JP2016526880A - 新規メタロプロテアーゼ - Google Patents
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- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06L—DRY-CLEANING, WASHING OR BLEACHING FIBRES, FILAMENTS, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR MADE-UP FIBROUS GOODS; BLEACHING LEATHER OR FURS
- D06L1/00—Dry-cleaning or washing fibres, filaments, threads, yarns, fabrics, feathers or made-up fibrous goods
- D06L1/12—Dry-cleaning or washing fibres, filaments, threads, yarns, fabrics, feathers or made-up fibrous goods using aqueous solvents
- D06L1/14—De-sizing
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
- D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
- D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
- D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
- D21C9/00—After-treatment of cellulose pulp, e.g. of wood pulp, or cotton linters ; Treatment of dilute or dewatered pulp or process improvement taking place after obtaining the raw cellulosic material and not provided for elsewhere
- D21C9/10—Bleaching ; Apparatus therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
Abstract
Description
本出願は、すべて2013年5月29日に出願された、国際公開第PCT/CN2013/076419号;同第PCT/CN2013/076387号;同第PCT/CN2013/076401号;同第PCT/CN2013/076406号;同第PCT/CN2013/076414号;同第PCT/CN2013/076384号;同第PCT/CN2013/076398号;及び同第PCT/CN2013/076415号に対する優先権を主張するものであり、これらの特許文献の全容は参照により本明細書に援用される。
本開示は、プロテアーゼ及びそれらの変異体に関する。プロテアーゼを含有している組成物は、クリーニング、食品及び飼料、並びにその他の様々な工業用途に好適である。
特に記載のない限り、本発明の実施は、当該技術分野内の分子生物学、タンパク質工学、微生物学及び組み換えDNA技術において通常使用される従来技術を伴う。このような技術は当業者に既知のものであり、当業者に広く知られている数多くの文献及び参考文献に記載されている。本明細書の上述の及び以降に記載されるすべての特許、特許出願、論文及び刊行物は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
・近隣wordsの閾値:11
・E値カットオフ:10
・スコア行列:NUC.3.1(マッチ=1,ミスマッチ=−3)
・ギャップ開始:5
・ギャップ伸長:2
また、アミノ酸配列検索におけるパラメーターは次の通りである。
・Word長:3
・E値カットオフ:10
・スコア行列:BLOSUM62
・ギャップ開始:11
・ギャップ伸長:1
本発明は、「本発明の酵素」又は「本発明のポリペプチド」として総称することのできる新規メタロプロテアーゼ酵素ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、単離されたポリペプチド、組換えポリペプチド、実質的に純粋なポリペプチド、又は非天然に生じたポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドはクリーニング用途で有用であり、クリーニングする必要のある物品又は表面をクリーニングする方法において有用なクリーニング組成物に組み込むことができる。
本発明は、「本発明の核酸」又は「本発明のポリヌクレオチド」と総称され、本発明のポリペプチドをコードする、単離された、非天然に生じる、又は組み換え核酸を提供する。以下に記載のすべてのものを含む本発明の核酸は、典型的に、対象とするポリペプチドをコードする配列又はそれらの断片を含むプラスミド発現ベクターの発現を介した本発明のポリペプチドの組み換えによる産生(例えば発現)に有用である。上記の通り、ポリペプチドは、酵素活性(例えば、タンパク質分解活性)を有するメタロプロテアーゼポリペプチドを包含し、クリーニング用途、並びにクリーニングする必要のある物品又は表面(例えば、物品の表面)をクリーニングするためのクリーニング組成物に有用である。
本発明のメタロプロテアーゼポリヌクレオペプチドをコードしている本発明の改変されたポリヌクレオチドを生成するのに好適であるものとして様々な方法が既知であり、例えば、部位飽和変異導入(site-saturation mutagenesis)、系統的変異導入、挿入変異導入、欠失変異導入、ランダム変異導入、部位特異的変異導入、及び定向進化、並びにその他の各種リコンビナトリアルなアプローチが挙げられるがこれらに限定されない。改変されたポリヌクレオチド及びタンパク質(例えば、メタロプロテアーゼポリペプチド)の作製方法としては、DNAシャッフリング法、ITCHY(Ostermeier et al.,7:2139〜44[1999])、SCRACHY(Lutz et al.98:11248〜53[2001]を参照されたい)、SHIPREC(Sieber et al.,19:456〜60[2001]を参照されたい)、及びNRR(Bittker et al.,20:1024〜9[2001];Bittker et al.,101:7011〜6[2004]を参照されたい)などの遺伝子の非相同組換えによる方法、並びにオリゴヌクレオチドを利用してランダムな及び標的とする変異、欠失及び/又は挿入を挿入する方法(Ness et al.,20:1251〜5[2002];Coco et al.,20:1246〜50[2002];Zha et al.,4:34〜9[2003];Glaser et al.,149:3903〜13[1992]を参照されたい)が挙げられる。
本発明は、本明細書に記載の本発明の少なくとも1種のメタロプロテアーゼポリヌクレオチド(例えば、本明細書に記載の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド)を含むベクター、本発明の少なくとも1種の核酸又はポリヌクレオチドを含む発現ベクター又は発現カセット、本発明の少なくとも1種の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離された、実質的に純粋な、又は組み換えDNA構築物、本発明の少なくとも1種のポリヌクレオチドを含む単離された又は組み換え細胞、並びにこのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、DNA構築物、細胞、細胞培養物、又はこれらの任意の組み合わせ若しくは混合物を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、助剤及びメタロプロテアーゼポリペプチドを含む組成物に使用でき、組成物は、布地ケア及びホームケア製品である。
特に断りのない限り、本明細書に提供される成分又は組成物のレベルはすべて、成分又は組成物の活性レベルに関するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は除外される。酵素成分の重量は活性タンパク質の合計に基づくものである。百分率(%)及び比率はすべて、特に断りのない限り、重量で計算している。すべての百分率(%)及び比率は、特に断りのない限り、総組成物に対し計算している。本発明の組成物は、クリーニング組成物、例えば、洗剤組成物などを包含する。例示された洗剤組成物において、酵素レベルは、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ特に断りのない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表記される。
本発明の更なる態様では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、メタロプロテアーゼ及びそれらの変異体を含む動物飼料組成物、動物飼料添加剤、及び/又はペットフードの成分として使用することができる。更に、本発明は、1種類以上の動物飼料材料、及び/又は動物飼料添加物成分、及び/又はペットフード材料に、メタロプロテアーゼポリペプチドを混合することを含む、このような動物飼料組成物、動物飼料添加組成物、及び/又はペットフードの調製方法に関する。更に、本発明は、動物飼料組成物、及び/又は動物飼料添加組成物、及び/又はペットフードの調製における、メタロプロテアーゼポリペプチドの使用に関する。
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを用いて布地を処理する(例えば、布地を湯通しする)組成物及び方法も想到される。布地の処理方法は当該技術分野において周知である(例えば、米国特許第6,077,316号を参照されたい)。例えば、布地の感触及び外観は、その布地を溶液中のメタロプロテアーゼと接触させる工程を含む方法により改善することができる。布地は、圧力下で溶液により処理され得る。
本明細書に記載のメタロプロテアーゼポリペプチドは、酵素により補助される製紙パルプの漂白、例えば、化学パルプ、セミケミカルパルプ、クラフトパルプ、機械パルプ又は亜硫酸塩法によリ調製されたパルプなどの漂白への更なる使用が見出されている。おおまかに言えば、製紙パルプの漂白に好適な条件下で製紙パルプを本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドとインキュベートする。
本明細書に記載のメタロプロテアーゼポリペプチドは、羽毛、皮膚、毛髪、皮革、及び等価物などの動物由来のタンパク質の酵素による除去及びそれらの分解又は廃棄への使用が更に見いだされる。いくつかの例では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む溶液中に動物の死骸を浸漬することで、従来の熱湯消毒水への浸漬又は抜羽プロセスと比較して皮膚を損傷から保護するよう機能させることができる。一実施形態では、羽毛には、羽毛の消化又は分解の開始に好適な条件下で、本発明の単離したメタロプロテアーゼポリペプチドを噴霧することができる。いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼは、上記のとおりに酸化剤と組み合わせて使用することができる。
請求される本発明は、以降の実施例により、更に詳細に記載されるが、この記載により本発明の範囲が請求されたものとして、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
パエニバチルス種(Paenibacillus sp.)メタロプロテアーゼPspPro3のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス種(Paenibacillus sp.)の株を選択した。37℃下で、Heart Infusion寒天プレート(Difco)で株を24時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムDNAを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ZymoのZF Fungal/Bacterial DNAミニプレップキット(カタログ番号D6005)によりゲノムDNAを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムDNAを使用した。Illuminaの次世代配列決定技術を利用して、BaseClear(Leiden,The Netherlands)によりパエニバチルス種(Paenibacillus sp.)株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、BioXpr(Namur,Belgium)によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス種(Paenibacillus sp.)のアノテーション後に、遺伝子のうち1つを同定し、この遺伝子配列をPspPro3と命名した。配列番号1に提供する。PspPro3遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号2に示す。このタンパク質は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785〜786)により予想されたとおり、N末端に長さにして26個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、PspPro3は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)Nprタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した(Takekawa et al.(1991)Journal of Bacteriology,173(21):6820〜6825)。PspPro3タンパク質に予想される成熟領域を配列番号3に示す。
パエニバチルス種(Paenibacillus sp.)メタロプロテアーゼPspPro3の発現
プロペプチド−成熟型のPspPro3のDNA配列を合成し、Generay(Shanghai,China)のバチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)発現ベクターp2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40〜52,2007)に挿入し、プラスミドpGX085(AprE−PspPro3)を得た(図1.1)。消化したベクターに、PspPro3タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)AprEシグナル配列の3末端と、予想されるPspPro3の未改変プロペプチド5’末端との間に3コドン(Ala−Gly−Lys)を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン(GTG)を有する。図1.1に示す通り、pGX085(AprE−PspPro3)は、AprEプロモーター、バチルス・スブチルス(B. subtilis)においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するAprEシグナル配列、及びPspPro3の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列(配列番号4)を含有する。合成AprE−PspPro3遺伝子の翻訳産物を配列番号5に示す。
メタロプロテアーゼPspPro3のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン(カタログ番号74H7165,Megazyme)を使用し、50mM Tris(pH 7)中で、精製したPspPro3のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をMilli−Q水(Millipore)で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを100mM Tris緩衝液(pH 7)に溶解して最終濃度1.5%(重量/体積)にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性96ウェルマイクロタイタープレート(96−MTP)(Corning Life Sciences,#3641)に50μLの希釈酵素(又はブランク対照としてMilli−Q H2Oのみ)を添加し、次に50μLの1.5%アゾ−カゼインを添加した。96−MTPのシール後、40℃下で、Thermomixer(Eppendorf)により650rpmで10分間反応を実施した。100μLの5%トリクロロ酢酸(TCA)を添加し反応を停止させた。平衡化(室温にて5分)後、遠心分離し(4℃、2000gで10分間)、120μLの上清を新しい96−MTPに移し、SpectraMax 190を使用して上清の吸光度を440nm(A440)で測定した。酵素のA440からブランク対照のA440を減算することにより実際のA440を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした(1.25ppm〜40ppm)。各値は2連アッセイの平均値とした。この値は5%超変動しない。タンパク質分解活性を実際のA440として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ(図1.2)により、PspPro3が活性プロテアーゼであることが示される。
メタロプロテアーゼPspPro3のpH特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なpH値(pH 4〜11の範囲)を有する12.5mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液でPspPro3のpH特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した96MTPで、特定のpHを有する50μLの25mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液を、2μLの希釈した酵素(250ppm/Milli−Q水)と混合し、続いて8μLの1.5%(重量/体積)アゾ−カゼイン水溶液を添加した。実施例1.3に記載のとおりに反応を実施し、解析した。各pH下での酵素活性を相対活性として記録した。最適pHでの活性を100%に設定した。pH4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10及び11を試験pHとした。各値は3連アッセイの平均値とした。図1.3に示す通り、PspPro3の最適pHは7.5であり、pH 5.5〜9で最大活性の70%超を保有する。
