CN116411010A

CN116411010A - 用于发酵生产l-赖氨酸的表达盒、菌株及其应用

Info

Publication number: CN116411010A
Application number: CN202111673635.4A
Authority: CN
Inventors: 张明明; 杨晓晓; 刘修才
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-07-11

Abstract

本发明公开了一种用于发酵生产L‑赖氨酸的表达盒、菌株及其应用。所述表达盒包含组氨酸激酶效应蛋白AUH99703.1的编码基因。所述AUH99703.1蛋白的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，或与SEQ ID NO:1具有至少约95％的同一性。所述菌株为谷氨酸棒状杆菌工程菌，其包含上述表达盒，本发明通过增强组氨酸激酶效应蛋白的方式，显著缩短发酵时间以及提高L‑赖氨酸产量。

Description

用于发酵生产L-赖氨酸的表达盒、菌株及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于发酵生产L-赖氨酸的表达盒、菌株及其应用。

背景技术

赖氨酸(lysine)又名2,6-二氨基己酸，属于碱性氨基酸。赖氨酸具有重要的营养生理功能，在医药、食品和饲料工业中应用广泛。同时，其也可作为前体物质用于合成尼龙聚合材料。赖氨酸的生产途径主要包括蛋白水解法、化学合成法以及发酵法三种，其中，微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、特异性高、环境污染小等特点，成为赖氨酸工业化生产应用最广的方法。

用于生产赖氨酸的原核微生物主要包括棒状杆菌、短杆菌、诺卡氏菌、假单胞菌、埃希氏菌、芽孢杆菌等。谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)是发酵生产氨基酸最为重要和安全的菌株，通过代谢改造提高它过量合成各种氨基酸的能力一直是研究热点。例如，过表达赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径强化以及优化细胞膜上赖氨酸转运蛋白等都有效提高了赖氨酸的生产率。

就改善赖氨酸的生产效率的方法而言，已经使用扩增参与赖氨酸的生物合成途径的基因或修饰基因的启动子以提高参与赖氨酸生物合成途径的酶的活性的方法。但是，除了不断加强生成赖氨酸相关的直接代谢途径，打开非赖氨酸代谢的其他旁路的发酵方法，也值得深入挖掘。本专利通过研究发现组氨酸激酶响应蛋白AUH99703.1的增强可以提高赖氨酸产量。但现阶段对于该蛋白在谷氨酸棒状杆菌生产赖氨酸中的应用尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中缺少一种高产量L-赖氨酸生产基因工程菌的缺陷，本发明提供了一种能提高谷氨酸棒状杆菌的L-赖氨酸产量的表达盒和高效生产L-赖氨酸的基因工程菌。从组氨酸激酶响应蛋白角度研究谷氨酸棒状杆菌生产L-赖氨酸尚未见报道。本发明通过增强谷氨酸棒状杆菌组氨酸激酶响应蛋白的方式，显著缩短发酵时间以及提高L-赖氨酸(简称赖氨酸)产量。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种表达盒，所述表达盒含组氨酸激酶响应蛋白AUH99703.1编码基因和启动子。

优选地，所述组氨酸激酶响应蛋白AUH99703.1的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示，或与SEQ ID NO:1具有至少约95％的同一性，进一步为至少具有97％的同一性，进一步为至少具有99％的同一性。

优选地，所述启动子为Peftu，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种分离的核酸，所述核酸编码包含如技术方案之一所述的表达盒。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种重组载体，所述重组载体包括如技术方案之一所述的表达盒，或包括如技术方案之二所述的核酸。

优选地，当所述重组载体包括所述表达盒组合时，所述表达盒与骨架质粒pK18mob形成重组整合载体。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：一种基因工程菌，所述基因工程菌中转入了如技术方案之一所述的表达盒，或如技术方案之二所述的核酸，或如技术方案之三所述的重组载体。

较佳地，所述基因工程菌的出发菌为谷氨酸棒状杆菌。

优选地，所述基因工程菌不表达乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)，例如其基因ldh被敲除。

所述表达盒被导入所述出发菌后，所述表达盒通过同源重组方式整合在所述出发菌的基因组上，或以非整合形式存在于所述出发菌中。

于一实施方式中，所述出发菌为谷氨酸棒状杆菌CathS141、谷氨酸棒状杆菌B253。虽然本发明实施例中的出发菌株选用了耐受秸秆水解液的菌株谷氨酸棒状杆菌CathS141，但是由实施例4、对比例1可以看出，当培养基为配制的葡萄糖培养基时，本发明的基因工程菌生产L-赖氨酸的效果也优于出发菌株，即耐受秸秆水解液的抑制物毒性不是出发菌株必须具备的条件。

