KR20110020245A

KR20110020245A - 변이체 미생물 프로테아제를 포함하는 조성물 및 방법

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Publication number: KR20110020245A
Application number: KR1020107027454A
Authority: KR
Inventors: 루이스 지 카스카오-페레이라; 데이비드 에이 에스텔; 주니어 제임스 티 캘리스; 프리츠 괴데게부어
Original assignee: 다니스코 유에스 인크.
Priority date: 2008-06-06
Filing date: 2009-06-03
Publication date: 2011-03-02
Also published as: WO2009149145A2; MX350188B; CA2726450A1; EP2647701A2; US20150247140A1; CN104694519B; CN103382421A; MX2010013100A; KR20110015006A; EP2647702A2; BRPI0915681A2; US20110256609A1; US20180051269A1; EP2297316A2; CN102112607A; CN102057043B; EP3173479A1; WO2009149200A3; CA2726451A1; US20150064767A1

Abstract

본 발명은 단백질 조작 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 단백질의 2 개 이상의 특성을 최적화시키는 라이브러리를 디자인하기 위한 부위 평가 라이브러리의 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 다양한 용도에 적합한 변이체 서브틸리신을 제공한다.

Description

변이체 미생물 프로테아제를 포함하는 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING VARIANT MICROBIAL PROTEASES}

본 발명은 단백질 조작 방법 및 변이체 프로테아제를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 부위 평가 라이브러리의 사용 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 다양한 용도에 적합한 서브틸리신 변이체를 제공한다.

세린 프로테아제는 넓은 범위의 특이성 및 생물학적 기능을 갖는 다양한 계열의 효소를 포함하는 카르보닐 히드롤라아제의 하위그룹이다. 서브틸리신이 세정 및 사료 적용에서의 유용성이 크기 때문에 이에 대해 많은 연구가 수행되어 왔다. 부가적인 연구는 다양한 적용에서 이들 효소의 기능에 악영향을 미칠 수 있는 불리한 환경 조건 (예를 들어, 산화제, 킬레이트제, 극한 온도 및/또는 pH 에 대한 노출) 에 초점을 두고 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 열악한 조건에 대항할 수 있고, 현행 당업계에 공지된 것보다 개선된 활성을 보유하거나 갖는 효소계에 대한 필요가 남아있다.

다양한 단백질 조작 방법은 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 단백질은 원하는 단백질 특성을 수득하기 위해 개질된다. 대부분의 방법에서, 단백질을 코딩하는 클로닝된 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개질되고 개질된 유전자가 발현되어 돌연변이체를 생성하고, 이것을 관심의 활성에 대해 스크리닝한다. 종종, 돌연변이체 특성은 야생형 단백질의 특성과 비교된다.

역사적으로, 단백질 디자인 과정은 모든 단백질 공간에서 원하는 적용에 최적 서열을 가진 것을 찾는 문제와 동등한 것으로 접근된다. 이 문제는 매우 어려워서 "NP 어려움" 이다. 복잡성 이론에서, 분류 P 로 정의되는 문제들은, 그 해법에 용이하고 효율적인, 다항-시간 알고리즘이 존재하는 것으로 고려된다. NP-어려움 문제는 효율적인 다항-시간 알고리즘이 현재 알려지지 않은 문제이고, 임의의 NP-어려움 문제가 해결된다면, 모든 NP-어려움 문제가 해결될 수 있는 문제이다 (예를 들어, Pierce and Winfree, Protein Engineer., 15:779-782 [2002] 참조). 라이브러리의 설립 및 스크리닝을 위한 현행의 전략은 일반적으로, 단백질 서열 다양성을 전체 서열에 걸쳐 랜덤하게 또는 단백질 내 정의된 위치에서 통제된 랜덤 방식으로 발생시키는 것을 포함한다. 이러한 라이브러리는 일반적으로 관심의 1 차 특성에 있어 "음성" 인 다수의 일원을 가지며, 비교적 적은 수의 양성 돌연변이를 찾기 위해 많은 수의 스크리닝을 필요로 한다. 일반적으로, 음성 돌연변이는 무시되고, 서열 정보는 오직 양성 일원에 대해서만 수득된다. 포화 돌연변이생성 (Estell et al., in World Biotech Report 1984, vol. 2: USA, Online Publications, London [1984], 페이지 181-187; 및 Wells et al., Gene 34:315-323 [1985]) 은 단백질 내에서 여러 특성을 최적화시키는 돌연변이를 위해 단백질 공간을 조사하는데 사용될 수 있는 하나의 기술이다.

여러 그룹이 포화 돌연변이생성에 의해 변화되는 부위를 확인하기 위한 전략을 개발했으나 (Reetz et al., Agnew. Chem. Int. Edn., 44:4192-4196 [2005]; Kato et al., J. MoI. Biol., 351 :683-692 [2005]; 및 Sandberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:8367-8371 [1993]), 부위 확인을 위한 일반적인 시스템을 제안하지는 못했다. 또한, 대부분의 단백질 조작 방법이 매우 많은 수의 아미노산 돌연변이 옵션을 생성하기 때문에, 원하는 단백질 특성을 생성하기 위해서는 다수의 변이체의 스크리닝이 일반적으로 필요하다. 일반적으로, 스크리닝은 유리한 변이체를 생성하기 위해 계속해서 반복된다. 그러므로, 대부분의 방법은 고되고 시간 소모적이다. 그러므로 효율적이고 원하는 결과를 달성하기 위한 단백질 조작 방법에 대해 당업계에서의 지속적인 요구가 있다.

본 발명은 단백질 조작 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 부위 평가 라이브러리의 사용 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 다수의 원하는 특성에 최적이 될 라이브러리를 합리적이고 효율적으로 디자인하기 위해서, 이러한 특성에 대해 수득되는 정보를 사용하기 위한 수단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 2 개 이상의 원하는 특성에 대해 향상된 라이브러리를 디자인하기 위한 수단을 제공한다.

본 발명은 단백질의 원하는 특성 개선과 관련이 있는 단백질의 아미노산 서열 내 위치를 확인하기 위한 수단을 제공한다. 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 이러한 원하는 특성 뿐 아니라 개선된 특성을 가진 단백질을 제조하기 위해서 어떤 돌연변이가 바람직한 지를 결정하기 위한 수단을 제공한다. 일부 부가적인 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 야생형 단백질보다 양호한 특정 % (예를 들어, 하나의 특성에 대해 야생형보다 110% 양호한) 의 개선을 갖는 아미노산 위치 및 돌연변이를 확인하기 위한 수단을 제공한다. 또다른 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 매우 개선된 특성 및 야생형 단백질보다 유의하게 열악하지 않은 하나 이상의 부가적인 특성 (예를 들어, 하나의 특성에 대해 야생형보다 110% 양호한, 그러나 또다른 특성에 대해 야생형보다 90% 열악하지 않은) 을 제공하는 돌연변이를 확인하기 위한 수단을 제공한다. 또다른 추가의 바람직한 구현예에서, 라이브러리는 상기 정보에 근거하여 구축된다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 확인된 돌연변이 모두를 사용하여 구축되는 반면, 일부 다른 구현예에서, 라이브러리는 확인된 돌연변이의 서브세트를 사용하여 구축된다. 또한, 라이브러리가 임의의 특정 수 및/또는 돌연변이 유형에 제약되는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 단백질 조작 방법을 제공한다: 단백질 변이체의 라이브러리를 제공하는 단계; 단백질 변이체의 라이브러리를 관심의 시험에서 하나 이상의 관심의 특성에 대해 시험하는 단계; 상기 하나 이상의 관심의 특성에 대한 값의 범위를 확인하는 단계; 관심의 시험에서 바람직한 결과와 관련된 값의 범위 내 최소값을 확인하는 단계; 및 하나 이상의 관심의 특성의 범위 내 상기 최소값을 초과하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 다수의 단백질 변이체를 제공하여, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단백질 변이체의 라이브러리를 제공하는 단계 (상기 라이브러리는 관심의 시험에서 바람직한 결과를 갖는 일원 내에서 풍부해짐). 일부 구현예에서, 바람직한 결과는 상기 첫번째 단계에서 언급된 시험 세트에서 관찰된 최대 값의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 를 초과하는 값에 상응한다. 일부 대안적인 구현예에서, 본 발명의 방법에서는 1 개 초과의 관심의 시험이 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 단백질은 효소이다. 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 효소는 프로테아제, 트랜스페라아제, 메탈로프로테아제, 에스테라아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제, 큐티나아제, 및 리파아제로부터 선택된다.

또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 단백질 조작 방법을 제공한다: 단백질 변이체의 라이브러리를 제공하는 단계; 단백질 변이체의 라이브러리를 관심의 시험에서 2 개 이상의 관심의 특성에 대해 시험하는 단계; 상기 2 개 이상의 관심의 특성에 대한 값의 범위를 확인하는 단계; 관심의 시험에서 바람직한 결과와 관련된 값의 범위 내 최소값을 확인하는 단계; 및 2 개 이상의 관심의 특성의 범위의 상기 최소값을 초과하는 다수의 단백질 변이체를 제공하여, 관심의 시험에서 바람직한 결과를 갖는 일원 내에서 풍부해진 단백질 변이체의 라이브러리를 제공하는 단계. 일부 바람직한 구현예에서, 바람직한 결과는 상기 첫번째 단계에서 언급된 시험 세트에서 관찰된 최대 값의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 를 초과하는 값에 상응한다. 일부 바람직한 구현예에서, 단백질은 효소이다. 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 효소는 프로테아제, 트랜스페라아제, 메탈로프로테아제, 에스테라아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제, 큐티나아제, 및 리파아제로부터 선택된다.

또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 단백질 조작 방법을 제공한다: 야생형 단백질 및 야생형 단백질의 단백질 변이체의 라이브러리를 제공하는 단계; 단백질 변이체의 라이브러리 및 야생형 단백질을 관심의 시험에서 하나 이상의 관심의 특성에 대해 시험하는 단계; 상기 하나 이상의 관심의 특성에 대한 값의 범위를 확인하는 단계; 관심의 시험에서 바람직한 결과와 관련된 값의 범위 내 최소값을 확인하는 단계; 야생형에 대해 수득된 결과과 비교하여 바람직한 결과를 갖는 단백질 변이체를 확인하는 단계 (바람직한 결과는 개선된 관심의 특성임); 및 하나 이상의 관심의 특성의 범위 내 상기 최소값을 초과하는 다수의 단백질 변이체를 제공하여, 관심의 시험에서 바람직한 결과를 갖는 일원 내에서 풍부해진 개선된 단백질 변이체의 라이브러리를 제공하는 단계. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 성능 지수의 측정 단계를 추가로 포함하며, 상기 성능 지수는 각각의 개선된 단백질 변이체에 대해 수득된 값을 야생형 단백질에 대해 수득된 값으로 나누어 측정된다. 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 개선된 단백질 변이체를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 개선된 단백질 변이체는 관심의 시험에서 1.1 을 초과하는 성능 지수 값을 달성한다. 일부 부가적인 구현예에서, 단백질은 효소이다. 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 효소는 프로테아제, 트랜스페라아제, 메탈로프로테아제, 에스테라아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제, 큐티나아제, 및 리파아제로부터 선택된다. 일부 대안적인 구현예에서, 단백질은 항체 및 성장 인자로부터 선택된다. 또다른 부가적인 바람직한 구현예에서, 야생형 단백질은 프로테아제, 트랜스페라아제, 메탈로프로테아제, 에스테라아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제, 큐티나아제, 및 리파아제부터 선택되는 효소의 성숙 형태이다. 일부 바람직한 구현예에서, 관심의 특성은 전하, 세정 성능, 경질 표면 세정 성능, 가용성, 열 안정성, 저장 안정성, 세제 안정성, 기질 결합, 효소 억제, 발현 수준, 반응 속도, 및 기질 분해로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 야생형 단백질 및 단백질 변이체는 하나 이상의 세제 조성물의 성분이다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 성능은 pH 가 5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제로 제형화된 세제 조성물에서 시험된다.

또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 단백질 폴드 내 모체 단백질의 개선된 변이체의 제조 방법을 제공한다: 관심의 검정법에서 관심의 특성의 범위에 걸쳐있는 단백질 폴드 내 시험 단백질의 다중 변이체를 검정하는 단계; 관심의 검정법에서 바람직한 결과와 관련된 관심의 특성의 범위 내 최소값을 확인하는 단계; 관심의 검정법에서 단백질 폴드의 모체 단백질를 검정하는 단계; 및 아미노산 치환 도입에 의한 모체 단백질의 개선된 변이체를 생성하는 것이 개선된 변이체가 관심의 특성의 범위의 최소값을 초과하는 식의 모체 단백질인 단계. 일부 바람직한 구현예에서, 모체 단백질 및 시험 단백질은 상이하다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 성능 지수의 측정 단계를 추가로 포함하며, 상기 성능 지수는 개선된 단백질 변이체에 대해 수득된 값을 모체 단백질에 대해 수득된 값으로 나누어 측정된다. 일부 구현예에서, 시험 단백질 및 모체 단백질은 효소이다. 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 효소는 프로테아제, 트랜스페라아제, 메탈로프로테아제, 에스테라아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제, 큐티나아제, 및 리파아제로부터 선택된다. 일부 대안적인 구현예에서, 시험 및 모체 단백질은 항체 및 성장 인자로부터 선택된다. 또다른 부가적인 바람직한 구현예에서, 모체 단백질은 프로테아제, 트랜스페라아제, 메탈로프로테아제, 에스테라아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제, 큐티나아제, 및 리파아제부터 선택되는 효소의 성숙 형태이다. 일부 바람직한 구현예에서, 관심의 특성은 전하, 세정 성능, 경질 표면 세정 성능, 가용성, 열 안정성, 저장 안정성, 세제 안정성, 기질 결합, 효소 억제, 발현 수준, 반응 속도, 및 기질 분해로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 시험 및 모체 단백질은 하나 이상의 세제 조성물의 성분이다. 일부 대안적인 구현예에서, 개선된 단백질 변이체는 세제 조성물의 성분이다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 성능은 pH 가 5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제로 제형화된 세제 조성물에서 시험된다.

또한 본 발명은 서브틸리신 변이체가 가수분해 활성을 갖고, 하기 위치:

로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서의 치환을 포함하는 성숙 형태이며, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하는 바실러스 서브틸리신의 단리된 서브틸리신 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 위치는 하기:

로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링된다. 일부 추가의 구현예에서, 하나 이상의 위치는 하기:

로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링된다. 일부 구현예에서, 서브틸리신 변이체는 18, 52, 72, 117, 119, 127, 144, 185, 209 및 213 로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서의 치환을 추가로 포함하고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링된다. 일부 바람직한 구현예에서, 치환은 하기 위치 중 하나 이상을 포함한다:

일부 바람직한 구현예에서, 치환은 하기로부터 선택되는 조합을 포함한다:

일부 구현예에서, 치환은 하기로부터 선택되는 조합을 포함한다:

본 발명은 또한 실시예에 포함되는 표에 언급된 변이체 뿐 아니라, 이러한 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에 의해 제공되는 것은 서브틸리신 변이체를 코딩하는 단리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 게다가 본 발명은 서브틸리신 변이체를 포함하는 세정 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 세탁 세제이다. 일부 구현예에서, 세탁 세제는 냉수 세제, 저 pH 세제, 또는 압축 세제이다. 게다가 본 발명은 하기 a) 및 b) 단계를 포함하는, 바실러스 서브틸리신의 서브틸리신 변이체의 제조 방법을 제공한다: a) 서브틸리신 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; 및 b) 서브틸리신 변이체의 생성에 적합한 조건하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계. 일부 구현예에서, 본 발명은 생성된 서브틸리신 변이체를 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 바실러스 종이고, 상기 구현예의 서브세트에서, 바실러스 종은 B. 서브틸리스이다. 또한 본 발명은 섬유를 포함하는 표면 및/또는 물품을 단리된 서브틸리신 변이체를 포함하는 세정 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세정 방법을 제공한다.

부가적으로는 본 발명은 하기 a) ~ f) 단계를 포함하는 프로테아제 조작 방법을 제공한다: a) 프로테아제의 일치하는 아미노산 위치에서 구별되는 치환을 갖는 다수의 프로테아제 변이체를 각각 포함하는 다수의 부위 평가 라이브러리 (SEL) 를 제공하는 단계; b) 관심의 특성의 시험에서 SEL 의 프로테아제 변이체 및 표준 프로테아제를 시험하는 단계; c) 시험에 대해 각각의 프로테아제 변이체에 대한 성능 지수 (PI) 를 측정하는 단계; d) 비-제한적 위치로서 2 개 이상의 아미노산 위치를 확인하는 단계 (각각의 2 개의 SEL 에서 다수의 프로테아제 변이체 중 하나 이상이 0.5 초과의 PI 를 가짐); 및 f) 2 개 이상의 비-제한적 위치에서 각각 치환을 포함하는 다수의 다중-치환된 프로테아제 변이체를 포함하는 다중 돌연변이 라이브러리를 제공하는 단계. 일부 구현예에서, 시험은 얼룩 제거 검정법 (마이크로천조각), LAS 안정성 검정법, 세제 안정성 검정법, 및 특정 활성 검정법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 개 이상의 상이한 검정법을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 박테리아 세린 프로테아제, 박테리아 서브틸리신, 및 박테리아 중성 메탈로프로테아제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 바실러스 서브틸리신의 다중 치환된 서브틸리신 변이체의 제조 방법을 제공한다: 제 1 특성의 제 1 시험에서 및 제 2 특성의 제 2 시험에서 다수의 단독 치환된 서브틸리신 변이체를 시험하는 단계로서, 각 시험에서 모체 서브틸리신의 특성은 1.0 의 값으로 제시되고, 바람직한 제 1 또는 제 2 특성은 1.0 초과의 값을 갖고, 매우 바람직하지 않은 제 1 또는 제 2 특성은 약 0.80 미만의, 또는 일부 바람직한 구현예에서, 약 0.60 미만의 값을 갖는 단계; 바람직한 제 1 특성과 연관되고 매우 바람직하지 않은 제 2 특성과 연관되지 않은 단독 치환된 서브틸리신 변이체 중 하나 이상 중의 치환을 확인하는 단계; 바람직한 제 2 특성과 연관되고 매우 바람직하지 않은 제 1 특성과 연관되지 않은 단독 치환된 서브틸리신 변이체 중 하나 이상 중의 치환을 확인하는 단계; 및 서브틸리신 내에 이전 단계로부터의 치환을 도입하여 다중-치환된 서브틸리신 변이체를 산출하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 방법은 제 1 시험 및 제 2 시험에서 다중-치환된 서브틸리신 변이체를 시험하는 단계를 추가로 포함하고, 개선된 서브틸리신 변이체는 제 1 및 제 2 시험 모두에서 1.0 초과의 값, 또는 제 1 시험에서 1.0 초과의 값 및 제 2 시험에서 0.80 내지 1.0 의 값을 달성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 개선된 서브틸리신 변이체(들) 의 제조 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 특성은 음적 상관 관계가 있다. 일부 구현예에서, 바람직한 제 1 또는 제 2 특성은 약 1.2 초과의 값을 갖는다. 일부 구현예에서, 매우 바람직하지 않은 제 1 또는 제 2 특성은 약 0.40 미만의 값을 갖는다. 일부 구현예에서, 제 1 특성은 안정성이고, 제 2 특성은 세정 성능이다. 상기의 서브 세트에서, 안정성은 세제에서의 안정성을 포함하고, 세정 성능은 세제에서의 혈액 우유 잉크 (BMI) 세정 성능을 포함한다. 일부 구현예에서, 모체 박테리아 서브틸리신은 SEQ ID NO:2 로서 언급된 아미노산 서열을 갖는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 야생형 성숙 형태이다. 다른 구현예에서, 모체 박테리아 서브틸리신은 SEQ ID NO:562 로서 언급된 아미노산 서열을 갖는 B. 렌투스 GG36 서브틸리신의 야생형, 또는 단독으로 또는 다른 개질과 조합으로, Y217L 치환을 포함하는 BPN" (SEQ IDNO:565) 이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 세정 성능은 pH 가 5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 시험된다. 본 발명에서 임의의 적합한 순서를 사용하므로, 상기 단계가 상기 열거된 정확한 순서에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 그러나, 일부 바람직한 구현예에서, 치환은 약 50% 초과 또는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS: solvent accessible surface) 을 갖는 모체 서브틸리신 내 위치에서 일어난다.

도 1A 는 pHPLT-VAAc1 의 맵을 제공하고, 도 1B 는 pHPLT-BPN' 의 맵을 제공한다.
도 2A 는 전하 변화의 함수로서의 북미 세탁 세제 내 BPN'-Y217L CCL 의 BMI 세정 성능을 나타낸다. 유사하게는 도 2B 는 전하 변화의 함수로서의 북미 세탁 세제 내 GG36 CCL 의 BMI 세정 성능을 나타낸다.
도 3A 는 전하 변화의 함수로서의 서유럽 액체 세탁 세제 내 BPN'-Y217L CCL 의 BMI 세정 성능을 나타낸다. 유사하게는 도 3B 는 전하 변화의 함수로서의 서유럽 액체 세탁 세제 내 GG36 CCL 의 BMI 세정 성능을 나타낸다.
도 4A 는 전하 변화의 함수로서의 일본 분말 세탁 세제 내 BPN'-Y217L CCL 의 BMI 세정 성능을 나타낸다. 유사하게는 도 4B 는 전하 변화의 함수로서의 일본 분말 세탁 세제 내 GG36 CCL 의 BMI 세정 성능을 나타낸다.
도 5A 는 전하 변화의 함수로서의 자동 식기 세정 세제 내 BPN'-Y217L CCL 의 구운 계란 노른자 세정 성능을 나타낸다. 유사하게는 도 5B 는 전하 변화의 함수로서의 자동 식기 세정 세제 내 GG36 CCL 의 구운 계란 노른자 세정 성능을 나타낸다.
도 6 은 80 개의 변이체를 함유하는 라이브러리에 대해, 모체 BPN'-Y217L 에 관한 네트 전하 변화의 함수로서의 LAS/EDTA 안정성을 나타낸다.

본 발명은 단백질 조작 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 부위 평가 라이브러리의 사용 방법을 제공한다.

실시 목적을 위해, 통상적으로는, 특정 적용에 최적인 단백질을 제작하기 위해 단백질 공간 내 최상의 서열을 발견하는 것이 반드시 필요하지만은 않다. 대부분의 적용을 위해, 해결해야하는 문제는 다수의 특성에 필요한 최소값을 충족시키거나 이를 초과하는 하나 이상의 단백질 서열을 확인하는 것이다. 이것은 특정 특성에 좋은 돌연변이의 지식 뿐 아니라, 임의의 원하는 특성에 나쁜 돌연변이의 지식을 필요로 한다. 본 발명은 1 차 특성을 개선하고 원하는 한계 내에서 다른 특성에 대한 값을 유지하도록 변경될 수 있는 단백질 내 위치를 확인함으로써 목적을 충족시키기 위한 수단을 제공한다.

본 발명은 각각의 부위에 "부위 평가 라이브러리" 를 설립함으로써 관심의 특성 모두에 대해 단백질 내 모든 위치를 평가하기 위한 수단을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 라이브러리는 각 위치에 9-19 개의 돌연변이를 함유하고, 단백질을 조작하고 라이브러리를 구축하는데 사용하기 위해 각 위치를 평가하는데 사용된다. 각각의 특성은 모체 효소에 대해 측정되고, 각각의 돌연변이체 대 야생형에 대한 겉보기 자유 에너지 차이가 계산된다. 그 후 상기 델타 델타 G ("즉, ΔΔG") 겉보기 값은 가상성을 측정하기 위해 사용된다.

변이체를 분석하기 위한 이상적인 방식은 관심의 과정에서 변이체 대 모체 단백질에 대한 자유 에너지의 차이를 통해 분석하는 것일 것이다. 과정에 대한 깁스 자유 에너지 (Gibbs Free Energy) 는 시스템에 의해 수행될 수 있는 작업의 최대 양을 나타낸다. 모체 효소와 관련된 자유 에너지에 있어서의 변화는 (ΔΔ G ) 하기와 같이 제시된다;

ΔΔ G = -RT In (k_변이체/k_모체)

(식 중, k_변이체 는 변이체 효소에 대한 속도 상수이고, k_모체 는 모체 효소에 대한 속도 상수이고, R 는 기체 법칙 상수이고, T 는 절대 온도임). 대부분의 검정법은 진정한 자유 에너지의 측정이 가능하도록 구축되지 않았으므로, 본원에서는 양을 이용하였다:

ΔΔ G _app = -RT In (P_변이체/P_모체)

(식 중, P_변이체 는 변이체 효소에 대한 성능 값이고, P_모체 는 동일한 조건 하에서 모체 효소에 대한 성능 값임). ΔΔ G _app 값은 데이터 분포 및 가상성에 대한 ΔΔ G 와 유사한 방식으로 거동하는 것으로 예상될 수 있다. 그러나, ΔΔ G 는 모체 효소와 비교해 변이체에 의해 수행될 수 있는 작업의 최대 양이므로, 양 ΔΔ G _app 는 일반적으로 ΔΔ G 를 과소평가할 것이고, 2 개의 부가적인 위치의 특성이 ΔΔ G _app 값을 함께 첨가함으로써 예상되는 값보다 클 수 있는 상승작용을 나타내는 결과를 야기한다.

효과적인 라이브러리를 디자인하기 위해 사용된 본 발명의 방법이 동시에 다중 특성을 조작하기 위해 사용되었다. 특정 효소가 본원에 기재되어 있지만, 조작을 위해 임의의 관심의 단백질에 방법을 적용한다. 각각의 위치에서 12 내지 19 개의 치환을 도입함으로써 본원에 기재된 부위 평가 라이브러리 (SEL) 를 성립하였다. 수득된 돌연변이를 활성 및 안정성 검정법을 사용하여 분석하였다. 매 위치에 대한 참조 지점으로서 야생형 아미노산을 열거한다. 각각의 특성에 대해, 모체 효소에 대한 ΔΔ G _app 의 평균 및 표준 편차를 측정하기 위해 측정값을 사용하였다. 모체 평균 (μ_모체) 을 0 에 표준화하고, ΔΔ G _app 에 대한 표준 편차 (σ_모체) 를 측정하였다. 상기 값을 분자의 각각의 위치에서의 각각의 특성에 대한 참조로서 사용하였다. 특성 사이의 상관 관계에 대한 증거를 위해 부위 평가 데이터를 시험하였다. 각각의 특성에 대한 ΔΔ G _app 값을 각각의 다른 특성에 대해 좌표로 나타내고, 상관 계수를 계산하였다. 단백질 기질에 대한 2 개의 활성 측정값을 상관 지었다.

아미노산 서열 내 위치를 분석하기 위해, 2 개 유형의 부위를 규정하였다. "비생산적" 위치는 모체 효소보다 양호한 돌연변이를 갖지 않은 반면, "생산적" 위치는 모체 효소보다 양호한 하나 이상의 치환을 갖는다. 부위가 생산적일 것이라는 개연성은 총 부위의 수로 나뉘어진 생산적 부위의 수에 의해 제시된다. 임의의 돌연변이가 모체 효소보다 양호할 것이라는 개연성은 적고 (즉, 6%-28%) 제시된 부위가 하나 이상의 Up 돌연변이를 가질 것이라는 개연성은 꽤 크다.

어떻게 생산적 및 비생산적 부위가 프로테아제 내에 구조적 특징 (예를 들어, 묻힌 아미노산, 상호작용 아미노산, 활성 부위 근처의 위치 등) 뿐 아니라, 진화시 보존된 또는 변화가능한 서열 부위에 관련되어 분포되는 지를 측정하는 것에 관심이 있었다. 상기 측정을 위해, 구조를 시험하고, 서열을 비-불필요 상동과 정렬시킨다.

실시예에 제시된 바와 같이, 임의의 특성에 대한 유해한 돌연변이를 특성의 상관 관계와 관계없이 모든 다른 톡성에 대한 유해한 돌연변이와 상관 짓는다. 오직 소수의 위치 (5-10%) 만이 모든 특성에 대해 열악한 돌연변이를 갖는다. 이러한 위치는 "폴드 (fold)" 를 규정하고 진화시 보존된다. 이것이 시사하는 바는 임의의 특성에 대해 유리한 돌연변이의 확인이 그 특성에 대한 실제로 예측가능한 스크리닝을 필요로 함에도 불구하고, 임의의 특성에 유해할 것 같은 돌연변이의 확인은 ANY 스크리닝을 사용하여 달성될 수 있다는 것이다. 간단한 단백질 조작 전략은 SEL 을 성립하고 간단한 활성 및/또는 안정성 스크리닝을 사용하여 스크리닝하는 것이다. 유해한 돌연변이를 확인하고 유해한 돌연변이를 거의 갖지 않은 이러한 위치를 다중 특성을 개선시기키 위한 라이브러리 및 조합 돌연변이 성립에 사용한다. 또한, 단백질의 표면 상에 있고 상호작용이 거의 없고 서열 정렬 내 가변적인 픽킹 (picking) 부위는 높은 비율의 생산적 부위를 제공한다. 분자 내부에 있고 많은 접촉을 가지며 진화시 강하게 보존된 부위는 유해한 돌연변이를 갖는 큰 개연성을 가질 것이고 회피해야만 한다. 컴퓨터 및/또는 전기적 방법 및/또는 프로그램을 포함하나 이에 제한되지 않는 서열 및/또는 구조 정보 분석을 위한 임의의 적합한 방법이 본 발명에서 사용될 것으로 고려된다.

본 방법은 2 개의 특성에 대한 상관 계수와 함께, 각각의 2 개의 특성에 대해 5 중량% 초과의 활성 및 5 미만의% 활성을 갖는 변이체의 수의 쌍방식 비교를 제공한다.

라이브러리 디자인

일부의 특히 바람직한 구현예에서, 부위 평가 라이브러리 데이터가 조합 라이브러리 디자인에 사용된다. 전통적인 지정 평가는 랜덤 라이브러리를 성립하고, 단일 특성에 대해 많은 수의 라이브러리를 스크리닝하고, 이들을 조합하고 과정을 반복한다. 여러 연구자들이 발견했듯이 (예를 들어., Bloom et al, Curr. Opin. Struct. Biol., 15:447-452 [2005]; Bloom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:5869-5874 [2006]; 및 Guo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9205-9210 [2004] 참조), 하나의 특성에 대한 양성 돌연변이의 축적은 통상적으로 다른 특성의 감소를 야기한다. 임의의 돌연변이가 임의의 특성에 대해 업 (Up) 될 개연성은 적고, 임의의 돌연변이가 다운 (Down) 될 개연성은 높고 (> 85%), 활성을 증가시키는 3 개 초과의 돌연변이가 축적이 여러 다른 특성의 감소를 야기할 개연성은 꽤 높다. 이 문제는 다중 특성에 대해 양호할 것인 라이브러리를 성립하기 위해 부위 평가 데이터를 사용함으로써 회피된다. 비생산적 부위는 조합 라이브러리에 포함되지 않았고, 생산적 부위는 업된 돌연변이의 % 에 의해 추가로 분류되었다.

세정 조성물

본 발명의 세정 조성물은 예를 들어 세탁 적용, 경질 표면 세정, 자동 식기 세정 적용 뿐 아니라 의치, 치아, 모발 및 피부와 같은 화장 적용에 유리하게 사용된다. 그러나, 저온 용액에서 증가된 효율성의 고유한 이점으로 인해, 본 발명의 효소는 세탁 적용에 이상적으로 적합하다. 또한, 본 발명의 효소는 과립 및 액체 조성물 모두에서 사용될 수 있다.

본 발명의 변이체 프로테아제는 또한 세탁 세정 첨가제 제품에서 사용된다. 일부 구현예에서, 저온 용액 세정 적용물이 사용된다. 첨가제 제품은, 가장 단순한 형태로, 하나 이상의 프로테아제일 수 있다. 일부 구현예에서, 첨가제는 세정 과정에 추가하기 위한 투약 형태로 포장된다. 임의의 적합한 단일 투약 형태가 또한 본 발명으로 사용되는데, 이는 알약, 정제, 젤리캡슐 (gelcap), 또는 미리측정된 분말 또는 액체와 같은 다른 단일 투약 단위가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물의 부피가 증가되도록 충전제(들) 또는 담체 물질(들) 이 포함된다. 적합한 충전제 또는 담체 물질에는 술페이트, 카르보네이트 및 실리케이트의 다양한 염 뿐 아니라 탈크, 점토 등이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 액체 조성물에 적합한 충전제 또는 담체 물질에는 물 또는 저분자량 1 차 및 2 차 알코올 (폴리올 및 디올 포함) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 알코올의 예에는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 5% 내지 약 90% 의 상기 물질을 함유한다. 산성 충전제가 pH 를 감소시키는데 사용된다. 대안적으로는, 세정 첨가제는 하기에 보다 충분히 기재되는 바와 같은 보조 성분을 포함한다.

본 발명의 세정 조성물 및 세정 첨가제는 단독으로 또는 다른 프로테아제 및/또는 부가적 효소와 함께, 본원에 제공되는 하나 이상의 프로테아제 변이체의 유효량을 필요로 한다. 효소의 필요 수준은 본 발명의 하나 이상의 프로테아제 변이체의 첨가에 의해 달성된다. 전형적으로는 본 발명의 세정 조성물은 약 0.0001 중량% 이상, 약 0.0001 중량% 내지 약 1 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 심지어 약 0.01 중량% 내지 약 0.1 중량% 의, 본 발명의 변이체 프로테아제 중 하나 이상을 포함한다.

본원의 세정 조성물은 전형적으로는, 수성 세정 작업에서 사용하는 동안 세정수가 pH 약 5.0 내지 약 11.5, 또는 심지어 약 7.5 내지 약 10.5 를 갖도록 제형화된다. 액체 생성물 제형은 전형적으로는, 순 pH 약 3.0 내지 약 9.0, 또는 심지어 약 3 내지 약 5 를 갖도록 제형화된다. 과립 세탁 생성물은 전형적으로 pH 약 9 내지 약 11 을 갖도록 제형화된다. 권고되는 이용 수준에서 pH 를 조절하는 기술은 완충액, 알칼리, 산 등의 사용을 포함하며, 당업자에게 널리 알려져 있다.

적합한 저-pH 세정 조성물은 전형적으로는 약 3 내지 약 5 의 순 pH 를 가지며, 전형적으로는 이러한 pH 환경에서 가수분해하는 계면활성제를 갖지 않는다. 상기 계면활성제는 하나 이상의 에틸렌 산화물 부분 또는 심지어 약 1 내지 약 16 몰의 에틸렌 산화물을 포함하는 나트륨 알킬 술페이트 계면활성제를 포함한다. 이러한 세정 조성물은 전형적으로는, 순 pH 약 3 내지 약 5 의 세정 조성물이 제공되도록 수산화나트륨, 모노에탄올아민 또는 염산과 같은 충분량의 pH 개질제를 포함한다. 이러한 조성물은 전형적으로는 하나 이상의 산 안정 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 액체인 한편, 다른 구현예에는 고체이다. 상기 액체 조성물의 pH 는 전형적으로는 순 pH 로서 측정된다. 상기 고체 조성물의 pH 는 용매가 증류수인 상기 조성물의 10% 고체 용액으로서 측정된다. 이러한 구현예에서, 모든 pH 측정은 20℃ 에서 수행된다.

일부 구현예에서, 변이체 프로테아제(들) 가 과립 조성물 또는 액체로 사용되며, 변이체 프로테아제가, 보관하는 동안 과립 조성물의 다른 성분으로부터 상기 변이체 프로테아제가 보호되도록 캡슐화된 입자의 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 추가로, 캡슐화는 또한 세정 방법 동안 변이체 프로테아제의 이용성을 제어하기 위한 수단이다. 일부 구현예에서, 캡슐화는 변이체 프로테아제(들) 및/또는 부가적 효소의 성능을 증강시킨다. 이와 관련하여, 본 발명의 변이체 프로테아제는 당업계에 알려져 있는 임의의 적합한 캡슐화 물질로 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 전형적으로는 본 발명의 변이체 프로테아제(들) 에 대한 촉매의 일부 이상을 캡슐화한다. 전형적으로는, 캡슐화 물질은 수용성 및/또는 수분산성이다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 0℃ 이상의 유리 전이 온도 (Tg) 를 갖는다. 유리 전이 온도는 WO 97/11151 호에 보다 상세히 기재되어 있다. 캡슐화 물질은 탄수화물, 천연 또는 합성 고무, 키틴, 키토산, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 실리케이트, 포스페이트, 보레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 파라핀 왁스 및 이의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 캡슐화 물질이 탄수화물인 경우, 이는 전형적으로는 단당류, 올리고당류, 다당류 및 이의 조합물에서 선택된다. 전형적으로는, 캡슐화 물질은 전분이다. 적합한 전분은 EP 0 922 499 호; US 4,977,252 호; US 5,354,559 호 및 US 5,935,826 호에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 열가소물, 아세토니트릴, 메타크릴로니트릴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메타크릴로니트릴 및 이의 혼합물과 같은 플라스틱으로 생성되는 마이크로스피어이고; 사용되는 시판 마이크로스피어는 EXPANCEL® (Stockviksverken, Sweden), 및 PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® 및 SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA) 에 의해 공급되는 것들을 포함한다.

본원에 기재되는 바와 같이, 본 발명의 변이체 프로테아제는 특히 세탁 세제에서 사용된다. 이들 적용은 다양한 환경 스트레스 하에서의 효소에 있다. 본 발명의 변이체 프로테아제는 다양한 조건하에서의 그의 안정성으로 인해, 많은 현재 사용되는 효소에 비해 장점을 제공한다.

