CN103343111B - 一种嗜热毛壳菌纤维素酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜热毛壳菌纤维素酶，其氨基酸序列选自以下：a)N末端氨基酸具有SEQ ID NO.5所示序列；b)C末端氨基酸具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的序列；c)包含由(a)或(b)的序列发生一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入或添加且与(a)或(b)具有纤维素酶活性的氨基酸序列；d)包含与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的序列的蛋白质至少90%同源性的序列，且具有纤维素酶活性的氨基酸序列。此外，本发明还公开采用里氏木霉、毕赤酵母表达该嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法。本发明还公开该嗜热毛壳菌纤维素酶在制备纺织物除毛产品及牛仔布水洗产品中的应用。

Description

一种嗜热毛壳菌纤维素酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种纤维素酶，尤其涉及一种嗜热毛壳菌纤维素酶；另外，本发明还涉及该嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法和应用。

背景技术

纤维素酶是一种纤维素类物质水解专一高效催化剂，可以将纤维素降解为小分子类纤维素、多糖类化合物及葡萄糖。纤维素酶在一些草食动物上很早就存在，科学家研究纤维素酶已经有100多年的历史了，当初主要想通过纤维素酶降解地球上贮量最丰富的纤维素，并变成可用生物能源，在这一过程中人们发现了纤维素酶的很多其它用途，现代纤维素酶广泛使用于纺织印染、造纸、饲料、生物能源、食品加工、酿造环保、石油开采等行业。纤维素酶在此过程中也发展出众多的品种，如有纤维素酶、酸性纤维素，现在已经有一些纤维素酶在碱性条件下也具有良好的性能，本发明旨在为纺织印染行业提供一种新型纤维素酶。纤维素酶在许多工业领域中均有广泛的应用：

1.织物柔软整理

纤维素纤维是纺织上主要的大类纤维，包括棉麻，其中用纤维素酶对棉型织物及麻织物进行柔软整理在一些文献上有报导，如毛巾、灯芯绒等织物通过纤维素酶处理后，手感有明显提高；特别是麻类织物通过处理后，可明显地降低麻纤维素上的小绒毛，从而减少麻纤维对人体的刺痒感，使麻纤维穿着更舒适；现在流行一种面料叫仿天丝面料，这种面料一般是用高支高密的棉织物通过纤维素酶长时间处理后，纤维通过失重，使此纤维具有天丝的悬垂、光亮、柔软的感觉。这些都是利用纤维素酶对纤维素纤维的降解，达到降低纤维素纤维的结晶度，从而使纤维素纤维变得柔软，当然此方法的缺点是织物强力损失较大，因此这方面应用比较广泛的只有仿天丝，而在麻纤维上的应用还处于研究中。

2.纤维素纤维的生物抛光

纤维素酶用于纤维素纤维除毛抛光报导较早的也大约在90年以后，因此纤维素纤维的生物抛光技术是近几十年发展起来的一门新技术，从作用的织物上来看一般分为休闲成衣抛光、天丝人棉和印染厂针织物生物抛光三大类，所用的酶一般常用的是酸性酶，纤维素酶较为少见。

2.1．休闲成衣织物抛光

这类主要织物为棉型成衣，一般以水洗厂为主，所用纤维素酶一般为酸性纤维素酶，也有一些保强性要求较高的织物要用到纤维素酶，其中起主导作用的是酸性纤维素酶。其作用机理是通过纤维素酶将纤维表面的绒毛降解成水溶性纤维素，多糖或葡萄糖，使纤维表面变得光洁、平整，达到抛光的目的，一般工艺比较简单：酶用量0.5-2%owf、PH4.5、温度50-60℃、处理时间40-60分钟。

