CN106399280B - 包含一种或多种可组合的突变的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供了改造的蛋白酶变体。具体而言，该蛋白酶变体包含选定表面位置处的可组合突变，所述突变影响酶的电荷和/或疏水性以增强得到的变体酶在选择性应用中的至少一种需要的特性。也提供了包含蛋白酶变体的组合物，以及使用该组合物的方法。

Description

包含一种或多种可组合的突变的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶

本申请是中国专利申请201310031350.X的分案申请，原申请的申请日是2009年11月10日，发明名称为“包含一种或多种可组合的突变的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶”，原申请是中国专利申请200980144526.4(PCT/US2009/063837)的分案申请。

本申请要求2008年11月11日提交的美国临时专利申请61/113,545和2009年6月19日提交的美国临时专利申请61/218,802的优先权，所述临时专利申请在此引入作为参考。

发明领域

本发明提供改造的蛋白酶变体。具体而言，该蛋白酶变体包含在选定的表面位置处的可组合突变，所述突变影响酶的电荷和/或疏水性以增强得到的变体酶在选择性应用中的至少一种需要的特性。也提供了包含蛋白酶变体的组合物，以及使用该组合物的方法。

发明背景

丝氨酸蛋白酶是羰基水解酶的亚类，所述羰基水解酶包含多种具有广泛的特异性和生物学功能的酶类。在枯草杆菌蛋白酶上已经进行了许多研究，主要是由于它们在清洁和喂饲应用中的有用性。其他研究集中于可能减少这些酶在多种应用中的功能性的不利环境条件上(例如，暴露于氧化剂、螫合剂、极端的温度和/或pH)。然而，本领域仍需要能抵抗这些不利条件并保留本领域目前已知的那些酶系统的活性或者具有改善的活性的酶系统的需求。

发明概述

本发明提供改造的蛋白酶变体。具体而言，该蛋白酶变体包含在选定的表面位置处的可组合突变，所述突变影响酶的电荷和/或疏水性以增强得到的变体酶在选择性应用中的至少一种需要的特性。也提供了包含蛋白酶变体的组合物，以及使用该组合物的方法。

在一个实施方案中，该蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属(Bacillus)枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自24、45、101、109、118、213和217位置的两个或多个位置的替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另一个实施方案中，该蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自24、45、101、109、118、213和217位置的两个或多个位置的替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)。

在另一个实施方案中，该蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另一个实施方案中，该蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)。

在另一个实施方案中，该蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另一个实施方案中，该蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)。

在另一个实施方案中，该蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-GI18Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q，和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的组合替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另一个实施方案中，该蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含替换T213Q，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另一个实施方案中，该蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并(包含)选自

S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E的组合替换，其中所述位置对应于SEQ ID NO：1的BPN’枯草杆菌蛋白酶的位置。

在另一个实施方案中，该蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含替代K213Q，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另一个实施方案中，本发明提供了编码上述任意一种蛋白酶变体的分离的核酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码上述任意一种蛋白酶变体的分离的核酸的表达载体。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含表达载体的宿主细胞，其相应地包含了编码上述任意一种蛋白酶变体的分离的核酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含至少一种蛋白酶变体的清洁组合物，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自24、45、101、109、118、213和217位置的两个或多个位置的替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂(dry laundry)。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另一个实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自24、45、101、109、118、213和217位置的两个或多个位置的替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号,并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的组合替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另一个实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含替换T213Q，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另外的实施方案中，本发明提供了包含至少一种蛋白酶变体的清洁组合物，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q-A45QS101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q，和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-

L217E的组合替换，其中所述位置对应于SEQ ID NO：1的BPN’枯草杆菌蛋白酶的位置。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。又在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另一个实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含替换K213Q，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另一个实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自24、45、101、109、118、213和217位置的两个或多个位置的替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其还包含一种或多种其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶(perhydrolases)、角质酶(cutinase)、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶(ligninase)、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另一个实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自24、45、101、109、118、213和217位置的两个或多个位置的替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)，并且其还包含一种或多种其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其还包含一种或多种其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)，并且其还包含一种或多种其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)，并且其还包含一种或多种其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的组合替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其还包含一种或多种其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另一个实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含替换T213Q，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其还包含一种或多种其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另外的实施方案中，清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q，和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E，的组合替换，其中所述位置对应于SEQ ID NO：1的BPN’枯草杆菌蛋白酶的位置，并且其还包含一种或多种其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另一个实施方案中，该清洁组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含替换K213Q，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其还包含一种或多种其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在一些实施方案中，该清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤剂是餐具洗涤剂。在其他实施方案中，该洗涤剂是衣物洗涤剂例如强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。在备选的实施方案中，该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。

在另一个实施方案中，该清洁组合物包含至少0.0001重量百分比的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自24、45、101、109、118、213和217位置的两个或多个位置的替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另一个实施方案中，该清洁组合物包含至少0.0001重量百分比的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自24、45、101、109、118、213和217位置的两个或多个位置的替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少0.0001重量百分比的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少0.0001重量百分比的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)。

在另外的实施方案中，本发明提供了包含至少0.0001重量百分比的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物，所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少0.0001重量百分比的至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的两个或多个位置的两个或多个替换，其中所述位置通过对应于如SEQ IDNO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号，并且其具有大于或等于0.5的相对蛋白质表达水平性能指数(TCA PI)和/或去污活性性能指数(BMI PI)。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少0.0001重量百分比的至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式并包含选自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q，和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的组合替换，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少0.0001重量百分比的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶GG36的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含替换T213Q，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少0.0001重量百分比的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含选自S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q，和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E的组合替换，其中所述位置对应于SEQ ID NO：1的BPN’枯草杆菌蛋白酶的位置。

在另外的实施方案中，该清洁组合物包含至少0.0001重量百分比的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶FNA的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的成熟形式，并包含替换K213Q，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO：1所述的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

在另外的实施方案中，本发明提供了清洁的方法，包括将表面和/或包含织物的物品与所述的任意一种清洁组合物接触，并任选地洗涤和/或漂洗所述表面或物品。

附图简述

图1提供了亲本蛋白酶GG36(SEQ ID：4)和FNA(SEQ ID NO：7)与BPN’(SEQ ID NO：1)成熟形式的比对。除非另外说明，替换位置以相对于BPN’位置的方式给出。

图2提供了表示氨基酸残基替换在pH 8.6的电荷改变之电荷改变真值表。可以容易地从该真值表中确定与亲本酶相比，变体酶的净电荷改变。

图3提供了表示氨基酸残基替换的亲水性改变的Kyte-Doolittle亲水性改变真值表。可以容易地从该真值表中确定与亲本酶相比，变体酶的净亲水性改变。

图4提供了pAC-GG36ci的图谱。

图5提供了pAC-FNAre的图谱。

发明详述

本发明提供改造的蛋白酶变体。具体而言，该蛋白酶变体包含在选定的表面位置处的可组合突变，所述突变影响酶的电荷和/或疏水性以增强得到的变体酶在选择性应用中的至少一种需要的特性。也提供了包含蛋白酶变体的组合物，以及使用该组合物的方法。

如本文中所指，引入的替换影响了枯草杆菌蛋白酶的电荷和/或疏水性，得到了包含至少一种可组合突变的酶，以提供当与亲本酶比较时，具有至少一种目的特性的性能指数>0.5的性能指数的变体蛋白酶。可组合突变可以用于在多种应用中增强至少一种需要的酶特性的性能指数。目的特性包括但不限于电荷、疏水性、可溶性、清洁性能例如从织物和/或硬表面去污、热稳定性、储藏稳定性、去垢剂稳定性、底物结合、酶抑制、表达水平、反应速率和底物降解。在一些实施方案中，目的特性是选自电荷、疏水性、表达水平(TCA PI)和清洁性能例如去污性能(BMI PI)的一种或多种特性。尽管在本文中以蛋白酶和血渍、乳渍和墨渍(BMI)的关系的方式进行描述，但是应当考虑，本发明的蛋白酶变体对于在由应用例如清洁应用指定的任意多种反应介质中的任一酶-底物相互作用是最优的。

在此之前，研发优良的蛋白质的尝试集中于最小化酶与表面的结合。例如，一些方法涉及改变枯草杆菌蛋白酶序列以获得具有降低对不可溶性底物吸附的变体酶(参见如，WO 95/07991)。在另外的方法中，改变了枯草杆菌蛋白酶的pI以获得在定义的pH具有净电荷为零的变体酶(参见如，WO 91/00345)。然而，正如在本发明的研发期间所测定，这些方法并非总是成功的。在本发明的研发期间，测定出酶的表面特性一般具有由以表面电荷和/或疏水性的方式改变的函数确定的最佳值。甚至对于通常非常活跃的酶，在一些条件下和与一些底物反应时，表面特性也可以造成整个反应比在其他条件下和/或与其他底物反应时更慢。在一些实施方案中，本发明提供了包含修饰了表面特性的变体蛋白酶，其通过改变酶表面上一个或多个氨基酸的性质获得。当在表面上并不与任一其他氨基酸相互作用且对于酶功能并非必需的位置处产生这些改变时，基于如本文中所述那些位置处替换的氨基酸的特性，可以预测蛋白质的特性。

从结构数据可以容易地鉴定位置；备选地，可使用同源序列比对、位点评价文库数据和/或它们的任一组合。可以将氨基酸得分真值表(amino acid scoring matrices)(例如图1)和/或疏水性尺度(scales)(例如图2)用于指导氨基酸替换并用于鉴定与替换的氨基酸的特性相关的蛋白质的那些物理特性。

定义

除非另外指明，本发明的实施包括属于本领域技术的普遍用于分子生物学、微生物学和重组DNA的常规技术。这些技术为本领域技术人员所公知，并记载于许多本领域熟知的文章和参考著作中。此处提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，包括上文中和下文中的，都明确引入本申请作为参考。

除非另外定义，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。虽然与此处描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施或检测，还是在本文中描述了一些优选的方法和材料。因此，通过整体参考说明书而更加完全地描述下面定义的术语。

同时，如本文中所用，单数“一个”、“一”和“所述”包括其复数指代，除非另外清楚指明。数值范围包括限定范围的端点数值。除非另外说明，核酸以5'至3'的方向从左向右书写，而氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。应理解本发明不限于所描述的特定方法学、实验方案和试剂，因为本领域技术人员可以根据使用它们的背景而对其进行改变。

预期通篇说明书中给定的每个上限值意欲包括每个较小的数值限制，相当于这样的较小数值限制明确记载于本文中。通篇说明书中给定的每个下限值意欲包括每个较大的数值限制，相当于这样的更大数值限制明确记载于本文中。整个说明书中每个数值范围包括落入该较宽数值范围的每个较窄数值范围，相当于这样的较窄数值范围全部明确记载于本文中。

此外，此处提供的标题不是本发明的各个实施方式或方面的限制，该各个实施方式或方面可以通过整体参考说明书而获得。因此，如上所述，通过整体引用说明书而更加完全地描述下面定义的术语。尽管如此，为了方便本发明的理解，将许多术语定义如下。

如本文中所用，术语“性能指数(PI)”指在给定的测定中，变体酶的性能相对于亲本酶或参考酶的性能的比率。清洁性能的PI在本文中提供为去除血渍、乳渍和墨渍(BMI)的性能，并提供为BMI PI值。用于表达水平性能的PI在本文中提供为由通过三氯乙酸(TCA)沉淀法测量的产生的蛋白质的水平，并提供为TCA PI值。

如本文中所用，“可组合的突变”是对于包含具有至少一种特性的性能指数(PI)值>0.5的突变的变体而言的那些突变。可组合的突变是可以联合的突变，以赋予蛋白质一种或多种需要特性的合适性能指标(Performance Indice)，并给予电荷和/或疏水性的改变。发生突变的位置如下分类：对于至少一种特性，非限制性位置具有＝20％的中性突变；和对于活性和稳定性，限制性位置具有<20％的中性突变。

术语“分离的”和“纯化的”指从其来源环境(例如，天然环境，如果其是天然发生的)中分离的物质。例如，当其在特定的组合物中以比天然发生的或野生型生物中存在的浓度更高或更低的浓度存在时或者以与并非通常存在于天然存在的或野生型生物中表达的组分组合的方式存在时，称该物质为“纯化的”。例如，存在于活的动物中的天然发生的多核苷酸或者多肽不是分离的，但是分离自天然系统中的一些或者所有共存物质的相同的核苷酸或多肽是分离的。在一些实施方案中，此类多核苷酸是载体的一部分，和/或此类多核苷酸或多肽是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为此类载体或组合物并不是其天然环境的一部分。在优选的实施方案中，称核苷酸或蛋白质为纯化的，例如，如果其在电泳凝胶或印迹中产生基本上一条带时。

术语“分离的”，当用于指DNA序列时，指已经从其天然遗传环境中分离的DNA序列，并因此没有其他无关的或不需要的编码序列，并且为适合于在遗传改造的蛋白质生产系统中使用的形式。此类分离的分子是那些分离自它们的天然环境的分子并包括cDNA和基因克隆。本发明的分离的DNA分子没有与它们通常相关的其他基因，但是可以包括天然存在的5'和3'非翻译区例如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域普通技术人员是显而易见的(参见例如，Dynan和Tijan，Nature 316：774-78[1985])。术语“分离的DNA序列”备选地称为“克隆的DNA序列”。