게다가, 세정에 포함되는 프로테아제가 노출되는 다양한 세제 제형, 세정수 부피, 세정수 온도, 및 세정시간을 포함하여 세정 조건은 다양하다. 또한, 상이한 지리학적 영역에서 사용되는 세제 제형은 세정수에 존재하는 관련 성분 농도가 상이하다. 예를 들어, 유럽 세제에는 전형적으로 약 4500-5000 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하고, 일본 세제에는 전형적으로 대략 667 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다. 북미에서, 특히 미국에서, 세제에는 전형적으로 약 975 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다.

저 세제 농도 시스템에는 약 800 ppm 미만의 세제 성분이 세정수에 존재하는 세제가 포함된다. 일본 세제는 대략 667 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 전형적으로 저 세제 농도 시스템으로 간주된다.

중간 세제 농도에는 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하는 세제가 포함된다. 북미 세제는 대략 975 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 일반적으로 중간 세제 농도 시스템으로 간주된다. 브라질 세제에는 전형적으로 대략 1500 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다.

고 세제 농도 시스템에는 약 2000 ppm 초과의 세제 성분이 세정수에 존재하는 세제가 포함된다. 유럽 세제는 대략 4500-5000 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 일반적으로 고 세제 농도 시스템으로 간주된다.

남미 세제는 일반적으로 고 비누 인산염 세정강화제 (suds phosphate builder) 세제이며, 남미에서 사용되는 세제의 범위는 1500 내지 6000 ppm 범위의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 중간 및 고 세제 농도 모두라고 볼 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 브라질 세제에는 전형적으로 대략 1500 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다. 그러나, 기타 남미 국가에 제한되지 않는 기타 고 비누 인산염 세정강화제 세제 지역은, 약 6000 ppm 이하의 세제 성분이 세정수에 존재하는 고 세제 농도 시스템을 가질 수 있다.

이에 비추어 보아, 세계적으로 전형적인 세정액 중의 세제 조성물의 농도가 약 800 ppm 미만의 세제 조성물 ("저 세제 농도 지역"), 예를 들어 일본에서는 약 667 ppm, 미국에서는 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm ("중간 세제 농도 지역"), 예를 들어 약 975 ppm, 그리고 브라질에서는 약 1500 ppm, 약 2000 ppm 초과 ("고 세제 농도 지역"), 예를 들어 유럽에서는 약 4500 ppm 내지 약 5000 ppm 및 고 비누 인산염 세정강화제 지역에서는 약 6000 ppm 으로 다양하다는 것이 명백하다.

전형적인 세정액의 농도는 경험적으로 측정된다. 예를 들어, 미국에서는 전형적인 세탁기는 약 64.4 L 부피의 세정액을 담는다. 따라서, 세정액 중에 약 975 ppm 의 세제 농도를 수득하기 위해서는, 약 62.79 g 의 세제 조성물을 64.4 L 의 세정액에 첨가해야만 한다. 이 양은 세제와 함께 제공될 수 있는 계량컵을 사용하여 소비자가 세정수로 측정한 전형적인 양이다.

추가 예로서, 상이한 지역은 상이한 세정 온도를 사용한다. 일본에서의 세정수의 온도는 전형적으로 유럽에서 사용되는 온도보다 낮다. 예를 들어, 북미 및 일본에서의 세정수의 온도는 10℃ 내지 30℃ (예를 들어, 약 20℃) 일 수 있는 반면, 유럽에서의 세정수의 온도는 전형적으로 30℃ 내지 60℃ (예를 들어, 약 40℃) 이다.

추가 예로서, 상이한 지역은 전형적으로 물의 경도가 상이하다. 물의 경도는 일반적으로 혼합된 Ca² ⁺/Mg² ⁺ 갤론 당 그레인 (grain) 으로 표현된다. 경도는 물 중의 칼슘 (Ca² ⁺) 및 마그네슘 (Mg² ⁺) 의 양의 측정값이다. 미국의 대부분의 물은 경질이나, 경도 값은 다양하다. 중간 경질 (60-120 ppm) 에서 경질 (121-181 ppm) 인 물은 백만 당 60 내지 181 부 (미국 갤론 당 그레인으로 전환된 백만 당 부는 갤론 당 17.1 에 동일한 그레인으로 나눠진 ppm # 이다) 의 경질 광물을 함유한다.

유럽의 물의 경도는 전형적으로 혼합된 Ca² ⁺/Mg² ⁺ 갤론 당 10.5 초과 (예를 들어, 10.5 내지 20.0) 의 그레인 (예를 들어, 혼합된 Ca² ⁺/Mg² ⁺ 갤론 당 약 15 그레인) 이다. 북미의 물의 경도는 전형적으로 일본의 물의 경도보다 크나, 유럽의 물의 경도보다는 적다. 예를 들어, 북미의 물의 경도는 3 내지 10 그레인, 3-8 그레인 또는 약 6 그레인일 수 있다. 일본의 물의 경도는 전형적으로 북미의 물의 경도보다 낮으며, 일반적으로 혼합된 Ca² ⁺/Mg² ⁺ 갤론 당 4 미만, 예를 들어 3 그레인이다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 세정 조건 세트 (예를 들어, 물 온도, 물의 경도, 및/또는 세제 농도) 에서 놀라운 세정 성능을 보여주는 프로테아제를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 프로테아제는 그 세정 성능이 다른 서브틸리신 프로테아제와 필적할만하다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 프로테아제는 현재 시판되는 서브틸리신 프로테아제와 비교하여 향상된 세정 성능을 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 변이체 프로테아제는 향상된 산화 안정성, 향상된 열 안정성, 및/또는 향상된 킬레이트제 안정성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 변이체 프로테아제는 다시 단독으로 또는 세정강화제 및 안정화제와 조합으로, 세제가 포함되지 않은 세정 조성물에 사용된다.

본 발명의 일부 구현예에서, 세정 조성물은 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 수준으로 포함하고, 조성물의 나머지는 (예를 들어, 약 99.999 중량% 내지 약 90.0 중량%) 세정 보조 물질을 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 변이체 프로테아제를 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 수준으로 포함하고, 세정 조성물의 나머지는 (예를 들어, 약 99.9999 중량% 내지 약 90.0 중량%, 약 99.999 중량% 내지 약 98 중량%, 약 99.995 중량% 내지 약 99.5 중량%) 세정 보조 물질을 포함한다.

일부 구현예에서, 바람직한 세정 조성물은, 본원에서 제공되는 하나 이상의 변이체 프로테아제 외에도 세정 성능 및/또는 섬유 케어 이점을 제공하는 하나 이상의 부가적인 효소 또는 효소 유도체를 포함한다. 이러한 효소에는 기타 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제 (예를 들어, 락카아제), 및/또는 만난나아제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

임의의 기타 적합한 프로테아제가 본 발명의 조성물에 사용된다. 적합한 프로테아제에는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것들이 포함된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 미생물 프로테아제가 사용된다. 일부 구현예에서, 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 바람직하게는 알칼리 미생물 프로테아제 또는 트립신 유사 프로테아제이다. 알칼리 프로테아제의 예에는 서브틸리신, 특히 바실러스 (Bacillus) 종 (예를 들어, 서브틸리스, 렌투스, 아밀로리퀘파시엔스, 서브틸리신 칼스베르그 (Carlsberg), 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168) 으로부터 유래된 것들이 포함된다. 부가적인 예에는 모두 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 번호 RE 34,606 호, 5,955,340 호, 5,700,676 호, 6,312,936 호, 및 6,482,628 호에 기재된 돌연변이체 프로테아제가 포함된다. 부가적인 프로테아제의 예에는 트립신 (예를 들어, 돼지 또는 소 기원의 것), 및 WO 89/06270 호에 기재된 푸사리움 (Fusarium) 프로테아제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 시판 프로테아제 효소에는 MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT® 및 PURAFECT® OXP (Genencor), ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, RELASE® 및 ESPERASE® (Novozymes); 및 BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany) 가 포함된다. 다양한 프로테아제는 WO 95/23221 호, WO 92/21760 호, 및 미국 특허 번호 5,801,039 호, 5,340,735 호, 5,500,364 호, 5,855,625 호, US RE 34,606 호, 5,955,340 호, 5,700,676 호, 6,312,936, 및 6,482,628 호, 및 다양한 기타 특허에 기재되어 있다.

또한, 임의의 적합한 리파아제가 본 발명에서 사용된다. 적합한 리파아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체도 본 발명에 포함된다. 유용한 리파아제의 예에는 휴미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa) 리파아제 (예를 들어, EP 258 068 호, 및 EP 305 216 호 참조), 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 리파아제 (예를 들어, EP 238 023 호 참조), 칸디다 (Candida) 리파아제, 예컨대 C. 안타르크티카 (C. antarctica) 리파아제 (예를 들어, C. 안타르크티카 (C. antarctica) 리파아제 A 또는 B; 예를 들어, EP 214 761 호 참조), 슈도모나스 (Pseudomonas) 리파아제, 예컨대 P. 알칼리제네스 (P. alcaligenes) 및 P. 슈도알칼리제네스 (P. pseudoalcaligenes) 리파아제 (예를 들어, EP 218 272 호 참조), P. 세파시아 (P. cepacia) 리파아제 (예를 들어, EP 331 376 호 참조), P. 스투트제리 (P. stutzeri) 리파아제 (예를 들어, GB 1,372,034 호 참조), P. 플루오레세인 (P. fluoresceins) 리파아제, 바실러스 (Bacillus) 리파아제 (예를 들어, B. 서브틸리스 (B. subtilis) 리파아제 [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus) 리파아제 [예를 들어, JP 64/744992 호 참조]; 및 B. 푸밀러스 (B. pumilus) 리파아제 [예를 들어, WO 91/16422 호 참조]) 가 포함된다.

게다가, 페니실리움 카멤베르티 (Penicillium camembertii) 리파아제 (Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991] 참조), 제오트리쿰 칸디둠 (Geotricum candidum) 리파아제 (Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989] 참조), 및 다양한 리조푸스 (Rhizopus) 리파아제, 예컨대 R. 델레마르 (R. delemar) 리파아제 (Hass et al., Gene 109:117-113 [1991] 참조), R. 니베우스 (R. niveus) 리파아제 (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) 및 R. 오리자에 (R. oryzae) 리파아제를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 클로닝된 리파아제가 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다.

또한 슈도모나스 멘도시나 (Pseudomonas mendocina) 유래의 큐티나아제 (WO 88/09367 호 참조), 및 푸사리움 솔라니피시 (Fusarium solanipisi) 유래의 큐티나아제 (WO 90/09446 호 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 큐티나아제와 같은 다른 유형의 지방분해 효소가 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다.

부가적인 적합한 리파아제에는 시판 리파아제, 예컨대 M1 LIPASE™, LUMA FAST™ 및 LIPOMAX™ (Genencor); LIPOLASE® 및 LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); 및 LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co; Ltd., Japan) 가 포함된다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 리파아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 리파아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 리파아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 리파아제 수준으로 포함한다.

알칼리 용액에서 사용하기에 적합한 임의의 아밀라아제 (알파 및/또는 베타) 는 또한 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 적합한 아밀라아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체도 일부 구현예에 포함된다. 본 발명에 사용되는 아밀라아제에는 B. 리체니포르미스 (B. licheniformis) 로부터 수득된 α-아밀라아제 (예를 들어, GB 1,296,839 호 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용되는 시판 아밀라아제에는 DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, BAN™ (Novozymes) 및 RAPIDASE® 및 MAXAMYL® P (Genencor) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 아밀라아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 아밀라아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 아밀라아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 아밀라아제 수준으로 포함한다.

일부 추가의 구현예에서, 임의의 적합한 셀룰라아제는 본 발명의 세정 조성물에서 사용된다. 적합한 셀룰라아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체도 일부 구현예에 포함된다. 적합한 셀룰라아제에는 휴미콜라 인솔렌 (Humicola insolens) 셀룰라아제 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,435,307 호 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특히 적합한 셀룰라아제는 색조 케어 장점을 가진 셀룰라아제 (예를 들어, EP 0 495 257 호 참조) 이다.

본 발명에 사용되는 시판 셀룰라아제에는 CELLUZYME® (Novozymes), 및 KAC-500(B)™ (Kao Corporation) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 셀룰라아제는 N-말단 부분이 결실된, 성숙 야생형 또는 변이체 셀룰라아제의 일부 또는 조각으로서 혼입된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,874,276 호 참조). 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 셀룰라아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 셀룰라아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 셀룰라아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 셀룰라아제 수준으로 포함한다.

세제 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 만난나아제가 또한 본 발명에서 사용된다. 적합한 만난나아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체도 일부 구현예에 포함된다. 다양한 만난나아제는 본 발명에서 사용되는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, 모두 참조로서 본원에 인용된 미국 특허 번호 6,566,114 호, 미국 특허 번호 6,602,842 호, 및 미국 특허 번호 6,440,991 호 참조). 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 만난나아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 만난나아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 만난나아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 만난나아제 수준으로 포함한다.

일부 구현예에서, 퍼옥시다아제는 본 발명의 조성물에서 과산화수소 또는 그의 공급원 (예를 들어, 퍼카르보네이트, 퍼보레이트 또는 퍼술페이트) 과 함께 사용된다. 일부 대안적인 구현예에서, 옥시다아제는 산소와 조합으로 사용된다. 양쪽 유형의 효소는 바람직하게는 강화제 (예를 들어, WO 94/12621 호 및 WO 95/01426 호 참조) 와 함께, "용액 표백" (즉, 세정액에서 섬유를 함께 세정할 때, 염색된 섬유에서 또다른 섬유로 직물 염료가 물드는 것을 방지하기 위함) 에 사용된다. 적합한 퍼옥시다아제/옥시다아제에는 식물, 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 개질된 돌연변이체도 일부 구현예에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소 수준으로 포함한다.

일부 구현예에서, 퍼히드롤라아제 (예를 들어, WO 05/056782 호 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 부가적인 효소가 사용된다. 또한, 일부 특히 바람직한 구현예에서, 상기 언급된 효소의 혼합물, 특히 하나 이상의 부가적인 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제, 만난나아제, 및/또는 하나 이상의 셀룰라아제의 혼합물이 본원에 포함된다. 게다가, 상기 효소의 다양한 혼합물이 본 발명에 사용될 것으로 고려된다. 또한, 변이체 프로테아제(들) 과 하나 이상의 부가적인 효소의 수준 변화는 모두 독립적으로 약 10% 범위일 수 있고, 세정 조성물의 나머지는 세정 보조 물질인 것으로 고려된다. 특이적인 세정 보조 물질의 선택은 세정되어야 할 표면, 물품 또는 섬유, 및 사용 동안의 세정 조건 동안 (예를 들어, 세정 세제 사용 동안) 조성물의 원하는 형태를 고려하여 쉽게 이루어질 수 있다.

적합한 세정 보조 물질의 예에는 계면활성제, 세정강화제, 표백제, 표백 활성화제, 표백 촉매, 기타 효소, 효소 안정화 시스템, 킬레이트물질 (chelant), 형광 증백제, 오염 방출 중합체, 염료 전이제, 분산제, 비누 (suds) 억제제, 염료, 향수, 착색제, 충전제 염, 히드로트롭 (hydrotrope), 광활성화제, 형광물질, 섬유 컨디셔너, 가수분해가능 계면활성제, 방부제, 항산화제, 항수축제, 항구김제, 살균제, 살진균제, 색조 얼룩, 실버케어 (silvercare), 항변색제 및/또는 항부식제, 알칼리성 공급원, 가용화제, 담체, 가공 보조제, 안료, 및 pH 조절제 (예를 들어, 모두 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 번호 6,610,642 호, 6,605,458 호, 5,705,464 호, 5,710,115 호, 5,698,504 호, 5,695,679 호, 5,686,014 호 및 5,646,101 호 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특이적 세정 조성물 물질의 구현예는 하기에 상세히 예시된다. 세정 보조 물질이 세정 조성물 중에서 본 발명의 변이체 프로테아제와 비상용성이지 않다면, 세정 보조 물질과 프로테아제(들) 을 이 두 성분의 조합이 적절할 때까지 분리된 채로 유지하는 (즉, 서로 접촉되지 않음) 적합한 방법이 사용된다. 이러한 분리 방법에는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법이 포함된다 (예를 들어, 젤리캡슐 (gelcap), 캡슐화, 정제, 물리적인 분리, 등).

일부 바람직한 구현예에서, 본원에서 제공되는 유효량의 하나 이상의 변이체 프로테아제(들) 은 단백질성 얼룩 제거가 필요한 다양한 표면의 세정에 유용한 조성물에 포함된다. 이러한 세정 조성물에는 세정 경질 표면, 섬유 및 식기와 같은 적용에 대한 세정 조성물이 포함된다. 게다가, 일부 구현예에서, 본 발명은 섬유 세정 조성물을 제공하나, 다른 구현예에서, 본 발명은 비-섬유 세정 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 또한 구강 캐어 (치분, 치약, 구강세정제 등 뿐 아니라 의치 세정 조성물을 포함), 피부 및 모발 세정 조성물을 비롯한 개인 캐어에 적합한 세정 조성물을 제공한다. 본 발명은 임의의 형태의 (즉, 액체, 과립, 바, 반고체, 젤, 에멀젼, 정제, 캡슐 등) 세제 조성물을 포함하는 것으로 의도된다.

예를 들어, 본 발명의 변이체 프로테아제가 사용되는 여러 세정 조성물은 이하에 더욱 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 세정 조성물이 세탁기 세정법(들) 에서 사용하기에 적합한 조성물로 제형화되는 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는, 하나 이상의 계면활성제 및 하나 이상의 세정강화제 화합물 뿐 아니라, 바람직하게는 유기 중합체 화합물, 표백제, 부가적인 효소, 비누 억제제, 분산제, 석회-비누 (soap) 분산제, 오물 현탁 및 항-재침전제 및 부식억제제로부터 선택되는 하나 이상의 세정 보조 물질을 함유한다. 일부 구현예에서, 세탁 조성물은 또한 연화제 (즉, 부가적인 세정 보조 물질로서) 를 함유한다. 또한 본 발명의 조성물은 고체 또는 액체 형태의 세제 첨가제 생성물을 사용한다. 이러한 첨가제 생성물은 통상의 세제 조성물의 성능을 보충 및/또는 강화시키는 것으로 의도되고, 세정 과정의 임의의 단계에서 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 세탁 세제 조성물의 밀도는 약 400 내지 약 1200 g/리터의 범위이고, 다른 구현예에서, 밀도는 약 20℃ 에서 측정된 조성물의 약 500 내지 약 950 g/리터 범위이다.

설겆이 방법에 사용하기 위한 조성물로서 제형화된 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는, 하나 이상의 계면활성제, 바람직하게는 유기 중합체 화합물, 비누 향상제, 제 II 군 금속 이온, 용매, 히드로트롭 및 부가적인 효소로부터 선택되는 하나 이상의 부가적인 세정 보조 물질을 함유한다.

일부 구현예에서, 다양한 세정 조성물, 예컨대 미국 특허 번호 6,605,458 호에 제시된 조성물이 본 발명의 변이체 프로테아제와 사용된다. 그러므로, 일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 압축 과립 섬유 세정 조성물이고, 다른 구현예에서, 상기 조성물은 색조 섬유의 세탁에 유용한 과립 섬유 세정 조성물이고, 추가의 구현예에서, 상기 조성물은 세정 용량을 통해 연화시키는 과립 섬유 세정 조성물이고, 부가적인 구현예에서, 상기 조성물은 강력 (heavy duty) 액체 섬유 세정 조성물이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 미국 특허 번호 6,610,642 호 및 미국 특허 번호 6,376,450 호에 기재된 것과 같은 섬유 세정 조성물이다. 또한, 본 발명의 변이체 프로테아제는 유럽 또는 일본 세정 조건 하에서 특정 유용성의 과립 세탁 세제 조성물 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,610,642 호 참조) 에 사용된다.

일부 대안적인 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 경질 표면 세정 조성물을 제공한다. 그러므로, 일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 미국 특허 번호 6,610,642 호, 6,376,450 호 및 6,376,450 호에 기재된 것과 같은 경질 표면 세정 조성물이다. 또다른 추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 식기세정 조성물을 제공한다. 그러므로, 일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 미국 특허 번호 6,610,642 호 및 6,376,450 호에 기재된 것과 같은 경질 표면 세정 조성물이다. 또다른 추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 식기세정 조성물을 제공한다. 일부 추가의 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 미국 특허 번호 6,376,450 호 및 6,376,450 호에 기재된 것과 같은 구강 캐어 조성물을 포함한다. 상기 언급된 미국 특허 번호 6,376,450 호, 6,605,458 호, 6,605,458 호 및 6,610,642 호에 포함된 화합물 및 세정 보조 물질의 제형 및 설명은 본원에 제공된 변이체 프로테아제에 사용된다.

본 발명의 세정 조성물은 임의의 적합한 형태로 제형화되고 제형자에 의해 선택되는 임의의 방법으로 제조되며, 이의 비제한적인 예는 모두 본원에 참고로서 인용되는 미국 특허 제 5,879,584 호, 제 5,691,297 호, 제 5,574,005 호, 제 5,569,645 호, 제 5,565,422 호, 제 5,516,448 호 제 5,489,392 호 및 제 5,486,303 호에 기재되어 있다. 낮은 pH 의 세정 조성물이 필요한 경우, 이러한 조성물의 pH 는 모노에탄올아민과 같은 물질 또는 HCl 과 같은 산성 물질의 첨가를 통해 조정된다.

본 발명의 목적을 위해 필수적이지는 않지만, 이하 설명한 보조제의 비제한적인 목록은 본 세정 조성물에서 사용하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 이러한 보조제는 예를 들어, 세정될 기질의 처리를 위해 세정 성능을 조력 또는 증강시키거나, 향수, 착색제, 염료 등의 경우에서와 같이 세정 조성물의 심미감을 변화시키기 위해 혼입된다. 이러한 보조제가 본 발명의 변이체 프로테아제에 추가되는 것으로 이해된다. 이러한 추가적인 성분의 명확한 성질, 및 이의 혼입 수준은 조성물의 물리적 형태 및 사용될 세정 작업의 특성에 따라 다를 것이다. 적합한 보조 물질에는 계면활성제, 세정강화제, 킬레이트제, 염료 전이 저해제, 침착 보조제, 분산제, 추가적 효소 및 효소 안정화제, 촉매적 물질, 표백 활성화제, 표백 촉진제 (bleach booster), 과산화수소, 과산화수소 공급원, 기성 과산 (preformed peracid), 중합체성 분산제, 흙 오염 제거제/재침착 방지제, 증백제, 비누 억제제, 염료, 향수, 구조 탄성화제, 섬유 유연제, 담체, 히드로트롭, 가공 보조제 및/또는 안료가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 하기 설명에 부가하여, 이러한 다른 보조제의 적합한 예 및 사용 수준은 참조로서 인용되는 미국 특허 제 5,576,282 호, 제 6,306,812 호 및 제 6,326,348 호에서 발견된다. 상기 언급된 보조 성분은 본 발명의 세정 조성물의 나머지를 구성할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 세정 조성물은 계면활성제 또는 계면활성제 시스템을 포함하며, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 쯔비터성 계면활성제, 반극성 비이온성 계면활성제 및 이의 혼합물로부터 선택된다.

일부 부가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 세제 세정강화제 또는 세정강화제 시스템을 포함한다. 세정강화제에는 알칼리 금속, 폴리포스파테이트의 암모늄 및 알카놀암모늄 염, 알칼리 금속 실리케이트, 알칼리 토금속 및 알칼리 금속 카르보네이트, 알루미노실리케이트 세정강화제 폴리카르복실레이트 화합물, 에테르 히드록시폴리카르복실레이트, 말레산 무수물과 에틸렌 또는 비닐 메틸 에테르와의 공중합체, 1,3,5-트리히드록시 벤젠-2,4,6-트리술폰산 및 카르복시메틸옥시숙신산, 다양한 알칼리 금속, 폴리아세트산의 암모늄 및 치환 암모늄 염 예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산 및 니트릴로트리아세트산 뿐 아니라 폴리카르복실레이트 예컨대 멜리트산, 숙신산, 시트르산, 옥시디숙신산, 폴리말레산, 벤젠 1,3,5-트리카르복실산, 카르복시메틸옥시숙신산, 및 이의 가용성 염이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

일부 추가의 구현예에서, 본원의 세정 조성물은 킬레이트제를 함유한다. 적합한 킬레이트제에는 구리, 철 및/또는 망간 킬레이트제 및 이의 혼합물이 포함된다.

일부의 또다른 추가의 구현예에서, 본원에 제공된 세정 조성물은 침착 보조제를 함유한다. 적합한 침착 보조제에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리카르복실레이트, 오염 방출 중합체 예컨대 폴리테레프탈산, 점토 예컨대 카올리나이트, 몬트모릴로나이트, 아타풀가이트, 일라이트, 벤토나이트, 할로이사이트 및 이의 혼합물이 포함된다.

일부 부가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물에는 또한 하나 이상의 염료 전이 저해제가 포함된다. 적합한 중합체성 염료 전이 저해제에는 폴리비닐피롤리돈 중합체, 폴리아민 N-산화물 중합체, N-비닐피롤리돈 및 N-비닐이미다졸의 공중합체, 폴리비닐옥사졸리돈 및 폴리비닐이미다졸 또는 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

일부의 또다른 부가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 분산제를 함유한다. 적합한 수용성 유기 물질에는 폴리카르복실산이 2 개 이하의 탄소 원자에 의해 서로 분리되는 2 개 이상의 카르복실 라디칼을 포함하는, 단일중합체성 또는 공중합체성 산 또는 이의 염이 포함된다.

일부의 특히 바람직한 구현예에서, 세정 조성물은 세정 성능 및/또는 섬유 케어 이점을 제공하는 하나 이상의 세제 효소를 포함한다. 적합한 효소의 예에는, 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀루라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 말라나아제, β-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 및 아밀라아제, 또는 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 전형적인 조합은 하나 이상의 프로테아제, 하나 이상의 리파아제, 하나 이상의 큐티나아제 및/또는 하나 이상의 셀룰라아제를 하나 이상의 아밀라아제와 함께 포함하는, 통상적으로 이용가능한 효소의 칵테일이다.

일부 추가의 구현예에서, 세정 조성물에서 사용되는 효소는 임의의 적합한 기술로 안정화된다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 효소는 칼슘 및/또는 마그네슘 이온을 효소에 제공하는 최종 조성물 중 상기 칼슘 및/또는 마그네슘 이온의 수용성 공급원의 존재 하에 안정화된다.

일부의 더욱 추가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물에는 촉매적 금속 착물이 포함된다. 금속-함유 표백 촉매의 하나의 유형은 한정된 표백 촉매 활성의 전이 금속 양이온 예컨대 구리, 철, 티타늄, 루테늄, 텅스텐, 몰리브덴 또는 망간 양이온, 탈색 촉매 활성이 없거나 거의 없는 보조 금속 양이온 예컨대 아연 또는 알루미늄 양이온, 및 촉매적 및 보조 금속 양이온에 대해 한정된 안정성 상수를 갖는 격리제, 특히 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라 (메틸렌포스폰산) 및 이의 수용성 염을 포함하는 촉매계이다. 이러한 촉매는 미국 특허 제 4,430,243 호에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, 본원의 조성물은 망간 화합물에 의해 촉매화된다. 이러한 화합물 및 사용 수준은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 5,576,282 호에 개시된 망간-기재 촉매가 포함된다. 또한, 본원에서 유용한 코발트 표백 촉매는 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 5,597,936 호 및 제 5,595,967 호에 기재되어 있다. 이러한 코발트 촉매는 미국 특허 제 5,597,936 호 및 제 5,595,967 호에서 교시된 바와 같은 공지된 절차에 의해 용이하게 제조된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공되는 조성물은 또한 마크로폴리시클릭 강성 리간드 (즉, "MRL") 의 전이 금속 착물이 적합하게 포함된다. 제한이 아닌, 실시적인 문제로서, 본원의 조성물 및 세정 절차는 수성 세정 매질 중 활성 MRL 종류의 약 일억분의 1 이상이 제공되도록 조정가능하며, 바람직하게는 세정액 중 MRL 의 약 0.005 ppm 내지 약 25 ppm, 더욱 바람직하게는 약 0.05 ppm 내지 약 10 ppm, 가장 바람직하게는 약 0.1 ppm 내지 약 5 ppm 이 제공될 것이다. 본 전이-금속 표백 촉매에서의 바람직한 전이-금속에는 망간, 철 및 크롬이 포함된다. 본원에서 바람직한 MRL 은 가교된 초-강성 리간드의 특이적 유형 예컨대 5,12-디에틸-1,5,8,12-테트라아자비시클로[6.6.2]헥사데칸이다. 적합한 전이 금속 MRL 은, 예를 들어 WO 00/332601 및 미국 특허 제 6,225,464 호에서 교시된 바와 같은 공지된 절차에 의해 용이하게 제조된다.

상기 지시된 같이, 본 발명의 세정 조성물은 임의의 적합한 형태로 제형화되고 제형자에 의해 선택된 임의의 방법에 의해 제조되며, 이의 비제한적 예는 모두 본원에 참고로서 인용되는 미국 특허 제 5,879,584 호, 제 5,691,297 호, 제 5,574,005 호, 제 5,569,645 호, 제 5,516,448 호, 제 5,489,392 호 및 제 5,486,303 호에 기재되어 있다.

본원에 기재된 세정 조성물은 위치 (situs) (예를 들어 표면, 식기 또는 섬유) 를 세정하는데 사용된다. 전형적으로는, 위치 중 일부 이상은 세척액 중 희석된 또는 순수 형태인 본 발명의 세정 조성물의 구현예와 접촉된 후, 상기 위치는 임의로 세정 및/또는 헹구어진다. 본 발명의 목적을 위해서, "세정" 에는 문질러 닦는 것, 및 기계적 교반이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 전형적으로는 용액 중 약 500 ppm 내지 약 15,000 ppm 의 농도로 사용된다. 세정 용매가 물인 경우, 물 온도는 전형적으로는 약 5℃ 내지 약 90℃ 의 범위이고, 위치가 섬유를 포함하는 경우, 물 대 섬유 질량비는 전형적으로는 약 1:1 내지 약 30:1 이다.

부가적인 구현예에서, 본 발명은 또한 세제 조성물 내 프로테아제의 성능을 평가하고 개선하기 위해 다양한 계면활성제 및 계면활성제 혼화물을 이용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 실험 디자인 소프트웨어를 사용하여, 액체 세탁 세제에서 가장 통상적으로 사용되는 계면활성제; 즉 선형 알킬벤젠 술포네이트 (LAS), 알킬에톡시 술페이트 (AES), 및 알콜 에톡실레이트 (AE) 의 존재하에 프로테아제의 활성을 평가하기 위해 심플렉스 격자 혼합물 실험을 디자인하였다. LAS 및 AES 는 음이온성 계면활성제인 반면, AE 는 비이온성 계면활성제이다.

놀랍게도, 프로테아제의 최적 성능을 위한 계면활성제 조성물의 선별은 간단히 프로테아제가 가장 안정한 계면활성제를 선별하는 것의 문제가 아니라는 것으로 밝혀졌다. 그보다는, 최적 계면활성제 조성물의 선별은 상이한 계면활성제를 최상의 전체 세정 결과를 제공하는 비로 조합하는 것을 기초로 하며, 다른 계면활성제의 부재하에서 사용되는 경우 계면활성제에 포함되는 혼합물은 프로테아제를 불안정화시킬 것이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 프로테아제는 제 2 계면활성제가 존재하는 경우 제 1 계면활성제의 존재하에서 더욱 잘 기능할 수 있으나 제 3 계면활성제가 존재하는 경우에는 덜 기능한다. 부가적인 구현예에서, 프로테아제는 제 2 및 제 3 계면활성제의 비에 따라 훨씬 높은 수준의 제 1 계면활성제를 용인한다. 계면활성제의 비를 주의깊게 선택한다면 상이한 계면활성제의 존재하에서 사용될 수 있는 효소는 효소의 사용을 특정 세제 조성물에 제한시키는, 효소가 그 활성에 악 영향을 주지 않는 계면활성제와의 조합으로만 사용되어야만 한다는 통상적인 믿음과 반대되는 것이 관찰되었다.

부분적으로 본원에 기재된 관찰에 근거하여, 본 발명의 조성물 및 방법은 프로테아제의 활성을 촉진시키기 위해 미리 선택된 비로 계면활성제의 화합물 및 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 세제 조성물을 제공하고, 계면활성제는 각각의 계면활성제 내 프로테아제의 안정성을 측정함으로써 간단히 선택되지 않는다. 일부 경우에서, 프로테아제는 상이한 비의, 동일한 계면활성제의 존재하에서, 또는 임의의 서브세트의 계면활성제의 존재하에서 그러나, 혼합물 중 하나 이상의 계면활성제의 부재하에서 불활성화되거나 감소된 활성을 나타낸다. 일부 경우에서, 프로테아제는 계면활성제 중 임의의 하나의 존재하에서, 혼합물 중 존재하는 다른 계면활성제의 부재하에서 불활성화되거나 감소된 활성을 나타낸다. 유사하게는, 일부 경우에서, 제 1 계면활성제의 존재는 제 2 계면활성제의 증가량으로 사용을 가능하게 하고, 제 1 계면활성제의 부재하에서 제 2 의 계면활성제의 동일량은 프로테아제의 활성을 불활성화시키거나 감소시킬 것이다.

또한, 제 1 유형의 계면활성제 (예를 들어, 비이온성 또는 음이온성 세제) 의 존재는 제 2 유형의 세제의 사용을 허용하고, 세제 제 1 유형의 계면활성제의 부재하에서 제 2 유형의 세제는 프로테아제의 활성을 불활성화시키거나 감소시킬 것이다.

이러한 실험에서, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN'-Y217L ("FNA"; Genencor) 뿐 아니라, 상기 효소의 변이체가 사용되었다. 저온 (즉, 16℃) 에서, 프로테아제는 비교적 소량의 AE 및 보다 많은 양의 AES 또는 LAS, 또는 모두를 포함하는 조성물에서 활성이었다. 비교하면, 프로테아제는 오직 AES 만, 오직 LAS 만, 특히 오직 AE 만 포함하는 조성물에서는 덜 활성이었다. 그러므로, 바람직한 조성물은 프로테아제가 가장 활성인 단일 계면활성제 만을 포함하는 것이 아니고, 2 개 이상, 바람직하게는 모든 3 개 계면활성제를 포함하는 것이고, 이중 임의의 하나는 충분한 수준으로 개별적으로 사용되는 경우, 프로테아제의 활성을 불활성화시키거나 감소시킬 것이다. 특정 비의 AES>LAS>AE 가 저온에서 상기 프로테아제에 대한 최고 결과를 산출하는 것으로 보였다.

반대로, 고온 (즉, 32℃) 에서, 프로테아제는 오직 AES 만을, 또는 LAS 와 조합으로의 AES 와 비교적 소량의 AE 를 포함하는 조성물에서 활성이었다. 그러므로, AES 에 대한 용인성은 더 높은 온도에서 증가하였고, 다른 계면활성제의 혼입을 덜 중요하게 만든다.

여러 부가적인 시험이 또한 수행되었다. 인큐베이션 후 프로테아제 활성을 AAPF-pNA 기질을 사용하여 측정하였다. 각각의 세제 제형에서 효소의 융점, Tm 을 측정하였다. 최종적으로, 4 개의 제형을 선택하고, 96 웰 검정법 결과에 대한 정정을 위해 Terg-O-Tometer 에서 시험하였다 (실시예 22 참조).

정의

다르게 지시되지 않는다면, 본 발명의 실시는 당업계 내에 있는 분자 생물학, 단백질 조작, 미생물학, 및 재조합 DNA 에 통상적으로 사용되는 통상의 기술을 포함한다. 이러한 기술은 당업자에게 알려져 있고, 다양한 교재 및 참조 논문에 기재되어 있다 (예를 들어, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition (Cold Spring Harbor), [1989]); and Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" [1987] 참조). 상기 및 하기 모두에서 본원에 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 기사 및 공보는 본원에 참조로서 여기에 명백하게 인용된다.

본원에 다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 이러한 용어의 정의를 제공하는 당업계에 알려지고 이용가능한 다양한 사전이 있다. 본원에 기재된 것과 유사거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용되지만, 바람직한 방법 및 물질은 본원에 기재된다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어는 전체로서 본 명세서를 참조로 하여 더욱 상세히 기재된다. 또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형 용어에는 문맥이 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수형 참조가 포함된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 다르게 지시되지 않는다면, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 좌에서 우로 표기하며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌에서 우로 각각 표기한다. 본 발명은 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 다양할 수 있기 때문에 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다.

본 발명의 실시는 다르게 지시되지 않는다면, 모두 당업계 내에 있는 단백질 정제, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술 및 단백질 서열분석의 통상의 기술을 사용한다.