2.2．棉针织物印染厂生物抛光

棉针织物生物抛光技术近几年来发展较快，最先使用的酸性纤维素酶生物抛光，目前发展到纤维素酶抛光，以及除氧中性抛光一浴，中性抛光除氧染色一浴工艺，现在针织物抛光是这四种工艺并行，各有优缺点。酸性纤维素酶抛光具抛光效果好、抛光速度快、但强力损失较高，强力损失15%左右，一般适于纱支在30支以下的针织物进行抛光；而纤维素酶抛光速度及效果是没法与酸性纤维素酶比的，但是保强性比较高，强力损失一般在10%左右，对于一些尾棉纤维，纱支较细的纤维比较适用。从工艺上来看：中性抛光除氧染色一浴法可以达到节能节水及节省时间的效果，但对一些敏感色染色效果会有一定的影响，同时工厂接受此工艺的不多，总体上来看工厂还是比较接受两步工艺。

2.3．天丝、人棉纤维的抛光

天丝和人棉纤维都是从木纤维中提取的纤维素纤维，这种纤维的最大缺点是：此类纤维是皮芯结构，纤维之间的抱合力较差，因此在加工中会发生纤维开口的现象，也叫原纤化，这种原纤化过程就会重新产生毛羽。目前这类纤维的抛光工艺大多采取多用量，短时间抛光，但目前用酸性纤维素酶效果并不理想。

3．牛仔服的生物酶洗

纤维素酶最早用于纺织是牛仔水洗，当时牛仔织物水洗，主要是通过石磨，达到起花的效果，此产品又名石磨蓝，由于大量使用石子，对设备使用寿命影响较大，同时对织物的强力损伤较大，因此人们开始寻找新的加工工艺，纤维素酶粉作为牛仔水洗产品就应运而生了。

牛仔织物酶洗是最传统的酵洗工艺，工艺很简单：一般向洗水机中加入酶粉1%owf，温度在室温或50-60℃水洗30-60分钟，主要评价起花度，对比度及沾色情况，其中抗沾色是此产品的技术关键，一般沾色少说明此产品的效果就好，当然起花与抗沾色是一对矛盾体，如何控制是纤维素酶技术的关键。

嗜热毛壳菌（Chaetomicum thermophilum）是一种广泛分布的，生长上限温度较高的一种嗜热真菌，从该菌中已分离了多种嗜热酶，并且证明了其纤维素酶存在多个组分。近年来主要研究方向集中于采用基因工程方法构建重组菌，进而表达获得纤维素酶。目前尚未有采用里氏木霉、或毕赤酵母来表达嗜热毛壳菌纤维素酶的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一供一种嗜热毛壳菌纤维素酶。

本发明要解决的技术问题之二是提供用上述嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供该嗜热毛壳菌纤维素酶的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一种嗜热毛壳菌纤维素酶，所述嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列选自以下:

(a)N末端氨基酸具有SEQ ID NO.5所示序列；

(b)C末端氨基酸具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的序列；

(c)包含由(a)或(b)的序列发生一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入或添加且与(a)或(b)具有纤维素酶活性的氨基酸序列；

(d)包含与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的序列的蛋白质至少90%同源性的序列，且具有纤维素酶活性的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，该方法包括如下步骤：

1）嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQ IDNO.2所示,合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；

2）嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3）里氏木霉的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，分泌到细胞外的嗜热毛壳菌纤维素酶为SEQ ID NO.3所示序列的第22-314位氨基酸序列。

进一步地，步骤2）具体为：将步骤1）所得的产物由SacⅡ和XhoI限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建。

进一步地，步骤3）具体为：首先，用EcoRI降解步骤2）构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUT C-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析；所述木霉纤维素酶诱导培养液的pH值为4.8，用乳糖作为诱导物。

在本发明的另一方面，提供另一种嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，该方法包括如下步骤：

1）嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQ IDNO.4所示；

2）嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3）毕赤酵母的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，步骤2）具体为：将步骤1）所得的产物由StuⅠ和KpnⅠ限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建。

进一步地，步骤3）具体为：步骤3）具体为：首先，用Spe I限制性内切酶将步骤2）构建的表达质粒切开后，直接转化毕赤酵母菌；随即挑选多个白色毕赤酵母菌落、培养、诱导后，将菌体与培养液分离，培养液通过SDS-PAGE电泳分析。