メタロプロテアーゼPspPro3の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、50mM Tris緩衝液(pH 7)でPspPro3の温度プロファイルを解析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例3に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、200μLのPCRチューブ中で、50μLの1.5%アゾ−カゼイン及び45μl Milli−Q水を混合し、これを次にPeltier Thermal Cycler(BioRad)で所望の温度(すなわち20〜90℃)で5分間インキュベートした。インキュベート後、5μLの希釈したPspPro3(100ppm)又は水(ブランク対照)を基質混合物に添加し、Peltier Thermal Cycleで異なる温度で10分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに100μLの5% TCAを入れた96−MTPに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例1.3に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を100%と設定して、活性を相対活性として記録した。20、30、40、50、60、70、80、及び90℃で試験した。各値は3連アッセイの平均値とした。図1.4のデータは、PspPro3が50℃を最適温度とし、45℃〜60℃で最大活性の70%超を保有していたことを示す。
自動食器洗浄(ADW)条件下でのメタロプロテアーゼPspPro3のクリーニング性能
PA−S−38(色素を添加した卵黄、加熱エージング処理)布帛細片(CFT−Vlaardingen,The Netherlands)を使用し、自動食器洗浄(ADW)のモデル洗剤をpH 6又は8で利用して、自動食器洗浄(ADW)条件下でのPspPro3のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したPspPro3を、10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度100ppm(Ca2+:Mg2+=3:1)で、漂白成分(過酸N,N−フタロイルアミノペルオキシカプロン酸−PAP)の非存在下又は存在下でAT洗剤(表1.1に示す組成)により反応を実施した。反応を開始するに当たり、PA−S−38布帛細片を入れた96−MTPに、pH6又は8で緩衝した180μLのAT洗剤を添加し、次に20μLの希釈した酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、50℃の恒温器/振とう器で1150rpmで20分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから100μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を利用して吸光度を405nm(A405)で測定した(本明細書において「初期性能」として参照)。96−MTPに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を200μL水ですすぎ洗いをした。180μLの0.1M CAPS緩衝液(pH 10)の添加後、50℃に設定した恒温器/振とう器で1150rpmで10分間2回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち100μLを新しい96−MTPに移し、405nmで吸光度を測定した(本明細書において「洗浄後」として参照)。2回の吸光度測定値を合算(「初期性能」と「洗浄後」の値を合算)し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する。AT洗剤中、pH 6及びpH 8下、漂白剤の存在又は非存在下での、PA−S−38布帛細片のクリーニングにおける、PspPro3の用量応答について、それぞれ図5A及び5Bに示す。
洗濯条件のメタロプロテアーゼPspPro3のクリーニング性能
EMPA−116(血液/牛乳/インクで汚した綿)布帛細片(CFT Vlaardingen,The Netherlandsから入手)を使用し、pH 8.2下で市販の洗剤を利用して、液体洗濯洗剤中のPspPro3タンパク質のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したPspPro3タンパク質サンプルを希釈溶液(10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコール)で既定の濃度に希釈した;市販の洗剤(Tide(登録商標)、Clean Breeze(登録商標)、Proctor & Gamble、USA、2011年9月に購入)を95℃で1時間インキュベートして、洗剤中に存在する酵素を失活させた。続いて、タンパク質分解アッセイを実施して、市販の洗剤中のプロテアーゼが失活していることを確認した。熱処理した洗剤を、5mM HEPES(pH 8.2)で最終濃度0.788g/Lに更に希釈した。一方、緩衝化した液体洗剤の水硬度は103ppmに調整した(Ca2+:Mg2+=3:1)。緩衝化した洗剤中のNaCl濃度を調節することにより、緩衝化した洗剤の比導電率を0.62mS/cm(低導電率)又は3.5mS/cm(高導電率)に調整した。反応を開始するに当たり、EMPA−116布帛細片を入れた96−MTPに190μLの高伝導率又は低伝導率の緩衝化した洗剤を添加し、次に10μLの希釈酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、32℃の恒温器/振とう器で1150rpmで20分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから150μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を使用して600nmで吸光度を測定した。この吸光度が染みモデルに対するプロテアーゼ活性を示す;続いて、酵素のA600からブランク対照のA600を減算することにより実際のA600を計算した。高伝導率又は低伝導率の液体洗濯洗剤中でのEMPA−116布帛細片のクリーニングについての用量応答を図1.6に示す。
PspPro3とその他のメタロプロテアーゼとの比較
A.相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、BLAST検索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389〜402,1997)により、NCBIの非冗長タンパク質データベース及びGenome Quest Patentデータベースで相同物を同定した。PspPro3の成熟タンパク質アミノ酸配列(配列番号3)をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率(PID)は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表1.2A及び1.2Bは、PspPro3に対する各配列の同一率についての一覧である。表1.2中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
CLUSTALWソフトウェア(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673〜4680,1994)をデフォルトパラメーターで利用して、成熟PspPro3(配列番号:3)のアミノ酸配列をサーモリシン(P00800,バチルス・サーモプロテオリティクス(Bacillus thermoproteolyticus))及びパエニバチルス種(Paenibacillus sp.)Aloe−11由来のプロテアーゼ(ZP_09775364)とアラインメントした。図1.7は、PspPro3配列とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
表2Aの代表的な相同体の配列及び近隣結合法(NJ)を利用して、PspPro3(配列番号:2)の完全長の配列についての系統発生樹を作製した(Saitou,N.;and Nei,M.(1987).The neighbor−joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.4,406〜425)。NJ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。phylodendron−系統発生樹プリンターソフトウェア(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint−form.html)を利用して系統発生樹を表示した。これを図1.8に示す。
Terg−o−TometerによるPspPro3の性能評価
Terg−o−Tometer(Instrument Marketing Services,Inc,Fairfield,NJ)を利用して、洗濯洗剤用途についてPspPro3の洗浄性能を試験した。32℃及び16℃で性能評価を実施した。負荷布は、1Lの脱イオン水を入れたTerg−o−Tometerの各ビーカーに、合計重量が40gになるよう、次のうちの2種の染み付き布帛細片:EMPA116:木綿に対し血液、牛乳、インク(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland)、EMPA117:ポリコットンに対し血液、牛乳、インク(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland)、EMPA112:木綿に対しココア(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland)、及びCFT C−10:木綿に対し顔料、油、及び牛乳成分(Center for Testmaterials BV,Vlaardingen,Netherlands)、に加え、エクストラ・ホワイト・インターロック・ニット生地を入れたものとした。水硬度は102ppm(6グレーン/ガロン)に調製し、ビーカー中で5mM HEPES(pH 8.2)によりpHを緩衝させた。近所の米国スーパーマーケットで購入し、熱により失活させた、市販の液体洗剤であるTide Regular HDL(Procter & Gamble)を0.8g/Lで使用した。使用前に、水浴中で92℃の温度で2〜3時間、洗剤を不活性化させた後、室温に冷却した。市販の洗剤を熱により失活させることで、酵素成分の活性を破壊しつつ、非酵素成分の特性を保持させる。熱により失活させた洗剤の酵素活性は、プロテアーゼ活性を測定するためのSuc−AAPF−pNAアッセイを利用して測定した。Purafect(登録商標)Prime HA、(Genencor Int’l)及びPspPro3プロテアーゼをそれぞれ最終濃度が0、0.2、0.5、1、及び1.5ppmになるよう添加した。洗浄時間は12分とした。洗浄処理後、すべての布帛細片を3分間すすぎ洗いし、低温で機械乾燥させた。
パエニバチルス種(Paenibacillus sp.)からのメタロプロテアーゼPspPro2のクローニング
様々な工業用途に有用となり得る可能性のある酵素供給源としてパエニバチルス種(Paenibacillus sp.)株を選択した。37℃下で、Heart Infusion寒天プレート(Difco)で株を24時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムDNAを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ZymoのZF Fungal/Bacterial DNAミニプレップキット(カタログ番号D6005)によりゲノムDNAを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムDNAを使用した。Illuminaの次世代配列決定技術を利用して、BaseClear(Leiden,The Netherlands)によりパエニバチルス種(Paenibacillus sp.)株の完全なゲノムを配列を決定した。データのアセンブリ後、BioXpr(Namur,Belgium)によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス種(Paenibacillus sp.)のアノテーション後に、遺伝子のうち1つを同定し、この遺伝子配列をPspPro2と命名した。配列番号6に提供する。PspPro2遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号7に示す。このタンパク質は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785〜786)により予想されたとおり、N末端に長さにして24個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、PspPro2は分泌酵素であることが示唆される。PspPro2のプロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)Nprタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した(Takekawa et al.et al.(1991)Journal of Bacteriology,173(21):6820〜6825)。PspPro2に予想される成熟領域を配列番号8に示す。
パエニバチルス種(Paenibacillus sp.)メタロプロテアーゼPspPro2の発現
プロペプチド−成熟型のPspPro2のDNA配列を合成し、Generay(Shanghai,China)のバチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)発現ベクターp2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40〜52,2007)に挿入し、プラスミドpGX084(AprE−PspPro2)を得た(図2.1)。消化したベクターに、PspPro2タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)AprEシグナル配列の3末端と、予想されるPspPro2の未改変プロペプチド5’末端との間に3コドン(Ala−Gly−Lys)を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン(GTG)を有する。図2.1に示す通り、pGX084(AprE−PspPro2)は、AprEプロモーター、バチルス・スブチルス(B.subtilis)においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するAprEシグナル配列、並びにPspPro2の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列を含有する(配列番号9)。合成AprE−PspPro2遺伝子の翻訳産物を配列番号10に示す。
メタロプロテアーゼPspPro2のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン(カタログ番号74H7165,Megazyme)を使用し、50mM Tris(pH 7)中で、精製したPspPro2のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をMilli−Q水(Millipore)で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを100mM Tris緩衝液(pH 7)に溶解して最終濃度1.5%(重量/体積)にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性96ウェルマイクロタイタープレート(96−MTP)(Corning Life Sciences,#3641)に、50μLの希釈した酵素(又はブランク対照としてMilli−Q水のみ)を添加し、次に50μLの1.5%アゾ−カゼインを添加した。96−MTPのシール後、40℃下で、Thermomixer(Eppendorf)により650rpmで10分間反応を実施した。100μLの5%トリクロロ酢酸(TCA)を添加し反応を停止させた。平衡化(室温にて5分)後、遠心分離し(4℃、2000gで10分間)、120μLの上清を新しい96−MTPに移し、SpectraMax 190を使用して上清の吸光度を440nm(A440)で測定した。酵素のA440からブランク対照のA440を減算することにより実際のA440を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした(1.25ppm〜40ppm)。各値は2連アッセイの平均値とした。この値は5%超変動しない。タンパク質分解活性を実際のA440として示す。アゾ−カゼインを基質とするタンパク質分解アッセイにより、PspPro2は活性なプロテアーゼであることが示された。
メタロプロテアーゼPspPro2のpH特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なpH値(pH 4〜11の範囲)を有する12.5mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液でPspPro2のpH特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した96MTPで、特定のpHを有する50μLの25mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液を、2μLの希釈した酵素(500ppm/Milli−Q水)と混合し、続いて48μLの1.5%(重量/体積)アゾ−カゼイン水溶液を添加した。実施例2.3に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適pH下での活性を100%と設定し、各pH下での酵素活性を相対活性として記録した。pH 4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10及び11を試験pH値とした。各値は3連アッセイの平均値である。図2.3に示す通り、PspPro2の最適pHは7.5であり、pH 5.5〜9.5で最大活性の70%超を保有する。
