CN116411008A - 用于发酵生产l-赖氨酸的表达盒、菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于发酵生产L‑赖氨酸的表达盒、菌株及其应用。所述表达盒包含启动子和谷氨酸棒状杆菌的生物素合成酶基因。本发明还公开了包含上述表达盒的核酸、含有该核酸的重组表达载体以及含有该核酸或该重组表达载体的基因工程菌以及它们的应用。本发明还公开了所述基因工程菌的制备方法，以及发酵所述基因工程菌制备L‑赖氨酸的方法。本发明提供的增强生物素合成酶表达的方式，有效调控细胞代谢，提高葡萄糖利用效率，进而提高L‑赖氨酸的产量，具备良好的应用前景。

Description

用于发酵生产L-赖氨酸的表达盒、菌株及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于发酵生产L-赖氨酸的表达盒、菌株及其应用。
背景技术
赖氨酸(lysine)又名2,6-二氨基己酸，属于碱性氨基酸。赖氨酸具有重要的营养生理功能，在医药、食品和饲料工业中应用广泛。同时，其也可作为前体物质用于合成尼龙聚合材料。赖氨酸的生产途径主要包括蛋白水解法、化学合成法以及发酵法三种，其中，微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、特异性高、环境污染小等特点，成为赖氨酸工业化生产应用最广的方法。
用于生产赖氨酸的原核微生物主要包括棒状杆菌、短杆菌、诺卡氏菌、假单胞菌、埃希氏菌、芽孢杆菌等。谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)是发酵生产氨基酸最为重要和安全的菌株，通过代谢改造提高它过量合成各种氨基酸的能力一直是研究热点。例如，过表达赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径强化以及优化细胞膜上赖氨酸转运蛋白等都有效提高了赖氨酸的生产率。
除了不断加强生成赖氨酸的代谢途径，打开非赖氨酸代谢的其他旁路的发酵方法，也值得深入挖掘。生物素(Biotin)为B族维生素之一，又称维生素H、维生素B7或辅酶R等。生物素是多种羧化酶的辅酶，参与体内的脂肪酸和碳水化合物的代谢，蛋白质的合成，以及维生素B12、叶酸、泛酸的代谢等。生物素合成酶在生物素的合成途径中发挥重要作用。现阶段，从调控生物素合成酶角度研究谷氨酸棒状杆菌生产L-赖氨酸尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中缺少一种高产量L-赖氨酸生产基因工程菌的缺陷，本发明提供了一种能提高谷氨酸棒状杆菌的赖氨酸产量的表达盒和能高效生产赖氨酸的基因工程菌。本发明通过增强谷氨酸棒状杆菌生物素合成酶表达的方式，改善细胞代谢，进而提高谷氨酸棒杆菌在葡萄糖或秸秆水解液条件下发酵效率，最终实现L-赖氨酸产量的提升。
本发明公开了一种产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌及应用。所述基因工程菌包括包含生物素合成酶编码基因表达盒，所述基因工程菌的出发菌为谷氨酸棒状杆菌，所述基因工程菌增强生物素合成酶。通过该方式，提高了菌株对葡萄糖的利用效率，从而提高L-赖氨酸的产量。同时，当使用秸秆水解液，本发明的基因工程菌的赖氨酸产量以及生产强度均优于出发菌株。
可以利用任何本领域已知的方法增强谷氨酸棒状杆菌生物素合成酶的表达，例如，可以通过额外引入、更换启动子等方式提高该基因的表达量。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种表达盒，所述表达盒包含启动子和谷氨酸棒状杆菌的生物素合成酶基因。
如技术方案之一所述的表达盒，所述生物素合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或与SEQ ID NO:2相比在第115位和/或第288位氨基酸存在差异。
在本发明的优选实施方案中，与SEQ ID NO:2相比存在V115G和/或G288A的氨基酸差异。
如技术方案之一所述的表达盒，编码所述生物素合成酶基因的核苷酸序列如SEQID NO:1或SEQ ID NO:17所示；和/或，所述启动子为Peftu，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种分离的核酸，所述核酸包含如技术方案之一所述的表达盒。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种重组载体，所述重组载体包括如技术方案之一所述的表达盒，或包括如技术方案之二所述的核酸。
在本发明一优选实施方案中，所述重组载体的骨架质粒为pK18mob。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：一种基因工程菌，所述基因工程菌中转入了如技术方案之一所述的表达盒，或如技术方案之二所述的核酸，或如技术方案之三所述的重组载体。
本发明所述基因工程菌的出发菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，虽然本发明实施例中的出发菌株选用了耐受秸秆水解液的菌株谷氨酸棒状杆菌CathS141，但是由实施例4可以看出，当培养基为配制的葡萄糖培养基时，本发明的基因工程菌生产L-赖氨酸的效果也优于出发菌株，即耐受秸秆水解液的抑制物毒性不是出发菌株必须具备的条件。因此，本发明的出发菌可以为谷氨酸棒状杆菌CathS141、谷氨酸棒状杆菌B253，但不限于这些实施例。谷氨酸棒杆菌CathS141的保藏号为CCTCC NO:M20211495。C.glutamicum B253购买自上海工业微生物所。
如技术方案之四所述基因工程菌，当如技术方案之一所述的表达盒、或如技术方案之二所述的核酸、或如技术方案之三所述的重组载体被导入所述出发菌后，所述表达盒通过同源重组方式整合在所述出发菌的基因组上，或以非整合形式存在于所述出发菌中。
本发明一优选实施方案中，优当所述基因工程菌包括所述表达盒时，所述表达盒整合在所述出发菌的基因组上。
更如技术方案之四所述基因工程菌，所述基因工程菌优选不表达乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)，例如其基因ldh被敲除。
在本发明一优选实施方案中，当如技术方案之一所述的表达盒、或如技术方案之二所述的核酸、或如技术方案之三所述的重组载体导入所述出发菌时，使所述表达盒整合至其基因组上的ldh基因位点。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之五为：一种制备L-赖氨酸的方法，所述方法包括在发酵培养基中发酵如技术方案之四所述的基因工程菌。
本发明所述发酵的条件可为本领域常规，例如，所述发酵培养基为含有不低于25g/L葡萄糖的培养基，和/或，所述发酵的条件为：温度为28-32℃，通气量为1.0-1.7vvm，pH为6.8-7.2，和/或，发酵时进行搅拌，搅拌的转速为400-800rpm。
在本发明一优选实施方案中，所述发酵培养基含有80-150g/L的葡萄糖，发酵温度为30℃，pH为7.0，通气量为1.4vvm，搅拌的转速为600rpm。
发明所述发酵培养基可为本领域常规，本发明所述发酵培养基优选含有葡萄糖的培养基例如秸秆水解液，所述秸秆水解液为农作物秸秆经酶解糖化后，秸秆中大分子碳水化合物如纤维素、半纤维素和木质素等被降解为小分子碳水化合物如葡萄糖形成的水解液。
按照本领域常规，一般来讲，可以在所述水解液中添加硫酸铵、甲硫氨酸和苏氨酸。在本发明一优选实施方案中，在所述水解液中添加15～25g/L硫酸铵和2～8g/L甲硫氨酸和2～8g/L苏氨酸。
