CN112877304B - 一种细菌漆酶突变体LacAt及其表达菌株的构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌漆酶突变体LacAt及其表达菌株的构建和应用，其中细菌漆酶突变体LacAt的蛋白序列如SEQ ID No：1所示，基因序列如SEQ ID No：2所示。本发明以漆酶LacAn为野生型出发蛋白，通过定向进化构建突变文库，对酶性质进行改良，以高通量筛选技术获得突变体酶命名为LacAt，发酵液酶活由野生型560U/L提高至1125U/L，突变体蛋白表达量较野生型酶提高2倍。将突变体漆酶LacAt用于偶氮染料直接6的脱色，在无介体添加时即可对染料完全脱色，提高了漆酶的应用能力，减少了使用成本及避免二次污染，有利于改进偶氮染料纺织整染工艺，降低运行成本。

Description

一种细菌漆酶突变体LacAt及其表达菌株的构建和应用

技术领域

本发明涉及一种漆酶突变体，具体地说是一种细菌漆酶突变体LacAt及其表达菌株的构建和应用。

背景技术

漆酶是一种广泛存在于细菌、古菌、真菌、动植物中的含铜多酚类氧化酶。可催化多种类型的活性染料进行有效的脱色反应，其中以偶氮类染料较多。偶氮染料作用广泛，全球百分之八十的染料都属于此类，同时也是公认难治理的染料。因此，研究其废液处理方法，具有重要的意义。

运用漆酶对偶氮类活性染料进行脱色，是现代生物化学、环境科学的研究热点。活性染料被广泛应用于棉、毛、丝、麻及聚酰胺织物的染色，是目前纺织印染行业应用最广的一类染料。但活性染料印染时会产生大量有色污水，为了抑制纤维表面的电荷，需要向废水中加入大量的氯离子，使治理活性染料染色废水的难度大大增加。我国是纺织品大国，倘若这些工业污水直接排放或者处理不当，则会对环境造成很大的危害。传统的处理方法容易在降解过程中造成二次污染，且成本高，能耗大，还可能产生有毒的副产物，使用漆酶催化的酶促方法可弥补传统处理方法的不足。

研究发现嗜热菌漆酶具有较高的最适温度和较强的热稳定性，这对于漆酶更广泛的应用具有十分重要意义。如本实验室前期研究基础表明，来源于Anoxybacillussp的漆酶LacAn对部分纺织用偶氮类染料具有较优的脱色效果。然而野生菌株存在表达含量低且酶学性质不佳如酶活低、金属离子抗性差、酶的最适条件不稳定等一系列问题。

发明内容

细菌漆酶催化范围宽，具有较为广泛的应用价值，但野生型酶表达产量较低，无法满足工业需求，限制了细菌漆酶应用能力。本发明针对上述不足，提供一种细菌漆酶突变体LacAt及其表达菌株的构建和应用。

本发明以来源于购买菌株Anoxybacillussp的漆酶LacAn为野生型出发蛋白，通过定向进化构建突变文库，对酶性质进行改良，以高通量筛选技术获得突变体酶命名为LacAt，发酵液酶活由野生型560U/L提高至1125U/L，突变体蛋白表达量较野生型酶提高2倍。将突变体漆酶LacAt用于偶氮染料直接6的脱色，在无介体添加时即可对染料完全脱色，提高了漆酶的应用能力，减少了使用成本及避免二次污染，有利于改进偶氮染料纺织整染工艺，降低运行成本，为解决现有酶促降解纺织染料中的问题提供研究基础。

本发明细菌漆酶突变体LacAt，其蛋白序列如SEQ ID No：1所示。

本发明细菌漆酶突变体LacAt，其基因序列如SEQ ID No：2所示。

本发明细菌漆酶突变体LacAt的表达菌株的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：突变体LacAt编码基因的获得

以Anoxybacillussp漆酶LacAn的cDNA为模板，以如下引物(下划线为突变位点序列)在氨基酸序列中引入G79D、A138V两处突变位点。

79F：GACCAAGTGCATGACGTGCATATA

79R：TATATGCACGTCATGCACTTGGTC

138F：AAGCTAATTGGGGAAGCACACG

138R：CGTGTGCTTCCCCAATTAGCTT

LacAtF：CCCATATGATGAACGATATATTTCGCC(下划线为Nde I识别序列)

