KR20110015004A

KR20110015004A - 변이체 미생물 프로테아제를 포함하는 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20110015004A
Application number: KR1020107027315A
Authority: KR
Inventors: 빅토르 유리에비치 알렉세예프; 루이스 지 카스카오-페레이라; 제임스 티 주니어 켈리스; 알렉산더 피사르치크
Original assignee: 다니스코 유에스 인크.
Priority date: 2008-06-06
Filing date: 2009-06-03
Publication date: 2011-02-14
Also published as: CN104130993A; WO2009149200A3; EP2947147A3; EP2297316A2; CN103382421B; EP2578679A1; ZA201008169B; CN104694519B; US20110256609A1; MX350188B; CN104130993B; EP2578680A1; RU2010154103A; JP2013240327A; WO2009149144A2; RU2541786C2; US20150064767A1; WO2009149145A2; EP2647701A3; DK2578680T3

Abstract

본 발명은 변이체 서브틸리신 및 본원에서 언급된 하나 이상의 변이체 서브틸리신을 포함하는 조성물 뿐 아니라, 상기 변이체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 세탁 세정 적용에 적합한 변이체 프로테아제를 제공한다.
[대표도]
도 2

Description

변이체 미생물 프로테아제를 포함하는 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING VARIANT MICROBIAL PROTEASES}

본 발명은 변이체 서브틸리신 및 본원에서 언급된 하나 이상의 변이체 서브틸리신을 포함하는 조성물 뿐 아니라, 상기 변이체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다.

세린 프로테아제는 넓은 범위의 특이성 및 생물학적 기능을 갖는 다양한 계열의 효소를 포함하는 카르보닐 히드롤라아제의 하위그룹이다. 서브틸리신이 세정 및 사료 적용에서의 유용성이 크기 때문에 이에 대해 많은 연구가 수행되어 왔다. 부가적인 연구는 다양한 적용에서 이들 효소의 기능에 악영향을 미칠 수 있는 불리한 환경 조건 (예를 들어, 산화제, 킬레이트제, 및/또는 극한 온도 및/또는 pH 에 대한 노출) 에 초점을 두고 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 열악한 조건에 대항할 수 있고, 현행 당업계에 공지된 것보다 개선된 활성을 보유하거나 갖는 효소계에 대한 필요가 남아있다.

본 발명은 변이체 서브틸리신 및 본원에서 언급된 하나 이상의 변이체 서브틸리신을 포함하는 조성물 뿐 아니라, 상기 변이체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 세탁 세정 적용에 적합한 변이체 프로테아제를 제공한다.

본 발명은, 하나 이상의 개질이 G100C, S101D, S101H, Q103D, M124G, L126G, S132H, S161N, Q275Z, 및/또는

로부터 선택되는 1 개 이상의 개질 세트로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 하나 이상의 개질을 포함하는 서브틸리신 변이체를 제공한다.

또한 본 발명은, 개질 세트가

로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 1 개 이상의 개질 세트를 포함하는 서브틸리신 변이체를 제공한다.

또한 본 발명은 개질 세트가

로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 1 개의 개질 세트를 포함하는 서브틸리신 변이체를 제공한다.

또한 본 발명은 개질 세트가

또한 본 발명은 치환 Y217L 및 추가로 상기 제공된 임의의 개질 세트 중 1 세트 이상을 포함하고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 서브틸리신 변이체를 제공한다. 본 발명은 치환 G97A/G128A/Y217Q 및 추가로 상기 제공된 임의의 개질 세트 중 하나 이상의 개질을 포함하고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 서브틸리신 변이체를 제공한다.

또한 본 발명은 본원에서 제공되는 바와 같은 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 세정 조성물을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 조성물은 세탁 세제이다. 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 세탁 세제는 강력 (heavy duty) 액체 세탁 세제이다. 일부 대안적인 구현예에서, 세정 조성물은 식기 세제이다. 일부 추가의 구현예에서, 세정 조성물은 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀루라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 말라나아제, β-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 및 아밀라아제, 또는 이의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부가적인 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 일부 추가의 구현예에서, 세정 조성물은 하나 이상의 안정화제를 추가로 포함한다. 또다른 일부 부가적인 구현예에서, 세정 조성물은 본원에서 제공되는 하나 이상의 임의의 서브틸리신 변이체 0.0001 중량% 이상, 및 임의로, 하나 이상의 적합한 보조 성분을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 하기 단계 a) 및 b) 를 포함하는 세정 방법을 포함한다: a) 섬유를 포함하는 표면 및/또는 물품을 본원에 언급된 하나 이상의 세정 조성물과 접촉시키는 단계; 및 b) 임의로 상기 표면 또는 물품을 세정 및/또는 헹구는 단계.

또한 본 발명은 본원에서 제공되는 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 동물 사료 뿐 아니라, 본원에서 제공되는 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 식품 가공 조성물을 제공한다.

도 1 은 프레임에 맞는 결실 및 삽입을 제작하기 위해 사용되는 방법을 설명하는 도식을 나타낸다. 라이브러리를 치환을 가진 클론 33%; 삽입을 가진 클론 33% 및 결실을 가진 클론 33% 를 갖는 것으로 디자인하였다.
도 2A 는 pAC-FNA10 의 플라스미드 맵이다. 플라스미드 요소는 다음과 같다: pUB110 = 플라스미드 pUB110 으로부터의 DNA 조각 (McKenzie et al, Plasmid 15:93-103 [1986], pBR322 = 플라스미드 pBR322 로부터의 DNA 조각 (Bolivar et al, Gene 2:95-113 [1977]), pC194 = 플라스미드 pC194 로부터의 DNA 조각 (Horinouchi and Weisblum, J. Bacteriol 150:815-825 [1982]).
도 2B 는 pHPLT-FNA 의 맵을 제공한다.
도 2C 는 pHPLT-BPN 의 맵을 제공한다. 벡터 pHPLT 는 LAT 프로모터 (PLAT) 인 LAT 신호 펩티드를 코딩하는 서열 (preLAT) 을 함유한다. 복제 및 neoR 의 기원은 플라스미드 pUB110 으로부터 유래된다.

본 발명은 변이체 서브틸리신 및 본원에서 언급된 하나 이상의 변이체 서브틸리신을 포함하는 조성물 뿐 아니라, 상기 변이체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다. 상기 변이체 서브틸리신을 제조하기 위한 본 발명의 전구체 프로테아제의 개질에는 하나 이상의 치환, 하나 이상의 결실, 또는 하나 이상의 삽입이 포함된다. 일부 구현예에서, 개질은 돌연변이의 조합을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 개질에는 하나 이상의 치환 및 하나 이상의 결실의 조합이 포함된다. 일부 기타 구현예에서, 개질에는 하나 이상의 치환 및 하나 이상의 삽입의 조합이 포함된다. 일부 추가의 구현예에서, 개질에는 하나 이상의 결실 및 하나 이상의 삽입의 조합이 포함된다. 또다른 구현예에서, 개질에는 하나 이상의 치환, 하나 이상의 결실, 및 하나 이상의 삽입의 조합이 포함된다.

본 발명의 개질 폴리뉴클레오티드 서열을 발생시키기 위해, 부위-포화 돌연변이생성, 스캐닝 돌연변이생성, 삽입 돌연변이생성, 결실 돌연변이생성, 랜덤 돌연변이생성, 부위-지정 돌연변이생성, 및 지정-진화 뿐 아니라 다양한 다른 재조합 접근법을 비롯한 여러가지 적합한 방법이 당업계에 알려져 있다. 통상적으로 사용되는 방법에는 DNA 셔플링 (Stemmer, Proc Natl Acad Sci U S A. 25:10747-51 [1994] 참조), 유전자의 비-상동 재조합에 근거한 방법 (예를 들어, ITCHY) (Ostermeier et al, Bioorg Med Chem. 7:2139-44 [1999]), SCRACHY (Lutz et al. Proc Natl Acad Sci USA. 98:11248-53 [2001]), SHIPREC (Sieber et al, Nat Biotechnol., 19:456-60 [2001]), 및 NRR (Bittker et al, Nat Biotechnol., 20:1024-9 [2001]; Bittker et al, Proc Natl Acad Sci. USA. 101:7011-6 [2004]), 및 랜덤 및 표적 돌연변이, 결실 및/또는 삽입을 삽입하기 위한 올리고뉴클레오티드의 사용에 의존하는 방법 (Ness et al, Nat Biotechnol. 20: 1251-5 [2002]; Coco et al, Nat Biotechnol., 20:1246-50 [2002]; Zha et al, Chembiochem. 3:34-9 [2003], Glaser et al, J Immunol., 149:3903-13 [1992], Sondek and Shortle, Proc Natl Acad Sci USA 89:3581-5 [1992], Yanez et al, Nucleic Acids Res., 32:el58 [2004], Osuna et al, Nucleic Acids Res., 32:el36 [2004], Gaytan et al, Nucleic Acids Res., 29:E9 [2001], and Gaytan et al, Nucleic Acids Res., 30:e84 [2002]) 이 포함된다.

일부 구현예에서, 전장 모체 포릴뉴클레오티드는 적합한 발현 플라스미드 내에 라이게이션되고, 하기 돌연변이생성 방법을 사용하여 본 발명의 개질 프로테아제의 구축을 용이하게 하나, 다른 방법도 사용될 수 있다. 방법은 Pisarchik et al. (Pisarchik et al, Prot. Eng. Des. Select, 20:257-265 [2007]) 에 기재된 방법을 기초로 한다. 일부 구현예에서, 부가되는 장점은 본원에서 사용되는 제한 효소가 인식 서열 외부를 절단하여, 이것이 임의의 뉴클레오티드 서열의 실질적인 소화를 가능하게 하고, 제한 부위 상처의 형성을 불가능하게 하는 것으로 제공된다. 본원에서 기재되는 바와 같이 첫째로, 전장 프로테아제를 코딩하는 자연 발생적 유전자를 수득하고 서열분석하고, 하나 이상의 아미노산에서 돌연변이를 만들기 원하는 (결실, 삽입, 치환, 또는 이의 조합) 하나 이상의 지점에 대해 스캐닝한다. 원하는 서열에 일치시키기 위해 서열을 변화시키기 위해 유전자의 돌연변이를 일반적으로 알려진 방법에 따른 프라이머 확장에 의해 달성한다. 돌연변이의 원하는 지점(들) 의 좌측 및 우측에 대한 조각을 PCR 에 의해 증폭시키고, Eam1104I 제한 부위를 포함시켰다. 좌측 및 우측 조각을 Eam1104I 로 소화시켜, 상보적인 3 개의 염기 돌출부를 갖는 다수의 조각을 발생시키고, 그 다음 이것을 모으고 라이게이션하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 개질된 서열의 라이브러리를 발생시킨다. 이 방법은 프레임-이동 돌연변이의 생성을 방지한다. 또한 이 방법은, 모든 올리고뉴클레오티드를 동일한 제한 부위를 가지도록 합성할 수 있어, 일부 다른 방법이 필요로 하는 합성 링커가 제한 부위 제작에 필요없도록 할 수 있기 때문에 돌연변이생성 과정을 단순하게 한다.

조성물

본 발명은 변이체 프로테아제 및 본원에 언급된 하나 이상의 변이체 서브틸리신을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 세정 조성물 뿐 아니라 사료 조성물, 직물 가공, 가죽 마감, 곡물 가공, 육류 가공, 식품 가공, 단백질 가수분해물의 제조, 소화 보조제, 살미생물 조성물, 제균 조성물, 진균억제 조성물 및 개인 케어 제품 (예를 들어 구강 케어, 모발 케어 및/또는 스킨 케어) 을 포함하는, 폴리펩티드의 분해 또는 합성이 필요한 다양한 상업적 적용을 갖는 프로테아제를 생성하기 위한 수단을 제공한다.

본 발명은 현재 사용되는 서브틸리신 프로테아제에 필적할만한 또는 이보다 향상된 세정 성능을 갖는 효소 조성물을 추가로 제공한다.

세정 조성물

본 발명의 세정 조성물은 예를 들어 세탁 적용에서 유리하게 사용된다. 실제로, 저온 용액에서 증가된 효율성의 고유한 이점으로 인해, 본 발명의 효소는 세탁 적용에 이상적으로 적합하다. 또한, 본 발명의 효소는 과립 및 액체 조성물 모두에서 사용될 수 있다.

본 발명의 변이체 프로테아제는 또한 세탁 세정 첨가제 제품에서 사용된다. 일부 구현예에서, 저온 용액 세정 적용물이 사용된다. 첨가제 제품은, 가장 단순한 형태로, 하나 이상의 프로테아제일 수 있다. 일부 구현예에서, 첨가제는 세정 과정에 추가하기 위한 투약 형태로 포장된다. 임의의 적합한 단일 투약 형태가 또한 본 발명으로 사용되는데, 이는 알약, 정제, 젤리캡슐 (gelcap), 또는 미리측정된 분말 또는 액체와 같은 다른 단일 투약 단위가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물의 부피가 증가되도록 충전제(들) 또는 담체 물질(들) 이 포함된다. 적합한 충전제 또는 담체 물질에는 술페이트, 카르보네이트 및 실리케이트의 다양한 염 뿐 아니라 탈크, 점토 등이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 액체 조성물에 적합한 충전제 또는 담체 물질에는 물 또는 저분자량 1 차 및 2 차 알코올 (폴리올 및 디올 포함) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 알코올의 예에는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 5% 내지 약 90% 의 상기 물질을 함유한다. 산성 충전제가 pH 를 감소시키는데 사용된다. 대안적으로는, 세정 첨가제는 하기에 보다 충분히 기재되는 바와 같은 보조 성분을 포함한다.

본 발명의 세정 조성물 및 세정 첨가제는 단독으로 또는 다른 프로테아제 및/또는 부가적 효소와 함께, 본원에 제공되는 하나 이상의 프로테아제 변이체의 유효량을 필요로 한다. 효소의 필요 수준은 본 발명의 하나 이상의 프로테아제의 첨가에 의해 달성된다. 전형적으로는 본 발명의 세정 조성물은 약 0.0001 중량% 이상, 약 0.0001 중량% 내지 약 1 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 심지어 약 0.01 중량% 내지 약 0.1 중량% 의, 본 발명의 변이체 프로테아제 중 하나 이상을 포함한다.

본원의 세정 조성물은 전형적으로는, 수성 세정 작업에서 사용하는 동안 세정수가 pH 약 5.0 내지 약 11.5, 또는 심지어 약 7.5 내지 약 10.5 를 갖도록 제형화된다. 액체 생성물 제형은 전형적으로는, 순 pH 약 3.0 내지 약 9.0, 또는 심지어 약 3 내지 약 5 를 갖도록 제형화된다. 과립 세탁 생성물은 전형적으로 pH 약 9 내지 약 11 을 갖도록 제형화된다. 권고되는 이용 수준에서 pH 를 조절하는 기술은 완충액, 알칼리, 산 등의 사용을 포함하며, 당업자에게 널리 알려져 있다.

적합한 저-pH 세정 조성물은 전형적으로는 약 3 내지 약 5 의 순 pH 를 가지며, 전형적으로는 이러한 pH 환경에서 가수분해하는 계면활성제를 갖지 않는다. 상기 계면활성제는 하나 이상의 에틸렌 산화물 부분 또는 심지어 약 1 내지 약 16 몰의 에틸렌 산화물을 포함하는 나트륨 알킬 술페이트 계면활성제를 포함한다. 이러한 세정 조성물은 전형적으로는, 순 pH 약 3 내지 약 5 의 세정 조성물이 제공되도록 수산화나트륨, 모노에탄올아민 또는 염산과 같은 충분량의 pH 개질제를 포함한다. 이러한 조성물은 전형적으로는 하나 이상의 산 안정 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 액체인 한편, 다른 구현예에는 고체이다. 상기 액체 조성물의 pH 는 전형적으로는 순 pH 로서 측정된다. 상기 고체 조성물의 pH 는 용매가 증류수인 상기 조성물의 10% 고체 용액으로서 측정된다. 이러한 구현예에서, 모든 pH 측정은 20℃ 에서 수행된다.

일부 구현예에서, 변이체 프로테아제(들) 가 과립 조성물 또는 액체로 사용되며, 변이체 프로테아제가, 보관하는 동안 과립 조성물의 다른 성분으로부터 상기 변이체 프로테아제가 보호되도록 캡슐화된 입자의 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 추가로, 캡슐화는 또한 세정 방법 동안 변이체 프로테아제의 이용성을 제어하기 위한 수단이다. 일부 구현예에서, 캡슐화는 변이체 프로테아제(들) 및/또는 부가적 효소의 성능을 증강시킨다. 이와 관련하여, 본 발명의 변이체 프로테아제는 당업계에 알려져 있는 임의의 적합한 캡슐화 물질로 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 전형적으로는 본 발명의 변이체 프로테아제(들) 에 대한 촉매의 일부 이상을 캡슐화한다. 전형적으로는, 캡슐화 물질은 수용성 및/또는 수분산성이다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 0℃ 이상의 유리 전이 온도 (Tg) 를 갖는다. 유리 전이 온도는 WO 97/11151 호에 보다 상세히 기재되어 있다. 캡슐화 물질은 탄수화물, 천연 또는 합성 고무, 키틴, 키토산, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 실리케이트, 포스페이트, 보레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 파라핀 왁스 및 이의 조합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 캡슐화 물질이 탄수화물인 경우, 이는 전형적으로는 단당류, 올리고당류, 다당류 및 이의 조합물에서 선택된다. 전형적으로는, 캡슐화 물질은 전분이다. 적합한 전분은 EP 0 922 499 호; US 4,977,252 호; US 5,354,559 호 및 US 5,935,826 호에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 열가소물, 아세토니트릴, 메타크릴로니트릴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메타크릴로니트릴 및 이의 혼합물과 같은 플라스틱으로 생성되는 마이크로스피어이고; 사용되는 시판 마이크로스피어는 EXPANCEL® (Stockviksverken, Sweden), 및 PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® 및 SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA) 에 의해 공급되는 것들을 포함한다.

본원에 기재되는 바와 같이, 본 발명의 변이체 프로테아제는 특히 세탁 세제에서 사용된다. 이들 적용은 다양한 환경 스트레스 하에서의 효소에 있다. 본 발명의 변이체 프로테아제는 다양한 조건하에서의 그의 안정성으로 인해, 많은 현재 사용되는 효소에 비해 장점을 제공한다.

게다가, 세정에 포함되는 프로테아제가 노출되는 다양한 세제 제형, 세정수 부피, 세정수 온도, 및 세정시간을 포함하여 세정 조건은 다양하다. 또한, 상이한 지리학적 영역에서 사용되는 세제 제형은 세정수에 존재하는 관련 성분 농도가 상이하다. 예를 들어, 유럽 세제에는 전형적으로 약 4500-5000 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하고, 일본 세제에는 전형적으로 대략 667 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다. 북미에서, 특히 미국에서, 세제에는 전형적으로 약 975 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다.

저 세제 농도 시스템에는 약 800 ppm 미만의 세제 성분이 세정수에 존재하는 세제가 포함된다. 일본 세제는 대략 667 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 전형적으로 저 세제 농도 시스템으로 간주된다.

중간 세제 농도에는 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하는 세제가 포함된다. 북미 세제는 대략 975 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 일반적으로 중간 세제 농도 시스템으로 간주된다. 브라질 세제에는 전형적으로 대략 1500 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다.

고 세제 농도 시스템에는 약 2000 ppm 초과의 세제 성분이 세정수에 존재하는 세제가 포함된다. 유럽 세제는 대략 4500-5000 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 일반적으로 고 세제 농도 시스템으로 간주된다.

남미 세제는 일반적으로 고 비누 인산염 세정강화제 (suds phosphate builder) 세제이며, 남미에서 사용되는 세제의 범위는 1500 내지 6000 ppm 범위의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 중간 및 고 세제 농도 모두라고 볼 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 브라질 세제에는 전형적으로 대략 1500 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다. 그러나, 기타 남미 국가에 제한되지 않는 기타 고 비누 인산염 세정강화제 세제 지역은, 약 6000 ppm 이하의 세제 성분이 세정수에 존재하는 고 세제 농도 시스템을 가질 수 있다.

이에 비추어 보아, 세계적으로 전형적인 세정액 중의 세제 조성물의 농도가 약 800 ppm 미만의 세제 조성물 ("저 세제 농도 지역"), 예를 들어 일본에서는 약 667 ppm, 미국에서는 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm ("중간 세제 농도 지역"), 예를 들어 약 975 ppm, 그리고 브라질에서는 약 1500 ppm, 유럽에서는 약 2000 ppm 초과 ("고 세제 농도 지역"), 예를 들어 약 4500 ppm 내지 약 5000 ppm 및 고 비누 인산염 세정강화제 지역에서는 약 6000 ppm 으로 다양하다는 것이 명백하다.

전형적인 세정액의 농도는 경험적으로 측정된다. 예를 들어, 미국에서는 전형적인 세탁기는 약 64.4 L 부피의 세정액을 담는다. 따라서, 세정액 중에 약 975 ppm 의 세제 농도를 수득하기 위해서는, 약 62.79 g 의 세제 조성물을 64.4 L 의 세정액에 첨가해야만 한다. 이 양은 세제와 함께 제공될 수 있는 계량컵을 사용하여 소비자가 세정수로 측정한 전형적인 양이다.

추가 예로서, 상이한 지역은 상이한 세정 온도를 사용한다. 일본에서의 세정수의 온도는 전형적으로 유럽에서 사용되는 온도보다 낮다. 예를 들어, 북미 및 일본에서의 세정수의 온도는 10℃ 내지 30℃ (예를 들어, 약 20℃) 일 수 있는 반면, 유럽에서의 세정수의 온도는 전형적으로 30℃ 내지 60℃ (예를 들어, 약 40℃) 이다.

추가 예로서, 상이한 지역은 전형적으로 물의 경도가 상이하다. 물의 경도는 일반적으로 혼합된 Ca² ⁺/Mg² ⁺ 갤론 당 그레인 (grain) 으로 표현된다. 경도는 물 중의 칼슘 (Ca² ⁺) 및 마그네슘 (Mg² ⁺) 의 양의 측정값이다. 미국의 대부분의 물은 경질이나, 경도 값은 다양하다. 중간 경질 (60-120 ppm) 에서 경질 (121-181 ppm) 인 물은 백만 당 60 내지 181 부 (미국 갤론 당 그레인으로 전환된 백만 당 부는 갤론 당 17.1 에 동일한 그레인으로 나눠진 ppm # 이다) 의 경질 광물을 함유한다.