优选地，当所述基因工程菌包括所述表达盒时，所述表达盒整合在所述出发菌的基因组上；

更优选地，当所述基因工程菌包括所述表达盒时，将包括所述表达盒的重组整合载体导入所述出发菌，使所述表达盒整合至基因组上的ldh基因位点。

作为本发明一实施方式，所述的表达盒整合至所述基因工程菌基因组上的ldh基因位点处并敲除ldh基因，所述ldh基因的locus_tag优选为SB89_13725。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之五为：一种制备L-赖氨酸的方法，所述方法为：在发酵培养基中发酵如技术方案之四所述的基因工程菌。

优选地，所述发酵培养基为含有不低于25g/L葡萄糖的培养基，例如80-150g/L的葡萄糖。

于一实施方式中，所述发酵培养基为含有葡萄糖的培养基例如秸秆水解液，所述秸秆水解液为农作物秸秆经酶解糖化后，秸秆中大分子碳水化合物如纤维素、半纤维素和木质素等被降解为小分子碳水化合物如葡萄糖形成的水解液。所述培养基例如含有不低于25g/L的葡萄糖，例如80-150g/L的葡萄糖。

较佳地，在所述水解液中添加硫酸铵、甲硫氨酸和苏氨酸。优选地，在所述水解液中添加15～25g/L硫酸铵、2～8g/L甲硫氨酸和2～8g/L苏氨酸。

进一步地，所述农作物秸秆在进行酶解糖化制备水解液前，可以进行预处理，例如包括筛分、除杂、酸预处理和/或脱毒处理。预处理可以提高农作物秸秆的糖化效率。其中的脱毒处理可以降低乙酸、糠醛、5-羟基苯甲醛、糠醛、羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、乙酰丙酸等毒性抑制物的含量。

优选地，所述发酵的条件为：温度为28-32℃，和/或，通气量为1.0-1.7vvm，和/或，pH为6.8-7.2，和/或，发酵时进行搅拌，搅拌的转速为400-800rpm。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之六为：如技术方案之一所述的表达盒、如技术方案之二所述的核酸、如技术方案之三所述的重组载体或如技术方案之四所述的基因工程菌在制备L-赖氨酸中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之七为：如技术方案之三所述的基因工程菌的制备方法，包括如下步骤(不分前后顺序)：

(1)将如技术方案之一所述的表达盒或技术方案之二所述的核酸或技术方案之三所述的重组载体导入出发菌中；

(2)敲除ldh基因，得所述基因工程菌。

优选地，所述制备方法中，先将如技术方案之三所述的表达盒组合导入出发菌中，敲除ldh基因，得所述基因工程菌。例如，所述出发菌为谷氨酸棒状杆菌CathS141、谷氨酸棒状杆菌B253，但不限于这些实施例。谷氨酸棒杆菌CathS141的保藏号为CCTCC NO:M20211495。谷氨酸棒状杆菌B253购买自上海工业微生物所。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明提供的表达盒中利用Peftu等作为组氨酸激酶响应蛋白AUH99703.1的启动子可以使其高效表达，提高葡萄糖转化效率，进而提高L-赖氨酸的产量。当使用秸秆水解液时，本发明的基因工程菌的赖氨酸产量比出发菌明显提升。本发明提供的基因工程菌可以有效利用秸秆等农业废料进行发酵，具备良好的应用前景。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

一、本发明所使用的菌株

大肠杆菌E.coli DH5α用于表达质粒和敲除质粒的构建.

谷氨酸棒状杆菌CathS141：作为出发菌株进行使用。

二、试剂与培养基

纤维素酶CTec 2.0用于水解木质纤维素中的纤维素和半纤维素，购自中国北京的诺维信(中国)公司。根据NREL LAP-006指南中的方法测得纤维素酶的滤纸酶活为203.2FPU/mL，纤维二糖酶活为4900.0CBU/mL，根据Bradford方法测得蛋白浓度为87.3mg/mL。限制性内切酶用于切割质粒或基因片段产生粘性末端，购自Thermo Scientific(Wilmington，DE，USA)。DNA聚合酶用于扩增基因片段，DNA连接酶用于连接酶切过的基因片段和质粒载体，这两种酶都是购自Takara(Otsu，Japan)。无缝克隆试剂盒用于连接含有同源片段的基因片段和质粒载体，购自汉恒生物科技公司(Nanjing，China)。质粒抽提试剂盒，PCR产物纯化回收试剂盒和凝胶回收试剂盒都是购自上海捷瑞生物科技公司(Shanghai，China)。其他试剂从本地供应商处购买。