LacAtR：CCTCGAGCCTCCAGCCAATAA(下划线为XhoI识别序列)

以常规PCR方式扩增并获得突变体LacAt编码基因，并在全长序列扩增时引入NdeI和XhoI两处酶切位点。PCR反应体系50μL，反应条件为：95℃预变性2min，随后进行30个循环(95℃20S，57℃20S，72℃1.5min)，循环后72℃延伸10min，最后4℃保温，取10μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将LacAt目的片段回收。

步骤2：重组质粒的构建

以NdeI和XhoI两种限制内切酶分别将回收后的LacAt目的片段和pET22b载体于37℃水浴中双酶切3-5h，通过AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒将两组酶切产物回收后，各取100ng回收产物，在T4连接酶作用下于16℃环境中将LacAt编码基因正向插入pET22b的NdeI和XhoI酶切位点之间，获得重组质粒。

步骤3：突变体LacAt重组表达菌株的构建

将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化产物涂板于LB(含100mg/L氨苄青霉素)平板在28-37℃培养。随机挑取部分单克隆，以菌落PCR方式验证阳性克隆。将阳性克隆接种于含有5mL液体LB(含100mg/L氨苄青霉素)试管中，于28-37℃、120-200rpm进行过夜培养后，取菌液保存于10-30％的甘油管中，放置于-80℃中以保菌。

以上述构建获得的表达菌株发酵制备漆酶突变体LacAt，包括如下步骤：

步骤1：发酵培养制备粗酶液

在28-37℃、120-200rpm条件下，将保存于甘油管中的菌株接种于含50mL液体LB培养基的250mL摇瓶中培养至菌体生物量OD₆₀₀值至0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导剂，并降温至16-28℃进行诱导表达，以SGZ检测发酵液中LacAt活力变化；连续检测漆酶LacAt活力开始下降时，结束发酵并收集发酵液，在4℃、12000rpm下离心15min，弃上清液收集沉淀菌体；以pH7.5的Na-K缓冲液重悬沉淀并清洗两次后，再以适量Na-K缓冲液重悬细胞并以超声破碎方式对菌体进行破壁，将破碎液在4℃、12000rpm下离心10-15min，弃沉淀收集上清液获取LacAt粗酶液1L；使用300mL规格超滤浓缩装置在4℃、0.2-0.3MPa条件下对粗酶液进行浓缩超滤，获得漆酶LacAt浓缩粗酶液30mL。

步骤2：漆酶LacAt的纯化

以Ni柱亲和层析纯化漆酶LacAt，配制纯化溶液：

Wash buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM 2-ME，20mM imidazole，pH8.0。

Elution buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM2-ME，250mM imidazole，pH8.0。

Saving buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM2-ME，pH8.0。

将配制完成的溶液均进行抽滤后超声除气。蛋白纯化具体步骤如下：

(1)用0.22um的滤膜过滤粗酶液，样品上清液上Ni-柱；

(2)待样品上清液流净后，加入10倍柱体积的Wash buffer清洗杂蛋白；

(3)加入3倍柱体积的Elution buffer洗脱目的蛋白，此时开始分管收集目的蛋白，调整咪唑浓度50mM-250mM，从低到高浓度下依次冲洗收集蛋白洗脱液。

(4)以15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测收集洗脱液中的蛋白纯度，收集目标蛋白较纯的洗脱液进行混合(图1)。

(5)将混合液置于透析袋中，在4℃环境中，将透析袋置于Saving buffer中进行透析更换漆酶保存体系。每隔3-5h更换一次透析缓冲液，连续透析3-4次，获得漆酶LacAt纯酶液。

本发明细菌漆酶突变体LacAt的应用，是在偶氮类染料脱色处理的过程中作为催化剂使用。

进一步地，将漆酶突变体LacAt用于偶氮类染料的脱色。细菌漆酶氧化染料底物脱色时常因氧化还原电势较低无法直接作用于底物而加入一些介体，这些小分子介体如丁香酸甲酯等起到电子转递的作用，以使漆酶完成底物的氧化反应。介体的加入虽然促进了反应的进行，但同时也增加了运行成本，并造成了二次污染。

