ES2346491T3 - Composicion de detergente que contiene composiciones de celulasas deficientes en componentes del tipo cbh i. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN COMPOSICIONES DE CELULASA CONTENIENDO UNO O MAS COMPONENTES DE ENDOGLUCANASA Y MENOS DE UN 5 % EN PESO APROXIMADAMENTE DE COMPONENTES DEL TIPO CBH I. CUANDO SE INCORPORAN A COMPOSICIONES DETERGENTES Y SE UTILIZAN EN MEDIOS DE LAVADO ACIDOS, NEUTROS O ALCALINOS, TALES COMPOSICIONES DE CELULASA DAN UNAS MEJORAS DE RECUPERACION Y CONSERVACION DEL COLOR ASI COMO PROPIEDADES MEJORADAS DE SUAVIZADO PARA TELAS QUE LLEVEN ALGODON. ADEMAS, TALES COMPOSICIONES DA MENOR PERDIDA DE RESISTENCIA A LAS TELAS CON ALGODON COMPARADO CON COMPOSICIONES DE CELULASA QUE CONTENGAN MAYOR CANTIDAD DE COMPONENTES DEL TIPO CBH I.
Description
Composición de detergente que contiene
composiciones de celulasas deficientes en componentes del tipo CBH
I.
La presente invención se refiere a composiciones
de detergente que contienen composiciones de celulasa específica.
En particular, la presente invención se refiere a composiciones de
detergente que contienen (a) una cantidad eficaz de uno o más
tensoactivos para limpieza y (b) una composición de celulasa que
contiene uno o más componentes de tipo endoglucanasa (EG) y menos
de aproximadamente un 5 por ciento en peso de componentes de tipo
exo-celobiohidrolasa (CBH) I y, preferiblemente,
menos de aproximadamente un 5 por ciento en peso de todos los
componentes de tipo CBH. Incluso más preferiblemente, las
composiciones de celulasa utilizadas en las composiciones de
detergente de la presente invención están libres de todos los
componentes de tipo CBH I y preferiblemente libre de todos los
componentes de tipo CBH. Dichas composiciones de detergente
proporcionan mejoras en la suavidad, tacto, retención/restauración
del color y similares. Adicionalmente, cuando dichas composiciones
de celulasa contienen algunos componentes de tipo CBH I, aunque
menos de aproximadamente un 5 por ciento en peso, también se
observa un aumento de las ventajas de limpieza.
Las celulasas son conocidas en la técnica como
enzimas que hidroliza la celulosa (enlaces
\beta-1,4-glucano),dando lugar
así a la formación de glucosa, celo-oligosacáridos,
y similares. Aunque las celulasas se producen (expresan) en hongos,
bacterias y similares, las producidas por hongos han acaparado la
máxima atención, ya que ciertos hongos producen un sistema completo
de celulasas capaz de degradar formas cristalinas de celulosa y
dichas celulasas se pueden producir fácilmente en grandes
cantidades a través de procedimientos de fermentación.
Con respecto a lo anterior, Wood et al.,
"Methods in Enzymology", 160, 25, páginas 234 et seq. (1988),
describen que ciertos hongos producen sistemas completos de
celulasas que comprenden varias clasificaciones de enzimas
diferentes incluyendo las identificadas como
exo-celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH"),
endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), y
\beta-glucosidasas (EC 3.2.1.21) ("BG"). Por
otro lado, algunos hongos son incapaces de producir sistemas
completos de celulasas. En general, estos sistemas carecen de
componentes de CBH. Véase, por ejemplo, Coughlan et al.,
Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, Aubert et
al., Editor, pages 11 et seq., (Academic Press, 1988); y Wood
et al., Methods in Enzymology, 160, 25, páginas 87 et seq.,
(Academic Press, New York, 1988).
Así mismo, aunque en la literatura se describe
que las celulasas bacterianas contienen pocos o ningún componente
CBH, existen algunos casos en los que se ha descrito que los
componentes de tipo CBH derivados de celulasas bacterianas poseen
actividad de exo-celobiohidrolasa.
Las clasificaciones de celulasa fúngica de CBH,
EG y BG se pueden expandir adicionalmente para incluir múltiples
componentes en cada clasificación, Por ejemplo, se han aislado
múltiples CBHs y EGs de un conjunto de fuentes fúngicas que
incluyen Trichoderma reesei que contiene 2 CBHs, es decir,
CBHI y CBHII, y por lo menos 3 EGs, es decir, EGI, EGII y
EGIII.
Se requiere que el sistema completo de celulasas
que comprende componentes de cada una de las clasificaciones CBH,
EG y BG convierta eficazmente celulosa cristalina en glucosa. Los
componentes aislados son muchos menos eficaces, si lo son, en la
hidrolización de celulosa cristalina. Además, se observa una
relación sinérgica entre los componentes de celulasa,
particularmente si son de diferentes clasificaciones. Es decir, la
eficacia de un sistema completo de celulasas es significativamente
superior que la suma de contribuciones de los componentes aislados
de la misma clasificación. En este aspecto, se sabe en la técnica
que los componentes de EG y componentes de CBH interaccionan de
manera sinérgica para degradar de manera más eficaz la celulosa.
Véase, por ejemplo, Wood, Biochem. Soc. Trans., 13, pp.
407-410 (1985).
La especificidad de substrato y el modo de
acción de diferentes componentes de celulasa varían
significativamente con la clasificación que puede justificar la
sinergia de los componentes combinados. Por ejemplo, el modo
aceptado actual de acción de la celulasa es que los componentes de
endogluconasa hidrolizan los enlaces glucosídicos
\beta-1,4 internos, particularmente, en regiones
de baja cristalinidad de la celulosa y los componentes de
exo-celobiohidrolasa hidrolizan la celobiosa desde
el extremo no reductor de la celulosa. La acción de los componentes
de la endoglucanasa facilita ampliamente la acción de las
exo-celobiohidrolasas mediante la creación de
nuevos extremos de cadena que son reconocidos por los componentes de
exo-celobiohidrolasa.
Los componentes de la
\beta-glucosidasa actúan sólo sobre
oligosacáridos, por ejemplo, celobiosa, para producir glucosa como
el único producto. Se consideran como una parte integral del sistema
de celulasas ya que dirigen la reacción global a la glucosa y de
este modo mitigan los efectos inhibidores de la celobiosa sobre los
componentes de CBH y EG.
\newpage
Por otro lado, también se sabe en la técnica que
las celulasas son útiles en las composiciones de detergentes para
los fines de aumentar la capacidad de limpieza de la composición,
para su uso como agente suavizante, y para mejorar el tacto de los
tejidos de algodón, y similares. Aunque el mecanismo exacto por el
cual las composiciones de celulasa suavizan las prendas no se
entiende totalmente, las propiedades de suavizado y restauración
del color de la celulasa se ha atribuido a los componentes de
endoglucanasa alcalina en las composiciones de celulasa. De este
modo, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud Internacional No.
WO 89/09259 da a conocer que las composiciones de detergentes que
contienen una composición de celulasa enriquecida en un componente
de endoglucanasa alcalina específica confieren una restauración del
color y mejora de la suavidad a prendas tratadas en comparación con
las composiciones de celulasa no enriquecidas en dicho componente.
Adicionalmente, el uso de dichos componentes de endoglucanasa
alcalina en composiciones de detergentes complementa las necesidades
de pH de la composición de detergente. El componente de
endoglucanasa de esta referencia se define como el que muestra la
máxima actividad a un pH alcalino de 7,5 a 10 y que presenta un
criterio de actividad definido sobre la carboximetilcelulosa y
Avicel.
Por otro lado, las composiciones de celulasa son
conocidas en la técnica por degradar los tejidos que contienen
algodón (véase, por ejemplo, Suzuki et al., Patente de
Estados Unidos No. 4,822,516), cuya degradación se manifiesta por
una menor pérdida de resistencia en el tejido. A su vez, dicha
pérdida de resistencia se justifica, en parte, por la reticencia a
utilizar las composiciones de celulasa en aplicaciones de
detergentes comerciales.
Por consiguiente, en vista de lo anterior, las
composiciones de celulasa que contienen uno o más componentes de
endoglucanasa que también proporcionan una menor pérdida de
resistencia para tejidos que contienen algodón en comparación con
un sistema completo de celulasas serían particularmente ventajosas
para su uso en composiciones de detergentes.
WO 91/17243, que es relevante bajo el Art
54(3) EPC, da a conocer la purificación de Humicola
insolens de una proteína de -43 kD que tiene actividad
endoglucanasa, y también proporciona la secuencia codificante (SEC
Id No. 1) que dice ser la de la esa endoglucanasa, y la secuencia
codificante (SEC Id No. 3) que dice ser de una cepa DSM 2672 de
Fusarium oxysporum.
La endoglucanasa purificada de H insolens se
decía que era inmunoreactiva con un anticuerpo desarrollado contra
la endoglucanasa de -43 kD muy purificada derivada de H insolens,
DSM 1800.
La descripción también da a entender que
comprende homólogos de las supuestas endoglucanasas que tienen las
secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC Id Nos. 1 y 3, donde
"homólogo" se define de la siguiente manera.
- (i)
- se pretende indicar un polipéptido codificado por ADN que se hibrida a la misma sonda que el ADN codificante de las SEC Id Nos. 1 y 3 bajo "ciertas condiciones específicas". La única indicación de dichas condiciones se proporciona como: premojado en 5xSSC y prehibridación durante 1 hora a 40ºC en una solución de formamida al 20%, 5x de solución de Denhardt, fosfato de sodio 50 mM, pH 6,8, y 50 mg un ADN de timo de ternera sonicado desnaturalizado, seguido de la hibridación en la misma solución complementada con ATP 100 mM durante 18 horas a 40ºC. No está claro que esta descripción permita de manera clara e inequívoca otra cosa que no sea las propias SEC ID Nos 1 y 3.
- (ii)
- Además, "homólogo" pretende incluir derivados de las secuencias mencionadas anteriormente obtenidas mediante la adición de uno o más residuos de aminoácidos a cualquiera de los extremos C o N-terminal, o ambos, de la secuencia nativa, la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia nativa, la deleción de uno o más residuos de aminoácidos en cualquiera de los extremos, o ambos, de la secuencia de aminoácidos nativa o en uno o más sitios en la secuencia nativa, o inserción de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia nativa. Las SEC ID No.s 1 y 3 de esta descripción se reproducen a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
También se dice que se "contempla" que las
endoglucanasas homólogas pueden derivar de otros microorganismos
que producen enzimas celulolíticas, tales como Trichoderma,
Myceliophthora, Phanerochaete, Schizophyllum, Penicillium,
Aspergillus, y Geotricum. No se proporcionan evidencias que apoyen
que dicha "contemplación", ya sea que dichos homólogos existen
en cualquiera de estos géneros, o que se pudieran identificar y
clonar fácilmente por un experto en la materia; pero en la medida
que pudiera ser el caso, tendría que estar comprendido por el
término "homólogo" tal como se define en (i) anterior.
\newpage
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\newpage
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
Las reivindicaciones adjuntas contienen
"disclaimers" de la material descrita en
WO-A-9206184 y
WO-A-
9206210, que son estado de la técnica en virtud del Art 54(3) EPC.
9206210, que son estado de la técnica en virtud del Art 54(3) EPC.
Se ha encontrado ahora que las composiciones de
celulasa fúngica que contienen uno o más componentes de tipo
endoglucanasa se pueden combinar en composiciones de detergentes
para conferir mejoras en la suavidad, la retención/restauración del
color y el tacto a los tejidos que contienen algodón lavados en un
medio de lavado que contiene dicha composición. También se ha
encontrado que cuando dichas composiciones de celulasa contienen
menos de aproximadamente un 5 por ciento en peso de componentes de
tipo CBH I, las composiciones de turgente resultantes confieren
menor pérdida de resistencia a los tejidos que contienen algodón
lavados de esta manera.
Con respecto a las composiciones de detergente
que contienen composiciones de celulasa que son deficientes en
CBHI, enriquecidas en CBHI o enriquecidas en EGIII, se ha observado
que es la cantidad de celulasa, y no la velocidad relativa de
hidrólisis de los componentes enzimáticos específicos para producir
la reducción de azúcares a partir de celulosa, lo que confiere las
propiedades deseadas del detergente a los tejidos que contienen
algodón, por ejemplo, una o más entre una mejor restauración del
color, una mejor suavidad y un mejor efecto de limpieza a la
composición del detergente.
Por consiguiente, en uno de sus aspectos de
composición, la presente invención se refiere a una composición de
detergente que comprende
(a) una cantidad eficaz de un tensoactivo o una
mezcla de tensoactivos para limpieza; y,
(b) de un 0,01 a un 5 por ciento en peso y
preferiblemente de aproximadamente un 0,05 a aproximadamente un 2
por ciento en peso, de una composición de celulasa fúngica en base
al peso de la composición de detergente donde dicha composición de
celulasa comprende uno o más componentes de tipo EG y menos de un 5
por ciento en peso de componentes de tipo CBH en base al peso de
proteína en la composición de celulasa;
caracterizada porque la composición de
detergente proporciona mejoras en la suavidad,
retención/restauración del color y tacto a tejido que contiene
algodón o celulosa regenerada; con una menor pérdida de resistencia
en comparación con el tratamiento con composiciones de detergentes
que contienen mayores cantidades de componentes de tipo CBH I; con
la condición de que dicha composición de celulasa fúngica (b) es (I)
diferente de una composición que contiene celulasa de EG IIII
sustancialmente pura, definiéndose como que tiene por lo menos un
40% en peso de EG III en base al peso total de proteínas celulasa;
y (II) diferente de una composición de celulasa ácida, que tiene un
pH óptimo inferior a 7,0, que contiene una cantidad enriquecida de
componentes de tipo EG en relación a componentes de tipo CBH.
\newpage
Más preferiblemente, la composición de celulasa
fúngica utilizada en la presente invención está libre de todos los
componentes de tipo CBH I y, aún más preferiblemente, está libre de
todos los componentes de tipo CBH.
En otra realización preferida, la composición de
celulasa deriva de un microorganismo que ha sido modificado
genéticamente para que sea incapaz de producir ningún componente de
tipo CBH I y más preferiblemente, ningún componente de tipo CBH, es
decir, componentes tipo CBH I y tipo CBH II. En una realización más
preferida, la composición de celulasa deriva de un microorganismo
que ha sido modificado genéticamente para que sea incapaz de
producir ningún componente de tipo CBH I o ningún componente de tipo
CBH sin la expresión de ninguna proteína heteróloga.
En uno de sus aspectos del método, la presente
descripción está dirigida a un método que reduce la pérdida de
resistencia para aumentar la suavidad de un tejido que contiene
algodón, cuyo método comprende lavar el tejido en un medio de
lavado derivado de una composición de detergente que comprende (a)
una cantidad eficaz de un tensoactivo o una mezcla de tensoactivos
para limpieza y (b) de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 y,
preferiblemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2, por
ciento en peso de una composición de celulasa fúngica en base al
peso de la composición de detergente, donde la composición de
celulasa comprende uno o más componentes de tipo EG y menos de
aproximadamente un 5 por ciento en peso de componentes de tipo CBH
I en base al peso de proteína en la composición de celulasa.
En otro de sus aspectos del método, la presente
descripción está dirigida a un método que reduce la pérdida de
resistencia para retener/restaurar el color de un tejido que
contiene algodón, cuyo método comprende lavar el tejido una o más
veces en un medio de lavado derivado de una composición de
detergente que comprende (a) una cantidad eficaz de un tensoactivo
o una mezcla de tensoactivos para limpieza y (b) de aproximadamente
0,01 a aproximadamente 5 y, preferiblemente de aproximadamente 0,05
a aproximadamente 2, por ciento en peso de una composición de
celulasa fúngica en base al peso de la composición de detergente,
donde la composición de celulasa comprende uno o más componentes de
tipo EG y menos de aproximadamente un 5 por ciento en peso de
componentes de tipo CBH I en base al peso de proteína en la
composición de celulasa.
La figura 1 es un esquema de la construcción de
p\DeltaCBHIpyr4.
La figura 2 ilustra la deleción del gen de T.
reesei mediante la integración del fragmento más grande de
EcoRI de p\DeltaCBHIpyr4 en el locus cbh1 en
uno de los cromosomas de T. reesei.
La figura 3 es una autorradiografía de ADN de la
cepa GC69 de T. reesei transformado con
p\DeltaCBHIpyr4 digerido con EcoRI después del
análisis de transferencia Southern utilizando
p\DeltaCBHIpyr4 marcado con ^{32}P como sonda. Los
tamaños de los marcadores de peso molecular se muestran en pares de
kilobases a la izquierda de la figura.
La figura 4 es una autorradiografía de ADN de la
cepa GC69 de T. reesei transformado con
p\DeltaCBHIpyr4 digerido con EcoRI utilizando
pIntCBHI marcado con ^{32}P como sonda. Los tamaños de los
marcadores de peso molecular se muestran en pares de kilobases a la
izquierda de la figura.
La figura 5 es un gel de enfoque isoeléctrico
que expresa las proteínas secretadas por las cepas de tipo salvaje
y por las cepas transformadas de T. reesei. Específicamente,
en la figura 5, el carril A del gel de enfoque isoeléctrico utiliza
CBHI parcialmente purificada de T. reesei; el carril B
utiliza un T. reesei de tipo salvaje; el carril C utiliza
proteína de una cepa de T. reesei con el gen cbh1
eliminado; y el carril D utiliza proteína de una cepa de T.
reesei con los genes cbh1 y cbh2 eliminados. En la
figura 5, está marcada la parte derecha de la figura para indicar
la localización de las proteínas individuales halladas en una o más
de las proteínas secretadas. Específicamente, BG se refiere a la
\beta-glucosidasa, E1 se refiere a endoglucanasa
I, E2 se refiere a endoglucanasa II, E3 se refiere a endoglucanasa
III, C1 se refiere a exo-celobiohidrolasa I y C2 se
refiere a exo-celobiohidrolasa II.