进一步地，按照本领域常规，一般来讲，所述农作物秸秆在进行酶解糖化制备水解液前，可以进行预处理，例如包括筛分、除杂、酸预处理和/或脱毒处理。预处理可以提高农作物秸秆的糖化效率。其中的脱毒处理可以降低乙酸、糠醛、5-羟基苯甲醛、糠醛、羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、乙酰丙酸等毒性抑制物的含量。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之六为：如技术方案之三所述的基因工程菌的制备方法，包括如下步骤(不分前后顺序)：
(1)将如技术方案之一所述的表达盒或技术方案之二所述的核酸或技术方案之三所述的重组载体导入出发菌中；
(2)敲除ldh基因，得所述基因工程菌。
在本发明一优选实施方案中，先将如技术方案之三所述的表达盒或技术方案之二所述的核酸或技术方案之三所述的重组载体导入出发菌中，同时敲除ldh基因，得所述基因工程菌。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之七为：如技术方案之一所述的表达盒、如技术方案之二所述的核酸、如技术方案之三所述的重组载体或如技术方案之四所述的基因工程菌在制备L-赖氨酸中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供的增强生物素合成酶表达的方式，有效调控细胞代谢，提高葡萄糖利用效率，进而提高L-赖氨酸的产量。当使用秸秆水解液时，本发明的基因工程菌的L-赖氨酸产量比出发菌明显提升。本发明提供的基因工程菌可以有效利用秸秆等农业废料进行发酵，具备良好的应用前景。
生物材料保藏信息
本发明的谷氨酸棒状杆菌菌株CathS141，已于2021年11月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M20211495，保藏日期2021年11月29日。培养物名称为CathS141，分类名称为Corynebacterium glutamicum CathS141。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
一、本发明所使用的菌株
大肠杆菌E.coli DH5α用于表达质粒和敲除质粒的构建。
谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌CathS141是一株用于生产赖氨酸的菌株，本实验中CathS141主要作为出发菌株进行使用。
二、试剂与培养基
纤维素酶CTec 2.0用于水解木质纤维素中的纤维素和半纤维素，购自中国北京的诺维信(中国)公司。根据NREL LAP-006指南中的方法测得纤维素酶的滤纸酶活为203.2FPU/mL，纤维二糖酶活为4900.0CBU/mL，根据Bradford方法测得蛋白浓度为87.3mg/mL。限制性内切酶用于切割质粒或基因片段产生粘性末端，购自Thermo Scientific(Wilmington,DE,USA)。DNA聚合酶用于扩增基因片段，DNA连接酶用于连接酶切过的基因片段和质粒载体，这两种酶都是购自Takara(Otsu,Japan)。无缝克隆试剂盒用于连接含有同源片段的基因片段和质粒载体，购自汉恒生物科技公司(Nanjin g,China)。质粒抽提试剂盒，PCR产物纯化回收试剂盒和凝胶回收试剂盒都是购自上海捷瑞生物科技公司(Shanghai，China)。其他试剂从本地供应商处购买。
培养大肠杆菌使用的培养基是Luria-Bertani(LB)培养基，具体成分如下：10.0g/L氯化钠，10.0g/L蛋白胨和5.0g/L酵母提取物。
培养谷氨酸棒状杆菌所用的培养基具体成分如下：1)种子培养基：25g/L葡萄糖，1.5g/L磷酸二氢钾，2.5g/L尿素和0.6g/L硫酸镁，25g/L玉米浆。2)发酵培养基：1g/L磷酸二氢钾，3g/L尿素，0.6g/L硫酸镁，20g/L玉米浆，视情况添加葡萄糖作为碳源。
实施例1：出发菌谷氨酸棒杆菌的获得
收集新疆乌苏的土壤样品，每1g土壤样品添加至10mL无菌水中，剧烈混匀1min后将静置沉淀一段时间，再将原样品分别稀释成10-3、10-4、10-5涂布在含有100mg/L制霉菌素的LB琼脂平板上，并在30℃下培养。经多次划线分离培养，获得纯化单菌落。
通过分离纯化获得一株可以生产L-赖氨酸的菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行菌体特征、生理生化特性等进行测定。所述的菌株具有以下形态特征：菌落湿润，呈圆形，表面光滑，边缘整齐，颜色为浅黄色；用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取该菌株的DNA，以其DNA为模版，使用细菌通用引物27F和1492R，并使用16S rDNA进行PCR扩增，进行测序后获得菌株16S rDNA序列,将菌株的16S rDNA序列在GenBank数据库中比对，鉴定该菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
小麦秸秆经过酸预处理、脱毒和酶水解后得到小麦秸秆水解液，以上述分离纯化得到的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过使用紫外线、亚硝基胍、5-氟尿嘧啶、ARTP等多次单独诱变及复合诱变，获得能够耐受秸秆水解液中的毒性抑制物进行正常的生长和赖氨酸生产的稳定菌株。将该菌株命名为CathS141，现保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M 20211495，保藏日期2021年11月29日。
实施例2：Peftu_cgl0072表达盒的构建
构建生物素合成酶cgl0072基因的整合质粒，具体构建方法如下：以C.glutamicum的基因组为模板，利用Peftu-F(如SEQ ID NO:4所示)和Peftu-R(如SEQ ID NO:5所示)引物通过PCR的方法扩增得到Peftu启动子(如SEQ ID NO:3所示)；以C.glutamicum的基因组为模板，利用cgl0072-F(如SEQ ID NO:6所示)和cgl0072-R(如SEQ ID NO:7所示)引物通过PCR的方式扩增得到cgl0072片段(如SEQ ID NO:1所示)；以Peftu和cgl0072为模板，利用Peftu-F和cgl0072-R引物，通过重叠延伸PCR的方式得到Peftu_cgl0072融合片段(如SEQID NO:8所示)。
SEQ ID NO.1(cgl0072核苷酸序列)
Atgaccatccccggcaccatccttgacaccgcccgcacccaagttctggaacagggaattggccttaatcagcagcagttgatggaggttctcaccttgcctgaagagcaaatcccagacttgatggaattagcccaccaggttcggttgaagtggtgtggggaagaaatcgaggtcgagggcattatttccctcaaaactggcggttgccctgaagattgtcatttctgctcacagtctgggttgtttgaatcgccggtgcgttcggtgtggctggatattccgaatctggttgaagccgctaaacagaccgcaaaaactggcgctaccgaattctgtatcgtcgccgcagtcaaggggcctgatgagaggctcatgacccagctggaggaagcagtcctcgcgattcactctgaagttgaaattgaagtcgcagcatcgatcggaacgttaaataaggaacaggtggatcgcctcgctgctgccggcgtgcaccgctacaaccataatttggaaactgcgcgttcctatttccctgaagttgtcaccactcatacatgggaagagcgccgcgaaactttgcgcctggtggcagaagctggaatggaagtctgttccggcggaatcttaggaatgggcgaaactttagagcagcgcgccgagtttgccgtgcagctggcggagcttgatccgcacgaagtccccatgaacttccttgatcctcgcccgggcaccccatttgccgatagggaattgatggacagccgtgacgctctgcgctctattggtgcgttccgccttgcgatgcctcacaccatgcttcgttttgctggcggtcgcgagctgactttgggcgacaagggttccgagcaagccctcctgggaggcatcaatgcgatgatcgtcggaaactacctgactacgctcggccgcccaatggaagatgacctcgacatgatggatcgtctccagctgcccatcaaagtccttaataaggtcatctaa