进一步地，本发明所选偶氮类染料为纺织整染中常用染料，包括：直接绿6(DG6)、直接黑19(DB19)、直接蓝6(DB6)、酸性黑1(AB1)。

本发明的漆酶突变体LacAt可在无介体的存在下直接氧化染料底物，对所选偶氮类染料均有不同程度的脱色效果，反应60min时，对DG6和DB19达到最高脱色率分别为99％、52％；反应进行80min时，对DB6、AB1达到最高脱色率分别为35％、32％。

进一步地，脱色体系选择：pH6.0-8.5、温度40-80℃、体系酶量100-300U/L，反应时间40-120min。

对比野生型酶LacAn与突变体酶LacAt氧化染料底物直接绿6脱色，同样条件下，LacAn对底物脱色率达到92％，其脱色能力略低于突变体LacAt。

与现有技术相比相比，本发明的有益效果体现在：

本发明细菌漆酶突变体LacAt，其蛋白表达量较野生酶提高了2倍，降低了生产成本，提升了细菌漆酶的应用能力。如本发明将细菌漆酶LacAt用于偶氮染料的防治整染废水处理以替代传统工艺。传统的染料废水处理方法容易在降解过程中造成二次污染，且成本高，能耗大，还可能产生有毒的副产物。漆酶是一种绿色催化剂，能够氧化降解染料底物，但野生酶的表达量较低，增加了使用成本限制了漆酶的应用。本发明所获得的细菌漆酶LacAt可用于偶氮染料的脱色，将有利于改进细菌漆酶的应用能力，降低了生产成本。

附图说明

图1漆酶LacAt纯化后电泳检测，M为蛋白Maker，control为发酵液全蛋白，sonicate为浓缩后超声破碎粗酶液，LacAt为混合后漆酶纯蛋白。LacAn为等量发酵液纯化后漆酶纯蛋白条带，从图1中可以看出目标漆酶条带纯度较高，其大小约为28.5kDa，等量发酵液纯化后突变体LacAt蛋白量明显高于野生型LacAn。

图2是漆酶LacAt脱色偶氮染料体系优化结果，其中A表示pH对脱色率的影响，B表示温度对脱色率的影响，C表示酶量对脱色率的影响，D表示介体浓度对脱色率的影响。从图2中可以看出，反应参数对LacAt脱色的影响很大，pH和温度影响酶的催化活性，使脱色率呈先增后降的趋势，随酶量及反应时间的增加脱色率呈先增后趋于平稳的趋势。

图3是漆酶突变体LacAt和野生型LacAn氧化脱色直接绿6对比结果，LacAt在反应60min时对底物脱色率达到99％，LacAn在反应进行80min时对底物脱色率达到92％，结果显示突变体氧化底物脱色效率略高于野生型。

具体实施方式

实施例1：漆酶LacAt的制备

菌株：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)

表达载体：pET22b

培养基：

LB培养基(1L)：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，溶于1L水中，高压灭菌，固体培养基添加1.5％琼脂。使用前加入终浓度为100mg/L的氨苄青霉素。

1、突变体LacAt编码基因的获得及重组质粒的构建

以Anoxybacillussp漆酶LacAn的cDNA为模板，以如下引物(下划线为突变位点序列)在氨基酸序列中引入G79D、A138V两处突变位点。

79F：GACCAAGTGCATGACGTGCATATA

79R：TATATGCACGTCATGCACTTGGTC

138F：AAGCTAATTGGGGAAGCACACG

138R：CGTGTGCTTCCCCAATTAGCTTLacAtF:CCCATATGATGAACGATATATTTCGCC(下划线为Nde I识别序列)

LacAtR:CCTCGAGCCTCCAGCCAATAA(下划线为XhoI识别序列)

以常规PCR方式扩增并获得突变体LacAt编码基因，并在全长序列扩增时引入NdeI和XhoI两处酶切位点。PCR反应体系50μL，反应条件为：95℃预变性2min，随后进行30个循环(95℃20S，57℃20S，72℃1.5min)，循环后72℃延伸10min，最后4℃保温，取10μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将LacAt目的片段回收。

以NdeI和XhoI两种限制内切酶分别将回收后的LacAt目的片段和pET22b载体于37℃水浴中双酶切8h，通过AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒将两组酶切产物回收后，各取100ng回收产物，在T4连接酶作用下于16℃环境中将LacAt编码基因正向插入pET22b的NdeI和XhoI酶切位点之间，获得重组质粒。