La figura 6A es una representación del locus
cbh2 de T. reesei, clonado como un fragmento de
EcoRI de 4,1 kb en ADN genómico y
la figura 6B es una representación del vector
pP\DeltaCBHII con deleción del gen cbh2.
La figura 7 es una autorradiografía de ADN de la
cepa P37P\DeltaCBHIPyr-26 de T. reesei
transformado con pP\DeltaCBHII digerido con EcoRI después
del análisis de transferencia Southern utilizando pP\DeltaCBHII
marcado con ^{32}P como sonda. Los tamaños de los marcadores de
peso molecular se muestran en pares de kilobases a la izquierda de
la figura.
La figura 8 es un diagrama del plásmido
pEGIpyr4.
La figura 9 muestra el perfil de actividad
RBB-CMC de una composición de celulasa fúngica
enriquecida con EG (CBHI y II eliminadas) derivada de
Trichoderma reesei sobre un intervalo de pH a 40ºC; así como
el perfil de actividad de una composición de celulasa enriquecida
en EGIII derivada de Trichoderma reesei sobre un intervalo
de pH a 40ºC.
\newpage
La figura 10 muestra los resultados de la
pérdida de resistencia después de tres ciclos de lavado en un
"launderometer" para tejidos que contienen algodón tratados
con composiciones de celulasa que tienen cantidades variantes de
componentes de CBH.
La figura 11 muestra los resultados de la
extracción de fibras (en base a las valoraciones de las pruebas de
panel) para tejidos que contienen algodón tratados con celulasa
secretada por una Trichoderma reesei de tipo salvaje
(celulasa completa) a diversos pHs.
La figura 12 muestra los resultados de la
extracción de fibras (en base a las valoraciones de las pruebas de
panel) para tejidos que contienen algodón tratados con
concentraciones variantes (en ppm) de celulasa secretada por una
Trichoderma reesei de tipo salvaje y para un tejido de
algodón tratado con celulasa secretada por una cepa de
Trichoderma reesei modificada genéticamente para ser incapaz
de secretar CBH I y CBH II.
La figura 13 muestra los resultados de suavidad
de las pruebas de panel para concentraciones variantes (en ppm) de
una composición de celulasa enriquecida en EG derivada de una cepa
de Trichoderma reesei modificada genéticamente para ser
incapaz de producir CBH I y CBH II.
La figura 14 es un diagrama de las alteraciones
específicas de sitio realizadas en los genes egl1 y
cbh1 para crear sitios de división convenientes para
endonucleasas de restricción. En cada caso, la línea superior
muestra la secuencia de ADN original, los cambios introducidos se
muestran en la línea central y la nueva secuencia se muestra en la
línea inferior.
La figura 15 es un diagrama del fragmento de
EcoRI más grande que se puede obtener de pCEPC1.
La figura 16 es una autorradiografía de ADN, de
una cepa no transformada de T. reesei RutC30 y de dos
transformantes de obtenidos mediante la transformación de T.
reesei con pCEPC1 digerido con EcoRI. El ADN se digirió
con PstI, se obtuvo una transferencia Southern y se hibridó
con pUC4K::cbh1 marcado con ^{32}P. Los tamaños de los
fragmentos de ADN marcadores se muestran en pares de kilobases a la
izquierda de la figura.
La figura 17 es un diagrama del plásmido
pEGII::P-1.
La figura 18 es una autorradiografía de ADN de
la cepa P37P\Delta\Delta67P-1 de T.
reesei con pEGII::P-1 digerido con
HindIII y BamHI. Se preparó una transferencia Southern
y se hibridó el ADN con un fragmento PstI de aproximadamente
4 kb de ADN de T. reesei radiomarcado que contiene el gen
egl3. Los carriles A, C y E contienen ADN de la cepa no
transformada, mientras que los carriles B, D y F contienen ADN de la
cepa de T. reesei no transformada. El ADN de T.
reesei se digirió con BglII en los carriles A y B, con
EcoRV en los carriles C y D y con PstI en los
carriles E y F. El tamaño de los fragmentos de ADN marcadores se
muestran en pares de kilobases a la izquierda de la figura.
La figura 19 es un diagrama del plásmido
pP\DeltaEGI-1.
La figura 20 es una autorradiografía de una
transferencia Southern de ADN aislado de transformantes de la cepa
GC69 obtenida con p\DeltaEGIpyr-3 digerida con
HindIII. El patrón de hibridación con la sonda,
p\DeltaEGIpyr-3 radiomarcado, esperado para una
cepa no transformada se muestra en el carril C. El carril a muestra
el patrón esperado para un transformante en el que el gen
egl1 se ha alterado y el carril B muestra un transformante
en el que el ADN de p\DeltaEGIpyr-3 se ha
integrado en el genoma, pero sin alterar el gen egl1. El carril d
contiene p\DeltaEGIpyr-3 digerido con
HindIII para proporcionar marcadores de tamaño adecuados. Los
tamaños de los fragmentos de ADN marcadores se muestran en pares de
kilobases a la derecha de la figura.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
presente invención se refiere en general a composiciones de
detergente que contienen composiciones de celulasa fúngica que
contiene uno o más componentes de celulasa de tipo EG y menos de
aproximadamente un 5 por ciento en peso de componentes de tipo CBH
I, así como a métodos que utilizan dichas composiciones de
celulasa. Cuando se utilizan en medio de lavado que tiene un pH
ácido, neutro o alcalino, dichas composiciones de detergente
confieren mejoras en la suavidad, retención/restauración de color y
tacto a tejidos que contienen algodón lavados en dichos medio.
Además, debido a la pequeña cantidad de componentes de tipo CBHI
presentes en la composición de celulasa, estas composiciones también
proporcionan una menor pérdida de resistencia en comparación con
las composiciones que contienen cantidades mayores de componentes
de tipo CBHI.
Sin embargo, antes de describir la presente
invención en detalle, se definirán primero los siguientes
términos.
El término "celulasa fúngica" se refiere a
una composición de enzimas derivada de fuentes o microorganismos
fúngicos modificados genéticamente para incorporar y expresar todos
o parte de los genes de celulasa obtenidos de una fuente fúngica.
Las celulasas fúngicas actúan sobre la celulosa o uno o más de sus
productos de degradación para hidrolizar celulosa y producir
productos primarios, glucosa y celobiosa. Las celulasas fúngicas se
diferencian de las celulasas producidas a partir de fuentes no
fúngicas incluyendo microorganismos, tales como actinomicetos,
bacterias reptantes (myxobacteria) y bacterias verdaderas. Los
hongos capaces de producir celulasas útiles en la preparación de
composiciones de celulasa utilizadas en las composiciones de
detergente descritas en la presente invención se describen en la
Patente británica No. 2 094 826A.
La mayoría de las celulasas fúngicas presentan
en general su actividad óptima en el intervalo de pH ácido o
neutro, aunque se sabe que algunas celulasas fúngicas poseen
actividad significativa bajo condiciones neutras y ligeramente
alcalinas, es decir, por ejemplo, se sabe que celulasas derivadas de
Humicola insolens presentan actividad en condiciones neutras
a ligeramente alcalinas.
Se sabe que las celulasas fúngicas están
comprendidas de varias clasificaciones de enzimas que tienen
diferente especificidad de sustratos, patrones de acción enzimática,
y similares. Adicionalmente, los componentes de enzimas en cada
clasificación pueden mostrar diferentes pesos moleculares,
diferentes grados de glucosilación, diferentes puntos
isoeléctricos, diferente especificidad de sustratos, diferentes
patrones de acción enzimática, etc. Por ejemplo, las celulasa
fúngicas pueden contener clasificaciones de celulasa que incluyen
endoglucanasas (EGs), exo-celobiohidrolasas (CBHs),
\beta-glucosidasas (BGs), etc. Por otro lado,
aunque en la literatura se describen celulasas bacterianas que
contienen pocos componentes CBH o ninguno, existen varios casos en
los que se ha descrito que los componentes de tipo CBH derivados de
celulasas bacterianas poseen actividad
exo-celobiohidrolasa.
A una composición de celulasas fúngicas
producida por una fuente fúngica natural y que comprende uno o más
componentes de CBH y EG, en la que cada uno de estos componentes se
encuentra en la proporción producida por la fuente fúngica, se le
hace referencia a menudo en la presente invención como" sistema
completo de celulasas fúngicas" o una "composición completa de
celulasas fúngicas" para diferenciarla de las clasificaciones y
componentes de celulasa aislada de la misma, de composiciones
incompletas de celulasa producidas por bacterias y algunos hongos,
o de composiciones de celulasas obtenidas de un microorganismo
modificado genéticamente para sobreproducir, subproducir o no
producir uno o más de los componentes de CBH y/o EG de celulasa.
Los procedimientos de fermentación para cultivar
hongos para la producción de celulasa son conocidos de por sí en la
técnica. Por ejemplo, los sistemas de celulasas se pueden producir
mediante cultivo sólido o sumergido, incluyendo lotes, alimentación
por lotes y procesos de flujo continuo. La recogida y purificación
delos sistemas de celulasas a partir del caldo de fermentación
también puede realizarse mediante procedimientos conocidos per
se en la técnica.
"Componentes de tipo endoglucanasa
("EG")" se refieren a todos los componentes de celulasa
fúngica o combinación de componentes que muestran propiedades de
actividad de detergente similares a los componentes de
endoglucanasa de Trichoderma reesei. En este aspecto, los
componentes de endoglucanasa de Trichoderma reesei
(específicamente, EG I, EG II, EG III, y similares, solos o
combinados) confieren suavidad, retención/restauración del color y
mejor tacto a tejidos que contienen algodón cuando estos componentes
se incorporan en un medio de lavado y el tejido se trata con este
medio. Por consiguiente, los componentes de tipo endoglucanasa son
aquellos componentes de celulasa fúngica que confieren suavidad,
retención/restauración de color y mejor tacto a prendas de algodón
cuando estos componentes se incorporan en un medio de lavado. En una
realización preferida, los componentes de tipo endoglucanasa
utilizados en las composiciones de detergente de la presente
invención también confieren una menor pérdida de resistencia a
tejidos que contienen algodón en comparación con la pérdida de
resistencia que aparece a partir del sistema completo de celulasas
derivado de Trichoderma reesei.
Dichos componentes de tipo endoglucanasa pueden
no incluir componentes clasificados como endoglucanasas utilizando
pruebas de actividad bioquímica habituales. Por ejemplo, dichas
pruebas de actividad habituales se basan en la capacidad del
componente (a) para hidrolizar derivados de celulosa solubles, tales
como carboximetilcelulosa (CMC), reduciendo de este modo la
viscosidad de soluciones que contienen CMC, (b) para hidrolizar
fácilmente formas hidratadas de celulosa, tales como celulosa
hinchada con ácido fosfórico (por ejemplo, celulosa Walseth) e
hidrolizar menos fácilmente las formas más cristalinas (por ejemplo,
Avicel, Solkafloc, etc.). En cambio, se cree que no todos los
componentes de endoglucanasa, tal como se definen mediante dichas
pruebas de actividad, proporcionarán una mejor suavidad, tacto y
retención/restauración del color. Por consiguiente, es más preciso
para los objetivos de la presente invención definir los componentes
de tipo endoglucanasa como aquellos componentes de celulasa fúngica
que poseen propiedades similares en las composiciones de detergente
a las que poseen los componentes de endoglucanasa de Trichoderma
reesei.
Las celulasas fúngicas pueden contener más de un
componente de tipo EG. Los diferentes componentes tienen en general
puntos isoeléctricos diferentes, pesos moleculares diferentes,
grados diferentes de glicosilación, diferente especificidad de
sustratos, diferentes patrones de acción enzimática, etc. Los
diferentes puntos isoeléctricos de los componentes permiten su
separación a través de una cromatografía de intercambio iónico y
similares. De hecho, el aislamiento de componentes de diferentes
fuentes fúngicas es conocido en la técnica. Véase, por ejemplo,
Bjork et al., Patente de Estados Unidos Serie No. 07/422,814,
Schulein et al., International Solicitud WO 89/09259, Wood
et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation,
pág. 31 a 52 (1988); Wood et al., Carbohydrate Research,
Vol. 190, pág. 279 a 297 (1989); Schulein, Methods in Enzymology,
Vol. 160, pág. 234 a 242 (1988); y similares.
En general, se contempla que las combinaciones
de componentes de tipo EG pueden producir una respuesta sinérgica
en la mejora de la suavidad, retención/restauración del color y
tacto en comparación a un único componente de tipo EG. Por otro
lado, un único componente de tipo EG puede ser más estable o puede
tener un espectro más amplio de actividad sobre un intervalo de
pHs. Por consiguiente, los componentes de tipo EG utilizados en la
presente invención pueden ser un único componente de tipo EG o una
combinación de dos o más componentes de tipo EG. Cuando se utiliza
una combinación de componentes, los componentes de tipo EG pueden
derivar de las mismas o diferentes fuentes fúngica.
"Componentes de tipo
exo-celobiohidrolasa ("tipo CBH")" se
refieren a los componentes de celulasa fúngica que muestran
propiedades de actividad del detergente similares a los componentes
de CBH I y/o CBH II de Trichoderma reesei. En este aspecto,
cuando se utiliza en ausencia de componentes de tipo EG (tal como se
ha definido anteriormente), los componentes de CBH I y CBH II de
Trichoderma reesei solos no confieren una
retención/restauración de color significativa y una mejora en el
tacto a los tejidos que contienen algodón tratados de este modo.
Adicionalmente, cuando se utilizan combinados con componentes de
tipo EG, el componente de tipo CBH I de Trichoderma reesei
confiere una mejor pérdida de resistencia y un incremento del efecto
de limpieza a los tejidos que contienen algodón.
Por consiguiente, los componentes de tipo CBH I
y los componentes de tipo CBH II se refieren a aquellos componentes
de celulasa fúngica que muestran propiedades de actividad de
detergente similares a los componentes CBH I y CBH II de
Trichoderma reesei, respectivamente. Tal como se ha indicado
anteriormente, para los componentes de tipo CBH I, esto incluye las
propiedades de mejora en la pérdida de resistencia de tejidos que
contienen algodón y/o conferir un aumento en las ventajas de
limpieza cuando se utiliza en presencia de componentes de tipo EG.
En una realización preferida, los componentes CBH I también
confieren un incremento en la ventaja de suavidad cuando se utiliza
en presencia de componentes de tipo EG.
Entre dichos componentes de tipo
exo-celobiohidrolasas se pueden incluir componentes
no clasificados habitualmente como
exo-celobiohidrolasas utilizando análisis de
actividad, tales como los utilizados para caracterizar CBH I y CBH
II de Trichoderma reesei. Por ejemplo, utilizando dichos
análisis de clasificación tradicionales, dichos componentes son:
(a) inhibidores competitivamente por celobiosa (Ki aproximadamente
1 mM); (b) incapaces de hidrolizar a celulosas sustituidas en ningún
grado significativo, tales como
carboxi-metilcelulosa, etc., y (c) capaces de
hidrolizar celulasa hinchada con ácido fosfórico y en un menor grado
celulosa altamente cristalina. En cambio, se cree que algunos
componentes de celulasa fúngica que están caracterizados como
componentes de CBH por dichos análisis de actividad, proporcionarán
una mejor suavidad, tacto y retención/restauración de color a
tejidos que contienen algodón cuando estos componentes se utilizan
solos en composiciones de detergente. Por consiguiente, se cree que
es más preciso para los objetivos de la presente invención definir
dichas exo-celobiohidrolasas como componentes de
tipo EG, ya que estos componentes poseen propiedades funcionales
similares en composiciones de detergente a las que se poseen
mediante los componentes de endoglucanasa de Trichoderma
reesei.
Las celulasas fúngicas enriquecidas en
componentes de tipo EG se pueden obtener mediante técnicas de
purificación. Específicamente, el sistema complete de celulasa se
puede purificar en componentes sustancialmente puros mediante
técnicas de separación reconocidas publicadas en la literatura,
incluyendo cromatografía de intercambio iónico a un pH adecuado,
cromatografía de afinidad, exclusión por tamaño y similares. Por
ejemplo, en la cromatografía de intercambio iónico (normalmente
cromatografía de intercambio aniónico), es posible separar los
componentes de celulasa mediante la elución con gradiente de pH, o
un gradiente de sales, o ambos, un gradiente de pH y sales.
También se contempla que las mezclas de
componentes de celulasa que tienen la proporción requerida de
componentes de tipo EG con respecto a componentes de celulasa de
tipo CBH I se podrían preparar mediante medios diferentes de
aislamiento y recombinación de los componentes. En este aspecto,
pude ser posible modificar las condiciones de fermentación para un
microorganismo natural con el fin de proporciona proporciones
relativamente elevadas de componentes de EG con respecto a CBH. Así
mismo, las técnicas recombinantes pueden alterar la proporción
relativa de componentes de EG con respecto a componentes de CBH para
producir una mezcla de componentes de celulasa que tienen una
proporción relativamente elevada de componentes EG con respecto a
componentes CBH o que pueden producir uno o más componentes de EG
libres de todos los componentes de CBH.
Con respecto a lo anterior, un método preferido
para la preparación de composiciones de celulasa enriquecidas en
componentes de tipo EG es mediante modificación genética de un
microorganismo para que sea incapaz de producir uno o más
componentes de tipo CBH, cuyos métodos no producen ninguna proteína
heteróloga. Así mismo, es posible modificar genéticamente un
microorganismo para sobreproducir uno o más componentes de tipo EG.
Por ejemplo, el documento U.S. Serie No. 07/593,919, solicitada el
5 de octubre de 1990, describe métodos para modificar genéticamente
Trichoderma reesei para que sea incapaz de producir uno o más
componentes de CBH y/o sobreproducir uno o más componentes de EG.