术语“分离的”，当用于指蛋白质时，指在除其天然环境外的条件中发现的蛋白质。在优选的形式中，分离的蛋白质基本上没有其他蛋白质，特别是其他同源的蛋白质。分离的蛋白质具有由SDS-PAGE测定的大于约10％的纯度，优选地大于约20％，和甚至更优选地大于约30％的纯度。本发明另外的方面包括由SDS-PAGE测定的高纯化形式(即，大于约40％的纯度，大于约60％的纯度，大于约70％的纯度，大于约80％的纯度，大于约90％的纯度，大于约95％的纯度，大于约97％的纯度和甚至大于约99％的纯度)的蛋白质。

如本文中所用，“亲本”蛋白质指例如通过引入一种或多种氨基酸替换修饰，以产生亲本蛋白质的一种或多种变体的蛋白质。因此，术语“蛋白酶变体”和“变体蛋白酶”用于指与变体蛋白酶类似，特别是与它们的功能类似的亲本蛋白酶的变体，但是在它们的氨基酸序列中的突变使得它们从1个至20个氨基酸位置与亲本蛋白酶的序列不同。示例性亲本蛋白酶的成熟区域的氨基酸序列显示于图1的比对结果中。FNA(SEQ ID NO:7)和GG36(SEQID NO:4)是已得到修饰并含有一个或多个可组合的替换的成熟亲本蛋白酶，所述可组合的替换产生本发明的变体蛋白酶。GG36是野生型迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的蛋白酶，而FNA是含有Y217L替换的解淀粉芽孢杆菌的BPN’蛋白酶。

如本文中所用，术语“蛋白酶”和“蛋白水解活性”指显示出水解肽或具有肽键的底物的能力的蛋白质或肽。存在许多熟知的方法来测量蛋白水解活性((Kalisz,“MicrobialProteinases”出自Fiechter(编著),Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,[1988])。例如，蛋白水解活性可以通过比较实验来确定，该实验分析了各种蛋白酶水解商业底物的能力。用于这种蛋白酶或蛋白水解活性分析的示例性底物包括但不限于，二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)，牛胶原(Sigma C-9879)，牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。使用这些底物的比色法为本领域所熟知，参见，例如WO 99/34011和美国专利6,376,450，所述两专利在本文中引入作为参考。pNA测定(参见，例如Del Mar等人,Anal.Biochem.,99:316-320[1979])也可以用于测定在梯度洗脱期间收集的组分的活性酶浓度。该测定测量当酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对-硝基苯胺(sucAAPF-pNA)时的对硝基苯胺释放率。用分光光度计在410nm处测量从水解反应中产生的黄色的速率，其与活性酶浓度成比例。此外，在280nm的吸光度测量可以用于测定总蛋白质的浓度。活性酶/总蛋白质比率给出了酶纯度。

如本文中所用，术语“枯草杆菌蛋白酶”指如在MEROPS-The Peptidase Data base中所述的S8丝氨酸蛋白酶家族的任一成员(Rawlings等人，MEROPS：the peptidasedatabase，Nucleic Acids Res，第34数据库专辑，D270-272，2006，在merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops.cgi？id＝s08；action＝：网站)。以下信息来源于到2008年11月6日为止的MEROPS-The Peptidase数据库，“肽酶家族S8含有丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶及其同源物(Peptidase family S8contains the serine endopeptidasesubtilisin and its homologues)”(Biochem J，290：205-218，1993)。S8家族，也已知为枯草杆菌酶，是丝氨酸肽酶的第二大家族，并可以分为两个亚族，S8A亚族的示例类型为枯草杆菌蛋白酶(S08.001)和S8B亚族的示例类型为枯草溶菌酶(kexin)(S08.070)。以前认为三肽基-肽酶II(TPP-II；S08.090)是第三亚族的示例类型，但是已经确定为错误分类。S8家族的成员具有Asp、His和Ser序列顺序的催化三分子，其与S1、S9和S10家族的序列顺序不同。在S8A亚族中，活性部位残基一般存在于Asp-Thr/Ser-Gly(其与在AA系中的天冬氨酸内肽酶家族中的序列基序类似)、His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro基序中。在S8B亚族中，催化残基一般存在于Asp-Asp-Gly、His-Gly-Thr-Arg和Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Pro基序中。大多数S8家族的成员是内肽酶，并且在中性-微碱性pH时具有活性。该家族中的许多肽酶是热稳定的。通常将酪蛋白用作为蛋白质底物，并且一般的合成底物是suc-AAPF。该家族的大多数成员是非特异性肽酶，具有优先在疏水残基后的剪切。然而，S8B的成员，例如枯草溶菌酶(S08.070)和弗林蛋白酶(S08.071)，在氨基二羧酸后剪切。一般丝氨酸肽酶抑制物例如DFP和PMSF可以抑制S8家族的大多数成员。因为家族的许多成员都与钙结合以稳定，用EDTA和EGTA可以观察到抑制，所以通常认为其是金属蛋白酶的特异抑制物。蛋白质抑制物包括火鸡卵类粘蛋白第三结构域(I01.003)、链霉菌属(Streptomyces)(I16.003)枯草杆菌蛋白酶抑制剂和I13家族的成员例如水蛭蛋白酶抑制剂C(I13.001)和大麦(棒ley)抑制剂CI-1A(I13.005)，它们中的许多也抑制胰凝乳蛋白酶(S01.001)。枯草杆菌蛋白酶前肽是其自身的抑制物，并且来自酵母属的同源蛋白酶B抑制物抑制塞里维辛(cerevisin)(S08.052)。目前已测定S8家族的几个成员的三级结构。典型的S8蛋白质结构由具有在两层螺旋之间的7链β折叠夹层的三层组成。枯草杆菌蛋白酶(S08.001)是SB系类型结构(SB)。尽管具有不同的结构，枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(S01.001)的活性部位是可以叠加的，表明相似性是趋同而非趋异进化的结果。

如本文中所用，术语“杆菌”和“杆菌属”包括本领域技术人员已知杆菌属的所有成员，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、B.halodurans、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应承认，杆菌属还在持续进行分类学上的重新组织。所以，杆菌属包括那些已经重新分类的物种，包括但不限于例如嗜热脂肪芽孢杆菌(现在命名为Geobacillus stearothermophilus)等微生物。氧气存在下抵抗性的内生孢子被认为是杆菌属的定义性特征，虽然该特征也适用于现在命名的环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus)、兼性芽孢杆菌(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢杆菌(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌(Thermobacillus)、Ureibacillus和枝芽孢杆菌(Virgibacillus)。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。与IUPAC-IUB Joint Commissionon Biochemical Nomenclature(JCBN)一致定义的氨基酸的3字母密码用于本公开中。应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由一种以上的核苷酸序列编码。

“前序列”是蛋白酶的信号肽和成熟区之间的氨基酸序列。在成熟过程期间剪切前序列，导致产生蛋白酶的活性成熟形式。

术语“信号序列”或“信号肽”指参与成熟或前体形式的蛋白质分泌的任一核苷酸和/或氨基酸序列。该信号序列的定义是功能性定义，意图包括由蛋白质基因的氨基端部分编码的所有氨基酸序列，其参与蛋白质分泌的实施。它们通常，但并非普遍地与蛋白质的氨基端部分或与前体蛋白质的氨基端部分结合。信号序列可以是内源的或者外源的。信号序列通常可以是与蛋白质(例如，蛋白酶)相关的，或者可以来自编码其他分泌蛋白质的基因。一种示例性外源信号序列包含与来自迟缓芽孢杆菌(ATCC21536)的枯草杆菌蛋白酶的信号序列的剩余部分融合的枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号序列的前七个氨基酸残基。

术语“杂合信号序列”指信号序列中的一部分是获自与待表达的基因的信号序列融合的表达宿主的信号序列。在一些实施方案中，使用合成的序列。

术语蛋白质或肽的“成熟”形式指蛋白质或肽的最终功能性形式。作为示例,本文中提供的FNA蛋白酶的成熟形式包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列，而GG36的成熟形式包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

本文中的术语“前体”指具有与成熟蛋白质的氨基端或羧基端有效连接的前序列的蛋白质或肽形式。作为示例，成熟GG36(SEQ ID NO:4)和FNA(SEQ ID NO:7)的前体的序列分别为SEQ ID NOS:3和SEQ ID NOS:6。前体也可以具有与前序列的氨基端有效连接的“信号”序列。前体也可以具有涉及翻译后活性的其他多核苷酸(例如，从其剪切以释放成熟形式的蛋白质或肽的多核苷酸)。

“天然存在的酶”和“天然存在的蛋白质”指具有与见于天然界的氨基酸序列相同的非修饰的氨基酸序列的酶或蛋白质。天然存在的酶包括天然酶，那些酶天然表达于或见于特定的微生物中。

术语“源自”和“获自”不仅指由所讨论的生物的菌株产生的或可产生的酶，例如蛋白酶，也指由分离自此种菌株的DNA序列编码的和在含有此种DNA序列的宿主生物中产生的酶。此外，该术语指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的酶，并且该酶具有所讨论酶的相同的特征。

本定义范围内的“衍生物”通常保留了在野生型、天然或亲本形式中观察到的特征性蛋白水解活性，以使衍生物可以用于野生型、天然或亲本形式类似的目的。功能性酶衍生物包括天然发生的、合成或重组产生的具有亲本酶的一般特征的肽或肽片段。

如本文中所用，“对应于”指在蛋白质或肽中所列举的位置处的残基。

如本文中所用，“替换的”和“替换”指取代亲本序列中一个或多个氨基酸残基或核酸碱基。在一些实施方案中，该替换涉及取代天然存在的残基或碱基。在一些实施方案中，替换两个或多个氨基酸以产生包含组合氨基酸替换的变体蛋白酶。在一些实施方案中，组合替换通过进行了替换的位置处的氨基酸表示。例如，由E6A-E30G表示的组合意为用丙氨酸(A)替换了位置6处的谷氨酸(E)，并且用甘氨酸(G)替换了位置30处的谷氨酸(E)。给出的氨基酸位置对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的成熟区域(SEQ OD NO:1)中的编号位置。

本文中的短语“在两个或多个位置处的替换”指在同一蛋白质中进行两个或多个替换的组合。因此，“在两个或多个位置处的替换”指2个、3个、4个、5个、6个和7个氨基酸替换的组合的任意一种。

如本文中所用，术语“表达盒”和“表达载体”指重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定的核酸在靶细胞中转录的特定核酸元件。该重组表达盒可以掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。一般地，除其他序列外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子。在优选的实施方案中，表达载体具有在宿主细胞中掺入并表达异源DNA片段的能力。许多原核的和真核的表达载体是商业可获得的。选择合适的表达载体是在本领域技术人员的知识范围内的。在本文中，术语“表达盒”与“DNA构建体”和它们的语法等同形式可以互换地使用。选择合适的表达载体是在本领域技术人员的知识范围内的。

如本文中所用，术语“载体”指设计用于将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。在一些实施方案中，该多核苷酸构建体包含编码蛋白酶(例如，前体或成熟蛋白酶)的DNA序列，所述DNA序列与能在合适的宿主中影响该DNA表达的合适的前序列(例如，分泌的序列等)有效连接。

如本文中所用，术语“质粒”指用作为克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，并且其在一些真核生物或原核生物中形成了染色体外的自我复制遗传元件或者整合到宿主染色体中。

如本文中所用，术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指用于包含根据本发明的DNA的表达载体的合适宿主。

如本文中所用，“清洁组合物”和“清洁制剂”指用于从待清洁的物品除去不需要的化合物的组合物，所述物品例如织物、餐具、隐形眼镜、其他固体底物、头发(洗发剂)、皮肤(肥皂和乳膏)、牙齿(漱口剂、牙膏)等。该术语包括选择用于特定类型的所希望的清洁组合物的任一物质/化合物以及在该组合物中使用的产品的形式(例如，液体、凝胶、颗粒、粉末或喷雾组合物)。通过考虑待清洁的表面、物品或织物以及在使用期间用于清洁条件的组合物的希望形式，可以容易地进行清洁组合物材料的特定选择。

该术语也指适合于清洁、漂白、消毒和/或杀菌任意物体和/或表面的任一组合物。该术语意图包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体洗衣剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁制剂，例如用于玻璃、木材、陶瓷的和金属的台面和窗户的清洁制剂；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物增鲜剂；织物软化剂；和纺织品和衣物预去斑剂，以及餐具洗涤剂)。

事实上，除非另外指明，本文中所用的术语“清洁组合物”包括，干的例如颗粒或粉末形式的全效或强效洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体的、凝胶的或者膏状形式的全效洗涤剂，特别是所谓的强效液体(HDL)型；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻渍餐具洗涤剂，特别是那些高发泡型(high-foaming type)；家用和公用的机洗餐具洗涤剂，包括多种片剂、颗粒、液体和助漂洗类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌型手洗洗涤类型、清洁棒、漱口剂、假牙清洁剂、汽车和地毯洗涤剂、卫浴清洁剂；洗发剂和护发素；沐浴凝胶和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂例如漂白添加剂和“染色棒(stain-stick)”或预处理类型。

如在本文中所用，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括衣物添加组合物和适合于在浸泡和/或预处理污垢织物(例如，衣物，日用织品和其他纺织材料)中使用的组合物。

