CN107075493B

CN107075493B - 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸

Info

Publication number: CN107075493B
Application number: CN201580060853.7A
Authority: CN
Inventors: M.D.G.P.托斯卡诺; L.德马里亚
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2014-12-04
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2035-12-03
Also published as: EP3227444A1; CA2963331A1; WO2016087617A1; US20170335307A1; BR112017011854A2; CN107075493A; RU2710720C2; US10683491B2; MX2017006695A; US11591585B2; EP3690037A1; EP3227444B1; RU2017123330A3; RU2017123330A; US20200263157A1

Abstract

本发明涉及适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物，如衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤组合物，包括自动餐具洗涤组合物中使用的枯草杆菌酶变体。本发明还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本发明变体的方法。

Description

枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸

对序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

相关技术说明

在洗涤剂工业中，在洗涤配制品中酶已经应用了数十年。在此类配制品中使用的酶包括淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露糖苷酶\和蛋白酶，连同其他的酶或其混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。

越来越多的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体，

Liquanase

和

(诺维信公司(Novozymes A/S))、

Purafect

和

(杰能科国际公司(Genencor International,Inc.))。另外，许多蛋白酶变体在本领域中已有描述，如WO 91/00345(诺维信公司)和WO 94/23053(诺维信公司)描述了例如在位置262的突变。这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用。

已描述多种有用的枯草杆菌酶变体，其中很多已提供在不同洗涤剂中的改进活性、稳定性以及溶解度。

然而，多种因素使得进一步改进蛋白酶是有利的。如温度和pH等洗涤条件会随时间而发生变化，并且许多污渍在传统的洗涤条件下仍然难以完全去除。此外，洗涤中条件可以导致酶失活(归因于例如pH、温度或螯合不稳定性)，从而导致在洗涤循环过程中洗涤性能的损失。因此，尽管在蛋白酶开发上进行了密集研究，对相比于亲本枯草杆菌酶具有改进的稳定性，特别是改进的洗涤稳定性和/或储存稳定性，以及优选地相似的或改进的洗涤性能的新的且改进的蛋白酶仍存在需求。

发明概述

本发明涉及具有蛋白酶活性并且包含取代X9E+X206L+X262E(例如S9E+Q206L+L262E)的枯草杆菌酶变体，其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。

本发明进一步涉及编码这些枯草杆菌酶变体的多核苷酸；包含枯草杆菌酶变体的组合物，优选洗涤剂组合物；这些组合物在清洁过程中的用途以及用于获得枯草杆菌酶变体和用于从表面除去污渍的方法。

附图简述

图1是枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:1)和枯草杆菌蛋白酶BPN'(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的比对，使用尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)。

定义

术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

术语“控制序列”意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

在此将术语“洗涤剂组分”定义为意指可以用于洗涤剂组合物中的化学品的类型。洗涤剂组分的实例是表面活性剂、助水溶剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、抗氧化剂以及增溶剂。该洗涤剂组合物可以包括一种或多种任何类型的洗涤剂组分。

除非另外指明，术语“洗涤剂组合物”包括所有形式的洗涤剂组合物，例如凝胶、颗粒、液体、糊状、粉末、喷雾或片剂组合物，包括重垢液(HDL)、精细织物液体洗涤剂、液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，用于例如玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；纺织品和衣物预去污剂(pre-spotter)，连同餐具洗涤剂，例如手洗餐具洗涤剂、轻垢餐具洗涤剂、机洗餐具洗涤剂；通用或重垢清洗剂，液体、凝胶或糊状形式的通用清洗剂、液体清洁和消毒剂，包括抗细菌手洗类型、清洁棒、漱口水、义齿清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂；头发香波和头发漂洗剂(hair-rinse)；淋浴露、泡沫浴；金属清洁剂；连同清洁辅助剂，例如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理类型。

除了包含本发明的枯草杆菌酶变体之外，该洗涤剂配制品还可以包含一种或多种另外的酶(如淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶(例如内切葡聚糖酶)、角质酶、卤代加过氧酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、蛋白酶、黄原胶酶和木葡聚糖酶或其任何混合物)，和/或组分，例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。

术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于，清洁所有形式的陶器，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的用餐工具，例如匙、刀、叉，以及上菜用具连同陶瓷，塑料(例如三聚氰胺)，金属，瓷器，玻璃及丙烯酸酯。

术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。

术语“表达”包括涉及一种变体的产生的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及用餐工具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料(例如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。

术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

术语“改进的特性”意指与相对于亲本枯草杆菌酶有所改进的一种枯草杆菌酶变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于洗涤性能、蛋白酶活性、热活性曲线、热稳定性、pH活性曲线、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改进的表面特性、底物特异性、产物特异性、增加的稳定性、在存储条件下的改进的稳定性、以及化学稳定性。

术语“稳定性(stability)”包括储存稳定性和在使用过程中的稳定性，例如在清洗过程中的稳定性，并且反应了作为时间函数的根据本发明的枯草杆菌酶变体的稳定性，例如当枯草杆菌酶变体置于溶液中时，尤其是在洗涤剂溶液中时，能够保留多少活性。这种稳定性受到许多因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物，例如助洗剂的量、表面活性剂等等。术语“改进的稳定性”或“增加的稳定性”在此定义为相对于亲本枯草杆菌酶的稳定性，在溶液中显示出更高的稳定性的变体枯草杆菌酶。术语“改进的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改进的化学稳定性”、“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”。

术语“改进的化学稳定性(improved chemical stability)”在此定义为变体枯草杆菌酶在一种或多种化学物存在下表现为在孵育一段时间之后仍保留酶活性，这种或这些种化学物是天然存在的或是合成的，可降低亲本酶的酶活性。改进的化学稳定性还可使得这些变体在这类化学物存在下能更好地催化反应。在本发明的一个特别的方面，这种改进的化学稳定性是洗涤剂的，尤其是液体洗涤剂的一种改进的稳定性。术语“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”具体是当本发明的枯草杆菌酶变体混入液体洗涤剂配制品并且然后在15℃和50℃之间的温度下(例如20℃、30℃或40℃)储存时蛋白酶活性的改进的稳定性。

术语“改进的热活性”意指一种变体在特定温度下相对于亲本的温度依赖的活性曲线展示改变的温度依赖的活性曲线。热活性值提供了变体在一定温度范围内增强水解反应的催化的效率的测量。一种具有较大热活性的变体将引起一种酶组合物在增强底物水解速率方面的增加，从而减少所需要的时间和/或降低活性所需要的酶浓度。可替代地，具有减小的热活性的一种变体将在比由亲本的温度依赖活性曲线定义的亲本的最佳温度更低的温度下提高酶促反应。

在此将术语“改进的洗涤性能”定义为相对于亲本蛋白酶的洗涤性能展示改进的洗涤性能的根据本发明的枯草杆菌酶变体，例如通过增加的去污。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。洗涤性能可以被量化，如在此的“洗涤性能”定义下所描述的。

术语“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

术语“洗衣”涉及家用洗衣和工业洗衣两者并且意指用一种包含本发明的洗涤剂组合物的溶液处理纺织品和/或织物的过程。湿洗过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行或可以手动进行。

术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用、自催化活化等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQID NO:1的氨基酸1至269和SEQ ID NO:2的氨基酸1至275。本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的一种多核苷酸。

术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。

术语“核酸构建体”意指单-链或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

术语“可操作地连接”意指如下配置，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置，以使得控制序列指导编码序列的表达。

术语“亲本”意指对其做出改变以产生本发明的酶变体的一种蛋白酶。应理解的是，在上下文中的“具有相同的氨基酸序列”的表达涉及100％序列一致性。在一个具体实施例中，该亲本是与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的多肽具有至少60％的一致性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的一致性的蛋白酶。

术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一种)。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)1223:1-5(1994)；欧洲生物化学杂志232:1-6(1995)；欧洲生物化学杂志237:1-5(1996)；欧洲生物化学杂志250:1-6(1997)；以及欧洲生物化学杂志264:610-650(1999)的增刊1-5。洗涤剂工业如衣物和餐具洗涤中最广泛使用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是如下蛋白酶的亚组，这些蛋白酶特征在于在活性位点具有丝氨酸，该丝氨酸与底物形成共价加合物。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸残基和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶是指根据斯艾森(Siezen)等人，1991，蛋白质工程学(ProteinEngng)4:719-737和斯艾森(Siezen)等人，1997，蛋白质科学(Protein Science)6:501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。可用于洗涤剂中的蛋白酶主要是内肽酶(EC 3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，具有在P1处Ala之后的切割。出于本发明的目的，根据如下文的材料与方法部分所述的Suc-AAPF-pNA活性测定确定蛋白酶活性。在一方面，本发明的变体具有亲本酶的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的酶活性。在一个具体方面，本发明的枯草杆菌酶变体具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的酶活性。

术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，具有在P1处Ala之后的切割。出于本发明的目的，根据以下“材料与方法(Materials and Methods)”所述的程序确定蛋白酶活性。本发明的枯草杆菌酶变体优选具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。