Además, los métodos de esa solicitud crean cepas de Trichoderma
reesei que no producen ninguna proteína heteróloga. Así mismo,
Miller et al., "Direct and Indirect Gene Replacement in
Aspergillus nidulans", Molecular and Cellular Biology, p.
1714-1721 (1985) dan a conocer métodos para suprimir
genes en Aspergillus nidulans mediante la transformación
mediada por ADN utilizando un fragmento lineal de ADN homólogo. Los
métodos de Miller et al., conseguirían una deleción de gen
sin producir ninguna proteína heteróloga.
En vista de lo anterior, la deleción de los
genes responsables de producir los componentes de celulasa de tipo
CBH I o de tipo CBH II tendría el efecto de enriquecer la cantidad
de componentes de tipo EG presentes en la composición de celulasas.
Así mismo, la deleción los genes responsables de producir los
componentes de tipo CBH I y CBH II daría lugar a una composición de
celulasa libre de componentes del tipo CBH.
También se contempla que las composiciones de
celulasa fúngicas se pueden utilizar en la presente invención a
partir de fuentes fúngicas que producen una composición incompleta
de celulasas fúngicas. Por ejemplo, se sabe que ciertos hongos
producen composiciones de celulasas libres de componentes de CBH.
Véase, por ejemplo, Coughlan et al., Biochemistry and
Genetics of Cellulose Degradation, Aubert et al. Editors, pp.
11-30 (Academic Press, 1988), describen que los
hongos de pudrición de la raíz no producen aparentemente componentes
de CBH, pero es posible que uno o más de estos componentes sean
componentes de tipo CBH I. Por otro lado, si una cantidad
suficiente de las endoglucanasas producidas por dichos hongos son,
para los objetivos de la presente invención, componentes de tipo
EG, entonces sería posible utilizar dicha celulasa en la práctica de
la presente invención sin el enriquecimiento para obtener la
proporción necesaria de los componentes de tipo EG con respecto a
componentes del tipo CBH I.
Adicionalmente, se puede añadir una cantidad
requerida de uno o más componentes de tipo CBH purificados mediante
procedimientos convencionales a una composición de celulasas
producidas a partir de un microorganismo modificado genéticamente
para ser incapaz de producir componentes de tipo CBH para conseguir
una proporción específica de componentes de tipo EG con respecto a
uno o más componentes de tipo CBH, es decir, se puede formular una
composición de celulasas libres de componentes de tipo CBH para
estar enriquecida en componentes de tipo EG para contener 1 por
ciento en peso de un componente de tipo CBH I simplemente mediante
la adición de esta cantidad de componente de tipo CBH I purificado
a la composición de celulasas.
Los "componentes de
\beta-Glucosidasa (BG)" se refieren a los
componentes de celulasa que muestran actividad BG; es decir, que
dichos componentes actuarán desde el extremo no reductor de la
celobiosa y otros celooligosacáridos solubles "celobiosa" y
producirán glucosa como el único producto. Los componentes de BG no
adsorben sobre los polímeros de celulosa ni reacciona con los
mismos. Además, dichos componentes de BG son inhibidos
competitivamente por glucosa (Ki aproximadamente 1 mM). Aunque en
sentido estricto, los componentes de BG no son literalmente
celulasas, ya que no pueden degradar la celulosa, dichos componentes
de BG están incluidos en la definición del sistema de celulasas, ya
que estas enzimas facilitan la degradación general de la celulosa
mediante la degradación posterior de los productos inhibidores de la
degradación de celulosa (particularmente celobiosa) producidos por
la acción combinada de componentes de CBH y componentes de EG. Sin
la presencia de los componentes de BG, tendrá lugar una hidrólisis
moderada o escasa de celulosa cristalina. Los componentes de BG se
caracterizan a menudo en sustratos de arilo, tales como
p-nitrofenol BD-glucósido (PNPG) y,
de este modo, se denominan a menudo
aril-glucosidasas. Debe indicarse que no todas las
aril-glucosidasas son componentes de BG, ya que
algunas no hidrolizan la celobiosa.
Se contempla que la presencia o ausencia de los
componentes de BG en la composición de celulasa se puede utilizar
para regular la actividad de los componentes de CBH.
Específicamente, debido a que la celobiosa es producida durante la
degradación de celulosa por los componentes de CBH y que se sabe que
concentraciones elevadas de celobiosa inhiben la actividad de CBH,
y que además dicha celobiosa es hidrolizada a glucosa por los
componentes de BG, la ausencia de componentes de BG en la
composición de celulasas "apagará" la actividad de CBH cuando
la concentración de celobiosa alcanza niveles inhibidores. También
se contempla que se pueden añadir uno o más aditivos (por ejemplo,
celobiosa, glucosa, etc.) a la composición de celulasas para
"desactivar" de manera eficaz, directa o indirectamente,
alguna o toda la actividad de tipo CBH I, así como otra actividad
de CBH. Cuando se utilizan dichos aditivos, se considera que la
composición resultante es una composición adecuada para su uso en
la presente invención si la cantidad de aditivo empleada es
suficiente para disminuir la actividad de tipo CBH I a niveles
iguales o inferiores a los niveles de actividad de tipo CBH I
conseguidos mediante la utilización de las composiciones de
celulasa descritas en la presente invención.
Por otro lado, una composición de celulasas que
contiene cantidades adicionadas de componentes de BG puede
incrementar la hidrólisis global de celulosa si el nivel de
celobiosa generado por los componentes de CBH se vuelve limitativo
de dicha hidrólisis global en ausencia de componentes de BG
adicionados.
Los métodos para aumentar o disminuir la
cantidad de componentes de BG en la composición de celulasas se
describen en la referencia de Patente de Estados Unidos Serie No.
07/625,140, solicitada el 10 de diciembre de 1990, como expediente
del agente no. 010055-056 y titulada
"SACCHARIFICATION OF CELLULOSE BY CLONING AND AMPLIFICATION OF
THE \beta-GLUCOSIDASE GENE OF TRICHODERMA
REESET".
Las celulasas fúngicas pueden contener más de un
componente de BG. Los diferentes componentes tienen en general
diferentes puntos isoeléctricos que permiten su separación a través
de la cromatografía de intercambio iónico y similares. Se puede
utilizar un único componente de BG o una combinación de componentes
de BG.
Cuando se utiliza en la composición de
detergente, el componente de BG se añade en general en una cantidad
suficiente para evitar la inhibición de los componentes de CBH y EG
y, particularmente, componentes de celulasa de tipo CBH I, por la
celobiosa. La cantidad de componente de BG añadida depende de la
cantidad de celobiosa producida en el lavado con detergente que se
puede determinar fácilmente por el experto en la materia. Sin
embargo, cuando se utiliza, el porcentaje en peso de componente de
BG en relación con los componentes de tipo CBH en la composición de
celulasa es preferiblemente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente
10 por ciento en peso, y más preferiblemente, de aproximadamente
0,5 a aproximadamente 5 por ciento en peso.
Las celulasas fúngicas preferidas para su uso en
la preparación de las composiciones de celulasas fúngicas
utilizadas en la presente invención son las obtenidas de
Trichoderma ressei, Trichoderma koningii, Pencillum sp.,
Humicola insolens, y similares. Ciertas celulasas fúngicas están
disponibles comercialmente, es decir, CELLUCAST (disponibles en
Novo Industry, Copenhagen, Dinamarca), RAPIDASE (disponibles en Gist
Brocades, N.V., Delft, Holanda), CYTOLASE 123 (disponibles en
Genencor International, South San Francisco, California) y
similares. Otras celulasa fúngicas se pueden aislar fácilmente por
procedimientos de fermentación y aislamiento reconocidos en la
técnica.
El término "tejido que contiene algodón" se
refiere a tejidos cosidos o no cosidos fabricados de algodón puro o
mezclas de algodón que incluyen tejidos tejidos de algodón,
tricotados de algodón, vaqueros algodón, y similares. Cuando se
utilizan mezclas de algodón, la cantidad de algodón en el tejido
debería ser de por lo menos aproximadamente el 40 por ciento en
peso de algodón; preferiblemente, más de aproximadamente el 60 por
ciento en peso de algodón; y lo más preferiblemente, más de
aproximadamente el 75 por ciento en peso de algodón. Cuando se
utiliza como mezclas, el material de acompañamiento utilizado en el
tejido puede incluir una o más fibras que no son de algodón,
incluyendo fibras sintéticas, tales como fibras de poliamida (por
ejemplo, nylon 6 y nylon 66), fibras acrílicas (por ejemplo, fibras
de poliacrilonitrilo), fibras de poliéster (por ejemplo,
tereftalato de polietileno), fibras de polivinil alcohol (por
ejemplo, Vinylon), fibras de cloruro de polivinilo, fibras de
cloruro de polivinilideno, fibras de poliuretano, fibras de poliurea
y fibras de aramida. Se contempla que la celulosa regenerada, tal
como rayón, se podría utilizar como sustituto del algodón en
tejidos que contienen algodón.
El término "agente activo de superficie o
tensoactivo" se refiere a tensoactivos aniónicos, no iónicos y
anfolíticos conocidos para su uso en composiciones de
detergentes.
El término "medio de lavado" se refiere a
una solución de lavado acuosa preparada mediante la adición de una
cantidad necesaria de una composición de detergente (tensoactivo)
al agua. El medio de lavado contiene en general una cantidad eficaz
para limpieza del detergente.
El medio de lavado se define como un "medio de
lavado ácido" si el pH del medio es de aproximadamente 4 a menos
de aproximadamente 7. El medio de lavado se define como un "medio
de lavado neutro" si el pH del medio es de aproximadamente 7. El
medio de lavado se define como un "medio de lavado alcalino" si
el pH del medio es desde por encima de 7 hasta aproximadamente 10.
Preferiblemente, el medio de lavado alcalino tendrá un pH desde por
encima de 7 hasta aproximadamente 9 e, incluso más preferiblemente,
desde por encima de 7 a aproximadamente 8. La presente invención se
refiere al descubrimiento de que los componentes de tipo EG se
pueden utilizar en composiciones de detergentes para conseguir un
suavizado, así como la retención/restauración del color y el tacto
de tejidos que contienen algodón, independientemente de si dichas
composiciones se utilizan en un medio de lavado ácido, neutro o
alcalino. Sin embargo, debido a que las composiciones de detergente
se utilizan generalmente en condiciones alcalinas, la composición de
celulasa utilizada es preferiblemente aquella que posee cierta
actividad bajo dichas condiciones. Las composiciones de celulasa
preferidas incluyen las derivadas de T. reesei y Humicola
insolens. Las composiciones de celulasa de Humicola
insolens son conocidas en la técnica para mantener la actividad
significativa bajo condiciones alcalinas.
Aunque la presencia de componentes de tipo EG es
necesaria para conseguir una retención/restauración del color,
suavizado y mejor tacto, las mezclas específicas de componentes de
tipo EG y componentes de tipo CBH (incluyendo componentes de tipo
CBH I) también muestran las mismas ventajas o incluso algunas
ventajas adicionales. Específicamente, aunque el uso de componentes
de EG dará lugar a ciertas ventajas en la limpieza, se observa una
ventaja adicional en la limpieza para tejidos que contienen algodón
lavados con una composición de detergente que contiene una
composición de celulasas que contiene uno o más de los componentes
de tipo EG y que contiene componentes de celulasa de tipo CBH I.
Adicionalmente, aunque el uso de componentes de EG conseguirá un
suavizado, se puede conseguir una ventaja adicional en el suavizado
mediante la incorporación de algunos componentes de tipo CBH I con
los componentes de tipo EG.
Por otro lado, la presencia de cantidades
significativas de componentes de tipo CBH I en combinación con los
componentes de tipo EG da lugar a una pérdida de resistencia
mejorada en tejidos que contienen algodón en comparación con
composiciones de celulasas que estás libres de componentes de tipo
CBH I o contienen cantidades reducidas de componentes de tipo CBH
I. Por consiguiente, con el fin de minimizar las características de
la pérdida de resistencia de las composiciones de detergentes que
contienen celulasas las composiciones de detergentes de la presente
invención utilizan composiciones de celulasas que contienen uno o
más componentes de tipo EG y menos de aproximadamente un 5 por
ciento en peso, y preferiblemente menos de aproximadamente un 2 por
ciento en peso, de componentes de tipo CBH I. Las composiciones de
detergentes que contienen dichas composiciones de celulasas
proporcionan las mejoras deseadas a los tejidos que contienen
algodón, a la vez que proporcionan una menor pérdida de resistencia
en comparación con las composiciones de detergentes que contienen
una composición de celulasas que tiene mayores cantidades de
componentes de tipo CBH I.
Adicionalmente, con respecto a lo anterior, la
selección de la composición específica de celulasas para su uso en
la composición de detergente de la presente invención se realiza
sopesando el deseo de una ventaja de lavado adicional conseguida
por la presencia de ciertos componentes de tipo CBH I frente a la
resistencia a la pérdida de resistencia que dictamina el uso mínimo
o nulo de componentes de tipo CBH I. Es decir, si la importancia
primaria por incorporar celulasa en la composición de detergente es
para mejorar la suavidad, la retención/restauración del color y
mejorar el tacto de tejidos que contienen algodón con la mínima
pérdida de resistencia posible en tejidos que contienen algodón,
entonces la celulasa utilizada en la composición de detergente
debería comprender preferiblemente uno o más componentes de tipo EG
libres de todos los componentes de tipo CBH I.
Por otro lado, si la importancia primaria para
incorporar celulasa en la composición de detergentes es para la
retención/restauración de color, una mejor suavidad y un mejor tacto
de tejidos que contienen algodón, conjuntamente con una ventaja
adicional en la limpieza, entonces la celulasa empleada en la
composición de detergentes debería contener una celulasa que
comprende uno o más componentes de tipo EG, así como algunos
componentes de tipo CBH I (aunque menos de aproximadamente un 5 por
ciento en peso, preferiblemente menos de aproximadamente un 2 por
ciento en peso, en base al peso de proteína total de la composición
de celulasas).
Con respecto a lo anterior, la cantidad de
celulasa utilizada generalmente en las composiciones de detergente
de la presente invención es una cantidad suficiente para conferir
retención/restauración de color y suavidad a las prendas de
algodón. Preferiblemente, las composiciones de celulasas se utilizan
desde aproximadamente un 0,01 por ciento en peso hasta
aproximadamente un 5 por ciento en peso en relación al peso de la
composición de detergente total. Más preferiblemente, las
composiciones de celulasas se utilizan desde aproximadamente un0,05
por ciento en peso hasta aproximadamente un 2 por ciento en peso en
relación con el peso de la composición de detergente total. La
concentración específica de celulasa utilizada en la composición de
detergente se selecciona, de manera que tras la dilución en un
medio de lavado, la concentración de los componentes de tipo EG
variará desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 500 ppm, y
preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 100
ppm. La cantidad específica de celulasa utilizada en la composición
de detergente dependerá de la cantidad de los componentes de tipo
EG en las composiciones de celulasas, así como del grado de
dilución de la composición de celulasas tras la adición al agua para
formar un medio de lavado. Estos factores se averiguan fácilmente
por el experto en la materia.
Preferiblemente, las composiciones de celulasas
utilizadas en las composiciones de detergentes de la presente
invención contienen por lo menos aproximadamente un 20 por ciento en
peso de componentes de tipo endoglucanasa en base al peso total de
proteína en la composición de celulasa, más preferiblemente, por lo
menos aproximadamente un 50 por ciento en peso, e incluso más
preferiblemente, por lo menos aproximadamente un 70 por ciento en
peso, y lo más preferiblemente, por lo menos aproximadamente un 90
por ciento en peso de componentes de tipo endoglucanasa en base al
peso total de proteína en la composición de celulasas.
A concentraciones de celulasa inferiores (es
decir, concentraciones de los componentes de de tipo EG de menos de
aproximadamente 5 ppm en el medio de lavado), la suavidad,
retención/restauración del color y mejora del tacto conseguidos
mediante el uso de las composiciones de detergentes de la presente
invención es más evidente sobre lavados repetidos. A
concentraciones más elevadas (es decir, concentraciones de
componentes de tipo EG de aproximadamente 5 ppm y por encima en el
medio de lavado), las mejoras se hacen destacables en un único
lavado.
Uno de los aspectos importantes de la presente
invención es que mediante el ajuste de la composición de celulasa
para contener uno o más componentes de EG y para contener cantidades
mínimas de componentes de tipo CBH I, es posible conseguir los
efectos deseados de suavidad, retención/restauración de color y
mejora del tacto a la vez que se reduce la pérdida de resistencia
en el tejido que contiene algodón.
Adicionalmente, el uso de dichas composiciones
de celulasa ajustadas permite el uso de concentraciones inferiores
de celulasa en la composición de detergente. A su vez, el uso de
concentraciones inferiores de celulasa en las composiciones de
detergente debería conducir a una mayor seguridad del
consumidor.
La composición de celulasas tal como se ha
descrito anteriormente se puede añadir a la composición de
detergente en un diluyente líquido, en gránulos, en emulsiones, en
geles, en pastas y similares. Dichas formas son conocidas por el
experto en la materia. Cuando se utiliza una composición de
detergente sólida, la composición de celulasas se formula
preferiblemente como gránulos. Preferiblemente, los gránulos se
pueden formular para contener un agente protector de celulasas.
Véase, por ejemplo, el documento U.S. Serie No. 07/642,669,
solicitado el 17 de junio de 1991 como Expediente del Agente No.
010055-073 y titulado "GRANULES CONTAINING BOTH
AN ENZYME AND AN ENZYME PROTECTING AGENT AND DETERGENT COMPOSITIONS
CONTAINING SUCH GRANULES". Así mismo, el gránulo se puede
formular para contener materiales para reducir la velocidad de
disolución del gránulo en el medio de lavado. Dichos materiales y
gránulos se describen en el documento U.S. Serie No. 07/642,596
solicitada el 17 de junio de 1991 como Expediente del Agente No.