유럽의 물의 경도는 전형적으로 혼합된 Ca² ⁺/Mg² ⁺ 갤론 당 10.5 초과 (예를 들어, 10.5 내지 20.0) 의 그레인 (예를 들어, 혼합된 Ca² ⁺/Mg² ⁺ 갤론 당 약 15 그레인) 이다. 북미의 물의 경도는 전형적으로 일본의 물의 경도보다 크나, 유럽의 물의 경도보다는 적다. 예를 들어, 북미의 물의 경도는 3 내지 10 그레인, 3-8 그레인 또는 약 6 그레인일 수 있다. 일본의 물의 경도는 전형적으로 북미의 물의 경도보다 낮으며, 일반적으로 혼합된 Ca² ⁺/Mg² ⁺ 갤론 당 4 미만, 예를 들어 3 그레인이다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 세정 조건 세트 (예를 들어, 물 온도, 물의 경도, 및/또는 세제 농도) 에서 놀라운 세정 성능을 보여주는 프로테아제를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 프로테아제는 그 세정 성능이 다른 서브틸리신 프로테아제와 필적할만하다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 프로테아제는 현재 시판되는 서브틸리신 프로테아제와 비교하여 향상된 세정 성능을 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 변이체 프로테아제는 향상된 산화 안정성, 향상된 열 안정성, 및/또는 향상된 킬레이트제 안정성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 변이체 프로테아제는 다시 단독으로 또는 세정강화제 및 안정화제와 조합으로, 세제가 포함되지 않은 세정 조성물에 사용된다.

본 발명의 일부 구현예에서, 세정 조성물은 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 수준으로 포함하고, 조성물의 나머지는 (예를 들어, 약 99.999 중량% 내지 약 90.0 중량%) 세정 보조 물질을 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 변이체 프로테아제를 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 수준으로 포함하고, 세정 조성물의 나머지는 (예를 들어, 약 99.9999 중량% 내지 약 90.0 중량%, 약 99.999 중량% 내지 약 98 중량%, 약 99.995 중량% 내지 약 99.5 중량%) 세정 보조 물질을 포함한다.

일부 구현예에서, 바람직한 세정 조성물은, 본원에서 제공되는 하나 이상의 변이체 프로테아제 외에도 세정 성능 및/또는 섬유 케어 이점을 제공하는 하나 이상의 부가적인 효소 또는 효소 유도체를 포함한다. 이러한 효소에는 기타 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제 (예를 들어, 락카아제), 및/또는 만난나아제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

임의의 기타 적합한 프로테아제가 본 발명의 조성물에 사용된다. 적합한 프로테아제에는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것들이 포함된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 미생물 프로테아제가 사용된다. 일부 구현예에서, 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 바람직하게는 알칼리 미생물 프로테아제 또는 트립신 유사 프로테아제이다. 알칼리 프로테아제의 예에는 서브틸리신, 특히 바실러스 (Bacillus) 종 (예를 들어, 서브틸리스, 렌투스, 아밀로리퀘파시엔스, 서브틸리신 칼스베르그 (Carlsberg), 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168) 으로부터 유래된 것들이 포함된다. 부가적인 예에는 모두 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 번호 RE 34,606 호, 5,955,340 호, 5,700,676 호, 6,312,936 호, 및 6,482,628 호에 기재된 돌연변이체 프로테아제가 포함된다. 부가적인 프로테아제의 예에는 트립신 (예를 들어, 돼지 또는 소 기원의 것), 및 WO 89/06270 호에 기재된 푸사리움 (Fusarium) 프로테아제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 시판 프로테아제 효소에는 상표명 MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT® 및 PURAFECT® OXP (Genencor) 로 판매되는 것들, 상표명 ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, RELASE® 및 ESPERASE® (Novozymes) 로 판매되는 것들; 및 상표명 BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany 로 판매되는 것들이 포함된다. 다양한 프로테아제는 WO 95/23221 호, WO 92/21760 호, 및 미국 특허 번호 5,801,039 호, 5,340,735 호, 5,500,364 호, 5,855,625 호, US RE 34,606 호, 5,955,340 호, 5,700,676 호, 6,312,936, 및 6,482,628 호, 및 다양한 기타 특허에 기재되어 있다.

또한, 임의의 적합한 리파아제가 본 발명에서 사용된다. 적합한 리파아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체도 본 발명에 포함된다. 유용한 리파아제의 예에는 휴미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa) 리파아제 (예를 들어, EP 258 068 호, 및 EP 305 216 호 참조), 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 리파아제 (예를 들어, EP 238 023 호 참조), 칸디다 (Candida) 리파아제, 예컨대 C. 안타르크티카 (C. antarctica) 리파아제 (예를 들어, C. 안타르크티카 (C. antarctica) 리파아제 A 또는 B; 예를 들어, EP 214 761 호 참조), 슈도모나스 (Pseudomonas) 리파아제, 예컨대 P. 알칼리제네스 (P. alcaligenes) 및 P. 슈도알칼리제네스 (P. pseudoalcaligenes) 리파아제 (예를 들어, EP 218 272 호 참조), P. 세파시아 (P. cepacia) 리파아제 (예를 들어, EP 331 376 호 참조), P. 스투트제리 (P. stutzeri) 리파아제 (예를 들어, GB 1,372,034 호 참조), P. 플루오레세인 (P. fluoresceins) 리파아제, 바실러스 (Bacillus) 리파아제 (예를 들어, B. 서브틸리스 (B. subtilis) 리파아제 [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus) 리파아제 [예를 들어, JP 64/744992 호 참조]; 및 B. 푸밀러스 (B. pumilus) 리파아제 [예를 들어, WO 91/16422 호 참조]) 가 포함된다.

게다가, 페니실리움 카멤베르티 (Penicillium camembertii) 리파아제 (Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991] 참조), 제오트리쿰 칸디둠 (Geotricum candidum) 리파아제 (Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989] 참조), 및 다양한 리조푸스 (Rhizopus) 리파아제, 예컨대 R. 델레마르 (R. delemar) 리파아제 (Hass et al., Gene 109:117-113 [1991] 참조), R. 니베우스 (R. niveus) 리파아제 (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) 및 R. 오리자에 (R. oryzae) 리파아제를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 클로닝된 리파아제가 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다.

또한 슈도모나스 멘도시나 (Pseudomonas mendocina) 유래의 큐티나아제 (WO 88/09367 호 참조), 및 푸사리움 솔라니피시 (Fusarium solanipisi) 유래의 큐티나아제 (WO 90/09446 호 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 큐티나아제와 같은 다른 유형의 지방분해 효소가 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다.

부가적인 적합한 리파아제에는 시판 리파아제, 예컨대 M1 LIPASE™, LUMA FAST™ 및 LIPOMAX™ (Genencor); LIPOLASE® 및 LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); 및 LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co; Ltd., Japan) 가 포함된다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 리파아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 리파아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 리파아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 리파아제 수준으로 포함한다.

알칼리 용액에서 사용하기에 적합한 임의의 아밀라아제 (알파 및/또는 베타) 는 또한 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 적합한 아밀라아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체도 일부 구현예에 포함된다. 본 발명에 사용되는 아밀라아제에는 B. 리체니포르미스 (B. licheniformis) 로부터 수득된 α-아밀라아제 (예를 들어, GB 1,296,839 호 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용되는 시판 아밀라아제에는 DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, BAN™ (Novozymes) 및 RAPIDASE® 및 MAXAMYL® P (Genencor) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 아밀라아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 아밀라아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 아밀라아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 아밀라아제 수준으로 포함한다.

일부 추가의 구현예에서, 임의의 적합한 셀룰라아제는 본 발명의 세정 조성물에서 사용된다. 적합한 셀룰라아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체도 일부 구현예에 포함된다. 적합한 셀룰라아제에는 휴미콜라 인솔렌 (Humicola insolens) 셀룰라아제 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,435,307 호 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특히 적합한 셀룰라아제는 색조 케어 장점을 가진 셀룰라아제 (예를 들어, EP 0 495 257 호 참조) 이다.

본 발명에 사용되는 시판 셀룰라아제에는 CELLUZYME® (Novozymes), 및 KAC-500(B)™ (Kao Corporation) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 셀룰라아제는 N-말단 부분이 결실된, 성숙 야생형 또는 변이체 셀룰라아제의 일부 또는 조각으로서 혼입된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,874,276 호 참조). 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 셀룰라아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 셀룰라아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 셀룰라아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 셀룰라아제 수준으로 포함한다.

세제 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 만난나아제가 또한 본 발명에서 사용된다. 적합한 만난나아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체도 일부 구현예에 포함된다. 다양한 만난나아제는 본 발명에서 사용되는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, 모두 참조로서 본원에 인용된 미국 특허 번호 6,566,114 호, 미국 특허 번호 6,602,842 호, 및 미국 특허 번호 6,440,991 호 참조). 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 만난나아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 만난나아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 만난나아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 만난나아제 수준으로 포함한다.

일부 구현예에서, 퍼옥시다아제는 본 발명의 조성물에서 과산화수소 또는 그의 공급원 (예를 들어, 퍼카르보네이트, 퍼보레이트 또는 퍼술페이트) 과 함께 사용된다. 일부 대안적인 구현예에서, 옥시다아제는 산소와 조합으로 사용된다. 양쪽 유형의 효소는 바람직하게는 강화제 (예를 들어, WO 94/12621 호 및 WO 95/01426 호 참조) 와 함께, "용액 표백" (즉, 세정액에서 섬유를 함께 세정할 때, 염색된 섬유에서 또다른 섬유로 직물 염료가 물드는 것을 방지하기 위함) 에 사용된다. 적합한 퍼옥시다아제/옥시다아제에는 식물, 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체도 일부 구현예에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소 수준으로 포함한다.

일부 구현예에서, 퍼히드롤라아제 (예를 들어, WO 05/056782 호 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 부가적인 효소가 사용된다. 또한, 일부 특히 바람직한 구현예에서, 상기 언급된 효소의 혼합물, 특히 하나 이상의 부가적인 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제, 만난나아제, 및/또는 하나 이상의 셀룰라아제의 혼합물이 본원에 포함된다. 게다가, 상기 효소의 다양한 혼합물이 본 발명에 사용될 것으로 고려된다. 또한, 변이체 프로테아제(들) 과 하나 이상의 부가적인 효소의 수준 변화는 모두 독립적으로 약 10% 범위일 수 있고, 세정 조성물의 나머지는 세정 보조 물질인 것으로 고려된다. 특이적인 세정 보조 물질의 선택은 세정되어야 할 표면, 물품 또는 섬유, 및 사용 동안의 세정 조건 동안 (예를 들어, 세정 세제 사용 동안) 조성물의 원하는 형태를 고려하여 쉽게 이루어질 수 있다.

적합한 세정 보조 물질의 예에는 계면활성제, 세정강화제, 표백제, 표백 활성화제, 표백 촉매, 기타 효소, 효소 안정화 시스템, 킬레이트물질 (chelant), 형광 증백제, 오염 방출 중합체, 염료 전이제, 분산제, 비누 (suds) 억제제, 염료, 향수, 착색제, 충전제 염, 히드로트롭 (hydrotrope), 광활성화제, 형광물질, 섬유 컨디셔너, 가수분해가능 계면활성제, 방부제, 항산화제, 항수축제, 항구김제, 살균제, 살진균제, 색조 얼룩, 실버케어 (silvercare), 항변색제 및/또는 항부식제, 알칼리성 공급원, 가용화제, 담체, 가공 보조제, 안료, 및 pH 조절제 (예를 들어, 모두 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 번호 6,610,642 호, 6,605,458 호, 5,705,464 호, 5,710,115 호, 5,698,504 호, 5,695,679 호, 5,686,014 호 및 5,646,101 호 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특이적 세정 조성물 물질의 구현예는 하기에 상세히 예시된다. 세정 보조 물질이 세정 조성물 중에서 본 발명의 변이체 프로테아제와 비상용성이지 않다면, 세정 보조 물질과 프로테아제(들) 을 이 두 성분의 조합이 적절할 때까지 분리된 채로 유지하는 (즉, 서로 접촉되지 않음) 적합한 방법이 사용된다. 이러한 분리 방법에는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법이 포함된다 (예를 들어, 젤리캡슐 (gelcap), 캡슐화, 정제, 물리적인 분리, 등).

예를 들어, 본 발명의 변이체 프로테아제가 사용되는 여러 세정 조성물은 이하에 더욱 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 세정 조성물이 세탁기 세정법(들) 에서 사용하기에 적합한 조성물로 제형화되는 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는, 하나 이상의 계면활성제 및 하나 이상의 세정강화제 화합물 뿐 아니라, 바람직하게는 유기 중합체 화합물, 표백제, 부가적인 효소, 비누 억제제, 분산제, 석회-비누 (soap) 분산제, 오물 현탁 및 항-재침전제 및 부식억제제로부터 선택되는 하나 이상의 세정 보조 물질을 함유한다. 일부 구현예에서, 세탁 조성물은 또한 연화제 (즉, 부가적인 세정 보조 물질로서) 를 함유한다. 또한 본 발명의 조성물은 고체 또는 액체 형태의 세제 첨가제 생성물을 사용한다. 이러한 첨가제 생성물은 통상의 세제 조성물의 성능을 보충 및/또는 강화시키는 것으로 의도되고, 세정 과정의 임의의 단계에서 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 세탁 세제 조성물의 밀도는 약 400 내지 약 1200 g/리터의 범위이고, 다른 구현예에서, 밀도는 약 20℃ 에서 측정된 조성물의 약 500 내지 약 950 g/리터 범위이다.

일부 구현예에서, 다양한 세정 조성물, 예컨대 미국 특허 번호 6,605,458 호에 제시된 조성물이 본 발명의 변이체 프로테아제와 사용된다. 그러므로, 일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 압축 과립 섬유 세정 조성물이고, 다른 구현예에서, 상기 조성물은 색조 섬유의 세탁에 유용한 과립 섬유 세정 조성물이고, 추가의 구현예에서, 상기 조성물은 세정 용량을 통해 연화시키는 과립 섬유 세정 조성물이고, 부가적인 구현예에서, 상기 조성물은 강력 (heavy duty) 액체 섬유 세정 조성물이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 미국 특허 번호 6,610,642 호 및 미국 특허 번호 6,376,450 호에 기재된 것과 같은 섬유 세정 조성물이다. 또한, 본 발명의 변이체 프로테아제는 유럽 또는 일본 세정 조건 하에서 특정 유용성의 과립 세탁 세제 조성물 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,610,642 호 참조) 에 사용된다.

본 발명의 세정 조성물은 임의의 적합한 형태로 제형화되고 제형자에 의해 선택되는 임의의 방법으로 제조되며, 이의 비제한적인 예는 모두 본원에 참고로서 인용되는 미국 특허 제 5,879,584 호, 제 5,691,297 호, 제 5,574,005 호, 제 5,569,645 호, 제 5,565,422 호, 제 5,516,448 호 제 5,489,392 호 및 제 5,486,303 호에 기재되어있다. 낮은 pH 의 세정 조성물이 필요한 경우, 이러한 조성물의 pH 는 모노에탄올아민과 같은 물질 또는 HCl 과 같은 산성 물질의 첨가를 통해 조정된다.

본 발명의 목적을 위해 필수적이지는 않지만, 이하 설명한 보조제의 비제한적인 목록은 본 세정 조성물에서 사용하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 이러한 보조제는 예를 들어, 세정될 기질의 처리를 위해 세정 성능을 조력 또는 증강시키거나, 향수, 착색제, 염료 등의 경우에서와 같이 세정 조성물의 심미감을 변화시키기 위해 혼입된다. 이러한 보조제가 본 발명의 변이체 프로테아제에 추가되는 것으로 이해된다. 이러한 추가적인 성분의 명확한 성질, 및 이의 혼입 수준은 조성물의 물리적 형태 및 사용될 세정 작업의 특성에 따라 다를 것이다. 적합한 보조 물질에는 계면활성제, 세정강화제, 킬레이트제, 염료 전이 저해제, 침착 보조제, 분산제, 추가적 효소 및 효소 안정화제, 촉매적 물질, 표백 활성화제, 표백 촉진제 (bleach booster), 과산화수소, 과산화수소 공급원, 기성 과산 (preformed peracid), 중합체성 분산제, 흙 오염 제거제/재침착 방지제, 증백제, 비누 억제제, 염료, 향수, 구조 탄성화제, 섬유 유연제, 담체, 히드로트롭, 가공 보조제 및/또는 안료가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 하기 설명에 부가하여, 이러한 다른 보조제의 적합한 예 및 사용 수준은 참조로서 인용되는 미국 특허 제 5,576,282 호, 제 6,306,812 호 및 제 6,326,348 호에서 발견된다. 상기 언급된 보조 성분은 본 발명의 세정 조성물의 나머지를 구성할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 세정 조성물은 계면활성제 또는 계면활성제 시스템을 포함하며, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 쯔비터성 계면활성제, 반극성 비이온성 계면활성제 및 이의 혼합물로부터 선택된다.

일부 부가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 세제 세정강화제 또는 세정강화제 시스템을 포함한다. 세정강화제에는 알칼리 금속, 폴리포스파테이트의 암모늄 및 알카놀암모늄 염, 알칼리 금속 실리케이트, 알칼리 토금속 및 알칼리 금속 카르보네이트, 알루미노실리케이트 세정강화제 폴리카르복실레이트 화합물, 에테르 히드록시폴리카르복실레이트, 말레산 무수물과 에틸렌 또는 비닐 메틸 에테르와의 공중합체, 1,3,5-트리히드록시 벤젠-2,4,6-트리술폰산 및 카르복시메틸옥시숙신산, 다양한 알칼리 금속, 폴리아세트산의 암모늄 및 치환 암모늄 염 예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산 및 니트릴로트리아세트산 뿐 아니라 폴리카르복실레이트 예컨대 멜리트산, 숙신산, 시트르산, 옥시디숙신산, 폴리말레산, 벤젠 1,3,5-트리카르복실산, 카르복시메틸옥시숙신산, 및 이의 가용성 염이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

일부의 부가적인 구현예에서, 본원의 세정 조성물은 킬레이트제를 함유한다. 적합한 킬레이트제에는 구리, 철 및/또는 망간 킬레이트제 및 이의 혼합물이 포함된다.

일부의 또다른 부가적인 구현예에서, 본원에 제공된 세정 조성물은 침착 보조제를 함유한다. 적합한 침착 보조제에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리카르복실레이트, 오염 방출 중합체 예컨대 폴리테레프탈산, 점토 예컨대 카올리나이트, 몬트모릴로나이트, 아타풀가이트, 일라이트, 벤토나이트, 할로이사이트 및 이의 혼합물이 포함된다.

일부 부가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물에는 또한 하나 이상의 염료 전이 저해제가 포함된다. 적합한 중합체성 염료 전이 저해제에는 폴리비닐피롤리돈 중합체, 폴리아민 N-산화물 중합체, N-비닐피롤리돈 및 N-비닐이미다졸의 공중합체, 폴리비닐옥사졸리돈 및 폴리비닐이미다졸 또는 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

일부의 또다른 부가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 분산제를 함유한다. 적합한 수용성 유기 물질에는 폴리카르복실산이 2 개 이하의 탄소 원자에 의해 서로 분리되는 2 개 이상의 카르복실 라디칼을 포함하는, 단일중합체성 또는 공중합체성 산 또는 이의 염이 포함된다.

일부의 특히 바람직한 구현예에서, 세정 조성물은 세정 성능 및/또는 섬유 케어 이점을 제공하는 하나 이상의 세제 효소를 포함한다. 적합한 효소의 예에는, 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀루라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 말라나아제, β-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 및 아밀라아제, 또는 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 전형적인 조합은 하나 이상의 프로테아제, 하나 이상의 리파아제, 하나 이상의 큐티나아제 및/또는 하나 이상의 셀룰라아제를 하나 이상의 아밀라아제와 함께 포함하는, 통상적으로 이용가능한 효소의 칵테일이다.

일부 추가의 구현예에서, 세정 조성물에서 사용되는 효소는 임의의 적합한 기술로 안정화된다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 효소는 칼슘 및/또는 마그네슘 이온을 효소에 제공하는 최종 조성물 중 상기 칼슘 및/또는 마그네슘 이온의 수용성 공급원의 존재 하에 안정화된다. 일부의 더욱 추가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물에는 촉매적 금속 착물이 포함된다. 금속-함유 표백 촉매의 하나의 유형은 한정된 표백 촉매 활성의 전이 금속 양이온 예컨대 구리, 철, 티타늄, 루테늄, 텅스텐, 몰리브덴 또는 망간 양이온, 탈색 촉매 활성이 없거나 거의 없는 보조 금속 양이온 예컨대 아연 또는 알루미늄 양이온, 및 촉매적 및 보조 금속 양이온에 대해 한정된 안정성 상수를 갖는 격리제, 특히 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라 (메틸렌포스폰산) 및 이의 수용성 염을 포함하는 촉매계이다. 이러한 촉매는 미국 특허 제 4,430,243 호에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, 본원의 조성물은 망간 화합물에 의해 촉매화된다. 이러한 화합물 및 사용 수준은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 5,576,282 호에 개시된 망간-기재 촉매가 포함된다. 또한, 본원에서 유용한 코발트 표백 촉매는 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 5,597,936 호 및 제 5,595,967 호에 기재되어 있다. 이러한 코발트 촉매는 미국 특허 제 5,597,936 호 및 제 5,595,967 호에서 교시된 바와 같은 공지된 절차에 의해 용이하게 제조된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공되는 조성물은 또한 마크로폴리시클릭 강성 리간드 (즉, "MRL") 의 전이 금속 착물이 적합하게 포함된다. 제한이 아닌, 실시적인 문제로서, 본원의 조성물 및 세정 절차는 수성 세정 매질 중 활성 MRL 종류의 약 일억분의 1 이상이 제공되도록 조정가능하며, 바람직하게는 세정액 중 MRL 의 약 0.005 ppm 내지 약 25 ppm, 더욱 바람직하게는 약 0.05 ppm 내지 약 10 ppm, 가장 바람직하게는 약 0.1 ppm 내지 약 5 ppm 이 제공될 것이다. 본 전이-금속 표백 촉매에서의 바람직한 전이-금속에는 망간, 철 및 크롬이 포함된다. 본원에서 바람직한 MRL 은 가교된 초-강성 리간드의 특이적 유형 예컨대 5,12-디에틸-1,5,8,12-테트라아자비시클로[6.6.2]헥사데칸이다. 적합한 전이 금속 MRL 은, 예를 들어 WO 00/332601 및 미국 특허 제 6,225,464 호에서 교시된 바와 같은 공지된 절차에 의해 용이하게 제조된다.

상기 지시된 같이, 본 발명의 세정 조성물은 임의의 적합한 형태로 제형화되고 제형자에 의해 선택된 임의의 방법에 의해 제조되며, 이의 비제한적 예는 모두 본원에 참고로서 인용되는 미국 특허 제 5,879,584 호, 제 5,691,297 호, 제 5,574,005 호, 제 5,569,645 호, 제 5,516,448 호, 제 5,489,392 호 및 제 5,486,303 호에 기재되어 있다.

본원에 기재된 세정 조성물은 위치 (situs) (예를 들어 표면, 식기 또는 섬유) 를 세정하는데 사용된다. 전형적으로는, 위치 중 일부 이상은 세척액 중 희석된 또는 순수 형태인 본 발명의 세정 조성물의 구현예와 접촉된 후, 상기 위치는 임의로 세정 및/또는 헹구어진다. 본 발명의 목적을 위해서, "세정" 에는 문질러 닦는 것, 및 기계적 교반이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 전형적으로는 용액 중 약 500 ppm 내지 약 15,000 ppm 의 농도로 사용된다. 세정 용매가 물인 경우, 물 온도는 전형적으로는 약 5℃ 내지 약 90℃ 의 범위이고, 위치가 섬유를 포함하는 경우, 물 대 섬유 질량비는 전형적으로는 약 1:1 내지 약 30:1 이다.