2、突变体LacAt重组表达菌株的构建

将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中于，转化产物涂板于LB(含100mg/L氨苄青霉素)平板在37℃培养。随机挑取部分单克隆，以菌落PCR方式验证阳性克隆。将阳性克隆接种于含有5mL液体LB(含100mg/L氨苄青霉素)试管中，于37℃、200rpm进行过夜培养后，取菌液保存于15％的甘油管中，放置于-80℃中以保菌。

3、发酵培养

在37℃、200rpm条件下，将保存于甘油管中的菌株接种于含50mL液体LB培养基的250mL摇瓶中培养至菌体生物量OD₆₀₀值至0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导剂，并降温至28℃进行诱导表达，以SGZ检测发酵液中LacAt活力变化。

SGZ检测体系为：取pH7.5的Na-K缓冲液970μL，加入浓度为10mM的CuSO₄母液10μL，浓度为10mM的SGZ母液10μL，于45℃水浴中预热3min后加入10μL漆酶液。混匀后反应体系在45℃下反应5min后立即冰浴30S，在468nm处检测吸光值并计算酶活，定义一个单位的酶活(U)为一分钟内转化1μM底物所需的酶量。

4、粗酶液获得

连续检测漆酶LacAt活力开始下降时，结束发酵并收集发酵液，在4℃、12000rpm下离心15min，弃上清液收集沉淀菌体。以pH7.5的Na-K缓冲液重悬沉淀并清洗两次后，加入适量缓冲液以超声破碎方式对菌体进行破壁，将破碎液在4℃、12000rpm下离心15min，弃沉淀收集上清液获取LacAt粗酶液1L。使用300mL规格超滤浓缩装置在4℃、0.3MPa条件下对粗酶液进行浓缩超滤，获得漆酶LacAt浓缩粗酶液30mL。

5、漆酶LacAt纯化

以Ni柱亲和层析纯化漆酶LacAt，配制纯化溶液：

Wash buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM 2-ME，20mM imidazole，pH8.0。

Elution buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM2-ME，250mM imidazole，pH8.0。

Saving buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM2-ME，pH8.0。

将配制完成的溶液均进行抽滤后超声除气。蛋白纯化具体步骤如下：

(1)用0.22um的滤膜过滤粗酶液，样品上清液上Ni-柱；

(2)待样品上清液流净后，加入10倍柱体积的Wash buffer清洗杂蛋白；

(3)加入3倍柱体积的Elution buffer洗脱目的蛋白，此时开始分管收集目的蛋白，调整咪唑浓度50mM-250mM，从低到高浓度下依次冲洗收集蛋白洗脱液。

(4)以15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测收集洗脱液中的蛋白纯度，收集目标蛋白较纯的洗脱液进行混合，同时对比野生型等量发酵液纯化后蛋白情况(图1)。

(5)将混合液置于透析袋中，在4℃环境中，将透析袋置于Saving buffer中进行透析更换漆酶保存体系。每隔5h更换一次透析缓冲液，连续透析三次，获得漆酶LacAt纯酶液。

图1是漆酶LacAt纯化后电泳检测，M为蛋白Maker，control为发酵液全蛋白，sonicate为浓缩后超声破碎粗酶液，LacAt为混合后漆酶纯蛋白。LacAn为等量发酵液纯化后漆酶纯蛋白条带，从图1中可以看出目标漆酶条带纯度较高，其大小约为28.5kDa，等量发酵液纯化后突变体LacAt蛋白量明显高于野生型LacAn。

实施例2：漆酶LacAt用于偶氮染料脱色

二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，配置偶氮染料母液10mM，同时配置CuSO₄母液10mM。

构建漆酶氧化直接绿6脱色初始反应体系10mL：染料100μM、LacAt酶活200U/L、CuSO₄100μM，以pH7.5的Na-K缓冲液补齐至10mL。体系在40℃反应3h后，于各染料吸光值下检测反应前后吸光值变化，并计算脱色率，以脱色率为评价标准优化并建立漆酶氧化染料脱色体系。脱色率计算公式如下：

