BRPI9916352B1 - enzima de subtilase isolada dos subgrupos i-s1 e i-s2, subtilase, seqüência isolada de dna, vetor de expressão, célula hospedeira microbiana, método para produzir uma subtilase ou uma variante de subtilase, composição, e, uso de uma subtilase ou de uma variante de subtilase ou de uma composição de enzima - Google Patents

Abstract

"enzima de subtilase isolada dos subgrupos i-s1, e i-s2, subtilase, seqüência isolada de dna, vetor de expressão, célula hospedeira microbiana, método para produzir uma subtilase ou uma variante de subtilase, composição, e, uso de uma subtilase ou de uma variante de subtilase ou de uma composição de enzima" enzimas de subtilase dos subgrupos i-s1 e i-s2 tendo um resíduo de aminoácido adicional na posição 96 da região (b) de elo de sítio ativo da posição 95 a 103. as variantes de subtilases exibem desempenho de lavagem melhorado em um detergente em comparação com a sua enzima precursora.

Description

“ENZIMA DE SUBTILASE ISOLADA, COMPOSIÇÃO, E, USO DE UMA SUBTILASE OU DE UMA VARIANTE DE SUBTILASE OU DE UMA COMPOSIÇÃO DE ENZIMA.” CAMPO TÉCNICO

Esta invenção diz respeito a novas enzimas de subtilase dos subgrupos I-Sl e I-S2 tendo pelo menos um resíduo de aminoácido adicional na posição 96 da região (b) de elo de sítio ativo da posição 95 a 103. Estas proteases são utilizáveis exibindo desempenho de lavagem excelente ou melhorado quando usadas em detergentes; composições de limpeza e detergentes. A invenção ainda diz respeito a genes que codificam a expressão das ditas enzimas quando inseridos dentro de uma célula ou organismo hospedeiros adequados; e tais células hospedeiras com estes transformadas e capazes de expressar as ditas variantes de enzima e métodos para produzir as novas enzimas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Na indústria de detergentes, as enzimas durante mais de 30 anos foram implementadas nas formulações de lavagem. As enzimas usadas em tais formulações compreendem proteases, lipases, amilases, celulases, bem como outras enzimas ou misturas destas. As enzimas comercialmente mais importantes são as proteases.

Um número crescente de proteases comercialmente usadas são variantes engendradas de proteína de proteases do tipo selvagem que ocorrem naturalmente, por exemplo, DURAZYM® (Novo Nordisk A/S), RELASE® (Novo Nordisk A/S), MAXAPEM® (Gist-Brocades N.V.), PURAFECT® (Genencor International, Inc.).

Além disso, várias variantes de protease são descritas na técnica, tais como na EP 130756 (GENENTECH) (que corresponde à Patente US re-concedida N0 34.606 (GENENCOR)); EP 214435 (HENKEL), WO 87/04461 (AMGEN); WO 87/05050 (GENEX); EP 260105 (GENENCOR); Thomas, Russell e Fersht (1985) Nature 318, 375 a 376; Thomas, Russell e Fersht (1987) J. Mol. Biol. 193, 803 a 813; Russel e Fersht, Nature 328, 496 a 500 (1987); WO 88/08028 (Genex); WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S.A.); WO 95/30011 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); US 5.543.302 (SOLVAY S.A.); EP 251 446 (GENENCOR); WO 89/06279 (NOVO NORDISK A/S); WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S); EP 525 610 Al (SOLVAY); e WO 94/02618 (GIST-BROC ADES N.V.).

Entretanto, ainda que várias variantes de protease utilizáveis tenham sido descritas existe ainda uma necessidade para novas proteases ou variantes de protease melhoradas para vários usos industriais.

Portanto, um objetivo da presente invenção, é fornecer proteases ou variantes de protease de proteína engendradas melhoradas especialmente para o uso na indústria de detergente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores verificaram que as subtilisinas em que pelo menos um dos elos de sítio ativo são mais longos do que aqueles presentemente conhecidos exibem propriedades de desempenho de lavagem melhoradas em composições de detergente. A identificação destas foi feita construindo-se variantes de subtilisina especialmente da subtilisina 309 (BLSAVI ou Savinase®) exibindo propriedades de desempenho de lavagem melhoradas em composições de detergente em relação à enzima precursora do tipo selvagem. Isto foi descrito em nosso mais recente pedido DK1332/97.

Foi agora verificado que certas subtilases ou variantes destas dos subgrupos I-Sl (“subtilisinas” verdadeiras) e I-S2 (subtilisinas altamente alcalinas) tendo pelo menos um resíduo de aminoácido adicional na posição 96 (ou mais exatamente entre as posições 96 e 97) da região (b) de elo de sítio ativo da posição 95 a 103 exibem surpreendentemente desempenho de lavagem melhorado em comparação àquelas presentemente conhecidas e àquelas descritas nos ditos pedidos.

As proteases melhoradas de acordo com a invenção podem ser obtidas pelo isolamento a partir de recursos naturais ou pela introdução de pelo menos um outro resíduo de aminoácido (uma inserção) no elo de sítio ativo (b) entre as posições 96 e 97 em uma subtilase do tipo selvagem (para uma definição dos elos de sítio ativo e da numeração das posições ver abaixo).

Embora esta verificação tenha sido feita na subtilisina 309 é prognosticado que será possível produzir ou isolar subtilases ou variantes de subtilase similarmente vantajosas.

Além disso será possível avaliar especificamente isolados naturais para identificar novas subtilases do tipo selvagem que compreendam um elo de sítio ativo (b) que seja mais longo do que o elo de sítio ativo correspondente em subtilases conhecidas do tipo selvagem, tais como a subtilisina 309, cujas subtilases podem ser consideradas ter um resíduo de aminoácido inserido entre as posições 96 e 97 e exibindo excelente desempenho de lavagem em um detergente em comparação com a sua subtilisina relacionada mais próxima conhecida, tais como a subtilisina 309.

No que diz respeito ao alinhamento e numeração referência é feita às Figuras 1, la, 2 e 2a abaixo que mostram os alinhamentos entre a subtilisina BPN’ (BASBPN) (a) e a subtilisina 309 (BLSAVI) (b) e os alinhamentos entre a subtilisina BPN’ (a) (BASBPN) e a subtilisina Carlsberg (g). Nas Figuras 1 e 2 os alinhamentos foram estabelecidos pelo uso da rotina GAP do pacote GCG como indicado abaixo, ao passo que os alinhamentos das Figuras la e 2a são os mesmos como mostrado na WO 91/00345. Estes alinhamentos são neste pedido de patente usados como uma referência para a numeração dos resíduos.

Os sete elos de sítio ativo (a) até (g) (incluindo ambos os resíduos de aminoácido da extremidade indicados) são aqui definidos abranger os resíduos de aminoácido nos segmentos dados abaixo (a) a região entre o resíduo de aminoácido 33 e 43; (b) a região entre o resíduo de aminoácido 95 e 103; (c) a região entre o resíduo de aminoácido 125 e 132; (d) a região entre o resíduo de aminoácido 153 e 173; (e) a região entre o resíduo de aminoácido 181 e 195; (f) a região entre o resíduo de aminoácido 202 e 204; (g) a região entre o resíduo de aminoácido 218 e 219.

Consequentemente em um primeiro aspecto a invenção diz respeito a enzimas isoladas (isto é, mais do que 10 % puras) de subtilase dos subgrupos I-Sl e I-S2 tendo pelo menos um resíduo de aminoácido adicional na posição 96 da região (b) do elo de sítio ativo da posição de 95 a 103, por meio do qual os ditos resíduos de aminoácido adicional(is) corresponde(m) à inserção de pelo menos um resíduo de aminoácido entre as posições 96 e 97.

Em um segundo aspecto a invenção diz respeito a uma seqüência isolada de DNA que codifica uma variante de subtilase da invenção.

Em um terceiro aspecto a invenção diz respeito a um vetor de expressão que compreende uma seqüência isolada de DNA que codifica uma variante de subtilase da invenção.

Em um quarto aspecto a invenção diz respeito a uma célula hospedeira microbiana transformada com um vetor de expressão de acordo com o quarto aspecto.

Em um outro aspecto a invenção diz respeito à produção das enzimas de subtilisina da invenção.

As enzimas da invenção, no geral podem ser produzidas pelo cultivo de uma cepa microbiana a partir da qual a enzima foi isolada e recuperando a enzima em uma forma substancialmente pura; ou pela inserção de um vetor de expressão de acordo com o quarto aspecto da invenção dentro de um hospedeiro microbiano adequado, cultivando-se o hospedeiro para expressar a enzima de subtilase desejada e recuperando o produto de enzima.

Além disso, a invenção diz respeito a uma composição que compreende uma subtilase ou variante de subtilase da invenção.

Ainda mais a invenção diz respeito ao uso das enzimas da invenção para vários usos industriais relevantes em particular para o uso em composições de limpeza e composições de limpeza que compreendam as enzimas mutantes especialmente composições de detergente que compreendam as enzimas de subtilisina mutantes.

