CN105492603B - 新型金属蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明的组合物和方法的各方面涉及新型金属蛋白酶、编码所述新型金属蛋白酶的多核苷酸、及其组合物和使用方法。

Description

新型金属蛋白酶
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年5月29日提交的国际专利申请No.PCT/CN2013/076419、No.PCT/CN2013/076387、No.PCT/CN2013/076401、No.PCT/CN2013/076406、No.PCT/CN2013/076414、No.PCT/CN2013/076384、No.PCT/CN2013/076398和No.PCT/CN2013/076415的优先权；这些专利申请的内容以引用方式全文并入本文。
技术领域
本发明涉及蛋白酶及其变体。包含蛋白酶的组合物适用于清洁、食品和饲料，以及多种其他工业应用中。
背景技术
金属蛋白酶(MP)属于水解酶类，其利用配位结合在活性位点中的水分子调节对肽键的亲核攻击。在这种情况下，二价离子(例如锌离子)激活水分子。该金属离子由氨基酸配体(通常是三个)固定。MA族由锌依赖性金属蛋白酶组成，其中两个锌配体为基序HisGluXXHis中的组氨酸。该Glu是催化残基。这些金属蛋白酶是有两个结构域的蛋白酶，活性位点位于两个结构域之间。亚族MA(E)也称Glu-zincin，其中第三个配体为谷氨酸，位于HDXXH基序的C端。家族M1、M3、M4、M13、M27和M34的成员都是分泌蛋白酶，几乎全部来自细菌(Rawlings and Salvessen(2013)Handbook of Proteolytic Enzymes,Elsevier Press(Rawlings和Salvessen，2013年，《蛋白水解酶手册》，爱思唯尔出版社))。这些分泌蛋白酶在高温下通常有活性，这种稳定性归因于与钙结合。嗜热菌蛋白酶样蛋白酶属于M4家族，通过MEROPS定义(Rawlings等人，2012年，Nucleic Acids Res，第40卷，第D343-D350页)。虽然工业酶领域很久以来就知道蛋白酶，但仍需要适于特定条件和应用的新型蛋白酶。
发明概述
本发明提供了新型金属蛋白酶、编码新型金属蛋白酶的核酸、与生产和使用新型金属蛋白酶有关的组合物及方法。
在一些实施方案中，本发明是一种包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQID NO：3的氨基酸序列具有至少60％、至少80％或至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于芽孢杆菌目(Bacillales)的成员；芽孢杆菌科(Bacillaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、脂环酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)，或者芽孢杆菌属(Bacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)或类芽孢杆菌属(Paenibacillus)物种，例如多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于粉蚧科(Pseudococcidae)的成员、或游动球菌属(Planococcus)物种，例如东海游动球菌(Planococcus donghaensis)。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽都有蛋白酶活性，例如偶氮酪蛋白水解活性。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在pH 5和pH 9.5之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在30℃和70℃之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在洗涤剂组合物中具有清洁活性，所述洗涤剂组合物例如ADW洗涤剂、衣物洗涤剂、液体或粉末衣物洗涤剂组合物。
在一些实施方案中，本发明是一种包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQID NO：8的氨基酸序列具有至少60％、至少80％或至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于芽孢杆菌目的成员；芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科或短芽孢杆菌科(Brevibacillaceae)，或者芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)或类芽孢杆菌属物种，例如类芽孢杆菌属。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于短芽孢杆菌属物种。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽都有蛋白酶活性，例如偶氮酪蛋白水解活性。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在pH 5和pH 10之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在35℃和70℃之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在洗涤剂组合物中具有清洁活性，所述洗涤剂组合物例如ADW洗涤剂、衣物洗涤剂、液体或粉末衣物洗涤剂组合物。
在一些实施方案中，本发明是一种包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQID NO：13的氨基酸序列具有至少60％、至少80％或至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于芽孢杆菌目的成员；芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科或短芽孢杆菌科，或者芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属物种，例如腐殖质类芽孢杆菌(Paenibacillus humicus)。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽都有蛋白酶活性，例如偶氮酪蛋白水解活性。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在pH 5和pH 9.5之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在35℃和70℃之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在洗涤剂组合物中具有清洁活性，所述洗涤剂组合物例如ADW洗涤剂、衣物洗涤剂、液体或粉末衣物洗涤剂组合物。
在一些实施方案中，本发明是一种包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQID NO：18的氨基酸序列具有至少60％、至少80％或至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于芽孢杆菌目的成员；芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科或短芽孢杆菌科，或者芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属物种，例如爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillus ehimensis)。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于短芽孢杆菌属物种。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽都有蛋白酶活性，例如偶氮酪蛋白水解活性。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在pH 5和pH 10.5之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在45℃和75℃之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在洗涤剂组合物中具有清洁活性，所述洗涤剂组合物例如ADW洗涤剂、衣物洗涤剂、液体或粉末衣物洗涤剂组合物。
在一些实施方案中，本发明是一种包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQID NO：23的氨基酸序列具有至少60％、至少80％或至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于芽孢杆菌目的成；芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科、脂环酸芽孢杆菌科、乳杆菌科，或者芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、脂环酸芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属或乳杆菌属物种，例如巴塞罗那类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于粉蚧科的成员、或游动球菌属物种，例如东海游动球菌。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽都有蛋白酶活性，例如偶氮酪蛋白水解活性。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在pH 5和pH10之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在35℃和65℃之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在洗涤剂组合物中具有清洁活性，所述洗涤剂组合物例如ADW洗涤剂、衣物洗涤剂、液体或粉末衣物洗涤剂组合物。
在一些实施方案中，本发明是一种包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQID NO：28的氨基酸序列具有至少60％、至少80％或至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于芽孢杆菌目的成员；芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科，或者芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属或乳杆菌属物种，例如多粘类芽孢杆菌。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于粉蚧科的成员、或游动球菌属物种，例如东海游动球菌。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽都有蛋白酶活性，例如偶氮酪蛋白水解活性。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在pH 5和pH 9.5之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在30℃和65℃之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在洗涤剂组合物中具有清洁活性，所述洗涤剂组合物例如ADW洗涤剂、衣物洗涤剂、液体或粉末衣物洗涤剂组合物。
在一些实施方案中，本发明是一种包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQID NO：33的氨基酸序列具有至少60％、至少80％或至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于芽孢杆菌目的成员；芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科，或者芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属物种，例如湖南类芽孢杆菌(Paenibacillus hunanensis)。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于多粘芽孢杆菌。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽都有蛋白酶活性，例如偶氮酪蛋白水解活性。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在pH 4.5和pH9.0之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在35℃和70℃之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在洗涤剂组合物中具有清洁活性，所述洗涤剂组合物例如ADW洗涤剂、衣物洗涤剂、液体或粉末衣物洗涤剂组合物。
在一些实施方案中，本发明是一种包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQID NO：38的氨基酸序列具有至少60％、至少80％或至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明是上述的任一项，其中所述多肽来源于芽孢杆菌目的成员；芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科、乳杆菌科，或者芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、乳杆菌属、类芽孢杆菌属或地芽孢杆菌属物种，例如解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽都有蛋白酶活性，例如偶氮酪蛋白水解活性。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在pH 5.5和pH 10之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在35℃和65℃之间保持其最大活性的至少50％。在本发明的各实施方案中，上述任一种多肽在洗涤剂组合物中具有清洁活性，所述洗涤剂组合物例如ADW洗涤剂、衣物洗涤剂、液体或粉末衣物洗涤剂组合物。
在一些实施方案中，本发明是包含上述任一种多肽的组合物，例如清洁组合物或洗涤剂组合物。在一些实施方案中，该组合物还包含表面活性剂、至少一个钙离子和/或锌离子、至少一种稳定剂、至少一种漂白剂，而且可含磷酸盐、或可不含磷酸盐。在一些实施方案中，该组合物还包含一种或多种附加的酶或酶衍生物，所述附加的酶或酶衍生物选自酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶，以及它们的组合。在一些实施方案中，该组合物配制在约5.5至约8.5的pH。在一些实施方案中，本发明是使用上述任一种多肽或组合物进行清洁的方法。在一些实施方案中，本发明是纺织品加工组合物、动物饲料组合物、皮革加工组合物或羽毛加工组合物。
附图简述
图1.1提供了pGX085(aprE-PspPro3)的质粒图谱，实施例1.2描述了这种质粒。
图1.2提供了PspPro3在偶氮酪蛋白分析中的剂量响应曲线。
图1.3提供了PspPro3的pH分布图(pH profile)。
图1.4提供了PspPro3的温度分布图(temperature profile)。
图1.5A示出了ADW洗涤剂中PspPro3蛋白质在pH 6和pH 8时清洁PA-S-38微布样(microswatch)的剂量响应。
图1.5B示出了ADW洗涤剂中PspPro3蛋白质在有漂白剂且pH 6和pH 8时清洁PA-S-38微布样的剂量响应。
图1.6示出了液体衣物洗涤剂中PspPro3蛋白质的清洁性能。
图1.7示出了PspPro3与其他蛋白质同源物的比对。
图1.8提供了PspPro3及其同源物的系统发育树。
图2.1提供了pGX084(aprE-PspPro2)的质粒图谱，实施例2.2描述了这种质粒。
图2.2提供了PspPro2在偶氮酪蛋白分析中的剂量响应曲线。
图2.3提供了经纯化PspPro2的pH分布图。
图2.4提供了经纯化PspPro2的温度分布图。
图2.5A示出了含有漂白剂的AT盘碟洗涤剂中PspPro2在pH 6时清洁性能的剂量响应。
图2.5B示出了含有漂白剂的AT洗涤剂中经纯化PspPro2在pH 8时清洁性能的剂量响应。
图2.6A示出了液体衣物洗涤剂中PspPro2蛋白质的清洁性能。
图2.6B示出了粉末衣物洗涤剂中PspPro2蛋白质的清洁性能。
图2.7示出了PspPro2与其他蛋白质同源物的比对。
图2.8提供了PspPro2及其同源物的系统发育树。
图3.1提供了pGX150(aprE-PhuPro2)的质粒图谱，实施例3.2描述了这种质粒。
图3.2提供了PhuPro2在偶氮酪蛋白分析中的剂量响应曲线。
图3.3提供了经纯化PhuPro2的pH分布图。
图3.4提供了经纯化PhuPro2的温度分布图。
图3.5A示出了AT盘碟洗涤剂中PhuPro2在pH 6时清洁性能的剂量响应。
图3.5B示出了AT盘碟洗涤剂中PhuPro2在pH 8时清洁性能的剂量响应。
图3.6示出了PhuPro2与其他蛋白质同源物的比对。
图3.7提供了PhuPro2及其同源物的系统发育树。
图4.1提供了pGX148(aprE-PehPro1)的质粒图谱，实施例4.2描述了这种质粒。
图4.2提供了PehPro1在偶氮酪蛋白分析中的剂量响应曲线。
图4.3提供了经纯化PehPro1的pH分布图。
图4.4提供了经纯化PehPro1的温度分布图。
图4.5A示出了含有漂白剂的AT盘碟洗涤剂中PehPro1在pH 6时清洁性能的剂量响应。
图4.5B示出了含有漂白剂的AT洗涤剂中经纯化PehPro1在pH 8时清洁性能的剂量响应。
图4.6示出了PehPro1与其他蛋白质同源物的比对。
图4.7提供了PehPro1及其同源物的系统发育树。
图5.1提供了pGX147(aprE-PbaPro1)的质粒图谱，实施例5.2描述了这种质粒。
图5.2提供了PbaPro1在偶氮酪蛋白分析中的剂量响应曲线。
图5.3提供了经纯化PbaPro1的pH分布图。
图5.4提供了经纯化PbaPro1的温度分布图。
图5.5A示出了ADW洗涤剂中PbaPro1蛋白质在pH 6时清洁PA-S-38微布样的剂量响应。
图5.5B示出了ADW洗涤剂中PbaPro1蛋白质在pH 8时清洁PA-S-38微布样的剂量响应。
图5.6示出了PbaPro1与蛋白酶同源物的比对。
图5.7提供了PbaPro1及其同源物的系统发育树。
图6.1提供了pGX138(aprE-PpoPro1)的质粒图谱，实施例6.2描述了这种质粒。
图6.2提供了PpoPro1在偶氮酪蛋白分析中的剂量响应曲线。
图6.3提供了经纯化PpoPro1的pH分布图。
图6.4提供了经纯化PpoPro1的温度分布图。
图6.5A示出了ADW洗涤剂中PpoPro1蛋白质在有漂白剂且pH 6时清洁PA-S-38微布样的剂量响应。
图6.5B示出了ADW洗涤剂中PpoPro1蛋白质在有漂白剂且pH 8时清洁PA-S-38微布样的剂量响应。
图6.6示出了PpoPro1与蛋白酶同源物的比对。
图6.7提供了PpoPro1及其同源物的系统发育树。
图7.1提供了pGX149(aprE-PhuPro1)的质粒图谱，实施例7.2描述了这种质粒。
图7.2提供了PhuPro1在偶氮酪蛋白分析中的剂量响应曲线。
图7.3提供了经纯化PhuPro1的pH分布图。
图7.4提供了经纯化PhuPro1的温度分布图。
图7.5A示出了ADW洗涤剂中PhuPro1蛋白质在pH 6时清洁PA-S-38微布样的剂量响应。
图7.5B示出了ADW洗涤剂中PhuPro1蛋白质在pH 8时清洁PA-S-38微布样的剂量响应。
图7.6示出了PhuPro1与其他蛋白质同源物的比对。
图7.7提供了PhuPro1及其同源物的系统发育树。
图7.8A和图7.8B示出了PhuPro1与
Figure BDA0000916970520000081
Prime HA蛋白酶的清洁性能。
图8.1提供了pGX146(aprE-PamPro1)的质粒图谱，实施例8.2描述了这种质粒。
图8.2提供了PamPro1在偶氮酪蛋白分析中的剂量响应曲线。
图8.3提供了经纯化PamPro1的pH分布图。
图8.4提供了经纯化PamPro1的温度分布图。
图8.5A示出了ADW洗涤剂中PamPro1蛋白质在pH 6时清洁PA-S-38微布样的剂量响应。
图8.5B示出了ADW洗涤剂中PamPro1蛋白质在pH 8时清洁PA-S-38微布样的剂量响应。
图8.6示出了PamPro1与蛋白酶同源物的比对。
图8.7提供了PamPro1及其同源物的系统发育树。
图9.1A至图9.1D示出了各种类芽孢杆菌金属蛋白酶与其他细菌金属蛋白酶同源物的比对。
图9.2提供了各种类芽孢杆菌金属蛋白酶与其他细菌金属蛋白酶同源物的系统发育树。
发明详述
本发明提供了新型金属蛋白酶，特别是由各种类芽孢杆菌属物种克隆且可用于洗涤剂组合物的金属蛋白酶。所述组合物和方法部分地基于这样的观察结果：在存在洗涤剂组合物的情况下本发明的新型金属蛋白酶具有蛋白水解活性。该特征使本发明的金属蛋白酶特别适合并可用于多种清洁应用，在这些清洁应用中，所述金属蛋白酶可以在有洗涤剂组合物中的表面活性剂与其他组分存在的情况下，将多肽水解。本发明包括组合物，所述组合物含有至少一种本文示出的新型金属蛋白酶。此类组合物中的一些包括洗涤剂组合物。本发明的金属蛋白酶可以与其他可用于洗涤剂组合物的酶组合。本发明还提供使用本发明的金属蛋白酶进行清洁的方法。
定义和缩写
除非另外指明，否则本发明的实践涉及分子生物学、蛋白质工程、微生物学与DNA重组技术领域常用的常规技术，这些技术都在本领域技术范围内。本领域技术人员熟悉这些技术，而且他们熟知的许多文献和参考工具书都讲述过这些技术。本文提及的所有专利、专利申请、论文和出版物，无论是上文已提到过、还是下文将提到的，都据此明确以引用方式并入本文。
除非本文另外指明，否则本文使用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一致。本领域的技术人员知道多本技术词典。本文描述了一些适用的方法和材料，但是，与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可用于实践本发明。因此，通过从整体上参考说明书，下文随即要定义的术语将得到更充分的描述。另外，如本文所用，表明单数的词“一个”、“一种”和“该”也包括复数含义，除非上下文明确另有所指。除非另外指明，否则分别地，核酸从左至右以5'至3'取向写出，氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。应当理解，本发明不限于述及的具体方法、方案和试剂，因为这些具体方法、方案和试剂会根据本领域技术人员使用它们的环境改变而变化。
此外，本文提供的标题不对本发明的各方面或各实施方案构成限制。
在本说明书通篇中给出的每一个最大阈限值都旨在包括每一个较小的阈限值，就如同此较小的阈限值在文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个最小阈限值都包括每一个较大的阈限值，就如同此较大的阈限值在文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落入此较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就如同此较窄数值范围在文中悉数明确写出一样。
如本文所用，术语“蛋白酶”是指能够分解蛋白质和肽的酶。蛋白酶能够水解肽键而发挥“蛋白水解”作用，所述肽键在肽或形成蛋白质的多肽链中将氨基酸连接在一起。蛋白酶作为蛋白消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。有多种众所周知的用于测量蛋白水解活性的工序(参见例如Kalisz,“Microbial Proteinases,”:Fiechter编辑的Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，1988年)。例如，蛋白水解活性可通过比较试验探知，这种比较试验分析相应蛋白酶水解适宜底物的能力。可用于蛋白酶活性分析或蛋白水解活性分析的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。本领域熟知利用这些底物的比色测定法(参见例如WO 99/34011和美国专利No.6,376,450，这两份专利都以引用方式并入本文)。也可使用肽基pNA测定法(参见例如Del Mar等人，Anal.Biochem.，第99卷，第316-320页，1979年)确定活性酶浓度。该测定法测量蛋白酶水解可溶性合成底物例如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时，释出对硝基苯胺的速率。用分光光度计在410nm处测量水解反应产生黄色的速率，该速率与活性酶浓度成比例。此外，可测量280nm处的吸光度，用测量结果确定经纯化蛋白质样品中的总蛋白浓度。酶对底物的活性与蛋白质浓度之比为酶的比活性。
如本文所用，术语“变体多肽”是指，这种多肽包含与亲本多肽或参考多肽(包括但不限于野生型多肽)的氨基酸序列至少有一个氨基酸残基不同的氨基酸序列。
如本文所用，“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内所有菌种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。公认芽孢杆菌属继续经历分类学的重组。因此该属旨在包括已经重新分类的物种，包括但不限于生物体例如嗜热脂肪芽孢杆菌，现命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”。在胁迫环境条件下生成抗性内生孢子被视为芽孢杆菌属的定义特征，但这种特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属、兼性芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、类芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、纤细芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属、中度嗜盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、尿素芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，是指在一条链中共价结合的核苷酸单体的任意长度的聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)是含有脱氧核糖核苷酸的多核苷酸，RNA(核糖核酸)是核糖核苷酸的聚合物，它们是具有不同生物学功能的多核苷酸或核酸的示例。多核苷酸或核酸包括但不限于，单链、双链或三链的DNA，基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或包含其他天然的、化学修饰的、生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的非限制性示例如下：基因、基因片段、染色体片段、表达序列标签(EST)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。
如本文所用，术语“突变”是指在参考氨基酸或核酸序列中发生的改变。该术语旨在涵盖置换、插入和缺失。
如本文所用，术语“载体”是指用于将核酸引入或转移进靶细胞或组织的核酸构建体。载体通常用于将外来DNA引入细胞或组织。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如病毒载体)、粘粒、表达载体、穿梭载体等。载体通常包含复制起点、多克隆位点和选择性标记。将载体插入靶细胞的过程通常称为转化。在一些实施方案中本发明包括含有编码金属蛋白酶多肽(例如前体或成熟金属蛋白酶多肽)的DNA序列的载体，该DNA序列有效连接至合适的前序列(例如分泌序列、信号肽序列等)，此前序列能够影响DNA序列在合适宿主中的表达、以及重组多肽链的折叠与转位。
如本文所用，术语“表达盒”、“表达质粒”或“表达载体”是指以重组方式或以合成方式产生的、用来在靶细胞中表达所关注核酸的核酸构建体或载体。表达载体或表达盒通常包含驱动外来核酸表达的启动子核苷酸序列。表达载体或表达盒通常还可以包含允许特定核酸在靶细胞中转录的任何其他指定的核酸元件。重组表达盒可掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。
在一些实施方案中，序列的末端是闭合的，因此DNA构建体形成闭环。用本领域熟知的技术掺入DNA构建体中的所关注核酸序列可以是野生型的、突变型的或经修饰的核酸。在一些实施方案中，DNA构建体包含一个或多个与宿主细胞染色体同源的核酸序列。在其他实施方案中，DNA构建体包含一个或多个非同源核苷酸序列。一旦体外组装了DNA构建体，就可将其用于例如：1)将异源序列插入宿主细胞的所需靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列置换内源序列)；3)删除靶基因；和/或4)将复制型质粒引入宿主中。“DNA构建体”与“表达盒”在本文中可互换使用。
如本文所用，“质粒”是指染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。质粒是双链的，而且可以是环状的，通常用作克隆载体。
如本文在将核酸序列引入细胞的语境中所用，术语“引入”是指任何适于将核酸序列转移进细胞的方法。适用于引入的此类方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、电穿孔、接合和转导(参见例如Ferrari等人，Genetics，载于Hardwood等人编辑的Bacillus，普莱南出版公司(Plenum Publishing Corp.)，第57-72页，1989年)。
转化是指由遗传物质(例如DNA)的吸收、可选的基因组整合和表达所致的细胞的遗传变更。
如本文所用，一条核酸与另一条核酸序列建立功能关系时，该核酸与另一条核酸序列为“有效连接”。例如，如果启动子影响核苷酸编码序列的转录，则称该启动子或增强子有效连接至该编码序列。如果核糖体结合位点被放置在利于编码序列翻译的位置，则该核糖体结合位点有效连接至该编码序列。通常，“有效连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不必是连续的。连接可以通过在便利的限制性位点处的连接反应来实现。若没有限制性位点，则可依据常规操作，使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，术语“基因”是指多核苷酸(例如DNA片段)，该多核苷酸编码多肽，而且包含位于编码区之前和之后的区域以及位于各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
如本文所用，在用于指细胞时“重组的”通常指该细胞已通过引入外来核酸序列而进行了修饰，或指该细胞衍生自经过如此修饰的细胞。例如，重组细胞可包含以不同形式存在于天然(非重组)形式的这种细胞内的基因，或者重组细胞可包含(存在于天然形式的这种细胞中的)天然基因，但该基因已经过修饰并被再次引入该细胞内。重组细胞可包含对该细胞而言是内源性的核酸，但该内源性核酸在未移出该细胞的情况下已被修饰；这种修饰包括利用基因置换、定点突变以及本领域普通技术人员已知的相关技术获得的那些修饰。重组DNA技术包括体外产生重组DNA和将该重组DNA转移进细胞的技术，该重组DNA可在细胞中表达或增殖，从而产生重组多肽。多核苷酸或核酸的“重组”和“重组的”，一般是指两条或更多条核酸或多核苷酸链或片段组装或组合，从而产生新的多核苷酸或核酸。重组的多核苷酸或核酸有时称为嵌合体。如果核酸或多肽是人造的或工程化改造的，就是“重组的”。
如果核酸或多核苷酸在天然状态下或被本领域技术人员已知的方法操纵时可转录和/或翻译产生多肽或多肽片段，则称该核酸或多核苷酸“编码”多肽。也称这种核酸的反义链编码该序列。
“宿主株”或“宿主细胞”是指适合包含所关注DNA序列的表达载体的宿主。
“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的多聚序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。本发明通篇使用的氨基酸单字母和三字母代码符合IUPAC-IUB联合委员会的生物化学命名规则(JCBN)。单字母X是指二十种氨基酸中的任何一种。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。突变可按以下方式命名：表示亲本氨基酸的单字母代码，后接位置编号，然后是表示变体氨基酸的单字母代码。例如，第87位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。突变还可以使用氨基酸三字母代码后接其在多肽链中的位置(从N端开始计数)命名，例如，Ala10是指第10位丙氨酸。多重突变通过在突变之间插入“-”表示。第87位和第90位的突变表示为“G087S-A090Y”或“G87S-A90Y”，或者“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。用单字母代码“Z”表示缺失。如果是相对亲本序列插入，则单字母代码“Z”位于位置编号左侧。如果是缺失，则单字母代码“Z”位于位置编号右侧。就插入而言，位置编号是插入的氨基酸之前的位置编号，每个氨基酸加上0.01。例如，如果在第87位和第88位之间插入丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和酪氨酸(Y)这三个氨基酸，则表示为“Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y”。因此，合并上述所有突变，再加上第100位缺失，得到：“G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”。在描述修饰时，位置后跟括号，括号内列出氨基酸，表明该位置可被括号内列出的任一种氨基酸置换。例如，6(L,I)是指第6位可被亮氨酸或异亮氨酸置换。
“前序列”(prosequence)或“前肽序列”(propeptide sequence)是指位于信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的、蛋白酶正确折叠和分泌必不可少的氨基酸序列；有时被称为分子内伴侣。切除前序列或前肽序列会得到成熟的活性蛋白酶。细菌金属蛋白酶通常以酶原形式表达。
术语“信号序列”或“信号肽”是指可参与成熟形式或前体形式蛋白质的分泌或指导转运的氨基酸残基序列。信号序列通常位于前体或成熟蛋白质序列的N端。信号序列既可以是内源性的，也可以是外源性的。正常情况下，成熟蛋白质中没有信号序列。信号序列通常在蛋白质完成转运后被信号肽酶从蛋白质切除。
蛋白质、多肽或肽的术语“成熟”形式，是指蛋白质、多肽或肽不含信号肽序列和前肽序列的功能性形式。
蛋白质或肽的术语“前体”形式，是指具有有效连接至蛋白质的氨基或羰基末端的前序列的蛋白质的成熟形式。前体还可含有效连接至前序列氨基末端的“信号”序列。前体还可具有参与翻译后活性的附加多肽(例如，为留下成熟形式的蛋白质或肽，从前体切除的多肽)。
与氨基酸序列或核酸序列有关的术语“野生型”，是指氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如，蛋白质、氨基酸或核酸序列)。
如本文所用，术语“非天然存在的”是指，作为野生型序列的修饰，在自然界中不存在的任何物质(例如，在实验室内制出的重组核酸和蛋白质序列)。
如本文所用，有关氨基酸残基位置的说法“与……相对应”、“对应于”或“对应”，是指氨基酸残基位于蛋白质或肽的列举位置处，或与蛋白质或肽中列举的残基类似、同源或等同。如本文所用，“对应区域”一般是指相关蛋白质或参考蛋白质中类似的位置。
术语“来源于”与“获自”不仅指由所述及的生物株产生或可以产生的蛋白质，还指由分离自该生物株的DNA序列编码并在含这种DNA序列的宿主生物中产生的蛋白质。此外，该术语还可以指，由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码、并且具有所考虑的蛋白质的鉴别特征的蛋白质。举例来说，“来源于芽孢杆菌的蛋白酶”是指芽孢杆菌天然产生的、具有蛋白水解活性的那些酶，还指类似于芽孢杆菌来源产生的那些酶的丝氨酸蛋白酶，但此类丝氨酸蛋白酶是采用基因工程技术、由编码该丝氨酸蛋白酶的核酸转化的非芽孢杆菌生物产生的。
在两种核酸或多肽序列的语境中，术语“同一”是指，如使用下述序列比较或分析算法中的一种测量的，当进行比对达到最大对应性时，这两种序列中相同的残基。
如本文所用，“同源基因”是指来自不同但通常相关的物种的一对基因，这对基因彼此对应，而且彼此相同或极其类似。该术语涵盖了因物种形成(即新物种形成)而分离的基因(例如直系同源基因)，以及因基因复制而分离的基因(例如旁系同源基因)。
如本文所用，“同一性％或同一性百分比”是指序列相似性。可使用本领域已知的标准技术来确定同一性百分比(参见例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，第2卷第482页，1981年；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，第48卷第443页，1970年；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第85卷第2444页，1988年；软件程序，例如威斯康星遗传学软件包(美国威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,Madison,WI))中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA程序；以及Devereux等人，Nucl.Acid Res.，第12卷第387-395页，1984年)。PILEUP是可用算法的一个示例。PILEUP利用渐进式成对序列比对法，由一组相关的序列产生多序列比对。该算法还可以画出树状图，显示用来产生比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法的简化(参见Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，第35卷第351-360页，1987年)。该方法类似Higgins和Sharp描述的方法(参见Higgins和Sharp，CABIOS，第5卷第151-153页，1989年)。可用的PILEUP参数包括3.00的默认空位权重、0.10的默认空位长度权重、和加权末端空位。另一个可用的算法是Altschul等人描述的BLAST算法(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.，第215卷第403-410页，1990年)；Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787[1993](Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷第5873-5787页，1993年)。BLAST程序使用若干个搜索参数，其中大多数都被设定为默认值。
NCBI BLAST算法依据生物学相似性找到最相关的序列，但不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul,SF等人，1997年，Nucleic Acids Res.，第25卷第3389-3402页；Schaffer,AA等人，2001年，Nucleic Acids Res.，第29卷第2994-3005页)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数是：
·相邻字串阈值：11
·E‐截止值：10
·计分矩阵：NUC.3.1(匹配＝1，不匹配＝‐3)
·空位开放：5
·空位延伸：2
氨基酸序列搜索采用下列参数：
·字长：3
·E‐截止值：10
·计分矩阵：BLOSUM62
·空位开放：11
·空位延伸：1
氨基酸序列同一性百分比(％)的值通过匹配的相同残基数除以“参考”序列中的总残基数来确定，其中“参考”序列包含程序为了实现最佳/最大比对而生成的任何空位。如果序列与SEQ ID NO：A的同一性百分比为90％，则称SEQ ID NO：A为“参考”序列。BLAST算法把“参考”序列当作“查询”序列。
序列比对算法的另一个示例是CLUSTAL W算法。参见Thompson等人，1994年，Nucleic Acids Res.，第22卷第4673-4680页。CLUSTAL W算法的默认参数为：
空位开放罚分： 10.0
空位延伸罚分： 0.05
蛋白质权重矩阵： BLOSUM系列
DNA权重矩阵： IUB
延迟发散序列％(Delay divergent sequences％)： 40
空位间隔距离： 8
DNA转换权重(DNA transitions weight)： 0.50
亲水性残基列表： GPSNDQEKR
使用负性矩阵： 关
切换残基特定罚分： 开
切换亲水性罚分： 开
切换末端空位间隔罚分 关。
在CLUSTAL算法中，包括任一端出现的缺失。例如，在500个氨基酸的多肽的任一端(或该多肽内)有五个氨基酸缺失的变体，相对于“参考”多肽的序列同一性百分比为99％(495个相同残基/500×100)。这种变体被与该多肽具有“至少99％的序列同一性”的变体涵盖。
如果所关注多肽包含与参考多肽的氨基酸序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的氨基酸序列，则可称所关注多肽与参考多肽“实质上相同”。该两条多肽的同一性百分比可通过观察两条经最佳比对的多肽序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽发生免疫交叉反应。通常，因保守氨基酸置换而不同的多肽会发生免疫交叉反应。所以，例如在某条多肽与第二多肽只因保守氨基酸置换或因一个或多个保守氨基酸置换而不同的情况下，这两条多肽实质上相同。
如果所关注核酸包含与参考核酸的核苷酸序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的核苷酸序列，则可称所关注核酸与参考核酸“实质上相同”。两条这类核酸的同一性百分比可通过观察两条经最佳比对的核酸序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条核酸序列实质上相同的一个指示是这两个核酸分子在严格条件(例如，在中等至高严格度的范围内)下彼此杂交。
如果核酸或多核苷酸与其他组分(包括但不限于(例如)其他蛋白质、核酸、细胞等)至少部分或完全分离，则该核酸或多核苷酸是“分离的”。类似地，如果多肽、蛋白质或肽与其他组分(包括但不限于(例如)其他蛋白质、核酸、细胞等)至少部分或完全分离，则该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。分离的物质在组合物中的丰度(以摩尔计)比其他物质高。例如，分离的物质可以占所有存在的大分子物质的至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％(以摩尔计)。优选的是，所关注物质被纯化达到基本上均一(即，采用常规检测方法在组合物中检测不到污染物)。纯度和均一性可以使用本领域熟知的多种技术测定，例如核酸或蛋白质样品的琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着在染色时可视化。如果需要，可采用高分辨率技术，譬如高效液相色谱法(HPLC)或类似的方法来纯化材料。
“杂交”是指一条核酸链与互补链形成双链(即发生碱基配对)的过程。如果某核酸序列与参考核酸序列在适度至高严格度的杂交与洗涤条件下彼此特异性杂交，则认为这两条核酸序列“可选择性杂交”。杂交条件以核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为基础。例如，“最高严格度”通常出现在大约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；“高严格度”通常出现在大约比Tm低5℃至10℃；“中等严格度”通常出现在大约比探针的Tm低10℃至20℃；并且“低严格度”通常出现在大约比Tm低20℃至25℃。在功能方面，可用最高严格度条件鉴别与杂交探针具有严格同一性或接近严格同一性的序列；而可用中等或低严格度杂交鉴别或检测多核苷酸序列的同源物。
适度和高严格度杂交条件是本领域熟知的。用下列条件下的杂交举例说明严格杂交条件：65℃和0.1X SSC(其中1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)。杂交的双链核酸用解链温度(Tm)来表征，在该温度下，有一半杂交核酸未与互补链配对。双链内错配的核酸可以降低Tm。极高严格度杂交条件包括68℃和0.1X SSC。编码金属蛋白酶变体的核酸的Tm，与该核酸及其相同互补物间形成的双链的Tm相比，可降低1℃至3℃或更多。
高严格度条件的另一示例包括：在约42℃的50％甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt溶液、0.5％SDS和100μg/mL变性载体DNA中杂交，随后在室温2X SSC和0.5％SDS中洗涤两次，在42℃0.1X SSC和0.5％SDS中再洗涤两次。适度严格度条件的示例包括：在包含20％甲酰胺、5X SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5X Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/mL变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中于37℃温育过夜，然后在约37℃至50℃的1X SSC中洗涤滤膜。本领域技术人员知道如何调整温度、离子强度等，来适应例如探针长度等因素。
术语“经纯化”在用于核酸或多肽时，一般表示根据本领域熟知的分析技术测定，核酸或多肽基本上不含其他组分(例如，经纯化多肽或多核苷酸在电泳凝胶、层析洗脱液和/或经过密度梯度离心的介质中形成独立的条带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一个条带的核酸或多肽是“经纯化”的。经纯化核酸或多肽至少为约50％纯度，通常至少为约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更高纯度(例如，以摩尔计的重量百分比)。在相关的意义上，本发明提供了在组合物中富集本发明的一种或多种分子(例如本发明的一种或多种多肽或多核苷酸)的方法。如果在应用纯化或富集技术后，组合物中某种分子的浓度显著增加，则认为在组合物中富集了这种分子。实质上纯的本发明的多肽或多核苷酸(例如，实质上纯的本发明的金属蛋白酶多肽，或编码本发明的金属蛋白酶多肽的多核苷酸)通常至少占特定组合物中所有大分子物质重量的约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或更多(以摩尔计)。
术语“富集的”是指组合物中存在的化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定的材料或组分的相对或绝对浓度比起始组合物中的高。