培养大肠杆菌使用的培养基是Luria-Bertani(LB)培养基，具体成分如下：10.0g/L氯化钠，10.0g/L蛋白胨和5.0g/L酵母提取物。

培养谷氨酸棒状杆菌所用的培养基具体成分如下：

(1)种子培养基：25g/L葡萄糖，1.5g/L磷酸二氢钾，2.5g/L尿素和0.6g/L硫酸镁，25g/L玉米浆。

(2)发酵培养基：1g/L磷酸二氢钾，3g/L尿素，0.6g/L硫酸镁，20g/L玉米浆，视情况添加葡萄糖作为碳源。

实施例1出发菌谷氨酸棒杆菌CathS141的获得

收集新疆乌苏的土壤样品，每1g土壤样品添加至10mL无菌水中，剧烈混匀1min后将静置沉淀一段时间，再将原样品分别稀释成10^-3、10^-4、10^-5涂布在含有100mg/L制霉菌素的LB琼脂平板上，并在30℃下培养。经多次划线分离培养，获得纯化单菌落。

通过分离纯化获得一株可以生产L-赖氨酸的菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行菌体特征、生理生化特性等进行测定。所述的菌株具有以下形态特征：菌落湿润，呈圆形，表面光滑，边缘整齐，颜色为浅黄色；用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取该菌株的DNA，以其DNA为模版，使用细菌通用引物27F和1492R，并使用16S rDNA进行PCR扩增，进行测序后获得菌株16S rDNA序列,将菌株的16S rDNA序列在GenBank数据库中比对，鉴定该菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

小麦秸秆经过酸预处理、脱毒和酶水解后得到小麦秸秆水解液，以上述分离纯化得到的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过使用紫外线、亚硝基胍、5-氟尿嘧啶、ARTP等多次单独诱变及复合诱变，获得能够耐受秸秆水解液中的毒性抑制物进行正常的生长和赖氨酸生产的稳定菌株。将该菌株命名为CathS141，现保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC M 20211495，保藏日期2021年11月29日。

实施例2 Peftu_AUH99703.1表达盒的构建

先构建组氨酸激酶响应蛋白AUH99703.1的整合质粒，具体构建方法如下：以C.glutamicum的基因组为模板，利用Peftu-F(如SEQ ID NO:4所示)和Peftu-R(如SEQ IDNO:5所示)引物通过PCR的方法扩增得到Peftu启动子(如SEQ ID NO:2所示)；以C.glutamicum的基因组为模板，利用auh-F(如SEQ ID NO:6所示)和auh-R(如SEQ ID NO:7所示)引物通过PCR的方式扩增得到组氨酸激酶响应蛋白AUH99703.1编码基因片段(如SEQID NO:2所示)；以Peftu和组氨酸激酶响应蛋白AUH99703.1编码基因片段为模板，利用Peftu-F和auh-R引物，通过重叠延伸PCR的方式得到Peftu_auh融合片段(如SEQ ID NO:8所示)。

Peftu-F:gaaatcaggaagtgggatcgaaacgaaaagcaatttgcttttcgacg SEQ ID NO:4

Peftu-R:tgtatgtcctcctggacttcgtg SEQ ID NO:5

auh-F:ccacgaagtccaggaggacatacaatgaaaaacttcaaggaggtggac SEQ ID NO:6

auh-R:ttactccattactcccggtag SEQ ID NO:7

实施例3将Peftu_auh整合在ldh基因位点

以C.glutamicum的基因组为模板，利用ldh-up-F(如SEQ ID NO:9所示)和ldh-up-R(如SEQ ID NO:10所示)引物通过PCR的方法扩增得到ldh-up片段(如SEQ ID NO:11所示)；以C.glutamicum的基因组为模板，利用ldh-down-F(如SEQ ID NO:12所示)和ldh-down-R(如SEQ ID NO:13所示)引物通过PCR的方法扩增得到ldh-down片段(如SEQ ID NO:14所示)；以ldh-up片段，Peftu_auh和ldh-down片段为模板，利用ldh-up-F和ldh-down-R引物，通过重叠延伸PCR的方式得到Δldh::auh融合片段，并用EcoRI和HindIII内切酶对其进行处理，再利用T4连接酶将其插入到pK18mob质粒(购买途径见http://www.biovector.net/product/1089.html)中，得到pK18-Δldh::auh质粒。期间，可利用含有卡那霉素抗性的种子培养平板筛选连接成功的质粒。

ldh-up-F:tcccccgggggaacaccatgcgattaaggtgc SEQ ID NO:9

ldh-up-R:gaaaagcaaattgcttttcgtttcgatcccacttcctgatttccctaac SEQ ID NO:10

ldh-down-F:actaccgggagtaatggagtaaatctttggcgcctagttggc SEQ ID NO:12

ldh-down-R:gtaagcttgtctgggacgttgatgacgctg SEQ ID NO:13

接着通过电转的方式将整合质粒pK18-Δldh::auh转入C.glutamicum中，进而通过PCR验证的方式筛选出发生正确同源重组的菌株，得到重组谷氨酸棒状杆菌，命名为cg-auh01。