DEFINIÇÕES

Antes de debater esta invenção em mais detalhes, os seguintes termos e convenções serão primeiro definidos. NOMENCLATURA DE AMINOÁCIDOS A = Ala = Alanina V = Vai = Valina L = Leu = Leucina I = Ile = Isoleucina P = Pro = Prolina F = Phe = Fenilalanina W = Trp = Triptofano M = Met = Metionina G = Gly = Glicina S = Ser = Serina T = Thr = Treonina C = Cys = Cisteína Υ = Tyr = Tirosina N = Asn = Asparagina Q = Gin = Glutamina D = Asp = Ácido Aspártico E = Glu = Ácido Glutâmico K = Lys = Lisina R = Arg = Arginina H = His = Histidina X = Xaa = Qualquer aminoácido NOMENCLATURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS A = Adenina G = Guanina C = Citosina T = Timina (apenas no DNA) U = Uracila (apenas no RNA) NOMENCLATURA E CONVENÇÕES PARA A DESIGNAÇÃO DE VARIANTES

Na descrição das várias variantes de enzima produzidas ou consideradas de acordo com a invenção, as seguintes nomenclaturas e convenções foram adaptadas para facilidade de referência: Uma matriz de referência é primeiro definida alinhando-se a enzima do tipo selvagem isolada ou precursora com subtilisina BPN’ (BASBPN). O alinhamento pode ser obtido pela rotina GAP do pacote GCG versão 9.1 para numerar as variantes usando-se os seguintes parâmetros: penalidade de criação gap = 8 e penalidade de extensão gap = 8 e todos os outros parâmetros mantidos em seus valores de penalidade. Um outro método é usar alinhamentos reconhecidamente conhecidos entre as subtilases, tais como o alinhamento indicado na WO 91/00345. Na maioria dos casos as diferenças não terão qualquer importância.

Tais alinhamentos entre subtilisina BPN (BASBPN) e subtilisina 309 (BLSAVI) e subtilisina Carlsberg (BLSCAR), respectivamente são indicados nas Figuras 1, la, 2 e 2a. Por meio destas várias supressões e inserções serão definidas em relação à BASBPN. Na Figura 1, a subtilisina 309 tem 6 supressões nas posições 36, 58, 158, 162, 163 e 164 em comparação com a BASBPN, ao passo que na Figura la a subtilisina 309 tem as mesmas supressões nas posições 36, 56, 159, 164, 165 e 166 em comparação com a BASBPN. Na Figura 2 a subtilisina Carlsberg tem uma supressão na posição 58 em comparação com a BASBPN, ao passo que na Figura 2a a subtilisina Carlsberg tem uma supressão na posição 56 em comparação com a BASBPN. Estas supressões estão nas Figuras 1, la, 2 e 2a indicadas por asteriscos (*).

As várias modificações realizadas em uma enzima do tipo selvagem são indicadas, no geral, usando-se três elementos como segue: A POSIÇÃO ORIGINAL DO AMINOÁCIDO DO AMINOÁCIDO SUBSTITUÍDO A notação G195E significa assim uma substituição de uma glicina na posição 195 com um ácido glutâmico.

No caso quando o resíduo original de aminoácido pode ser qualquer resíduo de aminoácido, uma notação resumida pode ser as vezes usada indicando apenas a posição e o aminoácido substituído, POSIÇÃO DE AMINOÁCIDO SUBSTITUÍDO

Tal notação é particularmente relevante em conexão com modificação(ões) nas subtilases homólogas (vide abaixo).

Similarmente quando a identidade do(s) resíduo(s) de aminoácido a ser(em) substituído(s) for(em) irrelevante(s), POSIÇÃO ORIGINAL DE AMINOÁCIDO

Quando tanto o(s) aminoácido(s) original(is) quanto o(s) aminoácido(s) substituído(s) podem compreender qualquer aminoácido então apenas a posição é indicada, por exemplo: 170.

Quando o(s) aminoácido(s) original(is) e/ou o(s) aminoácido(s) substituído(s) podem compreender mais do que um, mas não todos os aminoácidos então os aminoácidos selecionados são indicados dentro de chaves { }, POSIÇÃO ORIGINAL DE AMINOÁCIDO (AMINOÁCIDO SUBSTITUÍDO^_______AMINOÁCIDO SUBSTITUÍDOS

Para variantes específicas os três específicos ou um código de letras são usados, incluindo os códigos Xaa e X para indicar qualquer resíduo de aminoácido. SUBSTITUIÇÕES: A substituição de Ácido Glutâmico no lugar da glicina na posição 195 é designada como: Glyl95Glu ou G195E ou a substituição de qualquer resíduo de aminoácido ácido no lugar da glicina na posição 195 é designada como: Glyl95Xaa ou G195X ou Glyl95 ou G195 A substituição de serina no lugar de qualquer resíduo de aminoácido na posição 170 pode ser assim designada: Xaal70Ser ou X170S ou 170Ser ou 170S

Tal notação é particularmente relevante em conexão com modificação(ões) nas subtilases homólogas (vide abaixo). 170Ser é assim pretendido compreender por exemplo, tanto uma modificação Lysl70Ser em BASBPN quanto uma modificação Argl70Ser em BLSAVI (conforme a Figura 1).

Para uma modificação onde o(s) aminoácido(s) original (is) e/ou aminoácido(s) substituído(s) pode(m) compreender mais do que um, mas não todos os aminoácidos, a substituição de glicina, alanina, serina ou treonina no lugar da arginina na posição 170 pode ser indicada por: Argl70{Gly, Ala, Ser, Thr} ou R170{G, A, S, T} para indicar as variantes R170G, RI 70A, R170S e R170T. SUPRESSÕES: Uma supressão de glicina na posição 195 será indicada por: Glyl95* ou G195* Correspondentemente a supressão de mais do que um resíduo de aminoácido, tal como a supressão de glicina e leucina nas posições 195 e 196 serão designadas INSERÇÕES: A inserção de um resíduo de aminoácido adicional tal como por exemplo, uma lisina após G195 é Glyl95GlyLys ou G195GK; ou quando mais do que um resíduo de aminoácido é inserido, tal como por exemplo, um Lys, Ala e Ser após G195 isto é : Gly 195GlyLysAlaSer ou G195GKAS Em tais casos o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) é/são numerados pela adição de letras minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido que precede o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s). No exemplo acima as sequências 194 a 196 podem ser assim: 194 195 196 BLSAVI A - G - L 194 195 195a 195b 195c 196 Variante A-G-K-A-S-L

Nos casos onde um resíduo de aminoácido idêntico ao resíduo de aminoácido existente é inserido está claro que surge uma degeneração na nomenclatura. Se por exemplo uma glicina é inserida após a glicina no exemplo acima isto podería ser indicado por G195GG. A mesma mudança atual podería ser também apenas indicada como A194AG para a mudança de 194 195 196 BLSAVI A - G - L para 194 195 195a196 Variante A - G - G - L 194 194a 195 196 Tais casos estarão evidentes à pessoa habilitada e a indicação G195GG e as indicações correspondentes para este tipo de inserções são assim pretendidas para compreender tais indicações degeneradas equivalentes. PREENCHER UM INTERVALO: Onde uma supressão em uma enzima existe na comparação da referência com a seqüência de subtilisina BPN’ usada para a numeração, uma inserção em tal posição é indicada como: *36Asp ou *36D

para a inserção de um ácido aspártico na posição 36 MODIFICAÇÕES MÚLTIPLAS

Variantes que compreendem modificações múltiplas são separadas por sinais de positivo, por exemplo: Argl 70Tyr+Gly 195Glu ou R170Y+G195E representando modificações nas posições 170 e 195 substituindo-se tirosina e ácido glutâmico no lugar de arginina e glicina, respectivamente, ou por exemplo, Tyrl67{Gly, Ala, Ser, Thr}+Argl70{Gly, Ala, Ser, Thr} designa as variantes Tyrl 67Gly+Arg 170Gly, Tyr 167Gly+Arg 170 Ala, Tyrl 67Gly+Arg 170Ser, Tyrl 67Gly+Arg 170Thr, Tyr 167 Ala+Arg 170Gly, Tyrl 67 Ala+Arg 170 Ala, Tyrl 67 Ala+Arg 170Ser, Tyrl 67 Ala+Arg 170Thr, Tyr 167Ser+Arg 170Gly, Tyrl 67Ser+Arg 170Ala, Tyrl 67Ser+Argl 70Ser, Tyrl 67Ser+Arg 170Thr, Tyrl67Thr+Argl70Gly, Tyrl67Thr+Argl70Ala, Tyrl67Thr+Argl70Ser e Tyrl67Thr+Argl70Thr.

Esta nomenclatura é particularmente relevante no que diz respeito às modificações voltadas para a substituição, reposição, inserção ou supressão de resíduos de aminoácido tendo propriedades específicas comuns, tais como resíduos de carga positiva (K, R, H), carga negativa (D e) ou modificação de aminoácido(s) conservativo(s) de por exemplo, Tyrl67{Gly, Ala, Ser, Thr}+Argl70{Gly, Ala, Ser, Thr}, que significa substituir um aminoácido pequeno por um outro aminoácido pequeno. Ver seção “Descrição detalhada da invenção” para mais detalhes.

PROTEASES

As enzimas que clivam as ligações de amida nos substratos de proteína são classificadas como proteases ou (intercambiavelmente) peptidases (ver, Walsh, 1979, Enzimatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman e Company, San Francisco, Capítulo 3).

NUMERAÇÃO DE POSICÕES/RESÍDUOS DE AMINOÁCIDO

Se nada mais é mencionado a numeração de aminoácido aqui usada corresponde àquela da seqüência de subtilase BPN’ (BASBPN). Para mais descrição da seqüência BPN’ ver as Figuras 1 e 2 ou Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719 a 737.