メタロプロテアーゼPspPro2の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、50mM Tris緩衝液(pH 7)中で、PspPro2の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例2.3に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、200μLのPCRチューブ中で、50μLの1.5%アゾ−カゼイン及び45μl Milli−Q水を混合し、これを次にPeltier Thermal Cycler(BioRad)で所望の温度(すなわち20〜90℃)で5分間インキュベートした。インキュベート後、5μLの希釈したPspPro2(200ppm)又は水(ブランク対照)を基質混合物に添加し、Peltier Thermal Cycleで異なる温度で10分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに100μLの5% TCAを入れた96−MTPに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例3に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を100%と設定して、活性を相対活性として記録した。20、30、40、50、60、70、80及び90℃を試験温度とした。各値は2連アッセイの平均値である。図2.4のデータは、PspPro2が50℃を最適温度とし、40℃〜65℃で最大活性の70%超を保有していたことを示す。
自動食器洗浄(ADW)条件下でのメタロプロテアーゼPspPro2のクリーニング性能
PA−S−38(色素を添加した卵黄、加熱エージング処理)布帛細片(CFT−Vlaardingen,The Netherlands)を使用し、自動食器洗浄(ADW)のモデル洗剤をpH 6又は8で利用して、自動食器洗浄(ADW)条件下でのPspPro2のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したPspPro2タンパク質サンプルを、10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度100ppm(Ca2+:Mg2+=3:1)で、漂白成分(過酸N,N−フタロイルアミノペルオキシカプロン酸−PAP)の存在下でAT洗剤により反応を実施した(表1に示すAT洗剤組成物)。反応を開始するに当たり、PA−S−38布帛細片を入れた96−MTPに、pH6又はpH8で緩衝した180μLのAT洗剤を添加し、次に20μLの希釈した酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、50℃の恒温器/振とう器で1150rpmで50分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから100μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を利用して吸光度を405nmで測定した(本明細書において「初期性能」として参照)。96−MTPに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を200μL水ですすぎ洗いをした。180μLの0.1M CAPS緩衝液(pH 10)の添加後、50℃に設定した恒温器/振とう器で1150rpmで10分間2回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち100μLを新しい96−MTPに移し、405nmで吸光度を測定した(本明細書において「洗浄後」として参照)。2回の吸光度測定値を合算(「初期性能」と「洗浄後」の値を合算)し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する。AT洗剤中、pH 6及びpH 8下、漂白剤の存在又は非存在下での、PA−S−38布帛細片のクリーニングにおける、PspPro2の用量応答について、それぞれ図2.5A及び2.5Bに示す。
洗濯条件下でのメタロプロテアーゼPspPro2のクリーニング性能
A.液体洗濯洗剤中でのクリーニング性能
EMPA−116(血液/牛乳/インクで汚した綿)布帛細片(CFT Vlaardingen,The Netherlandsから入手)を使用し、pH8.2下で市販の洗剤を利用して、液体洗濯洗剤中のPspPro2タンパク質のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したPspPro2タンパク質サンプルを希釈液(10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコール)により所望の濃度に希釈した;市販の洗剤(Tide(登録商標)、Clean Breeze(登録商標)、Proctor & Gamble、USA、2011年9月に購入)を95℃で1時間インキュベートして、洗剤中に存在する酵素を失活させた。続いて、タンパク質分解アッセイを実施して、市販の洗剤中のプロテアーゼが失活していることを確認した。熱処理した洗剤を、5mM HEPES(pH 8.2)で最終濃度0.788g/Lに更に希釈した。一方、緩衝化した液体洗剤の水硬度は103ppmに調整した(Ca2+:Mg2+=3:1)。緩衝化した洗剤中のNaCl濃度を調節することにより、緩衝化した洗剤の比導電率を0.62mS/cm(低導電率)又は3.5mS/cm(高導電率)に調整した。反応を開始するに当たり、EMPA−116布帛細片を入れた96−MTPに190μLの高伝導率又は低伝導率の緩衝化した洗剤を添加し、次に10μLの希釈酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、32℃の恒温器/振とう器で1150rpmで20分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから150μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を使用して600nmで吸光度を測定した。この吸光度が染みモデルに対するプロテアーゼ活性を示す;続いて、酵素の「合計性能」のA600からブランク対照の「合計性能」のA600を減算することにより実際のA600を計算した。高伝導率又は低伝導率の液体洗濯洗剤中でのEMPA−116布帛細片のクリーニングについての用量応答を図2.6Aに示す。
PA−S−38(色素を添加した卵黄、加熱エージング処理)布帛細片(CFT−Vlaardingen,The Netherlands)を使用し、市販の洗剤を利用して、粉末洗濯洗剤におけるPspPro2タンパク質のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したPspPro2タンパク質サンプルを、希釈液(10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコール)により所望の濃度に希釈した。粉末洗濯洗剤(Tide(登録商標)、漂白剤不含有、Proctor & Gamble、中国、2011年12月購入)を硬度103ppmの水に溶解させて(Ca2+:Mg2+=3:1)、最終濃度2g/L(伝導率2.3mS/cm−低伝導率)又は5g/L(伝導率5.5mS/cm−高伝導率)とした。続いて、伝導率の異なる洗剤をマイクロ波で沸騰寸前まで加熱して、洗剤中に存在する酵素を失活させた。処理後にタンパク質分解活性を測定して、市販の洗剤中のプロテアーゼが失活していることを確認した。反応を開始するに当たり、PA−S−38布帛細片を入れた96−MTPに、加熱処理済みの高又は低電導率の洗剤190μLを添加し、次に10μLの希釈した酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、32℃の恒温器/振とう器で1150rpmで15分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから150μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を使用して405nmで吸光度を測定した。この吸光度が染みモデルに対するプロテアーゼ活性を示す;続いて、酵素の「合計性能」のA405からブランク対照の「合計性能」のA405を減算することにより実際のA405を計算した。高又は低伝導率の粉末洗濯洗剤によるPA−S−38布帛細片クリーニングの用量応答性を図2.6Bに示す。
PspPro2とその他のメタロプロテアーゼとの比較
相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、BLAST検索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389〜402,1997)により、NCBIの非冗長タンパク質データベース及びGenome Quest Patentデータベースで相同物を同定した。PspPro2(配列番号8)の成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率(PID)は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表2.2A及び2.2Bは、PspPro2に対する配列同一性(%)の一覧を提供する。表2.2中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
CLUSTALWソフトウェア(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673〜4680,1994)をデフォルトパラメーターで利用して、成熟PspPro2のアミノ酸配列(配列番号:8)サーモリシン(P00800,バチルス・サーモプロテイリティクス(Bacillus thermoproteolyticus))の配列及びパエニバチルス種(Paenibacillus sp.)、Aloe−11由来のプロテアーゼ(ZP_09775365.1)配列とアラインメントした。図2.7は、PspPro2配列とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
前駆体PspPro2タンパク質配列(配列番号:7)の完全長の配列についての系統発生樹を作製した(Saitou,N.;and Nei,M.(1987).The neighbor−joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.4,406〜425)。NJ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。phylodendron−系統発生樹プリンターソフトウェア(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint−form.html)を利用して系統発生樹を表示した。これを図2.8に示す。
パエニバチルス・ヒュミカス(Paenibacillus humicus)メタロプロテアーゼPhuPro2のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス・ヒュミカス(Paenibacillus humicus)の株(DSM18784)を選択した。37℃下で、Heart Infusion寒天プレート(Difco)で株を24時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムDNAを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ZymoのZF Fungal/Bacterial DNAミニプレップキット(カタログ番号D6005)によりゲノムDNAを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムDNAを使用した。Illuminaの次世代配列決定技術を利用して、BaseClear(Leiden,The Netherlands)によりパエニバチルス・ヒュミカス(Paenibacillus humicus)株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、BioXpr(Namur,Belgium)によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス・ヒュミカス(Paenibacillus humicus)のアノテーション後に、遺伝子のうち1つを同定し、この遺伝子配列をPhuPro2と命名した。配列番号11に提供する。PhuPro2遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号12に示す。このタンパク質は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785〜786)により予想されたとおり、N末端に長さにして23個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、PhuPro2は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)Nprタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した(Takekawa et al.et al.(Takekawa et al.(1991)Journal of Bacteriology,173(21):6820〜6825)。PhuPro2タンパク質に予想される成熟領域を配列番号13に示す。パエニバチルス・ヒュミカス(Paenibacillus humicus)から単離されたPhuPro2遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号11として設定する。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示す:
パエニバチルス・ヒュミカス(Paenibacillus humicus)メタロプロテアーゼPhuPro2の発現
プロペプチド−成熟型のPhuPro2のDNA配列を合成し、Generay(Shanghai,China)のバチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)発現ベクターp2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40〜52,2007)に挿入し、プラスミドpGX150(AprE−PhuPro2)を得た(図1)。消化したベクターに、PhuPro2タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)AprEシグナル配列の3末端と、予想されるPhuPro2の未改変プロペプチド5’末端との間に3コドン(Ala−Gly−Lys)を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン(GTG)を有する。図1に示す、得られたプラスミドは、標識されたpGX150(AprE−PhuPro2)であった。図3.1に示す通り、pGX150(AprE−PhuPro2)は、AprEプロモーター、バチルス・スブチルス(B. subtilis)においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するAprEシグナル配列、並びにPhuPro2の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列(配列番号14)を含有する。合成AprE−PhuPro2遺伝子の翻訳産物を配列番号15に示す。
メタロプロテアーゼPhuPro2のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン(カタログ番号74H7165,Megazyme)を使用し、50mM Tris(pH 7)中で、精製したメタロプロテアーゼPhuPro2のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をMilli−Q水(Millipore)で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを100mM Tris緩衝液(pH 7)に溶解して最終濃度1.5%(重量/体積)にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性96ウェルマイクロタイタープレート(96−MTP)(Corning Life Sciences,#3641)に、50μlの希釈した酵素(又はブランク対照としてMilli−Q水のみ)を添加し、次に50μlの1.5%アゾ−カゼインを添加した。96−MTPのシール後、40℃下で、Thermomixer(Eppendorf)により650rpmで10分間反応を実施した。100μLの5%トリクロロ酢酸(TCA)を添加し反応を停止させた。平衡化(室温にて5分)後、遠心分離し(4℃、2000gで10分間)、120μLの上清を新しい96−MTPに移し、SpectraMax 190を使用して上清の吸光度を440nm(A440)で測定した。酵素のA440からブランク対照のA440を減算することにより実際のA440を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした(1.25ppm〜40ppm)。各値は3連アッセイの平均値とした。
メタロプロテアーゼPhuPro2のpH特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なpH値(pH 4〜11の範囲)を有する12.5mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液でメタロプロテアーゼPhuPro2のpH特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した96MTPで、特定のpHを有する50μLの25mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液を、2μlのMilli−Q水で希釈した酵素(125ppm)と混合し、続いて48μLの1.5%(重量/体積)アゾ−カゼイン水を添加した。実施例3.3に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適pH下での活性を100%と設定し、各pH下での酵素活性を相対活性として記録した。pH4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10及び11を試験pHとした。各値は3連アッセイの平均値とした。図3.3に示す通り、PhuPro2の最適pHは6であり、pH 5.5〜8.5で最大活性の70%超を保有する。