两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：

(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：

(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

不同的严格条件定义如下。

术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用1X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用1X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.5X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.3X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.15X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“基本上纯的变体”意指按重量计包含最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％、以及最多0.5％的其他多肽材料的制剂，这些其他多肽材料是与其天然或重组地相关的。优选地，该变体按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的这些变体优选以基本上纯的形式存在。例如，这可通过经由众所周知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。

术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因工程化多肽生产系统内的形式的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组关联的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5’-和3’-非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸按重量计是至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的这些多核苷酸优选以基本上纯的形式存在。

术语“纺织品”意指包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料的任何纺织品材料，连同由这些材料制成的织物，例如服装、衣服和其他物品。当使用术语织物或衣服时，旨在也包括广义术语纺织品。

术语“变体”意指具有蛋白酶活性的、在三个或更多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸被不同的氨基酸置换；缺失意指除去占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸。术语枯草杆菌酶变体意指枯草杆菌酶亲本的变体，即枯草杆菌酶变体，是与亲本枯草杆菌酶相比在三个或更多个(例如，若干个)位置处包括改变(即取代、插入和/或缺失)的枯草杆菌酶。

术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤(如衣物洗涤或硬表面清洁)过程中除去存在于有待清洁的物体上的污物的能力。洗涤性能上的改进可以通过计算如在实例3中所述的AMSA测定中定义的所谓强度值(Int)来定量。

术语“野生型枯草蛋白酶”意指由天然存在的有机体(例如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母、真菌、植物或动物)表达的一种蛋白酶。野生型枯草杆菌酶的实例是枯草杆菌蛋白酶BPN’，即SEQ ID NO:2的氨基酸1至275。

变体命名规则

出于本发明的目的，枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQ ID NO:2的氨基酸1-275的序列(斯艾森(Siezen)等人，1991，蛋白质工程学(Protein Eng.)4:719-737))用于确定另一蛋白酶中相应的氨基酸残基。将另一种蛋白酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽比对，并且基于比对，使用尼德曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453)如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)的尼德尔程序，优选地5.0.0版或更新版本中所执行的，确定与在SEQ IDNO:2中披露的多肽中的任何氨基酸残基相应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

另一种蛋白酶中对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用若干计算机程序使用其对应的缺省参数比对多个多肽序列来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较；3.5版或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcids Research)32:1792-1797)；MAFFT(6.857版或更新版本；加藤(Katoh)和库玛(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和朝都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，537:39-64分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)；加藤和朝都，2010，26:1899-1900生物信息学)；以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83版或更新版本；汤普森(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)。

当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白质，可获取若干工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(Protein Engineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。

取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸与丙氨酸的置换命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。位置之前的“X”意指位置上的任何原始氨基酸都可以被取代。例如，X9E意指在位置9而不是E上的任何氨基酸残基被E取代；X206L意指在位置206而不是L上的任何氨基酸残基被L取代；以及X262E意指在位置262而不是E上的任何氨基酸残基被E取代。

缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸的缺失命名为“Gly195*”或“G195*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195^*+Ser411^*”或“G195^*+S411^*”。

插入：额外的氨基酸残基的插入，例如像在G195后插入赖氨酸可以表示为：Gly195GlyLys或者G195GK。可替代地，额外的氨基酸残基的插入，如在G195后插入赖氨酸可以表示为：*195aK。当插入多于一个的氨基酸残基，例如像在G195后插入Lys和Ala时，这种插入可以表示为：Gly195GlyLysAla或G195GKA。在此类情况下，还可以通过将小写字母添加到在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基位置编号处来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号，在这个实例中：*195aK*195bA。在以上的实例中，序列194至196因此为：

194 195 196

枯草杆菌蛋白酶309 A - G - L

194 195 195a 195b 196

变体 A - G - K - A - L

在取代和插入发生在相同的位置的情况下，这可表示为S99SD+S99A，或简写为S99AD。相同修饰也可以表示为S99A+^*99aD。

在其中插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基的情况下，显然是在命名中出现了简并。如果例如在以上实例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则将它表示为G195GG或*195GaG。对于以下变化，相同的实际变化也可以仅表示为A194AG或者^*194aG，从：

194 195 196

枯草杆菌蛋白酶309 A - G - L

到：

194 195 195a 196

变体 A - G - G - L

194 194a 195 196

这类情况对于技术人员来说是显而易见的，并且因此表示式G195GG和这种类型插入的相应表示式旨在包括这类等同简并表示式。

多种改变：包括多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。可替代地，空格或逗号可将多个改变分隔开，例如分别为A170Y G195E或A170Y，G195E。

不同改变：可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”，“Tyr167Gly+Arg170Ala”，“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

可替代地，不同改变或可任选的取代可用括号表示，例如Arg170[Tyr，Gly]或Arg170{Tyr，Gly}或简写为R170[Y，G]或R170{Y，G}。

发明详细说明

在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体相比于亲本枯草杆菌酶具有改进的稳定性，特别是改进的储存稳定性。在一个优选的实施例中，该枯草杆菌酶变体相比于亲本枯草杆菌酶具有改进的稳定性，特别是改进的储存稳定性，和同等或改进的洗涤性能。

在另一个实施例中，该枯草杆菌酶变体是

a)与该亲本枯草杆菌酶的氨基酸序列具有至少60％但小于100％序列一致性的一种多肽；

b)由如下的多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下项杂交：

(i)该亲本枯草杆菌酶的成熟多肽编码序列或

(ii)(i)的全长互补体；或

c)由如下的多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与该亲本枯草杆菌酶的成熟多肽编码序列具有至少60％但小于100％序列一致性。

在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少65％但小于100％序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少70％但小于100％序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少75％但小于100％序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少80％但小于100％序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少85％但小于100％序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少90％但小于100％序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少93％但小于100％序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少95％但小于100％序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少96％但小于100％序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少97％但小于100％序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体与该亲本枯草杆菌酶具有至少98％但小于100％序列一致性。

在一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:1至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:2至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:3至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:4至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:5至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:6至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:7至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:8至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:9至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:10至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:11至少60％一致的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。

在一方面，亲本枯草杆菌酶中改变的总数在3与30之间，优选在3与20之间，更优选在3与15之间，甚至更优选在3与10之间，最优选在3与8个改变之间。在另一方面，该亲本枯草杆菌酶中的改变的总数是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个改变。

本发明的枯草杆菌蛋白酶变体可以进一步包括一个或多个另外的改变。氨基酸改变可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列、抗原性表位或结合结构域。

保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸变化是这样一种性质，使得多肽的理化性质被改变。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定多肽中的必需氨基酸(康宁汉(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。对于BPN’(SEQ ID NO:2)，包含氨基酸S221、H64以及D32的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必需的。

在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体包括X9E+X206L+X262E并进一步包括X76D(例如N76D)。

在一个实施例中或任何上述实施例中，枯草杆菌酶变体进一步包括X9E+X206L+X262E和选自下组的一个或多个改变，该组由以下各项组成：X3T(例如S3T)、X4I(例如V4I)、X15T(例如A15T)、X24G(例如S24G)、X24R(例如S24R)、X27R(例如K27R)、*36D，X43A(例如N43A)、X43C(例如N43C)、X43L(例如N43L)、X43R(例如N43R)、X43W(例如N43W)、X68A(例如V68A)、X72A(例如I72A)、X72V(例如I72V)、X78D(例如S78D)、X87R(例如N87R)、X87S(例如N87S)、*97E，X98S(例如A98S)、X99A(例如S99A)、X99D(例如S99D)、X99A(例如S99A)、X99D(例如S99D)、X99E(例如S99E)、X99G(例如S99G)、*99D，X101D(例如S101D)、X101E(例如S101E)、X101G(例如S101G)、X101I(例如S101I)、X101K(例如S101K)、X101L(例如S101L)、X101M(例如S101M)、X101N(例如S101N)、X101R(例如S101R)、X103A(例如S103A)、X104F(例如V104F)、X104I(例如V104I)、X104N(例如V104N)、X104Y(例如V104Y)、X106A(例如S106A)、X114V(例如A114V)、X115T(例如G115T)、X115W(例如G115W)、X118R(例如G118R)、X118V(例如G118V)、X120D(例如H120D)、X120I(例如H120I)、X120N(例如H120N)、X120T(例如H120T)、X120V(例如H120V)、X123S(例如N123S)、X128A(例如S128A)、X128L(例如S128L)、X128S(例如S128S)、X129D(例如P129D)、X129N(例如P129N)、X129Q(例如P129Q)、X130A(例如S130A)、X147W(例如V147W)、X149C(例如V149C)、X149N(例如V149N)、X158E(例如A158E)、X160D(例如G160D)、X160P(例如G160P)、X161C(例如S161C)、X161E(例如S161E)、X162L(例如I162L)、X163A(例如S163A)、X163D(例如S163D)、X167A(例如Y167A)、X170S(例如R170S)、X182C(例如Q182C)、X182E(例如Q182E)、X185C(例如N185C)、X185E(例如N185E)、X188C(例如S188C)、X188D(例如S188D)、X188E(例如S188E)、X191N(例如Q191N)、X194P(例如A194P)、X195E(例如G195E)、X199M(例如V199M)、X204D(例如N204D)、X204V(例如N204V)、X205I(例如V205I)、X209W(例如Y209W)、X212A(例如S212A)、X212D(例如S212D)、X212G(例如S212G)、X212N(例如S212N)、X216I(例如S216I)、X216T(例如S216T)、X216V(例如S216V)、X217C(例如L217C)、X217D(例如L217D)、X217E(例如L217E)、X217M(例如L217M)、X217Q(例如L217Q)、X217Y(例如L217Y)、X218D(例如N218D)、X218E(例如N218E)、X218T(例如N218T)、X222C(例如M222C)、X222R(例如M222R)、X222S(例如M222S)、X225A(例如P225A)、X232V(例如A232V)、X235L(例如K235L)、X236H(例如Q236H)、X245K(例如Q245K)、X245R(例如Q245R)、X252K(例如N252K)、X255C(例如T255C)、X255E(例如T255E)、X256A(例如S256A)、X256C(例如S256C)、X256D(例如S256D)、X256V(例如S256V)、X256Y(例如S256Y)、X259D(例如S259D)、X260E(例如T260E)、X260P(例如T260P)、X261C(例如N261C)、X261E(例如N261E)、X261F(例如N261F)、X261L(例如N261L)、X261M(例如N261M)、X261V(例如N261V)、X261W(例如N261W)、X261Y(例如N261Y)和X274A(例如T274A)，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。