脱色率＝(A₀-A₁)/A₀×100％

A₀为反应前体系初始吸光值，A₁为反应后体系吸光值。

优化反应脱色参数，建立漆酶LacAt对偶氮类染料底物的脱色体系。优化后，在pH为7.0、温度60℃、LacAt酶活150U/L时，反应60min时，对直接绿(DG6)和直接黑19(DB19)达到最高脱色率分别为99％、52％；反应进行80min时，对直接蓝6(DB6)、酸性黑1(AB1)达到最高脱色率分别为35％、32％(图2)。

实施例3：漆酶LacAt和LacAn氧化脱色直接绿6脱色比较

二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，配置直接绿6母液10mM，同时配置CuSO₄母液10mM。

构建漆酶氧化直接绿6脱色初始反应体系10mL：染料100μM、CuSO₄100μM，LacAn和LacAt体系酶量均为150U/L、以pH7.5的Na-K缓冲液补齐至10mL。体系在40℃下反应，每隔20min取样检测并计算脱色率，对比突变体和野生型对偶氮染料氧化脱色的能力变化。脱色率计算公式如下：

脱色率＝(A₀-A₁)/A₀×100％

A₀为反应前体系初始吸光值，A₁为反应后体系吸光值。

优化反应脱色参数，建立漆酶LacAt对直接绿6的脱色体系。优化后，在pH为7.0、温度60℃、酶活150U/L时，LacAt反应60min时对底物脱色率达到99％，LacAn在反应进行80min时对底物脱色率达到92％(图3)。

SEQ ID No：1漆酶LacAt蛋白序列

MNDIFRQASESLLLFDQWEHVVVAFTTKRGGVSTGPFATLNVGMHVQDDPTVVYHNRQKVADELNVSLDRWVCADQVHDVHIEKVTKEHAGKGVRTYDTALPHTDGLYTSERDIMLALCFADCVPLYFFAPSKKLIGVAHAGWKGTVHNIAGEMVKRWNEEGVDARDIHVVIGPSIGRCCYVVDDRVIEFVQKALVNSPQSLYNETSKGQYALDLKEMNKQLLQQAGVPSEHIAVSSYCTSCEQSLFFSHRRDGGKTGRMMALIGWR

SEQ ID No：2漆酶LacAt基因序列

ATGAACGATATATTTCGCCAAGCGAGCGAATCGTTGCTTTTATTTGATCAATGGGAACATGTCGTCGTCGCCTTTACAACAAAACGAGGGGGAGTGAGCACCGGACCGTTTGCGACGTTAAACGTCGGCATGCACGTGCAAGATGATCCAACCGTCGTGTATCACAATCGACAAAAAGTAGCGGACGAACTGAACGTTTCGCTCGATCGCTGGGTATGTGCCGACCAAGTGCATGACGTGCATATAGAAAAAGTGACAAAAGAGCATGCGGGAAAAGGCGTGCGCACGTACGACACCGCTTTGCCGCATACAGACGGGCTGTATACGAGCGAGCGAGACATCATGTTGGCGCTTTGTTTTGCGGATTGTGTTCCGCTTTACTTTTTTGCGCCAAGTAAAAAGCTAATTGGGGAAGCACACGCCGGCTGGAAAGGAACCGTTCACAACATCGCAGGAGAAATGGTGAAGCGATGGAACGAAGAAGGGGTAGATGCGCGCGATATTCACGTTGTCATCGGTCCGTCGATCGGCCGTTGTTGTTACGTCGTCGATGATCGCGTCATTGAATTCGTTCAAAAGGCGCTAGTCAACTCGCCTCAATCTCTTTATAATGAAACAAGTAAGGGACAATATGCGCTCGATTTAAAAGAAATGAATAAACAACTCCTGCAACAAGCAGGTGTTCCGAGCGAGCATATCGCGGTTTCATCGTATTGCACAAGCTGTGAGCAGTCATTATTTTTCTCTCACCGTCGCGACGGCGGAAAAACAGGAAGAATGATGGCGCTTATTGGCTGGAGG

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Claims (8)

1.一种细菌漆酶突变体LacAt，其特征在于：

所述细菌漆酶突变体LacAt的蛋白序列如SEQ ID No：1所示。

2.根据权利要求1所述的细菌漆酶突变体LacAt，其特征在于：

所述细菌漆酶突变体LacAt的基因序列如SEQ ID No：2所示。

3.权利要求1或2所述的细菌漆酶突变体LacAt的表达菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：突变体LacAt编码基因的获得