メタロプロテアーゼPhuPro2の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、50mM Tris緩衝液(pH7)中で、メタロプロテアーゼPhuPro2の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例3.3に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、200μLのPCRチューブ中で、50μLの1.5%アゾ−カゼイン及び45μl Milli−Q水を混合し、これを次にPeltier Thermal Cycler(BioRad)で所望の温度(すなわち20〜90℃)で5分間インキュベートした。インキュベート後、5μLの希釈した酵素(50ppm)又は水(ブランク対照)を基質混合物に添加し、Peltier Thermal Cycleで異なる温度で10分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに100μLの5% TCAを入れた96−MTPに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例3.3に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を100%と設定して、活性を相対活性として記録した。20、30、40、50、60、70、80及び90℃を試験温度とした。各値は2連アッセイの平均値とした(この値は5%超変動しない)。図3.4のデータは、PhuPro2が50℃を最適温度とし、45℃〜65℃で最大活性の70%超を保有していたことを示す。
メタロプロテアーゼPhuPro2のクリーニング性能
PA−S−38(色素を添加した卵黄、加熱エージング処理)布帛細片(CFT−Vlaardingen,The Netherlands)を使用し、自動食器洗浄(ADW)のモデル洗剤をpH 6及び8で利用して、PhuPro2のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したプロテアーゼサンプルを、10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度100ppm(Ca2+:Mg2+=3:1)で、AT洗剤により反応を実施した(表3.1に示す洗剤組成物)。反応を開始するに当たり、PA−S−38布帛細片を入れた96−MTPに、pH 6又はpH 8で緩衝した180μLのAT洗剤を添加し、次に20μLの希釈した酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、50℃の恒温器/振とう器で1150rpmで30分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから100μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を利用して吸光度を405nmで測定した(本明細書において「初期性能」として参照)。96−MTPに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を200μL水ですすぎ洗いをした。180μLの0.1M CAPS緩衝液(pH 10)の添加後、50℃に設定した恒温器/振とう器で1150rpmで10分間2回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち100μLを新しい96−MTPに移し、405nmで吸光度を測定した(本明細書において「洗浄後」として参照)。2回の吸光度測定値を合算(「初期性能」と「洗浄後」の値を合算)し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する;続いて、酵素の「合計性能」のA405からブランク対照の「合計性能」のA405を減算することにより実際のA405を計算した。AT食器洗剤中、pH 6及びpH 8下での、PA−S−38布帛細片のクリーニングにおける、PhuPro2の用量応答について、それぞれ図3.5A及び3.5Bに示す。
PhuPro2とその他のプロテアーゼの比較
A.相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、BLAST検索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389〜402,1997)により、NCBIの非冗長タンパク質データベース及びGenome Quest Patentデータベースで相同物を同定した。PhuPro2(配列番号:13)に予想される成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率(PID)は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表3.2A及び3.2Bは、PhuPro2に対する配列同一性(%)の一覧を提供する。表3.2中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
CLUSTALWソフトウェア(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673〜4680,1994)をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟PhuPro2(配列番号:13)タンパク質のアミノ酸配列を、サーモリシン(P00800,バチルス・サーモプロテイリティクス(Bacillus thermoproteolyticus))の配列及びパエニバチルス・テッラエ(Paenibacillus terrae)HPL−003(YP_005073223.1)由来のプロテアーゼ配列とアラインメントした。図3.6は、PhuPro2配列とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
表2Aの代表的な相同体の配列及び近隣結合法(NJ)を利用して、PhuPro2(配列番号:12)の完全長の配列についての系統発生樹を作製した(Saitou,N.;and Nei,M.(1987).The neighbor−joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.4,406−425)。NJ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。phylodendron−系統発生樹プリンターソフトウェア(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint−form.html)を利用して系統発生樹を表示した。これを図3.7に示す。
パエニバチルス・エヒメンシス(Paenibacillus ehimensis)メタロプロテアーゼPehPro1のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス・エヒメンシス(Paenibacillus ehimensis)の株(DSM11029)を選択した。37℃下で、Heart Infusion寒天プレート(Difco)で株を24時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムDNAを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ZymoのZF Fungal/Bacterial DNAミニプレップキット(カタログ番号D6005)によりゲノムDNAを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムDNAを使用した。Illuminaの次世代配列決定技術を利用して、BaseClear(Leiden,The Netherlands)によりパエニバチルス・エヒメンシス(Paenibacillus ehimensis)株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、BioXpr(Namur,Belgium)によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス・エヒメンシス(Paenibacillus ehimensis)のアノテーション後に、遺伝子のうち1つを同定し、この遺伝子配列をPehPro1と命名した。配列番号16に提供する。PehPro1遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号17に示す。このタンパク質は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785〜786)により予想されたとおり、N末端に長さにして23個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、PehPro1は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)Nprタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した(Takekawa et al.et al.(1991)Journal of Bacteriology,173(21):6820〜6825)。PehPro1タンパク質に予想される成熟領域を配列番号18に示す。
パエニバチルス・エヒメンシス(Paenibacillus ehimensis)メタロプロテアーゼPehPro1の発現
プロペプチド−成熟型のPehPro1のDNA配列を合成し、Generay(Shanghai,China)のバチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)発現ベクターp2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40〜52,2007)に挿入し、プラスミドpGX148(AprE−PehPro1)を得た(図4.1)。消化したベクターに、PehPro1タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)AprEシグナル配列の3末端と、予想されるPehPro1の未改変プロペプチド5’末端との間に3コドン(Ala−Gly−Lys)を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン(GTG)を有する。図1に示す、得られたプラスミドは、標識されたpGX148(AprE−PehPro1)であった。図1に示す通り、pGX148(AprE−PehPro1)は、AprEプロモーター、バチルス・スブチルス(B. subtilis)においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するAprEシグナル配列、並びにPehPro1の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列(配列番号19)を含有する。合成AprE−PehPro1遺伝子の翻訳産物を配列番号20に示す。
メタロプロテアーゼPehPro1のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン(カタログ番号74H7165,Megazyme)を使用し、50mM Tris(pH 7)中で、精製したメタロプロテアーゼPehPro1のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をMilli−Q水(Millipore)で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを100mM Tris緩衝液(pH 7)に溶解して最終濃度1.5%(重量/体積)にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性96ウェルマイクロタイタープレート(96−MTP)(Corning Life Sciences,#3641)に、50μlの希釈した酵素(又はブランク対照としてMilli−Q水のみ)を添加し、次に50μlの1.5%アゾ−カゼイン水を添加した。96−MTPのシール後、40℃下で、Thermomixer(Eppendorf)により650rpmで10分間反応を実施した。100μLの5%トリクロロ酢酸(TCA)を添加し反応を停止させた。平衡化(室温にて5分)後、遠心分離し(4℃、2000gで10分間)、120μLの上清を新しい96−MTPに移し、SpectraMax 190を使用して上清の吸光度を440nm(A440)で測定した。酵素のA440からブランク対照のA440を減算することにより実際のA440を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした(1.25ppm〜40ppm)。各値は3連アッセイの平均値とした。
メタロプロテアーゼPehPro1のpH特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なpH値(pH 4〜11の範囲)を有する12.5mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液でメタロプロテアーゼPehPro1のpH特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した96MTPで、特定のpHを有する50μLの25mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液を、2μlのMilli−Q水で希釈した酵素(250ppm)と混合し、続いて48μLの1.5%(重量/体積)アゾ−カゼイン水を添加した。実施例4.3に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適pH下での活性を100%と設定し、各pH下での酵素活性を相対活性として記録した。pH 4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10及び11を試験pHとした。各値は3連アッセイの平均値とした。図4.3に示す通り、PehPro1の最適pHは7であり、pH 5.5〜9.5で最大活性の70%超を保有する。
メタロプロテアーゼPehPro1の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、50mM Tris緩衝液(pH 7)中で、メタロプロテアーゼPehPro1の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例4.3に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、200μLのPCRチューブ中で、50μLの1.5%アゾ−カゼイン及び45μl Milli−Q水を混合し、これを次にPeltier Thermal Cycler(BioRad)で所望の温度(すなわち20〜90℃)で5分間インキュベートした。インキュベート後、5μLの希釈した酵素(100ppm)又は水(ブランク対照)を基質混合物に添加し、Peltier Thermal Cycleで異なる温度で10分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに100μLの5% TCAを入れた96−MTPに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例4.3に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を100%と設定して、活性を相対活性として記録した。20、30、40、50、60、70、80及び90℃を試験温度とした。各値は2連アッセイの平均値である(この値は5%超変動しない)。図4.4のデータは、PehPro1が70℃を最適温度とし、60℃〜75℃で最大活性の70%超を保有していたことを示す。
メタロプロテアーゼPehPro1のクリーニング性能
PA−S−38(色素を添加した卵黄、加熱エージング処理)布帛細片(CFT−Vlaardingen,The Netherlands)を使用し、自動食器洗浄(ADW)のモデル洗剤をpH 6及び8で利用して、PehPro1のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したプロテアーゼサンプルを、10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度100ppm(Ca2+:Mg2+=3:1)で、AT洗剤により反応を実施した(表4.1に示す洗剤組成物)。反応を開始するに当たり、PA−S−38布帛細片を入れた96−MTPに、pH 6又はpH 8で緩衝した180μLのAT洗剤を添加し、次に20μLの希釈した酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、50℃の恒温器/振とう器で1150rpmで30分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから100μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を利用して吸光度を405nmで測定した(本明細書において「初期性能」として参照)。96−MTPに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を200μL水ですすぎ洗いをした。180μLの0.1M CAPS緩衝液(pH10)の添加後、50℃に設定した恒温器/振とう器で1150rpmで10分間2回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち100μLを新しい96−MTPに移し、405nmで吸光度を測定した(本明細書において「洗浄後」として参照)。2回の吸光度測定値を合算(「初期性能」と「洗浄後」の値を合算)し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する;続いて、酵素の「合計性能」のA405からブランク対照の「合計性能」のA405を減算することにより実際のA405を計算した。AT洗剤中、pH 6及びpH 8下での、PA−S−38布帛細片のクリーニングにおける、PehPro1の用量応答について、それぞれ図4.5A及び4.5Bに示す。
PehPro1とその他のプロテアーゼの比較
A.相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、BLAST検索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389〜402,1997)により、NCBIの非冗長タンパク質データベース及びGenome Quest Patentデータベースで相同物を同定した。PehPro1(配列番号18)の成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率(PID)は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表4.2A及び4.2Bは、PehPro1に対する配列同一性(%)の一覧を提供する。表4.2中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
CLUSTALWソフトウェア(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673〜4680,1994)をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟PehPro1(配列番号:18)のアミノ酸配列を、サーモリシン(P00800,バチルス・サーモプロテイリティクス(Bacillus thermoproteolyticus))及びパエニバチルス・エルギィ(Paenibacillus elgii)B69(ZP_09077634.1)由来のプロテアーゼとアラインメントした。図4.6は、PehPro1配列とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