SERINA PROTEASES

Uma serina protease é uma enzima que catalisa a hidrólise de ligações de peptídeo e em que existe um resíduo essencial de serina no sítio ativo (White, Handler e Smith, 1973 “Principies of Biochemistry,” Quinta Edição, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271 a 272).

As serina proteases bacterianas têm pesos moleculares na faixa de 20.000 a 45.000 Daltons. Estas são inibidas pelo diisopropilfluorofosfato. Estas hidrolisam ésteres de terminal simples e são similares em atividade à quimiotripsina eucariótica, também uma serina protease. Um termo mais estrito, alcalino protease, abrange um subgrupo, reflete o pH ótimo alto de algumas das serina proteases, de pH de 9,0 a 11,0 (para revisão, ver Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711 a 753). SUBTILASES

Um subgrupo das serina proteases experimentalmente denominadas subtilases foi proposto por Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719 a 737 e Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501 a 523. Estas são definidas pela análise de homologia de mais do que 170 seqüências de aminoácido de serina proteases previamente chamadas de proteases semelhantes à subtilisina. Uma subtilisina foi prévia e freqüentemente definida como uma serina protease produzida por bactérias Gram-positivas ou fungos e de acordo com Siezen et al. agora é um subgrupo das subtilases. Uma ampla variedade de subtilases foram identificadas e a seqüência de aminoácido de várias subtilases foi determinada. Para uma descrição mais detalhada de tais subtilases e suas seqüências de aminoácido, referência é feita a Siezen et al. (1997).

Um subgrupo das subtilases, o I-Sl ou “subtilisinas verdadeiras”, compreende as subtilisinas “clássicas”, tais como a subtilisina 168 (BSS168), a subtilisina BPN’, a subtilisina Carlsberg (ALCALASE®, NOVO NORDISK A/S) e a subtilisina DY (BSSDY).

Um outro subgrupo das subtilases, o I-S2 ou subtilisinas altamente alcalinas, é reconhecido por Siezen et al. (acima). As proteases do subgrupo I-S2 são descritas como subtilisinas altamente alcalinas e compreendem enzimas tais como a subtilisina PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Gist-Brocades NV), a subtilisina 309 (SAVINASE®, NOVO NORDISK A/S), a subtilisina 147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVO VORDISK A/S) e alcalino elastase YaB (BSEYAB). LISTA DE ACROSSEMIAS PARA SUBTILASES: I-Sl Subtilisina 168 BSS168 (BSSAS (Subtilisin amilosacchariticus), BSAPRJ (Subtilisin J), BSAPRN (Subtilisin NAT), BMSAMP (Mesentericopeptidase), Subtilisina BPN’, BASBPN, Subtilisina DY, BSSDY, Subtilisina Carlsberg, BLSCAR (BLKERA (Queratinase), BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3), BSSPRC, Serina protease C BSSPRD, Serina protease D I-S2 Subtilisina Sendai, BSAPRS Subtilisina ALP 1, BSAPRQ, Subtilisina 147, Esperase® BLS147 (BSAPRM (SubtilisinAprM), BAH101), Subtilisina 309, Savinase®, BLS309/BLSAVI (BSKSMK (M-protease), BAALKP(Subtilisina PB92, Bacilo alcalofílico alcalino protease), BLSUBL (Subtilisina BL)), alcalino elastase YaB, BYSYAB, “SAVINASE®” SAVINASE® é comercializado pela NOVO NORDISK A/S. É a subtilisina 309 do B. Lentus e difere da BAALKP apenas em uma posição (N87S, ver Figura 1, neste). SAVINASE® tem a seqüência de aminoácido designada b) na Figura 1.

SUBTILASE PRECURSORA O termo “subtilase precursora” descreve uma subtilase definida de acordo com Siezen et al. (1991 e 1997). Para mais detalhes ver a descrição de “SUBTILASES” imediatamente acima. Uma subtilase precursora também pode ser uma subtilase isolada de uma fonte natural em que a modificação subsequente foi feita embora se retenha a característica de uma subtilase. Altemativamente o termo “subtilase precursora” pode ser denominada “subtilase do tipo selvagem”.

MODIFICACÃOfÕES') DE UMA VARIANTE DE SUBTILASE O termo “modificação(ões)” usado aqui é definido para incluir a modificação química de uma subtilase, bem como a manipulação genética do DNA que codifica uma subtilase. A(s) modificação(ões) podem ser reposição(ões) da(s) cadeia(s) lateral(s) de aminoácido, substituição(ões), supressão(ões) e/ou inserções no(s) aminoácido(s) de interesse.

VARIANTE DE SUBTILASE

No contexto desta invenção, o termo variante de subtilase ou subtilase mutada significa uma subtilase que foi produzida por um organismo que expressa um gene mutante derivado de um microorganismo precursor que possuiu um gene original ou precursor e que produziu uma enzima precursora correspondente, o gene precursor tendo sido mutado de modo a produzir o gene mutante do qual a dita subtilase protease mutada é produzida quando expressada em um hospedeiro adequado.

SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS DE SUBTILASE

As regiões específicas de elo de sítio ativo e as inserções de aminoácido nos ditos elos da subtilase SAVTNASE® são identificadas para a modificação nestas para se obter uma variante de subtilase da invenção.

Entretanto, a invenção não é limitada às modificações desta subtilase em particular, mas estende-se a outras subtilases precursoras (do tipo selvagem), que tenham uma estrutura primária homóloga àquela da SAVINASE®. A homologia entre duas seqüências de aminoácido é neste contexto descrita pelo parâmetro “identidade”.

De modo a determinar o grau de identidade entre duas subtilases a rotina GAP do pacote GCG versão 9.1 pode ser aplicada (abaixo) usando-se os mesmos ajustes. O rendimento da rotina, é além do alinhamento de aminoácido o cálculo da “Porcentagem de Identidade” entre as duas seqüências.

Com base nesta descrição é rotina para uma pessoa habilitada na técnica identificar subtilases homólogas adequadas e as regiões homólogas de elo de sítio ativo correspondentes, que podem ser modificadas de acordo com a invenção.

DESEMPENHO DE LAVAGEM

A capacidade de uma enzima para catalisar a degradação de vários substratos que ocorrem naturalmente presentes nos objetos a serem limpos durante por exemplo, a lavagem ou limpeza de superfície dura é freqüentemente referida como a sua capacidade de lavagem, capacidade de lavar, detergência ou desempenho de lavagem. Por todo este pedido o termo desempenho de lavagem será usado para abranger esta propriedade. SEQUÊNCIA ISOLADA DE DNA O termo “isolado”, quando aplicado a uma molécula de seqüência de DNA, denota que a seqüência de DNA foi removida do seu ambiente genético natural e é assim livre de outras seqüências codificadoras estranhas ou não desejadas e está em uma forma adequada para o uso dentro de sistemas de produção de proteína geneticamente engendradas. Tais moléculas isoladas são aquelas que são separadas do seu ambiente natural e incluem cDNA e clones genômicos. As moléculas isoladas de DNA da presente invenção são livres de outros genes com os quais são ordinariamente associadas, mas podem incluir regiões 5’ e 3’ não traduzidas que ocorram naturalmente tais como promotores e terminadores. A identificação de regiões associadas estarão evidentes a uma pessoa de .habilidades comum na técnica (ver, por exemplo, Dynan e Tijan, Nature 316 774 a 778, 1985). O termo “uma seqüência isolada de DNA” pode ser altemativamente denominada “uma seqüência clonada DNA”.

PROTEÍNA ISOLADA

Quando aplicado a uma proteína, o termo “isolada” indica que a proteína foi removida do seu ambiente natural.

Em uma forma preferida, a proteína isolada é substancialmente livre de outras proteínas, particularmente outras proteínas homólogas (isto é, “impurezas homólogas” (ver abaixo)).

Uma proteína isolada é mais do que 10 % pura, preferivelmente mais do que 20 % pura, mais preferivelmente mais do que 30 % pura, como determinado por SDS-PAGE. Além disso é preferido fornecer a proteína em uma forma altamente purificada, isto é, mais do que 40 % pura, mais do que 60 % pura, mais do que 80 % pura, mais preferivelmente mais do que 95 % pura e ainda mais preferivelmente mais do que 99 % pura, como determinado por SDS-PAGE. O termo “proteína isolada” pode ser altemativamente denominado “proteína purificada”.

IMPUREZAS HOMÓLOGAS O termo “impurezas homólogas” significa qualquer impureza (por exemplo, um outro polipeptídeo que não o polipeptídeo da invenção) que origina da célula homóloga onde o polipeptídeo da invenção é originalmente obtido.

OBTIDO DE O termo “obtido de” como aqui usado em conexão com uma fonte microbiana específica, significa que o polinucleotídeo e/ou polipeptídeo produzidos pela fonte específica ou por uma célula em que um gene da fonte foi inserido.

SUBSTRATO O termo “Substrato” usado em conexão com um substrato para uma protease deve ser interpretado em sua forma mais ampla como aquela que compreende um composto contendo pelo menos uma ligação de peptídeo suscetível à hidrólise por uma subtilisina protease.