本发明涉及枯草杆菌酶变体，优选是与SEQ ID NO:1具有至少60％，如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％或100％序列一致性的蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中相比于SEQ ID NO:1，这些枯草芽孢杆菌酶变体包括取代X9E+X206L+X262E(例如S9E+Q206L+L262E)，其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。如上所述，SEQ ID NO:2用于编号，可以在图1中找到比对，并且术人员可以容易地比对除了SEQ ID NO:1的其他枯草杆菌酶亲本，并找到SEQ ID NO:2中的相应氨基酸。

本发明的诸位发明人已经发现，三重取代X9E+X206L+X262E提供了增加的稳定性至枯草杆菌酶。因此，本发明的一个实施例涉及枯草杆菌酶变体，它们相比于亲本枯草杆菌酶和/或相比于具有SEQ ID NO:1的枯草杆菌酶包括三个突变X9E+X206L+X262E(根据SEQID NO:2进行编号)，并且相比于亲本枯草杆菌酶(例如相比于SEQ ID NO:1)，具有在洗涤剂中的增加的稳定性。特别优选的实施例涉及枯草杆菌酶变体，当在pH为8的液体洗涤剂中在60℃下47小时后测量，如本申请的实例4和5中所述，这些枯草杆菌酶变体相比于SEQ IDNO:1包括取代X9E+X206L+X262E(根据SEQ ID NO 2进行编号)，并具有比亲本枯草杆菌酶和/或具有SEQ ID NO:1的枯草杆菌酶至少5％，如至少10％、如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％更高的残留活性。另一个优选的实施例涉及枯草杆菌酶变体，这些枯草杆菌酶变体相比于SEQ ID NO:1包括取代X9E+X206L+X262E(根据SEQ ID NO:2进行编号)，相对于亲本或相对于SEQ ID NO:1(枯草杆菌蛋白酶309)，它们具有t1/2半衰期改善因子，该t1/2半衰期改善因子大于1并优选是至少2，如至少5、如至少10、如至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少800、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500、至少5000、至少5500、至少6000、至少6500、至少7000、至少7500、至少8000、至少8500、至少9000、至少9500或至少10000或更多。t1/2半衰期改进因子的计算描述在本申请的实例4中。

另一个优选的实施例涉及枯草杆菌酶变体，这些枯草杆菌酶变体相比于SEQ IDNO:1包括取代X9E+X206L+X262E(根据SEQ ID NO:2进行编号)，其中这些枯草杆菌酶变体相比于亲本或相比于SEQ ID NO 1具有至少10％更多，如至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％残留活性。残留活性或t1/2的计算描述在本文的实例4中。

在另一个优选的实施例中，本发明涉及相比于亲本枯草杆菌酶和/或相比于具有SEQ ID NO:1的枯草杆菌酶包括三个突变X9E+X206L+X262E(根据SEQ ID NO:2进行编号)的枯草杆菌酶变体，并且它们相比于亲本枯草杆菌酶(例如相比于SEQ ID NO:1)具有在洗涤剂中的增加的稳定性，并且它相比于亲本枯草杆菌酶(例如相比于SEQ ID NO:1)具有同等或改进的洗涤性能。本发明的变体可以包括另外的稳定的和/或性能增强的突变，如N43R、G61E、N76D、S161E、G160D、G160P、S161E、N182E、N185E、S188E、A194P、N204D、V205I、Y209W、或S212G。在一个实施例中，并根据上述实施例中任一项，相比于SEQ ID NO 1，本发明的变体包括以下取代；S9E+Q206L+L262E、S9E+N76D+Q206L+L262E、S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E、S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E、S9E+N43R+N76D+Q206L+L262E、S9E+N43R+N76D+Q206L+Y209W+L262E、S9E+N76D+Q206L+Y209W+S212G+L262E、S9E+N76D+Q206L+V205I+Y209W+L262E、S9E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E、S9E+N76D+S188E+Q206L+Y209W+L262E、S9E+N76D+N185E+Q206L+Y209W+L262E、S9E+N76D+N182E+Q206L+Y209W+L262E、S9E+N76D+S161E+Q206L+Y209W+L262E、S9E+N76D+G160P+Q206L+Y209W+L262E、S9E+N76D+G160D+Q206L+Y209W+L262E；S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E或S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+L262E，其中相比于具有SEQ ID NO 1的蛋白酶,这些变体具有改进的稳定性。

根据一个实施例和/或上述实施例中任一项，本发明的枯草杆菌酶变体选自下组，该组由以下各项组成：

S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+S78H+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；

S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+L217M+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S216T+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；

S3V+S9R+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E；

S9E+N43R+I72A+N76D+Q141H+S145H+R149H+A158E+G159P+A194P+L262E；

W6L+S9E+N43R+A72I+N76D+G115W+H120V+P129D+A158E+G160P+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；

S9E+G20H+T22H+S24H+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E+*275aR；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E+*275aR；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+S256D+T260A+L262E；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E+*275aR；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+S256D+T260A+L262E；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E；

S9E+N43R+G61E+N76D+Q206L+L262E；

S9E+N43R+I72A+N76D+G115W+H120V+P129D+A158E+G160P+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；

S9E+N43R+I72A+N76D+G115W+H120V+P129D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；

S9E+N43R+I72A+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Y91H+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275bH+*275aH；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275bH*275aH；

S9E+N43R+N76D+*99aE+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aR；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E+*275aR；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+G195E+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275a R；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E+*275aR；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；

S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E；

S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+L262E

S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；

S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E；

S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194PN204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E

S9E N43R N76D N185E S188E Q191N A194P Q206L Y209W S259D L262E

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275b H；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+L262E；

S9E+G61E+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+Q206L+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+S256D+T260A+L262E+*275aH+*275b H；

S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+T260A+L262E；

S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E；

S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aR；

S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+Q206L+L262E；

S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E；

S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E+*275aH+*275b H；

S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E；

S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+G61E+N76D+Q206L+Y209W+S256D+L262E；

S9E+G61E+N76D+Q206L+S256D+L262E；

S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E；

S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N76D+Q206L+Y209W+N261W+L262E；

S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E；和

S9E+N76D+Q206L+L262E。

优选的变体包括相比于SEQ ID NO 1包含以下突变的变体(根据SEQ ID NO 2进行编号)：

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E；

S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275bH+*275aH；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH或

S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E。

这些枯草杆菌酶变体可以由150至350，例如175至330、200至310、220至300、240至290、260至280，或269、270、271、272、273、274或275个氨基酸组成。

在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体相比于亲本枯草杆菌酶具有改进的稳定性，特别是改进的洗涤稳定性。在一个优选的实施例中，该枯草杆菌酶变体相比于亲本枯草杆菌酶具有改进的稳定性，特别是改进的储存中稳定性，和同等或改进的洗涤性能。

在一个实施例中，该枯草杆菌酶变体相比于亲本枯草杆菌酶具有改进的稳定性，特别是改进的洗涤中稳定性，和同等或改进的洗涤性能，其中使用‘洗涤中稳定性测定’测量洗涤稳定性，并且使用如在实例3中描述的自动机械应力测定(AMSA)测量洗涤性能。

亲本蛋白酶

亲本或前体蛋白酶可以是任何枯草蛋白酶或如下定义的甚至更优选的任何枯草杆菌蛋白酶。

切割蛋白底物中的酰胺键的酶可被分类为蛋白酶，或(可互换地)分类为肽酶(参见沃尔什(Walsh)，1979，酶促反应机制(Enzymatic Reaction Mechanisms).W.H.弗里曼(W.H.Freeman)和孔帕尼(Company)，旧金山，第3章)。

丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解并且在活性位点处存在一个必需丝氨酸残基的酶(怀特(White)、汉德勒(Handler)和史密斯(Smith)，1973，“生物化学原理(Principles ofBiochemistry)”，第五版，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company)，纽约，第271-272页)。