추가로, 본원에 제공된 표제는 전체로서 명세서를 참조할 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어는 전체로서 명세서를 참조로 하여 더욱 상세히 정의된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어가 하기에 정의된다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "프로테아제," 및 "단백질분해 활성" 은 펩티드 연결을 갖는 펩티드 또는 기질을 가수분해하는 능력을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 말한다. 많은 잘 공지된 절차가 단백질분해 활성의 측정을 위해 존재한다 (Kalisz, "Microbial Proteinases," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, [1988]). 예를 들어, 단백질분해 활성은 상업적 기질을 가수분해하는 각각의 프로테아제 능력을 분석하는 비교 검정법에 의해 확인될 수 있다. 프로테아제 또는 단백질분해 활성의 분석에 유용한 예시적 기질에는, 디-메틸 카세인 (Sigma C-9801), 소 콜라겐 (Sigma C-9879), 소 엘라스틴 (Sigma E-1625), 및 소 케라틴 (ICN Biomedical 902111) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기질을 사용하는 비색 검정법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, WO 99/34011 호; 및 미국 특허 번호 6,376,450 호 참조, 둘다 본원에 참조로서 인용됨). pNA 검정법 (예를 들어, Del Mar et al., Anal. Biochem., 99:316-320 [1979]) 은 또한 구배 용리 동안 수집된 분획에 대한 활성 효소 농도를 측정하는데 사용된다. 상기 검정법은 p-니트로아닐린이 가용성 합성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐리드 (sAAPF-pNA) 를 가수분해하는 효소로서 방출되는 속도를 측정한다. 가수분해 반응으로부터의 황색조의 생성 속도는 분광광도계로 410 nm 에서 측정되고, 활성 효소 농도에 비례한다. 또한, 280 nm 에서의 흡광도 측정을 총 단백질 농도를 측정하기 위해 사용할 수 있다. 활성 효소/총-단백질 비는 효소 순도를 제공한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "바실러스 (Bacillus) 속" 에는 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 클라우시 (B. clausii), B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 서큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), 및 B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 가 포함되나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 바와 같은 "바실러스 (Bacillus)" 속명 내의 모든 종이 포함된다. 바실러스 (Bacillus) 속명에 대한 지속적인 분류학적 개편이 있다는 것으로 인지된다. 그러므로, 속명에는 이제는 "제오바실러스 스테아로테르모필루스 (Geobacillus stearothermophilus)" 라고 불리는 B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus) 와 같은 이러한 유기체를 포함하나 이에 제한되지 않는, 재분류된 종명이 포함되는 것으로 인지된다. 산소의 존재하에서의 내성 내생포자의 생성은, 상기 특성이 또한 현재 명칭 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 암피바실러스 (Amphibacillus), 아네우리니바실러스 (Aneurinibacillus), 아녹시바실러스 (Anoxybacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 필로바실러스 (Filobacillus), 그라실리바실러스 (Gracilibacillus), 할로바실러스 (Halobacillus), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 살리바실러스 (Salibacillus), 테르모바실러스 (Thermobacillus), 우레이바실러스 (Ureibacillus), 및 비르지바실러스 (Virgibacillus) 및 부가적인 유기체에 적용됨에도 불구하고, 바실러스 (Bacillus) 속명의 특징을 정의하는 것으로 간주된다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산," 은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드) 를 말한다. 상기 용어에는 단일-, 이중- 또는 삼중-가닥 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 잡종, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 기타 고유의, 화학적으로, 생화학적으로 개질된 비-고유 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예이다: 유전자, 유전자 조각, 염색체 조각, EST, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침, 및 프라이머. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 개질 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 기타 당 및 연결기, 예컨대 플루오로리보오스 및 티오에이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 방해된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "DNA 구축물" 및 "형질전환 DNA" 는 숙주 세포 또는 유기체 내로 서열을 도입하는데 사용되는 DNA 를 지칭하는데에 상호교환적으로 사용된다. 상기 DNA 는 PCR 또는 당업자들에게 공지된 임의의 기타 적당한 기술(들) 로 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 DNA 구축물은 관심 서열을 포함한다 (예를 들어, 유입 서열로서). 일부 구현예에서, 상기 서열은 제어 요소 (예를 들어, 프로모터 등) 등과 같은 추가 요소들에 작업 용액가능하게 연결된다. 상기 DNA 구축물은 선별가능 마커를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상동 박스 (homology box) 들이 측면에 위치한 유입 서열을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 형질전환 DNA 는 말단에 추가된, 기타 비-상동 서열들 (예를 들어, 스터퍼 (stuffer) 서열 또는 측면들) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 유입 서열의 말단은, 상기 형질전환 DNA 가 폐쇄된 고리를 형성하도록 폐쇄된다. 상기 형질전환 서열은 야생형이거나, 돌연변이 또는 변형된 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 DNA 구축물은 숙주 세포 염색체와 상동인 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 DNA 구축물은 비-상동 서열을 포함한다. 일단 상기 DNA 구축물이 시험관 내에서 조립되면, 이는: 1) 숙주 세포의 목적 표적 서열 내로 이종 서열 삽입, 및/또는 2) 상기 숙주 세포 염색체의 영역에 돌연변이유발 (즉, 내인성 서열을 이종 서열로 대체), 3) 표적 유전자 결실; 및/또는 4) 복제 플라스미드의 숙주 내 도입에 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현 카세트" 및 "발현 벡터" 는, 표적 세포 내 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소들을 가진, 재조합으로 또는 합성으로 생성된 핵산 구축물을 말한다. 상기 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스 또는 핵산 조각 내로 도입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분에는, 다른 서열 중에, 전사될 핵산 서열 및 프로모터가 포함된다. 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 이종 DNA 절편을 숙주 세포 내로 도입하고 발현시키는 능력을 갖고 있다. 다수의 원핵 및 진핵 발현 벡터가 시판된다. 적절한 발현 벡터를 선택하는 것은 당업자의 지식에 속한다. 용어 "발현 카세트" 는 본원에서 "DNA 구축물" 및 이들의 문법적 동등물과 상호교환적으로 사용된다. 적절한 발현 벡터를 선택하는 것은 당업자의 지식에 속한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터" 는 하나 이상의 세포 유형 내로 핵산을 도입시키도록 디자인된 폴리뉴클레오티드 구축물을 말한다. 벡터에는, 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 카세트 등이 있다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 구축물은 적당한 숙주 내에서 상기 DNA 의 발현을 유효하게 할 수 있는 적당한 전구서열 (pro서열) (예컨대, 분비성 등) 에 작업 용액가능하게 연결된 프로테아제 (예컨대, 전구체 또는 성숙 프로테아제) 를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "플라스미드" 는 클로닝 벡터로서 사용되는 환형 이중-가닥 (ds) DNA 구축물을 말하며, 이는 일부 진핵생물 또는 원핵생물에서 염색체외부 자가-복제 유전 요소를 형성하거나, 또는 숙주 염색체 내로 통합된다.

본원에서 핵산 서열을 세포 내로 도입시키는 맥락에서 사용되는 바와 같은 용어 "도입" 은 핵산 서열을 세포 내로 전달시키기에 적당한 임의의 방법을 말한다. 이러한 도입 방법으로는 원형질체 융합, 트랜스펙션, 형질전환 (transformation), 접합 및 형질도입 (transduction) 이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다 (예를 들어, Ferrari et al., "Genetics", in Hardwood et al., (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., 57-72 페이지, [1989] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "형질전환된" 및 "안정하게 형질전환된" 은 게놈 내로 통합되거나 또는 2 이상의 세대 동안 유지되는 에피솜 플라스미드로서의 비-고유 (이종) 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 세포를 말한다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계를 맺도록 위치되는 경우 "작업 용액가능하게 연결된다". 예를 들어, 분비 리더 (즉, 신호 펩티드) 를 코딩하는 DNA 는 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질 (preprotein) 로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작업 용액가능하게 연결되며; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작업 용액가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작업 용액가능하게 연결된다. 일반적으로, "작업 용액가능하게 연결된" 은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우, 인접해 있고 해독기 (reading phase) 에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 연결은 통상의 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 이루어진다. 상기 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 실행에 따라 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "유전자" 는 폴리펩티드를 코딩하고, 코딩 영역 전 후 영역뿐만 아니라, 개별 코딩 분절 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론) 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 분절) 를 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "상동 유전자" 는 상이하지만 일반적으로는 연관된 종으로부터 비롯된 유전자 쌍을 말하며, 상기 상동 유전자는 서로에게 상응하며 서로 일치하거나 또는 매우 유사하다. 상기 용어는 종분화 (즉, 신규 종의 개발) 에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 오르소로그 (orthologous) 유전자) 뿐만 아니라 유전적 복제에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 파라로그 (paralogous) 유전자) 를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질은 동일한 배열로 있고 동일한 위상 연결을 가진 동일한 주요 2 차 구조를 갖는 경우 공통의 "폴드 (fold)" 를 갖는 것으로 정의된다. 동일한 폴드를 가진 상이한 단백질은 종종 크기 및 형태가 상이한 회전 영역 및 2 차 구조의 주위 요소를 갖는다. 일부 경우, 이러한 상이한 주위 영역은 구조 절반을 포함할 수 있다. 동일한 폴드 카테고리에 함께 놓인 단백질은 반드시 공통의 진화 기원 (예를 들어, 특정 패킹 배열 및 사슬 위상을 선호하는 단백질의 물리 화학으로부터 발생하는 구조적 유사성) 을 갖지는 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "상동" 은 서열 유사성 또는 일치성을 말하며, 일치성이 바람직하다. 상기 상동은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 측정된다 (예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; 프로그램, 예컨대 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA {Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI)}; 및 Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같은 "유사 서열" 은 유전자의 기능이 BPN' 프로테아제를 기초로 한 유전자와 본질적으로 동일한 것이다. 유사 서열은 공지의 서열 정렬 방법으로 결정된다. 통상 사용되는 정렬 방법은 BLAST 이지만, 상기 및 하기에 나타나있듯이, 또한 서열 정렬에 사용될 수 있는 다른 방법도 있다.

유용한 알고리즘의 하나의 예는 PILEUP 이다. PILEUP 는 진행적, 쌍 방식 정렬을 사용하여 관련 서열 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 작성한다. 이것은 또한 정렬을 작성하는데 사용된 클러스터 관계를 보여주는 계도를 작성할 수 있다. PILEUP 는 Feng and Doolittle, (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]) 의 진행적 정렬 방법의 단순화를 사용한다. 상기 방법은 Higgins and Sharp (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]) 에 기재된 것과 유사하다. 유용한 PILEUP 파라미터는 디폴트 갭 웨이트 3.00, 디폴트 갭 길이 웨이트 0.10, 및 가중된 말단 갭을 포함한다.

또다른 유용한 알고리즘의 예는, Altschul 등 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]; 및 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]) 에 의해 기재되는 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996] 참조). WU-BLAST-2 는 다수의 검색 파라미터를 사용하는데, 이의 대부분은 디폴트 값에 맞춰진다. 조정가능한 파라미터는 하기 값을 사용해 설정된다: 오버랩 (overlap) 간격 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 단어 역치 (word threshold) (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적 값이고, 관심의 서열이 검색되는 특정 데이타베이스의 조성 및 특정 서열의 조성에 따라 다르게 프로그램 자체에 의해 성립된다. 그러나, 상기 값은 민감도를 증가시키도록 조정될 수 있다. 아미노산 서열 일치성 값 % 는 매칭하는 동일한 잔기의 수를 정렬된 영역 내 "더 긴" 서열의 잔기의 총 수로 나누어서 측정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역에서 최대의 실제 잔기를 갖는 서열이다 (정렬 점수를 최대화하기 위해 WU-Blast-2 에 의해 도입된 갭은 무시함).

그러므로, "핵산 서열 일치성의 백분율 (%)" 은 출발 서열 (즉, 관심의 서열) 의 뉴클레오티드 잔기와 일치하는 후보자 서열 내 뉴클레오티드 잔기의 % 로서 정의된다. 상기 방법은 오버랩 간격 및 오버랩 분획이 각각 1 및 0.125 인, 디폴트 파라미터로 설정된 WU-BLAST-2 의 BLASTN 모듈을 사용한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "재조합" 에는 이종 핵산 서열의 도입에 의해 개질된 세포 또는 벡터, 또는 그렇게 개질된 세포로부터 유래된 세포를 말하는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 고유의 (비-재조합) 형태 내에서 동일한 형태로 발견되지 않은 유전자를 발현하거나, 또는 고의적인 인간의 개입의 결과로서 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는, 다르게 비정상적으로 발현되는 고유의 유전자를 발현한다. "재조합," "재조합화," 및 "재조합된" 핵산의 발생은 일반적으로 2 개 이상의 핵산 조각의 조립으로, 조립물은 키메라 유전자를 산출한다.

일부 바람직한 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 하나 이상의 코돈에서의 부위 포화 돌연변이생성으로 발생된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 부위 포화 돌연변이생성은 2 개 이상의 코돈에 대해 수행된다. 추가의 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 야생형 서열과 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 또는 약 98% 초과의 상동을 갖는다. 대안적인 구현예에서, 돌연변이체 DNA 는 임의의 공지된 돌연변이화 과정 예컨대, 방사선조사, 니트로소구아니딘 등을 사용하여 생체 내에서 발생된다. 그 다음, 목적하는 DNA 서열을 단리하고 본원에 제공된 방법에 사용한다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "증폭" 및 "유전자 증폭" 은 증폭된 유전자가 게놈에 초기에 존재했던 것보다 더 높은 카피 수로 존재하게 되도록 특정 DNA 서열이 불균형하게 복제되는 과정을 말한다. 일부 구현예에서, 약물 (예를 들어 억제가능 효소의 억제제) 의 존재 하 성장에 의한 세포의 선별은 약물의 존재 하 성장에 필요한 유전자 산물을 코딩하는 내생 유전자의 증폭, 또는 이러한 유전자 산물을 코딩하는 외생 (즉, 투입) 서열의 증폭, 또는 둘 모두를 야기한다.

"증폭" 은 주형 특이성이 관여되는 핵산 복제의 특이적 경우이다. 이는 비-특이적 주형 복제 (즉, 주형-의존적이지만 특이적 주형에는 의존적이 아닌 복제) 와 대조된다. 주형 특이성은 복제의 충실도 (즉, 적당한 폴리뉴클레오티드 서열의 합성) 및 뉴클레오티드 (리보- 또는 데옥시리보-) 특이성으로 구별된다. 주형 특이성은 종종 "표적" 특이성으로 기재된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 분류하고자 하는 관점에서의 "표적" 이다. 증폭 기술은 주로 이러한 분류를 위해 디자인되었다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머" 는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하 (즉, 뉴클레오티드 및 유도제 예컨대 DNA 폴리머라아제의 존재 하, 및 적합한 온도 및 pH 에서) 에 두었을 때 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는, 정제된 제한 소화에서 자연적으로 발생하거나 합성적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 프라이머는 바람직하게는 증폭에서의 최대 효율을 위해 단일 가닥이지만, 대안적으로는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 연장 산물을 제조하기 위해 사용하기 전 그 가닥을 분리하기 위해 1 차 처리된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도제의 존재 하 연장 산물의 합성을 준비하기에 충분하게 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머 공급원 및 방법의 사용을 포함하는 많은 인자에 의존적일 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "탐침" 은 또다른 관심의 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는, 합성적으로, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되거나 정제된 제한 소화물과 같이 자연 발생되는지의 여부에 관계없는 올리고뉴클레오티드 (즉, 일련의 뉴클레오티드) 를 말한다. 탐침은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 탐침은 특정 유전자 서열의 검출, 확인 및 단리에 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 탐침은 효소 (예를 들어, ELISA 뿐만 아니라, 효소-기반 면역화학적 검정법), 형광, 방사능 및 발광 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 검출 시스템으로 검출가능하도록, 임의의 "리포터 분자" 로 표지될 것이 계획된다. 본 발명이 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 폴리머라아제 연쇄 반응과 관련하여 사용되는 경우 용어 "표적" 은, 폴리머라아제 연쇄 반응에 사용되는 프라이머에 의해 결합된 핵산의 영역을 말한다. 그러므로, "표적" 은 다른 핵산 서열로부터 색출된다. "분절" 은 표적 서열 내의 핵산의 영역으로서 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "폴리머라아제 연쇄 반응" ("PCR") 은 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,965,188 호의 방법을 말하고, 여기에는 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA 의 혼합물 중의 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키기 위한 방법이 포함된다.

표적 서열을 증폭하기 위한 상기 과정은 많은 과량의 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 도입한 후, DNA 폴리머라아제의 존재하에서 정확한 순서의 열 사이클을 진행하는 것으로 이루어진다. 2 개의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 각 가닥에 상보적이다. 증폭을 위해, 혼합물을 변성시킨 다음 프라이머를 표적 분자 내 상보적 서열에 대해 어닐링하였다. 어닐링 후, 새로운 쌍의 상보적 가닥을 형성하도록 프라이머를 폴리머라아제로 신장시킨다. 변성, 프라이머 어닐링 및 폴리머라아제 확장 단계는 고농도의, 원하는 표적 서열의 증폭된 분절을 수득하기 위해 수 회 반복될 수 있다 (즉, 변성, 어닐링 및 확장이 하나의 "사이클" 을 구성하며; 다수의 "사이클" 이 있을 수 있다). 원하는 표적 서열의 증폭된 분절의 길이는 서로에 대한 프라이머의 상대적인 위치에 의해 결정되므로, 상기 길이는 조절가능한 파라미터이다. 본 과정의 반복 양상으로 인해, 방법을 "폴리머라아제 연쇄 반응" (이하 "PCR") 이라고 부른다. 표적 서열의 원하는 증폭된 분절이 혼합물 중의 주된 서열이 되기 때문에 (농도에 있어서), 이들을 "PCR 증폭됨" 이라고 부른다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "증폭 시약" 은 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외하고 증폭에 필요한 시약 (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충액 등) 을 말한다. 전형적으로는, 다른 반응 성분과 함께 증폭 시약을 반응 용기 (시험관, 마이크로웰 등) 에 넣고 포함시킨다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "RT-PCR" 은 RNA 서열의 복제 및 증폭을 말한다. 이 방법에서는, 역전사가 PCR 에 커플링되어 있는데, 가장 흔히는 참조로서 본원에 인용된 미국 특허 제 5,322,770 호에 기술된 바와 같은 열안정 폴리머라아제를 이용하는 1 가지 효소 방법을 사용한다. RT-PCR 에서, RNA 주형은 상기 폴리머라아제의 역전사효소 활성에 기인하여 cDNA 로 변환되며, 그 후, 상기 폴리머라아제의 중합활성을 사용하여 증폭된다 (즉, 기타 PCR 방법들에서와 같음).

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소" 는 특정 뉴클레오티드 서열에서 또는 그 근처에서 이중 가닥 DNA 를 각각 절단하는 박테리아 효소를 말한다.

"제한 부위" 는 주어진 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인지 및 절단되는 뉴클레오티드 서열을 말하며, 흔히 DNA 조각의 삽입 부위이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 제한 부위는 선별 마커 및 상기 DNA 구축물의 5' 및 3' 말단 내로 조작된다.

"상동 재조합" 은 동일한 또는 거의 동일한 뉴클레오티드 서열의 부위에서의 2 개의 DNA 분자 또는 쌍을 이룬 염색체들 사이의 DNA 조각의 교환을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 염색체 통합은 상동 재조합이다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "아미노산" 은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이들의 일부를 말한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드" 는 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "관심의 단백질" 및 "관심의 폴리펩티드" 는 목적하는 및/또는 평가되는 단백질/폴리펩티드를 말한다. 일부 구현예에서, 관심의 단백질은 세포내부에서 발현되는 반면, 다른 구현예에서, 이것은 분비된 폴리펩티드이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 효소에는 본 발명의 세린 프로테아제가 포함된다. 일부 구현예에서, 관심의 단백질은 신호 펩티드와 융합된 분비된 폴리펩티드 (즉, 분비되는 단백질 상에 아미노-말단 확장) 이다. 거의 모든 분비된 단백질은 아미노-말단 단백질 확장을 사용하며, 이는 막을 가로지르는 전구체 단백질의 위치이전에, 및 상기 단백질에 표적하는데 중요한 역할을 한다. 상기 확장은 막 이동 동안 또는 그 즉시 신호 펩티다아제에 의해 단백질분해로 제거된다.

폴리뉴클레오티드는 고유의 상태에서 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조작되는 경우, 전사 및/또는 번역되어 RNA, 폴리펩티드 또는 그의 조각을 생산할 수 있는 경우 RNA 또는 폴리펩티드를 "코딩한다" 라고 언급된다. 이러한 핵산의 안티-센스 가닥도 또한 서열을 코딩하는 것으로 언급된다. 당업계에 공지된 바와 같이, DNA 는 RNA 폴리머라아제에 의해 전사되어 RNA 를 생산할 수 있으나, RNA 는 역전사효소에 의해 역전사되어 DNA 를 생산할 수 있다. 그러므로 DNA 는 RNA 를 코딩할 수 있으며 역도 성립한다.

"숙주 균주" 또는 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 DNA 를 포함하는 발현 벡터에 대한 적합한 숙주를 말한다.

효소가 상응하는 야생형 세포에서 발현되는 수준보다 높은 수준으로 세포에서 발현되는 경우 효소는 숙주 세포에서 "과발현" 된다.

용어 "단백질" 및 "폴리펩티드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)] 에 따라 정의된 아미노산에 대한 3 자리 코드가 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된다. 또한 유전적 코드의 퇴행으로 인해 폴리펩티드가 하나 초과의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다는 것이 이해된다.

"전구서열" 은, 신호 서열과 성숙 프로테아제 사이에 존재하는, 프로테아제의 분비에 필요한 아미노산 서열이다. 상기 전구서열의 절단으로 성숙 활성 프로테아제가 생성된다.

용어 "신호 서열" 또는 "신호 펩티드" 는 단백질의 성숙 또는 전구 형태의 분비에 참여할 수 있는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산의 임의 서열을 말한다. 신호 서열에 대한 이 정의는 기능상의 것으로서, 단백질 분비의 유효화에 참여하는, 상기 단백질 유전자의 N-말단 부분에 의해 코딩되는 모든 이러한 아미노산 서열들을 포함하는 것으로 의도된다. 이들은, 보편적인 것은 아니나 종종, 단백질의 N-말단 부분 또는 전구체 단백질의 N-말단 부분에 결합한다. 상기 신호 서열은 내인성일 수도 있고 외인성일 수도 있다. 상기 신호 서열은 상기 단백질 (예를 들어, 프로테아제) 에 정상적으로 결합된 것일 수 있고, 또는 또 다른 분비 단백질을 코딩하는 유전자로부터일 수도 있다. 한 가지 예시적인 외인성 신호 서열은 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) (ATCC 21536) 로부터의 서브틸리신의 신호 서열의 나머지에 융합되는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 서브틸리신으로부터의 신호 서열의 최초 7 개의 아미노산 잔기를 포함한다.

용어 "잡종 신호 서열" 은, 서열 일부가 발현될 유전자의 신호 서열에 융합되는 발현 숙주로부터 수득되는 신호 서열을 말한다. 일부 구현예에서, 합성 서열이 이용된다.

단백질 또는 펩티드의 "성숙" 형태라는 용어는 단백질 또는 펩티드의 최종적인 기능적 형태를 말한다. 예를 들어, 본 발명의 프로테아제의 성숙 형태에는 SEQ ID NO:2 의 잔기 위치 1-275 와 일치하는 아미노산 서열이 적어도 포함된다.

단백질 또는 펩티드의 "전구체" 형태라는 용어는, 상기 단백질의 아미노 또는 카르보닐 말단에 작업 용액가능하게 연결된 전구서열을 가진 단백질의 성숙한 형태를 말한다. 전구체는 또한 상기 전구서열의 아미노 말단에 작업 용액가능하게 연결된 "신호" 서열을 가질 수 있다. 상기 전구체는 또한 번역후 활성에 관련된 부가적인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이로부터 절단되어 단백질 또는 펩티드의 성숙한 형태를 남기는 폴리뉴클레오티드) 를 가질 수 있다.

"자연 발생적 효소" 는 자연에서 발견된 서열과 일치하는 미개질 아미노산 서열을 갖는 효소를 말한다. 자연 발생적 효소에는 특정 미생물에서 자연적으로 발현되거나 발견된 효소인 고유의 효소가 포함된다.

용어 "~ 로부터 유래된" 및 "~ 로부터 수득된" 은 문제의 유기체의 균주에 의해 생성되거나 생성되는 프로테아제 뿐만 아니라, 또한 그러한 균주로부터 단리된 DNA 서열에 의해 코딩되고 그러한 DNA 서열을 함유하는 숙주 유기체에서 생성된 프로테아제를 말한다. 부가적으로는, 상기 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 코딩되고 문제의 프로테아제의 확인된 특성을 갖는 효소를 말한다.

본 정의 범위 내의 "유도체" 는 일반적으로 유도체가 야생형, 고유형 또는 모체 형태로서 유사한 목적에 유용한 범위로 야생형, 고유형 또는 모체 형태에서 관찰된 단백질분해 활성 특성을 보유한다. 세린 프로테아제의 기능성 유도체는 본 발명의 세린 프로테아제의 일반적 특성을 갖는 자연 발생적, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 펩티드 또는 펩티드 조각을 포함한다.

용어 "기능성 유도체" 는 세린 프로테아제를 코딩하는 핵산의 기능적 특성을 갖는 핵산의 유도체를 말한다. 본 발명의 세린 프로테아제를 코딩하는 핵산의 기능성 유도체는 자연 발생적, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 핵산 또는 조각을 포함하고, 본 발명에 따른 세린 프로테아제 특성을 코딩한다. 본 발명에 따른 세린 프로테아제를 코딩하는 야생형 핵산에는 자연 발생적 대립유전자 및 당업계에 공지된 유전 코드의 축퇴성 (degeneracy) 에 근거한 상동이 포함된다.

2 개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥 중의 용어 "일치하는" 은 하기 서열 비교 또는 분석 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이 최대 대응에 대해 정렬되었을 때 동일한 2 개 서열 중의 잔기를 말한다.

용어 "최적 정렬" 은 가장 높은 % 일치성 점수를 제공하는 정렬을 말한다.

2 개의 아미노산, 폴리뉴클레오티드 및/또는 유전자 서열 (적합하게는) 과 관련된 "% 서열 일치성," "% 아미노산 서열 일치성," "% 유전자 서열 일치성," 및/또는 "% 핵산/폴리뉴클레오티드 서열 일치성," 은, 서열이 최적으로 정렬된 경우 2 개의 서열 중 일치하는 잔기의 % 를 말한다. 그러므로, 80% 아미노산 서열 일치성은 2 개의 최적으로 정렬된 폴리펩티드 서열 중의 아미노산의 80% 가 일치한다는 것을 의미한다.

그러므로 2 개의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 구 "실질적으로 일치하는" 은 표준 파라미터를 사용하는 프로그램 또는 알고리즘 (예를 들어, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 을 사용하여 참조 서열과 비교하여 약 70% 이상의 서열 일치성, 바람직하게는 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 바람직하게는 약 97% 이상, 바람직하게는 약 98% 이상 및 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 일치성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 2 개의 폴리펩티드가 실질적으로 일치한다는 하나의 지표는 첫번째 폴리펩티드가 두번째 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응하는 것이다. 전형적으로는, 보존 아미노산 치환에 의해 상이한 폴리펩티드는 면역학적으로 교차 반응한다. 그러므로, 폴리펩티드는 예를 들어, 2 개의 펩티드가 보존 치환에 의해서만 상이한 경우 두번째 폴리펩티드와 실질적으로 일치한다. 2 개의 핵산 서열이 실질적으로 일치한다는 또다른 지표는 2 개의 분자가 엄격한 조건 (예를 들어, 중간 ~ 높은 엄격함 범위 내) 하에서 서로 혼성화되는 것이다.

본 문맥에서 "동등한" 이라는 구는, 중간 ~ 최대 엄격함 조건 하에서, SEQ ID NO:1 에 제시된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 세린 프로테아제 효소를 말한다. 예를 들어, 동등하다라는 것은 동등한 성숙 세린 프로테아제가 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 갖는 성숙 BPN' 세린 프로테아제에 대해 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 및/또는 약 99% 이상의 서열 일치성을 포함하는 것을 의미한다.

용어 "단리된" 또는 "정제된" 은 본래 환경 (예를 들어, 자연적으로 발생되는 경우 자연 환경) 으로부터 제거된 물질을 말한다. 예를 들어, 상기 물질은 자연적으로 발생하는 또는 야생형 유기체에 존재하는 것보다 높은 또는 낮은 농도로 특정 조성물에 존재하거나 또는 자연 발생적 또는 야생형 유기체로부터 발현 시 정상적으로 존재하지 않는 성분과 함께 존재하는 경우 "정제된다" 라고 말한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않으나, 자연계 중의 공존 물질의 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 일부 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 또한, 이러한 벡터 또는 조성물은 자연 환경의 일부가 아닐수도 있다는 점에서 단리될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산 또는 단백질은, 예를 들어, 전기영동 젤 또는 블롯에서 본질적으로 하나의 밴드로 나타나는 경우 정제되었다고 말한다.

DNA 서열을 참조로 사용되는 경우 용어 "단리된" 은, 자연적인 유전 환경으로부터 제거되어 다른 외부적인 또는 원치않는 코딩 서열이 없으며, 유전공학적 단백질 제조 시스템에서 사용하기에 적합한 형태의 DNA 서열을 말한다. 이러한 단리된 분자는 자연 환경으로부터 단리된 것들이고, cDNA 및 게놈 클론이 포함된다. 본 발명의 단리된 DNA 분자는 보통 관련된 기타 유전자가 없고, 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연 발생적 5' 및 3' 미번역 영역이 포함될 수 있다. 관련 영역의 확인은 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985] 참조). 용어 "단리된 DNA 서열" 은 대안적으로는 "클로닝된 DNA 서열" 로 언급된다.

단백질을 참조로 하여 사용되는 경우, 용어 "단리된" 은, 고유의 환경 이외의 상태에서 발견된 단백질을 말한다. 바람직한 형태에서, 단리된 단백질은 다른 단백질, 특히 다른 상동 단백질이 실질적으로 없다. 단리된 단백질은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 약 10% 초과의 순도, 바람직하게는 약 20% 초과의 순도, 심지어 더욱 바람직하게는 약 30% 초과의 순도를 가질 수 있다. 발명의 추가 양상은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 고도로 정제된 형태 (즉, 약 40% 초과의 순도, 약 60% 초과의 순도, 약 80% 초과의 순도, 약 90% 초과의 순도, 약 95% 초과의 순도, 약 97% 초과의 순도, 및 심지어 약 99% 초과의 순도) 의 단백질을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "조합 돌연변이생성" 은 출발 서열의 변이체의 라이브러리가 생성되는 방법을 말한다. 상기 라이브러리에서, 변이체는 미리 정의된 일련의 돌연변이로부터 선택된 하나 또는 여러 돌연변이를 함유한다. 또한, 상기 방법은 미리 정의된 일련의 돌연변이의 일원이 아닌 랜덤 돌연변이를 도입하기 위한 수단을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에는 본원에 참조로서 인용된, 2000 년 10 월 26 일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 09/699,250 호에 언급된 것들이 포함된다. 대안적인 구현예에서, 조합 돌연변이생성 방법은 시판되는 키트 (예를 들어, QuikChange® Multisite, Stratagene, San Diego, CA) 를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "돌연변이체의 라이브러리" 는 게놈의 대부분이 일치하나, 하나 이상의 유전자의 상이한 상동이 포함되는 세포의 집단을 말한다. 이러한 라이브러리는 예를 들어, 개선된 특색을 갖는 유전자 또는 오페론을 확인하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "출발 유전자" 는 본 발명을 사용하여 개선 및/또는 변화된 관심의 단백질을 코딩하는 관심의 유전자를 말한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "다중 서열 배열" ("MSA") 은 알고리즘 (예를 들어, Clustal W) 을 사용하여 배열된 출발 서열의 다중 상동 서열을 말한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 서열" 및 "정준 서열" 은 관심의 특정 단백질 또는 서열의 모든 변이체가 비교되는 것과는 대조되는 전형적인 아미노산 서열을 말한다. 상기 용어는 또한 관심의 DNA 서열에 대부분 종종 존재하는 뉴클레오티드를 언급하는 서열을 말한다. 유전자의 각 위치에 대해, 보존 서열은 MSA 중의 위치에 가장 풍부한 아미노산을 제공한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 돌연변이" 는 출발 유전자 및 보존 서열의 서열의 차이를 말한다. 보존 돌연변이는 MSA 로부터 수득된 출발 유전자 및 보존 서열의 서열을 비교하여 확인된다. 일부 구현예에서, 보존 돌연변이가 출발 유전자 내에 도입되어, 보존 서열과 더욱 유사하게 된다. 보존 돌연변이에는 또한 출발 유전자 중의 아미노산의 빈도와 관련된 위치에서 출발 유전자 중의 아미노산이 MSA 에서 더욱 종종 발견되는 아미노산으로 변경되는 아미노산 변경이 포함된다. 그러므로, 용어 보존 돌연변이는 출발 유전자의 아미노산을 MSA 중의 아미노산보다 더욱 풍부한 아미노산으로 대체하는 모든 단일 아미노산 변화를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "초기 적중" 은 조합적 보존 돌연변이생성 라이브러리를 스크리닝하여 확인되는 변이체를 말한다. 바람직한 구현예에서, 초기 적중은 출발 유전자와 비교하여, 개선된 성능 특성을 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "개선된 적중" 은 향상된 조합적 보존 돌연변이생성 라이브러리를 스크리닝하여 확인되는 변이체를 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "개선 돌연변이" 및 "성능-향상 돌연변이" 는 출발 유전자 내로 도입되는 경우 성능을 개선시키는 돌연변이를 말한다. 일부 바람직한 구현예에서, 이들 돌연변이는 그러한 방법의 스크리닝 단계 동안 확인된 서열분석 적중에 의해 확인된다. 대부분의 구현예에서, 적중에서 더욱 종종 발견되는 돌연변이는 비스크리닝된 조합적 보존 돌연변이생성 라이브러리에 비해 개선된 돌연변이인 것 같다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "향상된 조합 보존 돌연변이생성 라이브러리" 는 CCM 돌연변이생성 및 스크리닝의 초기 조사로부터의 스크리닝 및/또는 서열분석 결과에 근거해 디자인 및 구축된 CCM 라이브러리를 말한다. 일부 구현예에서, 향상된 CCM 라이브러리는 CCM 의 초기 조사로부터 수득된 초기 적중의 서열을 근거로 한다. 부가적인 구현예에서, 향상된 CCM 은 돌연변이생성 및 스크리닝의 초기 조사로부터의 초기 적중에서 종종 발견된 돌연변이가 바람직하도록 디자인된다. 일부 바람직한 구현예에서, 이것은 성능-감소 돌연변이를 코딩하는 프라이머를 생략하거나 초기 CCM 라이브러리에 사용된 다른 프라이머에 대해 성능-향상 돌연변이를 코딩하는 프라이머의 농도를 증가시켜 달성된다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "성능-감소 돌연변이" 는 비스크리닝된 조합 보존 돌연변이생성 라이브러리와 비교하여 스크리닝으로부터 결과하는 적중에서 좀 덜 자주 발견된 조합 보존 돌연변이생성 라이브러리 중의 돌연변이를 말한다. 바람직한 구현예에서, 스크리닝 방법은 "성능-감소 돌연변이" 를 함유하는 변이체의 풍부함을 제거 및/또는 감소시킨다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "기능성 검정법" 은 단백질의 활성의 지표를 제공하는 검정법을 말한다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 용어는 단백질을 통상의 역량으로 기능하는 능력에 대해 분석하는 검정법 시스템을 말한다. 예를 들어, 효소의 경우, 기능성 검정법에는 반응을 촉진하는 효소의 유효성을 측정하는 것이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "표적 특성" 은 변경되게 되는 출발 유전자의 특성을 말한다. 본 발명이 임의의 특정 표적 특성에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다. 그러나, 일부 바람직한 구현예에서, 표적 특성은 유전자 생성물의 안정성 (예를 들어, 변성, 단백질분해 또는 다른 분해 인자에 대한 내성) 이고, 다른 구현예에서, 생성 숙주에서의 생성 수준은 변경된다. 게다가, 출발 유전자의 임의의 특성을 본 발명에서 발견할 수 있을 것으로 고려된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 핵산의 문맥에서 용어 "특성" 또는 그의 문법적인 동일어는, 선택되거나 검출될 수 있는 핵산의 임의의 특성 또는 속성을 말한다. 이러한 특성에는 폴리펩티드에 대한 결합에 영향을 주는 특성, 특정 핵산을 포함하는 세포에 부여된 특성, 유전자 전사에 영향을 주는 특성 (예를 들어, 프로모터 강도, 프로모터 인지, 프로모터 조절, 인핸서 기능), RNA 가공에 영향을 주는 특성 (예를 들어, RNA 스플라이싱, RNA 안정성, RNA 형태, 및 전사 후 개질), 전사에 영향을 주는 특성 (예를 들어, 수준, 조절, 리보솜 단백질에 대한 mRNA 의 결합, 번역 후 개질) 이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 핵산의 전사 인자, 폴리머라아제, 조절 인자 등에 대한 결합 부위는 바람직한 특성을 생성하거나 바람직하지 않은 특성을 확인하기 위해 변경될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 폴리펩티드 (단백질 포함) 의 문맥에서 용어 "특성" 또는 그의 문법적인 동일어는, 선택되거나 검출될 수 있는 폴리펩티드의 임의의 특성 또는 속성을 말한다. 이러한 특성에는 산화 안정성, 기질 특이성, 촉매 활성, 열 안정성, 알칼리 안정성, pH 활성 프로파일, 단백질분해에 대한 내성, K_M, k_cat, k_cat/k_M 비, 단백질 접힘, 면역 반응 유도, 리간드에 결합하는 능력, 수용체에 결합하는 능력, 분비되는 능력, 세포의 표면에 전시되는 능력, 올리고머를 형성하는 능력, 신호를 보내는 능력, 세포 증식을 촉진하는 능력, 세포 증식을 억제하는 능력, 세포자멸사를 유도하는 능력, 인산화 또는 글리코실화에 의해 개질되는 능력 및/또는 질환을 치료하는 능력 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "스크리닝" 은 당업계의 통상의 의미를 갖고, 일반적으로는 다단계 공정이다. 첫번째 단계에서, 돌연변이체 핵산 또는 그로부터의 변이체 폴리펩티드를 제공한다. 두번째 단계에서, 돌연변이체 핵산 또는 변이체 폴리펩티드의 특성을 측정한다. 세번째 단계에서, 측정된 특성을 상응하는 모체 핵산의 특성, 상응하는 자연 발생적 폴리펩티드의 특성 또는 돌연변이 핵산 발생에 대한 출발 물질 (예를 들어, 초기 서열) 의 특성을 비교한다.