GCS-171-US1 y titulado "GRANULAR
COMPOSITIONS".
Las composiciones de detergente de la presente
invención utilizan un agente activo de la superficie, es decir
tensoactivo, incluyendo tensoactivos aniónico, no iónico y
anfolítico conocidos para su uso en composiciones de
detergente.
Entre los tensoactivos aniónico adecuados para
su uso en la composición de detergente de la presente invención se
incluyen alquilbencenosulfonatos lineales o ramificados; éter
sulfatos de alquilo o alquenilo que tienen grupos alquilo o grupos
alquenilo lineales o ramificados; sulfatos de alquilo o alquenilo;
olefinsulfonatos; alcano-sulfonatos y similares.
Entre los contraiones adecuados para tensoactivos aniónicos se
incluyen iones de metales alcalinos, tales como sodio y potasio;
iones de metales alcalinotérreos, tales como calcio y magnesio;
iones amonio; y alcanolaminas que tienen calcio y magnesio; ion
amonio; y alcanolaminas que tienen 1 a 3 grupos alcanol de 2 ó 3
carbonos.
Los tensoactivos anfolíticos incluyen sulfonatos
de sales de amonio cuaternario, tensoactivos anfolíticos de tipo
betaína, y similares. Dichos tensoactivos anfolíticos tienen tanto
grupos cargados positivamente como cargados negativamente en la
misma molécula. Los tensoactivos no iónicos comprenden en general
éteres de polioxi-alquileno, así como alcanolamidas
de ácidos grasos superiores o aductos de óxido de alquileno de los
mismas, monoésteres de ácido graso en glicerina, y similares.
Los tensoactivos adecuados para su uso en la
presente invención se describen en la Solicitud de Patente
Británica No. 2 094 826 A.
También se pueden utilizar mezclas de dichos
tensoactivos.
El tensoactivo o una mezcla de tensoactivos se
utiliza en general en las composiciones de detergentes de la
presente invención en una cantidad de aproximadamente 1 por ciento
en peso a aproximadamente 95 por ciento en peso de la composición
total de detergente y preferiblemente desde aproximadamente el 5 por
ciento en peso a aproximadamente el 45 por ciento en peso de la
composición total de detergente. Tras la dilución en el medio de
lavado, la concentración de tensoactivo es en general de
aproximadamente 500 ppm o más; y preferiblemente, de
aproximadamente 1000 ppm a 15.000 ppm.
Además de la composición de celulasas y el
tensoactivo o tensoactivos, las composiciones de detergente de la
presente invención puede contener opcionalmente uno o más de los
siguientes componentes:
Dichas hidrolasas incluyen hidrolasa de éster de
carboxilato, hidrolasa de tioéster, hidrolasa de monoéster de
fosfato, e hidrolasa de diéster de fosfato que actúan en el enlace
éster; hidrolasa de glucósido que actúa en los compuestos de
glicosilo; una enzima que hidroliza los compuestos de
N-glicosilo; hidrolasa de tioéter que actúa en el
enlace éter; e hidrolasa de
\alpha-amino-acil-péptido,
hidrolasa de peptidil-amino ácido, hidrolasa de
acil-amino ácido, hidrolasa de dipéptido, e
hidrolasa de peptidil-péptido que actúa en el enlace
peptídico. Preferiblemente, entre ellos está la hidrolasa de éster
de carboxilato, hidrolasa de glucósido, y la hidrolasa de
peptidil-péptido. Las hidrolasas adecuadas incluyen
(1) proteasas que pertenecen a la hidrolasa de
peptidil-péptido, tales como pepsina, pepsina B,
renina, tripsina, quimiotripsina A, quimiotripsina B, elastasa,
enteroquinasa, catepsina C, papaína, quimiopapaína, ficina,
trombina, fibrinolisina, renina, subtilisina, aspergilopeptidasa A,
colagenasa, clostridiopeptidasa B, kalikreina, gastrisina, catepsina
D., bromelina, queratinasa, quimiotripsina C, pepsina C,
aspergilopeptidasa B, uroquinasa, carboxipeptidasa A y B, y
aminopeptidasa; (2) hidrolasas de glicósido (la celulasa que es un
ingrediente esencial está excluida de este grupo)
\alpha-amilasa, \beta-amilasa,
glucoamilasa, invertasa, lisozima, pectinasa, quitinasa, y
dextranasa. Preferiblemente, entre ellos están
\alpha-amilasa y \beta-amilasa.
Ellos funcionan en sistemas de ácidos a neutros, pero el que se
obtiene a partir de bacterias muestra una actividad elevada en un
sistema alcalino; (3) hidrolasa de éster de carboxilato que incluye
carboxilesterasa, lipasa, pectina esterasa, y clorofilasa. Entre
éstas es especialmente eficaz
la lipasa.
la lipasa.
Los nombres comerciales de los productos
comerciales y de los fabricantes son los siguientes:
"Alkalase", "Esperase", "Savinase", "AMG",
"BAN", "Fungamill", "Sweetzyme", "Thermamyl"
(Novo Industry, Copenhague, Dinamarca); "Maksatase",
"High-alkaline protease", "Amylase THC",
"Lipase" (Gist Brocades, N.V., Delft, Holanda); "Protease
B-4000", "Protease AP", "Protease AP
2100" (Schweizerische Ferment A.G., Basel, Suiza); "CRD
Protease" (Monsanto Company, St.Luis, Missouri); "Piocase"
(Piopin Corporation, Monticello, Illinois); "Pronase P",
"Pronase AS", "Pronase AF" (Kaken Chemical Co., Ltd.,
Japón); "Lapidase P-2000" (Lapidas, Secran,
Francia); los productos de proteasa (tamiz estándar de Tyler, 100%
de pase en malla 16 y 100% en malla 150) (Clington Corn Products,
Division of Standart Brand Corp., Nueva York); "Takamine",
"Bromelain 1:10", "HT Protease 200", "Enzyme
L-W" (obtenida de hongos, no de bacterias)
(Miles Chemical Company, Elkhart, Ind.); "Rhozyme
P-11 Conc.", "Pectinol", "Lipase B",
"Rhozyme PF", "Rhozyme J-25" (Rhom &
Haas, Gnecor, South San Francisco, CA); "Ambrozyme 200" (Jack
Wolf & Co., Ltd., Subsidiario de Nopco Chemical Company,
Newark, N.J.); "ATP 40", "ATP 120", "ATP 160"
(Lapidas, Secran, Francia); "Oripase" (Nagase & Co., Ltd.,
Japón).
La hidrolasa diferente de la celulasa se
incorpora en la composición del detergente según sea necesario para
el objetivo. Debería incorporarse preferiblemente en una cantidad de
0,001 a 5 por ciento en peso, y más preferiblemente de 0,02 a 3 por
ciento en peso, en términos de cantidad purificada. Se debe usar la
enzima en forma de gránulos fabricados de enzima sola cruda o en
combinación con otros componentes en la composición de detergente.
Los gránulos de enzima cruda se utilizan en una cantidad tal que la
enzima purificada es de 0,001 hasta 50 por ciento en peso en los
gránulos. Los gránulos se usan en una cantidad de 0,002 a 20 y
preferiblemente de 0,1 a 10 por ciento en peso. Como con las
celulasas, estos gránulos se pueden formular para que contengan un
agente protector de la enzima y un material retardante de la
disolución.
Dichos tensoactivos catiónicos y sales de ácidos
grasos de cadena larga incluyen sales de ácidos grasos saturados o
insaturados, sales de ácidos carboxílicos de alquenil o alquil éter,
sales o ésteres de ácidos \alpha-sulfograsos,
tensoactivos de tipo aminoácido, tensoactivos de éster de fosfato,
sales de amonio cuaternario incluyendo aquellas que tienen 3 a 4
sustituyentes alquilo y sustituyentes de alquilo sustituidos por
hasta 1 fenilo. Los tensoactivos catiónicos adecuados y las sales
de ácidos grasos de cadena larga se describen en la Solicitud de
Patente del Reino Unido No. 2 094 826 A.
La composición puede contener desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 por ciento en peso de
tales tensoactivos catiónicos y sales de ácidos grasos de cadena
larga.
La composición puede contener desde
aproximadamente 0 hasta aproximadamente 50 por ciento en peso de
uno o más componentes de builders seleccionados del grupo que
consiste en sales de metal alcalino y sales de alcanolaminas de los
siguientes compuestos: fosfatos, fosfonatos, fosfonocarboxilatos,
sales de aminoácidos, aminopoliacetatos, electrolitos de peso
molecular elevado, polímeros no disociantes, sales de ácidos
dicarboxílicos, y sales de aluminosilicatos. Los agentes
secuestrantes divalentes adecuados se describen en la solicitud de
Patente de Reino Unido No. 2 094 826 A.
La composición puede contener desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 por ciento en peso,
preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 30 por
ciento en peso, en base a la composición del una o más sales de
metal alcalino de los siguientes compuestos como electrolitos
alcalinos o inorgánicos: silicatos, carbonatos y sulfatos, así como
alcalinos orgánicos tales como trietanolamina, dietanolamina,
monoetanolamina y triisopropanoamina.
La composición puede contener desde
aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5 por ciento en peso de
uno o más de los siguientes compuestos como agentes de
antiredeposición: polietilenglicol, polivinil alcohol,
polivinilpirrolidona y carboximetilcelulosa.
Entre ellos una combinación de
carboximetilcelulosa y/o polietilenglicol con la composición de
celulosas de la presente invención proporciona una composición
especialmente útil para la eliminación de suciedad.
El uso de la celulasa de la presente invención
en combinación con un agente blanqueador tal como percarbonato de
sodio, perborato de sodio, el aducto de peróxido de
hidrógeno/sulfato de sodio y el aducto de peróxido de
hidrógeno/cloruro de sodio y/o un colorante blanqueador fotosensible
tal como una sal de zinc o aluminio de ftalocianina sulfonada
mejora adicionalmente los efectos detergentes.
Se pueden incorporar, si es necesario,
diferentes colorantes azules para limpieza y colorantes
fluorescentes en la composición. En la Solicitud de Patente del
Reino Unido No. 2 094 826 se describen colorantes azules para
limpieza y colorantes fluorescentes adecuados.
Se pueden incorporar en el detergente en polvo
los siguientes inhibidores de la formación de tortas: sales del
ácido p-toluensulfónico, sales del ácido
xilensulfónico, sales del ácido acético, sales del ácido
sulfosuccínico, talco, sílice finamente pulverizado, arcilla,
silicato de calcio (tal como Micro-cell de Johns
Manville Co.), carbonato de calcio y óxido de magnesio.
La composición de celulasa de la presente
invención se desactiva en algunos casos en presencia de iones de
cobre, zinc, cromo, mercurio, plomo, manganeso o plata o de sus
compuestos. Varios agentes quelantes de metales y agentes de
precipitación de metales son efectivos contra estos inhibidores.
Incluyen, por ejemplo, agentes secuestradores de iones metálicos
divalentes tal como se mencionan en el punto anterior en referencia
a aditivos opcionales, así como silicato de magnesio y sulfato de
magnesio.
La celobiosa, glucosa y gluconolactona actúan a
veces como inhibidores. Es preferible evitar la
co-presencia de estos sacáridos con la celulasa en
la media de lo posible. En el caso de que la
co-presencia sea inevitable, es necesario evitar el
contacto directo de los sacáridos con la celulasa mediante, por
ejemplo, su recubrimiento.
Los sales de ácidos grasos de la cadena larga y
los tensoactivos catiónicos actúan como inhibidores en algunos
casos. Sin embargo, la co-presencia de estas
sustancias con la celulasa es aceptable si se evita el contacto
directo de los mismos mediante algunos medios tales como compresión
o recubrimiento.
Los agentes enmascarantes y los métodos
mencionados anteriormente se pueden utilizar, si es necesario, en
la presente invención.
Los activadores varían dependiendo de la
variedad de las celulasas. En presencia de proteínas, cobalto y sus
sales, magnesio y sus sales, y calcio y sus sales, potasio y sus
sales, sodio y sus sales o mono-sacáridos, tales
como manosa y xilosa, las celulasas se activan y sus efectos de
detergencia mejoran extraordinariamente.
Los antioxidantes incluyen, por ejemplo,
tert-butil-hidroxitolueno,
4,4'-butilidenbis(6-tert-butil-3-metil-fenol),
2,2'-butildenbis(6-tert-butil-4-metilfenol),
cresol monoestirenado, cresol diestirenado, fenol monoestirenado,
fenol diestirenado y
1,1'-bis(4-hidroxi-fenil)ciclohexano.
Los solubilizantes incluyen, por ejemplo,
alcoholes inferiores, tales como etanol, sales de bencenosulfonato,
sales de alquil inferior-bencenosulfonato, tales
como sales de p-toluenosulfonato, glicoles tales
como propilenglicol, sales de acetilbencenosulfonato, acetamidas,
amidas del ácido piridindicarboxílico, sales de benzoato y urea.
La composición de detergente de la presente
invención se puede utilizar en un intervalo de pH amplio desde un
pH ácido hasta un pH alcalino. En una realización preferida, la
composición del detergente de la presente invención se puede
utilizar en un medio de lavado alcalino para el detergente y más
preferiblemente, en un medio de lavado alcalino para el detergente
que tiene un pH desde por encima de 7 hasta no más de
aproximadamente 8.
Aparte de los ingredientes mencionados
anteriormente, se pueden utilizar con las composiciones de
detergente de la presente invención, si se desea, perfumes,
tampones, conservantes, colorantes y similares. Dichos componentes
se utilizan convencionalmente en cantidades utilizadas hasta ahora
en la técnica.
Cuando la base del detergente utilizada en la
presente invención es en forma de polvo, puede ser una que se
prepara mediante cualquier método de preparación conocido que
incluye un método de secado por pulverización y un método de
granulación. Se prefiere la base del detergente que se obtiene en
particular mediante el método de secado por pulverización y/o el
método de granulación por secado por pulverización. La base del
detergente que se obtiene mediante el método de secado por
pulverización no está limitada con respecto a las condiciones de
preparación. La base del detergente que se obtiene mediante el
método de secado por pulverización son gránulos huecos que se
obtienen mediante la pulverización de una emulsión acuosa de
ingredientes resistentes al calor, tales como los agentes activos
de superficie y los builders, en un espacio caliente. Los gránulos
tienen un tamaño desde 50 hasta 2000 micrómetros. Después del
secado por pulverización, se pueden añadir perfumes, enzimas,
agentes blanqueadores, builders alcalinos inorgánicos. Con la
obtención de una base de detergente granular altamente densa
mediante el método de granulación por secado por pulverización,
también se pueden añadir varios ingredientes después de la
preparación de la base.
Cuando la base del detergente es un líquido,
puede ser una solución homogénea o una dispersión no homogénea.
Para eliminar la descomposición de carboximetilcelulosa por la
celulasa en el detergente, es deseable que la carboximetilcelulosa
esté granulada o recubierta antes de la incorporación en la
composición.
Las composiciones de detergente de la presente
invención se utilizan en usos industriales y domésticos a
temperaturas y proporciones de alcohol utilizadas habitualmente en
estos medios.
Además de su uso en detergentes para lavandería,
las composiciones de celulasas descritas aquí se pueden utilizar
adicionalmente en una etapa de prelavado en la solución apropiada a
un pH intermedio en el que existe la actividad suficiente para
proporcionar las mejoras deseadas en la retención/restauración del
color, suavidad y tacto. Cuando se utiliza la composición de
celulasa en una composición de prerremojo (por ejemplo, prelavado),
como una composición en forma líquida, pulverizador, gel o pasta, la
composición de celulasa se utiliza en general desde aproximadamente
0,01 a aproximadamente 20 por ciento en peso en base al peso total
de la composición del prerremojo. En dichas composiciones, se puede
utilizar opcionalmente un tensoactivo y cuando se utiliza, está
presente en general a una concentración de desde aproximadamente
0,01 a aproximadamente 20 por ciento en peso en base al peso total
del prerremojo. El resto de la composición comprende componentes
habituales utilizados en el prerremojo, es decir, diluyentes,
tampones, otras enzimas (proteasas), y similares, en sus
concentraciones convencionales. Por consiguiente, dichas
composiciones de prerremojo comprenden desde aproximadamente 0 a
aproximadamente 20 por ciento en peso de un tensoactivo y desde
aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 por ciento en peso de una
celulasa que comprende uno o más componentes de tipo EG y menos de
aproximadamente 5 por ciento en peso de componentes de tipo CBH
I.
Además, se contempla que las composiciones de
celulasas descritas aquí también se pueden utilizar en casa como
una composición sola autónoma adecuada para la restauración del
color en tejidos descoloridos. Véase, por ejemplo, la Patente de
Estados Unidos No. 4.738.682.
Los siguientes ejemplos se muestran para
ilustrar la presente invención y no debería interpretarse de ningún
modo como limitante en el alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos 1-12 y
20-28 demuestran la preparación de Trichoderma
ressei modificado genéticamente para ser incapaz de producir
uno o más componentes de celulasa o para sobreproducir componentes
de celulasas específicas.
El gen pyr4 codifica la
orotidin-5'-monofosfato
descarboxilasa, una enzima requerida para la biosíntesis de
uridina. El inhibidor tóxico ácido 5-fluoroorótico
(FOA) es incorporado en uridina por células de tipo salvaje y, de
este modo, envenena las células. Sin embargo, las células
defectuosas en el gen pyr4 son resistentes a este inhibidor,
pero requieren uridina para el crecimiento. Por lo tanto, es posible
seleccionar cepas derivadas de pyr4 utilizando FOA. A la
práctica, se esparcieron esporas de la cepa RL-P37
de T. reesei (Sheir-Neiss, G. y
Montenecourt, B.S., Appl. Microbiol. Biotechnol. 20, p.