SEQ ID NO.2(cgl0072氨基酸序列)
MTIPGTILDTARTQVLEQGIGLNQQQLMEVLTLPEEQIPDLMELAHQVRLKWCGEEIEVEGIISLKTGGCPEDCHFCSQSGLFESPVRSVWLDIPNLVEAAKQTAKTGATEFCIVAAVKGPDERLMTQLEEAVLAIHSEVEIEVAASIGTLNKEQVDRLAAAGVHRYNHNLETARSYFPEVVTTHTWEERRETLRLVAEAGMEVCSGGILGMGETLEQRAEFAVQLAELDPHEVPMNFLDPRPGTPFADRELMDSRDALRSIGAFRLAMPHTMLRFAGGRELTLGDKGSEQALLGGINAMIVGNYLTTLGRPMEDDLDMMDRLQLPIKVLNKVI
SEQ ID NO.3(Peftu)
cgaaaagcaatttgcttttcgacgccccaccccgcgcgttttagcgtgtcagtaggcgcgtagggtaagtggggtagcggcttgttagatatcttgaaatcggctttcaacagcattgatttcgatgtatttagctggccgttaccctgcgaatgtccacagggtagctggtagtttgaaaatcaacgccgttgcccttaggattcagtaactggcacattttgtaatgcgctagatctgtgtgctcagtcttccaggctgcttatcacagtgaaagcaaaaccaattcgtggctgcgaaagtcgtagccaccacgaagtccaggaggacataca
Peftu-F:gaaatcaggaagtgggatcgaaacgaaaagcaatttgcttttcgacg SEQ ID NO:4
Peftu-R:tgtatgtcctcctggacttcgtg SEQ ID NO:5
cgl0072-F:cacgaagtccaggaggacatacaatgaccatccccggcacca SEQ ID NO:6
cgl0072-R:gcgtcgccaactaggcgccaaagatttagatgaccttattaaggactttgatgg SEQID NO:7
SEQ ID NO.8(Peftu_cgl0072)
cgaaaagcaatttgcttttcgacgccccaccccgcgcgttttagcgtgtcagtaggcgcgtagggtaagtggggtagcggcttgttagatatcttgaaatcggctttcaacagcattgatttcgatgtatttagctggccgttaccctgcgaatgtccacagggtagctggtagtttgaaaatcaacgccgttgcccttaggattcagtaactggcacattttgtaatgcgctagatctgtgtgctcagtcttccaggctgcttatcacagtgaaagcaaaaccaattcgtggctgcgaaagtcgtagccaccacgaagtccaggaggacatacaatgaccatccccggcaccatccttgacaccgcccgcacccaagttctggaacagggaattggccttaatcagcagcagttgatggaggttctcaccttgcctgaagagcaaatcccagacttgatggaattagcccaccaggttcggttgaagtggtgtggggaagaaatcgaggtcgagggcattatttccctcaaaactggcggttgccctgaagattgtcatttctgctcacagtctgggttgtttgaatcgccggtgcgttcggtgtggctggatattccgaatctggttgaagccgctaaacagaccgcaaaaactggcgctaccgaattctgtatcgtcgccgcagtcaaggggcctgatgagaggctcatgacccagctggaggaagcagtcctcgcgattcactctgaagttgaaattgaagtcgcagcatcgatcggaacgttaaataaggaacaggtggatcgcctcgctgctgccggcgtgcaccgctacaaccataatttggaaactgcgcgttcctatttccctgaagttgtcaccactcatacatgggaagagcgccgcgaaactttgcgcctggtggcagaagctggaatggaagtctgttccggcggaatcttaggaatgggcgaaactttagagcagcgcgccgagtttgccgtgcagctggcggagcttgatccgcacgaagtccccatgaacttccttgatcctcgcccgggcaccccatttgccgatagggaattgatggacagccgtgacgctctgcgctctattggtgcgttccgccttgcgatgcctcacaccatgcttcgttttgctggcggtcgcgagctgactttgggcgacaagggttccgagcaagccctcctgggaggcatcaatgcgatgatcgtcggaaactacctgactacgctcggccgcccaatggaagatgacctcgacatgatggatcgtctccagctgcccatcaaagtccttaataaggtcatctaa
实施例3：将Peftu_cgl0072表达盒整合在基因组
以C.glutamicum的基因组为模板，利用ldh-up-F(如SEQ ID NO:9所示)和ldh-up-R(如SEQ ID NO:10所示)引物通过PCR的方法扩增得到ldh-up片段(如SEQ ID NO:11所示)；以C.glutamicum的基因组为模板，利用ldh-down-F(如SEQ ID NO:12所示)和ldh-down-R(如SEQ ID NO:13所示)引物通过PCR的方法扩增得到ldh-down片段(如SEQ ID NO:14所示)；以ldh-up片段，Peftu_cgl0072和ldh-down片段为模板，利用ldh-up-F和ldh-down-R引物，通过重叠延伸PCR的方式得到Δldh::cgl0072融合片段，并用EcoRI和HindIII内切酶对其进行处理，再利用T4连接酶将其插入到pK18mob质粒(购买途径见http://www.biovector.net/product/1089.html)中，得到pK18-Δldh::cgl0072质粒。期间，可利用含有卡那霉素抗性的种子培养平板筛选连接成功的质粒。
ldh-up-F:tcccccgggggaacaccatgcgattaaggtgc SEQ ID NO:9