변형된 특성을 갖는 핵산 또는 단백질의 수득을 위한 스크리닝 절차는 출발 물질의 특성에 따라 다르고, 이의 개질은 돌연변이 핵산의 발생이 용이하게 의도된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로 당업자는 본 발명이 스크리닝될 임의의 특정 특성에만 제한되는 것이 아니며, 하기 특성 기재 목록은 단지 예시로서만 설명된다는 것을 인지할 것이다. 임의의 특정 특성을 위한 스크리닝 방법은 일반적으로 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, 돌연변이화 전후로 결합, pH, 특이성 등을 측정할 수 있으며, 이의 변화는 변경을 나타낸다. 바람직하게는, 스크리닝은 칩, 파지 디스플레이, 및 복합 기질 및/또는 표시자를 사용하는 검정법을 포함하나 이에 제한되지 않게 다중 샘플을 동시에 스크리닝하는 것을 포함하는 고-처리량 방식으로 수행된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 스크리닝은 관심의 변이체를 변이체 집단으로부터 풍부하게 하는 선별 단계를 포함한다. 이들 구현예의 예에는 숙주 유기체에 대한 성장 유리성을 부여하는 변이체의 선별뿐만 아니라 파지 디스플레이 또는 임의의 기타 디스플레이 방법이 포함되며, 여기서 변이체는 결합 또는 촉매 특성에 근거한 변이체의 집단으로부터 포획될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 변이체의 라이브러리는 스트레스 (열, 프로테아제, 변성, 등) 에 노출되고, 이어서 여전히 미손상된 변이체가 스크리닝에서 확인되고 선별에 의해 풍부해진다. 상기 용어는 선별을 위해 임의의 적합한 수단을 포함하는 것으로 의도된다. 게다가, 본 발명이 임의의 특정 스크리닝 방법에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "표적 랜덤화" 는 하나 또는 여러 위치가 랜덤화된 다수의 서열을 생성하는 방법을 말한다. 일부 구현예에서, 랜덤화는 완료된다 (즉, 모든 4 개의 뉴클레오티드, A, T, G, 및 C 는 랜덤화 위치에서 일어날 수 있다). 대안적인 구현예에서, 뉴클레오티드의 랜덤화는 4 개의 뉴클레오티드의 서브세트에 제한된다. 표적된 랜덤화는 관심의 하나 또는 여러 단백질을 코딩하는, 하나 또는 여러 개의 서열 코돈에 적용할 수 있다. 발현되는 경우, 수득된 라이브러리는 하나 이상의 아미노산 위치가 랜덤화 코돈의 랜덤화 계획에 의해 측정된 바와 같이, 모든 20 개의 아미노산의 혼합물 또는 아미노산의 서브세트를 함유할 수 있는 단백질 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 표적 랜덤화로부터 발생한 집단의 개별 구성원은 코돈의 표적 또는 랜덤 삽입 또는 결실로 인해 아미노산의 수가 상이하다. 추가의 구현예에서, 합성 아미노산은 제조된 단백질 집단에 포함된다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 랜덤화로부터 생성된 집단의 대부분의 구성원은 출발 유전자보다 보존 서열에 대해 더 큰 서열 상동을 나타낸다. 일부 구현예에서, 서열은 하나 이상의 관심의 단백질을 코딩한다. 대안적인 구현예에서, 단백질은 상이한 생물학적 기능을 갖는다. 일부 바람직한 구현예에서, 유입 서열은 하나 이상의 선별가능 마커를 포함한다. 이 서열은 하나 이상의 관심의 단백질을 코딩할 수 있다. 이것은 기타 생물학적 기능을 가질 수 있다. 많은 경우, 유입 서열에는 선별가능 마커, 예컨대 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자가 포함될 것이다.

용어 "개질된 서열" 및 "개질된 유전자" 는 자연 발생적 핵산 서열의 결실, 삽입 또는 개입을 포함하는 서열을 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 개질 서열의 발현 생성물은 절단된 단백질이다 (예를 들어, 개질이 서열의 결실 또는 개입인 경우). 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 절단된 단백질은 생물학적 활성을 보유한다. 대안적인 구현예에서, 개질 서열의 발현 생성물은 신장된 단백질이다 (예를 들어, 핵산 서열 내의 삽입을 포함하는 개질). 일부 구현예에서, 삽입은 절단된 단백질을 야기한다 (예를 들어, 삽입이 정지 코돈을 형성하는 경우). 그러므로, 삽입은 발현 생성물로서 절단된 단백질 또는 신장된 단백질을 야기할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "돌연변이 서열" 및 "돌연변이 유전자" 는 상호교환적으로 사용되고, 숙주 세포의 야생형 서열에서 발생하는 하나 이상의 코돈에서 변경이 이루어진 서열을 말한다. 돌연변이 서열의 발현 생성물은 야생형과 비교해 변형된 아미노산 서열을 가진 단백질이다. 발현 생성물은 변경된 기능적 역량을 가질 수 있다 (예를 들어, 향상된 효소 활성).

용어 "돌연변이유발 프라이머" 또는 "돌연변이유발 올리고뉴클레오티드" (본원에서 상호교환적으로 사용됨) 는 주형 서열의 일부에 상응하고 그곳에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 조성물을 말하는 것으로 의도된다. 돌연변이유발 프라이머에 있어서, 프라이머는 주형 핵산에 정확하게 부합하지 않을 것이고, 프라이머에서의 미스매치(들) 은 핵산 라이브러리 내에 원하는 돌연변이를 도입하는데 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같은, "비-돌연변이유발 프라이머" 또는 "비-돌연변이유발 올리고뉴클레오티드" 는 주형 핵산에 정확하게 부합할 것인 올리고뉴클레오티드 조성물을 말한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 오직 돌연변이유발 프라이머만이 사용된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 프라이머는 하나 이상의 영역에 돌연변이유발 프라이머가 포함되고, 또한 올리고뉴클레오티드 혼합물에 포함된 또한 비-돌연변이유발 프라이머가 있도록 고안된다. 돌연변이유발 프라이머 중 하나 이상에 상응하는 돌연변이유발 프라이머 및 비-돌연변이유발 프라이머의 혼합물을 첨가하여, 다양한 조합 돌연변이 패턴이 제시된 수득되는 핵산 라이브러리를 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 돌연변이 핵산 라이브러리의 일원 중 일부는 특정 위치에서 그의 전구체 서열을 보존하는 반면, 다른 일원은 상기 위치에서 돌연변이되는 것이 바람직한 경우, 비-돌연변이유발 프라이머는 제시된 잔기에 대한 핵산 라이브러리 내 비-돌연변이 일원의 특정 수준을 수득하는 능력을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 길이가 10-50 개 염기인, 더욱 바람직하게는 길이가 약 15-45 개 염기인 돌연변이유발 및 비-돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 그러나, 원하는 돌연변이생성 결과를 얻기 위해 10 개 염기보다는 짧거나 50 개 염기보다는 긴 길이의 프라이머를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 해당하는 돌연변이유발 및 비-돌연변이유발 프라이머에 있어서, 상응하는 올리고뉴클레오티드의 길이가 일치해야할 필요는 없으나, 첨가되는 돌연변이에 상응하는 영역 중에 중복은 있다.

프라이머는 본 발명에 따른 미리 정의된 비율로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 수득되는 라이브러리가 특정의 특이적인 돌연변이의 수준이 유의하고, 동일 또는 상이한 부위에서 상이한 돌연변이의 양이 더 적은 것이 바람직한 경우, 첨가되는 프라이머의 양을 조절하여, 원하는 방향의 라이브러리를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로는, 비-돌연변이유발 프라이머를 더 적게 또는 더 많이 첨가함으로써, 상응하는 돌연변이(들) 이 돌연변이 핵산 라이브러리에서 생성되는 빈도를 조정하는 것이 가능하다.

본원에 사용되는 바와 같은, 어구 "인접 돌연변이" 는 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머 내에 존재하는 돌연변이를 말한다. 예를 들어, 인접 돌연변이는 서로 인접하거나 근처에 있을 수 있으나, 이들은 동일한 프라이머에 의해 수득되는 돌연변이 주형 핵산 내에 도입될 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 어구 "비인접 돌연변이" 는 별도의 올리고뉴클레오티드 프라이머 내에 존재하는 돌연변이를 말한다. 예를 들어, 비인접 돌연변이는 별도로 생성된 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 수득되는 돌연변이체 주형 핵산 내에 도입될 것이다.

용어 "야생형 서열" 또는 "야생형 유전자" 는 숙주 세포에서 고유의 서열 또는 자연적으로 발생하는 서열을 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 야생형 서열은 단백질 조작 계획의 시작점인 관심의 서열을 말한다. 야생형 서열은 상동 또는 이종 단백질을 코딩할 수 있다. 상동 단백질은 숙주 세포가 개입 없이 생성할 단백질이다. 이종 단백질은 숙주 세포가 개입이 없다면 생성하지 않을 단백질이다.

다르게 나타내지지 않는다면, 아미노산 위치 수는 SEQ ID NO:2 의 성숙 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 서열에 배정된 수를 말한다. 그러나 본 발명은 상기 특정 서브틸리신의 돌연변이에 제한되는 것이 아니라, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신에서 특정 확인된 잔기와 "동등한" 위치에 아미노산 잔기를 함유하는 전구체 프로테아제까지 확장된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "개질" 및 "돌연변이" 는 아미노산 서열 내의 임의의 변화 또는 변경을 말한다. 이 용어가 관심의 아미노산 서열 (예를 들어, 서브틸리신 서열) 내 아미노산 측쇄의 치환, 결실, 삽입 및/또는 대체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한 관심의 아미노산 서열 (예를 들어, 서브틸리신 서열) 의 화학적 개질을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항체" 는 면역글로불린을 말한다. 항체는 항체 생성이 바람직한 임의의 종으로부터 직접적으로 수득되는 면역글로불린을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 개질된 항체를 포함한다. 또한 상기 용어는 미손상 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 능력을 보유하는 항체 조각을 말하며 폴리클론 항체, 단일클론 항체, 키메라성 항체, 항-이디오타입 (항-ID) 항체를 포함한다. 항체 조각은 상보성 결정 영역 (CDR), 단쇄 조각 가변 영역 (scFv), 중쇄 가변 영역 (VH), 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리클론 및 단일클론 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 일부 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다.

용어 "산화에 안정한" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 절차, 예를 들어 표백제 또는 산화제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 제시된 시간에 걸쳐 특이적 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 약 1 분, 약 3 분, 약 5 분, 약 8 분, 약 12 분, 약 16 분, 약 20 분 등의 제시된 시간에 걸쳐 표백제 또는 산화제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 안정성은 실시예에 기재되는 바와 같이 측정된다.

용어 "킬레이트제에 안정한" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 절차, 예를 들어 킬레이트제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 제시된 시간에 걸쳐 특이적 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 약 10 분, 약 20 분, 약 40 분, 약 60 분, 약 100 분 등의 제시된 시간에 걸쳐 킬레이트제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 킬레이트제 안정성은 실시예에 기재되는 바와 같이 측정된다.

용어 "열적으로 안정한" 및 "열안정성" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 절차, 예를 들어 변형된 온도에 노출되는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 제시된 시간에 걸쳐 확인된 온도에 노출 후 특이적 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 효소를 말한다. 변형된 온도에는 증가 또는 감소된 온도가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 약 60 분, 약 120 분, 약 180 분, 약 240 분, 약 300 분 등의 제시된 시간에 걸쳐 변형된 온도에 노출된 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 열안정성은 실시예에 기재되는 바와 같이 측정된다.

산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "향상된 안정성" 은 기타 세린 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신 프로테아제) 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 높은 단백질분해 활성을 보유하는 것을 말한다. 산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "감소된 안정성" 은 기타 세린 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신 프로테아제) 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 낮은 단백질분해 활성을 보유하는 것을 말한다.

용어 "세정 활성" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법 동안 널리 행해지는 조건 하에서 프로테아제에 의해 달성되는 세정 성능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세정 성능은 얼룩을 표준 세정 조건에 적용 후 다양한 크로마토그래피, 분광광도계 또는 다른 정량 방법론에 의해 측정된 바와 같이 예를 들어 잔디, 혈액, 우유, 또는 계란 단백질과 같은 효소 민감성 얼룩과 관련된 다양한 세정 검정법의 적용에 의해 측정된다. 예시적 검정법에는 WO 99/34011 및 미국 특허 제 6,605,458 호 (모두 참조로서 본원에 인용됨) 에 기재된 것들뿐만 아니라, 실시예에 포함된 방법들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 프로테아제의 "세정 유효량" 은 특정 세정 조성물에서 원하는 수준의 효소 활성을 달성하는 본원에서 이전에 기재된 프로테아제의 양을 나타낸다. 이러한 유효량은 당업자에 의해 쉽게 확인되며, 사용되는 특정 프로테아제, 세정 적용, 세정 조성물의 특정 조성, 및 액체 또는 건조 (예를 들어 과립, 바) 조성물이 필요한지의 여부 등과 같은 많은 인자에 근거한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세정 보조 물질" 은, 특정 유형의 바람직한 세정 조성물 및 생성물 형태 (예를 들어 액체, 과립, 분말, 바, 페이스트, 스프레이, 정제, 젤; 또는 발포성 조성물) 로부터 선택되는 임의의 액체, 고체 또는 기체 물질을 의미하고, 상기 물질은 또한 바람직하게는 조성물에 사용되는 프로테아제 효소와 상용성이다. 일부 구현예에서, 과립 조성물은 "압축" 형태이고, 다른 구현예에서, 액체 조성물은 "농축" 형태이다.

세정 활성의 문맥에서 용어 "향상된 성능" 은 표준 세정 사이클 및/또는 다중 세정 사이클 후 통상의 평가에 의해 측정된 바와 같은 계란, 우유, 잔디 또는 혈액과 같은 특정 효소 민감성 얼룩의 증가된 또는 더 큰 세정 활성을 말한다.

세정 활성의 문맥에서 용어 "감소된 성능" 은 표준 세정 사이클 후 통상의 평가에 의해 측정된 바와 같은 계란, 우유, 잔디 또는 혈액과 같은 특정 효소 민감성 얼룩의 감소된 또는 더 적은 세정 활성을 말한다.

세정 활성의 문맥에서 용어 "비교 성능" 은 OPTIMASE™ 프로테아제 (Genencor), PURAFECT™ 프로테아제 제품 (Genencor), SAVINASE™ 프로테아제 (Novozymes), BPN'-변이체 (예를 들어 미국 특허 번호 Re 34,606 호 참조), RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE™, KANNASE™ 프로테아제 (Novozymes), MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE™ 프로테아제 (Genencor; 또한 미국 특허 번호 Re 34,606 호 및 미국 특허 번호 5,700,676 호; 5,955,340 호; 6,312,936 호; 및 6,482,628 호 참조), 및 B. 렌투스 (B. lentus) 변이체 프로테아제 제품 [예를 들어, WO 92/21760, WO 95/23221 및/또는 WO 97/07770 에 기재되어 있는 것들] 을 포함하나 이에 제한되지 않는 비교 서브틸리신 프로테아제 (예를 들어, 시판되는 프로테아제) 의 세정 활성의 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상을 말한다.

예시적인 서브틸리신 프로테아제 변이체에는 BPN' 의 위치 76, 101, 103, 104, 120, 159, 167, 170, 194, 195, 217, 232, 235, 236, 245, 248, 및/또는 252 와 동등한 잔기 위치에서의 치환 또는 결실을 갖는 변이체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 세정 성능은 표준 세정 사이클 조건 후 통상의 분광 광도적 또는 분석 방법론에 의해 측정된 바와 같은 잔디, 혈액 또는 우유와 같은 효소 민감성 얼룩에 관한 다양한 세정 검정법에서 본 발명의 프로테아제와 이러한 서브틸리신 프로테아제를 비교하여 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "섬유 세정 조성물" 에는 세탁 첨가 조성물 및 얼룩진 섬유 (예를 들어, 옷감, 린넨 및 기타 직물 물질) 의 담금 및/또는 전처리에 사용하기에 적합한 조성물을 비롯한 손세탁 및 기계 세탁 세제 조성물이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "비-섬유 세정 조성물" 에는 식기세정 세제 조성물, 구강 세정 조성물, 양치 세정 조성물, 및 개인 세정 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-직물 (즉, 섬유) 표면 세정 조성물이 포함된다.

본원의 세정 조성물의 "압축" 형태는 밀도에 의해, 그리고 조성에 있어서 무기 충전제 염의 양에 의해 가장 잘 반영된다. 무기 충전제 염은 분말 형태의 세제 조성물이 통상적인 성분이다. 통상적인 세제 조성물에서, 충전제 염은 상당한 양으로, 전형적으로 총 조성의 약 17 내지 약 35 중량% 로 존재한다. 반대로, 압축 조성물에서, 충전제 염은 총 조성의 약 15% 를 넘지 않는 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 충전제 염은 조성의 약 10 중량% 를 넘지 않는 양으로, 또는 더욱 바람직하게는 약 5 중량% 로 존재한다. 일부 구현예에서, 무기 충전제 염은 술페이트 및 클로라이드의 알칼리 및 알칼리 토금속 염으로부터 선택된다. 바람직한 충전제 염은 나트륨 술페이트이다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "계면활성제" 라는 용어는 계면 활성 특성을 갖는 것으로 당업계에서 일반적으로 인지되는 임의의 화합물을 말한다. 계면활성제에는 일반적으로, 음이온성, 양이온성, 비이온성, 및 쯔비터성 화합물이 포함되며, 이들은 본원에서 추가로 설명된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "접족" 및 "노출" 은 효소 및 계면활성제가 계면활성제에서 가용화되는 지방산을 생성함으로써 얼룩 또는 오염의 양을 적어도 부분적으로 감소시키게 할 수 있도록 유성 얼룩 또는 유성 오염과 계면활성제 및 지방분해 효소를 충분히 가깝게 두는 것을 말한다. 접촉은 세탁기, 싱크, 체표면 등에서 일어날 수 있다.

실시예

본 발명은 어떤 식으로든 청구되는 본 발명의 범주를 제한하지 않도록 의도되는 이하 실시예에서 더욱 상세히 기재되고 있다. 첨부된 도면은 본 발명의 명세서 및 기재의 완전한 일부로서 고려되는 것으로 의미된다. 하기 실시예는 청구된 본 발명을 설명하기 위해 제공되나 이를 제한하려는 것은 아니다.

하기 실험 설명에 있어서, 하기 약어가 적용된다: ppm (백만 당 부); M (몰농도); mM (밀리몰농도); μM (마이크로몰농도); nM (나노몰농도); mol (몰); mmol (밀리몰); ㎛ol (마이크로몰); nmol (나노몰); gm (그램); mg (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); pg (피코그램); L (리터); ㎖ 및 mL (밀리리터); ㎕ 및 ㎕ (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); nm (나노미터); U (단위); V (볼트); MW (분자량); sec (초); min(s) (분(s)); h(s) 및 hr(s) (시간(s)); ℃ (섭씨온도); QS (충분한 품질); ND (수행하지 않음); NA (이용불가능); rpm (분 당 회전수); H₂O (물); dH₂O (탈이온수); (HCl (염산); aa (아미노산); bp (염기쌍); kb (킬로염기쌍); kD (킬로달톤); cDNA (카피 또는 상보성 DNA); DNA (데옥시리보핵산); ssDNA (단일 가닥 DNA); dsDNA (이중 가닥 DNA); dNTP (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트); RNA (리보핵산); MgCl₂ (염화마그네슘); NaCl (염화나트륨); w/v (중량 대 부피); v/v (부피 대 부피); g (중력); OD (광학 밀도); PI (성능 지수); 둘베코 인산염 완충 용액 (DPBS); SOC (2% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto Yeast Extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl); Terrific Broth (TB; 12 g/ℓ Bacto Tryptone, 24 g/ℓ 글리세롤, 2.31 g/ℓ KH₂PO₄, 및 12.54 g/ℓ K₂HPO₄); OD₂₈₀ (280 nm 에서의 광학 밀도); OD₆₀₀ (600 nm 에서의 광학 밀도); A₄₀₅ (405 nm 에서의 흡광도); V_최대 (효소 촉매 반응의 최대 초기 속도); PAGE (폴리아크릴아미드 젤 전기영동); PBS (인산염 완충 식염수 [150 mM NaCl, 10 mM 나트륨 인산염 완충액, pH 7.2]); PBST (PBS+0.25% TWEEN® 20); PEG (폴리에틸렌 글리콜); PCR (폴리머라아제 연쇄 반응); RT-PCR (역전사 PCR); SDS (나트륨 도데실 술페이트); Tris (트리스(히드록시메틸)아미노메탄); HEPES (N-[2-히드록시에틸]피페라진-N-[2-에탄술폰산]); HBS (HEPES 완충 식염수); Tris-HCl (트리스[히드록시메틸]아미노메탄-히드로클로라이드); Tricine (N-[트리스-(히드록시메틸)-메틸]-글리신); CHES (2-(N-시클로-헥실아미노)에탄-술폰산); TAPS (3-{[트리스-(히드록시메틸)-메틸]-아미노}-프로판술폰산); CAPS (3-(시클로-헥실아미노)-프로판-술폰산; DMSO (디메틸 술폭시드); DTT (1,4-디티오-DL-트레이톨); SA (시나핀산 (s,5-디메톡시-4-히드록시 신남산); TCA (트리클로로아세트산); Glut 및 GSH (환원 글루타티온); GSSG (산화 글루타티온); TCEP (트리스[2-카르복시에틸]포스핀); Ci (큐리); mCi (밀리큐리); μCi (마이크로큐리); HPLC (고압 액체 크로마토그래피); RP-HPLC (역상 고압 액체 크로마토그래피); TLC (박층 크로마토그래피); MALDI-TOF (매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화법-비행시간형); Ts (토실); Bn (벤질); Ph (페닐); Ms (메실); Et (에틸), Me (메틸); Taq (테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) DNA 폴리머라아제); Klenow (DNA 폴리머라아제 I 대형 (Klenow) 조각); EGTA (에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산); EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산); bla (β-락타마아제 또는 암피실린-내성 유전자); HDL (고밀도 액체); MJ Research (MJ Research, Reno, NV); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, the Netherlands); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, San Jose, CA); Argo (Argo BioAnalytica, Morris Plains, NJ); Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Germany); Pall (Pall Corp., East Hills, NY); Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Woodlands, TX); Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, CA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, the Netherlands); Test Fabrics (Test Fabrics, Inc., West Pittiston, PA), Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom); OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, Ireland); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finland); Kelco (CP Kelco, Wilmington, DE); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA); Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Norway); Dynal (Dynal, Oslo, Norway); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island, NY); Sigma (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA); BD Biosciences 및/또는 Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); Mediatech (Mediatech, Herndon, VA; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ); GIBCO BRL 또는 Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Millipore (Millipore, Billerica, MA); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); NEB (New England Biolabs, Ipswich, MA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japan); Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine); Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA); Sorvall (Sorvall brand, from Kendro Laboratory Products, Asheville, NC); United States Testing (United States Testing Co., Hoboken, NJ);Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA); R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, CA); Gene Oracle (Gene Oracle, Mountain View, CA); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT); Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ); Bioke (Bioke, Leiden, The Netherlands); PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, NJ); SynPep (SynPep, Dublin, CA); New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA); Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO); Wintershall (Wintershall AG, Kassel, Germany); BASF (BASF Co., Florham Park, NJ); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT); Enichem (Enichem Iberica, Barcelona, Spain); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, the Netherlands); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, MI); 및 Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA).

실시예 1

검정법

하기 실시예에서, 판독의 용이성을 위해 하기 언급되는 바와 같은 다양한 검정법을 사용하였다. 하기 제공되는 프로토콜의 임의의 편차는 실시예에 표시된다.

A. 96 웰 마이크로타이터 플레이트 내 단백질 함량 측정을 위한 TCA 검정법

BPN' (예를 들어, 참조 프로테아제) 및 BPN' 변이체의 경우, 본 검정법은 가습 통기 및 230 rpm 에서 교반하면서 33℃ 로 3-4 일 성장시킨 마이크로타이터 플레이트로부터의 여과된 배양 상청액을 사용하여 시작하였다. 본 검정법을 위해 새로운 96 웰 평평 바닥 마이크로타이터 플레이트 (MTP) 를 사용하였다. 먼저, 각 웰에 0.25 N HCl 을 100 ㎕/웰로 넣었다. 그 다음, 50 ㎕ 의 여과된 배양 브로스를 첨가하였다. 그 다음 "빈칸" 판독값을 제공하기 위해 405 nm 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기 내 5 초 혼합 방식 사용) 를 측정하였다. 시험을 위해, 플레이트에 100 ㎕/웰의 15% (w/v) 트리클로로아세트산 (TCA) 을 넣고, 실온에서 5 내지 30 분 인큐베이션시켰다. 그 다음 405 nm 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기 내 5 초 혼합 방식 사용) 를 측정하였다.

GG36 (예를 들어, 참조 프로테아제) 및 그의 변이체의 경우, 본 검정법은 가습 통기 및 300 rpm 에서 교반하면서 37℃ 로 대략 3 일 성장시킨 마이크로타이터 플레이트로부터의 여과된 배양 상청액을 사용하여 수행하였다. 본 검정법에서, 96 웰 평평 바닥 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 의 0.25 M HCl 용액을 첨가하였다. 이어서, 여과된 배양 상청액의 25 ㎕ 분취물 (프로테아제 함유) 을 웰에 첨가하였다. 그 다음 "빈칸" 판독값을 제공하기 위해 405 nm 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기 내 5 초 혼합 방식 사용) 를 측정하였다. 이 측정 후, 각 웰에 100 ㎕ 의 30% (w/v) TCA 용액을 첨가하고, 마이크로타이터 플레이트를 실온에서 5 내지 15 분 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 405 nm 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기 내 5 초 혼합 방식 사용) 를 측정하였다.

사용된 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter) 및 SpectraMAX (유형 340; Molecular Devices) MTP Reader 였고; MTP 는 Costar (유형 9017) 이었다. 사용된 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter) 및 SpectraMAX 유형 340 (Molecular Devices) MTP Reader 였고; MTP 는 유형 9017 (Costar) 이었다.

TCA 로의 시험 판독값에서 빈칸 (TCA 없음) 을 빼서 계산하여, 샘플 내 단백질 함량의 상대적인 측정값을 제공하였다. 원한다면, 클론의 AAPF 검정법으로의 TCA 판독값을 공지된 전환 인자에 검정함으로써 표준 곡선을 생성할 수 있다. 그러나, TCA 결과는 1 ml 당 50 내지 500 단백질의 단백질 농도 (ppm) 에 대해 선형이고, 그러므로 양호한 성능 변이체를 선택하고자 하는 목적을 위해 효소 성능에 대해 직접적으로 작성될 수 있다. 샘플 내 탁도/광 산란 증가는 배양 상청액 내 침전가능한 단백질의 총 양과 상관관계가 있다.

B. 96 웰 마이크로타이터 플레이트 내 AAPF 프로테아제 검정법

본 발명의 프로테아제 및 이의 변이체의 프로테아제 활성을 측정하기 위해, N-숙시닐-L-알라닐-L-알라닐-L-프롤릴-L-페닐-p-니트로아닐리드 (suc-AAPF-pNA) 의 가수분해를 측정하였다. 사용된 시약 용액은 다음과 같았다: 0.005% TWEEN®-80 함유 100 mM Tris/HCl, pH 8.6 (Tris 희석 완충액); 10 mM CaCl₂ 및 0.005% TWEEN®-80 함유 100 mM Tris 완충액, pH 8.6 (Tris/Ca 완충액); 및 DMSO 내 160 mM suc-AAPF-pNA (suc-AAPF-pNA 저장액) (Sigma: S-7388). suc-AAPF-pNA 작업 용액 용액을 제조하기 위해, 1 ml suc-AAPF-pNA 저장액을 100 ml Tris/Ca 완충액에 첨가하고, 10 초 이상 잘 혼합하였다. 각 웰에 10 ㎕ 의 희석된 프로테아제 용액을 첨가하고, 직후에 190 ㎕ 1 mg/ml suc-AAPF-pNA 작업 용액 용액을 첨가함으로써 검정법을 수행하였다. 5 초 동안 용액을 혼합하고, 25℃ 에서, MTP 판독기로 410 nm 에서 동적 방식의 흡광도 변화 (5 분 내 20 회 판독) 를 판독하였다. 프로테아제 활성을 AU (활성 = ΔOD·분^-1 ml^-1) 로서 표현하였다.

C. 계면활성제 및 킬레이트제 안정성 검정법

AAPF 검정법을 사용하여 측정된 잔류 활성의 함수로서, LAS 및 LAS/EDTA 각각의 존재하에서 시험 프로테아제의 인큐베이션 후 LAS 및 LAS/EDTA 안정성을 측정하였다.

LAS 안정성 방법

시약:

도데실벤젠술포네이트, 나트륨 염 (=LAS): Sigma D-2525

TWEEN®-80: Sigma P-8074

TRIS 완충액 (유리산): Sigma T-1378); 6.35 g 을 약 960 ml 물에 용해시킴; 4N HCl 로 pH 를 8.2 로 조절함. TRIS 의 최종 농도는 52.5 mM 이다.

LAS 저장액: MQ 물 중 10.5% LAS 용액으로 제조함 (= 100 ml MQ 당 10.5 g)

TRIS 완충액-100 mM / pH 8.6 (100 mM Tris/0.005% TWEEN®80)

TRIS-Ca 완충액, pH 8.6 (100 mM Tris/10 mM CaCl₂/0.005% TWEEN®80).

하드웨어:

평평 바닥 MTP (Costar No. 9017)

Biomek FX

ASYS 멀티피펫

Spectramax MTP 판독기

iEMS 인큐베이터/진탕기

Innova 4330 인큐베이터/진탕기

Biohit 멀티채널 피펫

BMG Thermostar 진탕기.

52.5 mM Tris 완충액 pH 8.2 내 0.063% LAS 용액을 제조하였다. 1 ml 의 100 mg/ml suc-AAPF-pNA 저장액 (DMSO 중) 을 100 ml (100 mM) TRIS 완충액, pH 8.6 에 첨가함으로써 suc-AAPF-pNA 작업 용액 용액을 제조하였다. 상청액을 희석하기 위해, 평평 바닥 플레이트를 희석 완충액으로 채우고, 상청액의 분취물을 첨가하고 충분히 혼합하였다. 희석 비율은 성장 플레이트 (AAPF 활성) 내 프로테아제 대조군의 농도에 따라 다르다. 원하는 단백질 농도는 80 ppm 이었다.

10 ㎕ 의 희석된 상청액을 190 ㎕ 0.063% LAS 완충액/웰에 첨가하였다. 테이프로 MTP 를 덮고, 수 초 동안 흔들어, 인큐베이터 (Innova 4230) 넣어 BPN' 또는 GG36 에 대해 45℃ 에서 60 분 동안 200 rpm 로 교반하였다. 각 웰 내 혼합물 10 ㎕ 을 190 ㎕ suc-AAPF-pNA 작업 용액이 함유된 새로운 MPT 로 옮겨 인큐베이션 10 분 후 초기 활성 (t=10 분) 을 측정하였다. 상기 용액을 충분히 혼합하고, MTP 판독기 (5 분 내 25℃ 에서 20 회 판독) 를 사용하여 AAPF 활성을 측정하였다.

60 분 인큐베이션 후 인큐베이션 플레이트에서 또다른 10 ㎕ 의 용액을 제거하여 최종 활성 (t=60 분) 을 측정하였다. 그 다음 상기 기재한 바와 같이 AAPF 활성을 측정하였다. 샘플의 안정성을, 하기와 같이 잔류 및 초기 AAPF 활성의 비를 계산하여 측정하였다:

잔류 활성 (%) = [t-60 값]* 100 / [t-10 값].

LAS / EDTA 안정성 방법

정의된 조건 하에서의 인큐베이션 후 대표적인 음이온성 계면활성제 (LAS=선형 알킬벤 술포네이트, 나트륨 도데실벤젠술포네이트-DOBS) 및 디-나트륨 EDTA 의 존재 하에서의 프로테아제 변이체의 안정성을 측정하고, AAPF 검정법을 사용하여 잔류 활성을 측정하였다. 사용된 시약은 도데실벤젠 술포네이트, 나트륨 염 (DOBS, Sigma No. D-2525), TWEEN®-80 (Sigma No. P-8074), 디-나트륨 EDTA (Siegfried Handel No. 164599-02), HEPES (Sigma No. H-7523), 비-스트레스 완충액: 50 mM HEPES (11.9 g/ℓ) + 0.005% TWEEN®-80, pH 8.0, 스트레스 완충액: 50 mM HEPES (11.9 g/ℓ), 0.1% (w/v) DOBS (1 g/ℓ), 10 mM EDTA (3.36 g/ℓ), pH 8.0, 참조 프로테아제 및 프로테아제 변이체 배양 상청액 (200 - 400 ㎍/ml 단백질 함유) 였다. 사용된 기기는 희석 플레이트로서 V- 또는 U-바닥 MTP (각각 Greiner 651101 및 650161), 비-스트레스 및 LAS/EDTA 완충액 뿐 아니라, suc-AAPF-pNA 플레이트용의 F-바닥 MTP (Corning 9017), Biomek FX (Beckman Coulter), Spectramax Plus 384 MTP 판독기 (Molecular Devices), iEMS 인큐베이터/진탕기 (1 mm 진폭), Thermo Electron Corporation 사제, 밀봉 테이프: Nunc (236366) 였다.

iEMS 인큐베이터/진탕기 (Thermo/Labsystems) 를 29℃ 로 설정하였다. 비-스트레스 완충액을 함유하는 플레이트에 배양 상청액을 ~ 25 ppm 의 농도로 희석하였다 (마스터 희석 플레이트). 마스터 희석 플레이트로부터 20 ㎕ 의 샘플을 180 ㎕ 비-스트레스 완충액을 함유하는 플레이트에 첨가하여 2.5 ppm 의 최종 인큐베이션 농도를 산출하였다. 내용물을 혼합하고 실온에서 유지하고, 상기 플레이트 상에서 AAPF 검정법을 수행하였다. 또한 마스터 희석 플레이트로부터 20 ㎕ 의 샘플을 180 ㎕ 스트레스 완충액 (50 mM HEPES (11.9 g/ℓ), 0.1 % (w/v) DOBS (1 g/ℓ), 10 mM EDTA (3.36 g/ℓ), pH 8.0) 을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 용액을 혼합하고, 즉시 29℃ iEMS 진탕기에 30 분 동안 400 rpm 으로 두었다. 30 분 인큐베이션 후, 스트레스 플레이트 상에서 AAPF 검정법을 수행하였다. 샘플의 안정성을, 하기와 같이 잔류 및 초기 AAPF 활성의 비를 계산하여 측정하였다:

잔류 활성 (%) = [mOD·분^-1 스트레스]*100 / [mOD·분^-1 비-스트레스].

D. 세정 성능 검정법

프로테아제 변이체의 얼룩 제거 성능을 시판 세제에서 측정하였다. 시판 세제 제형의 가열 비활성화는 비-효소적 성분의 특성을 유지하면서 임의의 단백질 성분의 효소 활성을 파괴시키기 위한 것이다. 그러므로, 본 방법은 본 발명의 효소 변이체의 시험에 사용하기 위해 시판 세제를 준비시키는데 적합하였다.

마이크로천조각 :

CFT 에서 ¼" 원형 직경의 마이크로천조각을 주문하였다. 1 개의 마이크로천조각 또는 2 개의 마이크로천조각을 전체 표면적이 노출되도록 수직으로 (즉, 웰의 바닥에 평평하지 않게) 96 웰 MTP 의 각 웰에 놓았다.

BMI 마이크로천조각 검정법

0.25 인치 원형 직경의 혈액 우유 및 잉크 (BMI) 를 함유하는 마이크로천조각을 CFT 로부터 주문하였다. 천조각을 자르기 전에, 섬유 (EMPA 116) 를 물로 세정하였다. 1 개의 마이크로천조각을 전체 표면적이 노출되도록 수직으로 (즉, 웰의 바닥에 평평하지 않게) 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 놓았다. 원하는 세제 용액을 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 25℃ 로 Thermomixer 의 평형을 맞춘 후, 190 ㎕ 의 세제 용액을 마이크로천조각을 함유하는 MTP 의 각 웰에 첨가하였다. 상기 혼합물에, 10 ㎕ 의 희석된 효소 용액을, 최종 효소 농도가 1 ㎍/ml (BCA 검정법으로 측정됨) 이 되도록 첨가하였다. MTP 를 테이프로 밀봉하고, 1400 rpm 에서 진탕하면서 인큐베이터에 30 분 동안 두었다. 적합한 조건하에서의 인큐베이션 후, 각 웰로부터 100 ㎕ 의 용액을 새로운 MTP 로 옮겼다. 100 ㎕ 의 용액/웰을 함유하는 새로운 MTP 를 MTP SpectraMax 판독기를 사용하여 405 nm 에서 판독하였다. 빈칸 대조군 뿐 아니라, 2 개의 마이크로천조각 및 세제를 함유하나 효소는 함유하지 않는 대조군을 또한 포함시켰다.