细菌丝氨酸蛋白酶的分子量范围是20,000至45,000道尔顿。它们受到二异丙基氟磷酸的抑制。它们水解简单末端酯并且在活性上与同样是丝氨酸蛋白酶的真核糜蛋白酶相似。更狭义的术语，碱性蛋白酶，包括一个亚组，反映了一些丝氨酸蛋白酶从pH 9.0-11.0的高最适pH(综述参见Priest 1977Bacteriological Rev.41:711-753)。

枯草杆菌酶

斯艾森(Siezen)等人，1991，蛋白质工程(Protein Eng.)4:719-737以及斯艾森等人，1997，蛋白质科学(Protein Science)6:501-523提出了被暂时命名为枯草杆菌酶(subtilase)的一个丝氨酸蛋白酶亚组。它们是通过对先前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的170多个氨基酸序列进行同源性分析而定义的。枯草杆菌蛋白酶先前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据斯艾森(Siezen)等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定多种多样的枯草杆菌酶，并且已确定很多枯草杆菌酶的氨基酸序列。对于此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述，参见斯艾森(Siezen)等人(1997)。

枯草杆菌蛋白酶

枯草杆菌酶的一个亚组是枯草杆菌蛋白酶，它们为来自S8家族，特别是来自S8A子族的丝氨酸蛋白酶，如由MEROPS数据库(merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum？family＝S8)所定义的。

枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶309分别具有MEROPS编号S08.034和S08.003。

亲本枯草杆菌酶

术语“亲本枯草杆菌酶”描述一种根据斯艾森(Siezen)等人，1997，蛋白质科学(Protein Science)6:501-523定义的枯草杆菌酶。更详细的信息参见以上“枯草杆菌酶”的描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从自然来源中分离的枯草杆菌酶，其中在保留枯草杆菌酶特征的同时，已对其进行后续修饰(例如一条或多条氨基酸侧链的一个或多个置换，一个或多个取代、一个或多个缺失和/或一个或多个插入)。此外，亲本枯草杆菌酶可以是一种通过DNA改组技术制备的枯草杆菌酶，如由内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)，17:893-896所描述的。

可替代地，术语“亲本枯草杆菌酶”可以称为“前体枯草杆菌酶”，并且用于描述其中进行突变以获得本发明的变体的起始蛋白酶。该亲本枯草杆菌酶优选属于枯草杆菌蛋白酶亚组。

枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或“真”枯草杆菌蛋白酶，包括“标准的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN’、嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)(

诺维信公司)、以及枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。BPN’是来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’，枯草杆菌蛋白酶BPN’具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。斯艾森(Siezen)等人(见上文)识别了枯草杆菌酶的另一亚组，I-S2或强碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶，并且包括以下酶，如：枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(

杰能科国际(GenencorInternational，Inc.))、枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(

诺维信公司(Novozymes A/S))、碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)和具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的枯草杆菌蛋白酶309(

诺维信公司)。

供参考，下表1给出以上所提及的不同枯草杆菌酶的一些首字母缩略词的清单。关于另外的首字母缩略词，参见斯艾森(Siezen)等人(1991和1997)。

表1：不同枯草杆菌酶的首字母缩略词

同源枯草杆菌酶序列

两个氨基酸序列之间的同源性是在出于本发明的目的由参数“一致性”描述的背景下，两个氨基酸序列之间的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法来确定的。来自程序的结果除了氨基酸比对之外还计算两个序列之间的“百分比一致性”。

基于本描述，对于本领域的技术人员而言，鉴别可以根据本发明来修饰的适当同源枯草杆菌酶是相当简单的。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:7的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:8的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:9的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:10的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％序列一致性的多肽，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:11的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该亲本枯草杆菌酶可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是细菌蛋白酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)蛋白酶。

在一方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白酶。

这些物种的株系可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

变体的制备

本发明还涉及用于获得具有蛋白酶活性的枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括：

(a)将取代X9E+X206L+X262E引入亲本枯草杆菌酶，其中该位置对应于SEQ ID NO:2的位置，并且

(b)回收该变体。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过使用涉及包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；和巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(NucleicAcids Res.)18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，US2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可以用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；US 5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下各项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌鈣-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌醹-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。其他信号序列由西莫宁(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述。

该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。

表达载体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。

载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。在另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和卓林克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)或者共轭(参见，例如，克利威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

产生方法

本发明还涉及产生一种变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；并且(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

使用本领域已知的对具有蛋白酶活性的变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

在可替代的方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。

组合物

本发明还涉及包括本发明的枯草杆菌酶变体的组合物。在一个实施例中，该组合物是洗涤剂组合物。

另外的组分的选择处于本领域技术人员能力范围内并且包含常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的织物的类型、污渍的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。

在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括本发明的枯草杆菌酶变体以及一种或多种洗涤剂组分，例如表面活性剂、助水溶剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、抗氧化剂、以及增溶剂。

在本发明的一个实施例中，可以将本发明的枯草杆菌酶变体以对应于以下的量添加至洗涤剂组合物中：0.01-200mg酶蛋白/升洗涤液，优选0.05-50mg酶蛋白/升洗涤液，特别是0.1-10mg酶蛋白/升洗涤液。

用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-30％，例如0.01％-20％，例如0.5％-15％的酶蛋白。

用于在洗衣造粒(laundry granulation)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。

用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。

可以使用常规的稳定剂来稳定酶，如本发明的枯草杆菌酶变体，这些稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物，或者如在WO2005/105826和WO 2009/118375中所述的可使用肽醛或酮对根据本发明的变体进行稳定。

本发明的变体还可以掺入到WO 97/07202(通过引用结合在此)中所披露的洗涤剂配制品中。

本发明的枯草杆菌酶变体可以配制在液体洗衣组合物(如液体洗衣组合物)中，该组合物包括：

a)每升洗涤剂至少0.01mg的活性枯草杆菌酶变体，

b)2wt％至60wt％的至少一种表面活性剂

c)5wt％至50wt％的至少一种助洗剂

该洗涤剂组合物可以配制在用于衣物洗涤的颗粒洗涤剂中。

此类洗涤剂可以包括：

a)每克的组合物至少0.01mg的活性蛋白酶变体

b)阴离子表面活性剂，优选地5wt％至50wt％

c)非离子表面活性剂，优选地1wt％至8wt％

d)助洗剂，优选地5wt％至40wt％以及优选地如碳酸盐、沸石、磷酸盐助洗剂、钙螯合剂助洗剂或络合剂

尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被本领域技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。

表面活性剂

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。典型地，表面活性剂按重量计以从大约0.1％至60％，如大约1％至大约40％、或大约3％至大约20％、或大约3％至大约10％的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。表面活性剂降低洗涤剂中的表面张力，这使得清洁的污渍被提起并分散，并且然后洗去。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES、也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)(例如烷基二甲基氧化胺)、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。

助洗剂和共助洗剂

洗涤剂组合物可以包含按重量计大约0-65％，如大约5％至大约45％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂，或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化洗涤水。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性络合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。

洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-20％，例如约5％至约10％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或结合助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 2009/102854和US 5,977,053中。

本发明的枯草杆菌酶变体也可以配制在餐具洗涤组合物中，优选是自动餐具洗涤组合物(ADW)，该组合物包括：

a)至少0.01mg的根据本发明的活性蛋白酶变体，和

b)10wt％-50wt％助洗剂，优选地选自以下各项：柠檬酸、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物，和

c)至少一种漂白组分。

漂白系统

所述洗涤剂可以包含按重量计0-50％，如约0.1％至约25％的漂白系统。漂白系统通常通过氧化去除褪色并且许多漂白剂还具有强杀细菌特性，并且用于消毒和灭菌。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过亚氨酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。因此形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。该漂白系统还可以包括过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。该漂白系统还可以包括漂白催化剂或增效剂。

可用于本发明组合物中的漂白催化剂的一些非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰胶原、钴-胺催化剂和锰三氮杂环壬烷(MnTACN)催化剂；特别优选锰与1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me4-TACN)的络合物，具体地是Me3-TACN，如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2、和[2,2',2”-次氮基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亚基-κN-甲亚基)三酚并-κ3O]锰(III)。漂白催化剂也可以是其他金属化合物，如铁或钴络合物。

在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：

(iii)及其混合物；其中每个R¹独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R¹独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R¹独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。

助水溶物

助水溶物是溶解水溶液中的疏水化合物(或相反地，非极性环境中的极性物质)的化合物。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)2007的综述，胶体&界面科学新见(Current Opinion in Colloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集并且脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶剂显示连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂和聚合物的混合物)的相行为、稳定性和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。

洗涤剂可以包括按重量计0％-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

聚合物

洗涤剂可以包含按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

织物调色剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当该织物与一种洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包括该洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变该织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如描述于WO 2005/003274、WO 2005/003275、WO 2005/003276以及EP 1876226(通过引用而特此结合)中。该洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。