ldh-up-R:caaattgcttttcgtttcgatcccacttcctgatttccctaac SEQ ID NO:10
SEQ ID NO.11(ldh-up)
ggaacaccatgcgattaaggtgcgctgcttgaattgcagaattatgcaagatgcgccgcaacaaaacgcgatcggccaaggtcaaagtggtcaatgtaatgaccgaaaccgctgcgatgaaactaatccacggcggtaaaaacctctcaattaggagcttgacctcattaatgctgtgctgggttaattcgccggtgatcagcagcgcgccgtaccccaaggtgccgacactaatgcccgcgatcgtctccttcggtccaaaattcttctgcccaatcagccggatttgggtgcgatgcctgatcaatcccacaaccgtggtggtcaacgtgatggcaccagttgcgatgtgggtggcgttgtaaattttcctggatacccgccggttggttctggggaggatcgagtggattcccgtcgctgacgcatgccccaccgcttgtaaaacagccaggttagcagccgtaacccaccacggtttcggcaacaatgacggcgagagagcccaccacattgcgatttccgctccgataaagccagcgcccatatttgcagggaggattcgcctgcggtttggcgacattcggatccccggaaccagctctgcaatcacctgcgcgccgagggaagcgaggtgggtggcaggttttagtgcgggtttaagcgttgccaggcgagtggtgagcagagacgctagtctggggagcgaaaccatattgagtcatcttggcagagcatgcacaattctgcagggcatagattggttttgctcgatttacaatgtgattttttcaacaaaaataacacatggtctgaccacattttcggacataatcgggcataattaaaggtgtaacaaaggaatccgggcacaagctcttgctgattttctgagctgctttgtgggttgtccggttagggaaatcaggaagtgggatcgaaa
ldh-down-F:caaggactccattaacggttaaatctttggcgcctagttggc SEQ ID NO:12
ldh-down-R:gtaagcttgtctgggacgttgatgacgctg SEQ ID NO:13
SEQ ID NO.14(ldh-down)
atctttggcgcctagttggcgacgcaagtgtttcattggaacacttgcgctgccaactttttggtttacgggcaaaatgaaactgttggatggaatttaaagtgtttgtagcttaaggagctcaaatgaatgagtttgaccaggacattctccaggagatcaagactgaactcgacgagttaattctagaacttgatgaggtgacacaaactcacagcgaggccatcgggcaggtctccccaacccattacgttggtgcccgcaacctcatgcattacgcgcatcttcgcaccaaagacctccgtggcctgcagcaacgcctctcctctgtgggagctacccgcttgactaccaccgaaccagcagtgcaggcccgcctcaaggccgcccgcaatgttatcggagctttcgcaggtgaaggcccactttatccaccctcagatgtcgtcgatgccttcgaagatgccgatgagattctcgacgagcacgccgaaattctccttggcgaacccctaccggatactccatcctgcatcatggtcaccctgcccaccgaagccgccaccgacattgaacttgtccgtggcttcgccaaaagcggcatgaatctagctcgcatcaactgtgcacacgacgatgaaaccgtctggaagcagatgatcgacaacgtccacaccgttgcagaagaagttggccgggaaatccgcgtcagcatggaccttgccggaccaaaagtacgcaccggcgaaatcgccccaggcgcagaagtaggtcgcgcacgagtaacccgcgacgaaaccggaaaagtactgacgcccgcaaaactgtggatcaccgcccacggctccgaaccagtcccagcccccgaaagcctgcccggtcgccccgctctgccgattgaagtcaccccagaatggttcgacaaactagaaatcggcagcgtcatcaacgtcccagac
接着通过电转的方式将整合质粒pK18-Δldh::cgl0072转入C.glutamicum中，进而通过PCR验证的方式筛选出发生正确同源重组的菌株，得到重组谷氨酸棒状杆菌，命名为cg0072。
实施例4：利用基因工程菌株发酵生产L-赖氨酸
将基因工程菌株和谷氨酸棒杆菌亲本菌株CathS141接种到种子培养基中进行两轮活化，然后转接到发酵培养基中。发酵培养基包括1g/L磷酸二氢钾，3g/L尿素，0.6g/L硫酸镁，20g/L玉米浆，并添加80g/L葡萄糖作为碳源。发酵在250mL的摇瓶中进行，培养条件为30℃，200rpm。经过核磁检测表明，基因工程菌株cg0072产生了22.70g/L的L-赖氨酸，其比对照菌株的L-赖氨酸产量提高了14.08％(P<0.05)。表明增强生物素合成酶后提高了谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸转化效率。
实施例5：基因cgl0072突变体基因工程菌株库的构建
参考专利CN110343675A方法步骤对cgl0072基因执行易错PCR操作。然后参考实施例2构建cgl0072突变体质粒库。参考实施例3构建cgl0072基因工程突变体库。参考实施例4对突变体库进行评价，获得一株赖氨酸产量达23.96g/L的突变体菌株，命名为cg0072-m86。
以cg0072-m86突变体菌株基因为模板，通过引物seq0072-F(如SEQ ID NO:15所示)和seq0072-R(如SEQ ID NO:16所示)进行PCR扩增，然后将扩增片段进行测序分析。分析发现cg0072-m86突变体中发生存在2个氨基酸位点突变V115G和G288A，因此推测该两个位点突变是cg0072-m86产量进一步提升的重要因素。
seq0072-F:atgaccatccccggcaccatc SEQ ID NO:15
seq0072-R:ttagatgaccttattaaggactttgatgg SEQ ID NO:16
SEQ ID NO.17(cgl0072突变体核苷酸序列)