구운 계란 마이크로천조각 검정법

상기 검정법에 사용되는 96 웰 구운 계란 노른자 기질 플레이트를 닭 계란 노른자로부터 제조하였다. 닭 계란 노른자를 흰자로부터 분리시키고, 막 낭으로부터 방출시키고, Milli-Q 물로 20% (부피/중량) 희석하였다. 희석된 노른자를 자석 막대를 사용하여 실온에서 15 분 동안 교반하였다. 8 채널 파이펫을 사용하여 96 웰 V-바닥 플레이트 (Costar #3894) 의 각 웰의 중심 내에 5 ㎕ 를 주의 깊게 피펫팅하였다. 플레이트를 90℃ 에서 1 시간 동안 굽고, 실온으로 냉각시켰다. 구운 계란 노른자 기질 플레이트를 실온에서 보관하고, 제조 1 주일 내에 사용하였다. 자동 식기 세제를 본 문헌의 그밖에 기재된 바와 같이 제조하고, 50℃ 에서 예비 가열하였다. 세제 190 ㎕ 분취물을 8 채널 파이펫을 사용하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 10 ㎕ 의 희석된 효소를 96 채널 파이펫 장치를 사용하여 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 접착 호일 밀봉지로 조심스럽게 밀봉하고, 30 분 동안 교반하면서 50℃ 에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 120 ㎕ 의 반응 혼합물을 신규 96 웰 평평 바닥 플레이트로 옮기고, 흡광도/광산란도를 405 nm 에서 측정하였다. 405 nm 에서의 흡광도/광산란도는 계란 노른자 제거와 비례한다.

계란 노른자 마이크로천조각 검정법

자동 식기 세제를 본 문헌의 그 밖에 기재된 바와 같이 제조하였다. 사용된 기기에는 New Brunswick Innova 4230 진탕기/인큐베이터 및 SpectraMAX (유형 340) MTP 판독기가 포함되었다. MTP 는 Costar (유형 9017) 로 부터 수득하였다. 숙성된 계란 노른자와 안료 천조각 (CS-38) 을 [Center for Test Materials] 로부터 구입하였다. 0.25 인치 원형 마이크로천조각으로 절단하기 전에, 섬유를 물로 세정하였다. 1 개의 마이크로천조각을 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 놓았다. 시험 세제를 50℃ 로 평형화시켰다. 190 ㎕ 의 세제 용액을 마이크로천조각이 있는 MTP 의 각 웰에 첨가하였다. 상기 혼합물에, 10 ㎕ 의 희석된 효소 용액을 첨가하였다. MTP 를 접착 호일 밀봉지로 조심스럽게 밀봉하고, 진탕하면서 30 분 동안 인큐베이터에 두었다. 인큐베이션 후, 각 웰로부터 100 ㎕ 의 용액을 신규 MTP 내로 옮겼다. 상기 MTP 를 SpectraMax MTP 판독기를 사용하여 405 nm 에서 판독하였다. 빈칸 대조군 뿐 아니라, 마이크로천조각 및 세제, 그러나 효소는 함유하지 않은 대조군을 또한 포함시켰다.

"3K" 천조각 고정:

상기 유형의 마이크로천조각을 하기 기재되는 고정 방법을 사용하여 예비처리하였다. 10 L 비이커에서 8 리터의 증류수를, 국자를 사용하여 80 ml 의 30% 과산화수소와 잘 혼합하였다. 균일하게 고정시키기 위해 용액에 첨가하기 전에 40 개 조각의 EMPA 116 천조각을 팬-유형 분배기에 펼쳐놓았다. 국자를 사용하여, 용액 중에서 천조각을 총 30 분 동안, 처음 5 분 동안은 지속적으로, 그리고 25 분 동안은 가끔 놔두면서 휘휘 저었다.

고정 과정 후, 상기 용액을 버리고 천조각을 매회 대략 6 리터의 증류수로 6 회 헹구었다. 헹군 후에, 천조각을 종이 타올 위에 올려두고 건조시켰다. 압출 프레스 상의 ¼" 원형 다이를 사용하여 공기 건조된 천조각에 구멍을 냈다. 마지막으로 1 개의 마이크로천조각을 전체 표면적이 노출되도록 수직으로 (즉, 웰의 바닥에 평평하지 않게) 96 웰 MTP 의 각 웰에 놓았다.

"예비 세정된 " 천조각

상기 유형의 마이크로천조각을 탈이온수에서 20 분 동안 주위 온도에서 예비 세정하였다. 예비 세정 단계 후, 천조각을 페이퍼 타올에 올려두고 건조시켰다. 그 다음 공기 건조된 천조각을 배출 프레스 상의 ¼" 원형 다이를 사용하여 펀칭하였다. 마지막으로, 2 개의 마이크로천조각을 전체 표면적이 노출되도록 수직으로 (즉, 웰의 바닥에 평평하지 않게) 96 웰 MTP 의 각 웰에 놓았다.

세제

북미 (NA) 및 서유럽 (WE) 강력 액체 세탁 (HDL) 세제에 있어서 2 시간 동안 95℃ 의 수조에 (유리병에서) 미리 칭량된 액체 세제를 넣어 가열 비활성화를 수행하였다. 북미 (NA) 및 일본 (JPN) 강력 과립 세탁 (HDG) 세제의 가열 비활성화에 대한 인큐베이션 시간은 8 시간이었고, 서유럽 (WE) HDG 세제에 대한 인큐베이션 시간은 5 시간이었다. NA 및 WE 자동 식기 세정 (ADW) 세제의 가열 비활성화에 대한 인큐베이션 시간은 8 시간이었다. 상기 세제를 지역 슈퍼마켓 가게에서 구입하였다. 비-가열 및 가열된 세제 모두를, 세제가 용해되는 5 분 내에 검정하여, 비활성화된% 를 정확하게 측정하였다. 효소 활성을 AAPF 검정법으로 시험하였다.

세제의 작업 용액 용액을 가열 비활성화된 저장액으로부터 제조하였다. 모든 세제는 시판 세제였다. 적절한 양의 물 경도 (6 gpg 또는 12 gpg) 및 완충액을 목적한 조건에 부합하도록 세제 용액에 첨가하였다 (표 1-1). 병을 와류교반 (vortexing) 또는 상하교반 (inverting) 시켜 용액을 혼합하였다.

마이크로천조각에 대한 참조 세린 프로테아제 및 이의 변이체의 얼룩 제거 성능을 시판 가열 비활성화 세제 (Calgonit 5 in 1) 에서 MTP 규모에 대해 측정하였다. 사용된 시약은 다음과 같았다: 5 mM HEPES, pH 8.0 또는 5 mM MOPS, pH 7 완충액, 중간 물 경도의 경우 3:1 Ca:Mg (CaCl₂:MgCl₂·6H₂O); 6 gpg (갤론 당 그레인) 로 희석되는 15000 gpg 저장액, 플레이트 당 2 개의 BMI (혈액/우유/잉크) 천조각: CFT 에 의해 가공된 EMPA-116 BMI 면 천조각: 웰 당 예비로 헹구고 펀칭된 2 개의 천조각, 및 프로테아제 활성이 결여된 것으로 확인된 가열 비활성화 TIDE® 2X Cold 재고품 세제.

인큐베이터를 바람직한 온도 (16℃ 또는 32℃) 로 설정하였다. 약 10 ppm 효소의 마스터 희석 플레이트로부터 10 ㎕ 샘플을 상기 열거된 작업 용액 세제 용액 190 ㎕ 가 있는 BMI 2-천조각 플레이트에 첨가하였다. 검정법 플레이트에서 변이체에 대해 0.5 ppm 의 최종 농도를 산출하도록 부피를 조정하였다. 플레이트를 즉시 iEMS 인큐베이터로 옮기고, 제시된 온도에서 1400 rpm 진탕하면서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 ㎕ 의 상청액을 신규 96 웰 플레이트로 옮기고, 흡광도를 405 nm 및/또는 600 nm 에서 MTP 판독기에서 측정하였다. 1 또는 2 개의 마이크로천조각 및 프로테아제 샘플을 첨가하지 않은 세제를 함유하는 대조군 웰을 또한 시험에 포함시켰다. 405 nm 에서의 측정은 더 높은 값을 제공하고 안료 제거를 추적하는 반면, 600 nm 에서의 측정은 탁도 및 세정을 추적한다.

모든 마이크로천조각 검정법 방법에 대한 얼룩 제거 활성의 계산:

수득된 흡광도 값을 빈칸 값 (효소 없이 기질만) 에 대해 교정하여, 가수분해 활성의 측정값을 제공하였다. 각 샘플 (변이체) 에 대해 성능 지수를 계산하였다. 성능 지수는 동일한 단백질 농도에서의 변이체의 성능 (실제 값) 과 표준 효소 (이론 값) 를 비교한다. 또한, 표준 효소의 랭뮤어 (Langmuir) 방정식의 파라미터를 사용하여 이론 값을 계산할 수 있다.

효소 및 기기

참조 세린 프로테아제 이의 변이체의 샘플을 MTP 플레이트에서 성장한 배양물의 여과된 배양 브로스로부터 수득하였다. 사용된 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter), SpectraMAX MTP Reader (유형 340; Molecular Devices), iEMS 인큐베이터/진탕기 (Thermo/Labsystems); F-바닥 MTP (인큐베이션 후 반응 플레이트 판독에 사용되는 Costar 유형 9017); 및 V-바닥 MTP (상청액의 예비 희석에 사용되는 Greiner 651101) 였다. 본 검정법에서, 프로테아제는 기질을 가수분해하여, 기질로부터 안료 및 불용성 입자를 방출시킨다. 그러므로 탁도 비는 효소 활성의 측정값이다.

E. 프로테아제 및 이의 변이체의 상대적인 특이적 활성

프로테아제 변이체를 구별하기 위해서, 변이체 대 야생형 또는 표준 프로테아제의 비교 및 순위를 가능하게 하는, 기질로서 suc-AAPF-pNA 를 사용하여 상대적인 특이적 활성을 계산하였다. suc-AAPF-pNA 기질 상의 특이적 활성을 상기 기재된 검정법을 사용하여 각 샘플의 측정된 TCA-값에 의해 가수분해 활성을 나누어 측정하였다. 이러한 값을 사용하여, 상대적인 특이적 활성을 계산하였다 (변이체의 특이적 활성/참조 프로테아제의 특이적 활성).

F. 식기세정 성능

프로테아제 변이체의 성능을 다양한 자동 식기세정 조건하에서 시험하였다. 식기 세제의 조성은 하기 표에 제시된다. 이러한 세제는 wfk Testmaterials (www.testgewebe.de/en/products/detergents/) 로부터 시판되고, 그들의 wfk Testmaterials 명칭으로 불린다. 이러한 세제는 프로테아제 변이체의 분석을 가능하게 하기 위해서, 효소의 존재 없이 공급원으로부터 수득된다.

얼룩 유형 (계란 노른자, 다진 고기 및 계란, 및 계란과 우유) 의 각 조제물에 대한 프로토콜이 하기에 제시되어 있다. 별도의 오염 유형을 시험 디쉬에 적용하기 전에, 디쉬를 전체적으로 세정하였다. 이것은 특정 영구 얼룩의 잔여물이 이전 시험으로부터 디쉬 상에 존재할 수 있으므로 특히 필요하다. 또한 새로운 디쉬도 시험에서 첫번재 사용하기 전에 전체적으로 3 회 세정하였다.

스테인레스 스틸 상의 계란 노른자 얼룩 제조

상기 실험에서 사용되는 스테인레스 스틸 시트 (10 x 15 cm; 한 면에 브러쉬질 됨) 를 고 알칼리성 시판 세제 (예를 들어, ECOLAB® 세제; Henkel) 로 95℃, 실험실 식기세척기에서 전체적으로 세정하여, 깨끗하고 기름기가 없도록 하였다. 상기 시트를 처음 사용 전에 물기를 제거하였다. 시트를 계란 노른자로 오염시키기 전 80℃, 열 캐비넷에서 30 분 동안 건조시켰다. 브러쉬질 될 면은 오염 전에 건드리지 않았다. 또한 표면 상에 물 얼룩 또는 보풀이 없도록 하였다. 냉각된 시트를 오염 전에 칭량하였다.

계란 노른자를 흰자로부터 대략 10-11 개의 계란 노른자 (200 g 의 계란 노른자) 를 분리하여 준비하였다. 유리 비이커 내에서 노른자를 포크로 교반하여 노른자 현탁액을 균질화하였다. 그 다음 노른자를 걸러내어 (대략 0.5 mm 메쉬) 거친 입자 및 임의의 계란 껍질 조각을 제거하였다.

평평한 브러쉬 (2.5") 를 사용하여 2.0 ± 0.1 g 계란 노른자 현탁액을 스테인레스 스틸 시트의 각 브러쉬질 된 면 상에, 대략 1 ㎝ 폭의 미오염된 가장자리를 남기고 (필요하면 부착 테이프를 사용함) 140 ㎠ 의 면적에 가능한 한 평평하게 적용하고, 오염된 시트를 실온에서 4 시간 동안 (최대 24 hr) 수평으로 (시트의 모서리에 방울이 형성되는 것을 방지하기 위해) 건조시켰다.

계란 노른자 단백질을 변성시키기 위해, 시트를 30 초 동안 끓는, 탈염수 (필요한 경우 유지 장치를 사용함) 에 함침시켰다. 그 다음 시트를 다시 30 분 동안 80℃ 에서 건조시켰다. 건조 및 냉각 후, 시트를 칭량하였다. 칭량 후, 시트를 세정 시험에 적용하기 전 24 시간 이상 (20℃, 40-60% 상대 습도) 방치하였다. 시험 조건을 충족시키기 위해, 1000 ± 100 mg/140 ㎠ (변성 후 계란 노른자) 가 있는 시트만을 시험에 사용하였다. 세정 시험을 수행한 후, 시트를 80℃, 열 캐비넷에서 30 분 동안 건조시키고 냉각 후 다시 칭량하였다. % 세정 성능을 세정시 방출된 계란 노른자의 mg 을 적용된 변성된 계란 노른자 mg 로 나누고 100 을 곱하여 측정하였다.

포슬린 플레이트 상의 다진 고기 및 계란 얼룩의 제조

본 실험을 위해, EN 50242 에 따른, 형태 1495, No. 0219 디저트 플레이트 (Arzberg, 19 cm 직경, 백색, 광택 포슬린) 를 사용하였다. 총 225 g 순살 돼지고기 및 소고기 (50:50 비) 를 잘게 썰고 냉동으로 유지하였다. 혼합물을 다짐기에 2 회 통과시켰다. 35℃ 초과의 온도는 피했다. 그 다음 225 g 의 다짐육을 75 g 의 계란 (흰자 및 노른자 함께 섞임) 와 혼합하였다. 그 다음 사용 전 조제물을 -18℃ 에서 3 개월 이하 동안 동결시켰다. 돼지고기가 이용가능하지 않다면, 100% 소고기를 사용하였고, 그 반대도 가능하다. 다짐육 및 계란 혼합물 (300 g) 을 실온이 되게 하고 80 ml 탈염수와 혼합하였다. 그 다음 혼합물을 주방용 핸드 블렌더를 사용하여 2 분 동안 균질화하였다. 포크를 사용하여 각각의 백색 포슬린 플레이트에 3 g 의 다짐육/계란/물 혼합물을 바르고, 테두리 주변에 대략 2 cm 폭의 미오염된 가장자리를 남겨두었다. 적용된 양은 11.8 ± 0.5 mg/㎠ 였다. 플레이트를 2 시간 동안 12O℃, 예열된 열 캐비넷에서 건조시켰다. 플레이트가 냉각되지마자, 사용을 위해 준비시켰다. 식기 세정 시험을 수행한 후, 다짐육 단백질 잔여물의 보다 양호한 확인을 위해 플레이트에 닌히드린 용액 (에탄올 내 1 % 로 제조됨) 을 분사하였다. 색조 반응을 촉진시키기 위해, 플레이트를 80℃, 열 캐비넷에서 10 분 동안 가열하였다. IKW 사진 카달로그 (IKW - The German Cosmetic, Toiletry, Perfumery and Detergent Association) 를 참조로 하여 다짐육 잔여물의 색조 반응을 시각적으로 조사하여 세정 성능의 평가를 수행하였다.

스테인레스 스틸 상의 계란/우유 얼룩의 제조

상기 실험에서 사용되는 스테인레스 스틸 시트 (10 x 15 cm; 한 면에 브러쉬질 됨) 를 고 알칼리성 시판 세제로 95℃, 실험실 식기세척기에서 전체적으로 세정하여, 기름기를 제거하고 시트를 세정하였다. 상기 시트를 셀룰로오스 천으로 광을 내어 건조시켰다. 브러쉬질 될 면은 오염 전에 건드리지 않았다. 또한 표면 상에 물 얼룩 또는 보풀이 없도록 하였다. 오염 전 80℃, 열 캐비넷에 30 분 동안 시트를 두었다. 냉각된 시트를 오염 전에 칭량하였다.

전체 생 계란 (3-4 개의 계란; 대략 160 g/계란) 의 계란 노른자 및 흰자를 그릇에 두고, 계란 거품기로 휘저었다. 그 다음, 50 ml 반-탈지유 (1.5% 지방, 초고온, 균질화됨) 를 혼합물에 첨가하였다. 거품을 발생시키지 않으면서 우유 및 계란을 혼합하였다. 평평한 브러쉬를 사용하여 스테인레스 스틸 시트의 브러쉬질 된 면 상에 1.0 ± 0.1 g 의 계란/우유 혼합물을, 분배를 체크하는 저울을 사용하여 균일하게 분배하였다. 시트의 짧은 면 주위에 대략 1.0 cm 의 가장자리를 남겨두었다. 오염된 시트를 실온에서 4 시간 동안 (최대 24 hr) 수평으로 (시트의 모서리에 방울이 형성되는 것을 방지하기 위해) 건조시켰다.

그 다음, 시트를 30 초 동안 끓는, 탈염수 (필요한 경우 유지 장치를 사용함) 에 함침시켰다. 그 다음 시트를 다시 30 분 동안 80℃ 에서 건조시켰다. 건조 및 냉각 후, 시트를 칭량하였다. 칭량 후, 시트를 세정 시험에 적용하기 전 24 시간 이상 (20℃, 40-60% 상대 습도) 방치하였다. 시험 조건을 충족시키기 위해, 190 ± 10 mg 계란 노른자/우유가 있는 시트만을 시험에 사용하였다. 세정 시험을 수행한 후, 시트를 80℃, 열 캐비넷에서 30 분 동안 건조시키고 냉각 후 다시 칭량하였다. % 세정 성능을 세정시 방출된 계란/우유의 mg 을 적용된 변성된 계란/우유 mg 로 나누고 100 을 곱하여 측정하였다.

세정 기기 및 조건

상기 기재된 바와 같이 제조된 오염된 디쉬 및 스테인레스 스틸 시트가 장착된 자동 식기세정기 (Miele 모델 G690SC) 에서 세정 시험을 수행하였다. 규정된 양의 세제를 사용하였다. 시험된 온도는 50℃ 였다. 물 경도는 21° GH (German 경도) 였다. 상기 기재된 바와 같이, 세정 후 다짐육으로 오염된 플레이트를 0 내지 10 의 사진 비율 척도를 사용하여 시각적으로 평가하였고, "0" 은 완전히 더러운 플레이트를 나타내며 "10" 은 깨끗한 플레이트를 나타낸다. 상기 값은 효소-함유 세제의 얼룩 또는 오염 제거 (SR) 능력에 상응하였다. 계란 노른자 또는 계란 노른자/우유로 오염된 세정된 스테인레스 스틸 플레이트를 중량법으로 분석하여 세정 후 잔류 얼룩의 양을 측정하였다. 변이체 프로테아제를 세정 당 0 내지 30 mg/활성 단백질 수준에서 시험하였다.

G. 에글린 ( Eglin ) C 억제 검정법

본원에 기재된 바와 같이, 세린 프로테아제 농도 및 특이적 활성을 억제제로의 적정에 의해 측정하였다. 거머리 히루도 메디시날리스 (Hirudo medicinalis) 로부터의 에글린 c 는 서브틸리신 및 ASP 프로테아제의 단단한 결합 단백질 억제제이고 (Heinz et al., Biochemistry, 31: 8755-66, 1992), 그러므로 효소 농도 측정에 사용될 수 있고, 특이적 활성을 계산할 수 있다. 간략하게는, 여러 공지된 농도의 에글린 c 에 의해 생성되는 효소 억제의 양을 측정한다. 상기 정보로부터, 완전한 억제에 필요한 에글린 c 의 농도를 계산한다. 이것은 샘플 내 효소 농도와 동등하다.

프로테아제 활성을 상기 기재된 색소생산성 AAPF 검정법을 사용하여 측정하였다. 표준 방법에 의해 에글린 c 에 대한 유전자를 합성하고, E. 콜라이에서 발현시켰다. 이의 특성 및 억제 잠재력은 Sigma 에서 구입한 에글린 c 와 동일하였다. 공지된 특이적 활성의 바실러스 렌투스 서브틸리신의 샘플의 억제를 측정하여 에글린 c 저장액의 농도를 측정하였다. 그 다음 검정된 에글린 c 샘플을 사용하여 서브틸리신 변이체의 농도 및 특이적 활성을 측정하였다. 상기 값을 사용하여 표준화된 96 웰 효소 저장 플레이트를 제작하고, 모든 변이체를 공통 농도로 희석하였다.

H. 성능 지수

성능 지수를 동일한 단백질 농도에서 변이체의 성능 (실제 값) 과 표준 효소 (이론 값) 와 비교한다. 또한, 표준 효소의 랭뮤어 (Langmuir) 방정식의 파라미터를 사용하여 이론 값을 계산할 수 있다.

1 보다 큰 성능 지수 (PI) (PI>1) 는 표준 (예를 들어, 야생형) 보다 양호한 변이체를 확인시켜주며, 1 의 PI (PI=1) 는 표준과 동일한 성능을 하는 변이체를 확인시켜주며, 1 미만의 PI (PI<1) 는 표준보다 열악한 성능의 변이체를 확인시켜준다.

그러므로, PI 는 특정 환경 하에서 사용하기에 덜 바람직한 변이체 뿐 아니라 승자 변이체를 확인시켜준다.

실시예 2

B. 서브틸리스 내 BPN' 프로테아제의 제조

본 실시예에서는, B. 서브틸리스 내 BPN' 프로테아제를 제조하기 위해 수행된 실험을 기재하고 있다. B. 서브틸리스 내로의 플라스미드 pHPLT-BPN' 의 형질전환을 당업계에 공지된 바와 같이 수행하였다 (예를 들어, 본원에 참조로서 인용된 WO 02/14490 참조). 하기 제시된 DNA 서열 (B. 아밀로퀘파시엔스로부터의 aprE-BPN' 잡종 선도자, BPN' 프로 및 BPN' 성숙 DNA 서열) 은 BPN' 전구체 단백질을 코딩한다:

상기 서열에서, 굵은 글씨체는 성숙 프로테아제를 코딩하는 DNA 를 표시하고, 일반 글씨체는 선도자 서열 (aprE-BPN' 잡종 선도자) 을 표시하고, 밑줄은 프로 서열 (BPN') 을 표시한다. BPN' 전구체 단백질의 아미노산 서열 (aprE-BPN' 잡종 선도자, BPN' 프로 및 BPN' 성숙 DNA 서열) 이 하기에 제시된다. 본 서열에서, 굵은 글씨체 및 밑줄은 성숙 BPN' 프로테아제를 나타낸다.

BPN' 발현 벡터 ( pHPLT - BPN' ) 의 구축

pJH101term 을 사용하여 TGO 폴리머라아제 (Roche Diagnostics) 로의 표준 조건을 사용하여 PCR 조각을 수득하였다. 플라스미드 pJH101 은 EcoRI/BamHI 부위 내에 삽입된 하기 조각을 갖는 pJH101 (Ferrari et al., J Bacteriol, 154:1513-5 [1983]) 에 상응한다:

상기 조각은 융합 신호 서열 (B. 서브틸리스의 aprE 신호 서열의 첫번째 8 개의 아미노산 다음 9 번째 아미노산에서 시작하는 B. 아밀로리퀘파시엔스의 BPN' 신호 서열을 가지고 있음) 을 갖는 BPN' 유전자를 가지고 있다. 상기 조각은 하기 프라이머: 번역 정지 코돈의 HpaI 부위 하류방향을 도입하는, BPN' 성숙 유전자의 3' 말단에 어닐링하는 AK04-14: GtcctctgttaacTTACTGAGCTGCCGCCTGTAC (SEQ ID NO:4); 및 5' 말단에 NheI 부위를 도입하는, BPN' 신호 서열의 5' 말단에 어닐링하는 AK04-21.1: TTATGCG AGgctagcaaaaggagagggtaaagagtgagaagc (SEQ ID NO:5) 를 사용하는 PCR 반응에 대한 주형으로서 사용되었다.

상기 반응으로부터 수득된 PCR 조각을 표준 조건을 사용하여 Qiagen PCR 세정 키트로 세정하였다. 세정된 조각을 표준 조건하에서 제한 효소 NheI 및 HpaI 으로 소화시킨 후, 이것을 LAT 프로모터를 가지고 있는 NheI/HpaI 소화된 벡터 (pHPLT-VAAc1, US2006/0014265 에 기재됨 및 도 3A 참조) 내로 라이게이션하였다.

이어서, pHPLT-BPN' 라이게이션 혼합물을 본원에 참조로서 인용된 WO 02/14490 호에 기재된 바와 같이 B. 서브틸리스 내로 형질전환시켰다 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK). pHPLT-BPN' 벡터 (도 3B 참조) 를 갖고 있는 B. 서브틸리스 형질전환체의 선별적 성장을 20 mg/L 네오마이신을 함유하는 진탕 플라스크 내 25 ml MBD 배지 (MOPS 기재 규정 배지) 에서 수행하였다. 형질전환된 세포의 인큐베이션을 가수분해 활성을 갖는 분비된 BPN' 프로테아제의 생성을 야기하였다. NuPage Novex 10% Bis-Tris 젤 (Invitrogen®, Catalog No. NP0301BOX) 을 사용하여 젤 분석을 수행하였다. 분석을 위한 샘플을 제조하기 위해, 2 부피의 상청액을 1 부피 1M HCl, 1 부피 4X LDS 샘플 완충액 (Invitrogen®, Catalog No. NP0007), 및 1% PMSF (20 mg/ml) 와 혼합하고, 이어서 10 분 동안 70℃ 에서 가열하였다. 그 다음, 25 ㎕ 의 각각의 샘플을 10 ㎕ 의 SeeBlue plus 2 미리 염색된 단백질 표준 (Invitrogen®, Catalog No.LC5925) 과 함께 젤 상에 로딩하였다. 결과는 본 실시예에 기재된 BPN' 클로닝 전략이 B. 서브틸리스에 의해 생성된 활성 BPN' 를 산출한다는 것을 명확하게 증명하였다.

실시예 3

BPN' 부위 평가 라이브러리 및 다중 돌연변이 라이브러리의 생성

본 실시예에서는, BPN' 변이체의 구축이 기재되어 있다.

BPN' 부위 평가 라이브러리 ( SEL ) 구축

BPN' 발현 카세트를 가지고 있는 pHPLT-BPN' 벡터를 주형 DNA 로서 사용하였다. 상기 벡터는 독특한 BgKI 제한 부위를 가지고 있고, 이것은 SEL 구축에 유용하였다. Invitrogen® (탈염됨, 50 nmol 규모) 에 의해 합성되고 표 7-1 에 열거된 프라이머를 사용하여 라이브러리 생성하였다. BPN' SEL 을 구축하기 위해, 3 회의 PCR 증폭을 수행하였다: 성숙 BPN' DNA 서열 내 관심의 돌연변이된 코돈을 도입하기 위한 2 회의 돌연변이생성 PCR 및 성숙 BPN' 서열 내 원하는 돌연변이된 코돈을 갖는 pHPLT-BPN' 발현 벡터를 구축하기 위해 2 개의 돌연변이생성 PCR 을 융합시키기 위한 제 3 PCR. 돌연변이생성의 방법은 코돈-특이적 돌연변이 접근법에 기재하고 있다. 이 방법에서, 특이적 DNA 3 개쌍 내 한번에 따로 모든 가능한 돌연변이의 제작을 돌연변이될 코돈의 서열에 상응하는 특이적 디자인된 3 개쌍 DNA 서열 (NNS, N = A, C, T 또는 G, 및 S = C 또는 G) 을 둘러싸는 25 내지 45 개 길이의 뉴클레오티드를 갖는 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행한다. 이것은 특이적 BPN' 성숙 코돈에서의 뉴클레오티드의 랜덤 혼입을 보장한다. 프라이머 명칭에서 열거된 수는 (표 3-1) 특이적 BPN' 성숙 코돈 위치에 상응한다. SEL 을 구축하는데 사용되었던 2 개의 부가적인 프라이머는 BgKI 제한 부위 측면의 pHPLT-BPN' DNA 서열 부분과 함께 BgKI 제한 부위를 함유하였다.

각각의 SEL 의 구축은 pHPLT-BglII-FW 프라이머 및 특이적 BPN' 역방향 돌연변이생성 프라이머, 및 제 2 PCR 증폭을 위해 pHPLT-BglII-RV 프라이머 및 특이적 BPN' 정방향 돌연변이생성 프라이머 (정방향 및 역방향 돌연변이생성 프라이머에 대한 동일한 BPN' 성숙 코돈 위치) 를 사용하여 2 회의 1 차 PCR 증폭으로 시작하였다. 성숙 BPN' 서열 내 돌연변이의 도입은 Finnzymes Phusion High-Fidelity DNA 폴리머라아제 (Catalog No. F-530L) 를 사용하여 수행하였다. 모든 PCR 증폭을 폴리머라아제가 보충된 Finnzymes 프로토콜에 따라 실행하였다. PCR 조건은 다음과 같았다:

5X Phusion HF 완충액 10 ㎕

10 mM dNTP 혼합물 1 ㎕

Phusion DNA 폴리머라아제 0.75 ㎕ (2 유닛/ ㎕)

DMSO, 100% 1 ㎕

pHPLT-BPN' 주형 DNA 1 ㎕ (0.1 - 1 ng/ ㎕)

증류된, 오토클레이브된 물 50 ㎕ 이하

내,

1 차 PCR 1 의 경우:

pHPLT-BglII-FW 프라이머 및 특이적 BPN' 역방향 돌연변이생성 프라이머 - 둘다 1 ㎕ (10 μM); 및

제 1 차 PCR 2 의 경우:

pHPLT-BglII-RV 프라이머 및 특이적 BPN' 정방향 돌연변이생성 프라이머 - 둘다 1 ㎕ (10 μM);

하기 PCR 프로그램: 30 초 98℃, 30X (10 초 98℃, 20 초 55℃, 1 분 72℃) 및 5 분 72℃ 의, MJ Research (Location) PTC-200 Peltier 열 증폭기를 사용하여 PCR 을 완료하였다. 반응은 대략 2 내지 3 kB 길이의 2 개의 조각을 산출하고, 이것은 관심의 BPN' 성숙 코돈 주변의 약 30 개의 뉴클레오티드 염기 중복을 가졌다. 2 개의 상기 언급된 조각 및 정방향 및 역방향 BglII 프라이머를 사용하여 제 3 반응에서 조각을 융합하였다. 융합 PCR 반응을 하기와 같이 수행하였다:

pHPLT-BglII-FW 프라이머 및 pHPLT-BglII-RV 프라이머 - 둘다 1 ㎕ (10 μM)

5X Phusion HF 완충액 10 ㎕

10 mM dNTP 혼합물 1 ㎕

Phusion DNA 폴리머라아제 0.75 ㎕ (2 유닛/㎕)

DMSO, 100% 1 ㎕

1 차 PCR 1 반응 혼합물 1 ㎕

1 차 PCR 2 반응 혼합물 1 ㎕

증류된, 오토클레이브된 물 50 ㎕ 이하

하기 PCR 융합 프로그램은 하기와 같았다: 30 초 98℃, 30X (10 초 98℃, 20 초 55℃, 2:05 분 72℃) 및 5 분 72℃, MJ Research® PTC-200 Peltier 열 증폭기를 사용.

Qiagen® Qiaquick PCR 정제 키트 (Catalog No. 28106) 를 사용하여 증폭된 선형 4.8 Kb 조각을 정제하고, BglII 제한 효소로 소화시켜, 융합 조각의 양 면에 응집 말단을 제작하였다. 소화 반응물은 하기를 함유하였다:

- 35 ㎕ 정제된 선형 DNA 조각

- 4 ㎕ React® 3 완충액 (Invitrogen®)

- 1 ㎕ BglII, 10 유닛/ml (Invitrogen®)

반응 조건: 1 시간, 30℃.

BglII 소화된 정제된 조각의 라이게이션은 원하는 돌연변이를 함유하는 환형 및 다량체성 DNA 생성물을 산출하고, 이어서 이것을 수용능 바실러스 서브틸리스 내로 직접 형질전환하였다:

- 30 ㎕ 의 정제된 BglII 소화된 DNA 조각

- 8 ㎕ T4 DNA Ligase 완충액 (Invitrogen® Catalog No. 46300-018)

- 1 ㎕ T4 DNA Ligase, 1 유닛/㎕ (Invitrogen® Catalog No. 15224-017)

반응 조건: 16-20 시간, 16℃

본원에 참조로서 인용된 WO 02/14490 호에 기재되는 바와 같이 라이게이션 혼합물을 B. 서브틸리스를 형질전환시키는데 사용하였다 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK). 각각의 라이브러리에 대해, 96 개의 단독 콜로니를 집어내고 서열 분석 (BaseClear) 및 스크리닝 목적을 위해 네오마이신 및 1.25 g/L 효모 추출물을 함유하는 MOPS 배지에서 성장시켰다. 라이브러리 수는 1 내지 275 의 범위였다. 각각의 수는 성숙 랜덤으로 돌연변이된 bpn' 서열의 코돈을 나타낸다. 각각의 라이브러리는 최대 19 개의 BPN' 변이체를 함유하였다.

BPN' 다중 돌연변이 라이브러리 구축

합성 BPN' 다중 돌연변이 라이브러리 (또는 조합 라이브러리) 를 Geneart, Baseclear, 및 Bioke 에 의해 제조하였다. 각각의 합성 BPN' 다중 돌연변이 라이브러리는 성숙 서열의 2 개 이상의 선별된 코돈이 특이적 DNA 서열에 의해 랜덤으로 대체된 BPN' 유전자의 혼합물을 함유하였다. 예를 들어: BPN' 조합 라이브러리는 성숙 서열의 코돈 22 가 Thr, Gln, Val 또는 Tyr 에 대해 코딩하는 DNA 3 개 쌍, Val, Gln, Asn 또는 Tyr 의 경우 코돈 26, He, His, Tyr, 또는 Asn 의 경우 코돈 31 및, Ala, Glu, His 또는 Asp 의 경우 코돈 48 로 래덤으로 치환될 수 있는 식으로 디자인될 수 있다. 본 예에서, 조합 라이브러리는 최대 256 개의 BPN' 조합 변이체를 함유할 수 있다. 그러나, 전형적인 BPN' 다중 돌연변이 라이브러리는 수천개 이하의 독특한 BPN' 변이체 유전자를 함유할 수 있다. 말단 AvaI 및 HindIII 부위를 갖는 다중 돌연변이 라이브러리 조각 (예를 들어, 야생형 BPN' 참조) 을 AvaI 및 HindIII 로 소화시키고, 젤 정제하고, 응집 말단의 일반적인 클로닝에 대해 제조자에 의해 권고되는 바와 같이 Invitrogen® T4 DNA Ligase (Catalog No. 15224-025) 를 사용하는 리가아제 반응에 의해 pHPLT 벡터 내로 클로닝하였다. 야생형 BPN'AvaI/HindIII 조각은 다음과 같다:

라이게이션 반응 혼합물을 형질전환시키기 위해, 라이브러리 DNA (pHPLT 에서 클로닝된 BPN' 라이브러리 조각 혼합물) 를 TempliPhi 키트 (Amersham Catalog No. 25-6400) 를 사용하여 증폭시켰다. 이 목적을 위해, 1 ㎕ 의 라이게이션 반응 혼합물을 TempliPhi 키트로부터의 5 ㎕ 의 샘플 완충액과 혼합하고, 이것을 3 분 동안 95℃ 에서 가열하여 DNA 를 변성시켰다. 반응물을 빙상에서 2 분 동안 두어 식힌 다음, 간단히 스핀다운하였다. 그 다음, 5 ㎕ 의 반응 완충액 및 TempliPhi 키트로부터의 0.2 ㎕ 의 phi29 폴리머라아제를 첨가하고, 반응물을 30℃, MJ Research PCR 기계에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. phi29 효소를 65℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션에 의해 비활성화시켰다.

라이브러리의 형질전환을 위해 0.1 ㎕ 의 TempliPhi 증폭 반응 생성물을 500 ㎕ 의 수용능 B. 서브틸리스 세포와 혼합한 후 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK) 37℃ 에서 1 시간 동안 강하게 교반하였다. 이 후, 100 및 500 ㎕ 의 분취물을 20 ppm 네오마이신 및 0.5% 탈지유를 함유하는 HI-아가 플레이트 상에 플레이팅하였다.

하기 표는 본 발명에서 사용되는 일부 단일 치환의 목록을 제공한다.

BPN' 변이체를 함유하는 미정제 효소 샘플의 제조

BPN' 변이체 단백질을 96 웰 MTP, 37℃ 에서 68 시간 동안 MBD 배지 (MOPS 기재 규정 배지) 내에서 B. 서브틸리스 형질전환체를 성장시켜 제조하였다. MBD 배지는 NH₄Cl₂, FeSO₄, 및 CaCl₂ 를 기본 배지로부터 생략하고, 3 mM K₂HPO₄ 를 사용한 것을 제외하고는, 당업계에 알려진 바와 같이 본질적으로 제조되었고 (Neidhardt et al., J. Bacteriol., 119: 736-747 [1974] 참조), 염기성 배지는 60 mM 우레아, 75 g/L 글루코오스, 및 1% 소이톤이 보충되었다. 미량원소는 1 리터에, 400 mg FeSO₄ 7H₂O, 100 mg MnSO₄.H₂O, 100 mg ZnSO₄ 7H₂O, 50 mg CuCl₂ 2H₂O, 100 mg CoCl₂ 6H₂O, 100 mg NaMoO₄ 2H₂O, 100 mg Na₂B₄O₇ 10H₂O, 10 ml 의 1M CaCl₂, 및 10 ml 의 0.5 M 나트륨 시트레이트를 함유하는 100X 저장액으로서 구성되었다.