PRODUTO O termo “Produto” usado em conexão com um produto derivado de uma reação enzimática de protease deve ser no contexto desta invenção interpretado incluir os produtos de uma reação de hidrólise que envolve uma subtilase protease. Um produto pode ser o substrato em uma reação de hidrólise subsequente.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um alinhamento entre a subtilisina BPN’ (a) e a Savinase® (b) usando-se a rotina GAP mencionada acima. A Figura la mostra o alinhamento entre a subtilisina BPN’ e A Savinase® como extraído da WO 91/00345. A Figura 2 mostra um alinhamento entre a subtilisina BPN’ e a subtilisina Carlsberg usando-se a rotina GAP mencionada acima. A Figura 2a mostra o alinhamento entre a subtilisina BPN’ e a subtilisina Carlsberg como extraído da WO 91/00345. A Figura 3 mostra a estrutura tridimensional da Savinase (Banco de dados de Proteína (PDB) entrada 1SVN). Na Figura o elo de sítio ativo (b) é indicado.

DESCRICÂO DETALHADA DA INVENÇÃO

As subtilases da invenção em um primeiro aspecto dizem respeito a uma enzima de subtilase isolada (isto é, mais do que 10 % pura) dos subgrupos I-Sl e I-S2 tendo pelo menos um resíduo de aminoácido adicional na posição 96 da região (b) do elo de sítio ativo da posição 95 a 103, por meio do qual o(s) dito(s) resíduo(s) de aminoácido adicional(is) correspondem à inserção de pelo menos um resíduo de aminoácido entre as posições 96 e 97.

Em outras palavras as subtilases da invenção são caracterizadas por compreender uma região (b) de elo de sítio ativo de mais do que 9 resíduos de aminoácido e em que o resíduo de aminoácido adicional é ou pode ser considerado como sendo inserido entre as posições 96 e 97 como comparado à subtilase do tipo selvagem precursora ou uma conhecida.

Uma subtilase do primeiro aspecto da invenção pode ser uma subtilase precursora ou do tipo selvagem identificada e isolada da natureza.

Tal subtilase precursora do tipo selvagem pode ser especificamente avaliada por técnicas padrão conhecidas na técnica.

Um modo preferido de fazer isto pode ser amplificando-se especificamente por PCR regiões de DNA conhecidas por codificar os elos de sítio ativo nas subtilases de numerosos microorganismos diferentes, preferivelmente cepas diferentes de Bacilos.

As subtilases são um grupo de enzimas conservadas, no sentido de que o seu DNA e as seqüências de aminoácido são homólogas. Consequentemente é possível construir iniciadores relativamente específicos que flanqueiam os elos de sítio ativo.

Um modo de fazer isto é investigando-se um alinhamento de subtilases diferentes (ver, por exemplo, Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501 a 523). É a partir deste trabalho de rotina que uma pessoa habilitada na técnica constrói iniciadores de PCR que flanqueiam o elo de sítio ativo correspondente ao elo de sítio ativo (b) entre o resíduo de aminoácido de 95 a 103 em qualquer um dos grupos I-Sl ou I-S2, tais como a partir de BLSAVI. Usando-se tais iniciadores de PCR para amplificar o DNA de vários microorganismos diferentes, preferivelmente cepas diferentes de Bacilos, seguido pelo seqüenciamento de DNA dos ditos fragmentos de PCR amplificados, será possível identificar cepas que produzam subtilases destes grupos que compreendem uma região de sítio ativo mais longa, como comparada por exemplo, a BLSAVI, que corresponde á região de ela de sítio ativo das posições 95 a 103 e onde uma inserção pode ser considerada existir entre as posições 96 e 97. Tendo identificado a cepa e uma seqüência parcial de DNA de tal subtilase de interesse, é trabalho de rotina para uma pessoa habilitada na técnica completar a expressão e a purificação da clonagem de tal subtilase da invenção.

Entretanto, é considerado que uma enzima de subtilase da invenção predominantemente é uma variante de uma subtilase precursora.

Consequentemente, em uma modalidade da invenção diz respeito a uma enzima de subtilase isolada de acordo com o primeiro aspecto da invenção em que a dita enzima de subtilase é uma variante construída tendo um elo de sítio ativo (b) mais longo do que a sua enzima precursora tendo-se pelo menos uma inserção de aminoácido entre os resíduos de aminoácido 96 e 97.

As subtilases da invenção exibem excelente desempenho de lavagem em um detergente e se uma enzima é uma variante construída, um desempenho de lavagem melhorado em um detergente em comparação com a sua subtilase relacionada mais próxima, tal como subtilisina 309.

Diferentes produtos de subtilase exibirão um desempenho de lavagem diferente em diferentes tipos de composições de detergente. Uma subtilase da invenção tem desempenho de lavagem melhorado, quando comparada à sua relativa mais próxima em uma maioria de tais diferentes tipos de composições de detergente.

Preferivelmente uma enzima de subtilase da invenção tem desempenho de lavagem melhorado, quando comparada à sua relativa mais próxima na composição detergente mostrada no Exemplo 3 neste (vide abaixo).

De modo a determinar se uma dada seqüência de aminoácido de subtilase (irrelevante se a dita seqüência de subtilase d uma .ptecucsara de seqüência de subtilase do tipo selvagem ou uma variante de seqüência de subtilase produzida por qualquer outro método além de pela mutagênese direcionada por sítio) está dentro do escopo da invenção, os seguintes procedimentos podem ser usados: i) o alinhamento da dita seqüência de subtilase com a seqüência de aminoácido da subtilisina BPN’ (ver seção “Definições” neste (vide acima); ii) com base no alinhamento realizado na etapa i) identificar o elo de sítio ativo (b), na dita seqüência de subtilase que corresponde à região (b) de elo de sítio ativo da subtilisina BPN’ que compreende a região (ambas as extremidades de aminoácido incluídas) entre o resíduo de aminoácido de 95 a 103; iii) determinar se o laço de sítio ativo (b) na dita seqüência de subtilase, identificada na etapa ii) é mais longo do que o laço de sítio ativo correspondente em BLSAVI e se a dita prolongação corresponde à inserção de pelo menos um resíduo de aminoácido entre as posições 96 e 97.

Se este for o caso a subtilase investigada é uma subtilase dentro do escopo da presente invenção. O alinhamento realizado na etapa i) acima é realizado como descrito acima usando-se a rotina GAP.

Com base nesta descrição é rotina para uma pessoa habilitada na técnica identificar o laço de sítio ativo (b) em uma subtilase e determinar se a subtilase em questão está dentro do escopo da invenção. Se uma variante é construída pela mutagênese direcionada por sítio, está claro que é conhecido de antemão se a variante de subtilase está dentro do escopo da invenção.

Uma variante de subtilase da invenção pode ser construída por técnicas padrão conhecidas no ramo tais como pela mutagênese direcionada por sítio/randômica ou pelo rearranjo de DNA de .diferentes seqüências de subtilase. Ver a seção “PRODUÇÃO DE UMA VARIANTE DE SUBTILASE” e Material e métodos neste (vide abaixo) para mais detalhes.

Em outras modalidades a invenção diz respeito a 1. uma enzima de subtilase isolada de acordo com a invenção em que o dito pelo menos um resíduo de aminoácido inserido é selecionado do grupo que compreende: T, G, A e S; 2. uma enzima de subtilase isolada de acordo com a invenção em que o dito pelo menos um resíduo de aminoácido inserido é selecionado do grupo de resíduos carregados de aminoácido que compreende: D, E, Η, K e R, mais preferivelmente D, E, K e R; 3. uma enzima de subtilase isolada de acordo com a invenção em que o dito pelo menos um resíduo de aminoácido inserido é selecionado do grupo de resíduos de aminoácido que compreende: C, N, Q, S e T, mais preferivelmente N, Q, S e T; 4. uma enzima de subtilase isolada de acordo com a invenção em que o dito pelo menos um resíduo de aminoácido inserido é selecionado do grupo de pequenos resíduos hidrofóbicos de aminoácido que compreende: A, G e V; ou 5. uma enzima de subtilase isolada de acordo com a invenção em que o dito pelo menos um resíduo de aminoácido é selecionado do grupo de resíduos de aminoácido hidroíílicos grandes que compreende: F, I, L, M, P, W e Y, mais preferivelmente F, I,L,Me Y.

Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a uma enzima de subtilase isolada de acordo com a invenção em que a dita inserção entre as posições 96 e 97 compreende pelo menos dois aminoácidos, quando comparado ao elo de sítio ativo correspondente no BLSAVI.

Em outras modalidades, a invenção diz respeito a uma enzima de subtilase isolada que compreende pelo menos uma inserção, selecionada do grupo que compreende (na numeração de BASBPN): X96X{T, G, A, S) X96X{D, E, K, R} X96X{H, V, C, N, Q} X96X{F , I, L, Μ, P, W, Y} ou mais específico para a subtilisina 309 e as subtilases intimamente relacionadas, tais como BAALKP, BLSUBL e BSKSMK L96LA L96LT L96LG L96LS L96LD L96LE L96LK L96LR L96LH L96LV L96LC L96LN L96LQ L96LF L96LI L96LL L96LM L96LP L96LW L96LY

Além disso, a invenção diz respeito a subtilases que compreendem inserções múltiplas na posição 96 ou qualquer uma das seguintes combinações L96LA+A98T L96LG+A98T+S103T L96LG+A98T+Y167A L96LG+G100S L96LG+G100S+Y167A L96LG+Y167A L96LG+S99T+S110A L96LG+A98G+S99G+S101T+S103T É bem conhecido na técnica que uma assim chamada substituição conservativa de um resíduo de aminoácido para um resíduo de aminoácido similar é esperado produzir apenas uma mudança menor na característica da enzima. A Tabela III abaixo lista grupos de substituições conservativas de aminoácido.