atgaccatccccggcaccatccttgacaccgcccgcacccaagttctggaacagggaattggccttaatcagcagcagttgatggaggttctcaccttgcctgaagagcaaatcccagacttgatggaattagcccaccaggttcggttgaagtggtgtggggaagaaatcgaggtcgagggcattatttccctcaaaactggcggttgccctgaagattgtcatttctgctcacagtctgggttgtttgaatcgccggtgcgttcggtgtggctggatattccgaatctggttgaagccgctaaacagaccgcaaaaactggcgctaccgaattctgtatcggcgccgcagtcaaggggcctgatgagaggctcatgacccagctggaggaagcagtcctcgcgattcactctgaagttgaaattgaagtcgcagcatcgatcggaacgttaaataaggaacaggtggatcgcctcgctgctgccggcgtgcaccgctacaaccataatttggaaactgcgcgttcctatttccctgaagttgtcaccactcatacatgggaagagcgccgcgaaactttgcgcctggtggcagaagctggaatggaagtctgttccggcggaatcttaggaatgggcgaaactttagagcagcgcgccgagtttgccgtgcagctggcggagcttgatccgcacgaagtccccatgaacttccttgatcctcgcccgggcaccccatttgccgatagggaattgatggacagccgtgacgctctgcgctctattggtgcgttccgccttgcgatgcctcacaccatgcttcgttttgctggcggtcgcgagctgactttgggcgacaaggcttccgagcaagccctcctgggaggcatcaatgcgatgatcgtcggaaactacctgactacgctcggccgcccaatggaagatgacctcgacatgatggatcgtctccagctgcccatcaaagtccttaataaggtcatctaa
实施例6：基因工程菌cg0072-m86在木质纤维素水解液中的发酵
将小麦秸秆经过粉碎后，再通过直径为10毫米的筛网进行筛分，筛分后的秸秆再经过水洗除去泥土、石块和金属等杂质，在105℃烘箱中烘干至恒重后保存在封闭的塑料袋中备用。再通过酸预处理、生物脱毒和酶解糖化后，分离得到小麦秸秆水解液，其含有95.4g/L葡萄糖。在水解液中添加20g/L硫酸铵和5g/L甲硫氨酸和苏氨酸，将改造得到的基因工程菌株cg0072-m86和出发菌株CathS141培养在小麦秸秆水解液中进行发酵对比，发酵温度为30℃，pH用氨水控制在7.0，通气量为1.4vvm，转速为600rpm，以葡萄糖耗完为发酵终止时间。
结果表明以小麦秸秆水解液为培养基时，两株菌在赖氨酸产量上出现显著差异，基因工程菌株最终赖氨酸产量为比对照菌株提高了15.54％。同时值得关注的是，基因工程菌株提前9h结束发酵，因此基于发酵时间上的差异，基因工程菌株cg0072-m86的生产强度(单位时间的赖氨酸产量)比对照菌株提高了30.72％。当使用谷氨酸棒状杆菌B253为出发菌，按照和菌株cg0072-m86相同的改造方法改造得到菌株命名为B253-m86，验证其在上述相同的发酵条件下发酵效果，发现B253-m86最终赖氨酸产量比对照菌株提高了15.51％。同时基因工程菌株B253-m86比菌株B253也提前9h结束发酵。据此可知，本发明得到的重组菌株在真实物料水解液中具有高效的赖氨酸生产能力，因而具备良好的应用前景。
以上具体描述了本发明技术方案的操作实例，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件的等同替换，均在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海凯赛生物技术股份有限公司
CIBT美国公司
<120> 用于发酵生产L-赖氨酸的表达盒、菌株及其应用
<130> P21018730C
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1005
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
atgaccatcc ccggcaccat ccttgacacc gcccgcaccc aagttctgga acagggaatt 60
ggccttaatc agcagcagtt gatggaggtt ctcaccttgc ctgaagagca aatcccagac 120
ttgatggaat tagcccacca ggttcggttg aagtggtgtg gggaagaaat cgaggtcgag 180
ggcattattt ccctcaaaac tggcggttgc cctgaagatt gtcatttctg ctcacagtct 240
gggttgtttg aatcgccggt gcgttcggtg tggctggata ttccgaatct ggttgaagcc 300
gctaaacaga ccgcaaaaac tggcgctacc gaattctgta tcgtcgccgc agtcaagggg 360
cctgatgaga ggctcatgac ccagctggag gaagcagtcc tcgcgattca ctctgaagtt 420
gaaattgaag tcgcagcatc gatcggaacg ttaaataagg aacaggtgga tcgcctcgct 480
gctgccggcg tgcaccgcta caaccataat ttggaaactg cgcgttccta tttccctgaa 540
gttgtcacca ctcatacatg ggaagagcgc cgcgaaactt tgcgcctggt ggcagaagct 600
ggaatggaag tctgttccgg cggaatctta ggaatgggcg aaactttaga gcagcgcgcc 660
gagtttgccg tgcagctggc ggagcttgat ccgcacgaag tccccatgaa cttccttgat 720
cctcgcccgg gcaccccatt tgccgatagg gaattgatgg acagccgtga cgctctgcgc 780
tctattggtg cgttccgcct tgcgatgcct cacaccatgc ttcgttttgc tggcggtcgc 840
gagctgactt tgggcgacaa gggttccgag caagccctcc tgggaggcat caatgcgatg 900
atcgtcggaa actacctgac tacgctcggc cgcccaatgg aagatgacct cgacatgatg 960
gatcgtctcc agctgcccat caaagtcctt aataaggtca tctaa 1005
<210> 2
<211> 334
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
Met Thr Ile Pro Gly Thr Ile Leu Asp Thr Ala Arg Thr Gln Val Leu
1 5 10 15
Glu Gln Gly Ile Gly Leu Asn Gln Gln Gln Leu Met Glu Val Leu Thr
20 25 30
Leu Pro Glu Glu Gln Ile Pro Asp Leu Met Glu Leu Ala His Gln Val
35 40 45
Arg Leu Lys Trp Cys Gly Glu Glu Ile Glu Val Glu Gly Ile Ile Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Gly Gly Cys Pro Glu Asp Cys His Phe Cys Ser Gln Ser
65 70 75 80
Gly Leu Phe Glu Ser Pro Val Arg Ser Val Trp Leu Asp Ile Pro Asn
85 90 95
Leu Val Glu Ala Ala Lys Gln Thr Ala Lys Thr Gly Ala Thr Glu Phe