在相关的意义上，本发明提供了在组合物中富集本发明的一种或多种分子的方法，其中本发明的一种或多种分子例如：本发明的一种或多种多肽(例如，本发明的一种或多种金属蛋白酶多肽)、或本发明的一种或多种核酸(例如，编码本发明的一种或多种金属蛋白酶多肽的一种或多种核酸)。如果在应用纯化或富集技术后，组合物中某种分子的浓度显著增加，则认为在组合物中富集了这种分子。实质上纯的多肽或多核苷酸通常至少占特定组合物中所有大分子物质重量的约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或更多(以摩尔计)。
如本文所用，术语“功能测定法”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施方案中，该术语是指用来分析蛋白质以其通常的性能发挥作用的能力的测定系统。例如，就蛋白酶来说，功能测定法涉及测定蛋白酶水解蛋白质底物的效力。
术语“经修饰的核酸序列”和“经修饰的基因”在本文中可互换使用，是指包含天然存在的(即野生型)核酸序列的缺失、插入或中断的核酸序列。在一些实施方案中，经修饰的核酸序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果修饰为序列的缺失或中断的话)。在一些实施方案中，截短的蛋白质保留生物活性。在备选实施方案中，经修饰的核酸序列的表达产物是延长的蛋白质(例如，修饰包含在核酸序列中的插入)。在一些实施方案中，核苷酸插入核酸序列会得到截短的蛋白质(例如，在插入导致终止密码子形成的情况下)。因此，插入可以导致表达产物为截短的蛋白质或延长的蛋白质。
“突变”核酸序列通常指这样的核酸序列，其在宿主细胞的野生型序列中发生至少一个密码子改变，使得该突变核酸序列的表达产物为氨基酸序列相对野生型蛋白质改变的蛋白质。表达产物可以具有改变的功能性能力(例如，酶活性增强)。
如本文所用，短语“底物特异性改变”是指酶的底物特异性发生改变。在一些实施方案中，底物特异性改变被定义为，由于酶突变或反应条件改变而导致的针对特定底物的kcat和/或Km发生改变。酶的底物特异性通过比较酶表现出的对不同底物的催化效率来测定。这些测定结果尤其可用于评估突变酶的效率，因为通常期望产生的酶变体对所关注底物表现出更大的kcat/Km比率。然而，无意将本发明限定于任何特定的底物组合物或底物特异性。
如本文所用，“表面特性”用于指蛋白质的表面呈现的静电荷，以及诸如疏水性和亲水性之类的性质。如本文所用，术语“净电荷”被定义为分子中存在的全部电荷的总和。可以使亲本蛋白质分子发生“净电荷改变”，以提供净电荷不同于亲本分子的变体(即，变体所带净电荷与亲本分子的净电荷不同)。例如，用带负电的氨基酸置换中性氨基酸，或用中性氨基酸置换带正电的氨基酸，会导致相对亲本分子为-1的净电荷。用带负电的氨基酸置换带正电的氨基酸，会导致相对亲本分子为-2的净电荷。用带正电的氨基酸置换中性氨基酸，或用中性氨基酸置换带负电的氨基酸，会导致相对亲本分子为+1的净电荷。用带正电的氨基酸置换带负电的氨基酸，会导致相对亲本分子为+2的净电荷。凭借缺失和/或插入带电荷的氨基酸也能够改变亲本蛋白质的净电荷。净电荷改变适用于在相同的pH条件下测定时变体相对亲本的电荷改变。
术语“热稳定的”、“耐热的”和“热稳定性”是指，在被暴露于改变的温度时，蛋白酶在本发明的蛋白分解、水解、清洁或其他过程中普遍存在的条件下暴露于指定的温度一段给定的时间后保留特定量的酶活性。“改变的温度”包括升高或降低的温度。在一些实施方案中，蛋白酶在暴露于改变的温度一段给定的时间，例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等之后，至少保留约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。
在氧化、螯合剂、热、化学、自溶和/或pH稳定的蛋白酶的语境中，术语“稳定性增强”是指，相比其他蛋白酶(例如，嗜热菌蛋白酶)和/或野生型酶，随时间推移，保持了较高的蛋白水解活性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶的语境中，术语“稳定性减弱”是指，相比其他蛋白酶(例如，嗜热菌蛋白酶)和/或野生型酶，随时间推移，保持了较低的蛋白水解活性。
术语“清洁活性”是指，在本发明的蛋白分解、水解、清洁或其他过程中普遍存在的条件下，由金属蛋白酶多肽或参考蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽或参考蛋白酶的清洁性能可使用针对清洁物品或表面上的一种或多种不同的酶敏感污渍(例如，食物、草、血液、墨、奶、油和/或卵蛋白引起的污渍)的多种检测法测定。变体或参考蛋白酶的清洁性能可采用以下方法测定：对物品或表面上的污渍施予标准洗涤条件，然后使用各种色谱法、分光光度法或其他定量方法评估污渍被移除的程度。示例性的清洁测定法和清洁方法是本领域熟悉的，包括但不限于WO99/34011和美国专利6,605,458(这两份专利都以引用方式并入本文)中描述的那些，以及下文的实施例中包含的那些清洁测定法和清洁方法。
金属蛋白酶多肽或参考蛋白酶的术语“清洁有效量”，是指在特定清洁组合物中实现所期望的酶活性水平的蛋白酶量。本领域的普通技术人员可以轻易确定这种有效量，这种有效量取决于多种因素，例如用到的特定蛋白酶、清洁用途、清洁组合物的具体组成，是需要液体组合物还是干燥组合物(例如，粒状、片状或条状组合物)，等等。
术语“清洁助剂材料”是指清洁组合物中包含的除本发明金属蛋白酶多肽之外的任何液体、固体或气体材料。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种清洁助剂材料。通常根据清洁组合物的具体类型和形式(例如，液体、颗粒、粉末、条棒、糊剂、喷雾、片状物、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁助剂材料。优选的是，每种清洁助剂材料都与组合物中用到的蛋白酶相容。
在清洁活性的语境中，术语“性能增强”是指，通过在某些酶敏感污渍(例如蛋、奶、草、墨、油和/或血液)上测量，在标准洗涤循环和/或多个洗涤循环之后采用常规评估法确定，酶的清洁活性相比亲本蛋白或参考蛋白的增加或提高。
在清洁活性的语境中，术语“性能减弱”是指，在标准洗涤循环和/或多个洗涤循环之后采用常规评估法确定，酶在某些酶敏感污渍(例如蛋、奶或血液)上的清洁活性减小或降低。
清洁组合物和清洁制剂包括适于对任何物体、物品和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的任何组合物。此类组合物和制剂包括但不限于例如：液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物，(例如液体、片、凝胶、条棒、颗粒和/或固体)衣物清洁组合物或洗涤剂组合物以及精细织物洗涤剂组合物；硬表面清洁组合物和制剂，例如用于玻璃、木材、陶瓷及金属台面和窗的那些；地毯清洁剂；烘箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、洗衣添加剂清洁组合物、和衣物预去污清洁组合物；盘碟洗涤组合物，包括手洗或手动盘碟洗涤组合物(例如“手洗”或“手动”盘碟洗涤剂)和自动盘碟洗涤组合物(例如“自动盘碟洗涤剂”)。
除非另外指明，否则如本文所用，清洁组合物或清洁制剂包括颗粒或粉末形式的通用型清洗剂或重垢型清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片状物或糊剂形式的通用型清洗剂，尤其是所谓的重垢型液体(HDL)洗涤剂或重垢型粉末洗涤剂(HDD)类型；液体精细织物洗涤剂；手洗或手动盘碟洗涤剂，包括高泡类型的那些；手洗或手动盘碟洗涤剂、自动盘碟洗涤剂，或盘碟或餐具清洗剂，包括家居和机构使用的各种片状物、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁剂和消毒剂，包括抗菌洗手类型、清洁条棒、漱口水、假牙清洁剂、汽车香波、地毯香波、浴室清洁剂；人和其他动物用的洗发香波和/或护发素；沐浴露、泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污条”或预处理类型。在一些实施方案中，颗粒状组合物为“密实”形式(compact form)；在一些实施方案中，液体组合物为“浓缩”形式。
如本文所用，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括洗涤添加剂组合物和适用于浸泡和/或预处理脏污织物(例如布料、亚麻布和其他纺织材料)的组合物。
如本文所用，“非织物清洁组合物”包括非纺织物(即非织物)表面清洁组合物，包括但不限于(例如)手洗或手动或自动盘碟洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物和个人清洁组合物。
如本文所用，术语“织物和/或硬表面清洁和/或处理组合物”是清洁组合物和处理组合物的子集，除非另外指明，其包括颗粒或粉末形式的通用型清洗剂或“重垢型”清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂形式的通用型清洗剂，尤其是所谓的重垢型液体类型；液体精细织物洗涤剂；手洗盘碟洗涤剂或轻垢型盘碟洗涤剂，尤其是高泡类型的那些；机洗盘碟洗涤剂，包括家居和机构使用的各种片状物、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁剂和消毒剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂(包括抽水马桶清洁剂在内)；可为液体、固体和/或干衣机布(dryer sheet)形式的织物调理产品(包括软化和/或清新)；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污条”或预处理类型，负载基质的(substrate-laden)产品如添加的干衣机布。适用的所有此类产品可为标准形式、浓缩形式或甚至高度浓缩形式，甚至到此类产品在某方面可能为非水性的程度。
如本文所用，术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”用来表示,旨在用于在洗涤介质中清洁脏污的或弄脏的物体(包括特定织物和/或非织物的物体或物品)的组合物。本发明的此类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或制剂。实际上，在一些实施方案中，本发明的洗涤剂至少包含一种本发明的金属蛋白酶多肽，此外还可以包含一种或多种表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(如助洗盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、抗结块剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在某些情况下，助洗盐是硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选的是硅酸盐(如偏硅酸钠)比磷酸盐(如三聚磷酸钠)多。本发明的一些组合物，例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物，不包含任何磷酸盐(如磷酸盐或磷酸助洗剂)。
如本文所用，术语“漂白”是指在足够长的一段时间内和/或在适当的pH和/或温度条件下处理材料(例如，织物、衣物、纸浆等)或表面，以实现该材料的增亮(即，增白)和/或清洁。适用于漂白的化学品的示例包括但不限于(例如)ClO2、H2O2、过酸、NO2等。
如本文所用，蛋白酶(例如，本发明的金属蛋白酶多肽)的“洗涤性能”是指金属蛋白酶多肽对洗涤的贡献，与未向组合物添加金属蛋白酶多肽的洗涤剂相比，这种贡献赋予洗涤剂额外的清洁性能。洗涤性能是在相关洗涤条件下比较的。在一些测试系统中，可以控制其他相关因素(例如洗涤剂组成、泡沫浓度、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度)，以模拟某些细分市场中家居应用(例如，手洗或手动盘碟洗涤、自动盘碟洗涤、盘碟清洁、餐具清洁、织物清洁等)的典型条件。
术语“相关洗涤条件”在本文中用来指，在手洗盘碟洗涤、自动盘碟洗涤或衣物洗涤剂细分市场中在家庭中实际使用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
术语“洗涤性能改善”用来指在相关洗涤条件下，在去污方面获得更好的最终结果，或相对于相应的野生型或起始亲本蛋白酶，需要较少(以重量计)的金属蛋白酶多肽即可获得相同的最终结果。
如本文所用，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。无意于将本发明限定于任何特定的表面、物品，或任何要除去的污染物或微生物。
本文的清洁组合物的“密实”(compact)形式由密度以及就组成来说由无机填料盐的量最佳地反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐大量存在，通常占总组合物重量的约17％至约35％。相比而言，在密实组合物中，填料盐以不超过总组合物约15％的量存在。在一些实施方案中，填料盐以不超过组合物重量约10％、更优选不超过组合物重量约5％的量存在。在一些实施方案中，无机填料盐选自硫酸和氯化物的碱金属盐和碱土金属盐。在一些实施方案中，填料盐为硫酸钠。
除非上下文中另有明确规定，否则本文中就数值而言所用的术语“约”是指该数值+/-0.5的范围。例如，除非另有明确规定，否则短语“约6的pH值”是指5.5至6.5的pH值。
本文通常使用SEQ ID NO：3、8、13、18、23、28、33或38中所示野生型类芽孢杆菌金属蛋白酶氨基酸序列中对应氨基酸残基的位置编号，对给定氨基酸序列中氨基酸残基的位置进行编号。因此，将类芽孢杆菌的金属蛋白酶氨基酸序列当作参考亲本序列。可使用本文所述的比对算法，将给定的氨基酸序列(例如本文所述的金属蛋白酶氨基酸序列及其变体)与野生型金属蛋白酶序列(如SEQ ID NO：3)比对；并且，与野生型序列中的氨基酸残基对齐(优选最佳对齐)的给定氨基酸序列中的氨基酸残基，可以方便地参照该金属蛋白酶序列中的对应氨基酸残基进行编号。
寡核苷酸的合成和纯化步骤通常依照说明书执行。一般根据本领域众所周知的常规方法以及本文通篇提供的各种一般参考文献，来执行相应技术和工序。据信，其中的工序是本领域普通技术人员熟知的，并且为了方便读者阅读而提供。
本发明的金属蛋白酶多肽
本发明提供新型金属蛋白酶多肽，其可统称为“本发明的酶”或“本发明的多肽”。本发明的多肽包括分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽可用于清洁应用，而且可掺入清洁组合物中，所述清洁组合物可用于清洁需清洁的物品或表面的方法。
在一些实施方案中，本发明的酶与SEQ ID NO：3、8、13、18、23、28、33或38具有50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在各实施方案中，本发明的酶与来自表1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、6.2、7.2或8.2中任何属的金属蛋白酶具有50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，本发明的酶(包括上文的全部实施方案)可来源于芽孢杆菌目成员，或芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科、脂环酸芽孢杆菌科或乳杆菌科。在一些实施方案中，本发明的酶(包括上文的全部实施方案)可来源于芽孢杆菌属、脂环酸芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、微小杆菌属、乳杆菌属或类芽孢杆菌属物种。在一些实施方案中，本发明的酶(包括上文的全部实施方案)可来源于粉蚧科的成员。在一些实施方案中，本发明的酶(包括上文的全部实施方案)可来源于游动球菌属物种。已发现，彼此间具有高同一性、并与SEQ ID NO：3、8、13、18、23、28、33或38示出的类芽孢杆菌酶具有高同一性的各种金属蛋白酶。
在一个具体实施方案中，本发明是来源于类芽孢杆菌属的酶。在一个具体实施方案中，本发明是来源于类芽孢杆菌属并来源于类芽孢杆菌属物种、爱媛类芽孢杆菌、湖南类芽孢杆菌、巴塞罗那类芽孢杆菌、解淀粉类芽孢杆菌、腐殖质类芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌的酶。
本发明描述了与克隆自类芽孢杆菌属的酶相关的组合物和方法。所述组合物和方法部分地基于这样的观察结果：在存在洗涤剂组合物的情况下克隆和表达的本发明酶具有蛋白水解活性。另外，本发明的酶在洗涤剂组合物中表现出极佳的稳定性。这些特征使本发明的酶特别适用于多种清洁应用，在这些清洁应用中，本发明的酶可以在有表面活性剂以及存在于洗涤剂组合物中的其他组分的情况下，将蛋白质水解。
在一些实施方案中，本发明包括具有蛋白酶活性的分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的酶，其多肽包含与本文提供的亲本酶至少具有约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的多肽与示例的多肽具有指定程度的氨基酸序列同源性，例如，与SEQ ID NO 3、8、13、18、23、28、33或38的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、甚至至少99％的序列同源性。可利用氨基酸序列比对测定同源性，例如，使用本文所述的程序例如BLAST、ALIGN或CLUSTAL来测定。
还提供了具有蛋白酶活性的本发明多肽酶，所述酶包含氨基酸序列，当使用前述任一种比对方法比对时，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3、8、13、18、23、28、33或38的氨基酸序列相差不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过35个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸残基。
如上所述，本发明的变体酶多肽具有酶活性(例如蛋白酶活性)，因而可用于清洁应用，包括但不限于，用于清洁盘碟物品、餐具物品、织物和具有硬表面的物品(例如桌子、桌面、墙壁、家具、地板、天花板等的硬表面)的方法。包含本发明的一种或多种变体金属蛋白酶多肽的示例性清洁组合物在下文描述。使用本领域普通技术人员熟知的工序，可轻松测定本发明的酶多肽的酶活性(例如蛋白酶的酶活性)。下文提供的实施例描述了评估酶活性和清洁性能的方法。使用本领域内熟知的工序和/或实施例中提出的工序，可轻松测定本发明的多肽酶在去除污渍(例如蛋白质污渍，如血液/奶/墨或蛋黄)、清洁硬质表面，或清洁衣物、盘碟或餐具物品方面的性能。
本发明的金属蛋白酶多肽具有蛋白酶活性，因此，可用于酪蛋白水解、胶原蛋白水解、弹性蛋白水解、角蛋白水解、大豆蛋白水解或玉米粗粉蛋白水解。所以，本发明的多肽可用于其他应用，例如预处理食物、饲料，或降解蛋白质。
本发明的多肽还可用于预处理动物饲料产品，例如大豆蛋白、玉米粗粉和其他富含蛋白质的组分。用本发明的多肽预处理这些动物饲料产品，可有助于将复杂蛋白质分解成动物容易消化的水解产物。
在其他实施方案中，本发明公开的金属蛋白酶多肽可用于水解玉米大豆蛋白。本发明公开的金属蛋白酶多肽可单独使用，也可与其他蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶结合使用，而从玉米或大豆蛋白产生肽和游离氨基酸。在一些实施方案中，随后可将回收的蛋白质、肽或氨基酸用于动物饲料或人类食品。
本发明的多肽还可用于处理伤口，尤其可用于伤口清创。伤口清创是指除去死亡、受损或感染的组织，以提高剩余健康组织的愈合潜力。清创是烧伤和其他严重伤口的愈合过程中的重要部分。可使用包含本发明多肽的组合物处理伤口或烧伤，从而除去不需要的受损组织并改善健康组织。
本发明的金属蛋白酶多肽可以在很广的pH条件范围内具有蛋白酶活性。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽对偶氮酪蛋白底物有蛋白酶活性，实施例3.1至实施例3.8证实了这一点。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽在pH为约3.0至约12.0时具有蛋白酶活性。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽在pH为约4.0至约10.5时有蛋白酶活性。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽在pH为约5.5至约9.0时具有最大蛋白酶活性的至少70％。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽在pH为约6.0至约8.5时具有最大蛋白酶活性的至少80％。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽在pH为约7.5时具有最大蛋白酶活性。
在一些实施方案中，本发明的金属蛋白酶多肽在约10℃至约100℃的温度范围内有蛋白酶活性。在一些实施方案中，本发明的金属蛋白酶多肽在约20℃至约90℃的温度范围内有蛋白酶活性。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽在温度为约45℃至约60℃时具有最大蛋白酶活性的至少70％。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽在温度为50℃时具有最大蛋白酶活性。
在一些实施方案中，本发明的金属蛋白酶多肽在清洁组合物中展示出清洁性能。清洁组合物常包含对酶稳定性和酶性能有害的成分，这使清洁组合物对酶(如金属蛋白酶)保留功能来说是恶劣的环境。因此，将酶加入清洁组合物并预期酶功能(如，金属蛋白酶活性，例如由清洁性能展示的这种活性)，并不是无足轻重的。在一些实施方案中，本发明的金属蛋白酶多肽在自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂组合物中展示出清洁性能。在一些实施方案中，自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂组合物中的清洁性能包括蛋黄污渍的清洁。在一些实施方案中，本发明的金属蛋白酶多肽在衣物洗涤剂组合物中展示出清洁性能。在一些实施方案中，衣物洗涤剂组合物中的清洁性能包括血液/奶/墨污渍的清洁。本发明的金属蛋白酶多肽在每种清洁组合物中都展示出清洁性能，不论组合物含还是不含漂白组分都是如此。
本发明的金属蛋白酶多肽具有蛋白酶活性，因此，可用于酪蛋白水解、胶原蛋白水解、弹性蛋白水解、角蛋白水解、大豆蛋白水解或玉米粗粉蛋白水解。所以，本发明的多肽可用于其他应用，例如预处理食物、饲料，或降解蛋白质。
可对本发明的多肽作出各种改变，例如一个或多个氨基酸插入、缺失和/或置换(保守或非保守)，包括此类改变不实质上改变此多肽的酶活性的情况。相似地，也可对本发明的核酸作出各种改变，例如对一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸作出一个或多个置换，使得特定密码子编码相同或不同的氨基酸，从而导致沉默变异(例如，在所编码的氨基酸不因这种核苷酸突变而改变的情况下)或非沉默变异；序列中的一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个缺失；序列中的一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个添加或插入；以及/或者序列中的一个或多个核酸(或密码子)的切割或一个或多个截短。与初始核酸序列编码的多肽酶相比，核酸序列中的多种此类改变可能不会实质改变所得编码的多肽酶的酶活性。还可修饰本发明的核酸序列，使其包括一个或多个密码子用以在表达系统(例如，细菌表达系统)中提供最佳表达，同时，如果需要的话，所述一个或多个密码子仍编码相同的氨基酸。
在一些实施方案中，本发明提供具有期望酶活性(例如，蛋白酶活性或清洁性能活性)的一类酶多肽，这类酶多肽可以包含具有本文所述的氨基酸置换的序列，还可以包含一个或多个附加的氨基酸置换，例如保守置换和非保守置换，其中所述多肽显示、保持或大致保持期望的酶活性(例如，由SEQ ID NO：3、8、13、18、23、28、33和38的多肽酶的清洁活性或清洁性能反映的蛋白水解活性)。根据本发明的氨基酸置换可包括但不限于一个或多个非保守置换和/或一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸残基置换通常涉及将一功能类别的氨基酸残基成员替换为属于同一功能类别的残基(在计算功能同源性百分比时，保守氨基酸残基被视为在功能上是同源的或保守的)。保守氨基酸置换通常涉及用功能类似的氨基酸置换氨基酸序列中的氨基酸。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸在功能上相似，因而可以用作彼此的保守氨基酸置换。天冬氨酸和谷氨酸可以用作彼此的保守置换。天冬酰胺和谷氨酰胺可以用作彼此的保守置换。精氨酸、赖氨酸和组氨酸可以用作彼此的保守置换。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸可以用作彼此的保守置换。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可以用作彼此的保守置换。
可以设想其他的保守氨基酸置换组。例如，可按相似功能或化学结构或组成将氨基酸分组(例如，酸性氨基酸、碱性氨基酸、脂族氨基酸、芳族氨基酸、含硫氨基酸)。例如，脂族氨基酸组可包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。包含彼此之间可以视为保守置换的氨基酸的其他组包括：芳族氨基酸组：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫氨基酸组：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性氨基酸组：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性氨基酸组：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；非极性不带电荷的残基组：半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)和脯氨酸(P)；亲水不带电荷的残基组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。本领域的技术人员熟知氨基酸的其他分组法，多种标准教科书都讲述了这些分组法。本文列出的多肽序列，与上述置换组结合起来，可以提供全部保守置换多肽序列的明确列表。
在上文描述的氨基酸残基类别中存在更保守的置换，这些置换也可为合适的或备选地可为合适的。更保守的保守置换组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本发明多肽序列的保守置换变异(例如，本发明的金属蛋白酶变体)包括小百分比的置换，有时不到多肽序列氨基酸的25％、20％、15％、14％、13％，12％、11％、10％、9％、8％、7％或6％，或不到5％、4％、3％、2％或1％，或者不到多肽序列氨基酸的10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换，其中置换成相同保守置换组的保守选择的氨基酸。
如本文其他地方更详细描述及本文所提供的实施例中所述，本发明的多肽可具有清洁能力，可将所述清洁能力与已知蛋白酶(包括已知的金属蛋白酶)相比较。
本发明的核酸
本发明提供分离的、非天然存在的或重组的核酸，其可统称为“本发明的核酸”或“本发明的多核苷酸”，编码本发明的多肽。本发明的核酸(包括下文描绘的全部核酸)可用于重组生产(例如表达)本发明的多肽，典型地通过表达包含编码所关注多肽或其片段的序列的质粒表达载体。如上文论述过，多肽包括具有酶活性(例如，蛋白水解活性)的金属蛋白酶多肽，这些金属蛋白酶多肽可用在清洁应用和清洁组合物中，用来清洁需要清洁的物品或表面(例如，物品的表面)。
在一些实施方案中，本发明提供分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的核酸，其包含编码本发明在上文题为“本发明的多肽”部分和本文其他地方中描述的任何多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本发明还提供分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码本发明在上文和本文其他地方中描述的任何多肽中的两种或更多种多肽的组合的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的核酸与SEQ ID NO：4、9、14、19、24、29、34和39具有50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
本发明提供了编码本发明的金属蛋白酶多肽的核酸，其中金属蛋白酶多肽是有蛋白水解活性的成熟形式，其中变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO：3、8、13、18、23、28、33或38示出的类芽孢杆菌金属蛋白酶多肽的氨基酸序列对应而编号。
可使用任何适宜的合成、操纵和/或分离技术或其组合，生产本发明的核酸。例如，可使用标准的核酸合成技术，例如本领域技术人员熟知的固相合成技术来生产本发明的多核苷酸。在此类技术中，通常合成包含多达50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后把这些片段连接起来(例如，采用酶连接方法或化学连接方法)，以形成基本上任何需要的连续核酸序列。也可使用本领域已知的任一种适宜方法来促进本发明核酸的合成，包括但不限于使用经典亚磷酰胺方法进行的化学合成(参见例如Beaucage等人，Tetrahedron Letters，第22卷第1859-1869页，1981年))；或Matthes等人描述的方法(参见Matthes等人，EMBO J.，第3卷第801-805页，1984年)，该方法通常以自动合成的方式实施。本发明的核酸也可使用自动DNA合成仪制备。可从多个商业来源(例如米德兰认证试剂公司(Midland CertifiedReagent Company)、大美洲基因公司(Great American Gene Company)、操纵子技术股份有限公司(Operon Technologies Inc.)和DNA2.0公司)订购定制的核酸。本领域还知道其他的合成核酸的技术和相关原理(参见例如Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.，第53卷第323页，1984年)；Itakura等人，Science，第198卷第1056页，1984年)。
如上文指出过，可用于修饰核酸的重组DNA技术是本领域熟知的。例如，本领域技术人员都了解像限制性内切核酸酶消化、连接、逆转录与产生cDNA、聚合酶链反应(如PCR)之类的技术，而且可以毫不费力地付诸实践。还可使用一种或多种寡核苷酸探针筛选cDNA文库，来获得本发明的核苷酸，这种寡核苷酸探针可与编码本发明的金属蛋白酶多肽的多核苷酸杂交或PCR扩增这种多核苷酸。本领域技术人员熟知筛选并分离cDNA克隆的工序和PCR扩增工序，而且他们熟悉的许多标准参考文献都讲述过这些工序。本发明的一些核酸可通过改变天然存在的多核苷酸骨架(例如，编码酶或亲本蛋白酶的多核苷酸骨架)，例如用已知的诱变工序(如，定点诱变、位点饱和诱变和体外重组)，而获得。
本发明的经修饰金属蛋白酶多肽的制备方法
本领域已知多种适用于产生编码本发明金属蛋白酶多肽的本发明经修饰多核苷酸的方法，包括但不限于(例如)位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化，以及各种其他重组方法。经修饰的多核苷酸和蛋白质(如金属蛋白酶多肽)的制备方法包括DNA改组方法、基于基因非同源重组的方法，例如ITCHY法(参见Ostermeier等人，7:2139-44[1999])、SCRACHY法(参见Lutz等人，98:11248-53[2001])、SHIPREC法(参见Sieber等人，19:456-60[2001])、NRR法(参见Bittker等人，20:1024-9[2001]；Bittker等人，101:7011-6[2004])，以及依赖使用寡核苷酸来插入随机与定向突变、缺失和/或插入的方法(参见Ness等人，20:1251-5[2002]；Coco等人，20:1246-50[2002]；Zha等人，4:34-9[2003]；Glaser等人，149:3903-13[1992])。
用来产生本发明的金属蛋白酶多肽的载体、细胞和方法
本发明提供载体，其包含至少一个本文描述的本发明金属蛋白酶多核苷酸(例如，编码本文所述的本发明金属蛋白酶多肽的多核苷酸)；表达载体或表达盒，其包含至少一个本发明核酸或多核苷酸；分离的、实质上纯的或重组的DNA构建体，其包含至少一个本发明核酸或多核苷酸；分离的或重组的细胞，其包含至少一个本发明多核苷酸；以及组合物，其包含一个或多个所述载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物，或者其任何组合或混合物。
在一些实施方案中，本发明提供重组细胞，其包含至少一个本发明载体(例如表达载体或DNA构建体)，所述载体包含至少一个本发明核酸或多核苷酸。一些此类重组细胞被至少一个所述载体转化或转染。此类细胞通常称为宿主细胞。一些此类细胞包括细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。本发明还提供包含至少一个本发明金属蛋白酶多肽的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。
在一些实施方案中，本发明提供包含本发明的核酸或多核苷酸的载体。在一些实施方案中，载体为表达载体或表达盒，其中，编码本发明的金属蛋白酶多肽的本发明多核苷酸序列有效连接至为实现有效基因表达所需要的一个或多个其它核酸区段(例如，有效连接至编码本发明的金属蛋白酶多肽的本发明多核苷酸的启动子)。载体可包含转录终止子和/或选择基因，例如抗生素抗性基因，该抗生素抗性基因使得能够通过在含抗微生物剂的培养基内培养而实现质粒感染的宿主细胞的连续培养维持。
表达载体可来源于质粒或病毒DNA，或在备选实施方案中，包含两者的元件。示例性载体包括但不限于pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood和Cutting编辑，第三章，Molecular Biological Methods for Bacillus，约翰·威立父子出版公司，1990年；适合枯草芽孢杆菌的复制型质粒包括第92页列出的那些)；还可参见Perego,IntegrationalVectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis,Sonenshein et al.,[eds.]Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry,Physiology and Molecular Genetics,American Society for Microbiology,Washington,D.C.[1993],pp.615-624，以及p2JM103BBI。
为了在细胞中表达和产生所关注的蛋白质(例如，金属蛋白酶多肽)，可以将含有编码金属蛋白酶多肽的多核苷酸的至少一个拷贝(在一些情况下，含有多个拷贝)的至少一个表达载体在适宜该金属蛋白酶表达的条件下转化进细胞中。在本发明的一些实施方案中，将编码金属蛋白酶多肽的多核苷酸序列(以及包含在载体内的其他序列)整合进宿主细胞的基因组中，而在其他实施方案中，包含编码金属蛋白酶多肽的多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保留为染色体外的自主元件。本发明提供染色体外核酸元件以及整合进宿主细胞基因组的引入核苷酸序列(incoming nucleotide sequence)。本文描述的载体可用于产生本发明的金属蛋白酶多肽。在一些实施方案中，编码金属蛋白酶多肽的多核苷酸构建体存在于整合型载体中，该整合型载体使编码金属蛋白酶多肽的多核苷酸能够整合进宿主染色体以及任选地扩增。整合位点的示例是本领域技术人员熟知的。在一些实施方案中，编码本发明的金属蛋白酶多肽的多核苷酸由启动子引发转录，该启动子可以是用于所选择的前体蛋白酶的野生型启动子。在一些其他实施方案中，启动子对前体蛋白酶而言是异源的，但能够在宿主细胞中发挥作用。具体地讲，适用于细菌宿主细胞的启动子的示例包括但不限于(例如)amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子，以下基因的启动子：嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA、以及地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因。另外的启动子包括但不限于A4启动子、λ噬菌体的PR或PL启动子，以及大肠杆菌(E.coli)lac、trp或tac启动子。
本发明的金属蛋白酶多肽可在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)宿主细胞中产生。在一些实施方案中，本发明的金属蛋白酶多肽可在革兰氏阳性菌中产生。在一些实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、埃希氏菌属(Escherichia)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、木霉属(Trichoderma)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、酵母属(Saccharomyces)物种或毕赤酵母属(Pichia)物种。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽由芽孢杆菌宿主细胞产生。可用于产生本发明的金属蛋白酶多肽的芽孢杆菌宿主细胞的示例包括但不限于地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施方案中，用枯草芽孢杆菌宿主细胞来产生金属蛋白酶多肽。美国专利5,264,366和4,760,025(RE34,606)描述了各种可用于产生本发明的金属蛋白酶多肽的芽孢杆菌属宿主菌株，但也可使用其他合适的菌株。
可用于产生本发明的金属蛋白酶多肽的几种细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌菌株，以及天然存在的菌株的变体和/或重组菌株。在一些实施方案中，宿主菌株是重组菌株，其中编码所关注多肽的多核苷酸已引入该宿主中。在一些实施方案中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，尤其是重组的枯草芽孢杆菌宿主菌株。已知有多种枯草芽孢杆菌菌株，包括但不限于(例如)1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110和PEP 211菌株(参见例如Hoch等人，Genetics，第73卷第215–228页，1973年，还可参见美国专利No.4,450,235和No.4,302,544，以及EP 0134048，所有这些文献和专利全文以引用方式并入本文)。本领域熟知可将枯草芽孢杆菌用作表达宿主细胞(参见例如Palva等人，Gene，第19卷第81-87页，1982年；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.，第165卷第796–804页，1986年；Wang等人，Gene，第69卷第39–47页，1988年)。
在一些实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是在基因degU、degS、degR、degQ的至少一个中包含突变或缺失的芽孢杆菌。在一些实施方案中，突变位于degU基因中；并且在一些实施方案中，突变是degU(Hy)32(参见例如Msadek等人，J.Bacteriol.，第172卷第824-834页，1990年；以及Olmos等人，Mol.Gen.Genet.，第253卷第562–567页，1997年)。在一些实施方案中，芽孢杆菌属宿主在以下基因中包含突变或缺失：scoC4(参见例如Caldwell等人，J.Bacteriol.，第183卷第7329-7340页，2001年)；spoIIE(参见例如Arigoni等人，Mol.Microbiol.，第31卷第1407-1415页，1999年)；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如Perego等人，Mol.Microbiol.5，第5卷第173-185页，1991年)。实际上，可以考虑，opp操纵子中会引起与oppA基因中的突变相同的表型的任何突变，都可用于本发明的经改变芽孢杆菌属菌株的一些实施方案。在一些实施方案中，这些突变单独发生，而在其他实施方案中，存在突变的组合。在一些实施方案中，可用来产生本发明的金属蛋白酶多肽的经改变芽孢杆菌属宿主细胞菌株是已在一种或多种前面提到的基因中包含突变的芽孢杆菌属宿主菌株。此外，可使用包含内源性蛋白酶基因的突变和/或缺失的芽孢杆菌宿主细胞。在一些实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如美国专利申请公布No.2005/0202535，该专利公布以引用方式并入本文)。
可以使用本领域已知的任一种适宜的方法，用编码至少一种本发明金属蛋白酶多肽的至少一种核酸转化宿主细胞。利用质粒DNA构建体或载体将核酸(例如DNA)引入芽孢杆菌属细胞或大肠杆菌细胞中以及用此类质粒DNA构建体或载体转化这些细胞的方法是众所周知的。在一些实施方案中，随后从大肠杆菌细胞分离出质粒，并转化到芽孢杆菌属细胞中。然而，使用大肠杆菌之类的中介微生物并非是必需的；在一些实施方案中，可以直接将DNA构建体或载体引入芽孢杆菌属宿主。
本领域的技术人员熟知将本发明的核酸序列引入芽孢杆菌属细胞的合适方法(参见例如Ferrari等人，“Genetics”，Harwood等人编辑，Bacillus，普莱南出版公司(PlenumPublishing Corp.)，1989年，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.，第157卷第718-726页，1984年；Hoch等人，J.Bacteriol.，第93卷第1925-1937页，1967年)；Mann等人，CurrentMicrobiol.，第13卷第131-135页，1986年；Holubova，Folia Microbiol.，第30卷第97页，1985年；Chang等人，Mol.Gen.Genet.，第168卷第11-115页，1979年；Vorobjeva等人，FEMSMicrobiol.Lett.，第7卷第261-263页，1980年；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.，第51卷第634页，1986年；Fisher等人，Arch.Microbiol.，第139卷第213-217页，1981年；以及McDonald，J.Gen.Microbiol.，第130卷第203页，1984年)。实际上，此类方法诸如转化，包括原生质体转化，和转染、转导与原生质体融合是众所周知的，而且适用于本发明。本领域已知的用于转化芽孢杆菌属细胞的方法包括诸如质粒标记补救转化之类的方法，其中涉及供体质粒被携带部分同源的居民质粒的感受态细胞摄入(参见Contente等人，Plasmid，第2卷第555-571页，1979年；Haima等人，Mol.Gen.Genet.，第223卷第185-191页，1990年；Weinrauch等人，J.Bacteriol.，第154卷第1077-1087页，1983年；以及Weinrauch等人，J.Bacteriol.，第169卷第1205-1211页，1987年)。在该方法中，输入的供体质粒与居民“辅助”质粒的同源区在模拟染色体转化的过程中重组。
除常用的方法外，在一些实施方案中，用包含编码本发明的金属蛋白酶多肽的核酸的DNA构建体或载体直接转化宿主细胞(也就是说，在将DNA构建体或载体引入宿主细胞之前，不使用中间细胞来扩增或以其他方式处理DNA构建体或载体)。向宿主细胞引入本发明的DNA构建体或载体的方法包括本领域已知的用来将核酸序列(例如，DNA序列)引入宿主细胞、而不插入宿主基因组的物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法、脂质体法等。在另外的实施方案中，将DNA构建体或载体与质粒共转化，而不插入质粒中。在另外的实施方案中，使用本领域已知的方法从经改变的芽孢杆菌属菌株中除去选择性标记(参见Stahl等人，J.Bacteriol.，第158卷第411-418页，1984年)；Palmeros等人，Gene，第247卷第255-264页，2000年)。
在一些实施方案中，在常规营养培养基内培养本发明的转化细胞。适宜的具体培养条件(例如温度、pH等)是本领域技术人员熟悉的，在科学文献中有详细记载。在一些实施方案中，本发明提供了培养物(例如，细胞培养物)，这种培养物包含本发明的至少一种金属蛋白酶多肽或至少一种核酸。
在一些实施方案中，用编码本发明的至少一种金属蛋白酶多肽的至少一种多核苷酸序列转化宿主细胞，然后在合适的营养培养基内、在允许本发明的蛋白酶表达的条件下培养这种宿主细胞，之后从培养物回收所得到的蛋白酶。在一些实施方案中，采用常规工序从培养基回收细胞产生的蛋白酶，这些工序包括但不限于(例如)通过离心或过滤从培养基中分离出宿主细胞，使用盐(例如，硫酸铵)沉淀上清液或滤液中的蛋白质组分，层析纯化(例如，离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等)。
在一些实施方案中，由重组宿主细胞产生的金属蛋白酶多肽分泌到培养基中。可使用编码利于纯化的结构域的核酸序列来促进蛋白质纯化。包含编码金属蛋白酶多肽的多核苷酸序列的载体或DNA构建体可进一步包含编码利于纯化的结构域的核酸序列，用来促进金属蛋白酶多肽纯化(参见例如Kroll等人，DNA Cell Biol.，第12卷第441-453页，1993年)。此类利于纯化的结构域包括但不限于(例如)金属螯合肽，诸如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath，Protein Expr.Purif.，第3卷第263-281页，1992年)、允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，以及用于FLAGS延伸/亲和纯化系统的结构域。纯化结构域和异源蛋白质之间包含可裂解的接头序列，如XA因子或肠激酶(例如，可得自美国加利福尼亚州圣地亚哥英杰公司(Invitrogen,San Diego,CA)的序列)，也可用于促进纯化。
用于检测和测量酶(如本发明的金属蛋白酶多肽)的酶活性的测定法是众所周知的。用于检测和测量蛋白酶(如本发明的金属蛋白酶多肽)活性的各种测定法也是本领域普通技术人员熟悉的。具体地讲，可利用一些测定法来测量蛋白酶活性，这些测定法立足于酸可溶性肽从酪蛋白或血红蛋白的释放，测定280nm处的吸光度或利用福林法进行比色测量。其他示例性测定法涉及显色底物的增溶作用(参见例如Ward，“Proteinases”，Fogarty编辑，Microbial Enzymes and Biotechnology，伦敦应用科学出版社(Applied Science,London)，1983年，第251-317页)。其他示例性测定法包括但不限于琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺测定法(suc-AAPF-pNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定法(TNBS测定法)。本领域技术人员了解的许多另外的参考文献提出了合适的方法(参见例如Wells等人，Nucleic Acids Res.，第11卷第7911-7925页，1983年；Christianson等人，Anal.Biochem.，第223卷第119-129页，1994年；以及Hsia等人，Anal Biochem.，第242卷第221-227页，1999年)。