如本文中所用，“非织物清洁组合物”包括非纺织的(即，织物的)表面清洁组合物，包括但不限于餐具清洗洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物和个人清洁组合物。

如本文中所用，术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”用于指意图在用于清洁脏物体的洗涤介质中使用的混合物。在优选的实施方案中，该术语用于指用于清洁餐具、刀叉餐具等(例如“餐具洗涤剂”或“餐具清洁洗涤剂”)的洗涤剂。并不意图使本发明限于任一具体的洗涤剂制剂或组合物。事实上，除含有本发明的至少一种蛋白酶的洗涤剂外，该术语还包括含有表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和助溶剂的洗涤剂。

如本文中所用，“餐具洗涤组合物”指用于清洁餐具包括刀叉餐具的组合物的所有形式，包括但不限于颗粒和液体形式。并不意图使本发明限于任一具体类型餐具组合物。事实上，本发明用于清洁任意材料的餐具(例如，餐具，包括但不限于盘子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀叉餐具(例如，器具，包括但不限于匙、刀、叉、餐点器具等)，所述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃、丙烯酸脂类等。本文中所用的术语“餐具”指餐具和刀叉餐具二者。

如本文中所用，“无磷酸盐餐具洗涤剂”是含有不多于0.5％的磷(即，磷是痕量元素)的洗涤剂。

如本文中所用，变体蛋白酶的“洗涤性能”或“清洁性能”指当与不存在蛋白酶变体的情况下获得的清洁能力比较时，变体蛋白酶对清洁组合物的清洁能力所起的作用。

本文中所用的术语“相关洗涤条件”指餐具或衣物洗涤剂细分市场中在家庭中实际使用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤机械、肥皂液浓度、洗涤剂类型和水硬度。

术语“改善的洗涤性能”用于指在相关洗涤条件下在去污中获得的更好的最终结果，或者指相对于对应的野生型或起始亲本蛋白酶获得相同的最终结果所需的在重量方面更少的变体蛋白酶。

如本文中所用，术语“消毒”指从表面去除污垢，以及抑制或者杀灭物品表面的微生物。并不意图使本发明限于任一具体的表面、物品或者待除去的污垢或微生物。

如本文中所用，“酶的有效量”指为达到具体应用(例如，个人护理产品、清洁组合物等)中所需的酶活性所需的酶的量。本领域普通技术人员可以容易地确定该有效量，并且其基于许多因素，例如所用的具体的酶变体、清洁应用、清洁组合物的具体成分，以及需要的是液体组合物还是干(例如，颗粒、棒料)组合物，等。

本文中清洁组合物的“紧凑型”形式通过密度得到最好反映，并且就组合物而言，由无机填料盐的量得到最好反映。无机填料盐是粉末形式洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，该填充盐以基本量存在，一般占总组合物重量的约17％至约35％。相比之下，在紧凑型组合物中，该填充盐以不超出总组合物的约15％的量存在。在一些实施方案中，该填充盐按组合物的重量以不超过约10％，或者更优选地约5％的量存在。在一些实施方案中，该无机填料选自碱金属和碱土金属的硫酸盐和盐酸盐。优选的填料盐是硫酸钠。

如本文中所用，“辅助成分”或“辅助材料”指清洁材料，包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、污物释放聚合物、染料传递剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填充盐、水溶增溶剂、光漂剂、荧光增白剂、织物调节剂、水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色斑、silvercare、防晦暗剂和/或防腐蚀剂、碱度来源、增溶剂、载体、加工助剂、色素和pH控制剂(参见例如，美国专利6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所述全部专利申请在此处引入作为参考)。

如本文中所用，“餐具洗涤组合物”指用于清洁餐具的组合物的所有形式，包括但不限于颗粒和液体形式。

如本文中所用，“织物清洁组合物”指用于清洁织物的洗涤剂组合物的所有形式，包括但不限于颗粒、液体和棒状形式。

如本文中所用，“织物”包括任一织造材料。因此，该术语意图包括衣服，以及织品、纱、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料和任一其他织造材料。

如本文中所用，“纺织品”指织造的织物，以及适合于转变成或者用作纱的短纤维和长丝、织造物、针织品和非织造织物。该术语包括天然，以及合成的(例如，制造的)纤维制造的纱。

如本文中所用，“纺织材料”是用于纤维、纱中间产品、纱、织物和由织物制造的产品(例如，衣服和其他物品)的常用术语。

目前用于在工业、消费或药物应用中改善蛋白质性能的大多数策略都集中于在酶活性部位或者在酶活性部位附近的氨基酸替换，以增加催化效率。然而，在本发明的研发期间，测定到除可能由于催化效率改善而增加的酶性能之外，在酶表面上其他位置的突变显著地增加了酶性能。基本上，由酶介导的控制底物转变成产物的反应速率仅部分地通过单独的化学催化转变步骤的速率控制。在酶和底物结合为酶-底物ES复合物之前，以及在从化学转变后形成的酶-产物EP复合物解离期间，酶和底物作为胶体相互作用。即使该反应步骤以快速率进行，酶也可以非常慢地靠近底物(例如，扩散限制)，如同经历静电排斥力的相同指标的胶体的情况一样。此外，酶从酶-产物EP复合物中释放可以非常地慢(例如，扩散限制)，如同经历短程疏水引力和分散力的胶体的情况一样。与化学转变比较，两种条件都增加了酶转换底物为产物的时间，并成为限速步骤。尽管可以假设，相反电荷的胶体可以事实上地加速ES复合物的形成(例如，在扩散极限以上)，但是随后的EP复合物的解离会相当的慢(假定没有电荷产生或者丢失)并可能降低总体反应速率。因此，开发了不对称的成对相互作用势能(the pair-wise interaction potential)以确保最小化ES复合物和EP复合物二者的转换时间。这在工业生物技术中特别重要，因为其期望在通常的酶限制性条件下以尽可能最短的时间将所有的底物转变成产物。历史上，蛋白质工程师侧重于化学转变步骤的特定酶-底物相互作用，并没有意识到由胶体分子间力和表面力产生的短期和长期非特异性相互作用二者的作用，所述相互作用控制结合和解离步骤。本发明的目的是提供了通过改变酶表面上一个或多个氨基酸的性质获得的具有改变的表面特性的蛋白酶变体，其优化了分子间作用力，使得化学转化步骤成为限速步骤。

表面特性的修饰通过使用本文中所述的方法引入改变酶的电荷和/或疏水性的氨基酸替换达到。一旦该化学转变步骤成为了限速步骤，那么可以通过改变酶活性部位来达到变体酶性能的进一步改善。无论底物是溶液中的小肽还是不溶性宏观底物，该目的都是适用的。然而，涉及的机制知识对于制备和使用本发明并非必需。并不意图使本发明限于任一具体的机制。

简而言之，用于产生本发明的蛋白酶变体的方法包括(I)测定跨度物理特性范围的探针蛋白质；(II)测定给定的所要结果的物理特性最佳值；和(III)提供具有物理特性最佳值的变体蛋白质。

I.测定探针蛋白质

测定探针蛋白质涉及在合适的测定中检测覆盖目的物理特性(即“目的特性”)范围的多个探针蛋白质(即“探针蛋白质折叠”)。探针蛋白质包括蛋白质和/或其变体的有限集。在一些示例性实施方案中，测试了至少一种丝氨酸蛋白酶的一种或多种优点。例如，提供了相对于亲本酶的变体(两种丝氨酸蛋白酶，GG36和FNA)的净电荷的改变。在本文中描述了GG36和FNA变体的净电荷改变，与各自的亲本酶比较，跨越了-7至0的相对静电荷改变范围。

II.测定物理特性最佳值

测定物理特性最佳值即测定目的特性的最佳值，涉及鉴定所要结果的物理特性最佳值或其范围。在一些示例性实施方案中，测量了FNA和GG36蛋白酶变体的清洁性能指数，在本文中提供为BMI PI。在其他实施方案中，测量了FNA和GG36蛋白酶变体的表达水平，在本文中提供为TCA PI。在本实施方案中，当比较用具有相同折叠模式的蛋白质即丝氨酸蛋白酶获得的优点时，使用了相对比较(例如，相对于野生型或亲本蛋白质的静电荷差异)。备选地，当比较用具有不同折叠模式的蛋白质，例如丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶获得的优点时，使用了常见的物理特性尺度(例如，报道为ζ电势的蛋白质电荷)。使用跨越宽物理特性范围的探针蛋白质，以增加定义物理特性的最佳值的可能性。一旦通过测定探针蛋白质建立了目的优点的最佳值或最佳值范围，那么就可以预测将较差的性能(performer)(例如，处于最佳值范围的外面)转变成较高性能(performer)(例如，在最佳值范围内)可能所需的改变的总趋势和强度二者。

考虑使用一种以上的探针蛋白质系列，以允许鉴定目的优点的不同物理特性最优条件。例如在一些实施方案中，检测了相对于洗涤剂蛋白酶GG36和FNA的亲本酶的净电荷和疏水性二者的改变在血、乳、墨测定中的清洁性能。在一些例子中，认为相同的物理特性对于不同优点会显示出不同的最佳值。例如，存在FNA的清洁性能(BMI PI)的最佳蛋白酶电荷，其与表达水平(TCA PI)的最佳蛋白酶电荷不同。

在一些实施方案中，在测量的ζ电势、净电荷、电荷密度和/或可离子化基团的表面计数方面比较了亲本蛋白质和变体蛋白质之间与电荷相关的物理特性。总而言之，测定蛋白质电荷的任一方法(滴定法或者电泳测量法)都适合于比较不同的蛋白质折叠模式。当具备时，通过计算基于蛋白质一级、二级和/或三级序列信息的一个或多个上述值来比较不同蛋白质变体。用于此类目的的一般生物信息学工具包括使用Henderson-Hesselbach等式(例如，European Molecular Biology Laboratory)的等电点计算器或者Poisson-Boltzmann静电解算机(例如，DelPhi，MOE)。

III.提供具有物理特性最佳值的变体蛋白质

一旦在以上步骤中确定了最佳值和范围，那么将提供满足目的物理特性的多个候选蛋白质。用于提供候选蛋白质的合适方法包括但不限于，通过重组技术产生人工酶变体，以及通过层析法纯化天然酶变体(例如，同源的)、体外合成糖基化或磷酸化酶变体或者体外产生的酶缀合物。通过糖基化改变蛋白质的疏水性的另一方法是在酶的表面产生新的糖基化部位。在表达期间将会体内地糖基化这些变体。

在一些实施方案中，就由替换的残基对产生的变体相对于亲本酶的疏水性净改变的总体贡献而言，比较了蛋白酶变体间与疏水性相关的物理性质。在一些实施方案中，使用文献中可得到的和本领域已知的许多氨基酸疏水尺度的一种或多种来计算总体疏水贡献，其将蛋白质一级、二级和/或三级结构信息考虑在内。例如就测量的蛋白质在其天然含水环境和疏水相之间分配而言，比较不同的蛋白质折叠模式间与疏水性相关的物理特性。例子包括但不限于在空气-水或者庚烷-水界面处的表面张力，以及在水相和含有固体底物相之间的接触角和润湿测量。总之，适合于表征蛋白质在两种相之间分配的任一方法都适合于在本发明中使用，包括光学的(例如，椭圆对称、表面等离子共振、干涉测量和/或反射性)测定法、声学的(例如，石英晶体微量天平)测定法、荧光测定法、光谱学(例如，衰减全反射红外的)测定法或者浓度(例如，酶活性)测定法。

由于带电荷残基增加了亲水特性，因此电荷和疏水性尺度并非是相互独立的。因此，本发明的一些实施方案并不是简单的相对于其他而挑选一个尺度，而是使用多种不同的尺度(例如，理论或者实验测定的尺度)用于鉴定物理特性依从性。最常用的23种疏水性尺度的文献包括：疏水性(Rao和Argos)：计算膜埋入的螺旋参数(Rao和Argos，Biochim.Biophys.Acta 869：197-214[1986])；疏水性(Black和Mould)：计算生理性L-α氨基酸的疏水性(Black和Mould，Anal.Biochem.，193：72-82[1991])；疏水性(Bull和Breese)：计算疏水性(以kcal/mole表示的转移到表面的自由能)(Bull和Breese，Arch.Biochem.Biophys.161：665-670[1974])；疏水性(Chothia)：计算95％埋入残基的比例(在12种蛋白质中)(Chothia，J.Mol.Biol.，105：1-14[1976])；疏水性(Kyte和Doolittle)：计算亲水性(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-132[1982])；疏水性(Eisenberg等人)：计算标准化的共同疏水性尺度(Eisenberg等人，J.Mol.Biol.179：125-142[1984])；疏水性(Fauchere和Pliska)：计算疏水性尺度(pi-r)(Fauchere和Pliska，Eur.J.Med.Chem.，18：369-375[1983])；疏水性(Guy)：基于转移自由能(kcal/mole)计算疏水性尺度(Guy，Biophys J.，47：61-70[1985])；疏水性(Janin)：计算从球蛋白内部转移到外部的自由能(Janin，Nature 277：491-492[1979])；疏水性(Abraham和Leo)计算疏水性(delta G1/2cal)(Abraham和Leo，Proteins：Structure，Function and Genetics 2：130-152[1987])；疏水性(Manavalan等人)计算周围平均的疏水性(Manavalan等人，Nature275：673-674[1978])；疏水性(Miyazawa等人)计算疏水性尺度(基于3D数据的接触能)(Miyazawa等人，Macromolecules 18：534-552[1985])；疏水性(Aboderin)计算氨基酸在层析纸上的迁移率(RF)(Aboderin，Int.J.Biochem.，2：537-544[1971])；疏水性HPLC(Parker等人)基于HPLC肽滞留时间计算亲水性尺度(Parker等人，Biochem.，25：5425-5431[1986])；Hphob.HPLC pH3.4通过HPLC测定计算ph 3.4的疏水性指数(Cowan和Whittaker，Peptide Res.，3：75-80[1990])；Hphob.HPLC pH7.5通过HPLC测定计算计算ph 7.5的疏水性指数(Cowan和Whittaker，Peptide Res.，3：75-80[1990])；疏水性(Rose等人)(AA)计算平均级分面积损失(f)[埋入的平均面积/标准态面积](Rose等人，Science 229：834-838[1985])；和疏水性(Roseman)计算疏水性尺度(pi-r)(Roseman，J.Mol.Biol.，200：513-522[1988])。