100 105 110
Cys Ile Val Ala Ala Val Lys Gly Pro Asp Glu Arg Leu Met Thr Gln
115 120 125
Leu Glu Glu Ala Val Leu Ala Ile His Ser Glu Val Glu Ile Glu Val
130 135 140
Ala Ala Ser Ile Gly Thr Leu Asn Lys Glu Gln Val Asp Arg Leu Ala
145 150 155 160
Ala Ala Gly Val His Arg Tyr Asn His Asn Leu Glu Thr Ala Arg Ser
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Val Val Thr Thr His Thr Trp Glu Glu Arg Arg Glu
180 185 190
Thr Leu Arg Leu Val Ala Glu Ala Gly Met Glu Val Cys Ser Gly Gly
195 200 205
Ile Leu Gly Met Gly Glu Thr Leu Glu Gln Arg Ala Glu Phe Ala Val
210 215 220
Gln Leu Ala Glu Leu Asp Pro His Glu Val Pro Met Asn Phe Leu Asp
225 230 235 240
Pro Arg Pro Gly Thr Pro Phe Ala Asp Arg Glu Leu Met Asp Ser Arg
245 250 255
Asp Ala Leu Arg Ser Ile Gly Ala Phe Arg Leu Ala Met Pro His Thr
260 265 270
Met Leu Arg Phe Ala Gly Gly Arg Glu Leu Thr Leu Gly Asp Lys Gly
275 280 285
Ser Glu Gln Ala Leu Leu Gly Gly Ile Asn Ala Met Ile Val Gly Asn
290 295 300
Tyr Leu Thr Thr Leu Gly Arg Pro Met Glu Asp Asp Leu Asp Met Met
305 310 315 320
Asp Arg Leu Gln Leu Pro Ile Lys Val Leu Asn Lys Val Ile
325 330
<210> 3
<211> 335
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
cgaaaagcaa tttgcttttc gacgccccac cccgcgcgtt ttagcgtgtc agtaggcgcg 60
tagggtaagt ggggtagcgg cttgttagat atcttgaaat cggctttcaa cagcattgat 120
ttcgatgtat ttagctggcc gttaccctgc gaatgtccac agggtagctg gtagtttgaa 180
aatcaacgcc gttgccctta ggattcagta actggcacat tttgtaatgc gctagatctg 240
tgtgctcagt cttccaggct gcttatcaca gtgaaagcaa aaccaattcg tggctgcgaa 300
agtcgtagcc accacgaagt ccaggaggac ataca 335
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peftu-F
<400> 4
gaaatcagga agtgggatcg aaacgaaaag caatttgctt ttcgacg 47
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peftu-R
<400> 5
tgtatgtcct cctggacttc gtg 23
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cgl0072-F
<400> 6
cacgaagtcc aggaggacat acaatgacca tccccggcac ca 42
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cgl0072-R
<400> 7
gcgtcgccaa ctaggcgcca aagatttaga tgaccttatt aaggactttg atgg 54
<210> 8
<211> 1340
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peftu_cgl0072
<400> 8
cgaaaagcaa tttgcttttc gacgccccac cccgcgcgtt ttagcgtgtc agtaggcgcg 60
tagggtaagt ggggtagcgg cttgttagat atcttgaaat cggctttcaa cagcattgat 120
ttcgatgtat ttagctggcc gttaccctgc gaatgtccac agggtagctg gtagtttgaa 180
aatcaacgcc gttgccctta ggattcagta actggcacat tttgtaatgc gctagatctg 240
tgtgctcagt cttccaggct gcttatcaca gtgaaagcaa aaccaattcg tggctgcgaa 300
agtcgtagcc accacgaagt ccaggaggac atacaatgac catccccggc accatccttg 360
acaccgcccg cacccaagtt ctggaacagg gaattggcct taatcagcag cagttgatgg 420
aggttctcac cttgcctgaa gagcaaatcc cagacttgat ggaattagcc caccaggttc 480
ggttgaagtg gtgtggggaa gaaatcgagg tcgagggcat tatttccctc aaaactggcg 540
gttgccctga agattgtcat ttctgctcac agtctgggtt gtttgaatcg ccggtgcgtt 600
cggtgtggct ggatattccg aatctggttg aagccgctaa acagaccgca aaaactggcg 660
ctaccgaatt ctgtatcgtc gccgcagtca aggggcctga tgagaggctc atgacccagc 720
tggaggaagc agtcctcgcg attcactctg aagttgaaat tgaagtcgca gcatcgatcg 780
gaacgttaaa taaggaacag gtggatcgcc tcgctgctgc cggcgtgcac cgctacaacc 840
ataatttgga aactgcgcgt tcctatttcc ctgaagttgt caccactcat acatgggaag 900
agcgccgcga aactttgcgc ctggtggcag aagctggaat ggaagtctgt tccggcggaa 960
tcttaggaat gggcgaaact ttagagcagc gcgccgagtt tgccgtgcag ctggcggagc 1020