可使用多种方法确定宿主细胞中的成熟蛋白酶(例如，本发明的成熟金属蛋白酶多肽)产量。此类方法包括但不限于(例如)利用蛋白酶的特异性多克隆抗体或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)和荧光激活细胞分选法(FACS)。这些测定法和其他测定法是本领域众所周知的(参见例如Maddox等人，J.Exp.Med.，第158卷第1211页，1983年)。
在一些其他实施方案中，本发明提供了用于制备或生产本发明的成熟金属蛋白酶多肽的方法。成熟金属蛋白酶多肽不含信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组的细菌宿主细胞(例如芽孢杆菌细胞，如枯草芽孢杆菌细胞)中制备或生产本发明的金属蛋白酶多肽。在一些实施方案中，本发明提供了一种生产本发明的金属蛋白酶多肽的方法，该方法包括在有益于生产金属蛋白酶多肽的条件下培养重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含重组表达载体，这种重组表达载体包含编码本发明的金属蛋白酶多肽的核酸。此类方法中的一些方法进一步包括从培养物回收金属蛋白酶多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了生产本发明的金属蛋白酶多肽的方法，此方法包括：(a)将包含编码本发明的金属蛋白酶多肽的核酸的重组表达载体引入一群细胞(例如细菌细胞，如枯草芽孢杆菌细胞)；(b)在培养基内，在有益于产生由表达载体编码的金属蛋白酶多肽的条件下培养这群细胞。此类方法中的一些方法进一步包括：(c)从细胞或培养基分离出金属蛋白酶多肽。
织物和家居护理产品
在一些实施方案中，可将本发明的金属蛋白酶多肽用于包含助剂材料和金属蛋白酶多肽的组合物中，其中该组合物是织物和家居护理产品。
在一些实施方案中，含有至少一种金属蛋白酶多肽的织物和家居护理产品组合物包含一种或多种以下成分(按总组合物重量计)：约0.0005重量％至约0.1重量％、约0.001重量％至约0.05重量％、或甚至约0.002重量％至约0.03重量％的所述金属蛋白酶多肽；和以下一种或多种物质：约0.00003重量％至约0.1重量％的织物调色剂(fabric hueingagent)，约0.001重量％至约5重量％的香料胶囊，约0.001重量％至约1重量％的冷水可溶性增白剂，约0.00003重量％至约0.1重量％的漂白催化剂，约0.00003重量％至约0.1重量％的首洗(first wash)脂肪酶，约0.00003重量％至约0.1重量％的细菌清洁纤维素酶，和/或约0.05重量％至约20重量％的Guerbet非离子型表面活性剂。
在一些实施方案中，织物和家居护理产品组合物是液体衣物洗涤剂或盘碟洗涤剂，例如自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂或手洗盘碟洗涤剂。
旨在以任何适宜的形式提供织物和家居护理产品，包括流体或固体、颗粒、粉末、固体、条棒、液体、片状物、凝胶或糊剂形式。织物和家居护理产品可以是单位剂量小袋的形式，尤其这种产品为液体形式时；并且通常，织物和家居护理产品至少部分、甚至完全被水溶性小袋包封。此外，在包含至少一种金属蛋白酶多肽的织物和家居护理产品的一些实施方案中，织物和家居护理产品可具有上文详述参数和/或特性的任意组合。
具有本发明的金属蛋白酶多肽的组合物
除非另有说明，否则本文提出的全部组分或组合物水平都是指相应组分或组合物的活性水平，且未将可能存在于可商购获得来源中的杂质(例如残余的溶剂或副产物)计算在内。酶组分重量基于总活性蛋白计算。除非另外指明，否则所有百分比和比率都按重量计。除非另外指明，否则所有百分比和比率都基于总组合物计算。本发明的组合物包括清洁组合物，例如洗涤剂组合物。在示例性洗涤剂组合物中，酶水平基于总组合物的重量通过纯酶来表示，而且除非另外指明，否则洗涤剂成分基于总组合物的重量来表示。
如本文指出的那样，在一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含助剂材料，这些助剂材料包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其它酶、酶稳定体系、螯合剂、荧光增白剂、污物释放聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂(fluorescer)、织物调理剂、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、纳米银抗菌剂(silvercare)、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(参见例如美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，这些专利均以引用方式并入本文)。具体的清洁组合物材料的实施方案在下文详细举例说明。在清洁助剂材料不与清洁组合物中本发明的金属蛋白酶多肽相容的实施方案中，可以采用适宜的方法保持清洁助剂材料与蛋白酶分离(即，彼此不接触)直到适宜两种组分混合的时候。此类分离方法包括本领域已知的任何适宜的方法(例如，囊形片(gelcap)、包封、片状物、物理分离等)。
有利的是，将本发明的清洁组合物用于下列用途，例如洗衣用途、硬表面清洁用途、盘碟洗涤用途(包括自动盘碟洗涤和手动盘碟洗涤)，以及美容用途(例如，清洁假牙、牙齿、毛发、皮肤)。此外，由于本发明的酶在较低温度溶液中具有增强的效果，这一独特优势使其成为用于洗衣用途的理想选择。此外，本发明的酶可用于颗粒状组合物和液体组合物中。
本发明的金属蛋白酶多肽还可用于清洁添加剂产品中。在一些实施方案中，用于低温溶液清洁用途。在一些实施方案中，本发明提供的清洁添加剂产品包含至少一种本发明的酶；如果期望提供额外的漂白效果，将这种清洁添加剂产品加入洗涤过程不失为理想选择。这类情况包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，添加剂产品呈最简单的形式，即一种或多种蛋白酶。在一些实施方案中，将添加剂包装成剂型，便于加入清洁过程。在一些实施方案中，在采用过氧化物源且需要提高漂白效果的情况下，将添加剂包装成剂型，以便加入清洁过程。本发明可以使用任何适宜的单剂量单位形式，包括但不限于小丸、片、囊形片，或其他单剂量单位，例如预量的粉末或液体。在一些实施方案中，包括填料或载体材料，以增加此类组合物的体积。合适的填料或载体材料包括但不限于各种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐以及滑石粉、粘土等。适用于液体组合物的填料或载体材料包括但不限于水或低分子量的伯醇和仲醇(包括多元醇和二醇)。此类醇的示例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案中，组合物包含约5％至约90％的此类材料。酸性填料可以用于降低pH值。另选地，在一些实施方案中，清洁添加剂包含辅助成分，下文将更充分描述这些辅助成分。
本文的清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的本文所提供的至少一种金属蛋白酶多肽，这种金属蛋白酶多肽可单独提供，或可结合其他蛋白酶和/或其它酶一起提供。所需的酶水平是通过添加本发明的一种或多种金属蛋白酶多肽实现的。通常，本发明的清洁组合物包含至少约0.0001重量％、约0.0001重量％至约10重量％、约0.001重量％至约1重量％、或约0.01重量％至约0.1重量％的本发明的至少一种金属蛋白酶多肽。
通常配制本文的清洁组合物，以便在水性清洁操作期间使用时，洗涤水的pH值将为约4.0至约11.5，或甚至约5.0至约11.5，或甚至约5.0至约8.0，或甚至约7.5至约10.5。液体产品制剂通常被配制成具有约3.0至约9.0、或甚至约3至约5的pH值。颗粒状洗衣产品通常被配制成具有约9至约11的pH值。用于将pH值控制在推荐使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，这些技术是本领域技术人员熟知的。
适宜的“低pH值清洁组合物”通常具有约3至约5的pH值，而且通常不含会在这种pH环境中水解的表面活性剂。这类表面活性剂包括烷基硫酸钠表面活性剂，其包含至少一个环氧乙烷部分，或甚至包含约1至约16摩尔环氧乙烷。这类清洁组合物通常包含足量的pH值调节剂，例如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，目的是使这种清洁组合物具有约3至约5的pH值。这类组合物通常包含至少一种酸稳定酶。在一些实施方案中，组合物为液体，而在其他实施方案中，组合物为固体。这类液体组合物的pH值通常以净pH值量度。固体组合物的pH按照所述组合物的10％固体溶液来测量，其中溶剂为蒸馏水。在这些实施方案中，除非另外指明，否则所有的pH值都是20℃的测量结果。
在一些实施方案中，将金属蛋白酶多肽用于颗粒状组合物或液体时，期望金属蛋白酶多肽为包封粒子的形式，以便在存储过程中保护金属蛋白酶多肽免受颗粒组合物中其他组分的影响。此外，包封还是控制金属蛋白酶多肽在清洁过程中的可用性的手段。在一些实施方案中，包封增强了金属蛋白酶多肽和/或其它酶的性能。就这一点而言，可以采用本领域已知的任何适宜的包封材料来包封本发明的金属蛋白酶多肽。在一些实施方案中，包封材料通常至少包封本发明的金属蛋白酶多肽的一部分。包封材料通常为水溶性和/或水分散性材料。在一些实施方案中，包封材料的玻璃化转变温度(Tg)为0℃或高于0℃。WO 97/11151较详细地讲述了玻璃化转变温度。包封材料通常选自碳水化合物、天然的或合成的树胶、甲壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、固体石蜡，以及这些材料的组合。如果包封材料为碳水化合物，则通常选自单糖、寡糖、多糖以及它们的组合。在一些典型实施方案中，包封材料为淀粉(参见例如EP 0 922 499、US 4,977,252、US 5,354,559和US 5,935,826)。在一些实施方案中，包封材料是由塑料制成的微球体，其中塑料例如为热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈以及它们的混合物；可使用的市售微球体包括但不限于以如下提供的那些：
Figure BDA0000916970520000391
(瑞典斯托克韦斯文肯(Stockviksverken,Sweden))，PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228、
Figure BDA0000916970520000401
和
Figure BDA0000916970520000402
(美国宾夕法尼亚州福吉谷PQ公司(PQ Corp.,Valley Forge,PA))。
如本文所述，本发明的金属蛋白酶多肽尤其可用于清洁行业，包括但不限于衣物和盘碟洗涤剂。这些应用将酶置于各种环境胁迫下。本发明的金属蛋白酶多肽在各种条件下的稳定性使其优于许多现用的酶。
实际上，参与洗涤的蛋白酶会暴露于多种洗涤条件，包括各种各样的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时长。此外，对于不同地理区域使用的洗涤剂制剂，洗涤水中其相关组分的存在浓度可以不相同。例如，欧洲的洗涤剂典型地在洗涤水中具有约4500至5000ppm的洗涤剂组分，而日本的洗涤剂典型地在洗涤水中具有约667ppm的洗涤剂组分。在北美洲，尤其是在美国，洗涤剂典型地在洗涤水中有约975ppm的洗涤剂组分存在。
低洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中洗涤剂组分的浓度低于约800ppm的洗涤剂。通常认为日本洗涤剂是低洗涤剂浓度系统，因为这些洗涤剂有约667ppm的洗涤剂组分存在于洗涤水中。
中等洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在的洗涤剂组分的浓度介于约800ppm和约2000ppm之间的洗涤剂。通常认为北美洲的洗涤剂是中等洗涤剂浓度系统，因为这些洗涤剂以约975ppm的洗涤剂组分存在于洗涤水中。在巴西，典型地，存在于洗涤水中的洗涤剂组分的浓度为约1500pm。
高洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在的洗涤剂组分的浓度高于约2000ppm的洗涤剂。通常认为欧洲的洗涤剂是高洗涤剂浓度系统，因为这些洗涤剂以约4500至5000ppm的洗涤剂组分存在于洗涤水中。
拉丁美洲的洗涤剂通常是高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂，其导致洗涤水中洗涤剂组分的浓度在1500ppm至6000ppm范围内，所以拉丁美洲使用的洗涤剂的范围可以落入中等洗涤剂浓度和高洗涤剂浓度两者中。如上所述，在巴西，通常约1500pm的洗涤剂组分存在于洗涤水中。然而，在其他使用高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂的地理区域(不限于其他拉丁美洲国家)，可以具有高洗涤剂浓度系统，其中高达约6000ppm的洗涤剂组分存在于洗涤水中。
按照前述内容，显然，在全世界范围内，典型洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度可以从不到约800ppm的洗涤剂变化到高泡磷酸盐助洗剂地域的约6000ppm。
典型洗涤溶液的浓度可以凭经验确定。例如，在美国，典型洗衣机大约可容纳64.4L洗涤溶液。因此，要在该洗涤溶液中获得约975ppm的洗涤剂浓度，必须将约62.79克洗涤剂组合物添加到64.4L洗涤溶液中。该量是由消费者使用随洗涤剂一起提供的量杯量取到洗涤水中的典型用量。
再如，不同地域使用的洗涤温度不同。日本的洗涤水温度通常比欧洲使用的洗涤水温度低。例如，北美洲和日本的洗涤水温度通常介于约10℃和约40℃之间(如，约20℃)，而欧洲的洗涤水温度通常介于约30℃和约60℃之间(如，约40℃)。然而，许多消费者为节省能源，都改用冷水洗涤。此外，在别的一些地区，冷水通常用于洗衣以及洗盘碟用途。在一些实施方案中，本发明的“冷水洗涤”利用适于在以下温度实施洗涤的“冷水洗涤剂”：约10℃至约40℃、或约20℃至约30℃、或约15℃至约25℃，在约15℃至约35℃范围内的其他所有组合，以及在10℃至40℃之间的所有范围。
又如，不同地域的水硬度通常不同。水硬度通常用每加仑混合的Ca2+/Mg2+的格令数来描述。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的量度。美国的大多数水都是硬水，但硬度有波动。中等硬度水(60至120ppm)至硬水(121至181ppm)具有60至181百万份的硬度矿物(hardness minerals)(每百万份换算成每美制加仑的格令数：ppm数除以17.1，得到每加仑格令数)。
水 每加仑格令数 ppm
软 小于1.0 小于17
略硬 1.0至3.5 17至60
中等硬 3.5至7.0 60至120
硬 7.0至10.5 120至180
极硬 大于10.5 大于180
欧洲的水硬度通常是每加仑混合的Ca2+/Mg2+高于约10.5(例如约10.5至约20.0)格令(例如，每加仑混合的Ca2+/Mg2+约15格令)。北美洲的水硬度通常比日本的水硬度大，但比欧洲的水硬度小。例如，北美洲的水硬度可介于约3至约10格令之间、约3至约8格令之间，或为约6格令。日本的水硬度通常比北美洲的水硬度低，通常每加仑混合的Ca2+/Mg2+小于约4格令，例如约3格令。
因此，在一些实施方案中，本发明提供金属蛋白酶多肽，其在至少一组洗涤条件(如，水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)下显示出令人惊讶的洗涤性能。在一些实施方案中，本发明的金属蛋白酶多肽与其他金属蛋白酶多肽蛋白酶的洗涤性能相当。在本发明的一些实施方案中，本文提供的金属蛋白酶多肽表现出氧化稳定性提升、热稳定性增大、在各种条件下的清洁能力增强，以及/或者螯合剂稳定性增加。此外，本发明的金属蛋白酶多肽可用于不含洗涤剂的清洁组合物，同样地，其可单独使用、或与助洗剂和稳定剂结合使用。
在本发明的一些实施方案中，清洁组合物包含按组合物的重量计含量为约0.00001％至约10％的本发明至少一种金属蛋白酶多肽，以及按组合物的重量计含清洁助剂材料的余量(例如，约99.999％至约90.0％)。在本发明的另一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含按组合物的重量计含量为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的至少一种金属蛋白酶多肽，以及含清洁助剂材料的清洁组合物的余量(例如，按重量计约99.9999％至约90.0％、约99.999％至约98％、约99.995％至约99.5％)。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种其它洗涤剂酶，用来提供清洁性能和/或织物护理和/或盘碟洗涤益处。合适的酶的示例包括但不限于：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶，或者它们的任意组合或混合物。在一些实施方案中，使用酶的组合(即“合剂(cocktail)”)；该组合包含常规可应用酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶，以及淀粉酶。
除本文提供的金属蛋白酶多肽外，还可在本发明的组合物中使用任何其他合适的蛋白酶。合适的蛋白酶包括来源于动物、植物或微生物的那些。在一些实施方案中，使用了微生物蛋白酶。在一些实施方案中，包括经化学或基因修饰的突变体。在一些实施方案中，蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的示例包括枯草杆菌蛋白酶，尤其是来源于芽孢杆菌属的那些枯草杆菌蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、lentus、amyloliquefaciens、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。另外的示例包括美国专利No.RE 34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936和No.6,482,628中记载的那些突变蛋白酶，这些专利均以引用方式并入本文。其它蛋白酶的示例包括但不限于胰蛋白酶(如，猪或牛来源的胰蛋白酶)，以及WO 89/06270中记载的镰刀菌属(Fusarium)蛋白酶。在一些实施方案中，可用于本发明的市售蛋白酶包括但不限于：
Figure BDA0000916970520000431
MAXACALTM、MAXAPEMTM、
Figure BDA0000916970520000432
Figure BDA0000916970520000433
OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM和PURAFASTTM(杰能科公司(Genencor))；
Figure BDA0000916970520000434
Figure BDA0000916970520000435
DURAZYMTM、
Figure BDA0000916970520000436
Figure BDA0000916970520000437
和
Figure BDA0000916970520000438
(诺维信公司(Novozymes))；BLAPTM和BLAPTM变体(德国杜塞尔多夫汉高股份两合公司(HenkelKommanditgesellschaft auf Aktien,Duesseldorf,Germany))；KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶；日本东京花王公司(Kao Corp.,Tokyo,Japan))。WO95/23221、WO 92/21760、WO09/149200、WO 09/149144、WO 09/149145、WO 11/072099、WO 10/056640、WO 10/056653、WO11/140364、WO 12/151534，美国专利公布No.2008/0090747，美国专利No.5,801,039、No.5,340,735、No.5,500,364、No.5,855,625、US RE 34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936和No.6,482,628以及各种其他专利描述了各种蛋白酶。在一些另外的实施方案中，金属蛋白酶可用于本发明，包括但不限于WO 07/044993中所述的中性金属蛋白酶。
此外，任何适宜的脂肪酶可用于本发明。适宜的脂肪酶包括但不限于源自细菌或真菌的脂肪酶。本发明涵盖经化学或基因修饰的突变体。可用的脂肪酶的示例包括柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP 258 068和EP 305 216)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP 238 023)、假丝酵母(Candida)脂肪酶例如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(如南极假丝酵母脂肪酶A或B；参见例如EP 214 761)、假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois et al.,Biochem.Biophys.Acta 1131:253-260[1993](Dartois等人，《生物化学与生物物理学报》，第1131卷第253-260页，1993年))；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(参见例如JP 64/744992)；短小芽孢杆菌脂肪酶(参见例如WO 91/16422))。
此外，多种克隆的脂肪酶可用于本发明的一些实施方案，包括但不限于：沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人，Gene，第103卷第61-67页，1991年)、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，J.Biochem.，第106卷第383-388页，1989年)，以及各种根霉属(Rhizopus)脂肪酶，例如戴尔根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass等人，Gene，第109卷第117-113页，1991年)、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.，第56卷第716-719页，1992年)和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。
在本发明的一些实施方案中还可以应用其他类型的脂肪酶多肽酶如角质酶，包括但不限于来源于门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)以及来源于豌豆腐皮镰孢(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见WO 90/09446)。
其他适宜的脂肪酶包括市售脂肪酶，例如M1LIPASETM、LUMA FASTTM和LIPOMAXTM(杰能科公司(Genencor))；
Figure BDA0000916970520000441
和
Figure BDA0000916970520000442
ULTRA(诺维信公司(Novozymes))；以及IPASE PTM“Amano”(日本天野制药公司(Amano PharmaceuticalCo.Ltd.,Japan))。
在本发明的一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计含量为约0.00001％至约10％附加脂肪酶的脂肪酶，以及按组合物的重量计余量的清洁助剂材料。在本发明的另一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含按组合物的重量计含量为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％脂肪酶的脂肪酶。
在本发明的一些实施方案中，本发明可以使用任何适宜的淀粉酶。在一些实施方案中，也可以应用任何适宜在碱性溶液中使用的淀粉酶(如，α淀粉酶和/或β淀粉酶)。适宜的淀粉酶包括但不限于源自细菌或真菌的淀粉酶。在一些实施方案中，包括经化学或基因修饰的突变体。可用于本发明的淀粉酶包括但不限于从地衣芽孢杆菌获得的α-淀粉酶(参见例如GB 1,296,839)。另外一些适宜的淀粉酶包括可从以下文献中找到的那些：W09510603、WO9526397、WO9623874、WO9623873、WO9741213、WO9919467、WO0060060、WO0029560、WO9923211、WO9946399、WO0060058、WO0060059、WO9942567、WO0114532、WO02092797、WO0166712、WO0188107、WO0196537、WO0210355、WO9402597、WO0231124、WO9943793、WO9943794、WO2004113551、WO2005001064、WO2005003311、WO0164852、WO2006063594、WO2006066594、WO2006066596、WO2006012899、WO2008092919、WO2008000825、WO2005018336、WO2005066338、WO2009140504、WO2005019443、WO2010091221、WO2010088447、WO0134784、WO2006012902、WO2006031554、WO2006136161、WO2008101894、WO2010059413、WO2011098531、WO2011080352、WO2011080353、WO2011080354、WO2011082425、WO2011082429、WO2011076123、WO2011087836、WO2011076897、WO94183314、WO9535382、WO9909183、WO9826078、WO9902702、WO9743424、WO9929876、WO9100353、WO9605295、WO9630481、WO9710342、WO2008088493、WO2009149419、WO2009061381、WO2009100102、WO2010104675、WO2010117511和WO2010115021。可用于本发明的市售淀粉酶包括但不限于
Figure BDA0000916970520000451
Figure BDA0000916970520000452
STAINZYME
Figure BDA0000916970520000453
STAINZYME
Figure BDA0000916970520000454
和BANTM(诺维信公司(Novozymes))，以及POWERASETM、
Figure BDA0000916970520000455
和
Figure BDA0000916970520000456
P(杰能科公司(Genencor))。
在本发明的一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计含量为约0.00001％至约10％附加淀粉酶的淀粉酶，以及按组合物的重量计余量的清洁助剂材料。在本发明的另一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含按组合物的重量计含量为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％淀粉酶的淀粉酶。
在一些另外的实施方案中，在本发明的清洁组合物中可以使用任何适宜的纤维素酶。适宜的纤维素酶包括但不限于源自细菌或真菌的纤维素酶。在一些实施方案中，包括经化学或基因修饰的突变体。适宜的纤维素酶包括但不限于特异腐质霉(Humicolainsolens)纤维素酶(参见例如美国专利No.4,435,307)。特别适宜的纤维素酶是有护色有益效果的纤维素酶(参见例如EP 0 495 257)。可用于本发明的市售纤维素酶包括但不限于CELLUZYME、CELLUCLEAN、CAREZYME(诺维信公司(Novozymes))，PURADEX和REVITALENZ(丹尼士科美国公司(Danisco US Inc.))以及KAC-500(B)(花王公司(Kao Corporation))。在一些实施方案中，纤维素酶作为成熟野生型纤维素酶或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N端的一部分缺失(参见例如美国专利No.5,874,276)。另外一些适宜的纤维素酶包括可从WO2005054475、WO2005056787、美国专利No.7,449,318和No.7,833,773中找到的那些。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计含量为约0.00001％至约10％附加纤维素酶的纤维素酶，以及按组合物的重量计余量的清洁助剂材料。在本发明的另一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含按组合物的重量计含量为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％纤维素酶的纤维素酶。
还可在本发明中使用任何适用于洗涤剂组合物的甘露聚糖酶。适宜的甘露聚糖酶包括但不限于源自细菌或真菌的甘露聚糖酶。在一些实施方案中，包括经化学或基因修饰的突变体。技术人员知道可用于本发明的各种甘露聚糖酶(参见例如美国专利No.6,566,114、No.6,602,842、No.5,476,775和No.6,440,991，及美国临时申请No.61/739267；这些专利和专利申请均以引用方式并入本文)。可用于本发明的市售甘露聚糖酶包括但不限于MANNASTAR、PURABRITE和MANNAWAY。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计含量为约0.00001％至约10％附加甘露聚糖酶的甘露聚糖酶，以及按组合物的重量计余量的清洁助剂材料。在本发明的一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含按组合物的重量计含量为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的甘露聚糖酶。
在一些实施方案中，在本发明组合物中结合使用过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如，过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)。在一些可供选择的实施方案中，结合使用氧化酶与氧气。这两种类型的酶都可以用于(优选连同增强剂一起用于)“溶液漂白”(也就是说，将染色织物与另一织物一起置于洗涤液中洗涤时，用于防止染色织物的纺织品染料转移到另一织物)(参见例如WO 94/12621和WO 95/01426)。适宜的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于源自植物、细菌或真菌的那些。在一些实施方案中，包括经化学或基因修饰的突变体。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计含量为约0.00001％至约10％附加过氧化物酶和/或氧化酶的过氧化物酶和/或氧化酶，以及按组合物的重量计余量的清洁助剂材料。在本发明的另一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含按组合物的重量计含量为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％过氧化物酶和/或氧化酶的过氧化物酶和/或氧化酶。
在一些实施方案中，可以使用附加的酶，包括但不限于过水解酶(参见例如WO 05/056782)。此外，在一些实施方案中，本文涵盖上述酶的混合物，尤其是，涵盖一种或多种附加的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，预期这些酶的各种混合物可用于本发明。还预期金属蛋白酶多肽与一种或多种附加酶的含量均可独立地变动至约10％，清洁组合物的余量为清洁助剂材料。通过考虑待清洁的表面、物品或织物、以及期望用于使用期间(如，整个洗涤剂使用过程中)的清洁条件的组合物形式，能够轻易确定清洁助剂材料的具体选择。
适宜的清洁助剂材料的示例包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、附加的酶、酶稳定体系、螯合剂、荧光增白剂、污物释放聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢来源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污物去除剂、结构弹性化剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、织物柔软剂、载体、助水溶物、加工助剂、溶剂、颜料、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、纳米银抗菌剂、抗晦暗和/或抗腐蚀剂、碱源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(参见例如美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，这些专利均以引用方式并入本文)。具体的清洁组合物材料的实施方案在下文详细举例说明。在清洁助剂材料不与清洁组合物中本发明的金属蛋白酶多肽相容的实施方案中，可以采用适宜的方法保持清洁助剂材料与蛋白酶分离(即，彼此不接触)直到适宜将这两种组分混合的时候。此类分离方法包括本领域已知的任何适宜的方法(例如，囊形片、包封、片状物、物理分离等)。
在一些实施方案中，可用于清洁需要去除蛋白质类污渍的多种表面的组合物包含有效量的本文所提供的一种或多种金属蛋白酶多肽。这类清洁组合物包括例如用于清洁硬表面、织物和盘碟等用途的清洁组合物。实际上，本发明在一些实施方案中提供了织物清洁组合物，在其他实施方案中提供了非织物清洁组合物。值得注意的是，本发明还提供了适用于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理组合物(包括洁齿剂、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁组合物)、皮肤和毛发清洁组合物。本发明旨在涵盖任何形式的洗涤剂组合物(即，液体、颗粒、条棒、半固体、凝胶、乳液、片状物、胶囊等)。
下文将以举例的方式较详细地描述使用本发明的金属蛋白酶多肽的若干种清洁组合物。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物被配制成适用于洗衣机洗涤方法的组合物，这种情况下本发明的组合物优选地包含至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及一种或多种清洁助剂材料，其中清洁助剂材料优选地选自：有机高分子化合物、漂白剂、附加的酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、悬污剂、抗再沉积剂、腐蚀抑制剂。在一些实施方案中，洗衣组合物还包含软化剂(即，作为另外的清洁助剂材料)。本发明的组合物也可用于固体或液体形式的洗涤添加剂产品中。此类添加剂产品旨在补充和/或增强常规洗涤剂组合物的性能，并可以在清洁过程的任何阶段添加。在一些实施方案中，本文的衣物洗涤剂组合物的密度在约400克/升至约1200克/升的范围内，而在其他实施方案中，该密度在约500克/升至约950克/升的范围内，该密度是在20℃下测得的。
在将组合物配制用于手动盘碟洗涤方法的实施方案中，本发明的组合物优选包含至少一种表面活性剂以及优选至少一种附加的清洁助剂材料，所述附加的清洁助剂材料可以选自有机高分子化合物、泡沫增强剂、II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和附加的酶。
在一些实施方案中，将各种清洁组合物(例如美国专利No.6,605,458中提供的清洁组合物)与本发明的金属蛋白酶多肽一起使用。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明的金属蛋白酶多肽的组合物为密实颗粒状织物清洁组合物；而在一些另外的实施方案中，该组合物为可用于洗涤彩色织物的颗粒状织物清洁组合物；在另外的实施方案中，该组合物为凭借洗涤能力提供软化效果的颗粒状织物清洁组合物；在另外的实施方案中，该组合物为重垢型液体织物清洁组合物。在一些实施方案中，包含至少一种本发明的金属蛋白酶多肽的组合物为织物清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中描述的那些。另外，本发明的金属蛋白酶多肽可用于在欧洲或日本的洗涤条件下特别实用的颗粒状衣物洗涤剂组合物(参见例如美国专利No.6,610,642)。
在一些可供选择的实施方案中，本发明提供包含至少一种本文提供的金属蛋白酶多肽的硬表面清洁组合物。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明的金属蛋白酶多肽的组合物为硬表面清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642、No.6,376,450和No.6,376,450中描述的那些。
在另外的实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文提供的金属蛋白酶多肽的盘碟洗涤组合物。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明的金属蛋白酶多肽的组合物为硬表面清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中描述的那些。在另一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文提供的金属蛋白酶多肽的盘碟洗涤组合物。在一些另外的实施方案中，包含至少一种本发明的金属蛋白酶多肽的组合物包括口腔护理组合物，例如美国专利No.6,376,450和No.6,376,450中描述的那些。上述美国专利No.6,376,450、No.6,605,458、No.6,605,458和No.6,610,642中包含的化合物与清洁助剂材料的配制和说明可与本文提供的金属蛋白酶多肽一起使用。
本发明的清洁组合物可以被配制成任何适宜的形式，且可以采用配制人员选择的任何方法制备，美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,565,422、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303讲述了这些适宜形式和制备方法的非限制性示例，这些专利均以引用方式并入本文。在期望获得低pH值的清洁组合物时，可以经由添加物质例如单乙醇胺或酸性物质(如HCl)来调节这种组合物的pH值。
在一些实施方案中，可将本发明的清洁组合物配制成在洗涤条件下具有碱性pH值，例如约8.0至约12.0、约8.5至约11.0、或约9.0至约11.0的pH值。在一些实施方案中，可将本发明的清洁组合物配制成在洗涤条件下具有中性pH值，例如约5.0至约8.0、或约5.5至约8.0、或约6.0至约8.0、或约6.0至约7.5的pH值。在一些实施方案中，当清洁组合物在20℃温度下以1:100重量比溶于去离子水中时，使用常规pH计测量，可测得中性pH条件。
下文列出的一系列非限制性助剂适用于本发明的清洁组合物，但这些助剂并非实现本发明目的所必需的。在一些实施方案中，掺入这些助剂是为了(例如)辅助或增强清洁性能、处理待清洁的基底，或者在助剂为香料、着色剂、染料等的情况下，更改清洁组合物的美学效果。应当理解，这类助剂是除本发明的金属蛋白酶多肽之外的物质。这些附加组分的确切性质及其掺入水平，将取决于组合物的物理形式，和将要使用该组合物执行的清洁操作的性质。合适的助剂材料包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、附加的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白促进剂、过氧化氢、过氧化氢来源、预制的过酸、聚合物分散剂、粘土污物去除剂/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹性化剂、织物软化剂、载体、助水溶物、加工助剂和/或颜料。此类其他助剂及其使用水平的适宜示例除在下文公开外，也可在美国专利No.5576282、No.6306812和No.6326348中找到，这些专利以引用方式并入本文。上述助剂成分可构成本发明清洁组合物的余量。
在一些实施方案中，根据本发明的清洁组合物包含酸化粒子或氨基羧酸类助洗剂。氨基羧酸类助洗剂的示例包括氨基羧酸、氨基羧酸盐及氨基羧酸衍生物。在一些实施方案中，氨基羧酸类助洗剂为氨基多羧酸助洗剂，例如甘氨酸-N,N-二乙酸，或通式MOOC-CHR-N(CH2COOM)2的衍生物，式中R为C1-12烷基，M为碱金属。在一些实施方案中，氨基羧酸类助洗剂可为甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、羧甲基菊粉及其盐和衍生物、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、亚氨基二乙酸(IDS)及其盐和衍生物(例如N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA))、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)、磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)及其碱金属盐和衍生物。在一些实施方案中，酸化粒子具有约400μ至约1200μ的加权几何平均粒度和至少550g/L的堆密度。在一些实施方案中，酸化粒子至少包含约5％的助洗剂。
在一些实施方案中，酸化粒子可包含任何酸，包括有机酸和无机酸。有机酸可具有一个或两个羧基，在一些情况下可具有多达15个、尤其是多达10个碳原子，例如甲酸、乙酸、丙酸、癸酸、草酸、丁二酸、己二酸、马来酸、富马酸、癸二酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸以及乙醛酸。在一些实施方案中，酸为柠檬酸。无机酸包括盐酸和硫酸。在某些情况下，本发明的酸化粒子为包含高水平氨基羧酸类助洗剂的高活性粒子。已发现硫酸可进一步促使最终粒子稳定。
在一些实施方案中，根据本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂体系，其中表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂以及它们的混合物。在一些低pH值清洁组合物的实施方案中(例如，净pH值为约3至约5的清洁组合物)，该组合物通常不含烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信这种表面活性剂会在此类组合物中酸性内容物作用下水解。在一些实施方案中，按清洁组合物重量计，表面活性剂含量可以为约0.1％至约60％，而在可供选择的实施方案中含量可以为约1％至约50％，而在另外的实施方案中含量可以为约5％至约40％。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂体系。在掺入至少一种助洗剂的一些实施方案中，按清洁组合物重量计，这类清洁组合物包含至少约1％、约3％至约60％、或甚至约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于：多磷酸的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐，碱金属硅酸盐，碱土金属碳酸盐和碱金属碳酸盐，铝硅酸盐，聚羧酸盐化合物，醚羟基聚羧酸盐、马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物，1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸，羧基甲氧基琥珀酸，多元乙酸(例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)和多元羧酸(例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸)的各种碱金属盐、铵盐和取代铵盐，以及它们的可溶性盐。实际上，预期可以在本发明的各种实施方案中使用任何适宜的助洗剂。
在一些实施方案中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如多价螯合助洗剂)，如柠檬酸盐和聚磷酸盐(例如三聚磷酸钠与六水合三聚磷酸钠、三聚磷酸钾，以及三聚磷酸钠与三聚磷酸钾的混合物等)。预期可以在本发明中使用任何适宜的助洗剂，包括本领域已知的那些助洗剂(参见例如EP 2 100 949)。
在一些实施方案中，用于本文的助洗剂包括磷酸盐助洗剂和非磷酸盐助洗剂。在一些实施方案中，助洗剂为磷酸盐助洗剂。在一些实施方案中，助洗剂为非磷酸盐助洗剂。如果存在的话，助洗剂用量为按组合物的重量计0.1％至80％、5％至60％、或10％至50％。在一些实施方案中，产品包含磷酸盐助洗剂和非磷酸盐助洗剂的混合物。适宜的磷酸盐助洗剂包括单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚磷酸盐，包括这些化合物的碱金属盐，包括钠盐。在一些实施方案中，助洗剂可为三聚磷酸钠(STPP)。另外，组合物可包含碳酸盐和/或柠檬酸盐，优选包含柠檬酸盐，其可以有助于得到本发明的中性pH值组合物。其他适宜的非磷酸盐助洗剂包括多元羧酸的均聚物和共聚物、及其部分或完全中和的盐，单体多元羧酸和羟基羧酸、及其盐类。在一些实施方案中，上述化合物的盐包括铵盐和/或碱金属盐，即锂盐、钠盐和钾盐，包括钠盐。适宜的多元羧酸包括无环羧酸、脂环羧酸、杂环羧酸和芳香羧酸，其中在一些实施方案中，这些多元羧酸可至少包含两个羧基，这些羧基在每种情形下均彼此隔开，在某些情况下，被隔开不超过两个碳原子。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物至少包含一种螯合剂。适宜的螯合剂包括但不限于铜螯合剂、铁螯合剂和/或锰螯合剂，以及它们的混合物。在至少使用一种螯合剂的实施方案中，按主题清洁组合物的重量计，本发明的清洁组合物包含约0.1％至约15％、或甚至约3.0％至约10％螯合剂。
在另一些实施方案中，本文提供的清洁组合物至少包含一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸盐、污物释放聚合物(如聚对苯二甲酸(polytelephthalic acid))、粘土(如高岭石、蒙脱石、绿坡缕石(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭土)，以及它们的混合物。
如本文指出的那样，在一些实施方案中，抗再沉积剂用于本发明的一些实施方案中。在一些实施方案中，使用非离子型表面活性剂。例如，在自动盘碟洗涤实施方案中使用非离子型表面活性剂，以便实现表面改性，尤其是实现铺展(sheeting)，从而避免成膜、斑染，并改善光泽度。这些非离子型表面活性剂还可用于防止污渍再沉积。在一些实施方案中，抗再沉积剂是本领域已知的非离子型表面活性剂(参见例如EP 2 100 949)。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂可为乙氧基化的非离子型表面活性剂、环氧封端的聚(氧烷基化)醇类和氧化胺表面活性剂。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。适宜的聚合物型染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基