在具有相同的蛋白质折叠模式的蛋白酶和其变体之间或者在不同的蛋白质折叠模式之间比较的其他物理特性，包括但不限于，可溶性相关的物理特性、大小相关的物理特性和蛋白质解链温度。比较了不同蛋白质折叠模式之间在前述电荷和疏水性尺度二方面的可溶性相关物理特性。总而言之，任一表征蛋白质-蛋白质对蛋白质-溶剂相互作用的热力学或动力学值都适合于用于本发明的方法。例如，可以使用反映背离理想混合性质的第二维里系数(参见，Wilson，Acta Crystallographica，D50：361-365[1994])、chi参数、渗透压和活性或者逸度系数(参见例如，Reid等人，“The Properties of Gases and Liquids”，第4版，McGraw-Hill，[1987])。使用适合于测定蛋白质或多聚体维度的任一实验方法比较不同蛋白质折叠模式之间与大小相关的物理特性。使用蛋白质或多聚体构象(卷曲的、球状的、分支的)、它们的分子量和流体动力学半径或者回转半径之间的常用相关性，从分子量推断大小。用于大小或分子量测定的合适技术包括但不限于静态光散射和动态光散射、凝胶电泳、质谱和层析。备选地，大小可以容易地从实验测定的蛋白质晶体结构或者结构的同源模型的信息中估计。

蛋白质解链温度(T_m)一般通过监测温度范围内的物理指征特性测定。合适的方法包括但不限于，差示扫描量热法、圆二色性、动态光散射和紫外可见光谱。

丝氨酸蛋白酶类的应用

考虑将构建的以产生蛋白酶变体的可组合突变用于增强在多种应用中的至少一种需要的酶特性的性能指数，例如确定性能最佳值。性能/特性最佳值的确定主要受到所使用的介质(例如，洗涤剂的配方、pH、离子强度，等)，以及目的酶的氨基酸残基的净电荷和电荷分布影响。因此，考虑存在针对变化的pH、离子强度、表面活性剂类型和比率、助洗剂和螯合剂的不同制剂的最佳酶，所有所述因素都影响静电现象。考虑使用酶混合物用于生产适合于多种条件(例如，在具有不同的水硬度的不同地区或场所中出售的洗涤剂制剂中的蛋白酶)的制剂，其中该混合物的每一成员拥有不同的电荷最佳值。也考虑了用于生产适合于清洁多种污迹的制剂的酶混合物的用途，其中该混合物的每一成员擅长于清洁不同的污迹。此外，考虑了在酶反应期间，酶底物自身经历电荷改变的情况下酶混合物的用途，其中该混合物的每一成员拥有不同的电荷最佳值。

尽管在本文中以蛋白酶和血渍、乳渍和墨渍的关系的方式进行描述，但是应当考虑，本发明的蛋白酶变体对于在由应用例如清洁应用指定的任意多种反应介质(即条件)中的任一酶-底物相互作用是最优的。

如本文中更详细的描述，本发明的变体蛋白酶具有重要的特性，使得它们非常适合于某些应用。例如，在一些优选的实施方案中，本发明的变体蛋白酶与一些目前使用的蛋白酶比较，具有改变的电荷和/或疏水性。因此，这些蛋白酶特别地用于清洁组合物中。事实上，在某些洗涤条件下，与目前使用的枯草杆菌蛋白酶比较，本发明的蛋白酶显示出相当的或增强的表达和/或去污活性。因此，应当考虑将本发明的清洁和/或酶组合物提供在多种清洁组合物中。因此，本发明蛋白酶可以用于多种清洁组合物，以及动物饲料应用、皮革加工(例如，软化)、蛋白质水解和纺织品用途。该鉴定的蛋白酶也可以用于个人护理应用。

事实上，本发明的蛋白酶变体可以用于许多工业应用，特别是用于清洁、消毒、动物喂饲和纺织/皮革工业。在一些实施方案中，本发明的蛋白酶与洗涤剂、助洗剂、漂白剂和其他常规成分组合以产生多种在衣物和其他清洁领域中使用的新清洁组合物，例如，如衣物洗涤剂(粉末衣物洗涤剂和液体衣物洗涤剂二者)、衣物预洗剂、完全织物漂白剂、自动餐具清洗洗涤剂(液体自动餐具清洗洗涤剂和粉末自动餐具清洗洗涤剂二者)、家庭清洗剂、特别是棒和液体皂应用和drain openers。此外，通过将该材料与清洁组合物的水溶液接触，变体蛋白酶可以用于隐型眼镜以及其他物品的清洁。此外，这些变体蛋白酶可以用于例如肽水解、废物处理、纺织品应用、医疗器材清洁、生物膜去除，并可以用作为蛋白质生产中的融合-剪切酶等。这些产品的组合物对于本发明并不是关键的，只要变体蛋白酶在所使用的环境中一直维持其功能。在一些实施方案中，该组合物可以通过将清洁有效量的蛋白酶变体或者包含变体蛋白酶制备物的酶组合物与该组合物的常规成分以其领域公认的量组合来容易地制备。

清洁组合物

除非另外指出，本文中提供的所有组分或组合物水平通过参考组分或组合物的活性水平而提供，并不包括杂质，例如，残留溶剂或副产物，其可能存在于市售的来源中。酶组分的重量基于总活性蛋白质。除非另外指出，所有百分比和比率都通过重量计算。除非另外指出，所有百分比和比率都基于全部组合物计算。在示例性洗涤剂组合物中，酶水平按总组合物的重量计的纯酶表述，并且除非特别说明，洗涤剂成分按总组合物的重量计的方式来表述。

如本文所示，在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含辅助材料，包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶类、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、污物释放聚合物、染料传递剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填充盐、水溶增溶剂、光漂剂、荧光增白剂、织物调节剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、增光剂、silvercare、防晦暗剂和/或放腐蚀剂、碱度来源、增溶剂、载体、加工助剂、色素和pH控制剂(参见例如，美国专利号6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所述全部专利在此处引用作为参考)。具体清洁组合物的实施方案在以下详细说明。在清洁组合物中清洁辅助材料与本发明的变体蛋白酶不兼容的实施方案中，那么使用保持清洁辅助材料与蛋白酶分离(即相互并不接触)直到需要两种组分组合时的合适方法。该分离方法包括本领域已知的任一合适的方法(例如，软胶囊、胶囊、片剂、物理分离，等)。

本发明的清洁组合物可以有利地用于例如衣物应用、硬表面清洁、餐具清洗应用，以及美容应用例如假牙、牙齿、头发和皮肤。此外，由于在较低温度溶液中具有增加的有效性的独特优点，本发明的酶特别适合于衣物应用。而且，本发明的酶可以用于颗粒和液体组合物。

本发明的变体蛋白酶也可以用于清洁添加剂产品。在一些实施方案中，用于低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，当需要其他的漂白效果时，本发明提供了特别适合于掺入到洗涤过程中的包含本发明的至少一种酶的清洁添加产品。此类例子包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，该添加剂产品是其最简单的形式，一种或多种蛋白酶。在一些实施方案中，该添加剂是以剂量形式包装的，用于添加到清洁过程中。在一些实施方案中，添加剂是以剂量形式包装的，用于添加到清洁过程中，其中使用了过氧化(peroxygen)源并且期望得到增加的漂白效果。本发明使用的任一合适的单一剂量单位形式包括但不限于，丸剂、片剂、软胶囊，或者其他单一剂量单位例如预量过的粉末或液体。在一些实施方案中，包含填充物或载体材料以增加此类组合物的体积。合适的填充物或载体材料包括但不限于，多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐以及滑石、粘土等。用于液体组合物的合适填充物或载体材料包括但不限于，水或低分子量一级醇和二级醇包括多元醇和二元醇。此类醇的示例包括但不限于，甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案中，该组合物含有约5％至约90％的此类物质。酸性填充物用于降低pH。备选地，在一些实施方案中，该清洁添加剂包括如下更充分描述的辅助成分。

本清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的本文中所提供的至少一种蛋白酶变体，其可以是单独的或者与其他蛋白酶和/或其他酶的组合。所需酶的水平通过添加一种或多种本发明的蛋白酶变体来达到。一般地，本清洁组合物包括至少约0.0001重量百分比，约0.0001至约10，约0.001至约1或者甚至约0.01至约0.1重量百分比的本发明的至少一种变体蛋白酶。

本文中的清洁组合物一般如下配制以在用于含水清洁操作期间使用时，洗涤用水具有约5.0至约11.5或者甚至约7.5至约10.5的pH。一般制备具有约3.0至约9.0或者甚至约3至约5的净pH的液体产品制剂。一般制备具有约9至约11的pH的颗粒洗衣产品。控制pH在推荐的使用水平的技术包括缓冲液、碱、酸等的使用，并且是本领域技术人员熟知的。

合适的低pH清洁组合物一般具有约3至约5的净pH，并且一般不含在该pH环境中水解的表面活性剂。此类表面活性剂包括烷基硫酸钠，其包含至少一个环氧乙烷部分或者甚至约1至约16摩尔的环氧乙烷。此类清洁组合物一般包含足够量的pH调节物，例如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，以为此类清洁组合物提供约3至约5的净pH。此类组合物一般包含至少一种酸稳定酶。在一些实施方案中，该组合物是液体，而在其他实施方案中，它们是固体。此类液体组合物的pH一般测量为净pH。将此类固体组合物的pH测量为所述组合物的10％固体溶液，其中该溶剂是蒸馏水。在这些实施方案中，除非另外指出，所有pH测量都在20℃进行。

在一些实施方案中，当将变体酶用于颗粒组合物或液体中时，期望的是变体蛋白酶是封装的颗粒形式，以在储存期间保护变体蛋白酶免于受颗粒组合物中其他组分的影响。此外，包封也是在清洁过程中控制变体蛋白酶的有效性的方法。在一些实施方案中，包封增强了变体蛋白酶和/或其他酶的性能。就此而言，将本发明的变体蛋白酶用本领域已知的任一合适包封材料封装。在一些实施方案中，该包封材料一般封装了有关本发明的变体蛋白酶的催化剂的至少一部分。一般地，该包封材料是水溶的和/或水分散的。在一些实施方案中，该包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。玻璃化转变温度在WO 97/11151中进行了更详细的描述。该包封材料一般选自碳水化合物、天然或合成树胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡和它们的混合物。当包封物质是碳水化合物时，其通常选自单糖、寡糖、多糖和它们的组合物。在一些一般的实施方案中，该封装材料是淀粉(参见例如，EP 0922499；US 4,977,252；US 5,354,559和US 5,935,826)。在一些实施方案中，包封材料是用塑料制备的微球体，例如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈和它们的混合物；可用的市售微球体包括但不限于那些由

(Stockviksverken，瑞士)和PM 6545、PM6550、PM 7220、PM 7228、

和

(PQ Corp.，Valley Forge，PA)提供的微球体。

如本文中所述，本发明的变体蛋白酶可以特别地用于清洁工业，包括但不限于衣物和餐具洗涤剂。这些应用将酶置于多种环境压力下。本发明的变体蛋白酶提供了优于许多目前使用的酶的优点，归因于其在多种条件下的稳定性。

事实上，参与洗涤的蛋白酶暴露于多种洗涤条件，包括不同的洗涤剂制剂、洗涤用水体积、洗涤用水温度和洗涤时间长短。此外，在不同地区使用的洗涤剂制剂，其相对组分在洗涤用水中存在的浓度是不同的。例如，欧洲洗涤剂在洗涤用水中一般具有约4500-5000ppm的洗涤剂组分，而日本洗涤剂在洗涤用水中一般具有大约667ppm的洗涤剂组分。在北美，特别是美国，洗涤剂在洗涤用水中一般具有约975ppm的洗涤剂组分。

低洗涤剂浓度系统包括在洗涤用水中存在小于约800ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。一般认为日本洗涤剂为低洗涤剂浓度系统，因为它们在洗涤用水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。

中等洗涤剂浓度包括在洗涤用水中存在约800ppm至约2000ppm之间的洗涤剂组分的洗涤剂。一般认为北美洗涤剂为中等洗涤剂浓度系统，因为它们在洗涤用水中具有大约975ppm的洗涤剂组分。巴西洗涤剂在洗涤用水中存在的洗涤剂组分一般为大约1500ppm。