另外的酶

洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种(另外的)酶，如淀粉酶、阿拉伯糖酶、碳水化合物分解酶、纤维素酶(例如内切葡聚糖酶)、角质酶、半乳聚糖酶、卤代加过氧酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、氧化酶(例如漆酶和/或过氧化物酶)、果胶酶、果胶裂解酶、蛋白酶、木聚糖酶、黄原胶酶、和木葡聚糖酶。

一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶

适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。

尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例为在EP 495257、EP 531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO94/07998、EP 531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描述的那些。

显示内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纤维素酶(EC 3.2.1.4)的实例描述于WO 02/99091中。

纤维素酶的其他实例包括描述于WO 96/29397中的家族45纤维素酶，并且特别是在对应于WO 02/99091的SEQ ID NO:8中的以下位置的一个或多个位置处具有取代、插入和/或缺失的其变体：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，优选选自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM、和Carezyme^TM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Clazinase^TM、和Puradax HA^TM(杰能科国际有限公司(Genencor InternationalInc.))、以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(Kao Corporation))。

蛋白酶

该组合物可以包括一种或多种另外的蛋白酶，这些蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源，例如植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。

金属蛋白酶的实例是如描述于WO 2007/044993(杰能科国际公司(GenencorInt.))中的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。

适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：

Duralase^Tm、Durazym^Tm、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

以及

(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些：

Purafect

Purafect

Purafect

Purafect

以及

(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^TM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

脂肪酶和角质酶

适合的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如，如描述于EP 258068和EP305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 2010/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 2010/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 2011/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 2011/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO2011/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 2011/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 2012/137147)。

其他实例是例如EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO01/92502、WO 2007/87508以及WO 2009/109500中所描述的那些脂肪酶变体。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO2010/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 2005/056782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 2009/067279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 2010/100028)。

淀粉酶

可以与本发明的枯草杆菌酶变体一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/19467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/10355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

其他适合的淀粉酶是具有WO 99/19467中的SEQ ID NO:6的序列的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/23873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列一致性的变体。使用WO96/23873的SEQ ID 2进行编号，SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO 2008/153815中的SEQ ID NO:2、WO01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 2008/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的合适的淀粉酶是具有WO 2009/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ IDNO:2具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在一个或多个以下位置中具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，

其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

另外的合适的淀粉酶是具有WO 2013/184577的SEQ ID NO:1的淀粉酶或与SEQ IDNO:1具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选变体是在以下位置：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K和G477K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R178和/或S179或T180和/或G181处具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体包括以下取代：

E187P+I203Y+G476K

E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K

并任选地进一步包括在位置241的取代和/或在位置178和/或位置179的缺失。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 2010/104675中的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQ ID NO:1具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128、K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。

SEQ ID NO:1的更优选变体是以下位置：N21D、D97N、V128I、K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K和G478K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体包括取代N21D+D97N+V128I，并任选地进一步包括在位置200的取代和/或在位置180和/或位置181的缺失。

其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。

其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO2013/001087中的那些淀粉酶变体。可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、特妙淀粉酶^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme ^TM、Stainzyme Plus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X及BAN^TM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase、Preferenz S1000、Preferenz S100及Preferenz S110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。

过氧化物酶/氧化酶

适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。

可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(诺维信公司)。

可以通过添加包含一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等，优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。

非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇包含从12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制品可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238216中披露的方法来制备。

辅料

还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。

分散剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉末洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉末洗涤剂，表面活性剂科学系列(Surfactant Science Series)，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker)。

染料转移抑制剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。

荧光增白剂：本发明的洗涤剂组合物将优选地还包含另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约05％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙胺基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐以及2-(芪基(stilbyl)-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。适合的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

污物释放聚合物：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉布和基于聚酯的织物)移除污物，特别是从基于聚酯的织物移除疏水性污物。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉末洗涤剂(Powdered Detergents)，表面活性剂科学系列(Surfactant science series)第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 03/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。

其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产品的配制

本发明的洗涤剂组合物可以处于任何合宜的形式，例如，棒、均质片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个隔室的小袋、常规或压型粉末、颗粒、糊剂、凝胶或常规、压型或浓缩液体。存在多种洗涤剂配制品形式，例如层(相同或不同相)、袋以及用于机械给料装置的形式。

可以将小袋配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。该内部体积可以被分成小袋的区室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。

优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Indiana,US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体洗衣洗涤剂组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包含固体的室不同。参见例如US 2009/0011970。

可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

洗衣皂条

本发明的酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随着时间显著变化的物理形式，即如果将固体物体(例如洗衣皂条)放置于容器内部，该固体物体不发生改变来填充它被放置于其中的容器。该条是典型地呈条形式但是可以呈其他固体形状，如圆形或卵形的一种固体。

该衣物肥皂棒可以包含一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酸基本硼酸、一个或多个肥皂或合成的表面活性剂、多元醇例如甘油、pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na⁺、K⁺或NH₄ ⁺并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，因此该一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。

洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污垢释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。

洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在工艺的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。

颗粒洗涤剂配制品

可以如WO 2009/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 2007/001262、US 6,472,364、WO 2004/074419或WO 2009/102854中所描述的制备颗粒洗涤剂。其他洗涤剂配制品描述于WO 2009/124162、WO 2009/124163、WO2009/117340、WO 2009/117341、WO 2009/117342、WO 2009/072069、WO2009/063355、WO 2009/132870、WO 2009/121757、WO 2009/112296、WO2009/112298、WO 2009/103822、WO 2009/087033、WO 2009/050026、WO2009/047125、WO 2009/047126、WO 2009/047127、WO 2009/047128、WO2009/021784、WO 2009/010375、WO 2009/000605、WO 2009/122125、WO2009/095645、WO 2009/040544、WO 2009/040545、WO 2009/024780、WO2009/004295、WO 2009/004294、WO 2009/121725、WO 2009/115391、WO2009/115392、WO 2009/074398、WO 2009/074403、WO 2009/068501、WO2009/065770、WO 2009/021813、WO 2009/030632、WO 2009/015951、WO2011/025615、WO 2011/016958、WO 2011/005803、WO 2011/005623、WO2011/005730、WO 2011/005844、WO 2011/005904、WO 2011/005630、WO2011/005830、WO 2011/005912、WO 2011/005905、WO 2011/005910、WO2011/005813、WO 2010/135238、WO 2010/120863、WO 2010/108002、WO2010/111365、WO 2010/108000、WO 2010/107635、WO 2010/090915、WO2010/033976、WO 2010/033746、WO 2010/033747、WO 2010/033897、WO2010/033979、WO 2010/030540、WO 2010/030541、WO 2010/030539、WO2010/024467、WO 2010/024469、WO 2010/024470、WO 2010/025161、WO2010/014395、WO 2010/044905、WO 2010/145887、WO 2010/142503、WO2010/122051、WO 2010/102861、WO 2010/099997、WO 2010/084039、WO2010/076292、WO 2010/069742、WO 2010/069718、WO 2010/069957、WO2010/057784、WO 2010/054986、WO 2010/018043、WO 2010/003783、WO2010/003792、WO 2011/023716、WO 2010/142539、WO 2010/118959、WO2010/115813、WO 2010/105942、WO 2010/105961、WO 2010/105962、WO2010/094356、WO 2010/084203、WO 2010/078979、WO 2010/072456、WO2010/069905、WO 2010/076165、WO 2010/072603、WO 2010/066486、WO2010/066631、WO 2010/066632、WO 2010/063689、WO 2010/060821、WO2010/049187、WO 2010/031607、和WO 2010/000636。

用途

本发明还针对根据本发明的枯草杆菌酶变体或其组合物在纺织品和织物洗涤中的使用方法，如家用衣物洗涤以及工业衣物洗涤。

本发明还针对在清洁硬表面例如地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)中使用根据本发明的变体或其组合物的方法。

可以将本发明的枯草杆菌蛋白酶变体添加至洗涤剂组合物中，并由此成为洗涤剂组合物的组分。因此，本发明的一个方面涉及枯草杆菌酶变体在清洁过程如衣物洗涤和/或硬表面清洁中的用途。

本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。

在一个特定的方面，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括如在此描述的本发明的多肽。

清洁过程或者纺织品护理过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用洗衣，但是它也可以是工业洗衣。此外，本发明涉及一种用于洗涤织物和/或服装的方法，其中该方法包括用包含洗涤剂组合物和至少一种本发明的蛋白酶变体的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以例如是包含洗涤剂组合物的水洗溶液。

最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学产品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物相比时类似或改进的洗涤性能。

本发明进一步涉及本发明的枯草杆菌酶变体在蛋白质污渍去除过程中的用途。蛋白质污渍可能是如食品污渍等污渍，如婴儿食品、皮脂、可可、鸡蛋、血液、牛奶、墨水、草、或其组合。

洗涤方法

本发明涉及一种使用包括本发明的蛋白酶变体的洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。

优选实施例涉及清洁方法，该方法包括在适合于清洁物体的条件下将该物体与包括本发明的蛋白酶变体的洗涤剂组合物接触的步骤。在优选实施例中，该洗涤剂组合物用于洗衣或餐具洗涤过程中。