以上方法，列举了里氏木霉和毕赤酵母菌为宿主细胞的嗜热毛壳菌纤维素酶制备方法，同样，其他微生物如腐质霉属（Humicola）、园孢霉属（Staphylotrichum）、曲霉属（Aspergillus），木霉属（Trichoderma）、镰孢霉属(Fusarium)、顶孢霉属(Acremonium)、酿酒酵母(Saccharomyces)、汉逊酵母（Hansenula）的微生物都能作为制备嗜热毛壳菌纤维素酶的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供上述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的嗜热毛壳菌纤维素酶在制备纺织物除毛产品中的应用，及其在制备牛仔布水洗产品中的应用。

在本发明的另一方面，提供上述氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的嗜热毛壳菌纤维素酶在制备牛仔布水洗产品中的应用。

本发明采用化学方法人工合成嗜热毛壳菌纤维素酶基因，然后进行嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建，再进行里氏木霉的转化（或毕赤酵母的转化）与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，由此得到的嗜热毛壳菌纤维素酶经实验验证在纺织物除毛试验中效果明显，在牛仔布水洗试验中应用效果明显。

附图说明

图1是本发明实施例1中用于构建嗜热毛壳菌纤维素酶基因在里氏木霉表达质粒pCT45A的示意图。

图2是本发明实施例1中SDS-PAGE分析里氏木霉表达嗜热毛壳菌CHTCA基因转化子培养液中所产蛋白条带的示意图，其中，M道为标准蛋白；H道为空载质粒转化子蛋白；1-15道为pCT45A第1-15转化子蛋白。

图3A-图3C是本发明实施例2中纤维素酶在pH6.0条件下除去纺织物绒毛效果比较示意图；其中，图3A为CHTCA纤维素酶；图3B为商品纤维素酶；图3C为同样处理但没有加酶。

图4是本发明实施例3中用于构建嗜热毛壳菌纤维素酶催化域基因在毕赤酵母表达质粒pCHT45Pp的示意图。

图5是本发明实施例3中SDS-PAGE分析毕赤酵母表达嗜热毛壳菌CHTCA催化域基因转化子培养液中所产蛋白条带示意图，其中，M道为标准蛋白；H道为空载质粒转化子蛋白；1-15道为pCHT45Pp第1-15转化子蛋白。

图6A和图6B是本发明实施例4的纤维素酶处理牛仔裤起花和抗沾色效果示意图。图6A为牛仔裤用酶处理后的正面示意图；图6B为牛仔裤用酶处理后的反面示意图。其中，1为里氏木霉生产的CHTCA纤维素酶；2为毕赤酵母生产的CHTCA纤维素酶催化域；3为商品纤维素酶。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1．微生物和质粒材料

用于克隆的大肠杆菌DH5α,毕赤酵母（Pichia pastoris）和pPink-HC质粒由Invitrogen公司提供。用于异源基因高效表达宿主为里氏木霉(Trichoderma reesei RUT C-30)，从American Type Culture Collection(ATCC)购买，起始质粒pBluescipt KS(一)从Stratagene公司购买。

2．纤维素酶基因的发现与合成

用里氏木霉内切β-1,4-β-葡萄糖酶V（EGV，编码号：CAA83846；Saloheimo等，1994.Mol.Microbiol.13:219-229）作模板，在NCB1/BLAST搜索具有同源性的蛋白质系列，发现嗜热毛壳菌（Chaetomicum thermophilum）基因组文库有一同源蛋白质，功能不详，该基因序列、cDNA序列和蛋白质序列分别如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示。为了在里氏木霉高效表达，委托Life Technology Corporation采用本领域常见的化学方法合成了编码SEDID NO.2基因，为了克隆的方便，5’端增加了SacⅡ酶切位点和ACTGCGCATC核苷酸，而3’端增加了XhoⅠ位点的核苷酸，该基因合成片段命名为CHTCA，CHTCA用Sac II和XhoⅠ酶切位点，用琼脂糖凝胶电泳分离，用T4连接酶链接到用同样方法制备的pT3C质粒（编码号：EF127533，Li等，2007，Appl，Microbiol，Biotechnol，74:1264—1275），转化大肠杆菌DH5α通透细胞，通过分析8个转化子中的质粒，然后通过系列测定获得了编码CHTCA的里氏木霉表达质粒，命名为pCT45A。需要说明的是在原始pT3C质粒中3’端为PstⅠ位点，通过定点突变后转换成了XhoⅠ位点，这里构建的质粒为pCT45A（见图1）。