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唑烷酮、聚乙烯基咪唑或它们的混合物。在至少使用一种染料转移抑制剂的实施方案中，按清洁组合物的重量计，本发明的清洁组合物包含约0.0001％至约10％，约0.01％至约5％，或甚至约0.1％至约3％。
在一些实施方案中，本发明的组合物内包含硅酸盐。在一些此类实施方案中，使用了硅酸钠(如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶层状硅酸盐(crystalline phyllosilicates))。在一些实施方案中，硅酸盐以约1％至约20％的水平存在。在一些实施方案中，硅酸盐以按组合物的重量计约5％至约15％的水平存在。
在一些另外的实施方案中，本发明的清洁组合物还包含分散剂。适宜的水溶性有机材料包括但不限于均聚合酸或共聚合酸或这些聚合酸的盐，其中聚羧酸至少包含两个羧基，这些羧基彼此隔开不超过两个碳原子。
在一些另外的实施方案中，可以通过任何适宜的技术稳定清洁组合物中使用的酶。在一些实施方案中，最终组合物中存在钙和/或镁离子的水溶性来源，这些水溶性来源向本文采用的酶提供钙和/或镁离子，本文采用的酶因此而稳定。在一些实施方案中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐，包括碱土金属盐，例如钙盐(如甲酸钙)。预期可在本发明中使用稳定酶的各种技术。例如，在一些实施方案中，通过在最终组合物中存在锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源(以向本文采用的酶提供所述离子)、以及其他金属离子(如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)，铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)、氧钒(IV))，从而稳定本文采用的酶。氯化物和硫酸盐也可以用于本发明的一些实施方案。适宜的寡糖和多糖的示例(如糊精)是本领域已知的(参见例如WO 07/145964)。在一些实施方案中，还可以使用可逆蛋白酶抑制剂，例如含硼化合物(如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)，并且/或者可根据需要使用三肽醛，以便进一步提高稳定性。
在一些实施方案中，本发明的组合物中存在漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐(如，过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施方案中，无机过氧化氢合物盐为碱金属盐。在一些实施方案中，包括结晶固体形式、无额外保护的无机过氧化氢合物盐；但在一些其他实施方案中，对盐进行了包覆。本领域已知的任一种适宜的盐都可用于本发明(参见例如EP 2 100 949)。
在一些实施方案中，在本发明的组合物中使用了漂白活化剂。漂白活化剂通常为有机过酸的前体，在60℃和低于60℃温度的清洁过程中，漂白活化剂可增强漂白功能。适用于本文的漂白活化剂包括下述化合物：这种化合物在过水解条件下，会产生脂肪族过氧羧酸，并且/或者任选取代的过苯甲酸，其中所述脂肪族过氧羧酸优选具有约1至约10个碳原子，尤其是约2至约4个碳原子。另外的漂白活化剂是本领域已知的，而且可用于本发明(参见例如EP 2 100 949)。
此外，在一些实施方案中，如本文进一步描述的，本发明的清洁组合物还至少包含一种漂白催化剂。在一些实施方案中，使用了三氮杂环壬烷锰与相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。另外的漂白催化剂也可用于本发明(参见例如US 4,246,612、5,227,084、4,810410，WO 99/06521和EP 2 100 949)。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一些实施方案中，使用了含金属的漂白催化剂。在一些实施方案中，金属漂白催化剂包含催化剂体系，该催化剂体系包含具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、几乎没有或完全没有漂白催化活性的辅助性金属阳离子(如锌或铝阳离子)，以及对催化性和辅助性金属阳离子具有确定的稳定性常数的多价螯合剂，尤其可使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐(参见例如美国专利No.4,430,243)。在一些实施方案中，使用锰化合物催化本发明的清洁组合物。这类化合物及其使用水平是本领域众所周知的(参见例如美国专利No.5,576,282)。在另外的实施方案中，在本发明的清洁组合物中使用了钴漂白催化剂。各种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见例如美国专利No.5,597,936和No.5,595,967)，而且容易用已知工序制备。
在一些另外的实施方案中，本发明的清洁组合物包含大多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为一种实践方式，但非限制性地，在一些实施方案中，调整本发明提供的组合物和清洁过程，使得活性MRL物质在水性洗涤介质中的浓度大约为至少每一亿分之一；在一些实施方案中，调整以在洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm，更优选为约0.05ppm至约10ppm，最优选为约0.1ppm至约5ppm的MRL。
在一些实施方案中，本发明的过渡金属漂白催化剂中的过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。MRL还包括但不限于交联桥接(cross-bridged)的特殊超刚性配体(如，5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。适宜的过渡金属MRL容易凭借已知工序制备(参见例如WO 2000/32601，和美国专利No.6,225,464)。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于预防和/或减轻金属的晦暗、腐蚀和/或氧化，其中金属包括铝、不锈钢、有色金属(如银和铜)。适宜的金属护理剂包括EP 2 100 949、WO 9426860和WO 94/26859中描述的那些。在一些实施方案中，金属护理剂为锌盐。在一些另外的实施方案中，本发明的清洁组合物包含按重量计约0.1％至约5％的一种或多种金属护理剂。
在一些实施方案中，清洁组合物为具有金属蛋白酶多肽蛋白酶变体的高密度液体(HDL)组合物。HDL液体衣物洗涤剂可包含去污表面活性剂(10％-40％)，这种去污表面活性剂包括阴离子型去污表面活性剂(选自直链或支链或无规链的、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)，和任选的非离子型表面活性剂(选自直链或支链或无规链的、取代或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化醇和/或C6-C12烷基酚烷氧基化物)；任选地，其中阴离子型去污表面活性剂(亲水指数(HIc)为6.0至9)与非离子型去污表面活性剂的重量比大于1:1。
所述组合物可任选地包含表面活性增强聚合物，这种表面活性增强聚合物由两亲性的烷氧基化油脂清洁聚合物和/或无规接枝聚合物组成，其中两亲性的烷氧基化油脂清洁聚合物选自具有分支的亲水性与疏水性的烷氧基化聚合物，诸如烷氧基化聚亚烷基亚胺，含量在0.05重量％至10重量％范围内；无规接枝聚合物通常由亲水性主链与疏水侧链组成，其中亲水性主链包含选自下列的单体：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单位、烷氧基单位、马来酸酐、饱和多元醇(如甘油)以及这些单体的混合物；疏水侧链选自：C4-C25烷基、聚丙烯、聚丁烯、饱和C-C6单羧酸的乙烯基酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯以及这些单体的混合物。
组合物可包含另外的聚合物，诸如污物释放聚合物(包括阴离子封端的聚酯，例如SRP1；包含选自糖类、二元羧酸、多元醇及其组合的至少一种单体单位、呈无规或嵌段构型的聚合物；呈无规或嵌段构型的、基于对苯二甲酸亚乙酯的聚合物及其共聚物，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6，Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，Marloquest SL)、抗再沉积聚合物(0.1重量％至10重量％，包括羧酸酯聚合物，诸如包含选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、延胡索酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物的至少一种单体的聚合物，乙烯基吡咯烷酮均聚物、和/或聚乙二醇，分子量在500至100,000Da范围内)；纤维素聚合物(包括选自如下的那些：烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧烷基纤维素、烷基羧烷基纤维素，示例包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物)、以及聚合羧酸盐(诸如马来酸/丙烯酸无规共聚物，或聚丙烯酸均聚物)。
组合物还可包含饱和或不饱和的脂肪酸，优选饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0重量％至10重量％)；沉积助剂(其示例包括多糖，优选纤维素聚合物；聚二烯丙基二甲基卤化铵(DADMAC)；呈无规或嵌段构型的、DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、卤化咪唑啉
Figure BDA0000916970520000551
的共聚物及其混合物；阳离子瓜尔胶，阳离子纤维素例如阳离子羟乙基纤维素，阳离子淀粉，阳离子聚丙烯酰胺，以及它们的混合物)。
组合物可进一步包含染料转移抑制剂，其示例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基
Figure BDA0000916970520000552
唑烷酮、聚乙烯基咪唑和/或它们的混合物；螯合剂，其示例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧甲基谷氨酸的四钠盐)(GLDA)、次氮基三乙酸(NTA)、4,5-二羟基间苯二磺酸、柠檬酸及其任何盐、N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)，以及这些物质的衍生物。
组合物可进一步包含酶(0.01重量％的活性酶至0.03重量％的活性酶)，所述酶可以选自酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶，以及这些酶的任意混合物。组合物可包含酶稳定剂(其示例包括多元醇诸如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，可逆的蛋白酶抑制剂，硼酸、硼酸衍生物(如芳族硼酸酯)或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰基苯基硼酸)，肽或甲酸盐)。
组合物还可包含硅氧烷或脂肪酸基的抑泡剂；调色染料，钙和镁离子，视觉信号成分，消泡剂(0.001重量％至约4.0重量％)和/或结构剂(structurant)/增稠剂(0.01重量％至5重量％，选自甘油二酯、甘油三酯、乙二醇双硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微纤纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶以及它们的混合物)。
适宜的去污表面活性剂还包括阳离子型去污表面活性剂(选自烷基吡啶
Figure BDA0000916970520000561
化合物、烷基季铵化合物、烷基季
Figure BDA0000916970520000562
化合物、烷基叔锍化合物和/或这些化合物的混合物)；两性离子和/或两性去污表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子型表面活性剂，以及它们的混合物。
组合物可为任何液体形式，例如液体或凝胶形式，或它们的任意组合。组合物可为任何单位剂型，例如小袋(pouch)。
在一些实施方案中，清洁组合物为具有金属蛋白酶多肽蛋白酶变体的高密度粉末(HDD)组合物。HDD粉末衣物洗涤剂可包含：去污表面活性剂，包括阴离子型去污表面活性剂(选自直链或支链或无规链的、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)，非离子型去污表面活性剂(选自直链或支链或无规链的、取代或未取代的C8-C18烷基乙氧基化物和/或C6-C12烷基酚烷氧基化物)，阳离子型去污表面活性剂(选自烷基吡啶
Figure BDA0000916970520000563
化合物，烷基季铵化合物，烷基季
Figure BDA0000916970520000564
化合物，烷基叔锍化合物，以及它们的混合物)，两性离子和/或两性去污表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱)，两性表面活性剂，半极性非离子型表面活性剂以及它们的混合物；助洗剂(无磷助洗剂[例如，沸石助洗剂，例子包括沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP，含量在0重量％至小于10重量％范围内]；磷酸盐助洗剂[示例包括含量在0重量％至小于10重量％范围内的三聚磷酸钠]；柠檬酸、柠檬酸盐、次氮基三乙酸或其盐[含量在小于15重量％范围内]；硅酸盐[含量在0重量％至小于10重量％范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠，或者层状硅酸盐(SKS-6)]；碳酸盐[含量在0重量％至小于10重量％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠])；漂白剂(光漂白剂，示例包括磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、氧杂蒽染料以及它们的混合物；疏水或亲水漂白活化剂(示例包括十二烷酰基羟苯磺酸盐、癸酰基羟苯磺酸盐、癸酰基羟苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基羟苯磺酸盐、四乙酰乙二胺(TAED)和壬酰羟苯磺酸盐(NOBS)、nitrile quat以及它们的混合物；过氧化氢；过氧化氢来源(无机过氧化氢合盐，示例包括过硼酸，过碳酸，过硫酸，过磷酸或过硅酸的单水合或四水合钠盐)；预制的亲水和/或疏水过酸(选自过羧酸和过羧酸盐，过碳酸酸和过碳酸盐，过亚氨酸和过亚氨酸盐，过氧单硫酸和过氧单硫酸盐)以及它们的混合物和/或漂白催化剂(例如亚胺漂白促进剂，示例包括亚铵阳离子和聚离子、亚胺两性离子、改性胺、改性氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺；环糖酮以及它们的混合物；含金属的漂白催化剂，例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子连同辅助金属阳离子诸如锌或铝和多价螯合剂诸如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐)。
组合物可进一步包含酶，所述酶选自酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶，以及它们的任意混合物。
组合物还可包含附加的洗涤剂成分，包括香料微囊、淀粉包封的香料谐香剂(perfume accord)、调色剂、附加的聚合物(包括织物完整性(fabric integrity)聚合物和阳离子聚合物)、染料锁定成分、织物软化剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化多胺、织物沉积助剂和/或环糊精。
在一些实施方案中，清洁组合物为具有本发明的金属蛋白酶的自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂组合物。ADW洗涤剂组合物可包含含量从0重量％至10重量％的两种或更多种非离子型表面活性剂，选自：乙氧基化非离子型表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧烷基化)醇或氧化胺表面活性剂；含量在5重量％至60重量％范围内的助洗剂，包括磷酸盐(单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或寡聚磷酸盐，优选三聚磷酸钠(STPP))或无磷助洗剂(例如，基于氨基酸的化合物，其示例包括甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)及其盐和衍生物、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其盐和衍生物、亚氨基二琥珀酸(IDS)及其盐和衍生物、羧甲基菊粉及其盐和衍生物以及它们的混合物，次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、β-丙氨酸二乙酸(B-ADA)以及这些物质的盐)；含量在0.5重量％至50重量％范围内的、聚羧酸的均聚物和共聚物及其部分或完全中和盐，单体聚羧酸和羟基羧酸及其盐；含量在0.1重量％至50重量％范围内的磺化/羧化聚合物(为产物提供尺寸稳定性)；含量在约0.1重量％至约10重量％范围内的干燥助剂(选自聚酯，尤其是阴离子聚酯，任选连同另外的具有有利于缩聚的3至6种官能团(尤其是酸、醇或酯官能团)的单体，聚碳酸酯-，聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其活性环状碳酸酯和尿素型的前体化合物)；含量在约1重量％至约20重量％范围内的硅酸盐(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶层状硅酸盐)；无机漂白剂(例如过氧化氢合盐，如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧基十二烷二酸、二过氧基十四烷二酸、二过氧基十六烷二酸)；含量在约0.1重量％至约10重量％范围内的漂白活化剂，即有机过酸前体；漂白催化剂(选自三氮杂环壬烷合锰及相关络合物，二吡啶基胺合Co、Cu、Mn、Fe及相关络合物，五胺乙酸合钴(III)及相关络合物)；含量在约0.1重量％至5重量％范围内的金属护理剂(选自苯并三唑、金属盐及络合物，和/或硅酸盐)；酶，其含量为每克自动盘碟洗涤剂组合物含约0.01至5.0mg活性酶(酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶，以及它们的任意混合物)；以及酶稳定剂组分(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。
通常情况下，掺入洗涤剂组合物的金属蛋白酶水平为按组合物的重量计0.000001％至5％的酶蛋白，或者0.00001％至2％、或0.0001％至1％的酶蛋白，或者0.001％至0.75％的酶蛋白。
本发明的金属蛋白酶多肽用于动物饲料
在本发明的另外一方面，可将本发明的金属蛋白酶多肽用作动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品的组分，所述动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品包含金属蛋白酶及其变体。本发明还涉及制备这种动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，包括将金属蛋白酶多肽与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分混合。另外，本发明涉及在动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的制备中使用金属蛋白酶多肽。
术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在一个具体实施方案中，动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的示例包括但不限于家猪(pig)和猪(swine)，例如小猪、还在发育的猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、小鸡、肉鸡、产蛋鸡；鱼类，例如大马哈鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；甲壳动物，例如小虾和对虾。在另一个实施方案中，动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛犊、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和蓝牛羚(nilgai)。
在本发明的上下文中，术语“宠物食品”应理解为家养动物的食物，其中家养动物诸如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、龙猫、奇珍鼠、豚鼠；禽宠物，诸如金丝雀、长尾小鹦鹉、鹦鹉；爬行类宠物，诸如乌龟、蜥蜴和蛇；水生宠物，诸如热带鱼和青蛙。
术语“动物饲料组合物”、“饲料”和“秣料”可互换使用，都可包含一种或多种选自下列物质的喂料：a)谷类食物，诸如小粒谷类作物(例如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷类作物(例如玉米或高粱)；b)谷类食物的副产品，诸如玉米面筋粉、干酒糟及其可溶物(DDGS)(尤其是，基于玉米的干酒糟及其可溶物(cDDGS))、小麦麸、小麦粉头(middlings)、小麦次粉(shorts)、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁、柑橘渣；c)从诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜、鱼粉、干燥血浆蛋白、肉骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰子肉、芝麻等来源获得的蛋白质；d)从植物和动物来源获得的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
本发明的金属蛋白酶多肽用于纺织物退浆
还考虑使用本发明的金属蛋白酶多肽处理织物(例如，使纺织物退浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域众所周知的(参见例如美国专利No.6,077,316)。例如，可通过使织物与溶液中的金属蛋白酶接触的方法，来改善织物的触感与外观。可在压力下用溶液处理织物。
可在编织纺织物的过程中或之后、或在退浆阶段期间、或在一个或多个附加的织物加工步骤期间，施用本发明的金属蛋白酶。在编织纺织物过程中，编织线会暴露于相当大的机械应力。通常先用淀粉或淀粉衍生物为经纱上浆，再将经纱装上纺织机编织，上浆的目的是增强经纱的拉伸强度、防止断裂。可在编织过程中或之后施用本发明的金属蛋白酶，以便除去这些上浆淀粉或淀粉衍生物。编织完成后，可使用金属蛋白酶除去上浆涂层，再进一步加工织物，确保获得均匀耐洗的织物。
本发明的金属蛋白酶可以，作为洗涤剂添加剂，例如，在含水组合物中，单独使用，或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起使用，以使织物(包括含棉织物)退浆。也可以在组合物和方法中使用淀粉酶用于在靛蓝染色牛仔布和服装上产生石洗外观。在制造衣服过程中，可先将织物裁剪、缝制为衣服或服装，再进行整理。特别地，已开发出不同的酶促整理方法来制造牛仔裤。整理牛仔服装通常以酶促退浆步骤开始，在此期间，用蛋白水解酶处理服装，以使织物软化，并使棉更容易被后续的酶促整理步骤处理。可以在整理牛仔服装的方法(例如，“生物打磨工艺”)、酶退浆方法和使织物软化的方法中，以及/或者整理工艺中使用本发明的金属蛋白酶。
本发明的金属蛋白酶多肽用于纸浆漂白
本文描述的金属蛋白酶多肽还可用于纸浆的酶辅助漂白，其中纸浆例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或由亚硫酸盐法制出的纸浆。一般来讲，在适宜漂白纸浆的条件下将纸浆与本发明的金属蛋白酶多肽一起温育。
在一些实施方案中，纸浆为用氧气、臭氧、过氧化物或过氧酸漂白的无氯纸浆。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽用于酶辅助的纸浆漂白，其中所述纸浆是用改进或连续的制浆方法制出的，表现出低木质素含量。在一些其他实施方案中，单独施用金属蛋白酶多肽，或者优选地将金属蛋白酶多肽结合木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶施用。
本发明的金属蛋白酶多肽用于蛋白质降解
本文描述的金属蛋白酶多肽还可用于酶辅助的动物蛋白质去除以及其随后的降解或处置(例如羽毛、皮肤、毛发、兽皮等)。在某些情况下，与传统烫水浸泡或拔毛操作相比，将动物尸体浸泡在含有本发明的金属蛋白酶多肽的溶液中可避免动物皮肤受损。在一个实施方案中，可以在适宜消化鸟羽或起始鸟羽降解的条件下，将分离的本发明金属蛋白酶多肽喷洒到羽毛上。在一些实施方案中，可结合氧化剂，如上文提到的那样，使用本发明的金属蛋白酶。
在一些实施方案中，使用本发明的金属蛋白酶多肽来辅助去除与未经处理的羽毛相关的油或脂肪。在一些实施方案中，金属蛋白酶多肽用于组合物中以清洁羽毛以及对纤维进行消毒和部分脱水。在一些其他实施方案中，在洗涤溶液中，联合95％乙醇或其他极性有机溶剂，在有或无表面活性剂(约0.5％(v/v))的情况下，施用本发明的金属蛋白酶多肽。
在其他实施方案中，使用本发明公开的金属蛋白酶多肽回收鸟羽中的蛋白质。本发明公开的金属蛋白酶多肽可以单独地或组合地用于适宜的羽毛加工及蛋白水解方法，例如PCT/EP2013/065362、PCT/EP2013/065363和PCT/EP2013/065364中公开的那些方法，这些文献据此以引用方式并入本文。在一些实施方案中，随后可将回收的蛋白质用于动物或鱼饲料中。
实验
以下实施例进一步详细描述本发明，这些实施例不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例1.1
克隆类芽孢杆菌的金属蛋白酶PspPro3
选择类芽孢杆菌属菌株，作为可用于各种工业应用中的酶的可能来源。通过如下获得基因组DNA用于测序：首先将菌株于心浸液琼脂平板(Difco)上37℃培养24小时。从平板上刮下细胞材料，用Zymo公司的ZF真菌/细菌DNA小量制备试剂盒(目录号D6005)由该细胞材料制备基因组DNA。将基因组DNA用于基因组测序。类芽孢杆菌属菌株的全基因组由BaseClear(荷兰莱顿(Leiden,The Netherlands))使用Illumina新一代测序技术进行测序。对数据进行组装后，通过BioXpr(比利时那慕尔(Namur,Belgium))对重叠群进行注释。注解后在类芽孢杆菌中鉴定出的一个基因编码金属蛋白酶，将该基因命名为PspPro3，其序列由SEQ ID NO：1示出。PspPro3基因编码的对应蛋白质由SEQ ID NO：2示出。使用SignalP4.0版(Nordahl Petersen等人，2011年，Nature Methods，第8卷，第785-786页)预测，该蛋白质在N端有长度为26个氨基酸的信号肽。存在信号序列表明PspPro3为分泌的酶。基于与多粘类芽孢杆菌Npr蛋白(Takekawa等人，1991年，Journal of Bacteriology，第173卷，第21期，第6820-6825页)的蛋白序列比对，预测了前肽区。预测的PspPro3蛋白成熟区由SEQID NO：3示出。
从类芽孢杆菌分离出的PspPro3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码预测的天然信号肽的序列以斜体示出：
Figure BDA0000916970520000631
Figure BDA0000916970520000632
GCGGAGAGTTCCGTTTCGGGGCCGGCTCAGCTTACGCCAACCTTCCATGCCGAACAATGGAAAGCACCTTCATCGGTATCGGGTGATGACATCGTATGGAGCTATTTAAATCGGCAAAAGAAAACGTTGCTGGGTACGGACAGCACCAGTGTCCGTGATCAATTCCGTATCGTAGATCGCACAAGCGACAAATCCGGCGTGAGCCATTATCGGCTGAAGCAATATGTAAACGGAATTCCCGTATATGGAGCTGAACAGACCATTCATGTGGGCAAATCCGGTGAAGTGACCTCTTATCTGGGAGCCGTGATTACTGAGGATCAGCAAGAAGAAGCTACGCAAGGTACAACTCCGAAAATCAGCGCTTCTGAAGCGGTCCATACCGCATATCAGGAGGCAGCTACACGGGTTCAAGCCCTCCCTACCTCCGATGATACGATTTCTAAAGATGCGGAGGAGCCAAGCAGTGTAAGCAAAGACACTTACTCCGAAGCAGCTAACAACGGAAAAACGAGTTCTGTTGAAAAGGACAAGCTCAGCCTTGAGAAAGCGGCTGACCTGAAAGATAGCAAAATTGAAGCGGTGGAGGCAGAGCCAAACTCCATTGCCAAAATCGCCAACCTGCAGCCTGAGGTAGATCCTAAAGCCGAACTATATTTCTATGCGAAGGGCGATGCATTGCAGCTGGTTTATGTGACTGAGGTTAATATTTTGCAGCCTGCGCCGCTGCGTACACGCTACATCATTGACGCCAATGATGGCAAAATCGTATCCCAGTATGACATCATTAATGAAGCGACAGGCACAGGCAAAGGTGTACTCGGTGATACCAAAACATTCAACACTACTGCTTCCGGCAGCAGCTACCAGTTAAGAGATACGACTCGCGGGAATGGAATCGTGACTTACACGGCCTCCAACCGTCAAAGCATCCCAGGTACGATCCTGACCGATGCCGATAACGTATGGAATGATCCAGCCGGCGTGGATGCCCACGCTTATGCAGCCAAAACCTATGATTATTATAAGGAAAAGTTCAATCGCAACAGCATTGACGGACGAGGCCTGCAGCTCCGTTCGACAGTTCATTACGGCAATCGTTACAACAACGCCTTCTGGAACGGCTCCCAAATGACTTATGGAGACGGAGACGGCACCACATTTATCGCTTTTAGCGGTGATCCGGATGTAGTTGGTCATGAACTCACACACGGTGTTACGGAGTATACTTCCAATTTGGAATATTACGGAGAATCCGGTGCGTTGAACGAGGCCTTCTCGGACATCATCGGCAATGACATCCAGCGTAAAAACTGGCTTGTAGGCGATGATATTTACACGCCACGCATTGCGGGTGATGCACTTCGTTCTATGTCCAATCCTACGCTGTACGATCAACCGGATCACTATTCGAACTTGTACAGAGGCAGCTCCGATAACGGCGGCGTTCATACGAACAGCGGTATTATAAATAAAGCCTATTATCTGTTGGCACAAGGCGGCACCTTCCATGGTGTAACTGTCAATGGGATTGGCCGCGATGCAGCGGTTCAAATTTACTACAGCGCCTTTACGAACTACCTGACTTCTTCTTCTGACTTCTCCAATGCACGTGATGCCGTTGTACAAGCGGCAAAAGATCTCTACGGCGCGAGCTCGGCACAAGCTACCGCAGCAGCCAAATCTTTTGATGCTGTAGGCGTTAAC
PspPro3前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。预测的信号肽以斜体示出，预测的前肽加下划线表示：
Figure BDA0000916970520000641
AESSVSGPAQLTPTFHAEQWKAPSSVSGDDIVWS YLNRQKKTLLGTDSTSVRDQFRIVDRTSDKSGVSHYRLKQYVNGIPVYGAEQTIHVGKSGEVTSYLGAVITEDQQEE ATQGTTPKISASEAVHTAYQEAATRVQALPTSDDTISKDAEEPSSVSKDTYSEAANNGKTSSVEKDKLSLEKAADLK DSKIEAVEAEPNSIAKIANLQPEVDPKAELYFYAKGDALQLVYVTEVNILQPAPLRTRYIIDANDGKIVSQYDIINEATGTGKGVLGDTKTFNTTASGSSYQLRDTTRGNGIVTYTASNRQSIPGTILTDADNVWNDPAGVDAHAYAAKTYDYYKEKFNRNSIDGRGLQLRSTVHYGNRYNNAFWNGSQMTYGDGDGTTFIAFSGDPDVVGHELTHGVTEYTSNLEYYGESGALNEAFSDIIGNDIQRKNWLVGDDIYTPRIAGDALRSMSNPTLYDQPDHYSNLYRGSSDNGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGTFHGVTVNGIGRDAAVQIYYSAFTNYLTSSSDFSNARDAVVQAAKDLYGASSAQATAAAKSFDAVGVN
预测的成熟形式PspPro3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：
ATGTGKGVLGDTKTFNTTASGSSYQLRDTTRGNGIVTYTASNRQSIPGTILTDADNVWNDPAGVDAHAYAAKTYDYYKEKFNRNSIDGRGLQLRSTVHYGNRYNNAFWNGSQMTYGDGDGTTFIAFSGDPDVVGHELTHGVTEYTSNLEYYGESGALNEAFSDIIGNDIQRKNWLVGDDIYTPRIAGDALRSMSNPTLYDQPDHYSNLYRGSSDNGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGTFHGVTVNGIGRDAAVQIYYSAFTNYLTSSSDFSNARDAVVQAAKDLYGASSAQATAAAKSFDAVGVN
实施例1.2
表达类芽孢杆菌金属蛋白酶PspPro3
由中国上海捷瑞公司(Generay,Shanghai,China)合成PspPro3的前肽-成熟形式的DNA序列，将其插入枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz,Protein ExprPurif,55:40-52,2007(Vogtentanz，《蛋白质表达与纯化》，第55卷，第40-52页，2007年))，得到质粒pGX085(AprE-PspPro3)(图1.1)。将编码PspPro3蛋白的基因连接到酶切后的载体上，导致在枯草芽孢杆菌AprE信号序列的3’末端和预测的PspPro3天然前肽的5’末端之间添加了3个密码子(Ala-Gly-Lys)。该基因具有替代起始密码子(GTG)。如图1.1所示，pGX085(AprE-PspPro3)包含AprE启动子、用于引导靶蛋白在枯草芽孢杆菌中分泌的AprE信号序列、以及编码预测的PspPro3前肽和成熟区的合成核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。合成的AprE-PspPro3基因的翻译产物由SEQ ID NO：5示出。
用pGX085(AprE-PspPro3)质粒转化枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32,ΔscoC)，然后将转化的细胞涂布在补充了5ppm氯霉素和1.2％脱脂奶粉(目录号232100，Difco)的Luria琼脂平板上。挑选平板上透明晕圈最大的菌落，放入装有MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基，额外补充了5mM CaCl2)的250ml摇瓶发酵。
浓缩摇瓶内的发酵液，然后使用VivaFlow 200超滤装置(赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim))将浓缩发酵液进行缓冲液交换，交换到包含20mM Tris-HCl(pH8.5)、1mM CaCl2和10％丙二醇的上样缓冲液中。过滤后，将样品加到用上述上样缓冲液预平衡的150mL Q琼脂糖高效柱中，然后利用补充了0到0.7M的NaCl线性梯度的上样缓冲液，从柱上洗脱PspPro3。进一步合并相应的经纯化活性蛋白质级分，用10K Amicon Ultra浓缩，以便进一步分析。
质粒pGX085(AprE-PspPro3)中的合成PspPro3基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：4示出。编码预测的天然信号肽的序列以斜体示出，编码添加的三个残基(AGK)的区域以粗体示出：
Figure BDA0000916970520000651
Figure BDA0000916970520000652
GCAGAATCATCAGTGTCAGGACCGGCTCAGCTTACGCCGACGTTTCATGCAGAGCAGTGGAAAGCACCGAGCAGCGTTAGCGGAGATGACATCGTGTGGAGCTACCTGAACAGACAGAAGAAAACGCTTCTTGGCACGGACAGCACGAGCGTCAGAGACCAGTTCAGAATCGTGGATAGAACAAGCGACAAAAGCGGCGTCAGCCATTATAGACTGAAGCAGTATGTGAACGGAATCCCGGTTTATGGCGCAGAACAAACAATCCATGTCGGAAAGAGCGGCGAAGTTACGAGCTATCTGGGCGCGGTTATTACAGAGGACCAGCAAGAGGAGGCTACACAAGGCACGACACCGAAAATTTCAGCATCAGAGGCAGTTCATACGGCCTACCAAGAAGCTGCAACGAGAGTTCAAGCCCTGCCTACGTCAGATGATACAATCAGCAAAGACGCTGAGGAACCTAGCTCAGTTAGCAAGGACACGTATAGCGAAGCCGCGAACAATGGCAAGACGTCAAGCGTGGAAAAAGACAAGCTTTCACTGGAGAAGGCCGCTGATCTGAAAGACTCAAAGATCGAGGCTGTGGAAGCGGAACCGAATAGCATTGCAAAGATTGCCAACCTGCAACCGGAGGTGGACCCGAAGGCGGAGCTGTATTTCTACGCTAAAGGCGATGCACTGCAACTGGTTTACGTCACGGAGGTTAACATCCTGCAGCCGGCACCGCTTAGAACGAGATACATCATTGACGCGAACGACGGCAAGATCGTGAGCCAGTACGACATTATCAACGAGGCCACGGGAACGGGCAAGGGAGTCCTTGGCGACACGAAGACATTCAATACAACGGCCTCAGGCTCATCATACCAGCTGAGAGACACGACGAGAGGCAACGGAATCGTCACGTACACGGCTAGCAATAGACAGAGCATTCCGGGCACAATCCTTACGGACGCAGACAATGTGTGGAATGACCCGGCAGGCGTGGACGCACATGCCTACGCAGCGAAGACGTACGACTACTACAAGGAGAAGTTCAACAGAAACAGCATCGACGGAAGAGGACTGCAACTTAGAAGCACGGTGCATTACGGCAACAGATACAACAACGCTTTCTGGAACGGCAGCCAAATGACGTATGGAGACGGCGATGGAACAACGTTTATCGCATTCTCAGGCGACCCTGACGTTGTGGGACATGAACTGACGCATGGAGTCACAGAATACACGAGCAATCTGGAGTATTACGGAGAATCAGGCGCACTTAATGAGGCCTTCAGCGACATCATCGGAAACGACATCCAGAGAAAGAACTGGCTGGTTGGCGATGATATCTACACGCCGAGAATTGCGGGCGACGCGCTGAGATCAATGAGCAACCCTACGCTGTACGATCAGCCGGATCAYTACAGCAACCTGTATAGAGGCTCAAGCGATAATGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGCATCATCAACAAAGCCTATTATCTGCTGGCGCAAGGCGGCACATTCCATGGCGTTACAGTTAATCGCATTGGCAGAGACGCAGCCGTGCAGATCTACTACAGCGCATTCACGAATTACCTGACATCAAGCAGCGACTTTTCAAATGCAAGAGATGCAGTGGTGCAGGCGGCTAAAGACCTTTATGGAGCTTCAAGCGCTCAGGCCACAGCTGCGGCAAAAAGCTTCGACGCGGTTGGAGTGAAT
从质粒pGX085(AprE-PspPro3)表达的PspPro3前体蛋白的氨基酸序列由SEQ IDNO：5示出。预测的信号序列以斜体示出，添加的三个残基(AGK)以粗体示出，预测的前肽加下划线表示：
Figure BDA0000916970520000661
AESSVSGPAOLTPTFHAEOWKAPSSVS GDDIVWSYLNRQKKTLLGTDSTSVRDQFRIVDRTSDKSGVSHYRLKQYVNGIPVYGAEQTIHVGKSGEVTSYLGAVI TEDQQEEATQGTTPKISASEAVHTAYQEAATRVQALPTSDDTISKDAEEPSSVSKDTYSEAANNGKTSSVEKDKLSL EKAADLKDSKIEAVEAEPNSIAKIANLQPEVDPKAELYFYAKGDALQLVYVTEVNILQPAPLRTRYIIDANDGKIVS QYDIINEATGTGKGVLGDTKTFNTTASGSSYQLRDTTRGNGIVTYTASNRQSIPGTILTDADNVWNDPAGVDAHAYAAKTYDYYKEKFNRNSIDGRGLQLRSTVHYGNRYNNAFWNGSQMTYGDGDGTTFIAFSGDPDVVGHELTHGVTEYTSNLEYYGESGALNEAFSDIIGNDIQRKNWLVGDDIYTPRIAGDALRSMSNPTLYDQPDHYSNLYRGSSDNGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGTFHGVTVNGIGRDAAVQIYYSAFTNYLTSSSDFSNARDAVVQAAKDLYGASSAQATAAAKSFDAVGVN
用串联质谱测定了从枯草芽孢杆菌培养物分离的重组PspPro3蛋白的氨基酸序列，如下所示。该序列与预测的在SEQ ID NO：3中示出的序列一致。
ATGTGKGVLGDTKTFNTTASGSSYQLRDTTRGNGIVTYTASNRQSIPGTILTDADNVWNDPAGVDAHAYAAKTYDYYKEKFNRNSIDGRGLQLRSTVHYGNRYNNAFWNGSQMTYGDGDGTTFIAFSGDPDVVGHELTHGVTEYTSNLEYYGESGALNEAFSDIIGNDIQRKNWLVGDDIYTPRIAGDALRSMSNPTLYDQPDHYSNLYRGSSDNGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGTFHGVTVNGIGRDAAVQIYYSAFTNYLTSSSDFSNARDAVVQAAKDLYGASSAQATAAAKSFDAVGVN
实施例1.3
金属蛋白酶PspPro3的蛋白水解活性
使用偶氮酪蛋白(目录号74H7165，美格兹密公司(Megazyme))作为底物，在50mMTris(pH 7)中测定经纯化PspPro3的蛋白水解活性。反应前，用Milli-Q水(密理博公司(Millipore))将酶稀释到特定浓度。将偶氮酪蛋白溶解于100mM Tris缓冲液(pH 7)中，使其最终浓度为1.5％(w/v)。为引发反应，将50μL稀释的酶(或只用Milli-Q水作空白对照)加到置于冰上的非结合性96孔微量滴定板(96-MTP)(康宁生命科学公司(Corning LifeSciences)，目录号3641)中，然后添加50μL 1.5％偶氮酪蛋白。密封96-MTP，置于Thermomixer(艾本德公司(Eppendorf))中，以40℃、650rpm进行反应10分钟。之后加入100μL 5％三氯乙酸(TCA)终止反应。在平衡(在室温5分钟)和之后的离心(4℃、2000g，10分钟)后，将120μL上清液转移到新的96-MTP中，使用SpectraMax 190在440nm处测定上清液的吸光度(A440)。从酶的A440扣除空白对照的A440，得到净A440。将净A440相对不同的蛋白浓度(从1.25ppm至40ppm)作图。每个值都是一式两份测定的平均值，且值的波动不超过5％。用净A440代表蛋白水解活性。以偶氮酪蛋白为底物的蛋白水解测定结果(图1.2)表明，PspPro3为活性蛋白酶。
实施例1.4
金属蛋白酶PspPro3的pH分布图
以偶氮酪蛋白为底物，在不同pH值(pH 4至11)的12.5mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中研究PspPro3的pH分布图。为开始测定，首先，在放置冰上的96-MTP中，混合50μL具有特定pH值的25mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液与2μL稀释的酶(250ppm，溶于Milli-Q水)，然后加入48μL在水中制备的1.5％(w/v)偶氮酪蛋白。按实施例1.3所述，执行并分析反应。每种pH值下的酶活性都以相对活性记录，其中将最适pH值下的活性设定为100％。所测试的pH值为4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10和11。每个值都是一式三份测定的平均值。如图1.3所示，PspPro3的最适pH值为7.5；pH值介于5.5和9之间时，保持最大活性的70％以上。
实施例1.5
金属蛋白酶PspPro3的温度分布图
使用偶氮酪蛋白测定法在50mM Tris缓冲液(pH 7)中分析PspPro3的温度分布图。按实施例3所述的方式制备酶样品和偶氮酪蛋白底物。反应前，在200μL PCR管中混合50μL1.5％偶氮酪蛋白和45μL Milli-Q水，然后将PCR管放入Peltier热循环仪(伯乐公司(BioRad))，在所需温度(即20℃至90℃)下温育5分钟。温育之后，将5μL稀释的PspPro3(100ppm)或水(空白对照)加入底物混合物，再放入Peltier热循环仪，以不同温度反应10分钟。将每个测定混合物转移到每孔装有100μL 5％TCA的96-MTP中，使反应中止。随后按实施例1.3所述的方式离心并测定吸光度。活性以相对活性记录，其中将最适温度下的活性设定为100％。所测试的温度为20、30、40、50、60、70、80和90℃。每个值都是一式三份测定的平均值。图1.4中的数据表明，PspPro3的最适温度为50℃；温度介于45℃和60℃之间时，保持其最大活性的70％以上。
实施例1.6
金属蛋白酶PspPro3在自动盘碟洗涤(ADW)条件下的清洁性能