实施例4基因工程菌发酵性能评价

通过摇瓶体系评价基因工程菌株的发酵性能。发酵过程为：发酵培养基包括1g/L磷酸二氢钾，3g/L尿素，0.6g/L硫酸镁，20g/L玉米浆，并添加120g/L葡萄糖作为碳源，添加25μg/mL的卡纳霉素。发酵在250mL的摇瓶中进行，培养条件为30℃，200rpm，发酵时间为48h。通过核磁法检测发现对照菌株产生了28.76g/L赖氨酸，而基因工程菌株cg-auh01的赖氨酸产量达35.95g/L，即产量提升了25.01％，由此表明组氨酸激酶响应蛋白的引入显著提升了菌株的赖氨酸生产性能。

对比例1比较不同启动强度下组氨酸激酶响应蛋白对发酵的影响

基因工程菌的制备同实施例2和3，区别在于将启动子分别换为强度较弱的PH36(核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示)，用到的引物为PH36-F/PH36-R(如SEQ ID NO:16和SEQID NO:17所示)，获得基因工程菌cg-auh02。发酵过程参考实施例4。结果发现cg-auh02产生了31.57g/L的赖氨酸，进一步表明组氨酸激酶响应蛋白的增强可以提高赖氨酸产量，同时也说明其促进效果与该蛋白的增强程度呈正相关关系。

PH36-F:gaaatcaggaagtgggatcgaaacaaaagctgggtacctctatctg SEQ ID NO:16

PH36-R:ggatcccatgctactcctaccaac SEQ ID NO:17

实施例5基因工程菌在木质纤维素水解液中发酵评价

木质纤维素类生物质中富含丰富的糖类，水解后可以获得葡萄糖，为了评价木质纤维素类生物质水解物中基因工程菌生产赖氨酸的性能，因此本专利以小麦秸秆水解液为底物进行评价。小麦秸秆经过粉碎后，再通过直径为10毫米的筛网进行筛分，筛分后的秸秆再经过水洗除去泥土，石块和金属等杂质，在105℃烘箱中烘干至恒重后保存在封闭的塑料袋中备用。再通过酸预处理、生物脱毒和酶解糖化后，分离得到小麦秸秆水解液，其含有95.4g/L葡萄糖。在水解液中添加20g/L硫酸铵和5g/L甲硫氨酸和5g/L苏氨酸，将改造得到的菌株cg-auh 01和出发菌株CathS141培养在小麦秸秆水解液中进行发酵对比，发酵温度为30℃，pH用氨水控制在7.0，通气量为1.4vvm，转速为600rpm，以葡萄糖耗完为发酵终止时间。通过核磁法检测赖氨酸产量。

结果表明以小麦秸秆水解液为培养基时，两株菌在发酵时的发酵时间上出现显著区别，其中出发菌株需要72h方可代谢完所有葡萄糖，但是重组菌株cg_auh 01发酵所需时间减少了13h。此时，对照菌株和重组菌株赖氨酸的产酸速率分别为0.28g/L/h和0.39g/L/h，即组氨酸激酶响应蛋白的增强使生产强度提高39.29％。

当使用谷氨酸棒状杆菌B253为出发菌，按照和菌株cg_auh 01相同的改造方法改造得到菌株命名为B253-115，验证其在上述相同的发酵条件下发酵效果，菌株B253-115的产酸速率(g/L/h)比菌株B253提高了38.75％。发酵时间缩短了12h。

据此可知，本发明得到的重组菌株具备高效的赖氨酸生产能力，具备良好的应用前景。

以上具体描述了本发明技术方案的操作实例，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件的等同替换，均在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凯赛生物技术股份有限公司

CIBT美国公司

<120> 用于发酵生产L-赖氨酸的表达盒、菌株及其应用

<130> P210110923CF

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 544

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AUH99703.1氨基酸序列

<400> 1

Met Lys Asn Phe Lys Glu Val Asp Ile Ile Arg Phe Ala Thr Arg Ile

1 5 10 15

Leu Val Ile Gln Val Ala Thr Val Ala Leu Val Val Ala Ile Cys Thr

20 25 30

Gly Ile Phe Ala Val Leu Met Met Asp Gln Met Lys Thr Glu Ala Glu

35 40 45

His Thr Ala Leu Ser Ile Gly Arg Ser Val Ala Ser Asn Pro Gln Ile

50 55 60

Arg Glu Glu Val Ala Leu Asp Thr Gln Thr Gly Ala Asn Pro Ser Ala

65 70 75 80

Glu Glu Leu Ala Asp Gly Asp Ile Gln Ala Ile Ala Gln Ala Ala Asn

85 90 95

Glu Arg Thr Gly Ala Leu Phe Val Val Ile Thr Asp Gly Leu Gly Ile

100 105 110

Arg Leu Ser His Pro Asp Glu Glu Arg Leu Gly Glu Gln Val Ser Thr

115 120 125

Ser Phe Glu Ala Ala Met Arg Gly Glu Glu Thr Met Ala Trp Glu Thr

130 135 140

Gly Thr Leu Gly Ala Ser Ala Arg Ala Lys Val Pro Ile Phe Ala Pro

145 150 155 160

Asp Ser Asn Val Pro Val Gly Glu Val Ser Val Gly Phe Glu Arg Asp

165 170 175

Ser Val Tyr Ser Arg Leu Pro Met Phe Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ile