46-53 (1984)) sobre la superficie de un medio
solidificado que contiene 2 mg/ml de uridina y 1,2 mg/ml de FOA. Las
colonias espontáneas resistentes a FOA aparecieron a los tres o
cuatro días y fue posible identificar posteriormente los derivados
resistentes a FOA que requerían uridina para el crecimiento. Con el
fin de identificar los derivados que específicamente tenían un gen
pyr4 defectuoso, se generaron protoplastos y se transformaron
con un plásmido que contenía un gen pyr4 de tipo salvaje
(véase los Ejemplos 3 y 4). Tras la transformación, los protoplastos
se emplacaron en un medio que carecía de uridina. El posterior
crecimiento de colonias transformadas demostró la complementación
de un gen pyr4 defectuoso por el gen pyr4 que porta el
plásmido. De esta manera, se identificó la cepa GC69 como derivado
de pyr4 de la cepa RL-P37.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonó el gen cbh1 que codifica la
proteína CBH I a partir del ADN genómico de la cepa
RL-P37 de T. reesei mediante la hibridación
con una sonda de oligonucleótidos diseñada en base a la secuencia
publicada para este gen utilizando métodos de síntesis de sondas
conocidos (Shoemaker et al., 1983b). El gen cbh1
reside en un fragmento PstI de 6,5 kb y se insertó en pUC4K
cortado con PstI (adquirido de Pharmacia Inc., Piscataway,
NJ) sustituyendo el gen Kanr de este vector utilizando técnicas
conocidas en el sector, las cuales se establecen en Maniatis et
al., (1989). El plásmido resultante pUC4K::cbh1 se cortó a
continuación con HindIII y se aisló el fragmento más grande
de aproximadamente 6 kb y se volvió a unir para producir
pUC4K::cbh1\DeltaH/H (veáse la figura 1). Este
procedimiento elimina la secuencia de codificación completa de
cbh1 y aproximadamente 1,2 kb en dirección 5' y 1,5 kb en
dirección 3' de las secuencias flanqueantes. Se mantienen
aproximadamente 1 kb de ADN flanqueante de cualquier extreme del
fragmento de PstI original.
El gen pyr 4 de T. reesei se clonó
como un fragmento HindIII de 6,5 kb de ADN genómico en pUC18
para formar pTpyr2 (Smith et al., 1991) siguiendo los
métodos de Maniatis et al., supra. El plásmido
pUC4K::cbhI\DeltaH/H se cortó con HindIII y los extremos
se desfosforilaron con fosfatasa alcalina intestina de ternera. Este
ADN desfosforilado en el extremo se unión con el fragmento
HindIII de 6,5 kb que contenía el gen pyr4 de T.
reesei para producir p\DeltaCBHIpyr4. La figura 4
ilustra la construcción de este plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo el micelio mediante la inoculación de
100 ml de YEG (extracto de levadura al 0,5%, glucosa al 2%) en un
matraz de 500 ml con aproximadamente 5 x 10^{7} esporas de T.
reesei GC69 (la cepa derivada de pyr4). A continuación,
se incubó el matraz a 37ºC con agitación durante aproximadamente 16
horas. El micelio se recogió mediante centrifugación a 2,750 x g.
el micelio recogido se lavó posteriormente en una solución de
sorbitol 1,2 M y se resuspendió en 40 ml de una solución que
contenía 5 mg/ml de una solución de NovozymR 234 (que es el nombre
comercial para un sistema enzimático multicomponente que contiene
1,3-alfa-glucanasa,
1,3-beta-glucanasa, laminarinasa,
xilanasa, quitinasa y proteasa de Novo Biolabs, Danbury, Ct.);
5 mg/ml MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 0,5 mg/ml de
albúmina de suero bovino; 1,2 M de sorbitol. Se extrajeron los
protoplastos de la debris celular mediante la filtración a través de
Miracloth (Calbiochem Corp, La Jolla, CA) y se recogieron mediante
centrifugación a 2,000 x g. Los protoplastos se lavaron tres veces
en sorbitol 1,2 M y una vez en sorbitol 1,2 M, CaCl_{2} 50 mM, se
centrifugaron y su resuspendieron a una densidad de aproximadamente
2 x 10^{8} protoplastos por ml de sorbitol 1,2 M, CaCl_{2} 50
mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 200 ml de la suspensión de
protoplastos preparada en el ejemplo 3 a 20 ml de
p\DeltaCBHIpyr4 digerido con EcoRI (preparado en el
ejemplo 2) en tampón TE (Tris 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM) y 50 ml de
una solución de polietilenglicol (PEG) que contenía PEG 4000 al
25%, KCl 0,6 M y CaCl_{2} 50 mM. Esta mezcla se incubó en hielo
durante 20 minutos. Después de este periodo de incubación, se
añadieron a la misma 2, 0 ml de la solución de PEG identificada
anteriormente, la solución se mezcló posteriormente y se incubó a
temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de esta segunda
incubación, se añadieron a la misma 4,0 ml de una solución que
contenía sorbitol 1,2 M y CaCl_{2} 50 mM y esta solución se mezcló
posteriormente. A continuación, la solución de protoplastos se
añadió inmediatamente a alícuotas fundidas de Medio N de Vogel (3 g
de citrato de sodio, 5 gramos de KH_{2}PO_{4}, 2 gramos
NH_{4}NO_{3}, 0,2 gramos MgSO_{4}.7H_{2}O, 0,1 gramos de
CaCl_{2}.2H_{2}O, 5 mg de \alpha-biotina, 5 mg
de ácido cítrico, 5 mg ZnSO_{4}.7H_{2}O, 1 mg de
Fe(NH_{4})_{2}\cdot6H_{2}O, 0,25 mg de
CuSO_{4}.5H_{2}O, 50 mg de MnSO_{4}.4H_{2}O por litro) que
contenía adicionalmente glucosa al 1%, sorbitol 1,2 M y agarosa al
1%. La mezcla de protoplastos/medio se vertió a continuación sobre
un medio sólido que contenía el mismo medio de Vogel indicado
anteriormente. No hubo uridina presente en el medio y, por tanto,
sólo colonias transformadas eran capaces de crecer como resultado
de la complementación de la mutación de pyr4 de la cepa GC69 por el
inserto del gen pyr4 de tipo salvaje en
p\DeltaCBHIpyr4. Estas colonias se transfirieron
posteriormente y se purificaron en un medio N de Vogel que contenía
como aditivo, glucosa al 1% y se eligieron transformantes estables
para el análisis posterior.
En esta etapa, los transformantes estables se
diferenciaron de los transformantes no estables por su velocidad de
crecimiento más rápido y la formación de colonias circulares con un
perfil liso en lugar de irregular en un medio de cultivo sólido que
carecía de uridina. En algunos casos, se realizó un análisis
posterior de estabilidad mediante el crecimiento de los
transformantes en un medio sólido no selectivo (es decir, que
contiene uridina), la recogida de esporas de este medio y la
determinación del porcentaje de estas esporas que posteriormente
germinarán y crecerán en un medio selectivo que carecía de
uridina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ADN de los transformantes obtenidos en
el Ejemplo 4 después de crecer en medio N de Vogel líquido que
contenía glucosa al 1%. Estas muestras de ADN transformante se
cortaron a continuación con una enzima de restricción PstI y
se sometieron a electroforesis en gel de agarosa. A continuación, el
gel se transfirió a un filtro de membrana Nytran y se hibridó con
una sonda p\DeltaCBHIpyr4 marcada con ^{32}P. La sonda
se seleccionó para identificar el gen cbh1 nativo como un
fragmento PstI de 6,5 kb, el gen pyr4 nativo y
cualquier secuencia de ADN derivada del fragmento de ADN
transformante.
Las bandas radioactivas de la hibridación se
visualizaron mediante autorradiografía. La autorradiografía se
observa en la figura 3. Se desarrollaron cinco muestras tal como se
ha descrito anteriormente, por tanto las muestras A, B, C, d y E.
El carril E es la cepa GC69 no transformada y se utilizó como
control en el análisis presente. Los carriles A-D
representan los transformantes obtenidos por los métodos descritos
anteriormente. Los números en la cara de la autorradiografía
representan los tamaños de los marcadores de peso molecular. Tal
como se puede observar a partir de esta autorradiografía, el carril
D no contiene la banda de CBH I de 6,5 kb, indicando que este gen
se ha eliminado totalmente en el transformante mediante la
integración del fragmento de ADN en el gen cbh1. La cepa con
cbh1 eliminado se denomina P37P\DeltaCBHI. La figura 2
representa la eliminación del gen cbh1 de T. reesei
mediante la integración a través de un doble cruzamiento del
fragmento EcoRI más grande p\DeltaCBHIpyr4 en el
locus cbh1 en uno de los cromosomas de T. reesei. Los
otros transformantes analizados parecen idénticos a la cepa de
control no transformada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó el mismo procedimiento en este
ejemplo que en el Ejemplo 5, a excepción de que la sonda utilizada
se cambió a una sonda pIntCBHI marcada con ^{32}P. Esta sonda es
un plásmido de tipo pUC que contenía un fragmento BgIII de 2 kb del
locus cbh1 en la región que se eliminó en
pUC4K::cbh1\DeltaH/H. Se desarrollaron dos muestras en
este ejemplo incluyendo un control, la muestra A, que es la cepa
GC69 no transformada y el transformante P37P\DeltaCBHI, muestra
B. Tal como se puede observar en la figura 4, la muestra A contenía
el gen cbh1, tal como se indica por la banda a 6,5 kb; aunque
el transformante, la muestra B, no contiene esta banda de 6,5 kb
y, por tanto, no contiene el gen cbh1 y no contiene ninguna
secuencia derivada de l plásmido pUC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon las esporas de la cepa
P37P\DeltaCBHI producida en 50 ml de un medio basal de Trichoderma
que contenía glucosa al 1%, (NH_{4})_{2}SO_{4} al
0,14%, KH_{2}PO_{4} al 0,2%, MgSO_{4} al 0,03%, urea al
0,03%, bactotriptona al 0,75%, Tween 80 al 0,05%,
CuSO_{4}.5H_{2}O al 0,000016%, FeS_{4}.7H_{2}O al 0,001%,
ZnSO_{4}.7H_{2}O al 0,000128%, Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O al
0,0000054%, MnCl.4H_{2}O al 0,0000007%). El medio se incubó con
agitación en un matraz de 250 ml a 37ºC durante aproximadamente 48
horas. El micelio resultante se recogió mediante la filtración a
través de Miracloth (Calbiochem Corp.) y se lavó dos o tres veces
con fosfato de potasio 17 mM. El micelio se suspendió finalmente en
fosfato de potasio 17 mM con soforosa 1 mM y se incubó
posteriormente durante 24 horas a 30ºC con agitación. A
continuación, se recogió el sobrenadante de estos cultivos y se
descartó el micelio. Se analizaron muestras del sobrenadante de
cultivo mediante enfoque isoeléctrico utilizando un sistema
Pharmacia Phastgel y geles de premoldeado a pH 3-9
según las instrucciones del fabricante. El gel se tiñó con tinción
de plata para visualizar las bandas de proteína. La banda
correspondiente a la proteína cbh1 estaba ausente de la
muestra derivada de la cepa P37P\DeltaCBHI, tal como se muestra
en la figura 5. Este gel de enfoque isoeléctrico muestra diversas
proteínas en diferentes cultivos con sobrenadante de T.
reesei. El carril A es CBHI parcialmente purificada; el carril
B es el sobrenadante de un cultivo de T. reesei no
transformado; el carril C es el sobrenadante de la cepa
P37P\DeltaCBHI producido según los métodos de la presente
invención. La posición de varios componentes de celulasa se marca
como CBHI, CBHII, EGI, EGII, y EGIII. Dado que CBHI constituye el
50% de la proteína extracelular total, es la proteína secretada
principal y, por tanto, es la banda más oscura en el gel. Este gel
de enfoque isoeléctrico muestra claramente el agotamiento de la
proteína CBHI en la cepa P37P\DeltaCBHI.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen cbh2 de T. reesei, que
codifica la proteína CBHII, se clonó como el fragmento de
EcoRI de 4,1 kb (Chen et al., 1987, Biotechnology,
5:274-278). Este fragmento de 4,1 kb se insertó ente
los sitios EcoRI de pUC4XL. Este último plásmido es un
derivado de pUC (construido por R.M. Berka, Genencor International
Inc.) que contiene un sitio de clonación múltiple con un patrón
simétrico de sitios de endonucleasas de restricción dispuestos en
el orden mostrado aquí: EcoRI, BamHI, SacI,
smaI, HindIII, XhoI, BglII, ClaI,
BglII, XhoI, HindIII, smaI,
SacI, BamHI, EcoRI. Utilizando los métodos
conocidos en la técnica, se construyó un plásmido pP\DeltaCBHII
(Figura 6B), en el que se eliminó una región central de 1,7 kb de
este gen entre un sitio HindIII (a 74 pb 3' del sitio de
inicio de la traducción de CBHII) y un sitio ClaI (a 265 pb 3' del
último codón de CBHII) y se sustituyó por un fragmento de ADN
HindIII-ClaI de 1,6 kb que contenía el gen
pyr4 de T. reesei.
El gen pyr4 de T. reesei se
escindió de pTyr2 (véase el Ejemplo 2) en un fragmento
NheI-SphI de 1,6 kb y se insertó entre los sitios
SphI y XbaI de pUC219 (véase el ejemplo 23) para crear
p219M (Smith et al., 1991, Curr. Genet 19 p.
27-33). A continuación, se eliminó el gen
pyr4 como un fragmento HindIII-ClaI
que tenía siete pb de ADN en un extreme y seis pb de ADN en el otro
extremo derivado del sitio de clonación múltiple de pUC219 y se
insertó en los sitios HindIII y ClaI del gen cbh2 para
formar el plásmido pP\DeltaCBHII (véase la figura 6B).
La digestión de este plásmido con EcoRI
liberará un fragmento que tenía 0,7 kb de ADN flanqueante del locus
de cbh2 en un extremo, 1,7 kb de ADN flanqueante del locus de
cbh2 en el otro extremo y el gen pyr4 de T.
reesei en el centro.
\vskip1.000000\baselineskip
Los protoplastos de la cepa GC69 se generará y
transformará con pP\DeltaCBHII digerido con EcoRI según
los métodos indicados en los ejemplos 3 y 4. El ADN de los
transformantes se digerirá con EcoRI y Asp178 y se someterán
a electroforesis en gel de agarosa. El ADN del gel de transferirá a
un filtro de membrana y se hibridará con pP\DeltaCBHII marcado
con ^{32}P según los métodos del Ejemplo 11. Se identificarán los
transformantes que tienen una única copia del fragmento EcoRI
de pP\DeltaCBHII integrado con precisión en el locus de
cbh2. Los transformantes también crecerán en matraces de
agitación como en el ejemplo 7 y se examinará la proteína en los
sobrenadantes de cultivo mediante enfoque isoeléctrico. De esta
manera, se generarán transformantes de GC69 de T. reesei que
no producen la proteína CBHII.
\newpage
Las esporas del transformante (P37P\DeltaCBHI)
en el que se eliminó el gen cbh1 se esparcieron sobre un
medio que contenía FOA. Posteriormente se obtuvo un derivado de
pyr4 de este transformante utilizando los métodos del
ejemplo 1. Esta cepa de pyr4 se denominó
P37P\DeltaCBHIPyr-26.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron protoplastos de la cepa
P37P\DeltaCBHIPyr-26 y se transformaron con
pP\DeltaCBHII digerido con EcoRI según los métodos
indicados en los Ejemplos 3 y 4.
Se cultivaron transformantes estables
purificados en matraces de agitación como en el ejemplo 7 y se
examinó la proteína en los sobrenadantes de cultivo mediante enfoque
isoeléctrico. Se identificó un transformante (denominado
P37P\Delta\DeltaCBH67) que no producía ninguna proteína CBHII.
El carril D de la figura 5 muestra el sobrenadante de un
transformante en el que se eliminaron los genes cbh1 y
cbh2 producidos según los métodos de la presente
invención.
invención.
Se extrajo ADN de la cepa
P37P\Delta\DeltaCBH67, se digirió con EcoRI y Asp718, y
se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El ADN de este gel
se transfirió a un filtro de membrana y se hibridó con
pP\DeltaCBHII marcado con ^{32}P (figura 7). El carril A de la
figura 7 muestra el patrón de hibridación observado para ADN de una
cepa de T. reesei no transformada. Se observó el fragmento de
EcoRI de 4,1 kb que contenía el gen cbh2 de tipo
salvaje. El carril B muestra el patrón de hibridación observado para
la cepa P37P\Delta\DeltaCBH67. La banda única de 4,1 kb se
eliminó y se sustituyó por dos bandas de aproximadamente 0,9 y 31
kb. Éste es el patrón esperado si se integraba una copia única del
fragmento EcoRI de pP\DeltaCBHII de manera precisa en el
locus de cbh2.
También se digirieron las mismas muestras de ADN
con EcoRI y se realizó un análisis de transferencia Southern
al igual que antes. En este ejemplo, la sonda era pIntCBHII marcada
con ^{32}P. este plásmido contiene una parte de la secuencia
codificante del gen cbh2 de la que se eliminó el segmento
del gen cbh2 en el plásmido pP\DeltaCBHII. No se observó
hibridación con ADN de la cepa P37P\Delta\DeltaCBH67 mostrando
que el gen cbh2 se eliminó y que no había secuencias
derivadas del plásmido pUC presentes en esta cepa.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen eg11 de T. reesei, que codifica
EGI, se clonó como un fragmento de HindIII de 4,2 kb de ADN
genómico de la cepa RL-P37 mediante hibridación con
oligonucleótidos sintetizados según la secuencia publicada
(Penttila et al., 1986, Gene 45:253-263; van
Arsdell et al., 1987, Bio/Technology
5:60-64). Se cogió un fragmento
HindIII-BamHI de 3,6 kb de este clon y se unió con un
fragmento HindIII-BamHI de 1,6 kb que contenía el gen
pyr4 de T. reesei obtenido de pTpyr2 (véase el Ejemplo
2) y pUC218 (idéntico a pUC219, véase el ejemplo 23, pero con el
sitio de clonación múltiple en la orientación opuesta) cortado con
HindIII para producir el plásmido pEGIpyr4 (Figura 8). La
digestión de pEGIpvr4 con HindIII liberaría un fragmento de
ADN que contenía sólo ADN genómico de T. reesei (los genes
egl1 y pyr4), excepto 24 pb del ADN sintético
secuenciado entre los dos genes y 6 pb de ADN sintético secuenciado
en un extremo (véase la figura 8).
