CN116323932A - 具有改善的溶解度的蛋白酶变体 - Google Patents

具有改善的溶解度的蛋白酶变体 Download PDF

Info

Publication number
CN116323932A
CN116323932A CN202180052570.3A CN202180052570A CN116323932A CN 116323932 A CN116323932 A CN 116323932A CN 202180052570 A CN202180052570 A CN 202180052570A CN 116323932 A CN116323932 A CN 116323932A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protease
variant
seq
substitution
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180052570.3A
Other languages
English (en)
Inventor
R·T·伦哈德
E·P·弗里斯
P·E·佩德森
R·L·安德森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novozymes AS
Original Assignee
Novozymes AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes AS filed Critical Novozymes AS
Publication of CN116323932A publication Critical patent/CN116323932A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/20—Compounding polymers with additives, e.g. colouring
    • C08J3/201—Pre-melted polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K11/00—Use of ingredients of unknown constitution, e.g. undefined reaction products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2367/00—Characterised by the use of polyesters obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain; Derivatives of such polymers
    • C08J2367/04—Polyesters derived from hydroxy carboxylic acids, e.g. lactones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
    • Y02W30/62—Plastics recycling; Rubber recycling

Abstract

本发明涉及蛋白酶变体，编码所述变体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体和表达载体，表达所述变体的宿主细胞，获得这些变体的方法，包含所述变体的洗涤剂组合物，以及所述变体或所述洗涤剂组合物的用途。