在pH 6或8检测了PspPro3在自动盘碟洗涤(ADW)条件下的清洁性能，其中使用模型自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂和PA-S-38微布样(荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT-Vlaardingen,The Netherlands))(蛋黄，带颜料，加热老化)。反应前，用包含10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520000681
80和10％丙二醇的稀释溶液将经纯化PspPro3稀释到所需浓度。在AT洗涤剂(组成在表1.1中示出)中执行反应，其中水硬度为100ppm(Ca2+:Mg2+＝3:1)，有或无漂白组分(过酸N,N-邻苯二甲酰氨基过氧己酸(PAP))。为引发反应，将180μL缓冲在pH 6或8的AT洗涤剂加入放置了PA-S-38微布样的96-MTP中，然后加入20μL稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，置于培养箱/摇床内，以50℃、1150rpm温育30分钟。温育之后，从每个孔取出100μL洗涤液转移到新的96-MTP中，使用分光光度计测定405nm处的吸光度(A405)(此处称为“初始性能”)。弃去96-MTP中剩余的洗涤液，用200μL水洗微布样一次。在加入180μL 0.1M CAPS缓冲液(pH 10)后，置于培养箱/摇床内，以50℃、1150rpm再温育10分钟。从所得洗涤液中取出100μL转移到新的96-MTP中，测定405nm处的吸光度(此处称为“洗脱性能”(wash-off))。两次吸光度测量值的和(“初始性能”加上“洗脱性能”)，得到“总性能”，以此衡量在模型污渍上的蛋白酶活性。图1.5A和图1.5B分别示出了在AT洗涤剂中在不含漂白剂或含有漂白剂的情况下，PspPro3蛋白质在pH值为6和8时清洁PA-S-38微布样的剂量响应。
表1.1：含有漂白剂的AT盘碟洗涤剂制剂的组成
Figure BDA0000916970520000691
*添加0.9M柠檬酸将AT洗涤剂的pH值调至所需值(pH 6或8)。
实施例1.7
金属蛋白酶PspPro3在洗衣条件下的清洁性能
在pH 8.2检测了PspPro3蛋白质在液体衣物洗涤剂中的清洁性能，其中使用商购洗涤剂和EMPA-116微布样(荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT Vlaardingen,TheNetherlands))(用血液/奶/墨染污的棉布)。反应前，用稀释溶液(10mM NaCl、0.1mMCaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520000692
80和10％丙二醇)将经纯化PspPro3蛋白样品稀释到所需浓度；将商购洗涤剂(
Figure BDA0000916970520000693
Clean
Figure BDA0000916970520000694
美国宝洁公司(Proctor&Gamble,USA)，2011年9月购买)在95℃下温育1小时，以便灭活洗涤剂中的酶。然后执行蛋白水解测定，确认商购洗涤剂中的蛋白酶已失活。用5mM HEPES(pH 8.2)进一步稀释加热处理过的洗涤剂，获得0.788g/L的最终浓度。同时，将缓冲的液体洗涤剂的水硬度调至103ppm(Ca2+:Mg2+＝3:1)。调节缓冲的洗涤剂中的NaCl浓度，将缓冲的洗涤剂的比电导率调至0.62mS/cm(低电导率)或3.5mS/cm(高电导率)。为引发反应，将190μL高电导率或低电导率的缓冲的洗涤剂加到装有EMPA-116微布样的96-MTP中，然后加入10μL稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，置于培养箱/摇床内，以32℃、1150rpm温育20分钟。温育之后，从每个孔取出150μL洗涤液转移到新的96-MTP中，使用分光光度计测定600nm处的吸光度，该吸光度指示于模型污渍上的蛋白酶活性；从蛋白酶的A600扣除空白对照的A600，得到净A600。图1.6示出了在高电导率或低电导率下在液体衣物洗涤剂中清洁EMPA-116微布样的剂量响应。
实施例1.8
比较PspPro3与其他金属蛋白酶
A.同源蛋白酶的鉴定
在NCBI非冗余蛋白质数据库及Genome Quest专利数据库中执行BLAST搜索(Altschul等人，Nucleic Acids Res，第25卷，第3389-3402页，1997年)(搜索参数设为默认值)，来鉴定同源物。将PspPro3成熟蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)用作查询序列。两种搜索设置的同一性百分比(PID)均被定义为相同残基的数量除以逐对比对中所比对残基的数。表1.2A和表1.2B提供了与PspPro3具有百分比同一性的序列的列表。表1.2中的长度是指同源蛋白酶全序列的长度。
Figure BDA0000916970520000701
Figure BDA0000916970520000711
Figure BDA0000916970520000712
B.同源蛋白酶序列的比对
使用CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research，第22卷，第4673-4680页，1994年)，设定默认参数，将成熟PspPro3的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与嗜热菌蛋白酶(P00800，嗜热溶蛋白芽孢杆菌)和源自类芽孢杆菌Aloe-11(ZP_09775364)的蛋白酶比对。图1.7示出了PspPro3与这些蛋白酶序列的比对结果。
C.系统发育树
使用表2A中的代表性同源物的序列和邻接法(NJ)(Saitou,N.和Nei,M.，1987年，“The neighbor-joining method:a new method for reconstructing GuideTrees.MolBiol.Evol.，第4卷，第406-425页)，构建了PspPro3全长序列(SEQ ID NO：2)的系统发育树。NJ法基于被分析的所有序列对之间的距离矩阵而工作。这些距离与序列之间的趋异度相关。使用phylodendron-phylogenetic tree printer软件(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html)显示图1.8所示的系统发育树。
实施例1.9
PspPro3的Terg-o-Tometer性能评估
使用Terg-o-Tometer(新泽西州费尔菲尔德的仪器营销服务有限公司(Instrument Marketing Services,Inc,Fairfield,NJ))在衣物洗涤剂应用中测试PspPro3的洗涤性能。在32℃和16℃下进行性能评估。污物负载由以下每种污渍布样之二组成：血、奶、墨污染的棉布(EMPA116)(瑞士圣加仑的测试材料股份公司(Test materialsAG,St.Gallen,Switzerland))，血、奶、墨污染的涤棉布(polycotton)(EMPA117)(瑞士圣加仑的测试材料股份公司(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland))，可可污染的棉布(EMPA112)(瑞士圣加仑的测试材料股份公司(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland))，以及颜料、油和奶成分污染的棉布(CFT C-10)(荷兰弗拉尔丁恩的测试材料中心私人有限公司(Center for Testmaterials BV,Vlaardingen,Netherlands))，加上额外的白色双罗纹针织物，从而使每个Terg-o-Tometer量杯的总织物负载为40g，所述量杯装有1L的去离子水。将水硬度调节至6格令/加仑，用5mM HEPES(pH8.2)缓冲量杯中的pH。热灭活的Tide Regular HDL(宝洁公司(Procter&Gamble))(从美国当地超市购买的商用液体洗涤剂)以0.8g/L的浓度使用。使用前将洗涤剂灭活，处理方法是在92℃下水浴2至3小时，然后冷却至室温。商业洗涤剂的热灭活可破坏酶组分的活性，同时保留非酶组分的特性。使用用于测量蛋白酶活性的Suc-AAPF-pNA测定法，测量经加热灭活的洗涤剂中的酶活性。将
Figure BDA0000916970520000721
Prime HA(杰能科有限公司(Genencor Int’l))和PspPro3蛋白酶各自都加至最终浓度为0、0.2、0.5、1和1.5ppm。洗涤时间为12分钟。洗涤处理之后，将所有布样漂洗3分钟，并在低热下机器干燥。
处理前后，使用Tristimulus Minolta Meter CR-400测定每一类布样各四块的光反射率。将L、a和b值的差转换为如由CIE-LAB色空间定义的总色差(dE)。通过如下方式，将污渍的清洁表示为去污指数百分比(％SRI)：取洗涤前后的色差比，并且与未洗涤的污垢(洗涤之前)和未污染的织物的色差进行比较，将读取每个洗涤布样的两个不同区域所获得的8个值取平均值；污渍的清洁在表1.9A和表1.9B中记录为平均％SRI(dE)±95CI。表1.9A汇总了32℃下PspPro3的清洁性能，表1.9B汇总了16℃下PspPro3的清洁性能。
Figure BDA0000916970520000731
Figure BDA0000916970520000732
Figure BDA0000916970520000741
实施例2.1
从类芽孢杆菌属物种中克隆金属蛋白酶PspPro2
选择类芽孢杆菌属菌株作为可用于各种工业应用中的酶的可能来源。通过如下方式获得用于测序的基因组DNA：首先在37℃下使菌株在心浸液琼脂平板(Difco)上生长24小时。从平板上刮下细胞材料，用Zymo公司的ZF真菌/细菌DNA小量制备试剂盒(目录号D6005)从该细胞材料中制备基因组DNA。该基因组DNA用于基因组测序。类芽孢杆菌属菌株的全基因组由BaseClear(荷兰莱顿(Leiden,The Netherlands))使用Illumina新一代测序技术进行测序。对数据进行组装后，通过BioXpr(比利时那慕尔(Namur,Belgium))对重叠群进行注释。在类芽孢杆菌属中进行注释后所鉴定的基因之一编码金属蛋白酶，并且该基因(命名为PspPro2)的序列以SEQ ID NO：6提供。由PspPro2基因编码的相应蛋白质如SEQ ID NO：7所示。该蛋白在N端具有长度为24个氨基酸的信号肽，如通过SignalP 4.0版(NordahlPetersen等人，2011年，Nature Methods，第8卷，第785-786页)所预测的。信号序列的存在表明PspPro2为分泌性酶。基于PspPro2与多粘类芽孢杆菌的Npr蛋白(Takekawa等人，1991年，Journal of Bacteriology，第173卷，第21期，第6820-6825页)的蛋白序列比对，预测了PspPro2的前肽区。预测的PspPro2成熟区如SEQ ID NO：8所示。
从类芽孢杆菌属物种中分离的PspPro2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。编码预测的天然信号肽的序列以斜体示出：
Figure BDA0000916970520000751
Figure BDA0000916970520000752
GCAGAGCATTCTGTTCCTGATCCTACTCAGCTAACACCGACCTTTCACGCCGAGCAATGGAAGGCTCCTTCCACGGTAACCGGCGACAATATTGTATGGAGCTATTTGAATCGACAAAAGAAAACCTTATTGAATACAGACAGCACCAGTGTGCGTGATCAGTTCCGCATCATTGATCGTACAAGCGACAAATCCGGTGCAAGCCATTATCGGCTCAAGCAATATGTAAACGGGATCCCCGTATATGGGGCTGAACAGACCATTCATGTGAACAACGCCGGTAAAGTAACCTCTTATTTGGGTGCTGTCATTTCAGAGGATCAGCAGCAAGACGCGACCGAAGATACCACTCCAAAAATCAGCGCGACTGAAGCCGTTTATACCGCATATGCAGAAGCCGCTGCCCGGATTCAATCCTTCCCTTCCATCAATGATAGTCTTTCTGAGGCTAGTGAGGAACAAGGGAGTGAGAATCAAGGCAATGAGATTCAAAACATTGGGATTAAAAGCAGTGTAAGTAATGACACTTACGCAGAGGCGCATAACAACGTACTTTTAACCCCCGTTGACCAAGCAGAGCAAAGTTACATTGCCAAAATTGCTAATCTGGAGCCAAGTGTAGAGCCCAAAGCAGAATTATACATCTATCCAGATGGTGAGACTACACGACTGGTTTATGTAACAGAGGTTAATATTCTTGAACCTGCGCCTCTGCGCACACGCTACTTCATTGATGCGAAAACCGGCAAAATCGTATTCCAGTATGACATCCTCAACCACGCAACAGGCACCGGCCGCGGCGTGGATGGCAAAACAAAATCATTTACGACTACAGCTTCAGGCAACCGGTATCAGTTGAAAGACACGACTCGCAGCAATGGAATCGTGACTTACACCGCTGGCAATCGCCAGACGACGCCAGGTACGATTTTGACCGATACAGATAATGTATGGGAGGACCCTGCGGCTGTTGATGCCCATGCCTACGCCATTAAAACCTATGACTATTATAAGAATAAATTCGGTCGCGACAGTATTGATGGACGTGGCATGCAAATTCGTTCGACAGTCCATTACGGCAAAAAATATAACAATGCCTTCTGGAACGGCTCGCAAATGACCTACGGAGACGGAGACGGGTCCACATTTACCTTCTTCAGCGGCGATCCCGATGTCGTGGGGCATGAGCTCACCCACGGCGTCACCGAGTTCACCTCCAATTTGGAGTATTATGGTGAGTCCGGTGCATTGAACGAAGCCTTCTCGGATATTATCGGTAATGATATAGATGGCACCAGTTGGCTTCTTGGCGACGGCATTTATACGCCTAATATTCCAGGCGACGCTCTGCGTTCCCTGTCCGATCCTACACGATTCGGCCAGCCGGATCACTACTCCAATTTCTATCCGGACCCCAACAATGATGATGAAGGCGGAGTCCATACGAACAGCGGTATTATCAACAAAGCCTATTATTTGCTGGCACAAGGCGGTACGTCCCATGGTGTAACGGTAACTGGTATCGGACGCGAAGCGGCTGTATTCATTTACTACAATGCCTTTACCAACTATTTGACCTCTACCTCCAACTTCTCTAACGCACGCGCTGCTGTTATACAGGCAGCCAAGGATTTTTATGGTGCTGATTCGCTGGCAGTAACCAGTGCTATTCAATCCTTTGATGCGGTAGGAATCAAA
PspPro2前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。预测的信号肽以斜体示出，预测的前肽加下划线示出：
Figure BDA0000916970520000761
AEHSVPDPTQLTPTFHAEQWKAPSTVTGDNIVWSYL NRQKKTLLNTDSTSVRDQFRIIDRTSDKSGASHYRLKQYVNGIPVYGAEQTIHVNNAGKVTSYLGAVISEDQQQDAT EDTTPKISATEAVYTAYAEAAARIQSFPSINDSLSEASEEQGSENQGNEIQNIGIKSSVSNDTYAEAHNNVLLTPVD QAEQSYIAKIANLEPSVEPKAELYIYPDGETTRLVYVTEVNILEPAPLRTRYFIDAKTGKIVFQYDILNHATGTGRGVDGKTKSFTTTASGNRYQLKDTTRSNGIVTYTAGNRQTTPGTILTDTDNVWEDPAAVDAHAYAIKTYDYYKNKFGRDSIDGRGMQIRSTVHYGKKYNNAFWNGSQMTYGDGDGSTFTFFSGDPDVVGHELTHGVTEFTSNLEYYGESGALNEAFSDIIGNDIDGTSWLLGDGIYTPNIPGDALRSLSDPTRFGQPDHYSNFYPDPNNDDEGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGTSHGVTVTGIGREAAVFIYYNAFTNYLTSTSNFSNARAAVIQAAKDFYGADSLAVTSAIQSFDAVGIK
预测的PspPro2成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
ATGTGRGVDGKTKSFTTTASGNRYQLKDTTRSNGIVTYTAGNRQTTPGTILTDTDNVWEDPAAVDAHAYAIKTYDYYKNKFGRDSIDGRGMQIRSTVHYGKKYNNAFWNGSQMTYGDGDGSTFTFFSGDPDVVGHELTHGVTEFTSNLEYYGESGALNEAFSDIIGNDIDGTSWLLGDGIYTPNIPGDALRSLSDPTRFGQPDHYSNFYPDPNNDDEGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGTSHGVTVTGIGREAAVFIYYNAFTNYLTSTSNFSNAKAAVIQAAKDFYGADSLAVTSAIQSFDAVGIK
实施例2.2
类芽孢杆菌属金属蛋白酶PspPro2的表达
由中国上海捷瑞公司(Generay,Shanghai,China)合成PspPro2的前肽-成熟形式的DNA序列，并将其插入枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz,Protein ExprPurif,55:40-52,2007(Vogtentanz，《蛋白质表达与纯化》，第55卷，第40-52页，2007年))中，得到质粒pGX084(AprE-PspPro2)(图2.1)。将此编码PspPro2蛋白的基因连接到酶切后的载体中，使得在枯草芽孢杆菌AprE信号序列的3’末端和预测的PspPro2天然前肽的5’末端之间添加了3个密码子(Ala-Gly-Lys)。该基因具有替代起始密码子(GTG)。如图2.1所示，pGX084(AprE-PspPro2)包含AprE启动子、AprE信号序列以及合成的核苷酸序列，该AprE信号序列用于引导枯草芽孢杆菌中的靶蛋白分泌，该合成的核苷酸序列编码预测的PspPro2前肽和成熟区(SEQ ID NO:9)。合成的AprE-PspPro2基因的翻译产物如SEQ ID NO：10所示。
将pGX084(AprE-PspPro2)质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32,ΔscoC)中，然后将转化的细胞涂布在补充有5ppm氯霉素和1.2％脱脂奶粉(目录号232100，Difco)的Luria琼脂平板上。选择平板上具有最大透明晕圈的菌落，将其置于装有MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基，还补充有另外5mM CaCl2)的250ml摇瓶中进行发酵。
然后浓缩摇瓶中的发酵液，并使用VivaFlow 200超滤装置(赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim))对该发酵液进行缓冲液交换，交换到包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)和1mM CaCl2的上样缓冲液中。过滤之后，将该样品加到用上述上样缓冲液预平衡的150ml Q琼脂糖高效柱中，用0至0.5M NaCl线性盐梯度的上样缓冲液从柱中洗脱PspPro2。收集、浓缩相应活性级分，并将该活性级分再次缓冲置换到上述上样缓冲液中。将该样品上样到用相同的上样缓冲液预平衡的20ml DEAE Fast Flow柱中。用0至0.3M NaCl线性盐梯度的上样缓冲液从柱中洗脱PspPro2。进一步合并纯化的相应活性蛋白级分，然后通过10K AmiconUltra进行浓缩，以供后续分析使用。质粒pGX084(AprE-PspPro2)中的合成的PspPro2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。编码预测的天然信号肽的序列以斜体示出，编码3个添加的残基(AGK)的寡核苷酸以粗体示出：
Figure BDA0000916970520000771
Figure BDA0000916970520000772
GCAGAGCATTCAGTTCCTGACCCGACGCAACTTACACCGACATTTCATGCTGAGCAGTGGAAGGCACCGAGCACGGTCACGGGCGACAACATCGTGTGGAGCTACCTGAACAGACAGAAAAAGACGCTGCTGAACACGGACTCAACGAGCGTGAGAGACCAGTTCAGAATCATCGACAGAACGAGCGACAAGTCAGGCGCGTCACATTATAGACTGAAGCAGTACGTGAACGGCATCCCGGTCTACGGAGCCGAGCAAACGATCCATGTGAATAATGCGGGCAAAGTTACATCATACCTGGGCGCCGTCATCTCAGAAGACCAGCAGCAAGATGCAACGGAGGATACAACACCGAAGATCAGCGCCACAGAAGCGGTCTATACGGCTTACGCCGAAGCGGCTGCAAGAATCCAGAGCTTCCCGTCAATTAATGACAGCCTGAGCGAAGCATCAGAGGAACAAGGCAGCGAGAACCAGGGCAATGAAATCCAAAACATCGGCATCAAGAGCAGCGTGTCAAACGACACGTATGCGGAGGCTCATAACAACGTTCTGCTGACACCGGTCGATCAGGCCGAACAGAGCTATATTGCAAAGATCGCGAATCTGGAGCCGTCAGTCGAGCCGAAGGCCGAGCTGTATATCTATCCGGACGGCGAGACGACGAGACTGGTGTACGTTACGGAGGTCAACATCCTTGAGCCTGCGCCGCTGAGAACAAGATACTTTATCGACGCCAAGACGGGCAAGATCGTGTTTCAGTACGATATCCTGAACCATGCGACGGGAACAGGCAGAGGCGTGGACGGCAAAACAAAATCATTCACGACAACGGCAAGCGGCAACAGATACCAGCTGAAGGACACAACAAGATCAAATGGCATCGTCACATACACGGCCGGAAATAGACAGACGACGCCGGGAACGATTCTGACGGATACAGATAACGTGTGGGAAGATCCGGCAGCAGTTGATGCACATGCATACGCGATCAAGACGTACGACTACTACAAGAACAAATTCGGAAGAGATTCAATCGATGGAAGAGGCATGCAAATCAGATCAACGGTTCATTATGGCAAAAAGTACAACAATGCCTTCTGGAACGGCAGCCAAATGACATACGGCGATGGAGACGGCTCAACGTTTACATTCTTTTCAGGCGACCCGGACGTCGTCGGCCATGAACTGACGCATGGCGTTACAGAGTTCACGAGCAACCTGGAGTATTACGGCGAATCAGGCGCACTGAATGAGGCTTTCAGCGACATCATTGGCAACGACATTGATGGCACATCATGGCTGCTTGGCGACGGCATTTACACACCTAACATTCCGGGCGATGCACTGAGAAGCCTGTCAGACCCTACGAGATTCGGCCAACCTGACCATTACAGCAACTTCTACCCGGATCCTAATAACGATGATGAGGGCGGAGTGCATACGAACAGCGGCATTATCAACAAAGCGTACTATCTGCTGGCACAAGGCGGAACGTCACATGGAGTGACGGTGACAGGAATCGGCAGAGAGGCGGCAGTGTTTATCTACTACAACGCCTTCACAAACTACCTGACGAGCACGTCAAATTTCAGCAACGCTAGAGCGGCGGTCATCCAGGCAGCAAAGGACTTTTATGGAGCAGACTCACTGGCAGTTACGTCAGCAATTCAGTCATTCGACGCAGTTGGAATTAAG
通过质粒pGX084(AprE-PspPro2)表达的PspPro2前体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：10所示。预测的信号序列以斜体示出，3个添加的残基(AGK)以粗体示出，预测的前肽加下划线示出：
Figure BDA0000916970520000781
AEHSVPDPTQLTPTFHAEQWKAPSTVT GDNIVWSYLNRQKKTLLNTDSTSVRDQFRIIDRTSDKSGASHYRLKQYVNGIPVYGAEQTIHVNNAGKVTSYLGAVI SEDQQQDATEDTTPKISATEAVYTAYAEAAARIQSFPSINDSLSEASEEQGSENQGNEIQNIGIKSSVSNDTYAEAH NNVLLTPVDQAEQSYIAKIANLEPSVEPKAELYIYPDGETTRLVYVTEVNILEPAPLRTRYFIDAKTGKIVFQYDIL NHATGTGRGVDGKTKSFTTTASGNRYQLKDTTRSNGIVTYTAGNRQTTPGTILTDTDNVWEDPAAVDAHAYAIKTYDYYKNKFGRDSIDGRGMQIRSTVHYGKKYNNAFWNGSQMTYGDGDGSTFTFFSGDPDVVGHELTHGVTEFTSNLEYYGESGALNEAFSDIIGNDIDGTSWLLGDGIYTPNIPGDALRSLSDPTRFGQPDHYSNFYPDPNNDDEGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGTSHGVTVTGIGREAAVFIYYNAFTNYLTSTSNFSNARAAVIQAAKDFYGADSLAVTSAIQSFDAVGIK
从枯草芽孢杆菌培养物分离的重组PspPro2蛋白的氨基酸序列通过串联质谱测定，其如下所示。该氨基酸序列与所预测的一致，如SEQ ID NO：8所示。
ATGTGRGVDGKTKSFTTTASGNRYQLKDTTRSNGIVTYTAGNRQTTPGTILTDTDNVWEDPAAVDAHAYAIKTYDYYKNKFGRDSIDGRGMQIRSTVHYGKKYNNAFWNGSQMTYGDGDGSTFTFFSGDPDVVGHELTHGVTEFTSNLEYYGESGALNEAFSDIIGNDIDGTSWLLGDGIYTPNIPGDALRSLSDPTRFGQPDHYSNFYPDPNNDDEGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGTSHGVTVTGIGREAAVFIYYNAFTNYLTSTSNFSNARAAVIQAAKDFYGADSLAVTSAIQSFDAVGIK
实施例2.3
金属蛋白酶PspPro2的蛋白水解活性
使用偶氮-酪蛋白(目录号74H7165，美格兹密公司(Megazyme))作为底物，在50mMTris(pH 7)中测定纯化的PspPro2的蛋白水解活性。反应前，用Milli-Q水(密理博公司(Millipore))将酶稀释到特定浓度。将偶氮-酪蛋白溶解于100mM Tris缓冲液(pH 7)中，使其最终浓度为1.5％(重量/体积)。为引发反应，将50μl稀释的酶(或只加Milli-Q水作为空白对照)加到置于冰上的非结合96孔微量滴定板(96-MTP)(康宁生命科学(Corning LifeSciences)，目录号3641)中，然后加入50μl 1.5％偶氮-酪蛋白。密封96-MTP后，反应在40℃下以650rpm在Thermomixer(艾本德公司(Eppendorf))中进行10分钟。加入100μl 5％三氯乙酸(TCA)终止反应。在平衡(室温下5分钟)和接着离心(在4℃和2000g下10分钟)后，将120μl上清液转移至新的96-MTP中，使用SpectraMax 190在440nm处测定上清液的吸光度(A440)。净A440通过用酶的A440减去空白对照的A440来计算，然后用所得值对应于不同蛋白浓度(从1.25ppm至40ppm)进行作图。每个值均为一式两份测定的平均值，并且该值变化不超过5％。蛋白水解活性示为净A440。用偶氮-酪蛋白作为底物的蛋白水解测定(图2.2)表明PspPro2为活性蛋白酶。
实施例2.4
金属蛋白酶PspPro2的pH分布图
用偶氮-酪蛋白作为底物，在不同pH值(pH 4至11)的12.5mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中研究PspPro2的pH分布图。为开始测定，先在置于冰上的96-MTP中将50μl特定pH的25mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液与2μl稀释的酶(500ppm，溶于Milli-Q水中)混合，然后加入48μl在水中制备的1.5％(重量/体积)偶氮-酪蛋白。按实施例2.3所述方法来进行反应并分析。每个pH下的酶活性都记录为相对活性，其中最适pH下的活性设为100％。所测试的pH值为4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10和11。每个结果均为一式三份测定的平均值。如图2.3所示，PspPro2的最适pH为7.5，在pH 5.5和9.5之间保持其最大活性的70％以上。
实施例2.5
金属蛋白酶PspPro2的温度分布图
使用偶氮-酪蛋白测定法在50mM Tris缓冲液(pH 7)中分析PspPro2的温度分布图。按实施例2.3所述方法制备酶样品和偶氮-酪蛋白底物。反应前，在200μl PCR管中混合50μl 1.5％偶氮-酪蛋白和45μl Milli-Q水，然后将PCR管放在Peltier热循环仪(伯乐公司(BioRad))中，在所需温度(即20℃至90℃)下温育5分钟。温育之后，将5μl稀释的PspPro2(200ppm)或水(空白对照)加入底物混合物中，反应在Peltier热循环仪中不同温度下进行10分钟。为终止反应，将每个测定混合物转移到每孔包含100μl 5％TCA的96-MTP中。随后按实施例3中所述方法进行离心和吸光度测定。活性记录为相对活性，其中最适温度下的活性设为100％。所测试的温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。每个结果均为一式三份测定的平均值。图2.4中的数据表明，PspPro2表现为50℃的最适温度，并且在40℃和65℃之间保持其最大活性的70％以上。
实施例2.6
自动盘碟洗涤(ADW)条件下金属蛋白酶PspPro2的清洁性能
使用模型自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂，在pH 6和8下用PA-S-38(蛋黄，带颜料，通过加热老化)微布样(荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT-Vlaardingen,The Netherlands))来测试自动盘碟洗涤(ADW)条件下PspPro2蛋白的清洁性能。反应前，用稀释溶液(包含10mMNaCl、0.1mM CaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520000801
80和10％丙二醇)将纯化的PspPro2蛋白样品稀释到所需浓度。在存在漂白剂组分(过酸N,N-邻苯二甲酰氨基过氧己酸-PAP)的情况下，在100ppm水硬度(Ca2+:Mg2+＝3:1)的AT洗涤剂中进行反应(AT洗涤剂组成如表1所示)。为引发反应，将180μl pH 6或pH 8的AT洗涤剂溶液加到放置有PA-S-38微布样的96-MTP中，然后加入20μl稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，使其在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中温育30分钟。温育之后，将每个孔中的100μl洗涤液转移至新的96-MTP中，使用分光光度计在405nm处测定其吸光度(这里称为“初始性能”)。弃去96-MTP中剩下的洗涤液，用200μl水漂洗微布样一次。在加入180μl 0.1M CAPS缓冲液(pH 10)后，在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中再次温育10分钟。将100μl所得洗涤液转移至新的96-MTP中，在405nm处测定其吸光度(这里称为“洗脱性能”)。两次吸光度测量值之和(“初始性能”加上“洗脱性能”)即为“总性能”，“总性能”用于衡量蛋白酶作用于模型污渍的活性。在漂白剂存在的情况下，pH 6和pH 8下PspPro2在AT洗涤剂中清洁PA-S-38微布样的剂量响应分别在图2.5A和图2.5B中示出。
Figure BDA0000916970520000811
*AT制剂洗涤剂的pH通过添加0.9M柠檬酸来调节至所需pH值(pH 6或pH 8)。
实施例2.7
洗衣条件下金属蛋白酶PspPro2的清洁性能
A.在液体衣物洗涤剂中的清洁性能
使用商业洗涤剂，在pH 8.2下用EMPA-116(血/奶/墨污染的棉布)微布样(购自荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT Vlaardingen,The Netherlands))来测定PspPro2蛋白在液体衣物洗涤剂中的清洁性能。反应前，用稀释溶液(10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520000821
80和10％丙二醇)将纯化的PspPro2蛋白样品稀释到所需浓度，将商业洗涤剂(
Figure BDA0000916970520000822
Clean
Figure BDA0000916970520000823
美国宝洁公司(Proctor&Gamble,USA)，购买于2011年9月)在95℃下温育1小时，以灭活存在于洗涤剂中的酶。然后进行蛋白水解测定，以确认蛋白酶在商业洗涤剂中失活。进一步用5mM HEPES(pH 8.2)稀释经加热处理过的洗涤剂，使其最终浓度为0.788g/L。同时，将经缓冲的液体洗涤剂的水硬度调节至103ppm(Ca2+:Mg2+＝3:1)。通过调节缓冲的洗涤剂中的NaCl浓度，将缓冲的洗涤剂的比电导率调节至0.62mS/cm(低电导率)或3.5mS/cm(高电导率)。为引发反应，将190μl高电导率或低电导率的缓冲的洗涤剂加到包含EMPA-116微布样的96-MTP中，然后加入10μl稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，使其在32℃和1150rpm的培养箱/摇床中温育20分钟。温育之后，将每个孔中的150μl洗涤液转移至新的96-MTP中，使用分光光度计在600nm处测定其吸光度，该吸光度指示蛋白酶作用于模型污渍的活性；然后用酶的A600减去空白对照的A600计算净A600。在高电导率或低电导率的液体衣物洗涤剂中清洁EMPA-116微布样的剂量响应在图2.6A中示出。
B.在粉末衣物洗涤剂中的清洁性能
使用商业洗涤剂和PA-S-38(蛋黄，带颜料，通过加热老化)微布样(荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT-Vlaardingen,The Netherlands))来测定PspPro2蛋白在粉末衣物洗涤剂中的清洁性能。反应前，用稀释溶液(10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520000824
80和10％丙二醇)将纯化的PspPro2蛋白样品稀释到所需浓度。将粉末衣物洗涤剂(无漂白剂
Figure BDA0000916970520000825
中国宝洁公司(Proctor&Gamble,China)，购买于2011年12月)溶解于103ppm水硬度(Ca2+:Mg2+＝3:1)的水中，使其最终浓度为2g/L(电导率为2.3mS/cm的低电导率)或5g/L(电导率为5.5mS/cm的高电导率)。随后在微波炉中将不同电导率的洗涤剂加热至接近沸腾，以便灭活存在于洗涤剂中的酶。该处理之后，测定蛋白水解活性，以确保商业洗涤剂中的蛋白酶已失活。为引发反应，将190μl高电导率或低电导率的经加热处理的洗涤剂加到包含PA-S-38微布样的96-MTP中，然后加入10μl稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，使其在32℃和1150rpm的培养箱/摇床中温育15分钟。温育之后，将每个孔中的150μl洗涤液转移至新的96-MTP中，使用分光光度计在405nm处测定其吸光度，该吸光度指示蛋白酶作用于模型污渍的活性；然后用酶的A405减去空白对照的A405计算净A405。在高电导率或低电导率的粉末衣物洗涤剂中清洁PA-S-38微布样的剂量响应在图2.6B中示出。
实施例2.8
PspPro2与其他金属蛋白酶的比较
同源蛋白酶的鉴定
通过与NCBI非冗余蛋白质数据库和Genome Quest专利数据库比对进行BLAST检索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389-402,1997(Altschul等人，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页，1997年))(检索参数设为默认值)来鉴定同源物。用PspPro2的成熟蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：8)作为查询序列。两种检索设置的同一性百分比(PID)被定义为相同残基的数量除以逐对比对中所比对残基的数量。表2.2A和表2.2B提供了与PspPro2具有百分比同一性的序列列表。表2.2中的长度指同源蛋白酶的全序列长度。
Figure BDA0000916970520000831
Figure BDA0000916970520000841
Figure BDA0000916970520000842
B.同源蛋白酶序列的比对
使用默认参数下的CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research，第22卷，第4673-4680页，1994年)将成熟PspPro2的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)与嗜热菌蛋白酶(P00800，嗜热溶蛋白芽孢杆菌)和来源于类芽孢杆菌属物种Aloe-11(ZP_09775365.1)序列的蛋白酶进行比对。图2.7示出了PspPro2与这些蛋白酶序列的比对。
C.系统发育树
使用表2A中的代表性同源物的序列和邻接法(NJ)(Saitou,N.；and Nei,M.(1987).The neighbor-joining method:a new method for reconstructing GuideTrees.MolBiol.Evol.4,406-425(Saitou,N.和Nei,M.，1987年，The neighbor-joiningmethod:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.，第4卷，第406-425页))来构建前体PspPro2蛋白序列(SEQ ID NO：7)的系统发育树。NJ法基于被分析的所有序列对之间的距离矩阵而工作。这些距离与序列之间的趋异度相关。使用进化树(phylodendron)-系统发育树绘制软件(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html)显示图2.8所示的系统发育树。
实施例3.1
腐殖质类芽孢杆菌金属蛋白酶PhuPro2的克隆
选择腐殖质类芽孢杆菌菌株(DSM18784)作为可用于各种工业应用中的酶的可能来源。通过如下方式获得用于测序的基因组DNA：首先在37℃下使菌株在心脏浸液琼脂平板(Difco)上生长24小时。从平板上刮下细胞材料，用Zymo公司的ZF真菌/细菌DNA小量制备试剂盒(目录号D6005)从该细胞材料中制备基因组DNA。该基因组DNA用于基因组测序。腐殖质类芽孢杆菌属菌株的全基因组由BaseClear(荷兰莱顿(Leiden,The Netherlands))使用Illumina新一代测序技术进行测序。对数据进行组装后，通过BioXpr(比利时那慕尔(Namur,Belgium))对重叠群进行注释。在腐殖质类芽孢杆菌中进行注释后所鉴定的基因之一编码金属蛋白酶，并且该基因(命名为PhuPro2)的序列以SEQ ID NO：11提供。由PhuPro2基因编码的相应蛋白质如SEQ ID NO：12所示。该蛋白在N端具有长度为23个氨基酸的信号肽，如通过SignalP 4.0版(Nordahl Petersen等人，2011年，Nature Methods，第8卷，第785-786页)所预测的。信号序列的存在表明PhuPro2为分泌性酶。基于PhuPro2与多粘类芽孢杆菌的Npr蛋白(Takekawa等人，1991年，Journal of Bacteriology，第173卷，第21期，第6820-6825页)的蛋白序列比对，预测了PhuPro2的前肽区。预测的PhuPro2蛋白成熟区如SEQID NO：13所示。从腐殖质类芽孢杆菌中分离的PhuPro2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。编码预测的天然信号肽的序列以斜体示出：
Figure BDA0000916970520000861
Figure BDA0000916970520000862
GAATCGCCAAGCCTCGGAGCGGCCGGAACTCCCGGGGTCAGCGTCGTGAACAATCAGCTCGTGACTCAATTCATCGAGGCTTCCAAGGATGCCAAGATTGTCCCGGGCTCTTCCGAGGATAAAATCTGGGCTTTCCTTGAAGGCCAGCAAGCAAAGCTGGGTGIATCCGCAGCGGATGIAAAAACCTCGTTCCTGATCCAGAAGAAGGAAGTCGATCCGACTTCGGGCGTCGAGCATTTCCGCCTGCAGCAATATGTGAATGGCATCCCGGTATATGGCGGTGACCAAACCATTCACATCGACAAGGCCGGCCAGGTTACGTCGTTCGTAGGAGCTGTTCTGCCGGCTCAAAATCAAATCACGGCAAAATCCAGCGTACCAGCCATAAGCGCATCCGACGCTCTGGCTATCGCGGCGAAGGAAGCCAGTTCCCGCATCGGCGAGCTGGGAGCACAGGAGAAGACTCCGTCGGCTCAGCTGTACGTATATCCGGAAGGCAACGGGTCGCGTCTCGTCTACCAGACGGAAGTGAATGTGCTTGAGCCGCAGCCTCTGCGCACCCGCTATCTTATCGATGCGGCCGACGGCCATATCGTGCAGCAGTACGATCTGATCGAGACGGCGACCGGTTCGGGCACGGGCGTGCTGGGCGACAATAAGACGTTCCAGACGACTCTTTCCGGCAGCACGTACCAGCTGAAAGACACCACTCGCGCAACGGCATCTACACCTACACAGCCAGCAATCGGACCACGATTCCGGGCACGCTGCTGACGGACGCCGACAACGTATGGACGGATGGAGCCGCCGTCGATGCCCATACTTATGCCGGAAAAGTATATGATTTCTACAAAACGAAGTTCGGACGCAACAGCCTCGACGGCAACGGCCTGCTGATCCGTTCCTCGGTCCACTACAGCAGCAGGTACAACAATGCCTTCTGGAACGGCACCCAGATTGTATTCGGCGACGGCGACGGCTCGACGTTCATTCCGCTGTCGGGCGATCTCGACGTGGTCGGCCATGAGCTGTCCCACGGAGTCATCGAGTACACGTCCAACCTTCAATACCTCAATGAATCCGGCGCGCTGAACGAGTCCTATGCCGACGTCCTCGGCAACTCGATCCAGGCGAAAAACTGGCTTATCGGCGACGATGTCTATACGCCTGGCATCTCCGGAGATGCTCTCCGTTCCATGTCCAACCCGACGCTTTACGGGCAGCCGGACAACTATGCCAACCGCTATACGGGATCTTCCGACAACGGCGGCGTTCATACGAACAGCGGCATCACGAACAAAGCGTTCTACCTGCTCGCCCAAGGCGGCACCCAGAACGGCGTTACCGTCGCCGGCATCGGGCGCGACGCAGCCGTGAACATTTTCTACAACACAGTGGCCTATTACCTTACTTCCACTTCCAACTTCGCCGCGGCGAAGAACGCCTCGATCCAGGCAGCCAAAGACCTGTACGGAACGGGCTCCTCTTATGTCACCTCGGTGACCAATGCATTCAGAGCCGTAGGCCTG
PhuPro2前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。预测的信号序列以斜体示出，预测的前肽加下划线示出：
Figure BDA0000916970520000871
ESPSLGAAGTPGVSVVNNQLVTQFIEASKDAKIVPGSSED KIWAFLEGQQAKLGVSAADVKTSFLIQKKEVDPTSGVEHFRLQQYVNGIPVYGGDQTIHIDKAGQVTSFVGAVLPAQ NQITAKSSVPAISASDALAIAAKEASSRIGELGAQEKTPSAQLYVYPEGNGSRLVYQTEVNVLEPQPLRTRYLIDAA DGHIVQQYDLIETATGSGTGVLGDNKTFQTTLSGSTYQLKDTTRGNGIYTYTASNRTTIPGTLLTDADNVWTDGAAVDAHTYAGKVYDFYKTKFGRNSLDGNGLLIRSSVHYSSRYNNAFWNGTQIVFGDGDGSTFIPLSGDLDVVGHELSHGVIEYTSNLQYLNESGALNESYADVLGNSIQAKNWLIGDDVYTPGISGDALRSMSNPTLYGQPDNYANRYTGSSDNGGVHTNSGITNKAFYLLAQGGTQNGVTVAGIGRDAAVNIFYNTVAYYLTSTSNFAAAKNASIQAAKDLYGTGSSYVTSVTNAFRAVGL
预测的PhuPro2成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示：
ATGSGTGVLGDNKTFQTTLSGSTYQLKDTTRGNGIYTYTASNRTTIPGTLLTDADNVWTDGAAVDAHTYAGKVYDFYKTKFGRNSLDGNGLLIRSSVHYSSRYNNAFWNGTQIVFGDGDGSTFIPLSGDLDVVGHELSHGVIEYTSNLQYLNESGALNESYADVLGNSIQAKNWLIGDDVYTPGISGDALRSMSNPTLYGQPDNYANRYTGSSDNGGVHTNSGITNKAFYLLAQGGTQNGVTVAGIGRDAAVNIFYNTVAYYLTSTSNFAAAKNASIQAAKDLYGTGSSYVTSVTNAFRAVGL
实施例3.2
腐殖质类芽孢杆菌金属蛋白酶PhuPro2的表达
由中国上海捷瑞公司(Generay,Shanghai,China)合成PhuPro2的前肽-成熟形式的DNA序列，并将其插入枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz，Protein ExprPurif，第55卷，第40-52页，2007年)中，得到质粒pGX150(AprE-PhuPro2)(图1)。将此编码PhuPro2蛋白的基因连接到酶切后的载体中，使得在枯草芽孢杆菌AprE信号序列的3’末端和预测的PhuPro2天然前肽5’末端之间添加了3个密码子(Ala-Gly-Lys)。该基因具有替代起始密码子(GTG)。图1所示的所得质粒为标记的pGX150(AprE-PhuPro2)。如图3.1所示，pGX150(AprE-PhuPro2)包含AprE启动子、AprE信号序列以及合成的核苷酸序列，该AprE信号序列用于引导枯草芽孢杆菌中的靶蛋白分泌，该合成的核苷酸序列编码预测的PhuPro2前肽和成熟区(SEQ ID NO：14)。合成的AprE-PhuPro2基因的翻译产物如SEQ ID NO：15所示。
然后将pGX150(AprE-PhuPro2)质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32,ΔscoC)中，接着将转化的细胞涂布在补充有5ppm氯霉素和1.2％脱脂奶粉(目录号232100，Difco)的Luria琼脂平板上。选择平板上具有最大透明晕圈的菌落，将其置于装有MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基，还补充有另外5mM CaCl2)的250ml摇瓶中进行发酵。
然后浓缩摇瓶中的发酵液，并使用VivaFlow 200超滤装置(赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim))将该发酵液进行缓冲液交换，交换到包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM CaCl2和10％丙二醇的上样缓冲液中。过滤之后，将该样品加到用上述上样缓冲液预平衡的80ml Q琼脂糖高效柱中，并收集和浓缩流过的活性级分。将该样品上样到用包含0.15MNaCl的上述上样缓冲液预平衡的320ml Superdex 75凝胶过滤柱中。进一步合并纯化的相应活性蛋白级分，然后通过10K Amicon Ultra进行浓缩，以供后续分析使用。
质粒pGX150(AprE-PhuPro2)中的合成的PhuPro2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。编码3个添加的残基(AGK)的序列以粗体示出：
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCT
Figure BDA0000916970520000881
GAATCACCGAGCCTTGGCGCTGCAGGAACACCGGGCGTTAGCGTTGTGAATAACCAACTGGTCACGCAGTTCATCGAAGCATCAAAAGACGCGAAAATTGTCCCTGGATCAAGCGAAGATAAGATTTGGGCATTTCTGGAAGGCCAGCAAGCAAAGCTTGGCGTCTCAGCTGCCGACGTGAAGACGAGCTTCCTGATCCAGAAGAAGGAGGTTGACCCGACATCAGGCGTTGAGCACTTTAGACTGCAACAGTACGTCAACGGCATCCCGGTTTATGGAGGCGATCAAACAATCCATATTGATAAGGCAGGCCAGGTCACATCATTCGTCGGAGCTGTCCTGCCGGCTCAGAACCAAATTACAGCAAAATCATCAGTTCCGGCAATTTCAGCCTCAGACGCTCTGGCAATCGCTGCCAAGGAGGCAAGCTCAAGAATTGGCGAACTGGGCGCACAAGAAAAGACACCGAGCGCCCAACTTTATGTCTATCCGGAGGGCAACGGAAGCAGACTGGTGTACCAGACAGAGGTCAATGTTCTGGAGCCGCAACCGCTGAGAACGAGATACCTTATCGATGCTGCGGATGGCCACATTGTTCAGCAATACGACCTGATTGAGACAGCAACAGGAAGCGGAACGGGCGTGCTGGGCGACAACAAGACGTTTCAGACAACACTTAGCGGCAGCACGTACCAACTTAAGGACACGACGAGAGGCAATGGCATTTACACGTACACGGCCTCAAACAGAACGACAATCCCAGGCACACTGCTGACGGATGCAGACAATGTTTGGACGGACGGCGCAGCAGTTGACGCACACACGTACGCCGGCAAGGTGTACGACTTTTACAAGACGAAGTTCGGCAGAAACAGCCTTGATGGAAATGGACTGCTGATCAGAAGCAGCGTCCACTACAGCAGCAGATACAATAACGCCTTCTGGAACGGCACACAAATCGTCTTTGGCGATGGAGACGGATCAACATTCATCCCGCTGTCAGGCGACCTGGACGTTGTGGGCCACGAGCTGAGCCACGGCGTCATCGAGTACACGAGCAACCTGCAGTACCTGAATGAAAGCGGCGCACTGAACGAGTCATATGCTGATGTGCTTGGCAATAGCATCCAGGCCAAGAACTGGCTTATCGGAGACGACGTCTACACACCTGGCATCAGCGGCGATGCTCTGAGAAGCATGAGCAATCCTACACTTTACGGCCAACCGGACAACTACGCGAATAGATATACGGGCAGCAGCGACAATGGCGGCGTTCATACAAACTCAGGCATCACGAACAAGGCGTTCTACCTGCTGGCACAGGGAGGCACGCAAAACGGCGTTACAGTTGCGGGCATTGGCAGAGATGCGGCCGTCAACATCTTCTACAACACAGTCGCCTACTACCTGACGAGCACGTCAAACTTCGCAGCGGCAAAGAACGCATCAATTCAAGCAGCAAAGGATCTGTACGGAACAGGCAGCTCATATGTCACGTCAGTTACGAATGCGTTTAGAGCCGTCGGCCTTTAA
通过质粒pGX150(AprE-PhuPro2)表达的PhuPro2前体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：15所示。预测的信号序列以斜体示出，3个添加的残基(AGK)以粗体示出，预测的前肽加下划线示出。
Figure BDA0000916970520000891
ESPSLGAAGTPGVSVVNNQLVTQFIEAS KDAKIVPGSSEDKIWAFLEGQQAKLGVSAADVKTSFLIQKKEVDPTSGVEHFRLQQYVNGIPVYGGDQTIHIDKAG QVTSFVGAVLPAQNQITAK.SSVPAISASDALAIAAKTEASSRIGELGAQEKTPSAQLYVYPEGNGSRLVYQTEVN VLEPQPLRTRYLIDAADGHIVQQYDLIETATGSGTGVLGDNKTFQTTLSGSTYQLKDTTRGNGIYTYTASNRTTIPGTLLTDADNVWTDGAAVDAHTYAGKVYDFYKTKFGRNSLDGNGLLIRSSVHYSSRYNNAFWNGTQIVFGDGDGSTFIPLSGDLDVVGHELSHGVIEYTSNLQYLNESGALNESYADVLGNSIQAKNWLIGDDVYTPGISGDALRSMSNPTLYGQPDNYANRYTGSSDNGGVHTNSGITNKAFYLLAQGGTQNGVTVAGIGRDAAVNIFYNTVAYYLTSTSNFAAAKNASIQAAKDLYGTGSSYVTSVTNAFRAVGL(SEQ ID NO:15)
实施例3.3
金属蛋白酶PhuPro2的蛋白水解活性
使用偶氮-酪蛋白(目录号74H7165，美格兹密公司(Megazyme))作为底物，在50mMTris(pH 7)中测定纯化的金属蛋白酶PhuPro2的蛋白水解活性。反应前，用Milli-Q水(密理博公司(Millipore))将酶稀释到特定浓度。将偶氮-酪蛋白溶解于100mM Tris缓冲液(pH7)中，使其最终浓度为1.5％(重量/体积)。为引发反应，将50μl稀释的酶(或只加Milli-Q水作为空白对照)加到置于冰上的非结合96孔微量滴定板(96-MTP)(康宁生命科学(CorningLife Sciences)，目录号3641)中，然后加入50μl 1.5％偶氮-酪蛋白。密封96-MTP后，反应在40℃下以650rpm在Thermomixer(艾本德公司(Eppendorf))中进行10分钟。加入100μl5％三氯乙酸(TCA)终止反应。在室温下平衡5分钟后，接着在4℃和2000g下离心10分钟，然后将120μl上清液转移至新的96-MTP中，使用SpectraMax 190在440nm处测定上清液的吸光度(A440)。净A440通过用酶的A440减去空白对照的A440来计算，然后用所得值对应于不同蛋白浓度(从1.25ppm至40ppm)进行作图。每个值均为一式三份测定的平均值。
蛋白水解活性示为净A440。用偶氮-酪蛋白作为底物的蛋白水解测定(如图3.2所示)表明PhuPro2为活性蛋白酶。
实施例3.4
金属蛋白酶PhuPro2的pH分布图
用偶氮-酪蛋白作为底物，在不同pH值(pH 4至11)的12.5mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中研究金属蛋白酶PhuPro2的pH分布图。为开始测定，先在置于冰上的96-MTP中将50μl特定pH的25mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液与2μl Milli-Q水稀释的酶(125ppm)混合，然后加入48μl在水中制备的1.5％(重量/体积)偶氮-酪蛋白。按实施例3.3所述方法来进行反应并分析。每个pH下的酶活性都记录为相对活性，其中最适pH下的活性设为100％。所测试的pH值为4、5、6、7、8、9、10和11。每个值均为一式三份测定的平均值。如图3.3所示，PhuPro2的最适pH为6，在pH 5.5和pH 8.5之间保持最大活性的70％以上。
实施例3.5
金属蛋白酶PhuPro2的温度分布图
使用偶氮-酪蛋白测定法在50mM Tris缓冲液(pH 7)中分析金属蛋白酶PhuPro2的温度分布图。按实施例3.3所述方法制备酶样品和偶氮-酪蛋白底物。反应前，在200μl PCR管中混合50μl 1.5％偶氮-酪蛋白和45μl Milli-Q水，然后将PCR管放在Peltier热循环仪(伯乐公司(BioRad))中，在所需温度(即20℃至90℃)下温育5分钟。温育之后，将5μl稀释的酶(50ppm)或水(空白对照)加入底物混合物中，反应在Peltier热循环仪中不同温度下进行10分钟。为终止反应，将每个测定混合物转移到每孔包含100μl 5％TCA的96-MTP中。随后按实施例3.3中所述方法进行离心和吸光度测定。活性记录为相对活性，其中最适温度下的活性设为100％。所测试的温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。每个值均为一式两份测定的平均值(该值变化不超过5％)。图3.4中的数据表明，PhuPro2在50℃下表现为最适温度，并且在40℃和65℃之间保持其最大活性的70％以上。
实施例3.6
金属蛋白酶PhuPro2的清洁性能
使用模型自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂，在pH 6和8下用PA-S-38(蛋黄，带颜料，通过加热老化)微布样(荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT-Vlaardingen,The Netherlands))来测试PhuPro2的清洁性能。反应前，用稀释溶液(包含10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520000911
80和10％丙二醇)将纯化的蛋白酶样品稀释到所需浓度。在100ppm水硬度(Ca2+:Mg2+＝3:1)的AT洗涤剂中进行反应(洗涤剂组成如表3.1所示)。为引发反应，将180μl缓冲在pH 6或pH 8的AT洗涤剂加到放置有PA-S-38微布样的96-MTP中，然后加入20μl稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，使其在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中温育30分钟。温育之后，将每个孔中的100μl洗涤液转移至新的96-MTP中，使用分光光度计在405nm处测定其吸光度(这里称为“初始性能”)。弃去96-MTP中剩下的洗涤液，用200μl水漂洗微布样一次。然后加入180μl 0.1M CAPS缓冲液(pH 10)，在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中再次温育10分钟。将100μl所得洗涤液转移至新的96-MTP中，在405nm处测定其吸光度(这里称为“洗脱性能”)。两次吸光度测量值之和(“初始性能”加上“洗脱性能”)即为“总性能”，“总性能”用于衡量蛋白酶作用于模型污渍的活性；然后用酶的A405减去空白对照的“总性能”的A405计算净A405。在pH 6和pH 8下，PhuPro2在AT盘碟洗涤剂中清洁PA-S-38微布样的剂量响应在图3.5A和图3.5B中示出。
表3.1：AT盘碟洗涤剂的组成
Figure BDA0000916970520000921
*AT制剂洗涤剂的pH通过添加0.9M柠檬酸来调节至所需值(pH 6或pH 8)。
实施例3.7
PhuPro2与其他蛋白酶的比较
A.同源蛋白酶的鉴定
通过与NCBI非冗余蛋白质数据库和Genome Quest专利数据库比对进行BLAST检索(Altschul等人，Nucleic Acids Res，第25卷，第3389-3402页，1997年)(检索参数设为默认值)来鉴定同源物。用PhuPro2的预测的成熟蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：13)作为查询序列。两种检索设置的同一性百分比(PID)被定义为相同残基的数量除以逐对比对中所比对残基的数量。表3.2A和表3.2B提供了与PhuPro2具有百分比同一性的序列列表。表3.2中的长度指同源蛋白酶的全序列长度。
Figure BDA0000916970520000922
Figure BDA0000916970520000931
Figure BDA0000916970520000932
B.同源蛋白酶序列的比对
使用默认参数下的CLUSTALW软件(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673-4680,1994(Thompson等人，Nucleic Acids Research，第22卷，第4673-4680页，1994年))将预测的成熟PhuPro2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)与嗜热菌蛋白酶(P00800，嗜热溶蛋白芽孢杆菌)和来源于土地类芽孢杆菌HPL-003(YP_005073223.1)序列的蛋白酶进行比对。图3.6示出了PhuPro2与这些蛋白酶序列的比对。
C.系统发育树
使用表2A中的代表性同源物的序列和邻接法(NJ)(Saitou,N.；and Nei,M.(1987).The neighbor-joining method:a new method for reconstructing GuideTrees.MolBiol.Evol.4,406-425(Saitou,N.和Nei,M.，1987年，The neighbor-joiningmethod:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.，第4卷，第406-425页)来构建PhuPro2的全长序列(SEQ ID NO：12)的系统发育树。NJ法基于被分析的所有序列对之间的距离矩阵而工作。这些距离与序列之间的趋异度相关。使用进化树-系统发育树绘制软件(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html)显示图3.7所示的系统发育树。
实施例4.1
爱媛类芽孢杆菌金属蛋白酶PehPro1的克隆
选择爱媛类芽孢杆菌菌株(DSM11029)作为可用于各种工业应用中的酶的可能来源。为获得用于测序的基因组DNA，首先在37℃下使菌株在心脏浸液琼脂平板(Difco)上生长24小时。从平板上刮下细胞材料，用Zymo公司的ZF真菌/细菌DNA小量制备试剂盒(目录号D6005)从该细胞材料中制备基因组DNA。该基因组DNA用于基因组测序。爱媛类芽孢杆菌菌株的全基因组由BaseClear(荷兰莱顿(Leiden,The Netherlands))使用Illumina新一代测序技术进行测序。对数据进行拼接后，通过BioXpr(比利时那慕尔(Namur,Belgium))对重叠群进行注释。在爱媛类芽孢杆菌中进行注释后所鉴定的基因之一编码金属蛋白酶，并且该基因(命名为PehPro1)的序列以SEQ ID NO：16提供。由PehPro1基因编码的相应蛋白质如SEQ ID NO：17所示。该蛋白在N端具有长度为23个氨基酸的信号肽，如通过SignalP 4.0版(Nordahl Petersen等人，2011年，Nature Methods，第8卷，第785-786页)所预测的。信号序列的存在表明PehPro1为分泌性酶。基于PehPro1与多粘类芽孢杆菌的Npr蛋白(Takekawa等人，1991年，Journal of Bacteriology，第173卷，第21期，第6820-6825页)的蛋白序列比对，预测了PehPro1的前肽区。预测的PehPro1蛋白成熟区如SEQ ID NO：18所示。
从爱媛类芽孢杆菌中分离的PehPro1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。编码预测的天然信号肽的序列以斜体示出：
Figure BDA0000916970520000941
Figure BDA0000916970520000942
GCTCCACAAGATCAAGCTGCTCCCTTCGGAGGATTCACCCCTCAATTGATTACCGGGGAAAGCTGGAGTGCGCCGCAAGGAGTATCGGGAGAGGAAAAAATCTGGAAGTATCTCGAATCCAAGCAGGAAAGCTTCCAAATCGGCCAAACCGTTGATCTGAAAAAGCAATTGAAAATTATCGGCCAAACGACCGACGAGAAAACGGGAACCACGCATTACCGTCTACAGCAGTATGTGGGAGGCGTCCCCGTATACGGCGGCGTACAAACGATCCATGTCAACAAAGAAGGACAAGTTACCTCGCTGATCGGCAGCCTGCTTCCCGACCAGCAGCAGCAAGTTTCGAAAAGCTTGAATTCGCAAATCAGCGAAGCGCAAGCCATCGCCGTGGCCCAGAAAGATACCGAGGCCGCCGTCGGCAAGCTGGGTGAACCGCAAAAGACACCGGAAGCGGATCTGTACGTTTATTTACACAACGGACAACCGGTCCTCGCTTATGTGACCGAGGTTAACGTTCTCGAACCGGAGGCAATCCGGACGCGCTACTTCATCAGCGCCGAAGACGGCAGCATTTTATTCAAGTACGACATCCTCGCTCACGCTACAGGTACCGGAAAAGGCGTGCTCGGAGATACGAAATCGTTCACGACCACGCAATCCGGCTCCACTTATCAATTGAAGGATACGACGCGCGGGCAAGGTATCGTCACTTACAGCGCTGGCAACCGGTCCTCTCTGCCGGGAACGCTGCTCACCAGCTCCAGCAATATTTGGAACGACGGCGCGGCGGTCGATGCGCATGCCTATACCGCCAAAGTGTACGATTACTATAAAAACAAATTTGGCCGCAACAGCATTGACGGCAACGGCTTCCAGCTTAAATCGACCGTGCACTATTCCTCCAGATACAACAACGCCTTCTGGAACGGTGTGCAAATGGTGTACGGCGACGGCGACGGCGTAACCTTCATTCCGTTCTCCGCCGATCCGGACGTCATCGGCCACGAATTGACCCACGGCGTTACGGAACATACGGCCGGCCTGGAATACTACGGCGAATCCGGAGCGCTGAACGAATCGATCTCCGATATTATCGGCAACGCGATCGACGGCAAAAACTGGCTGATCGGCGACTTGATTTATACGCCGAATACTCCCGGGGACGCCCTCCGCTCTATGGAGAACCCCAAGCTGTATAACCAACCCGACCGCTATCAAGACCGCTATACGGGACCTTCCGATAACGGCGGCGTGCATATTAACAGCGGTATCAACAACAAAGCCTTCTACCTGATCGCCCAAGGCGGCACGCACTATGGCGTCACCGTGAACGGGATCGGACGCGATGCGGCTGTGCAAATTTTCTATGACGCCCTCATCAATTACCTGACTCCAACTTCGAACTTCTCGGCGATGCGCGCAGCAGCCATTCAAGCGGCAACCGACCTGTACGGAGCGAATTCTTCTCAAGTAAACGCTGTCAAAAAAGCGTATACTGCCGTCGGCGTGAAC
PehPro1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。预测的信号序列以斜体示出，预测的前肽示出为加下划线的文本：
MLKVWASIITGAFLLGSVQGVQAAPQDQAAPFGGFTPQLITGESWSAPQGVSGEEKIWKYLESKQESFQ IGQTVDLKKQLKIIGQTTDEKTGTTHYRLQQYVGGVPVYGGVQTIHVNKEGQVTSLIGSLLPDQQQQVSKSLNSQIS EAQAIAVAQKDTEAAVGKLGEPQKTPEADLYVYLHNGQPVLAYVTEVNVLEPEAIRTRYFISAEDGSILFKYDILAHATGTGKGVLGDTKSFTTTQSGSTYQLKDTTRGQGIVTYSAGNRSSLPGTLLTSSSNIWNDGAAVDAHAYTAKVYDYYKNKFGRNSIDGNGFQLKSTVHYSSRYNNAFWNGVQMVYGDGDGVTFIPFSADPDVIGHELTHGVTEHTAGLEYYGESGALNESISDIIGNAIDGKNWLIGDLIYTPNTPGDALRSMENPKLYNQPDRYQDRYTGPSDNGGVHINSGINNKAFYLIAQGGTHYGVTVNGIGRDAAVQIFYDALINYLTPTSNFSAMRAAAIQAATDLYGANSSQVNAVKKAYTAVGVN
预测的PehPro1成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示：
ATGTGKGVLGDTKSFTTTQSGSTYQLKDTTRGQGIVTYSAGNRSSLPGTLLTSSSNIWNDGAAVDAHAYTAKVYDYYKNKFGRNSIDGNGFQLKSTVHYSSRYNNAFWNGVQMVYGDGDGVTFIPFSADPDVIGHELTHGVTEHTAGLEYYGESGALNESISDIIGNAIDGKNWLIGDLIYTPNTPGDALRSMENPKLYNQPDRYQDRYTGPSDNGGVHINSGINNKAFYLIAQGGTHYGVTVNGIGRDAAVQIFYDALINYLTPTSNFSAMRAAAIQAATDLYGANSSQVNAVKKAYTAVGVN
实施例4.2
爱媛类芽孢杆菌金属蛋白酶PehPro1的表达
由中国上海捷瑞公司(Generay,Shanghai,China)合成PehPro1的前肽-成熟形式的DNA序列，并将其插入枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz，Protein ExprPurif,，第55卷，第40-52页，2007年)中，得到质粒pGX148(AprE-PehPro1)(图4.1)。将此编码PehPro1蛋白的基因连接到酶切后的载体中，使得在枯草芽孢杆菌AprE信号序列的3’端和预测的PehPro1天然前肽5’端之间添加了3个密码子(Ala-Gly-Lys)。该基因具有替代起始密码子(GTG)。图1所示的所得质粒为标记的pGX148(AprE-PehPro1)。如图1所示，pGX148(AprE-PehPro1)包含AprE启动子、AprE信号序列以及合成的核苷酸序列，该AprE信号序列用于引导枯草芽孢杆菌中的靶蛋白分泌，该合成的核苷酸序列编码预测的PehPro1前肽和成熟区(SEQ ID NO：19)。合成的AprE-PehPro1基因的翻译产物如SEQ ID NO：20所示。
然后将pGX148(AprE-PehPro1)质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32,ΔscoC)中，接着将转化的细胞涂布在补充有5ppm氯霉素和1.2％脱脂奶粉(目录号232100，Difco)的Luria琼脂平板上。选择平板上具有最大透明晕圈的菌落，将其置于装有MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基，还补充有另外5mM CaCl2)的250ml摇瓶中进行发酵。
然后浓缩摇瓶中的发酵液，并使用VivaFlow 200超滤装置(赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim))将该发酵液进行缓冲液交换，交换到包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM CaCl2和10％丙二醇的上样缓冲液中。过滤之后，将该样品加到用上述上样缓冲液预平衡的80ml Q琼脂糖高效柱中，用0至0.3M NaCl的线性盐梯度的上样缓冲液从柱中洗脱PehPro1。收集、浓缩相应活性级分，并将该活性级分再次缓冲置换到上述上样缓冲液中。将该样品上样到用相同的上样缓冲液预平衡的40ml DEAE Fast Flow柱中。用0至0.15M NaCl的线性盐梯度的上样缓冲液从柱中洗脱PehPro1。进一步合并纯化的相应活性蛋白级分，然后通过10K Amicon Ultra进行浓缩，以供后续分析使用。
质粒pGX148(AprE-PehPro1)中的合成的PehPro1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。编码3个添加的残基(AGK)的序列以粗体示出：
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCT
Figure BDA0000916970520000971
GCACCTCAAGATCAGGCAGCACCTTTTGGAGGCTTTACACCGCAACTTATCACAGGCGAATCATGGTCAGCACCGCAGGGCGTTTCAGGCGAGGAAAAGATCTGGAAGTACCTTGAGAGCAAGCAGGAGTCATTTCAAATCGGCCAGACAGTCGACCTGAAAAAGCAACTGAAGATCATCGGCCAAACAACGGACGAAAAGACGGGCACGACGCATTATAGACTGCAACAATATGTTGGCGGCGTGCCGGTTTATGGAGGCGTGCAAACAATCCACGTGAACAAGGAAGGACAGGTCACGTCACTGATCGGCAGCCTGCTGCCGGATCAGCAGCAACAAGTCTCAAAGAGCCTGAACTCACAAATTAGCGAGGCACAAGCGATTGCAGTTGCACAAAAGGACACGGAAGCAGCTGTCGGCAAGCTGGGCGAACCGCAAAAAACACCTGAGGCTGACCTTTACGTCTACCTGCATAACGGCCAGCCGGTCCTTGCGTACGTTACGGAAGTTAACGTGCTGGAGCCGGAGGCCATCAGAACGAGATACTTCATTAGCGCGGAGGATGGAAGCATTCTGTTTAAGTACGATATTCTTGCTCACGCGACAGGCACAGGCAAGGGCGTCCTTGGCGACACAAAAAGCTTCACGACAACGCAGAGCGGATCAACGTACCAGCTGAAAGATACAACAAGAGGACAAGGCATCGTTACGTATTCAGCGGGCAATAGATCAAGCCTGCCGGGCACACTGCTGACATCAAGCTCAAACATTTGGAATGACGGCGCAGCAGTTGATGCCCATGCGTACACAGCCAAGGTGTACGACTACTATAAGAACAAGTTTGGCAGAAATAGCATCGACGGAAATGGATTTCAACTTAAATCAACGGTGCACTACTCATCAAGATATAACAATGCGTTGGAACGGAGTGCAGATGGTCTACGGAGACGGCGACGGCGTGACATTTATTCCGTTTAGCGCCGACCCGGACGTGATTGGACATGAACTGACACATGGAGTGACAGAGCATACGGCGGGACTGGAATATTACGGCGAAAGCGGCGCACTGAACGAAAGCATCTCAGACATTATTGGAAACGCAATCGATGGCAAAAACTGGCTGATTGGCGATCTGATTTATACGCCGAATACACCGGGCGATGCACTGAGATCAATGGAGAATCCGAAGCTGTACAACCAACCGGACAGATACCAAGATAGATACACAGGACCGTCAGACAACGGCGGAGTCCATATCAACAGCGGAATCAATAACAAAGCCTTTTACCTGATCGCCCAAGGCGGAACGCACTATGGCGTTACAGTCAATGGCATCGGAAGAGATGCCGCAGTTCAGATTTTCTATGACGCGCTGATCAACTATCTGACGCCTACAAGCAATTTCTCAGCAATGAGAGCCGCAGCAATCCAAGCAGCCACGGATCTGTATGGAGCCAATTCATCACAAGTTAATGCTGTTAAGAAGGCTTATACGGCAGTGGGAGTTAACTAA
通过质粒pGX148(AprE-PehPro1)表达的PehPro1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：20所示。预测的信号序列以斜体示出，3个添加的残基(AGK)以粗体示出，预测的前肽示出为加下划线的文本。
Figure BDA0000916970520000981
APQDQAAPFGGFTPQLITGESWSAPQG VSGEEKIWKYLESKQESFQIGQTVDLKKQLKIIGQTTDEKTGTTHYRLQQYVGGVPVYGGVQTIHVNKEGQVTSLI GSLLPDQQQQVSKSLNSQISEAQAIAVAQKDTEAAVGKLGEPQKTPEADLYVYLHNGQPVLAYVTEVNVLEPEAIR TRYFISAEDGSILFKYDILAHATGTGKGVLGDTKSFTTTQSGSTYQLKDTTRGQGIVTYSAGNRSSLPGTLLTSSSNIWNDGAAVDAHAYTAKVYDYYKNKFGRNSIDGNGFQLKSTVHYSSRYNNAFWNGVQMVYGDGDGVTFIPFSADPDVIGHELTHGVTEHTAGLEYYGESGALNESISDIIGNAIDGKNWLIGDLIYTPNTPGDALRSMENPKLYNQPDRYQDRYTGPSDNGGVHINSGINNKAFYLIAQGGTHYGVTVNGIGRDAAVQIFYDALINYLTPTSNFSAMRAAAIQAATDLYGANSSQVNAVKKAYTAVGVN.
实施例4.3
金属蛋白酶PehPro1的蛋白水解活性
使用偶氮-酪蛋白(目录号74H7165，美格兹密公司(Megazyme))作为底物，在50mMTris(pH 7)中测定纯化的金属蛋白酶PehPro1的蛋白水解活性。反应前，用Milli-Q水(密理博公司(Millipore))将酶稀释到特定浓度。将偶氮-酪蛋白溶解于100mM Tris缓冲液(pH7)中，使其最终浓度为1.5％(重量/体积)。为引发反应，将50μl稀释的酶(或只加Milli-Q水作为空白对照)加到置于冰上的非结合96孔微量滴定板(96-MTP)(康宁生命科学(CorningLife Sciences)，目录号3641)中，然后加入50μl 1.5％偶氮-酪蛋白。密封96-MTP后，反应在40℃下以650rpm在Thermomixer(艾本德公司(Eppendorf))中进行10分钟。加入100μl5％三氯乙酸(TCA)终止反应。在室温下平衡5分钟后，接着在4℃和2000g下离心10分钟，然后将120μl上清液转移至新的96-MTP中，使用SpectraMax 190在440nm处测定上清液的吸光度(A440)。净A440通过用酶的A440减去空白对照的A440来计算，然后用所得值对应于不同蛋白浓度(从1.25ppm至40ppm)进行作图。每个值均为一式三份测定的平均值。蛋白水解活性示为净A440。用偶氮-酪蛋白作为底物的蛋白水解测定(如图4.2所示)表明PehPro1为活性蛋白酶。
实施例4.4
金属蛋白酶PehPro1的pH分布图
用偶氮-酪蛋白作为底物，在不同pH值(pH 4至11)的12.5mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中研究金属蛋白酶PehPro1的pH分布图。为开始测定，先在置于冰上的96-MTP中将50μl特定pH的25mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液与2μl Milli-Q水稀释的酶(250ppm)混合，然后加入48μl在水中制备的1.5％(重量/体积)偶氮-酪蛋白。按实施例4.3所述方法来进行反应并分析。每个pH下的酶活性都记录为相对活性，其中最适pH下的活性设为100％。所测试的pH值为4、5、6、7、8、9、10和11。每个值均为一式三份测定的平均值。如图4.3所示，PehPro1的最适pH为7，在pH 5.5和pH 9.5之间保持最大活性的70％以上。
实施例4.5
金属蛋白酶PehPro1的温度分布图
使用偶氮-酪蛋白测定法在50mM Tris缓冲液(pH 7)中分析金属蛋白酶PehPro1的温度分布图。按实施例4.3所述方法制备酶样品和偶氮-酪蛋白底物。反应前，在200μl PCR管中混合50μl 1.5％偶氮-酪蛋白和45μl Milli-Q水，然后将PCR管放在Peltier热循环仪(伯乐公司(BioRad))中，在所需温度(即20℃至90℃)下温育5分钟。温育之后，将5μl稀释的酶(100ppm)或水(空白对照)加入底物混合物中，反应在Peltier热循环仪中不同温度下进行10分钟。为终止反应，将每个测定混合物转移到每孔包含100μl 5％TCA的96-MTP中。随后按实施例4.3中所述方法进行离心和吸光度测定。活性记录为相对活性，其中最适温度下的活性设为100％。所测试的温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。每个值均为一式两份测定的平均值(该值变化不超过5％)。图4.4中的数据表明，PehPro1表现为70℃的最适温度，并且在60℃和75℃之间保持其最大活性的70％以上。
实施例4.6
金属蛋白酶PehPro1的清洁性能
使用模型自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂，在pH 6和8下用PA-S-38(含有颜料的蛋黄，通过加热老化)微布样(荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT-Vlaardingen,The Netherlands))来测试PehPro1的清洁性能。反应前，用稀释溶液(包含10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520000991
80和10％丙二醇)将纯化的蛋白酶样品稀释到所需浓度。在100ppm水硬度(Ca2+:Mg2+＝3:1)的AT洗涤剂中进行反应(洗涤剂组成如表4.1所示)。为引发反应，将180μl在pH 6或pH 8下缓冲的AT洗涤剂加到放置有PA-S-38微布样的96-MTP中，然后加入20μl稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，使其在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中温育30分钟。温育之后，将每个孔中的100μl洗涤液转移至新的96-MTP中，使用分光光度计在405nm处测定其吸光度(这里称为“初始性能”)。弃去96-MTP中剩下的洗涤液，用200μl水漂洗微布样一次。然后加入180μl 0.1M CAPS缓冲液(pH 10)，在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中再次温育10分钟。将100μl所得洗涤液转移至新的96-MTP中，在405nm处测定其吸光度(这里称为“洗脱性能”)。两次吸光度测量值之和(“初始性能”加上“洗脱性能”)即为“总性能”，“总性能”用于衡量蛋白酶作用于模型污渍的活性；然后用酶的A405减去空白对照的“总性能”的A405计算净A405。在pH 6和pH 8下，PehPro1在AT洗涤剂中清洁PA-S-38微布样的剂量响应在图4.5A和图4.5B中示出。
表4.1：AT盘碟洗涤剂的组成
Figure BDA0000916970520001001
*AT制剂洗涤剂的pH通过添加0.9M柠檬酸来调节至所需值(pH 6或pH 8)。
实施例4.7
PehPro1与其他蛋白酶的比较
A.同源蛋白酶的鉴定
通过与NCBI非冗余蛋白质数据库和Genome Quest专利数据库比对进行BLAST检索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389-402,1997(Altschul等人，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页，1997年))(检索参数设为默认值)来鉴定同源物。用PehPro1的成熟蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：18)作为查询序列。两种检索设置的同一性百分比(PID)被定义为相同残基的数量除以逐对比对中所比对残基的数量。表4.2A和表4.2B提供了与PehPro1具有百分比同一性的序列列表。表4.2中的长度指同源蛋白酶的全序列长度。
Figure BDA0000916970520001011
Figure BDA0000916970520001012
B.同源蛋白酶序列的比对
使用默认参数下的CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research，第22卷，第4673-4680页，1994年)将预测的成熟PehPro1的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)与嗜热菌蛋白酶(P00800，嗜热溶蛋白芽孢杆菌)和来源于埃吉类芽孢杆菌B69(ZP_09077634.1)的蛋白酶进行比对。图4.6示出了PehPro1与这些蛋白酶序列的比对。
C.系统发育树
使用表2A中的代表性同源物的序列和邻接法(NJ)(Saitou,N.；and Nei,M.(1987).The neighbor-joining method:a new method for reconstructing GuideTrees.MolBiol.Evol.4,406-425(Saitou,N.和Nei,M.，1987年，The neighbor-joiningmethod:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.，《分子生物学与进化》，第4卷，第406-425页))来构建前体蛋白PehPro1(SEQ ID NO：17)的系统发育树。NJ法基于被分析的所有序列对之间的距离矩阵而工作。这些距离与序列之间的趋异度相关。使用进化树-系统发育树绘制软件(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html)显示图4.7所示的系统发育树。
实施例5.1
巴塞罗那类芽孢杆菌金属蛋白酶PbaPro1的克隆
选择巴塞罗那类芽孢杆菌菌株(DSM15478)作为可用于各种工业应用中的酶的可能来源。为获得用于测序的基因组DNA，首先在37℃下使菌株在心脏浸液琼脂平板(Difco)上生长24小时。从平板上刮下细胞材料，用Zymo公司的ZF真菌/细菌DNA小量制备试剂盒(目录号D6005)从该细胞材料中制备基因组DNA。该基因组DNA用于基因组测序。巴塞罗那类芽孢杆菌菌株的全基因组由BaseClear(荷兰莱顿(Leiden,The Netherlands))使用Illumina新一代测序技术进行测序。对数据进行拼接后，通过BioXpr(比利时那慕尔(Namur,Belgium))对重叠群进行注释。在巴塞罗那类芽孢杆菌中进行注释后所鉴定的基因之一编码金属蛋白酶，并且该基因(命名为PbaPro1)的序列以SEQ ID NO：21提供。由PbaPro1基因编码的相应蛋白质如SEQ ID NO：22所示。该蛋白在N端具有长度为25个氨基酸的信号肽，如通过SignalP 4.0版(Nordahl Petersen等人，2011年，Nature Methods，第8卷，第785-786页)所预测的。信号序列的存在表明PbaPro1为分泌性酶。基于PbaPro1与多粘类芽孢杆菌的Npr蛋白(Takekawa等人，1991年，Journal of Bacteriology，第173卷，第21期，第6820-6825页)的蛋白序列比对，预测了PbaPro1的前肽区。预测的PbaPro1蛋白成熟区如SEQ IDNO：23所示。
从巴塞罗那类芽孢杆菌中分离的PbaPro1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。编码预测的天然信号肽的序列以斜体示出：
Figure BDA0000916970520001031
Figure BDA0000916970520001032
ATGCCGTTATCTGACTCATCCATTCCATTTGAGGGCCCCTACACCTCCGAGGAGAGTATTCTGTTGAACAACAACCCGGACGAAATGATTTATAATTTTCTTGCACAACAAGAGCAATTTCTGAATGCCGACGTCAAAGGACAGCTCAAAATCATTAAACGCAACACAGACACTTCCGGCATCAGACACTTTCGTCTGAAGCAATACATCAAAGGTGTTCCGGTTTACGGCGCAGAACAAACGATCCATCTGGACAAGAACGGAGCTGTAACTTCCGCACTCGGCGATCTTCCGCCAATTGAAGAACAGGCTGTTCCGAATGATGGCGTTCCCGCAATCAGTGCAGACGATGCCATCCGTGCCGCCGAGAATGAAGCCACCTCCCGTCTTGGAGAGCTTGGCGCACCAGAGCTTGAGCCAAAGGCCGAATTAAACATTTATCATCATGAAGATGACGGACAAACCTACCTCGTTTACATTACGGAAGTTAACGTGCTTGAGCCTTCCCCGCTACGGACCAAATATTTTATTAACGCCCTTGATGGAAGCATCGTATCTCAATACGATATTATCAACTTTGCCACAGGCACCGGTACAGGCGTGCATGGTGATACCAAAACACTGACGACAACTCAATCCGGCAGCACCTATCAGCTGAAAGATACAACTCGTGGAAAAGGCATTCAAACCTATACTGCGAACAATCGCTCCTCGCTTCCAGGCAGCTTGTCTACCAGTTCCAATAACGTATGGACAGACCGTGCAGCTGTAGATGCGCACGCCTATGCTGCCGCCACATATGACTTCTACAAAAACAAATTCAATCGCAACGGCATTGACGGAAACGGGCTGTTGATTCGCTCTACAGTGCATTATGGCTCCAACTATAAAAACGCCTTCTGGAACGGAGCACAGATTGTCTATGGAGATGGCGATGGCATCGAGTTCGGTCCCTTCTCCGGTGATCTCGATGTTGTCGGACATGAATTGACACACGGGGTGATTGAATATACAGCCAATCTCGAATATCGCAATGAGCCGGGTGCTTTAAACGAAGCTTTTGCCGACATTATGGGGAACACCATCGAAAGCAAAAACTGGCTGCTTGGCGACGGAATCTATACTCCAAACATTCCAGGTGATGCCCTGCGCTCGTTATCCGACCCTACGCTGTATAACCAGCCTGACAAATACAGTGATCGCTACACTGGCTCTCAGGATAATGGCGGTGTGCATATCAACAGCGGGATCATTAACAAAGCATATTATCTTGCAGCCCAAGGCGGTACTCATAACGGGGTAACCGTTAGCGGCATCGGCCGGGATAAAGCAGTACGTATTTTCTATAGCACGCTGGTGAACTACCTGACGCCAACCTCCAAATTTGCAGCAGCCAAAACAGCGACAATTCAGGCAGCCAAGGACCTGTACGGTGCCAATTCCGCTGAAGCTACGGCAATCACCAAAGCTTATCAAGCGGTAGGTTTG
PbaPro1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。预测的信号序列以斜体示出，预测的前肽示出为加下划线的文本：
Figure BDA0000916970520001041
MPLSDSSIPFEGPYTSEESILLNNNPDEMIYNFLAQQE QFLNADVKGQLKIIKRNTDTSGIRHFRLKQYIKGVPVYGAEQTIHLDKNGAVTSALGDLPPIEEQAVPNDGVPAIS ADDAIRAAENEATSRLGELGAPELEPKAELNIYHHEDDGQTYLVYITEVNVLEPSPLRTKYFINALDGSIVSQYDI INFATGTGTGVHGDTKTLTTTQSGSTYQLKDTTRGKGlQTYTANNRSSLPGSLSTSSNNVWTDRAAVDAHAYAAATYDFYKNKFNRNGIDGNGLLIRSTVHYGSNYKNAFWNGAQIVYGDGDGIEFGPFSGDLDVVGHELTHGVIEYTANLEYRNEPGALNEAFADIMGNTIESKNWLLGDGIYTPNIPGDALRSLSDPTLYNQPDKYSDRYTGSQDNGGVHINSGIINKAYYLAAQGGTHNGVTVSGIGRDKAVRIFYSTLVNYLTPTSKFAAAKTATIQAAKDLYGANSAEATAITKAYQAVGL
预测的PbaPro1成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示：
ATGTGTGVHGDTKTLTTTQSGSTYQLKDTTRGKGIQTYTANNRSSLPGSLSTSSNNVWTDRAAVDAHAYAAATYDFYKNKFNRNGIDGNGLLIRSTVHYGSNYKNAFWNGAQIVYGDGDGIEFGPFSGDLDVVGHELTHGVIEYTANLEYRNEPGALNEAFADIMGNTIESKNWLLGDGIYTPNIPGDALRSLSDPTLYNQPDKYSDRYTGSQDNGGVHINSGIINKAYYLAAQGGTHNGVTVSGIGRDKAVRIFYSTLVNYLTPTSKFAAAKTATIQAAKDLYGANSAEATAITKAYQAVGL
实施例5.2
巴塞罗那类芽孢杆菌金属蛋白酶PbaPro1的表达
由中国上海捷瑞公司(Generay,Shanghai,China)合成PbaPro1的前肽-成熟形式的DNA序列，并将其插入枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz，Protein ExprPurif，第55卷，第40-52页，2007年)中，得到质粒pGX147(AprE-PbaPro1)(图5.1)。将此编码PbaPro1蛋白的基因连接到酶切后的载体中，使得在枯草芽孢杆菌AprE信号序列的3’端和预测的PbaPro1天然前肽5’端之间添加了3个密码子(Ala-Gly-Lys)。该基因具有替代起始密码子(GTG)。图1所示的所得质粒为标记的pGX147(AprE-PbaPro1)。如图5.1所示，pGX147(AprE-PbaPro1)包含AprE启动子、AprE信号序列以及合成的核苷酸序列，该AprE信号序列用于引导枯草芽孢杆菌中的靶蛋白分泌，该合成的核苷酸序列编码预测的PbaPro1前肽和成熟区(SEQ ID NO：24)。合成的AprE-PbaPro1基因的翻译产物如SEQ ID NO：25所示。
然后将pGX147(AprE-PbaPro1)质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32,ΔscoC)中，接着将转化的细胞涂布在补充有5ppm氯霉素和1.2％脱脂奶粉(目录号232100，Difco)的Luria琼脂平板上。选择平板上具有最大透明晕圈的菌落，将其置于装有MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基，还补充有另外5mM CaCl2)的250ml摇瓶中进行发酵。
然后浓缩摇瓶中的发酵液，并使用VivaFlow 200超滤装置(赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim))将该发酵液进行缓冲液交换，交换到包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM CaCl2和10％丙二醇的上样缓冲液中。过滤之后，将该样品加到用上述上样缓冲液预平衡的80ml Q琼脂糖高效柱中，并收集和浓缩流过的活性级分。将该样品上样到用上述上样缓冲液(包含0.15M NaCl)预平衡的320ml Superdex 75凝胶过滤柱中。进一步合并纯化的相应活性蛋白级分，然后通过10K Amicon Ultra进行浓缩，以供后续分析使用。
质粒pGX147(AprE-PbaPro1)中的合成的PbaPro1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示。编码3个添加的残基(AGK)的序列以粗体示出：
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGG
Figure BDA0000916970520001051
ATGCCTCTGTCAGACAGCAGCATTCCGTTTGAGGGCCCGTACACATCAGAAGAAAGCATCCTGCTGAACAACAACCCGGACGAGATGATCTACAATTTCCTGGCACAGCAGGAGCAGTTCCTGAACGCAGACGTGAAGGGCCAGCTGAAAATCATCAAAAGAAACACAGACACGAGCGGCATCAGACACTTCAGACTGAAGCAGTACATCAAGGGCGTCCCGGTTTACGGCGCTGAGCAGACAATCCACCTGGACAAAAATGGCGCAGTGACGAGCGCACTTGGAGATCTGCCGCCGATTGAAGAGCAAGCAGTCCCGAACGATGGCGTTCCGGCGATTAGCGCTGATGACGCTATCAGAGCGCGGAAAACGAAGCGACGTCAAGACTGGGAGAACTTGGCGCACCGGAACTTGAACCGAAGGCGGAACTGAACATCTATCACCACGAAGACGATGGACAGACGTACCTGGTGTACATCACGGAGGTGAATGTGCTGGAGCCGTCACCGCTGAGAACAAAATACTTCATCAATGCGCTGGATGGCAGCATCGTTAGCCAATACGACATCATTAACTTCGCCACAGGCACGGGCACAGGCGTTCATGGCGACACAAAAACGCTTACGACAACACAGTCAGGCTCAACGTACCAGCTGAAAGACACAACAAGAGGCAAGGGCATCCAGACGTATACAGCCAATAACAGAAGCTCACTTCCGGGCTCACTGTCAACAAGCAGCAATAATGTCTGGACGGACAGAGCTGCAGTGGACGCGCACGCGTATGCTGCGGCCACGTACGACTTCTACAAGAACAAGTTCAACAGAAACGGCATTGATGGCAACGGCCTGCTTATTAGAAGCACGGTCCACTACGGCTCAAACTACAAGAATGCGTTTTGGAACGGCGCCCAAATTGTTTATGGCGATGGAGACGGCATCGAGTTCGGACCTTTTAGCGGCGACCTGGATGTGGTCGGACATGAACTGACGCACGGCGTTATCGAGTATACGGCGAATCTGGAATACAGAAATGAACCGGGCGCTCTGAATGAGGCCTTCGCGGATATCATGGGCAACACAATTGAGAGCAAAAACTGGCTTCTGGGCGACGGAATCTACACGCCGAACATTCCGGGAGATGCACTGAGATCACTGAGCGACCCTACGCTGTACAACCAGCCGGACAAATACAGCGACAGATACACGGGATCACAGGACAATGGCGGCGTCCATATTAACTCAGGCATCATCAACAAAGCGTATTATCTGGCAGCTCAAGGCGGCACGCATAATGGCGTCACAGTTAGCGGAATCGGCAGAGACAAGGCCGTCAGAATTTTCTACTCAACGCTGGTGAACTACCTGACACCGACAAGCAAGTTTGCAGCCGCCAAAACAGCCACGATTCAGGCAGCAAAGGACCTGTACGGAGCGAACTCAGCAGAGGCCACAGCGATTACGAAGGCTTATCAAGCCGTGGGACTGTAA
通过质粒pGX147(AprE-PbaPro1)表达的PbaPro1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：25所示。预测的信号序列以斜体示出，3个添加的残基(AGK)以粗体示出，预测的前肽示出为加下划线的文本。
Figure BDA0000916970520001061
MPLSDSSIPFEGPYTSEESILLNNNPDE MIYNFLAQQEQFLNADVKGQLKIIKRNTDTSGIRHFRLKQYIKGVPVYGAEQTIHLDKNGAVTSALGDLPPIEEQAV PNDGVPAISADDAIRAAENEATSRLGELGAPELEPKAELNIYHHEDDGQTYLVYITEVNVLEPSPLRTKYFINALDG SIVSQYDIINFATGTGTGVHGDTKTLTTTQSGSTYQLKDTTRGKGIQTYTANNRSSLPGSLSTSSNNVWTDRAAVDAHAYAAATYDFYKNKFNRNGIDGNGLLIRSTVHYGSNYKNAFWNGAQIVYGDGDGIEFGPFSGDLDVVGHELTHGVIEYTANLEYRNEPGALNEAFADIMGNTIESKNWLLGDGIYTPNIPGDALRSLSDPTLYNQPDKYSDRYTGSQDNGGVHINSGIINKAYYLAAQGGTHNGVTVSGIGRRDKAVRIFYSTLVNYLTPTSKFAAAKTATIQAAKDLYGANSAEATAITKAYQAVGL
实施例5.3
金属蛋白酶PbaPro1的蛋白水解活性
使用偶氮-酪蛋白(目录号74H7165，美格兹密公司(Megazyme))作为底物，在50mMTris(pH 7)中测定纯化的金属蛋白酶PbaPro1的蛋白水解活性。反应前，用Milli-Q水(密理博公司(Millipore))将酶稀释到特定浓度。将偶氮-酪蛋白溶解于100mM Tris缓冲液(pH7)中，使其最终浓度为1.5％(重量/体积)。为引发反应，将50μl稀释的酶(或只加Milli-Q水作为空白对照)加到置于冰上的非结合96孔微量滴定板(96-MTP)(康宁生命科学(CorningLife Sciences)，目录号3641)中，然后加入50μl 1.5％偶氮-酪蛋白。密封96-MTP后，反应在40℃下以650rpm在Thermomixer(艾本德公司(Eppendorf))中进行10分钟。加入100μl5％三氯乙酸(TCA)终止反应。在室温下平衡5分钟后，接着在4℃和2000g下离心10分钟，然后将120μl上清液转移至新的96-MTP中，使用SpectraMax 190在440nm处测定上清液的吸光度(A440)。净A440通过用酶的A440减去空白对照的A440来计算，然后用所得值对应于不同蛋白浓度(从1.25ppm至40ppm)进行作图。每个值均为一式三份测定的平均值。
蛋白水解活性示为净A440。用偶氮-酪蛋白作为底物的蛋白水解测定(如图5.2所示)表明PbaPro1为活性蛋白酶。
实施例5.4
金属蛋白酶PbaPro1的pH分布图
用偶氮-酪蛋白作为底物，在不同pH值(pH 5至11)的12.5mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中研究金属蛋白酶PbaPro1的pH分布图。为开始测定，先在置于冰上的96-MTP中将50μl特定pH的25mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液与2μl Milli-Q水稀释的酶(125ppm)混合，然后加入48μl在水中制备的1.5％(重量/体积)偶氮-酪蛋白。按实施例5.3所述方法来进行反应并分析。每个pH下的酶活性都记录为相对活性，其中最适pH下的活性设为100％。所测试的pH值为5、6、7、8、9、10和11。每个值均为一式三份测定的平均值。如图5.3所示，PbaPro1的最适pH为8，在pH 7和pH 9之间保持最大活性的70％以上。
实施例5.5
金属蛋白酶PbaPro1的温度分布图
使用偶氮-酪蛋白测定法在50mM Tris缓冲液(pH 7)中分析金属蛋白酶PbaPro1的温度分布图。按实施例5.3所述方法制备酶样品和偶氮-酪蛋白底物。反应前，在200μl PCR管中混合50μl 1.5％偶氮-酪蛋白和45μl Milli-Q水，然后将PCR管放在Peltier热循环仪(伯乐公司(BioRad))中，在所需温度(即20℃至90℃)下温育5分钟。温育之后，将5μl稀释的酶(50ppm)或水(空白对照)加入底物混合物中，反应在Peltier热循环仪中不同温度下进行10分钟。为终止反应，将每个测定混合物转移到每孔包含100μl 5％TCA的96-MTP中。随后按实施例5.3中所述方法进行离心和吸光度测定。活性记录为相对活性，其中最适温度下的活性设为100％。所测试的温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。每个值均为一式两份测定的平均值(该值变化不超过5％)。图5.4中的数据表明，PbaPro1表现为50℃的最适温度，并且在45℃和55℃之间保持其最大活性的70％以上。
实施例5.6
金属蛋白酶PbaPro1的清洁性能
使用模型自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂，在pH 6和8下用PA-S-38(含有颜料的蛋黄，通过加热老化)微布样(荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT-Vlaardingen,The Netherlands))来测试PbaPro1的清洁性能。反应前，用稀释溶液(包含10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520001081
80和10％丙二醇)将纯化的蛋白酶样品稀释到所需浓度。在100ppm水硬度(Ca2+:Mg2+＝3:1)的AT洗涤剂中进行反应(洗涤剂组成如表5.1所示)。为引发反应，将180μl在pH 6或pH 8下缓冲的AT洗涤剂加到放置有PA-S-38微布样的96-MTP中，然后加入20μl稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，使其在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中温育30分钟。温育之后，将每个孔中的100μl洗涤液转移至新的96-MTP中，使用分光光度计在405nm处测定其吸光度(这里称为“初始性能”)。弃去96-MTP中剩下的洗涤液，用200μl水漂洗微布样一次。然后加入180μl 0.1M CAPS缓冲液(pH 10)，在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中再次温育10分钟。将100μl所得洗涤液转移至新的96-MTP中，在405nm处测定其吸光度(这里称为“洗脱性能”)。两次吸光度测量值之和(“初始性能”加上“洗脱性能”)即为“总性能”，“总性能”用于衡量蛋白酶作用于模型污渍的活性；然后用酶的A405减去空白对照的“总性能”的A405计算净A405。在pH 6和pH 8下，PbaPro1在AT洗涤剂中清洁PA-S-38微布样的剂量响应在图5.5A和图5.5B中示出。
表5.1：含有漂白剂的AT盘碟洗涤剂制剂的组成
Figure BDA0000916970520001082
*AT制剂洗涤剂的pH通过添加0.9M柠檬酸来调节至所需值(pH 6或pH 8)。
实施例5.7
PbaPro1与其他蛋白酶的比较
A.同源蛋白酶的鉴定
通过与NCBI非冗余蛋白质数据库和Genome Quest专利数据库比对进行BLAST检索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389-402,1997(Altschul等人，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页，1997年))(检索参数设为默认值)来鉴定同源物。用PbaPro1的预测的成熟蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：23)作为查询序列。两种检索设置的同一性百分比(PID)被定义为相同残基的数量除以逐对比对中所比对残基的数量。表5.2A和表5.2B提供了与PbaPro1具有百分比同一性的序列列表。表5.2中的长度指同源蛋白酶的全序列长度。
Figure BDA0000916970520001091
Figure BDA0000916970520001101
B.同源蛋白酶序列的比对
使用默认参数下的CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research，第22卷，第4673-4680页，1994年)将预测的成熟PbaPro1的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)与嗜热菌蛋白酶(P00800，嗜热溶蛋白芽孢杆菌)和来源于多粘类芽孢杆菌SC2的蛋白酶(YP_003948511.1)进行比对。图5.6示出了PbaPro1与这些蛋白酶序列的比对。
C.系统发育树
使用表2A中的代表性同源物的序列和邻接法(NJ)(Saitou,N.和Nei,M.，1987年，“邻接法：用于重构引导树的一种新方法”，The neighbor-joining method:a new methodfor reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.，第4卷，第406-425页)来构建PbaPro1的全长序列(SEQ ID NO：22)的系统发育树。NJ法基于被分析的所有序列对之间的距离矩阵而工作。这些距离与序列之间的趋异度相关。使用进化树-系统发育树绘制软件(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html)显示图5.7所示的系统发育树。
实施例6.1
多粘类芽孢杆菌SC2金属蛋白酶PpoPro1的克隆
在NCBI数据库中鉴定出PpoPro1基因的核酸序列(NCBI参考序列：NC_014622.1，来源于4536397-4538175)，并且该序列以SEQ ID NO：26提供。由PpoPro1基因编码的相应蛋白质如SEQ ID NO：27所示。该蛋白在N端具有长度为24个氨基酸的信号肽，如通过SignalP4.0版(Nordahl Petersen等人，2011年，Nature Methods，第8卷，第785-786页)所预测的。信号序列的存在表明PpoPro1为分泌性酶。基于PpoPro1与多粘类芽孢杆菌的Npr蛋白(Takekawa等人，1991年，Journal of Bacteriology，第173卷，第21期，第6820-6825页)的蛋白序列比对，预测了PpoPro1的前肽区。预测的PpoPro1蛋白成熟区如SEQ ID NO：28所示。
从NCBI数据库中鉴定出的PpoPro1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示。编码预测的天然信号肽的序列以斜体示出：
Figure BDA0000916970520001111
Figure BDA0000916970520001112
GAGAGTTCCGTTTCGGGGCCAGCTCAGCTTACACCGACCTTCCACGCCGAGCAATGGAAAGCACCTACCTCGGTATCGGGGGATGACATTGTATGGAGCTATTTAAATCGACAAAAGAAATCGTTGCTGGGTGTGGATAGCTCCAGTGTACGTGAACAATTCCGAATCGTTGATCGCACAAGCGACAAATCCGGTGTAAGCCATTATCGACTGAAGCAGTATGTAAACGGAATTCCCGTGTATGGAGCTGAACAAACTATTCATGTGGGCAAATCTGGTGAGGTCACCTCTTACTTAGGAGCGGTGGTTAATGAGGATCAGCAGGCAGAAGCTACCCAAGCTACAACTCCAAAAATCAGCGCTTCTGAAGCGGTCTACACCGCATATAAAGAAGCAGCTGCACGGATTGAAGCCCTCCCTACCTCCGACGATACTATTTCTAAAGACGCTGAGGAGCCAAGCAGTGTAAGTAAAGATACTTACGCCGAAGCAGCTAACAACGAAAAAACGCTTTCTGTTGATAAGGACGAGCTGAGTCTTGATCAGGCATCTGTCCTGAAAGATAGCAAAATTGAAGCAGTGGAACCAGAAAAAAGTTCCATTGCCAAAATCGCTAATCTGCAGCCTGAAGTAGATCCTAAAGCAGAACTCTACTACTACGCTAAGGGGGATGACCTGCTGCTGGTTTATGTAACAGAAGTTAATGTTTTAGAACCTGCCCCACTGCGTACCCGCTACATTATTGATGCCAATGACGGCAGCATCGTATTCCAGTATGACATCATTAATGAAGCGACAGGCACAGGT4AAGGTGTGCTTGGTGATTCCAAATCGTTCACTACTACCGCTTCCGGCAGTAGCTACCAGTTAAAAGATACAACACGCGGTAACGGAATCGTGACTTACACGGCCTCCAACCGTCAAAGCATCCCAGGTACCATTTTGACAGATGCCGATAATGTATGGAATGATCCAGCTGGTGTGGACGCCCATGCGTATGCTGCTAAAACCTATGATTACTATAAAGCCAAATTTGGACGCAACAGCATTGACGGACGCGGTCTGCAACTTCGTTCGACGGTCCATTACGGTAGTCGCTACAACAATGCCTTCTGGAACGGCTCCCAAATGACTTATGGAGATGGAGATGGTAGCACATTTATCGCCTTCAGCGGGGACCCCGATGTAGTAGGACATGAACTTACGGCATGGTGTCACAGAGTATACTTCGAATTTGGAATATTACGGAGAGTCCGGCGCATTGAATGAAGCTTTCTCAGACGTTATCGGGAATGACATTCAGCGCAAAAACTGGCTTGTAGGCGATGATATTTACACGCCAAACATTGCAGGCGATGCCCTTCGCTCAATGTCCAATCCAACCCTGTACGATCAACCAGATCACTATTCCAACCTGTACAGAGGCAGCTCCGATAACGGCGGTGTTCACACCAACAGCGGTATTATCAATAAAGCTTACTACTTGTTAGCACAAGGTGGTAATTTCCATGGCGTAACTGTAAATGGAATTGGCCGTGATGCAGCGGTGCAAATTTACTACAGTGCCTTTACGAACTACCTGACTTCTTCTTCCGACTTCTCCAACGCACGTGCTGCTGTGATCCAAGCCGCAAAAGATCTGTACGGGGCGAACTCAGCAGAAGCAACTGCAGCTGCCAAGTCTTTTGACGCTGTAGGCGTAAACTAA
PpoPro1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。预测的信号序列以斜体示出，预测的前肽示出为加下划线的文本：
Figure BDA0000916970520001121
ESSVSGPAQLTPTFHAEQWKAPTSVSGDDIVWSYLNR QKKSLLGVDSSSVREQFRIVDRTSDKSGVSHYRLKQYVNGIPVYGAEQTIHVGKSGEVTSYLGAVVNEDQQAEATQG TTPKISASEAVYTAYKEAAARIEALPTSDDTISKDAEEPSSVSKDTYAEAANNEKTLSVDKDELSLDQASVLKDSKI EAVEPEKSSIAKIANLQPEVDPKAELYYYPKGDDLLLVYVTEVNVLEPAPLRTRYIIDANDGSIVFQYDIINEATGTGKGVLGDSKSFTTTASGSSYQLKDTTRGNGIVTYTASNRQSIPGTILTDADNVWNDPAGVDAHAYAAKTYDYYKAKFGRNSIDGRGLQLRSTVHYGSRYNNAFWNGSQMTYGDGDGSTFIAFSGDPDVVGHELTHGVTEYTSNLEYYGESGALNEAFSDVIGNDIQRKNWLVGDDIYTPNIAGDALRSMSNPTLYDQPDHYSNLYRGSSDNGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGNFHGVTVNGIGRDAAVQIYYSAFTNYLTSSSDFSNARAAVIQAAKDLYGANSAEATAAAKSFDAVGVN
预测的PpoPro1成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示：
ATGTGKGVLGDSKSFTTTASGSSYQLKDTTRGNGIVTYTASNRQSIPGTILTDADNVWNDPAGVDAHAYAAKTYDYYKAKFGRNSIDGRGLQLRSTVHYGSRYNNAFWNGSQMTYGDGDGSTFIAFSGDPDVVGHELTHGVTEYTSNLEYYGESGALNEAFSDVIGNDIQRKNWLVGDDIYTPNIAGDALRSMSNPTLYDQPDHYSNLYRGSSDNGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGNFHGVTVNGIGRDAAVQIYYSAFTNYLTSSSDFSNARAAVIQAAKDLYGANSAEATAAAKSFDAVGVN
实施例6.2
多粘类芽孢杆菌SC2金属蛋白酶PpoPro1的表达
由中国上海捷瑞公司(Generay,Shanghai,China)合成PpoPro1的前肽-成熟形式的DNA序列，并将其插入枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz，Protein ExprPurif，第55卷，第40-52页，2007年)中，得到质粒pGX138(AprE-PpoPro1)(图1)。将此编码PpoPro1蛋白的基因连接到酶切后的载体中，使得在枯草芽孢杆菌AprE信号序列的3’端和预测的PpoPro1天然前肽5’端之间添加了3个密码子(Ala-Gly-Lys)。该基因具有替代起始密码子(GTG)。图6.1所示的所得质粒为标记的。pGX138(AprE-PpoPro1)包含AprE启动子、AprE信号序列以及合成的核苷酸序列，该AprE信号序列用于引导枯草芽孢杆菌中的靶蛋白分泌，该合成的核苷酸序列编码预测的PpoPro1前肽和成熟区(SEQ ID NO：29)。合成的AprE-PpoPro1基因的翻译产物如SEQ ID NO：30所示。
然后将pGX138(AprE-PpoPro1)质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32,ΔscoC)中，接着将转化的细胞涂布在补充有5ppm氯霉素和1.2％脱脂奶粉(目录号232100，Difco)的Luria琼脂平板上。选择平板上具有最大透明晕圈的菌落，将其置于装有MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基，还补充有另外5mM CaCl2)的250ml摇瓶中进行发酵。
然后浓缩摇瓶中的发酵液，并使用VivaFlow 200超滤装置(赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim))将该发酵液进行缓冲液交换，交换到包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM CaCl2和10％丙二醇的上样缓冲液中。过滤之后，将该样品加到用上述上样缓冲液预平衡的80ml Q琼脂糖高效柱中，用0至0.25M NaCl的线性盐梯度的上样缓冲液从柱中洗脱PpoPro1。收集并浓缩相应活性级分。将该样品上样到用上述上样缓冲液(包含0.15M NaCl)预平衡的320ml Superdex 75凝胶过滤柱中。进一步合并纯化的相应活性蛋白级分，然后通过10K Amicon Ultra进行浓缩，以供后续分析使用。
质粒pGX138(AprE-PpoPro1)中的合成的PpoPro1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示。编码3个添加的残基(AGK)的序列以粗体示出：
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCT
Figure BDA0000916970520001141
GAATCATCAGTGTCAGGACCGGCTCAGCTTACACCGACATTTCACGCAGAACAATGGAAGGCTCCGACGTCAGTTTCAGGAGACGACATCGTGTGGAGCTACCTGAATAGACAGAAGAAAAGCCTGCTGGGAGTGGATAGCAGCAGCGTCAGAGAGCAGTTCAGAATCGTTGACAGAACGAGCGACAAAAGCGGAGTCAGCCATTATAGACTGAAGCAGTACGTGAATGGCATCCCGGTTTATGGCGCAGAGCAGACAATTCATGTTGGCAAGAGCGGAGAAGTCACAAGCTATCTGGGCGCTGTGGTCAATGAAGATCAACAAGCCGAGGCTACACAGGGAACAACGCCGAAAATTAGCGCCTCAGAGGCAGTCTACACGGCGTACAAAGAAGCGGCTGCAAGAATCGAAGCCCTGCCGACATCAGACGATACAATTTCAAAAGATGCGGAGGAGCCGAGCTCAGTTAGCAAGGATACATACGCGGAAGCCGCAAACAATGAGAAAACACTGAGCGTGGACAAGGACGAGCTGTCACTTGATCAGGCTAGCGTCCTTAAAGACAGCAAGATCGAGGCCGTTGAGCCTGAAAAGTCATCAATTGCGAAAATCGCCAATCTGCAACCTGAAGTCGACCCGAAGGCGGAACTGTACTACTACCCGAAAGGCGATGACCTGCTTCTGGTGTACGTCACGGAAGTGAACGTCCTGGAACCGGCACCGCTGAGAACAAGATACATCATCGACGCGAACGACGGAAGCATCGTCTTCCAGTATGACATTATCAACGAAGCAACGGGAACGGGCAAAGGCGTTCTTGGAGACTCAAAGAGCTTCACGACAACGGCTTCAGGAAGCAGCTACCAGCTGAAAGACACGACGAGAGGAAACGGAATCGTCACATATACGGCGTCAAACAGACAAAGCATCCCTGGCACAATCCTGACGGATGCTGACAACGTTTGGAATGATCCGGCTGGCGTGGATGCCCATGCTTATGCGGCAAAAACGTATGACTATTACAAGGCGAAGTTCGGCAGAAATTCAATCGATGGCAGAGGACTGCAGCTTAGAAGCACGGTGCACTACGGATCAAGATATAACAATGCCTTCTGGAACGGCAGCCAGATGACATACGGAGACGGAGATGGAAGCACATTTATTGCATTCAGCGGCGACCCTGATGTGGTTGGCCATGAGCTGACGCATGGCGTTACAGAATATACGAGCAATCTTGAATACTACGGCGAGTCAGGCGCTCTGAACGAGGCATTTAGCGATGTTATCGGCAATGACATCCAGAGAAAAAACTGGCTGGTGGGCGACGATATTTACACGCCTAATATCGCTGGCGATGCCCTTAGATCAATGTCAAACCCGACGCTGTATGATCAGCCTGACCACTACTCAAACCTGTATAGAGGCTCATCAGATAACGGAGGCGTCCATACGAATAGCGGCATCATTAACAAGGCATATTATCTTCTGGCCCAGGGCGGCAATTTTCATGGAGTGACGGTTAATGGAATTGGAAGAGACGCAGCCGTCCAAATCTACTACAGCGCTTTCACGAACTACCTTACATCAAGCTCAGACTTTAGCAATGCCAGAGCTGCTGTTATCCAGGCAGCGAAGGATCTTTACGGCGCCAACTCAGCCGAAGCTACGGCCGCAGCTAAATCATTTGATGCAGTGGGCGTTAAT
通过质粒pGX138(AprE-PpoPro1)表达的PpoPro1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：30所示。预测的信号序列以斜体示出，3个添加的残基(AGK)以粗体示出，预测的前肽示出为加下划线的文本。
Figure BDA0000916970520001151
ESSVSGPAQLTPTFHAEQWKAPTSVSGD DIVWSYLNRQKKSLLGVDSSSVREQFRIVDRTSDKSGVSHYRLKQYVNGIPVYGAEQTIHVGKSGEVTSYLGAVVNE DQQAEATQGTTPKISASEAVYTAYKEAAARIEALPTSDDTISKDAEEPSSVSKDTYAEAANNEKTLSVDKDELSLDQ ASVLKDSKIEAVEPEKSSIAKIANLQPEVDPKAELYYYPKGDDLLLVYVTEVNVLEPAPLRTRYIIDANDGSIVFQY DIINEATGTGKGVLGDSKSFTTTASGSSYQLKDTTRGNGIVTYTASNRQSIPGTILTDADNVWNDPAGVDAHAYAAKTYDYYKAKFGRNSIDGRGLQLRSTVHYGSRYNNAFWNGSQMTYGDGDGSTFIAFSGDPDVVGHELTHGVTEYTSNLEYYGESGALNEAFSDVIGNDIQRKNWLVGDDIYTPNIAGDALRSMSNPTLYDQPDHYSNLYRGSSDNGGVHTNSGIINKAYYLLAQGGNFHGVTVNGIGRDAAVQIYYSAFTNYLTSSSDFSNARAAVIQAAKDLYGANSAEATAAAKSFDAVGVN
实施例6.3
金属蛋白酶PpoPro1的蛋白水解活性
使用偶氮-酪蛋白(目录号74H7165，美格兹密公司(Megazyme))作为底物，在50mMTris(pH 7)中测定纯化的PpoPro1的蛋白水解活性。反应前，用Milli-Q水(密理博公司(Millipore))将酶稀释到特定浓度。将偶氮-酪蛋白溶解于100mM Tris缓冲液(pH 7)中，使其最终浓度为1.5％(重量/体积)。为引发反应，将50μl稀释的酶(或只加Milli-Q水作为空白对照)加到置于冰上的非结合96孔微量滴定板(96-MTP)(康宁生命科学(Corning LifeSciences)，目录号3641)中，然后加入50μl 1.5％偶氮-酪蛋白。密封96-MTP后，反应在40℃下以650rpm在Thermomixer(艾本德公司(Eppendorf))中进行10分钟。加入100μl 5％三氯乙酸(TCA)终止反应。然后在室温下平衡5分钟，接着在4℃和2000g下离心10分钟，将120μl上清液转移至新的96-MTP中，使用SpectraMax 190在440nm处测定上清液的吸光度(A440)。净A440通过用酶的A440减去空白对照的A440来计算，然后用所得值对应于不同蛋白浓度(从1.25ppm至40ppm)进行作图。每个值均为一式两份测定的平均值，并且该值变化不超过5％。蛋白水解活性示为净A440。用偶氮-酪蛋白作为底物的蛋白水解测定(图6.2)表明PpoPro1为活性蛋白酶。
实施例4
金属蛋白酶PpoPro1的pH分布图
用偶氮-酪蛋白作为底物，在不同pH值(pH 4至11)的12.5mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中研究PpoPro1的pH分布图。为开始测定，先在置于冰上的96-MTP中将50μl特定pH的25mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液与2μl稀释的酶(250ppm，溶于Milli-Q水中)混合，然后加入48μl在水中制备的1.5％(重量/体积)偶氮-酪蛋白。按实施例6.3所述方法来进行反应并分析。每个pH下的酶活性都记录为相对活性，其中最适pH下的活性设为100％。所测试的pH值为4、5、6、7、8、9、10和11。每个值均为一式三份测定的平均值。如图6.3所示，PpoPro1的最适pH为约7，在pH 5.5和pH 8.5之间保持最大活性的70％以上。
实施例6.5
金属蛋白酶PpoPro1的温度分布图
使用偶氮-酪蛋白测定法在50mM Tris缓冲液(pH 7)中分析PpoPro1的温度分布图。按实施例6.3所述方法制备酶样品和偶氮-酪蛋白底物。反应前，在200μl PCR管中混合50μl 1.5％偶氮-酪蛋白和45μl Milli-Q水，然后将PCR管放在Peltier热循环仪(伯乐公司(BioRad))中，在所需温度(即20℃至90℃)下温育5分钟。温育之后，将5μl稀释的PpoPro1(100ppm)或水(空白对照)加入底物混合物中，反应在Peltier热循环仪中不同温度下进行10分钟。为终止反应，将每个测定混合物转移到每孔包含100μl 5％TCA的96-MTP中。随后按实施例6.3中所述方法进行离心和吸光度测定。活性记录为相对活性，其中最适温度下的活性设为100％。所测试的温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。每个值均为一式两份测定的平均值(该值变化不超过5％)。图6.4中的数据表明，PpoPro1表现为50℃的最适温度，并且在40℃和55℃之间保持其最大活性的70％以上。
实施例6.6
金属蛋白酶PpoPro1的清洁性能
使用模型自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂(AT洗涤剂)，在pH 6和pH 8下用PA-S-38(含有颜料的蛋黄，通过加热老化)微布样(荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT-Vlaardingen,TheNetherlands))来测试PpoPro1的清洁性能。反应前，用稀释溶液(包含10mM NaCl、0.1mMCaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520001161
80和10％丙二醇)将纯化的PpoPro1稀释到所需浓度。在存在漂白剂组分(过酸N,N-邻苯二甲酰氨基过氧己酸-PAP)的情况下，在100ppm水硬度(Ca2+:Mg2+＝3:1)的AT洗涤剂中进行反应(AT洗涤剂组成如表6.1所示)。为引发反应，将180μL在pH 6或pH 8下缓冲的AT洗涤剂加到放置有PA-S-38微布样的96-MTP中，然后加入20μL稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，使其在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中温育30分钟。温育之后，将每个孔中的100μl洗涤液转移至新的96-MTP中，使用分光光度计在405nm处测定其吸光度(这里称为“初始性能”)。弃去96-MTP中剩下的洗涤液，用200μL水漂洗微布样一次。然后加入180μL 0.1M CAPS缓冲液(pH 10)，在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中再次温育10分钟。将100μL所得洗涤液转移至新的96-MTP中，在405nm处测定其吸光度(这里称为“洗脱性能”)。两次吸光度测量值之和(“初始性能”加上“洗脱性能”)即为“总性能”，“总性能”用于衡量蛋白酶作用于模型污渍的活性；然后用酶的A405减去空白对照的“总性能”的A405计算净A405。在漂白剂存在的情况下，在pH 6和pH 8下PpoPro1在AT盘碟洗涤剂中清洁PA-S-38微布样的剂量响应在图6.5A和图6.5B中示出。
表6.1：含有漂白剂的AT盘碟洗涤剂制剂的组成
Figure BDA0000916970520001171
*AT制剂洗涤剂的pH通过添加0.9M柠檬酸来调节至所需值(pH 6或pH 8)。
实施例6.7
PpoPro1与其他金属蛋白酶的比较
同源蛋白酶的鉴定
通过与NCBI非冗余蛋白质数据库和Genome Quest专利数据库比对进行BLAST检索(Altschul等人，Nucleic Acids Res，第25卷，第3389-3402页，1997年)(检索参数设为默认值)来鉴定同源物。用PpoPro1的预测的成熟蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：28)作为查询序列。两种检索设置的同一性百分比(PID)被定义为相同残基的数量除以逐对比对中所比对残基的数量。表6.2A和表6.2B提供了与PpoPro1具有百分比同一性的序列列表。表6.2中的长度指同源蛋白酶的全序列长度。
Figure BDA0000916970520001181
Figure BDA0000916970520001182
Figure BDA0000916970520001191
同源蛋白酶序列的比对
使用默认参数下的CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research，第22卷，第4673-4680页，1994年)将预测的成熟PpoPro1的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)与嗜热菌蛋白酶(P00800，嗜热溶蛋白芽孢杆菌)和来源于多粘类芽孢杆菌SC2的蛋白酶(YP_003948511.1)进行比对。图6.6示出了PpoPro1与这些蛋白酶序列的比对。
系统发育树
使用表6.2A中的代表性同源物的序列和邻接法(NJ)(Saitou,N.；and Nei,M.(1987).The neighbor-joining method:a new method for reconstructing GuideTrees.MolBiol.Evol.4,406-425(Saitou,N.和Nei,M.，1987年，The neighbor-joiningmethod:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.，第4卷，第406-425页))来构建前体PpoPro1(SEQ ID NO：27)的系统发育树。NJ法基于被分析的所有序列对之间的距离矩阵而工作。这些距离与序列之间的趋异度相关。使用进化树-系统发育树绘制软件(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html)显示图6.7所示的系统发育树。
实施例7.1
湖南类芽孢杆菌金属蛋白酶PhuPro1的克隆
选择湖南类芽孢杆菌菌株(DSM22170)作为可用于各种工业应用中的酶的可能来源。为获得用于测序的基因组DNA，首先在37℃下使菌株在心脏浸液琼脂平板(Difco)上生长24小时。从平板上刮下细胞材料，用Zymo公司的ZF真菌/细菌DNA小量制备试剂盒(目录号D6005)从该细胞材料中制备基因组DNA。该基因组DNA用于基因组测序。湖南类芽孢杆菌菌株的全基因组由BaseClear(荷兰莱顿(Leiden,The Netherlands))使用Illumina新一代测序技术进行测序。对数据进行拼接后，通过BioXpr(比利时那慕尔(Namur,Belgium))对重叠群进行注释。在湖南类芽孢杆菌中进行注释后所鉴定的基因之一编码金属蛋白酶，并且该基因(命名为PhuPro1)的序列以SEQ ID NO：31提供。该基因具有替代起始密码子(TTG)。由PhuPro1基因编码的相应蛋白质如SEQ ID NO：32所示。该蛋白在N端具有长度为23个氨基酸的信号肽，如通过SignalP 4.0版(Nordahl Petersen等人，2011年，Nature Methods，第8卷，第785-786页)所预测的。信号序列的存在表明PhuPro1为分泌性酶。基于PhuPro1与多粘类芽孢杆菌的Npr蛋白(Takekawa等人，1991年，Journal of Bacteriology，第173卷，第21期，第6820-6825页)的蛋白序列比对，预测了PhuPro1的前肽区。预测的PhuPro1蛋白成熟区如SEQ ID NO：33所示。
从湖南类芽孢杆菌中分离的PhuPro1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示。编码预测的天然信号肽的序列以斜体示出：
Figure BDA0000916970520001201
Figure BDA0000916970520001202
GCAGAAGCAAATGATCTGGCACCACTCGGTGATTACACGCCAAAATTGATTACGCAAGCAACAGGCATCACTGGCGCTAGTGGCGATGCTAAAGTATGGAAGTTCCTGGAGAAGCAAAAACGTACCATCGTAACCGATGATGCAGCTTCTGCTGATGTGAAGGAATTGTTTGAGATCACAAAACGTCAATCCGATTCTCAAACCGGTACAGAGCACTATCGCCTGAACCAAACCTTTAAAGGCATCCCAGTCTATGGCGCAGAGCAAACACTGCACTTTGACAAATCCGGCAATGTATCTCTGTACATGGGTCAGGTTGTTGAGGATGTGTCCGCTAAACTGGAAGCTTCCGATTCCAAAAAAGGCGTAACTGAGGATGTATACGCTTCGGATACGAAAAATGATCTGGTAACACCAGAAATCAGCGCTTCTCAAGCCATCTCGATTGCTGAAAAGGATGCAGCTTCCAAAATCGGCTCCCTCGGCGAAGCACAAAAAACGCCAGAAGCGAAGCTGTATATCTACGCTCCTGAGGATCAAGCAGCACGTCTGGCTTATGTGACAGAAGTAAACGTACTGGAGCCATCTCCGCTGCGTACTCGCTATTTTGTAGATGCAAAAACAGGTTCGATCCTGTTCCAATATGATCTGATTGAGCATGCAACAGGTACAGGTAAAGGGGTACTGGGTGATACCAAGTCCTTCACTGTAGGTACTTCCGGTTCTTCCTATGTGATGACTGATAGCACGCGTGGAAAAGGTATCCAAACCTACACGGCGTCTAACCGCACATCACTGCCAGGTAGCACTGTAACGAGCAGCAGCAGCACATTTAACGATCCAGCATCTGTCGATGCCCATGCGTATGCACAAAAAGTATATGATTTCTACAAATCCAACTTTAACCGCAACAGCATCGACGGTAATGGTCTGGCTATCCGCTCCACTACGCACTATTCCACACGTTATAACAATGCGTTCTGGAATGGTTCCCAAATGGTATACGGTGATGGCGATGGTTCGCAATTCATCGCATTCTCCGGCGACCTTGACGTAGTAGGTCACGAGCTGACACACGGTGTAACCGAGTACACAGCGAACCTGGAATACTATGGTCAATCCGGTGCACTGAACGAATCCATTTCGGATATCTTTGGTAACACAATCGAAGGTAAAAACTGGATGGTAGGCGATGCGATCTACACACCAGGCGTATCCGGCGATGCTCTTCGCTACATGGATGATCCAACAAAAGGTGGACAACCAGCGCGTATGGCAGATTACAACAACACAAGCGCTGATAATGGCGGTGTACACACAAACAGTGGTATCCCGAATAAAGCATACTACTTGCTGGCACAGGGTGGCACATTTGGCGGTGTAAATGTAACAGGTATCGGTCGCTCGCAAGCGATCCAGATCGTTTACCGTGCACTAACATACTACCTGACATCCACATCTAACTTCTCGAACTACCGTTCTGCAATGGTGCAAGCATCTACAGACCTGTACGGTGCAAACTCTACACAAACAACAGCGGTGAAAAACTCGCTGAGCGCAGTAGGCATTAAC
PhuPro1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示。预测的信号序列以斜体示出，预测的前肽示出为加下划线的文本：
Figure BDA0000916970520001211
AEANDLAPLGDYTPKLITQATGITGASGDAKVWKFLEKQ KRTIVTDDAASADVKELFEITKRQSDSQTGTEHYRLNQTFKGIPVYGAEQTLHFDKSGNVSLYMGQVVEDVSAKLEA SDSKKGVTEDVYASDTKNDLVTPEISASQAISIAEKDAASKIGSLGEAQKTPEAKLYIYAPEDQAARLAYVTEVNVL EPSPLRTRYFVDAKTGSILFQYDLIEHATGTGKGVLGDTKSFTVGTSGSSYVMTDSTRGKGIQTYTASNRTSLPGSTVTSSSSTFNDPASVDAHAYAQKVYDFYKSNFNRNSIDGNGLAIRSTTHYSTRYNNAFWNGSQMVYGDGDGSQFIAFSGDLDVVGHELTHGVTEYTANLEYYGQSGALNESISDIFGNTIEGKNWMVGDAIYTPGVSGDALRYMDDPTKGGQPARMADYNNTSADNGGVHTNSGIPNKAYYLLAQGGTFGGVNVTGIGRSQAIQIVYRALTYYLTSTSNFSNYRSAMVQASTDLYGANSTQTTAVKNSLSAVGIN
预测的PhuPro1成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示：
ATGTGKGVLGDTKSFTVGTSGSSYVMTDSTRGKGIQTYTASNRTSLPGSTVTSSSSTFNDPASVDAHAYAQKVYDFYKSNFNRNSIDGNGLAIRSTTHYSTRYNNAFWNGSQMVYGDGDGSQFIAFSGDLDVVGHELTHGVTEYTANLEYYGQSGALNESISDIFGNTIEGKNWMVGDAIYTPGVSGDALRYMDDPTKGGQPARMADYNNTSADNGGVHTNSGIPNKAYYLLAQGGTFGGVNVTGIGRSQAIQIVYRALTYYLTSTSNFSNYRSAMVQASTDLVGANSTQTTAVKNSLSAVGIN
实施例7.2
湖南类芽孢杆菌金属蛋白酶PhuPro1的表达