3．里氏木霉遗传转化与CHTCA纤维素酶高产菌株的筛选：

本发明使用了里氏木霉RUT C-30为宿主细胞，采用化学转化的方法（Penttila等,1987Gene61:155-164）将用EcoRI限制内切酶降解后的pCT45A质粒片段转入宿主细胞，然后在含有潮霉素B的土豆葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养，潮霉素B从Roche公司购买，5天后将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过6天生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化传代稳定的转化子。通过此方法，得到15个传代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，此培养液pH4.8，用乳糖作为诱导物，在三角瓶中培养6天后，采样离心，取上清液，用聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）加考马斯蓝染色，通过此分析，发现15个转化子中，第2，3，4，5，6，7，8，9，12，13，14和15转化子产生一条大约40,000道尔顿的蛋白条带（见图2）。而且采用本领域常用的AZO-CMC作为底物的企业分析方法测得的纤维素酶活力如表一所示，活力单位在pH7.5和温度50°C条件下，1.0分钟将1ml质量百分比浓度为0.5%(w/v)AZO-CMC释放0.1OD_595nm定义为1个单位(U)。可以看出，SDS-PAGE胶上40,000道尔顿条带的深浅与酶活水平高度相关。进一步证明40,000道尔顿的蛋白为本发明的纤维素酶。

表一:里氏木霉表达嗜热毛壳菌CHTCA基因转化子培养液中纤维素酶活力

编号	活力(U/ml)
		H	14.8
1	18.4
		2	136
3	164
		4	159
5	144

6	130
		7	139
8	173
		9	98
10	13.1
		11	16.4
12	169
		13	149
14	153
		15	132

实施例2里氏木霉生产的CHTCA纤维素酶对纺织物除毛效果试验

将同样量（0.03g）的CHTCA纤维素酶（实施例1制得）和商品纤维素酶(购自杰能科的全能酶11L)和25×25cm白色针织布在10升各种pH条件下处理40分钟。水洗机的转速控制在150RPM，温度50°C。水洗后，将白布用清水冲洗1分钟，白布水洗前后在80°C烘箱烘至恒重，除去绒毛的抛光效果如图3A、图3B和图3C所示：在同样蛋白用量的情况下、CHTCA纤维素酶比商品纤维素酶更能除去绒毛、达到抛光的效果。而且除去绒毛的量CHTCA纤维素酶从pH4.5-7.5比商品纤维素酶都要多（见表二）。

表二.纤维素酶在不同pH条件下除去纺织物绒毛效果（%）

pH	4.5	5.0	5.5	6.0	6.5	7.0	7.5
								CHTCA	2.14	2.40	2.51	2.45	2.34	2.17	1.94
商品纤维素酶	1.89	2.24	2.11	2.09	2.05	1.88	1.65