Description

具有改善的溶解度的蛋白酶变体
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及蛋白酶变体，编码所述变体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体和表达载体，表达所述变体的宿主细胞，获得这些变体的方法，包含所述变体的洗涤剂组合物，以及所述变体或所述洗涤剂组合物的用途。
背景技术
在洗涤剂工业中，酶已经在洗涤配制品中应用了几十年。在此类配制品中使用的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶以及其他酶或其混合物。商业上，最重要的酶是蛋白酶。
越来越多的商用蛋白酶(用于例如衣物和餐具洗涤剂)是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化的变体。另外，本领域已经描述了相对于亲本蛋白酶具有改变的其他蛋白酶变体，这些改变产生例如更好的洗涤性能、热稳定性、储存稳定性或催化活性方面的改善。
然而，多种因素使得蛋白酶的进一步改善是有利的。例如，洗涤条件(例如温度和pH)倾向于随时间变化，并且在世界上不同的国家或地区也不同，并且在常规洗涤条件下仍然难以完全去除许多污渍。
另一个与蛋白酶相关的挑战是其溶解度。蛋白酶的溶解度是生产这些酶时的一个重要因素，因为低溶解度的蛋白酶在发酵和下游加工期间更容易结晶。具有高溶解度的蛋白酶可以在较高浓度下加工，使纯化蛋白酶的工艺更便宜、更快且更可持续。”
本发明通过提供具有改善的溶解度的蛋白酶变体解决了这一挑战。
发明内容
本发明提供了具有改善的溶解度的蛋白酶变体。本发明的蛋白酶变体在对应于SEQ ID NO:1的位置215的位置处包含带正电荷的氨基酸或极性氨基酸。
因此，在第一方面，本发明涉及一种亲本蛋白酶的蛋白酶变体，其中该变体与SEQID NO:1具有至少至少80％但小于100％的序列同一性；
其中该变体包含选自由以下组成的组的第一取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T；
其中该变体包含至少三个另外的选自由以下组成的组的改变，优选地取代：X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)；
其中该变体具有蛋白酶活性；并且
其中位置编号基于SEQ ID NO:2的编号。
在第二方面，本发明涉及一种多核苷酸，该多核苷酸编码第一方面所述的蛋白酶变体。
在第三方面，本发明涉及一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含第二方面所述的多核苷酸。
在第四方面，本发明涉及一种宿主细胞，该宿主细胞表达根据第一方面所述的蛋白酶变体。
在第五方面，本发明涉及一种用于获得根据权利要求1-15中任一项所述的蛋白酶变体的方法，该方法包括：
(a)向亲本蛋白酶中引入选自由以下组成的组的第一取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T；以及引入至少三个另外的选自由以下组成的组的改变，优选地取代：X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)；其中该变体具有蛋白酶活性；以及
(b)回收该变体。
在第六方面，本发明涉及一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含根据第一方面所述的蛋白酶变体。
在第七方面，本发明涉及根据第一方面所述的蛋白酶变体或根据第六方面所述的洗涤剂组合物在清洁过程，优选地衣物洗涤或硬表面清洁例如自动餐具洗涤(ADW)中的用途。
附图说明
图1基于WO 1989/06279的表1示出了SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2之间的比对，从中可以容易地确定对应于SEQ ID NO:2的位置的位置编号。
定义
蛋白酶：术语“蛋白酶”意指水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其十三个亚类中的每一种)(http://en.wikipedia.org/wiki/Category:EC_3.4)。EC编号参考加利福尼亚州圣迭戈(San Diego)NC-IUBMB的1992年酶命名法(学术出版社(AcademicPress))，包括分别出版于以下中的增刊1-5：Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]1994,223,1-5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]1995,232,1-6；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]1996,237,1-5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]1997,250,1-6；和Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]1999,264,610-650。术语“枯草杆菌酶(subtilase)”是指根据Siezen等人,Protein Eng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人,ProteinScience[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶的亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是蛋白酶的亚组，其特征在于在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)特征在于除了具有丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶变体是内肽酶(EC 3.4.21)。出于本发明的目的，根据下文实例中所描述的蛋白酶活性测定确定蛋白酶活性。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，通过一系列步骤(包括剪接)对前体进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG、或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG、或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，这些控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接到提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。
融合多肽：术语“融合多肽”是其中一种多肽在本发明的变体的N-末端或C-末端融合的多肽。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合来生产融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学与生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。
杂合多肽：术语“杂合多肽”意指包含来自两个或更多个多肽的结构域的多肽，例如，来自一个多肽的结合模块和来自另一个多肽的催化结构域。结构域可以在N-末端或C-末端融合。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改善的变体相关的特征。此类改善的特性包括但不限于：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、聚酯降解活性、聚酯特异性、蛋白水解稳定性、溶解度、比活性、在储存条件下的稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性和热稳定性。
在一个方面，本发明的变体具有改善的溶解度。特别地，本发明的变体表现出(例如，在发酵期间)减少的蛋白酶结晶形成，和/或增加的蛋白酶结晶溶解度(或，换言之，改善的蛋白酶结晶再溶解)。可以根据下文实例1中所描述的程序确定蛋白酶结晶形成和蛋白酶结晶溶解度。蛋白酶结晶溶解度也可以确定为蛋白酶结晶溶解速率。使用这一方法，通过在水性缓冲液中提高蛋白酶浓度(例如，经由旋转浓缩器(spin concentrator))并且提高盐浓度以及调节pH值直到达到适合于结晶的条件，来使蛋白酶结晶。结晶后，可以通过测量结晶的溶解速率来确定蛋白酶结晶溶解度。
在一方面，本发明的变体具有同等或改善的蛋白酶活性。根据下文实例中所描述的蛋白酶活性测定确定蛋白酶活性。
分离的：术语“分离的”是指多肽、核酸、细胞或其他特定材料或组分，其与在自然界中发现的与其天然相关联的至少一种其他材料或组分(包括但不限于，例如，其他蛋白质，核酸，细胞等)分离。分离的多肽包括但不限于含有分泌的多肽的培养液。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在N-末端加工(例如，信号肽的去除)后处于其成熟形式的多肽。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本或亲本蛋白酶：术语“亲本”或“亲本蛋白酶”意指对其进行了改变以产生本发明的酶变体的蛋白酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
聚合物：术语“聚合物”是指其结构是由通过共价化学键连接的多个单体(重复单元)构成的化学化合物或化合物的混合物。在本发明的上下文中，术语聚合物包括天然或合成聚合物，其由单一类型的重复单元(即，均聚物)或不同的重复单元的混合物(即，共聚物或杂聚物)构成。根据本发明，术语“寡聚体”当提及聚合物使用时，意指含有2至约20个单体的分子。
纯化的：术语“纯化的”意指基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术(例如，在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经过密度梯度离心的培养基中，纯化的多肽或核酸可形成离散的条带)所确定。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，组合物富集了分子。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
重组：当用于提及细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”意指已经从其天然状态经修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或与在自然界中发现的相比，以不同水平表达或在不同条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列的差异在于一个或多个核苷酸和/或与异源序列(例如，表达载体中的异源启动子)可操作地连接。重组蛋白与天然序列的差异可以在于一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码多肽的核酸的载体是重组载体。术语“重组”与“遗传修饰的”和“转基因的”同义。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277，优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个多核苷酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,同上)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度–比对中的空位总数)
变体和蛋白酶变体：术语“变体”和“蛋白酶变体”意指具有蛋白酶活性的多肽，与亲本相比，该多肽包含在一个或多个(例如，几个)位置处的取代、插入、和/或缺失。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。出于本发明的目的，根据以下实例中所描述的程序确定蛋白酶活性。
野生型：提及氨基酸序列或核酸序列时术语“野生型”意指该氨基酸序列或核酸序列是天然或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中未发现的任何物质(例如，在实验室中产生的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
蛋白酶变体命名惯例
出于本发明的目的，使用SEQ ID NO:2的多肽来确定本发明的变体中的相应氨基酸残基编号。将本发明的变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2进行比对，并基于比对，将氨基酸位置编号对应于本发明的变体中的任何氨基酸残基。
本文对于SEQ ID NO:1、3、4、5和6的编号是基于SEQ ID NO:2的编号。因此，对于SEQ ID NO:1、3、4、5和6，其氨基酸残基是基于SEQ ID NO:2中的相应氨基酸残基进行编号的。特别地，编号是基于WO 1989/06279的表1中的比对，其示出了包括枯草杆菌酶BPN’(BASBPN)序列(在该表中的序列c)的成熟多肽和来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的枯草杆菌蛋白酶309(也称为
Figure BDA0004094098810000081
)(BLSAVI)(在该表中的序列a)的成熟多肽的五种蛋白酶的比对。本领域技术人员应知道，专利文献中用于枯草杆菌蛋白酶309和其他蛋白酶的位置编号通常根据这种比对基于BPN’的相应位置编号。
出于参考目的提供附图1，并且基于WO 1989/06279的表1示出了SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2之间的比对，从中可以容易地确定对应于SEQ ID NO:2的位置的位置编号。
另一种蛋白酶中相应氨基酸残基的鉴定可以使用几种计算机程序使用其对应的缺省参数通过多个多肽序列的比对来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数-期望的多序列比较；3.5版本或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)、MAFFT(6.857版本或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
在描述本发明的变体时，为了便于参考，以下描述的命名法经过了调整。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。相应地，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个取代通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。替代性地，多个取代可以由逗号(“,”)分开，例如，“Gly205Arg,Ser411Phe”或“G205R,S411F”。
缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。相应地，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。替代性地，多个缺失可以由逗号(“,”)分开，例如，“Gly195*,Ser411*”或“G195*,S411*”。
插入：对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。相应地，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多个改变：包含多个改变的变体通过加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170处和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。替代性地，多个改变可以由逗号(“,”)分开，例如，“Arg170Tyr,Gly195Glu”或“R170Y,G195E”。
不同改变：在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变通过逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
序列综述
SEQ ID NO:1是
Figure BDA0004094098810000101
蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是BPN’蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:1的变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是SEQ ID NO:1的变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是SEQ ID NO:1的变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是SEQ ID NO:1的变体的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明提供了新的具有改善的溶解度的蛋白酶变体。本发明的蛋白酶变体在对应于SEQ ID NO:1的位置215(即，SEQ ID NO:1的位置A215)的位置处包含带正电荷的氨基酸或极性氨基酸。在此位置处引入带正电荷的氨基酸或极性氨基酸导致改善的溶解度，特别地减少的蛋白酶结晶形成以及增加的蛋白酶结晶溶解度，如下文实例中所述。
蛋白酶变体
本发明涉及亲本蛋白酶的蛋白酶变体，其中该变体与SEQ ID NO:1具有至少至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，其中该变体包含选自由以下组成的组的第一取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T，其中该变体包含至少三个，例如，至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个另外的选自由以下组成的组的改变，优选地取代：X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)，其中该变体具有蛋白酶活性，并且其中位置编号基于SEQ ID NO:2的编号。
在实施例中，第一取代选自由以下组成的组：X215K、X215Q、X125N、X215S和X215T；优选地，第一取代选自由以下组成的组：X215K、X215Q、X125N和X215T。
在实施例中，第一取代选自由以下组成的组：A215K、A215R、A215Q、A215N、A215S和A215T；优选地，第一取代选自由以下组成的组：A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T；最优选地，第一取代选自由以下组成的组：A215K、A215Q、A215N和A215T。
在实施例中，变体包含至少三个，例如，至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个另外的选自由以下组成的组的改变，优选地，取代：X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)。在优选的实施例中，变体包含至少三个，例如，至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个另外的选自由以下组成的组的改变，优选地取代：S3T、V4I、S9E、I35ID、N43R、N76D、S99D、S99F、S101E、S101L、S103A、S103T、V104I、H120D、G160S、G195E、V205I、Q206L、Y209W、K235L、S259D、N261W和L262E。
在优选的实施例中，蛋白酶变体包含至少三个，例如，至少四个、或五个另外的选自由以下组成的组的改变，优选地取代：
a)S3T、V4I、S99D、S101E、S103A、G160S和V205I；
b)I35ID、N76D、H120D、G195E、K235L；
c)S9E、N43R、N76D、S99F、S101L、S103T、V104I、V205I、Q206L、Y209W、S259D、N261W和L262E；以及
d)S9E、N43R、N76D、V205I、Q206L、Y209W、S259D、N261W和L262E。
在优选的实施例中，蛋白酶变体包含至少三个，例如，至少四个、至少五个、至少六个、或七个另外的选自由以下组成的组的取代：S3T、V4I、S99D、S101E、S103A、G160S和V205I。
在优选的实施例中，蛋白酶变体包含至少三个，例如，至少四个、或五个另外的选自由以下组成的组的改变，优选地取代：I35ID、N76D、H120D、G195E和K235L。
在优选的实施例中，蛋白酶变体包含至少三个，例如，至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个或十三个另外的选自由以下组成的组的取代：S9E、N43R、N76D、S99F、S101L、S103T、V104I、V205I、Q206L、Y209W、S259D、N261W和L262E。
在优选的实施例中，蛋白酶变体包含至少三个，例如，至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或九个另外的选自由以下组成的组的取代：S9E、N43R、N76D、V205I、Q206L、Y209W、S259D、N261W和L262E。
在优选的实施例中，蛋白酶变体包含具有以下的SEQ ID NO:1，基本上由其组成，或由其组成：选自由X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T组成的组的取代；优选地，选自由A215K、A215R、A215Q、A215N、A215S和A215T组成的组的取代；最优选地，选自由A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T组成的组的取代。
在优选的实施例中，蛋白酶变体包含具有以下的SEQ ID NO:3，基本上由其组成，或由其组成：选自由X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T组成的组的取代；优选地，选自由A215K、A215R、A215Q、A215N、A215S和A215T组成的组的取代；最优选地，选自由A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T组成的组的取代。
在优选的实施例中，蛋白酶变体包含具有以下的SEQ ID NO:4，基本上由其组成，或由其组成：选自由X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T组成的组的取代；优选地，选自由A215K、A215R、A215Q、A215N、A215S和A215T组成的组的取代；最优选地，选自由A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T组成的组的取代。
在优选的实施例中，蛋白酶变体包含具有以下的SEQ ID NO:5，基本上由其组成，或由其组成：选自由X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T组成的组的取代；优选地，选自由A215K、A215R、A215Q、A215N、A215S和A215T组成的组的取代；最优选地，选自由A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T组成的组的取代。
在优选的实施例中，蛋白酶变体包含具有以下的SEQ ID NO:6，基本上由其组成，或由其组成：选自由X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T组成的组的取代；优选地，选自由A215K、A215R、A215Q、A215N、A215S和A215T组成的组的取代；最优选地，选自由A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T组成的组的取代。
除了上文所述的取代，变体可以包含在一个或多个其他位置处的另外的取代。
氨基酸改变可以是具有微小性质的，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
替代性地，这些氨基酸改变具有使多肽的物理化学特性改变的这样一种性质。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
本发明的变体具有改善的溶解度。特别地，本发明的变体表现出(例如，在表达这些变体的宿主细胞的发酵期间)减少的蛋白酶结晶形成，以及此类蛋白酶结晶的增加的溶解度，如下文实例1中所述。改善的溶解度可以使用本领域技术人员已知的各种方法来确定。优选地，根据下文实例1将改善的溶解度确定为减少的蛋白酶结晶形成或增加的蛋白酶结晶溶解度。