表2Aの代表的な相同体の配列及び近隣結合法(NJ)を利用して、PehPro1(配列番号:17)の完全長の配列についての系統発生樹を作製した(Saitou,N.;and Nei,M.(1987).The neighbor−joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.4,406〜425)。NJ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。phylodendron−系統発生樹プリンターソフトウェア(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint−form.html)を利用して系統発生樹を表示した。これを図4.7に示す。
パエニバチルス・バルシノネンシス(Paenibacillus barcinonensis)メタロプロテアーゼPbaPro1のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス・バルシノネンシス(Paenibacillus barcinonensis)の株(DSM15478)を選択した。37℃下で、Heart Infusion寒天プレート(Difco)で株を24時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムDNAを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ZymoのZF Fungal/Bacterial DNAミニプレップキット(カタログ番号D6005)によりゲノムDNAを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムDNAを使用した。Illuminaの次世代配列決定技術を利用して、BaseClear(Leiden,The Netherlands)によりパエニバチルス・バルシノネンシス(Paenibacillus barcinonensis)株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、BioXpr(Namur,Belgium)によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス・バルシノネンシス(Paenibacillus barcinonensis)のアノテーション後に、遺伝子のうち1つを同定し、この遺伝子配列をPbaPro1と命名した。配列番号21に提供する。PbaPro1遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号22に示す。このタンパク質は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785〜786)により予想されたとおり、N末端に長さにして25個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、PbaPro1は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)Nprタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した(Takekawa et al.et al.(1991)Journal of Bacteriology,173(21):6820〜6825)。PbaPro1タンパク質に予想される成熟領域を配列番号23に示す。
パエニバチルス・バルシノネンシス(Paenibacillus barcinonensis)メタロプロテアーゼPbaPro1の発現
プロペプチド−成熟型のPbaPro1のDNA配列を合成し、Generay(Shanghai,China)のバチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)発現ベクターp2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40〜52,2007)に挿入し、プラスミドpGX147(AprE−PbaPro1)を得た(図5.1)。消化したベクターに、PbaPro1タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)AprEシグナル配列の3末端と、予想されるPbaPro1の未改変プロペプチド5’末端との間に3コドン(Ala−Gly−Lys)を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン(GTG)を有する。図1に示す、得られたプラスミドは、標識しされたpGX147(AprE−PbaPro1)であった。図5.1に示す通り、pGX147(AprE−PbaPro1)は、AprEプロモーター、バチルス・スブチルス(B. subtilis)においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するAprEシグナル配列、並びにPbaPro1の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列(配列番号24)を含有する。合成AprE−PbaPro1遺伝子の翻訳産物を配列番号25に示す。
メタロプロテアーゼPbaPro1のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン(カタログ番号74H7165,Megazyme)を使用し、50mM Tris(pH 7)中で、精製したメタロプロテアーゼPbaPro1のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をMilli−Q水(Millipore)で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを100mM Tris緩衝液(pH 7)に溶解して最終濃度1.5%(重量/体積)にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性96ウェルマイクロタイタープレート(96−MTP)(Corning Life Sciences,#3641)に、50μLの希釈した酵素(又はブランク対照としてMilli−Q水のみ)を添加し、次に50μLの1.5%アゾ−カゼイン水を添加した。96−MTPのシール後、40℃下で、Thermomixer(Eppendorf)により650rpmで10分間反応を実施した。100μLの5%トリクロロ酢酸(TCA)を添加し反応を停止させた。平衡化(室温にて5分)後、遠心分離し(4℃、2000gで10分間)、120μLの上清を新しい96−MTPに移し、SpectraMax 190を使用して上清の吸光度を440nm(A440)で測定した。酵素のA440からブランク対照のA440を減算することにより実際のA440を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした(1.25ppm〜40ppm)。各値は3連アッセイの平均値とした。
メタロプロテアーゼPbaPro1のpH特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なpH値(pH 5〜11の範囲)を有する12.5mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液でメタロプロテアーゼPbaPro1のpH特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した96MTPで、特定のpHを有する50μLの25mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液を、2μlのMilli−Q水で希釈した酵素(125ppm)と混合し、続いて48μLの1.5%(重量/体積)アゾ−カゼイン水を添加した。実施例5.3に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適pH下での活性を100%と設定し、各pH下での酵素活性を相対活性として記録した。pH 4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10及び11を試験pHとした。各値は3連アッセイの平均値とした。図5.3に示す通り、PbaPro1の最適pHは8であり、pH 7〜9で最大活性の70%超を保有する。
メタロプロテアーゼPbaPro1の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、50mM Tris緩衝液(pH 7)中で、メタロプロテアーゼPbaPro1の温度プロファイルを分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例5.3に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、200μLのPCRチューブ中で、50μLの1.5%アゾ−カゼイン及び45μl Milli−Q水を混合し、これを次にPeltier Thermal Cycler(BioRad)で所望の温度(すなわち20〜90℃)で5分間インキュベートした。インキュベート後、5μLの希釈した酵素(50ppm)又は水(ブランク対照)を基質混合物に添加し、Peltier Thermal Cycleで異なる温度で10分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに100μLの5% TCAを入れた96−MTPに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例5.3に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を100%と設定して、活性を相対活性として記録した。20、30、40、50、60、70、80及び90℃を試験温度とした。各値は2連アッセイの平均値である(この値は5%超変動しない)。図5.4のデータは、PbaPro1が50℃を最適温度とし、45℃〜55℃で最大活性の70%超を保有していたことを示す。
メタロプロテアーゼPbaPro1のクリーニング性能
PA−S−38(色素を添加した卵黄、加熱エージング処理)布帛細片(CFT−Vlaardingen,The Netherlands)を使用し、自動食器洗浄(ADW)のモデル洗剤をpH 6及び8で利用して、PbaPro1のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したプロテアーゼサンプルを、10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度100ppm(Ca2+:Mg2+=3:1)で、AT洗剤により反応を実施した(表5.1に示す洗剤組成物)。反応を開始するに当たり、PA−S−38布帛細片を入れた96−MTPに、pH 6又はpH 8で緩衝した180μLのAT洗剤を添加し、次に20μLの希釈した酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、50℃の恒温器/振とう器で1150rpmで30分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから100μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を利用して吸光度を405nmで測定した(本明細書において「初期性能」として参照)。96−MTPに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を200μL水ですすぎ洗いをした。180μLの0.1M CAPS緩衝液(pH 10)の添加後、50℃に設定した恒温器/振とう器で1150rpmで10分間2回めのインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち100μLを新しい96−MTPに移し、405nmで吸光度を測定した(本明細書において「洗浄後」として参照)。2回の吸光度測定値を合算(「初期性能」と「洗浄後」の値を合算)し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する;続いて、酵素の「合計性能」のA405からブランク対照の「合計性能」のA405を減算することにより実際のA405を計算した。AT洗剤中、pH 6及びpH 8下での、PA−S−38布帛細片のクリーニングにおける、PbaPro1の用量応答について、それぞれ図5.5A及び5.5Bに示す。
PbaPro1とその他のプロテアーゼの比較
A.相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、BLAST検索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389〜402,1997)により、NCBIの非冗長タンパク質データベース及びGenome Quest Patentデータベースで相同物を同定した。PbaPro1(配列番号:23)に予想される成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率(PID)は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表5.2A及び5.2Bは、PbaPro1に対する配列同一性(%)の一覧を提供する。表5.2中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
CLUSTALWソフトウェア(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673〜4680,1994)をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟PbaPro1(配列番号:23)のアミノ酸配列を、サーモリシン(P00800,バチルス・サーモプロテイリティクス(Bacillus thermoproteolyticus))及びパエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)SC2(YP_003948511.1)由来のプロテアーゼとアラインメントした。図5.6は、PbaPro1配列とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
表2Aの代表的な相同体の配列及び近隣結合法(NJ)を利用して、PbaPro1(配列番号:22)の完全長の配列についての系統発生樹を作製した(Saitou,N.;and Nei,M.(1987).The neighbor−joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.4,406〜425)。NJ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。phylodendron−系統発生樹プリンターソフトウェア(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint−form.html)を利用して系統発生樹を表示した。これを図5.7に示す。
パエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)SC2メタロプロテアーゼPpoPro1のクローニング
PpoPro1遺伝子の核酸配列はNCBIデータベースで同定され(NCBI参照配列:4536397−4538175のNC_014622.1)、配列番号:26に提供される。PpoPro1遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号27に示す。このタンパク質は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785〜786)により予想されたとおり、N末端に長さにして24個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、PpoPro1は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)Nprタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した(Takekawa et al.et al.(1991)Journal of Bacteriology,173(21):6820−6825)。PpoPro1タンパク質に予想される成熟領域を配列番号28に示す。
パエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)SC2メタロプロテアーゼPpoPro1の発現
プロペプチド−成熟型のPpoPro1のDNA配列を合成し、Generay(Shanghai,China)のバチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)発現ベクターp2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40〜52,2007)に挿入し、プラスミドpGX138(AprE−PpoPro1)を得た(図1)。消化したベクターに、PpoPro1タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)AprEシグナル配列の3末端と、予想されるPpoPro1の未改変プロペプチド5’末端との間に3コドン(Ala−Gly−Lys)を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン(GTG)を有する。図6.1に示す、得られるプラスミド、すなわち標識したpGX138(AprE−PpoPro1)は、AprEプロモーター、バチルス・スブチルス(B. subtilis)においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するAprEシグナル配列、並びにPpoPro1の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列(配列番号29)を含有する。合成AprE−PpoPro1遺伝子の翻訳産物を配列番号30に示す。