TABELA III

Substituições conservativas de aminoácido Propriedade Comum Aminoácido Básico (carga positiva) K = lisina H = histidina Ácido (carga negativa) E = ácido glutâmico D = ácido aspártico Polar Q = glutamina N = asparagina Hidrofóbico L = leucina I = isoleucina V = valina M = metionina Aromático F = fenilalanina W = triptofano Y = tirosma Pequeno G = glicina A = alanina S = serina T = treonina De acordo com este princípio as variantes de subtilase que compreendem substituições conservativas, tais como G97A+A98AS+S99G, G97S+A98AT+S99A são esperadas exibir características que não são drasticamente diferentes umas das outras.

Com base nas variantes de subtilase divulgadas e/ou exemplificadas aqui, é trabalho de rotina para uma pessoa habilitada na técnica identificar modificação(ões) conservativa(s) adequada(s) para estas variantes de modo a se obter outras variantes de subtilase exibindo similarmente desempenho melhorado de lavagem.

De acordo com a invenção as subtilases da invenção pertencem aos subgrupos I-Sl e I-S2, especialmente ao subgrupo I-S2, tanto para isolar novas enzimas da invenção a partir da criação natural ou a partir da criação artificial de diversidade e para planejar e produzir variantes a partir de uma subtilase precursora.

Em relação a variantes do subgrupo I-Sl, é preferido escolher uma subtilase precursora do grupo que compreende BSS168 (BSSAS, BSAPRJ, BSAPRN, BMSAMP), BASBPN, BSSDY, BLSCAR (BLKERA, BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3), BSSPRC e BSSPRD ou variantes funcionais destas tendo retido as características do subgrupo I-S1.

Em relação às variantes do subgrupo I-S2 é preferido escolher uma subtilase precursora do grupo que compreende BSAPRQ, BLS147 (BSAPRM, BAH101), BLSAVI (BSKSMK, BAALKP, BLSUBL), BYSYAB e BSAPRS ou variantes funcionais destas tendo retido as características de subgrupo I-S2.

Em particular a dita subtilase precursora é BLSAVI (SAYINASE® NOVO NORDISK A/S) e uma variante de subtilase preferida da invenção é consequentemente uma variante de SAVINASE®. A presente invenção também compreende qualquer uma das subtilases da invenção mencionadas acima em combinação com qualquer outra modificação para a sequência de aminoácido desta. Especialmente combinações com outras modificações conhecidas na técnica para fornecer propriedades melhoradas para a enzima são consideradas. A técnica descreve várias variantes de subtilase com diferentes propriedades melhoradas e várias destas são mencionadas na seção “Fundamentos da invenção’ neste (vide acima). Estas referências são divulgadas aqui como referências pata identificar uma variante de subtilase, que vantajosamente pode ser combinada com uma variante de subtilase da invenção.

Tais combinações compreendem as posições: 222 (melhora a estabilidade à oxidação), 218 (melhora a estabilidade térmica), substituições nos sítios de ligação de Ca estabilizando a enzima, por exemplo, a posição 76 e muitas outras evidentes da técnica anterior.

Em outras modalidades uma variante de subtilase da invenção pode ser vantajosamente combinada com uma ou mais modificação(ões) em qualquer uma das posições: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 e 274.

Especificamente as seguintes variantes BLSAVI, BLSUBL, BSKSMK e BAALKP são consideradas apropriadas para a combinação: K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167, 8170, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L e T274A.

Além disso as variantes que compreende qualquer uma das variantes S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+ VKMYou N76D+V104A ou outras combinações destas mutações (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) em combinação com qualquer uma ou mais das modificação(ões) mencionadas acima exibem propriedades melhoradas.

Ainda outras variantes de subtilase do(s) aspecto(s) principal(is) da invenção são preferivelmente combinados com uma ou mais modificação(ões) em qualquer uma das posições 129, 131, 133 e 194, preferivelmente como modificações 129K, 131H, 133P, 133D e 194P e mais preferivelmente como modificações P129K, P131H, A133P, A133D e A194P. Qualquer uma destas modificações são esperadas fornecer um nível mais alto de expressão de uma variante de subtilase da invenção na produção desta.

Consequentemente, ainda uma outra modalidade da invenção diz respeito a uma variante de acordo com a invenção em que a dita modificação é selecionada do grupo que compreende: PRODUZIR UMA VARIANTE DE SUBTILASE

Muitos métodos para clonar uma subtilase da invenção e para introduzir inserções nos genes (por exemplo, genes de subtilase) são bem conhecidos na técnica, conforme as referências citadas na seção “FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO”.

No geral, procedimentos padrão para a clonagem de genes e introdução de inserções (randômica e/ou direcionada por sítio) dentro dos ditos genes podem ser usados de modo a se obter uma variante de subtilase da invenção. Para a descrição adicional de técnicas adequadas, referência é feita aos Exemplos neste (vide abaixo) e (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) “Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. e Cutting, S. M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990); e WO 96/34946.

Além disso, uma variante de subtilase da invenção pode ser construída por técnicas padrão para a criação artificial de diversidade, tais como por rearranjo de DNA de genes diferentes de subtilase (WO 95/22625; Stemmer WPC, Nature 370: 389 a 391 (1994)). O rearranjo de DNA por exemplo, do gene que codifica a Savinase® com um ou mais seqüências parciais de subtilases identificadas na natureza para compreender regiões de elo de sítio ativo (b) mais longas do que as do elo de sítio ativo (b) da Savinase®, fornecerá, após avaliação subsequente quanto às variantes de desempenho de lavagem melhorada, as variantes de subtilase de acordo com a invenção.

VETORES DE EXPRESSÃO

Um vetor de expressão recombinante que compreende uma construção de DNA que codifica a enzima da invenção pode ser qualquer vetor que possa ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante. A seleção de vetor dependerá freqüentemente da célula hospedeira dentro da qual deva ser introduzido. Assim, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que exista como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação do cromossoma, por exemplo, um plasmídeo. Altemativamente, o vetor pode ser um que na introdução em uma célula hospedeira é integrado no genoma da célula hospedeira em parte ou em sua totalidade e replicado junto com o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) foi/foram integrado(s). O vetor é preferivelmente um vetor de expressão em que a seqüência de DNA que codifica a enzima da invenção está operavelmente ligada a segmentos adicionais requeridos para a transcrição do DNA. No geral, o vetor de expressão é derivado de plasmídeo ou DNA viral ou pode conter elementos de ambos. O termo, “operavelmente ligado” indica que os segmentos estão arranjados de modo que funcionem de comum acordo com seus propósitos intencionados, por exemplo, inicia a transcrição em um promotor e prossegue através da seqüência de DNA que codifica a enzima. O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que mostre atividade transcricional na célula hospedeira de seleção e pode ser derivada de genes que codifiquem proteínas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para o uso em células hospedeiras bacterianas incluem o promotor do gene da amilase maltogênica do Bacillus stearothermophilus, o gene da amilase alfa do Bacillus licheniformis, o gene da amilase alfa do Bacillus amiloliqüefaciens, o gene da protease alcalina do Bacillus subíilis ou o gene de xilosidase do Bacillus pumilus gene ou o fago Lambda dos promotores PR ou PL ou os promotores lac, trp ou tac do E. coli. A seqüência de DNA que codifica a enzima da invenção também pode estar, se necessário, operavelmente conectada a um terminador adequado. O vetor recombinante da invenção pode ainda compreender uma seqüência de DNA que permita ao vetor replicar na célula hospedeira em questão. O vetor pode também compreender um marcador selecionável, por exemplo, um gene, o produto do qual complementa um defeito na célula hospedeira ou um gene que codifique a resistência a, por exemplo, antibióticos como a canamicina, o cloranfenicol, a eritromicina, a tetraciclina, a espectinomicina ou coisa parecida ou a resistência a metais pesados ou herbicidas.

Para direcionar uma enzima da presente invenção no caminho secretor das células hospedeiras, uma seqüência de sinal secretor (também conhecida como uma seqüência líder, seqüência prepro ou pré seqüência) pode ser fornecida no vetor recombinante. A seqüência de sinal secretor é unida à seqüência de DNA que codifica a enzima na matriz de leitura correta. As seqüências de sinal secretor são comumente posicionadas em 5’ em relação à seqüência de DNA que codifica a enzima. A seqüência de sinal secretor pode ser aquela normalmente associada com a enzima ou pode ser de um gene que codifique uma outra proteína secretada.

Os procedimentos usados para ligar as seqüências de DNA que codificam a presente enzima, o promotor e opcionalmente o terminador e/ou a seqüência de sinal secretor, respectivamente ou para montar estas seqüências pelos esquemas adequados de amplificação por PCR e inseri-los em vetores adequados que contenham a informação necessária para a replicação ou integração, são bem conhecidos pelas pessoas habilitadas na técnica (conforme, por exemplo, Sambrook et al., acima citado).

CÉLULA HOSPEDEIRA A seqüência de DNA que codifica a presente enzima introduzida na célula hospedeira pode ser homóloga ou heteróloga ao hospedeiro em questão. Se homóloga à célula hospedeira, isto é, produzida pela célula hospedeira na natureza, será típica e operavelmente conectada a uma outra seqüência promotora ou, se aplicável, uma outra seqüência de sinal secretor e/ou seqüência terminadora do que em seu ambiente natural. O termo “homólogo” é intencionado a incluir uma seqüência de DNA que codifique uma enzima natural ao organismo hospedeiro em questão. O termo “heterólogo” é intencionado a incluir uma seqüência de DNA não expressada pela célula hospedeira na natureza. Assim, a seqüência de DNA pode ser de um outro organismo ou pode ser uma seqüência sintética. A célula hospedeira na qual a construção de DNA ou o vetor recombinante da invenção é introduzido pode ser qualquer célula que seja capaz de produzir a presente enzima e inclui bactérias, leveduras, fungos e células eucarióticas superiores incluindo vegetais.