在一个实施例中，与除不具有选自由X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T组成的组的取代外其他方面相同的蛋白酶相比，蛋白酶变体具有改善的溶解度。在优选的实施例中，与不具有选自由X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T组成的组的取代且不具有至少三个另外的选自由X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)组成的组的改变，优选地取代的相同的蛋白酶相比，蛋白酶变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。
在优选的实施例中，蛋白酶变体在10℃-30℃下，优选地在15℃-25℃下，更优选地在约20℃下，最优选地在20℃下具有改善的溶解度。
在优选的实施例中，蛋白酶变体在pH 3-9下，优选地在pH 4-8下，更优选地在pH4-6下，甚至更优选地在pH 4-5下，最优选地在pH 4.5下具有改善的溶解度。
在优选的实施例中，蛋白酶变体在15℃-25℃和pH 4-6下具有改善的溶解度。优选地，蛋白酶变体在20℃和pH 4-5下具有改善的溶解度。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1相比，蛋白酶变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:3相比，蛋白酶变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:4相比，蛋白酶变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:5相比，蛋白酶变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:6相比，蛋白酶变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。
除了改善的溶解度之外，与亲本相比，本发明的变体可以具有一个或多个改善的特性。该一个或多个改善的特性可以选自由以下组成的组：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、蛋白水解稳定性、比活性、在储存条件下的稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性和热稳定性。
本发明的变体具有蛋白酶活性，优选地同等或改善的蛋白酶活性。在一个实施例中，与除不具有选自由X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T组成的组的取代外其他方面相同的蛋白酶相比，蛋白酶变体具有改善的溶解度。在优选的实施例中，与不具有选自由X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T组成的组的第一取代且不具有至少三个另外的选自由X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)组成的组的改变，优选地取代的相同的蛋白酶相比，蛋白酶变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1的蛋白酶活性相比，变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:3的蛋白酶活性相比，变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:4的蛋白酶活性相比，变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:5的蛋白酶活性相比，变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:6的蛋白酶活性相比，变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。
在一方面，本发明涉及多肽，优选地分离的或纯化的多肽，该多肽与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，其中该变体包含选自由以下组成的组的取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T，其中该变体具有蛋白酶活性，并且其中位置编号基于SEQ ID NO:2的编号。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的取代：A215K、A215R、A215Q、A125N、A215S和A215T。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的取代：A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的取代：A215K、A215Q、A215N和A215T。在一个实施例中，与SEQ ID NO:1相比，变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。在一个实施例中，与SEQ ID NO:1相比，变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。在优选的实施例中，变体在10℃-30℃下，优选地在15℃-25℃下，更优选地在约20℃下，最优选地在20℃下具有改善的溶解度。在优选的实施例中，变体在pH 3-9下，优选地在pH 4-8下，更优选地在pH 4-6下，甚至更优选地在pH 4-5下，最优选地在pH 4.5下具有改善的溶解度。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215K的SEQ ID NO:1、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215R的SEQ ID NO:1、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215Q的SEQ ID NO:1、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215N的SEQ ID NO:1、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215S的SEQ ID NO:1、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215T的SEQ ID NO:1、基本上由其组成、或由其组成。
在一方面，本发明涉及多肽，优选地分离的或纯化的多肽，该多肽与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，其中该变体包含选自由以下组成的组的第一取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T，其中这些变体包含至少三个，例如，至少四个、至少五个、至少六个或七个另外的选自由以下组成的组的取代：S3T、V4I、S99D、S101E、S103A、G160S和V205I，其中该变体具有蛋白酶活性，并且其中位置编号基于SEQ ID NO:2的编号。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215R、A215Q、A125N、A215S和A215T。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215Q、A215N和A215T。在一个实施例中，与SEQ ID NO:3相比，变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。在一个实施例中，与SEQ ID NO:3相比，变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。在优选的实施例中，变体在10℃-30℃下，优选地在15℃-25℃下，更优选地在约20℃下，最优选地在20℃下具有改善的溶解度。在优选的实施例中，变体在pH3-9下，优选地在pH 4-8下，更优选地在pH 4-6下，甚至更优选地在pH 4-5下，最优选地在pH4.5下具有改善的溶解度。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215K的SEQ ID NO:3、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215R的SEQ ID NO:3、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215Q的SEQ ID NO:3、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215N的SEQ IDNO:3、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215S的SEQ IDNO:3、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215T的SEQ IDNO:3、基本上由其组成、或由其组成。
在一方面，本发明涉及多肽，优选地分离的或纯化的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4具有至少80％，例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，其中该变体包含选自由以下组成的组的第一取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T，其中这些变体包含至少三个，例如，至少四个或五个另外的选自由以下组成的组的取代：I35ID、N76D、H120D、G195E和K235L，其中该变体具有蛋白酶活性，并且其中位置编号基于SEQ IDNO:2的编号。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215R、A215Q、A125N、A215S和A215T。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215Q、A215N和A215T。在一个实施例中，与SEQ ID NO:4相比，变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。在一个实施例中，与SEQID NO:4相比，变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。在优选的实施例中，变体在10℃-30℃下，优选地在15℃-25℃下，更优选地在约20℃下，最优选地在20℃下具有改善的溶解度。在优选的实施例中，变体在pH 3-9下，优选地在pH 4-8下，更优选地在pH 4-6下，甚至更优选地在pH 4-5下，最优选地在pH 4.5下具有改善的溶解度。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215K的SEQ ID NO:4、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215R的SEQ ID NO:4、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215Q的SEQ ID NO:4、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215N的SEQ ID NO:4、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215S的SEQ ID NO:4、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215T的SEQ ID NO:4、基本上由其组成、或由其组成。
在一方面，本发明涉及多肽，优选地分离的或纯化的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少80％，例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，其中该变体包含选自由以下组成的组的第一取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T，其中这些变体包含至少三个，例如，至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、或十三个另外的选自由以下组成的组的取代：S9E、N43R、N76D、S99F、S101L、S103T、V104I、V205I、Q206L、Y209W、S259D、N261W和L262E，其中该变体具有蛋白酶活性，并且其中位置编号基于SEQ ID NO:2的编号。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215R、A215Q、A125N、A215S和A215T。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215Q、A215N和A215T。在一个实施例中，与SEQ ID NO:5相比，变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。在一个实施例中，与SEQ ID NO:5相比，变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。在优选的实施例中，变体在10℃-30℃下，优选地在15℃-25℃下，更优选地在约20℃下，最优选地在20℃下具有改善的溶解度。在优选的实施例中，变体在pH 3-9下，优选地在pH 4-8下，更优选地在pH 4-6下，甚至更优选地在pH 4-5下，最优选地在pH 4.5下具有改善的溶解度。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215K的SEQ ID NO:5、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215R的SEQ ID NO:5、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215Q的SEQ ID NO:5、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215N的SEQ ID NO:5、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215S的SEQ ID NO:5、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215T的SEQ ID NO:5、基本上由其组成、或由其组成。
在一方面，本发明涉及多肽，优选地分离的或纯化的多肽，该多肽与SEQ ID NO:6具有至少80％，例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，其中该变体包含选自由以下组成的组的第一取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T，其中这些变体包含至少三个，例如，至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或九个另外的选自由以下组成的组的取代：S9E、N43R、N76D、V205I、Q206L、Y209W、S259D、N261W和L262E，其中该变体具有蛋白酶活性，并且其中位置编号基于SEQ ID NO:2的编号。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215R、A215Q、A125N、A215S和A215T。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T。在优选的实施例中，变体包含选自由以下组成的组的第一取代：A215K、A215Q、A215N和A215T。在一个实施例中，与SEQ ID NO:6相比，变体具有同等或改善的蛋白酶活性，例如，至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。在一个实施例中，与SEQ ID NO:6相比，变体具有至少5％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高的改善的溶解度。在优选的实施例中，变体在10℃-30℃下，优选地在15℃-25℃下，更优选地在约20℃下，最优选地在20℃下具有改善的溶解度。在优选的实施例中，变体在pH 3-9下，优选地在pH 4-8下，更优选地在pH 4-6下，甚至更优选地在pH 4-5下，最优选地在pH 4.5下具有改善的溶解度。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215K的SEQ ID NO:6、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215R的SEQ ID NO:6、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215Q的SEQ ID NO:6、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215N的SEQ ID NO:6、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215S的SEQ ID NO:6、基本上由其组成、或由其组成。在优选的实施例中，变体包含具有取代A215T的SEQ ID NO:6、基本上由其组成、或由其组成。
亲本蛋白酶
本发明的蛋白酶变体可以基于任何亲本蛋白酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
在一方面，亲本蛋白酶与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且具有蛋白酶活性。在实施例中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差多达20个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。在实施例中，该亲本包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一方面，亲本蛋白酶与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且具有蛋白酶活性。在实施例中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的多肽相差多达20个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。在实施例中，该亲本包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一方面，亲本蛋白酶与SEQ ID NO:4的多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且具有蛋白酶活性。在实施例中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的多肽相差多达20个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。在实施例中，该亲本包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一方面，亲本蛋白酶与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且具有蛋白酶活性。在实施例中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的多肽相差多达20个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。在实施例中，该亲本包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一方面，亲本蛋白酶与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且具有蛋白酶活性。在实施例中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的多肽相差多达20个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。在实施例中，该亲本包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
亲本多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明的多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合来生产融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学与生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如本文中与给定来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，亲本是胞外分泌的。
亲本可以是细菌蛋白酶。例如，亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)蛋白酶。
在一个方面，亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)蛋白酶。
在另一方面，亲本是类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)蛋白酶。
在另一方面，亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)蛋白酶。
应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段以及其他分类学等同物，例如无性型，而与它们已知的物种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上探针，从其他来源(包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得的DNA样品)中鉴定亲本并获得亲本。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合DNA样品来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人,1989)。
蛋白酶变体的制备
本发明还涉及用于获得蛋白酶变体的方法，该方法包括：
(a)向亲本蛋白酶中引入选自由以下组成的组的第一取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T；以及引入至少三个另外的选自由以下组成的组的改变，优选地取代：X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)；其中该变体具有蛋白酶活性；以及
(b)回收该变体。
在一个实施例中，第一取代选自由以下组成的组：X215K、X215Q、X125N、X215S和X215T；优选地，第一取代选自由以下组成的组：X215K、X215Q、X125N和X215T。
在一个实施例中，第一取代选自由以下组成的组：A215K、A215R、A215Q、A215N、A215S和A215T；优选地，第一取代选自由以下组成的组：A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T；最优选地，第一取代选自由以下组成的组：A215K、A215Q、A215N和A215T。
在一个实施例中，该至少三个另外的改变，优选地取代选自由以下组成的组：S3T、V4I、S9E、I35ID、N43R、N76D、S99D、S99F、S101E、S101L、S103A、S103T、V104I、H120D、G160S、G195E、V205I、Q206L、Y209W、K235L、S259D、N261W和L262E。
在一个实施例中，该至少三个另外的改变，优选地取代选自由以下组成的组：
a)S3T、V4I、S99D、S101E、S103A、G160S和V205I；
b)I35ID、N76D、H120D、G195E、K235L；
c)S9E、N43R、N76D、S99F、S101L、S103T、V104I、V205I、Q206L、Y209W、S259D、N261W和L262E；以及
d)S9E、N43R、N76D、V205I、Q206L、Y209W、S259D、N261W和L262E。
可以使用本领域已知的任何诱变程序，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等制备变体。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个突变的技术。