メタロプロテアーゼPpoPro1のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン(カタログ番号74H7165,Megazyme)を使用し、50mM Tris(pH 7)中で、精製したPpoPro1のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をMilli−Q水(Millipore)で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを100mM Tris緩衝液(pH 7)に溶解して最終濃度1.5%(重量/体積)にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性96ウェルマイクロタイタープレート(96−MTP)(Corning Life Sciences,#3641)に、50μLの希釈した酵素(又はブランク対照としてMilli−Q水のみ)を添加し、次に50μLの1.5%アゾ−カゼイン水を添加した。96−MTPのシール後、40℃下で、Thermomixer(Eppendorf)により650rpmで10分間反応を実施した。100μLの5%トリクロロ酢酸(TCA)を添加し反応を停止させた。平衡化(室温にて5分)後、遠心分離し(4℃、2000gで10分間)、120μLの上清を新しい96−MTPに移し、SpectraMax 190を使用して上清の吸光度を440nm(A440)で測定した。酵素のA440からブランク対照のA440を減算することにより実際のA440を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした(1.25ppm〜40ppm)。各値は2連アッセイの平均値でとした。この値は5%超変動しない。タンパク質分解活性を実際のA440として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ(図6.2)によりPpoPro1が活性プロテアーゼであることが示される。
メタロプロテアーゼPpoPro1のpH特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なpH値(pH 4〜11の範囲)を有する12.5mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液でPpoPro1のpH特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した96−MTPで、特定のpHを有する50μLの25mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液を、2μlのMilli−Q水で希釈した酵素(250ppm)と混合し、続いて8μLの1.5%(重量/体積)アゾ−カゼイン水を添加した。実施例6.3に記載のとおりに反応を実施し、解析した。各pH下での酵素活性を相対活性として記録した。最適pHでの活性を100%に設定した。pH4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10及び11を試験pHとした。各値は3連アッセイの平均値とした。図6.3に示す通り、PpoPro1の最適pHは約7であり、pH5.5〜8で最大活性の70%超を保有する。
メタロプロテアーゼPpoPro1の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、50mM Tris緩衝液(pH 7)中で、PpoPro1の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例6.3に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、200μLのPCRチューブ中で、50μLの1.5%アゾ−カゼイン及び45μl Milli−Q水を混合し、これを次にPeltier Thermal Cycler(BioRad)で所望の温度(すなわち20〜90℃)で5分間インキュベートした。インキュベート後、5μLの希釈したPpoPro1(100ppm)又は水(ブランク対照)を基質混合物に添加し、Peltier Thermal Cycleで異なる温度で10分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに100μLの5% TCAを入れた96−MTPに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例6.3に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。活性は相対活性として記録し、最適温度下での活性を100%に設定した。20、30、40、50、60、70、80及び90℃を試験温度とした。各値は2連アッセイの平均値でとした(この値は5%超変動しない)。図6.4のデータは、PpoPro1が50℃を最適温度とし、40℃〜55℃で最大活性の70%超を保有していたことを示す。
メタロプロテアーゼPpoPro1のクリーニング性能
PA−S−38(色素を添加した卵黄、加熱エージング処理)布帛細片(CFT−Vlaardingen,The Netherlands)を使用し、自動食器洗浄(ADW)のモデル洗剤(AT洗剤)をpH6及び8で利用して、PpoPro1のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したPpoPro1を、10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度100ppm(Ca2+:Mg2+=3:1)で、漂白成分(過酸N,N−フタロイルアミノペルオキシカプロン酸−PAP)の存在下で、AT洗剤(表6.1に示す組成)により反応を実施した。反応を開始するに当たり、PA−S−38布帛細片を入れた96−MTPに、pH 6又は8で緩衝した180μLのAT洗剤を添加し、次に20μLの希釈した酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、50℃の恒温器/振とう器で1150rpmで30分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから100μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を利用して吸光度を405nmで測定した(本明細書において「初期性能」として参照)。96−MTPに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を200μL水ですすぎ洗いをした。180μLの0.1M CAPS緩衝液(pH 10)の添加後、50℃に設定した恒温器/振とう器で1150rpmで10分間2回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち100μLを新しい96−MTPに移し、405nmで吸光度を測定した(本明細書において「洗浄後」として参照)。2回の吸光度測定値を合算(「初期性能」と「洗浄後」の値を合算)し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する;続いて、酵素の「合計性能」のA405からブランク対照の「合計性能」のA405を減算することにより実際のA405を計算した。AT洗剤中、pH 6及びpH 8下、漂白剤の存在下での、PA−S−38布帛細片のクリーニングにおける、PpoPro1の用量応答について、それぞれ図6.5A及び6.5Bに示す。
PpoPro1とその他のメタロプロテアーゼとの比較
A.相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、BLAST検索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389〜402,1997)により、NCBIの非冗長タンパク質データベース及びGenome Quest Patentデータベースで相同物を同定した。PpoPro1(配列番号:28)に予想される成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率(PID)は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表6.2A及び6.2Bは、PpoPro1に対する配列同一性(%)の一覧を提供する。表6.2中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
CLUSTALWソフトウェア(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673〜4680,1994)をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟PpoPro1(配列番号:28)のアミノ酸配列を、サーモリシン(P00800,バチルス・サーモプロテイリティクス(Bacillus thermoproteolyticus))及びパエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)SC2(YP_003948511.1)由来のプロテアーゼとアラインメントした。図6.6は、PpoPro1とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
表6.2Aの代表的な相同体の配列及び近隣結合法(NJ)を利用して、PpoPro1(配列番号:27)の完全長の配列についての系統発生樹を作製した(Saitou,N.;and Nei,M.(1987).The neighbor−joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.4,406〜425)。NJ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。phylodendron−系統発生樹プリンターソフトウェア(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint−form.html)を利用して系統発生樹を表示した。これを図6.7に示す。
パエニバチルス・ヒュナネンシス(Paenibacillus hunanensis)メタロプロテアーゼPhuPro1のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス・ヒュナネンシス(Paenibacillus hunanensis)の株(DSM22170)を選択した。37℃下で、Heart Infusion寒天プレート(Difco)で株を24時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムDNAを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ZymoのZF Fungal/Bacterial DNAミニプレップキット(カタログ番号D6005)によりゲノムDNAを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムDNAを使用した。Illuminaの次世代配列決定技術を利用して、BaseClear(Leiden,The Netherlands)によりパエニバチルス・ヒュナネンシス(Paenibacillus hunanensis)株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、BioXpr(Namur,Belgium)によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス・ヒュナネンシス(Paenibacillus hunanensis)のアノテーション後に、遺伝子のうち1つを同定し、この遺伝子配列をPhuPro1と命名した。配列番号31に提供する。遺伝子は、代替的な開始コドン(TTG)を有する。PhuPro1遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号32に示す。このタンパク質は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785〜786)により予想されたとおり、N末端に長さにして23個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、PhuPro1は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)Nprタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した(Takekawa et al.et al.(1991)Journal of Bacteriology,173(21):6820〜6825)。PhuPro1タンパク質に予想される成熟領域を配列番号33に示す。
パエニバチルス・ヒュナネンシス(Paenibacillus hunanensis)メタロプロテアーゼPhuPro1の発現
プロペプチド−成熟型のPhuPro1のDNA配列を合成し、Generay(Shanghai,China)のバチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)発現ベクターp2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40〜52,2007)に挿入し、プラスミドpGX149(AprE−PhuPro1)を得た(図7.1)。消化したベクターに、PhuPro1タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)AprEシグナル配列の3末端と、予想されるPhuPro1の未改変プロペプチド5’末端との間に3コドン(Ala−Gly−Lys)を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン(GTG)を有する。図1に示す、得られるプラスミド、すなわち標識したpGX149(AprE−PhuPro1)は、AprEプロモーター、バチルス・スブチルス(B. subtilis)においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するAprEシグナル配列、並びにPhuPro1の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列(配列番号34)を含有する。合成AprE−PhuPro1遺伝子の翻訳産物を配列番号35に示す。
メタロプロテアーゼPhuPro1のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン(カタログ番号74H7165,Megazyme)を使用し、50mM Tris(pH 7)中で、精製したメタロプロテアーゼPhuPro1のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をMilli−Q水(Millipore)で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを100mM Tris緩衝液(pH 7)に溶解して最終濃度1.5%(重量/体積)にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性96ウェルマイクロタイタープレート(96−MTP)(Corning Life Sciences,#3641)に、50μLの希釈した酵素(又はブランク対照としてMilli−Q水のみ)を添加し、次に50μLの1.5%アゾ−カゼイン水を添加した。96−MTPのシール後、40℃下で、Thermomixer(Eppendorf)により650rpmで10分間反応を実施した。100μLの5%トリクロロ酢酸(TCA)を添加し反応を停止させた。平衡化(室温にて5分)後、遠心分離し(4℃、2000gで10分間)、120μLの上清を新しい96−MTPに移し、SpectraMax 190を使用して上清の吸光度を440nm(A440)で測定した。酵素のA440からブランク対照のA440を減算することにより実際のA440を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした(1.25ppm〜40ppm)。各値は3連アッセイの平均値とした。タンパク質分解活性を実際のA440として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ(図7.2)により、PhuPro1が活性プロテアーゼであることが示される。
メタロプロテアーゼPhuPro1のpH特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なpH値(pH 4〜11の範囲)を有する12.5mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液でメタロプロテアーゼPhuPro1のpH特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した96−MTPで、特定のpHを有する50μLの25mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液を、2μLのMilli−Q水で希釈した酵素(125ppm)と混合し、続いて48μLの1.5%(重量/体積)アゾ−カゼイン水を添加した。実施例3に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適pH下での活性を100%と設定し、各pH下での酵素活性を相対活性として記録した。pH 4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10及び11を試験pHとした。各値は3連アッセイの平均値とした。図7.3に示す通り、PhuPro1の最適pHは約6であり、pH 5〜8で最大活性の70%超を保有する。
メタロプロテアーゼPhuPro1の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、50mM Tris緩衝液(pH 7)中で、PhuPro1の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例7.3に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、200μLのPCRチューブ中で、50μLの1.5%アゾ−カゼイン及び45μl Milli−Q水を混合し、これを次にPeltier Thermal Cycler(BioRad)で所望の温度(すなわち20〜90℃)で5分間インキュベートした。インキュベート後、5μLの希釈した酵素(50ppm)又は水(ブランク対照)を基質混合物に添加し、Peltier Thermal Cycleで異なる温度で10分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに100μLの5% TCAを入れた96−MTPに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例7.3に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を100%と設定して、活性を相対活性として記録した。20、30、40、50、60、70、80及び90℃を試験温度とした。各値は2連アッセイの平均値である(この値は5%超変動しない)。図7.4のデータは、PhuPro1が60℃を最適温度とし、45℃〜65℃で最大活性の70%超を保有していたことを示す。
メタロプロテアーゼPhuPro1のクリーニング性能