ttgatccgca cgaagtcccc atgaacttcc ttgatcctcg cccgggcacc ccatttgccg 1080
atagggaatt gatggacagc cgtgacgctc tgcgctctat tggtgcgttc cgccttgcga 1140
tgcctcacac catgcttcgt tttgctggcg gtcgcgagct gactttgggc gacaagggtt 1200
ccgagcaagc cctcctggga ggcatcaatg cgatgatcgt cggaaactac ctgactacgc 1260
tcggccgccc aatggaagat gacctcgaca tgatggatcg tctccagctg cccatcaaag 1320
tccttaataa ggtcatctaa 1340
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldh-up-F
<400> 9
tcccccgggg gaacaccatg cgattaaggt gc 32
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldh-up-R
<400> 10
caaattgctt ttcgtttcga tcccacttcc tgatttccct aac 43
<210> 11
<211> 943
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldh-up
<400> 11
ggaacaccat gcgattaagg tgcgctgctt gaattgcaga attatgcaag atgcgccgca 60
acaaaacgcg atcggccaag gtcaaagtgg tcaatgtaat gaccgaaacc gctgcgatga 120
aactaatcca cggcggtaaa aacctctcaa ttaggagctt gacctcatta atgctgtgct 180
gggttaattc gccggtgatc agcagcgcgc cgtaccccaa ggtgccgaca ctaatgcccg 240
cgatcgtctc cttcggtcca aaattcttct gcccaatcag ccggatttgg gtgcgatgcc 300
tgatcaatcc cacaaccgtg gtggtcaacg tgatggcacc agttgcgatg tgggtggcgt 360
tgtaaatttt cctggatacc cgccggttgg ttctggggag gatcgagtgg attcccgtcg 420
ctgacgcatg ccccaccgct tgtaaaacag ccaggttagc agccgtaacc caccacggtt 480
tcggcaacaa tgacggcgag agagcccacc acattgcgat ttccgctccg ataaagccag 540
cgcccatatt tgcagggagg attcgcctgc ggtttggcga cattcggatc cccggaacca 600
gctctgcaat cacctgcgcg ccgagggaag cgaggtgggt ggcaggtttt agtgcgggtt 660
taagcgttgc caggcgagtg gtgagcagag acgctagtct ggggagcgaa accatattga 720
gtcatcttgg cagagcatgc acaattctgc agggcataga ttggttttgc tcgatttaca 780
atgtgatttt ttcaacaaaa ataacacatg gtctgaccac attttcggac ataatcgggc 840
ataattaaag gtgtaacaaa ggaatccggg cacaagctct tgctgatttt ctgagctgct 900
ttgtgggttg tccggttagg gaaatcagga agtgggatcg aaa 943
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldh-down-F
<400> 12
caaggactcc attaacggtt aaatctttgg cgcctagttg gc 42
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldh-down-R
<400> 13
gtaagcttgt ctgggacgtt gatgacgctg 30
<210> 14
<211> 959
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldh-down
<400> 14
atctttggcg cctagttggc gacgcaagtg tttcattgga acacttgcgc tgccaacttt 60
ttggtttacg ggcaaaatga aactgttgga tggaatttaa agtgtttgta gcttaaggag 120
ctcaaatgaa tgagtttgac caggacattc tccaggagat caagactgaa ctcgacgagt 180
taattctaga acttgatgag gtgacacaaa ctcacagcga ggccatcggg caggtctccc 240
caacccatta cgttggtgcc cgcaacctca tgcattacgc gcatcttcgc accaaagacc 300
tccgtggcct gcagcaacgc ctctcctctg tgggagctac ccgcttgact accaccgaac 360
cagcagtgca ggcccgcctc aaggccgccc gcaatgttat cggagctttc gcaggtgaag 420
gcccacttta tccaccctca gatgtcgtcg atgccttcga agatgccgat gagattctcg 480
acgagcacgc cgaaattctc cttggcgaac ccctaccgga tactccatcc tgcatcatgg 540
tcaccctgcc caccgaagcc gccaccgaca ttgaacttgt ccgtggcttc gccaaaagcg 600
gcatgaatct agctcgcatc aactgtgcac acgacgatga aaccgtctgg aagcagatga 660
tcgacaacgt ccacaccgtt gcagaagaag ttggccggga aatccgcgtc agcatggacc 720
ttgccggacc aaaagtacgc accggcgaaa tcgccccagg cgcagaagta ggtcgcgcac 780
gagtaacccg cgacgaaacc ggaaaagtac tgacgcccgc aaaactgtgg atcaccgccc 840
acggctccga accagtccca gcccccgaaa gcctgcccgg tcgccccgct ctgccgattg 900
aagtcacccc agaatggttc gacaaactag aaatcggcag cgtcatcaac gtcccagac 959
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> seq0072-F
<400> 15
atgaccatcc ccggcaccat c 21
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> seq0072-R