El ejemplo 13 demuestra el aislamiento de los
componentes de la Celulasa Citolasa 123 (una composición completa
de celulasas fúngicas completa obtenida Trichoderma reesei y
disponible en Genencor International, Inc., South San Francisco,
CA) a través de procesos de purificación.
\newpage
Se fraccionó la celulasa CITOLASA 123 de la
siguiente manera. La distribución normal de los componentes
celulasa en este sistema de celulasas es la siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
El fraccionamiento se realizó utilizando
columnas que contenían las siguientes resinas: resina de filtración
en gel Sephadex G-25 de Sigma Chemical Company (St.
Louis, Mo), resina de intercambio aniónico QATrisacryl M y resina
de intercambio catiónico SPTrisacryl M de IBF Biotechnics (Savage,
Md). Se desaló la celulasa CITOLASA 123, 0,5 g, utilizando una
columna de 3 litros de la resina de filtración en gel Sephadex
G-25 con tampón de fosfato de sodio 10 mM a pH 6,8.
A continuación, la solución desalada se cargó en una columna de 20
ml de resina de intercambio aniónico QA Trisacryl M. La fracción
unida en esta columna contenía CBH I y EG I. Estos componentes se
separaron mediante una elución en gradiente utilizando un gradiente
acuoso que contenía de 0 a aproximadamente 500 mM de cloruro de
sodio. La fracción no unida en esta columna contenía CBH II y EG
II. Estas fracciones se desalaron utilizando una columna de resina
de filtración en gel Sephadex G-25 equilibrada con
citrato de sodio 10 mM, pH 3.3. Esta solución, 200 ml, se cargó a
continuación en una columna de 20 ml de resina de intercambio
catiónico SP Trisacryl M. Se eluyeron por separado CBH II y EG II
utilizando un gradiente acuoso que contenía de 0 a aproximadamente
200 mM de cloruro de sodio.
Siguiendo procedimientos similares a los del
Ejemplo 13 anterior, otros sistemas de celulasas que se pueden
separar en sus componentes incluyen CELLUCAST (disponible en Novo
Industry, Copenhagen, Dinamarca), RAPIDASA (disponible en Gist
Brocades, N.V., Delft, Holanda), y sistemas de celulasas derivados
de Trichoderma koningii, Penicillum sp. y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo 13 anterior demostraba el aislamiento
de varios componentes de la Celulasa Citolasa 123. Sin embargo,
debido a que EG III está presente en cantidades muy pequeñas en la
Celulasa Citolasa 123, se utilizaron los siguientes procedimientos
para aislar este componente,
Se calentaron cien litros de filtrado de
celulasa sin células hasta aproximadamente 30ºC. El material
calentado se formó con PEG 8000 (polietilenglicol, PM de
aproximadamente 8000) al 4% p/v y aproximadamente 10% p/v de
sulfato de sodio anhidro. La mezcla formó una mezcla líquida de dos
fases. Las fases se separaron utilizando una centrífuga de pilas
de discos SA-1. Las fases se analizaron utilizando
geles de enfoque isoeléctrico con tinción de plata. El
fraccionamiento y enriquecimiento se obtuvieron para EG III y
xilanasa. La composición recuperada contenía aproximadamente del 20
al 50 por ciento en peso de EG III.
Con respecto al procedimiento anterior, el uso
de un polietilenglicol que tiene un peso molecular sustancialmente
inferior a 8000 produjo una separación inadecuada; mientras que, el
uso de polietilenglicol que tiene un peso molecular sustancialmente
superior a aproximadamente 8000 dio lugar a la exclusión de las
enzimas deseadas en la composición recuperada. Con respecto a la
cantidad de sulfato de sodio, los niveles de sulfato de sodio
sustancialmente superiores a aproximadamente un 10% p/v causaron
problemas de precipitación; mientras que niveles de sulfato de
sodio inferiores a aproximadamente un 10% peso/vol produjo una
separación pobre o la solución permaneció en una única fase.
La purificación de EGIII se realiza mediante
fraccionamiento de una composición completa de celulasa fúngicas
(celulasa CITOLASA 123, disponible comercialmente en Genencor
International, South San Francisco, CA) que es producida por
Trichoderma reesei de tipo salvaje. Específicamente, el
fraccionamiento se realiza utilizando columnas que contienen las
siguientes resinas: resina de filtración en gel Sephadex
G-25 de Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo),
resina de intercambio aniónico QA Trisacryl M y resina de
intercambio catiónico SP TrisacrylM de IBF Biotechnics (Savage,
Md). La celulasa CITOLASA 123, 0,5 g, se desala utilizando una
columna de 3 litros de la resina de filtración en gel Sephadex
G-25 con tampón fosfato de sodio 10 mM a pH 6,8. La
solución desalada se carga a continuación en una columna de 20 ml de
una resina de intercambio aniónico QA Trisacryl M. La fracción
unida en esta columna contenía CBH I y EG I. La fracción no unida en
esta columna contiene CBH II, EG II y EG III. Estas fracciones se
desalan utilizando una columna de resina de filtración en gel
Sephadex G-25 equilibrada con citrato de sodio 10
mM, pH 4,5. Esta solución, 200 ml, se carga a continuación en una
columna de 20 ml de resina de intercambio catiónico SP Trisacryl M.
La EG III se eluyó con 100 mL de una solución acuosa de cloruro
sódico 200 mM.
Con el fin de aumentar la eficacia del
aislamiento de EG III, puede ser deseable utilizar Trichoderma
reesei modificada genéticamente para expresar EG III y/o para
que sea incapaz de producir uno o más de los componentes EG I, EG
II, CBH I y/o CBH II. Esto necesariamente conducirá al aislamiento
más eficaz de EG III mediante, por ejemplo, el fraccionamiento y/o
la extracción con PEG tal como se ha descrito anteriormente.
Así mismo, puede ser deseable para las
composiciones de EG III descritas anteriormente que sean purificadas
adicionalmente para proporcionar composiciones de EG III
sustancialmente puras, es decir, composiciones que contienen EG III
en más de aproximadamente un 80 por ciento en peso de proteína. Por
ejemplo, dicha proteína EG III sustancialmente pura se puede
obtener mediante la utilización de material obtenido del
procedimiento A en el procedimiento B o viceversa. Un método
particular para purificar adicionalmente EG III es mediante el
fraccionamiento adicional de una muestra de EG III obtenida en la
parte b) de este ejemplo 14. La fracción posterior se usó en un
sistema FPLC utilizando una columna
Mono-S-HR 5/5 (disponible de
Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). El sistema FPLC
consiste en un controlador de cromatografía líquida, 2 bombas, un
monitor de doble vía, un colector de la fracción y un registrador
gráfico (todos ellos disponibles en Pharmacia LKB Biotechnology,
Piscataway, NJ). El fraccionamiento se realizó mediante la
desalación de 5 ml de la muestra de EG III preparada en la parte b)
de este Ejemplo 14 con una columna Sephadex G-25 de
20 ml que se había equilibrada previamente con citrato de sodio 10
mM, pH 4. A continuación, la columna se eluyó con un gradiente
acuoso de NaCl 0-200 mM a una velocidad de 0,5
ml/minuto con muestras recogidas en fracciones de 1 ml. Se recuperó
la EG III en las fracciones 10 y 11 y se determinó que era más de un
90% pura mediante electroforesis en gel de SDS. La EG III de esta
pureza es adecuada para determinar la secuencia de aminoácidos
N-terminal mediante técnicas conocidas.
Los componentes de EG III, así como EG I y EG
II, sustancialmente puros, purificados en el Ejemplo 13 anterior se
pueden utilizar individualmente o en mezclas en los métodos de la
presente invención. Estos componentes de EG tienen las siguientes
características:
1. pH óptimo determinado mediante actividad
RBB-CMC como en el ejemplo 15 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de una mezcla de estos componentes en la
práctica de esta invención puede proporcionar una respuesta
sinérgica en la mejora de la suavidad, la retención/restauración del
color y/o el tacto en comparación con un único componente. Por otro
lado, el uso de un único componente en la práctica de la presente
invención puede ser más estable o tener un espectro más amplio de
actividad sobre un intervalo de pH. Por ejemplo, el ejemplo 15
siguiente muestra que EG III tiene una actividad considerable contra
RBB-CMC en condiciones alcalinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó el siguiente procedimiento para
determinar los perfiles de pH de dos composiciones diferentes de
celulasas. La primera composición de celulasas era una composición
de celulasas con CBH I y CBH II eliminadas preparadas a partir de
Trichoderma reesei modificada genéticamente de una forma
similar a la descrita anteriormente para que sea incapaz de
producir los componentes CBH I y CBH II. En tanto en cuanto esta
composición de celulasas no contiene CBH I y CBH II que comprenden
generalmente desde aproximadamente un 58 a 70 por ciento de una
composición de celulasas derivada de Trichoderma reesei, esta
composición de celulasas está necesariamente enriquecida en los
componentes EG, es decir, EG I, EG II, EG III y similares.
La segunda composición de celulasas era una
fracción pura en aproximadamente 20-40% de EG III
aislada de una composición de celulasas derivada de Trichoderma
reesei mediante métodos de purificación similares a la parte b)
del Ejemplo 14.
La actividad de estas composiciones de celulasas
se determinó a 40ºC y las determinaciones se realizaron utilizando
los siguientes procedimientos.
Añadir de 5 a 20 ml de una solución de enzimas
apropiada a una concentración suficiente para proporcionar la
cantidad necesaria de enzima en la solución final. Añadir 250 ml de
RBB-CMC al 2 por ciento en peso (Azul brillante de
Remazol R-Carboximetil-celulosa -
disponible comercialmente en MegaZyme, 6 Altona Place, North Rocks,
N.S.W. 2151, Australia) en un tampón de citrato/fosfato 0,05M a pH
4, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 y 8.
Mezclar con agitación e incubar a 40ºC durante
30 minutos. Enfriar en un baño de hielo durante 5 a 10 minutos.
Añadir 1000 ml de celosolve de metilo que contenía acetato de sodio
0,3 M y acetato de zinc 0,02 m. Mezclas con agitación y dejar
reposar durante 5-10 minutos. Centrifugar y verter
el sobrenadante en cubetas. Se determinó la actividad enzimática
relativa midiendo la densidad óptica (DO) de la solución en cada
cubeta a 590 nm. Niveles más elevados de densidad óptica
corresponden a niveles más elevados de actividad enzimática.
Los resultados de este análisis se establecen en
la figura 9 que ilustra la actividad relativa de la composición de
células con CBH I y II eliminadas en comparación con la composición
de celulasas de EGIII. A partir de esta figura, se observa que la
composición de celulasas con CBH I y CBH II eliminadas posee una
actividad celulolítica óptima contra RBB-CMC a pH
próximo a 5,5 y tiene cierta actividad a pHs alcalinos, es decir, a
pHs desde por encima de 7 a 8. Por otro lado, la composición de
celulasas enriquecida en EG III posee actividad celulolítica a pH
aproximadamente 5,5-6 y posee actividad
significativa a pHs alcalinos.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este ejemplo es examinar la
capacidad de diferentes composiciones de celulasas de reducir la
resistencia de tejidos que contienen algodón. Debido a que la
actividad de la mayoría de componentes de celulasas derivadas de
Trichoderma reesei es máxima a pH 5 o próximo al mismo, los
resultados de pérdida de resistencia serán más evidentes cuando el
análisis se realiza a aproximadamente este pH. Sin embargo, se cree
que los resultados conseguidos a pH 5 se correlacionan con
resultados de la pérdida de resistencia que tendrían lugar a otros
pHs y, por consiguiente, son indicativos de la capacidad relativa de
pérdida de resistencia de los componentes de celulasas
analizados.
Específicamente, en este ejemplo, la primera
composición de celulasas analizada era una composición completa de
celulasas fúngicas (celulasa CITOLASA 123, disponible comercialmente
en Genencor International, South San Francisco, CA) producida por
la Trichoderma reesei de tipo salvaje y se identifica como
GC010.
La segunda composición de celulasas analizada
era una composición de celulasas con la CBH II eliminada preparada
a partir de Trichoderma reesei modificada genéticamente de
manera similar a los Ejemplos 1-12 anteriores y
20-28 a continuación para que sea incapaz de
expresar CBH II y se identifica como CBHIId. En la medida que CBH
II comprenda hasta aproximadamente un 15 por ciento de la
composición de celulasas, la eliminación de este componente da
lugar a niveles de enriquecimiento de CBH I y todos los componentes
de EG.
La tercera composición de celulasas analizada
era una composición de celulasas con la CBH I y CBH II eliminadas
preparada a partir de Trichoderma reesei modificada
genéticamente de una manera similar a la descrita anteriormente
para que sea incapaz de expresar CBH I y CBH II y se identifica como
CBHI/IId. En la medida que CBH I y CBH II comprendan hasta
aproximadamente un 70 por ciento de la composición de celulasas, la
eliminación de este componente da lugar a niveles enriquecidos de
todos los componentes de EG.
La última composición de celulasas analizada era
una composición de celulasas con la CBH I eliminada preparada a
partir de Trichoderma reesei modificada genéticamente
genéticamente de una manera similar a la descrita anteriormente
para que sea incapaz de expresar CBH I y se identifica como CBHId.
En la medida que CBH I comprenda hasta aproximadamente un 55 por
ciento de la composición de celulasas, la eliminación de este
componente da lugar a niveles enriquecidos de CBH II y todos los
componentes de EG.
Las composiciones de celulasas descritas
anteriormente se analizaron por su efecto en la pérdida de
resistencia del tejido que contenía algodón en un
"launderometer". Las composiciones se normalizaron en primer
lugar de manera que se utilizaron cantidades iguales de componentes
de EG. A continuación, cada composición de celulasas se añadió a
soluciones separadas de 400 ml de un tampón de citrato/fosfato 20
mM, se ajustó a pH 5, y que contenían 0,5 ml de un tensoactivo no
iónico. Cada una de las soluciones resultantes se añadió a
continuación a un recipiente separado del "launderometer". A
estos recipientes se añadió una cantidad de bolitas para facilitar
la pérdida de resistencia, así como un tejido de algodón de 16
pulgadas x 20 pulgadas (algodón tejido 100%, disponible como Style
No. 467 de Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ
08846). A continuación, se cerró el recipiente y se bajó el
recipiente en el baño del "launderometer" que se mantuvo a
43ºC. A continuación, se giró el recipiente en el baño a una
velocidad de por lo menos aproximadamente 40 revoluciones por
minuto (rpm) durante aproximadamente 1 hora. Posteriormente, se
extrae la prenda, se enjuaga bien y se seca en un secador
estándar.
Con el fin de maximizar los resultados de la
pérdida de resistencia, se repitió el procedimiento anterior dos
veces más y después del tercer tratamiento, se extrajeron los
tejidos de algodón y se analizaron por la pérdida de resistencia.
La pérdida de resistencia se midió determinando la resistencia a la
tensión en la dirección de relleno ("FTS") utilizando un
Tester Instron y los resultados se compararon con la FTS del tejido
tratado en la misma solución con la excepción de que no se añadió
celulasa. Los resultados de este análisis se describen como el % de
pérdida de resistencia que se determina de la siguiente manera:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de este análisis se establecen en
la figura 10 que muestra que las composiciones que contienen CBH I,
es decir, la celulasa completa (GC010) y la celulasa con CBH II
eliminada, poseían la máxima pérdida de tensión, mientras que las
composiciones que no contenían CBH I poseían una pérdida de
resistencia significativamente reducida en comparación con la
celulasa completa y la celulasa con la CBH II eliminada. A partir
de estos resultados, se observa que la presencia de CBH I en una
composición de celulasas transmite una mayor pérdida de tensión a
la composición en comparación con una composición similar que no
contiene CBH I.
Así mismo, estos resultados muestran que la CBH
II juega cierto papel en la pérdida de resistencia.
Por consiguiente, en vista de estos resultados,
cuando se desean composiciones de celulasas resistentes a la
pérdida de resistencia, dichas composiciones deben estar libres de
todos los componentes de celulasa de tipo CBH I y preferiblemente,
todos los componentes de celulasas de tipo CBH. En este aspecto, se
contempla que las composiciones de celulasas enriquecidas en EG
darán lugar a una pérdida de resistencia incluso menor a pH \geq
7 que los resultados observados a pH 5 mostrados en la figura
10.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la capacidad de celulasa enriquecida
en EG para restaurar el color en tejidos que contienen algodón en
los siguientes experimentos. Específicamente, la restauración del
color de un tejido de algodón tejido surge de la acumulación sobre
el tejido de fibras de la superficie durante un periodo de tiempo.
Estas fibras provocan una apariencia descolorida y apagada para el
tejido y, por consiguiente, la eliminación de estas fibras es un
prerequisito necesario para restaurar el color brillante original en
el tejido. En vista de lo anterior, estos experimentos determinan
la capacidad de una composición de celulasas de restaurar el color
midiendo la capacidad de la composición de celulasas de eliminar las
fibras de la superficie.