高洗涤剂浓度系统包括在洗涤用水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。一般认为欧洲洗涤剂为高洗涤剂浓度系统，因为它们在洗涤用水中具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。

拉美洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂，并且由于它们在洗涤用水中具有1500ppm至6000ppm的洗涤剂组分，因此在拉美使用的洗涤剂可以属于中等和高洗涤剂浓度二者的范围。如上提及，巴西洗涤剂在洗涤用水中存在的洗涤剂组分一般为大约1500ppm。然而，并不仅限于拉美国家，其他高泡磷酸盐助洗洗涤剂地区也具有存在于洗涤用水中的高达约6000ppm洗涤剂组分的高洗涤剂浓度系统。

根据前述，在全世界，洗涤剂组合物在一般洗涤溶液中的浓度变化如下：从小于约800ppm的洗涤剂组合物(“低洗涤剂浓度地区”)，例如在日本约667ppm，到约800ppm至约2000ppm之间(“中间洗涤剂浓度地区”)，例如在美国约975ppm和在巴西约1500ppm，到高于约2000ppm(“高洗涤剂浓度地区”)，例如在欧洲约4500ppm至约5000ppm和在高泡磷助洗剂地区约6000ppm。

经验地确定一般的洗涤溶液的浓度。例如，在美国，一般的洗衣机容纳约64.4L的洗涤溶液。因此，为了在洗涤溶液中获得约975ppm的洗涤剂浓度，必须加入约62.79g的洗涤剂组合物到64.4L洗涤溶液中。该量是通过消费者使用洗涤剂提供的测量杯测量加入到洗涤用水中的一般量。

作为另外的例子，不同的地区使用不同的洗涤温度。在日本，洗涤用水的温度一般低于在欧洲使用的温度。例如，在北美和日本，洗涤用水的温度一般为约10℃至约30℃(例如，约20℃)，而在欧洲，洗涤用水的温度一般为约30℃至约60℃(例如，约40℃)。然而，为了节约能源，许多消费者改为用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域，一般将冷水用于洗衣，以及餐具洗涤应用。在一些实施方案中，本发明的“冷水洗涤”指在约10℃至约40℃、或者约10℃至约30℃、或者约15℃至约25℃，以及在约10℃至约40℃的范围内的所有其他组合温度时进行的洗涤。作为另外的例子，不同地区一般具有不同的水硬度。水硬度通常描述为每加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺的格令量。硬度是在水中测量的钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)的量。在美国，大多数水是硬的，但是硬度的程度不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有百万分之60至181(百万分率转变成美国每加仑格令是ppm#除以17.1等于每加仑格令)的硬矿物质。

水	每加仑的格令	百万分率
			软	少于1.0	小于17
微硬	1.0至3.5	17至60
			中等硬	3.5至7.0	60至120
硬	7.0至10.5	120至180
			非常硬	高于10.5	大于180

欧洲水硬度一般高于每加仑约10.5(例如约10.5至约20.0)格令的混合的Ca²⁺/Mg^{2 +}(例如，每加仑约15格令的混合的Ca²⁺/Mg²⁺)。北美水硬度一般高于日本水硬度，但是低于欧洲水硬度。例如，北美水硬度可以在约3格令至约10格令之间、约3格令至约8格令之间或者约6格令。日本水硬度一般低于北美水硬度，通常低于约4格令，例如每加仑约3格令的混合的Ca²⁺/Mg²⁺。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了在至少一组洗涤条件(例如，水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)下显示出令人惊奇的洗涤性能的变体蛋白酶。在一些实施方案中，本发明的变体蛋白酶与其他枯草杆菌蛋白酶在洗涤性能方面是相当的。在一些实施方案中，与目前市售的枯草杆菌蛋白酶比较，本发明的变体蛋白酶显示出增强的洗涤性能。因此，在本发明的一些优选的实施方案中，本文中提供的变体蛋白酶显示出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、在多种条件下增强的清洁能力和/或增强的螯合稳定性。此外，本发明的变体蛋白酶可以单独或者与助洗剂和稳定剂组合地用于并不含有洗涤剂的清洁组合物中。

在本发明的一些实施方案中，清洁组合物包含按组合物的重量计约0.00001％至约10％水平的本发明的至少一种变体蛋白酶和按组合物的重量计含清洁辅助材料的剩余部分(例如，约99.999％至约90.0％)。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物包含按组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至2％、约0.005％至约0.5％水平的至少一种变体蛋白酶和含清洁辅助材料的清洁组合物的剩余部分(例如，按重量计约99.9999％至约90.0％、约99.999％至约98％、约99.995％至约99.5％)。

在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种其他洗涤剂酶，其提供了清洁性能和/或织物护理和/或餐具清洗益处。合适的酶的示例包括但不限于，半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在一些实施方案中，所用的酶组合物(即，“混合物”)包含常规使用的酶如蛋白酶、酯肪酶、角质酶和/或纤维素酶连同使用的淀粉酶。

除本文中提供的蛋白酶变体外，在本发明的组合物中可以使用任一其他合适的蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。在一些特别优选的实施方案中，使用微生物蛋白酶。在一些实施方案中，包括化学或遗传修饰的变体。在一些实施方案中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选地碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子包括枯草杆菌蛋白酶，特别是衍生自芽孢杆菌属(Bacillus)的那些枯草杆菌蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶、缓慢芽孢杆菌的蛋白酶,解淀粉芽孢杆菌的蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶Carlsberg,枯草杆菌蛋白酶309,枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。其他例子包括在美国专利RE34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628中描述的变体蛋白酶，所述全部专利在此处引用作为参考。其他蛋白酶例子包括但不限于，胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的胰蛋白酶)和在WO 89/06270所述的镰孢属(Fusarium)蛋白酶。在一些实施方案中，在本发明中使用的市售蛋白酶包括但不限于，

MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、

EXCELLASE^TM、PURAFAST^TM和

OXP(Genencor)；

DURAZYM^TM、

和

(Novozymes)；和BLAP^TM(HenkelKommanditgesellschaft auf Aktien，Duesseldorf，德国)。多种蛋白酶描述于WO95/23221、WO 92/21760、U.S.专利申请公开文本No.2008/0090747和美国专利5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、US RE 34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628，以及多种其他专利中。在一些实施方案中，在本发明中使用的金属蛋白酶包括但不限于，描述于WO 07/044993中的中性金属蛋白酶。

此外，本发明中可以使用任一合适的脂肪酶。合适的脂肪酶包括但不限于细菌和真菌来源的那些脂肪酶。本发明包括化学或遗传修饰的突变体。有用的脂肪酶的示例包括柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶(参见例如，EP 258 068和EP 305 216)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如，EP 238 023)、假丝酵母(Candida)脂肪酶，例如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如，南极假丝酵母脂肪酶A或南极假丝酵母脂肪酶B；参见例如，EP 214 761)、假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶例如P.alcaligenes脂肪酶和P.pseudoalcaligenes脂肪酶(参见例如，EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如，EP 331 376)、P.stutzeri脂肪酶(参见例如，GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶[Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta 1131：253-260[1993]]；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶[参见例如，JP64/744992]；和B.pumilus脂肪酶[参见例如，WO 91/16422])。

此外，在本发明的一些实施方案中可以使用许多克隆的脂肪酶，包括但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见，Yamaguchi等人，Gene 103：61-67[1991])、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见，Schimada等人，J.Biochem.，106：383-388[1989])和多种根霉属(Rhizopus)脂肪酶例如代氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见，Hass等人，Gene 109：117-113[1991])、R.niveus脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.56：716-719[1992])和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。

在本发明的一些实施方案中也可以使用其他类型的脂解酶例如角质酶，包括但不限于，来源于门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见，WO 88/09367)，和来源于豌豆腐皮镰孢(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见，WO 90/09446)。

另外的合适脂肪酶包括市售的脂肪酶例如M1LIPASE^TM、LUMA FAST^TM和LIPOMAX^TM(Genencor)；

和

ULTRA(Novozymes)；和LIPASE P^TM“Amano”(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，日本)。

在本发明的一些实施方案中，清洁组合物进一步包含按组合物的重量计约0.00001％至约10％的其他脂肪酶水平的脂肪酶和按组合物的重量计的清洁辅助材料的剩余部分。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物也包含按组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至2％、约0.005％至约0.5％的脂肪酶水平的脂肪酶。

在本发明的一些实施方案中，本发明可以使用任一合适的淀粉酶。在一些实施方案中，也可以使用适合于在碱性溶液中使用的任一淀粉酶(例如，α淀粉酶和/或β淀粉酶)。合适的淀粉酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些淀粉酶。在一些实施方案中包括化学或遗传修饰的突变体。在本发明中使用的淀粉酶包括但不限于，获自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α淀粉酶(参见例如，GB 1,296,839)。在本发明中使用的市售淀粉酶包括但不限于，

和BAN^TM(Novozymes)，以及POWERASE^TM、

和

P(Genencor)。

在本发明的一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计约0.00001％至约10％的其他淀粉酶水平的淀粉酶和按组合物的重量计的清洁辅助材料的剩余部分。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物也包含按组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至2％、约0.005％至约0.5％的淀粉酶水平的淀粉酶。

在一些另外的实施方案中，本发明的清洁组合物可以使用任一合适的纤维素酶。合适的纤维素酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些纤维素酶。在一些实施方案中包括化学或遗传修饰的突变体。合适的纤维素酶包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶(参加例如，美国专利4,435,307)。特别合适的纤维素酶是具有色彩护理优点的纤维素酶(参见例如，EP 0 495 257)。在本发明中使用的市售的纤维素酶包括但不限于，

(Novozymes)和KAC-500(B)^TM(KaoCorporation)。在一些实施方案中，掺入的纤维素酶为成熟野生型或变体纤维素酶的一部分或者片段，其中氨基端的一部分缺失(参见例如，美国专利5,874,276)。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计约0.00001％至约10％水平的其他纤维素酶的纤维素酶和按组合物的重量计的清洁辅助材料的剩余部分。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物也包含按组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的纤维素水平的纤维素酶。

适合于在洗涤剂组合物中使用的任一甘露聚糖酶也可以用于本发明中。合适的甘露聚糖酶包括但不限于细菌和真菌来源的那些甘露聚糖酶。在一些实施方案中包括化学或遗传修饰的突变体。在本发明中使用的多种甘露聚糖酶是已知的(参见例如，美国专利6,566,114、美国专利6,602,842和美国专利6,440,991，所述全部专利申请在此处引用作为参考)。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计约0.00001％至约10％的其他甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶和按组合物的重量计的清洁辅助材料的剩余部分。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物也包含按组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至2％、约0.005％至约0.5％的甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶。

在一些实施方案中，在本发明的组合物中使用与过氧化氢或其来源(例如，过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合的过氧化物酶。在一些备选的实施方案中，氧化酶与氧组合使用。两种酶都用于“溶液漂白”(即，当织物在洗涤用水中一起洗涤时，防止织物染料从染色织物向另一织物转移)，优选地与增强剂一起使用(参见例如，WO 94/12621和WO 95/01426)。合适的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于，植物、细菌或真菌来源的那些过氧化物酶/氧化酶。在一些实施方案中包括了化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计约0.00001％至约10％的其他过氧化物酶和/或氧化酶水平的其他过氧化物酶和/或氧化酶和按组合物的重量计的清洁辅助材料的剩余部分。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物也包含按组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至2％、约0.005％至约0.5％的过氧化物酶和/或氧化酶水平的过氧化物酶和/或氧化酶。

在一些实施方案中，可以使用的其他酶包括但不限于过水解酶(perhydrolase)(参见例如，WO 05/056782)。此外，在一些具体优选的实施方案中，包括了本文上述酶的混合物，具体是一种或多种其他蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。事实上，考虑在本发明中使用这些酶的多种混合物。也考虑变体蛋白酶和一种或多种其他酶的不同水平都可以独立地变动至约10％，清洁组合物的剩余部分是清洁辅助材料。通过考虑待清洁的表面、物品或者织物，和在使用期间(例如，在清洗洗涤剂使用期间)用于清洁条件的组合物的期望形式可以容易地具体选择清洁辅助材料。

合适的清洁辅助材料的例子包括但不限于，表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活性剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢的来源、预制的过酸、聚合分散剂、去粘土污渍剂、结构增弹剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、色料、填料盐、水溶增溶剂、光漂剂、荧光增白剂、衣物柔顺剂、织物软化剂、载体、水溶增溶剂、加工助剂、溶剂、色素、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色斑、silvercare、防晦暗剂和/或防腐蚀剂、碱度来源、增溶剂、载体、加工助剂、色素和pH控制剂(参见例如，美国专利6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所述全部专利申请在此处引入作为参考)。以下详细地列举了具体的清洁组合物材料的实施方案。在清洁组合物中清洁辅助材料与本发明的变体蛋白酶不兼容的实施方案中，那么使用保持清洁辅助材料与蛋白酶分离(即相互并不接触)的合适方法，直到需要将两种组分组合时。该分离方法包括本领域已知的任一合适的方法(例如，软胶囊、胶囊、片剂、物理分离等)。