PA−S−38(色素を添加した卵黄、加熱エージング処理)布帛細片(CFT−Vlaardingen,The Netherlands)を使用し、自動食器洗浄(ADW)のモデル洗剤をpH 6及び8で利用して、PhuPro1のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したプロテアーゼサンプルを、10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度100ppm(Ca2+:Mg2+=3:1)で、AT洗剤により反応を実施した(表7.1に示す洗剤組成物)。反応を開始するに当たり、PA−S−38布帛細片を入れた96−MTPに、pH 6又はpH 8で緩衝した180μLのAT洗剤を添加し、次に20μLの希釈した酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、50℃の恒温器/振とう器で1150rpmで30分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから100μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を利用して吸光度を405nmで測定した(本明細書において「初期性能」として参照)。96−MTPに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を200μL水ですすぎ洗いをした。180μLの0.1M CAPS緩衝液(pH 10)の添加後、50℃に設定した恒温器/振とう器で1150rpmで10分間2回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち100μLを新しい96−MTPに移し、405nmで吸光度を測定した(本明細書において「洗浄後」として参照)。2回の吸光度測定値を合算(「初期性能」と「洗浄後」の値を合算)し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する;続いて、酵素の「合計性能」のA405からブランク対照の「合計性能」のA405を減算することにより実際のA405を計算した。AT洗剤中、pH及びpH 8下、漂白剤の存在下での、PA−S−38布帛細片のクリーニングにおける、PhuPro1の用量応答について、それぞれ図7.5A及び7.5Bに示す。
PhuPro1とその他のプロテアーゼの比較
A.相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、BLAST検索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389〜402,1997)により、NCBIの非冗長タンパク質データベース及びGenome Quest Patentデータベースで相同物を同定した。PhuPro1(配列番号:33)に予想される成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率(PID)は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表7.2A及び7.2Bは、PhuPro1に対する配列同一性(%)の一覧を提供する。表7.2中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
CLUSTALWソフトウェア(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673〜4680,1994)をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟PhuPro1(配列番号:33)タンパク質のアミノ酸配列を、プロテイナーゼT(P00800,チルス・サーモプロテイリティクス(Bacillus thermoproteolyticus))及びパエニバチルス・テッラエ(Paenibacillus terrae)HPL−003(YP_005073223.1)由来のプロテアーゼとアラインメントした。図7.6は、PhuPro1とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
表2Aの代表的な相同体の配列及び近隣結合法(NJ)を利用して、PhuPro1(配列番号:2)の完全長の配列についての系統発生樹を作製した(Saitou,N.;and Nei,M.(1987).The neighbor−joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.4,406〜425)。NJ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。phylodendron−系統発生樹プリンターソフトウェア(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint−form.html)を利用して系統発生樹を表示した。これを図7.7に示す。
Terg−o−TometerによるPhuPro1の性能評価
Terg−o−Tometer(Instrument Marketing Services,Inc,Fairfield,NJ)を利用して、洗濯洗剤用途についてPhuPro1の洗浄性能を試験した。32℃及び16℃で性能評価を実施した。負荷布は、1Lの脱イオン水を入れたTerg−o−Tometerの各ビーカーに、合計重量が40gになるよう、次のうちの2種の染み付き布帛細片:EMPA116:木綿に対し血液、牛乳、インク(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland)、EMPA117:ポリコットンに対し血液、牛乳、インク(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland)、EMPA112:木綿に対しココア(Test materials AG,St.Gallen,Switzerland)、及びCFT C−10:木綿に対し顔料、油、及び牛乳成分(Center for Testmaterials BV,Vlaardingen,Netherlands)、に加え、エクストラ・ホワイト・インターロック・ニット生地を入れたものとした。水硬度は102ppm(6グレーン/ガロン)に調製し、ビーカー中で5mM HEPES(pH 8.2)によりpHを緩衝させた。近所の米国スーパーマーケットで購入し、熱により失活させた、市販の液体洗剤であるTide Regular HDL(Procter & Gamble)を0.8g/Lで使用した。使用前に、水浴中で92℃の温度で2〜3時間、洗剤を不活性化させた後、室温に冷却した。市販の洗剤を熱により失活させることで、酵素成分の活性を破壊しつつ、非酵素成分の特性を保持させる。熱により失活させた洗剤の酵素活性は、プロテアーゼ活性を測定するためのSuc−AAPF−pNAアッセイを利用して測定した。Purafect(登録商標)Prime HA、(Genencor Int’l)及びPhuPro1プロテアーゼをそれぞれ最終濃度が1ppmになるよう添加した。酵素を含有しない対照サンプルを包含させた。洗浄時間は12分とした。洗浄処理後、すべての布帛細片を3分間すすぎ洗いし、低温で機械乾燥させた。
パエニバチルス・アミロリティクス(Paenibacillus terrae)メタロプロテアーゼPamPro1のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス・アミロリティクス(Paenibacillus terrae)の株(DSM11747)を選択した。37℃下で、Heart Infusion寒天プレート(Difco)で株を24時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムDNAを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ZymoのZF Fungal/Bacterial DNAミニプレップキット(カタログ番号D6005)によりゲノムDNAを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムDNAを使用した。Illuminaの次世代配列決定技術を利用して、BaseClear(Leiden,The Netherlands)によりパエニバチルス・アミロリティクス(Paenibacillus terrae)株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、BioXpr(Namur,Belgium)によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス・アミロリティクス(Paenibacillus terrae)のアノテーション後に、遺伝子のうち1つを同定し、この遺伝子配列をPamPro1と命名した。配列番号36に提供する。PamPro1遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号37に示す。このタンパク質は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785〜786)により予想されたとおり、N末端に長さにして25個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、PamPro1は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)Nprタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した(Takekawa et al.(1991)Journal of Bacteriology,173(21):6820〜6825)。PamPro1タンパク質に予想される成熟領域を配列番号3に示す。
パエニバチルス・アミロリティクス(Paenibacillus amylolyticus)メタロプロテアーゼPamPro1の発現
プロペプチド−成熟型のPamPro1のDNA配列を合成し、Generay(Shanghai,China)のバチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)発現ベクターp2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40〜52,2007)に挿入し、プラスミドpGX146(AprE−PamPro1)を得た(図1)。消化したベクターに、PamPro1タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)AprEシグナル配列の3末端と、予想されるPamPro1の未改変のプロペプチド5’末端との間に3コドン(Ala−Gly−Lys)を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン(GTG)を有する。図8.1に示す、得られるプラスミド、すなわち標識したpGX146(AprE−PamPro1)は、AprEプロモーター、バチルス・スブチルス(B. subtilis)においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するAprEシグナル配列、並びにPamPro1の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列(配列番号39)を含有する。合成AprE−PamPro1遺伝子の翻訳産物を配列番号40に示す。
メタロプロテアーゼPamPro1のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン(カタログ番号74H7165,Megazyme)を使用し、50mM Tris(pH 7)中で、精製したメタロプロテアーゼPamPro1のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をMilli−Q水(Millipore)で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを100mM Tris緩衝液(pH 7)に溶解して最終濃度1.5%(重量/体積)にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性96ウェルマイクロタイタープレート(96−MTP)(Corning Life Sciences,#3641)に、50μLの希釈した酵素(又はブランク対照としてMilli−Q水のみ)を添加し、次に50μLの1.5%アゾ−カゼイン水を添加した。96−MTPのシール後、40℃下で、Thermomixer(Eppendorf)により650rpmで10分間反応を実施した。100μLの5%トリクロロ酢酸(TCA)を添加し反応を停止させた。平衡化(室温にて5分)後、遠心分離し(4℃、2000gで10分間)、120μLの上清を新しい96−MTPに移し、SpectraMax 190を使用して上清の吸光度を440nm(A440)で測定した。酵素のA440からブランク対照のA440を減算することにより実際のA440を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした(1.25ppm〜40ppm)。各値は3連アッセイの平均値とした。タンパク質分解活性を実際のA440として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ(図8.2)によりPamPro1が活性プロテアーゼであることが示される。
メタロプロテアーゼPamPro1のpH特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なpH値(pH 4〜11の範囲)を有する12.5mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液でメタロプロテアーゼPamPro1のpH特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した96−MTPで、特定のpHを有する50μLの25mM酢酸塩/Bis−Tris/HEPES/CHES緩衝液を、2μLのMilli−Q水で希釈した酵素(125ppm)と混合し、続いて48μLの1.5%(重量/体積)アゾ−カゼイン水を添加した。実施例8.3に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適pH下での活性を100%と設定し、各pH下での酵素活性を相対活性として記録した。pH 4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10及び11を試験pHとした。各値は3連アッセイの平均値とした。図8.3に示す通り、PamPro1の最適pHは約8であり、pH 7〜9.5で最大活性の70%超を保有する。
メタロプロテアーゼPamPro1の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、50mM Tris緩衝液(pH 7)中で、PamPro1の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例8.3に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、200μLのPCRチューブ中で、50μLの1.5%アゾ−カゼイン及び45μl Milli−Q水を混合し、これを次にPeltier Thermal Cycler(BioRad)で所望の温度(すなわち20〜90℃)で5分間インキュベートした。インキュベート後、5μLの希釈した酵素(50ppm)又は水(ブランク対照)を基質混合物に添加し、Peltier Thermal Cycleで異なる温度で10分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに100μLの5% TCAを入れた96−MTPに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例8.3に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を100%と設定して、活性を相対活性として記録した。20、30、40、50、60、70、80及び90℃を試験温度とした。各値は2連アッセイの平均値である(この値は5%超変動しない)。図8.4のデータは、PamPro1が50℃を最適温度とし、45℃〜55℃で最大活性の70%超を保有していたことを示す。
メタロプロテアーゼPamPro1のクリーニング性能
PA−S−38(色素を添加した卵黄、加熱エージング処理)布帛細片(CFT−Vlaardingen,The Netherlands)を使用し、自動食器洗浄(ADW)のモデル洗剤をpH 6及び8で利用して、PamPro1のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したプロテアーゼサンプルを、10mM NaC、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80及び10%プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度100ppm(Ca2+:Mg2+=3:1)で、AT洗剤により反応を実施した(表8.1に示す洗剤組成)。反応を開始するに当たり、PA−S−38布帛細片を入れた96−MTPに、pH6又はpH 8で緩衝した180μLのAT洗剤を添加し、次に20μLの希釈した酵素(又はブランク対照として希釈液)を添加した。96−MTPをシールし、50℃の恒温器/振とう器で1150rpmで30分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから100μLの洗浄液を新しい96−MTPに移し、分光光度計を利用して吸光度を405nmで測定した(本明細書において「初期性能」として参照)。96−MTPに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を200μL水ですすぎ洗いをした。180μLの0.1M CAPS緩衝液(pH 10)の添加後、50℃に設定した恒温器/振とう器で1150rpmで10分間2回めのインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち100μLを新しい96−MTPに移し、405nmで吸光度を測定した(本明細書において「洗浄後」として参照)。2回の吸光度測定値を合算(「初期性能」と「洗浄後」の値を合算)し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する;続いて、酵素の「合計性能」のA405からブランク対照の「合計性能」のA405を減算することにより実際のA405を計算した。AT洗剤中、pH及びpH 8下、漂白剤の存在下での、PA−S−38布帛細片のクリーニングにおける、PamPro1の用量応答について、それぞれ図5A及び5Bに示す。
PamPro1とその他のプロテアーゼの比較