El primer experimento mide la capacidad de un
sistema completo de celulasas (celulasa CITOLASA 123, disponible
comercialmente en Genencor International, South San Francisco, CA)
producido por Trichoderma reesei de tipo salvaje para
eliminar las fibras de la superficie de un tejido que contiene
algodón a lo largo de varios pHs. Esta celulasa se analizó por su
capacidad de eliminar fibras de la superficie en un
"launderometer". Se añadió una cantidad apropiada de celulasa
para proporcionar 25 ppm o 100 ppm de celulasa en la composición
final para separar las soluciones de 400 ml de un tampón
citrato/fosfato 20 mM que contenía 0,5 ml de un tensoactivo no
iónico. Las muestras se prepararon y se ajustaron para proporcionar
muestras a pH 5, pH 6, pH 7 y pH 7,5. Cada una de las soluciones
resultantes se añadió a continuación a un recipiente separado del
"launderometer". En estos recipientes se añadieron una
cantidad de bolitas para facilitar la eliminación de fibras, así
como un tejido de algodón de 7 pulgadas x 5 pulgadas (algodón
tejido 100%, disponible como Style No. 439W de Test Fabrics, Inc.,
200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846). A continuación, el
recipiente se cerró y se bajó al baño del "launderometer" que
se mantuvo a 43ºC. A continuación, se giró el recipiente en el baño
a una velocidad de por lo menos aproximadamente 40 revoluciones por
minuto (rpms) durante aproximadamente 1 hora. Posteriormente, se
extrae la prenda, se enjuaga bien y se seca en un secador
estándar.
estándar.
\newpage
Los tejidos tratados de esta manera se
analizaron por la eliminación de fibras mediante la evaluación en
un análisis en panel. En particular, los tejidos codificados (es
decir no marcados) fueron calificados por niveles de fibra por 6
individuos. Los tejidos se evaluaron visualmente por las fibras de
la superficie y se calificaron en una escala de 0 a 6. La escala
tiene seis patrones para permitir comparaciones significativas. Los
patrones son los siguientes:
Al tejido a calificar se le puso una
calificación que coincidía de manera más próxima con uno de los
patrones. Después de un análisis completo de los tejidos, se
añadieron los valores asignados a cada tejido por todos los
individuos y generó un valor promedio.
Los resultados de este análisis se establecen en
la figura 11. Específicamente, la figura 11 ilustra que al mismo
pH, se observa una respuesta dependiente de la dosis en la cantidad
de fibras eliminadas. Es decir, que al mismo pH, los tejidos
tratados con más celulasa proporcionaron niveles más elevados de
eliminación de fibra en comparación con tejidos tratados con menos
celulasa. Además, los resultados de esta figura demuestran que a
pHs más elevados, aún se puede realizar la eliminación de fibras
simplemente utilizando concentraciones más elevadas de
celulasa.
En un segundo experimento, se compararon dos
composiciones de celulasas diferentes por la capacidad de eliminar
fibras. Específicamente, la primera composición de celulasas
analizada era un sistema completo de celulasas (celulasa CITOLASA
123, disponible comercialmente en Genencor International, South San
Francisco, CA) producido por Trichoderma reesei de tipo
salvaje y se identifica como GC010.
La segunda composición de celulasas analizada
era una composición de celulasas con CBH I y CBH II eliminadas
preparada a partir de Trichoderma reesei modificada
genéticamente de una manera similar a la descrita anteriormente
para que sea incapaz de producir CBHI y CBH II y se identifica como
CBHI/IId. En la medida de que CBH I y CBH II comprenden hasta
aproximadamente un 70 por ciento de la composición de celulasas, la
eliminación de este componente da lugar a niveles enriquecidos de
todos los componentes de EG.
Las composiciones de celulasas se normalizaron
de manera que se utilizaban cantidades similares de componentes de
EG. Estas composiciones se analizaron por su capacidad de eliminar
fibras de la superficie en un "launderometer". Se añadió una
cantidad apropiada de celulasa para proporcionar las concentraciones
requeridas de componentes de EG en las composiciones finales a
soluciones separadas de 400 ml de un tampón de citrato/fosfato 20
mM que contenía 0,5 ml de un tensoactivo no iónico. Las muestras se
prepararon y se ajustaron a pH 5. Cada una de las soluciones
resultantes se añadió a continuación a un recipiente separado de un
"launderometer". En estos recipientes se añadieron una cantidad
de bolitas para facilitar la eliminación de fibras, así como un
tejido de algodón de 7 pulgadas x 5 pulgadas (algodón tejido 100%,
disponible como Style No. 439W de Test Fabrics, Inc., 200 Blackford
Ave., Middlesex, NJ 08846). A continuación, el recipiente se cerró
y se bajó al baño del "launderometer" que se mantuvo a 43ºC. A
continuación, se giró el recipiente en el baño a una velocidad de
por lo menos aproximadamente 40 revoluciones por minuto (rpms)
durante aproximadamente 1 hora. Posteriormente, se extrae la
prenda, se enjuaga bien y se seca en un secador estándar.
\newpage
Los tejidos tratados de esta manera se
analizaron por la eliminación de fibras mediante la evaluación en
un análisis en panel descrito anteriormente. Los resultados de este
análisis se establecen en la figura 12. Específicamente, la figura
12 ilustra que las composiciones de celulasas tanto de GC010 como
CBH I/IId produjeron resultados de eliminación de fibra
sustancialmente idénticos cuando se utilizan cantidades iguales de
EG. Estos resultados sugieren que son los componentes de EG los que
proporcionan la eliminación de fibras. Estos resultados acoplados
con los resultados de la figura 11 demuestran que los componentes de
EG pueden eliminar fibras incluso en condiciones alcalinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo es adicional al ejemplo 17 y
corrobora que los componentes de tipo CBH no son necesarios para la
restauración del color. El objetivo de este ejemplo es examinar la
capacidad de las composiciones de celulasas deficientes en
componentes del tipo CBH para restaurar el color en tejidos que
contienen algodón. Debido a que la actividad de la mayoría de
componentes de EG derivados de Trichoderma reesei es máxima a
un pH 5 o próximo al mismo, los resultados de restauración del
color serán más evidentes cuando el análisis se realiza a
aproximadamente este pH. Sin embargo, se cree que los resultados
conseguidos a pH 5 se correlacionan con resultados de la
restauración de color que tendrían lugar a otros pHs y, por
consiguiente, son indicativos de la capacidad relativa de la
restauración del color de los componentes de celulasas
analizados.
Específicamente, la composición de celulasas
utilizada en este ejemplo era una composición de celulasas con la
CBH I y CBH II eliminadas preparada a partir de Trichoderma
reesei modificada genéticamente de una manera similar a la
descrita anteriormente para que sea incapaz de expresar CBH I y CBH
II. En la medida que CBH I y CBH II comprendan hasta
aproximadamente un 70 por ciento de la composición de celulasas, la
eliminación de este componente da lugar a niveles enriquecidos de
todos los componentes de EG.
El análisis se realizó mediante la adición de
una concentración suficiente de esta composición de celulasas a un
tampón citrato/fosfato 50 mM para proporcionar 500 ppm de celulasa.
La solución se ajustó a pH 5 y contenía un 0,1 por ciento en peso
de tensoactivo no iónico (Grescoterg GL100 - disponible
comercialmente en Gresco Mfg., Thomasville, NC 27360). A
continuación, se colocó un tejido que contenía algodón descolorido
de 10 pulgadas x 10 pulgadas en 1 litro de este tampón y se dejó
reposar a 110ºF durante 30 minutos y, a continuación, se agitó
durante 30 minutos a 100 revoluciones por minuto. A continuación, se
extrajeron los tejidos del tampón, se lavaron y se secaron. A
continuación, los tejidos resultantes se compararon con el tejido
previo al tratamiento. Los resultados de este análisis son los
siguientes:
El término "se observan ventajas" significa
que el tejido tratado muestra restauración del color (es decir,
está menos descolorido) en comparación con el tejido no tratado.
Estos resultados corroboran los resultados del ejemplo 17 de que la
presencia de componentes de tipo CBH no es necesaria para conseguir
la restauración del color de tejidos que contienen algodón
descoloridos.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra que la presencia de
componentes de tipo CBH no es esencial para conferir una mejor
suavidad a tejidos que contienen algodón. Específicamente, este
ejemplo utiliza una composición de celulasas derivada de
Trichoderma reesei modificada genéticamente de una manera
descrita anteriormente para que sea incapaz de producir los
componentes CBH I y CBH II.
Esta composición de celulasas se analizó por su
capacidad para suavizar prendas para lavar de felpa.
Específicamente, se cortaron tejidos de felpa de algodón no suaves
de 8,5 onzas y de 14 pulgadas por 15 pulgadas (disponibles como
Style No. 420NS de Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave.,
Middlesex, NJ 08846), en muestras de tela de 7 pulgadas por 7.5
pulgadas.
La composición de celulasas descrita
anteriormente se analizó por su capacidad de suavizar estas muestras
de tela en un "launderometer". Específicamente, se añadió una
cantidad apropiada de celulasa para proporcionar 500 ppm, 250 ppm,
100 ppm, 50 ppm, y 10 ppm de celulasa en la solución final de
celulasas a soluciones separadas de 400 ml de un tampón
citrato/fosfato 20 mM que contenía un 0,025 por ciento en peso de un
tensoactivo no iónico (Triton X114). Adicionalmente, se utilizó un
blanco que contenía la misma solución, pero son celulasa añadida.
Las muestras preparadas de esta manera se ajustaron a pH 5. A
continuación, cada una de las soluciones resultantes se añadió a un
recipiente separado de un "launderometer". En estos recipientes
se añadió una cantidad de bolitas para facilitar la suavidad, así
como las muestras de tela de algodón descritas anteriormente. Todas
las condiciones se desarrollaron por triplicado con dos muestras de
tela por recipiente. A continuación, se cerró cada recipiente y se
bajó el recipiente en el baño del "launderometer" que se
mantuvo a 37ºC. A continuación, se giró el recipiente en el baño a
una velocidad de por lo menos aproximadamente 40 revoluciones por
minuto (rpm) durante aproximadamente 1 hora. Posteriormente, se
extrajeron las muestras de tela, se enjuagaron y se secaron en un
secador estándar.
A continuación, se analizaron las muestras de
tela por su suavidad mediante la evaluación en una prueba de
preferencias. Específicamente, a seis panelistas se les proporcionó
su propio grupo de muestras de tela y se les pidió que las
calificaran con respecto a la suavidad en base a criterios de
suavidad, tales como la maleabilidad de todo el tejido. Las
muestras de tela obtenidas a partir del tratamiento con las cinco
concentraciones de enzimas diferentes y el blanco se colocaron tras
una pantalla y a los panelistas se les pidió ordenarlas desde la
menos suave a la más suave. Se asignaron puntuaciones a cada muestra
de tela en base a su orden en relación con las otras muestras;
siendo 5 la más suave y 0 la menos suave. Las puntuaciones de cada
panelista se acumularon y a continuación se hizo el promedio.
Los resultados de este promedio se indican en la
figura 13. Específicamente, estos resultados demuestran que a
concentraciones de celulasa más elevadas, se obtiene una mejor
suavidad. Cabe indicar que esta suavidad mejorada se consigue sin
la presencia de CBHI o II en la composición de celulasas.
Con respecto a estos resultados, se contempla
que con concentraciones inferiores de la composición de celulasas,
se manifestará la propia suavidad mejorada a lo largo de lavados
repetidos.
Con respecto a los ejemplos 16 a 19, las
composiciones de celulasas enriquecidas en componentes de tipo EG
derivados de microorganismos diferentes a Trichoderma reesei
se podrían utilizar en lugar de las composiciones de celulasas
descritas en estos ejemplos. En particular, el origen de la
composición de celulasas enriquecida en componentes de tipo EG no
es importante para esta invención y se puede utilizar cualquier
composición de celulasas fúngicas enriquecida en componentes de
tipo EG. Por ejemplo, las celulasas fúngicas para su uso en la
preparación de composiciones de celulasas fúngicas utilizadas en la
presente invención se pueden obtener de Trichoderma koningii,
Pencillum sp., y similares o se pueden utilizar celulasas
disponibles comercialmente, es decir, CELLUCLAST (disponible en
Novo Industry, Copenhagen, Dinamarca), RAPIDASA (disponible en Gist
Brocades, N.V., Delft, Holanda), y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un derivado defectuoso en pyr 4 de la
cepa RutC30 de T. reesei (Sheir-Neiss y
Montenecourt, (1984), Appl. Microbiol. Biotechnol.
20:46-53) mediante el método descrito en el ejemplo
1. Se transformaron los protoplastos de esta cepa con
pEGIpyr4 no digerido y se purificaron los transformantes
estables.
Cinco de estos transformantes (designados como
EP2, EP4, EP5, EP6, EP11), así como RutC30 no transformados se
inocularon en 50 ml de medio YEG (extracto de levadura, 5 g/l;
glucosa, 20 g/l) en matraces de agitación de 250 ml y se cultivaron
con agitación durante dos días a 28ºC. El micelio resultante se lavó
con agua estéril y se añadió a 50 ml de medio TSF (tampón
citrato-fosfato 0,05M, pH 5,0; celulosa
microcristalina Avicel, 10 g/l; KH_{2}PO_{4}, 2,0 g/l;
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,4 g/l; peptona proteosa, 1,0 g/l;
Urea, 0,3 g/l; MgSO_{4}.7H_{2}O, 0,3 g/l; CaCl_{2}, 0,3 g/l;
FeSO_{4}.7H_{2}O, 5,0 mg/l; MnSO_{4}.H_{2}O, 1,6 mg/l;
ZnSO_{4}, 1,4 mg/l; CoCl_{2}, 2,0 mg/l; Tween 80 al 0,1%). Estos
cultivos se incubaron con agitación durante cuatro días más a 28ºC.
Se extrajeron muestras del sobrenadante a partir de estos cultivos y
se realizaron pruebas diseñadas para medir la cantidad total de
proteína y de actividad de endoglucanasa tal como se describe a
continuación.
La prueba de la endoglucanasa dependía de la
liberación de oligosacáridos teñidos solubles de Azul brillante
Remazol- carboximetilcelulosa (RBB-CMC, obtenida de
MegaZyme, North Rocks, NSW, Australia). El sustrato se preparó
mediante la adición de 2 g de RBB-CMC seco a 80 ml
de agua desionizada recién hervida con agitación vigorosa. Cuando
se enfrió hasta temperatura ambiente, se añadieron 5 ml de tampón de
acetato de sodio 2 M (pH 4,8) y el pH se ajustó a 4,5. El volumen
se ajustó finalmente a 100 ml con agua desionizada y se añadió
azida sódica hasta una concentración final de 0,02%. Las alícuotas
del cultivo de control de T. reesei, el sobrenadante de
cultivo del transformante pEGIpyr4 o acetato de sodio 0,1
como blanco (10-20 ml) se colocaron en tubos, se
añadieron 250 ml de sustrato y los tubos se incubaron durante 30
minutos a 37ºC. los tubos se colocaron en hielo durante 10 minutos
y a continuación se añadió 1 ml de precipitante frío (acetato de
sodio al 3,3%, acetato de zinc al 0,4%, pH 5 con HCl, etanol al
76%). Los tubos se giraron agitación y se dejaron reposar durante
cinco minutos antes de centrifugar durante tres minutos a
aproximadamente 13.000 x g.
La densidad óptica se midió
espectrofotométricamente a una longitud de onda de
590-600 nm.
\newpage
La prueba de proteínas utilizada fue la prueba
del BCA (ácido bicinconínico) que utiliza reactivos obtenidos de
Pierce, Rockford, Illinois, USA. El patrón fue la albúmina de suero
bovino (BSA). El reactivo de BCA se fabricó mezclando 1 parte de
reactivo B con 50 partes de reactivo A. Un ml del reactivo de BCA se
mezcló con 50 ml de BSA diluido de manera apropiada o sobrenadante
del cultivo de prueba. La incubación fue durante 30 minutos a 37ºC
y la densidad óptica se midió finalmente espectrofotométricamente a
una longitud de onda de 562 nm.
Los resultados de las pruebas descritas
anteriormente se muestran en la tabla 1. Está claro que algunos de
los transformantes produjeron mayores cantidades de actividad
endoglucanasa en comparación con la cepa RutC30 no transformada. Se
cree que las endoglucanasas y las
exo-celobiohidrolasas producidas por T.
reesei no transformada constituyen aproximadamente ente el 20 y
el 70 por ciento respectivamente de la cantidad total de proteína
secretada. Por lo tanto, se esperaría que un transformante, tal como
EP5, que produce aproximadamente cuatro veces más endoglucanasa que
la cepa RutC30, secretara aproximadamente las mismas cantidades que
proteínas del tipo endoglucanasa y
exo-celobiohidrolasa.
Los transformantes descritos en este ejemplo se
obtuvieron utilizando pEGIpyr4 intacto y contendrá
secuencias de ADN integradas en el genoma, el cual derivaba del
plásmido pUC. Antes de la transformación, sería posible digerir
pEGIpyr4 con HindIII y aislar el fragmento de ADN más
grande que contenía sólo el ADN de T. reesei. La
transformación de T. reesei con este fragmento aislado de ADN
permitiría el aislamiento de transformantes que sobreproducían EGI
y no contenían secuencias de ADN heterólogas, a excepción de los dos
fragmentos cortos de ADN sintético mostrados en la figura 8.
También sería posible utilizar pEGIpvr4 para transformar una cepa a
la que se había eliminado el gen cbh1, o el gen de
cbh2, o ambos genes. De esta manera, se podría construir una
cepa que sobreproduciría EGI y produciría un rango limitado de
exo-celobiohidrolasas o ninguna.
Los métodos del ejemplo 20 se podrían utilizar
para producir cepas de T. reesei que sobreproducirían
cualquiera de los componentes de celulasa, componentes de xilanasa,
u otras proteínas producidas normalmente por T. reesei.