180 185 190

Ser Val Leu Gly Ile Leu Ile Gly Val Gly Val Ala Met Gly Met Arg

195 200 205

Arg Arg Trp Glu Arg Val Thr Leu Gly Leu Gln Pro Glu Glu Leu Val

210 215 220

Thr Leu Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Ile Asp Gly Ile Asp Glu Gly

225 230 235 240

Val Leu Ala Leu Ser Pro Asn Gly Thr Ile Gly Val His Asn Glu Gln

245 250 255

Ala Gln Ser Met Ile Gly Ala Gly Pro Met Ser Gly Arg Thr Leu Lys

260 265 270

Glu Leu Gly Leu Asp Leu Gly Leu Asp Gly Val Val Ser His Gly Gln

275 280 285

His Pro Glu Thr Val Ala His Asn Gly Arg Ile Leu Tyr Leu Asp Phe

290 295 300

His Pro Val Arg Arg Gly Asp Gln Asp Leu Gly Tyr Val Val Thr Ile

305 310 315 320

Arg Asp Arg Thr Asp Ile Ile Glu Leu Ser Glu Arg Leu Asp Ser Val

325 330 335

Arg Thr Met Thr His Ala Leu Arg Ala Gln Arg His Glu Phe Ala Asn

340 345 350

Arg Ile His Thr Ala Thr Gly Leu Ile Asp Ala Gly Arg Val His Asp

355 360 365

Ala Ala Glu Phe Leu Gly Asp Ile Ser Arg Asn Gly Gly Gln Ser His

370 375 380

Pro Leu Ile Gly Ser Ala His Leu Asn Glu Ala Phe Leu Ser Ser Phe

385 390 395 400

Leu Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala Ser Glu Lys Gly Val Ser Leu Arg