仍另一个实施例涉及用于从织物或餐具上除去污渍的方法，该方法包括在适合于清洁该物体的条件下将该织物或餐具与包括本发明的蛋白酶的组合物接触。

还考虑了使用一种或多种本发明的蛋白酶处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。可以任何织物处理方法使用蛋白酶，这些方法在本领域是熟知的(参见，例如，US6,077,316)。例如，在一方面，通过一种方法改进织物的触感和外观，该方法包括将该织物与溶液中的蛋白酶接触。在一方面，在压力下用该溶液处理该织物。

本发明的洗涤剂组合物适合用于在洗衣和硬表面应用(包括餐具洗涤)中使用。因此，本发明包括用于清洗织物或洗涤餐具的方法。该方法包括使有待清洁的织物/餐具与包括根据本发明的洗涤剂组合物的溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。餐具可以包括任何餐具，例如陶器、用餐工具、陶瓷、塑料(例如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。该溶液优选具有从约5.5至约11.5的pH。可在溶液中按以下浓度使用组合物：从约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温范围典型地是从约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃和约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。

可以使用常规稳定剂和蛋白酶抑制剂来稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、不同的盐(例如NaCl、KCl)、乳酸、甲酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))、或肽醛(如二肽醛、三肽醛或四肽醛或醛类似物)(或者具有形式B1-B0-R，其中R是H、CH3、CX3、CHX2、或CH2X(X＝卤素)，B0是单个氨基酸残基(优选地具有一个任选取代的脂肪族或芳香族侧链)；并且B1由一个或多个氨基酸残基组成(优选一个、两个或三个)，任选地包括一个N-末端保护基团，或者如描述于WO2009/118375、WO 98/13459中的)或者蛋白类型的蛋白酶抑制剂，例如RASI、BASI、WASI(水稻、大麦和小麦的双功能α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂)或CI2或SSI。可以如在例如WO 92/19709、WO 92/19708和US6,472,364中描述的配制该组合物。在一些实施例中，在此利用的这些酶由存在于为这些酶提供此类离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，连同其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))稳定化。

在一些优选实施例中，在此提供的这些洗涤剂组合物被典型地这样配制，使得用于水性清洁操作过程中，洗涤水具有以下pH：从约5.0至约11.5，或在替代实施例中，甚至从约6.0至约10.5。在一些优选实施例中，颗粒或液体洗衣产品被配制成具有从约6至约8的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

材料和方法

Suc-AAPF-pNA活性测定

蛋白水解活性可以通过采用Suc-AAPF-PNA作为底物的方法来确定。Suc-AAPF-PNA是N-琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且是可以通过内切蛋白酶切割的一种封闭肽。

在切割后，一个游离PNA分子被释放出来，其具有黄色颜色并且因此可以通过可见光分光光度法在波长405nm进行测量。Suc-AAPF-PNA底物是通过巴亨(Bachem)(目录号L1400，溶解在DMSO中)制造。

待分析的蛋白酶样品被稀释在残余活性缓冲液中(100mM Tris pH8.6)。通过转移30μl的稀释的酶样品至96孔微量滴定板并添加70μl底物工作溶液(0.72mg/ml于100mMTris pH 8.6中)进行该测定。将该溶液在室温混合并且在OD 405nm经5分钟每20秒测量吸收。

在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的蛋白酶的活性成正比例。将蛋白酶样品稀释至其中斜率为线性的水平。

实例1：枯草杆菌蛋白酶309变体的制备和表达

下面总结了突变和表达盒到枯草芽孢杆菌的引入。所有DNA操纵是通过PCR(例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人；分子克隆(Molecular Cloning)；冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press))进行。

使用编码枯草杆菌蛋白酶309变体的重组枯草杆菌构建体来接种包含富营养培养基(例如，100g/L蔗糖(丹尼斯克目录号109-0429)、40g/L大豆壳(大豆粉)、10g/LNa₂HPO₄.12H₂O(默克(Merck)目录号6579)、0.1ml/L替换-Dowfax63N10(陶氏化学(Dow))的摇瓶。典型地在30℃下在220rpm的振摇下进行4天的培养。

实例2：枯草杆菌蛋白酶309变体的纯化

将培养液在26000x g离心20分钟，并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余芽孢杆菌宿主细胞。用3M Tris碱将0.2μm滤液中的pH调节至pH 8，并将经pH调节的滤液施加至在20mM Tris/HCl、1mM CaCl₂(pH 8.0)中平衡的MEP Hypercel柱(颇尔公司(Pall Corporation))上。将柱用平衡缓冲液洗涤后，将该柱用20mM CH₃COOH/NaOH、1mM CaCl₂(pH 4.5)逐步洗脱。使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定法将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析，并且合并峰级分。将来自该MEPHypercel柱的合并物的pH用20％(v/v)CH₃COOH或3M Tris碱调节至pH 6，并且将经pH调节的合并物用去离子水稀释至与20mM MES/NaOH、2mM CaCl₂(pH 6.0)相同的电导率。将经稀释的合并物施加至在20mM MES/NaOH、2mM CaCl₂，pH 6.0中平衡的

快速流动柱(GE医疗公司(GE Healthcare))上。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将蛋白酶变体用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)经五个柱体积进行洗脱。使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定法将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析，并且通过SDS-PAGE对活性级分进行分析。将级分(在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上的仅观察到一条带)合并为纯化的制剂并且用于另外的实验。

实例3：枯草杆菌蛋白酶309变体的洗涤性能

使用自动机械应力测定(AMSA)评定在衣物洗涤中的枯草杆菌蛋白酶309变体的洗涤性能，其中可以检査许多小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽，以及盖子，该盖子将待洗涤的纺织品对槽开口强力挤压。在洗涤期间，将平板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性振荡方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。

在表2中指定的实验条件下进行衣物洗涤实验。

表2

洗涤剂剂量	2.0g/L
		测试溶液体积	160μL(20μL酶+140μL洗涤剂)
pH	8.4
		洗涤时间	20分钟
温度	20℃
		水硬度	12°dH

标准洗涤剂和测试材料描述在表3中：

表3：标准洗涤剂和测试材料的组成

测试材料获得自测试材料BV中心(Center For Testmaterials BV)，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。

通过将CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺＝2:1:4.5)添加到测试系统中将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。

将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表示为在白光照射样品时从样品反射的光的强度。当样品被沾污时，反射光的强度低于干净样品。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。

使用柯达智能平板扫描仪(Kodak iQsmart flatbed scanner)(Kodak,Midtager29,DK-2605

丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。

为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)值。可以通过将RGB值作为向量相加并随后考虑所得向量的长度计算强度值(Int)：

结果示于表4中。结果作为与枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:1)相比的相对性能和两种不同小块布样的两种酶浓度30和60nM的平均值给出。与枯草杆菌蛋白酶309(SEQ IDNO:1)相比，低于0.8的RP值被认为更差，0.8-1.2被认为是同等，1.2或更高被认为更好。

表4：相比于枯草杆菌蛋白酶309，变体的AMSA相对性能

实例4：加速储存稳定性测定

在60℃下孵育长达48小时的情况下，使用加速测定评估蛋白酶变体在液体洗涤剂中的储存稳定性。

使用0.01％Triton X-100将包含25-75μg/ml活性蛋白酶的培养上清液稀释1、2、4和8倍。对于每个变体，包括具有每个稀释度的2个孔。使用磁棒(在Zephyr移液台(CaliperLifeSciences公司)上持续30min)，将30μl稀释的蛋白酶样品与270μl标准O洗涤剂在微量滴定板(Nunc U96PP 0.5ml)的孔中混合。然后将20μl的这种混合物转移至另一个微量滴定板(加有磁棒的Nunc U96PP 0.5ml)中，并且与80μl 100mM Tris(pH 8.6)混合(在Zephyr上至少5min)。将30μl的这种稀释液转移至Nunc F 96-MTP中，并且在添加70μl底物溶液后，通过每20sec在405nm下测量吸光度持续5min来确定非应激样品的初始活性(在SpectraMaxPlus上)。在密封后，将洗涤剂板在艾本德恒温混匀仪(Eppendorf Thermomixer)中在60℃下进行孵育(未振荡)。在1、4、23和47小时孵育后，抽取20μl样品，并且像初始非应激活性一样，测量应激样品的残余活性。

在用洗涤剂孵育过程中的活性下降被假定为指数式的。从Log(活性)对孵育时间(0、1、4、23和47小时)的线性回归发现半衰期(T1/2)，并且将半衰期改进因子(T1/2IF)计算为相对于SEQ ID NO:1的半衰期的蛋白酶变体的半衰期。这意指Savinase(枯草杆菌蛋白酶309)的T1/2是1。

表5.洗涤剂的组合物

表6在标准O中的加速储存稳定性结果。T1/2IF：相对于枯草杆菌蛋白酶309或枯草杆菌蛋白酶309+N76D参考的半衰期改进因子

实例5：加速储存稳定性测定

在60℃下孵育长达48小时的情况下在CNS(中国国家标准)洗涤剂中，使用加速测定评估蛋白酶变体在液体洗涤剂中的储存稳定性。否则，在与实例4相同的条件下进行实验。

表7洗涤剂的组成

在此实验中，在CNS(中国国家标准)中测试稳定性，并且表8中的结果表示为T1/2IF：如实例4所述相对于枯草杆菌蛋白酶309或枯草杆菌蛋白酶309+N76D的半衰期改进因子。