Los resultados anteriores se presentan con el
objetivo de demostrar la sobreproducción del componente EGI en
relación a proteína total y no con el objetivo de demostrar el grado
de sobreproducción. En este aspecto, se espera que el grado de
sobreproducción varíe con cada experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un plásmido pCEPC1 en el que la
secuencia codificante para EGI estaba funcionalmente fusionada al
promotor del gen cbh1. Esto se consiguió utilizando
mutagénesis específica de sitio in vitro para alterar la
secuencia de ADN de los genes cbh1 y egl1 con el fin
de crear sitios de división convenientes para la endonucleasa de
restricción en 5' (en dirección 5') de sus sitios respectivos de
inicio de la traducción. Se realizó un análisis de la secuencia de
ADN para verificar la secuencia esperada en la unión entre los dos
segmentos de ADN. Las alteraciones específicas realizadas se
muestran en la figura 14.
Los fragmentos de ADN que se combinaron para
formar pCEPC1 se insertaron entre los sitios EcoRI de pUC4K
y fueron los siguientes (véase la figura 15):
- A)
- Un fragmento de 2,1 kb de la región flanqueante 5' del locus de cbh1. Esto incluye la región promotora y se extiende al sitio BclI diseñado y de este modo no contiene la secuencia codificante de cbh1.
- B)
- Un fragmento de 1,9 kb de ADN genómico del locus de egl1 que empieza en el extremo 5' con el sitio BamHI diseñado y que se extiende a lo largo de la región codificante y que incluye aproximadamente 0,5 kb más allá del codón de parada de la traducción. En el extremo 3' del fragmento hay 18 pb del sitio de clonación múltiple de pUC218 y un oligonucleótidos sintético de 15 pb utilizado para unir este fragmento con el fragmento siguiente.
- C)
- Un fragmento de ADN de la región flanqueante 3' del locus de cbh1, que se extiende desde una posición aproximadamente 1 kb en dirección 3' a aproximadamente 2,5 kb en dirección 3' del codón de parada de la traducción de cbh1.
- D)
- Insertado en un sitio NheI en el fragmento (C) había un fragmento NheI-SphI de 3,1 kb de ADN que contenía el gen py4 de T. reesei obtenido de pTpyr2 (Ejemplo 2) y tenía 24 pb de ADN en un extremo derivado del sitio de clonación múltiple de pUC18.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pCEPC1 se diseñó de manera que la
secuencia codificante de EI se integraría en el locus de
cbh1, sustituyendo la secuencia codificante para CBH I sin
introducir ningún ADN extraño en la cepa huésped. La digestión de
este plásmido con EcoRI libera un fragmento que incluye la
región promotora de cbh1, la secuencia codificante y la
región de terminación de la transcripción de egl1, el gen
pyr4 de T. reesei y un segmento de ADN de la región
flanqueante 3' (en dirección 3') del locus de cbh 1 (véase la figura
15).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo una cepa RutC30 de T. reesei
defectuosa en pyr4 (Sheir-Neiss,
supra) usando el método indicado en el Ejemplo 1. Esta cepa
se transformó con pCEPC1 que había sido digerido con EcoRI.
Se seleccionaron los transformantes estables y posteriormente se
cultivaron en matraces de agitación para la producción de celulasa,
tal como se describe en el Ejemplo 20. Con el fin de visualizar las
proteínas de celulasa, se realizó una electroforesis en gel por
enfoque isoeléctrico en las muestras de estos cultivos usando el
método descrito en el Ejemplo 7. De un total de 23 transformantes
analizados de esta manera, se encontró que 12 no producían ninguna
proteína CBHI, que es el resultado esperado de la integración del
ADN de CEPC1 en el locus de cbh1. Se utilizó un análisis de
transferencia southern para confirmar que la integración había
tenido lugar efectivamente en el locus de cbh1 en algunos de
estos transformantes y que ninguna secuencia derivada del vector
plasmídico bacteriano (pCU4K) estaba presente (véase Figura 16).
Para este análisis, se digirió el ADN de los transformantes con
Pstl antes de someterse a electroforesis y transferencia al
filtro de membrana. La transferencia Southern resultante se sondó
con el plásmido radiomarcado pUC4K::cbh1 (véase el Ejemplo
2). La sonda hibridada con el gen cbh1 en un fragmento de
6,5 kb de ADN del cultivo de control no transformado (Fig. 16,
carril A). Se esperaría que la integración del fragmento CEPC1 de
ADN en el locus de cbh1 diera lugar a la pérdida de esta
banda de 6,5 kb y la aparición de otras tres bandas correspondientes
a los fragmentes de ADN de aproximadamente 1,0 kb, 2,0 kb y 3,5 kb.
Éste es exactamente el patrón observado para el transformante
mostrado en la figura 16, carril C. También se muestra en la figura
16, el carril B es un ejemplo de un transformante en el que se han
integrado múltiples copias de pCEPC1 en sitios en el genoma
diferentes del
locus cbh1.
locus cbh1.
Los análisis de actividad de endoglucanasa se
realizaron en muestras de sobrenadante de cultivo del cultivo no
transformado y los transformantes exactamente tal como se describe
en el Ejemplo 20 excepto que las muestras se diluyeron 50 veces
antes del análisis, de manera que la concentración de proteína en
las muestras estaba entre aproximadamente 0,03 y 0,07 mg/ml. Los
resultados de los análisis realizados con el cultivo de control no
trasformado y cuatro transformadores diferentes (designados
CEPC1-101, CEPC1-103,
CEPC1-105 y CEPC1-112) se muestran
en la Tabla 2. Los transformantes CEPC1-103 y
CEPC1-112 son ejemplos donde la integración del
fragmento CEPC1 ha conducido a la pérdida de producción de CBHI.
Los resultados mencionados anteriormente se
presentan con el objetivo de demostrar la sobreproducción del
componente EGI en relación a la proteína total y no con el objetivo
de demostrar el grado de sobreproducción. En este aspecto, se
espera que el grado de sobreproducción varíe con cada
experimento.
Sería posible a construir plásmidos similares a
pCEPC1, pero con cualquier otro gen de T. reesei sustituyendo
el gen egl1. De este modo, se puede conseguir la
sobreexpresión de otros genes y la eliminación simultánea del gen
cbh1.
Sería también posible transformar las cepas de
T. reesei derivadas de pyr4 a las que se habían
eliminado previamente otros genes, por ejemplo cbh2, con
pCEPC1 para construir los transformantes que no producirían, por
ejemplo, exocelobiohidrolasas y sobreexpresarían endoglucanasas.
Usando construcciones similares a pCEPC1, pero
donde el ADN de otro locus de T. reesei fue sustituido por
el ADN del locus de cbh1, sería posible insertar genes bajo
control de otro promotor en otro locus en el genoma de T.
reesei.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen egl3, que codifica EGII
(previamente referido como EGIII por otros), fue clonado de T.
reesei y la secuencia de ADN publicada (Saloheimo et
al., 1988, Gene 63:11-21). Se ha obtenido el gen
de la cepa RL-P37 como un fragmento
Pstl-Xhol de aproximadamente 4 kb de ADN
genómico insertado entre los sitios Pstil y Xhol de
pUC219. El último vector, pUC219, deriva de pUC119 (descrito en
Wilson et al., 1989, Gene 77:69-78) mediante
la expansión del sitio de clonación múltiple para incluir sitios de
restricción para BgIII, Clal y Xhol. Usando métodos
conocidos en la técnica, el gen pyr4 de T. reesei,
presente en un fragmento SaII de 2,7 kb de ADN genómico, se
insertó en un sitio SaII en la secuencia codificante de EGII
para crear el plásmido pEGII::P-1 (figura 17). Esto
dio lugar a la interrupción de la secuencia codificante de EGII,
pero sin la supresión de ninguna secuencia. El plásmido,
pEGII::P-1 se puede digerir con HindIII y
BamHI para producir un fragmento lineal de ADN derivado
exclusivamente de T. reesei, a excepción de 5 pb en un
extremo y 16 pb en el otro extremo, ambos derivados del sitio de
clonación múltiple de pUC219.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa GC69 de T. reesei se transformará
con pEGII::P-1 que se había digerido previamente con
HindIII y BamHI y se seleccionarán los transformantes
estables. Se aislará el ADN completo de los transformantes y se
usará un análisis de transferencia Southern para identificar
aquellos transformantes en los que el fragmento de ADN que contiene
los genes pyr4 y eql3 se había integrado en el locus
egl3 y por consiguiente, había alterado la secuencia
codificante de EGII. Los transformantes serán incapaces de producir
EGII. También sería posible usar pEGII::P-1 para
transformar una cepa a la que se había eliminado uno o todos los
genes egl1, cbh2 o cbh1. De este modo, se podría
construir una cepa que sólo produciría ciertos componentes de
celulasas y ningún componente EGII.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un derivado deficiente de pyr4
de la cepa P37P\Delta\DeltaCBH67 (del Ejemplo 11) mediante el
método indicado en el Ejemplo 1. Esta cepa
P37P\Delta\Delta67P-1 se transformó con
pEGII::P-1 que se había digerido previamente con
HindIII y BamHI y se seleccionaron los transformantes
estables. Se aisló el ADN completo de los transformantes y se usó
un análisis de transferencia Southern para identificar las cepas en
las que el fragmento de ADN contenía los genes egl3 y
pyr4 se había integrado en el locus de egl3 y por
consiguiente, había alterado la secuencia codificante de EGII. La
transferencia Southern ilustrada en la figura 18 se sondó con un
fragmento PstI de aproximadamente 4 kb de ADN de T.
reesei que contenía el gen egl3 que había sido clonado
en el sitio PstI de pUC18 y posteriormente se volvió aislar.
Cuando el ADN aislado de la cepa
P37P\Delta\Delta67P-1 se digirió con PstI
para el análisis de transferencia Southern, se visualizó
posteriormente el locus de egl3 como una banda de 4 kb única
en la autorradiografía (figura 18, carril E). Sin embargo, para un
transformante alterado para el gen eal3 esta banda se perdió
y fue reemplazada por dos bandas nuevas tal como se esperaba
(figura 18, carril F). Si el ADN se digería con EcoRV o
BgIII, el tamaño de la banda que correspondía al gen
egl3 se incrementaba en tamaño en aproximadamente 2,7 kb (el
tamaño del fragmento de pyr4 insertado) entre la cepa
P37P\Delta\Delta67P-1 no transformada (Carriles
A y C) y el transformante alterado para egl3 (figura 18,
Carriles B y D). El transformante que contenía el gen egl3
alterado ilustrado en la figura 18 (Carriles B, D y F) se denominó
A22. El transformante identificado en la figura 18 es incapaz de
producir CBHI, CBHII o EGII.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen egl1 de la cepa
RL-P37 de T. reesei se obtuvo tal como se ha
descrito en el Ejemplo 12, como un fragmento HindIII de 4,2
kb de ADN genómico. Este fragmento se insertó en el sitio
HindIII de pUC100 (un derivado de pUC18;
Yanisch-Perron et al., 1985, Gene
33:103-119, con un oligonucleótido insertado en el
sitio de clonación múltiple añadiendo los sitios de restricción
para BgIII, ClaI y XhoI). Usando la metodología
conocida en la técnica, se eliminó un fragmento EcoRV de
aproximadamente 1 kb que se extiende desde una posición cercana a
la mitad de la secuencia codificante de EGI hasta una posición más
allá del extremo 3' fin de la secuencia codificante y se reemplazó
por un fragmento ScaI de 3,5 kb de ADN de T. reesei
que contenía el gen pyr4. El plásmido resultante se denominó
pP\DeltaEGI-1 (véase la figura 19).
El plásmido pP\DeltaEGI-1 se
puede digerir con HindIII para liberar un fragmento de ADN
que comprende solamente por ADN genómico de T. reesei que
tiene un segmento del gen egl1 en cualquier extremo y el gen
pyr4 que remplaza una parte de la secuencia codificante de
EGI en el centro.
La transformación de una cepa deficiente de
pyr4 de T. reesei apropiada con el
pP\DeltaEGI-1 digerido con HindIII
conducirá a la integración de este fragmento de ADN en el locus
egl1 en cierta proporción de los transformantes. De esta
manera se obtendrá una cepa incapaz de producir EGI.
\vskip1.000000\baselineskip
La idea de que el gen de EGI se podía desactivar
usando el método indicado en el Ejemplo 26 se refuerza con este
experimento. En este caso, se construyó un plásmido,
pAEGlpyr-3, que era similar a
pP\DeltaEGI-1, a excepción de que el gen
pyr4 de Aspergillus niger reemplazó el gen pyr4
de T. reesei como marcador seleccionable. En este caso el
gen egl1 estaba presente de nuevo como un fragmento
HindIII de 4,2 kb insertado en el sitio HindIII de
PUC100. El mismo fragmento interno EcoRV de 1 kb se extrajo
durante la construcción de pP\DeltaEGI-1 (véase
el Ejemplo 26) pero en este caso se sustituyó por un fragmento de
2,2 kb que contenía el gen pyrG de A. niger clonado
(Wilson et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16 p.2339). La
transformación de una cepa deficiente de pyr4 de T.
reesei (cepa GC69) con p\DeltaEGIpyr-3,
después de que se había digerido con HindIII para liberar el
fragmento que contenía el gen pyrG con regiones flanqueantes
del locus de egl1 en cualquier extremo, condujo a los
transformantes en los que se había alterado el gen egl1.
Estos transformantes se reconocieron mediante el análisis de
transferencia Southern de ADN transformante digerido con
HindIII y sondado con p\DeltaEGIpyr-3
radiomarcado. En la cepa no transformada de T. reesei el gen
egl1 estaba presente en un fragmento HindIII de 4,2
kb de ADN y este patrón de hibridación se representa en la figura
20, carril C. Sin embargo, tras la eliminación del gen egl1
mediante la integración del fragmento deseado de
p\DeltaEGIpyr-3, este fragmento de 4,2 kb
desapareció y se sustituyó por un fragmento aproximadamente 1,2 kb
más grande de tamaño, figura 20, carril A. También se muestra en la
figura 20, carril B es un ejemplo de un transformante donde la
integración de una sola copia de p\DeltaEGIpyr-3
ha tenido lugar en un sitio en el genoma diferente del locus
egl1.
\vskip1.000000\baselineskip
Un derivado deficiente de pyr4 de la cepa
A22 (del Ejemplo 25) se obtendrá usando el método indicado en el
Ejemplo 1. Esta cepa se transformará con
pP\DeltaEGI-1 que se había digerido previamente
con HindIII para liberar un fragmento de ADN que comprende
solamente ADN genómico de T. reesei que tenía un segmento del
gen egl1 en cualquier extremo con parte de la secuencia
codificante de EGI reemplazada por el gen pyr4.
Se seleccionarán los transformantes de
pyr4+ estables y se aislará el ADN completo de los
transformantes. El ADN se sondará con
pP\DeltaEGI-1 marcado con ^{32}P después del
análisis de transferencia Southern para identificar los
transformantes en los que el fragmento de ADN que contenía el gen
pyr4 y secuencias egl1 se ha integrado en el locus
egl1 y, por consiguiente, ha alterado la secuencia que
codificante EGI. Los transformantes identificados serán incapaces
de producir CBHI, CBHII, EGI y EGII.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
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Claims (10)
1. Composición de detergente que comprende:
(a) una cantidad eficaz de un tensoactivo o una
mezcla de tensoactivos para limpieza; y
(b) desde un 0,01 hasta un 5 por ciento en peso
de una composición de celulasas fúngicas en base al peso de la
composición de detergente, donde dicha composición de celulasas
comprende uno o más componentes del tipo EG y menos de un 5 por
ciento en peso de componentes del tipo CBH en base al peso de la
proteína en la composición de celulasas;
- caracterizada porque la composición del detergente proporciona mejoras en la suavidad, la retención/restaura- ción del color y el tacto para tejidos que contienen algodón o celulosa regenerada, con una menor pérdida de resistencia en comparación con el tratamiento con composiciones de detergentes que contienen mayores cantidades de componentes del tipo CBH I;
- con la condición de que dicha composición de celulasas fúngicas (b) es (I) diferente de una composición que contiene celulasa EG III sustancialmente pura, definiéndose por tener por lo menos un 40% en peso de EG III en base al peso total de proteínas de celulasa; y (II) diferente de una composición ácida de celulasas, es decir que tiene un pH óptimo inferior a 7,0, que contiene una cantidad enriquecida de componentes del tipo EG ácidos en relación con los componentes del tipo CBH.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Composición de detergente según la
reivindicación 1, donde la composición de celulasas comprende menos
de un 2 por ciento en peso de componentes del tipo CBH I en base al
peso de proteína en la composición de celulasas.
3. Composición de detergente según las
reivindicación 1 ó la reivindicación 2, donde la composición de
celulasas contiene por lo menos un 70 por ciento en peso de
componentes del tipo EG en base al peso total de proteína en la
composición de celulasas.
4. Composición de detergente según la
reivindicación 1 ó la reivindicación 2, donde la composición de
celulasas contiene por lo menos un 90 por ciento en peso de
componentes del tipo EG en base al peso total de proteína en la
composición de celulasas.
5. Composición de detergente según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición de
celulasas está libre de todos los componentes del tipo CBH 1.
6. Composición de detergente según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición de
celulasas está libre de todos los componentes de tipo CBH.
7. Composición de detergente según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición de
celulasas deriva de un microorganismo modificado genéticamente
incapaz de expresar ningún componente de tipo CBH y/o capaz de
sobreexpresar uno o más componentes de tipo EG.
8. Composición de detergente según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición de
celulasas deriva de un microorganismo modificado genéticamente
incapaz de expresar los componente de tipo CBH.
9. Composición de detergente según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición de
celulasas no contiene ninguna proteína heteróloga.
10. Composición de detergente según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición de
detergente comprende desde un 0,05 hasta un 2 por ciento en peso de
dicha composición de celulasas.
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