在一些优选的实施方案中，本文中提供的一种或多种变体蛋白酶的有效量包含于用于清洁需要去除蛋白质污迹的多种表面的组合物中。此类清洁组合物包括用于如清洁硬表面、织物和餐具此类应用的清洁组合物。事实上，在一些实施方案中，本发明提供了织物清洁组合物，而在另外的实施方案中，本发明提供了非织物清洁组合物。特别地，本发明也提供了适合于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理(包括dentrifices、牙膏、漱口剂等，以及假牙清洁组合物)、皮肤和头发清洁组合物。本发明意图包括任一形式(即，液体、颗粒、棒、半固体、凝胶、乳剂、片剂、胶囊等)的洗涤组合物。

通过实施例的方式，以下更详细地描述了使用本发明的变体蛋白酶的几种清洁组合物。在一些实施方案中，其中将本发明的清洁组合物配制为适合于在洗衣机洗涤方法中使用的组合物，本发明的组合物优选地含有至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及选自有机聚合化合物、漂白剂、其他酶、抑泡剂、分散剂、石灰皂分散剂、污物悬液和抗再沉淀剂和腐蚀抑制剂的一种或多种清洁辅助材料。在一些实施方案中，洗衣组合物也含有软化剂(即，作为其他的清洁辅助材料)。本发明的组合物也可以用于固体或液体形式的洗涤剂添加产品。此类添加剂产品意图补充和/或增强传统洗涤组合物的性能，并可以在清洁过程的任一阶段添加。在一些实施方案中，在20℃测量的本文中的衣物洗涤组合物的浓度为约400g/升至约1200g/升，而在其他实施方案中，其为约500g/升至约950g/升。

在配制为在人工餐具洗涤方法中使用的组合物的实施方案中，本发明的组合物优选地含有至少一种表面活性剂和优选地至少一种选自有机聚合化合物、增泡剂、第II族金属离子、溶剂、水溶增溶剂和其他酶的其他清洁助剂材料。

在一些实施方案中，多种清洁组合物例如在美国专利6,605,458中提供的那些清洁组合物可以与本发明的变体蛋白酶一起使用。因此，在一些实施方案中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物是紧凑型颗粒织物清洁组合物，而在其他实施方案中，该组合物是在洗涤有色织物中有用的颗粒织物清洁组合物，在另外的实施方案中，该组合物是在洗涤的过程中提供软化的颗粒织物清洁组合物，在其他的实施方案中，该组合物是强效液体织物清洁组合物。在一些实施方案中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物是织物清洁组合物，例如在美国专利6,610,642和6,376,450中描述的那些织物清洁组合物。此外，本发明的变体蛋白酶可以用于在欧洲或日本洗涤条件下颗粒衣物洗涤剂组合物的具体用途中(参见例如，美国专利6,610,642)。

在一些备选的实施方案中，本发明提供了包含本文中提供的至少一种变体蛋白酶的硬表面清洁组合物。因此，在一些实施方案中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物是硬表面清洁组合物，例如描述于美国专利6,610,642、6,376,450和6,376,450中的那些硬表面清洁组合物。

又在另外的实施方案中，本发明提供了包含本文中提供的至少一种变体蛋白酶的餐具洗涤组合物。因此，在一些实施方案中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物是硬表面清洁组合物，例如在美国专利6,610,642和6,376,450中的那些硬表面清洁组合物。仍在一些另外的实施方案中，本发明提供了包含本文中提供的至少一种变体蛋白酶的餐具洗涤组合物。在一些另外的实施方案中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物包含口腔护理组合物，例如那些在美国专利申请6,376,450和6,376,450中的那些口腔护理组合物。包含在前述美国专利6,376,450、6,605,458、6,605,458和6,610,642中的化合物和清洁辅助材料的配方和说明书可与本文中提供的变体蛋白酶一起使用。

本发明的清洁组合物可以配制成任一合适的形式并通过由制造者选择的任一方法制备，所述方法的非限制性示例描述于美国专利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392和5,486,303中，所述全部专利在此处引入作为参考。当需要低pH清洁组合物时，通过添加材料例如单乙醇胺或者酸性物质例如HCl调节此类组合物的pH。

虽然实质上并非是本发明的目的，但是在下文中说明的辅助物的非限制性列表适合于在速溶清洁组合物中使用。在一些实施方案中，将这些辅助物掺入，例如以辅助或者增强清洁性能、用于处理待清洁的底物或者以修饰清洁组合物的美学感官(如在使用香料、染料、色料等的情况时)。应当理解，此类辅助物是在除本发明的变体蛋白酶之外而添加的。这些添加组分的精确性质和其掺入的水平取决于组合物的物理形式和将使用其的清洁操作的性质。合适的辅助物材料包括但不限于，表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、其他的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活性剂、漂白加强剂、过氧化氢、过氧化氢的来源、预制的过酸、聚合的分散剂、去粘土污渍/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构增弹剂、织物软化剂、载体、水溶增溶剂、加工助剂和/或色素。除以下的公开外，此类其他辅助物的合适示例和使用的水平见于引用作为参考的美国专利申请5,576,282、6,306,812和6,326,348。上述的辅助成分可以构成本发明的清洁组合物的余量。

在一些实施方案中，根据本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中该表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂和它们的混合物。在一些低pH清洁组合物实施方案中(例如，具有约3至约5的净pH的组合物)，该组合物一般并不含有烷基乙氧基化硫酸盐，因为认为此类表面活性剂可能被该组合物的酸性物质水解。在一些实施方案中，该表面活性剂按清洁组合物的重量计为约0.1％至约60％的水平存在，而在备选的实施方案中，该水平为约1％至约50％，而仍在另外的实施方案中，该水平为约5％至约40％。

在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统。在一些掺入至少一种助洗剂的实施方案中，清洁组合物包含按清洁组合物的重量计的至少约1％、约3％至约60％或者甚至约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于，多磷酸盐的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐、碱金属硅酸盐、碱土金属碳酸盐和碱金属碳酸盐、铝硅酸盐、聚羧酸酯化合物、羟基聚羧酸酯醚、马来酸酐与乙烯或者乙烯甲基醚的共聚物、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸和羧基甲氧基琥珀酸(carboxymethyloxysuccinic acid)、聚乙酸的多种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐例如乙二胺四乙酸和氨三乙酸，以及聚羧酸盐例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧联琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸和它们的可溶性盐。事实上，考虑在本发明的多种实施方案中使用任一合适的助洗剂。

在一些实施方案中，助洗剂形成水溶性硬度离子复合物(hardness ion complex)(例如，多价螯合的助洗剂)，例如柠檬酸盐和聚磷酸盐(例如，三聚磷酸钠和三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾以及混合的三聚磷酸钠和三聚磷酸钾等)。考虑在本发明中使用任一合适的助洗剂，包括本领域已知的那些助洗剂(参见例如，EP 2 100 949)。

在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含至少一种螯合剂。合适的螯合剂包括但不限于，铜、铁和/或锰螯合剂和它们的混合物。在使用至少一种螯合剂的实施方案中，本发明的清洁组合物包含占受试清洁组合物的重量计的约0.1至约15％或者甚至约3.0％至约10％的螯合剂。

仍在一些实施方案中，本文中提供的清洁组合物包含至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于，聚乙二醇、聚丙二醇、多羧酸酯、去污聚合物例如polytelephthalic acid，粘土例如高岭石、蒙脱土、凹凸棒石黏土(atapulgite)、伊利石、膨润土、埃洛石石和它们的混合物。

如在本文中所指，在一些实施方案中，在本发明的一些实施方案中可以使用抗再沉积剂。在一些优选的实施方案中，可以使用非离子表面活性剂。例如，在自动餐具洗涤实施方案中，非离子表面活性剂可以用于表面修饰目的，特别是对于表面(sheeting)，以避免薄膜形成和起斑并改善光泽。这些非离子表面活性剂也可以用于预防污渍的再沉积。在一些优选的实施方案中，抗再沉积剂是本领域已知的非离子表面活性剂(参见例如，EP2100949)。

在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合型染料转移抑制剂包括但不限于，聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮(polyvinyloxazolidone)和聚乙烯咪唑或者它们的混合物。在使用了至少一种染料转移抑制剂的实施方案中，本发明的清洁组合物包含按清洁组合物重量计约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或者甚至约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物内包含硅酸盐。在一些此类实施方案中，可以使用硅酸钠(例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和晶体层状硅酸盐)。在一些实施方案中，硅酸盐以约1％至约20％的水平存在。在一些优选的实施方案中，硅酸盐按组合物的重量计以约5％至约15％的水平存在。

仍在一些其他实施方案中，本发明的清洁组合物也含有分散剂。合适的水溶性有机材料包括但不限于，同或共聚合物酸或者它们的盐，其中多聚羧酸包含至少两个羧基，通过不多于2个的碳原子将所述羧基彼此分离。

在一些另外的实施方案中，在清洁组合物中使用的酶通过任何合适的技术稳定。在一些实施方案中，本文中使用的酶通过最终组合物中存在的钙和/镁离子的水溶性来源而稳定，所述最终组合物提供此类离子给酶。在一些实施方案中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐包括碱土金属盐，例如钙盐。本发明中可以使用多种用于酶稳定的技术。例如，在一些实施方案中，本文中使用的酶通过在最终组合物中存在锌(II)、钙(II)和/镁(II)离子的水溶性来源，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧化钒(oxovanadium(IV))而得到稳定，所述最终组合物提供此类离子给酶。在本发明的一些实施方案中也可以使用氯化物和硫酸盐。合适的寡糖和多糖(例如，糊精)的示例是本领域已知的(参见例如，WO 07/145964)。在一些实施方案中，也可以使用可逆的蛋白酶抑制剂，例如含硼的化合物(例如，硼酸盐、4-甲酰苯基硼酸)和/或如所希望地，使用三肽醛进一步改善稳定性。

在一些实施方案中，本发明的组合物中存在漂白剂、漂白活性剂和/或漂白催化剂。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含无机和/有机漂白化合物。无机漂白剂包括但不限于，过氧化氢合物盐(例如，过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施方案中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施方案中，包含没有其他保护的结晶性固体的无机过氧化氢合物盐，而在一些其他实施方案中，该盐是包被的。可以在本发明中使用本领域已知的任何合适盐(参见例如，EP 2100 949)。

在一些实施方案中，将漂白活性剂用于本发明的组合物中。漂白活性剂一般是在60℃或更低温度的清洁期间增强漂白作用的有机过酸前体。适合于在本文中使用的漂白活性剂包括在过水解(perhydrolysis)条件下提供脂肪族过氧化羧酸(aliphaicperoxoycarboxylic acid)和/或任选地经取代的过苯甲酸的化合物，其中脂肪族过氧化羧酸具有优选的约1个至约10个碳原子、特别是约2个至约4个碳原子。其他漂白活性剂是本领域已知的并可以适用于本发明中(参见例如，EP 2 100 949)。

此外，在一些实施方案中和如本文中进一步所述，本发明的清洁组合物进一步包含至少一种漂白催化剂。在一些实施方案中，可以使用三氮杂环壬烷锰和相关的络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。在本发明中可以使用其他漂白催化剂(参加例如，美国4,246,612、5,227,084、4,810410、WO 99/06521和EP 2 100 949)。

在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有一种或多种催化金属复合物。在一些实施方案中，可以使用含金属的漂白催化剂。在一些优选的实施方案中，使用包含催化系统的金属漂白催化剂，所述催化系统包含确定了漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有极少或者没有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如，锌或铝阳离子)和具有针对催化性和辅助性金属阳离子的定义了稳定常数的螯合剂(sequestrate)，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四甲叉膦酸(亚甲基膦酸)和它们的水溶性盐(参见例如，美国专利申请4,430,243)。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物通过锰化合物催化。使用的此类化合物及其水平是本领域熟知的(参见例如，美国专利申请5,576,282)。在其他的实施方案中，可以在本发明的清洁组合物中使用钴漂白催化剂。多种钴漂白催化剂是本领域已知的(参加例如，美国专利申请5,597,936和5,595,967)并可以通过已知的方法容易地制备。

在其他的实施方案中，本发明的清洁组合物包含巨多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为实施的方式，并不以限制的方式，在一些实施方案中，调节由本发明提供的组合物和清洁方法以在含水洗涤介质中提供至少亿万分之一级别的活性MRL种类，并且在一些优选的实施方案中，在溶液中提供约0.005ppm至约25ppm，更优选地约0.05ppm至约10ppm，和最优选地约0.1ppm至约5ppm的MRL。

在速溶过渡金属漂白催化剂中优选的过渡金属包括但不限于，锰、铁和铬。优选的MRL也包括但不限于，交联的特异超刚性配体(例如，5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]正十六烷)。可以通过已知的方法(参见例如，WO 2000/32601和美国专利申请6,225,464)容易地制备合适的过渡金属MRL。

在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂用于预防和/或降低金属，包括铝、不锈钢和非铁类金属(例如，银和铜)的锈蚀、腐蚀和/或氧化。合适的金属护理剂包括描述于EP 2 100 949、WO 9426860和WO 94/26859中的那些金属护理剂。在一些实施方案中，金属护理剂是锌盐。在一些另外的实施方案中，本发明的清洁组合物包含按重量计约0.1％至约5％的一种或多种金属护理剂。

如上所指出，本发明的清洁组合物可以配制成任一合适的形式，并可以通过由配制者选择的任一方法制备，所述方法的非限制性示例描述于美国专利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,516,448、5,489,392、和5,486,303，所述全部专利申请在此处引入作为参考。在其中需要低pH清洁组合物的一些实施方案中，可以通过添加酸性物质例如HCl调节此种组合物的pH。