405 410 415

Ile Asn Ser Asp Thr Leu Ile Leu Gly Thr Val Lys Asp Pro Glu Asp

420 425 430

Val Ala Thr Ile Leu Gly Asn Leu Ile Asn Asn Ala Ile Asp Ala Ala

435 440 445

Val Ser Gly Glu Ala Pro Arg Trp Ile Glu Leu Thr Leu Met Asp Asp

450 455 460

Ala Asp Thr Leu Val Ile Ser Val Ala Asp Ser Gly Pro Gly Ile Arg

465 470 475 480

Glu Gly Val Asp Val Phe Ala Thr Ala Thr Gln Ile Gly Asp Ser Glu

485 490 495

Asp Asn Glu Arg Thr His Gly His Gly Ile Gly Leu Lys Leu Cys Arg

500 505 510

Ala Leu Ala Arg Ser His Gly Gly Asp Val Trp Val Ile Asp Arg Gly

515 520 525

Thr Glu Asp Gly Ala Val Phe Gly Val Lys Leu Pro Gly Val Met Glu

530 535 540

<210> 2

<211> 1635

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AUH99703.1核苷酸序列

<400> 2

atgaaaaact tcaaggaggt ggacatcatt cgctttgcta cccgaatact ggtgattcaa 60

gtggctaccg tcgcgttggt ggtagctatt tgcaccggca ttttcgcagt tttgatgatg 120

gatcagatga aaacggaggc cgagcacaca gcgctgtcca tcggacgttc ggtggcatcc 180

aacccgcaga tccgcgagga agtagcgctt gatactcaaa caggagcaaa cccatcggcc 240

gaagaattag ccgatggaga tatccaagcg attgcgcagg cggccaatga acgcactgga 300

gctttgtttg tcgttatcac tgacggttta ggtatccgcc tgtcccaccc agatgaggaa 360

cgtctggggg agcaggtgag cactagcttt gaggctgcca tgaggggtga agaaaccatg 420

gcgtgggaga ccgggaccct cggtgcgtcc gcacgagcaa aagtgcctat ctttgcgccg 480

gattctaatg ttccagtcgg tgaggtcagt gtcgggtttg agcgagacag tgtgtattcc 540

cgcctgccca tgttcctcgc cgcccttgct cttatttctg tgttgggaat ccttatcggc 600

gtgggtgtag ccatgggcat gcgacgccgt tgggaacgcg tgaccttggg tttgcagccg 660

gaggagctag tgacccttgt gcaaaatcag actgcagtca tcgatggcat tgatgagggc 720

gtgctggcgc tgagcccaaa cggaacaatt ggggtgcata atgagcaggc acaatccatg 780

attggtgcag gtcctatgag tggcaggacg ttgaaagaac tagggcttga cctgggtctt 840

gatggcgttg tatcgcatgg tcagcatccg gaaaccgttg cccataatgg caggatcctc 900

tatctggatt tccaccccgt gcgccgtggg gatcaagatt taggctacgt ggtaaccatc 960

cgcgatcgca ccgacatcat tgaactcagt gaacgcctcg actctgtgcg caccatgacc 1020

cacgcactcc gcgcccagcg ccacgagttt gccaaccgca tccacaccgc aacagggctt 1080

atcgacgccg gccgcgtcca tgacgcggcc gagtttctag gcgatatatc ccgcaacggg 1140

ggacaatcac atccattaat cggatcagcg cacctcaatg aagcattttt gagctcattt 1200

ttaagtactg cttctatttc ggcatctgaa aagggcgtta gtctgcgcat caactctgac 1260

acgctcatcc ttggcactgt taaagatcca gaagatgtag caaccatttt gggtaattta 1320

atcaacaatg ccatcgacgc cgcggtgtca ggtgaagccc cacggtggat tgagcttacg 1380

ttgatggatg atgccgatac gctggtcatt tctgttgcag attctggtcc tggaatccga 1440

gagggcgtgg atgtatttgc cacagccacc cagataggag actctgaaga taatgaacgc 1500

acccacgggc atggcattgg tctaaaactg tgccgggctt tggctagatc acatggtggc 1560

gatgtctggg tgattgatag aggaaccgaa gatggcgctg tatttggagt gaaactaccg 1620

ggagtaatgg agtaa 1635

<210> 3

<211> 335

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Peftu核苷酸序列

<400> 3

cgaaaagcaa tttgcttttc gacgccccac cccgcgcgtt ttagcgtgtc agtaggcgcg 60

tagggtaagt ggggtagcgg cttgttagat atcttgaaat cggctttcaa cagcattgat 120

ttcgatgtat ttagctggcc gttaccctgc gaatgtccac agggtagctg gtagtttgaa 180

aatcaacgcc gttgccctta ggattcagta actggcacat tttgtaatgc gctagatctg 240

tgtgctcagt cttccaggct gcttatcaca gtgaaagcaa aaccaattcg tggctgcgaa 300

agtcgtagcc accacgaagt ccaggaggac ataca 335

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Peftu-F核苷酸序列

<400> 4

gaaatcagga agtgggatcg aaacgaaaag caatttgctt ttcgacg 47

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Peftu-R核苷酸序列

<400> 5

tgtatgtcct cctggacttc gtg 23

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> auh-F核苷酸序列

<400> 6

ccacgaagtc caggaggaca tacaatgaaa aacttcaagg aggtggac 48

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> auh-R核苷酸序列

<400> 7

ttactccatt actcccggta g 21

<210> 8

<211> 1970

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Peftu_auh核苷酸序列

<400> 8