정의

다르게 지시되지 않는다면, 본 발명의 실시는 당업계 내에 있는 분자 생물학, 단백질 조작, 미생물학, 및 재조합 DNA 에 통상적으로 사용되는 통상의 기술을 포함한다. 이러한 기술은 당업자에게 알려져 있고, 다양한 교재 및 참조 논문에 기재되어 있다 (예를 들어, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition (Cold Spring Harbor), [1989]); and Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" [1987] 참조). 상기 및 하기 모두에서 본원에 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 기사 및 공보는 본원에 참조로서 여기에 명백하게 인용된다.

본원에 다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 이러한 용어의 정의를 제공하는 당업계에 알려지고 이용가능한 다양한 사전이 있다. 본원에 기재된 것과 유사거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용되지만, 바람직한 방법 및 물질은 본원에 기재된다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어는 전체로서 본 명세서를 참조로 하여 더욱 상세히 기재된다. 또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형 용어에는 문맥이 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수형 참조가 포함된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 다르게 지시되지 않는다면, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 좌에서 우로 표기하며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌에서 우로 각각 표기한다. 본 발명은 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 다양할 수 있기 때문에 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다.

본 발명의 실시는 다르게 지시되지 않는다면, 모두 당업계 내에 있는 단백질 정제, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술 및 단백질 서열분석의 통상의 기술을 사용한다.

추가로, 본원에 제공된 표제는 전체로서 명세서를 참조할 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어는 전체로서 명세서를 참조로 하여 더욱 상세히 정의된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어가 하기에 정의된다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "프로테아제," 및 "단백질분해 활성" 은 펩티드 연결을 갖는 펩티드 또는 기질을 가수분해하는 능력을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 말한다. 많은 잘 공지된 절차가 단백질분해 활성의 측정을 위해 존재한다 (Kalisz, "Microbial Proteinases," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, [1988]). 예를 들어, 단백질분해 활성은 상업적 기질을 가수분해하는 각각의 프로테아제 능력을 분석하는 비교 검정법에 의해 확인될 수 있다. 프로테아제 또는 단백질분해 활성의 분석에 유용한 예시적 기질에는, 디-메틸 카세인 (Sigma C-9801), 소 콜라겐 (Sigma C-9879), 소 엘라스틴 (Sigma E-1625), 및 소 케라틴 (ICN Biomedical 902111) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기질을 사용하는 비색 검정법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, WO 99/34011 호; 및 미국 특허 번호 6,376,450 호 참조, 둘다 본원에 참조로서 인용됨). pNA 검정법 (예를 들어, Del Mar et al., Anal. Biochem., 99:316-320 [1979]) 은 또한 구배 용리 동안 수집된 분획에 대한 활성 효소 농도를 측정하는데 사용된다. 상기 검정법은 p-니트로아닐린이 가용성 합성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐리드 (sAAPF-pNA) 를 가수분해하는 효소로서 방출되는 속도를 측정한다. 가수분해 반응으로부터의 황색조의 생성 속도는 분광광도계로 410 nm 에서 측정되고, 활성 효소 농도에 비례한다. 또한, 280 nm 에서의 흡광도 측정을 총 단백질 농도를 측정하기 위해 사용할 수 있다. 활성 효소/총-단백질 비는 효소 순도를 제공한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "바실러스 (Bacillus) 속" 에는 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 클라우시 (B. clausii), B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 서큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), 및 B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 가 포함되나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 바와 같은 "바실러스 (Bacillus)" 속명 내의 모든 종이 포함된다. 바실러스 (Bacillus) 속명에 대한 지속적인 분류학적 개편이 있다는 것으로 인지된다. 그러므로, 속명에는 이제는 "제오바실러스 스테아로테르모필루스 (Geobacillus stearothermophilus)" 라고 불리는 B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus) 와 같은 이러한 유기체를 포함하나 이에 제한되지 않는, 재분류된 종명이 포함되는 것으로 인지된다. 산소의 존재하에서의 내성 내생포자의 생성은, 상기 특성이 또한 현재 명칭 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 암피바실러스 (Amphibacillus), 아네우리니바실러스 (Aneurinibacillus), 아녹시바실러스 (Anoxybacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 필로바실러스 (Filobacillus), 그라실리바실러스 (Gracilibacillus), 할로바실러스 (Halobacillus), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 살리바실러스 (Salibacillus), 테르모바실러스 (Thermobacillus), 우레이바실러스 (Ureibacillus), 및 비르지바실러스 (Virgibacillus) 및 부가적인 유기체에 적용됨에도 불구하고, 바실러스 (Bacillus) 속명의 특징을 정의하는 것으로 간주된다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산," 은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드) 를 말한다. 상기 용어에는 단일-, 이중- 또는 삼중-가닥 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 잡종, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 기타 고유의, 화학적으로, 생화학적으로 개질된 비-고유 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예이다: 유전자, 유전자 조각, 염색체 조각, EST, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침, 및 프라이머. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 개질 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 기타 당 및 연결기, 예컨대 플루오로리보오스 및 티오에이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 방해된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "DNA 구축물" 및 "형질전환 DNA" 는 숙주 세포 또는 유기체 내로 서열을 도입하는데 사용되는 DNA 를 지칭하는데에 상호교환적으로 사용된다. 상기 DNA 는 PCR 또는 당업자들에게 공지된 임의의 기타 적당한 기술(들) 로 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 DNA 구축물은 관심 서열을 포함한다 (예를 들어, 유입 서열로서). 일부 구현예에서, 상기 서열은 제어 요소 (예를 들어, 프로모터 등) 등과 같은 추가 요소들에 작동가능하게 연결된다. 상기 DNA 구축물은 선별가능 마커를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상동 박스 (homology box) 들이 측면에 위치한 유입 서열을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 형질전환 DNA 는 말단에 추가된, 기타 비-상동 서열들 (예를 들어, 스터퍼 (stuffer) 서열 또는 측면들) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 유입 서열의 말단은, 상기 형질전환 DNA 가 폐쇄된 고리를 형성하도록 폐쇄된다. 상기 형질전환 서열은 야생형이거나, 돌연변이 또는 변형된 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 DNA 구축물은 숙주 세포 염색체와 상동인 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 DNA 구축물은 비-상동 서열을 포함한다. 일단 상기 DNA 구축물이 시험관 내에서 조립되면, 이는: 1) 숙주 세포의 목적 표적 서열 내로 이종 서열 삽입, 및/또는 2) 상기 숙주 세포 염색체의 영역에 돌연변이유발 (즉, 내인성 서열을 이종 서열로 대체), 3) 표적 유전자 결실; 및/또는 4) 복제 플라스미드의 숙주 내 도입에 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현 카세트" 및 "발현 벡터" 는, 표적 세포 내 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소들을 가진, 재조합으로 또는 합성으로 생성된 핵산 구축물을 말한다. 상기 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스 또는 핵산 조각 내로 도입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분에는, 다른 서열 중에, 전사될 핵산 서열 및 프로모터가 포함된다. 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 이종 DNA 절편을 숙주 세포 내로 도입하고 발현시키는 능력을 갖고 있다. 다수의 원핵 및 진핵 발현 벡터가 시판된다. 적절한 발현 벡터를 선택하는 것은 당업자의 지식에 속한다. 용어 "발현 카세트" 는 본원에서 "DNA 구축물" 및 이들의 문법적 동등물과 상호교환적으로 사용된다. 적절한 발현 벡터를 선택하는 것은 당업자의 지식에 속한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터" 는 하나 이상의 세포 유형 내로 핵산을 도입시키도록 디자인된 폴리뉴클레오티드 구축물을 말한다. 벡터에는, 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 카세트 등이 있다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 구축물은 적당한 숙주 내에서 상기 DNA 의 발현을 유효하게 할 수 있는 적당한 전구서열 (prosequence) (예컨대, 분비성 등) 에 작동가능하게 연결된 프로테아제 (예컨대, 전구체 또는 성숙 프로테아제) 를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "플라스미드" 는 클로닝 벡터로서 사용되는 환형 이중-가닥 (ds) DNA 구축물을 말하며, 이는 일부 진핵생물 또는 원핵생물에서 염색체외부 자가-복제 유전 요소를 형성하거나, 또는 숙주 염색체 내로 통합된다.

본원에서 핵산 서열을 세포 내로 도입시키는 맥락에서 사용되는 바와 같은 용어 "도입" 은 핵산 서열을 세포 내로 전달시키기에 적당한 임의의 방법을 말한다. 이러한 도입 방법으로는 원형질체 융합, 트랜스펙션, 형질전환 (transformation), 접합 및 형질도입 (transduction) 이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다 (예를 들어, Ferrari et al., "Genetics", in Hardwood et al., (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., 57-72 페이지, [1989] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "형질전환된" 및 "안정하게 형질전환된" 은 게놈 내로 통합되거나 또는 2 이상의 세대 동안 유지되는 에피솜 플라스미드로서의 비-고유 (이종) 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 세포를 말한다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계를 맺도록 위치되는 경우 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 분비 리더 (즉, 신호 펩티드) 를 코딩하는 DNA 는 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질 (preprotein) 로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동가능하게 연결되며; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된" 은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우, 인접해 있고 해독기 (reading phase) 에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 연결은 통상의 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 이루어진다. 상기 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 실행에 따라 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "유전자" 는 폴리펩티드를 코딩하고, 코딩 영역 전 후 영역뿐만 아니라, 개별 코딩 분절 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론) 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 분절) 를 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "상동 유전자" 는 상이하지만 일반적으로는 연관된 종으로부터 비롯된 유전자 쌍을 말하며, 상기 상동 유전자는 서로에게 상응하며 서로 일치하거나 또는 매우 유사하다. 상기 용어는 종분화 (즉, 신규 종의 개발) 에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 오르소로그 (orthologous) 유전자) 뿐만 아니라 유전적 복제에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 파라로그 (paralogous) 유전자) 를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "오르소로그" 및 "오르소로그 유전자" 는 종분화에 의해 공통의 조상 유전자 (즉, 상동 유전자) 로부터 진화한 상이한 종의 유전자를 말한다. 전형적으로, 오르소로그는 진화 과정 동안에 동일한 기능을 유지한다. 오르소로그의 규명은 새롭게 서열화된 게놈 중의 유전자 기능을 신뢰할만하게 예측하는데 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "파라로그" 및 "파라로그 유전자" 는 게놈 내에서의 복제에 의해 관련되는 유전자를 말한다. 오르소로그는 진화 과정 동안에 동일한 기능을 유지하는 반면, 파라로그는 비록 일부 기능은 본래의 것과 종종 관련되어 있더라도 새로운 기능을 진화시킨다. 파라로그 유전자의 예에는, 모두 세린 단백질분해 효소이고 동일 종에서 함께 발생하는 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 및 트롬빈을 코딩하는 유전자가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질은 동일한 배열로 있고 동일한 위상 연결을 가진 동일한 주요 2 차 구조를 갖는 경우 공통의 "폴드 (fold)" 를 갖는 것으로 정의된다. 동일한 폴드를 가진 상이한 단백질은 종종 크기 및 형태가 상이한 회전 영역 및 2 차 구조의 주위 요소를 갖는다. 일부 경우, 이러한 상이한 주위 영역은 구조 절반을 포함할 수 있다. 동일한 폴드 카테고리에 함께 놓인 단백질은 반드시 공통의 진화 기원 (예를 들어, 특정 패킹 배열 및 사슬 위상을 선호하는 단백질의 물리 화학으로부터 발생하는 구조적 유사성) 을 갖지는 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "상동" 은 서열 유사성 또는 일치성을 말하며, 일치성이 바람직하다. 상기 상동은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 측정된다 (예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; 프로그램, 예컨대 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA {Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI)}; 및 Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같은 "유사 서열" 은 유전자의 기능이 야생형 서브틸리신 프로테아제를 기초로 한 유전자와 본질적으로 동일한 것이다. 부가적으로, 유사 유전자는 야생형 서브틸리신 프로테아제의 서열과 적어도 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 서열 일치성이 있다. 대안적으로는, 유사 서열은 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 프로테아제 영역에서 발견되는 유전자의 약 70 내지 약 100% 의 정렬을 갖는다. 추가의 구현예에서, 상기 특성 중 하나 초과가 서열에 적용된다. 유사 서열은 공지의 서열 정렬 방법으로 결정된다. 통상 사용되는 정렬 방법은 BLAST 이지만, 상기 및 하기에 나타나있듯이, 또한 서열 정렬에 사용될 수 있는 다른 방법도 있다.

유용한 알고리즘의 하나의 예는 PILEUP 이다. PILEUP 는 진행적, 쌍 방식 정렬을 사용하여 관련 서열 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 작성한다. 이것은 또한 정렬을 작성하는데 사용된 클러스터 관계를 보여주는 계도를 작성할 수 있다. PILEUP 는 Feng and Doolittle, (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]) 의 진행적 정렬 방법의 단순화를 사용한다. 상기 방법은 Higgins and Sharp (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]) 에 기재된 것과 유사하다. 유용한 PILEUP 파라미터는 디폴트 갭 웨이트 3.00, 디폴트 갭 길이 웨이트 0.10, 및 가중된 말단 갭을 포함한다.

또다른 유용한 알고리즘의 예는, Altschul 등 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]; 및 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]) 에 의해 기재되는 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996] 참조). WU-BLAST-2 는 다수의 검색 파라미터를 사용하는데, 이의 대부분은 디폴트 값에 맞춰진다. 조정가능한 파라미터는 하기 값을 사용해 설정된다: 오버랩 (overlap) 간격 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 단어 역치 (word threshold) (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적 값이고, 관심의 서열이 검색되는 특정 데이타베이스의 조성 및 특정 서열의 조성에 따라 다르게 프로그램 자체에 의해 성립된다. 그러나, 상기 값은 민감도를 증가시키도록 조정될 수 있다. 아미노산 서열 일치성 값 % 는 매칭하는 동일한 잔기의 수를 정렬된 영역 내 "더 긴" 서열의 잔기의 총 수로 나누어서 측정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역에서 최대의 실제 잔기를 갖는 서열이다 (정렬 점수를 최대화하기 위해 WU-Blast-2 에 의해 도입된 갭은 무시함).

그러므로, "핵산 서열 일치성의 백분율 (%)" 은 출발 서열 (즉, 관심의 서열) 의 뉴클레오티드 잔기와 일치하는 후보자 서열 내 뉴클레오티드 잔기의 % 로서 정의된다. 상기 방법은 오버랩 간격 및 오버랩 분획이 각각 1 및 0.125 인, 디폴트 파라미터로 설정된 WU-BLAST-2 의 BLASTN 모듈을 사용한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "재조합" 에는 이종 핵산 서열의 도입에 의해 개질된 세포 또는 벡터, 또는 그렇게 개질된 세포로부터 유래된 세포를 말하는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 고유의 (비-재조합) 형태 내에서 동일한 형태로 발견되지 않은 유전자를 발현하거나, 또는 고의적인 인간의 개입의 결과로서 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는, 다르게 비정상적으로 발현되는 고유의 유전자를 발현한다. "재조합," "재조합화," 및 "재조합된" 핵산의 발생은 일반적으로 2 개 이상의 핵산 조각의 조립으로, 조립물은 키메라 유전자를 산출한다.

일부 바람직한 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 하나 이상의 코돈에서의 부위 포화 돌연변이생성으로 발생된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 부위 포화 돌연변이생성은 2 개 이상의 코돈에 대해 수행된다. 추가의 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 야생형 서열과 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 또는 약 98% 초과의 상동을 갖는다. 대안적인 구현예에서, 돌연변이체 DNA 는 임의의 공지된 돌연변이화 과정 예컨대, 방사선조사, 니트로소구아니딘 등을 사용하여 생체 내에서 발생된다. 그 다음, 목적하는 DNA 서열을 단리하고 본원에 제공된 방법에 사용한다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "증폭" 및 "유전자 증폭" 은 증폭된 유전자가 게놈에 초기에 존재했던 것보다 더 높은 카피 수로 존재하게 되도록 특정 DNA 서열이 불균형하게 복제되는 과정을 말한다. 일부 구현예에서, 약물 (예를 들어 억제가능 효소의 억제제) 의 존재 하 성장에 의한 세포의 선별은 약물의 존재 하 성장에 필요한 유전자 산물을 코딩하는 내생 유전자의 증폭, 또는 이러한 유전자 산물을 코딩하는 외생 (즉, 투입) 서열의 증폭, 또는 둘 모두를 야기한다.

"증폭" 은 주형 특이성이 관여되는 핵산 복제의 특이적 경우이다. 이는 비-특이적 주형 복제 (즉, 주형-의존적이지만 특이적 주형에는 의존적이 아닌 복제) 와 대조된다. 주형 특이성은 복제의 충실도 (즉, 적당한 폴리뉴클레오티드 서열의 합성) 및 뉴클레오티드 (리보- 또는 데옥시리보-) 특이성으로 구별된다. 주형 특이성은 종종 "표적" 특이성으로 기재된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 분류하고자 하는 관점에서의 "표적" 이다. 증폭 기술은 주로 이러한 분류를 위해 설계되었다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머" 는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하 (즉, 뉴클레오티드 및 유도제 예컨대 DNA 폴리머라아제의 존재 하, 및 적합한 온도 및 pH 에서) 에 두었을 때 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는, 정제된 제한 소화에서 자연적으로 발생하거나 합성적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 프라이머는 바람직하게는 증폭에서의 최대 효율을 위해 단일 가닥이지만, 대안적으로는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 연장 산물을 제조하기 위해 사용하기 전 그 가닥을 분리하기 위해 1 차 처리된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도제의 존재 하 연장 산물의 합성을 준비하기에 충분하게 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머 공급원 및 방법의 사용을 포함하는 많은 인자에 의존적일 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "탐침" 은 또다른 관심의 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는, 합성적으로, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되거나 정제된 제한 소화물과 같이 자연 발생되는지의 여부에 관계없는 올리고뉴클레오티드 (즉, 일련의 뉴클레오티드) 를 말한다. 탐침은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 탐침은 특정 유전자 서열의 검출, 확인 및 단리에 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 탐침은 효소 (예를 들어, ELISA 뿐만 아니라, 효소-기반 면역화학적 검정법), 형광, 방사능 및 발광 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 검출 시스템으로 검출가능하도록, 임의의 "리포터 분자" 로 표지될 것이 계획된다. 본 발명이 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 폴리머라아제 연쇄 반응과 관련하여 사용되는 경우 용어 "표적" 은, 폴리머라아제 연쇄 반응에 사용되는 프라이머에 의해 결합된 핵산의 영역을 말한다. 그러므로, "표적" 은 다른 핵산 서열로부터 색출된다. "분절" 은 표적 서열 내의 핵산의 영역으로서 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "폴리머라아제 연쇄 반응" ("PCR") 은 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,965,188 호의 방법을 말하고, 여기에는 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA 의 혼합물 중의 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키기 위한 방법이 포함된다. 표적 서열을 증폭하기 위한 상기 과정은 많은 과량의 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 도입한 후, DNA 폴리머라아제의 존재하에서 정확한 순서의 열 사이클을 진행하는 것으로 이루어진다. 2 개의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 각 가닥에 상보적이다. 증폭을 위해, 혼합물을 변성시킨 다음 프라이머를 표적 분자 내 상보적 서열에 대해 어닐링하였다. 어닐링 후, 새로운 쌍의 상보적 가닥을 형성하도록 프라이머를 폴리머라아제로 신장시킨다. 변성, 프라이머 어닐링 및 폴리머라아제 확장 단계는 고농도의, 원하는 표적 서열의 증폭된 분절을 수득하기 위해 수 회 반복될 수 있다 (즉, 변성, 어닐링 및 확장이 하나의 "사이클" 을 구성하며; 다수의 "사이클" 이 있을 수 있다). 원하는 표적 서열의 증폭된 분절의 길이는 서로에 대한 프라이머의 상대적인 위치에 의해 결정되므로, 상기 길이는 조절가능한 파라미터이다. 본 과정의 반복 양상으로 인해, 방법을 "폴리머라아제 연쇄 반응" (이하 "PCR") 이라고 부른다. 표적 서열의 원하는 증폭된 분절이 혼합물 중의 주된 서열이 되기 때문에 (농도에 있어서), 이들을 "PCR 증폭됨" 이라고 부른다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "증폭 시약" 은 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외하고 증폭에 필요한 시약 (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충액 등) 을 말한다. 전형적으로는, 다른 반응 성분과 함께 증폭 시약을 반응 용기 (시험관, 마이크로웰 등) 에 넣고 포함시킨다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "RT-PCR" 은 RNA 서열의 복제 및 증폭을 말한다. 이 방법에서는, 역전사가 PCR 에 커플링되어 있는데, 가장 흔히는 참조로서 본원에 인용된 미국 특허 제 5,322,770 호에 기술된 바와 같은 열안정 폴리머라아제를 이용하는 1 가지 효소 방법을 사용한다. RT-PCR 에서, RNA 주형은 상기 폴리머라아제의 역전사효소 활성에 기인하여 cDNA 로 변환되며, 그 후, 상기 폴리머라아제의 중합활성을 사용하여 증폭된다 (즉, 기타 PCR 방법들에서와 같음).

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소" 는 특정 뉴클레오티드 서열에서 또는 그 근처에서 이중 가닥 DNA 를 각각 절단하는 박테리아 효소를 말한다.

"제한 부위" 는 주어진 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인지 및 절단되는 뉴클레오티드 서열을 말하며, 흔히 DNA 조각의 삽입 부위이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 제한 부위는 선별 마커 및 상기 DNA 구축물의 5' 및 3' 말단 내로 조작된다.

"상동 재조합" 은 동일한 또는 거의 동일한 뉴클레오티드 서열의 부위에서의 2 개의 DNA 분자 또는 쌍을 이룬 염색체들 사이의 DNA 조각의 교환을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 염색체 통합은 상동 재조합이다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "아미노산" 은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이들의 일부를 말한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드" 는 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "관심의 단백질" 및 "관심의 폴리펩티드" 는 목적하는 및/또는 평가되는 단백질/폴리펩티드를 말한다. 일부 구현예에서, 관심의 단백질은 세포내부에서 발현되는 반면, 다른 구현예에서, 이것은 분비된 폴리펩티드이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 효소에는 본 발명의 세린 프로테아제가 포함된다. 일부 구현예에서, 관심의 단백질은 신호 펩티드와 융합된 분비된 폴리펩티드 (즉, 분비되는 단백질 상에 아미노-말단 확장) 이다. 거의 모든 분비된 단백질은 아미노-말단 단백질 확장을 사용하며, 이는 막을 가로지르는 전구체 단백질의 위치이전에, 및 상기 단백질에 표적하는데 중요한 역할을 한다. 상기 확장은 막 이동 동안 또는 그 즉시 신호 펩티다아제에 의해 단백질분해로 제거된다.

폴리뉴클레오티드는 고유의 상태에서 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조작되는 경우, 전사 및/또는 번역되어 RNA, 폴리펩티드 또는 그의 조각을 생산할 수 있는 경우 RNA 또는 폴리펩티드를 "코딩한다" 라고 언급된다. 이러한 핵산의 안티-센스 가닥도 또한 서열을 코딩하는 것으로 언급된다. 당업계에 공지된 바와 같이, DNA 는 RNA 폴리머라아제에 의해 전사되어 RNA 를 생산할 수 있으나, RNA 는 역전사효소에 의해 역전사되어 DNA 를 생산할 수 있다. 그러므로 DNA 는 RNA 를 코딩할 수 있으며 역도 성립한다.