A.相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、BLAST検索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389〜402,1997)により、NCBIの非冗長タンパク質データベース及びGenome Quest Patentデータベースで相同物を同定した。PamPro1(配列番号:38)に予想される成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率(PID)は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表8.2A及び8.2Bは、PamPro1に対する配列同一性(%)の一覧を提供する。表8.2中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
CLUSTALWソフトウェア(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673〜4680,1994)をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟PamPro1(配列番号:38)のアミノ酸配列を、サーモリシン(P00800,バチルス・サーモプロテイリティクス(Bacillus thermoproteolyticus))及びパエニバチルス・ペオリアエ(Paenibacillus peoriae)KCTC 3763(YP_005073223.1)由来のプロテアーゼとアラインメントした。図8.6は、PamPro1とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
表8.2Aの代表的な相同体の配列及び近隣結合法(NJ)を利用して、PamPro1(配列番号:37)の完全長の配列についての系統発生樹を作製した(Saitou,N.;and Nei,M.(1987).The neighbor−joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.4,406〜425)。NJ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。phylodendron−系統発生樹プリンターソフトウェア(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint−form.html)を利用して系統発生樹を表示した。これを図8.7に示す。
様々なパエニバチルス(Paenibacillus)メタロプロテアーゼとその他の細菌由来のメタロプロテアーゼ相同体との比較
A.相同なプロテアーゼ配列のアラインメント
CLUSTALWソフトウェア(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673〜4680,1994)をデフォルトパラメーターで利用して、実施例1.1〜8.7に記載の、パエニバチルス(Paenibacillus)プロテアーゼに予想される成熟配列のアミノ酸配列を、関連する細菌由来のメタロプロテアーゼとアラインメントした。図9.1は、様々なパエニバチルス(Paenibacillus)メタロプロテアーゼとその他の細菌由来のメタロプロテアーゼ相同体とのアラインメントを示す。
図9.1の完全長のメタロプロテアーゼ配列についての系統発生樹は、近隣結合法(NJ)を利用して作製した(Saitou,N.;and Nei,M.(1987).The neighbor−joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.MolBiol.Evol.4,406〜425)。NJ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。phylodendron−系統発生樹プリンターソフトウェア(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint−form.html)を利用して系統発生樹を表示した。これを図9.2に示す。図9.2では、パエニバチルス(Paenibacillus)属の配列のクラスタ形成を観察することができる。
Claims (67)
- 配列番号:3、8、13、18、23、28、33、及び38からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも60%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号:3、8、13、18、23、28、33、及び38からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%配列同一性を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号:3、8、13、18、23、28、33、及び38からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも95%配列同一性を有する、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号:3、8、13、18、23、28、33、及び38からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、バチルス(Bacillales)目のメンバーに由来するものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記バチルス(Bacillales)目のメンバーが、パエニバチルス(Paenibacillaceae)科のメンバーである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記バチルス(Bacillales)目のメンバーがパエニバチルス種(Paenibacillus spp.)である、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、プラノコッカス(Planococcus)種に由来するものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、プロテアーゼ活性を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ活性が、カゼイン加水分解、コラーゲン加水分解、エラスチン加水分解、ケラチン加水分解、大豆タンパク質加水分解、又はコーンミールタンパク質加水分解を含むものである、請求項9に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、pH 4.5〜10で前記ポリペプチドの最大活性の少なくとも50%を保持するものである、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、30℃〜70℃で前記ポリペプチドの最大活性の少なくとも50%を保持するものである、請求項1〜11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、洗剤組成物中でクリーニング活性を有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記洗剤組成物がADW洗剤組成物である、請求項13に記載のポリペプチド。
- 前記洗剤組成物が、洗濯洗剤組成物である、請求項13に記載のポリペプチド。
- 前記洗剤組成物が、液体洗濯洗剤組成物である、請求項15に記載のポリペプチド。
- 前記洗剤組成物が、粉末洗濯洗剤組成物である、請求項15に記載のポリペプチド。
- 前記洗剤組成物が、漂白成分を含むものである、請求項13に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、組み換えポリペプチドである、請求項1〜18のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むものである、組成物。
- 前記組成物が、クリーニング組成物である、請求項20に記載の組成物。
- 前記組成物が、洗剤組成物である、請求項21に記載の組成物。
- 前記洗剤組成物が、洗濯洗剤、布地柔軟化洗剤、食器洗浄洗剤、及び硬質表面クリーニング洗剤からなる群から選択されるものである、請求項22に記載の組成物。
- 前記組成物が、界面活性剤を更に含むものである、請求項20〜22のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項24に記載の組成物。
- 前記界面活性剤がイオン性界面活性剤である、請求項24に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項24に記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも1種のカルシウムイオン及び/又は亜鉛イオンを更に含むものである、請求項20〜27のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも1種の安定剤を更に含むものである、請求項20〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記ポリペプチドを約0.001〜約0.1重量%含むものである、請求項20〜29のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1種の漂白剤を更に含むものである、請求項20〜30のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記クリーニング組成物がリン酸塩を含まないものである、請求項20〜31のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記クリーニング組成物がリン酸塩を含むものである、請求項20〜31のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1種の補助成分を更に含むものである、請求項20〜33のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、顆粒、粉末、固体、棒状物、液体、錠剤、ゲル、又はペーストの組成物である、請求項20〜34のいずれか一項に記載の組成物。
- アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ,カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−1、4−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、その他のメタロプロテアーゼ酵素、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される1種以上の追加の酵素又は酵素誘導体を更に含む、請求項20〜35のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、pH約5.5〜約8.5で処方されるものである、請求項20〜36のいずれか一項に記載の組成物。
- 動物試料を前処理するための方法であって、動物試料前処理前製品を請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドにより前処理することを含む、方法。
- 表面又は物品を、請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むクリーニング組成物と接触させることを含む、クリーニング方法。
- 表面又は物品を、請求項20〜37のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、クリーニング方法。
- 前記表面又は物品をそれぞれ前記組成物と接触させた後、前記表面又は物品をすすぎ洗いすることを更に含む、請求項39又は40に記載の方法。
- 前記物品が食器である、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記物品が布地である、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面又は物品を前記組成物と接触させた後、前記表面又は物品をすすぎ洗いする工程を更に含む、請求項39〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面又は物品を前記すすぎ洗いをした後、前記表面又は物品を乾燥させる工程を更に含む、請求項44に記載の方法。
- 表面又は物品をクリーニングする方法であって、請求項20〜37のいずれか一項に記載の組成物と、クリーニングする必要のある表面又は物品を準備することと;前記表面又は物品の表面をクリーニングするのに好適な条件下で、前記組成物を、前記クリーニングする必要のある表面又は物品と接触させて、クリーニングされた表面又は物品を得ることと、を含む方法。
- 前記洗浄された表面又は物品をすすいで、すすがれた表面又は物品を提供する工程を更に含む、請求項46に記載の方法。
- 前記すすがれた表面又は物品を乾燥する工程を更に含む、請求項46又は47に記載の方法。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、
a.請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより宿主細胞を安定的に形質転換させることと;
b.前記宿主細胞に前記プロテアーゼを産生させるのに好適な条件下で、前記形質転換させた宿主細胞を培養することと;
c.前記プロテアーゼを回収することと、
を含む、方法。 - 前記宿主細胞が糸状菌又は細菌の細胞である、請求項49に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、バチルス(Bacillus spp.)、ストレプトミセス(Streptomyces spp.)、エシェリキア(Escherichia spp.)、アスペルギルス(Aspergillus spp.)、トリコデルマ(Trichoderma spp.)、シュードモナス(Pseudomonas spp.)、コリネバクテリウム(Corynebacterium spp.)、サッカロミセス(Saccharomyces spp.)、又はピキア(Pichia spp.)からなる群から選択される、請求項49又は50に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、
a.配列番号:4、9、14、19、24、29、34、及び39からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対し少なくとも70%配列同一性であるもの;又は
b.中程度〜高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号:4、9、14、19、24、29、34、及び39からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に由来するプローブとハイブリダイズさせることができるもの;又は
c.配列番号:4、9、14、19、24、29、34、及び39からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対し少なくとも70%配列同一性を有するポリヌクレオチド配列に対し相補的なポリヌクレオチド配列
を含む、ポリヌクレオチド配列を含む、請求項49〜51のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ベクターが、ネイティブ又は非天然に生じるシグナルペプチドをコードしているDNA配列を含む、請求項49〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、異種プロモーター及び/又はシグナルペプチドをコードしているDNA配列を含む、請求項49〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、相同プロモーター及び/又はシグナルペプチドをコードしているDNAを含む、請求項49〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、培養培地又は発酵ブロスで培養される、請求項49〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸配列であって、
(i)配列番号:4、9、14、19、24、29、34、及び39からなる群から選択される配列に対し少なくとも70%同一性を有する、又は
(ii)中程度〜高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号:4、9、14、19、24、29、34、及び39からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に由来するプローブにハイブリダイズさせることができるか、又は
(iii)配列番号:4、9、14、19、24、29、34、及び39からなる群から選択される前記ポリヌクレオチド配列と相補的である、
核酸配列を含むものである、核酸配列。 - 請求項57に記載の核酸配列を含むものである、ベクター。
- 請求項58に記載のベクターにより形質転換させたものである、宿主細胞。
- バチルス(Bacillus spp.)、ストレプトミセス(Streptomyces spp.)、エシェリキア(Escherichia spp.)、アスペルギルス(Aspergillus spp.)、トリコデルマ(Trichoderma spp.)、シュードモナス(Pseudomonas spp.)、コリネバクテリウム(Corynebacterium spp.)、サッカロミセス(Saccharomyces spp.)、又はピキア(Pichia spp.)からなる群から選択されるものである、請求項59に記載の宿主細胞。
- 前記バチルス(Bacillus spp.)がバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)である、請求項59又は60に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むものである、布地加工組成物。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むものである、動物飼料組成物。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むものである、皮革加工組成物。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組み換えポリペプチドを含むものである、羽毛加工組成物。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組み換えポリペプチドを含むものである、羽毛加工組成物。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組み換えポリペプチドを含むものである、トウモロコシ大豆タンパク質加工組成物。
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