实施例3CHTCA催化域在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达与重组蛋白的分泌

一个DNA分子序列（SEQ ID NO.4）由Life Technology公司合成，该序列编码CHTCA蛋白的第22至238位氨基酸(SEQ ID NO.5)对应CHTCA催化域部分。一个TAA添加在SEQID NO.4的3’端用于翻译终止，同时为了克隆的方便，在SEQ ID NO.4的5’和3’端分别添加了StuⅠ和KpnⅠ系列，SEQ ID NO.4分子由这二种酶切后，与同样酶切后的pPink-HC质粒用T4连接酶连接，用连接反应液转化E.coli DH5α细胞，挑选出8个在LB/Amp琼脂上菌落，在LB液体培养基中过夜培养后，分离出质粒，通过DNA测序后，获得构建正确的质粒，命名为批pCHT45Pp(见图4)。用Spe I限制性内切酶将pCHT45Pp切开后，直接转化毕赤酵母Pink1号菌(由Invitrogen公司提供)。所有克隆、转化、培养条件都如Pichia PinkExpression System(毕赤酵母表达系统)所述（见实施例1,由Invitrogen公司提供），随机挑选15个白色毕赤酵母菌落、培养、诱导后，将菌体与培养液分离，培养液通过SDS-PAGE分析的蛋白条带如图5所示，而用AZO-CMC在pH7.5条件下分析的酶活如表三所示，比较图5和表三可确认所有转化子都产生了活力水平不等的纤维素酶活力和浓度不等的蛋白条带，蛋白条带的质量从15000至75000道尔顿范围，但主要的条带为26000和27000道尔顿的两条带，这些带的深浅与酶活水平具有较强的相关性，充分证明这些蛋白条带大部分具有降解AZO-CMC的活力，这些条带的纤维素酶蛋白只含有CHTCA催化域。将毕赤酵母第八号菌株在摇瓶中培养和诱导，共培养2.0升，将发酵液和菌体分离后，浓缩得到了20毫升液体酶样品，通过蛋白质测量，蛋白质浓度为60毫克/毫升，所以共获得大约1.2克酶蛋白。

表三:毕赤酵母表达嗜热毛壳菌CHTCA催化域基因转化子培养液中纤维素酶活力

编号	活力(U/ml)
		H	0.01
1	13.2
		2	15.4
3	17.0
		4	67.2
5	14.1
		6	85.9
7	67.3
		8	1.23
9	45.8
		10	56.1
11	54.1
		12	76.4
13	22.2
		14	55.2
15	65.4

实施例4纤维素酶牛仔布水洗试验

用同样单位的AZO-CMC活力的里氏木霉生产的CHTCA纤维素酶（实施例1制得）、毕赤酵母生产的CHTCA纤维素酶催化域（实施例3制得）和商品纤维素酶(购自杰能科的全能酶11L)进行牛仔布水洗试验，结果如图6A和图6B所示：所有纤维素酶都有非常相似的牛仔布正面脱色和起花效果（见图6A中的1，2），但是从反面防沾色效果来看，CHTCA纤维素酶沾色最重（见图6B中的1），而CHTCA纤维素酶催化域处理的牛仔布不仅起花效果好（见图6A中的2），而且沾色低（见图6B中的2），而且比市场上的商品纤维素酶沾色（见图6B中的3）更低。

Claims (7)

1.一种嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQ ID NO.2所示,合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；

2)嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3)里氏木霉的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，分泌到细胞外的嗜热毛壳菌纤维素酶为SEQ ID NO.3所示序列的第22-314位氨基酸序列；步骤3)具体为：首先，用EcoRI降解步骤2)构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUT C-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析；所述木霉纤维素酶诱导培养液的pH值为4.8，用乳糖作为诱导物。

2.如权利要求1所述的嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：将步骤1)所得的产物由Sac Ⅱ和XhoI限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建。

3.一种嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQ ID NO.4所示；

2)嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3)毕赤酵母的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；步骤3)具体为：首先，用Spe I限制性内切酶将步骤2)构建的表达质粒切开后，直接转化毕赤酵母菌；随即挑选多个白色毕赤酵母菌落、培养、诱导后，将菌体与培养液分离，培养液通过SDS-PAGE电泳分析。

4.如权利要求3所述的嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：将步骤1)所得的产物由Stu Ⅰ和Kpn Ⅰ限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建。

5.一种采用权利要求1-2任一项所述的方法制得的嗜热毛壳菌纤维素酶在制备纺织物除毛产品中的应用。

6.一种采用权利要求1-2任一项所述的方法制得的嗜热毛壳菌纤维素酶在制备牛仔布水洗产品中的应用。

7.一种采用权利要求3-4任一项所述的方法制得的嗜热毛壳菌纤维素酶在制备牛仔布水洗产品中的应用。