"숙주 균주" 또는 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 DNA 를 포함하는 발현 벡터에 대한 적합한 숙주를 말한다.

효소가 상응하는 야생형 세포에서 발현되는 수준보다 높은 수준으로 세포에서 발현되는 경우 효소는 숙주 세포에서 "과발현" 된다.

용어 "단백질" 및 "폴리펩티드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)] 에 따라 정의된 아미노산에 대한 3 자리 코드가 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된다. 또한 유전적 코드의 퇴행으로 인해 폴리펩티드가 하나 초과의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다는 것이 이해된다.

"전구서열" 은, 신호 서열과 성숙 프로테아제 사이에 존재하는, 프로테아제의 분비에 필요한 아미노산 서열이다. 상기 전구서열의 절단으로 성숙 활성 프로테아제가 생성된다.

용어 "신호 서열" 또는 "신호 펩티드" 는 단백질의 성숙 또는 전구 형태의 분비에 참여할 수 있는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산의 임의 서열을 말한다. 신호 서열에 대한 이 정의는 기능상의 것으로서, 단백질 분비의 유효화에 참여하는, 상기 단백질 유전자의 N-말단 부분에 의해 코딩되는 모든 이러한 아미노산 서열들을 포함하는 것으로 의도된다. 이들은, 보편적인 것은 아니나 종종, 단백질의 N-말단 부분 또는 전구체 단백질의 N-말단 부분에 결합한다. 상기 신호 서열은 내인성일 수도 있고 외인성일 수도 있다. 상기 신호 서열은 상기 단백질 (예를 들어, 프로테아제) 에 정상적으로 결합된 것일 수 있고, 또는 또 다른 분비 단백질을 코딩하는 유전자로부터일 수도 있다. 한 가지 예시적인 외인성 신호 서열은 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) (ATCC 21536) 로부터의 서브틸리신의 신호 서열의 나머지에 융합되는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 서브틸리신으로부터의 신호 서열의 최초 7 개의 아미노산 잔기를 포함한다.

용어 "잡종 신호 서열" 은, 서열 일부가 발현될 유전자의 신호 서열에 융합되는 발현 숙주로부터 수득되는 신호 서열을 말한다. 일부 구현예에서, 합성 서열이 이용된다.

단백질 또는 펩티드의 "성숙" 형태라는 용어는 단백질 또는 펩티드의 최종적인 기능적 형태를 말한다. 예를 들어, 본 발명의 BPN' 서브틸리신 프로테아제의 성숙 형태에는 하기 언급되는 바와 같은, SEQ ID NO:2 의 잔기 위치 1-275 와 일치하는 아미노산 서열이 적어도 포함된다:

단백질 또는 펩티드의 "전구체" 형태라는 용어는, 상기 단백질의 아미노 또는 카르보닐 말단에 작동가능하게 연결된 전구서열을 가진 단백질의 성숙한 형태를 말한다. 전구체는 또한 상기 전구서열의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 "신호" 서열을 가질 수 있다. 상기 전구체는 또한 번역후 활성에 관련된 부가적인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이로부터 절단되어 단백질 또는 펩티드의 성숙한 형태를 남기는 폴리뉴클레오티드) 를 가질 수 있다.

"자연 발생적 효소" 는 자연에서 발견된 서열과 일치하는 미개질 아미노산 서열을 갖는 효소를 말한다. 자연 발생적 효소에는 특정 미생물에서 자연적으로 발현되거나 발견된 효소인 고유의 효소가 포함된다.

용어 "~ 로부터 유래된" 및 "~ 로부터 수득된" 은 문제의 유기체의 균주에 의해 생성되거나 생성되는 프로테아제 뿐만 아니라, 또한 그러한 균주로부터 단리된 DNA 서열에 의해 코딩되고 그러한 DNA 서열을 함유하는 숙주 유기체에서 생성된 효소를 말한다. 부가적으로는, 상기 용어는 합성 DNA 서열 및/또는 cDNA 기원에 의해 코딩되고 문제의 프로테아제의 확인된 특성을 갖는 효소를 말한다.

본 정의 범위 내의 "유도체" 는 일반적으로 유도체가 야생형, 고유형 또는 모체 형태로서 유사한 목적에 유용한 범위로 야생형, 고유형 또는 모체 형태에서 관찰된 단백질분해 활성 특성을 보유한다. 세린 프로테아제의 기능성 유도체는 본 발명의 세린 프로테아제의 일반적 특성을 갖는 자연 발생적, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 펩티드 또는 펩티드 조각을 포함한다.

용어 "기능성 유도체" 는 세린 프로테아제를 코딩하는 핵산의 기능적 특성을 갖는 핵산의 유도체를 말한다. 본 발명의 세린 프로테아제를 코딩하는 핵산의 기능성 유도체는 자연 발생적, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 핵산 또는 조각을 포함하고, 본 발명에 따른 세린 프로테아제 특성을 코딩한다. 본 발명에 따른 세린 프로테아제를 코딩하는 야생형 핵산에는 자연 발생적 대립유전자 및 당업계에 공지된 유전 코드의 축퇴성 (degeneracy) 에 근거한 상동이 포함된다.

2 개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥 중의 용어 "일치하는" 은 하기 서열 비교 또는 분석 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이 최대 대응에 대해 정렬되었을 때 동일한 2 개 서열 중의 잔기를 말한다.

용어 "최적 정렬" 은 가장 높은 % 일치성 점수를 제공하는 정렬을 말한다.

2 개의 아미노산, 폴리뉴클레오티드 및/또는 유전자 서열 (적합하게는) 과 관련된 "% 서열 일치성," "% 아미노산 서열 일치성," "% 유전자 서열 일치성," 및/또는 "% 핵산/폴리뉴클레오티드 서열 일치성," 은, 서열이 최적으로 정렬된 경우 2 개의 서열 중 일치하는 잔기의 % 를 말한다. 그러므로, 80% 아미노산 서열 일치성은 2 개의 최적으로 정렬된 폴리펩티드 서열 중의 아미노산의 80% 가 일치한다는 것을 의미한다.

그러므로 2 개의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 구 "실질적으로 일치하는" 은 표준 파라미터를 사용하는 프로그램 또는 알고리즘 (예를 들어, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 을 사용하여 참조 서열과 비교하여 약 70% 이상의 서열 일치성, 바람직하게는 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 바람직하게는 약 97% 이상, 바람직하게는 약 98% 이상 및 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 일치성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 2 개의 폴리펩티드가 실질적으로 일치한다는 하나의 지표는 첫번째 폴리펩티드가 두번째 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응하는 것이다. 전형적으로는, 보존 아미노산 치환에 의해 상이한 폴리펩티드는 면역학적으로 교차 반응한다. 그러므로, 폴리펩티드는 예를 들어, 2 개의 펩티드가 보존 치환에 의해서만 상이한 경우 두번째 폴리펩티드와 실질적으로 일치한다. 2 개의 핵산 서열이 실질적으로 일치한다는 또다른 지표는 2 개의 분자가 엄격한 조건 (예를 들어, 중간 ~ 높은 엄격함 범위 내) 하에서 서로 혼성화되는 것이다.

본 문맥에서 "동등한" 이라는 구는, 중간 ~ 최대 엄격함 조건 하에서, SEQ ID NO:1 에 제시된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 세린 프로테아제 효소를 말한다. 예를 들어, 동등하다라는 것은 동등한 성숙 세린 프로테아제가 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 갖는 성숙 서브틸리신 프로테아제에 대해 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 및/또는 약 99% 이상의 서열 일치성을 포함하는 것을 의미한다.

용어 "단리된" 또는 "정제된" 은 본래 환경 (예를 들어, 자연적으로 발생되는 경우 자연 환경) 으로부터 제거된 물질을 말한다. 예를 들어, 상기 물질은 자연적으로 발생하는 또는 야생형 유기체에 존재하는 것보다 높은 또는 낮은 농도로 특정 조성물에 존재하거나 또는 자연 발생적 또는 야생형 유기체로부터 발현 시 정상적으로 존재하지 않는 성분과 함께 존재하는 경우 "정제된다" 라고 말한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않으나, 자연계 중의 공존 물질의 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 일부 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 또한, 이러한 벡터 또는 조성물은 자연 환경의 일부가 아닐수도 있다는 점에서 단리될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산 또는 단백질은, 예를 들어, 전기영동 젤 또는 블롯에서 본질적으로 하나의 밴드로 나타나는 경우 정제되었다고 말한다.

DNA 서열을 참조로 사용되는 경우 용어 "단리된" 은, 자연적인 유전 환경으로부터 제거되어 다른 외부적인 또는 원치않는 코딩 서열이 없으며, 유전공학적 단백질 제조 시스템에서 사용하기에 적합한 형태의 DNA 서열을 말한다. 이러한 단리된 분자는 자연 환경으로부터 단리된 것들이고, cDNA 및 게놈 클론이 포함된다. 본 발명의 단리된 DNA 분자는 보통 관련된 기타 유전자가 없고, 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연 발생적 5' 및 3' 미번역 영역이 포함될 수 있다. 관련 영역의 확인은 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985] 참조). 용어 "단리된 DNA 서열" 은 대안적으로는 "클로닝된 DNA 서열" 로 언급된다.

단백질을 참조로 하여 사용되는 경우, 용어 "단리된" 은, 고유의 환경 이외의 상태에서 발견된 단백질을 말한다. 바람직한 형태에서, 단리된 단백질은 다른 단백질, 특히 다른 상동 단백질이 실질적으로 없다. 단리된 단백질은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 약 10% 초과의 순도, 바람직하게는 약 20% 초과의 순도, 심지어 더욱 바람직하게는 약 30% 초과의 순도를 가질 수 있다. 발명의 추가 양상은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 고도로 정제된 형태 (즉, 약 40% 초과의 순도, 약 60% 초과의 순도, 약 80% 초과의 순도, 약 90% 초과의 순도, 약 95% 초과의 순도, 약 97% 초과의 순도, 및 심지어 약 99% 초과의 순도) 의 단백질을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "조합 돌연변이생성" 은 출발 서열의 변이체의 라이브러리가 생성되는 방법을 말한다. 상기 라이브러리에서, 변이체는 미리 정의된 일련의 돌연변이로부터 선택된 하나 또는 여러 돌연변이를 함유한다. 또한, 상기 방법은 미리 정의된 일련의 돌연변이의 일원이 아닌 랜덤 돌연변이를 도입하기 위한 수단을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에는 본원에 참조로서 인용된, 2000 년 10 월 26 일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 09/699,250 호에 언급된 것들이 포함된다. 대안적인 구현예에서, 조합 돌연변이생성 방법은 시판되는 키트 (예를 들어, QuikChange® Multisite, Stratagene, San Diego, CA) 를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "돌연변이체의 라이브러리" 는 게놈의 대부분이 일치하나, 하나 이상의 유전자의 상이한 상동이 포함되는 세포의 집단을 말한다. 이러한 라이브러리는 예를 들어, 개선된 특색을 갖는 유전자 또는 오페론을 확인하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "출발 유전자" 는 본 발명을 사용하여 개선 및/또는 변화된 관심의 단백질을 코딩하는 관심의 유전자를 말한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "다중 서열 배열" ("MSA") 은 알고리즘 (예를 들어, Clustal W) 을 사용하여 배열된 출발 서열의 다중 상동 서열을 말한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 서열" 및 "정준 서열" 은 관심의 특정 단백질 또는 서열의 모든 변이체가 비교되는 것과는 대조되는 전형적인 아미노산 서열을 말한다. 상기 용어는 또한 관심의 DNA 서열에 대부분 종종 존재하는 뉴클레오티드를 언급하는 서열을 말한다. 유전자의 각 위치에 대해, 보존 서열은 MSA 중의 위치에 가장 풍부한 아미노산을 제공한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 돌연변이" 는 출발 유전자 및 보존 서열의 서열의 차이를 말한다. 보존 돌연변이는 MSA 로부터 수득된 출발 유전자 및 보존 서열의 서열을 비교하여 확인된다. 일부 구현예에서, 보존 돌연변이가 출발 유전자 내에 도입되어, 보존 서열과 더욱 유사하게 된다. 보존 돌연변이에는 또한 출발 유전자 중의 아미노산의 빈도와 관련된 위치에서 출발 유전자 중의 아미노산이 MSA 에서 더욱 종종 발견되는 아미노산으로 변경되는 아미노산 변경이 포함된다. 그러므로, 용어 보존 돌연변이는 출발 유전자의 아미노산을 MSA 중의 아미노산보다 더욱 풍부한 아미노산으로 대체하는 모든 단일 아미노산 변화를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "향상된 조합 보존 돌연변이생성 라이브러리" 는 CCM 돌연변이생성 및 스크리닝의 초기 조사로부터의 스크리닝 및/또는 서열분석 결과에 근거해 디자인 및 구축된 CCM 라이브러리를 말한다. 일부 구현예에서, 향상된 CCM 라이브러리는 CCM 의 초기 조사로부터 수득된 초기 적중의 서열을 근거로 한다. 부가적인 구현예에서, 향상된 CCM 은 돌연변이생성 및 스크리닝의 초기 조사로부터의 초기 적중에서 종종 발견된 돌연변이가 바람직하도록 디자인된다. 일부 바람직한 구현예에서, 이것은 성능-감소 돌연변이를 코딩하는 프라이머를 생략하거나 초기 CCM 라이브러리에 사용된 다른 프라이머에 대해 성능-향상 돌연변이를 코딩하는 프라이머의 농도를 증가시켜 달성된다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "성능-감소 돌연변이" 는 비스크리닝된 조합 보존 돌연변이생성 라이브러리와 비교하여 스크리닝으로부터 결과하는 적중에서 좀 덜 자주 발견된 조합 보존 돌연변이생성 라이브러리 중의 돌연변이를 말한다. 바람직한 구현예에서, 스크리닝 방법은 "성능-감소 돌연변이" 를 함유하는 변이체의 풍부함을 제거 및/또는 감소시킨다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "기능성 검정법" 은 단백질의 활성을 유도시키는 검정법을 말한다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 용어는 단백질을 통상의 역량으로 기능하는 능력에 대해 분석하는 검정법 시스템을 말한다. 예를 들어, 효소의 경우, 기능성 검정법에는 반응을 촉진하는 효소의 유효성을 측정하는 것이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "표적 특성" 은 변경되게 되는 출발 유전자의 특성을 말한다. 본 발명이 임의의 특정 표적 특성에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다. 그러나, 일부 바람직한 구현예에서, 표적 특성은 유전자 생성물의 안정성 (예를 들어, 변성, 단백질분해 또는 다른 분해 인자에 대한 내성) 이고, 다른 구현예에서, 생성 숙주에서의 생성 수준은 변경된다. 게다가, 출발 유전자의 임의의 특성을 본 발명에서 발견할 수 있을 것으로 고려된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 핵산의 문맥에서 용어 "특성" 또는 그의 문법적인 동일어는, 선택되거나 검출될 수 있는 핵산의 임의의 특성 또는 속성을 말한다. 이러한 특성에는 폴리펩티드에 대한 결합에 영향을 주는 특성, 특정 핵산을 포함하는 세포에 부여된 특성, 유전자 전사에 영향을 주는 특성 (예를 들어, 프로모터 강도, 프로모터 인지, 프로모터 조절, 인핸서 기능), RNA 가공에 영향을 주는 특성 (예를 들어, RNA 스플라이싱, RNA 안정성, RNA 형태, 및 전사 후 개질), 전사에 영향을 주는 특성 (예를 들어, 수준, 조절, 리보솜 단백질에 대한 mRNA 의 결합, 번역 후 개질) 이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 핵산의 전사 인자, 폴리머라아제, 조절 인자 등에 대한 결합 부위는 바람직한 특성을 생성하거나 바람직하지 않은 특성을 확인하기 위해 변경될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 폴리펩티드 (단백질 포함) 의 문맥에서 용어 "특성" 또는 그의 문법적인 동일어는, 선택되거나 검출될 수 있는 폴리펩티드의 임의의 특성 또는 속성을 말한다. 이러한 특성에는 산화 안정성, 기질 특이성, 촉매 활성, 열 안정성, 알칼리 안정성, pH 활성 프로파일, 단백질분해에 대한 내성, K_M, k_cat, k_cat/k_M 비, 단백질 폴딩, 면역 반응 유도, 리간드에 결합하는 능력, 수용체에 결합하는 능력, 분비되는 능력, 세포의 표면에 전시되는 능력, 올리고머를 형성하는 능력, 신호를 보내는 능력, 세포 증식을 촉진하는 능력, 세포 증식을 억제하는 능력, 세포자멸사를 유도하는 능력, 인산화 또는 글리코실화에 의해 개질되는 능력 및/또는 질환을 치료하는 능력이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "개질된 서열" 및 "개질된 유전자" 는 자연 발생적 핵산 서열의 결실, 삽입 또는 개입을 포함하는 서열을 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 개질 서열의 발현 생성물은 절단된 단백질이다 (예를 들어, 개질이 서열의 결실 또는 개입인 경우). 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 절단된 단백질은 생물학적 활성을 보유한다. 대안적인 구현예에서, 개질 서열의 발현 생성물은 신장된 단백질이다 (예를 들어, 핵산 서열 내의 삽입을 포함하는 개질). 일부 구현예에서, 삽입은 절단된 단백질을 야기한다 (예를 들어, 삽입이 정지 코돈을 형성하는 경우). 그러므로, 삽입은 발현 생성물로서 절단된 단백질 또는 신장된 단백질을 야기할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "돌연변이 서열" 및 "돌연변이 유전자" 는 상호교환적으로 사용되고, 숙주 세포의 야생형 서열에서 발생하는 하나 이상의 코돈에서 변경이 이루어진 서열을 말한다. 돌연변이 서열의 발현 생성물은 야생형과 비교해 변형된 아미노산 서열을 가진 단백질이다. 발현 생성물은 변경된 기능적 역량을 가질 수 있다 (예를 들어, 향상된 효소 활성).

용어 "돌연변이유발 프라이머" 또는 "돌연변이유발 올리고뉴클레오티드" (본원에서 상호교환적으로 사용됨) 는 주형 서열의 일부에 상응하고 그곳에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 조성물을 말하는 것으로 의도된다. 돌연변이유발 프라이머에 있어서, 프라이머는 주형 핵산에 정확하게 부합하지 않을 것이고, 프라이머에서의 미스매치(들) 은 핵산 라이브러리 내에 원하는 돌연변이를 도입하는데 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같은, "비-돌연변이유발 프라이머" 또는 "비-돌연변이유발 올리고뉴클레오티드" 는 주형 핵산에 정확하게 부합할 것인 올리고뉴클레오티드 조성물을 말한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 오직 돌연변이유발 프라이머만이 사용된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 프라이머는 하나 이상의 영역에 돌연변이유발 프라이머가 포함되고, 또한 올리고뉴클레오티드 혼합물에 포함된 또한 비-돌연변이유발 프라이머가 있도록 고안된다. 돌연변이유발 프라이머 중 하나 이상에 상응하는 돌연변이유발 프라이머 및 비-돌연변이유발 프라이머의 혼합물을 첨가하여, 다양한 조합 돌연변이 패턴이 제시된 수득되는 핵산 라이브러리를 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 돌연변이 핵산 라이브러리의 일원 중 일부는 특정 위치에서 그의 전구체 서열을 보존하는 반면, 다른 일원은 상기 위치에서 돌연변이되는 것이 바람직한 경우, 비-돌연변이유발 프라이머는 제시된 잔기에 대한 핵산 라이브러리 내 비-돌연변이 일원의 특정 수준을 수득하는 능력을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 길이가 10-50 개 염기인, 더욱 바람직하게는 길이가 약 15-45 개 염기인 돌연변이유발 및 비-돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 그러나, 원하는 돌연변이생성 결과를 얻기 위해 10 개 염기보다는 짧거나 50 개 염기보다는 긴 길이의 프라이머를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 해당하는 돌연변이유발 및 비-돌연변이유발 프라이머에 있어서, 상응하는 올리고뉴클레오티드의 길이가 일치해야할 필요는 없으나, 첨가되는 돌연변이에 상응하는 영역 중에 중복은 있다. 프라이머는 본 발명에 따른 미리 정의된 비율로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 수득되는 라이브러리가 특정의 특이적인 돌연변이의 수준이 유의하고, 동일 또는 상이한 부위에서 상이한 돌연변이의 양이 더 적은 것이 바람직한 경우, 첨가되는 프라이머의 양을 조절하여, 원하는 방향의 라이브러리를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로는, 비-돌연변이유발 프라이머를 더 적게 또는 더 많이 첨가함으로써, 상응하는 돌연변이(들) 이 돌연변이 핵산 라이브러리에서 생성되는 빈도를 조정하는 것이 가능하다.

본원에 사용되는 바와 같은, 어구 "인접 돌연변이" 는 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머 내에 존재하는 돌연변이를 말한다. 예를 들어, 인접 돌연변이는 서로 인접하거나 근처에 있을 수 있으나, 이들은 동일한 프라이머에 의해 수득되는 돌연변이 주형 핵산 내에 도입될 것이다.

용어 "야생형 서열" 또는 "야생형 유전자" 는 숙주 세포에서 고유의 서열 또는 자연적으로 발생하는 서열을 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 야생형 서열은 단백질 조작 계획의 시작점인 관심의 서열 (즉, "모체" 서열) 을 말한다. 야생형 서열은 상동 또는 이종 단백질을 코딩할 수 있다. 상동 단백질은 숙주 세포가 개입 없이 생성할 단백질이다. 이종 단백질은 숙주 세포가 개입이 없다면 생성하지 않을 단백질이다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "프로테아제 변이체", "서브틸리신 변이체", "서브틸리신 프로테아제 변이체" 는 단백질 조작에서 출발 지점으로서 사용되는 야생형 서브틸리신 또는 모체 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신) 와 유사한 프로테아제를 참조로 하여 사용된다. 이들 변이체는 야생형 또는 다른 모체와 기능이 유사하나, 야생형 또는 모체 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신) 와 서열이 상이하게 되는 아미노산 서열 내 돌연변이를 갖는다.

다르게 나타내지지 않는다면, 아미노산 위치 수는 SEQ ID NO:2 의 성숙 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 서열에 배정된 수를 말한다. 그러나 본 발명은 상기 특정 서브틸리신의 돌연변이에 제한되는 것이 아니라, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신에서 특정 확인된 잔기와 "동등한" 위치에 아미노산 잔기를 함유하는 전구체 프로테아제까지 확장된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "개질" 및 "돌연변이" 는 아미노산 서열 내의 임의의 변화 또는 변경을 말한다. 이 용어가 관심의 아미노산 서열 (예를 들어, 서브틸리신 서열) 내 아미노산 측쇄의 치환, 결실, 삽입 및/또는 대체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한 관심의 아미노산 서열 (예를 들어, 서브틸리신 서열) 의 화학적 개질을 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "산화에 안정한" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 절차, 예를 들어 표백제 또는 산화제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 제시된 시간에 걸쳐 특이적 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 약 1 분, 약 3 분, 약 5 분, 약 8 분, 약 12 분, 약 16 분, 약 20 분 등의 제시된 시간에 걸쳐 표백제 또는 산화제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 안정성은 실시예에 기재되는 바와 같이 측정된다.