1：T1/2 IF>1000；

2：500≤T1/2 IF≤1000；

3：50≤T1/2 IF<500。

表8：加速储存稳定性结果在CNS中，A栏＝相对于枯草杆菌蛋白酶309+N76D的T1/2IF，B栏＝相对于枯草杆菌蛋白酶309的T1/2 IF。

实例6：枯草杆菌蛋白酶309变体sp.的AMSA洗涤性能

使用自动机械应力测定(AMSA)，使用液体衣物洗涤剂测试枯草杆菌蛋白酶309变体对三种不同的技术污渍的洗涤性能。

通过AMSA，可以检査许多小体积酶洗涤剂溶液在衣物洗涤中的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽，以及盖子，该盖子将待洗涤的纺织品对槽开口强力挤压。在洗涤期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是在第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。

表9：标准洗涤剂和测试材料如下：

测试材料从EMPA试验材料AG(EMPA Testmaterials AG，

12，CH-9015St.Gallen，瑞士)，从测试材料BV中心(Center For Testmaterials BV，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰)获得。

将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。

使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart，柯达(Kodak)，Midtager 29，DK-2605

使用单循环洗涤程序，用描述于表10中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表10中所指定。

表10：用于衣物洗涤实验的实验条件

通过将CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:CO₃ ^-＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。

表11：在20℃下与具有枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO 1)的洗涤剂相比，枯草杆菌蛋白酶309变体的相对性能

表11的结果示出，在20℃下在巧克力/牛奶上(PC-03，C-03)，相比于枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶309变体具有改进的或同等性能的洗涤性能。

表12：在20℃下在EMPA117EH上在棉/聚酯污渍上的血液/牛奶/油墨上，与具有枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO 1)的洗涤剂相比，来自芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶309变体的蛋白酶的相对性能。

表12的结果示出，在20℃下额外加热的在EMPA117EH，在棉布/聚酯上的血液/牛奶/墨水上，相比于枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶309变体具有改进的或同等性能的洗涤性能。

实例7：在微型洗涤中的枯草杆菌蛋白酶309变体的测试

使用微型洗涤系统，使用洗衣液洗涤剂在一种技术污渍上测试来自芽孢杆菌属的蛋白酶的洗涤性能。

微型洗涤测定是如下测试方法，其中污染的纺织品被连续地提起放进测试溶液中并且随后冲洗。

表13：在以下指定的实验条件下进行洗涤实验：

测试材料获得自EMPA试验材料AG(EMPA Testmaterials AG

12,CH-9015圣加仑州(St.Gallen)，瑞士)。

随后将纺织品风干并且将洗涤性能测量为这些纺织品的颜色的亮度。还可以将亮度表示为反射比(R)，反射比是当用白光照射时，从测试材料反射或发射的光的量度。使用Zeiss MCS 521VIS分光光度计在460nm处测量纺织品的反射比(R)。根据制造商的方案进行测量。

通过取得来自用酶洗涤的小块布样的测量值并且与来自未用酶洗涤的小块布样的测量值相减来计算针对每种污渍的酶效果，ΔRem_酶。

如在微型洗涤测定中针对衣物洗涤方法所描述的，用描述于表13中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表14中所指定。

表14：用于微型洗涤衣物洗涤实验的实验条件

通过将CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:CO₃ ^-＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至8.4°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。

表15：在25℃下与具有枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO 1)的洗涤剂相比，来自芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶309变体的蛋白酶的相对性能

表15的结果示出，在25℃下在血液/牛奶/墨水上，相比于枯草杆菌蛋白酶309(SEQID NO 1)，枯草杆菌蛋白酶309变体示出改进的或同等的洗涤性能。

实例8：加速储存稳定性测定

在58℃，pH 9下孵育长达48小时的情况下，在CNS(中国国家标准)洗涤剂中，使用加速测定评估蛋白酶变体在液体洗涤剂中的储存稳定性。

否则，在与实例4和5相同的条件下进行实验。

表16中的结果表示为T1/2IF：如实例4所述的相对于枯草杆菌蛋白酶309(SEQ IDNO 1)的半衰期改进因子。

1：T1/2IF>1000；

2：500≤T1/2IF≤1000；

3：50≤T1/2IF<500。

表16：加速储存稳定性结果在CNS中，相对于枯草杆菌蛋白酶309。

序列表

<110> 诺维信公司(Novozymes A/S)

<120> 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸

<130> 12912-WO-PCT

<160> 11

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 269

<212> PRT

<213> 迟缓芽孢杆菌

<400> 1

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 2

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140

Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190

Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

225 230 235 240

Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255

Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270

Ala Ala Gln

275

<210> 3

<211> 275

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌168

<400> 3

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ser Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ser Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Thr Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser

130 135 140

Ser Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly

145 150 155 160

Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala

180 185 190

Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr

225 230 235 240

Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr

245 250 255

Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270

Ala Ala Gln

275

<210> 4

<211> 274

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌DY

<400> 4

Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val

1 5 10 15

Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Gly Ile Ile Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ala Ala Ser His Thr Asp Leu Lys Val Val Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Phe Val Ser Gly Glu Ser Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly

50 55 60

Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val

65 70 75 80

Leu Gly Val Ala Pro Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asn

85 90 95

Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp

100 105 110

Ala Thr Gln Asn Gly Leu Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro

115 120 125

Ser Gly Ser Thr Ala Leu Lys Gln Ala Val Asp Lys Ala Tyr Ala Ser

130 135 140

Gly Ile Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Ser

145 150 155 160

Gln Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val

165 170 175

Gly Ala Val Asp Ser Asn Lys Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly

180 185 190

Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Val Ser Val Tyr Ser Thr Tyr

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Tyr Thr Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro

210 215 220

His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Tyr Pro Thr Leu

225 230 235 240

Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Asn Leu

245 250 255

Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala

260 265 270

Ala Gln

<210> 5

<211> 274

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 5

Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val

1 5 10 15

Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly

50 55 60

Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val

65 70 75 80

Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn

85 90 95

Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp

100 105 110

Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro

115 120 125

Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg

130 135 140

Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn

145 150 155 160

Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val

165 170 175

Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly

180 185 190

Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr

195 200 205

Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro

210 215 220

His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu

225 230 235 240

Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu

245 250 255

Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala

260 265 270

Ala Gln

<210> 6

<211> 268

<212> PRT

<213> 迟缓芽孢杆菌

<400> 6

Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Ser Phe Ile Asn Thr Gln Gln Ala His

1 5 10 15

Asn Arg Gly Ile Phe Gly Asn Gly Ala Arg Val Ala Val Leu Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Ala Ser His Pro Asp Leu Arg Ile Ala Gly Gly Ala Ser Phe

35 40 45

Ile Ser Ser Glu Pro Ser Tyr His Asp Asn Asn Gly His Gly Thr His

50 55 60

Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly

65 70 75 80

Val Arg Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Leu Lys Val Leu Asp Arg Asn

85 90 95

Gly Ser Gly Ser Leu Ala Ser Val Ala Gln Gly Ile Glu Trp Ala Ile

100 105 110

Asn Asn Asn Met His Ile Ile Asn Met Ser Leu Gly Ser Thr Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Arg Ala Asn Asn Ala Gly Ile

130 135 140

Leu Leu Val Gly Ala Ala Gly Asn Thr Gly Arg Gln Gly Val Asn Tyr

145 150 155 160

Pro Ala Arg Tyr Ser Gly Val Met Ala Val Ala Ala Val Asp Gln Asn

165 170 175

Gly Gln Arg Ala Ser Phe Ser Thr Tyr Gly Pro Glu Ile Glu Ile Ser

180 185 190

Ala Pro Gly Val Asn Val Asn Ser Thr Tyr Thr Gly Asn Arg Tyr Val

195 200 205

Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala

210 215 220

Ala Leu Val Lys Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Thr Asn Asn Gln Ile Arg

225 230 235 240

Gln Arg Ile Asn Gln Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Leu Tyr

245 250 255

Gly Asn Gly Leu Val His Ala Gly Arg Ala Thr Gln

260 265

<210> 7

<211> 269

<212> PRT

<213> 嗜碱芽孢杆菌PB92

<400> 7

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 8

<211> 268

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌YaB

<400> 8

Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Asn Arg Val Gln Ala Pro Ile Ala Gln

1 5 10 15

Ser Arg Gly Phe Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Ser Asn His Ala Asp Leu Arg Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe

35 40 45

Val Pro Gly Glu Pro Asn Ile Ser Asp Gly Asn Gly His Gly Thr Gln

50 55 60

Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly

65 70 75 80

Val Ala Pro Asn Val Asp Leu Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Ala Ser

85 90 95

Gly Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Ala Ala

100 105 110

Asn Asn Gly Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Ser Ala Gly

115 120 125

Ser Ala Thr Met Glu Gln Ala Val Asn Gln Ala Thr Ala Ser Gly Val

130 135 140

Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Asn Val Gly Phe

145 150 155 160

Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn

165 170 175

Asn Asn Arg Ala Thr Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val

180 185 190

Ala Pro Gly Val Gly Val Gln Ser Thr Val Pro Gly Asn Gly Tyr Ala

195 200 205

Ser Phe Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala

210 215 220

Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg

225 230 235 240

Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Asn Leu Gly Asn Thr Thr Gln Phe