cgaaaagcaa tttgcttttc gacgccccac cccgcgcgtt ttagcgtgtc agtaggcgcg 60

tagggtaagt ggggtagcgg cttgttagat atcttgaaat cggctttcaa cagcattgat 120

ttcgatgtat ttagctggcc gttaccctgc gaatgtccac agggtagctg gtagtttgaa 180

aatcaacgcc gttgccctta ggattcagta actggcacat tttgtaatgc gctagatctg 240

tgtgctcagt cttccaggct gcttatcaca gtgaaagcaa aaccaattcg tggctgcgaa 300

agtcgtagcc accacgaagt ccaggaggac atacaatgaa aaacttcaag gaggtggaca 360

tcattcgctt tgctacccga atactggtga ttcaagtggc taccgtcgcg ttggtggtag 420

ctatttgcac cggcattttc gcagttttga tgatggatca gatgaaaacg gaggccgagc 480

acacagcgct gtccatcgga cgttcggtgg catccaaccc gcagatccgc gaggaagtag 540

cgcttgatac tcaaacagga gcaaacccat cggccgaaga attagccgat ggagatatcc 600

aagcgattgc gcaggcggcc aatgaacgca ctggagcttt gtttgtcgtt atcactgacg 660

gtttaggtat ccgcctgtcc cacccagatg aggaacgtct gggggagcag gtgagcacta 720

gctttgaggc tgccatgagg ggtgaagaaa ccatggcgtg ggagaccggg accctcggtg 780

cgtccgcacg agcaaaagtg cctatctttg cgccggattc taatgttcca gtcggtgagg 840

tcagtgtcgg gtttgagcga gacagtgtgt attcccgcct gcccatgttc ctcgccgccc 900

ttgctcttat ttctgtgttg ggaatcctta tcggcgtggg tgtagccatg ggcatgcgac 960

gccgttggga acgcgtgacc ttgggtttgc agccggagga gctagtgacc cttgtgcaaa 1020

atcagactgc agtcatcgat ggcattgatg agggcgtgct ggcgctgagc ccaaacggaa 1080

caattggggt gcataatgag caggcacaat ccatgattgg tgcaggtcct atgagtggca 1140

ggacgttgaa agaactaggg cttgacctgg gtcttgatgg cgttgtatcg catggtcagc 1200

atccggaaac cgttgcccat aatggcagga tcctctatct ggatttccac cccgtgcgcc 1260

gtggggatca agatttaggc tacgtggtaa ccatccgcga tcgcaccgac atcattgaac 1320

tcagtgaacg cctcgactct gtgcgcacca tgacccacgc actccgcgcc cagcgccacg 1380

agtttgccaa ccgcatccac accgcaacag ggcttatcga cgccggccgc gtccatgacg 1440

cggccgagtt tctaggcgat atatcccgca acgggggaca atcacatcca ttaatcggat 1500

cagcgcacct caatgaagca tttttgagct catttttaag tactgcttct atttcggcat 1560

ctgaaaaggg cgttagtctg cgcatcaact ctgacacgct catccttggc actgttaaag 1620

atccagaaga tgtagcaacc attttgggta atttaatcaa caatgccatc gacgccgcgg 1680

tgtcaggtga agccccacgg tggattgagc ttacgttgat ggatgatgcc gatacgctgg 1740

tcatttctgt tgcagattct ggtcctggaa tccgagaggg cgtggatgta tttgccacag 1800

ccacccagat aggagactct gaagataatg aacgcaccca cgggcatggc attggtctaa 1860

aactgtgccg ggctttggct agatcacatg gtggcgatgt ctgggtgatt gatagaggaa 1920

ccgaagatgg cgctgtattt ggagtgaaac taccgggagt aatggagtaa 1970

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ldh-up-F核苷酸序列

<400> 9

tcccccgggg gaacaccatg cgattaaggt gc 32

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ldh-up-R核苷酸序列

<400> 10

gaaaagcaaa ttgcttttcg tttcgatccc acttcctgat ttccctaac 49

<210> 11

<211> 943

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ldh-up核苷酸序列

<400> 11

ggaacaccat gcgattaagg tgcgctgctt gaattgcaga attatgcaag atgcgccgca 60

acaaaacgcg atcggccaag gtcaaagtgg tcaatgtaat gaccgaaacc gctgcgatga 120

aactaatcca cggcggtaaa aacctctcaa ttaggagctt gacctcatta atgctgtgct 180

gggttaattc gccggtgatc agcagcgcgc cgtaccccaa ggtgccgaca ctaatgcccg 240

cgatcgtctc cttcggtcca aaattcttct gcccaatcag ccggatttgg gtgcgatgcc 300

tgatcaatcc cacaaccgtg gtggtcaacg tgatggcacc agttgcgatg tgggtggcgt 360

tgtaaatttt cctggatacc cgccggttgg ttctggggag gatcgagtgg attcccgtcg 420

ctgacgcatg ccccaccgct tgtaaaacag ccaggttagc agccgtaacc caccacggtt 480

tcggcaacaa tgacggcgag agagcccacc acattgcgat ttccgctccg ataaagccag 540

cgcccatatt tgcagggagg attcgcctgc ggtttggcga cattcggatc cccggaacca 600

gctctgcaat cacctgcgcg ccgagggaag cgaggtgggt ggcaggtttt agtgcgggtt 660

taagcgttgc caggcgagtg gtgagcagag acgctagtct ggggagcgaa accatattga 720

gtcatcttgg cagagcatgc acaattctgc agggcataga ttggttttgc tcgatttaca 780

atgtgatttt ttcaacaaaa ataacacatg gtctgaccac attttcggac ataatcgggc 840

ataattaaag gtgtaacaaa ggaatccggg cacaagctct tgctgatttt ctgagctgct 900

ttgtgggttg tccggttagg gaaatcagga agtgggatcg aaa 943