용어 "킬레이트제에 안정한" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 절차, 예를 들어 킬레이트제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 제시된 시간에 걸쳐 특이적 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 약 10 분, 약 20 분, 약 40 분, 약 60 분, 약 100 분 등의 제시된 시간에 걸쳐 킬레이트제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 킬레이트제 안정성은 실시예에 기재되는 바와 같이 측정된다.

용어 "열적으로 안정한" 및 "열안정성" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 절차, 예를 들어 변형된 온도에 노출되는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 제시된 시간에 걸쳐 확인된 온도에 노출 후 특이적 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 효소를 말한다. 변형된 온도에는 증가 또는 감소된 온도가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 약 60 분, 약 120 분, 약 180 분, 약 240 분, 약 300 분 등의 제시된 시간에 걸쳐 변형된 온도에 노출된 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 열안정성은 실시예에 기재되는 바와 같이 측정된다.

산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "향상된 안정성" 은 기타 세린 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신 프로테아제) 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 높은 단백질분해 활성을 보유하는 것을 말한다.

산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "감소된 안정성" 은 기타 세린 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신 프로테아제) 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 낮은 단백질분해 활성을 보유하는 것을 말한다.

용어 "세정 활성" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법 동안 널리 행해지는 조건 하에서 프로테아제에 의해 달성되는 세정 성능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세정 성능은 얼룩을 표준 세정 조건에 적용 후 다양한 크로마토그래피, 분광광도계 또는 다른 정량 방법론에 의해 측정된 바와 같이 예를 들어 잔디, 혈액, 우유, 또는 계란 단백질과 같은 효소 민감성 얼룩과 관련된 다양한 세정 검정법의 적용에 의해 측정된다. 예시적 검정법에는 WO 99/34011 및 미국 특허 제 6,605,458 호 (모두 참조로서 본원에 인용됨) 에 기재된 것들뿐만 아니라, 실시예에 포함된 방법들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 프로테아제의 "세정 유효량" 은 특정 세정 조성물에서 원하는 수준의 효소 활성을 달성하는 본원에서 이전에 기재된 프로테아제의 양을 나타낸다. 이러한 유효량은 당업자에 의해 쉽게 확인되며, 사용되는 특정 프로테아제, 세정 적용, 세정 조성물의 특정 조성, 및 액체 또는 건조 (예를 들어 과립, 바) 조성물이 필요한지의 여부 등과 같은 많은 인자에 근거한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세정 보조 물질" 은, 특정 유형의 바람직한 세정 조성물 및 생성물 형태 (예를 들어 액체, 과립, 분말, 바, 페이스트, 스프레이, 정제, 젤; 또는 발포성 조성물) 로부터 선택되는 임의의 액체, 고체 또는 기체 물질을 의미하고, 상기 물질은 또한 바람직하게는 조성물에 사용되는 프로테아제 효소와 상용성이다. 일부 구현예에서, 과립 조성물은 "압축" 형태이고, 다른 구현예에서, 액체 조성물은 "농축" 형태이다.

세정 활성의 문맥에서 용어 "향상된 성능" 은 표준 세정 사이클 및/또는 다중 세정 사이클 후 통상의 평가에 의해 측정된 바와 같은 계란, 우유, 잔디 또는 혈액과 같은 특정 효소 민감성 얼룩의 증가된 또는 더 큰 세정 활성을 말한다.

세정 활성의 문맥에서 용어 "감소된 성능" 은 표준 세정 사이클 후 통상의 평가에 의해 측정된 바와 같은 계란, 우유, 잔디 또는 혈액과 같은 특정 효소 민감성 얼룩의 감소된 또는 더 적은 세정 활성을 말한다.

세정 활성의 문맥에서 용어 "비교 성능" 은 OPTIMASE™ 프로테아제 (Genencor), PURAFECT™ 프로테아제 제품 (Genencor), SAVINASE™ 프로테아제 (Novozymes), BPN'-변이체 (예를 들어 미국 특허 번호 Re 34,606 호 참조), RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE™, KANNASE™ 프로테아제 (Novozymes), MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE™ 프로테아제 (Genencor; 또한 미국 특허 번호 Re 34,606 호 및 미국 특허 번호 5,700,676 호; 5,955,340 호; 6,312,936 호; 및 6,482,628 호 참조), 및 B. 렌투스 (B. lentus) 변이체 프로테아제 제품 [예를 들어, WO 92/21760, WO 95/23221 및/또는 WO 97/07770 에 기재되어 있는 것들] 을 포함하나 이에 제한되지 않는 비교 서브틸리신 프로테아제 (예를 들어, 시판되는 프로테아제) 의 세정 활성의 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상을 말한다.

세정 성능은 표준 세정 사이클 조건 후 통상의 분광 광도적 또는 분석 방법론에 의해 측정된 바와 같은 잔디, 혈액 또는 우유와 같은 효소 민감성 얼룩에 관한 다양한 세정 검정법에서 본 발명의 프로테아제와 이러한 서브틸리신 프로테아제를 비교하여 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "세정 조성물" 및 "세정 제형" 은 섬유, 식기, 콘택트 렌즈, 기타 고체 기질, 모발 (샴푸), 피부 (비누 및 크림), 치아 (구강청정제, 치약) 등과 같은 세정되어야 하는 품목으로부터 원치않는 화합물을 제거하는데 사용되는 조성물을 말한다. 상기 용어는 조성물이 조성물에 사용되는 퍼히드롤라아제 및 기타 효소(들) 과 상용성인 한, 특정 유형의 바람직한 세정 조성물 및 생성물 형태 (예를 들어, 액체, 젤, 과립 또는 스프레이 조성물) 에 대해 선택된 임의의 물질/화합물을 포함한다. 세정 조성물 물질의 구체적인 선택은 세정되는 표면, 품목 또는 섬유 및 사용 동안의 세정 조건에 대한 바람직한 조성물의 형태를 고려하여 쉽게 선택된다.

상기 용어는 추가로 임의의 대상 및/또는 표면을 세정, 표백, 살균 및/또는 멸균하기에 적합한 임의의 조성물을 말한다. 이 용어에는 세제 조성물 (예를 들어, 액체 및/또는 고체 세탁 세제 및 미세 섬유 세제; 경질 표면 세정 제형, 예컨대 유리, 목재, 세라믹 및 금속 커운터 탑 및 창문용; 카페트 세정제; 오븐 세정제; 섬유 청정제; 섬유 유연제; 및 직물 및 세탁 전-스팟제 뿐 아니라 식기 세제) 이 포함되나 이에 제한되지 않는 것으로 의도된다.

게다가, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세정 조성물" 에는, 다르게 언급되지 않는 한, 과립 또는 분말 형태의 다목적 또는 강력 ("heavy-duty") 세정제, 특히 세정 세제; 액체, 겔 또는 페이스트 형태의 다목적 세정제, 특히 소위 강력 액체 (HDL) 형; 액체 미세-섬유 세제; 손 식기세정제 또는 경량 식기세정제, 특히 고발포형의 것; 가정 및 영업용의 다양한 정제, 과립, 액체 및 헹굼 보조 유형을 포함하는 기계 식기세정제; 항균 손 세정 유형, 세정 바, 구강세정제, 의치 세정제, 차량 또는 카페트 샴푸, 욕실 세정제를 비롯한 세정 및 소독제; 헤어 샴푸 및 헤어 린스; 샤워 젤 및 거품 목욕제 및 금속 세정제뿐만 아니라; 표백 첨가제 및 "얼룩-막대" 또는 전처리 유형과 같은 세정 보조제가 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "세제 조성물" 및 "세제 제형" 은 오염된 물체의 세정을 위해 세정 매질에서 사용하기로 의도된 혼합물을 참조하여 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 용어는 섬유 및/또는 의복의 세탁 (예를 들어, "세탁 세제") 을 참조하여 사용된다. 대안적인 구현예에서, 상기 용어는 식기, 수저 등을 세정하는데 사용되는 세제 (예를 들어, "식기세정 세제") 와 같은 기타 세제를 말한다. 본 발명이 임의의 특정 세제 제형 또는 조성물에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다. 또한 용어에는 계면활성제, 트랜스퍼라아제(들), 가수분해 효소, 산화 환원 효소, 세정강화제, 표백제, 표백 활성화제, 청색화제 (bluing agent) 및 형광 염료, 케이크화 (caking) 억제제, 차폐제, 효소 활성화제, 항산화제, 및 가용화제를 함유하는 세제가 포함되는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "섬유 세정 조성물" 에는 세탁 첨가 조성물 및 얼룩진 섬유 (예를 들어, 옷감, 린넨 및 기타 직물 물질의 담금 및/또는 전처리에 사용하기에 적합한 조성물을 비롯한 손세탁 및 기계 세탁 세제 조성물이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "비-섬유 세정 조성물" 에는 식기세정 세제 조성물, 구강 세정 조성물, 양치 세정 조성물, 및 개인 세정 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-직물 (즉, 섬유) 표면 세정 조성물이 포함된다.

본원의 세정 조성물의 "압축" 형태는 밀도에 의해, 그리고 조성에 있어서 무기 충전제 염의 양에 의해 가장 잘 반영된다. 무기 충전제 염은 분말 형태의 세제 조성물이 통상적인 성분이다. 통상적인 세제 조성물에서, 충전제 염은 상당한 양으로, 전형적으로 총 조성의 약 17 내지 약 35 중량% 로 존재한다. 반대로, 압축 조성물에서, 충전제 염은 총 조성의 약 15% 를 넘지 않는 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 충전제 염은 조성의 약 10 중량% 를 넘지 않는 양으로, 또는 더욱 바람직하게는 약 5 중량% 로 존재한다. 일부 구현예에서, 무기 충전제 염은 술페이트 및 클로라이드의 알칼리 및 알칼리 토금속 염으로부터 선택된다. 바람직한 충전제 염은 나트륨 술페이트이다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "계면활성제" 라는 용어는 계면 활성 특성을 갖는 것으로 당업계에서 일반적으로 인지되는 임의의 화합물을 말한다. 계면활성제에는 일반적으로, 음이온성, 양이온성, 비이온성, 및 쯔비터성 화합물이 포함되며, 이들은 본원에서 추가로 설명된다.

실시예

본 발명은 어떤 식으로든 청구되는 본 발명의 범주를 제한하지 않도록 의도되는 이하 실시예에서 더욱 상세히 기재되고 있다. 첨부된 도면은 본 발명의 명세서 및 기재의 완전한 일부로서 고려되는 것으로 의미된다. 하기 실시예는 청구된 본 발명을 설명하기 위해 제공되나 이를 제한하려는 것은 아니다.

하기 실험 설명에 있어서, 하기 약어가 적용된다: PI 또는 Pi (Performance Index: 성능 지수), ppm (백만 당 부); M (몰농도); mM (밀리몰농도); μM (마이크로몰농도); nM (나노몰농도); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); gm (그램); mg (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); pg (피코그램); L (리터); ㎖ 및 mL (밀리리터); ㎕ 및 ㎕ (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); nm (나노미터); U (단위); V (볼트); MW (분자량); sec (초); min(s) (분(s)); h(s) 및 hr(s) (시간(s)); ℃ (섭씨온도); QS (충분한 품질); ND (수행하지 않음); NA (이용불가능); rpm (분 당 회전수); H₂O (물); dH₂O (탈이온수); (HCl (염산); aa (아미노산); bp (염기쌍); kb (킬로염기쌍); kD (킬로달톤); cDNA (카피 또는 상보성 DNA); DNA (데옥시리보핵산); ssDNA (단일 가닥 DNA); dsDNA (이중 가닥 DNA); dNTP (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트); RNA (리보핵산); MgCl₂ (염화마그네슘); NaCl (염화나트륨); w/v (중량 대 부피); v/v (부피 대 부피); g (중력); OD (광학 밀도); 둘베코 인산염 완충 용액 (DPBS); SOC (2% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto Yeast Extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl); Terrific Broth (TB; 12 g/ℓ Bacto Tryptone, 24 g/ℓ 글리세롤, 2.31 g/ℓ KH₂PO₄, 및 12.54 g/ℓ K₂HPO₄); OD₂₈₀ (280 nm 에서의 광학 밀도); OD₆₀₀ (600 nm 에서의 광학 밀도); A₄₀₅ (405 nm 에서의 흡광도); V_최대 (효소 촉매 반응의 최대 초기 속도); PAGE (폴리아크릴아미드 젤 전기영동); PBS (인산염 완충 식염수 [150 mM NaCl, 10 mM 나트륨 인산염 완충액, pH 7.2]); PBST (PBS+0.25% TWEEN® 20); PEG (폴리에틸렌 글리콜); PCR (폴리머라아제 연쇄 반응); RT-PCR (역전사 PCR); SDS (나트륨 도데실 술페이트); Tris (트리스(히드록시메틸)아미노메탄); HEPES (N-[2-히드록시에틸]피페라진-N-[2-에탄술폰산]); HBS (HEPES 완충 식염수); Tris-HCl (트리스[히드록시메틸]아미노메탄-히드로클로라이드); Tricine (N-[트리스-(히드록시메틸)-메틸]-글리신); CHES (2-(N-시클로-헥실아미노)에탄-술폰산); TAPS (3-{[트리스-(히드록시메틸)-메틸]-아미노}-프로판술폰산); CAPS (3-(시클로-헥실아미노)-프로판-술폰산; DMSO (디메틸 술폭시드); DTT (1,4-디티오-DL-트레이톨); SA (시나핀산 (s,5-디메톡시-4-히드록시 신남산); TCA (트리클로로아세트산); Glut 및 GSH (환원 글루타티온); GSSG (산화 글루타티온); TCEP (트리스[2-카르복시에틸]포스핀); Ci (큐리); mCi (밀리큐리); μCi (마이크로큐리); HPLC (고압 액체 크로마토그래피); RP-HPLC (역상 고압 액체 크로마토그래피); TLC (박층 크로마토그래피); MALDI-TOF (매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화법-비행시간형); Ts (토실); Bn (벤질); Ph (페닐); Ms (메실); Et (에틸), Me (메틸); Taq (테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) DNA 폴리머라아제); Klenow (DNA 폴리머라아제 I 대형 (Klenow) 조각); EGTA (에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산); EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산); bla (β-락타마아제 또는 암피실린-내성 유전자); HDL (고밀도 액체); MJ Research (MJ Research, Reno, NV); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, the Netherlands); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, San Jose, CA); Argo (Argo BioAnalytica, Morris Plains, NJ); Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Germany); Pall (Pall Corp., East Hills, NY); Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Woodlands, TX); Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, CA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, the Netherlands); Test Fabrics (Test Fabrics, Inc., West Pittiston, PA), Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); Epicentre (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI); GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom); OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, Ireland); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finland); Kelco (CP Kelco, Wilmington, DE); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA); Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Norway); Dynal (Dynal, Oslo, Norway); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island , NY); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA); BD Biosciences 및/또는 Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); Mediatech (Mediatech, Herndon, VA; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ); GIBCO BRL 또는 Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Millipore (Millipore, Billerica, MA); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); New England Biolabs 및 NEB (New England Biolabs, Ipswich, MA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japan); Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine); Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA); Sorvall (Sorvall brand, from Kendro Laboratory Products, Asheville, NC); United States Testing (United States Testing Co., Hoboken, NJ); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA); R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, CA); Gene Oracle (Gene Oracle, Mountain View, CA); Zymo Research (Zymo Research, Orange, CA); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT); Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ); PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, NJ); SynPep (SynPep, Dublin, CA); New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA); Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO); Wintershall (Wintershall AG, Kassel, Germany); BASF (BASF Co., Florham Park, NJ); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT); Enichem (Enichem Iberica, Barcelona, Spain); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, the Netherlands); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, MI); 및 Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA).

실시예 1

검정법

하기 실시예에서, 판독의 용이성을 위해 하기 언급되는 바와 같은 다양한 검정법을 사용하였다. 하기 제공되는 프로토콜의 임의의 편차는 실시예에 표시된다. 본 발명에서, 서브틸리신 넘버링은 하기 언급되는 바와 같은 성숙 BPN' 서열의 넘버링에 상응한다:

A. 96 웰 마이크로타이터 플레이트 내 단백질 함량 측정을 위한 TCA 검정법

BPN' (예를 들어, 참조 프로테아제) 및 BPN' 변이체의 경우, 본 검정법은 가습 통기 및 230 rpm 에서 교반하면서 33℃ 로 3-4 일 성장시킨 마이크로타이터 플레이트로부터의 여과된 배양 상청액을 사용하여 시작하였다. 본 검정법을 위해 새로운 96 웰 평평 바닥 마이크로타이터 플레이트 (MTP) 를 사용하였다. 먼저, 각 웰에 0.25 N HCl 을 100 ㎕/웰로 넣었다. 그 다음, 50 ㎕ 의 여과된 배양 브로스를 첨가하였다. 그 다음 "빈칸" 판독값을 제공하기 위해 405 nm 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기 내 5 초 혼합 방식 사용) 를 측정하였다. 시험을 위해, 플레이트에 100 ㎕/웰의 15% (w/v) 트리클로로아세트산 (TCA) 을 넣고, 실온에서 5 내지 30 분 인큐베이션시켰다. 그 다음 405 nm 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기 내 5 초 혼합 방식 사용) 를 측정하였다.

사용된 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter) 및 SpectraMAX (유형 340; Molecular Devices) MTP Reader 였고; MTP 는 Costar (유형 9017) 이었다. 사용된 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter) 및 SpectraMAX 유형 340 (Molecular Devices) MTP Reader 였고; MTP 는 유형 9017 (Costar) 이었다.

TCA 로의 시험 판독값에서 빈칸 (TCA 없음) 을 빼서 계산하여, 샘플 내 단백질 함량의 상대적인 측정값을 제공하였다. 원한다면, 클론의 AAPF 검정법으로의 TCA 판독값을 공지된 전환 인자에 검정함으로써 표준 곡선을 생성할 수 있다. 그러나, TCA 결과는 1 ml 당 50 내지 500 단백질의 단백질 농도 (ppm) 에 대해 선형이고, 그러므로 양호한 성능 변이체를 선택하고자 하는 목적을 위해 효소 성능에 대해 직접적으로 작성될 수 있다. 샘플 내 탁도/광 산란 증가는 배양 상청액 내 침전가능한 단백질의 총 양과 상관관계가 있다

B. 96 웰 마이크로타이터 플레이트 내 AAPF 프로테아제 검정법

본 발명의 프로테아제 및 이의 변이체의 프로테아제 활성을 측정하기 위해, N-숙시닐-L-알라닐-L-알라닐-L-프롤릴-L-페닐-p-니트로아닐리드 (suc-AAPF-pNA) 의 가수분해를 측정하였다. 사용된 시약 용액은 다음과 같았다: 0.005% TWEEN®-80 함유 100 mM Tris/HCl, pH 8.6 (Tris 희석 완충액); 10 mM CaCl₂ 및 0.005% TWEEN®-80 함유 100 mM Tris 완충액, pH 8.6 (Tris/Ca 완충액); 및 DMSO 내 160 mM suc-AAPF-pNA (suc-AAPF-pNA 저장액) (Sigma: S-7388). suc-AAPF-pNA 작동 용액을 제조하기 위해, 1 ml suc-AAPF-pNA 저장액을 100 ml Tris/Ca 완충액에 첨가하고, 10 초 이상 잘 혼합하였다. 각 웰에 10 ㎕ 의 희석된 프로테아제 용액을 첨가하고, 직후에 190 ㎕ 1 mg/ml suc-AAPF-pNA 작동 용액을 첨가함으로써 검정법을 수행하였다. 5 초 동안 용액을 혼합하고, 25℃ 에서, MTP 판독기로 410 nm 에서 동적 방식의 흡광도 변화 (5 분 내 20 회 판독) 를 판독하였다. 프로테아제 활성을 AU (활성 = ΔOD·분^-1 ml^-1) 로서 표현하였다.

C. 계면활성제 및 킬레이트제 안정성 검정법

AAPF 검정법을 사용하여 측정된 잔류 활성의 함수로서, LAS 및 LAS/EDTA 각각의 존재하에서 시험 프로테아제의 인큐베이션 후 LAS 및 LAS/EDTA 안정성을 측정하였다.

LAS 안정성 방법

시약:

도데실벤젠술포네이트, 나트륨 염 (=LAS): Sigma D-2525

TWEEN®-80: Sigma P-8074

TRIS 완충액 (유리산): Sigma T-1378); 6.35 g 을 약 960 ml 물에 용해시킴; 4N HCl 로 pH 를 8.2 로 조절함. TRIS 의 최종 농도는 52.5 mM 이다.

LAS 저장액: MQ 물 중 10.5% LAS 용액으로 제조함 (= 100 ml MQ 당 10.5 g)

TRIS 완충액-100 mM / pH 8.6 (100 mM Tris/0.005% TWEEN®80)

TRIS-Ca 완충액, pH 8.6 (100 mM Tris/10 mM CaCl₂/0.005% TWEEN®80).

하드웨어:

평평 바닥 MTP (Costar No. 9017)

Biomek FX

ASYS 멀티피펫

Spectramax MTP 판독기

iEMS 인큐베이터/진탕기

Innova 4330 인큐베이터/진탕기

Biohit 멀티채널 피펫

BMG Thermostar 진탕기.

52.5 mM Tris 완충액 pH 8.2 내 0.063% LAS 용액을 제조하였다. 1 ml 의 100 mg/ml suc-AAPF-pNA 저장액 (DMSO 중) 을 100 ml (100 mM) TRIS 완충액, pH 8.6 에 첨가함으로써 suc-AAPF-pNA 작동 용액을 제조하였다. 상청액을 희석하기 위해, 평평 바닥 플레이트를 희석 완충액으로 채우고, 상청액의 분취물을 첨가하고 충분히 혼합하였다. 희석 비율은 성장 플레이트 (AAPF 활성) 내 프로테아제 대조군의 농도에 따라 다르다. 원하는 단백질 농도는 80 ppm 이었다.

10 ㎕ 의 희석된 상청액을 190 ㎕ 0.063% LAS 완충액/웰에 첨가하였다. 테이프로 MTP 를 덮고, 수 초 동안 흔들어, 인큐베이터 (Innova 4230) 넣어 45℃ 에서 60 분 동안 200 rpm 로 교반하였다. 각 웰 내 혼합물 10 ㎕ 을 190 ㎕ suc-AAPF-pNA 작업 용액이 함유된 새로운 MPT 로 옮겨 인큐베이션 10 분 후 초기 활성 (t=10 분) 을 측정하였다. 상기 용액을 충분히 혼합하고, MTP 판독기 (5 분 내 25℃ 에서 20 회 판독) 를 사용하여 AAPF 활성을 측정하였다.

60 분 인큐베이션 후 인큐베이션 플레이트에서 또다른 10 ㎕ 의 용액을 제거하여 최종 활성 (t=60 분) 을 측정하였다. 그 다음 상기 기재한 바와 같이 AAPF 활성을 측정하였다. 샘플의 안정성을, 하기와 같이 잔류 및 초기 AAPF 활성의 비를 계산하여 측정하였다:

잔류 활성 (%) = [t-60 값]* 100 / [t-10 값].

