegl1遺伝子の断片
を有するT.reeseiゲノムDNAのみからなるDNA断片を放出
するpPΔEG I−１により転換される。

安定なpyr4＋形質転換体を選択し、全DNAをその形質
転換体から単離される。DNAは、形質転換体を同定する
ためにサザン法分析後に³²P標識pPΔEG I−１でプロー
ブされる。ここで、pyr4遺伝子およびegl1配列を含有す
るDNAの断片は、egl1座で組み込まれ、結果としてEG I
暗号配列を分断する。同定された形質転換体は、CBH
I、CBH II、EG IおよびEG IIを産生することができな
い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:885） Ｄ０６Ｍ 101:06 (72)発明者 レアナス，エドワード アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94070 サンカルロス カプリーノ ウ ェイ 352 (72)発明者 ワイス，ジェフリー エル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94117 サンフランシスコ ブエナ ヴ ィスタ 457 (56)参考文献 特開 昭60−149387（ＪＰ，Ａ) 米国特許4894338（ＵＳ，Ａ) 英国特許1368599（ＧＢ，Ｂ) 国際公開89／09259（ＷＯ，Ａ１) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，1989年 ３月 15日，Ｖｏｌ．260，Ｎｏ．１，ｐｐ. 37−43 Ｔｕｕｌａ Ｔ．Ｔｅｅｒｉ，Ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙ ｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｔｒｉｃｈ ｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ，Ｔｅｃｈ ｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎ ｔｒｅ ｏｆ Ｆｉｎｌａｎｄ，ｐｐ. 17−20 Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃ ｈｎｏｌ．，1991年 ３月27日，Ｖｏ ｌ．13，Ｎｏ．３，ｐｐ．227−233

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】綿含有織物の製造中に菌類セルラーゼ組成
   物を含む処理組成物を用いて酸性条件下で該綿含有織物
   を処理することによって、該綿含有織物の肌触りおよび
   ／または外観を改善しおよび／または該綿含有織物に高
   められた色彩および／またはストーンウォッシュの外観
   を与える方法において、前記処理組成物中の前記菌類セ
   ルラーゼ組成物の濃度が約0.01グラム／リットルから約
   10.0グラム／リットルであり、前記菌類セルラーゼ組成
   物が、該菌類セルラーゼ組成物中の全タンパク質重量に
   基づいて少なくとも10重量％のEG型成分を含み、かつ実
   質的に全てのCBH I型成分を含まないことを特徴とする
   方法。
2. 【請求項２】前記菌類セルラーゼ組成物がCBH II型成分
   も実質的に含まないことを特徴とする請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】前記菌類セルラーゼ組成物が、該菌類セル
   ラーゼ組成物中のタンパク質の全重量に基づいて少なく
   とも20重量％のEG型成分を含むことを特徴とする請求項
   １または２記載の方法。
4. 【請求項４】前記処理組成物が、約２重量％未満の界面
   活性剤または界面活性剤混合物をさらに含むことを特徴
   とする請求項１から３いずれか１項記載の方法。
5. 【請求項５】綿含有織物の製造中に菌類セルラーゼ組成
   物を含む菌類セルラーゼ水溶液を用いて酸性条件下で綿
   含有織物を処理することによって、該綿含有織物の肌触
   りおよび／または外観を改善しおよび／または該綿含有
   織物に高められた色彩および／またはストーンウォッシ
   ュの外観を与える方法において、前記セルラーゼ水溶液
   中の前記菌類セルラーゼ組成物の濃度が約0.01グラム／
   リットルから約10.0グラム／リットルであり、前記菌類
   セルラーゼ組成物が、該菌類セルラーゼ組成物中の全タ
   ンパク質重量に基づいて少なくとも10重量％のEG型成分
   を含み、かつ実質的に全てのCBH I型成分を含まないこ
   とを特徴とする方法。
6. 【請求項６】前記菌類セルラーゼ組成物がCBH II型成分
   も実質的に含まないことを特徴とする請求項５記載の方
   法。
7. 【請求項７】前記菌類セルラーゼ組成物が、該菌類セル
   ラーゼ組成物中のタンパク質の全重量に基づいて少なく
   とも20重量％のEG型成分を含むことを特徴とする請求項
   ５または６記載の方法。
8. 【請求項８】前記菌類セルラーゼ水溶液が、約２重量％
   未満の界面活性剤または界面活性剤混合物をさらに含む
   ことを特徴とする請求項５から７いずれか１項記載の方
   法。