<400> 16
ttagatgacc ttattaagga ctttgatgg 29
<210> 17
<211> 1005
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cgl0072突变体核苷酸序列
<400> 17
atgaccatcc ccggcaccat ccttgacacc gcccgcaccc aagttctgga acagggaatt 60
ggccttaatc agcagcagtt gatggaggtt ctcaccttgc ctgaagagca aatcccagac 120
ttgatggaat tagcccacca ggttcggttg aagtggtgtg gggaagaaat cgaggtcgag 180
ggcattattt ccctcaaaac tggcggttgc cctgaagatt gtcatttctg ctcacagtct 240
gggttgtttg aatcgccggt gcgttcggtg tggctggata ttccgaatct ggttgaagcc 300
gctaaacaga ccgcaaaaac tggcgctacc gaattctgta tcggcgccgc agtcaagggg 360
cctgatgaga ggctcatgac ccagctggag gaagcagtcc tcgcgattca ctctgaagtt 420
gaaattgaag tcgcagcatc gatcggaacg ttaaataagg aacaggtgga tcgcctcgct 480
gctgccggcg tgcaccgcta caaccataat ttggaaactg cgcgttccta tttccctgaa 540
gttgtcacca ctcatacatg ggaagagcgc cgcgaaactt tgcgcctggt ggcagaagct 600
ggaatggaag tctgttccgg cggaatctta ggaatgggcg aaactttaga gcagcgcgcc 660
gagtttgccg tgcagctggc ggagcttgat ccgcacgaag tccccatgaa cttccttgat 720
cctcgcccgg gcaccccatt tgccgatagg gaattgatgg acagccgtga cgctctgcgc 780
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gagctgactt tgggcgacaa ggcttccgag caagccctcc tgggaggcat caatgcgatg 900
atcgtcggaa actacctgac tacgctcggc cgcccaatgg aagatgacct cgacatgatg 960
gatcgtctcc agctgcccat caaagtcctt aataaggtca tctaa 1005

Claims (12)

1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含启动子和谷氨酸棒状杆菌的生物素合成酶基因。
2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述生物素合成酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，或与SEQ ID NO:2相比在第115位和/或第288位氨基酸存在差异；
优选地，与SEQ ID NO:2相比存在V115G和/或G288A的氨基酸差异。
3.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，编码所述生物素合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:17所示；和/或，所述启动子为Peftu，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸包含如权利要求1～3任一项所述的表达盒。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求1～3任一项所述的表达盒，或包括如权利要求4所述的核酸；
优选地，所述重组表达载体的骨架质粒为pK18mob。
6.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中转入了如权利要求1～3任一项所述的表达盒，或如权利要求4所述的核酸，或如权利要求5所述的重组表达载体；
优选地，所述基因工程菌的出发菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，例如，所述出发菌为谷氨酸棒状杆菌B253或谷氨酸棒状杆菌CathS141。
7.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，当如权利要求1～3任一项所述的表达盒，或如权利要求4所述的核酸，或如权利要求5所述的重组表达载体被转入所述出发菌后，通过同源重组方式整合在所述基因工程菌的基因组上，或以非整合形式存在于所述基因工程菌中；
优选地，所述表达盒整合在所述基因工程菌的基因组上。
8.如权利要求6或7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌不表达乳酸脱氢酶，例如其基因ldh被敲除；
优选地，将如权利要求1～3任一项所述的表达盒，或如权利要求4所述的核酸，或如权利要求5所述的重组载体转入所述出发菌，使所述表达盒整合至其基因组上的ldh基因位点，所述基因ldh的locus_tag为SB89_13725。
9.一种制备L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括在发酵培养基中发酵如权利要求6～8任一项所述的基因工程菌；
所述发酵培养基为含有不低于25g/L葡萄糖的培养基；和/或，所述发酵的条件为：温度28-32℃，通气量为1.0-1.7vvm，pH为6.8-7.2，和/或，发酵时进行搅拌，搅拌的转速为400-800rpm；
优选地，所述发酵培养基含有80-150g/L的葡萄糖，发酵温度为30℃，pH为7.0，通气量为1.4vvm，搅拌的转速为600rpm。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为木质纤维素水解液，例如秸秆水解液，所述秸秆水解液为农作物秸秆经酶解糖化后形成的水解液；
优选地，在所述水解液中添加硫酸铵、甲硫氨酸和苏氨酸，例如，在所述水解液中添加15～25g/L硫酸铵和2～8g/L甲硫氨酸和2～8g/L苏氨酸；可选地，所述农作物秸秆在进行酶解糖化制备水解液前，进行预处理，所述预处理包括筛分、除杂、酸预处理和/或脱毒处理。
11.一种基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，所述步骤不分前后顺序：
1)将如权利要求1～3任一项所述的表达盒，或如权利要求4所述的核酸，或如权利要求5所述的重组表达载体导入出发菌中；
2)敲除ldh基因，得所述基因工程菌；
优选地，所述制备方法中，将如权利要求1～3任一项所述的表达盒，或如权利要求4所述的核酸，或如权利要求5所述的重组表达载体导入出发菌中，同时敲除ldh基因，得所述基因工程菌。
12.如权利要求1～3任一项所述的表达盒、如权利要求4所述的核酸、如权利要求5所述的重组表达载体、如权利要求6～8任一项所述的基因工程菌在制备L-赖氨酸中的应用。
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