Os exemplos de células hospedeiras bactérianas que, no cultivo, são capazes de produzir a enzima da invenção são bactérias gram -positivas tais como as cepas de Bacillus, tais como as cepas de B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amiloliqüefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium ou B. íuringiensis ou cepas de Strepíomyces, tais como S. lividans ou S. murinus ou bactérias gram negativas tais como Echerichia coli. A transformação das bactérias pode ser efetuada pela transformação, eletroporação ou conjugação de protoplasto ou usando-se células competentes de uma maneira conhecida por si (conforme, Sambrook et al., acima).

Quando expressar a enzima em bactérias tais como E. coli, a enzima pode ser retida no citoplasma, tipicamente como grânulos insolúveis (conhecidos como corpos de inclusão) ou pode ser direcionada ao espaço periplásmico por uma seqüência de secreção bacteriana. no caso precedente, as células são lisadas e os grânulos são recuperados e desnaturados após o que a enzima é redobrada diluindo-se o agente de desnaturação. No último caso, a enzima pode ser recuperada do espaço periplásmico pelo rompimento das células, por exemplo, por sonificação ou choque osmótico, para liberar os conteúdos do espaço periplásmico e recuperar a enzima.

Quando expressar a enzima em bactérias gram positivas tais como as cepas de Bacillus ou Strepíomyces, a enzima pode ser retida no citoplasma ou pode ser direcionada ao meio extracelular por uma seqüência de secreção bacteriana. No último caso, a enzima pode ser recuperada do meio como descrito abaixo.

MÉTODO DE PRODUZIR SUBTILASE A presente invenção fornece um método de produzir uma enzima isolada de acordo com a invenção, em que uma célula hospedeira adequada, que foi transformada com uma seqüência de DNA que codifica a enzima, é cultivada sob condições que permitam a produção da enzima e a enzima resultante é recuperada da cultura.

Quando um vetor de expressão que compreende uma seqüência de DNA que codifica a enzima é transformada dentro de uma célula hospedeira heteróloga é possível permitir a produção heteróloga recombinante da enzima da invenção.

Deste modo, é possível fabricar uma composição de subtilase altamente purificada, caracterizada em ser isenta de impurezas homólogas.

Neste contexto impureza homóloga significa qualquer impureza (por exemplo, outros polipeptídeos que não a enzima da invenção) que se origine da célula homóloga onde a enzima da invenção é originalmente obtida. O meio usado para cultivar as células hospedeiras transformadas pode ser qualquer meio convencional adequado para desenvolver as células hospedeiras em questão. A subtilase expressada pode ser convenientemente secretada no meio de cultura e pode ser recuperada deste por procedimentos bem conhecidos que incluem separar as células do meio por centrifugação ou filtração, precipitação de componentes proteináceos do meio por intermédio de um sal tal como sulfato de amônio, seguido por procedimentos cromatográficos tais como a cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade ou coisa parecida.

USO DE UMA VARIANTE DE SUBTILASE DA INVENÇÃO

Uma variante de protease de subtilase da invenção pode ser usada para várias aplicações industriais, em particular dentro da indústria de detergente.

Além disso, a invenção diz respeito a uma composição de enzima, que compreende uma variante de subtilase da invenção.

Um resumo das aplicações industriais e das composições de enzima preferidas correspondentes está descrito abaixo.

Este resumo não é de nenhum modo intencionado a ser uma lista completa de aplicações adequadas de uma variante de subtilase da invenção. Uma variante de subtilases da invenção pode ser usada em outras aplicações industriais conhecidas na técnica por incluir o uso de uma protease, in particular de uma subtilase.

COMPOSIÇÕES DE DETERGENTE QUE COMPREENDEM AS ENZIMAS MUTANTES A presente invenção compreende o uso das enzimas mutantes da invenção em composições de limpeza e detergentes e de tais composições que compreendem as enzimas mutantes de subtilisina. Tais composições de limpeza e detergentes são bem descritos na técnica e referência é feita às WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011 para mais descrição de composições de limpeza e detergentes adequados.

Além disso, o(s) exemplo(s) abaixo demonstram as melhorias no desempenho de lavagem para várias variantes de subtilase da invenção. COMPOSIÇÕES DETERGENTES A enzima da invenção pode ser adicionada e assim tomar-se um componente de uma composição detergente. A composição detergente da invenção pode ser, por exemplo, formulada como uma composição detergente de lavar roupas a mão ou a máquina incluindo uma composição aditiva de lavar roupas adequada para pré tratamento de tecidos tingidos e uma composição amaciante de enxágüe de tecido adicionada ou ser formulada como uma composição detergente para uso geral em operações domésticas de limpeza de superfícies duras ou ser formulada para operações de lavar louças a mão ou a máquina.

Em um aspecto específico, a invenção fornece um aditivo de detergente que compreende a enzima da invenção. O aditivo de detergente bem como a composição detergente podem compreender uma ou mais outras enzimas tais como uma protease, uma lipase, uma cutinase, uma amilase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lacase e/ou uma peroxidase.

No geral, as propriedades da(s) enzima(s) selecionada(s) deve(m) ser compatível(is) com o detergente selecionado, (isto é, pH ótimo, compatibilidade com os outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.) e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes. PROTEASES: As proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferida. Os mutantes quimicamente modificados ou de proteína engendrada são incluídos. A protease pode ser uma serina protease ou uma metalo protease, preferivelmente uma protease alcalina microbiana ou uma protease semelhante à tripsina. Os exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, a subtilisina Novo, a subtilisina Carlsberg, a subtilisina 309, a subtilisina 147 e a subtilisina 168 (descrita na WO 89/06279). Os exemplos de proteases semelhantes à tripsina são tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina) e a protease Fusarium descrita na WO 89/06270 e WO 94/25583.

Os exemplos de proteases utilizáveis são as variantes descritas nas WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 e WO 98/34946 especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 e 274.

As enzimas de protease preferidas comercialmente disponíveis incluem Alcalase®, Savinase®, Primase®, Duralase®, Esperase® e Kannase® (Novo Nordisk A/S), Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®, Purafect OxP®, FN2® e FN3® (Genencor International Inc.). LIPASES: As lipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fungica. Os mutantes quimicamente modificados ou de proteína engendrada são incluídos. Os exemplos de lipases utilizáveis incluem lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como descrito na EP 258 068 e EP 305 216 ou de H. insolens como descrito na WO 96/13580, uma Pseudomonas lipase, por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma Bacillus lipase, por exemplo, de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biofísica Acta, 1131, 253 a 360), B. stearothermophílus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422).

Outros exemplos são variantes de lipase tais como aquelas descritas na WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

As enzimas de lipase preferidas comercialmente disponíveis incluem Lipolase® e Lipolase Ultra® (Novo Nordisk A/S). AMILASES: As amilases adequadas (a e/ou β) incluem aquelas de origem bacteriana ou fungica. Os mutantes quimicamente modificados ou de proteína engendrada são incluídos. As amilases incluem, por exemplo, α-amilases obtidas de Bacillus, por exemplo, uma cepa especial de B. licheniformis, descrito em mais detalhes na GB 1.296.839.

Os exemplos de amilases utilizáveis são as variantes descritas nas WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 e WO 97/43424 especialmente as variantes com substituições em um ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391,408 e 444.

As amilases comercialmente disponíveis são Duramil®, Termamil®, Fungamil® e BAN® (Novo Nordisk A/S), Rapidase® e Purastar® (da Genencor International Inc.). CELULASES: As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fóngica. Os mutantes quimicamente modificados ou de proteína engendrada são incluídos. As celulases adequadas incluem celulases do gênero Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celulases fóngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Micélioftora thermophila e Fusarium oxísporum divulgadas na US 4.435.307, US 5.648.263, US 5.691.178, US 5.776.757 e WO 89/09259.

As celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidados com a cor. Os exemplos de tais celulases são as celulases descritas na EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são as variantes de celulase tais como aquelas descritas na WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5.457.046, US 5.686.593, US 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.

As celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme® e Carezyme® (Novo Nordisk A/S), Clazinase® e Puradax HA® (Genencor International Inc.) e KAC-500 (B)® (Kao Corporation). PEROXIDASES/OXIDASES: As peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fóngica. Os mutantes quimicamente modificados ou de proteína engendrada são incluídos. Os exemplos de peroxidases utilizáveis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus e suas variantes como aquelas descritas na WO 93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257.

As peroxidases comercialmente disponíveis incluem Guardzyme® (Novo Nordisk A/S). A(s) enzima(s) detergente(s) pode(m) ser incluída(s) em uma composição detergente adicionando-se aditivos separados contendo uma ou mais enzimas ou adicionando-se um aditivo combinado que compreenda todas destas enzimas. Um aditivo detergente da invenção, isto é um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado por exemplo, como um granulado, um líquido, uma pasta, etc. As formulações aditivas detergentes preferidas são granulados, em particular granulados isentos de poeira, líquidos, em particular líquidos estabilizados ou pastas.