通过涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码目的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序做出单氨基酸或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用聚合酶链式反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],Academic Press[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接激活的转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是期望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的变体的多核苷酸进行表达的多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变启动子、截短启动子和杂合启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于以下文献中：Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，和里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其突变启动子、截短启动子和杂合启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因中获得：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3'末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。
酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992,同上)描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例从以下中获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译而言重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从以下的基因中获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区域，该编码区域编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导该变体进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列的5'-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。替代性地，编码序列的5'端可以含有对编码序列而言外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。替代性地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。其他信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物学评论]57:109-137描述。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicolainsolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。
控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成活性变体。前肽编码序列可以从以下的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽和前肽序列两者都存在的情况下，将前肽序列紧邻变体的N-末端定位并且将信号肽序列紧邻前肽序列的N-末端定位。
还可能期望的是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长而调节变体的表达。调节序列的实例是作为对化学或物理刺激的反应而引起基因表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是使基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将可操作地连接至该调节序列。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。替代性地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以合宜地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。替代性地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于在木霉属(Trichoderma)细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。替代性地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，这些核酸与相对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核生物或真核生物。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门菌属以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。优选地，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单胞菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下方式来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌一般的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、巨座壳属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉胞菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium torulosum)、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023、Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合的方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
生产方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该变体的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及任选地(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中培养重组宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。培养使用本领域中已知的程序，在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中发生。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测这些变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定变体的活性。
可以使用本领域已知的方法回收变体。例如，可以通过常规程序从营养培养基中回收变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收全发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水作用色谱法、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版社],纽约,1989)。
在替代性的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的变体的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵工艺中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的变体的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生目的变体)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如本文所用，术语“发酵液”是指由细胞发酵生产的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，生产发酵液。发酵液可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在特别的实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐、或前述两种或更多种的混合物；并且第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐、或前述两种或更多种的混合物。
在一个方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的内容物。典型地，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)在蛋白质合成的碳限制条件下孵育生长到饱和之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中描述的方法来生产。
洗涤剂组合物
本发明还涉及包含本发明的蛋白酶变体的组合物，例如，洗涤剂组合物或清洁组合物。
本发明还涉及包含本发明的蛋白酶变体并进一步包含一种或多种洗涤剂组分和/或一种或多种另外的酶的组合物。在优选的实施例中，组合物是包含一种或多种洗涤剂组分、特别是一种或多种非天然存在的洗涤剂组分的洗涤剂组合物。
本发明还涉及组合物，其包含本发明的蛋白酶变体，并且进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的酶：淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶(例如内切葡聚糖酶)、角质酶、卤素过加氧酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂合酶、过氧物酶、蛋白酶、黄原胶酶、地衣多糖酶和木葡聚糖酶，或其任何混合物。
洗涤剂组合物可以例如处于以下形式：条，均匀的片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，糊剂，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体。在优选的实施例中，洗涤剂组合物处于液体或凝胶，特别地液体衣物洗涤剂的形式。
本发明还涉及本发明的组合物在清洁过程，如衣物洗涤或硬表面清洁如餐具洗涤中的用途。
洗涤剂组合物的另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括下文列出的示例性、非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：待清洁的织物的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。
在特定实施例中，洗涤剂组合物包含本发明的蛋白酶变体和一种或多种非天然存在的洗涤剂组分，例如表面活性剂、水溶助剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、污垢释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。
在一个实施例中，可以将本发明的蛋白酶变体以对应于以下的量添加至洗涤剂组合物中：0.01-200mg酶蛋白/升洗涤液，优选地0.05-50mg酶蛋白/升洗涤液，特别是0.1-10mg酶蛋白/升洗涤液。
自动餐具洗涤(ADW)组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.001％-30％，例如0.01％-20％，例如0.1％-15％，例如0.5％-10％的酶蛋白。
用于衣物洗涤的颗粒状组合物可以例如包括按该组合物的重量计0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。
用于衣物洗涤的液体组合物可以例如包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。
可以使用常规的稳定剂来稳定化酶，如本发明的蛋白酶变体，这些稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物例如芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且可以如在例如WO 1992/19709和WO 1992/19708中所述配制该组合物，或者如在WO 2005/105826和WO 2009/118375中所述的可使用肽醛或酮对根据本发明的变体进行稳定。
本发明的蛋白酶变体可以配制在液体洗衣组合物，例如包含如下的液体洗衣组合物中：
a)至少0.01mg的活性蛋白酶变体/升洗涤剂，
b)2wt％至60wt％的至少一种表面活性剂
c)5wt％至50wt％的至少一种助洗剂
该洗涤剂组合物可以配制成用于衣物洗涤的颗粒洗涤剂。这样的洗涤剂可包含：
a)至少0.01mg的活性蛋白酶变体/克组合物
b)优选地5wt％至50wt％的阴离子型表面活性剂
c)优选地1wt％至8wt％的非离子型表面活性剂
d)优选地5wt％至40wt％的助洗剂，例如碳酸盐、沸石、磷酸盐助洗剂、钙掩蔽助洗剂、或络合剂。
尽管根据特定的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被本领域技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子型和/或阳离子型和/或非离子型和/或半极性型和/或兼性离子型、或其混合物。在特定实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子型表面活性剂的混合物。一种或多种表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％的水平存在。基于所期望的清洁应用来选择该一种或多种表面活性剂，并且该表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。表面活性剂降低洗涤剂中的表面张力，这使得正在清洁的污渍被提起并分散，并且然后洗去。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％，包括从约5％至约15％或从约20％至约25％的阴离子型表面活性剂。阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括磺酸甲酯(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从约0％至约10％的阳离子型表面活性剂。阳离子型表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、及其组合。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％、特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％、例如从约3％至约5％或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化脂肪醇(PFA)、烷氧基化脂肪酸烷基酯，如乙氧基化和/或丙氧基化脂肪酸烷基酯、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬苯酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺GA，或脂肪酸葡糖酰胺FAGA)，以及在商标名SPAN和TWEEN下可获得的产品，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计约0％至约10％的半极性型表面活性剂。半极性型表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计约0％至约10％的兼性离子型表面活性剂。兼性离子型表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱、及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以含有按重量计约0-65％(如约5％至约45％)的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和螯合剂例如通过从液体中去除金属离子来软化洗涤水。助洗剂和/或共助洗剂可以特别是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合试剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如，来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
洗涤剂组合物还可以含有按重量计0-20％，例如约5％至约10％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以包括单独的共助洗剂，或与助洗剂(例如沸石助洗剂)组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(例如氨基羧酸盐、氨基聚羧酸盐、和膦酸盐)、以及烷基琥珀酸、或烯基琥珀酸。另外的特定实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。进一步的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 2009/102854和US 5,977,053中。
本发明的蛋白酶变体也可以配制在餐具洗涤组合物中，优选地是自动餐具洗涤组合物(ADW)，该组合物包含：
a)至少0.01mg的根据本发明的活性蛋白酶变体，和
b)10-50wt％的助洗剂，优选地选自柠檬酸、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)、和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、及其混合物，以及
c)至少一种漂白组分。
漂白系统
洗涤剂可以含有按重量计0-50％，如约0.1％至约25％的漂白系统。漂白系统去除经常因氧化所致的褪色，并且许多漂白剂还具有强的杀菌特性并且用于消毒和灭菌。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源例如过碳酸钠和过硼酸钠、预形成的过酸及其混合物。适合的预形成的过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如，过硫酸氢钾(Oxone(R)))、及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括与过酸形成漂白活化剂组合的基于过氧化物的漂白系统，其可以包含例如无机盐，包括碱金属盐例如过硼酸盐的钠盐(通常为单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐。
术语漂白活化剂在本文意指与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。由此形成的过酸构成活化的漂白剂。本文将使用的适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺、或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。目的漂白活化剂的特定家族披露于EP 624154中并且该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酯像乙酸甘油酯具有环境友好的优点，因为其最终降解成柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是高效的漂白活化剂。最后，ATC为衣物洗涤添加剂提供良好的助洗能力。替代性地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺、或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)的过酸。漂白系统还可以包括漂白催化剂或促进剂。
可以用于本发明的组合物中的漂白催化剂的一些非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰胶原、钴-胺催化剂、和锰三氮杂环壬烷(MnTACN)催化剂；特别优选的是锰与1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me4-TACN)，特别是Me3-TACN的络合物，如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2、和[2,2',2”-次氨基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亚基-κN-甲基亚基)三酚并-κ3O]锰(III)。这些漂白催化剂还可以是其他金属化合物，如铁或钴络合物。
在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由具有下式的有机催化剂组成：
Figure BDA0004094098810000471
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是含有从9至24个碳的支链烷基基团或含有从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是含有从9至18个碳的支链烷基基团或含有从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R1独立地选自由以下组成的组：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
水溶助剂
水溶助剂是溶解水溶液中的疏水化合物(或相反地，非极性环境中的极性物质)的化合物。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而水溶助剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如Hodgdon和Kaler,2007,Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不表现如在形成胶束、薄层或其他明确限定的中间相(meso-phase)的表面活性剂和脂质中所见的临界浓度(高于此浓度则发生自聚集)。相反，许多水溶助剂示出了连续类型的聚集过程，在该过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了含有极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。通常地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中使用水溶助剂。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的工艺中)而不引起不期望的现象，例如相分离或高黏度。
洗涤剂可以含有按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇、和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基硫酸钠、及其组合。
聚合物
洗涤剂可以含有按重量计0-10％(例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％、或0.2％-1％)的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如以上提及的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油脂清洁、和/或消泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提及的特性和/或多于一种的下文提及的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧酸酯，如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)、以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。还考虑了以上提及的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当该织物与包含该洗涤剂组合物的洗涤液接触时，织物调色剂可以沉积在织物上，并且因此通过可见光的吸收/反射改变该织物的色彩。荧光增白剂发出至少一些可见光。相反，当织物调色剂吸收至少部分可见光光谱时，它们改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合染料。适合的小分子染料包括选自由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成的组的小分子染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫、和碱性红、或其混合物，例如如WO 2005/003274、WO 2005/003275、WO 2005/003276以及EP 1876226(通过引用并入本文)中所描述的。该洗涤剂组合物优选地包含从约0.00003wt.％至约0.2wt.％、从约0.00008wt.％至约0.05wt.％、或甚至从约0.0001wt.％至约0.04wt.％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt.％的织物调色剂，当该组合物的形式为单位剂量袋时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO2007/087257和WO 2007/087243中。