실시예 4

BPN' 변이체의 LAS 안정성

본 실시예에서는, LAS 의 존재하에서 다양한 단일-치환 BPN' 변이체 및 다중-치환 BPN' 변이체의 안정성을 평가하기 위해 수행된 실험을 기재하고 있다. 실시예 1 에 기재된 방법을 사용하여 승온 (45℃) 에서 LAS 의 존재하에서 인큐베이션 전후의 AAPF 활성을 측정함으로써 LAS 안정성을 측정하였다. 하기 표의 결과는 변이체 BPN' 의 안정성을 야생형 BPN' 효소과 비교한 상대적인 안정성 값으로서 제시된다. 특히 상대적 안정성은 변이체 잔류 활성 대 야생형 잔류 활성의 비이다. 1 초과의 값은 LAS 의 존재하에서 보다 큰 안정성을 나타낸다.

표 4-1 은 야생형 BPN' 와 비교한 BPN' 변이체의 상대적인 안정성 값을 나타낸다. 본 발명의 개발 중 특정된 바와 같이, 다양한 BPN' 변이체는 야생형 BPN' 과 비교해 LAS 의 존재하에서 보다 높은 안정성을 나타냈다. 특히 시험된 92 개 BPN' 부위의 LAS 안정성 검정법에서, 40 개 부위 (43%) 는 열악했고 (유해) 및 52 개 부위 (57%) 는 양호했다 (유리). 또한 시험된 1508 개의 변이체 중에서, 96 개 (6%) 는 우세했고 (업), 196 개 (13%) 는 중도였고 (동일), 1216 (81%) 개는 열등했다 (다운).

실시예 5

BPN' - 변이체의 특이적 활성

본 실시예에서는, BPN' 및 BPN'-변이체의 상대적인 특이적 활성을 측정하기 위해 수행된 실험이 기재되어 있다. AAPF 에 대한 특이적 활성을 실시예 1 에 제공된 방법을 사용하여 측정하였다. 표 5-1 에서, 결과는 BPN' 변이체의 활성을 야생형 BPN' 의 활성과 비교한 상대적인 특이적 활성 값으로서 제시된다.

특히 상대적인 특이적 활성은 변이체 특이적 활성 대 야생형 특이적 활성의 비이다. 1 초과의 값 (PI>1) 은 AAPF 기질에 대해 보다 높은 특이적 활성을 나타낸다.

실시예 6

BPN' - 변이체 데이터의 비교 평가

본 실시예에서는, BPN' 및 BPN'-변이체의 단백질 발현, 얼룩 제거 활성, LAS 안정성, 및 AAPF 활성 (관심의 특성 시험) 을 측정하기 위해 수행된 실험 결과가 기재되어 있다. 실시예 1 에 기재된 방법을 사용하여 결과를 수득하였다. 전체적으로 기재되어 있는 바와 같이, BPN' 변이체의 기능성은 변이체 대 모체 단백질의 성능의 비인 성능 지수 (PI) 로서 정량화되었다. 본원에서 사용된 PI 등급에는 업 돌연변이 (PI > 1.0); 중성 돌연변이 (PI > 0.5); 비-유해한 돌연변이 (PI > 0.05); 및 유해 돌연변이 (PI < 0.05) 가 포함된다. "조합 돌연변이" 는 변이체가 하나 이상의 특성에 대한 성능 지수 값 = 0.5, 및 모든 특성에 대한 성능 지수 값 > 0.05 을 가진 돌연변이이다. 조합 돌연변이는 하나 이상의 원하는 특성에 대한 적합한 성능 지수를 가진 단백질을 전달하기 위해 조합될 수 있는 돌연변이이다. 돌연변이가 일어나는 위치는 다음과 같이 분류된다: 비-제한적 위치는 하나 이상의 특성에 대해 > 20% 중성 돌연변이를 갖고; 제한적 위치는 활성 및 안정성에 대해 < 20% 중성 돌연변이를 갖는다.

상기 데이터는 임의의 서브틸리신의 조작에 사용된다. 조작되는 서브틸리신이 특정 위치에서 서브틸리신 BPN' 와 상이한 아미노산을 갖는 경우, 상기 데이터는 BPN' 야생형 아미노산에 대한 치환을 비롯한 최고 선택 치환을 확인함으로써 원하는 특성을 변결할 하나 이상의 치환을 확인하는데 사용된다.

표 6-1 은 275 위치에서의 서브틸리신 BPN'의 5,004 개 변이체에 대한 성능 지표 값 (Pi) 을 나타낸다. 0.05 이하의 성능 지수는 0.05 로 고정되었고, 표에서 굵은 이태리체로 표시된다. 또한, 안정성 측정의 경우, 안정성 검정법에서 활성의 성능 지표가 0.05 이하인 경우, 연관된 안정성 성능 지수는 0.05 로 고정되었다.

조합 돌연변이:

표 6-2 에는 275 개 위치에 대한 조합 돌연변이 (2,907) 인 서브틸리신 BPN' 변이체가 열거되어 있다. 상기 변이체는 하나 이상의 특성에 대해 성능 지수 값 > 0.5 를 갖고, 모든 특성에 대해 >0.05 를 갖는다.

-243

-69

-82

실시예 7

변이체 프로테아제 데이터의 비교 평가

본 실시예에서는, BPN', GG36 (GCI-P036) 및 변이체 프로테아제의 세정 성능, LAS 안정성, AAPF 활성 및 단백질 함량 (관심의 특성 시험) 을 측정하기 위해 수행된 실험 결과를 비교한다. 전체적으로 기재되어 있는 바와 같이, 변이체 프로테아제의 기능성은 변이체 대 참조 프로테아제의 성능의 비인, 성능 지수 (PI) 로서 정량화하였다. 본원에서 사용된 PI 분류에는 업 돌연변이 (PI > 1.0); 중성 돌연변이 (PI > 0.5); 비-유해한 돌연변이 (PI > 0.05); 및 유해 돌연변이 (PI < 0.05) 가 포함된다

생산적 부위는 임의의 특성에 대해 하나 이상의 Up 돌연변이를 갖는 것들이다. 생산적, 비-제한적 부위는 시험된 임의의 특성 (단밸직 발현은 제외) 에 대해 >20% 중성 돌연변이 (PI > 0.5) 및 하나 이상의 업 돌연변이 (PI > 1.0) 를 갖는 것들이다. 하기 표 7-1 에서, 생산적, 비-제한적 부위의 정의를 충족시키는 변이체에 대한 결과는 업 돌연변이 (PI > 1) 의 정의를 충족시키는 시험된 변이체의 백분율 (%) 로서 제시된다.

고도의 생산적 부위는 단밸직 발현을 제외한 하나 이상의 특성에 대해 > 20% 업 돌연변이 (PI > 1) 를 갖는 것들이다 (TCA 검정법). 하기 표 7-2 에서, 고도의 생산적 부위의 정의를 충족시키는 변이체에 대한 결과는 업 돌연변이 (PI > 1) 의 정의를 충족시키는 시험된 변이체의 백분율 (%) 로서 제시된다.

제한적 부위는 활성 및 안정성에 대해 20% 미만의 중성 돌연변이를 갖는 것들이다. 하기 표 7-3 에서, 제한적 부위의 정의를 충족시키는 변이체에 대한 결과는 중성 돌연변이 (PI > 0.5) 의 정의를 충족시키는 평가된 변이체의 백분율 (%) 로서 제시된다.

요약하면 본 발명의 개발 동안 측정된 바와 같이, 2 개의 참조 서브틸리신의 성숙 영역 내 10 개 위치는 활성 및 안정성에 대한 제한적 위치이다. 그러므로 2 개의 참조 서브틸리신의 성숙 영역 내 나머지 265 개 위치는 활성 및 안정성에 대해 비-제한적 위치 (> 20% 중성 돌연변이) 이다.

실시예 8

B. 서브틸리스 내 프로테아제 제조

본 실시예에서는, B. 서브틸리스에서 다양한 프로테아제를 제조하기 위해 수행된 실험이 기재되어 있다. 특히, GG36, 및 BPN'-Y217L 에 대한 발현 벡터로의 B. 서브틸리스의 형질전환에 사용되는 방법이 제공된다. 형질전환은 당업계에 공지된 바와 같이 수행되었다 (예를 들어, WO 02/14490 참조).

GG36 프로테아제 제조

본 실시예에서는, B. 서브틸리스에서 GG36 (또한 본원에서는 B. 렌투스 서브틸리신으로서 불림) 을 제조하기 위해 수행된 실험이 제공되어 있다. 발현 플라스미드 pAC-GG36ci 를 일치 aprE 프로모터 및 BPN' 전사 터미네이터의 통제 하에서 aprE 신호 서열의 8 번재 코돈에서 융합된 GG36 코돈-개선 유전자를 사용하여 조립하였다. 하기에 제시된 서열에서, 굵은 이태리체는 일치 aprE 프로모터를 표시하고, 일반 글씨체는 신호 서열을 표시하고, 밑줄은 프로 서열을 표시하고, 굵은 글씨체는 GG36 성숙 프로테아제를 코딩하는 DNA 를 표시하고, 밑줄친 이태리체는 BPN' 터미네이터를 표시한다. GG36 성숙 프로테아제의 코딩 영역은 클로닝 목적을 위해 KpnI 및 XhoI 제한 부위가 측면에 있다:

GG36 전구체 단백질의 아미노산 서열이 하기에 제시되어 있다. 본 서열에서, 굵은 글씨체는 성숙 GG36 프로테아제를 표시한다:

성숙 GG36 프로테아제의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:562) 을 본원에 기재된 변이체 라이브러리의 제조를 위한 기반으로서 사용하였다:

플라스미드 pAC-GG36ci 의 요소에는 pUB110 = 플라스미드 pUB110 (McKenzie et al., Plasmid 15:93-103 [1986]) 으로부터의 DNA 조각, pBR322 = 플라스미드 pBR322 (Bolivar et al., Gene 2:95-113 [1977]) 로부터의 DNA 조각, pC194 = 플라스미드 pC194 (Horinouchi et al., J Bacteriol, 150:815-825 [1982]) 로부터의 DNA 조각이 포함된다. 플라스미드는 다음과 같은 특징이 있다: B. 서브틸리스에 대한 Ori = pUBHO 로부터의 복제 기원, CAT = pC194 로부터의 클로르암페니콜 내성 유전자, pMB1 기원 = pBR322 로부터의 복제 기원, bla = pBR322 로부터의 베타-락타마아제, 짧은 aprE 프로모터 = 일치 전사 프로모터, 신호 펩티드 (Signal Peptide) = 신호 펩티드, 프로 펩티드 = GG36 프로 영역, GG36ci 성숙 펩티드 = 성숙 GG36 (본 연구에서 발현된 각각의 변이체에 대한 코딩 영역에 의해 대체됨), BPN' 터미네이터 = 서브틸리신 BPN' 로부터의 전사 터미네이터.

BPN' - Y217L ( PURAFECT ® PRIME 서브틸리신 ) 프로테아제 제조

본 실시예에서는, B. 서브틸리스에서 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN'-Y217L (PURAFECT® PRIME 서브틸리신으로 시판됨; 또한 "FNA" 로도 불림) 을 제조하기 위해 수행된 실험이 기재되어 있다. 발현 플라스미드 pAC-FNAre 을 일치 aprE 프로모터 및 BPN' 전사 터미네이터의 통제 하에서 aprE 신호 서열의 8 번재 코돈에서 융합된 BPN'-Y217L 유전자를 사용하여 조립하였다. 하기에 제시된 서열에서, 굵은 이태리체는 일치 aprE 프로모터를 표시하고, 일반 글씨체는 신호 서열을 표시하고, 밑줄은 프로 서열을 표시하고, 굵은 글씨체는 BPN'-Y217L 성숙 프로테아제를 코딩하는 DNA 를 표시하고, 밑줄친 이태리체는 BPN' 터미네이터를 표시한다. BPN'-Y217L 성숙 프로테아제의 코딩 영역은 클로닝 목적을 위해 KpnI 및 XhoI 제한 부위가 측면에 있다:

BPN'-Y217L 전구체 단백질의 아미노산 서열이 하기에 제시되어 있다. 본 서열에서, 굵은 글씨체는 성숙 BPN'-Y217L 프로테아제를 표시한다:

성숙 BPN'-Y217L 프로테아제의 아미노산 서열을 본원에 기재된 변이체 라이브러리의 제조를 위한 기반으로서 사용하였다:

플라스미드 pAC-FNAre 의 요소에는 pUB110 = 플라스미드 pUB110 (McKenzie et al., Plasmid 15:93-103 [1986]) 으로부터의 DNA 조각, pBR322 = 플라스미드 pBR322 (Bolivar et al., Gene 2:95-113 [1977]) 로부터의 DNA 조각, pC194 = 플라스미드 pC194 (Horinouchi et al., J Bacteriol, 150:815-825 [1982]) 로부터의 DNA 조각이 포함된다. 플라스미드는 다음과 같은 특징이 있다: B. 서브틸리스에 대한 Ori = pUBHO 로부터의 복제 기원, CAT = pC194 로부터의 클로르암페니콜 내성 유전자, pMB1 기원 = pBR322 로부터의 복제 기원, bla = pBR322 로부터의 베타-락타마아제, 짧은 aprE 프로모터 = 일치 전사 프로모터, 신호 펩티드 (Signal Peptide) = 신호 펩티드, 프로 펩티드 = BPN'-Y217L 프로 영역, BPN'-Y217L 성숙 펩티드 = 성숙 BPN'-Y217L (본 연구에서 발현된 각각의 변이체에 대한 코딩 영역에 의해 대체됨), BPN' 터미네이터 = 서브틸리신 BPN' 로부터의 전사 터미네이터.

실시예 9

효소 변이체의 발현

본 실시예에는 형질전환된 B. 서브틸리스의 다양한 재조합 효소를 발현하기 위해 사용된 방법이 기재되어 있다.

서브틸리신 - 2 ml 규모

BPN'-Y217L 또는 GG36 발현 벡터를 가지고 있는 B. 서브틸리스 클론을 200 ㎕ 의 LB 배지 + 25 ㎍/ml 클로르암페니콜을 함유하는 96 웰 배양 플레이트 (BD, 353075) 내에 글리세롤 저장액으로부터 스틸 96 웰 레플리케이터로 복제하고, 습윤 공간에서 37℃, 220 rpm 에서 밤새 성장시켰다. 밤샘 배양물로부터 200 ㎕ 분취물을 5 ml 플라스틱 배양 튜브 내 2000 ㎕ 규정 배지 + 25 ㎍/ml 클로르암페니콜에 접종하기 위해 사용하였다. 배양 배지는 주 질소 공급원으로서 우레아, 주 탄소 공급원으로서 글루코오스가 함유되고, 로부스트 세포 성장을 위해 1% 소이톤이 보충된 MOPS 완충액 기반의 풍부 반-규정 배지였다. 배양 튜브를 37℃, 220 rpm 에서, 60 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배양 브로스를 8000 x RCF 초과에서 원심분리하였다. 저장을 위해 상청액을 15 ml 폴리프로필렌 원뿔 튜브에 따라부었다. 추가 정제 또는 농축은 수행하지 않았다. 상청액 저장액을 장기간 안정성을 위해 40% 프로필렌 글리콜 퇴종 농도로 제형화하고, 4℃ 에서 저장하였다.

실시예 10

효소 변이체의 제조

본 실시예에는 효소 전하 사다리 및 조합 전하 라이브러리의 제조가 기재되어 있다.

효소 전하 사다리

관심의 물리적 특성 범위에 걸친 다중 단백질 변이체를 존재하는 라이브러리로부터 선별하거나 당업계에 공지된 부위-지정 돌연변이생성 기술에 의해 발생시켰다 (예를 들어, 미국 특허 출원 일련 번호 10/576,331 호, 11/581,102 호, 및 11/583,334 호 참조). 그 다음 상기 규정된 탐침 단백질 세트를 관심의 시험에서 검정하였다.

예시적 프로테아제 전하 사다리 변이체가 하기 표에 제시되어 있고 본원에 기재된 바와 같이 검정하였다. 본 표에서, 전하 변화는 야생형 효소에 상대적이다.

효소 조합 전하 라이브러리

B. 렌투스 서브틸리신 (= GG36 ) 조합 전하 라이브러리의 생성

조합 전하 라이브러리 (CCL) 의 생성을 위해 코돈-개선 GG36 유전자를 갖는 pAC-GG36ci 플라스미드를 DNA 2.0 으로 전송하였다. 또한 형질전환을 위해 바실러스 서브틸리스 균주 (유전자형: AaprE, AnprE, AspoIIE, amyEwxylRPxylAcomK-phleo) 를 제공받았다. 또한 표 10-3 에 제시된 GG36 프로테아제 내 4 개 부위 각각에서 위치 라이브러리의 생성을 위해 DNA2.0 Inc. 로 요청하였다. 변이체를 96 웰 플레이트 내 글리세롤 저장액으로서 공급받았다.

GG36 CCL 을 활성 부위 외부에 4 개의 잘 분포된, 표면 노출된, 미전하 극성 아미노산 잔기를 확인함으로써 디자인하였다. 이들 잔기는 Ser-85, Gln-107, Ser-182 및 Asn-242 (BPN' 넘버링에서 잔기 87, 109, 188, 및 248) 이었다. 각 부위에서 3 가지 가능성의 모든 조합을 형성함으로써 81 개 원 조합 라이브러리 (G-1 에서 G-81) 를 제작하였다: 야생형, 아르기닌 또는 아스파르산.

B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' - Y217L CCL 의 생성

CCL 의 생성을 위해 BPN'-Y217L 유전자를 갖는 pAC-FNAre 플라스미드를 DNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA) 로 전송하였다. 또한 형질전환을 위해 바실러스 서브틸리스 균주 (유전자형: AaprE, AnprE, AspoIIE, amyEwxylRPxylAcomK-phleo) 를 제공받았다. 또한 표 10-4 에 제시된 4 개의 BPN'-Y217L 프로테아제 부위 각각에서 위치 라이브러리의 생성을 위해 DNA2.0 Inc. 로 요청하였다. 변이체를 96 웰 플레이트 내 글리세롤 저장액으로서 공급받았다.

서브틸리신 BPN'-Y217L 조합 전하 라이브러리를 활성 부위 외부에 4 개의 잘 분포된, 표면 노출된, 미전하 극성 아미노산 잔기를 확인함으로써 디자인하였다. 이들 잔기는 Ser-87, Asn-109, Ser-188 및 Ser-248 이었다. 각 부위에서 3 가지 가능성의 모든 조합을 형성함으로써 81 개 원 조합 라이브러리 (F-1 에서 F-81) 를 제작하였다: 야생형, 아르기닌 또는 아스파르산.

실시예 11

변이체 BPN' - Y217L 및 GG36 서브틸리신 성능

본 실시예에는 실시예 1 에 기재된 바와 같은 세탁 및 자동 식기세정 적용 모두에서 다양한 시장 지형학 (예를 들어, 상이한 pH, T, 및/또는 물 경도) 을 나타내는 세제 내 BMI 마이크로천조각 및 구운 계란 검정법으로의 BPN'-Y217L 및 GG36 변이체의 시험을 기재하고 있다.

상기 관찰은 서브틸리신 BPN'-Y217L 및 GG36 과 같은 기타 세린 프로테아제에서도 유지되었다. 예를 들어 도 2A 및 2B 는 재고품, 가열-비활성화 TIDE® 2X 세제를 사용하는 북미 세제 세탁 조건 하에서의 세정 성능에서 BPN'-Y217L 및 GG36 각각에 대한 최적 전하를 보여준다. 좌측 Y-축은 마이크로천조각 세정 성능을 보여주고, 더 큰 숫자는 우세한 BMI 얼룩 제거를 나타낸다. 우측 Y-축은 모체 분자 (채워지지 않은 기호) 에 대한 변이체의 세정 성능 (채워진 기호) 으로서 정의되는 성능 지수를 보여준다. 수평선은 검정법의 잡음 초과 2 또는 3 표준 편차에서의 성능 지수를 나타낸다. BPN'-Y217L 전하 조합 라이브러리 (CCL) 는 모체 BPN'-Y217L 에 비해 0 전하 변화에서 최적 전하를 나타내는 반면, GG36 CCL 은 GG36 모체에 비해 -2 전하에서 최적을 나타낸다.

도 3A, 3B, 4A, 4B, 5A 및 5B 는 최적 전하 위치가 세제 제형, pH, 온도 및 물 경도 및 세제 농도로 인한 이온 강도에 의해 결정되는 용액 환경의 작용임을 나타낸다. 예를 들어, BPN'-Y217L CCL 에 대한 최적 전하는 북미 세탁 조건하에서는 0 에서 서유럽 및 일본 조건 하에서는 좀더 + 전하로 현저하게 이동한다. 또한 최적 전하는 액체 및 과립 (분말) 세탁 세제 제형 모두에 대해 관찰된다. 유사하게는, 최적 전하는 효소 기질로서 구운 계란에 대한 자동 식기 세정 (ADW) 세제 (예를 들어, Reckitt Benckiser Calgonit 40℃, 12 gpg, pH 10) 에서의 BPN'-Y217L 및 GG36 CCL 모두에서 관찰되었다.

본 발명의 개발 동안 증명된 바와 같이, 상이한 세제에서의 프로테아제 전하 변이체 (예를 들어, GG36, BPN'-Y217L, 등) 의 세정 성능은 작업 용액 pH 및 전도도에 크게 의존한다. 최종 전도도는 이온 강도의 측정값이고, 물 경도, 세제 농도 및 조성으로 인한 것이다. 예를 들어, pH 10.6 및 3.0 mS/cm 의 전도도에서 수행되는 경우 유럽 및 북미 ADW 세제 하에서 구운 계란 얼룩에 대한 GG36 및 BPN'-Y217L 변이체의 세정 성능 사이에는 상관 관계가 있다. 특히, pH 및 전도도가 동일한 경우에 전하 변이체의 세정 성능은 꽤 상관 관계가 있다. 이러한 발견은 pH 및 전도성을 부합시킨 또다른 세제에 대한 결과를 추정하여 제공된 세제를 사용하는 효소 성능을 스크리닝하는 것을 가능하게 한다. 유사한 작업 pH 및 전도도를 나타내는 세제에 대한 결과를 추정하여 pH 및 전도성을 부합시킨 완충액에서의 효소 성능을 스크리닝하는 것이 마찬가지로 가능하다.

실시예 12

LAS 및 킬레이트제 안정성

본 실시예에는 음이온성 계면활성제 및 킬레이트제 중 하나 또는 그 모두를 함유하는 반응 배지 중에서 단백질 전하와 안정성 사이의 관계를 측정하는 것이 기재되어 있다. 스트레스 및 비-스트레스 샘플의 프로테아제 활성의 측정을 위해, suc-AAPF-pNA 검정법을 사용하였다. 스트레스 및 비-스트레스 샘플의 알파-아밀라아제 활성의 측정을 위해, BODIPY-전분 검정법을 사용하였다. 스트레스 플레이트로부터의 잔류 LAS 및 EDTA 는 suc-AAPF-pNA 또는 BODIPY-전분 검정법에 영향을 주지 않는다.

LAS / EDTA 안정성

사용된 시약에는: 대조군 완충액: 50 mM HEPES, 0.005% Tween-80, pH 8.0; 및 스트레스 완충액 50 mM HEPES, 0.1% (w/v) LAS (도데실벤젠-술포네이트, 나트륨 염, Sigma D-2525), 10 mM EDTA, pH 8.0 이 포함된다. 효소 변이체 (20 ppm) 를 대조군 또는 스트레스 완충액을 함유하는 96 웰 비-결합 평평 바닥 플레이트 내에 1:20 으로 희석하고 혼합하였다. 대조군 플레이트를 실온에서 인큐베이션하는 반면 스트레스 플레이트는 즉시 37℃ 에서 30-60 분 동안 (처리되는 효소의 안정성에 따라) 두었다. 인큐베이션 후, 효소 활성을 프로테아제에 대해 suc-AAPF-pNA 검정법을 사용하여 측정하였다. 남은 또는 잔류 활성 분획은 스트레스 샘플의 반응 속도를 대조군 샘플의 반응 속도로 나눈 것과 동일하였다. 모체 효소 및 변이체는 대조군 완충액에서 60 분 동안 안정한 것으로 밝혀졌다.

도 6 은 80 개 변이체를 함유하는 라이브러리에 대해 모체 BPN'-Y217L 에 대한 네트 전하 변화의 작용으로서의 LAS/EDTA 안정성을 나타낸다. 모체 BPN'-Y217L 분자에 대해 여러 순수 전하에 걸치도록 실시예 2 에 기재된 방법에 따라 상기 라이브러리를 디자인하고 구축하였다. 도면으로부터 명백하듯이, 모체 BPN'-Y217L 에 비한 음전하 (-4 이하) 의 축적은 조합된 LAS/킬레이트제 안정성에 대해 유리하다. 이것은 복합 액체 세탁 환경에서 단백질 안정성을 개선하기 위해 단백질 물리적 특성 (이 경우 순수 전하) 을 최적화하는 예이다.

실시예 13

BPN' 다중 돌연벼이 라이브러리 ( MML ) 변이체의 얼룩 제거 성능

BPN' 다중 돌연변이 라이브러리 (또는 조합 라이브러리) 를 본원에 기재된 바와 같이 Geneart 또는 DNA 2.0 에 의해, 모체 단백질로서 BPN' 를 사용하여 제조하였다. BPN' 변이체 단백질은 또한 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다. 배양 상청액의 단백질 농도는 실시예 1 에 기재된 바와 같은 TCA 침전에 의해 측정되었다. 변이체의 얼룩 제거 성능을 실시예 1 에 기재된 방법을 사용하고 하기 변형을 가하여, pH 8/16℃, pH 7/16℃ 및 pH 8/32℃ 에서 EMPA 116 천조각 (BMI 얼룩, CFT) 상에 세탁 적용에서 시험하였다. 사용된 시험 세제는 가열 비활성화된 TIDE® 2X Cold 세제 (Procter & Gamble) 였다. 시판 세제 제형의 가열 비활성화는 비-효소적 성분의 특성을 유지하면서 임의의 단백질 성분의 효소 활성을 파괴시키기 위한 것이다. 2 시간 동안 95℃ 의 수조에 (유리병에서) 미리 칭량된 양의 액체 세제를 넣어 세제의 가열 비활성화를 수행하였다. 세제를 지역 슈퍼마켓 가게에서 구입하였다. 비-가열 및 가열된 세제 모두를, 세제가 용해되는 5 분 내에 검정하여, 비활성화된% 를 정확하게 측정하였다. 효소 활성을 AAPF 검정법에 의해 시험하였다. BPN' 변이체의 기능성을 성능 지수 (Pi) (즉, 모체 BPN' 에 비한 변이체의 성능의 비) 로서 정량화하였다. 결과는 표 13-1 에 제시되어 있다. 하나 이상의 BMI 얼룩 제거 성능 시험 및/또는 TCA 침전에 대해 0.5 이상의 Pi 값을 보이는 BPN' 변이체는 개선된 세정 이점 및/또는 발현을 나타냈다. 0.05 이하의 성능 지수는 0.05 로 고정되었고, 표에서 굵은 이태리체로 표시된다. 0.05 이하의 TCA 단백질 성능 지수를 갖는 모든 변이체의 경우, 모든 값은 0.05 로 고정되었다. 본 표에서, "ND" 는 "측정되지 않음" 을 나타낸다.

실시예 14

BPN' 2 개 부위 변이체의 얼룩 제거 성능

모체 단백질로서 BPN' 을 사용하고, 융합 PCR 을 사용하여 위치 217 및 222 (BPN' 넘버링) 에서 2 개의 부위 변이체를 생성하였다. BPN' 변이체 단백질을 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다. 배양 상청액의 단백질 농도는 실시예 1 에 기재된 바와 같은 TCA 침전에 의해 측정되었다. 변이체의 얼룩 제거 성능을 실시예 1 에 기재된 방법을 사용하여, 가열-비활성화 TIDE® 2X Cold (Procter & Gamble) 내 pH 8/16℃ 에서 EMPA 116 천조각 (BMI 얼룩, CFT) 상에 세탁 적용에서 시험하였다. BPN' 변이체의 기능성을 성능 지수 (Pi) (즉, BPN'-Y217L 에 비한 변이체의 성능의 비) 로서 정량화하였다. 결과는 표 14-1 에 제시되어 있다. BMI 얼룩 제거 성능 시험 및/또는 TCA 침전에 대해 0.5 이상의 Pi 값을 보이는 BPN' 변이체는 개선된 세정 이점 및/또는 발현을 나타냈다.

실시예 15

B. 서브틸리스에서의 ASP 프로테아제 생성

본 실시예에서는, B. 서브틸리스에서 69B4 프로테아제 (또한 본원에서 "ASP," "Asp," 및 "ASP 프로테아제," 및 "Asp 프로테아제" 로 언급됨) 를 생성하기 위해 수행된 실험이 본원에 전체가 참조로서 인용된 미국 특허 출원 일련 번호 10/576,331 호에 기재되어 있다. 간략하게는, 바실러스 종에 적합화된 코돈 사용이 있는 하기 제시된 DNA 서열 (합성 ASP DNA 서열) 은 야생형 ASP 전구체 단백질을 코딩한다:

상기 서열에서, 굵은 글씨체는 성숙 프로테아제를 코딩하는 DNA 를 표시하고, 일반 글씨체는 선도자 서열을 표시하고, 밑줄은 N-말단 및 C-말단 프로서열 (prosequence) 을 표시한다.

셀룰로모나스 (Cellulomonas) 균주 69B4 (DSM 983316035) 로부터 유래된 성숙 세린 프로테아제 효소는 189 개 길이의 아미노산이고, 하기에서 볼 수 있듯이 His32, Asp56, 및 Ser137 로 이루어지는 촉매적 3 인조를 갖는다 (촉매적 3 인조는 굵은 글씨로 밑줄쳐있다):

실시예 16

ASP 조합 돌연변이체 및 다중 돌연변이 라이브러리의 제조

본 실시예에서는, ASP 의 조합 돌연변이체 및 다중 돌연변이 라이브러리를 구축하기 위해 사용되는 방법이 기재되어 있다. ASP 의 조합 돌연변이체의 구축은 미국 특허 출원 일련 번호 10/576,331 호에 기재되어 있다.

다중 돌연변이 라이브러리 구축

다중 돌연변이 라이브러리를 반응에 사용된 프라이머 농도를 제외하고 Stratagene QCMS 키트에서 요약된 바와 같이 구축하였다. 구체적으로는, 1 ㎕ 의 메틸화된, 정제된 pUC18-ASP 플라스미드 (약 70 ng) 를 15 ㎕ 의 멸균 증류수, 1.5 ㎕ 의 dNTP, 2.5 ㎕ 의 10x 완충액, 1 ㎕ 의 효소 혼화물 및 1.0 ㎕ 돌연변이체 프라이머 혼합물 (총 100 pmol 의 프라이머) 과 혼합하였다. 10 ㎕ 의 각각의 18 개의 돌연변이체 프라이머 (100 pmol/㎕) 를 사용하여 프라이머 혼합물을 제조하고; Stratagene 에 의해 권고되는 라이브러리를 위해 50 ng 의 각각의 프라이머를 첨가하여, 돌연변이생성 예비 실시에서 소수의 돌연변이를 산출하였다. 그러므로, 프로토콜을 돌연변이생성 본 실시에서 각각의 반응에 총 100 pmol 의 프라이머가 포함되도록 수정하였다. 사이클 조건은 얇은 벽 0.2 mL PCR 튜브를 사용하여 MJ Research PTC2-200 열 증폭기에서, 95℃ 에서 1 분 동안, 그 후 95℃ 에서 1 분 동안, 55℃ 에서 1 분 동안, 그리고 65℃ 에서 12 분 동안의 30 회 사이클이었다. 반응 생성물을 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하여 QCMS 키트로부터 1 ㎕ 의 DpnI 로 소화시켰다. 부가적인 0.5 ㎕ 의 DpnI 을 첨가하고, 반응물을 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

이어서, 라이브러리 DNA (돌연변이 생성 단일 가닥 pUC18-ASP 생성물) 를 전기수용능 E. 콜라이 세포 (Invitrogen®, Catalog No. C4040-52, One Shot® TOPlO Electrocomp™ E. 콜라이, dam+) 내에 전기천공하고 형질전환된 세포의 성장을 100 mg/L 암피실린을 함유하는 아가 플레이트 상에서 선별하여 E. 콜라이 세포 내에 ASP 다중 돌연변이 라이브러리를 산출하였다. 콜로니 (1000 개 중 10 개) 를 수확하고, 제조자에 의해 요약된 단계에 의해 플라스미드 DNA 를 제조하기 위해 Qiagen 스핀 미니프렙 DNA 키트 (Catalog No. 27106) 를 사용하였다. 미니프렙 DNA 를 키트에 제공되는 50 ㎕ 의 Qiagen 완충액 EB 로 용리하였다.

미니프렙 DNA 를 PstI 및 HindIII DNA 제한 효소를 사용하여 소화시켰다. ASP 라이브러리 조각 혼합물 (PstI x HindIII) 을 젤 정제하고, 응집 말단 클로닝에 대해 제조자에 의해 권고되는 바와 같이 Invitrogen® T4 DNA Ligase (Catalog No. 15224-025) 를 사용하는 리가아제 반응에 의해 4154 개 염기쌍 HindIII x PstI pHPLT 벡터 조각 내로 클로닝하였다. 또다른 접근법에서, 합성 ASP 라이브러리 조각을 GeneArt 에 의해 제조하였다. 또한 상기 ASP 라이브러리 조각을 PstI 및 HindIII 로 소화시키고, 정제하고 리가아제 반응에 의해 4154 개 염기쌍 HindIII x PstI pHPLT 벡터 조각 내로 클로닝하였다.

라이게이션 반응 혼합물을 바실러스 세포 내로 직접적으로 형질전환시키기 위해, 라이브러리 DNA (pHPLT 에서 클로닝된 ASP 라이브러리 조각 혼합물) 를 TempliPhi 키트 (Amersham Catalog No. 25-6400) 를 사용하여 증폭시켰다. 이 목적을 위해, 1 ㎕ 의 라이게이션 반응 혼합물을 TempliPhi 키트로부터의 5 ㎕ 의 샘플 완충액과 혼합하고, 이것을 3 분 동안 95℃ 에서 가열하여 DNA 를 변성시켰다. 반응물을 빙상에서 2 분 동안 두어 식힌 다음, 간단히 스핀다운하였다. 그 다음, 5 ㎕ 의 반응 완충액 및 TempliPhi 키트로부터의 0.2 ㎕ 의 phi29 폴리머라아제를 첨가하고, 반응물을 30℃, MJ Research PCR 기계에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. phi29 효소를 PCR 기계에서 65℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션에 의한 반응에서 가열 비활성화시켰다.

바실러스 내로의 라이브러리의 형질전환을 위해, 0.1 ㎕ 의 TempliPhi 증폭 반응 생성물을 500 ㎕ 의 수용능 B. 서브틸리스 세포와 혼합한 후 (AaprE, AnprE, oppA, AspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK) 37℃ 에서 1 시간 동안 강하게 교반하고, 100 및 500 ㎕ 을 20 ppm 네오마이신 술페이트 (Sigma, Catalog No. N-1876; 1 mg 당 732 ㎍ 네오마이신 함유) 및 0.5% 탈지유를 함유하는 HI-아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 라이브러리로부터 95 개의 클론을 집어내고 서열분석하였다.

클론의 오직 14% 만이 백본 (모체) 서열 (R014I-A064K-T086K-T116E-R123F 를 가진 ASP) 과 동일하였고, 클론의 약 3% 는 그 밖의 돌연변이를 가져 돌연변이생성이 잘 작동하였다. 나머지 서열분석된 클론 (72%) 은 모두 돌연변이체였고, 이들 약 94% 가 독특한 돌연변이체였다. 라이브러리에 대한 서열분석 결과는 하기 표 16-1 에 제시된다.

실시예 17

다중 특성에 대한 열악한 돌연변이의 상관 관계

본 실시예에서는, 임의의 특성에 대한 유해한 돌연변이가 특성의 상관 관계와 관련 없이 모든 다른 특성에 대한 유해한 돌연변이와 상관 관계가 있다는 원칙이 예시된다. 본원에서 나타내어진 바와 같이, 오직 소수의 위치 (5-10%) 만이 모든 특성에 대해 열악한 돌연변이를 갖는다. 상기 위치는 단백질 폴드를 규정하고 진화 시 보존된다. 이것의 의미는 비록 임의의 특성에 대한 유리한 돌연변이의 확인이 특성에 대한 진정으로 예측되는 스크리닝을 필요로 함에도 불구하고, 임의의 특성에 대해 유해할 것 같은 돌연변이의 확인은 본원에 제시된 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 스크리닝을 사용하여 달성될 수 있다는 것이다.

변이체 효소를 본원에 기재된 바와 같이 그리고 그 전체가 모두 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 출원 일련 번호 10/576,331, 10/581,014, 11/581,102, 및 11/583,334 호에 따라 제조하였다. 하기 표는 2 개의 특성에 대한 상관 계수와 함께, 각각의 2 개의 특성에 대해 5 중량% 초과의 활성 및 5 미만의% 활성을 갖는 변이체의 수의 쌍방식 비교를 제공한다. 본 실시예에서 사용되는 검정법 시스템은 또한 상기 참조된 출원에서 제시되어 있다. 본원에 사용된 특성은 ASP 에 대한 카세인 활성 (CAS), 케라틴 활성 (KER), AAPF 활성 (AAPF), LAS 안정성 (LAS) 및 열 안정성; 및 ACT 에 대한 과산 형성 (PAF) 및 과산 분해 (PAD) 였다.