245 250 255

Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 9

<211> 272

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属NKS-21

<400> 9

Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Pro Tyr Ile Tyr Ser Asp Val Val His

1 5 10 15

Arg Gln Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr

20 25 30

Gly Val Ala Pro His Pro Asp Leu His Ile Arg Gly Gly Val Ser Phe

35 40 45

Ile Ser Thr Glu Asn Thr Tyr Val Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His

50 55 60

Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Tyr Gly Val Leu Gly

65 70 75 80

Val Ala Pro Gly Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Arg Asn

85 90 95

Gly Ser Gly Ser His Ala Ser Ile Ala Gln Gly Ile Glu Trp Ala Met

100 105 110

Asn Asn Gly Met Asp Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Pro Ser Gly

115 120 125

Ser Thr Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asp Arg Ala Arg Asn Ala Gly Val

130 135 140

Leu Leu Ile Gly Ala Ala Gly Asn Ser Gly Gln Gln Gly Gly Ser Asn

145 150 155 160

Asn Met Gly Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Ser Val Met Ala Val Gly Ala

165 170 175

Val Asp Gln Asn Gly Asn Arg Ala Asn Phe Ser Ser Tyr Gly Ser Glu

180 185 190

Leu Glu Ile Met Ala Pro Gly Val Asn Ile Asn Ser Thr Tyr Leu Asn

195 200 205

Asn Gly Tyr Arg Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val

210 215 220

Ala Gly Val Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys His Pro His Leu Thr Ala

225 230 235 240

Ala Gln Ile Arg Asn Arg Met Asn Gln Thr Ala Ile Pro Leu Gly Asn

245 250 255

Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Gly Leu Val Asp Ala Glu Tyr Ala Ala Gln

260 265 270

<210> 10

<211> 269

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属G-825-6

<400> 10

Asn Gln Val Thr Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Ala

1 5 10 15

Trp Thr Arg Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Val Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Val

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Asn Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Thr

100 105 110

Ala Gln Asn Asn Ile His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Val

115 120 125

Gly Ser Gln Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Gln Ala Thr Asn Ala Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Leu Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Leu Asn Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Thr Gln Ile

225 230 235 240

Arg Gln His Leu Thr Ser Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asn Ser Asn Gln

245 250 255

Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 11

<211> 279

<212> PRT

<213> 普通高温放线菌

<400> 11

Tyr Thr Pro Asn Asp Pro Tyr Phe Ser Ser Arg Gln Tyr Gly Pro Gln

1 5 10 15

Lys Ile Gln Ala Pro Gln Ala Trp Asp Ile Ala Glu Gly Ser Gly Ala

20 25 30

Lys Ile Ala Ile Val Asp Thr Gly Val Gln Ser Asn His Pro Asp Leu

35 40 45

Ala Gly Lys Val Val Gly Gly Trp Asp Phe Val Asp Asn Asp Ser Thr

50 55 60

Pro Gln Asn Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Ile Ala Ala

65 70 75 80

Ala Val Thr Asn Asn Ser Thr Gly Ile Ala Gly Thr Ala Pro Lys Ala

85 90 95

Ser Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Asn Ser Gly Ser Gly Thr Trp

100 105 110

Thr Ala Val Ala Asn Gly Ile Thr Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala Lys

115 120 125

Val Ile Ser Leu Ser Leu Gly Gly Thr Val Gly Asn Ser Gly Leu Gln

130 135 140

Gln Ala Val Asn Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ser Val Val Val Ala Ala

145 150 155 160

Ala Gly Asn Ala Gly Asn Thr Ala Pro Asn Tyr Pro Ala Tyr Tyr Ser

165 170 175

Asn Ala Ile Ala Val Ala Ser Thr Asp Gln Asn Asp Asn Lys Ser Ser

180 185 190

Phe Ser Thr Tyr Gly Ser Val Val Asp Val Ala Ala Pro Gly Ser Trp

195 200 205

Ile Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Ser Leu Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala Gly Leu Leu Ala Ser

225 230 235 240

Gln Gly Arg Ser Ala Ser Asn Ile Arg Ala Ala Ile Glu Asn Thr Ala

245 250 255

Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Ala Lys Gly Arg Val Asn

260 265 270

Ala Tyr Lys Ala Val Gln Tyr

275

Claims

1.一种枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体包括取代S9E+Q206L+L262E，其中

(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置；

(b)该变体具有蛋白酶活性；

(c)该变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少93％但小于100％序列一致性；和

d)与具有SEQ ID NO:1的枯草杆菌酶相比，该变体在液体洗涤剂中具有改进的储存稳定性。

2.如权利要求1所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少95％但小于100％序列一致性。

3.如权利要求1或2所述的变体，该变体进一步包括X76D。

4.如权利要求1-3中任一项所述的变体，该变体进一步包括选自下组的一个或多个改变，该组由以下各项组成：X3T、X4I、X15T、X24G、X24R、X27R、*36D、X43A、X43C、X43L、X43R、X43W、X68A、X72A、X72V,X78D、X87R、X87S、*97E、X98S、X99A、X99D、X99A、X99D、X99E、X99G、*99D、X101D、X101E、X101G、X101I、X101K、X101L、X101M、X101N、X101R、X103A、X104F、X104I、X104N、X104Y、X106A、X114V、X115T、X115W、X118R、X118V、X120D、X120I、X120N、X120T、X120V、X123S、X128A、X128L、X128S、X129D、X129N、X129Q、X130A、X147W、X149C、X149N、X158E、X160D、X160P、X161C、X161E、X162L、X163A、X163D、X167A、X170S、X182C、X182E、X185C、X185E、X188C、X188D、X188E、X191N、X194P、X195E、X199M、X204D、X204V、X205I、X209W、X212A、X212D、X212G、X212N、X216I、X216T、X216V、X217C、X217D、X217E、X217M、X217Q、X217Y、X218D、X218E、X218T、X222C、X222R、X222S、X225A、X232V、X235L、X236H、X245K、X245R、X252K、X255C、X255E、X256A、X256C、X256D、X256V、X256Y、X259D、X260E、X260P、X261C、X261E、X261F、X261L、X261M、X261V、X261W、X261Y和X274A，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。

5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，其是SEQ ID NO:1的变体，该变体包括选自下组的一组改变或由其组成，该组有以下各项组成：

S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+S78H+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；

S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+L217M+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S216T+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E；

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E；

S9E+N43R+G61E+N76D+Q206L+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+*99aE+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E+*275aR；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+G195E+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N43R+N76D+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275a R；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+L262E

S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；

S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E；

S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194PN204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；

S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E

S9E N43R N76D N185E S188E Q191N A194P Q206L Y209W S259D L262E

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275bH+*275aH

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275b H；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+L262E；

S9E+G61E+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+Q206L+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+S256D+T260A+L262E+*275aH+*275b H；

S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+T260A+L262E；

S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E；

S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aR；

S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+Q206L+L262E；

S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E；

S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E+*275aH+*275b H；

S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E；

S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+G61E+N76D+Q206L+Y209W+S256D+L262E；

S9E+G61E+N76D+Q206L+S256D+L262E；

S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E；

S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH；

S9E+N76D+Q206L+Y209W+N261W+L262E；

S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E；和

S9E+N76D+Q206L+L262E。

6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，当如本文实例3中的加速储存稳定性测定中所描述的进行测量时，相比于具有SEQ ID NO:1的枯草杆菌酶，该变体具有至少25％改进的稳定性。

7.如权利要求1-6中任一项所述的变体，当在AMSA测定中测量时，相比于SEQ ID NO:1，该变体具有改进的洗涤性能。

8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，当如本文实施例4或5中所述在pH为8的液体洗涤剂中在60℃下47小时后测量时，该变体具有比SEQ ID NO:1的枯草杆菌酶更高的残留活性。

9.如权利要求1-8中任一项所述的变体，其中相比于SEQ ID NO:1的改变的总数在3与15之间。

10.如权利要求1-9中任一项所述的变体，其中该变体由260至280或269至275个氨基酸组成。

11.一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包括如权利要求1-10中任一项所述的变体以及一种或多种洗涤剂组分。

12.如权利要求11所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包括选自下组的一种或多种另外的酶，该组由以下各项组成：淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、角质酶、卤代加过氧酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、蛋白酶、黄原胶酶、和木葡聚糖酶，或其任何混合物。

13.如权利要求11或12所述的洗涤剂组合物，其处于条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体的形式。

14.如权利要求11-13中任一项所述的组合物在清洁过程中的用途。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述清洁过程是洗衣或餐具洗涤或其它硬表面清洁。

16.一种用于产生如权利要求1-10中任一项所述的枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括

(a)将取代S9E+Q206L+L262E引入具有SEQ ID NO:1的亲本枯草杆菌酶；并且

(b)回收该变体；

其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置，所述变体具有蛋白酶活性，所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少93％但小于100％序列一致性，并且与具有SEQ ID NO:1的枯草杆菌酶相比，该变体在液体洗涤剂中具有改进的储存稳定性。