LAS / EDTA 안정성 방법

정의된 조건 하에서의 인큐베이션 후 대표적인 음이온성 계면활성제 (LAS=선형 알킬벤 술포네이트, 나트륨 도데실벤젠술포네이트-DOBS) 및 디-나트륨 EDTA 의 존재 하에서의 프로테아제 변이체의 안정성을 측정하고, AAPF 검정법을 사용하여 잔류 활성을 측정하였다. 사용된 시약은 도데실벤젠 술포네이트, 나트륨 염 (DOBS, Sigma No. D-2525), TWEEN®-80 (Sigma No. P-8074), 디-나트륨 EDTA (Siegfried Handel No. 164599-02), HEPES (Sigma No. H-7523), 비-스트레스 완충액: 50 mM HEPES (11.9 g/ℓ) + 0.005% TWEEN®-80, pH 8.0, 스트레스 완충액: 50 mM HEPES (11.9 g/ℓ), 0.1% (w/v) DOBS (1 g/ℓ), 10 mM EDTA (3.36 g/ℓ), pH 8.0, 참조 프로테아제 및 프로테아제 변이체 배양 상청액 (200 - 400 ㎍/ml 단백질 함유) 였다. 사용된 기기는 희석 플레이트로서 V- 또는 U-바닥 MTP (각각 Greiner 651101 및 650161), 비-스트레스 및 LAS/EDTA 완충액 뿐 아니라, suc-AAPF-pNA 플레이트용의 F-바닥 MTP (Corning 9017), Biomek FX (Beckman Coulter), Spectramax Plus 384 MTP 판독기 (Molecular Devices), iEMS 인큐베이터/진탕기 (1 mm 진폭), Thermo Electron Corporation 사제, 밀봉 테이프: Nunc (236366) 였다.

iEMS 인큐베이터/진탕기 (Thermo/Labsystems) 를 29℃ 로 설정하였다. 비-스트레스 완충액을 함유하는 플레이트에 배양 상청액을 ~ 25 ppm 의 농도로 희석하였다 (마스터 희석 플레이트). 마스터 희석 플레이트로부터 20 ㎕ 의 샘플을 180 ㎕ 비-스트레스 완충액을 함유하는 플레이트에 첨가하여 2.5 ppm 의 최종 인큐베이션 농도를 산출하였다. 내용물을 혼합하고 실온에서 유지하고, 상기 플레이트 상에서 AAPF 검정법을 수행하였다. 또한 마스터 희석 플레이트로부터 20 ㎕ 의 샘플을 180 ㎕ 스트레스 완충액 (50 mM HEPES (11.9 g/ℓ), 0.1 % (w/v) DOBS (1 g/ℓ), 10 mM EDTA (3.36 g/ℓ), pH 8.0) 을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 용액을 혼합하고, 즉시 29℃ iEMS 진탕기에 30 분 동안 400 rpm 으로 두었다. 30 분 인큐베이션 후, 스트레스 플레이트 상에서 AAPF 검정법을 수행하였다. 샘플의 안정성을, 하기와 같이 잔류 및 초기 AAPF 활성의 비를 계산하여 측정하였다:

잔류 활성 (%) = [mOD·분^-1 스트레스]*100 / [mOD·분^-1 비-스트레스].

D. 세정 성능 검정법

프로테아제 변이체의 얼룩 제거 성능을 시판 세제에서 측정하였다. 시판 세제 제형의 가열 비활성화는 비-효소적 성분의 특성을 유지하면서 임의의 단백질 성분의 효소 활성을 파괴시키기 위한 것이다. 그러므로, 본 방법은 본 발명의 효소 변이체의 시험에 사용하기 위해 시판 세제를 준비시키는데 적합하였다.

마이크로천조각 :

CFT 에서 ¼" 원형 직경의 마이크로천조각을 주문하였다. 1 개의 마이크로천조각 또는 2 개의 마이크로천조각을 전체 표면적이 노출되도록 수직으로 (즉, 웰의 바닥에 평평하지 않게) 96 웰 MTP 의 각 웰에 놓았다.

BMI 마이크로천조각 검정법

0.25 인치 원형 직경의 혈액 우유 및 잉크 (BMI) 를 함유하는 마이크로천조각을 CFT 로부터 주문하였다. 천조각을 자르기 전에, 섬유 (EMPA 116) 를 물로 세정하였다. 1 개의 마이크로천조각을 전체 표면적이 노출되도록 수직으로 (즉, 웰의 바닥에 평평하지 않게) 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 놓았다. 원하는 세제 용액을 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 25℃ 로 Thermomixer 의 평형을 맞춘 후, 190 ㎕ 의 세제 용액을 마이크로천조각을 함유하는 MTP 의 각 웰에 첨가하였다. 상기 혼합물에, 10 ㎕ 의 희석된 효소 용액을, 최종 효소 농도가 1 ㎍/ml (BCA 검정법으로 측정됨) 이 되도록 첨가하였다. MTP 를 테이프로 밀봉하고, 1400 rpm 에서 진탕하면서 인큐베이터에 30 분 동안 두었다. 적합한 조건하에서의 인큐베이션 후, 각 웰로부터 100 ㎕ 의 용액을 새로운 MTP 로 옮겼다. 100 ㎕ 의 용액/웰을 함유하는 새로운 MTP 를 MTP 판독기를 사용하여 405 nm 에서 판독하였다. 빈칸 대조군 뿐 아니라, 2 개의 마이크로천조각 및 세제를 함유하나 효소는 함유하지 않는 대조군을 또한 포함시켰다.

"예비 세정된 " 마이크로천조각

상기 유형의 마이크로천조각을 탈이온수에서 20 분 동안 주위 온도에서 예비 세정하였다. 예비 세정 단계 후, 천조각을 페이퍼 타올에 올려두고 건조시켰다. 그 다음 공기 건조된 천조각을 배출 프레스 상의 ¼" 원형 다이를 사용하여 펀칭하였다. 마지막으로, 2 개의 마이크로천조각을 전체 표면적이 노출되도록 수직으로 (즉, 웰의 바닥에 평평하지 않게) 96 웰 MTP 의 각 웰에 놓았다.

세제

북미 (NA) 및 서유럽 (WE) 강력 액체 세탁 (HDL) 세제에 있어서 2 시간 동안 95℃ 의 수조에 (유리병에서) 미리 칭량된 액체 세제를 넣어 가열 비활성화를 수행하였다. 상기 세제를 지역 슈퍼마켓 가게에서 구입하였다. 비-가열 및 가열된 세제 모두를, 세제가 용해되는 5 분 내에 검정하여, 비활성화된% 를 정확하게 측정하였다. 효소 활성을 AAPF 검정법으로 시험하였다.

가열-비활성화된 세제에서의 효소 활성을 시험하기 위해, 세제의 작동 용액을 가열 비활성화된 저장액으로부터 제조하였다. 적절한 양의 물 경도 (6 gpg 또는 12 gpg) 및 완충액을 목적한 조건에 부합하도록 세제 용액에 첨가하였다. 병을 와류교반 (vortexing) 또는 상하교반 (inverting) 시켜 용액을 혼합하였다.

효소 및 기기

참조 세린 프로테아제 이의 변이체의 샘플을 MTP 플레이트에서 성장한 배양물의 여과된 배양 브로스로부터 수득하였다. 사용된 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter), SpectraMAX MTP Reader (유형 340; Molecular Devices), iEMS 인큐베이터/진탕기 (Thermo/Labsystems); F-바닥 MTP (인큐베이션 후 반응 플레이트 판독에 사용되는 Costar 유형 9017); 및 V-바닥 MTP (상청액의 예비 희석에 사용되는 Greiner 651101) 였다. 본 검정법에서, 프로테아제는 기질을 가수분해하여, 기질로부터 안료 및 불용성 입자를 방출시킨다. 그러므로 탁도 비는 효소 활성의 측정값이다.

마이크로천조각에 대한 참조 세린 프로테아제 및 이의 변이체의 얼룩 제거 성능을 시판 가열 비활성화 세제에서 MTP 규모에 대해 측정하였다. 사용된 시약은 다음과 같았다: 5 mM HEPES, pH 8.0 또는 5 mM MOPS, pH 7 완충액, 중간 물 경도의 경우 3:1 Ca:Mg (CaCl₂:MgCl₂·6H₂O); 6 gpg (갤론 당 그레인) 로 희석되는 15000 gpg 저장액, 플레이트 당 2 개의 BMI (혈액/우유/잉크) 천조각: CFT 에 의해 가공된 EMPA-116 BMI 면 천조각: 웰 당 예비로 헹구고 펀칭된 2 개의 천조각, 및 프로테아제 활성이 결여된 것으로 확인된 가열 비활성화 TIDE® 2X Cold 재고품 세제.

인큐베이터를 바람직한 온도 (16℃ 또는 32℃) 로 설정하였다. 약 10 ppm 효소의 마스터 희석 플레이트로부터 10 ㎕ 샘플을 상기 열거된 작동 세제 용액 190 ㎕ 가 있는 BMI 2-천조각 플레이트에 첨가하였다. 검정법 플레이트에서 변이체에 대해 0.5 ppm 의 최종 농도를 산출하도록 부피를 조정하였다. 플레이트를 즉시 iEMS 인큐베이터로 옮기고, 제시된 온도에서 1400 rpm 진탕하면서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 ㎕ 의 상청액을 신규 96 웰 플레이트로 옮기고, 흡광도를 405 nm 및/또는 600 nm 에서 MTP 판독기에서 측정하였다. 1 또는 2 개의 마이크로천조각 및 프로테아제 샘플을 첨가하지 않은 세제를 함유하는 대조군 웰을 또한 시험에 포함시켰다. 405 nm 에서의 측정은 더 높은 값을 제공하고 안료 제거를 추적하는 반면, 600 nm 에서의 측정은 탁도 및 세정을 추적한다.

모든 마이크로천조각 검정법 방법에 대한 얼룩 제거 활성의 계산:

수득된 흡광도 값을 빈칸 값 (효소 없이 기질만) 에 대해 교정하여, 가수분해 활성의 측정값을 제공하였다. 각 샘플 (변이체) 에 대해 성능 지수를 계산하였다. 성능 지수는 동일한 단백질 농도에서의 변이체의 성능 (실제 값) 과 표준 효소 (이론 값) 를 비교한다. 또한, 표준 효소의 랭뮤어 (Langmuir) 방정식의 파라미터를 사용하여 이론 값을 계산할 수 있다.

E. 프로테아제 및 이의 변이체의 상대적인 특이적 활성

프로테아제 변이체를 구별하기 위해서, 변이체 대 야생형 또는 표준 프로테아제의 비교 및 순위를 가능하게 하는, 기질로서 suc-AAPF-pNA 를 사용하여 상대적인 특이적 활성을 계산하였다. suc-AAPF-pNA 기질 상의 특이적 활성을 상기 기재된 검정법을 사용하여 각 샘플의 측정된 TCA-값에 의해 단백질 분해 활성을 나누어 측정하였다. 이러한 값을 사용하여, 상대적인 특이적 활성을 계산하였다 (변이체의 특이적 활성/참조 프로테아제의 특이적 활성).

F. 성능 지수

성능 지수는 동일한 단백질 농도에서의 변이체의 성능 (실제 값) 과 표준 또는 참조 프로테아제 (이론 값) 를 비교한다. 또한, 표준 프로테아제의 랭뮤어 (Langmuir) 방정식의 파라미터를 사용하여 이론 값을 계산할 수 있다. 1 을 초과하는 성능 지수 (PI) (PI>1) 는 표준 (예를 들어, 야생형) 과 비교하여 더 나은 변이체를 확인시켜주며, 1 의 PI (PI=1) 는 표준과 동일하게 성능하는 변이체를 확인시켜주며, 1 미만의 PI (PI<1) 는 표준보다 열악하게 성능하는 변이체를 확인시켜 준다. 그러므로, PI 는 승자 뿐 아니라, 특정 상황하에서 사용하기에 덜 바람직한 변이체도 확인시켜준다.

실시예 2

표적화된 ISD (삽입 치환 결실) 라이브러리 구축

도 1 에 제시된 바와 같은 BPN'-Y217L 의 2 개 영역 (성숙 영역의 위치 63-77 및 92-132) 내 프레임에 맞는 삽입, 결실 및/또는 치환을 함유하는 개질된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN'-Y217L (PURAFECT® PRIME 서브틸리신으로서 시판됨) 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 제작하기 위해 PCR-기재 방법을 사용하였다 (Pisarchik et al, Prot. Eng. Des. Select., 20:257-265 [2007] 참조). BPN'-Y217L 유전자의 부분의 5' 및 3' 분절을 증폭시키기 위해, 정방향 및 역방향 모두, 392 개 아미노산의 전장 단백질의 BPN'-Y217L 유전자의 표적 영역을 똑같이 커버하는 올리고뉴클레오티드의 2 개 세트를 사용하였다. BPN'-Y217L 성숙 프로테아제의 코딩 영역은 클로닝 목적을 위해 KpnI 및 XhoI 제한 부위를 함유한다:

BPN'-Y217L 전구체 단백질의 아미노산 서열이 하기에 제시되어 있다. 이 서열에서, 굵은 글씨는 성숙 BPN'-Y217L 프로테아제를 나타낸다:

성숙 BPN'-Y217L 프로테아제의 아미노산 서열은 본원에서 기재된 변이체 라이브러리 제조의 근거로서 사용되었다:

각 올리고뉴클레오티드는 주형에 대한 어닐링에 필요한 약 20-24 개의 뉴클레오티드, 표적된 코돈 (축퇴성이 있는 또는 없는) 및 Eam1104I 인지 서열을 함유하였다. 모든 하기 프라이머는 표적 영역의 말단에 도달할 때까지 3 bp 하류방향으로 이동하였다. 2 개의 PCR 반응물 (5' 및 3' 분절) 은 각각 상응하는 반대 프라이밍 올리고뉴클레오티드와 조합으로 5' 정방향 또는 3' 역방향 유전자 서열 측면 올리고뉴클레오티드를 함유하였다. 5' 조각을, 각각 Eam1104I 제한 부위를 함유하는 단일 정방향 프라이머 (P3203, TGGATCAGTTTGCTGTTTGCT; SEQ ID NO:6) 및 역방향 프라이머 P4385-P4441 (표 2-1 참조) 를 사용하여 pAC-FNA10 플라스미드 (도 2A 참조) 로부터 증폭시켰다. 3' 조각을, 각각 Eam1104I 제한 부위를 함유하는 단일 역방향 프라이머 (P3435, ATGTATCAAGATAAGAAAGAACAAG; SEQ ID NO:7) 및 정방향 프라이머 P4328-P4384 (표 2-1 참조) 를 사용하여 증폭시켰다.

각 증폭 반응물은 30 pmol 의 각 올리고뉴클레오티드 및 100 ng 의 pAC-FNA10 주형 DNA 를 함유하였다. Vent DNA 폴리머라아제 (New England Biolabs) 를 사용하여 증폭을 수행하였다. PCR 혼합물 (20 ul) 을 먼저 95℃ 에서 2.5 분 동안 가열한 후 94℃ 에서 15 초 동안의 변성, 55℃ 에서 15 초 동안의 어닐링 및 72℃ 에서 40 초 동안의 확장의 30 회 사이클에 적용하였다. 증폭 후, PCR 반응에 의해 생성된 좌측 및 우측 조각을 젤-정제시키고 혼합하였다 (약 200 ng 의 각 조각). 모든 혼합물은 3 개의 인접 코돈을 표적하는 3 개의 좌측 조각 및 동일한 코돈을 표적하는 3 개의 우측 조각을 함유한다. 상기 혼합물을 Eam1104I 로 소화시키고, T4 DNA 리가아제로 라이게이션시키고, 측면 프라이머 (P4299 CGTTGAAGAAGATCACGTAGCA; SEQ ID NO: 122, 및 P3246 TTTATTTTATAAACTCATTCCCTGAT; SEQ ID NO: 123) 로 증폭시켰다. 수득된 조각을 MluI 및 XhoI 으로 소화시키고, 바실러스 서브틸리스 발현 플라스미드 pHPLT-FNA 내의 MluI/XhoI 부위 내로 클로닝하였다 (도 2B). 사용된 pHPLT 벡터로부터의 BPN'-Y217L 발현 카세트는 하기 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다.

pHPLT 벡터 (Plat 프로모터-프리-프로-BPN'-Y217L-터미네이터) 로부터의 발현 카세트의 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO. 124) 을 하기에 제시한다:

제조자의 권고에 따라 롤링 써클 증폭 (Epicentre) 을 사용하여 라이게이션 혼합물을 증폭시켰다. 1 ul 의 라이게이션 혼합물을 5 ul 의 샘플 완충액과 혼합하고, 95℃ 에서 3 분 동안 가열하고 빙상에서 냉각시켰다. 그 다음, 5 ul 의 반응 완충액 및 0.2 ul 의 효소를 각 튜브에 첨가한 후, 30℃ 에서 10 시간 동안 인큐베이션하였다. 롤링 써클 증폭 생성물을 100 배 희석하고 바실러스 서브틸리스를 형질전환시키는데 사용하였다. 자일로오스 유도성 프로모터 (예를 들어, Hahn et al., Mol Microbiol, 21:763-775 [1996] 참조) 의 조절 하에 comK 유전자의 유도에 의해 수용능이 있게 만들어진 바실러스 서브틸리스 세포 (유전형: ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) 를, 돌연변이된 영역을 가진 BPN'-Y217L 프로테아제를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 45 개 라이브러리로 형질전환시켰다. 세포를 1 ml 의 루리라 브로스 (Luria Broth: LB) 에 37℃ 에서 1 시간 동안 성장시킨 다음, 1.6% 탈지유 및 10 mg/ℓ 네오마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 할로 생성을 위해 45 개의 라이브러리 각각으로부터 2000 개 이상의 클론을 스크리닝하였다. 탈지유 플레이트 상에 플레이팅하는 경우, 0.05% 내지 20% 의 클론이 할로를 생성하였다. 할로를 생성하는 제한된 수의 클론을 서열 분석하였다. 상기 클론은 삽입 및 결실 비가 상이하나, 이 중 어느 것에서도 프레임 이동 돌연변이는 없었다. 할로를 생성하는 클론을 실시예 1 에 기재된 96 웰 플레이트 검정법을 사용하여 AAPF 활성에 대해 추가로 스크리닝하였다. 이전에 기재된 96 웰 마이크로타이터 플레이트 내에서 B. 서브틸리스 형질전환체를 성장시킴으로서 BPN'-Y217L 변이체 단백질을 생성하였다. 배양 상청액의 단백질 농도를 실시예 1 에 기재된 TCA 침전에 의해 측정하였다.

실시예 3

표적화된 ISD 에 의해 생성된 BPN' - Y217L 변이체의 얼룩 제거 성능

상기 기재된 바와 같이 생성된 BPN'-Y217L 변이체의 얼룩 제거 활성 (pH 8/16℃ 에서 EMPA 116 천조각 (BMI 얼룩, CFT) 을 사용하는 세탁 적용에서의 얼룩 제거 성능을 측정하기 위한 마이크로천조각 검정법) 및 TCA 침전 (관심의 특성 시험) 에 의한 단백질 측정을 측정하기 위해 수행된 실험 결과가 표 3-1 에 제시된다. 실시예 1 에 기재된 방법을 사용하고, 얼룩 제거 성능 검정법에 대한 다음과 같은 변형을 하여 결과가 수득되었다. 사용되는 시험 세제는 가열 비활성화 Tide 2X 세제 (Procter & Gamble) 였다.

시판 세제 제형의 가열 비활성화는 비효소 성분의 특성을 보유하면서 임의의 단백질 성분의 내인성 효소 활성을 파괴하는 기능을 한다. 세제의 가열 비활성화는 수조 내에 미리 칭량된 양의 액체 세제 (유리병 내) 를 95℃ 에서 2 시간 동안 두어 수행하였다. 세제를 지역 슈퍼마켓 가게에서 구입하였다. 비가열 및 가열 세제 모두는 비활성화된 % 를 정확하게 측정하기 위해 세제를 5 분 내에 용해시켜 검정하였다. 효소 활성을 AAPF 검정법에 의해 시험하였다. 전반적으로 기재된 바와 같이 BPN'-Y217L 변이체의 기능을 변이체 대 모체 단백질 BPN'-Y217L 의 성능의 비인 성능 지수 ("Pi" 또는 "PI") 로서 정량화하였다. BMI 얼룩 제거 성능 및/또는 TCA 침전에 대해 0.5 이상인 PI 값을 나타내는 BPN'-Y217L 변이체는 향상된 세정 이익 및/또는 발현을 보였다.

돌연변이는 모체 아미노산에 대한 1 자리 코드 뒤에, 3 자리 위치수, 그 다음 변이체 아미노산에 대한 1 자리 코드로 명명된다. 예를 들어, 위치 87 에서의 글리신 (G) 을 세린 (S) 으로 돌연변이화하는 것은 "G087S" 로서 나타낸다. 다중 돌연변이는 돌연변이 사이에 "/" 를 삽입함으로써 표시된다. 위치 87 및 90 에서의 돌연변이는 "G087S/A090Y" 로서 표현된다. 결실의 경우, 1 자리 코드 "Z" 가 사용된다. 모체 서열에 대한 삽입의 경우, 1 자리 코드 "Z" 가 위치수의 좌측에 있다. 결실의 경우, 1 자리 코드 "Z" 가 위치수의 우측에 있다. 삽입의 경우, 위치수는 삽입된 아미노산(들) 전의 위치수 + 각각의 아미노산에 대해 0.01 이다. 예를 들어, 위치 87 과 88 사이의 3 개의 아미노산 알라닌 (A), 세린 (S) 및 티로신 (Y) 의 삽입은 "Z087.01A/Z087.02S/Z087.03Y" 로서 제시된다. 그러므로, 상기 모든 돌연변이 + 위치 100 에서의 결실 조합은: "G087S/ Z087.01A/Z087.02S/Z087.03Y/A090Y/A100Z" 이다.

70

표 3-2 는 조합을 구성하는 삽입 목록을 제공한다.