以Anoxybacillussp漆酶LacAn的cDNA为模板，以如下引物在氨基酸序列中引入G79D、A138V两处突变位点：

79F：GACCAAGTGCATGACGTGCATATA

79R：TATATGCACGTCATGCACTTGGTC

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138R：CGTGTGCTTCCCCAATTAGCTT

LacAtF：CCCATATGATGAACGATATATTTCGCC

LacAtR：CCTCGAGCCTCCAGCCAATAA

以常规PCR方式扩增并获得突变体LacAt编码基因，并在全长序列扩增时引入NdeI和XhoI两处酶切位点，回收LacAt目的片段；

步骤2：重组质粒的构建

以NdeI和XhoI两种限制内切酶分别将回收后的LacAt目的片段和pET22b载体于37℃水浴中双酶切3-5h，将两组酶切产物回收后，各取100ng回收产物，在T4连接酶作用下于16℃环境中将LacAt编码基因正向插入pET22b的NdeI和XhoI酶切位点之间，获得重组质粒；

步骤3：突变体LacAt重组表达菌株的构建

将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化产物涂板于LB平板在28-37℃培养，随机挑取部分单克隆，以菌落PCR方式验证阳性克隆；将阳性克隆接种于含有5mL液体LB试管中，于28-37℃、120-200rpm培养，取菌液保存于10-30％的甘油管中，放置于-80℃中以保菌。

4.以权利要求3所述的方法构建获得的表达菌株发酵制备漆酶突变体LacAt，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：发酵培养制备粗酶液

在28-37℃、120-200rpm条件下，将保存于甘油管中的菌株接种于含50mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，培养至菌体生物量OD₆₀₀值至0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导剂，并降温至16-28℃进行诱导表达，以SGZ检测发酵液中LacAt活力变化；连续检测漆酶LacAt活力开始下降时，结束发酵并收集发酵液，在4℃、12000rpm下离心15min，弃上清液收集沉淀菌体；以pH7.5的Na-K缓冲液重悬沉淀并清洗两次后，再以适量Na-K缓冲液重悬细胞并以超声破碎方式对菌体进行破壁，将破碎液在4℃、12000rpm下离心10-15min，弃沉淀收集上清液获取LacAt粗酶液1L；使用300mL规格超滤浓缩装置在4℃、0.2-0.3MPa条件下对粗酶液进行浓缩超滤，获得漆酶LacAt浓缩粗酶液30mL；

步骤2：漆酶LacAt的纯化

以Ni柱亲和层析纯化漆酶LacAt，具体包括如下步骤：

(1)用0.22um的滤膜过滤粗酶液，样品上清液上Ni-柱；

(2)待样品上清液流净后，加入10倍柱体积的Wash buffer清洗杂蛋白；

(3)加入3倍柱体积的Elution buffer洗脱目的蛋白，此时开始分管收集目的蛋白，调整咪唑浓度50mM-250mM，从低到高浓度下依次冲洗收集蛋白洗脱液；

(4)以15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测收集洗脱液中的蛋白纯度，将只含有单一目标条带的洗脱液收集混合；

(5)将混合液置于透析袋中，在4℃环境中，将透析袋置于Saving buffer中进行透析更换漆酶保存体系，每隔3-5h更换一次透析缓冲液，连续透析3-4次，获得漆酶LacAt纯酶液。

5.权利要求1或2所述的细菌漆酶突变体LacAt的应用，其特征在于：

所述细菌漆酶突变体LacAt在偶氮类染料脱色处理的过程中作为催化剂使用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述偶氮类染料包括直接绿6、直接黑19、直接蓝6或酸性黑1。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：

所述细菌漆酶突变体LacAt可在无介体的存在下直接氧化染料底物，对偶氮类染料均有不同程度的脱色效果，反应60min时，对DG6、DB19达到最高脱色率分别为99％、52％；反应80min时，对DB6、AB1达到最高脱色率分别为35％、32％。

8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：

脱色参数：pH6.0-8.5、温度40-80℃、体系酶量100-300U/L，反应时间40-120min。

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