另外的酶
该洗涤剂组合物可以包含一种或多种另外的酶，例如淀粉酶、阿拉伯糖酶、糖酶、纤维素酶(例如，内切葡聚糖酶)、角质酶、脱氧核糖核酸酶、半乳聚糖酶、卤素过加氧酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、氧化酶(例如，漆酶和/或过氧化物酶)、果胶酶、果胶裂合酶、另外的蛋白酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶或氧化还原酶。
当该组合物包含一种或多种另外的酶时，该另外的酶优选地是淀粉酶和/或脂肪酶，特别地是淀粉酶。
所选的一种或多种酶的特性应当与所选的洗涤剂相容(例如最适pH、与其他酶成分或非酶成分的相容性等)。
蛋白酶
除了本发明的蛋白酶变体之外，组合物可以包含一种或多种另外的蛋白酶，包括细菌、真菌、植物、病毒、或动物来源的那些蛋白酶。微生物来源的蛋白酶是优选的。蛋白酶可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)的丝氨酸蛋白酶。金属蛋白酶可以是例如来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或另一金属蛋白酶，例如来自M5、M7、或M8家族的那些金属蛋白酶。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 2007/044993(杰能科国际公司(GenencorInt.))中的中性金属蛋白酶，例如源自解淀粉芽孢杆菌的那些金属蛋白酶。
适合的可商购蛋白酶包括在以下商标名下销售的那些蛋白酶：
Figure BDA0004094098810000501
DuralaseTM、DurazymTM、/>
Figure BDA0004094098810000502
Figure BDA0004094098810000503
Figure BDA0004094098810000504
Ultra、
Figure BDA0004094098810000505
Figure BDA0004094098810000506
Figure BDA0004094098810000507
和/>
Figure BDA0004094098810000508
(诺维信公司(Novozymes A/S))，在以下商标名下销售的那些蛋白酶：/>
Figure BDA0004094098810000509
Figure BDA00040940988100005010
Figure BDA00040940988100005011
Excellenz P1000TM、Excellenz P1250TM、/>
Figure BDA00040940988100005012
Figure BDA00040940988100005013
Effectenz P1000TM、Effectenz P1050TM、Effectenz P2000TM、/>
Figure BDA00040940988100005014
和/>
Figure BDA00040940988100005015
(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特-布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(US 5352604的图29示出的序列)及其变体(汉高公司(Henkel AG))、以及来自花王公司(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶和角质酶
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体酶或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)的脂肪酶，例如，如描述于EP 258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属(Humicola)的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(假单胞菌属中的一些现在改名为伯克霍尔德菌属(Burkholderia))，例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、假单胞菌属物种菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 2010/065455)；来自灰巨座壳(Magnaporthegrisea)的角质酶(WO 2010/107560)；来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 2011/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)脂肪酶(WO 2011/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 2011/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 2011/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 2012/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，例如在EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 2007/87508和WO 2009/109500中描述的那些。
优选的商业脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特-布罗卡德斯公司-)。
又其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如，与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 2010/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 2005/056782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 2009/067279)、以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 2010/100028)。
淀粉酶
可以与本发明的蛋白酶变体一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424中以及WO 99/19467的SEQ ID NO:4中，如在以下位置的一个或多个处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 2002/10355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182处具有缺失并且在位置193处具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ IDNO:6中的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
其他适合的淀粉酶是具有WO 99/19467中的SEQ ID NO:6序列的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有取代、缺失、或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/23873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置处具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476(使用WO 96/23873的SEQ ID NO:2进行编号)。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置(如181和182、182和183、或位置183和184)中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个位置处具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 2008/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10，或其与WO 2008/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性的变体，或其与WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体的淀粉酶。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 2009/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有C-末端截短、和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是具有在以下位置中的一个或多个位置中的取代：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183中的缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，
其中该变体是C-末端截短的并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 2013/184577的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQID NO:1具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1的优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选的变体是具有在以下位置中的一个或多个位置中的取代：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K以及G477K，和/或在位置R178和/或S179或T180和/或G181中的缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体包含以下取代：
E187P+I203Y+G476K
E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K
并且任选地进一步包含在位置241处的取代和/或在位置178和/或位置179处的缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 2010/104675的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQID NO:1具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1的优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128、K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。
SEQ ID NO:1的更优选的变体是具有在以下位置中的一个或多个位置中的取代：N21D、D97N、V128I、K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K和G478K，和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中的缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体包含取代N21D+D97N+V128I，并且任选地进一步包含在位置200处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％的序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174、R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314、R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及在选自下组的一个或多个位置中另外地具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是另外地在所有这些位置处具有取代的变体。
其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中的那些淀粉酶变体。可商购的淀粉酶包括DuramylTTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X、BANTM、
Figure BDA0004094098810000551
和/>
Figure BDA0004094098810000552
Prime(来自诺维信公司)、和RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase、Preferenz S1000、Preferenz S100和Preferenz S110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司)。
一种优选的淀粉酶是具有WO 2016/180748中的SEQ ID NO:13的淀粉酶的变体，其具有改变H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+F113Q+R116Q+W167F+Q172G+A174S+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+K391A+P473R+G476K。
另一种优选的淀粉酶是具有WO 2013/001078中的SEQ ID NO:1的淀粉酶的变体，其具有改变D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K。
另一种优选的淀粉酶是具有WO 2018/141707中的SEQ ID NO:1的淀粉酶的变体，其具有改变H1*+G7A+G109A+W140Y+G182*+D183*+N195F+V206Y+Y243F+E260G+N280S+G304R+E391A+G476K。
进一步优选的淀粉酶是具有WO 2017/191160中的SEQ ID NO:1的淀粉酶的变体，其具有改变L202M+T246V。
脱氧核糖核酸酶(DNA酶)
适合的脱氧核糖核酸酶(DNA酶)是催化DNA主链中的磷酸二酯键的水解切割从而降解DNA的任何酶。可获得自细菌的DNA酶是优选的，特别地，可获得自芽孢杆菌属物种的DNA酶是优选的；特别地，可获得自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的DNA酶是优选的。此类DNA酶的实例描述于WO 2011/098579和WO 2014/087011中。
氧化还原酶
在一个实施例中，该组合物可以包含氧化还原酶，其是催化还原-氧化反应的酶。优选的氧化还原酶是超氧化物歧化酶。
过氧化物酶/氧化酶
适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌、或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂/崩解试剂、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC、和/或多元醇，例如丙二醇)、织物调理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂、以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在技术人员的技术范围内。
分散剂：本发明的洗涤剂组合物还可以含有分散剂。特别地，粉末洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚的或共聚的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。适合的分散剂例如描述于Powdered Detergents[粉状洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列],第71卷,Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司],1997中。
染料转移抑制试剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制试剂。适合的聚合染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯基咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制试剂能够以按该组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％、或甚至约0.1％至约3％的水平存在。
荧光增白剂：本发明的洗涤剂组合物将优选地还含有另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，如荧光增白剂或光学增亮剂。当存在时，增亮剂的水平优选为约0.01％至约05％。在本发明的组合物中可以使用适合的用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和双苯基-联苯乙烯基衍生物。二氨芪-磺酸衍生物型的荧光增白剂的实例包括以下的钠盐：4,4’-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐；4,4’-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2’-二磺酸盐；4,4’-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐，4,4’-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2’-二磺酸盐；4,4′-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2′:4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选的荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由印度孟买的派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals and Chemicals)供应。适合的用于本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt.％、从0.05wt.％、从约0.1wt.％或甚至从约0.2wt.％的较低水平至0.5wt.％或甚至0.75wt.％的较高水平。
污垢释放聚合物：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉和基于聚酯的织物)去除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如PowderedDetergents[粉状洗涤剂]，Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷，第7章，Marcel Dekker，Inc.[马塞尔·德克尔公司]。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核芯结构和附接至该核芯结构的多个烷氧基化基团的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物。核芯结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚链烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细所述的(通过引用并入本文)。此外，随机接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856、以及WO 2006/113314中(将其通过引用特此并入)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，如经修饰的纤维素衍生物，如描述于EP 1867808或WO 03/040279中的那些(将二者都通过引用并入本文)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素、及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素、及其混合物。
抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚亚乙基亚胺。以上在污垢释放聚合物下所描述的基于纤维素的聚合物还可以作为抗再沉积剂起作用。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载剂、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制
一种或多种洗涤剂酶，即本发明的蛋白酶变体和任选地一种或多种另外的酶可以通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。包含一种或多种酶的洗涤剂添加剂可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品包括颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定的液体；或者浆液。
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何合宜的形式，例如，条，均匀的片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，糊剂，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体。存在多种洗涤剂配制品形式，如层(相同或不同相)、袋、以及用于机器给药单位的形式。
袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合于保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。该内体积可以分成袋的室。优选的膜是聚合材料，优选地被成型为膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物、或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糖糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物、以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量典型地将是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包含可水解降解并且水溶性的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在商品参考号M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.,US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris CraftIn.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含由水溶性膜分隔的固体衣物洗涤剂组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与含有固体的室不同。参见，例如US 2009/0011970。