실시예 4

BPN'3 의 조합 변이체의 구축

BPN'G97A-G128A-Y217Q ("BPN'3") 를 모체로서 사용하여, 유전자의 4 개의 조각을 사용하는 확장 (융합) PCR 에 관련된 전략에 의해 조합 변이체를 제작하였다. 조각 1 을 프라이머 P4974 및 P4977 에 의해 증폭시켰다 (표 4-1 참조). 조각 4 를 프라이머 4978 및 P4976 에 의해 증폭시켰다 (표 4-1). 조각 1 및 4 모두는 임의의 돌연변이를 함유하지 않았다. 조각 2 및 3 각각은 부분적으로 중복되는 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 주형으로서 또는 주형의 존재하에서 BPN'3 을 사용하여 원하는 돌연변이를 함유하는 12 및 16 서열 세트 각각으로서 제작되었다. 조각 2 서열 세트를 하기 프라이머에 의해 증폭시켰다:

01: P4979 및 P4980 (주형으로서 BPN'3)

02: P4981 및 P4982 (주형 없음)

03: P4983 및 P4984 (주형 없음)

04: P4985 및 P4986 (주형 없음)

05: P4987 및 P4988 (주형 없음)

06: P4989 및 P4990 (주형 없음)

07: P4991 및 P4992 (주형 없음)

08: P4993 및 P4994 (주형 없음)

09: P4995 및 P4996 (주형 없음)

10: P4997 및 P4998 (주형 없음)

11: P4999 및 P5000 (주형 없음)

12: P5001 및 P5002 (주형 없음)

조각 3 서열 세트를 하기 프라이머에 의해 증폭시켰다:

01: P5003 및 P5004 (주형으로서 BPN'3)

02: P5005 및 P5006 (주형 없음)

03: P5007 및 P5008 (주형 없음)

04: P5009 및 P5010 (주형 없음)

05: P5011 및 P5012 (주형 없음)

06: P5013 및 P5014 (주형 없음)

07: P5015 및 P5016 (주형 없음)

08: P5017 및 P5018 (주형 없음)

09: P5019 및 P5020 (주형 없음)

10: P5021 및 P5022 (주형 없음)

11: P5023 및 P5024 (주형 없음)

12: P5025 및 P5026 (주형 없음)

13: P5027 및 P5028 (주형 없음)

14: P5029 및 P5030 (주형 없음)

15: P5031 및 P5032 (주형 없음)

16: P5033 및 P5034 (주형 없음)

조합 변이체의 구축에 사용되는 프라이머 서열을 표 4-1 에 열거한다.

각 증폭 반응물은 30 pmol 의 각 올리고뉴클레오티드 및 100 ng 의 주형 DNA 를 함유하였다. Vent DNA 폴리머라아제 (New England Biolabs) 를 사용하여 증폭을 수행하였다. PCR 혼합물 (20 ul) 을 먼저 95℃ 에서 2.5 분 동안 가열한 후 94℃ 에서 15 초 동안의 변성, 55℃ 에서 15 초 동안의 어닐링 및 72℃ 에서 40 초 동안의 확장의 30 회 사이클에 적용하였다. 증폭 후, 모든 조각을 Gel Band Purification 키트 (Qiagen) 에 의해 정제하고, 프라이머 P4975 및 P4948 을 사용하여 융합 PCR 에 대한 주형으로서 사용하기 위해 혼합하였다. 융합 PCR 반응으로부터의 전장 DNA 조각을 QIAGEN 젤-밴드 정제 키트에 의해 젤-정제시키고, BamHI 및 HindIII 제한 효소에 의해 소화시키고, 바실러스 발현 플라스미드 pHPLT-BPN 부분 opt (도 2C) 내에 라이게이션하고, 이것을 동일한 제한 효소로 절단하였다.

라이게이션 혼합물을 제조자의 권고에 따라 롤링 사이클 증폭 (Epicentre) 을 사용하여 증폭시켰다. 1 ul 의 라이게이션 혼합물을 5 ul 의 샘플 완충액과 혼합하고, 95℃ 로 3 분 동안 가열하고, 빙상에서 냉각시켰다. 그 다음, 5 ul 의 반응 완충액 및 0.2 ul 의 효소를 각 튜브에 첨가한 후, 30℃ 에서 10 시간 동안 인큐베이션한다. 롤링 사이클 증폭 생성물을 100 배 희석하고, 1 ul 의 상기 희석액을 실시예 2 에 기재되어 있는 바와 같이 바실러스 서브틸리스 세포 (유전형: ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) 를 형질전환시키기 위해 사용하였다. 형질전환체를 1.6% 탈지유 및 10 ppm 네오마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고, 밤새 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 할로가 있는 콜로니만을 집어내고, 실시예 2 에 기재된 추가 분석을 위해 마이크로타이터 플레이트에서 성장시켰다. 배양 상청액의 단백질 농도를 실시예 1 에 기재된 TCA 침전에 의해 측정하였다.

실시예 5

BPN'3 의 조합 변이체의 얼룩 제거 성능

실시예 4 에 기재된 바와 같이 생성된 BPN'3 의 조합 변이체의 얼룩 제거 활성을 실시예 3 에 기재된 바와 같이 시험하였다. 전반적으로 기재된 바와 같이, BPN' 변이체의 기능을 변이체 대 모체 단백질 BPN'3 의 성능의 비인 성능 지수 (Pi) 로서 정량화하였다. BMI 얼룩 제거 성능 및/또는 TCA 침전에 대해 0.5 이상인 Pi 값을 나타내는 BPN'3 변이체는 향상된 세정 이익 및/또는 발현을 보였다. 0.05 이하의 성능 지수는 0.05 로 고정되었고 표에 굵은 이탤릭체 글씨로 표시되어 있다. 결과를 표 5-1 에 제시한다.

실시예 6

위치 128, 129, 및 130 에서의 BPN'3 의 조합 변이체의 구축

BPN'G97A-G128A-Y217Q (BPN'3) 에서 위치 128/129/130 근처에 집중된 조합 라이브러리를 부위 특이적 포화 돌연변이생성 및/또는 부위 특이적 삽입 및/또는 결실을 사용하여 제작하였다. 생성된 변이체는 치환, 삽입, 및 결실 돌연변이를 함유한다. 라이브러리 L1, L2 및 L3 은 WT 위치 S130S 에 기반하고, L4 는 S130A 에 기반한다. 위치 128/129 및 130 근처에 집중된 4 개의 포화 라이브러리는 표 6-1 에 제시된 바와 같이 구축되었다.

라이브러리 구축 전, 2 개의 정지 코돈을 프로테아제를 불활성화시키기 위해 BPN3' 서열 내 위치 128 및 129 에 도입하였다. 이것은 라이브러리 내 모체 플라스미드의 낮은 배경을 확보하기 위해 수행하였다. NEB 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA 및 메틸라아제 (New England Biolabs) 의 2 마이크로그램을 사용하여 모체 플라스미드 (pHPLT-BPN'3) 를 메틸화시켰다. 그 다음 메틸화된 DNA 를 DNA Clean 및 Concentrator 키트 (Zymo Research) 로 정제하였다. QuikChange 다중 부위-지정 돌연변이생성 (QCMS) 키트 (Stratagene) 의 변형 버전을 이용하여 당업계에 공지된 방법 (Amin et al., Biotechniques 35: 1134-1140, [2003] 참조) 을 사용하여 돌연변이생성을 수행하였다.

돌연변이생성 반응물은 60 ng 주형 플라스미드, 0.5 ul 정방향 프라이머 128/129 Stop F (25 uM), 0.5 ul 역방향 프라이머 128/129 Stop R (25 uM), 1 ul dNTP's (QCMS 키트), 2.5 ul 10x QCMS 반응 완충액, 18.5 ul 탈이온수, 및 1 ul 의 효소 혼화물 (QCMS 키트) 을 25 ul 의 총 부피로 함유하였다. 돌연변이생성 반응을 위해, 사용된 열순환 반응기 프로그램은 95°에서 1 분 동안의 1 사이클 후, 95℃ 에서 1 분 동안, 55℃ 에서 1 분 동안, 및 68℃ 에서 11 분 동안의 25 회 사이클이었다 (MJ Research thermocycler). 주형 DNA 를 DpnI (QCMS 키트, Qiagen) 에 의해 소화시키고, 1.5 uL 의 반응물을 제조자의 프로토콜을 사용하는 Templiphi 키트 (Amersham) 를 사용하여 롤링 사이클 증폭 (RCA) 에 의해 증폭시켰다.

1 ㎕ 의 증폭된 DNA 를 사용하여 100 ㎕ 의 수용능 바실러스 서브틸리스 세포 (유전형: ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) 를 형질전환시켰다. 20 uL 또는 80 uL 의 형질전환 혼합물의 분취액을 10 ㎍/ml 네오마이신 + 1.6% 탈지유 (Teknova) 가 보충된 루리아 (Luria) 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 성장 후, 올바른 서열을 갖는 플라스미드를 확인하기 위해 탈지유 플레이트 상에서 할로를 형성하지 않는 4 개의 콜로니를 집어내었다. "pHPLT-BPN' 128/129 Stop" 이라고 불리는 위치 128/129 에서 2 개의 정지 코돈을 가진 올바른 변이체를 표 6-1 에 기재된 조합 라이브러리의 구축을 위해 모체 플라스미드로서 선택하였다.

플라스미드 pHPLT-BPN' 128/129 Stop 을 메틸화시키고 표 6-3 에 제시된 축퇴성 프라이머 쌍을 갖는 주형으로서 사용하였다.

중간에 NNS 코돈(들) 및 17 - 20 개의 측면 염기를 갖는 중복 정방향 및 역방향 프라이머 (PAGE-정제됨) 를 각각 선택된 라이브러리에 대해 디자인하고, 각각의 정방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머에 대한 서열을 표 6-3 에 제시한다. 4 개 반응에 대한 빠른-변화 돌연변이생성 및 롤링 써클 증폭을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 형질전환체를 10 ㎍/ml 네오마이신 + 1.6% 탈지유가 보충된 루리아 (Luria) 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 모든 할로 형성 콜로니를 10 ug/ml 네오마이신이 보충된 125 ul LB 배지를 함유하는 2 개의 마이크로타이터 플레이트 내에 집어냈다. Quintara Biosciences 에 의해 클론을 서열분석하였다. 단백질 발현을 위해, 주 질소원으로서 우레아, 주 탄소원으로서 글루코오스, 로부스트 세포 성장을 위해 1% 소이톤, 및 2.5 ug/ml 네오마이신이 보충된 MOP 완충액 기반의 180 ul 의 풍부한 반규정 배지를 함유하는 마이크로-필터 플레이트 (.22um, Millipore) 에서 배양물을 밤새 성장시켰다. 배양물을 37℃, 250 rpm, 및 70% 습도에서 64 시간 동안 성장시켰다. 배양 상청액의 단백질 농도를 실시예 1 에 기재된 TCA 침전에 의해 측정하였다.

실시예 7

위치 128, 129, 및 130 에서의 BPN'3 의 조합 변이체의 얼룩 제거 성능

실시예 6 에 기재된 바와 같이 생성된 위치 128, 129, 및 130 에서의 BPN'3 의 조합 변이체의 얼룩 제거 활성을 실시예 3 에 기재된 바와 같이 시험하였다. 전반적으로 기재된 바와 같이, BPN' 변이체의 기능을 변이체 대 모체 단백질 BPN'3 의 성능의 비인 성능 지수 (Pi) 로서 정량화하였다. BMI 얼룩 제거 성능 및/또는 TCA 침전에 대해 0.5 이상인 Pi 값을 나타내는 BPN'3 변이체는 향상된 세정 이익 및/또는 발현을 보였다. 결과를 표 7-1 에 제시한다.

실시예 8

BPN' 의 조합 변이체의 구축

위치 96, 98, 129 및/또는 222 에서의 삽입 또는 치환을 제작하기 위해, 하기 BPN' 돌연변이체 -- BPN' G97A/G128A/Y217Q, BPN' M124V/L126A/Y217Q, BPN' G128A/Y217Q, 및 BPN' N123G/Y217Q 를 모체 분자로서 사용하는 확장 (융합) PCR 에 의해, BPN' 의 조합 변이체를 제작하였다. 제작된 각각의 조합 돌연변이체에 대해, 모체 DNA 분자, 도입된 돌연변이 및 사용된 PCR 프라이머는 표 8-1 에 열거된다. 각각의 돌연변이체를 제작하기 위해, 표 8-1 에 열거된 각각의 모체 분자를 사용하는 유전자의 5' 및 3' 영역 내 PCR 프라이머 (표 8-2) 에 의해 2 개의 조각 1 및 2 를 생성하였다. 상기 조각을 혼합하고 전장 유전자를 복구시키기 위해 측면 프라이머 P4973 및 P4950 (표 8-2) 에 의해 증폭시켰다.

각 증폭 반응물은 30 pmol 의 각 PCR 프라이머 및 100 ng 의 주형 DNA 를 함유하였다. Vent DNA 폴리머라아제 (New England Biolabs) 를 사용하여 증폭을 수행하였다. PCR 혼합물 (20 ul) 을 먼저 95℃ 에서 2.5 분 동안 가열한 후 94℃ 에서 15 초 동안의 변성, 55℃ 에서 15 초 동안의 어닐링 및 72℃ 에서 40 초 동안의 확장의 30 회 사이클에 적용하였다. 증폭 후, 5' 및 3' 조각을 QIAGEN 젤-밴드 정제 키트에 의해 젤-정제시키고 혼합하고, 측면 프라이머 P4973 및 P4950 에 의해 증폭시켰다. 생성된 전장 DNA 조각을 QIAGEN 젤-밴드 정제 키트에 의해 젤-정제시키고, BamHI 및 HindIII 제한 효소에 의해 소화시키고, 각각의 모체 분자를 함유하는 pHPLT-BPN' 벡터로 라이게이션하고, 이것을 또한 동일한 제한 효소로 절단하였다.

실시예 9

BPN' 의 조합 변이체의 얼룩 제거 성능

실시예 1 에 기재된 바와 같이 생성된 BPN'3 의 조합 변이체의 얼룩 제거 활성을 실시예 3 에 기재된 바와 같이 시험하였다. 전반적으로 기재된 바와 같이, BPN' 변이체의 기능을 변이체 대 모체 단백질 BPN'3 (BPN' G97A-G128A-Y217Q) 의 성능의 비인 성능 지수 (Pi) 로서 정량화하였다. BMI 얼룩 제거 성능 및/또는 TCA 침전에 대해 0.5 이상인 Pi 값을 나타내는 변이체는 향상된 세정 이익 및/또는 발현을 보였다. 0.05 이하의 성능 지수는 0.05 로 고정되었고 표에 굵은 이탤릭체 글씨로 표시되어 있다. 결과를 표 9-1 에 제시한다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 발행물은 본 발명이 속하는 당업자의 수준의 것이다. 당업자는 본 발명이 언급된 목적을 실행하고, 언급된 목표 및 장점뿐만 아니라 발명 고유의 것을 수득하기 위해 잘 조정된다는 것을 쉽게 인지한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 바람직한 구현예를 대표하는 것이고, 예시적이고, 본 발명의 범주에 대한 제한으로 의도되는 것은 아니다. 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고 다양한 치환 및 변형이 본원에 기재된 본 발명에 대해 만들어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다.

본원에 설명으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들), 제한(들) 없어도 적합하게 실시될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명을 위해 사용되며, 나타내고 기재된 특징 또는 그의 일부의 임의의 동등물을 제외하여 이러한 용어 및 표현을 사용하는 것으로는 의도되지 않으나, 청구된 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인지된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구현예 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본원에 기재된 개념의 변형 및 변화가 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변화는 본원에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려되는 것으로 이해되어야만 한다.