Os granulados isentos de poeira podem ser produzidos, por exemplo, como divulgados na US 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Os exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietileno glicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; non-ilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que existem de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono e di e triglicerídeos de ácidos graxos. Os exemplos de materiais de revestimento formadores de película adequados para aplicação pelas técnicas de leito fluido são dados na GB 1483591. As preparações líquidas de enzima podem ser, por exemplo, estabilizadas pela adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método divulgado na EP 238.216. A composição detergente da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até 70 % de água e de 0 a 30 % de solvente orgânico ou não aquoso. A composição detergente compreende um ou mais tensoativos, que podem ser não iônicos incluindo semi-polares e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou zwitteriônicos. Os tensoativos estão tipicamente presentes em um nível de 0,10 a 60 % em peso.

Quando incluídos nestes o detergente conterá usualmente de cerca de 1 % a cerca de 40 % de um tensoativo aniônico tal como alquilbenzenossulfonato linear, alfa-olefínsulfonato, alquil sulfato (sulfato de álcool graxo), etoxissulfato álcool, alcanossulfonato secundário, éster metílico de ácido graxo alfa-sulfo, ácido alquil ou alquenilsuccínico ou sabão.

Quando incluído neste o detergente conterá usualmente de cerca de 0,20 a cerca de 40 % de um tensoativo não iônico tal como etoxilato álcool, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo, monoetanolamida de acido graxo etoxilado de alquildimetilaminaóxido, monoetanolamida de ácido graxo, amida de ácido graxo de poliidróxi alquila ou derivados de N-acil N-alquila de glicosamina (“glucamidas”)· O detergente pode conter de 0 a 65 % de um reforçador de detergente ou agente de complexação tal como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminotetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos em camada (por exemplo, SKS-6 da Hoechst). O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Os exemplos são celulose carboximetílica, poli(vinilpirrolidona), poli(etileno glicol), poli(álcool vinílico), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazóis), policarboxilatos tais como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico e copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico. O detergente pode conter um sistema de alvejamento que pode compreender uma fonte de H202 tal como perborato ou percarbonato que pode ser combinado com um ativador de alvejamento formador de perácido tal como tetraacetiletilenodiamina ou nonanoiloxibenzenossulfonato. Al-temativamente, o sistema de alvejamento pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona. A(s) enzima(s) da composição detergente da invenção pode(m) ser estabilizada(s) usando-se agentes estabilizadores convencionais, por exemplo, um poliol tais como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster aromático de borato ou um derivado de ácido fenil borônico tal como ácido 4-formilfenil borônico e a composição pode ser formulada como descrito, por exemplo, na WO 92/19709 e WO 92/19708. O detergente também pode conter outros ingredientes detergentes convencionais tais como por exemplo, condicionadores de tecido incluindo argilas, reforçadores de espuma, supressores de espuma de sabão, agentes anti-corrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes anti-redeposição de sujeira, corantes, bactericidas, abrilhantadores óticos, hidrótropos, inibidores de mancha ou perfumes. É atualmente considerado que nas composições detergentes qualquer enzima, em particular a enzima da invenção, pode ser adicionada em uma quantidade que corresponda a 0,01 a 100 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, preferivelmente de 0,05 a 5 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, em particular de 0,1 a 1 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem. A enzima da invenção pode ser adicionalmente incorporada nas formulações de detergente divulgada na WO 97/07202 que é por meio desta incorporada como referência.

APLICAÇÕES INDUSTRIAIS EM COURO

Uma subtilase da invenção pode ser usada na indústria de couro, em particular para o uso na depilação de peles.

Na dita aplicação uma variante de subtilase da invenção é preferivelmente usada em uma composição de enzima que ainda compreende uma outra protease.

Para uma descrição mais detalhada de outras proteases adequadas ver a seção que diz respeito às enzimas adequadas para o uso em uma composição detergente (vide acima). APLICAÇÕES INDUSTRIAIS EM LÃ Uma subtilase da invenção pode ser usada na indústria de lã, em particular para o uso na limpeza de roupas que compreendem lã.

Na dita aplicação uma variante de subtilase da invenção é preferivelmente usada em uma composição de enzima que ainda compreende uma outra protease.

Para uma descrição mais detalhada de outras proteases adequadas ver a seção que diz respeito às enzimas adequadas para o uso em uma composição detergente (vide acima). A invenção é descrita em mais detalhes nos seguintes exemplos que não são de qualquer modo intencionados a limitar o escopo da invenção como reivindicado. MATERIAIS E MÉTODOS CEPAS: B. subtilis DN1885 (Diderichsen et al., 1990). B. lentus 309 e 147 são cepas específicas de Bacillus lentus, depositado com a NCIB e registrado os números de acesso NCIB 10309 e 10147 e descritas na Patente US N2 3.723.250 incorporada aqui por referência. E. coli MC 1000 (M. J. Casadaban e S. N. Cohen (1980); J. Mol. Biol. 138 179 a 207), foi feita r-, m+ por métodos convencionais e também está descrita no Pedido de Patente US Série N2 039.298. PLASMÍDEOS: pJS3: vetor de transporte de E. coli - B. subtilis contendo um gene sintético que codifica a subtilase 309. (Descrito por Jacob Schimdt et al. em Protein and Peptide letters 3: 39 a 44 (1996)).

pSX222: vetor de expressão de B. subtilis (Descrito na WO 96/34946). MÉTODOS GERAIS DE BIOLOGIA MOLECULAR: A menos que de outro modo mencionado as manipulações e transformações de DNA foram realizadas usando-se métodos padrão de biologia molecular (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) “Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. e Cutting, S. M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990).

As enzimas para manipulações de DNA foram usadas de acordo com as especificações dos fornecedores.

ENZIMAS PARA MANIPULAÇÕES DE DNA

A menos que de outro modo mencionado todas as enzimas para manipulações de DNA, tais como por exemplo, endonucleases de restrição, ligases, etc., são obtidas da New England Biolabs, Inc. ATIVIDADE PROTEOLÍTICA

No contexto desta invenção a atividade proteolítica é expressada em unidades de Kilo NOVO Protease (KNPU). A atividade é determinada relativamente a uma enzima padrão (SAVINASE ) e a determinação é fundamentada na digestão de uma solução de dimetil caseína (DMC) pela enzima proteolítica em condições padrão, isto é, 50 °C, pH 8,3, 9 min. de tempo de reação, 3 min. de tempo de medição. Um folheto AF 220/1 é disponibilizado sob requisição pela Novo Nordisk A/S, Dinamarca, cujo folheto é aqui incluído por referência.

Um GU é uma Unidade de Glicina, definida como a atividade de enzima proteolítica que, sob condições padrão, durante uns 15 minutos de incubação a 40° C, com N-acetil caseína como substrato, produz uma quantidade de grupo NH2 equivalente a 1 rnmol de glicina. A atividade de enzima também pode ser medida usando-se o ensaio de PNA, de acordo com reação com o substrato solúvel de succinil-alanina-alanina-prolina-fenil-alanina-para-nitro-fenol, que é descrito no Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T. M., Goodlander, B. D., Garrison, P. H. e Smith, L. A., (1988). FERMENTAÇÃO: As fermentações para a produção de enzimas de subtilase foram realizadas a 30° C em uma mesa de agitação rotativa (300 r.p.m.) em frascos Erlenmeyer de 500 ml com chicanas contendo 100 ml de meio BPX por 5 dias.

Consequentemente de modo a fazer, por exemplo, 2 litros de caldo, 20 frascos Erlenmeyer foram simultaneamente fermentados. MEIO: Composição do meio BPX (por litro): Amido de batata 100 g Cevada moída 50 g Farinha de soja 20 g Na2HP04 x 12 H20 9 g Plurônico 0,1 g Caseinato de sódio 10 g O amido no meio é liqüefeito com α-amilase e o meio é esterilizado aquecendo-se a 120° C por 45 minutos. Após a esterilização o pH do meio é ajustado para 9 pela adição de NaHCCh a 0,1 M. EXEMPLO 1 Construção e expressão de variantes de enzima: Mutagênese direcionada a sítio: As variantes de subtilase 309 direcionadas a sítio da invenção que compreendem inserções específicas no elo de sítio ativo (b) entre as posições 96 e 97 foram fabricadas pela clonagem tradicional de fragmentos de DNA (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2~ Ed., Cold Spring Harbor, 1989) produzidos pela PCR de oligos contendo as inserções desejadas (ver abaixo). O DNA plasmídico padrão foi pJS3 ou um análogo deste contendo uma variante de Subtilase 309.

As inserções foram introduzidas por mutagênese direcionada por oligo para a construção de variantes de inserção L96LX (X = qualquer resíduo de aminoácido inserido entre as posições 96 e 97) resultando em variantes de subtilase 309 L96LX.

As variantes de subtilase 309 foram transformadas no E. coli. O DNA purificado de uma cultura durante a noite destes transformantes foi transformado dentro do B. subtilis pela digestão de endonuclease de restrição, purificação de fragmentos de DNA, ligação, transformação de B. subtilis. A Transformação de B. subtilis foi realizada como descrito por Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209 a 221.

Mutagênese randômica localizada de modo a inserir inserções randômicas em uma região localizada: A estratégia global usada para realizar a mutagênese localizada randômica foi: Um iniciador mutagênico (oligonucleotídeo) foi sintetizado correspondendo à seqüência de DNA que flanqueia o sítio de inserção, separado pelos pares de base de DNA que definem a inserção.