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ldh-down-F核苷酸序列

<400> 12

actaccggga gtaatggagt aaatctttgg cgcctagttg gc 42

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ldh-down-R核苷酸序列

<400> 13

gtaagcttgt ctgggacgtt gatgacgctg 30

<210> 14

<211> 959

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ldh-down核苷酸序列

<400> 14

atctttggcg cctagttggc gacgcaagtg tttcattgga acacttgcgc tgccaacttt 60

ttggtttacg ggcaaaatga aactgttgga tggaatttaa agtgtttgta gcttaaggag 120

ctcaaatgaa tgagtttgac caggacattc tccaggagat caagactgaa ctcgacgagt 180

taattctaga acttgatgag gtgacacaaa ctcacagcga ggccatcggg caggtctccc 240

caacccatta cgttggtgcc cgcaacctca tgcattacgc gcatcttcgc accaaagacc 300

tccgtggcct gcagcaacgc ctctcctctg tgggagctac ccgcttgact accaccgaac 360

cagcagtgca ggcccgcctc aaggccgccc gcaatgttat cggagctttc gcaggtgaag 420

gcccacttta tccaccctca gatgtcgtcg atgccttcga agatgccgat gagattctcg 480

acgagcacgc cgaaattctc cttggcgaac ccctaccgga tactccatcc tgcatcatgg 540

tcaccctgcc caccgaagcc gccaccgaca ttgaacttgt ccgtggcttc gccaaaagcg 600

gcatgaatct agctcgcatc aactgtgcac acgacgatga aaccgtctgg aagcagatga 660

tcgacaacgt ccacaccgtt gcagaagaag ttggccggga aatccgcgtc agcatggacc 720

ttgccggacc aaaagtacgc accggcgaaa tcgccccagg cgcagaagta ggtcgcgcac 780

gagtaacccg cgacgaaacc ggaaaagtac tgacgcccgc aaaactgtgg atcaccgccc 840

acggctccga accagtccca gcccccgaaa gcctgcccgg tcgccccgct ctgccgattg 900

aagtcacccc agaatggttc gacaaactag aaatcggcag cgtcatcaac gtcccagac 959

<210> 15

<211> 95

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PH36核苷酸序列

<400> 15

caaaagctgg gtacctctat ctggtgccct aaacggggga atattaacgg gcccagggtg 60

gtcgcacctt ggttggtagg agtagcatgg gatcc 95

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PH36-F核苷酸序列

<400> 16

gaaatcagga agtgggatcg aaacaaaagc tgggtacctc tatctg 46

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PH36-R核苷酸序列

<400> 17

ggatcccatg ctactcctac caac 24

Claims

1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含组氨酸激酶效应蛋白AUH99703.1编码基因和启动子。

2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述组氨酸激酶效应蛋白AUH99703.1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或，所述启动子为Peftu，核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；和/或，所述组氨酸激酶效应蛋白AUH99703.1编码基因的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码包含如权利要求1或2所述的表达盒。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求1或2任一项所述的表达盒，或包括如权利要求3所述的核酸；

优选地，所述重组载体的骨架质粒为pK18mob。

5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中转入了如权利要求1或2所述的表达盒，或如权利要求3所述的核酸，或如权利要求4所述的重组表达载体；

较佳地，所述基因工程菌的出发菌为谷氨酸棒状杆菌；

例如，所述基因工程菌的出发菌为谷氨酸棒状杆菌CathS141、谷氨酸棒状杆菌B253。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，当如权利要求1或2所述的表达盒，或如权利要求3所述的核酸，或如权利要求4所述的重组载体被转入所述出发菌后，所述表达盒通过同源重组方式整合在所述基因工程菌的基因组上，或以非整合形式存在于所述基因工程菌中；

优选地，所述表达盒整合在所述基因工程菌的基因组上。

7.如权利要求5或6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌不表达乳酸脱氢酶，例如其基因ldh被敲除；

优选地，如权利要求1或2所述的表达盒整合至所述基因工程菌基因组上的ldh基因位点处并敲除ldh基因，所述ldh基因的locus_tag优选为SB89_13725。

8.一种基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，所述步骤不分前后顺序：

1)将如权利要求1或2所述的表达盒，或如权利要求3所述的核酸，或如权利要求4所述的重组载体导入出发菌中；

2)敲除ldh基因，得所述基因工程菌；

优选地，出发菌为谷氨酸棒状杆菌；

优选地，所述制备方法中，将如权利要求1或2所述的表达盒，或如权利要求3所述的核酸，或如权利要求4所述的重组载体导入出发菌谷氨酸棒状杆菌CathS141中，同时敲除ldh基因，得所述基因工程菌。

9.一种制备L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括在发酵培养基中发酵如权利要求5-7任一项所述的基因工程菌；

所述发酵培养基为含有不低于25g/L葡萄糖的培养基，和/或所述发酵的条件为：温度为28-32℃，和/或，通气量为1.0-1.7vvm，和/或，pH为6.8-7.2，和/或，发酵时进行搅拌，搅拌的转速为400-800rpm；

优选地，所述发酵培养基含有80-150g/L的葡萄糖，发酵温度为30℃，pH为7.0，通气量为1.4vvm，搅拌的转速为600rpm。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为木质纤维素水解液，例如秸秆水解液，所述秸秆水解液为农作物秸秆经酶解糖化后形成的水解液，和/或在所述水解液中添加硫酸铵、甲硫氨酸和苏氨酸；

优选地，在所述水解液中添加15～25g/L硫酸铵、2～8g/L甲硫氨酸和2～8g/L苏氨酸；

可选地，所述农作物秸秆在进行酶解糖化制备水解液前，进行预处理，所述预处理包括筛分、除杂、酸预处理和/或脱毒处理。

11.如权利要求1或2所述的表达盒、如权利要求3所述的核酸、如权利要求4所述的重组载体、如权利要求5-7任一项所述的基因工程菌在制备L-赖氨酸中的应用。