본 발명은 본원에 광범위하고 일반적으로 기재되어 있다. 속명 개시 내에 포함되는 좀 더 좁은 종명 및 하부 속명 그룹 각각이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 여기에는 속명으로부터 임의의 대상을 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 갖는 본 발명의 속명 기재가, 삭제된 물질이 본원에 구체적으로 언급되었는지의 여부와 관계없이 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> DANISCO US INC., GENENCOR DIVISION ALEKSEYEV, Viktor Yuryevich CASCAO-PEREIRA, Luis G. KELLIS, James T. PISARCHIK, Alexander <120> COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING VARIANT MICROBIAL PROTEASES <130> 31427WO <140> PCT/US09/46067 <141> 2009-06-03 <160> 221 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 275 <212> PRT <213> B. amyloliquefaciens <220> <221> misc_feature <223> Mature BPN' sequence <400> 1 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 2 <211> 275 <212> PRT <213> B. amyloliquefaciens <220> <221> misc_feature <223> Mature form of the BPN' subtilisin protease <400> 2 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 3 <211> 1326 <212> DNA <213> B. amyloliquefaciens <220> <221> misc_feature <223> Coding region of the BPN'-Y217L mature protease <400> 3 gaattcatct caaaaaaatg ggtctactaa aatattattc catctattat aataaattca 60 cagaatagtc ttttaagtaa gtctactctg aattttttta aaaggagagg gtaaagagtg 120 agaagcaaaa aattgtgaga agcaaaaaat tgtggatcag tttgctgttt gctttagcgt 180 taatctttac gatggcgttc ggcagcacat ccagcgcgca ggctgcaggg aaatcaaacg 240 gggaaaagaa atatattgtc gggtttaaac agacaatgag cacgatgagc gccgctaaga 300 agaaagacgt catttctgaa aaaggcggga aagtgcaaaa gcaattcaaa tatgtagacg 360 cagctagcgc tacattaaac gaaaaagctg taaaagaatt gaaaaaagac ccgagcgtcg 420 cttacgttga agaagatcac gtagcacacg cgtacgcgca gtccgtgcca tatggcgtat 480 cacaaattaa agcccctgct ctgcactctc aaggctacac cggttcaaat gttaaagtag 540 cggttatcga cagcggtatc gattcttctc atccagatct taaagtagca ggcggagcca 600 gcatggttcc ttctgaaaca aatcctttcc aagacaacaa ctctcacgga acacacgttg 660 ctggtaccgt tgcggctctt aataactcaa tcggtgtatt aggcgttgcg ccaagcgcat 720 cactttacgc tgtaaaagtt ctcggcgccg acggttccgg ccaatacagc tggatcatta 780 acggaatcga gtgggcgatc gcaaacaata tggacgttat taacatgagc ctcggcggac 840 cgtccggttc tgctgcttta aaagcggcag ttgataaagc cgttgcatcc ggcgtcgtag 900 tcgttgcggc agccggcaac gaaggcactt ccggcagctc aagcacagtg ggctaccctg 960 gtaaataccc ttctgtcatt gcagtaggcg ctgtcgacag cagcaaccaa agagcatctt 1020 tctcaagcgt aggacctgag ctcgatgtca tggcacctgg cgtatctatc caaagcacgc 1080 ttcctggaaa caaatacggc gcgttgaacg gtacatcaat ggcatctccg cacgttgccg 1140 gagccgcggc tttgattctt tctaagcacc cgaactggac aaacactcaa gtccgcagct 1200 ctctagaaaa caccactaca aaacttggtg attctttcta ctatggaaaa gggctgatca 1260 atgtacaggc ggcagctcag taaaactcga gataaaaaac cggccttggc cccgccggtt 1320 ttttat 1326 <210> 4 <211> 382 <212> PRT <213> B. amyloliquefaciens <220> <221> misc_feature <223> Amino acid sequence of the BPN'-Y217L precursor protein <400> 4 Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ile Phe Thr Met Ala Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ala Gln Ala Ala Gly 20 25 30 Lys Ser Asn Gly Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met 35 40 45 Ser Thr Met Ser Ala Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly 50 55 60 Gly Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asp Ala Ala Ser Ala Thr 65 70 75 80 Leu Asn Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala 85 90 95 Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Tyr Ala Gln Ser Val Pro 100 105 110 Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr 115 120 125 Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser 130 135 140 Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser 145 150 155 160 Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His Gly Thr His Val Ala 165 170 175 Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala 180 185 190 Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser 195 200 205 Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn 210 215 220 Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala 225 230 235 240 Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val 245 250 255 Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val 260 265 270 Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp 275 280 285 Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp 290 295 300 Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Asn Lys 305 310 315 320 Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly 325 330 335 Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln 340 345 350 Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe 355 360 365 Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln 370 375 380 <210> 5 <211> 275 <212> PRT <213> B. amyloliquefaciens <220> <221> misc_feature <223> Amino acid sequence of the mature BPN'-Y217L protease <400> 5 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P3203 <400> 6 tggatcagtt tgctgtttgc t 21 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P3435 <400> 7 atgtatcaag ataagaaaga acaag 25 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4328 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 aaactcttca ndtndtcacg gaactcacgt tgccggcaca 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4329 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 aaactcttca ndtndtggaa ctcacgttgc cggcacagtt 40 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4330 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 aaactcttca ndtndtactc acgttgccgg cacagttg 38 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4331 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 aaactcttca ndtndtcacg ttgccggcac agttgcggct 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4332 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 aaactcttca ndtndtgttg ccggcacagt tgcggctctt 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4333 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 13 aaactcttca ndtndtgccg gcacagttgc ggctcttaat 40 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4334 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 aaactcttca ndtndtcggc acagttgcgg ctcttaataa c 41 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4335 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 aaactcttca ndtndtacag ttgcggctct taataactca 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4336 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 16 aaactcttca ndtndtgttg cggctcttaa taactcaatc 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4337 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 aaactcttca ndtndtgcgg ctcttaataa ctcaatcggt 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4338 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 18 aaactcttca ndtndtgctc ttaataactc aatcggtgta 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4339 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 aaactcttca ndtndtctta ataactcaat cggtgtatta 40 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4340 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 20 aaactcttca ndtndtaata actcaatcgg tgtattag 38 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4341 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 21 aaactcttca ndtndtaact caatcggtgt attaggcgtt 40 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4342 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 22 aaactcttca ndtndttcaa tcggtgtatt aggcgttg 38 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4343 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 aaactcttca ndttcaatcg gtgtattagg cgttg 35 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4344 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 aaactcttca ndtndtaaag ttctcggtgc tgacggttc 39 <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4345 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 aaactcttca ndtndtgttc tcggtgctga cggttcc 37 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4346 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 26 aaactcttca ndtndtctcg gtgctgacgg ttccggccaa 40 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4347 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 aaactcttca ndtndtggtg ctgacggttc cggccaatac 40 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4348 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 28 aaactcttca ndtndtgctg acggttccgg ccaataca 38 <210> 29 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4349 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 29 aaactcttca ndtndtgacg gttccggcca atacagctg 39 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4350 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 30 aaactcttca ndtndtggtt ccggccaata cagctggatc 40 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4351 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 31 aaactcttca ndtndttccg gccaatacag ctggatcatt 40 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4352 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 32 aaactcttca ndtndtggcc aatacagctg gatcattaac 40 <210> 33 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4353 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 aaactcttca ndtndtcaat acagctggat cattaacgga 40 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4354 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 34 aaactcttca ndtndttaca gctggatcat taacggaatc 40 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4355 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 35 aaactcttca ndtndtagct ggatcattaa cggaatcgag 40 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4356 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 36 aaactcttca ndtndttgga tcattaacgg aatcgagtg 39 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4357 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 37 aaactcttca ndtndtatca ttaacggaat cgagtg 36 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4358 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 38 aaactcttca ndtndtatta acggaatcga gtgggcgatc 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4359 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 39 aaactcttca ndtndtaacg gaatcgagtg ggcgatcgca 40 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4360 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 40 aaactcttca ndtndtggaa tcgagtgggc gatcgcaaac 40 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4361 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 41 aaactcttca ndtndtatcg agtgggcgat cgcaaacaat 40 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4362 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 aaactcttca ndtndtgagt gggcgatcgc aaacaatatg 40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4363 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 43 aaactcttca ndtndttggg cgatcgcaaa caatatggac 40 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4364 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 44 aaactcttca ndtndtgcga tcgcaaacaa tatggacgtt 40 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4365 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 45 aaactcttca ndtndtatcg caaacaatat ggacgttatt 40 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4366 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 46 aaactcttca ndtndtgcaa acaatatgga cgttattaac 40 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4367 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 47 aaactcttca ndtndtaaca atatggacgt tattaacatg 40 <210> 48 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4368 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 48 aaactcttca ndtndtaata tggacgttat taacatgag 39 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4369 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 49 aaactcttca ndtndtatgg acgttattaa catgagcctc 40 <210> 50 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4370 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 50 aaactcttca ndtndtgacg ttattaacat gagcctc 37 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4371 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 51 aaactcttca ndtndtgtta ttaacatgag cctcggcgga 40 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4372 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 52 aaactcttca ndtndtatta acatgagcct cggcggacct 40 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4373 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 53 aaactcttca ndtndtaaca tgagcctcgg cggaccttct 40 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4374 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 54 aaactcttca ndtndtatga gcctcggcgg accttctggt 40 <210> 55 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4375 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 55 aaactcttca ndtndtagcc tcggcggacc ttctggttct 40 <210> 56 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4376 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 56 aaactcttca ndtndtctcg gcggaccttc tggttctgct 40 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4377 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 aaactcttca ndtndtggcg gaccttctgg ttctgctgct 40 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4378 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 58 aaactcttca ndtndtggac cttctggttc tgctgcttta 40 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4379 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 59 aaactcttca ndtndtcctt ctggttctgc tgctttaaaa 40 <210> 60 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4380 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 60 aaactcttca ndtndttctg gttctgctgc tttaaaag 38 <210> 61 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4381 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 61 aaactcttca ndtndtggtt ctgctgcttt aaaagcggca 40 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4382 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 62 aaactcttca ndtndttctg ctgctttaaa agcggcagtt 40 <210> 63 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4383 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 63 aaactcttca ndtndtgctg ctttaaaagc ggcagttgat 40 <210> 64 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4384 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 64 aaactcttca ndtgctgctt taaaagcggc agttgat 37 <210> 65 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4385 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 65 aaactcttca ahngttgtct tggaaaggat ttgtttc 37 <210> 66 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4386 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 66 aaactcttca ahnahngttg tcttggaaag gatttgtttc 40 <210> 67 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4387 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 67 aaactcttca ahnahngttg ttgtcttgga aaggatttgt 40 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4388 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 68 aaactcttca ahnahnagag ttgttgtctt ggaaaggatt 40 <210> 69 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4389 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 69 aaactcttca ahnahngtga gagttgttgt cttggaaagg 40 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4390 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 70 aaactcttca ahnahntccg tgagagttgt tgtcttggaa 40 <210> 71 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4391 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 71 aaactcttca ahnahnagtt ccgtgagagt tgttgtcttg 40 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4392 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 72 aaactcttca ahnahngtga gttccgtgag agttgttgtc 40 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4393 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 73 aaactcttca ahnahnaacg tgagttccgt gagagttgtt 40 <210> 74 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4394 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 74 aaactcttca ahnahnggca acgtgagttc cgtgagagtt 40 <210> 75 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4395 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 75 aaactcttca ahnahngccg gcaacgtgag ttccgtgaga 40 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4396 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 76 aaactcttca ahnahntgtg ccggcaacgt gagttccgtg 40 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4397 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 77 aaactcttca ahnahnaact gtgccggcaa cgtgagttcc 40 <210> 78 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4398 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 78 aaactcttca ahnahncgca actgtgccgg caacgtgagt 40 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4399 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 79 aaactcttca ahnahnagcc gcaactgtgc cggcaacgtg 40 <210> 80 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4400 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 80 aaactcttca ahnahnaaga gccgcaactg tgccggcaac 40 <210> 81 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4401 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 81 aaactcttca ahngtaaagt gatgcgcttg gcgcaac 37 <210> 82 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4402 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 82 aaactcttca ahnahngtaa agtgatgcgc ttggcgcaac 40 <210> 83 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4403 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 83 aaactcttca ahnahnagcg taaagtgatg cgcttg 36 <210> 84 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4404 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 84 aaactcttca ahnahntaca gcgtaaagtg atgcgcttg 39 <210> 85 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4405 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 85 aaactcttca ahnahntttt acagcgtaaa gtgatgcgct 40 <210> 86 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4406 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 86 aaactcttca ahnahnaact tttacagcgt aaagtgatg 39 <210> 87 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4407 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 87 aaactcttca ahnahngaga acttttacag cgtaaagtga 40 <210> 88 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4408 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 88 aaactcttca ahnahnaccg agaactttta cagcgtaaag 40 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4409 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 89 aaactcttca ahnahnagca ccgagaactt ttacagcgta 40 <210> 90 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4410 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 90 aaactcttca ahnahngtca gcaccgagaa cttttacag 39 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4411 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 91 aaactcttca ahnahnaccg tcagcaccga gaacttttac 40 <210> 92 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4412 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 92 aaactcttca ahnahnggaa ccgtcagcac cgagaacttt 40 <210> 93 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4413 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 93 aaactcttca ahnahngccg gaaccgtcag caccgagaac 40 <210> 94 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4414 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 94 aaactcttca ahnahnttgg ccggaaccgt cagcaccgag 40 <210> 95 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4415 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 95 aaactcttca ahnahngtat tggccggaac cgtcagcac 39 <210> 96 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4416 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 96 aaactcttca ahnahngctg tattggccgg aaccgtcag 39 <210> 97 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4417 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 97 aaactcttca ahnahnccag ctgtattggc cggaaccgtc 40 <210> 98 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4418 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 98 aaactcttca ahnahngatc cagctgtatt ggccggaac 39 <210> 99 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4419 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 99 aaactcttca ahnahnaatg atccagctgt attggccgga 40 <210> 100 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4420 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 100 aaactcttca ahnahngtta atgatccagc tgtattg 37 <210> 101 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4421 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 101 aaactcttca ahnahntccg ttaatgatcc agctgtattg 40 <210> 102 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4422 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 102 aaactcttca ahnahngatt ccgttaatga tccagctgta 40 <210> 103 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4423 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 103 aaactcttca ahnahnctcg attccgttaa tgatccagct 40 <210> 104 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4424 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 104 aaactcttca ahnahnccac tcgattccgt taatgatcca 40 <210> 105 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4425 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 105 aaactcttca ahnahncgcc cactcgattc cgttaatgat 40 <210> 106 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4426 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 106 aaactcttca ahnahngatc gcccactcga ttccgttaat 40 <210> 107 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4427 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 107 aaactcttca ahnahntgcg atcgcccact cgattccgtt 40 <210> 108 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4428 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 108 aaactcttca ahnahngttt gcgatcgccc actcgattcc 40 <210> 109 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4429 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 109 aaactcttca ahnahnattg tttgcgatcg cccactcgat 40 <210> 110 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4430 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 110 aaactcttca ahnahncata ttgtttgcga tcgcccactc 40 <210> 111 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4431 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 111 aaactcttca ahnahngtcc atattgtttg cgatcgccca 40 <210> 112 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4432 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 112 aaactcttca ahnahnaacg tccatattgt ttgcgatcgc 40 <210> 113 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4433 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 113 aaactcttca ahnahnaata acgtccatat tgtttgcgat 40 <210> 114 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4434 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 114 aaactcttca ahnahngtta ataacgtcca tattgtttgc 40 <210> 115 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4435 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 115 aaactcttca ahnahncatg ttaataacgt ccatattgtt 40 <210> 116 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4436 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 116 aaactcttca ahnahngctc atgttaataa cgtccatatt 40 <210> 117 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4437 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 117 aaactcttca ahnahngagg ctcatgttaa taacgtccat 40 <210> 118 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4438 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 118 aaactcttca ahnahngccg aggctcatgt taataacgtc 40 <210> 119 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4439 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 119 aaactcttca ahnahntccg ccgaggctca tgttaataac 40 <210> 120 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4440 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 120 aaactcttca ahnahnaggt ccgccgaggc tcatgttaat 40 <210> 121 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4441 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 121 aaactcttca ahnahnagaa ggtccgccga ggctcatgtt 40 <210> 122 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4299 <400> 122 cgttgaagaa gatcacgtag ca 22 <210> 123 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P3246 <400> 123 tttattttat aaactcattc cctgat 26 <210> 124 <211> 1351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence of the expression cassette from the pHPLT vector (Plat promoter-pre-pro-BPN'-Y217L-terminator) <400> 124 gcttttcttt tggaagaaaa tatagggaaa atggtacttg ttaaaaattc ggaatattta 60 tacaatatca tatgtttcac attgaaaggg gaggaaaatc gtgaaacaac aaaaacggct 120 ttagtctagc aaaaggagag ggtaaagagt gagaagcaaa aaattgtgga tcagtttgct 180 gtttgcttta gcgttaatct ttacgatggc gttcggcagc acatcctctg cccaggcggc 240 agggaaatca aacggggaaa agaaatatat tgtcgggttt aaacagacaa tgagcacgat 300 gagcgccgct aagaagaaag atgtcatttc tgaaaaaggc gggaaagtgc aaaagcaatt 360 caaatatgta gacgcagctt cagctacatt aaacgaaaaa gctgtaaaag aattgaaaaa 420 agacccgagc gtcgcttacg ttgaagaaga tcacgtagca cacgcgtacg cgcagtccgt 480 gccttacggc gtatcacaaa ttaaagcccc tgctctgcac tctcaaggct acactggatc 540 aaatgttaaa gtagcggtta tcgacagcgg tatcgattct tctcatcctg atttaaaggt 600 agcaggcgga gccagcatgg ttccttctga aacaaatcct ttccaagaca acaactctca 660 cggaactcac gttgccggca cagttgcggc tcttaataac tcaatcggtg tattaggcgt 720 tgcgccaagc gcatcacttt acgctgtaaa agttctcggt gctgacggtt ccggccaata 780 cagctggatc attaacggaa tcgagtgggc gatcgcaaac aatatggacg ttattaacat 840 gagcctcggc ggaccttctg gttctgctgc tttaaaagcg gcagttgata aagccgttgc 900 atccggcgtc gtagtcgttg cggcagccgg taacgaaggc acttccggca gctcaagcac 960 agtgggctac cctggtaaat acccttctgt cattgcagta ggcgctgttg acagcagcaa 1020 ccaaagagca tctttctcaa gcgtaggacc tgagcttgat gtcatggcac ctggcgtatc 1080 tatccaaagc acgcttcctg gaaacaaata cggcgcgttg aacggtacat caatggcatc 1140 tccgcacgtt gccggagcgg ctgctttgat tctttctaag cacccgaact ggacaaacac 1200 tcaagtccgc agcagtttag aaaacaccac tacaaaactt ggtgattctt tctactatgg 1260 aaaagggctg atcaacgtac aggcggcagc tcagtaaact cgagagagga cggatttcct 1320 gaaggaaatc cgttttttta ttttaagctt g 1351 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4948 <400> 125 gtgtttttct tggaattgtg ctg 23 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4974 <400> 126 gcctcacatt tgtgccacct a 21 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4975 <400> 127 catatgagtt atgcagtttg tag 23 <210> 128 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4976 <400> 128 cctctcggtt atgagttagt tc 22 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4977 <400> 129 gtagagcgaa gcagacgggg cta 23 <210> 130 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4978 <400> 130 cttaaagcag cagttgataa agct 24 <210> 131 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4979 <400> 131 cttggtgtag ccccgtctgc tt 22 <210> 132 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4980 <400> 132 atccatgtta ttcgcgatgg cccatt 26 <210> 133 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4981 <400> 133 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gcctcttgct ctgcagcaga cggatcaggc 60 caatactcat ggattatcaa 80 <210> 134 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4982 <400> 134 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggcctga 60 tccgtctgct gcagagcaag 80 <210> 135 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4983 <400> 135 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gccgttaaag ttcttgatgc acgtgacgga 60 tcaggccaat actcatggat 80 <210> 136 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4984 <400> 136 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggcctga 60 tccgtcacgt gcatcaagaa 80 <210> 137 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4985 <400> 137 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gccgttaaag ttcttgcagc agactctgga 60 tcaggccaat actcatggat 80 <210> 138 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4986 <400> 138 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggcctga 60 tccagagtct gctgcaagaa 80 <210> 139 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4987 <400> 139 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gccgttaaag ttcttgcagc agactcttca 60 ggccaatact catggattat 80 <210> 140 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4988 <400> 140 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggcctga 60 agagtctgct gcaagaactt 80 <210> 141 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4989 <400> 141 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gccgttaaag ttcttgcagc agacggagat 60 ggccaatact catggattat 80 <210> 142 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4990 <400> 142 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggccatc 60 tccgtctgct gcaagaactt 80 <210> 143 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4991 <400> 143 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gccgttaaag ttcttgatgc acgtgactct 60 ggatcaggcc aatactcatg 80 <210> 144 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4992 <400> 144 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggcctga 60 tccagagtca cgtgcatcaa 80 <210> 145 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4993 <400> 145 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gccgttaaag ttcttgatgc acgtgactct 60 tcaggccaat actcatggat 80 <210> 146 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4994 <400> 146 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggcctga 60 agagtcacgt gcatcaagaa 80 <210> 147 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4995 <400> 147 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gccgttaaag ttcttgatgc acgtgacgga 60 gatggccaat actcatggat 80 <210> 148 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4996 <400> 148 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggccatc 60 tccgtcacgt gcatcaagaa 80 <210> 149 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4997 <400> 149 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gccgttaaag ttcttgcagc agactcttct 60 tcaggccaat actcatggat 80 <210> 150 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4998 <400> 150 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggcctga 60 agaagagtct gctgcaagaa 80 <210> 151 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4999 <400> 151 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gccgttaaag ttcttgcagc agactctgga 60 gatggccaat actcatggat 80 <210> 152 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5000 <400> 152 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggccatc 60 tccagagtct gctgcaagaa 80 <210> 153 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5001 <400> 153 cttggtgtag ccccgtctgc ttcgctctac gccgttaaag ttcttgcagc agactctgat 60 ggccaatact catggattat 80 <210> 154 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5002 <400> 154 atccatgtta ttcgcgatgg cccattcgat gccgttgata atccatgagt attggccatc 60 agagtctgct gcaagaactt 80 <210> 155 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5003 <400> 155 atcgaatggg ccatcgcgaa t 21 <210> 156 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5004 <400> 156 tgcaacagct ttatcaactg ct 22 <210> 157 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5005 <400> 157 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtatctggaa tgagcctggg agcaccaagc 60 ggcagt 66 <210> 158 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5006 <400> 158 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgcttggtg ctcccaggct 60 cattccagat 70 <210> 159 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5007 <400> 159 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtaatcaaca tgagcctggg atctccaagc 60 ggcagt 66 <210> 160 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5008 <400> 160 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgcttggag atcccaggct 60 catgttgatt 70 <210> 161 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5009 <400> 161 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtaatcaaca tgagcctggg agcagttagc 60 ggcagt 66 <210> 162 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5010 <400> 162 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgctaactg ctcccaggct 60 catgttgatt 70 <210> 163 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5011 <400> 163 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtaatcaaca tgagcctggg agcagatagc 60 ggcagt 66 <210> 164 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5012 <400> 164 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgctatctg ctcccaggct 60 catgttgatt 70 <210> 165 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5013 <400> 165 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtaatcaaca tgagcctggg agcaagcggc 60 agtgcggca 69 <210> 166 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5014 <400> 166 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgcttgctc ccaggctcat 60 gttgattaca 70 <210> 167 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5015 <400> 167 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtaatcaaca tgagcctggg agcaggaggc 60 agtgcggca 69 <210> 168 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5016 <400> 168 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg cctcctgctc ccaggctcat 60 gttgattaca 70 <210> 169 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5017 <400> 169 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtaatcaaca tgagcctggg agcaccagtt 60 gatat 65 <210> 170 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5018 <400> 170 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcgata tcaactggtg ctcccaggct 60 catgttgatt 70 <210> 171 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5019 <400> 171 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtaatcaaca tgagcctggg agcaccaagc 60 ggcagt 66 <210> 172 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5020 <400> 172 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgtcgcactg ccgcttggtg ctcccaggct 60 catgttgatt 70 <210> 173 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5021 <400> 173 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtatctggaa tgagcctggg atctccaagc 60 ggcagt 66 <210> 174 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5022 <400> 174 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgcttggag atcccaggct 60 cattccagat 70 <210> 175 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5023 <400> 175 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtatctggaa tgagcctggg agcagtaagc 60 ggcagt 66 <210> 176 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5024 <400> 176 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgcttactg ctcccaggct 60 cattccagat 70 <210> 177 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5025 <400> 177 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtatctggaa tgagcctggg agcagatagc 60 ggcagt 66 <210> 178 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5026 <400> 178 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgctatctg ctcccaggct 60 cattccagat 70 <210> 179 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5027 <400> 179 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtatctggaa tgagcctggg agcaagcggc 60 agtgcggca 69 <210> 180 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5028 <400> 180 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgcttgctc ccaggctcat 60 tccagataca tccatgtt 78 <210> 181 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5029 <400> 181 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtaatcaaca tgagcctggg atctgttagc 60 ggcagt 66 <210> 182 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5030 <400> 182 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgctaacag atcccaggct 60 catgttgatt 70 <210> 183 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5031 <400> 183 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtaatcaaca tgagcctggg atctgatagc 60 ggcagt 66 <210> 184 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5032 <400> 184 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgctatcag atcccaggct 60 catgttgatt 70 <210> 185 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5033 <400> 185 atcgaatggg ccatcgcgaa taacatggat gtaatcaaca tgagcctggg atctagcggc 60 agtgcggca 69 <210> 186 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5034 <400> 186 tgcaacagct ttatcaactg ctgctttaag tgccgcactg ccgctagatc ccaggctcat 60 gttgatt 67 <210> 187 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5035 <400> 187 tgatccgtct gagcaggggc tttaatttgt ga 32 <210> 188 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P5036 <400> 188 attaaagccc ctgctcagac ggatcaggcc aatactc 37 <210> 189 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: 128/129 Stop F <400> 189 catgagcctg ggataatgaa gcggcagtgc ggcacttaaa gcag 44 <210> 190 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: 128/129 Stop R <400> 190 gtgccgcact gccgcttcat tatcccaggc tcatgttgat tacatc 46 <210> 191 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: 128/129 deg QC F <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 191 catgagcctg ggannsnnsa gcggcagtgc ggcacttaaa gcag 44 <210> 192 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: 128/129 deg QC R <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 192 ccgcactgcc gctsnnsnnt cccaggctca tgttgattac atc 43 <210> 193 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: 128/129 del QC F <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 193 catgagcctg ggannsagcg gcagtgcggc acttaaagca g 41 <210> 194 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: 128/129 del QC R <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 194 ccgcactgcc gctsnntccc aggctcatgt tgattacatc 40 <210> 195 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: 128 A 129 QC F <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 195 catgagcctg ggannsgcgn nsagcggcag tgcggcactt aaagcag 47 <210> 196 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: 128 A 129 QC R <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 196 ccgcactgcc gctsnncgcs nntcccaggc tcatgttgat tacatc 46 <210> 197 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: 128/129 del A QC F <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 197 catgagcctg ggannsgcag gcagtgcggc acttaaagca g 41 <210> 198 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: 128/129 del A QC R <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 198 gtgccgcact gcctgcsnnt cccaggctca tgttgattac atc 43 <210> 199 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4947 <400> 199 ctttagtcta gcaaaaggag ag 22 <210> 200 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4948 <400> 200 gtgtttttct tggaattgtg ctg 23 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4949 <400> 201 cgactcgagc catccagatc 20 <210> 202 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4950 <400> 202 cttgtctcca agcttaaaat aaaa 24 <210> 203 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4951 <400> 203 aaagttcttg cagcaagtga cggatcaggc caatactca 39 <210> 204 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4952 <400> 204 gcctgatccg tcacttgctg caagaacttt aacggcgtag 40 <210> 205 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4953 <400> 205 taaagttctt ggcgcaagtg acggatcagg ccaatactca 40 <210> 206 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4954 <400> 206 cctgatccgt cacttgcgcc aagaacttta acggcgta 38 <210> 207 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4955 <400> 207 gttaaagttc ttgatgcacg tgacggatca ggccaatact ca 42 <210> 208 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4956 <400> 208 gatccgtcac gtgcatcaag aactttaacg gcgtagagcg a 41 <210> 209 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4957 <400> 209 gttaaagttc ttgatggtcg tgacggatca ggccaatact ca 42 <210> 210 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4958 <400> 210 gatccgtcac gaccatcaag aactttaacg gcgtagagcg aa 42 <210> 211 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4959 <400> 211 tgagcctggg agcagtaagc ggcagtgcgg cacttaaa 38 <210> 212 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4960 <400> 212 gcactgccgc ttactgctcc caggctcatg ttgattac 38 <210> 213 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4961 <400> 213 ttagcgcagg aggagtaagc ggcagtgcgg cacttaaa 38 <210> 214 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4962 <400> 214 gcactgccgc ttactcctcc tgcgctaacg ttgatta 37 <210> 215 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4963 <400> 215 gagcctggga ggagtaagcg gcagtgcggc acttaaa 37 <210> 216 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4964 <400> 216 tgccgcactg ccgcttactc ctcccaggct catgccgatt 40 <210> 217 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4965 <400> 217 gagcctggga gcagtaagcg gcagtgcggc acttaaa 37 <210> 218 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4966 <400> 218 gcactgccgc ttactgctcc caggctcatg ttgatt 36 <210> 219 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4967 <400> 219 aacgggactt cccaagcctc gccgcatgta gctg 34 <210> 220 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4968 <400> 220 acatgcggcg aggcttggga agtcccgttt tgcgcac 37 <210> 221 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: P4973 <400> 221 aaaggatcct aatcggcgct tttc 24

Claims

개질이 G100C, S101D, S101H, Q103D, M124G, L126G, S132H, S161N, Q275Z, 및/또는

로부터 선택되는 1 개 이상의 개질 세트로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 하나 이상의 개질을 포함하는 서브틸리신 변이체.
개질이

로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 하나 이상의 개질을 포함하는 서브틸리신 변이체.
개질이

로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 2 개 이상의 개질을 포함하는 서브틸리신 변이체.
개질이

로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 2 개 이상의 개질을 포함하는 서브틸리신 변이체.
치환 Y217L 및 추가로 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 언급된 하나 이상의 개질 세트를 포함하고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 서브틸리신 변이체.
치환 G97A/G128A/Y217Q 및 추가로 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 언급된 하나 이상의 개질을 포함하고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 서브틸리신 변이체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 세정 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 세정 조성물이 세탁 세제인 세정 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 세탁 세제가 강력 액체 세탁 세제인 세탁 세제.
제 7 항에 있어서, 상기 세정 조성물이 식기 세제인 세정 조성물.
제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀루라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 말라나아제, β-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 및 아밀라아제, 또는 이의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부가적인 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함하는 세정 조성물.
제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 안정화제를 추가로 포함하는 세정 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 서브틸리신 변이체 0.0001 중량% 이상, 및 임의로, 하나 이상의 적합한 보조 성분을 포함하는 세정 조성물.
하기 단계 a) 및 b) 를 포함하는 세정 방법:
a) 섬유를 포함하는 표면 및/또는 물품을 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 세정 조성물과 접촉시키는 단계; 및
b) 임의로 상기 표면 또는 물품을 세정 및/또는 헹구는 단계.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 동물 사료.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 식품 가공 조성물.