可以由水可溶的袋中的室或片剂的不同层来将洗涤剂成分彼此物理分开。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。每个室的不同溶解曲线还可以引起所选择的组分在洗涤溶液中的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地含有按重量计至少20％并且多达95％的水，如多达约70％的水、多达约65％的水、多达约55％的水、多达约45％的水、或多达约35％的水。浓缩液体洗涤剂可以具有较低的水含量，例如不超过约30％或不超过约20％，例如在约1％至约20％的范围内，例如约2％至约15％。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚、以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
可以将液体洗涤剂组合物配制成具有例如约6至约10的温和pH，例如约pH 7、约pH8或约pH 9，或可以将它们配制成具有例如约10至约12的更高的pH，例如约pH 10、约pH 11或约pH 12。
除非另有指出，如本文所用的术语“液体”应理解为涵盖液体洗涤剂组合物的任何类型，例如浓缩液体、凝胶、或例如具有一个或多个室的袋的液体或凝胶部分。
洗衣皂条
本发明的酶可以添加到洗衣皂条中并用于手洗衣物、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条、以及洗涤剂条。条的类型的通常区别在于他们含有的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括含有来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体并且因此非液体、凝胶或粉末的物理形式。
洗衣皂条可以含有一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸、一种或多种皂或合成的表面活性剂、多元醇如甘油、pH控制化合物如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗衣皂条还可以含有络合剂，例如EDTA和HEDP、香料和/或不同类型的填充剂、表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂、助洗剂、聚合污垢释放剂、洗涤剂螯合剂、稳定剂、填充剂、染料、着色剂、染料转移抑制剂、烷氧基化的聚碳酸酯、抑泡剂、结构剂、粘合剂、浸出剂、漂白活化剂、粘土去污剂、抗再沉积剂、聚合分散试剂、增亮剂、织物软化剂、香料和/或本领域已知的其他化合物。
洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限于：混合器、压条机例如两级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道和包装机。可以制备含有皂、本发明的酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。酶和任选的另外的酶可以同时例如以液体形式添加，作为蛋白酶抑制剂。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
颗粒洗涤剂配制品
颗粒(粉末)洗涤剂中通常使用呈颗粒形式的酶，其包含含酶的核芯和任选的一个或多个包衣。用于制备核芯的各种方法在本领域中是众所周知的，并且包括例如a)喷雾干燥含液体酶的溶液，b)产生分层的产品，其中酶被包衣为围绕预形成的惰性核芯颗粒的层，例如使用流化床装置进行，c)将酶吸收到预形成的核芯的表面上和/或其中，d)挤出含酶的糊剂，e)将含酶的粉末悬浮在熔融蜡中并雾化以产生粒状产品，f)通过将含酶的液体添加到制粒组分的干粉末组合物中来进行混合制粒，g)通过研磨或粉碎较大的颗粒、小丸等对含酶的核芯进行粒度减小，以及h)流化床制粒。可以干燥含酶的核芯(例如使用流化床干燥器或用于在进料或酶工业中干燥颗粒的其他已知方法)，导致典型地为0.1％-10％w/w水的含水量。
含酶的核芯任选地提供有包衣以改善储存稳定性和/或减少粉尘形成。通常用于洗涤剂的酶颗粒的一种包衣是盐包衣，典型地是无机盐包衣，其可以是例如用流体床以盐的溶液施加的。可以使用的其他包衣材料是例如，聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)和聚乙烯醇(PVA)。颗粒可含有多于一个包衣，例如盐包衣，随后是例如PEG、MHPC或PVA的材料的另外的包衣。
有关酶颗粒及其生产的进一步的信息，参见WO 2013/007594、以及例如WO 2009/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 2007/001262、US 6,472,364、WO 2004/074419和WO2009/102854。
用途及清洁方法
本发明还涉及用于在纺织品和织物洗涤如家庭衣物洗涤和工业衣物洗涤中使用根据本发明的蛋白酶变体或其组合物的方法。
本发明还涉及用于在清洁硬表面例如地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)中使用根据本发明的变体或其组合物的方法。
可以将本发明的蛋白酶变体添加到洗涤剂组合物中并且因此使其成为该洗涤剂组合物的组分。因此，本发明的一方面涉及蛋白酶变体在清洁过程(如洗涤和/或硬表面清洁)中的用途。
本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，其包括适合于预处理有污渍的织物的衣物洗涤添加剂组合物、和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
清洁过程或纺织品护理过程可以例如是衣物洗涤过程、洗碗过程或硬表面如浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽和脸盆清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用洗涤，但是也可以是工业洗涤。此外，本发明涉及用于洗涤织物和/或服装的工艺，其中该工艺包括用含有洗涤剂组合物和至少一种本发明的蛋白酶变体的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤或者在手动洗涤中进行清洁过程或纺织品护理过程。洗涤溶液可以是例如含有洗涤剂组合物的水性洗涤溶液。
最近几年，人们对替代洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这来源于用可再生生物组分如酶和多肽替代石油化学品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变时，需要与先前使用的洗涤剂酶(如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)相比具有替代性和/或改善特性的新酶活性或新酶，以实现当与传统洗涤剂组合物相比时相似的或改善的洗涤性能。
本发明进一步涉及本发明的蛋白酶变体在除去蛋白质污渍过程中的用途。蛋白质污渍可以是以下的污渍，例如：食品污渍(例如，婴儿食品、可可、蛋、或奶)、或其他污渍(例如皮脂、血液、墨水、或草)、或其组合。
洗涤方法
本发明提供了用洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法，该洗涤剂组合物包含本发明的蛋白酶变体。
清洁方法包括在适合于清洁物体的条件下使物体与包含本发明的蛋白酶变体的洗涤剂组合物接触。在优选的实施例中，洗涤剂组合物用于衣物或餐具洗涤过程中。
另一个实施例涉及用于从织物或餐具去除污渍的方法，该方法包括在适合于清洁该物体的条件下将该织物或餐具与包括本发明的蛋白酶的组合物接触。在本发明的清洁方法中，正在清洁的物体可以是任何适合的物体，例如纺织品或硬表面，例如餐具或地板、桌子、墙壁等。
还考虑了使用一种或多种本发明的蛋白酶变体处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。蛋白酶可以用于本领域熟知的任何织物处理方法中(参见，例如US 6,077,316)。例如，在一个方面，通过包括使该织物与溶液中的蛋白酶接触的方法改善织物的触感和外观。在一个方面，在压力下用该溶液处理该织物。
本发明的洗涤剂组合物适用于衣物和硬表面应用，包括餐具洗涤。相应地，本发明包括用于洗涤织物或洗涤餐具的方法，该方法包括使待清洁的织物/餐具与包含根据本发明的洗涤剂组合物的溶液接触。织物可以包含在正常消费者使用条件下能够被洗涤的任何织物。餐具可以包含任何餐具，例如陶器、用餐工具、陶瓷、塑料(例如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。溶液优选地具有约5.5至约11.5的pH。可以在溶液中按以下浓度使用组合物：约100ppm(优选地500ppm)至约15,000ppm。水温范围典型地是从约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、和约90℃。水对织物比率典型地是从约1:1至约30:1。
可以使用常规稳定剂和蛋白酶抑制剂稳定化本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂和蛋白酶抑制剂例如，多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、不同的盐例如NaCl；KCl；乳酸、甲酸、硼酸、或者硼酸衍生物(例如芳族硼酸酯)、或者苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)、或者肽醛(例如二肽醛、三肽醛或四肽醛或醛类似物)(或者具有形式B1-B0-R，其中R是H、CH3、CX3、CHX2、或CH2X(X＝卤素)，B0是单个氨基酸残基(优选地具有任选地经取代的脂肪族或芳族侧链)；并且B1由一个或多个氨基酸残基(优选一个、两个或三个)组成，任选地包含N-末端保护基团，或者如在WO 2009/118375、WO 98/13459中描述的)或者蛋白质类型的蛋白酶抑制剂，例如RASI、BASI、WASI(水稻、大麦和小麦的双功能α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂)或CI2或SSI。该组合物可以如例如WO 92/19709、WO 92/19708、和US 6,472,364中所述的进行配制。在一些实施例中，本文采用的这些酶由存在于为这些酶提供此类离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)、和/或镁(II)离子的水溶性来源，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)、以及氧钒(IV))稳定化。
本文提供的洗涤剂组合物被典型地这样配制，使得用于水性清洁操作过程中时，洗涤水具有以下pH：从约5.0至约12.5，例如从约5.0至约11.5，或从约6.0至约10.5。在一些实施例中，将颗粒或液体衣物洗涤产品配制成具有从约6至约8的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的技术人员熟知的。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
多肽的制备和纯化
通过本领域已知的标准方法进行突变并将表达盒引入枯草芽孢杆菌中。所有DNA操纵都是通过PCR(例如，如描述于Sambrook等人,2001)使用本领域技术人员已知的标准方法进行的。将编码蛋白酶多肽的重组枯草芽孢杆菌构建体接种到复合培养基(TBgly)中，并且在37℃下在抗生素选择下培养24h。用过夜培养物以1:100的比率接种含有丰富培养基(PS-1：100g/L蔗糖(丹尼斯克公司目录号109-0429)、40g/L大豆皮(大豆粉)、10g/LNa2HPO4·12H2O(默克公司(Merck)目录号106579)、0.1ml/L Dowfax63N10(陶氏公司(Dow))的摇瓶。在30℃下以270rpm摇动进行4天摇瓶培养。
如下进行培养上清液的纯化：将培养液以26,000x g离心20分钟，并小心地从沉淀物倒出上清液。上清液通过Nalgene 0.2μm过滤单元装置以便去除宿主细胞的剩余物。用3MTris碱将0.2μm滤液中的pH调节至pH 8，并将pH调节的滤液施加到在20mM Tris/HCl、1mMCaCl2(pH 8.0)中平衡的MEP Hypercel柱(颇尔公司(Pall Corporation))。用平衡缓冲液洗涤柱后，将该柱用20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2(pH 4.5)逐步洗脱。使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析，并且合并峰级分。将来自该MEP Hypercel柱的合并物的pH用20％(v/v)CH3COOH或3M Tris碱调节至pH 6，并且将经pH调节的合并物用去离子水稀释至与20mM MES/NaOH、2mM CaCl2(pH 6.0)相同的电导率。将经稀释的合并物施加至在20mM MES/NaOH、2mM CaCl2(pH 6.0)中平衡的
Figure BDA0004094098810000641
快流柱(GE医疗公司(GE Healthcare))上。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将蛋白酶变体用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0→0.5M)经五个柱体积进行洗脱。使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定分析来自柱的级分的蛋白酶活性，并且通过SDS-PAGE分析活性级分。将级分(其中在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅观察到一个条带)合并为纯化的制剂并且用于进一步的实验。
蛋白酶活性测定
可以通过采用Suc-AAPF-pNA底物的方法确定蛋白水解活性。Suc-AAPF-pNA是N-琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且它是可以通过内切蛋白酶切割的封闭肽。在蛋白水解切割后，具有黄颜色的游离pNA分子被释放出来，并且它可以通过可见光分光光度法在波长405nm处进行测量。该Suc-AAPF-PNA底物由巴亨公司(Bachem)制造(目录号L1400，溶解于DMSO中)。
将待分析的蛋白酶样品稀释于残余活性缓冲液(100mM Tris，pH 8.6)中。通过转移30μl的稀释的酶样品至96孔微量滴定板并添加70μl底物工作溶液(0.72mg/ml于100mMTris，pH 8.6中)进行该测定。将溶液在室温混合并且在OD 405nm处经5分钟每20秒测量吸收。
在给定的一组条件下，时间依赖性吸收曲线的斜率(吸光度/分钟)与所讨论的蛋白酶的活性成正比。应该将蛋白酶样品稀释至其中斜率为线性的水平。
实例1.蛋白酶变体的改善的溶解度
定义：
发酵液：
·ACB＝在发酵液中的完全蛋白酶活性(包括结晶的蛋白酶)。
·ACB SUP＝在发酵液中的溶解蛋白酶活性。
·ACB PEL＝在发酵液中的小颗粒蛋白酶活性(包括结晶的蛋白酶)。
·AINIT＝在发酵液中的溶解蛋白酶活性的百分比。
蛋白酶结晶溶解：
·AFULL＝在稀释的发酵液中的完全蛋白酶活性(包括结晶的蛋白酶)。
·AEXP＝基于发酵液的蛋白酶活性以及稀释因子的稀释的发酵液的预期完全蛋白酶活性：
Figure BDA0004094098810000651
·ASUP＝在稀释的发酵液中的溶解蛋白酶活性。
·ACORR＝在发酵液中的测量的活性与在稀释的发酵液中的预期完全蛋白酶活性的差异(以百分比计)：
Figure BDA0004094098810000652
·ADISS＝在稀释的发酵液中的蛋白酶的溶解级分(以百分比计)：
Figure BDA0004094098810000653
材料与方法：
在发酵液中的初始的溶解蛋白酶活性：
收获宿主细胞的发酵液，这些宿主细胞表达在对应于SEQ ID NO:1的位置A215的位置处具有和不具有取代的蛋白酶变体，并且分析发酵液的蛋白酶结晶。蛋白酶结晶的存在通过光学显微镜(Olympus BX51)和X射线粉末衍射(XRPD，帕纳科公司(PANalytical)Empyrean)来确认，如晶体学报(Acta Cryst.)(Frankaer,C.G.等人,(2014).Acta Cryst.[晶体学报]D70,1115-1123)中所述。
通过研究溶解蛋白酶活性(非结晶的蛋白酶级分)作为在发酵液中的初始的溶解蛋白酶活性(AINIT)来评估结晶溶解度/形成。收集以下样品：
·ACB：完全发酵液样品(包括结晶的蛋白酶)
·ACB SUP：上清液样品(溶解的蛋白酶)
·ACB PEL：来自培养液的含有结晶蛋白酶的小颗粒样品。
通过高速离心(5min，10.000xRCF，20℃)对ACB SUP和ACB PEL进行取样并分级。随后通过上文所述的蛋白酶活性测定来分析样品。将ACB和ACB SUP中的蛋白酶活性用于通过以下计算AINIT：
Figure BDA0004094098810000661
其中AINIT是在发酵液中的溶解蛋白酶活性的百分比。将活性ACB PEL样品用作对照以评估蛋白酶活性的质量平衡。最终，将蛋白酶+A215X变体的AINIT相对于不具有A215X取代的相同蛋白酶(即，蛋白酶-A215X)的AINIT进行归一化，得到在发酵液中的初始的溶解蛋白酶活性的差异(其以增加倍数给出)：
Figure BDA0004094098810000662
其中A215X表示在蛋白酶变体中在对应于SEQ ID NO:1的位置A215的位置处引入的特定的取代(例如，A215K)。
蛋白酶结晶溶解：
为了评估在对应于SEQ ID NO:1的位置A215的位置处具有和不具有取代的蛋白酶变体的结晶溶解，用H2O将发酵液稀释五倍，用乙酸(20％)将pH水平调节至pH 4.5，并且用CaCl2(34％)将电导率调节至9mS/cm。溶解在20℃的恒温下充分混合下进行。
在溶解后立即开始实验。在总共15min和60min后，收集完全蛋白酶活性样品(AFULL)和上清液蛋白酶活性样品(ASUP)。ASUP样品通过高速离心(5min，10.000xRCF，20℃)进行取样并且倒出上清液。随后通过上文所述的蛋白酶活性测定来分析所有样品。
为评估发酵液中的结晶溶解，基于发酵液的蛋白酶活性和稀释因子来计算预期完全蛋白酶活性(AEXP)：
Figure BDA0004094098810000671
通过计算ACB和AFULL之间的差异(即，在发酵液中的测量的活性和在发酵液中的预期完全蛋白酶活性之间的差异)，将溶解实验期间收集的AFULL样品用于验证AEXP：
Figure BDA0004094098810000672
其中ACORR以百分比给出。
通过计算在60min时的溶解的蛋白酶的级分(ADISS)来评估结晶溶解：
Figure BDA0004094098810000673
最终，将蛋白酶+A215X的ADISS相对于不具有A215X取代的相同蛋白酶的ADISS进行归一化，得到在发酵液中的蛋白酶结晶溶解的差异(其以增加倍数给出)：
Figure BDA0004094098810000674
其中ADISS_T60表示在60分钟时的ADISS值。
结果：
表1示出了A215X变体在培养液中的初始的溶解蛋白酶活性。如可以看到的，在五种测试的蛋白酶中，A215K取代使在发酵液中测量的初始的溶解蛋白酶活性产生了2.9至15.6倍的增加。另外，取代A215Q和A215N分别使初始的溶解活性增加了5.1倍和2.4倍。A215T取代具有更细微的影响，增加了1.1倍，并且对于A215S变体，则没有观察到对初始的溶解活性的影响。这些数据表明引入A215X取代使蛋白酶结晶形成的程度降低。
Figure BDA0004094098810000675
Figure BDA0004094098810000681
表2示出了A215X变体在60min后的溶解蛋白酶活性。如可以看到的，对于测试的所有五种蛋白酶，A215K取代使溶解蛋白酶活性增加了1.1至6.0倍。取代A215Q、A215N、A215T和A215S使结晶溶解度增加了1.6至4.3倍。尽管A215S取代不影响蛋白酶结晶形成的程度(参见表1)，但该取代使60min后的溶解活性增加了1.7倍。因此，这些数据表明引入A215X取代使蛋白酶结晶的溶解度增加。
Figure BDA0004094098810000682
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 具有改善的溶解度的蛋白酶变体
<130> 15273-WO-PCT
<160> 6
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）
<400> 1
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）
<400> 2
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
260 265 270
Ala Ala Gln
275
<210> 3
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:1的变体
<400> 3
Ala Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Asp Gly Glu Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 4
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:1的变体
<400> 4
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Asp Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Ser Ile Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly
85 90 95
Ala Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp
100 105 110
Ala Gly Asn Asn Gly Met Asp Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro
115 120 125
Ser Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg
130 135 140
Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp
165 170 175
Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Glu Leu Asp
180 185 190
Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr
195 200 205
Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly
210 215 220
Ala Ala Ala Leu Val Leu Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln
225 230 235 240
Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn
245 250 255
Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265 270
<210> 5
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:1的变体
<400> 5
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Glu Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Arg Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Phe Gly Leu Gly Thr Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu Ser Thr Trp Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asp Thr Trp Glu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 6
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:1的变体
<400> 6
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Glu Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Arg Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu Ser Thr Trp Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asp Thr Trp Glu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265