C. 케라틴 가수분해 검정법

상기 검정법 시스템에서, 사용된 화학약품 및 시약 용액은 하기와 같았다:

케라틴 ICN 902111

세제 1.6 g 의 세제를 1000 ml 물에 용해하였다 (pH = 8.2)

10,000 gpg 의, 0.6 ml 의 CaCl₂/MgCl₂ 및 1190 mg 의

HEPES 를 또한 첨가하여, 6 gpg 및 5 mM 의

경도 및 완충액 강도를 각각 산출하였다.

NaOH 로 pH 를 8.2 로 조정하였다.

피크릴술폰산 (TNBS)

Sigma P-2297 (5% 수용액)

시약 A 45.4 g 의 Na₂B₄O₇·10 H₂O (Merck 6308) 및

15 ml 의 4N NaOH 를 함께 용해하여, 1000 ml 의

최종 부피 (필요하다면 가열에 의함) 를 산출하였다.

시약 B 35.2 g 의 NaH₂PO₄·1H₂O (Merck 6346) 및 0.6 g 의 Na₂SO₃

(Merck 6657) 를 함께 용해하여, 1000 ml 의 최종 부피를

산출하였다.

방법:

인큐베이션 전에, 케라틴을 동시에 소량씩 100 ㎛ 체에 걸렀다. 그 다음, 10 g 의 100 ㎛ 미만의 케라틴을 pH 를 8.2 로 표준 조정하며, 실온에서 20 분 이상 동안 세제 용액에서 교반하였다. 마지막으로, 상기 현탁액을 실온에서 20 분 동안 원심분리하였다 (Sorvall, GSA 로터, 13,000 rpm). 그 다음 상기 절차를 반복하였다. 마지막으로 습윤 침전물을 총 부피 200 ml 로 세제에 현탁시키고, 현탁액을 파이펫 작업 동안 교반되도록 유지하였다. 인큐베이션 전에, MTP 를 Biohit 멀티채널 파이펫 및 1200 ㎕ 팁 (200 ㎕ 짜리 6 개 일회용 및 팁에 케라틴이 가라앉는 것을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 처분함) 으로 웰 당 200 ㎕ 의 기질로 채웠다. 그 다음, 10 ㎕ 의 여과 배양액을, 기질을 함유하는 MTP 에 첨가하였다. 테이프로 플레이트를 덮고, 인큐베이터에 넣고, 350 rpm (Innova 4330 [New Brunswick]) 에서 3 시간 동안 20℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 3000 rpm (iSigma 6K 15 원심분리기) 에서 3 분 동안 원심분리하였다. 약 15 분 후 인큐베이터에서 첫번째 플레이트를 제거하고, 50 ml 의 시약 A 당 1 ml 의 TNBS 용액을 첨가하여 TNBS 시약을 제조하였다.

MTP 를 웰 당 60 ㎕ 의 TNBS 시약 A 로 채웠다. 인큐베이션된 플레이트로부터, 10 ㎕ 을 TNBS 시약 A 가 있는 MTP 로 옮겼다. 테이프로 플레이트를 덮고, 실온에서 500 rpm 으로 벤치 쉐이커 (BMG Thermostar) 에서 20 분 동안 진탕하였다. 마지막으로, 200 ㎕ 의 시약 B 를 웰에 첨가하고, 쉐이커에서 1 분 동안 혼합하고, 405 nm 에서의 흡광도를 MTP-판독기로 측정하였다.

케라틴 가수분해 활성의 계산

수득된 흡광도 값을 빈칸 값 (효소 없이 기질만) 에 대해 교정하였다. 수득 흡광도는 가수분해 활성에 대한 측정값을 제공한다. 각 샘플 (변이체) 로부터, 성능 지수를 계산하였다. 성능 지수는 동일한 단백질 농도에서의 변이체의 성능 (실제 값) 과 표준 효소 (이론 값) 를 비교한다. 또한, 표준 효소의 랭뮤어 (Langmuir) 방정식의 파라미터를 사용하여 이론 값을 계산할 수 있다. 1 을 초과하는 성능 지수 (PI) (PI>1) 는 표준 (예를 들어, 야생형) 보다 양호한 변이체를 확인시켜주며, 1 의 PI (PI=1) 는 표준과 동일한 성능을 하는 변이체를 확인시켜주며, 1 미만의 PI (PI<1) 는 표준보다 열악한 성능의 변이체를 확인시켜준다.

디메틸카세인 가수분해 검정법 (96 웰)

상기 검정법 시스템에서, 사용된 화학약품 및 시약은 하기와 같았다:

디메틸카세인 (DMC):

Sigma C-9801

TWEEN®-80: Sigma P-8074

PIPES 완충액 (산 없음):

Sigma P-1851; 15.1 g 을 약 960 ml 의 물에 용해하고;

4N NaOH 로 pH 를 7.0 로 조정하고, 1 ml 의

5% TWEEN®-80 을 첨가하고, 부피를 1000 ml 로 맞췄다.

PIPES 및 TWEEN®-80 의 최종 농도는

각각 50 mM 및 0.005% 이다.

피크릴술폰산 (TNBS):

Sigma P-2297 (5% 수용액)

시약 A 45.4 g 의 Na₂B₄O₇·10 H₂O (Merck 6308) 및

15 ml 의 4N NaOH 를 함께 용해하여, 1000 ml 의

최종 부피 (필요하다면 가열에 의함) 를 산출하였다.

시약 B 35.2 g 의 NaH₂PO₄·1 H₂O (Merck 6346) 및

0.6 g 의 Na₂SO₃ (Merck 6657) 를 함께 용해하여,

1000 ml 의 최종 부피를 산출하였다.

방법:

기질을 제조하기 위해, 4 g 의 DMC 를 400 ml 의 PIPES 완충액에 용해하였다. 여과된 배양 상청액을 PIPES 완충액으로 희석하였고; 성장 플레이트 중의 대조군의 최종 농도는 20 ppm 였다. 그 다음, MTP 의 웰 중에 각 희석 상청액 10 ㎕ 을 200 ㎕ 의 기질에 첨가하였다. 테이프로 MTP 플레이트를 덮고, 몇 초간 진탕하고, 진탕 없이 2 시간 동안 37℃, 오븐에 두었다.

약 15 분 후 오븐으로부터 첫번째 플레이트 제거하고, 50 ml 의 시약 A 당 1 ml 의 TNBS 용액을 혼합하여 TNBS 시약을 제조하였다. MTP 를 웰 당 60 ㎕ 의 TNBS 시약 A 로 채웠다. 인큐베이션된 플레이트를 몇 초간 진탕하고, 이 후 10 ㎕ 를 TNBS 시약 A 가 담긴 MTP 로 옮겼다. 테이프로 플레이트를 덮고, 실온에서 500 rpm 으로 벤치 쉐이커 (BMG Thermostar) 에서 20 분 동안 진탕하였다. 마지막으로, 200 ㎕ 의 시약 B 를 웰에 첨가하고, 쉐이커에서 1 분 동안 혼합하고, MTP-판독기를 사용하여 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다.

디메틸카세인 가수분해 활성의 계산:

수득된 흡광도 값을 빈칸 값 (효소 없이 기질만) 에 대해 정정하였다. 수득 흡광도는 가수분해 활성에 대한 측정이다. 샘플의 (임의의) 특이적 활성을 흡광도 및 측정된 단백질 농도를 나누어 계산하였다.

열안정성 검정법

상기 검정법은 완충 배양 상청액의 가열 전후에, 디메틸카세인 (DMC) 가수분해에 기반한다. 디메틸카세인 가수분해 검정법에 기재된 바와 같은 동일한 화학약품 및 시약 용액을 사용하였다.

방법:

여과된 배양 상청액을 PIPES 완충액 중 20 ppm (성장 플레이트 중의 대조군의 농도에 기반함) 으로 희석하였다. 그 다음, 각 희석 상청액 50 ㎕ 을 MTP 의 빈 웰에 넣었다. MTP 플레이트를 iEMS 인큐베이터/쉐이커 HT (Thermo Labsystems) 에 90 분 동안 60℃ 및 400 rpm 에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 5 분 동안 빙상에서 냉각시켰다. 그 다음, 10 ㎕ 의 용액을 200 ㎕ 의 DMC 기질/웰을 함유하는 새로운 MTP 에 첨가하여, 인큐베이션 후 최종 활성을 측정하였다. 테이프로 상기 MTP 를 덮고, 몇 초간 진탕하고, 37℃ 오븐에서 진탕 없이 2 시간 동안 두었다. DMC 가수분해 검정법에 사용된 것과 동일한 검출법이 사용되었다.

열안정성의 계산:

샘플의 잔류 활성을 최종 흡광도 및 초기 흡광도의 비로서 표현하였다 (모두 빈칸에 대해 정정됨).