由中国上海捷瑞公司(Generay,Shanghai,China)合成PhuPro1的前肽-成熟形式的DNA序列，并将其插入枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz，Protein ExprPurif，第55卷，第40-52页，2007年)中，得到质粒pGX149(AprE-PhuPro1)(图7.1)。将此编码PhuPro1蛋白的基因连接到酶切后的载体中，使得在枯草芽孢杆菌AprE信号序列的3’端和预测的PhuPro1天然前肽5’端之间添加了3个密码子(Ala-Gly-Lys)。该基因具有替代起始密码子(GTG)。图1显示所得质粒，标记的pGX149(AprE-PhuPro1)包含AprE启动子、AprE信号序列以及合成的核苷酸序列，该AprE信号序列用于引导枯草芽孢杆菌中的靶蛋白分泌，该合成的核苷酸序列编码预测的PhuPro1前肽和成熟区(SEQ ID NO：34)。合成的AprE-PhuPro1基因的翻译产物如SEQ ID NO：35所示。
将pGX149(AprE-PhuPro1)质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32,ΔscoC)中，然后将转化的细胞涂布在补充有5ppm氯霉素和1.2％脱脂奶粉(目录号232100，Difco)的Luria琼脂平板上。选择平板上具有最大透明晕圈的菌落，将其置于装有MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基，还补充有另外5mM CaCl2)的250ml摇瓶中进行发酵。
然后浓缩摇瓶中的发酵液，并使用VivaFlow 200超滤装置(赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim))将该发酵液进行缓冲液交换，交换到包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM CaCl2和10％丙二醇的上样缓冲液中。过滤之后，将该样品加到用上述上样缓冲液预平衡的80ml Q琼脂糖高效柱中，收集流过的活性级分，然后通过10K Amicon Ultra进行浓缩，以供后续分析使用。
质粒pGX149(AprE-PhuPro1)中的合成的PhuPro1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示。编码3个添加的残基(AGK)的序列以粗体示出：
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGC
Figure BDA0000916970520001231
GCAGAAGCTAATGATCTTGCCCCGCTTGGCGATTATACACCGAAGCTTATTACACAGGCAACGGGAATTACAGGCGCATCAGGCGATGCGAAGGTGTGGAAGTTCCTGGAGAAGCAGAAGAGAACGATTGTCACGGACGACGCCGCAAGCGCGGATGTCAAGGAGCTGTTCGAGATCACGAAGAGACAGAGCGATAGCCAGACGGGAACGGAGCATTACAGACTGAACCAGACGTTCAAGGGCATTCCGGTCTACGGAGCTGAACAAACGCTGCATTTTGATAAAAGCGGCAACGTCTCACTGTACATGGGCCAAGTCGTTGAGGACGTTAGCGCCAAACTTGAGGCTAGCGACAGCAAGAAAGGCGTCACAGAAGATGTCTACGCGTCAGACACGAAAAACGACCTGGTTACACCGGAAATCTCAGCTTCACAGGCCATCTCAATTGCAGAGAAAGACGCAGCGTCAAAAATCGGCTCACTGGGCGAGGCTCAGAAAACGCCGGAGGCGAAACTTTACATCTACGCCCCTGAGGACCAGGCTGCGAGACTGGCTTACGTGACAGAAGTTAATGTGCTGGAGCCGTCACCGCTTAGAACGAGATATTTCGTGGACGCAAAGACGGGCAGCATTCTGTTTCAGTACGATCTTATCGAACACGCGACAGGCACAGGAAAGGGAGTTCTGGGAGACACAAAAAGCTTCCACGGTTGGCACGTCAGGCAGCACCTACGTGATGACAGACAGCACGAGAGGCAAGGGCATTCAAACGTATACAGCGAGCAACAGAACAAGCCTGCCGGGAAGCACAGTCACGAGCTCATCATCAACGTTTAATGACCCGGCCTCAGTGGATGCTCACGCATACGCGCAGAAAGTGTACGACTTCTACAAAAGCAACTTCAATAGAAACAGCATCGACGGAAACGGCCTTGCGATCAGAAGCACGACGCACTACAGCACAAGATACAACAACCCCTTCTGGAACGGCAGCCAAATGGTTTACGGCGATGGCGACGGATCACAGTTTATCGCATTTAGCGGAGACCTGGACGTCGTTGGCCATGAGCTGACACATGGCGTTACGGAGTACACAGCAAACCTGGAATACTATGGCCAGTCAGGCGCCCTTAACGAGAGCATCAGCGACATTTTTGGCAATACGATCGAAGGAAAGAACTGGATGGTCGGCGACGCAATCTACACACCGGGCGTTTCAGGCGATGCACTGAGATATATGGACGACCCGACAAAGGGCGGACAGCCGGCCAGAATGGCGGATTACAATAATACGTCAGCAGATAACGGCGGCGTGCATACAAATAGCGGCATCCCTAACAAAGCATATTACCTGCTTGCGCAAGGAGGAACATTTGGCGGCGTGAATGTTACGGGCATTGGCAGATCACAAGCGATTCAGATCGTTTACAGAGCGCTGACGTACTACCTTACGAGCACGAGCAATTTTAGCAACTACAGAAGCGCAATGGTGCAGGCAAGCACGGATCTGTATGGCGCAAATTCAACACAAACGACGGCGGTCAAGAATAGCCTTTCAGCAGTGGGCATTAACTAA
通过质粒pGX149(AprE-PhuPro1)表达的PhuPro1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：35所示。预测的信号序列以斜体示出，3个添加的残基(AGK)以粗体示出，预测的前肽示出为加下划线的文本。
Figure BDA0000916970520001241
AEANDLAPLGDYTPKLITQATGITGASG DAKVWKFLEKQKRTIVTDDAASADVKELFEITKRQSDSQTGTEHYRLNQTFKGIPVYGAEQTLHFDKSGNVSLYMGQ VVEDVSAKLEASDSKKGVTEDVYASDTKNDLVTPEISASQAISIAEKDAASKIGSLGEAQKTPEAKLYIYAPEDQAA RLAYVTEVNVLEPSPLRTRYFVDAKTGSILFQYDLIEHATGTGKGVLGDTKSFTVGTSGSSYVMTDSTRGKGIQTYTASNRTSLPGSTVTSSSSTFNDPASVDAHAYAQKVYDFYKSNFNRNSIDGNGLAIRSTTHYSTRYNNAFWNGSQMVYGDGDGSQFIAFSGDLDVVGHELTHGVTEYTANLEYYGQSGALNESISDIFGNTIEGKNWMVGDAIYTPGVSGDALRYMDDPTKGGQPARMADYNNTSADNGGVHTNSGIPNKAYYLLAQGGTFGGVNVTGIGRSQAIQIVYRALTYYLTSTSNFSNYRSAMVQASTDLYGANSTQTTAVKNSLSAVGIN
实施例7.3
金属蛋白酶PhuPro1的蛋白水解活性
使用偶氮-酪蛋白(目录号74H7165，美格兹密公司(Megazyme))作为底物，在50mMTris(pH 7)中测定纯化的金属蛋白酶PhuPro1的蛋白水解活性。反应前，用Milli-Q水(密理博公司(Millipore))将酶稀释到特定浓度。将偶氮-酪蛋白溶解于100mM Tris缓冲液(pH7)中，使其最终浓度为1.5％(重量/体积)。为引发反应，将50μl稀释的酶(或只加Milli-Q水作为空白对照)加到置于冰上的非结合96孔微量滴定板(96-MTP)(康宁生命科学(CorningLife Sciences)，目录号3641)中，然后加入50μl 1.5％偶氮-酪蛋白。密封96-MTP后，反应在40℃下以650rpm在Thermomixer(艾本德公司(Eppendorf))中进行10分钟。加入100μl5％三氯乙酸(TCA)终止反应。然后在室温下平衡5分钟，接着在4℃和2000g下离心10分钟，将120μl上清液转移至新的96-MTP中，使用SpectraMax 190在440nm处测定上清液的吸光度(A440)。净A440通过用酶的A440减去空白对照的A440来计算，然后用所得值对应于不同蛋白浓度(从1.25ppm至40ppm)进行作图。每个值均为一式三份测定的平均值。蛋白水解活性示为净A440。用偶氮-酪蛋白作为底物的蛋白水解测定(如图7.2所示)表明PhuPro1为活性蛋白酶。
实施例7.4
金属蛋白酶PhuPro1的pH分布图
用偶氮-酪蛋白作为底物，在不同pH值(pH 4至11)的12.5mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中研究金属蛋白酶PhuPro1的pH分布图。为开始测定，先在置于冰上的96-MTP中将50μl特定pH的25mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液与2μl Milli-Q水稀释的酶(125ppm)混合，然后加入48μl在水中制备的1.5％(重量/体积)偶氮-酪蛋白。按实施例3所述方法来进行反应并分析。每个pH下的酶活性都记录为相对活性，其中最适pH下的活性设为100％。所测试的pH值为4、5、6、7、8、9、10和11。每个值均为一式三份测定的平均值。如图7.3所示，PhuPro1的最适pH为约6，在pH 5和pH8之间保持最大活性的70％以上。
实施例7.5
金属蛋白酶PhuPro1的温度分布图
使用偶氮-酪蛋白测定法在50mM Tris缓冲液(pH 7)中分析金属蛋白酶PhuPro1的温度分布图。按实施例7.3所述方法制备酶样品和偶氮-酪蛋白底物。反应前，在200μl PCR管中混合50μl 1.5％偶氮-酪蛋白和45μl Milli-Q水，然后将PCR管放在Peltier热循环仪(伯乐公司(BioRad))中，在所需温度(即20℃至90℃)下温育5分钟。温育之后，将5μl稀释的酶(50ppm)或水(空白对照)加入底物混合物中，反应在Peltier热循环仪中不同温度下进行10分钟。为终止反应，将每个测定混合物转移到每孔包含100μl 5％TCA的96-MTP中。随后按实施例7.3中所述方法进行离心和吸光度测定。活性记录为相对活性，其中最适温度下的活性设为100％。所测试的温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。每个值均为一式两份测定的平均值(该值变化不超过5％)。图7.4中的数据表明，PhuPro1在60℃下表现为最适温度，并且在45℃和65℃之间保持其最大活性的70％以上。
实施例7.6
金属蛋白酶PhuPro1的清洁性能
使用模型自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂，在pH 6和pH 8下用PA-S-38(含有颜料的蛋黄，通过加热老化)微布样(荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT-Vlaardingen,TheNetherlands))来测试PhuPro1的清洁性能。反应前，用稀释溶液(包含10mM NaCl、0.1mMCaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520001251
80和10％丙二醇)将纯化的蛋白酶样品稀释到所需浓度。在100ppm水硬度(Ca2+:Mg2+＝3:1)的AT洗涤剂中进行反应(洗涤剂组成如表7.1所示)。为引发反应，将180μl在pH 6或pH 8下缓冲的AT洗涤剂加到放置有PA-S-38微布样的96-MTP中，然后加入20μl稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，使其在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中温育30分钟。温育之后，将每个孔中的100μl洗涤液转移至新的96-MTP中，使用分光光度计在405nm处测定其吸光度(这里称为“初始性能”)。弃去96-MTP中剩下的洗涤液，用200μl水漂洗微布样一次。然后加入180μl 0.1M CAPS缓冲液(pH 10)，在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中再次温育10分钟。将100μl所得洗涤液转移至新的96-MTP中，在405nm处测定其吸光度(这里称为“洗脱性能”)。两次吸光度测量值之和(“初始性能”加上“洗脱性能”)即为“总性能”，“总性能”用于衡量蛋白酶作用于模型污渍的活性；然后用酶的A405减去空白对照的“总性能”的A405计算净A405。pH 6和pH 8下，PhuPro1在AT洗涤剂中清洁PA-S-38微布样的剂量响应在图7.5A和图7.5B中示出。
表7.1：AT洗涤剂的组成
Figure BDA0000916970520001261
*AT制剂洗涤剂的pH通过添加0.9M柠檬酸来调节至所需值(pH 6或pH 8)。
实施例7.7
PhuPro1与其他蛋白酶的比较
A.同源蛋白酶的鉴定
通过与NCBI非冗余蛋白质数据库和Genome Quest专利数据库比对进行BLAST检索(Altschul等人，Nucleic Acids Res，第25卷，第3389-3402页，1997年)(检索参数设为默认值)来鉴定同源物。用PhuPro1的预测的成熟蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：33)作为查询序列。两种检索设置的同一性百分比(PID)被定义为相同残基的数量除以逐对比对中所比对残基的数量。表7.2A和表7.2B提供了与PhuPro1具有百分比同一性的序列列表。表7.2中的长度指同源蛋白酶的全序列长度。
Figure BDA0000916970520001271
Figure BDA0000916970520001272
B.同源蛋白酶序列的比对
使用默认参数下的CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research，第22卷，第4673-4680页，1994年)将预测的成熟PhuPro1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)与蛋白酶T(P00800，嗜热溶蛋白芽孢杆菌)和来源于土地类芽孢杆菌HPL-003的蛋白酶(YP_005073223.1)进行比对。图7.6示出了PhuPro1与这些蛋白酶序列的比对。
C.系统发育树
使用表2A中的代表性同源物的序列和邻接法(NJ)(Saitou,N.和Nei,M.，1987年，The neighbor-joining method:a new method for reconstructing GuideTrees.MolBiol.Evol.，第4卷，第406-425页)来构建PhuPro1的全长序列(SEQ ID NO：2)的系统发育树。NJ法基于被分析的所有序列对之间的距离矩阵而工作。这些距离与序列之间的趋异度相关。使用进化树-系统发育树绘制软件(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html)显示图7.7所示的系统发育树。
实施例7.8
PhuPro1的Terg-o-Tometer性能评估
使用Terg-o-Tometer(新泽西州费尔菲尔德的仪器营销服务有限公司(Instrument Marketing Services,Inc,Fairfield,NJ))在衣物洗涤剂应用中测试PhuPro1的洗涤性能。在32℃和16℃下进行性能评估。污垢负载由以下污渍布样各二组成：血、奶、墨污染的棉布(EMPA116)(瑞士圣加仑的测试材料股份公司(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland))，血、奶、墨污染的涤棉布(polycotton)(EMPA117)(瑞士圣加仑的测试材料股份公司(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland))，可可污染的棉布(EMPA112)(瑞士圣加仑的测试材料股份公司(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland))，以及颜料、油、奶成分污染的棉布(CFT C-10)(荷兰弗拉尔丁恩的测试材料中心私人有限公司(Center for Testmaterials BV,Vlaardingen,Netherlands))，另外还加上白色双罗纹针织物，从而使Terg-o-Tometer每个量杯的总织物负载为40g，所述量杯装有1L的去离子水。将水硬度调节至6格令/加仑，用5mM HEPES(pH8.2)缓冲量杯中的pH值。热灭活的Tide Regular HDL(宝洁公司(Procter&Gamble))——从美国当地超市购买的商业液体洗涤剂——以0.8g/L的浓度使用。使用前将洗涤剂灭活，处理方法是在92℃下水浴2至3小时，然后冷却至室温。商业洗涤剂的热灭活可破坏酶组分的活性，同时保留非酶组分的特性。使用用于测量蛋白酶活性的Suc-AAPF-pNA测定法来测量经加热灭活的洗涤剂中的酶活性。将
Figure BDA0000916970520001281
Prime HA(杰能科有限公司(Genencor Intl))和PhuPro1蛋白酶各自都加至最终浓度为1ppm。不含酶的对照样品包括在内。洗涤时间为12分钟。洗涤处理之后，将所有布样漂洗3分钟，并在低热下用机器干燥。
处理前后，使用Tristimulus Minolta Meter CR-400测定每一类布样各四块的光反射率。将L、a和b值的差转换为如由CIE-LAB色空间定义的总色差(dE)。污渍的清洁表示为去污指数百分比(％SRI)，具体地：通过取洗涤前后的色差比，并且将此色差比与未洗涤的污垢(洗涤之前)和未污染的织物的色差进行比较，对通过读取每个洗涤布样的两个不同区域获得的8个值取平均值。32℃下PhuPro1和
Figure BDA0000916970520001291
Prime HA蛋白酶的清洁性能在表7.8A和图7.8A中示出，16℃下PhuPro1和
Figure BDA0000916970520001292
Prime HA蛋白酶的清洁性能在表7.8B和图7.8B中示出。
Figure BDA0000916970520001293
Figure BDA0000916970520001294
Figure BDA0000916970520001301
实施例8.1
解淀粉类芽孢杆菌金属蛋白酶PamPro1的克隆
选择解淀粉类芽孢杆菌菌株(DSM11747)作为可用于各种工业应用中的酶的可能来源。为获得用于测序的基因组DNA，首先在37℃下使菌株在心脏浸液琼脂平板(Difco)上生长24小时。从平板上刮下细胞材料，用Zymo公司的ZF真菌/细菌DNA小量制备试剂盒(目录号D6005)从该细胞材料中制备基因组DNA。该基因组DNA用于基因组测序。解淀粉类芽孢杆菌菌株的全基因组由BaseClear(荷兰莱顿(Leiden,The Netherlands))使用Illumina新一代测序技术进行测序。对数据进行拼接后，通过BioXpr(比利时那慕尔(Namur,Belgium))对重叠群进行注释。在解淀粉类芽孢杆菌中进行注释后所鉴定的基因之一编码金属蛋白酶，并且该基因(命名为PamPro1)的序列以SEQ ID NO：36提供。由PamPro1基因编码的相应蛋白质如SEQ ID NO：37所示。该蛋白在N端具有长度为25个氨基酸的信号肽，如通过SignalP4.0版(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785-786(Nordahl Petersen等人，2011年，《自然方法》，第8卷，第785-786页))所预测的。信号序列的存在表明PamPro1为分泌性酶。基于PamPro1与多粘类芽孢杆菌的Npr蛋白(Takekawa等人，1991年，Journalof Bacteriology，第173卷，第21期，第6820-6825页)的蛋白序列比对，预测了PamPro1的前肽区。预测的PamPro1蛋白成熟区如SEQ ID NO：3所示。
从解淀粉类芽孢杆菌中分离的PamPro1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：36所示。编码预测的天然信号肽的序列以斜体示出：
Figure BDA0000916970520001311
Figure BDA0000916970520001312
AATCCATTCCACTTCAGGCCCCTTATGCCTCTGAGGGGGGTATTCCATTGAACAGTGGAACAGATGACACTA
Figure BDA0000916970520001314
TTATCTTGGACAGCAGGAACAATTTCTGAATTCCGATGTGAAATCCCAGCTCAAAATTGTCAAAAGAAACACAGATACATCTGGCGTAAGACACTTCCGCCTGAAACAGTATATTAAAGGTATCCCGGTTTATGGTGCAGAACAGACGGTCCACCTGGACAAAACCGGA
Figure BDA0000916970520001315
AGCTCCGCACTTGGCGATCTTCCACCGATTGAAGAGCAGGCCATTCCGAATGATGGTGTAGCCGAGATCAGCGGAGAAGACGCGATCCAGATTGCAACCGAAGAAGCAACCTCCCGGATTGGAGAGCTTGGTGCCGCGGAAATCACGCCTCAAGCTGAATTGAACATCTATCATCATGAAGAAGATGGTCAGACATA
Figure BDA0000916970520001316
AACGTACTGGAACCTGCCCCTC
Figure BDA0000916970520001317
AAATATTTCATTAACGCAGTGGATGGCAGTATC
Figure BDA0000916970520001313
ATCCCAGTTTGACCTCATTAACTTCGCTACTGGAACAGGTACAGGTGTACTCGGTGATACCAAAACCCTGACAACCACCCAATCCGGCAGCACCTTCCAACTGAAAGACACCACTCGTGGCAATGGCATCCAAACGTATACGGCAAACAATGGCTCCTCACTGCCTGGTAGCTTGCTTACAGATTCGGATAATGTATGGACCGATCGTGCAGGTGTAGATGCTCATGCTCATGCCGCTGCTACGTATGATTTCTACAAAAACAAATTCAACCGTAACGGTATTAATGGTAACGGATTGTTGATCAGATCAACCGTGCACTACGGCTCCAATTACAATAACGCCTTCTGGAACGGGGCACAGATTGTCTTTGGTGACGGAGATGGAACGATGTTCCGATCCCTGTCTGGTGATCTGGATGTTGTGGGTCATGAATTGACGCATGGTGTTATTGAATATACAGCCAATCTGGAATATCGCAATGAACCAGGTGCACTCAATGAAGCCTTTGCCGATATTTTCGGTAATACGATCCAAAGCAAAAACTGGCTGCTCGGTGATGATATCTACACACCTAACACTCCAGGAGATGCGCTGCGCTCCCTCTCCAACCCTACATTGTATGGTCAACCTGACAAATACAGCGATCGCTACACAGGCTCACAGGACAACGGCGGTGTCCATATCAACAGTGGTATCATCAATAAAGCCTATTTCCTTGCTGCTCAAGGCGGAACACATAATGGTGTGACTGTTACCGGAATCGGCCGGGATAAAGCGATCCAGATTTTCTACAGCACACTGGTGAACTACCTGACACCAACGTCCAAATTTGCCGCTGCCAAAACAGCTACCATTCAAGCAGCCAAAGATCTGTACGGAGCAACTTCCGCTGAAGCTACTGCTATTACCAAAGCATATCAAGCTGTAGGCCTG
PamPro1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示。预测的信号序列以斜体示出，预测的前肽示出为加下划线的文本：
Figure BDA0000916970520001321
APVSDQSIPLQAPYASEGGIPLNSGTDDTIFNYLGQQ EQFLNSDVKSQLKIVKRNTDTSGVRHFRLKQYIKGIPVYGAEQTVHLDKTGAVSSALGDLPPIEEQAIPNDGVAEIS GEDAIQIATEEATSRIGELGAAEITPQAELNIYHHEEDGQTYLVYITEVNVLEPAPLRTKYFINAVDGSIVSQFDLI NFATGTGTGVLGDTKTLTTTQSGSTFQLKDTTRGNGIQTYTANNGSSLPGSLLTDSDNVWTDRAGVDAHAHAAATYDFYKNKFNRNGINGNGLLIRSTVHYGSNYNNAFWNGAQIVFGDGDGTMFRSLSGDLDVVGHELTHGVIEYTANLEYRNEPGALNEAFADIFGNTIQSKNWLLGDDIYTPNTPGDALRSLSNPTLYGQPDKYSDRYTGSQDNGGVHINSGIINKAYFLAAQGGTHNGVTVTGIGRDKAIQIFYSTLVNYLTPTSKFAAAKTATIQAAKDLYGATSAEATAITKAYQAVGL
预测的PamPro1成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示：
ATGTGTGVLGDTKTLTTTQSGSTFQLKDTTRGNGIQTYTANNGSSLPGSLLTDSDNVWTDRAGVDAHAHAAATYDFYKNKFNRNGINGNGLLIRSTVHYGSNYNNAFWNGAQIVFGDGDGTMFRSLSGDLDVVGHELTHGVIEYTANLEYRNEPGALNEAFADIFGNTIQSKNWLLGDDIYTPNTPGDALRSLSNPTLYGQPDKYSDRYTGSQDNGGVHINSGIINKAYFLAAQGGTHNGVTVTGIGRDKAIQIFYSTLVNYLTPTSKFAAAKTATIQAAKDLYGATSAEATAITKAYQAVGL
实施例8.2
解淀粉类芽孢杆菌金属蛋白酶PamPro1的表达
由中国上海捷瑞公司(Generay,Shanghai,China)合成PamPro1的前肽-成熟形式的DNA序列，并将其插入枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz，Protein ExprPurif，第55卷，第40-52页，2007年)中，得到质粒pGX146(AprE-PamPro1)(图1)。将此编码PamPro1蛋白的基因连接到酶切后的载体中，使得在枯草芽孢杆菌AprE信号序列的3’端和预测的PamPro1天然前肽5’端之间添加了3个密码子(Ala-Gly-Lys)。该基因具有替代起始密码子(GTG)。图8.1显示所得质粒，标记的pGX146(AprE-PamPro1)包含AprE启动子、AprE信号序列以及合成的核苷酸序列，该AprE信号序列用于引导枯草芽孢杆菌中的靶蛋白分泌，该合成的核苷酸序列编码预测的PamPro1前肽和成熟区(SEQ ID NO：39)。合成的AprE-PamPro1基因的翻译产物如SEQ ID NO：40所示。
然后将pGX146(AprE-PamPro1)质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32,ΔscoC)中，接着将转化的细胞涂布在补充有5ppm氯霉素和1.2％脱脂奶粉(目录号232100，Difco)的Luria琼脂平板上。选择平板上具有最大透明晕圈的菌落，将其置于装有MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基，还补充有另外5mM CaCl2)的250ml摇瓶中进行发酵。
然后浓缩摇瓶中的发酵液，并使用VivaFlow 200超滤装置(赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim))将该发酵液进行缓冲液交换，交换到包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM CaCl2和10％丙二醇的上样缓冲液中。过滤之后，将该样品加到用上述上样缓冲液预平衡的80ml Q琼脂糖高效柱中，并收集和浓缩流过的活性级分。将该样品上样到用上述上样缓冲液(包含0.15M NaCl)预平衡的320ml Superdex 75凝胶过滤柱中。进一步合并纯化的相应活性蛋白级分，然后通过10K Amicon Ultra进行浓缩，以供后续分析使用。
质粒pGX146(AprE-PamPro1)中的合成的PamPro1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：39所示。编码3个添加的残基(AGK)的序列以粗体示出：
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCT
Figure BDA0000916970520001331
GCTCCGGTTAGCGACCAGTCAATCCCTCTTCAAGCACCGTATGCCAGCGAAGGAGGCATTCCGCTTAACAGCGGCACGGACGACACGATTTTCAATTACCTGGGCCAACAGGAGCAGTTCCTGAACAGCGACGTCAAGAGCCAGCTGAAGATCGTCAAAAGAAACACAGACACATCAGGCGTGAGACACTTCAGACTGAAGCAATACATCAAGGGCATCCCGGTTTATGGCGCTGAACAAACGGTTCACCTGGACAAAACAGGCGCAGTTTCATCAGCACTGGGAGATCTGCCGCCGATTGAAGAGCAAGCAATCCCGAATGATGGAGTTGCGGAAATTAGCGGCGAGGATGCAATCCAAATCGCGACGGAGGAGGCTACATCAAGAATTGGAGAACTTGGCGCAGCGGAGATTACACCGCAGGCTGAACTGAACATCTATCACCATGAGGAAGACGGCCAGACGTACCTGGTTTACATTACGGAAGTGAACGTGCTGGAACCGGCACCTCTGAGAACAAAGTACTTTATCAACGCGGTTGACGGCAGCATCGTCTCACAGTTCGACCTGATTAACTTCGCCACGGGAACAGGAACGGGCGTTCTTGGAGACACAAAGACGCTGACGACGACGCAGTCAGGCAGCACATTCCAGCTGAAGGACACAACAAGAGGCAACGGCATCCAAACGTACACGGCGAACAATGGATCATCACTGCCGGGCTCACTGCTGACGGATTCAGATAACGTGTGGACGGATAGAGCTGGCGTTGACGCGCATGCTCACGCTGCTGCGACGTACGACTTCTACAAGAACAAGTTCAACAGAAACGGCATTAACGGAAATGGCCTGCTGATCAGAAGCACGGTGCATTATGGCTCAAACTACAACAACGCTTTTTGGAACGGCGCACAGATCGTGTTTGGCGACGGCGATGGCACAATGTTTAGAAGCCTGTCAGGAGACCTGGATGTGGTGGGCCACGAACTGACGCACGGCGTGATCGAGTATACGGCGAACCTTGAATATAGAAACGAGCCGGGAGCACTGAATGAGGCGTTCGCGGACATTTTCGGCAACACAATCCAGAGCAAAAACTGGCTGCTGGGCGACGATATCTATACACCGAACACACCGGGCGATGCACTGAGATCACTGTCAAATCCGACGCTGTATGGCCAACCGGATAAGTACTCAGACAGATATACGGGCAGCCAAGACAATGGCGGCGTTCACATCAACTCAGGCATCATCAACAAGGCTTACTTCCTTGCGGCCCAAGGAGGAACACATAACGGCGTTACAGTTACAGGCATTGGCAGAGACAAGGCGATCCAGATCTTTTACAGCACGCTGGTGAACTACCTGACACCTACGTCAAAGTTTGCCGCAGCGAAAACAGCAACAATTCAGGCGGCTAAAGACCTGTACGGAGCGACATCAGCCGAGGCCACAGCAATTACAAAAGCATATCAAGCAGTTGGCCTTTAA
通过质粒pGX146(AprE-PamPro1)表达的PamPro1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：40所示。预测的信号序列以斜体示出，3个添加的残基(AGK)以粗体示出，预测的前肽示出为加下划线的文本。
Figure BDA0000916970520001341
APVSDQSIPLQAPYASEGGIPLNSGTDD TIFNYLGQQEQFLNSDVKSQLKIVKRNTDTSGVRHFRLKQYIKGIPVYGAEQTVHLDKTGAVSSALGDLPPIEEQAI PNDGVAEISGEDAIQIATEEATSRIGELGAAEITPQAELNIYHHEEDGQTYLVYITEVNVLEPAPLRTKYFINAVDG SIVSQFDLINFATGTGTGVLGDTKTLTTTQSGSTFQLKDTTRGNGIQTYTANNGSSLPGSLLTDSDNVWTDRAGVDAHAHAAATYDFYKNKFNRNGINGNGLLIRSTVHYGSNYNNAFWNGAQIVFGDGDGTMFRSLSGDLDVVGHELTHGVIEYTANLEYRNEPGALNEAFADIFGNTIQSKNWLLGDDIYTPNTPGDALRSLSNPTLYGQPDKYSDRYTGSQDNGGVHINSGIINKAYFLAAQGGTHNGVTVTGIGRDKAIQIFYSTLVNYLTPTSKFAAAKTATIQAAKDLYGATSAEATAITKAYQAVGL
实施例8.3
金属蛋白酶PamPro1的蛋白水解活性
使用偶氮-酪蛋白(目录号74H7165，美格兹密公司(Megazyme))作为底物，在50mMTris(pH 7)中测定纯化的金属蛋白酶PamPro1的蛋白水解活性。反应前，用Milli-Q水(密理博公司(Millipore))将酶稀释到特定浓度。将偶氮-酪蛋白溶解于100mM Tris缓冲液(pH7)中，使其最终浓度为1.5％(重量/体积)。为引发反应，将50μl稀释的酶(或只加Milli-Q水作为空白对照)加到置于冰上的非结合96孔微量滴定板(96-MTP)(康宁生命科学(CorningLife Sciences)，目录号3641)中，然后加入50μl 1.5％偶氮-酪蛋白。密封96-MTP后，反应在40℃下以650rpm在Thermomixer(艾本德公司(Eppendorf))中进行10分钟。加入100μl5％三氯乙酸(TCA)终止反应。在室温下平衡5分钟后，接着在4℃和2000g下离心10分钟，然后将120μl上清液转移至新的96-MTP中，使用SpectraMax 190在440nm处测定上清液的吸光度(A440)。净A440通过用酶的A440减去空白对照的A440来计算，然后用所得值对应于不同蛋白浓度(从1.25ppm至40ppm)进行作图。每个值均为一式三份测定的平均值。蛋白水解活性示为净A440。用偶氮-酪蛋白作为底物的蛋白水解测定(如图8.2所示)表明PamPro1为活性蛋白酶。
实施例8.4
金属蛋白酶PamPro1的pH分布图
用偶氮-酪蛋白作为底物，在不同pH值(pH 4至11)的12.5mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中研究金属蛋白酶PamPro1的pH分布图。为开始测定，先在置于冰上的96-MTP中将50μl特定pH的25mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液与2μl Milli-Q水稀释的酶(125ppm)混合，然后加入48μl在水中制备的1.5％(重量/体积)偶氮-酪蛋白。按实施例8.3所述方法来进行反应并分析。每个pH下的酶活性都记录为相对活性，其中最适pH下的活性设为100％。所测试的pH值为4、5、6、7、8、9、10和11。每个值均为一式三份测定的平均值。如图8.3所示，PamPro1的最适pH为约8，在pH 7和pH 9.5之间保持最大活性的70％以上。
实施例8.5
金属蛋白酶PamPro1的温度分布图
使用偶氮-酪蛋白测定法在50mM Tris缓冲液(pH 7)中分析金属蛋白酶PamPro1的温度分布图。按实施例8.3所述方法制备酶样品和偶氮-酪蛋白底物。反应前，在200μl PCR管中混合50μl 1.5％偶氮-酪蛋白和45μl Milli-Q水，然后将PCR管放在Peltier热循环仪(伯乐公司(BioRad))中，在所需温度(即20℃至90℃)下温育5分钟。温育之后，将5μl稀释的酶(50ppm)或水(空白对照)加入底物混合物中，反应在Peltier热循环仪中不同温度下进行10分钟。为终止反应，将每个测定混合物转移到每孔包含100μl 5％TCA的96-MTP中。随后按实施例8.3中所述方法进行离心和吸光度测定。活性记录为相对活性，其中最适温度下的活性设为100％。所测试的温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。每个值均为一式两份测定的平均值(该值变化不超过5％)。图8.4中的数据表明，PamPro1在约50℃下表现为最适温度，并且在45℃和55℃之间保持其最大活性的70％以上。
实施例8.6
金属蛋白酶PamPro1的清洁性能
使用模型自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂，在pH 6和pH 8下用PA-S-38(含有颜料的蛋黄，通过加热老化)微布样(荷兰弗拉尔丁恩的CFT公司(CFT-Vlaardingen,TheNetherlands))来测试PamPro1的清洁性能。反应前，用稀释溶液(包含10mM NaCl、0.1mMCaCl2、0.005％
Figure BDA0000916970520001362
80和10％丙二醇)将纯化的蛋白酶样品稀释到所需浓度。在100ppm水硬度(Ca2+:Mg2+＝3:1)的AT洗涤剂中进行反应(洗涤剂组成如表8.1所示)。为引发反应，将180μl在pH 6或pH 8下缓冲的AT洗涤剂加到放置有PA-S-38微布样的96-MTP中，然后加入20μl稀释的酶(或加入稀释溶液作为空白对照)。密封96-MTP，使其在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中温育30分钟。温育之后，将每个孔中的100μl洗涤液转移至新的96-MTP中，使用分光光度计在405nm处测定其吸光度(这里称为“初始性能”)。弃去96-MTP中剩下的洗涤液，用200μl水漂洗微布样一次。然后加入180μl 0.1M CAPS缓冲液(pH 10)，在50℃和1150rpm的培养箱/摇床中再次温育10分钟。将100μl所得洗涤液转移至新的96-MTP中，在405nm处测定其吸光度(这里称为“洗脱性能”)。两次吸光度测量值之和(“初始性能”加上“洗脱性能”)即为“总性能”，“总性能”用于衡量蛋白酶作用于模型污渍的活性；然后用酶的A405减去空白对照的“总性能”的A405计算净A405。pH 6和pH 8下，PamPro1在AT盘碟洗涤剂中清洁PA-S-38微布样的剂量响应在图5A和图5B中示出。
表8.1：含有漂白剂的AT盘碟洗涤剂制剂的组成
Figure BDA0000916970520001361
*AT制剂洗涤剂的pH通过添加0.9M柠檬酸来调节至所需值(pH 6或pH 8)。
实施例8.7
PamPro1与其他蛋白酶的比较
A.同源蛋白酶的鉴定
通过与NCBI非冗余蛋白质数据库和Genome Quest专利数据库比对进行BLAST检索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389-402,1997(Altschul等人，NucleicAcids Res，第25卷，第3389-3402页，1997年))(检索参数设为默认值)来鉴定同源物。用PamPro1的预测的成熟蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：38)作为查询序列。两种检索设置的同一性百分比(PID)被定义为相同残基的数量除以逐对比对中所比对残基的数量。表8.2A和表8.2B提供了与PamPro1具有百分比同一性的序列列表。表8.2中的长度指同源蛋白酶的全序列长度。
Figure BDA0000916970520001371
Figure BDA0000916970520001372
Figure BDA0000916970520001381
B.同源蛋白酶序列的比对
使用默认参数下的CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research，第22卷，第4673-4680页，1994年)将预测的成熟PamPro1的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)与嗜热菌蛋白酶(P00800，嗜热溶蛋白芽孢杆菌)和来源于皮尔瑞俄类芽孢杆菌KCTC 3763的蛋白酶(YP_005073223.1)进行比对。图8.6示出了PamPro1与这些蛋白酶序列的比对。
C.系统发育树
使用表8.2A中的代表性同源物的序列和邻接法(NJ)(Saitou,N.和Nei,M.，1987年，The neighbor-joining method:a new method for reconstructing GuideTrees.MolBiol.Evol.，第4卷，第406-425页)来构建PamPro1的全长序列(SEQ ID NO：37)的系统发育树。NJ法基于被分析的所有序列对之间的距离矩阵而工作。这些距离与序列之间的趋异度相关。使用进化树-系统发育树绘制软件(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html)显示图8.7所示的系统发育树。
实施例9
各种类芽孢杆菌金属蛋白酶与其他细菌金属蛋白酶同源物的比较
A.同源蛋白酶序列的比对
使用默认参数下的CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research，第22卷，第4673-4680页，1994年)将实施例1.1至实施例8.7中所述类芽孢杆菌蛋白酶的预测的成熟序列的氨基酸序列与相关的细菌金属蛋白酶进行比对。图9.1示出了各种类芽孢杆菌金属蛋白酶与其他细菌金属蛋白酶同源物的比对。
B.系统发育树
使用邻接法(NJ)(Saitou,N.和Nei,M.，1987年，The neighbor-joining method:anew method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.，第4卷，第406-425页)构建了图9.1中所比对的金属蛋白酶的全长序列的系统发育树。NJ法基于被分析的所有序列对之间的距离矩阵而工作。这些距离与序列之间的趋异度相关。使用进化树-系统发育树绘制软件(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html)显示图9.2所示的系统发育树，其中可以观察到类芽孢杆菌属序列的聚类。
虽然本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的，这些实施方案仅以举例方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员可以设想出各种变型、更改和替代形式。应理解的是，本文描述的本发明实施方案的各种替代形式可用于实践本发明。本发明的范围旨在通过以下权利要求来限定，并且由此涵盖落入这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims (20)

1.一种多肽，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性，
其中所述多肽来源于类芽孢杆菌属物种湖南类芽孢杆菌(Paenibacillushunanensis)，
其中所述多肽为金属蛋白酶且在洗涤剂组合物中具有清洁活性。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽具有蛋白酶活性，所述蛋白酶活性包括酪蛋白水解、胶原蛋白水解、弹性蛋白水解、角蛋白水解、大豆蛋白水解或玉米粗粉蛋白水解。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽在pH 4.5和pH8之间和/或在45℃和65℃之间保持其最大活性的至少50％。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽为重组多肽。
5.一种组合物，所述组合物包含根据前述权利要求1-4中任一项所述的多肽。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物为清洁组合物或洗涤剂组合物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述洗涤剂组合物选自衣物洗涤剂、织物软化洗涤剂、盘碟洗涤剂以及硬表面清洁洗涤剂。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含表面活性剂、至少一种钙离子和/或锌离子、至少一种稳定剂、0.001重量％至0.1重量％的所述多肽、至少一种漂白剂、至少一种辅助成分和/或一种或多种附加的酶或酶衍生物，所述附加的酶或酶衍生物选自酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切β-1,4葡聚糖酶、内切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶、附加的金属蛋白酶以及它们的组合。
9.根据权利要求5至7中任一项所述的组合物，其中所述清洁组合物含有磷酸或为无磷酸的。
10.根据权利要求5至7中任一项所述的组合物，其中所述组合物为固体、液体、凝胶状或糊剂状组合物。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物为颗粒状、粉状、棒状、或片状组合物。
12.一种清洁方法，所述方法包括使表面或物品与包含根据权利要求1至4中任一项所述的多肽的清洁组合物接触。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述物品为盘碟或织物。
14.一种用于产生根据权利要求1至4中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括：
a.用表达载体稳定转化宿主细胞，所述表达载体包含编码根据权利要求1至4中任一项所述的多肽的多核苷酸；
b.在适于所述宿主细胞产生所述多肽的条件下培养所述转化的宿主细胞；以及
c.回收所述多肽。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达载体包含SEQ ID NO:34的多核苷酸序列。
16.一种核酸序列，所述核酸序列编码权利要求1-4任一项的多肽。
17.权利要求16的核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:34的多核苷酸序列。
18.一种载体，所述载体包含根据权利要求16或17所述的核酸序列。
19.一种宿主细胞，所述宿主细胞用根据权利要求18所述的载体转化。
20.一种纺织品加工组合物、动物饲料组合物、皮革加工组合物、羽毛加工组合物、或玉米大豆蛋白加工组合物，所述组合物包含根据权利要求1至4中任一项所述的多肽。
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