Claims (23)

1.一种亲本蛋白酶的蛋白酶变体，其中该变体与SEQ ID NO:1具有至少至少80％但小于100％的序列同一性；
其中该变体包含选自由以下组成的组的第一取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T；
其中该变体包含至少三个另外的选自由以下组成的组的改变，优选地取代：X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)；
其中该变体具有蛋白酶活性；并且
其中位置编号基于SEQ ID NO:2的编号。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶变体，其中该第一取代选自由以下组成的组：X215K、X215Q、X125N、X215S和X215T；优选地，该第一取代选自由以下组成的组：X215K、X215Q、X125N和X215T。
3.根据权利要求1所述的蛋白酶变体，其中该第一取代选自由以下组成的组：A215K、A215R、A215Q、A215N、A215S和A215T；优选地，该第一取代选自由以下组成的组：A215K、A215Q、A215N、A215S和A215T；最优选地，该第一取代选自由以下组成的组：A215K、A215Q、A215N和A215T。
4.根据权利要求1所述的蛋白酶变体，其中该至少三个另外的改变，优选地取代，选自由以下组成的组：S3T、V4I、S9E、I35ID、N43R、N76D、S99D、S99F、S101E、S101L、S103A、S103T、V104I、H120D、G160S、G195E、V205I、Q206L、Y209W、K235L、S259D、N261W和L262E。
5.根据权利要求4所述的蛋白酶变体，其中该至少三个另外的改变，优选地取代，选自由以下组成的组：
a)S3T、V4I、S99D、S101E、S103A、G160S和V205I；
b)I35ID、N76D、H120D、G195E、K235L；
c)S9E、N43R、N76D、S99F、S101L、S103T、V104I、V205I、Q206L、Y209W、S259D、N261W和L262E；以及
d)S9E、N43R、N76D、V205I、Q206L、Y209W、S259D、N261W和L262E。
6.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白酶变体，与该亲本蛋白酶相比，该蛋白酶变体具有改善的溶解度；优选地，与该亲本蛋白酶相比，溶解度改善至少4％，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、或更高。
7.根据权利要求6所述的蛋白酶变体，其中该亲本蛋白酶是除不具有该第一取代且不具有该至少三个另外的改变，优选地取代外其他方面相同的蛋白酶，该第一取代选自由以下组成的组：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T并且该至少三个另外的改变，优选地取代选自由以下组成的组：X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)。
8.根据权利要求6所述的蛋白酶变体，其中与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6相比，该变体具有改善的溶解度。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的蛋白酶变体，其中该蛋白酶变体在10℃-30℃下，优选地在15℃-25℃下，最优选地在20℃下具有改善的溶解度。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的蛋白酶变体，其中该蛋白酶变体在pH 3-9下，优选地在pH 4-8下，更优选地在pH 4-6下，甚至更优选地在pH 4-5下，最优选地在pH 4.5下具有改善的溶解度。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的蛋白酶变体，其中该蛋白酶变体在15℃-25℃和pH 4-6下，优选地在20℃和pH 4-5下具有改善的溶解度。
12.根据权利要求6-11中任一项所述的蛋白酶变体，其中根据实例1将改善的溶解度确定为减少的蛋白酶结晶形成和/或增加的蛋白酶结晶溶解度。
13.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白酶变体，与该亲本蛋白酶相比，该蛋白酶变体具有同等或改善的蛋白酶活性；优选地，该蛋白酶活性是至少100％，例如，至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％。
14.根据权利要求13所述的蛋白酶变体，其中该亲本蛋白酶是除不具有该第一取代且不具有该至少三个另外的改变，优选地取代外其他方面相同的蛋白酶，该第一取代选自由以下组成的组：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T并且该至少三个另外的改变，优选地取代选自由以下组成的组：X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的蛋白酶变体，其中与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6相比，该变体具有同等或改善的蛋白酶活性。
16.一种多核苷酸，该多核苷酸编码根据权利要求1-15中任一项所述的蛋白酶变体。
17.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含根据权利要求16所述的多核苷酸。
18.一种宿主细胞，该宿主细胞表达根据权利要求1-15中任一项所述的蛋白酶变体。
19.一种用于获得根据权利要求1-15中任一项所述的蛋白酶变体的方法，该方法包括：
(a)向亲本蛋白酶中引入选自由以下组成的组的第一取代：X215K、X215R、X215Q、X125N、X215S和X215T；以及引入至少三个另外的选自由以下组成的组的改变，优选地取代：X3T(例如，S3T)、X4I(例如，V4I)、X9E(例如，S9E)、I35ID、X43R(例如，N43R)、X76D(例如，N76D)、X99D(例如，S99D、X99F(例如，S99F)、X101E(例如，S101E)、X101L(例如，S101L)、X103A(例如，S103A)、X103T(例如，S103T)、X104I(例如，V104I)、X120D(例如，H120D)、X160S(例如，G160S)、X195E(例如，G195E)、X205I(例如，V205I)、X206L(例如，Q206L)、X209W(例如，Y209W)、X235L(例如，K235L)、X259D(例如，S259D)、X261W(例如，N261W)和X262E(例如，L262E)；其中该变体具有蛋白酶活性；以及
(b)回收该变体。
20.一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含根据权利要求1-15中任一项所述的蛋白酶变体以及一种或多种洗涤剂组分。
21.根据权利要求20所述的洗涤剂组合物，其中该组合物可以处于以下形式：条，均匀的片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，糊剂，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体。
22.根据权利要求20所述的洗涤剂组合物，其中该组合物处于液体形式。
23.根据权利要求1-15中任一项所述的蛋白酶变体或根据权利要求20-22所述的洗涤剂组合物在清洁过程，优选地衣物洗涤或硬表面清洁例如餐具洗涤，例如，自动餐具洗涤中的用途。
CN202180052570.3A 2020-08-28 2021-08-30 具有改善的溶解度的蛋白酶变体 Pending CN116323932A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20193301.7 2020-08-28
EP20193301 2020-08-28
EP21156744.1 2021-02-12
EP21156744 2021-02-12
PCT/EP2021/073869 WO2022043547A1 (en) 2020-08-28 2021-08-30 Protease variants with improved solubility