本文中公开的清洁组合物可以用于清洁物品(situs)(例如，表面、餐具或织物)。一般而言，该物品的至少一部分与以纯品形式或者稀释于洗涤用水中的本发明清洁组合物的实施方案接触，并然后任选地洗涤和/或漂洗该物品。对于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于，擦洗和机械搅拌。在一些实施方案中，该清洁组合物在溶液中一般以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶液是水时，水温一般为约5℃至约90℃的范围，并当物品包含织物时，水与织物质量比率一般为约1:1至约30:1。

实验

提供以下实施例以说明并进一步阐明本发明的某些优选的实施方案和方面，并不应解释为限制其范围。

在以下公开的实验中，使用以下缩写：

℃(摄氏度)；rpm(转/分钟)；H₂O(水)；HCl(盐酸)；aa和AA(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm和um(微米)；M(体积摩尔浓度的)；mM(毫摩尔)；μM和uM(微摩尔)；U(单位)；V(电压)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；hr(小时)；MgCl₂(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；OD₂₈₀(280nm处光密度)；OD₄₀₅(405nm处光密度)；OD₆₀₀(600nm处光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸盐缓冲盐水[150mM NaCl、10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；LAS(十二烷基磺酸钠)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)胺基甲烷)；TAED(N,N,N’N’-四乙酰乙二胺)；BES(聚酯砜(polyesstersulfone))；MES(2-吗啉代乙磺酸,一水合物；f.w.195.24；Sigma#M-3671)；CaCl2(氯化钙,无水的；f.w.110.99；Sigma#C-4901)；SRI(去污指数),BMI(血乳墨)和BMI PI(血乳墨性能指数),TCA(三氯乙酸)和TCA PI(三氯乙酸性能指数)。

此外，材料获自以下的一些机构：TIGR(The Institute for Genomic Research，Rockville，MD)；AATCC(American Association of Textile and Coloring Chemists)；Amersham(Amersham Life Science，Inc.Arlington Heights，IL)；Corning(CorningInternational，Corning，NY)；ICN(ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA)；Pierce(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)；Equest(Equest，Warwick International Group，Inc.，Flintshire，UK)；EMPA(Eidgenossische Material Prufungs und VersuchAnstalt，St.Gallen，Switzerland)；CFT(Center for Test Materials，Vlaardingen，TheNetherlands)；Amicon(Amicon，Inc.，Beverly，MA)；ATCC(American Type CultureCollection，Manassas，VA)；Becton Dickinson(Becton Dickinson Labware，LincolnPark，NJ)；Perkin-Elmer(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)；Rainin(Rainin Instrument，LLC，Woburn，MA)；Eppendorf(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)；Waters(Waters，Inc.，Milford，MA)；Geneart(Geneart GmbH，Regensburg，Germany)；Perseptive Biosystems(Perseptive Biosystems，Ramsey，MN)；Molecular Probes(Molecular Probes，Eugene，OR)；BioRad(BioRad，Richmond，CA)；Clontech(CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)；Cargill(Cargill，Inc.，Minneapolis，MN)；Difco(Difco Laboratories，Detroit，MI)；GIBCO BRL或Gibco BRL(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；New Brunswick(New Brunswick Scientific Company，Inc.，Edison，NJ)；Thermoelectron(Thermoelectron Corp.，Waltham，MA)；BMG(BMG Labtech，GmbH，Offenburg，Germany)；Greiner(Greiner Bio-One，Kremsmuenster，Austria)；Novagen(Novagen，Inc.，Madison，WI)；Novex(Novex，San Diego，CA)；Finnzymes(Finnzymes OY，Finland)Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；Invitrogen(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)；Sigma(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)；DuPont Instruments(Asheville，NY)；Global MedicalInstrumentation或GMI(Global Medical Instrumentation；Ramsey，MN)；MJ Research(MJResearch，Waltham，MA)；Infors(Infors AG，Bottmingen，Switzerland)；Stratagene(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)；Roche(Hoffmann La Roche，Inc.，Nutley，NJ)；Agilent(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)；Merck(Merck&Co.，Rahway，NJ)；IonBeam Analysis Laboratory(Ion Bean Analysis Laboratory，The University ofSurrey Ion Beam Centre(Guildford，UK)；TOM(Terg-o-Meter)；BMI(血渍、乳渍、墨渍)；BaChem(BaChem AG，Bubendorf，Switzerland)；Molecular Devices(Molecular Devices，Inc.，Sunnyvale，CA)；Corning(Corning International，Corning，NY)；MicroCal(Microcal，Inc.，Northhampton，MA)；Chemical Computing(Chemical Computing Corp.，Montreal，Canada)；NCBI(National Center for Biotechnology Information)；Beckman(Beckman-Coulter，Fullerton，CA)；SeitzSchenk(SeitzSchenk Filtersystems GmbH，BadKreuznach，Germany)；Pall(Pall Corp.，East Hills，NY)；Malvern Instruments(MalvernInstruments，Inc.，Worcestershire，UK)，DNA 2.0(Menlo Park，CA)，Molecular Devices(Sunnyvale，CA)，Costar(Cambridge，MA).

实施例1

测定法

在以下的实施例中，为了便于阅读，如下所述地使用多种测定法。标出了以下提供的方法的任一差别。

A.在96空微滴定板中用于蛋白质含量测定的TCA测定法

对于FNA(例如，亲本蛋白酶)和其突变体，使用来自在33℃、230转/分钟摇荡并加湿通风生长于微滴定板3-4天的过滤培养上清开始该测定。将新的96孔平底微滴定板(MTP)用于测定。首先，在每孔中放入100μL/孔的0.25N HCl。然后加入50μL的过滤培养液。然后在405nm处(在平板读取器中使用5秒混合模式)测定光散射/吸收，以提供“空白”读数。对于该测试，将100μL/孔的15％(w/v)三氯乙酸(TCA)放入板中，并室温温育5至30分钟。然后在405nm处(在平板读取器中使用5秒混合模式)测定光散射/吸收。

对于GG36(例如，亲本蛋白酶)和其突变体，使用来自在37℃、300转/分钟摇荡并加湿通风生长于微滴定板约3天的过滤培养上清进行该测定。在该测定中，将100μL的0.25MHCl溶液加入到96孔平底微滴定板的每一孔中。随后，向每孔加入25μL等分的过滤培养上清(含蛋白酶)。然后在405nm处(在平板读取器中使用5秒混合模式)测定光散射/吸收，以提供“空白”读数。在该测量后，将100μL/孔的30％(w/v)TCA溶液加入每孔，并将微滴定板室温温育5至15分钟。最后，在405nm处(在平板读取器中使用5秒混合模式)测定最终的光散射/吸收。

使用的设备是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)和SpectraMAX(340型；Molecular Devices)MTP Reader；MTP来自Costar(9017型)。使用的设备是Biomek FXRobot(Beckman Coulter)和SpectraMAX 340型(Molecular Devices)MTP Reader；和MTP是9017型(Costar)。

通过从含TCA的测试读数中减去空白(无TCA)进行计算以提供样品中蛋白质含量的相对测量。如需要，可以通过用具有已知转变因子的克隆的AAPF测定校正TCA读数来产生标准曲线。然而，就蛋白酶浓度为每毫升50至500微克(ppm)的蛋白质而言，TCA结果是线性的，并因此为了选择良好性能的变体，可以直接针对酶性能作图。在样品中浑浊度/光散射的增加与培养上清中可沉淀蛋白质的总量相关。

B.清洁性能测定

在市售的

2X Cold洗涤剂中、在微滴定板(MTP)规模上测定提到的丝氨酸蛋白酶和其变体在微块布样上的去污性能。将确定缺少蛋白酶活性的热灭活

2X Cold(成品洗涤剂)用于该测定。将热灭活的购买的洗涤剂用于破坏任一蛋白质组分的酶活性，但保留非酶组分的特性。因此，该方法适合于制备用于在测试本发明的酶变体中使用的商业购买的洗涤剂。使用的试剂为：5mM HEPES，pH8.0或5mM MOPS，pH7缓冲液、3:1Ca：Mg的介质水硬度(CaCl₂：MgCl₂·6H₂O)；稀释成6gpg的每加仑15000格令(gpg)储液。每孔使用由CFT处理的两块EMPA-116BMI(血渍/乳渍/墨渍)棉花布料样品。将微布料样品室温在去离子水中预洗涤20分钟。预洗涤步骤后，将布料样本置于纸巾上面干燥。然后，在冲压(expulsion press下)使用1/4”圆冲模将风干的布料样品冲孔。最后，将两块微布料样品垂直地放入96孔MTP的每一孔中以暴露全部表面区域(即，并不是平放在孔的底部)。工作洗涤剂溶液显示于表1-1中。

将温箱设定为16℃。将来自主稀释平板的～10ppm酶的10μL样品加入具有上文列出的190μL工作洗涤剂溶液的BMI 2-布料样品板中。将测定板中的体积调节到变体的终浓度为0.5ppm。立即将平板转移到iEMS温箱/震荡器(Thermo/Labsystems)；并在给定的温度1400转/分钟摇荡温育30分钟。温育后，将100μL的上清转移到新96孔板(将Costar 9017型用于温育后读取反应平板)中，并在405nm和/或600nm处在SpectraMAX MTP Reader(340型；Molecular Devices)中测量吸收率。测试中也包括含有2块微布料样品和没有添加蛋白酶样品的洗涤剂的对照孔。405nm处的测量提供了更高的值并追踪了色素去除，而在600nm处的测量追踪了浑浊度和清洁。在该测定中，蛋白酶水解底物并从底物中释放色素和不溶性颗粒。因此，浑浊度的速率是酶活性的测量。

计算去污活性

将获得的吸光度值用空白值(没有酶的底物)校正，以提供水解活性的测量。对每一样品(变体)，计算性能指数。在相同的蛋白质浓度比较变体(实际值)和标准酶(理论值)的性能的性能指数。此外，可以使用标准酶的Langmuir等式的参数计算理论值。

性能指数

在相同蛋白质浓度比较变体(实际值)和亲本蛋白酶(理论值)的性能的性能指数。此外，使用标准蛋白酶的结合曲线(即，Langmuir等式)的参数可以计算理论值。对于至少一种特性具有值>0.5的性能指数(PI)鉴定了包含至少一种突变的变体，所述突变可以与一种或多种突变组合以产生具有一种或多种目的特性的合适的性能指标的蛋白质，该一种或多种目的特性不同于测量的PI值>0.5的目的特性，或者是除测量的PI值>0.5的目的特性之外的特性。

实施例2

枯草芽孢杆菌GG36枯草杆菌蛋白酶变体

在该实施例中，进行实验以在所述的枯草芽孢杆菌中产生GG36(也在本文中称为迟缓芽胞杆菌枯草杆菌蛋白酶)。如本领域已知进行转化(参见例如，WO 02/14490)。

在枯草芽孢杆菌中产生GG36蛋白酶

使用在共有aprE启动子和BPN’转录终止予的控制下，与aprE信号序列的笫8个密码子融合的GG36密码予改进的基因构建表达质粒pAC-GG36ci。在以下提供的序列(SEQ IDNO：2)中，黑字体和斜字体表示共有aprE启动子，标准字体表示信号序列，下划线字体表示前序列，且黑字体表示编码GG36成熟蛋白酶的DNA，并且下划线斜字体表示BPN’终止子。用于克隆的KpnI和XhoI限制位点位于编码GG36成熟区的DNA序列(SEQ ID NO：4)的侧翼(参见图4)。

atctcaaaaaaatgggtctactaaaatattactccatctattataataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcattgctgatttctgttgcttttagctcatccatcgcatccgctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaa ttggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagttgaggcaaatgacgaggtaαccattctctc taaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttctgtccgttgagttaagccca gaagatgtggacgcgttagagctcgatccagctatttcttatattgaagaggatgcagaagtaactacaatggcgcaatcggtaccatggggaattagcagagtacaagccccagctgcacataaccgtggattgacaggttctggtgtaaaagttgctgtccttgataccggtatttccactcatccagacttaaatattcgtggtggagctagctttgtaccaggggaaccatccactcaagatggcaatggacatggcactcatgttgccggcacaatcgcggctcttaacaattcaattggtgttcttggcgtagcgccaagcgcagaactatacgctgttaaagtattaggagcaagcggttcaggctctgtcagctctattgcccaaggattggaatgggcagggaacaatggcatgcacgttgctaatcttagtttaggatctccttcgccaagtgccacacttgagcaagctgttaatagcgcgacttctagaggcgttcttgttgtagcggcctctggaaattcaggtgcaggctcaatcagctatccggcccgttatgcgaacgctatggcagtcggagctactgaccaaaacaacaaccgcgccagcttttcacagtatggcgcagggcttgacattgtcgcaccaggtgtaaacgtgcagagcacttacccaggttcaacatatgccagcttaaacggtacatcaatggctactcctcatgttgcaggtgcggctgcacttgttaaacaaaagaacccatcttggtccaatgtacaaatccgcaatcatcttaagaatacggcaactagcttaggaagcacaaacttgtatggaagcggacttgtcaatgcagaagctgcaactcgttaaaagcttaactcgagataaaaaaccggcctt ggccccgccggttttttat(SEQ ID NO：2)