Subsequentemente, o iniciador mutagênico resultante foi usado em uma reação de PCR com um iniciador oposto adequado. O fragmento de PCR resultante foi purificado e prolongado em tuna segunda reação de PCR, antes de ser digerido pelas endonucleases e clonado no vetor de transporte do E. coli - B. subtilis (ver abaixo).

Altemativamente e se necessário, o fragmento de PCR resultante é usado em uma segunda reação de PCR como um iniciador com um segundo iniciador oposto adequado para permitir a digestão e a clonagem da região mutagenizada dentro do vetor de transporte. As reações de PCR são realizadas sob condições normais.

Seguindo-se esta estratégia uma biblioteca randômica localizada foi construída no SAVINASE em que as inserções foram introduzidas na região de elo de sítio ativo entre as posições 96 e 97.

As mutações foram introduzidas pelos iniciadores mutagênicos (ver abaixo), de modo que todos os 20 aminoácidos são representados (N = 25 % de A, T, C e G; ao passo que S = 50 % de C e G. O fragmento de PCR produzido foi prolongado na direção do terminal N de Savinase por uma outra rodada de PCR pela combinação de uma seqüência de sobreposição com um fragmento de PCR produzido pela amplificação por PCR com os iniciadores; 5’ CTA AAT ATT CGT GGT GGC GC 3’ (sentido) e 5’ GAC TTT AAC AGC GTA TAG CTC AGC 3’ (anti-sentido). Os fragmentos de DNA prolongados foram clonados nos sítios Hind III e Mlu I do plasmídeo modificado pJS3 (ver acima) e depois as colônias de E. coli randomicamente selecionadas foram seqüenciadas para confirmar as mutações planejadas. O iniciador mutagênico (5’ GCT GAG CTA TAC GCT GTT AAA GTC CTA NNS GGG GCG AGC GGT TCA GGT TC 3’ (sentido)) foi usado em uma reação de PCR com um iniciador oposto de anti-sentido adequado, situado a jusante do sítio Mlu I no pJS3 (por exemplo, 5’- CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT -3’ (anti-sentido)) e o plasmídeo pJS3 como padrão. Este produto de PCR resultante foi clonado dentro do vetor de transporte pJS3 usando-se as enzimas de restrição Hind III e Mlu I. A biblioteca randômica foi transformada no E. coli por técnicas bem conhecidas. A biblioteca preparada conteve aproximadamente 100.000 clones individuais/biblioteca.

Depois as colônias randomicamente selecionadas foram seqüenciadas para confirmar as mutações planejadas De modo a purificar uma variante de subtilase da invenção, o plasmídeo de expressão pJS3 do B. subtilis que compreende uma variante da invenção foi transformada dentro de uma cepa competente do B. subtilis e foi fermentado como descrito acima em um meio contendo 10 pg/ml de Cloranfenicol (CAM). EXEMPLO 2 Purificação de variantes de enzima: Este procedimento diz respeito à purificação de uma fermentação em escala de 2 litros para a produção das subtilases da invenção em uma célula hospedeira de Bacillus.

Aproximadamente 1,6 litros do caldo de fermentação foi centrifugado a 5000 rpm por 35 minutos em béqueres de 1 litro. Os sobrenadantes foram ajustados ao pH 6,5 usando-se 10 % de ácido acético e filtrados em placas de filtro Seitz Supra SI00.

Os filtrados foram concentrados a aproximadamente 400 ml usando-se uma unidade Amicon CH2A UF equipada com um cartucho Amicon S1Y10 UF. O concentrado UF foi centrifugado e filtrado antes da absorção na temperatura ambiente em uma coluna de afinidade de Bacitracin no pH 7. A protease foi eluída da coluna de Bacitracin na temperatura ambiente usando-se 25 % de 2-propanol e cloreto de sódio 1 M em uma solução tampão com ácido dimetilglutárico 0,01, ácido bórico 0,1 M e cloreto de cálcio ajustado ao pH 7.

As frações com atividade de protease da etapa de purificação de Bacitracin foram combinadas e aplicadas a uma coluna Sefadex G25 de 750 ml (5 cm de diâmetro) equilibrada com um tampão contendo ácido dimetilglutárico 0,01, ácido bórico 0,2 M e cloreto de cálcio 0,002 M ajustado ao pH 6,5.

As frações com atividade proteolítica da coluna Sefadex G25 foram combinadas e aplicadas a uma coluna de troca catiõnica CM Sefarose CL 6B de 150 ml (5 cm de diâmetro) equilibrada com um tampão contendo ácido dimetilglutárico 0,01 M, ácido bórico 0,2 M e cloreto de cálcio 0,002 M ajustado ao pH 6,5. A protease foi eluída usando-se um gradiente linear de 0 a 0,1 M de cloreto de sódio em 2 litros do mesmo tampão (0 a 0,2 M de cloreto de sódio no caso da Subtilisina 147).

Em uma protease da etapa final de purificação contendo frações da coluna CM Sefarose foram combinadas e concentradas em uma célula Amicon de ultrafiltração equipada com uma membrana GR81PP (da Danish Sugar Factories Inc.).

Usando-se as técnicas do Exemplo 1 para a construção e fermentação e o procedimento de isolamento acima as seguintes variantes da subtilisina 309 foram produzidas e isoladas: L96LT

L96LS

L96LD

L96LE

L96LP

L96LG

L96LH

L96LI

L96LA

L96LG

L96LA+A98T

L96LT+Y67A

L96LG+G100S

L96LG+G100S

Estas variantes exibiram melhor desempenho de lavagem do que a Savinase em um ensaio preliminar. EXEMPLO 3 Desempenho de lavagem de composições detergentes que compreendem variantes de enzima Os seguintes exemplos fornecem resultados de vários testes de lavagem que foram conduzidos sob as condições indicadas MINI LAVAGEM Condições de lavagem DETERGENTES: Os detergentes usados foram um detergente modelo, denominado Detergente 95 ou obtidos de supermercados na Dinamarca (OMO, folha informativa ED-9745105) e nos USA (Wisk, folha informativa ED-9711893), respectivamente. Antes de usar, toda a atividade enzimática nos detergentes foi inativada por tratamento com micro onda O Detergente 95 é uma formulação modelo simples. O pH é ajustado a 10,5, que está dentro da faixa normal para um detergente em pó. A composição de detergente modelo 95 é como segue: 25 % STP (Na5P3O10) 25 % Na2S04 10 % Na2C03 20 % LAS (Nansa 80S) 5.0 % tensídio não iônico (Dobanol 25-7) 5.0 % Na2Si205 0,5 % Celulose carboximetílica 9,5 % Água AMOSTRAS DE PANO: As amostras de pano usadas foram EMPAI 16 e EMPAI 17, obtidas da EMPA Testmaterialen, Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gall, Suíça. REFLECTÀNCIA A medição de reflectância (R) no material de teste foi feita a 460 nm usando-se um fotômetro Macbeth ColorEye 7000. As medições foram feitas de acordo com o protocolo dos fabricantes.

AVALIAÇÃO A avaliação do desempenho de lavagem de uma subtilase é determinada pelo fator melhoria ou pelo fator desempenho para a subtilase investigada. O fator melhoria, IFDoSe/reSposta é definido como a relação entre as inclinações das curvas de desempenho de lavagem para um detergente contendo a subtilase investigada e o mesmo detergente contendo uma subtilase de referência na concentração assintótica da subtilase indo a zero O desempenho de lavagem é calculado de acordo com a formula I: (i); onde R é o desempenho de lavagem em unidades de reflectância; Rp é a intercepção da curva apropriada com o eixo y (cego); a é a inclinação da curva apropriada quando c -> 0; c é a concentração da enzima; e AR^ é o efeito teórico máximo da lavagem quando c -> oo. O fator de desempenho, P, é calculado de acordo com a formula II (II) onde Rvariame é a reflectância do material de teste lavado com 10 nM de variante; Rsavinase e a reflectância do material de teste lavado com 10 nM de Savinase; Rbranco é a reflectância do material de teste lavado com nenhuma enzima. Detergente Modelo 95 US (detergente: US Wisk, Amostra de tecido: EMPAI 17) - Variante As subtilases da invenção são assim observadas exibir desempenho de lavagem melhorado em comparação com a Savinase®

Claims (6)

1. Enzima de subtilase isolada de SEQ ID NO:l tendo um resíduo de aminoácido adicional na posição 96 da região de elo de sítio ativo (b) da posição 95 a 103, em que o dito um resíduo de aminoácido adicional corresponde à inserção de um resíduo de aminoácido entre as posições 96 e 97, caracterizada pelo fato de que o dito um resíduo de aminoácido adicional ou inserido é selecionado do grupo consistindo em L96LG, L96LA e L96LT.

2. Enzima de subtilase isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é combinada com uma ou mais modificações selecionadas do grupo consistindo de: L96LA+A98T, L96LG+G100S, L96LG+Y167A, L96LG+A98T, L96LA+A98T+S103T, L96LG+A98T+A194T, L96LA+S99T+S101A, L96LG+S99T+S101A, N76D+L96LA+A98T e L96LG+A98G+S99G+S101T+S103T.

3. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma subtilase ou uma variante de subtilase como definida nas reivindicações 1 ou 2.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma celulase, lipase, cutinase, oxidorreductase, uma outra protease ou uma amilase.

5. Composição de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição detergente.

6. Uso de uma subtilase ou de uma variante de subtilase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 e 2 ou de uma composição de enzima como definida nas reivindicações 3 e 4, caracterizado pelo fato de ser empregado em um detergente de lavar roupas e/ou um detergente de lavar louças.