하기 표에서 제시되는 바와 같이, 상관 관계가 있는 것으로 밝혀진 특성은 (상관 계수 > 0.5) ASP 에 대해 CAS, KER 및 AAPF 였다. 기타 모두는 상관 관계가 없었다 (상관 계수 <0.3). 특성들이 상관 관계가 없다는 사실에도 불구하고, 돌연변이가 2 가지 특성에 유해할 것이라는 개연성은 기회에 의해 예상되는 것보다 훨씬 높다. 표 17-1 은 관찰된 수의 변이체의 계산된 비 및 기회에 근거한 변이체의 예상 수를 제공한다. 1 초과의 수는 양적 상관 관계를 나타내고, 1 미만의 수는 음적 상관 관계를 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Danisco US Inc., Genencor Division Cascao-Pereira, Luis G. Estell, David A. Goedegbuur, Frits Kellis Jr., James T. <120> Compositions and Methods Comprising Variant Microbial Proteases <130> 31178WO-2A <140> PCT/US09/46156 <141> 2009-06-03 <150> US 61/059,695 <151> 2008-06-06 <160> 568 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1149 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 gtgagaagca aaaaattgtg gatcagtttg ctgtttgctt tagcgttaat ctttacgatg 60 gcgttcggca gcacatcctc tgcccaggcg gcagggaaat caaacgggga aaagaaatat 120 attgtcgggt ttaaacagac aatgagcacg atgagcgccg ctaagaagaa agatgtcatt 180 tctgaaaaag gcgggaaagt gcaaaagcaa ttcaaatatg tagacgcagc ttcagctaca 240 ttaaacgaaa aagctgtaaa agaattgaaa aaagacccga gcgtcgctta cgttgaagaa 300 gatcacgtag cacatgcgta cgcgcagtcc gtgccttacg gcgtatcaca aattaaagcc 360 cctgctctgc actctcaagg ctacactgga tcaaatgtta aagtagcggt tatcgacagc 420 ggtatcgatt cttctcatcc tgatttaaag gtagcaggcg gagccagcat ggttccttct 480 gaaacaaatc ctttccaaga caacaactct cacggaactc acgttgccgg cacagttgcg 540 gctcttaata actcaatcgg tgtattaggc gttgcgccaa gcgcatcact ttacgctgta 600 aaagttctcg gtgctgacgg ttccggccaa tacagctgga tcattaacgg aatcgagtgg 660 gcgatcgcaa acaatatgga cgttattaac atgagcctcg gcggaccttc tggttctgct 720 gctttaaaag cggcagttga taaagccgtt gcatccggcg tcgtagtcgt tgcggcagcc 780 ggtaacgaag gcacttccgg cagctcaagc acagtgggct accctggtaa atacccttct 840 gtcattgcag taggcgctgt tgacagcagc aaccaaagag catctttctc aagcgtagga 900 cctgagcttg atgtcatggc acctggcgta tctatccaaa gcacgcttcc tggaaacaaa 960 tacggggcgt acaacggtac gtcaatggca tctccgcacg ttgccggagc ggctgctttg 1020 attctttcta agcacccgaa ctggacaaac actcaagtcc gcagcagttt agaaaacacc 1080 actacaaaac ttggtgattc tttctactat ggaaaagggc tgatcaacgt acaggcggca 1140 gctcagtaa 1149 <210> 2 <211> 382 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 2 Val Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ile Phe Thr Met Ala Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ala Gln Ala Ala Gly 20 25 30 Lys Ser Asn Gly Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met 35 40 45 Ser Thr Met Ser Ala Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly 50 55 60 Gly Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asp Ala Ala Ser Ala Thr 65 70 75 80 Leu Asn Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala 85 90 95 Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Tyr Ala Gln Ser Val Pro 100 105 110 Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr 115 120 125 Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser 130 135 140 Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser 145 150 155 160 Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His Gly Thr His Val Ala 165 170 175 Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala 180 185 190 Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser 195 200 205 Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn 210 215 220 Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala 225 230 235 240 Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val 245 250 255 Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val 260 265 270 Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp 275 280 285 Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp 290 295 300 Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Asn Lys 305 310 315 320 Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly 325 330 335 Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln 340 345 350 Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe 355 360 365 Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln 370 375 380 <210> 3 <211> 2013 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 3 gaattcctcc attttcttct gctatcaaaa taacagactc gtgattttcc aaacgagctt 60 tcaaaaaagc ctctgcccct tgcaaatcgg atgcctgtct ataaaattcc cgatattggc 120 ttaaacagcg gcgcaatggc ggccgcatct gatgtctttg cttggcgaat gttcatctta 180 tttcttcctc cctctcaata attttttcat tctatccctt ttctgtaaag tttatttttc 240 agaatacttt tatcatcatg ctttgaaaaa atatcacgat aatatccatt gttctcacgg 300 aagcacacgc aggtcatttg aacgaatttt ttcgacagga atttgccggg actcaggagc 360 atttaaccta aaaaagcatg acatttcagc ataatgaaca tttactcatg tctattttcg 420 ttcttttctg tatgaaaata gttatttcga gtctctacgg aaatagcgag agatgatata 480 cctaaataga gataaaatca tctcaaaaaa atgggtctac taaaatatta ttccatctat 540 tacaataaat tcacagaata gtcttttaag taagtctact ctgaattttt ttaaaaggag 600 agggtaaaga gtgagaagca aaaaattgtg gatcagtttg ctgtttgctt tagcgttaat 660 ctttacgatg gcgttcggca gcacatcctc tgcccaggcg gcagggaaat caaacgggga 720 aaagaaatat attgtcgggt ttaaacagac aatgagcacg atgagcgccg ctaagaagaa 780 agatgtcatt tctgaaaaag gcgggaaagt gcaaaagcaa ttcaaatatg tagacgcagc 840 ttcagctaca ttaaacgaaa aagctgtaaa agaattgaaa aaagacccga gcgtcgctta 900 cgttgaagaa gatcacgtag cacatgcgta cgcgcagtcc gtgccttacg gcgtatcaca 960 aattaaagcc cctgctctgc actctcaagg ctacactgga tcaaatgtta aagtagcggt 1020 tatcgacagc ggtatcgatt cttctcatcc tgatttaaag gtagcaggcg gagccagcat 1080 ggttccttct gaaacaaatc ctttccaaga caacaactct cacggaactc acgttgccgg 1140 cacagttgcg gctcttaata actcaatcgg tgtattaggc gttgcgccaa gcgcatcact 1200 ttacgctgta aaagttctcg gtgctgacgg ttccggccaa tacagctgga tcattaacgg 1260 aatcgagtgg gcgatcgcaa acaatatgga cgttattaac atgagcctcg gcggaccttc 1320 tggttctgct gctttaaaag cggcagttga taaagccgtt gcatccggcg tcgtagtcgt 1380 tgcggcagcc ggtaacgaag gcacttccgg cagctcaagc acagtgggct accctggtaa 1440 atacccttct gtcattgcag taggcgctgt tgacagcagc aaccaaagag catctttctc 1500 aagcgtagga cctgagcttg atgtcatggc acctggcgta tctatccaaa gcacgcttcc 1560 tggaaacaaa tacggggcgt acaacggtac gtcaatggca tctccgcacg ttgccggagc 1620 ggctgctttg attctttcta agcacccgaa ctggacaaac actcaagtcc gcagcagttt 1680 agaaaacacc actacaaaac ttggtgattc tttctactat ggaaaagggc tgatcaacgt 1740 acaggcggca gctcagtaaa acataaaaaa ccggccttgg ccccgccggt tttttattat 1800 ttttcttcct ccgcatgttc aatccgctcc ataatcgacg gatggctccc tctgaaaatt 1860 ttaacgagaa acggcgggtt gacccggctc agtcccgtaa cggccaagtc ctgaaacgtc 1920 tcaatcgccg cttcccggtt tccggtcagc tcaatgccgt aacggtcggc ggcgttttcc 1980 tgataccggg agacggcatt cgtaatcgga tcc 2013 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 4 gtcctctgtt aacttactga gctgccgcct gtac 34 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 5 ttatgcgagg ctagcaaaag gagagggtaa agagtgagaa gc 42 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 6 gcaatcagat cttccttcag gttatgacc 29 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 7 gcatcgaaga tctgattgct taactgcttc 30 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 cacgtagcac atgcatacnn scagtccgtg ccttacggc 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 gtagcacatg catacgcgnn stccgtgcct tacggcgta 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 gcacatgcat acgcgcagnn sgtgccttac ggcgtatca 39 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 catgcatacg cgcagtccnn sccttacggc gtatcacaa 39 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 gcatacgcgc agtccgtgnn stacggcgta tcacaaatt 39 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 13 tacgcgcagt ccgtgcctnn sggcgtatca caaattaaa 39 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 gcgcagtccg tgccttacnn sgtatcacaa attaaagcc 39 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 cagtccgtgc cttacggcnn stcacaaatt aaagcccct 39 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 16 tccgtgcctt acggcgtann scaaattaaa gcccctgct 39 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 gtgccttacg gcgtatcann sattaaagcc cctgctctg 39 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 18 ccttacggcg tatcacaann saaagcccct gctctgcac 39 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 tacggcgtat cacaaattnn sgcccctgct ctgcactct 39 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 20 ggcgtatcac aaattaaann scctgctctg cactctcaa 39 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 21 gtatcacaaa ttaaagccnn sgctctgcac tctcaaggc 39 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 22 tcacaaatta aagcccctnn sctgcactct caaggctac 39 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 caaattaaag cccctgctnn scactctcaa ggctacact 39 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 attaaagccc ctgctctgnn stctcaaggc tacactgga 39 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 aaagcccctg ctctgcacnn scaaggctac actggatca 39 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 26 gcccctgctc tgcactctnn sggctacact ggatcaaat 39 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 cctgctctgc actctcaann stacactgga tcaaatgtt 39 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 28 gctctgcact ctcaaggcnn sactggatca aatgttaaa 39 <210> 29 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 29 ctgcactctc aaggctacnn sggatcaaat gttaaagta 39 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 30 cactctcaag gctacactnn stcaaatgtt aaagtagcg 39 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 31 tctcaaggct acactggann saatgttaaa gtagcggtt 39 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 32 caaggctaca ctggatcann sgttaaagta gcggttatc 39 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 ggctacactg gatcaaatnn saaagtagcg gttatcgac 39 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 34 tacactggat caaatgttnn sgtagcggtt atcgacagc 39 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 35 actggatcaa atgttaaann sgcggttatc gacagcggt 39 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 36 ggatcaaatg ttaaagtann sgttatcgac agcggtatc 39 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 37 tcaaatgtta aagtagcgnn satcgacagc ggtatcgat 39 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 38 aatgttaaag tagcggttnn sgacagcggt atcgattct 39 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 39 gttaaagtag cggttatcnn sagcggtatc gattcttct 39 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 40 aaagtagcgg ttatcgacnn sggtatcgat tcttctcat 39 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 41 gtagcggtta tcgacagcnn satcgattct tctcatcct 39 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 gcggttatcg acagcggtnn sgattcttct catcctgat 39 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 43 gttatcgaca gcggtatcnn stcttctcat cctgattta 39 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 44 atcgacagcg gtatcgatnn stctcatcct gatttaaag 39 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 45 gacagcggta tcgattctnn scatcctgat ttaaaggta 39 <210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 46 agcggtatcg attcttctnn scctgattta aaggtagca 39 <210> 47 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 47 ggtatcgatt cttctcatnn sgatttaaag gtagcaggc 39 <210> 48 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 48 atcgattctt ctcatcctnn sttaaaggta gcaggcgga 39 <210> 49 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 49 gattcttctc atcctgatnn saaggtagca ggcggagcc 39 <210> 50 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 50 tcttctcatc ctgatttann sgtagcaggc ggagccagc 39 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 51 tctcatcctg atttaaagnn sgcaggcgga gccagcatg 39 <210> 52 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 52 catcctgatt taaaggtann sggcggagcc agcatggtt 39 <210> 53 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 53 cctgatttaa aggtagcann sggagccagc atggttcct 39 <210> 54 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 54 gatttaaagg tagcaggcnn sgccagcatg gttccttct 39 <210> 55 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 55 ttaaaggtag caggcggann sagcatggtt ccttctgaa 39 <210> 56 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 56 aaggtagcag gcggagccnn satggttcct tctgaaaca 39 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 gtagcaggcg gagccagcnn sgttccttct gaaacaaat 39 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 58 gcaggcggag ccagcatgnn sccttctgaa acaaatcct 39 <210> 59 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 59 ggcggagcca gcatggttnn stctgaaaca aatcctttc 39 <210> 60 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 60 ggagccagca tggttcctnn sgaaacaaat cctttccaa 39 <210> 61 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 61 gccagcatgg ttccttctnn sacaaatcct ttccaagac 39 <210> 62 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 62 agcatggttc cttctgaann saatcctttc caagacaac 39 <210> 63 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 63 atggttcctt ctgaaacann scctttccaa gacaacaac 39 <210> 64 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 64 gttccttctg aaacaaatnn sttccaagac aacaactct 39 <210> 65 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 65 ccttctgaaa caaatcctnn scaagacaac aactctcac 39 <210> 66 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 66 tctgaaacaa atcctttcnn sgacaacaac tctcacgga 39 <210> 67 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 67 gaaacaaatc ctttccaann saacaactct cacggaact 39 <210> 68 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 68 acaaatcctt tccaagacnn saactctcac ggaactcac 39 <210> 69 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 69 aatcctttcc aagacaacnn stctcacgga actcacgtt 39 <210> 70 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 70 cctttccaag acaacaacnn scacggaact cacgttgcc 39 <210> 71 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 71 ttccaagaca acaactctnn sggaactcac gttgccggc 39 <210> 72 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 72 caagacaaca actctcacnn sactcacgtt gccggcaca 39 <210> 73 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 73 gacaacaact ctcacggann scacgttgcc ggcacagtt 39 <210> 74 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 74 aacaactctc acggaactnn sgttgccggc acagttgcg 39 <210> 75 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 75 aactctcacg gaactcacnn sgccggcaca gttgcggct 39 <210> 76 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 76 tctcacggaa ctcacgttnn sggcacagtt gcggctctt 39 <210> 77 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 77 cacggaactc acgttgccnn sacagttgcg gctcttaat 39 <210> 78 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 78 ggaactcacg ttgccggcnn sgttgcggct cttaataac 39 <210> 79 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 79 actcacgttg ccggcacann sgcggctctt aataactca 39 <210> 80 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 80 cacgttgccg gcacagttnn sgctcttaat aactcaatc 39 <210> 81 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 81 gttgccggca cagttgcgnn scttaataac tcaatcggt 39 <210> 82 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 82 gccggcacag ttgcggctnn saataactca atcggtgta 39 <210> 83 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 83 ggcacagttg cggctcttnn saactcaatc ggtgtatta 39 <210> 84 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 84 acagttgcgg ctcttaatnn stcaatcggt gtattaggc 39 <210> 85 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 85 gttgcggctc ttaataacnn satcggtgta ttaggcgtt 39 <210> 86 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 86 gcggctctta ataactcann sggtgtatta ggcgttgcg 39 <210> 87 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 87 gctcttaata actcaatcnn sgtattaggc gttgcgcca 39 <210> 88 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 88 cttaataact caatcggtnn sttaggcgtt gcgccaagc 39 <210> 89 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 89 aataactcaa tcggtgtann sggcgttgcg ccaagcgca 39 <210> 90 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 90 aactcaatcg gtgtattann sgttgcgcca agcgcatca 39 <210> 91 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 91 tcaatcggtg tattaggcnn sgcgccaagc gcatcactt 39 <210> 92 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 92 atcggtgtat taggcgttnn sccaagcgca tcactttac 39 <210> 93 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 93 ggtgtattag gcgttgcgnn sagcgcatca ctttacgct 39 <210> 94 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 94 gtattaggcg ttgcgccann sgcatcactt tacgctgta 39 <210> 95 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 95 ttaggcgttg cgccaagcnn stcactttac gctgtaaaa 39 <210> 96 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 96 ggcgttgcgc caagcgcann sctttacgct gtaaaagtt 39 <210> 97 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 97 gttgcgccaa gcgcatcann stacgctgta aaagttctc 39 <210> 98 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 98 gcgccaagcg catcacttnn sgctgtaaaa gttctcggt 39 <210> 99 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 99 ccaagcgcat cactttacnn sgtaaaagtt ctcggtgct 39 <210> 100 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 100 agcgcatcac tttacgctnn saaagttctc ggtgctgac 39 <210> 101 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 101 gcatcacttt acgctgtann sgttctcggt gctgacggt 39 <210> 102 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 102 tcactttacg ctgtaaaann sctcggtgct gacggttcc 39 <210> 103 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 103 ctttacgctg taaaagttnn sggtgctgac ggttccggc 39 <210> 104 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 104 tacgctgtaa aagttctcnn sgctgacggt tccggccaa 39 <210> 105 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 105 gctgtaaaag ttctcggtnn sgacggttcc ggccaatac 39 <210> 106 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 106 gtaaaagttc tcggtgctnn sggttccggc caatacagc 39 <210> 107 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 107 aaagttctcg gtgctgacnn stccggccaa tacagctgg 39 <210> 108 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 108 gttctcggtg ctgacggtnn sggccaatac agctggatc 39 <210> 109 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 109 ctcggtgctg acggttccnn scaatacagc tggatcatt 39 <210> 110 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 110 ggtgctgacg gttccggcnn stacagctgg atcattaac 39 <210> 111 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 111 gctgacggtt ccggccaann sagctggatc attaacgga 39 <210> 112 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 112 gacggttccg gccaatacnn stggatcatt aacggaatc 39 <210> 113 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 113 ggttccggcc aatacagcnn satcattaac ggaatcgag 39 <210> 114 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 114 tccggccaat acagctggnn sattaacgga atcgagtgg 39 <210> 115 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 115 ggccaataca gctggatcnn saacggaatc gagtgggcg 39 <210> 116 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 116 caatacagct ggatcattnn sggaatcgag tgggcgatc 39 <210> 117 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 117 tacagctgga tcattaacnn satcgagtgg gcgatcgca 39 <210> 118 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 118 agctggatca ttaacggann sgagtgggcg atcgcaaac 39 <210> 119 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 119 tggatcatta acggaatcnn stgggcgatc gcaaacaat 39 <210> 120 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 120 atcattaacg gaatcgagnn sgcgatcgca aacaatatg 39 <210> 121 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 121 attaacggaa tcgagtggnn satcgcaaac aatatggac 39 <210> 122 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 122 aacggaatcg agtgggcgnn sgcaaacaat atggacgtt 39 <210> 123 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 123 ggaatcgagt gggcgatcnn saacaatatg gacgttatt 39 <210> 124 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 124 atcgagtggg cgatcgcann saatatggac gttattaac 39 <210> 125 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 125 gagtgggcga tcgcaaacnn satggacgtt attaacatg 39 <210> 126 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 126 tgggcgatcg caaacaatnn sgacgttatt aacatgagc 39 <210> 127 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 127 gcgatcgcaa acaatatgnn sgttattaac atgagcctc 39 <210> 128 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 128 atcgcaaaca atatggacnn sattaacatg agcctcggc 39 <210> 129 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 129 gcaaacaata tggacgttnn saacatgagc ctcggcgga 39 <210> 130 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 130 aacaatatgg acgttattnn satgagcctc ggcggacct 39 <210> 131 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 131 aatatggacg ttattaacnn sagcctcggc ggaccttct 39 <210> 132 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 132 atggacgtta ttaacatgnn sctcggcgga ccttctggt 39 <210> 133 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 133 gacgttatta acatgagcnn sggcggacct tctggttct 39 <210> 134 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 134 gttattaaca tgagcctcnn sggaccttct ggttctgct 39 <210> 135 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 135 attaacatga gcctcggcnn sccttctggt tctgctgct 39 <210> 136 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 136 aacatgagcc tcggcggann stctggttct gctgcttta 39 <210> 137 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 137 atgagcctcg gcggacctnn sggttctgct gctttaaaa 39 <210> 138 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 138 agcctcggcg gaccttctnn stctgctgct ttaaaagcg 39 <210> 139 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 139 ctcggcggac cttctggtnn sgctgcttta aaagcggca 39 <210> 140 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 140 ggcggacctt ctggttctnn sgctttaaaa gcggcagtt 39 <210> 141 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 141 ggaccttctg gttctgctnn sttaaaagcg gcagttgat 39 <210> 142 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 142 ccttctggtt ctgctgctnn saaagcggca gttgataaa 39 <210> 143 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 143 tctggttctg ctgctttann sgcggcagtt gataaagcc 39 <210> 144 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 144 ggttctgctg ctttaaaann sgcagttgat aaagccgtt 39 <210> 145 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 145 tctgctgctt taaaagcgnn sgttgataaa gccgttgca 39 <210> 146 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 146 gctgctttaa aagcggcann sgataaagcc gttgcatcc 39 <210> 147 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 147 gctttaaaag cggcagttnn saaagccgtt gcatccggc 39 <210> 148 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 148 ttaaaagcgg cagttgatnn sgccgttgca tccggcgtc 39 <210> 149 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 149 aaagcggcag ttgataaann sgttgcatcc ggcgtcgta 39 <210> 150 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 150 gcggcagttg ataaagccnn sgcatccggc gtcgtagtc 39 <210> 151 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 151 gcagttgata aagccgttnn stccggcgtc gtagtcgtt 39 <210> 152 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 152 gttgataaag ccgttgcann sggcgtcgta gtcgttgcg 39 <210> 153 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 153 gataaagccg ttgcatccnn sgtcgtagtc gttgcggca 39 <210> 154 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 154 aaagccgttg catccggcnn sgtagtcgtt gcggcagcc 39 <210> 155 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 155 gccgttgcat ccggcgtcnn sgtcgttgcg gcagccggt 39 <210> 156 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 156 gttgcatccg gcgtcgtann sgttgcggca gccggtaac 39 <210> 157 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 157 gcatccggcg tcgtagtcnn sgcggcagcc ggtaacgaa 39 <210> 158 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 158 tccggcgtcg tagtcgttnn sgcagccggt aacgaaggc 39 <210> 159 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 159 ggcgtcgtag tcgttgcgnn sgccggtaac gaaggcact 39 <210> 160 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 160 gtcgtagtcg ttgcggcann sggtaacgaa ggcacttcc 39 <210> 161 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 161 gtagtcgttg cggcagccnn saacgaaggc acttccggc 39 <210> 162 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 162 gtcgttgcgg cagccggtnn sgaaggcact tccggcagc 39 <210> 163 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 163 gttgcggcag ccggtaacnn sggcacttcc ggcagctca 39 <210> 164 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 164 gcggcagccg gtaacgaann sacttccggc agctcaagc 39 <210> 165 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 165 gcagccggta acgaaggcnn stccggcagc tcaagcaca 39 <210> 166 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 166 gccggtaacg aaggcactnn sggcagctca agcacagtg 39 <210> 167 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 167 ggtaacgaag gcacttccnn sagctcaagc acagtgggc 39 <210> 168 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 168 aacgaaggca cttccggcnn stcaagcaca gtgggctac 39 <210> 169 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 169 gaaggcactt ccggcagcnn sagcacagtg ggctaccct 39 <210> 170 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 170 ggcacttccg gcagctcann sacagtgggc taccctggt 39 <210> 171 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 171 acttccggca gctcaagcnn sgtgggctac cctggtaaa 39 <210> 172 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 172 tccggcagct caagcacann sggctaccct ggtaaatac 39 <210> 173 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 173 ggcagctcaa gcacagtgnn staccctggt aaataccct 39 <210> 174 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 174 agctcaagca cagtgggcnn scctggtaaa tacccttct 39 <210> 175 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 175 tcaagcacag tgggctacnn sggtaaatac ccttctgtc 39 <210> 176 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 176 agcacagtgg gctaccctnn saaataccct tctgtcatt 39 <210> 177 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 177 acagtgggct accctggtnn stacccttct gtcattgca 39 <210> 178 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 178 gtgggctacc ctggtaaann sccttctgtc attgcagta 39 <210> 179 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 179 ggctaccctg gtaaatacnn stctgtcatt gcagtaggc 39 <210> 180 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 180 taccctggta aataccctnn sgtcattgca gtaggcgct 39 <210> 181 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 181 cctggtaaat acccttctnn sattgcagta ggcgctgtt 39 <210> 182 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 182 ggtaaatacc cttctgtcnn sgcagtaggc gctgttgac 39 <210> 183 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 183 aaataccctt ctgtcattnn sgtaggcgct gttgacagc 39 <210> 184 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 184 tacccttctg tcattgcann sggcgctgtt gacagcagc 39 <210> 185 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 185 ccttctgtca ttgcagtann sgctgttgac agcagcaac 39 <210> 186 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 186 tctgtcattg cagtaggcnn sgttgacagc agcaaccaa 39 <210> 187 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 187 gtcattgcag taggcgctnn sgacagcagc aaccaaaga 39 <210> 188 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 188 attgcagtag gcgctgttnn sagcagcaac caaagagca 39 <210> 189 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 189 gcagtaggcg ctgttgacnn sagcaaccaa agagcatct 39 <210> 190 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 190 gtaggcgctg ttgacagcnn saaccaaaga gcatctttc 39 <210> 191 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 191 ggcgctgttg acagcagcnn scaaagagca tctttctca 39 <210> 192 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 192 gctgttgaca gcagcaacnn sagagcatct ttctcaagc 39 <210> 193 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 193 gttgacagca gcaaccaann sgcatctttc tcaagcgta 39 <210> 194 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 194 gacagcagca accaaagann stctttctca agcgtagga 39 <210> 195 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 195 agcagcaacc aaagagcann sttctcaagc gtaggacct 39 <210> 196 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 196 agcaaccaaa gagcatctnn stcaagcgta ggacctgag 39 <210> 197 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 197 aaccaaagag catctttcnn sagcgtagga cctgagctt 39 <210> 198 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 198 caaagagcat ctttctcann sgtaggacct gagcttgat 39 <210> 199 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 199 agagcatctt tctcaagcnn sggacctgag cttgatgtc 39 <210> 200 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 200 gcatctttct caagcgtann scctgagctt gatgtcatg 39 <210> 201 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 201 tctttctcaa gcgtaggann sgagcttgat gtcatggca 39 <210> 202 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 202 ttctcaagcg taggacctnn scttgatgtc atggcacct 39 <210> 203 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 203 tcaagcgtag gacctgagnn sgatgtcatg gcacctggc 39 <210> 204 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 204 agcgtaggac ctgagcttnn sgtcatggca cctggcgta 39 <210> 205 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 205 gtaggacctg agcttgatnn satggcacct ggcgtatct 39 <210> 206 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 206 ggacctgagc ttgatgtcnn sgcacctggc gtatctatc 39 <210> 207 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 207 cctgagcttg atgtcatgnn scctggcgta tctatccaa 39 <210> 208 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 208 gagcttgatg tcatggcann sggcgtatct atccaaagc 39 <210> 209 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 209 cttgatgtca tggcacctnn sgtatctatc caaagcacg 39 <210> 210 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 210 gatgtcatgg cacctggcnn stctatccaa agcacgctt 39 <210> 211 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 211 gtcatggcac ctggcgtann satccaaagc acgcttcct 39 <210> 212 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 212 atggcacctg gcgtatctnn scaaagcacg cttcctgga 39 <210> 213 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 213 gcacctggcg tatctatcnn sagcacgctt cctggaaac 39 <210> 214 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 214 cctggcgtat ctatccaann sacgcttcct ggaaacaaa 39 <210> 215 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 215 ggcgtatcta tccaaagcnn scttcctgga aacaaatac 39 <210> 216 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 216 gtatctatcc aaagcacgnn scctggaaac aaatacggg 39 <210> 217 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 217 tctatccaaa gcacgcttnn sggaaacaaa tacggggcg 39 <210> 218 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 218 atccaaagca cgcttcctnn saacaaatac ggggcgtac 39 <210> 219 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 219 caaagcacgc ttcctggann saaatacggg gcgtacaac 39 <210> 220 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 220 agcacgcttc ctggaaacnn stacggggcg tacaacggt 39 <210> 221 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 221 acgcttcctg gaaacaaann sggggcgtac aacggtacg 39 <210> 222 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 222 cttcctggaa acaaatacnn sgcgtacaac ggtacgtca 39 <210> 223 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 223 cctggaaaca aatacgggnn stacaacggt acgtcaatg 39 <210> 224 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 224 ggaaacaaat acggggcgnn saacggtacg tcaatggca 39 <210> 225 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 225 aacaaatacg gggcgtacnn sggtacgtca atggcatct 39 <210> 226 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 226 aaatacgggg cgtacaacnn sacgtcaatg gcatctccg 39 <210> 227 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 227 tacggggcgt acaacggtnn stcaatggca tctccgcac 39 <210> 228 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 228 ggggcgtaca acggtacgnn satggcatct ccgcacgtt 39 <210> 229 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 229 gcgtacaacg gtacgtcann sgcatctccg cacgttgcc 39 <210> 230 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 230 tacaacggta cgtcaatgnn stctccgcac gttgccgga 39 <210> 231 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 231 aacggtacgt caatggcann sccgcacgtt gccggagcg 39 <210> 232 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 232 ggtacgtcaa tggcatctnn scacgttgcc ggagcggct 39 <210> 233 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 233 acgtcaatgg catctccgnn sgttgccgga gcggctgct 39 <210> 234 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 234 tcaatggcat ctccgcacnn sgccggagcg gctgctttg 39 <210> 235 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 235 atggcatctc cgcacgttnn sggagcggct gctttgatt 39 <210> 236 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 236 gcatctccgc acgttgccnn sgcggctgct ttgattctt 39 <210> 237 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 237 tctccgcacg ttgccggann sgctgctttg attctttct 39 <210> 238 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 238 ccgcacgttg ccggagcgnn sgctttgatt ctttctaag 39 <210> 239 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 239 cacgttgccg gagcggctnn sttgattctt tctaagcac 39 <210> 240 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 240 gttgccggag cggctgctnn sattctttct aagcacccg 39 <210> 241 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 241 gccggagcgg ctgctttgnn sctttctaag cacccgaac 39 <210> 242 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 242 ggagcggctg ctttgattnn stctaagcac ccgaactgg 39 <210> 243 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 243 gcggctgctt tgattcttnn saagcacccg aactggaca 39 <210> 244 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 244 gctgctttga ttctttctnn scacccgaac tggacaaac 39 <210> 245 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 245 gctttgattc tttctaagnn sccgaactgg acaaacact 39 <210> 246 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 246 ttgattcttt ctaagcacnn saactggaca aacactcaa 39 <210> 247 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 247 attctttcta agcacccgnn stggacaaac actcaagtc 39 <210> 248 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 248 ctttctaagc acccgaacnn sacaaacact caagtccgc 39 <210> 249 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 249 tctaagcacc cgaactggnn saacactcaa gtccgcagc 39 <210> 250 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 250 aagcacccga actggacann sactcaagtc cgcagcagt 39 <210> 251 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 251 cacccgaact ggacaaacnn scaagtccgc agcagttta 39 <210> 252 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 252 ccgaactgga caaacactnn sgtccgcagc agtttagaa 39 <210> 253 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 253 aactggacaa acactcaann scgcagcagt ttagaaaac 39 <210> 254 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 254 tggacaaaca ctcaagtcnn sagcagttta gaaaacacc 39 <210> 255 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 255 acaaacactc aagtccgcnn sagtttagaa aacaccact 39 <210> 256 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 256 aacactcaag tccgcagcnn sttagaaaac accactaca 39 <210> 257 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 257 actcaagtcc gcagcagtnn sgaaaacacc actacaaaa 39 <210> 258 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 258 caagtccgca gcagtttann saacaccact acaaaactt 39 <210> 259 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 259 gtccgcagca gtttagaann saccactaca aaacttggt 39 <210> 260 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 260 cgcagcagtt tagaaaacnn sactacaaaa cttggtgat 39 <210> 261 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 261 agcagtttag aaaacaccnn sacaaaactt ggtgattct 39 <210> 262 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 262 agtttagaaa acaccactnn saaacttggt gattctttc 39 <210> 263 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 263 ttagaaaaca ccactacann scttggtgat tctttctac 39 <210> 264 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 264 gaaaacacca ctacaaaann sggtgattct ttctactat 39 <210> 265 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 265 aacaccacta caaaacttnn sgattctttc tactatgga 39 <210> 266 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 266 accactacaa aacttggtnn stctttctac tatggaaaa 39 <210> 267 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 267 actacaaaac ttggtgatnn sttctactat ggaaaaggg 39 <210> 268 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 268 acaaaacttg gtgattctnn stactatgga aaagggctg 39 <210> 269 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 269 aaacttggtg attctttcnn statggaaaa gggctgatc 39 <210> 270 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 270 cttggtgatt ctttctacnn sggaaaaggg ctgatcaac 39 <210> 271 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 271 ggtgattctt tctactatnn saaagggctg atcaacgta 39 <210> 272 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 272 gattctttct actatggann sgggctgatc aacgtacag 39 <210> 273 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 273 tctttctact atggaaaann sctgatcaac gtacaggcg 39 <210> 274 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 274 ttctactatg gaaaagggnn satcaacgta caggcggca 39 <210> 275 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 275 tactatggaa aagggctgnn saacgtacag 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280 ctgatcaacg tacaggcgnn sgctcagtaa agcttactg 39 <210> 281 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 281 atcaacgtac aggcggcann scagtaaagc ttactggcc 39 <210> 282 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 282 aacgtacagg cggcagctnn staaagctta ctggccgtc 39 <210> 283 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 283 gccgtaaggc acggactgsn ngtatgcatg tgctacgtg 39 <210> 284 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 284 tacgccgtaa ggcacggasn ncgcgtatgc atgtgctac 39 <210> 285 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 285 tgatacgccg taaggcacsn nctgcgcgta tgcatgtgc 39 <210> 286 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 286 ttgtgatacg ccgtaaggsn nggactgcgc gtatgcatg 39 <210> 287 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 287 aatttgtgat acgccgtasn ncacggactg cgcgtatgc 39 <210> 288 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 288 tttaatttgt gatacgccsn naggcacgga ctgcgcgta 39 <210> 289 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 289 ggctttaatt tgtgatacsn ngtaaggcac ggactgcgc 39 <210> 290 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic 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Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 295 ttgagagtgc agagcaggsn ntttaatttg tgatacgcc 39 <210> 296 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 296 gccttgagag tgcagagcsn nggctttaat ttgtgatac 39 <210> 297 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 297 gtagccttga gagtgcagsn naggggcttt aatttgtga 39 <210> 298 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 298 agtgtagcct tgagagtgsn nagcaggggc tttaatttg 39 <210> 299 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 299 tccagtgtag ccttgagasn ncagagcagg ggctttaat 39 <210> 300 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 300 tgatccagtg tagccttgsn ngtgcagagc aggggcttt 39 <210> 301 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 301 atttgatcca gtgtagccsn nagagtgcag agcaggggc 39 <210> 302 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 302 aacatttgat ccagtgtasn nttgagagtg cagagcagg 39 <210> 303 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 303 tttaacattt gatccagtsn ngccttgaga gtgcagagc 39 <210> 304 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 304 tactttaaca 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333 aggatttgtt tcagaaggsn ncatgctggc tccgcctgc 39 <210> 334 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 334 gaaaggattt gtttcagasn naaccatgct ggctccgcc 39 <210> 335 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 335 ttggaaagga tttgtttcsn naggaaccat gctggctcc 39 <210> 336 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 336 gtcttggaaa ggatttgtsn nagaaggaac catgctggc 39 <210> 337 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 337 gttgtcttgg aaaggattsn nttcagaagg aaccatgct 39 <210> 338 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 338 gttgttgtct tggaaaggsn ntgtttcaga aggaaccat 39 <210> 339 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 339 agagttgttg tcttggaasn natttgtttc agaaggaac 39 <210> 340 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 340 gtgagagttg ttgtcttgsn naggatttgt ttcagaagg 39 <210> 341 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 341 tccgtgagag ttgttgtcsn ngaaaggatt tgtttcaga 39 <210> 342 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 342 agttccgtga gagttgttsn nttggaaagg atttgtttc 39 <210> 343 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic 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Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 348 aactgtgccg gcaacgtgsn ntccgtgaga gttgttgtc 39 <210> 349 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 349 cgcaactgtg ccggcaacsn nagttccgtg agagttgtt 39 <210> 350 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 350 agccgcaact gtgccggcsn ngtgagttcc gtgagagtt 39 <210> 351 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 351 aagagccgca actgtgccsn naacgtgagt tccgtgaga 39 <210> 352 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 352 attaagagcc gcaactgtsn nggcaacgtg agttccgtg 39 <210> 353 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 353 gttattaaga gccgcaacsn ngccggcaac gtgagttcc 39 <210> 354 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 354 tgagttatta agagccgcsn ntgtgccggc aacgtgagt 39 <210> 355 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 355 gattgagtta ttaagagcsn naactgtgcc ggcaacgtg 39 <210> 356 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 356 accgattgag ttattaagsn ncgcaactgt gccggcaac 39 <210> 357 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 357 tacaccgatt gagttattsn nagccgcaac tgtgccggc 39 <210> 358 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 358 taatacaccg attgagttsn naagagccgc aactgtgcc 39 <210> 359 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 359 gcctaataca ccgattgasn nattaagagc cgcaactgt 39 <210> 360 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 360 aacgcctaat acaccgatsn ngttattaag agccgcaac 39 <210> 361 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 361 cgcaacgcct aatacaccsn ntgagttatt aagagccgc 39 <210> 362 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is 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(20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 391 gatcgcccac tcgattccsn naatgatcca gctgtattg 39 <210> 392 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 392 tgcgatcgcc cactcgatsn ngttaatgat ccagctgta 39 <210> 393 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 393 gtttgcgatc gcccactcsn ntccgttaat gatccagct 39 <210> 394 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 394 attgtttgcg atcgcccasn ngattccgtt aatgatcca 39 <210> 395 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 395 catattgttt gcgatcgcsn nctcgattcc gttaatgat 39 <210> 396 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 396 gtccatattg tttgcgatsn nccactcgat tccgttaat 39 <210> 397 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 397 aacgtccata ttgtttgcsn ncgcccactc gattccgtt 39 <210> 398 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 398 aataacgtcc atattgttsn ngatcgccca ctcgattcc 39 <210> 399 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 399 gttaataacg tccatattsn ntgcgatcgc ccactcgat 39 <210> 400 <400> 400 000 <210> 401 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 401 catgttaata acgtccatsn ngtttgcgat cgcccactc 39 <210> 402 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 402 gctcatgtta ataacgtcsn nattgtttgc gatcgccca 39 <210> 403 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 403 gaggctcatg ttaataacsn ncatattgtt tgcgatcgc 39 <210> 404 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 404 gccgaggctc atgttaatsn ngtccatatt gtttgcgat 39 <210> 405 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 405 tccgccgagg ctcatgttsn naacgtccat attgtttgc 39 <210> 406 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 406 aggtccgccg aggctcatsn naataacgtc catattgtt 39 <210> 407 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 407 agaaggtccg ccgaggctsn ngttaataac gtccatatt 39 <210> 408 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 408 accagaaggt ccgccgagsn ncatgttaat aacgtccat 39 <210> 409 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 409 agaaccagaa ggtccgccsn ngctcatgtt aataacgtc 39 <210> 410 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 410 agcagaacca gaaggtccsn ngaggctcat gttaataac 39 <210> 411 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 411 agcagcagaa ccagaaggsn ngccgaggct catgttaat 39 <210> 412 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 412 taaagcagca gaaccagasn ntccgccgag gctcatgtt 39 <210> 413 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 413 ttttaaagca gcagaaccsn naggtccgcc gaggctcat 39 <210> 414 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 414 cgcttttaaa gcagcagasn nagaaggtcc gccgaggct 39 <210> 415 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 415 tgccgctttt aaagcagcsn naccagaagg tccgccgag 39 <210> 416 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 416 aactgccgct tttaaagcsn nagaaccaga aggtccgcc 39 <210> 417 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 417 atcaactgcc gcttttaasn nagcagaacc agaaggtcc 39 <210> 418 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 418 tttatcaact gccgctttsn nagcagcaga accagaagg 39 <210> 419 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 419 ggctttatca actgccgcsn ntaaagcagc agaaccaga 39 <210> 420 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 420 aacggcttta tcaactgcsn nttttaaagc agcagaacc 39 <210> 421 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 421 tgcaacggct ttatcaacsn ncgcttttaa agcagcaga 39 <210> 422 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 422 ggatgcaacg gctttatcsn ntgccgcttt taaagcagc 39 <210> 423 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 423 gccggatgca acggctttsn naactgccgc ttttaaagc 39 <210> 424 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 424 gacgccggat gcaacggcsn natcaactgc cgcttttaa 39 <210> 425 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 425 tacgacgccg gatgcaacsn ntttatcaac tgccgcttt 39 <210> 426 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 426 gactacgacg ccggatgcsn nggctttatc aactgccgc 39 <210> 427 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 427 aacgactacg acgccggasn naacggcttt atcaactgc 39 <210> 428 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 428 cgcaacgact acgacgccsn ntgcaacggc tttatcaac 39 <210> 429 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 429 tgccgcaacg actacgacsn nggatgcaac ggctttatc 39 <210> 430 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 430 ggctgccgca acgactacsn ngccggatgc aacggcttt 39 <210> 431 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 431 accggctgcc gcaacgacsn ngacgccgga tgcaacggc 39 <210> 432 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 432 gttaccggct gccgcaacsn ntacgacgcc ggatgcaac 39 <210> 433 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 433 ttcgttaccg gctgccgcsn ngactacgac gccggatgc 39 <210> 434 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 434 gccttcgtta ccggctgcsn naacgactac gacgccgga 39 <210> 435 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 435 agtgccttcg ttaccggcsn ncgcaacgac tacgacgcc 39 <210> 436 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 436 ggaagtgcct tcgttaccsn ntgccgcaac gactacgac 39 <210> 437 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 437 gccggaagtg ccttcgttsn nggctgccgc aacgactac 39 <210> 438 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 438 gctgccggaa gtgccttcsn naccggctgc cgcaacgac 39 <210> 439 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 439 tgagctgccg gaagtgccsn ngttaccggc tgccgcaac 39 <210> 440 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 440 gcttgagctg ccggaagtsn nttcgttacc ggctgccgc 39 <210> 441 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 441 tgtgcttgag ctgccggasn ngccttcgtt accggctgc 39 <210> 442 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 442 cactgtgctt gagctgccsn nagtgccttc gttaccggc 39 <210> 443 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 443 gcccactgtg cttgagctsn nggaagtgcc ttcgttacc 39 <210> 444 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 444 gtagcccact gtgcttgasn ngccggaagt gccttcgtt 39 <210> 445 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 445 agggtagccc actgtgctsn ngctgccgga agtgccttc 39 <210> 446 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 446 accagggtag cccactgtsn ntgagctgcc ggaagtgcc 39 <210> 447 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 447 tttaccaggg tagcccacsn ngcttgagct gccggaagt 39 <210> 448 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 448 gtatttacca gggtagccsn ntgtgcttga gctgccgga 39 <210> 449 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 449 agggtattta ccagggtasn ncactgtgct tgagctgcc 39 <210> 450 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 450 agaagggtat ttaccaggsn ngcccactgt gcttgagct 39 <210> 451 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 451 gacagaaggg tatttaccsn ngtagcccac tgtgcttga 39 <210> 452 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 452 aatgacagaa gggtatttsn nagggtagcc cactgtgct 39 <210> 453 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 453 tgcaatgaca gaagggtasn naccagggta gcccactgt 39 <210> 454 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 454 tactgcaatg acagaaggsn ntttaccagg gtagcccac 39 <210> 455 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 455 gcctactgca atgacagasn ngtatttacc agggtagcc 39 <210> 456 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 456 agcgcctact gcaatgacsn nagggtattt accagggta 39 <210> 457 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 457 aacagcgcct actgcaatsn nagaagggta tttaccagg 39 <210> 458 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 458 gtcaacagcg cctactgcsn ngacagaagg gtatttacc 39 <210> 459 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 459 gctgtcaaca gcgcctacsn naatgacaga 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464 tgctctttgg ttgctgctsn naacagcgcc tactgcaat 39 <210> 465 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 465 agatgctctt tggttgctsn ngtcaacagc gcctactgc 39 <210> 466 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 466 gaaagatgct ctttggttsn ngctgtcaac agcgcctac 39 <210> 467 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 467 tgagaaagat gctctttgsn ngctgctgtc aacagcgcc 39 <210> 468 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 468 gcttgagaaa gatgctctsn ngttgctgct gtcaacagc 39 <210> 469 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 469 tacgcttgag aaagatgcsn nttggttgct gctgtcaac 39 <210> 470 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 470 tcctacgctt gagaaagasn ntctttggtt gctgctgtc 39 <210> 471 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 471 aggtcctacg cttgagaasn ntgctctttg gttgctgct 39 <210> 472 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 472 ctcaggtcct acgcttgasn nagatgctct ttggttgct 39 <210> 473 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 473 aagctcaggt cctacgctsn ngaaagatgc tctttggtt 39 <210> 474 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 474 atcaagctca ggtcctacsn ntgagaaaga tgctctttg 39 <210> 475 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 475 gacatcaagc tcaggtccsn ngcttgagaa agatgctct 39 <210> 476 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 476 catgacatca agctcaggsn ntacgcttga gaaagatgc 39 <210> 477 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 477 tgccatgaca tcaagctcsn ntcctacgct tgagaaaga 39 <210> 478 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 478 aggtgccatg acatcaagsn naggtcctac gcttgagaa 39 <210> 479 <211> 39 <212> DNA <213> 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<210> 484 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 484 gctttggata gatacgccsn ntgccatgac atcaagctc 39 <210> 485 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 485 cgtgctttgg atagatacsn naggtgccat gacatcaag 39 <210> 486 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 486 aagcgtgctt tggatagasn ngccaggtgc catgacatc 39 <210> 487 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 487 aggaagcgtg ctttggatsn ntacgccagg tgccatgac 39 <210> 488 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 488 tccaggaagc 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a, c, g, or t <400> 493 cgccccgtat ttgtttccsn naagcgtgct ttggataga 39 <210> 494 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 494 gtacgccccg tatttgttsn naggaagcgt gctttggat 39 <210> 495 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 495 gttgtacgcc ccgtatttsn ntccaggaag cgtgctttg 39 <210> 496 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 496 accgttgtac gccccgtasn ngtttccagg aagcgtgct 39 <210> 497 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 497 cgtaccgttg tacgccccsn ntttgtttcc aggaagcgt 39 <210> 498 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 498 tgacgtaccg ttgtacgcsn ngtatttgtt tccaggaag 39 <210> 499 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 499 cattgacgta ccgttgtasn ncccgtattt gtttccagg 39 <210> 500 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 500 tgccattgac gtaccgttsn ncgccccgta tttgtttcc 39 <210> 501 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 501 agatgccatt gacgtaccsn ngtacgcccc gtatttgtt 39 <210> 502 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 502 cggagatgcc attgacgtsn ngttgtacgc cccgtattt 39 <210> 503 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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517 gttcgggtgc ttagaaagsn ncaaagcagc cgctccggc 39 <210> 518 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 518 ccagttcggg tgcttagasn naatcaaagc agccgctcc 39 <210> 519 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 519 tgtccagttc gggtgcttsn naagaatcaa agcagccgc 39 <210> 520 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 520 gtttgtccag ttcgggtgsn nagaaagaat caaagcagc 39 <210> 521 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 521 agtgtttgtc cagttcggsn ncttagaaag aatcaaagc 39 <210> 522 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 522 ttgagtgttt gtccagttsn ngtgcttaga aagaatcaa 39 <210> 523 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 523 gacttgagtg tttgtccasn ncgggtgctt agaaagaat 39 <210> 524 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 524 gcggacttga gtgtttgtsn ngttcgggtg cttagaaag 39 <210> 525 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 525 gctgcggact tgagtgttsn nccagttcgg gtgcttaga 39 <210> 526 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 526 actgctgcgg acttgagtsn ntgtccagtt cgggtgctt 39 <210> 527 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic 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aaagaatcsn naagttttgt agtggtgtt 39 <210> 542 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 542 ttttccatag tagaaagasn naccaagttt tgtagtggt 39 <210> 543 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 543 cccttttcca tagtagaasn natcaccaag ttttgtagt 39 <210> 544 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 544 cagccctttt ccatagtasn nagaatcacc aagttttgt 39 <210> 545 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 545 gatcagccct tttccatasn ngaaagaatc accaagttt 39 <210> 546 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 546 gttgatcagc ccttttccsn ngtagaaaga atcaccaag 39 <210> 547 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 547 tacgttgatc agccctttsn natagtagaa agaatcacc 39 <210> 548 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 548 ctgtacgttg atcagcccsn ntccatagta gaaagaatc 39 <210> 549 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 549 cgcctgtacg ttgatcagsn nttttccata gtagaaaga 39 <210> 550 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 550 tgccgcctgt acgttgatsn ncccttttcc atagtagaa 39 <210> 551 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 551 agctgccgcc tgtacgttsn ncagcccttt tccatagta 39 <210> 552 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 552 ctgagctgcc gcctgtacsn ngatcagccc ttttccata 39 <210> 553 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 553 ttactgagct gccgcctgsn ngttgatcag cccttttcc 39 <210> 554 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 554 gctttactga gctgccgcsn ntacgttgat cagcccttt 39 <210> 555 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 555 taagctttac tgagctgcsn nctgtacgtt gatcagccc 39 <210> 556 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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cgcatcactt tacgctgtaa aagttctcgg tgctgacggt tccggccaat 360 acagctggat cattaacgga atcgagtggg cgatcgcaaa caatatggac gttattaaca 420 tgagcctcgg cggaccttct ggttctgctg ctttaaaagc ggcagttgat aaagccgttg 480 catccggcgt cgtagtcgtt gcggcagccg gtaacgaagg cacttccggc agctcaagca 540 cagtgggcta ccctggtaaa tacccttctg tcattgcagt aggcgctgtt gacagcagca 600 accaaagagc atctttctca agcgtaggac ctgagcttga tgtcatggca cctggcgtat 660 ctatccaaag cacgcttcct ggaaacaaat acggggcgta caacggtacg tcaatggcat 720 ctccgcacgt tgccggagcg gctgctttga ttctttctaa gcacccgaac tggacaaaca 780 ctcaagtccg cagcagttta gaaaacacca ctacaaaact tggtgattct ttctactatg 840 gaaaagggct gatcaacgta caggcggcag ctcagtaagt taacagagga ggatttcctg 900 aaggaaatcc gtttttttat tttaagcttg gaga 934 <210> 560 <211> 1303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 560 atctcaaaaa aatgggtcta ctaaaatatt actccatcta ttataataaa ttcacagaat 60 agtcttttaa gtaagtctac tctgaatttt tttaaaagga gagggtaaag agtgagaagc 120 aaaaaattgt ggatcgtcgc gtcgaccgca ttgctgattt ctgttgcttt tagctcatcc 180 atcgcatccg ctgctgaaga agcaaaagaa aaatatttaa ttggctttaa tgagcaggaa 240 gctgtcagtg agtttgtaga acaagttgag gcaaatgacg aggtagccat tctctctgag 300 gaagaggaag tcgaaattga attgcttcat gaatttgaaa cgattcctgt tctgtccgtt 360 gagttaagcc cagaagatgt ggacgcgtta gagctcgatc cagctatttc ttatattgaa 420 gaggatgcag aagtaactac aatggcgcaa tcggtaccat ggggaattag cagagtacaa 480 gccccagctg cacataaccg tggattgaca ggttctggtg taaaagttgc tgtccttgat 540 accggtattt ccactcatcc agacttaaat attcgtggtg gagctagctt tgtaccaggg 600 gaaccatcca ctcaagatgg caatggacat ggcactcatg ttgccggcac aatcgcggct 660 cttaacaatt caattggtgt tcttggcgta gcgccaagcg cagaactata cgctgttaaa 720 gtattaggag caagcggttc aggctctgtc agctctattg cccaaggatt ggaatgggca 780 gggaacaatg gcatgcacgt tgctaatctt agtttaggat ctccttcgcc aagtgccaca 840 cttgagcaag ctgttaatag cgcgacttct agaggcgttc ttgttgtagc ggcctctgga 900 aattcaggtg caggctcaat cagctatccg gcccgttatg cgaacgctat ggcagtcgga 960 gctactgacc aaaacaacaa ccgcgccagc ttttcacagt atggcgcagg gcttgacatt 1020 gtcgcaccag gtgtaaacgt gcagagcact tacccaggtt caacatatgc cagcttaaac 1080 ggtacatcaa tggctactcc tcatgttgca ggtgcggctg cacttgttaa acaaaagaac 1140 ccatcttggt ccaatgtaca aatccgcaat catcttaaga atacggcaac tagcttagga 1200 agcacaaact tgtatggaag cggacttgtc aatgcagaag ctgcaactcg ttaaaagctt 1260 aactcgagat aaaaaaccgg ccttggcccc gccggttttt tat 1303 <210> 561 <211> 380 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 561 Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile 1 5 10 15 Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys 20 25 30 Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe 35 40 45 Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu 50 55 60 Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val 65 70 75 80 Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp 85 90 95 Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala 100 105 110 Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His 115 120 125 Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr 130 135 140 Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe 145 150 155 160 Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His 165 170 175 Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly 180 185 190 Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser 195 200 205 Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly 210 215 220 Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro 225 230 235 240 Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val 245 250 255 Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr 260 265 270 Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn 275 280 285 Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val 290 295 300 Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala 305 310 315 320 Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala 325 330 335 Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg 340 345 350 Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr 355 360 365 Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 370 375 380 <210> 562 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 562 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 563 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 563 gaattcatct caaaaaaatg ggtctactaa aatattattc catctattat aataaattca 60 cagaatagtc ttttaagtaa gtctactctg aattttttta aaaggagagg gtaaagagtg 120 agaagcaaaa aattgtgaga agcaaaaaat tgtggatcag tttgctgttt gctttagcgt 180 taatctttac gatggcgttc ggcagcacat ccagcgcgca ggctgcaggg aaatcaaacg 240 gggaaaagaa atatattgtc gggtttaaac agacaatgag cacgatgagc gccgctaaga 300 agaaagacgt catttctgaa aaaggcggga aagtgcaaaa gcaattcaaa tatgtagacg 360 cagctagcgc tacattaaac gaaaaagctg taaaagaatt gaaaaaagac ccgagcgtcg 420 cttacgttga agaagatcac gtagcacacg cgtacgcgca gtccgtgcca tatggcgtat 480 cacaaattaa agcccctgct ctgcactctc aaggctacac cggttcaaat gttaaagtag 540 cggttatcga cagcggtatc gattcttctc atccagatct taaagtagca ggcggagcca 600 gcatggttcc ttctgaaaca aatcctttcc aagacaacaa ctctcacgga acacacgttg 660 ctggtaccgt tgcggctctt aataactcaa tcggtgtatt aggcgttgcg ccaagcgcat 720 cactttacgc tgtaaaagtt ctcggcgccg acggttccgg ccaatacagc tggatcatta 780 acggaatcga gtgggcgatc gcaaacaata tggacgttat taacatgagc ctcggcggac 840 cgtccggttc tgctgcttta aaagcggcag ttgataaagc cgttgcatcc ggcgtcgtag 900 tcgttgcggc agccggcaac gaaggcactt ccggcagctc aagcacagtg ggctaccctg 960 gtaaataccc ttctgtcatt gcagtaggcg ctgtcgacag cagcaaccaa agagcatctt 1020 tctcaagcgt aggacctgag ctcgatgtca tggcacctgg cgtatctatc caaagcacgc 1080 ttcctggaaa caaatacggc gcgttgaacg gtacatcaat ggcatctccg cacgttgccg 1140 gagccgcggc tttgattctt tctaagcacc cgaactggac aaacactcaa gtccgcagct 1200 ctctagaaaa caccactaca aaacttggtg attctttcta ctatggaaaa gggctgatca 1260 atgtacaggc ggcagctcag taaaactcga gataaaaaac cggccttggc cccgccggtt 1320 ttttat 1326 <210> 564 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic precursor protein <400> 564 Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ile Phe Thr Met Ala Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ala Gln Ala Ala Gly 20 25 30 Lys Ser Asn Gly Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met 35 40 45 Ser Thr Met Ser Ala Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly 50 55 60 Gly Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asp Ala Ala Ser Ala Thr 65 70 75 80 Leu Asn Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala 85 90 95 Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Tyr Ala Gln Ser Val Pro 100 105 110 Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr 115 120 125 Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser 130 135 140 Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser 145 150 155 160 Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His Gly Thr His Val Ala 165 170 175 Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala 180 185 190 Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser 195 200 205 Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn 210 215 220 Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala 225 230 235 240 Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val 245 250 255 Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val 260 265 270 Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp 275 280 285 Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp 290 295 300 Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Asn Lys 305 310 315 320 Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly 325 330 335 Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln 340 345 350 Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe 355 360 365 Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln 370 375 380 <210> 565 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus amiloliquefaciens <400> 565 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 566 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic Asp sequence <400> 566 atgacaccac gaactgtcac aagagctctg gctgtggcaa cagcagctgc tacactcttg 60 gctgggggta tggcagcaca agctaacgaa ccggctcctc caggatctgc atcagcccct 120 ccacgattag ctgaaaaact tgaccctgac ttacttgaag caatggaacg cgatctgggg 180 ttagatgcag aggaagcagc tgcaacgtta gcttttcagc atgacgcagc tgaaacggga 240 gaggctcttg ctgaggaact cgacgaagat ttcgcgggca cgtgggttga agatgatgtg 300 ctgtatgttg caaccactga tgaagatgct gttgaagaag tcgaaggcga aggagcaact 360 gctgtgactg ttgagcattc tcttgctgat ttagaggcgt ggaagacggt tttggatgct 420 gcgctggagg gtcatgatga tgtgcctacg tggtacgtcg acgtgcctac gaattcggta 480 gtcgttgctg taaaggcagg agcgcaggat gtagctgcag gacttgtgga aggcgctgat 540 gtgccatcag atgcggtcac ttttgtagaa acggacgaaa cgcctagaac gatgttcgac 600 gtaattggag gcaacgcata tactattggc ggccggtcta gatgttctat cggattcgca 660 gtaaacggtg gcttcattac tgccggtcac tgcggaagaa caggagccac tactgccaat 720 ccgactggca catttgcagg tagctcgttt ccgggaaatg attatgcatt cgtccgaaca 780 ggggcaggag taaatttgct tgcccaagtc aataactact cgggcggcag agtccaagta 840 gcaggacata cggccgcacc agttggatct gctgtatgcc gctcaggtag cactacaggt 900 tggcattgcg gaactatcac ggcgctgaat tcgtctgtca cgtatccaga gggaacagtc 960 cgaggactta tccgcacgac ggtttgtgcc gaaccaggtg atagcggagg tagcctttta 1020 gcgggaaatc aagcccaagg tgtcacgtca ggtggttctg gaaattgtcg gacgggggga 1080 acaacattct ttcaaccagt caacccgatt ttgcaggctt acggcctgag aatgattacg 1140 actgactctg gaagttcccc tgctccagca cctacatcat gtacaggcta cgcaagaacg 1200 ttcacaggaa ccctcgcagc aggaagagca gcagctcaac cgaacggtag ctatgttcag 1260 gtcaaccgga gcggtacaca ttccgtctgt ctcaatggac ctagcggtgc ggactttgat 1320 ttgtatgtgc agcgatggaa tggcagtagc tgggtaaccg tcgctcaatc gacatcgccg 1380 ggaagcaatg aaaccattac gtaccgcgga aatgctggat attatcgcta cgtggttaac 1440 gctgcgtcag gatcaggagc ttacacaatg ggactcaccc tcccctga 1488 <210> 567 <211> 189 <212> PRT <213> Cellulomonas bogoriensis <400> 567 Phe Asp Val Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Ile Gly Gly Arg Ser Arg 1 5 10 15 Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Asn Gly Gly Phe Ile Thr Ala Gly His 20 25 30 Cys Gly Arg Thr Gly Ala Thr Thr Ala Asn Pro Thr Gly Thr Phe Ala 35 40 45 Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Phe Val Arg Thr Gly Ala 50 55 60 Gly Val Asn Leu Leu Ala Gln Val Asn Asn Tyr Ser Gly Gly Arg Val 65 70 75 80 Gln Val Ala Gly His Thr Ala Ala Pro Val Gly Ser Ala Val Cys Arg 85 90 95 Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Thr Ala Leu Asn 100 105 110 Ser Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Val Arg Gly Leu Ile Arg Thr 115 120 125 Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu Leu Ala Gly 130 135 140 Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr 145 150 155 160 Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn Pro Ile Leu Gln Ala Tyr 165 170 175 Gly Leu Arg Met Ile Thr Thr Asp Ser Gly Ser Ser Pro 180 185 <210> 568 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic reagent <400> 568 Ala Ala Pro Phe 1

Claims

서브틸리신 변이체가 가수분해 활성을 갖고, 하기:

로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서의 치환을 포함하는 성숙 형태이며, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하는 바실러스 서브틸리신의 단리된 서브틸리신 변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 위치가:

로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하는 단리된 서브틸리신 변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 위치가:

로부터 선택되고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하는 서브틸리신 변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 서브틸리신 변이체가 18, 52, 72, 117, 119, 127, 144, 185, 209 및 213 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서의 치환을 추가로 포함하고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하는 서브틸리신 변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 치환이:

중 하나 이상을 포함하고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하는 서브틸리신 변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 치환이:

로부터 선택되는 치환의 조합을 포함하고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하는 서브틸리신 변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 치환이:

로부터 선택되는 조합을 포함하고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하는 서브틸리신 변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 치환이:

로부터 선택되는 조합을 포함하고, 상기 위치는 SEQ ID NO:2 로서 언급된 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하는 서브틸리신 변이체.
제 1 항에 언급된 서브틸리신 변이체를 코딩하는 단리된 핵산.
제 9 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제 10 항에 언급된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 1 항의 서브틸리신 변이체를 포함하는 세정 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 세정 조성물이 세탁 세제인 세정 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 세탁 세제가 냉수 세제, 저 pH 세제, 또는 압축 세제인 세정 조성물.
하기 a) 및 b) 단계를 포함하는, 바실러스 서브틸리신의 서브틸리신 변이체의 제조 방법:
a) 제 1 항의 서브틸리신 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; 및
b) 서브틸리신 변이체의 생성에 적합한 조건하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하여, 서브틸리신 변이체를 생성하는 단계.
제 15 항에 있어서, 생성된 서브틸리신 변이체를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 바실러스 종인 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 바실러스 종이 B. 서브틸리스인 방법.
섬유를 포함하는 표면 및/또는 물품을 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 단리된 서브틸리신 변이체를 포함하는 세정 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세정 방법.
하기 a) ~ f) 단계를 포함하는, 프로테아제 조작 방법:
a) 프로테아제의 일치하는 아미노산 위치에서 구별되는 치환을 갖는 다수의 프로테아제 변이체를 각각 포함하는 다수의 부위 평가 라이브러리 (SEL) 를 제공하는 단계;
b) 관심의 특성의 시험에서 SEL 의 프로테아제 변이체 및 표준 프로테아제를 시험하는 단계;
c) 시험에 대해 각각의 프로테아제 변이체에 대한 성능 지수 (PI) 를 측정하는 단계;
d) 비-제한적 위치로서 2 개 이상의 아미노산 위치를 확인하는 단계 (각각의 2 개의 SEL 에서 다수의 프로테아제 변이체 중 하나 이상이 0.5 초과의 PI 를 가짐); 및
f) 2 개 이상의 비-제한적 위치에서 각각 치환을 포함하는 다수의 다중-치환된 프로테아제 변이체를 포함하는 다중 돌연변이 라이브러리를 제공하는 단계.
제 20 항에 있어서, 상기 시험이 얼룩 제거 검정법 (마이크로천조각), LAS 안정성, EDTA 안정성, 세제 안정성 검정법, 및 특이적인 활성 검정법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 개 이상의 상이한 검정법을 포함하는 방법.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 프로테아제가 박테리아 서브틸리신인 방법.
하기 a) ~ d) 단계를 포함하는, 바실러스 서브틸리신의 다중 치환된 서브틸리신 변이체의 제조 방법:
a) 제 1 특성의 제 1 시험에서 및 제 2 특성의 제 2 시험에서 다수의 단독 치환된 서브틸리신 변이체를 시험하는 단계로서, 각 시험에서 모체 서브틸리신의 특성은 1.0 의 값으로 제시되고, 바람직한 제 1 또는 제 2 특성은 1.0 초과의 값을 갖고, 매우 바람직하지 않은 제 1 또는 제 2 특성은 약 0.80 미만의, 또는 일부 바람직한 구현예에서, 약 0.60 미만의 값을 갖는 단계;
b) 바람직한 제 1 특성과 연관되고 매우 바람직하지 않은 제 2 특성과 연관되지 않은 단독 치환된 서브틸리신 변이체 중 하나 이상 중의 치환을 확인하는 단계;
c) 바람직한 제 2 특성과 연관되고 매우 바람직하지 않은 제 1 특성과 연관되지 않은 단독 치환된 서브틸리신 변이체 중 하나 이상 중의 치환을 확인하는 단계; 및
d) 서브틸리신 내에 이전 단계로부터의 치환을 도입하여 다중-치환된 서브틸리신 변이체를 산출하는 단계.
제 23 항에 있어서, 제 1 시험 및 제 2 시험에서 다중-치환된 서브틸리신 변이체를 시험하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 개선된 서브틸리신 변이체는 제 1 및 제 2 시험 모두에서 1.0 초과의 값, 또는 제 1 시험에서 1.0 초과의 값 및 제 2 시험에서 0.80 내지 1.0 의 값을 달성하는 방법.
제 24 항에 있어서, 개선된 서브틸리신 변이체(들) 을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 25 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 특성이 음적 상관 관계가 있는 방법.
제 26 항에 있어서, 바람직한 제 1 또는 제 2 특성이 약 1.2 초과의 값을 갖는 방법.
제 24 항에 있어서, 매우 바람직하지 않은 제 1 또는 제 2 특성이 약 0.40 미만의 값을 갖는 방법.
제 24 항에 있어서, 제 1 특성이 안정성이고, 제 2 특성이 세정 성능인 방법.
제 29 항에 있어서, 상기 안정성이 세제 내 안정성을 포함하고, 상기 세정 성능이 세제 내 혈액 우유 잉크 (BMI) 세정 성능을 포함하는 방법.
제 24 항에 있어서, 세정 성능이 pH 가 5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 시험되는 방법.
제 24 항에 있어서, 모체 박테리아 서브틸리신이 SEQ ID NO:2 로서 언급된 아미노산 서열을 갖는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 야생형 성숙 형태인 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 위치가 약 50% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 모체 서브틸리신 내 위치인 방법.
제 33 항에 있어서, 모체 서브틸리신 내 상기 하나 이상의 위치가 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치인 방법.