用于在枯草芽孢杆菌中表达GG36蛋白酶的质粒pAC-GG36ci显示于图4中。质粒元件如下：pUB110＝来自质粒pUB110的DNA片段[McKenzie T.，Hoshino T.，Tanaka T.，Sueoka N.(1986)pUB110的核苷酸序列：与复制和其调节有关的一些突出特性(TheNucleotide Sequence of pUB110：Some Salient Features in Relation toReplication and Its Regulation)。Plasmid 15：93-103]，pBR322＝来自质粒pBR322的DNA片段[Bolivar F，Rodriguez RL，Greene PJ，Betlach MC，Heyneker HL，Boyer HW。(1977)新载体II的构建和表征。多目的克隆系统(Construction and characterizationof new cloning vehicles.II.A multipurpose cloning system)。Gene 2：95-113]，pC194＝来自质粒pC194的DNA片段[Horinouchi S.，Weisblum B。(1982)pC194的核苷酸序列和功能图，特异诱导氯霉素抗性的质粒(Nucleotide sequence and functional map ofpC194，a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance)，J.Bacteriol 150：815-825]。

质粒特征如下：枯草芽孢杆菌的Ori＝来自pUB110的复制原点，CAT＝来自pC194的氯霉素抗性基因，pMB1复制原点＝来自pBR322的复制原点，bla＝来自pBR322的β-内酰胺酶，短aprE启动予＝共有转录启动子，信号肽＝信号肽，前肽＝GG36前区域，GG36ci成熟肽＝成熟GG36(被在本研究中表达的每一变体的编码区替代)，BPN’终止子＝来自枯草杆菌蛋白酶BPN’的转录终止子。

以下提供了GG36前体蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。在该序列中，黑体表示成熟GG36蛋白酶(野生型)，其也提供为SEQ ID NO：4：MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR*(SEQ ID NO：3)

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR*(SEQ ID NO：4)

迟缓芽胞杆菌枯草杆菌蛋白酶(＝GG36)组合电荷/疏水性文库(CCHL)的设计和产生

通过鉴定7种均匀分布的、表面暴露的氨基酸来设计迟缓芽胞杆菌枯草杆菌蛋白酶组合的电荷/疏水性文库(CCHL)。这些残基是S24、R45、S101、Q109、G118、T213和L217。替换位置的编号对应于在BPN’枯草杆菌蛋白酶中编号的位置(BPN’编号；图1)。如表2-1显示，通过在每一位置处进行可能的四种组合：野生型，谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、亮氨酸(L)和精氨酸(R)，产生了33个成员的组合疏水性文库(GH2-GH33)。

含有密码子改进的GG36基因的pAC-GG36ci质粒发送到DNA 2.0 Inc.(MenloPark，CA)用于产生CHL。将枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE：amyE::xylRPxylAcomK-phleo)提供为用于转化编码GG36变体枯草杆菌蛋白酶的DNA的宿主菌株。变体提供为在96孔板中的甘油储备物。

表2-2显示了在GG36中进行的替换以产生的变体。表2-1也提供了变体GG36和野生型之间的净电荷和疏水性的差异。

蛋白酶变体的表达

用钢制96孔复制器将来自甘油储备物的克隆加到含有200μl的LB培养基+25μg/ml氯霉素的96孔培养板(BD，353075)中，复制含有GG36或FNA表达载体的枯草芽孢杆菌克隆，并37℃在湿润的环境中220转/分钟生长过夜。将200μl过夜培养物接种在5ml塑料摇管中的2000μl确定成分培养基+25μg/ml氯霉素中。该培养基富含基于MOP缓冲液的半确定成分培养基，其用尿素作为主要的氮源，葡萄糖作为主要的碳源，并补充了1％大豆蛋白胨用于增强细胞生长。将摇管在37℃、220转/分钟温育60小时。60小时后，将上清在大于8000×RCF的离心机中离心。将溶液倒入15ml聚丙烯圆锥管中储存。不再进行另外的纯化或浓缩。为了长期稳定性，将上清储备物配制为40％丙二醇储备物并储存于4℃。

实施例3

枯草芽孢杆菌FNA枯草杆菌蛋白酶变体

在枯草芽孢杆菌中产生FNA蛋白酶

在该实施例中，进行实验以在所述的枯草芽孢杆菌中产生FNA(也在本文中称为枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L(＝FNA))。如本领域已知进行转化(参见例如，WO02/14490)。

使用在共有aprE启动子和BPN’转录终止予的控制下，与aprE信号序列的第8个密码子融合的FNA基因构建表达质粒pAC-FNAre。在以下提供的序列(SEQ ID NO：5)中，黑字体和斜字体表示共有aprE启动子，标准字体表示信号序列，下划线字体表示前序列，且黑字体表示编码FNA成熟蛋白酶的DNA，并且下划线斜字体表示BPN’终止子。FNA成熟区含有用于克隆的KpnI和XhoI限制位点(参见图5)。

gaattcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattataataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatccagcgcgcaggctgcagggaaatcaa acggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagaagaaagacgtcat ttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagctagcgctacattaaacgaaaaagct gtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgtagcacacgcgtacgcgcagtccgtgccatatggcgtatcacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacaccggttcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctcatccagatcttaaagtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaacacacgttgctggtaccgttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggcgccgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccgtccggttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggcaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgtcgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagctcgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagccgcggctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagctctctagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaatgtacaggcggcagctcagtaaaactcgagataaaaaacc ggccttggccccgccggttttttat(SEQ ID NO：5).

用于在枯草芽孢杆菌中表达FNA蛋白酶的质粒pAC-FNAre显示于图5中。质粒元件如下：pUB110＝来自质粒pUB110的DNA片段[McKenzie T.，Hoshino T.，Tanaka T.，SueokaN.(1986)pUB110的核苷酸序列：与复制和其调节有关的一些突出特性(The NucleotideSequence of pUB110：Some Salient Features in Relation to Replication and ItsRegulation)。Plasmid 15：93-103]，pBR322＝来自质粒pBR322的DNA片段[Bolivar F，Rodriguez RL，Greene PJ，Betlach MC，Heyneker HL，Boyer HW。(1977)新载体II的构建和表征。多目的克隆系统(Construction and characterization of new cloningvehicles.II.A multipurpose cloning system)。Gene 2：95-113]，pC194＝来自质粒pC194的DNA片段[Horinouchi S.，Weisblum B。(1982)pC194的核苷酸序列和功能图，特异诱导氯霉素抗性的质粒(Nucleotide sequence and functional map of pC194，aplasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance)，J.Bacteriol 150：815-825]。

质粒特征如下：枯草芽孢杆菌的Ori＝来自pUB110的复制原点，CAT＝来自pC194的氯霉素抗性基因，pMB1复制原点＝来自pBR322的复制原点，bla＝来自pBR322的β-内酰胺酶，短aprE启动子＝共有转录启动子，信号肽＝信号肽[指定的]，前肽＝FNA前区域，FNA成熟肽＝成熟FNA(被在本研究中表达的每一变体的编码区替代)，BPN’终止子＝来自枯草杆菌蛋白酶BPN’的转录终止予。

以下提供了FNA前体蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。在该序列中，黑体表示成熟FNA蛋白酶(野生型)，其也提供为SEQ ID NO：7：

MRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ*(SEQ ID NO：6)

AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ*(SEQ ID NO：7)

枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L(＝FNA)组合电荷/疏水性文库(CCHL)的设计和产生

通过鉴定7种均匀分布的、表面暴露的氨基酸来设计枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L组合的电荷/疏水性文库。这些残基是S24、A45、S101、N109、N118、K213和L217。在如表3-1显示，通过在每一位置处进行4种可能的组合：野生型，谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、亮氨酸(L)和精氨酸(R)产生了32个成员的组合疏水性文库(FH2-FH33)。

含有FNA基因的pAC-FNAre质粒发送到DNA 2.0Inc.(Menlo Park，CA)用于产生组合疏水性文库。提供枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE、amyE:：xylRPxylAcomK-phleo)用于编码FNA变体替代物的DNA的转化。变体提供为在96孔板中的甘油储备物。

表3-1显示了在FNA中进行的替换以产生的变体。表3-1也提供了变体FNA和野生型之间的净电荷和疏水性的差异。

蛋白酶变体的表达

用钢制96孔复制器将来自甘油储备物的克隆加到含有200μl的LB培养基+25μg/ml氯霉素的96孔培养板(BD，353075)中，复制含有GG36或FNA表达载体的枯草芽孢杆菌克隆，并37℃在湿润的环境中220转/分钟生长过夜。将200μl过夜培养物接种在5ml塑料摇管中的2000μl确定成分培养基+25μg/ml氯霉素中。该培养基富含基于MOP缓冲液的半确定成分培养基，其用尿素作为主要的氮源，葡萄糖作为主要的碳源，并补充了1％大豆蛋白胨用于增强细胞生长。将摇管在37℃、220转/分钟温育60小时。60小时后，将上清在大于8000×RCF的离心机中离心。将溶液倒入15ml聚丙烯圆锥管中储存。不再进行另外的纯化或浓缩。为了长期稳定性，将上清储备物配制为40％丙二醇储备物并储存于4℃。

实施例4

去污和相对表达的评价

该实施例描述了在BMI微布料样品测定中测试GG36和FNA组合疏水性文库变体。使用在实施例1中提供的方法。表4-1(GG36)和4-2(FNA)中显示的结果是性能指标，其中与分别的亲本比较了相对蛋白质表达(TCA PI)和去污活性(BMI PI)方面的变体的性能。具有性能指数大于0.5(PI>0.5)的那些变体具有改善的性能。将性能指数小于或等于0.05规定为0.05并表示为黑斜体。ND表示没有测定。

本说明书中提及的所有专利和文献表现出了本发明所属领域的技术人员的水平。本领域技术人员应当容易的理解，本发明适合于实施该目的并获得所提及的结果和优点，以及其特性。本文中所述的组合物和方法表示为示例性的优选实施方案，并不意为限制本发明的范围。本领域技术人员应当容易的理解，可以对本文中公开的发明进行不同的替换和修饰，并不背离本发明的范围和精神。

本文中说明性描述的发明可以合适地在没有本文中具体公开的因素、限制存在的情况下实施。使用的术语和表达用作为描述性并非限制性术语，并且这些术语和表述的使用并不意图排除其显示和描述的任何等价特征以及其部分。但是应当理解，多种修饰可以在本发明所权利要求的范围内。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选的实施方案具体地公开，并且本领域技术人员可以采用本文中公开的观点的任选特性、修饰和变化，并且如本文中所定义，认为此类修饰和变化是在本发明的范围内的。

在本文中已经广泛且概括性地描述了本发明。属于概括性公开内的每一较窄的种类和次概括也构成了本发明的一部分。这包括具有限制或者否定性限制条件的本发明概括性公开，以从种类中排除任何物质而不论该物质是否被本发明明确地描述为排除。

Claims (21)

1.芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并包含选自S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,N109Q-N118Q-K213Q,S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q,S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q,S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q,S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q,S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R,S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R,S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R,S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E,S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q,和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E的两个或者多个位置的替换，其中所述芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶是FNA，其中所述位置通过对应于如SEQ ID NO:1所示的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而进行编号。

2.分离的核酸，其编码如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体。

3.表达载体，其包含权利要求2所述的核酸。

4.宿主细胞，其包含如权利要求3所述的表达载体。

5.清洁组合物，其包含至少一种权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体。

6.权利要求5所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物是洗涤剂。

7.权利要求6所述的清洁组合物，其中所述洗涤剂是强效液体洗涤剂或干洗洗涤剂。

8.权利要求7所述的清洁组合物，其中所述洗涤剂是餐具洗涤剂。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的清洁组合物，其进一步包含选自半纤维素酶、纤维素酶、蛋白酶、酯酶、过水解酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、木质素酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶和淀粉酶或它们的混合物的一种或多种其他酶或酶衍生物。

10.权利要求9所述的清洁组合物，其中所述半纤维素酶是木聚糖酶、甘露聚糖酶或β-葡聚糖酶。

11.权利要求9所述的清洁组合物，其中所述氧化酶是过氧化物酶、酚氧化酶或脂肪加氧酶。

12.权利要求11所述的清洁组合物，其中所述酚氧化酶是漆酶。

13.权利要求9所述的清洁组合物，其中所述蛋白酶是金属蛋白酶。

14.权利要求9所述的清洁组合物，其中所述酯酶是脂肪酶、磷脂酶。

15.权利要求9所述的清洁组合物，其中所述果胶酶是果胶酸裂合酶。

16.权利要求9所述的清洁组合物，其中所述淀粉酶是支链淀粉酶。

17.权利要求9所述的清洁组合物，其中所述蛋白酶是角蛋白酶。

18.权利要求9所述的清洁组合物，其中所述酯酶是角质酶。

19.权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其进一步包含至少一种稳定剂。

20.清洁组合物，其包含至少0.0001重量百分比的至少一种权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体，并任选地，至少一种合适的辅助成分。

21.清洁的方法，所述方法包含步骤：

a)将包含织物的表面和/或物品与权利要求5-18中任一项所述的清洁组合物或权利要求1和19中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体接触；并

b)任选地洗涤和/或漂洗所述表面或物品。

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