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116323932A true CN116323932A (zh) 2023-06-23

Family

ID=77726470

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180052557.8A Pending CN116323931A (zh) 2020-08-28 2021-08-30 降解聚酯的蛋白酶变体
CN202180052570.3A Pending CN116323932A (zh) 2020-08-28 2021-08-30 具有改善的溶解度的蛋白酶变体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180052557.8A Pending CN116323931A (zh) 2020-08-28 2021-08-30 降解聚酯的蛋白酶变体

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20230265408A1 (zh)
EP (2) EP4204547A1 (zh)
JP (1) JP2023538773A (zh)
CN (2) CN116323931A (zh)
CA (1) CA3186910A1 (zh)
MX (1) MX2023002095A (zh)
WO (2) WO2022043547A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2024050346A1 (en) * 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Detergent compositions and methods related thereto

Family Cites Families (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (zh) 1969-05-29 1972-11-22
EP0218272B1 (en) 1985-08-09 1992-03-18 Gist-Brocades N.V. Novel lipolytic enzymes and their use in detergent compositions
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5989870A (en) 1986-04-30 1999-11-23 Rohm Enzyme Finland Oy Method for cloning active promoters
US4810414A (en) 1986-08-29 1989-03-07 Novo Industri A/S Enzymatic detergent additive
US5389536A (en) 1986-11-19 1995-02-14 Genencor, Inc. Lipase from Pseudomonas mendocina having cutinase activity
DE3854249T2 (de) 1987-08-28 1996-02-29 Novo Nordisk As Rekombinante Humicola-Lipase und Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Humicola-Lipasen.
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
NZ234059A (en) 1989-06-13 1992-05-26 Genencor Int Method of killing cells by acid treatment; composition therefor
GB8915658D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
JP3220137B2 (ja) 1989-08-25 2001-10-22 ヘンケル・リサーチ・コーポレイション アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法
DK0548228T3 (da) 1990-09-13 1999-05-10 Novo Nordisk As Lipasevarianter
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
EP0511456A1 (en) 1991-04-30 1992-11-04 The Procter & Gamble Company Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme
ES2085024T3 (es) 1991-04-30 1996-05-16 Procter & Gamble Detergentes liquidos reforzados con complejo de acido borico-poliol para inhibir la enzima proteolitica.
RU2108320C1 (ru) 1991-12-13 1998-04-10 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Активатор пероксида водорода и композиция для отбеливания или дезинфекции на его основе
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
EP0651794B1 (en) 1992-07-23 2009-09-30 Novozymes A/S MUTANT $g(a)-AMYLASE, DETERGENT AND DISH WASHING AGENT
DK0867504T4 (da) 1993-02-11 2011-08-29 Genencor Int Oxidativ stabil alfa-amylase
EP0652946B1 (en) 1993-04-27 2005-01-26 Genencor International, Inc. New lipase variants for use in detergent applications
FR2704860B1 (fr) 1993-05-05 1995-07-13 Pasteur Institut Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire.
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
BR9407767A (pt) 1993-10-08 1997-03-18 Novo Nordisk As Variante de enzima &-amilase uso da mesma construção de DNA vetor de express o recombinante célula processos para produzir uma &-amilase hibrida e para preparar uma variante de uma &-amilase aditivo detergente e composições detergentes
AU7853194A (en) 1993-10-13 1995-05-04 Novo Nordisk A/S H2o2-stable peroxidase variants
JPH07143883A (ja) 1993-11-24 1995-06-06 Showa Denko Kk リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
ATE222604T1 (de) 1994-02-22 2002-09-15 Novozymes As Methode zur herstellung einer variante eines lipolytischen enzymes
US6599730B1 (en) * 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
JP3851656B2 (ja) 1994-05-04 2006-11-29 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド 改善された界面活性剤耐性を有するリパーゼ
DK0765394T3 (da) 1994-06-03 2001-12-10 Novozymes As Oprensede Myceliopthora-laccaser og nukleinsyrer der koder for disse
WO1995035381A1 (en) 1994-06-20 1995-12-28 Unilever N.V. Modified pseudomonas lipases and their use
AU2884695A (en) 1994-06-23 1996-01-19 Unilever Plc Modified pseudomonas lipases and their use
EP0777737B1 (en) 1994-06-30 2005-05-04 Novozymes Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
CN1167503A (zh) 1994-10-26 1997-12-10 诺沃挪第克公司 一种具有脂解活性的酶
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
EP0839186B1 (en) 1995-07-14 2004-11-10 Novozymes A/S A modified enzyme with lipolytic activity
WO1997007202A1 (en) 1995-08-11 1997-02-27 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzymes
AU6513096A (en) 1995-07-19 1997-02-18 Novo Nordisk A/S Treatment of fabrics
DE19528059A1 (de) 1995-07-31 1997-02-06 Bayer Ag Wasch- und Reinigungsmittel mit Iminodisuccinaten
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
EP0929639B1 (en) 1996-09-24 2002-11-13 The Procter & Gamble Company Liquid detergents containing proteolytic enzyme, peptide aldehyde and calcium ions
JP2001502369A (ja) 1996-10-08 2001-02-20 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 染料前駆体としてのジアミノ安息香酸誘導体
HUP0000117A2 (hu) 1996-10-18 2000-06-28 The Procter And Gamble Company Mosószerkészítmények
ES2436066T3 (es) 1997-10-13 2013-12-26 Novozymes A/S Mutantes de alfa-amilasa
US5955310A (en) 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
JP2003530440A (ja) 1998-10-13 2003-10-14 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 洗剤組成物または成分
ATE332968T1 (de) 1998-10-26 2006-08-15 Novozymes As Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen
EP1137761B1 (en) 1998-12-04 2007-08-01 Novozymes A/S Cutinase variants
EP2278016B1 (en) 1999-03-22 2012-09-26 Novozymes Inc. Promoter sequences derived from Fusarium Venenatum and uses thereof
AU3420100A (en) 1999-03-31 2000-10-23 Novozymes A/S Lipase variant
EP2221365A1 (en) 2000-03-08 2010-08-25 Novozymes A/S Variants with altered properties
MXPA02011911A (es) 2000-06-02 2003-05-27 Novozymes As Variantes de cutinasa.
EP2204446A1 (en) 2000-08-01 2010-07-07 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
WO2003012036A2 (en) 2001-07-27 2003-02-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Systems for in vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides
GB0127036D0 (en) 2001-11-09 2002-01-02 Unilever Plc Polymers for laundry applications
ATE439422T1 (de) 2002-06-11 2009-08-15 Unilever Nv Waschmitteltabletten
EP1923455A3 (en) 2003-02-18 2009-01-21 Novozymes A/S Detergent compositions
CA2529726A1 (en) 2003-06-18 2005-01-13 Unilever Plc Laundry treatment compositions
GB0314211D0 (en) 2003-06-18 2003-07-23 Unilever Plc Laundry treatment compositions
GB0314210D0 (en) 2003-06-18 2003-07-23 Unilever Plc Laundry treatment compositions
WO2005056782A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Genencor International, Inc. Perhydrolase
WO2005105826A1 (ja) 2004-04-28 2005-11-10 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai チロペプチンａ類縁体
JP5166880B2 (ja) 2004-12-23 2013-03-21 ノボザイムス アクティーゼルスカブ α−アミラーゼ変異型
ATE404660T1 (de) 2005-03-23 2008-08-15 Unilever Nv Körperförmige wasch- oder reinigungsmittelzusammensetzungen
EP1869154B1 (en) 2005-04-15 2010-11-03 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions with alkoxylated polyalkylenimines
JP2008538378A (ja) 2005-04-15 2008-10-23 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 修飾ポリエチレンイミンポリマーおよびリパーゼ酵素を有する液体洗濯洗剤組成物
RU2394879C2 (ru) 2005-05-31 2010-07-20 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Полимерсодержащие моющие составы и их применение
CA2610018C (en) 2005-06-17 2011-09-20 The Procter & Gamble Company Organic catalyst with enhanced enzyme compatibility
TWI444478B (zh) 2005-10-12 2014-07-11 Genencor Int 儲存穩定性之中性金屬蛋白酶的用途與製造
US8518675B2 (en) 2005-12-13 2013-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of peracids using an enzyme having perhydrolysis activity
AR059157A1 (es) 2006-01-23 2008-03-12 Procter & Gamble Composiciones detergentes
HUE063025T2 (hu) 2006-01-23 2023-12-28 Procter & Gamble Enzimeket és szövetszínezõ anyagokat tartalmazó készítmények
US20070191249A1 (en) 2006-01-23 2007-08-16 The Procter & Gamble Company Enzyme and photobleach containing compositions
JP2009523900A (ja) 2006-01-23 2009-06-25 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー リパーゼと漂白剤触媒を含む組成物
EP1979477B1 (en) 2006-01-23 2017-04-19 Novozymes A/S Lipase variants
US20070191247A1 (en) 2006-01-23 2007-08-16 The Procter & Gamble Company Detergent compositions
EP1979457A2 (en) 2006-01-23 2008-10-15 The Procter and Gamble Company A composition comprising a lipase and a bleach catalyst
EP2024479B2 (en) 2006-05-31 2015-02-25 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions with amphiphilic graft polymers based on polyalkylene oxides and vinyl esters
DE202006009003U1 (de) 2006-06-06 2007-10-25 BROSE SCHLIEßSYSTEME GMBH & CO. KG Kraftfahrzeugschloß
DE602006020852D1 (de) 2006-07-07 2011-05-05 Procter & Gamble Waschmittelzusammensetzungen
RU2009149406A (ru) 2007-05-30 2011-07-10 ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН (US) Варианты альфа-амилазы с повышенными уровнями продукции в процессах ферментации
ES2364193T3 (es) 2007-07-02 2011-08-26 THE PROCTER &amp; GAMBLE COMPANY Composición para bolsa de múltiples compartimentos para el lavado de ropa.
JP5520828B2 (ja) 2007-11-05 2014-06-11 ダニスコ・ユーエス・インク 改変される特徴を有するバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ変異体
RU2470069C2 (ru) 2008-01-04 2012-12-20 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Композиция средства для стирки, содержащая гликозилгидролазу
WO2009092699A1 (en) 2008-01-24 2009-07-30 Unilever Nv Machine dishwash detergent compositions
US20090209447A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Michelle Meek Cleaning compositions
JP5650543B2 (ja) 2008-02-29 2015-01-07 ノボザイムス アクティーゼルスカブ リパーゼ活性を有するポリペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチド
BRPI0909084B1 (pt) 2008-03-26 2020-11-03 Novozymes A/S peptídeo aldeído, e, composição líquida
JP2012504390A (ja) 2008-09-30 2012-02-23 ノボザイムス，インコーポレイティド 糸状菌細胞におけるポジティブ及びネガティブ選択遺伝子の使用方法
EP2367923A2 (en) 2008-12-01 2011-09-28 Danisco US Inc. Enzymes with lipase activity
RU2560424C2 (ru) 2009-02-20 2015-08-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Способ получения состава ферментационного бульона
MX2011008656A (es) 2009-03-06 2011-09-06 Huntsman Adv Mat Switzerland Metodos de decoloracion-blanqueo enzimatico de textiles.
WO2010104675A1 (en) 2009-03-10 2010-09-16 Danisco Us Inc. Bacillus megaterium strain dsm90-related alpha-amylases, and methods of use, thereof
US20120028318A1 (en) 2009-03-18 2012-02-02 Danisco Us Inc. Fungal cutinase from magnaporthe grisea
EP2411510A2 (en) 2009-03-23 2012-02-01 Danisco US Inc. Cal a-related acyltransferases and methods of use, thereof
MX356282B (es) * 2009-12-09 2018-05-22 Danisco Us Inc Composiciones y metodos que comprenden variantes de proteasa.
JP2013515139A (ja) 2009-12-21 2013-05-02 ダニスコ・ユーエス・インク サーモビフィダ・フスカのリパーゼを含む洗剤組成物、及びその使用方法
CN102712880A (zh) 2009-12-21 2012-10-03 丹尼斯科美国公司 含有嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶的洗涤剂组合物及其使用方法
WO2011084599A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing bacillus subtilis lipase and methods of use thereof
MX342388B (es) 2010-02-10 2016-09-28 Novozymes As Variantes y composiciones que comprenden variantes con alta estabilidad en presencia de un agente quelante.
GB2477914B (en) 2010-02-12 2012-01-04 Univ Newcastle Compounds and methods for biofilm disruption and prevention
AR081423A1 (es) 2010-05-28 2012-08-29 Danisco Us Inc Composiciones detergentes con contenido de lipasa de streptomyces griseus y metodos para utilizarlas
BR112013025811A2 (pt) 2011-04-08 2016-11-29 Danisco Us Inc "composição e método para remover uma mancha de base lipídica de uma superfície"
MX353621B (es) 2011-06-30 2018-01-22 Novozymes As Variantes de alfa-amilasa.
DK3543333T3 (da) 2011-06-30 2022-02-14 Novozymes As Fremgangsmåde til screening af alfa-amylaser
EP2732018B1 (en) 2011-07-12 2017-01-04 Novozymes A/S Storage-stable enzyme granules
CA2874061A1 (en) 2012-06-08 2014-01-09 Danisco Us Inc. Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers
CA2893454C (en) 2012-12-07 2022-04-19 Novozymes A/S Washing method for textiles
MX2017006695A (es) 2014-12-04 2017-08-21 Novozymes As Variantes de subtilasa y polinucleotidos que las codifican.
EP3227425A1 (en) * 2014-12-04 2017-10-11 Novozymes A/S Liquid cleaning compositions comprising protease variants
US10508269B2 (en) * 2015-03-13 2019-12-17 Carbios Polypeptide having a polyester degrading activity and uses thereof
EP4212609A1 (en) 2015-05-08 2023-07-19 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
WO2016203064A2 (en) * 2015-10-28 2016-12-22 Novozymes A/S Detergent composition comprising protease and amylase variants
US10731111B2 (en) * 2015-11-25 2020-08-04 Conopco, Inc. Liquid laundry detergent composition
CN109415421B (zh) 2016-05-03 2023-02-28 诺维信公司 α-淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸
MX2019007024A (es) * 2016-12-16 2019-08-16 Carbios Proteasas de degradacion de plastico mejoradas.
BR112019015943A2 (pt) 2017-02-01 2020-04-07 Novozymes As variantes de alfa-amilase
US11549105B2 (en) * 2017-12-21 2023-01-10 Carbios Proteases and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20230323330A1 (en) 2023-10-12
WO2022043563A1 (en) 2022-03-03
CA3186910A1 (en) 2022-03-03
MX2023002095A (es) 2023-03-15
WO2022043547A1 (en) 2022-03-03
US20230265408A1 (en) 2023-08-24
JP2023538773A (ja) 2023-09-11
EP4204547A1 (en) 2023-07-05
EP4204548A1 (en) 2023-07-05
CN116323931A (zh) 2023-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10450553B2 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
EP3122875B1 (en) Beta-glucanase variants and polynucleotides encoding same
WO2015091990A1 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
EP3017032A2 (en) Polypeptides having anti-redeposition effect and polynucleotides encoding same
WO2015144932A1 (en) Enzyme variants and polynucleotides encoding same
EP2941485A1 (en) Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
EP2925849A2 (en) Polypeptides for cleaning or detergent compositions
US20230265408A1 (en) Protease variants with improved solubility
WO2015091959A2 (en) Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
US11001821B2 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
EP3362558A1 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
EP3405572B1 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
EP3011021A1 (en) Polypeptides having amylase activity and polynucleotides encoding same
US20190002863A1 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination