MX2010013101A - Composiciones y metodos que comprenden proteasas microbianas variantes. - Google Patents
Composiciones y metodos que comprenden proteasas microbianas variantes.Info
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Abstract
La presente invención provee subtilisinas variantes y composiciones que comprenden por lo menos una subtilisina variante expuesta aquí, así como métodos para usar estas variantes y composiciones. En algunas modalidades, la presente invención provee subtilisinas variantes adecuadas para aplicaciones de limpieza de ropa.
Description
OSICIONES Y METODOS QUE COMPRENDEN PROTEASAS MICR
VARIANTES
Campo de la Invención
La presente invención provee subtilisinas v mposiciones que comprenden por lo menos una sub nte expuesta en la presente, así como métodos p variantes y composiciones. En particular, la ción provee proteasas variantes adecuada aciones de limpieza de ropa.
Antecedentes de la Invención
Las serina proteasas son un subgrupo de c lasas que comprenden una clase diversa de enz n una amplia gama de especificidades y f gicas. Se ha conducido mucha investigación s
idad mejorada sobre aquellas actualmente cono
écnica.
Sumario de la Invención
La presente invención provee subt
antes y composiciones que comprenden por lo m
ilisina variante expuesta en la presente, a
dos para usar estas variantes y composició
as modalidades, la presente invención
easas variantes adecuadas para aplicacio
ieza de ropa.
La presente invención provee varian
ilisina aisladas que comprenden por lo m
unto de los siguientes conjuntos de sustitució
-G128A-Y217Q, G97A-L126A-G128A, G97A-L126A-G128A- Q, G97A-L126A-Y217Q, G97A-M124V-G128A, G97A-M124V-G128A-Y217Q, G
G-M124V, L96T-N123G-M124V-G128A, L96T-N123G-M124V-L126A, L96T-N Q, L96T-N123G-Y217Q, M124V-G128A-Y217Q, M124V-L126A-G128A, M124V-A-Y217Q, M124V-L126A-Y217Q, N123G-G128A-Y217Q, N123G-L126A-G128A, A-G128A-Y217Q, N123G-L126A-Y217Q, N123G-M124V-G128A, N123G-M124V-Q, N123G-M124V-L126A, N123G-M124V-L126A-G128A, N123G-M124V-L126A G-M124V-Y217Q, N62Q-G128A-Y217Q, N62Q-G97A-G128A, N62Q-G97A-G128 -G97A-L126A, N62Q-G97A-L126A-G128A, N62Q-G97A-L126A-Y217Q, N62Q- -G97A-M 124V-G128A, N62Q-G97A-M124V-L126A, N62Q-G97A-M124V-Y217 -N123G, N62Q-G97A-N123G-G128A, N62Q-G97A-N123G-L126A, N62Q-G97A- V, N62Q-G97A-N123G-Y217Q, N62Q-G97A-Y217Q, N62Q-L126A-G128A, N62 A-Y217Q, N62Q-L126A-Y217Q, N62Q-L96T-G128A, N62Q-L96T-G128A-Y217Q, , N62Q-L96T-G97A-G128A, N62Q-L96T-G97A-L126A, N62Q-L96T-G97A-M124 -G97A-N123G, N62Q-L96T-G97A-Y217Q, N62Q-L96T-L126A, N62Q-L96T-L126 -L96T-L126A-Y217Q, N62Q-L96T-M124V, N62Q-L96T-M124V-G128A, N62Q-L A, N62Q-L96T-M124V-Y217Q, N62Q-L96T-N123G, N62Q-L96T-N123G-G128A, G-L126A, N62Q-L96T-N123G-M124V, N62Q-L96T-N123G-Y217Q, N62Q-L96T- -M124V-G128A, N62Q-M124V-G128A-Y217Q, N62Q-M124V-L126A, N62Q-M1 A, N62Q-M124V-L126A-Y217Q, N62Q-M124V-Y217Q, N62Q-N123G-G128A, N A-Y217Q, N62Q-N123G-L126A, N62Q-N123G-L126A-G128A, N62Q-N123G-L12 -N 123G-M124V, N62Q-N123G-M124V-G128A, N62Q-N123G-M124V-L126A, N V-Y217Q, y N62Q-N123G-Y217Q,
onde las sustituciones están en posiciones equiva
T, G97T-G128S-Y217D, G97D-G128A-Y217I, G97Q-G128S-Y217Q, G97G-G12 -G128A-Y217N, G97S-G128A-Y217M, G97S-G128S-Y217N, G97S-G128S-Y21 S-Y217M, G97S-G128P-Y217Q, G97T-G128S-Y217Q, G97D-G128S-Y217Q-A7 S-Y217N, G97G-G128A-Y217I, G97Q-G128A-Y217D, G97Q-G128S-Y217M, G Q-S162P, G97S-G128S-Y217D, G97T-G128P-Y217I, G97Q-G128G-Y217E, G97 ?, G97D-G128S-Y217H, G97M-G128S-Y217L, G97M-G128S-Y217N, G97S-G1 -G128S-Y217I, G97A-G128P-Y217A, G97R-G128S-Y217D, G97D-G128A-Y21 G-Y217D, G97V-G128G-Y217E, G97A-G128G-Y217T, G97G-G128N-Y217L, G T, G97M-G128A-Y217E, y G97M-G128A-Y217N,
nde las sustituc iones están en pos iciones equiva
os iciones de subt il is ina BPN ' expuestas en SEQ I
La presente invención además provee varia
l i sina ais ladas que comprenden por lo menos un
s siguientes conj untos de sust itución :
S87D-Q206E, P40E-A144K-K213L, N61E-P129E-S159K, S87D- -K265N, S87D-T242R-Q275E, N61E-Q103E-N240K, S87D-T242R-K265N, N62R-E, P129E-S145D-N240K, P129E-P239R-K265N, Q103E-P129E-T242R, P40E-N61E -T242R, S24R-N62R-S87D-S145D-K265N, P40E-N62R-S87D-Q103E-S162K, S24 -S159K-K213L, S24R-S87D-A144K-K265N-Q275E, N61E-P129E-S162K-K213L-
-Q103E-A144K-Q206E-K213L-N240K-T242R, S24R-Q103E-P129E-S145D-P239R N, N61E-Q103E-P129E-K213L-P239R-N240K-T242R, N61E-Q103E-Q206E-K213 K-T242R, S24R-P40E-N61 E-S87D-Q 103E-S 159K-S 162K-K213L-N240K, N61 E-N E-S159K-S162K-K213L-T242R-Q275E, P40E-N62R-S87D-S145D-S159K-S162K- N-Q275E, N62R-S87D-S145D-S159K-S162K-K213L-N240K-K265N-Q275E, S24R E-P129E-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-N61E-Q103E-P129E-S145D- K-T242R-K265N, N61 E-S 87D-Q 103E-P 129E-S 159K-S 162K-K213L-N240K-T242 -Q103E-P129E-A144K-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-Q103E-P129E-S145D R-N240K-T242R-K265N, N61E-Q103E-P129E-A144K-Q206E-K213L-P239R-N240 -P40E-N61E-S87D-Q103E-P129E-A144K-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-P4 E-P 129E-A 144K-K213 L·P239R-N240K-T242R-K265N, S24R-P40E-N61 E-Q 103E- K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-P40E-N61E-Q103E-P129E-A144K- L-P239R-N240K-T242R, S24R-N61E-S87D-Q103E-P129E-A144K-Q206E-K213L- K-T242R, P40E-N61E-S87D-Q103E-S145D-S159K-S162K-K213L-P239R-N240K- -N61 E-Q 103E-P 129E-S 162K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-N61 E-Q K-S145D-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, P40E-N61E-Q103E-P129E-A144 ?-?213L-P239R-N240K-T242R, S24R-N61 E-Q 103E-P 129E-A 144K-Q206E-K21 )K-T242R-K265N, y S24R-P40E-N61E-S87D-Q103E-P129E-A144K-S162K-Q R-N240K-T242R,
onde las sust ituc iones están en pos iciones equiva
os ic iones de subt il i sina BPN ' expuestas en SEQ I
-F58G, S53G-S78N, S53G-Y104N, S53G-I11 1V, S53G-A114G,
-N117S, S53G-S125A, S53G-S132N, S53G-P239V, F58G-S78N, F58G-Y104N, F58 -A114G, F58G-N117S, F58G-S125A, F58G-S132N, F58G-P239V, S78N-Y104N, S7 -A114G, S78N-N117S, S78N-S125A, S78N-S132N, S78N-P239V, Y104N-I111V, Y G, Y104N-N117S, Y104N-S125A, Y104N-S132N, Y104N-P239V, II 11 V-Al 14G, I -S125A, I111V-S132N, I111V-P239V, A1 14G-N117S, A114G-S125A, A114G-S13 V, N117S-S125A, N117S-S 132N, N117S-P239V, S125A-S132N, S125A-P239V, S1 -F58G-S78N, S53G-F58G-Y104N, S53G-F58G-I11 1V, S53G-F58G-A114G, S53G- -F58G-S125A, S53G-F58G-S132N, S53G-F58G-P239V, S53G-S78N-Y104N, S53G -S78N-A1 14G, S53G-S78N-N117S, S53G-S78N-S125A, S53G-S78N-S132N, S53G V, S53G-Y104N-I111V, S53G-Y104N-A114G, S53G-Y104N-N117S, S53G-Y104N- -Y104N-S132N, S53G-Y104N-P239V, S53G-I111V-A1 14G, S53G-I1 11V-N117S, S A, S53G-I111V-S132N, S53G-I111V-P239V, S53G-A114G-N117S, S53G-A114G-S G-S132N, S53G-A114G-P239V, S53G-N117S-S125A, S53G-N117S-S132N, S53G-V, S53G-S125A-S132N, S53G-S125A-P239V, S53G-S132N-P239V, F58G-S78N-Y -I111V, F58G-S78N-A114G, F58G-S78N-N117S, F58G-S78N-S125A, F58G-S78N- -S78N-P239V, F58G-Y104N-I111V, F58G-Y104N-A114G, F58G-Y104N-N117S, F A, F58G-Y104N-S132N, F58G-Y104N-P239V, F58G-I111V-A114G, F58G-I111V- -S125A, F58G-I111V-S 132N, F58G-I111V-P239V, F58G-A114G-N117S, F58G-A1 -A114G-S132N, F58G-A114G-P239V, F58G-N1 17S-S125A, F58G-N117S-S 132N, V, F58G-S125A-S132N, F58G-S12 A-P239V, F58G-S132N-P239V, S78N-Y104N-I N-A114G, S78N-Y104N-N117S, S78N-Y104N-S125A, S78N-Y104N-S 132N, S78N V, S78N-I111 V-Al 14G, S78N-I111 V-Nl 17S, S78N-I111 V-S 125 A, S78N-I111 V-S 1
s posiciones de subtilisina BPN' expuestas en
La presente invención también provee vari lisina que comprenden las sustituciones G97A/G12 e comprenden además por lo menos uno de los subc sustitución anteriores, y en donde las ?? sponden a las posiciones de subtilisina de BPN' : 1.
La presente invención también provee icos aislados que codifican las variantes de sub stas en la presente, así como vectores de expré enden estos ácidos nucleicos, y células hosped enden estos vectores de expresión.
La presente invención también provee compo impieza que comprenden por lo menos una vari lisina como se provee en la presente. En
zima adicionales seleccionados del grupo que con elulasas, peroxidasas, proteasas, celulasas, xi sas, fosfolipasas , esterases, cutinasas, pec tinasas, reductasas, oxidasas, fenol o igenasas, ligninasas, pululanasas,
sanasas, malanasas, ß-glucanasas , arabino ronidasa, condroitinasa, lacasa y amilasas, o me mismas. En algunas modalidades, las composici ieza comprenden además por lo menos un ilizador. En algunas modalidades adiciónal osiciones de limpieza comprenden por lo menos O. to en peso de por lo menos una variante de sub ista en la presente, y opcionalmente , un ing liar adecuado.
La presente invención también provee mé ieza, que comprende los pasos de: poner en cont
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención provee subtilisinas v posiciones que comprenden por lo menos una var lisina expuesta en la presente, así como méto estas variantes y composiciones. En particu nte invención provee proteasas variantes adecua aciones de limpieza de ropa.
En algunas modalidades, la presente i e medios para producir subtilisinas variantes co aciones comerciales en donde se desea la degra sis de polipéptidos , con la inclusión de compo impieza, así como componentes de alimentos para a samiento de textiles, acabado de pieles, proce rano, procesamiento de carne, procesamiento de al ración de hidrolizados de proteína, au stivos, composiciones microbicidas , compo
lgunas modalidades, la composición de limpiez gente para lavandería. En algunas modalidad gente para lavandería es un detergente para ag etergente de pH bajo, o un detergente compa idades adicionales, la presente invención provee limpieza, que comprenden el paso de poner en uperficie y/o un artículo que comprende una tela sición de limpieza que comprende por lo me nte de subtilisina.
Composiciones de limpieza
Las composiciones de limpieza de la ción se utilizan venta osamente por eje aciones de lavandería. De hecho, debido a las s de efectividad incrementada en solucio ratura más baja, las enzimas de la presente i
para adición a un proceso de limpieza. Cualqui osis individual adecuada también encuentra uso nte invención, que incluye pero no se limita a p tas, cápsulas de gelatina u otras unidades d iduales tales como polvos o líquidos pre-medi as modalidades, llenadores o materiales de veh yen para incrementar el volumen de la comp íales llenadores o de vehículo adecuado incluy e limitan a, varias sales de sulfato, carb ato así como talco, arcilla y similares. Los ma dores o de vehículo adecuados para compo das incluyen, pero no se limitan a, agua o a rios y secundarios de peso molecular bajo que les y dioles. Ejemplos de esos alcoholes incluy limitan a, metanol, etanol, propanol, e isoprop as modalidades, las composiciones contie
onales. El nivel requerido de enzima se logra ición de una o más variantes de proteasa de la ción. Típicamente, las composiciones de limpiez nte comprenden por lo menos aproximadamente 0. o en peso, de aproximadamente 0.0001 a aproxim e aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.5, o proximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 por c de por lo menos una de las proteasa variante nte invención.
Las composiciones de limpieza de la pres ían típicamente de tal manera que, durante el ciones de limpieza acuosas, el agua de lavado aproximadamente 5.0 a aproximadamente 11.5 o in imadamente 7.5 a aproximadamente 10.5. Las formu roducto líquido son típicamente formuladas para eto de aproximadamente 3.0 a aproximadamente
imadamente 5, y son típicamente libres de ioactivos que hidrolizan en ese ambiente de es tensioactivos incluyen agentes tensioact ilsulfato de sodio que comprenden por lo me ión óxido de etileno o incluso de aproximadame imadamente 16 moles de óxido de etilen siciones de limpieza típicamente comprenden una cíente de un modificador de pH, tal como hidr , monoetanolamina, o ácido clorhídrico para pr osición de limpieza con un pH neto de aproximadam imadamente 5. Esas composiciones típicamente co lo menos una enzima estable al ácido. En lidades, las composiciones son liquidas mientra S modalidades, son sólidas. El pH de las compo idas se mide típicamente como un pH neto. El pH Osiciones sólidas se mide como una solución co
én un medio para controlar la disponibilida asa variante durante el proceso de limpieza. En idades, la encapsulación incrementa el rendimi ) proteasa(s) variante (s) y/o enzimas adicionales cto, las proteasas variantes de la presente i ncapsuladas con cualquier material encapsulador ido en la técnica. En algunas modalidades, el sulador típicamente encapsula por lo menos p izador para la(s) proteasa(s) variante (s) de la ción. Típicamente, el material encapsulador es gua y/o dispersable en agua. En algunas modalid ial encapsulador tiene una temperatura de trans io (Tv) de 0°C o más alta. La temperatura de tr idrio se describe con más detalle en WO 97/1 ial encapsulador se selecciona de aquel que con hidratos, gomas naturales o sintéticas,
a microesfera hecha de plástico tal como termopl onitrilo, metaacrilonitrilo, poliacrilo etaacrilonitrilo y mezclas de los mismo esferas comercialmente disponibles que encuent yen aquellas suministradas por E kviksverken, Suecia) , y PM 6545, PM 6550, P
, EXTENDOSPHERES® , LUXSIL®, Q-CEL®, y SPHERIC Valley Forge, PA) > .
Como se describe en la presente, las p ntes de la presente invención encuentran uso pa etergentes de lavandería. Estas aplicaciones pon as bajo varios estreses ambientales. Las p ntes de la presente invención proveen ventaj s enzimas actualmente usadas, debido a su ad varias condiciones.
De hecho, hay una variedad de condiciones d
gua de lavado, mientras que un detergente amente tiene aproximadamente 667 ppm de com gentes en el agua de lavado. En Norte cularmente en los Estados Unidos, los dét amente tienen aproximadamente 975 ppm de com gentes presentes en el agua de lavado.
El sistema de concentración de detergen ye detergentes en donde menos de aproximadamente omponentes detergentes están presentes en el o. Los detergentes japoneses típicamente se co un sistema de concentración de detergente baja n aproximadamente 667 ppm de componentes dét ntes en el agua de lavado.
Una concentración de detergente media rgentes en donde entre aproximadamente 800 imadamente 2000 ppm de componentes detergente
omponentes detergentes están presentes en el o. Los detergentes europeos generalmente se c on sistemas de concentración de detergente alta n aproximadamente 4500-5000 ppm de com gentes en el agua de lavado.
En Latinoamérica los detergentes son gene gentes con mej orador de detergencia de fosfato ación y el intervalo de detergentes usa oamérica puede caer en las concentracio gentes media y alta ya que varían de 1500 ppm a omponentes detergentes en el agua de lavado. onó antes, Brasil típicamente tiene aproximadame de componentes detergentes en el agua de lav go, otras geografías con detergente con mejo gencia de fosfato de alta espumación, no lim países de Latinoamérica, pueden tener sist
imadamente 800 ppm a aproximadamente 20 grafías de concentración de detergente medias lo aproximadamente 975 ppm en los Estados U imadamente 1500 ppm en Brasil; a más de aproxim ppm ("geografías de concentración de detergente ejemplo aproximadamente 4500 ppm a aproximadame en Europa y aproximadamente 6000 ppm en geogra rador de detergencia de fosfato de alta espumacio
Las concentraciones de las soluciones de cas se determinan empíricamente. Por ejemplo, os Unidos, una máquina lavadora típica cont en de aproximadamente 64.4 L de solución de lav iguiente, a fin de obtener una concentra imadamente 975 ppm de detergente dentro de la avado aproximadamente 62.79 g de composición de ebe al medir a 64.4 L de solución de lava
ratura del agua de lavado en Europa es típicamen
60°C (v.gr., aproximadamente 40°C) .
Como un ejemplo adicional, diferentes ge
amente tienen diferentes durezas de agua. La du
se describe usualmente en términos de gramos p
2+Mg2+ mixto . La dureza es una medición de la can
o (Ca ) y magnesio (Mg ) en el agua. La mayor p
en los Estados Unidos es dura, pero el grado d
. El agua moderadamente dura (60-120 ppm) a du
pm) tiene 60 a 181 partes por millón (partes po
rtidas a gramos por litro es ppm # dividido en
ual a gramos por litro) de minerales de dureza.
Agua Gramos por litro Partes por mi
Suave Menos que 17.1 Menos que
Ligeramente dura 17.1 a 59.85 17 a 60 oderadamente dura 59.85 a 119.7 60 a 120
Dura 119.7 a 179.55 120 a 180
Muy dura Mayor que 179.55 Mayor que 1
gua en Japón es típicamente menor que la dureza forte América, usualmente menor que 68.4, por gramos por litro de Ca2f+Mg2+ mixto.
Por consiguiente, en algunas modalida nte invención provee proteasas variantes que miento de lavado sorprendente en por lo m nto de condiciones de lavado (v.gr., temperat , dureza del agua y/o concentración de detergen as modalidades, las proteasas variantes de la ción son comparables en rendimiento de lavado c ilisina proteasas. En algunas modalidades, las p ntes de la presente invención presentan rendimi o incrementados en comparación con subtilisina p cialmente disponibles en la actualidad. Por lo t as modalidades preferidas de la presente invenc asas variantes provistas aquí presentan est
imadamente 0.00001% a aproximadamente 10% en pe sición y el resto (v.gr., aproximadamente 99 imadamente 90.0%) comprende materiales auxili eza en peso de la composición. En otros aspect nte invención, las composiciones de limpieza nte invención comprenden por lo menos una nte a un nivel de aproximadamente 0.0 imadamente 10%, aproximadamente 0.001% a aproxim aproximadamente 0.001% a aproximadament imadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% en pe sición y el resto de la composición de limpieza imadamente 99.9999% a aproximadamente imadamente 99.999% a aproximadamente imadamente 99.995% a aproximadamente 99.5% en p ende materiales auxiliares de limpieza.
En algunas modalidades, las composici
adas incluyen aquellas de origen animal, ve biano. En algunas modalidades particu ridas, se usan proteasa microbianas. En idades, se incluyen mutantes químicame icamente modificados. En algunas modalida asa es una serina proteasa, preferiblemente una biana alcalina o una proteasa similar a t los de proteasas alcalinas incluyen subti cialmente aquellas derivadas de Bacillus ilisina, lentus, a yloliquefacients, sub sberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y sub Ejemplos adicionales incluyen aquellas p tes descritas en las patentes de E.U.A. Nos. RE 5,340, 5,700,676, 6,312,936, y 6,482,628, to es se incorporan aquí por referencia. Ejem easas adicionales incluyen, pero no se limitan a
,625, US RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,3 as otras patentes .
Además, cualquier lipasa adecuada encuentr resente invención. Las lipasas adecuadas incluy limitan a, aquellas de origen bacteriano o fúng ites químicamente o genéticamente modifica ados por la presente invención, ejemplos de s incluyen lipasas de Humicola lanuginosa (véase 58 068 y EP 305 216), lipasa de Rhizomucor miehei ., EP 238 023), lipasa de Candida, tales como l ntárctica (v.gr., la C. antárctica lipasa A o B
EP 214761) , lipasa de Pseudomonas tal como l lcaligenes y P. pseudoalcaligenes (véase, v. 72) , lipasa de P. cepacia (véase, v.gr., EP sa de P. stutzeri (véase, v.gr., GB1 , 372 , 034 ) , l escens, lipasa de Bacillus (v.gr. , lipasa de B.
como lipasa de R. delemar (véase, Hass et a 117-113
[1991]), una lipasa de R niveus (Kugi Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719
[1992]) y l e .
Otros tipos de enzimas lipolíticas tal asas también encuentran uso en algunas modalidad nte invención que incluyen, pero no se limita asa derivada de Pseudomonas mendocina (vé 9367) , y la cutinasa derivada de Fusarium so e, WO 90/09446) .
Lipasas adecuadas adicionales incluyen cialmente disponibles tales como MI LIPASE™, 1?? IPOMAX™ (Genencor) ; LIPOLASE® y LIPOLASE® zymes) y LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceut , Japón) .
En algunas modalidades de la presente in
aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% d so de la composición.
Cualquier amilasa (alfa y/o beta) adecua e en soluciones alcalinas encuentra un uso en idades de la presente invención. Las amilasas a yen, pero no se limitan a aquellas de origen ba ngico. Mutantes químicamente o genéticamente mod incluyen en algunas modalidades. Las amila ntran uso en la presente invención incluyen, pe an a, a-amilasas obtenidas de B. licheniformi GB 1 , 296 , 839 ) . Las amilasas comercialmente dis ncuentran uso en la presente invención incluyen, limitan a DURA YL®, TERMAMYL® , FUNGAMYL® zymes) y RAPIDASE® y MAXA YL® P (Genencor) .
En algunas modalidades de la presente composiciones de limpieza de la presente i
imadamente 0.5% de amilasa en peso de la composi
En algunas modalidades adicionales, c lasa adecuada encuentra uso en composiciones de a presente invención. Las celulasas adecuadas i no se limitan a, aquellas de origen bacte ico. Mutantes químicamente o genéticamente modifi yen en algunas modalidades. Las celulasas a yen, pero no se limitan a celulasas de Humicola Se v.gr., patente de E.U.A. No. 4,435,307). Las C cialmente adecuadas son las celulasas que ficios de cuidado de color (véase v.gr., EP 0 4 celulasas comercialmente disponibles que encuen a presente invención incluyen, pero no se li ZYME® (Novozymes) , y KAC-500(B)™ ( ao Corporat as modalidades, las celulasas se incorpor iones o fragmentos de celulasas de tipo silvestre
asas a un nivel de aproximadamente 0.0 imadamente 10%, aproximadamente 0.001% a aproxim aproximadamente 0.001% a aproximadament imadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de cel de la composición.
Cualquier mananasa adecuada para usa siciones detergentes también encuentra uso nte invención. Las mananasas adecuadas incluyen, imitan a, aquellas de origen bacteriano o ites químicamente o genéticamente modificados se lgunas modalidades. Varias mananasas son conoc s encuentran en la presente invención (véase te de E.U.A. No. 6,566,114, patente de E.U 2,842, y patente de E.U.A. No. 6,440,991, to s se incorporan aquí por referencia) . En lidades, las composiciones de limpieza de la
imadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de man de la composición.
En algunas modalidades, las peroxidasas se inación con peróxido de hidrógeno o una fuente d ., a percarbonato, perborato o persulfato) siciones de la presente invención. En Üdades alternativas, las oxidasas se usan en com xígeno. Ambos tipos de enzimas se usan para "bla ción" (es decir, para evitar la transferenci rante textil de una tela teñida a otra tela cu S son lavadas juntas en una solución de riblemente junto con un agente incrementador ., WO 94/12621 y O 95/01426) . Las peroxidasas/ adas incluyen, pero no se limitan a, aquellas d tal, bacteriano o fúngico. Mutantes química ticamente modificados se incluyen en algunas moda
imadamente 10%, aproximadamente 0.001% a aproxim aproximadamente 0.001% a aproximadament imadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de idasa y/u oxidasa en peso de la composición.
En algunas modalidades, las enzimas adi ntran uso, que incluyen pero no se li drolasas (véase v.gr., WO 05/056782) . Además, en idades particularmente preferidas, mezclas as anteriormente mencionadas son abarcadas nte, en particular una o más proteasa, amilasa, asa, y/o por lo menos una celulasa adiciona , se contempla que varias mezclas de estas trarán uso en la presente invención. Tam mpla que los niveles variables de las p ntes y una o más enzimas adicionales pueden endientemente a aproximadamente 10%, el rest
ueo, catalizadores de blanqueo, otras enzimas, ilizadores de enzima, quelantes, abrilla os, polímeros de liberación de suciedad, age ferencia de colorante, dispersantes, supres as, tintes, perfumes, colorantes, sales 11e tropos, fotoactivadores , fluorescentes, acondici elas, agentes tensioactivos hidrolizables , conser xidantes, agentes antiencogimiento, agentes anti icidas, funguicidas, motas de colores, cuidad , agentes antiherrumbre y/o anticorrosión, fu linidad, agentes solubilizantes , vehículos, auxil esamiento, pigmentos y agentes de control de p ., patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642, 6, 5,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,68 6,101, todas las cuales se incorporan a rencia) . Modalidades de materiales de composi
., cápsulas de gelatina, encapsulación, t ación física etc.).
A manera de ejemplo, varias composici eza en donde las proteasas variantes de la ción encuentran uso se describen con más det nte. En modalidades en las cuales las composic eza de la presente invención se formul siciones adecuadas para usarse en métodos de l na lavadora, las composiciones de la presente i riblemente contienen por lo menos un agente tens T lo menos un compuesto mejorador de detergen uno o más materiales auxiliares de riblemente seleccionados de compuestos pol icos, agentes blanqueadores, enzimas adic sores de espumas, dispersantes, dispersantes , agentes de suspensión de suciedad y antirrede
so de limpieza. En algunas modalidades, la den composiciones detergentes para lavandería en la de aproximadamente 400 a aproximadamente 1200 ras que en otras modalidades, varía de aproxim a aproximadamente 950 g/litro de composición
En algunas modalidades, varias composici eza tales como aquellas provistas en la pat . No. 6,605,458 encuentran uso con las p ntes de la presente invención. Por lo tanto, en idades, las composiciones que comprenden por proteasa variante de la presente invención sición de limpieza de telas granulada compacta, en otras modalidades, la composición es una com impieza de telas granulada útil en el lavado de , en modalidades adicionales, la composición
omposiciones detergentes para lavandería granu icular utilidad bajo condiciones de lavado eu esas (véase v.gr., patente de E.U.A. No. 6,610,6
Las composiciones de limpieza de la ción se formulan en cualquier forma adecuad aran por cualquier proceso escogido por el for los no limitantes de las cuales se describen tes de E.U.A. Nos. 5,879,584, 5,691,297, 5, 9,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, y 5, s las cuales se incorporan aquí por referencia. C a una composición de limpieza de pH bajo, el p osición se ajusta mediante la adición de un mate monoetanolamina o un material ácido tal como HC1
Aunque no es esencial para los propósito enté invención, el listado no limitante de au trados de aquí en adelante es adecuado para usars
poración de los mismos dependerá de la forma f omposición y la naturaleza de la operación de la cual se ha de usar. Los materiales au ados incluyen, pero no se limitan a oactivos, mejoradores de detergencia, tadores, agentes inhibidores de transfere ante, auxiliares de deposición, dispersantes, ionales y estabilizadores de enzima, ma íticos, activadores de blanqueo, reforzad ueo, peróxido de hidrógeno, fuente de peró geno, perácidos preformados, agentes de di érica, agentes de remoción/anti-redeposición de arcilla, abrillantadores, supresores de antes, perfumes, agentes de elasticidad de est izantes de telas, vehículos, hidrotropos, auxil samiento y/o pigmentos. Además de la s
el agente tensioactivo se selecciona de oactivos no iónicos, agentes tensioactivos an es tensioactivos catiónicos, agentes tensi íticos, agentes tensioactivos zwiteriónicos , ioactivos no iónicos semi-polares y mezclas s .
En algunas modalidades adicionales siciones limpiadoras de la presente invención co o más mejoradores de detergencia o sistemas mej etergencia. Los mejoradores de detergencia incluy e limitan a, las sales de metal alcalino, a olamonio de polifosfatos , silicatos de metal a natos d metal alcalino térreo y alcalino, mejora rgencia de aluminosilicato, compuesto carboxilato . Eter hidroxipolicarboxilatos , copolí rido maleico con etileno o éter vinilmetílic
siciones de limpieza en la presente contienen u tador. Agentes quelatadores adecuados incluyen tadores de cobre, hierro y/o manganeso y mezcla s .
En algunas modalidades adicionales siciones de limpieza provistas aquí conti iar de deposición. Los auxiliares de de ados incluyen polietilenglicol , polipropile arboxilato, polímeros de liberación de sucieda ácido politereftálico, arcillas tales como ca orillonita, atapulgita, ilita, bentonita, halo as de las mismas.
En algunas modalidades adicionales siciones de limpieza de la presente invención yen uno o más agentes inhibidores de transier ante. Los agentes inhibidores de transiere
sales, en los cuales el ácido policarboxílico c lo menos dos radicales carboxilo separados uno o más de dos átomos de carbono .
En algunas modalidades particularmente pre composiciones de limpieza comprenden una o más gentes que proveen rendimiento de limpie icios de cuidado de telas. Ejemplos de enzimas a yen, pero no se limitan a, hemícelulasas, pero asas, celulasas, xilanasas, lipasas, fosfo asas, cutinasas, pectinasas, queratinasas , red sas, fenoloxidasas , lipoxigenasas , lig anasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glu nosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, la sas, o mezclas de las mismas. Una combinación t óctel de enzimas aplicables convencionales que lo menos una proteasa, por lo menos una lipasa,
En algunas modalidades adicionales siciones de limpieza de la presente invención ejos de metal catalíticos. Un tipo de catali ueo que contiene metal es un sistema cataliz ende un catión de metal de transición de a lítica de blanqueo definida, tal como cationes d o, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno, o ma atión de metal auxiliar que tiene poca o nada a lítica de blanqueo, tal como cationes de zinc o a secuestrante que tiene constantes de est idas para los cationes de metal catalí liares, particularmente ácido etilendiaminotetra etilendiaminotetra (metilenfosfónico) y sales gua de los mismos. Esos catalizadores se descri te de E.U.A. No. 4,430,243.
En algunas modalidades, las composicione
nseñan por ejemplo en las patentes de E.U. ,936, y 5,595,967. En algunas modalidade siciones provistas aguí también incluyen adecú omplejo de metal de transición de un ligando policíclico (es decir, "MRL"). Como un asunto p a manera de limitación, las composiciones y pro ieza de la presente son ajustables, para pro de por lo menos una parte por cien millone cie de MRL activa en el medio de lavado ac riblemente proveerá de aproximadamente 0.005 imadamente 25 ppm, muy preferiblemen imadamente 0.05 ppm a aproximadamente 10 ppm riblemente aún de aproximadamente 0.1 imadamente 5 ppm, del MRL en la solución de lav ies de transición preferidos en el cataliz ueo de metal de transición de la presente
adecuada y se preparan por cualquier proceso el formulador, ejemplos no limitantes de los c iben en las patentes de E.U.A. Nos. 5, ,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,516,448, 5,489 ,303, todas las cuales se incorporan a encia .
Las composiciones de limpieza descrit ntran uso en limpieza de un lugar (v.g ficie, vajilla o tela) . Típicamente, por lo m ión del lugar se pone en contacto con una modalid nte composición de limpieza, en forma neta o di solución de lavado, y después el lugar es opcio o y/o enjuagado. Para propósitos de la ción, lavado" incluyen pero no se limitan a fro n mecánica. En algunas modalidades, las composic ieza típicamente se utilizan a concentraci
s en biología molecular, ingeniería de pr biología y ADN recombinante, que están den ce de la técnica. Esas técnicas son conocidas tos en la técnica y se describen en numerosos jos de referencia (véase v.gr. , Sambrook cular Cloning: A Laboratory Manual " , Segunda Spring Harbor) ,
[1989]); y Ausubel et al., cols in Molecular Biology"
[1987] ) . Todas las p itudes, artículos y publicaciones mencionadas nte, tanto anteriormente como posteriormente, so expresamente incorporados aquí por referencia.
A menos que se defina e otra manera en la p los términos técnicos y científicos usados aqu ismo significado que es comúnmente entendido to en la técnica al cual está dirigida esta en varios diccionarios disponibles y conocidos
l a menos que el contexto indique claramente ot valos numéricos son inclusivos de los núme en el intervalo. A menos que se indique otra c s nucleicos están escritos de izquierda a der tación 5 ' a 3'; las secuencias de aminoácido tos de izquierda a derecha en orientación xi, respectivamente. Cabe entender que esta inve limitada a los protocolos de metodología partic ivos descritos, ya que esos pueden variar, S xto en que sean usados por los expertos en la té
La práctica de la presente invención uti que se indique otra cosa, técnicas convenció icación de proteína, biología molecular, microb eas de ADN recombinante y secuenciación de pr las cuales están dentro del alcance de los exp mpo .
ctividad proteolítica" se refieren a proteína o presenta la capacidad para · hidrolizar pép atos que tienen enlaces peptídicos. dimientos bien conocidos existen para medir la a olítica (Kalisz, "Microbial Proteinases" , En: ) , Advances in Biochemical Engineering/Biotec ] ) . Por ejemplo, la actividad proteolítica s r mediante pruebas comparativas que analiz idad de la proteasa respectiva para hidrol ato comercial . Sustratos ilustrativos útiles isis de actividad de proteasa o proteolítica i no se limitan a di-metil caseína (Sigma eno de bovino (Sigma C-9879) , elastina de bovin 25) , y queratina de bovino (ICN Biomedical as colorimétricas que utilizan estos sustratos cidas en la técnica (véase v.gr., WO 99/34011; y
cción de color amarillo a partir de la reac lisis se mide a 410 nm en un espectrofotómet rcional a la concentración de enzima activa. Ade iones de absorbancia a 280 nm se pueden us minar la concentración de proteína total . La reí a activa/proteína total da la pureza de la enzim
Como se usa en la presente, "el género B ye todas las especies dentro del género "Bacillu onocido por los expertos en la técnica, que incl e limitan a B. subtilis, B. licheniformis, B. le isf B. stearothermophilus, B. alkalophil liquefaciens, B. clausii , B. halodurans, B. meg oagulans, B. circulans, B. lautus y B. thuringie ocido que el género Bacillus continú anización taxonómica. Por lo tanto, se pretend o incluya especies que han sido reclasificad
bacillus .
Los términos "polinucleótido" y "ácido nu s intercambiablemente en la presente, se refier polimérica de nucleótidos de cualquier longitud ucleótidos o desoxirribonucleótidos . Estos yen, pero no se limitan a, un ADN de cadena s cadena o triple cadena, ADN genómico, ADN ido de ADN-ARN, o un polímero que comprende a y pirimidina, u otras bases de nucleótidos na icamente, biológicamente modificadas, no natu adas . Los siguientes son ejemplos no limita ucleótidos: genes, fragmentos de gen, fr sómicos, ESTs, exones, introñes, ARNm, ARN zimas, ADNc, polinucleótidos recomb ucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN ualquier secuencia, ARN aislados de cualquier se
eambiablemente para referirse a ADN usad ducir secuencias en una célula hospedera u o dero. El ADN puede ser generado in vitro po squiera otras técnicas adecuadas conocidas tos en la técnica. En modalidades particu ridas, el constructo de ADN comprende una secu és (v.gr., como una secuencia de entrada) . En idades, la secuencia está operablemente enl ntos adicionales tales como elementos de control tores, etc.). El constructo de ADN ademá ender un marcador seleccionable . Además puede co secuencia de entrada flanqueada por cajas de no na modalidad adicional, el ADN transformante c secuencias no homologas, añadidas a los ., secuencias de relleno o flancos) . En idades, los extremos de la secuencia de entra
2) mutagenizar una región del cromosoma de la dera (es decir, reemplazar una secuencia endó ecuencia heteróloga) , 3) suprimir genes objetivo ducir un plásmido replicador en el hospedero.
Como se usa en la presente, los términos "c sión" y "vector de expresión" se refieren a con ácido nucleico generados recombinanteme ticamente, con una serie de elementos de ácido ificados que permiten transcripción de un ácido icular en una célula objetivo. El cásete de e binante se puede incorporar en un plásmido, er itocondrial , ADN de plástido, virus o fragmento ico. Típicamente, la porción de cásete de e binante del vector de expresión incluye, ent ncías, una secuencia de ácido nucleico que ha scrita y un promotor. En modalidades preferi
s expertos en la técnica .
Como se usa en la presente, el término "ve re a un constructo de polinucleótido diseña ducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de vectores incluyen vectores de clonación, vect esión, vectores de lanzadera, plásmidos, ca lares. En algunas modalidades, el constr ucleótido comprende una secuencia de ADN que cod easa (v.gr. , proteasa precursora o madura) q ablemente enlazada a una prosecuencia adecuada etora, etc.) capaz de efectuar la expresión de A edero adecuado .
Como se usa en la presente, el término "p efiere a un constructo de ADN de doble cad ular como un vector de clonación, y que forma un tico auto-replicable extracromosómico en
tics" en Hardwood et al, (eds.), Bacillus . shing Corp., páginas 57-72,
[1989]).
Como se usa en la presente, los sformados" y "establemente transformados" se r célula que tiene una secuencia de polinucleót a (heteróloga) integrada en su genoma o como un mal que es mantenido por lo menos por dos genera
Un ácido nucleico está "operablemente e o es colocado en una relación funcional c ncía de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN que íder secretor (es decir, un péptido de señal bléntente enlazado a ADN para un polipéptido sado como una preproteína que participa en la s polipéptido; un promotor o incrementado blemente enlazado a una secuencia codificante s ranscripción de la secuencia; o un sitio de
ele conformidad con la práctica convencional.
Como se usa en la presente el término " re a un polinucleótido (v.gr. , un segmento de A ica un polipéptido e incluye regiones que pr n a las regiones codificantes así como secue vención (intrones) entre segmentos codi iduales (exones) .
Como se usa en la presente, "genes homol ren a un par de genes de especies diferente mente relacionadas, que corresponden unas a otr idénticas o muy similares unas a otras. El términ que son separados por especiación (es de rollo de nuevas especies) (v.gr., genes ortólog genes que han sido separados por duplicación ., genes parálogos) .
Como se usa en la presente, las prote
n un origen evolutivo común (v.gr., sim cturales que se producen a partir de la física y as proteínas que favorecen ciertas disposici ue y topologías de cadena) .
Como se usa en la presente, "homología" se militud o identidad de secuencia, de las cu idad es preferida. Esta homología se determina so de técnicas estándares conocidas en la técnic
Smith y aterman, Adv. Appl . Math., 2:482 ernán y Wunsch, J. Mol. Biol . , 48:443
[1970]; P n, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444
[1988]; p como GAP, BESTFIT , FASTA, y TFASTA en el nsin Genetics Software Package (Genetics Compute son, WI) ; y Devereux et al, Nucí. Acid Res., 12 ] ) .
Como se usa en la presente, una "secuencia
ecuencia con la secuencia de la subtilisina pro silvestre. Alternativamente, secuencias análoga alineación de entre aproximadamente 70 a aproxim de los genes encontrados en la región de sub asa de B. amyloliquefaciens. En modalidades adic de una de las propiedades anteriores se apli ncia. Secuencias análogas se determinan por idos de alineación de secuencia. Un método de al mente usado es BLAST, aunque como se iormente y como se indica más adelante, exist os que también encuentran uso en secuen ación .
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP una alineación de secuencia múltiple a parti de secuencias relacionadas mediante el aciones en pares progresivas. También puede gra
Otro ejemplo de un algoritmo útil es el a , descrito por Altschul et al., (Altschul et
Biol., 215:403-410,
[1990]; y Karlin et al., Pro . Sci. USA 90:5873-5787
[1993]). Un programa cularmente útil es el programa WU-BLAST-2 chul et al., Meth. Enzymol . , 266:460-480 [1996 -2 usa varios parámetros de búsqueda, la mayorí es se establecen a los valores por omisi etros ajustables son los establecidos con los si res : alcance de traslape =1, fracción de tra 5, umbral de palabra (T) = 11. Los parámetros HSP on valores dinámicos y son establecidos por el o según la composición de la secuencia particul Osicion de la base de datos particular contra la a la secuencia de interés. Sin embargo, los en ser ajustados para incrementar la sensibil
úos de nucleótido en una secuencia candidata icos con el residuos de nucleótido de la secu io (es decir, la secuencia de interés) . Un rido utiliza el módulo de BLASTN de WU-BLAST-2 parámetros por omisión, con el alcance de trasl ión de traslape fijados a 1 y 0.125, respectivam
Como se usa en la presente, wrecombinante" rencia a una célula o vector, que ha sido mo ante la introducción de una secuencia de ácido róloga o que la célula es derivada de una cé ficada. Por lo tanto, por ejemplo, las binantes expresan genes que no se encuentran tica dentro de la forma nativa (no recombinante la o expresan genes nativos que son de ot almente expresados, sub-expresados o no son ex soluto como resultado de intervención humana del
mutante tienen más de aproximadamente 50%, imadamente 55%, más de aproximadamente 60%, imadamente 65%, más de aproximadamente 70%, imadamente 75%, más de aproximadamente 80%, imadamente 85%, más de aproximadamente 90%, imadamente 95%, o más de aproximadamente ogia con la secuencia.de tipo silvestre. En mod nativas, el ADN mutante es generado in vivo med e cualquier procedimiento mutagénico conocido t ejemplo, radiación, nitrosoguanidina y simila ncia de ADN deseada es después aislada y usada os provistos en la presente.
Como se usa en la presente, los ificación" y "amplificación de gen" se ref sos por los cuales las secuencias de ADN específ oporcionadamente replicadas de tal manera que
"Amplificación" es un caso especial de rep cido nucleico que implica especificidad de plant e contrastar con replicación de plantilla no es decir, replicación que es dependiente de la ap no dependiente de una plantilla específi ificidad de plantilla aquí se distingue de fide cación (es decir, síntesis de la secuen ucleótidos apropiada) y especificidad de nu - o desoxirribo- ) . La especificidad de plant ibe frecuentemente en términos de espec tivo" . Secuencias objetivo son "objetivos" en el ue han de ser buscadas para ser distribuidas nucleico. Las técnicas de amplificación h adas principalmente para esta distribución.
Como se usa en la presente, el término "ceb re a un oligonucleótido, ya sea que ocurra natu
ble cadena. Si es de doble cadena, el cebador pr para separar sus cadenas antes de usarse para ctos de extensión. Preferiblemente, el cebado desoxirribonucleótido . El cebador debe ientemente largo para cebar la síntesis de prod sión en presencia del agente inductor. Las lo as de los cebadores dependerán de muchos facto yen temperatura, fuente del cebador y el uso del
Como se usa en la presente, el término "s re a un oligonucleótido (es decir, una secue ótidos) , ya sea que ocurra naturalmente como tión por restricción purificada o p ticamente, recombinantemente o por amplificac que es capaz de hibridar a otro oligonucleó és. Una sonda puede ser de cadena sencilla o a. Las sondas son útiles en la detección, identi
Como se usa en la presente, el término "ob o se usa en referencia a la reacción en ca erasa, se refiere a la región de ácido nuclei los cebadores usados para reacción en ca erasa. Por lo tanto, se busca que el "objeti ribuido desde otras secuencias de ácido nucle entó" se define como una región de ácido nucleic secuencia objetivo.
Como se usa en la presente, el término "rea a de polimerasa" ("PCR") se refiere a los método tes de E.U.A. Nos. 4,683,195 4,683,202, y 4, rporadas aquí por referencia, que incluyen méto mentar la concentración de un segmento de una s tivo en una mezcla de AND genómico sin clon ficación. Este proceso para amplificar la s tivo consiste de introducir un gran exceso
formar un nuevo par de cadenas complementarl de desnaturalización, alineación de cebador y e olimerasa se pueden repetir muchas veces (es turalización, alineación y extensión constit o" ; puede haber numerosos "ciclos") para obte concentración de un segmento amplificado de la s ivo deseada. La longitud del segmento amplifica ncia objetivo deseada se determina por las o ivas de los cebadores uno con respecto a otro esta longitud es un parámetro controlable. E aspecto de repetición del proceso, el método se la "reacción en cadena de polimerasa" (de nte "PCR") . Debido a que los segmentos ampl dos de la secuencia objetivo se vuelven las se minantes (en términos de concentración) en la me que son "amplificados por PCR" .
re a la replicación y amplificación de secue En este método, la transcripción inversa es ac muy frecuentemente mediante el uso de procedim a en el cual se utiliza una polimerasa termo se describe en la patente de E.U.A. No. 5, pora aquí por referencia. En RT-PCR, la plantill convertida a ADNc debido a la actividad criptasa inversa de la polimerasa, y después amp nte el uso de la actividad de polimerizació erasa (es decir, como en otros métodos de PCR) .
Como se usa en la presente, los nucleasas de restricción" y "enzimas de restric ren a enzimas bacterianas, cada una de las cual e doble cadena en o cerca de una secuencia de nu ífica .
Un xxsitio de restricción" se refiere
idénticas. En una modalidad preferida, la int sómica es recombinación homologa.
Como se usa en la presente "aminoácido" se uencias de péptido o proteína o porciones de las términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" cambiablemente .
Como se usa en la presente, "proteína de in péptido de interés" se refiere
ína/polipéptido que es deseada y/o que es eval as modalidades, la proteína de interés es e celularment , mientras que en otras modalidades éptido secretado. En modalidades particu ridas, estas enzimas incluyen las serina proteas nte invención. En algunas modalidades, la pro és es un polipéptido secretado que es fusiona do de señal (es decir, una extensión amino-ter
étodos conocidos por los expertos en la técnic transcrito y/o traducido para producir el éptido o fragmento del mismo. La cadena anti-se cido nucleico se dice que codifica las secuenci noce en la técnica, un ADN puede ser transcrito polimerasa para producir ARN, pero un ARN pu crito en forma inversa por transcriptasa inve cir un ADN. Por lo tanto, un ADN puede codific ersa .
"Cepa hospedera" o "célula hospedera" se r deros adecuados para un vector de exprés ende ADN de conformidad con la presente invenció
Una enzima es "sobreexpresada" en una dera si la enzima es expresada en la célula a lto que el nivel a la cual es expresada en una c silvestre correspondiente.
la secuencia de señal y proteasa madura aria para la secreción de la proteasa. La dige osecuencia da por resultado una proteasa activa
El término "secuencia de señal" o "pép " se refiere a cualquier secuencia se nucleó ácidos que pueda participar en la secreción s madura o precursora de la proteína. Esta defin ncia se señal es una funcional, que signif ye todas aquellas secuencias de aminoácidos cod la porción N-terminal del gen de proteína, que p realización de la secreción de proteína. A menu niversalmente se encuentran unidas a la por nal de una proteína o a la porción N-terminal ína precursora. La secuencia de señal puede ser xógena. La secuencia de señal puede ser lmente asociada con la proteína (v.gr., prot
ncía de señal del gen que ha de ser expres as modalidades, se utilizan secuencias sintética
El término forma "madura" de una proteína o efiere a la forma funcional final de la pro do. Por ejemplo, la forma madura de la subtilis asa de la presente invención incluye por lo ncía de aminoácidos idéntica a las posici úos 1-275 de SEQ ID N0:1, como se expone a conti
PYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQ AGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAV VLGA GSGQYSWIINGIEWAIANNMDVI SAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSN ELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRS DSFYYGKGLINVQAAAQ (SEQ ID 0:1)
El término forma "precursora" de una pro do se refiere a la forma madura de la proteína q rosecuencia operablemente enlazada al amino o c nal de la proteína. El precursor puede te ncia de "señal" operablemente enlazada, al
as, aquellas enzimas naturalmente expres itradas en el microorganismo particular.
Los términos "derivado de" y "obtenido ren a no sólo una proteasa producida o produc epa del organismo en cuestión, sino también una icada por la secuencia de ADN aislada de esa cida en un organismo hospedero que contiene la s D . Además, el término se refiere a una proteas ficada por una secuencia de ADN de origen sinté y que tiene las características de identificaci asa en cuestión.
Un "derivado" , dentro del alcance ción, generalmente retiene la actividad prot terística observada en la forma de tipo si a u original a un grado que el derivado es ú sitos similares como la forma de tipo silvestre
ica serina proteasa de la presente invención s nucleicos o fragmentos que ocurren natur cidos sintéticamente o recombinantemente, y c a proteasa característica de la presente invenc s nucleicos de tipo silvestre que codifican asas de conformidad con la presente invención s y homólogos que ocurren naturalmente con bas eración del código genético conocido en la técni
El término "idéntico", en el contexto ncías de ácidos nucleico o de polipéptidos , se s residuos en las dos secuencias que son lo o se alinean para correspondencia máxima, como nte el curso de uno de los siguientes algor ración o análisis de secuencia siguientes.
El término "alineación óptima" se refie ación que da la puntuación de por ciento de i
entidad de secuencia de aminoácidos significa qu aminoácidos en dos secuencias de polipéptidos a rma óptima son idénticas.
La frase "sustancialmente idéntica" en el s aminoácidos o polpéptidos por lo tanto se refi ucleótido o polipéptido que comprende por l imadamente 70% de identidad de se riblemente por lo menos 75%, preferiblemente s aproximadamente 80%, preferiblemente por l imadamente 85%, preferiblemente por lo imadamente 90%, preferiblemente por lo imadamente 95%, preferiblemente por lo imadamente 97%, preferiblemente por lo imadamente 98%, y preferiblemente por l imadamente 99% de identidad de secuencia en cove una secuencia de referencia que usa los pro
ren sólo por una sustitución conservativa ación de que dos secuencias de ácido nucle ncialmente idénticas es que las dos moléculas otra bajo condiciones astringentes (v.gr., dent valo de astringencia media a alta) .
La frase "equivalente" , en este conte re a enzimas serina proteasas que son codificada ucleótido capaz de hibridar al polinucleót fica la proteasa de interés, bajo condici ingencia media a máxima. Por ejemplo, el alente significa que una proteasa de serina alente comprende por lo menos aproximadamente ienos aproximadamente 75%, por lo menos aproxim por lo menos aproximadamente 85%, por l imadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91% s aproximadamente 92%, por lo menos aproximadame
que el material es "purificado" cuando está pre composición particular en una concentración más baja de la que existe en un organismo que se aímente o de tipo silvestre o en combinac nentes que normalmente no están presentes bajo e n organismo que se presenta naturalmente o stre. Por ejemplo, un polinucleótido o polipép resenta naturalmente presente en un animal vivo do, pero el mismo polinucleótido o polipéptido lgunos o todos los materiales coexistentes en el al es aislado. En algunas modalidades ucleótidos son parte de un vector y/ ucleótidos o polipéptidos son parte de una compo mbargo son aislados ya que el vector o composici de su ambiente natural. En modalidades prefer que un ácido nucleico o proteína es purific
nte natural e incluyen ADNc y clones genómic ulas de ADN aisladas de la presente invención so ros genes con los cuales están ordinariamente as pueden incluir regiones 5' y 3' no traducidas que almente tales como promotores y terminado ificación de regiones asociadas será evidente to en la técnica (véase, v.gr., Dynan y Tijan, 774-78
[1985] ) . El término "una secuencia de ADN lternativamente referida como "una secuencia da" .
El término "aislada" , cuando se usa en refe proteína, se refiere a una proteína que se encu condición distinta que en su ambiente nativo, a preferida, la proteína aislada es sustancialmen otras proteínas, particularmente otras p logas . Una proteína aislada es más de aproximadam
Como se usa en la presente, el término "mut natoria" se refiere a métodos de los cuales se otecas de variantes de secuencias de inicio. otecas, las variantes contienen una o varias mu idas de un conjunto de mutaciones predefinido. métodos proveen medios para introducir mu orias, que no eran miembros del conjunto de mu finido. En algunas modalidades, los métodos los expuestos en la solicitud de patente de E. o serie 09/699,250, presentada el 26 de octubre porada aquí por referencia. En modalidades alter métodos de mutagénesis combinatoria abarc cialmente disponibles (v.gr., QuikChange® Mu agene, San Diego, CA) .
Como se usa en la presente, el término "bi utantes" se refiere a una población de células
cuencia múltiple" ( "MSA" ) se refiere a las secue ogos múltiples de un gen de inicio que son a nte el uso de algún algoritmo (v.gr., Clustal W) .
Como se usa en la presente, los términos "s onsenso" y "secuencia canónica" se refieren ncía de aminoácidos arquetípica con la cual t ntes de una proteína o secuencia de interés pa comparadas. Los términos también se refieren ncia que expone los nucleótidos que est entemente presentes en una secuencia de ADN de cada posición de un gen, la secuencia de consen ácido que es más abundante en esa posición en la
Como se usa en la presente, el término "mut nso" se refiere a una diferencia en la secuenc e inicio y una secuencia de consenso. Las mutac nso son identificadas al comparar las secuencias
cambios de aminoácidos individuales que reempl ácido del gen de inicio por un aminoácido que ante que el aminoácido en la MSA.
Como se usa en la presente, el término "bi utagénesis de consenso combinatoria increment ere a una biblioteca de CC que está dis truida con base en resultados de determinación s secuenciación a partir de una ronda ante génesis y determinación selectiva de CCM. En lidades, la biblioteca de CCM incrementada se ba encia de un acierto inicial que resulta de u rior de CCM. En modalidades adicionales, ementada está diseñada de tal manera que las mu se observaron frecuentemente en aciertos inic as anteriores de mutagénesis y determinaciones se favorecidas. En algunas modalidades preferidas,
minación selectiva en comparación con una bibli énesis de consenso combinatoria no dét tivamente. En modalidades preferidas, el pro minación selectiva remueve y/o reduce la abund ntes que contienen "mutaciones reducto miento" .
Como se usa en la presente, el término onal" se refiere a una prueba que provee una in a actividad de proteína. En modalidades particu ridas, el término se refiere a sistemas de prueb s una proteína es analizada para su capacid onar en su capacidad usual. Por ejemplo, en el as, una prueba funcional implica la determinaci ividad de la enzima para catalizar una reacción.
Como se usa en la presente, el término "p ivo" se refiere a la propiedad del gen de inici
El término "propiedad" o equivalentes gram mismo en el contexto de un ácido nucleico, como , se refieren a cualquier característica o atribu nucleico que puede ser seleccionada o detectad edades, incluyen pero no se limitan a, una propi a la unión a un polipéptido, una propiedad con célula que comprende un ácido nucleico particu edad que afecta la transcripción de gen tencia del promotor, reconocimiento de p ación del promotor, función del incrementado edad que afecta el procesamiento de ARN (v. me de ARN, estabilidad de ARN, conformación d icación post-transcripcional) , una propiedad qu raducción (v.gr., nivel, regulación, unión de ína ribosomal, modificación de post-traducció lo, un sitio de unión para un factor de transc
ificidad de sustrato, actividad catalítica, est ca, estabilidad alcalina, perfil de actividad tencia a degradación proteolítica, relac at / kcat/kM, doblez de proteína, que induce una r ológica, capacidad para unirse a un ligando, c unirse a un receptor, capacidad para ser se idad para ser desplegada sobre la superficie ia, capacidad para oligomerizar, capacida lizar, capacidad para estimular proliferación idad para inhibir proliferación celular, capaci ir apoptosis, capacidad para ser modific rilación o glicosilación, y/o capacidad para medad etc.
Los términos "secuencia modificada" y icados" se usan intercambiablemente en la prese irse a una secuencia que incluye una su
a secuencia de ácido nucleico) . En algunas moda inserción conduce a una proteína truncada (v.gr. nserción da por resultado la formación de un ción) . Por lo tanto, una inserción puede itado ya sea una proteína truncada o una ada como un producto de expresión.
Como se usa en la presente, los términos "s te" y "gen mutante" se usan intercambiablemen ren a una secuencia que tiene una alteración e s un codón que ocurre en una secuencia de tipo s a célula hospedera. El producto de expresió ncia mutante es una proteína con una secue ácidos alterada en relación con el tipo silve cto de expresión puede tener una capacidad f rada (v.gr., actividad enzimática incrementada).
Los términos "cebador mutagénic
onucleótido no mutagénico" se refiere a composic nucleótido que coincidirán en forma precisa con ico de la plantilla. En una modalidad de la
se usan cebadores mutagénicos. En otra m erida de la invención, los cebadores están dise manera que para por lo menos una región en la cu ido un cebador mutagénico, hay también ceb énico incluido en la mezcla de oligonucleóti ir una mezcla de cebadores mutagénicos y ceba génicos correspondientes a por lo menos uno dores mutagénicos, es posible producir una bibli o nucleico resultante en la cual una variedad de cionales combinatorios estén presentes. Por eje esea que algunos de los miembros de la bibli o nucleico mutante retengan su secuencia de prec tas posiciones mientras que otros miembros son
er el resultado de mutagénesis deseado. Con re ores mutagénicos y no mutagénicos correspondie ecesario que los oligonucleótidos correspondien icos en longitud, si no que solo hay traslap n correspondiente a la mutación que se ha de ebadores se pueden añadir en una relación predef rmidad con la presente invención. Por ejemplo que la biblioteca resultante tenga un Íficativo de cierta mutación especifica y un idad de mutación diferente en el mismo o diferent justar la cantidad de cebador agregado, es cir la biblioteca desviada deseada. Alternativam ar cantidades menores o mayores de cebad énicos, es posible ajustar la frecuencia con la ción(es) correspondiente se produzca en la bibli nucleico mutante.
resenta naturalmente en una célula hospedera. En idades, la secuencia de tipo silvestre se refie ncia de interés que es el punto de inicio de un ngeniería de proteína . La secuencia de tipo s codificar ya sea una proteína homologa o het proteína homologa es una que la célula h ciría sin intervención. Una proteína heterólog la célula hospedera no produciría excep rvención. A menos que se indique otra cosa, los osición de aminoácidos se refieren a aquellos asi secuencia de subtilisina madura de oliquefacients de SEQ ID NO: 1. La invenci go, no está limitada a la mutación de esta sub icular, sino que se extiende a proteasas precurs ienen residuos de aminoácidos en posiciones ivalentes" a los residuos identificados particu
diferentes en secuencia de la proteasa stre u original (v.gr. , subtilisina) .
Como se usa en la presente, los ficación" y "mutación" se refieren a cualquier ación en una secuencia de aminoácidos. Se pret érmino abarque sustituciones, supresiones, ins reemplazo de cadenas laterales de aminoácidos ncia de aminoácidos de interés (v.gr., una secu lisina) . También se pretende que el término icaciones químicas de una secuencia de aminoá és (v.gr., una secuencia de subtilisina).
El término "estable a la oxidación" se r asas de la presente invención que retienen una ífica de actividad enzimática durante un perí condiciones que prevalecen durante los olítico, hidrolizante , de limpieza u otros pro
n agente blanqueador u oxidante durante un perío ejemplo, por lo menos aproximadamente 1 imadamente 3 minutos, aproximadamente 5 r imadamente 8 minutos, aproximadamente 12 t imadamente 16 minutos, aproximadamente 20 minut lgunas modalidades, la estabilidad se mide ibe en los ejemplos.
El término "estable a quelatador" se re asas de la presente invención que retienen una ificada de actividad enzimática durante un perí ciones que prevalecen durante el proceso prote lizante, de limpieza u otro proceso de la invenc lo mientras se expone a o se pone en conta es quelatadores . En algunas modalidades, las p nen por lo menos aproximadamente 50%, aproxim aproximadamente 70%, aproximadamente
se describe en los ejemplos.
Los términos "térmicamente establ oestable" se refieren a proteasas de la ción que retienen una cantidad especificada de a ática después de la exposición a temp ificadas durante un período dado bajo condici lecen durante el proceso proteolítico, hidroliz ieza u otro proceso de la invención, por ejemplo expone a temperaturas alteradas. Las temp adas incluyen temperaturas incrementadas o dism lgunas modalidades, las proteasas retienen por imadamente 50%, aproximadamente 60%, aproxim aproximadamente 75%, aproximadamente imadamente 85%, aproximadamente 90%, aproxim aproximadamente 95%, aproximadamente imadamente 97%, aproximadamente 98%, o aproxim
camente y/o al pH se refiere a actividad prot ida más alta durante el tiempo en comparación c a proteasas (v.gr., subtilisina proteasas) y/o po silvestre.
El término "estabilidad disminuida" en el a proteasa estable a oxidación, quelatador, térm al pH se refiere a actividad proteolítica rete durante el tiempo en comparación con otras asas (v.gr. , subtilisina proteasas) y/o enzimas stre .
El término "actividad de limpieza" se re miento de limpieza logrado por la protea ciones que prevalecen durante el proceso prote lizante, de limpieza u otro proceso de la inven as modalidades, el rendimiento de limpieza se d la aplicación de varias pruebas de limpieza rela
Como se usa en la presente, "composici eza" y "formulaciones de limpieza", se ref siciones que encuentran uso en la remoción de COT seados de artículos que han de ser limpiados, ta , vajillas, lentes de contacto, otros sustratos lo (champúes) , piel (jabones y crema) , agues bucles, pastas de dientes), etc. El términ s quiera materiales/compuestos seleccionados particular de composición de limpieza deseado y roducto (v.gr., composición líquida, en gel, gra spersión) , siempre que la composición sea compat erhidrolasa y otras enzimas usadas en la composi ción específica de materiales de composición de ace fácilmente al considerar la superficie, ar que se ha de limpiar, y la forma deseada siciones para las condiciones de limpieza du
nas; limpiadores de alfombras; limpiadores de scantes de telas; suavizantes de telas; nadores de manchas de textiles y ropa a gentes para vajillas).
De hecho, el término "composición de li se usa en la presente, incluye al menos que se cosa, agentes de lavado en forma granulada o todos los propósitos o trabajo pesado, espec gentes de limpieza; agentes para lavado d sitos en forma líquida, de gel o pasta, espec denominados tipos líquidos de trabajo pesado gentes líquidos para telas finas; agentes par l de vajillas o agentes para lavado de vaji jo ligero, especialmente aquellos del tipo ación; agentes para lavado de vajillas en lav lias, que incluyen los diversos tipos de t
atamiento .
Como se usa en la presente, los osición detergente" y "formulación detergente" ferencia a mezclas que están diseñadas para usar de lavado para limpieza de objetos sucios. En idades preferidas, el término se usa en refe o de telas y/o prendas (v.gr., "detergent dería" ) . En modalidades alternativas, el tér re a otros detergentes, tales como aquellos usa ar vajillas, cubertería, etc. (v.gr., "detergen o de vajillas") . No se pretende que la ción este limitada alguna formulación o com gente particular. De hecho, se pretende que adem drolasa, el término abarque detergentes que c es tensioactivos, transferasa (s) , enzimas hidro reductasas , mej oradores de detergencia,
a técnica y se basan en muchos factores, tales asa particular usada, la aplicación de limpi sición especifica de la composición de limpieza ere una composición líquida o seca (v.gr., granu s) , etc .
El término "materiales auxiliares de li se usa en la presente, significa cualquier ido, sólido o gaseoso seleccionado para icular de composición de limpieza deseada y la f cto (v.gr. , composición líquida, granulada, en p , pasta, aspersión, tableta, gel ; o de espum iales también son preferiblemente compatibles a proteasa usada en la composición. En lidades, las composiciones granuladas están e acta" , mientras que en otras modalidade siciones líquidas están en una forma "concentrad
as tales como huevo, leche, pasto o sangre, mina por evaluación usual después de un ciclo d dar.
El término "rendimiento comparativo" en el ctividad de limpieza, se refiere a por l imadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70% aproximadamente 80% por lo menos aproximadament lo menos aproximadamente 95% de la actividad de na subtilisina proteasa comparativa (v.gr. , p cialmente disponibles) , que incluyen pero no se roteasa OPTIMASE™ (Genencor) , productos de
ECT ™ (Genencor) , proteasa SAVINASE ™ (Nov ntes de BNP' , (véase, v.gr., patente de E.U.A. 6) , proteasa RELASE™, DURAZY E™, EVERLASE™, K zymes) , proteasas AXACAL™, MAXAPEM™, PROP ncor; véase también, patente de E.U.A. No. Re 3
rar las proteasas de la presente invención con lisina proteasas en varias pruebas de ionadas con manchas sensibles a la enzima tal , sangre o leche, como se determina por meto trofotométricas o analíticas usuales desp ciones de ciclo de lavado estándares .
Como se usa en la presente, "composici eza de telas" incluyen composiciones detergent o de ropa a mano y en máquina lavadora que siciones aditivas de lavandería y compo adas para usarse en el remojo y/o pretratami sucias (v.gr. , ropas, ropas de cama y otros ma les) .
La forma "compacta" de las composici eza en la presente se refleja mejor por densid nos de composición, por la cantidad de sal 1
presente en cantidades que no exceden aproxim o muy preferiblemente aproximadamente 5% en pes sición. En algunas modalidades, las sales li ánicas se seleccionan de las sales de metal al alcalinotérreo de sulfatos y cloruros.
dora preferida es sulfato de sodio.
Como se usa en la presente, el término ioactivo" se refiere a cualquier compuesto gene ocido en la técnica como que tiene cualidades ac rficie. Los agentes tensioactivos generalmente estos aniónicos, catiónicos, no ióni teriónicos, que se describen adicionalmente ente .
Sección Experimental
La presente invención se describe con
os) ; mg (miligramos) ; µ9 (microgramos) ; pg (pico itros) ; mi y mL (mililitros) ; µ? y µ?. (microlit ímetros) ; mm (milímetros) ; µp? (mieras o micrómet metros) ; U (unidades) ; V (volts) ; PM (peso mol (segundos); min(s) (minuto/minutos); h y hr (hora (grados centígrados) ; CS (cantidad suficiente) ; izado) ; NA (no aplicable) ; rpm (revoluciones por (agua) ; dH20 (agua desionizada) ; HC1 (ácido clorh (aminoácido) ; bp (pares de bases) ; kb (kilop ) ; kD (kilodaltons) ; ADNc (ADN de c ementario) ; ADN (ácido desoxirribonucleico) ; AD adena sencilla) ; ADNdc (ADN de doble cadena fosfato desoxirribonucleótido) ; ARN (ácido ribonu (cloruro de magnesio) ; NaCl (cloruro de sod a volumen) ; v/v (volumen a volumen) ; g (grave sidad óptica) ; solución regulada en su pH por
0.25% TWEEN® 20); PEG (polietilenglicol ) ; PCR ( dena de polimerasa) ; RT-PCR (PCR-transcripción i
(dodecilsulfato de sodio) ;
(hidroximetil) aminometano) ; HEPES (ácido xietil] iperazino-N- [2 -etansulfónico] ) ; HBS ( a regulada en su pH con HEPES) ; Tris-HC roximetil] aminometan-clorhidrato) ; Tricina ( roximetil) -metil] -glicina) ; CHES (ácido 2- ( lamino) etan-sulfónico) / TAPS (ácido 3 oximetil ) -metil] -amino} -propansulfónico) ; CAPS ( lo-hexilamino) -propan-sulfónico ; DMSO (sulfóx ilo); DTT (1, 4-ditio-DL-treitol) ; SA (ácido si o s, 5-dimetoxi-4-hidroxi cinámico); TCA loroacético) ; Glut y GSH (glutatión reducido tatión oxidado); TCEP (Tris [ 2 -carboxietil] fosfi íes) ; mCi (miliCuries) ; Ci (microCuries)
masa o gen de resistencia a ampicilina) ; HDL (lí densidad) ; MJ Research (MJ Research, Ren lear (Baseclear BV, Inc., Leiden, Países ptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) gan (ThermoFinnigan, San José, CA) ; Argo alytica, Morris Plains, NJ) ; Seitz EKS (Sei rsystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania) ; Pal . , East Hills, NY) ; Spectrum (Spectrum Labor guez Rancho, CA) ; Molecular Structure (M ture Corp., Woodlands, TX) ; Accelrys (Accelrys iego, CA) ; Chemical Computing (Chemical Computin eal, Canadá); New Brunswick (New Brunswick Sci Edison, NJ) ; CFT (Center for Test Ma dingen, Países Bajos) ; Test Fabrics (Test Fabric
Pittiston, PA) , Procter & Gamble (Procter & , Cincinnati, OH) ; GE Healthcare (GE Healthcare,
o/BRL, Grand Island , NY) ; Sigma (Sigma Chemical , MO) ; Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscatawa
(National Center for Biotechnology Information) ; stems (Applied Biosystems, Foster City, C iences y/o Clontech (BD Biosciences atories, Palo Alto, CA) ; Operon Technologies ologies, Inc., Alameda, CA) ; MWG Biotech (MWG Point, NC) ; Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wils Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Pruss (D fco Laboratories, Detroit, MI) ; M ateen, Herndon, VA; Santa Cruz (Sant chnology, Inc, Santa Cruz, CA) ; Oxoid (Oxo sburg, NY) ; Worthington (Worthington Biochemic old, NJ) ; GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Technologi ersburg, MD) ; Milipore (Milipore, Billerica, M (Bio-Rad, Hercules, CA) ; Invitrogen (Invitrogen C
es (Molecular Devices, Corp, Sunnyvale, CA) ; R&D Systems, Minneapolis, M ) ; Stratagene (St ng Systems, La Jolla, CA) ; Marsh (Marsh Bios ster, NY) ; Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Al .0 (DNA2.0, Menlo Park, CA) ; Gene Oracle (Gene ain View, CA) ; Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, W Biacore (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) ; P oTech, Rocky Hill, NJ) ; SynPep (SynPep, Dublin, tive (New Objective brand; Scientific In ices, Inc., Ringoes, NJ) ; Waters (Waters, Inc.,
Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA) ; ex, Corp., Sunnyvale, CA) ; Monsanto (Monsanto , MO) ; intershall (Wintershall AG, Kassel, Al (BASF Co, Florham Park, NJ) ; Huntsman ( chemical Corp, Salt Lake City, UT) ; Enichem ica, Barcelona, España) ; Fruka Chemie AG (Fluk
stos más adelante se indican en los ejemplos.
A. Prueba de TCA para Determinación de Cont ína en Placas de Microtitulación de 96 Pozos
Para BPN' (v.gr., proteasa de refere ntes de BPN1 , esta prueba se inició mediante e nadante de cultivo filtrado de placas de microti crecieron 3-4 días a 33°C con agitación a 23 ión humidificada . Una placa de microtitulación de 96 pozos fresca (MTP) se usó para la ro, 100 µ?_/???? de HCl 0.25 N se puso en ca és, se añadió 50 de caldo de cultivo filt rsión de la luz/absorbancia a 405 nm (con el uso ezclado durante 5 seg en el lector de pla minó después, a fin de proveer la lectura del " la prueba, 100 µ?_/???? de 15% (p/v) d
? el tipo 9017 (Costar) .
Los cálculos se realizaron al sustraer el tes de la lectura de la prueba con TCA para proveer una iva del contenido de proteína en las muestras . Si ede crear una curva estándar al calibrar las lectur pruebas de AAPF de clones con factores de c idos. Sin embargo, los resultados de TCA son line cto a la concentración de proteína de 50 a 500 pro ppm) y por lo tanto se puede graficar directament miento de enzima para el propósito de escoger vari rendimiento. El incremento de turbidez/dispersión d s muestras se correlaciona con la cantidad total de pitable en el sobrenadante de cultivo.
B. Prueba de Proteasa AAPF en Pl titulación de 96 Pozos
ecimiento de suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388) . Para solución de trabajo de suc-AAPF-pNA, 1 mi de sol ecimiento de suc-AAPF-pNA se añadió a 100 mi regu is/Ca y se mezcló bien por lo menos durante 10 seg a se realizó mediante la adición de 10 µ? de sol asa diluida a cada pozo, inmediatamente seguida on de 190 µ? 1 mg/ml de solución de trabajo de Las soluciones se mezclaron durante 5 seg, y el c bancia en el modo cinético (20 lecturas en 5 min a 410 nm en un lector de MTP, a 25°C. La acti asa se expresó como AU (actividad = ??? min1 mi"1) .
C. Pruebas de Estabilidad a Agente Tensio tador
La estabilidad a LAS y LAS/EDTA se -midió de ación de la proteasa de prueba en presencia d
g se disuelve en aproximadamente 960 mi de agu usta a 8.2 con HCl 4N. La concentración final de mM .
Solución de abastecimiento de LAS: Se pre ión al 10.5 % de LAS en agua MQ (=10.5 g por 1
Regulador de pH TRIS - 100 mM / pH 8.6 (1 /0.005% de Tween®-80)
Regulador de pH TRIS-Ca, pH 8.6 (100 mM de CaC12/0.005% de Tween-®80)
Equipo :
MTPs de fondo redondo (Costar No. 9017)
Biomek FX
Multipipetas ASYS
Lector Spectramax MTP,
s de fondo plano se llenaron con regulador d ión y una alícuota del sobrenadante se añad o bien. La relación de dilución dependió ntración de los controles de proteasa en las p miento (actividad AAPF) . La concentración de da fue 80 ppm.
Diez µ? del sobrenadante diluido se añadier e regulador de pH LAS al 0.063%/pozo. La MTP s inta, se agitó durante unos cuantos segundos y s a incubadora (Innova 4230) a 45°C durante 60 m rpm de agitación. La actividad inicial (t=10 min minó después de 10 minutos de incubación al tr de la mezcla en cada pozo a una MTP fresca que µ? de solución de trabajo de suc-AAPF-pNA iones se mezclaron bien y la actividad de AAPF nte el uso de un lector de MTP (20 lecturas en 5
Método de Estabilidad a LAS/EDTA
La estabilidad de variantes de prote ncía de un agente tensioactivo aniónico repres alquilbecensulfonato lineal, dodecilbencensulf -DOBS) y EDTA de di-sodio se midió después de in condiciones definidas y la actividad resi minó mediante el uso de la prueba de AAPF. Los r s fueron dodecilbencensulfonato, sal de sodio No. D- 2525), TWEEN®-80 (Sigma No. P-8074), EDT (Siegfried Handel No. 164599-02), HEPES (Sigma , regulador de pH sin estrés: 50 mM de HEPES (1 05% de TWEEN®-80, pH 8.0, regulador de pH con es HEPES (11.9 g/1) , 0.1% de (p/v) DOBS (1 g/1) , (3.36 g/1), pH 8.0, sobrenadantes de cultivo de ferencia y variante de proteasa, que contenían 2 de proteína. El equipo usado fue MTP con fond
s que contienen regulador de pH sin estrés ntración de 25 ppm (placa de dilución maestra) estra de la placa de dilución maestra se añadió contenían 180 µ? de regulador de pH sin estrés concentración de incubación final de 2.5 p nidos se mezclaron y se mantuvieron a tem nte y se realizó una prueba de AAPF en esta plac estra de la placa de dilución maestra también s acas que contenían 180 µ? de regulador de pH co M de HEPES (11.9 g/1) , 0.1% (p/v) de DOBS (1 g/1 DTA (3.36 g/1), pH 8.0). Las soluciones se mez iatamente se colocaron en agitador de iEMS te 30 min a 400 rpm. Después de 30 min ación, se realizó una prueba de AAPF sobre la s. La estabilidad de las muestras se deter lar la relación de la actividad de AAPF re
ras retiene las propiedades de componen áticos. Por lo tanto, este método fue adecua rar detergentes comercialmente comprados para u r las variantes de enzima de la presente invenci
Micromuestras :
Micromuestras de 0.635 cm de diámetro cir ieron de CFT. Micromuestras individuales muestras se colocaron verticalmente en cada poz e 96 pozos para exponer el área de superficie en , no plana en el fondo del pozo) .
Prueba de micromuestra de BMI
Micromuestras que contenían sangre, leche ) de 0.635 cm de diámetro circular se obtuvieron S de cortar las muestras, la tela (EMPA 116) se
rminada a partir de la prueba de BCA) . La MTP cinta y se colocó en la incubadora durante 30 t agitación a 1400 rpm. Después de la incubación ciones apropiadas, 100 µ? de la solución de cada firió a una MTP fresca. La nueva MTP que contení olución/pozo se leyó a 405 nm mediante el us r de MTP SpectraMax. Los controles de testigo, ontrol que contenía dos micromuestras y deterge zima también se incluyeron.
Muestra "Pre- lavada"
Este tipo de micromuestra fue pre-lavada nizada durante 20 minutos a temperatura a és del paso de pre-lavado, las muestras se
toallas de papel para secarlas. Las muestras aire después se perforaron mediante el uso de
do previamente pesado (en una botella de vidri de agua a 95°C durante 2 horas. Los deterge aron de tiendas de supermercado locales. Ta gentes no calentados como calentados se probaro minutos de disolver el detergente para determ itud el porcentaje desactivado. La actividad a se probó mediante la prueba de AAPF.
Para probar la actividad de la enz gentes inactivados con calor, las soluciones de os detergentes se hicieron a partir de los mater ecimiento inactivados con calor. Cantidades ap reza de agua (102.6 gramos por litro) y regulad ñadieron a las soluciones detergentes para coinc condiciones deseadas. Las soluciones se mezcl er a acción de remolino o invertir las botellas.
s para pre-dilución de sobrenadante) . En esta proteasas hidrolizan el sustrato y liberan pi culas insolubles del sustrato. Por lo ta idad de turbidez es una medición de actividad de
El rendimiento de remoción de manchas d asas de referencia y variantes de las mi muestras se determinó en una escala de MTP en d ivado con calor comercialmente disponible. Los s fueron: 5 mM de HEPES, pH 8.0 ó 5 mM de OPS, pH de Ca: g para dureza de agua media. (CaCl2: MgC 00 gramos por litro (g/1) de material de abast do a 102.6 gramos por litro, 2 muestras re/leche/tinta) por placa: muestras de algodón de rocesadas por CFT: pre-enjuagadas y perforadas 2 ozo, y detergente frío fuera de anaquel TIDE® 2X i alor en el cual se confirmó falta de actividad de pr
La incubadora se fijó a la temperatura o 32°C) . 10 yL de muestras de la placa de ra de -10 ppm de enzima se añadió a placas con 2 MI con 190 yL de soluciones de detergente de das anteriormente. El volumen se ajustó para ntración final de 0.5 ppm para variantes en la rueba. Las placas fueron inmediatamente transf adoras iEMS y se incubaron durante 30 minutos de agitación a la temperatura dada. Después ación, 100 yL de sobrenadante fue transferid a placa de 96 pozos y la absorbancia se midi r de MTP a 405 nm y/o 600 nm. Pozos de cont enían 1 ó 2 micromuestras y detergente sin la ad tras de proteasa también se incluyeron en la pr ción a 405 nm provee un valor más alto y ra ción de pigmento, mientras que la medición a
y la enzima estándar (valor teórico) a l ntración de proteína. Además, los valores teó n calcular mediante el uso de los parámetro ión de Langmuir de la enzima estándar.
E. Actividad Específica Relativa de Prot ntes de las Mismas
A fin de discriminar las variantes de prot idad específica relativa se calculó mediante e APF-pNA como un sustrato, que permitió la compa ficación de las variantes versus la proteasa stre o estándar. La actividad específica sobre ato AAPF-pNA se determinó al dividir la a olítica por los valores de TCA medidos de cada nte el uso de las pruebas descritas anteriorm estos valores, se calculó la actividad es
proteasa estándar. Un índice de rendimiento (PI que 1 (PI>1) identifica una mejor vari ración con la estándar (v.gr. , tipo silvestre) , n PI de 1 (PI=I) identifica una variante que re que la estándar, y un PI que es menor que ifica una variante que tiene un rendimiento per dar. Por lo tanto, el PI identifica ganadores, ntes que son menos deseables para usarse bajo nstancias.
Ejemplo 2
imiento de Remoción de Manchas de Variantes de Bi de Mutaciones Múltiples (MML) de BPN1
Variantes de mutaciones múltiples de iotecas combinatorias) fueron producidas por G 2.0, con el uso de BPN' como la proteína orig
ío 1. La inactivación con calor de fórmulas de de eíales sirve para destruir la actividad en ena de cualesquiera componentes de proteína ne las propiedades de componentes no enzimáticos.
La inactivación con calor de los deterge izó al colocar cantidades previamente pes gente líquido (en una botella de vidrio) en un a 95 °C durante 2 horas. El detergente se c as de supermercado locales . Tanto los deterge tados como los calentados se probaron dentr os de disolver el detergente, para determi itud el porcentaje desactivado. La actividad a se probó mediante la prueba de AAPF. La funci ariantes de BPN' fue cuantificada como un ín imiento (Pi) (es decir, la relación de rendimient nte en relación con BPN1 original) . Los resul
Tabla 2-1
ores de Pi de Variantes de ???' probadas para Exp y Rendimiento de Remoción de Manchas (BMI pH 7/
BMI pH 8/32 °C)
igo de variante TCA BMI BMI
pH 8/16°C pH 7/16°C PH original 1.00 1.00 1.00
(BPN'Y217L) 1.01 1.12 1.08 *
-G128A-Y217Q 1.33 1.4 1.24
-L126A-G128A 0.56 0.83 0.85
-L126A-G128A-Y217Q 0.45 0.57 0.79
-L126A-Y217Q 1.11 1.32 1.24
-M124V-G128A 0.63 1.16 1.1
-M124V-G128A-Y217Q 0.52 1.12 1.04
-M124V-L126A 1.63 1.29 1.21
-M124V-L126A-G128A 0.66 1.04 1.15
-M124V-L126A-Y217Q 1.79 1.35 1.22
-M124V-Y217Q 0.72 0.05 0.05
-N123G-G128A 0.5 0.54 0.55
-N123G-G128A-Y217Q 0.36 0.5 0.59
-N123G-L126A 0.64 0.46 0.4
-N123G-L126A-G128A 0.47 0.05 0.12
-N123G-L126A-Y217Q 0.62 0.24 0.38
-N123G-M124V 0.38 0.38 0.34
-N123G-M124V-G128A 0.36 0.05 0.05
-N123G- 124V-L126A 0.58 0.4 0.4
-N123G-M124V-Y217Q 0.05 0.05 0.05
-N123G-Y217Q 0.55 1.35 1.24
6A-G128A-Y217Q 0.56 0.8 0.84
- - ^
-L126A-G128A-Y217Q 0.42 0.05 0.06 -L126A-Y217Q 0.51 0.11 0.06 -M124V-G128A 0.49 0.59 0.53 -M124V-G128A-Y217Q 0.42 0.34 0.54 -M124V-L126A 0.68 0.62 0.6 -M124V-L126A-G128A 0.48 0.05 0.08 -M124V-L126A-Y217Q 0.73 0.43 0.53 -M124V-Y217Q 0.51 1.23 1.06 -N123G-G128A 0.48 0.05 0.05 -N123G-G128A-Y217Q 0.49 0.05 0.09 -N123G-L126A 0.43 0.05 0.05 -N123G-L126A-G128A 0.48 0.05 0.05 -N123G-L126A-Y217Q 0.35 0.05 0.05 -N123G-M124V 0.51 0.05 0.05 -N123G-M124V-G128A 0.41 0.05 0.06 -N123G-M124V-L126A 0.42 0.06 0.14 -N123G-M124V-Y217Q 0.48 0.06 0.12 -N123G-Y217Q 0.45 0.15 0.05 V-G128A-Y217Q 0.77 1.27 1.18 V-L126A-G128A 0.72 1.12 1.1 V-L126A-G128A-Y217Q 0.52 1.21 1.22 V-L126A-Y217Q 1.71 1.39 1.16 G-G128A-Y217Q 0.13 1 1.25 G-L126A-G128A 0.49 0.13 0.17 G-L126A-G128A-Y217Q 0.39 0.13 0.11 G-L126A-Y217Q 0.91 0.37 0.43 G-M124V-G128A 0.6 0.05 0.13 G-M124V-G128A-Y217Q 0.63 0.05 0.05 G-M124V-L126A 0.81 0.48 0.44 G-M124V-L126A-G128A 0.46 0.24 0.47 G-M124V-L126A-Y217Q 0.71 0.35 0.44 G-M124V-Y217Q 0.6 0.35 0.42 -G128A-Y217Q 0.69 1.3 1.2 -G 7A- 12 A
Q-L96T-G128A 0.48 0.2 0.1 Q-L96T-G128A-Y217Q 0.9 0.11 0.26 Q-L96T-G97A 0.48 0.88 0.82 Q-L96T-G97A-G128A 0.53 0.15 0.2 Q-L96T-G97A-L126A 0.58 0.05 0.16 Q-L96T-G97A-M124V 0.64 0.68 0.74 Q-L96T-G97A-N123G 0.37 0.09 0.25 Q-L96T-G97A-Y217Q 0.57 0.85 0.74 Q-L96T-L126A 0.5 0.05 0.05 Q-L96T-L126A-G128A 0.51 0.09 0.2 Q-L96T-L126A-Y217Q 0.43 0.05 0.19 Q-L96T-M124V 0.44 0.78 0.72 Q-L96T-M124V-G128A 0.74 0.05 0.14 Q-L96T-M124V-L126A 0.7 0.25 0.3 Q-L96T-M124V-Y217Q 0.55 0.73 0.78 Q-L96T-N123G 0.36 0.05 0.05 Q-L96T-N123G-G128A 0.44 0.05 0.05 Q-L96T-N123G-L126A 0.42 0.05 0.14 Q-L96T-N123G-M124V 0.41 0.05 0.05 Q-L96T-N123G-Y217Q 0.5 0.05 0.08 Q-L96T-Y217Q 0.58 0.86 0.64 Q-M124V-G128A 0.46 0.75 0.71 Q-M124V-G128A-Y217Q 0.45 0.43 0.59 Q- 124V-L126A 1.62 1.2 1.06 Q-M124V-L126A-G128A 0.51 0.23 0.45 Q-M124V-L126A-Y217Q 0.97 0.05 0.09 Q-M124V-Y217Q 1.04 1.22 1.09 Q-N123G-G128A 0.41 0.05 0.05 Q-N123G-G128A-Y217Q 0.43 0.05 0.13 Q-N123G-L126A 0.55 0.05 0.05 Q-N123G-L126A-G128A 0.5 0.05 0.05 Q-N123G-L126A-Y217Q 0.54 0.05 0.09 Q-N123G-M124V 0.48 0.05 0.05 - - -
eína de sobrenadantes de cultivo se de precipitación TCA como se describe plo 1. El endimiento de remoción de las variantes se probó en aplicació ndería sobre muestras de EMPA 116 (man CFT) a pH8/l6°C mediante el uso de ritos en el ejemplo 1, como se describe plo 2. La actividad de la enzima se ante la prueba de AAPF como se describe plo 1. La funcionalidad de variantes d cuantificó como un índice de rendimient decir, la relación de rendimiento ante en relación con FNA) . Los resulta tran en la tabla 3-1. Las variantes d muestran un valor de Pi mayor que o i para prueba de rendimiento de remoc
Tabla 3-1
Valores de Pi de Variantes de BPN' Probadas par
rminación de Proteína (TCA) y Rendimiento de Remo
Manchas (BMI pH 8/16 °C)
ero de Variantes TCA
riante pH
1 G97N-G128A-Y217M l.09 1
2 G97G-G128S-Y217E 1.53 1
3 G97A-G128A-Y217Q 1.34 1
4 G97M-G128S-Y217E 1.20 1
5 G97A-G128S-Y217Q 1.90 1
6 G97D-G128S-Y217Q 1.55 1
7 G97 -G128G-Y217M 1.61 1
8 G97G-G128S-Y217Q 1.64 1
9 G97S-G128S-Y217Q 1.52 1
10 G97G-G128A-Y217Q 1.33 1
11 G97S-G128A-Y217E 1.03 1
12 G97A-G128S-Y217L 2.18 1
13 G97A-G128A-Y217N 1.22 1
14 G97Q-G128S-Y217L 1.89 1
15 G97A-G128A-Y217M 1.45 1
16 G97A-G128A-Y217S 1.35 1
17 G97D-G128A-Y217Q 1.14 1
18 G97M-G128S-Y217 0.99 1
34 G97S-G128P-Y217Q 0.99 35 G97T-G128S-Y217Q 1.06 36 G97D-G128S-Y217Q-A73T 1.18 37 G97E-G128S-Y217N 1.24 38 G97G-G128A-Y217I 1.51 39 G97Q-G128A-Y217D 1.14 40 G97Q-G128S-Y217M 1.98 41 G97R-G128T-Y217Q-S162P 0.68 42 G97S-G128S-Y217D 1.50 43 G97T-G128P-Y217I 1.30 44 G97Q-G128G-Y217E 1.58 45 G97C-G128G-Y217N 1.26 46 G97D-G128S-Y217H 1.49 47 G97M-G128S-Y217L 1.02 48 G97 -G128S-Y217N 0.98 49 G97S-G128S-Y217E 0.59 50 G97 -G128S-Y217I 1.11 51 G97A-G128P-Y217A 0.84 52 G97R-G128S-Y217D 0.95 53 G97D-G128A-Y217D 0.75 54 G97V-G128G-Y217D 0.71 55 G97V-G128G-Y217E 0.72 56 G97A-G128G-Y217T 1.29 57 G97G-G128N-Y217L 0.82 58 G97D-G128A-Y217T 0.69 59 G97M-G128A-Y217E 0.64 60 G97M-G128A-Y217N 0.58 FNA G97G-G128G-Y217L 1.00
rminar actividad de remoción de manchas (pr muestra para determinar el rendimiento de rem as en aplicaciones de lavandería con el uso de MPA 116 (mancha BMI , CFT Vlaardingen) (BMI pH8, 32 °C) , determinación de proteína por precipit y estabilidad de LAS/EDTA (pruebas de propie rés) de variantes de BPN' se muestran en las tab 4-3 y 4-4.
Los resultados se obtuvieron mediante el us dos descritos en el ejemplo 1, con las si ficaciones para la prueba de rendimiento de rem has . El detergente de prueba usado fue deterge ® 2X inactivado con calor (Procter & Gamble, Cin USA) .
La inactivación con calor de fórmulas de de reíales sirve para destruir la actividad en
tivado. La actividad de la enzima se probó med a de AAPF. Como se describe en la prese onalidad de variantes de BPN' fue cuantificada e de rendimiento (Pi) , que es la relación de ren a variante a variantes de proteína original BPN -Y217Q. BPN: G97A-G128A-Y217Q que muestran un ayor que o igual a 0.5 para rendimiento de rem as de BMI y/o precipitación de TCA mostraron be limpieza y/o expresión mejorados. Los ind miento menores que o iguales a 0.05 se fijaron dican en negrillas y cursivas en la tabla.
Tabla 4-1
imiento de Remoción de Manchas de Variantes de Mu
Múltiples de BPN1 ; G97A-G128A-Y217Q Original
Variante BMI BMI BMI
E 0.96 0.96 0.96 5E 0.95 1.01 0.95 9E S145D N240K 0.95 0.97 0.98 4K 0.95 0.87 0.95 9K 0.94 0.90 0.96 2K 0.94 0.92 1.01 0K 0.94 0.92 1.03 R S87D Q206E 0.90 ,0.95 0.98 D S162K 265N 0.89 0.96 0.93 E S145D S162K K213L T242R 0.88 0.95 0.89 D A144K S145D S159K Q275E 0.88 0.91 0.96 R S87D A144 K265N Q275E 0.88 0.94 0.93 2R 0.87 Ó .84 0.83 E N61E P129E A144K S162K
3L N240K 0.85 0.88 0.89 R P40E N61E A144K Q206E
3L T242R 0.85 ,0.81 0.91 9E P239R K265N 0.83 0.93 0.86 R P129E Q206E N240K K265N 0.81 0.86 0.82 E S145D S159K S162K K213L
9R Q275E 0.78 0.82 0.83 3E 0.67 0.84 0.72 D T242R Q275E 0.60 0.74 0.62 9E S145D N240K T242R K265N 0.58 0.72 0.68 R 0.58 0.63 0.64 E N61E S87D S162K T242R 0.55 0.62 0.58 E N61E S87D P129E S159K
2K T242R 0.52 0.47 0.57
E P129E T242R 0.23 0.28 0.31 N61E Q103E P129E K213L
K T242R 0.22 0.15 0.27 N62R S145D S159K S162K
E Q275E 0.21 0.24 0.31 P40E N61E S87D Q103E
S162K 213L N240K 0.19 0.21 0.25 S87D S145D S159K S162K
N Q275E 0.19 0.22 0.19 N61E N62R S87D S159K
K K265N 0.18 0.19 0.21 S87D Q103E S159K S162K
L T242R 0.17 0.13 0.17 Q103E P129E P239R N240 0.14 0.18 0.23 N62R S87D S145D S159K
K Q275E 0.14 0.14 0.27 N62R S87D S145D K265N 0.13 0.22 0.16 S87D S145D S159K S162K
L N240K K265N Q275E 0.11 0.11 0.12 N61E Q103E P129E Q206E
R N240K 0.09 0.05 0.05 Q103E A144K Q206E K213L
K T242R 0.07 0.05 0.15 Q103E P129E S145D P239R
K K265N 0.06 0.05 0.05 N61E Q103E P129E Q206E
L P239R N240K T242R 0.05 0.05 0.05 Q103E P129E K213L P239R
K T242R 0.05 0.05 0.05
R N61E Q103E P129E A144K
5D Q206E K213L P239R ?240?
2R 0. 05 0. 05 0. 05 R N61E Q103E P129E S145D
9R ?240? T242R ?265? 0. 05 0. 05 0. 05 R ?40? N61E Q103E P129E
4? S145D 213L P239R ?240?
2R 0. 05 0. 05 0. 05 ? S87D Q103E P129E S159K
2? K213L ?240? T242R 0. 05 0. 05 0. 05 R ?40? N61E S87D Q103E
9? A144K S162K Q206E K213L
9R ?240? T242R 0. 05 0. 05 0. 05 R N61E S87D Q103E P129E
4? Q206E K213L P239R ?240?
2R 0. 05 0. 05 0. 05 R N62R P129E S145D P239R
5? Q275E 0. 05 0. 05 0. 05 ? N61E S87D Q103E S145D
9? S162K K213L P239R ?240?
2R 0. 05 0. 05 0. 05 ? N61E Q103E P129E A144K
2? Q206E K213L P239R ?240?
2R 0. 05 0. 05 0. 05 R N62R P129E Q206E ?240?
5? Q275E 0. 05 0. 05 0. 05 ? N62R S87D S145D S159K
2? ?240? ?265? Q275E 0. 05 0. 05 0. 05 ? N62R S87D S159K S162K
La estabilidad de LAS/EDTA de las biblio iones múltiples de BP 1 se probaron y compar
: G97A-G128A-Y217Q. La prueba de LAS/EDTA se real escribe en la prueba de estabilidad de LAS en el cepto que el regulador de pH de estrés contenía
+ 10 mM de EDTA y las placas de estrés se inc durante 30 minutos. La funcionalidad de vari se cuantifico como un índice de rendimiento (Pi) relación de rendimiento de una variante a inal BPN' : G97A-G128A-Y217Q . Los resultados se tabla 4 -2.
Tabla 4-2
imiento de Remoción de Manchas de Variantes de Mu
Múltiples de BPN1 ; G97A-G128A-Y217Q Original
S53G S125A 0.71 0.76 0.85
S53G S132N 0.93 0.93 0.74
S53G P239V 0.52 0.59 0.46
F58G S78N 0.44 0.49 0.50
F58G Y104N 0.05 0.05 0.56
F58G I111V 0.15 0.19 0.52
F58G A114G 0.05 0.05 0.59
F58G N117S 0.09 0.09 0.53
F58G S125A 0.05 0.05 0.56
F58G S132N 0.07 0.07 0.49
F58G P239V 0.05 0.05 0.52
S78N Y104N 0.37 0.56 0.67
S78N I111V 0.92 0.92 0.71
S78N A114G 0.74 0.75 0.48
S78N N117S 0.83 0.87 0.61
S78N S125A 0.77 0.79 0.89
S78N S132N 0,81 0.76 0.60
S78N P239V 0.40 0.47 0.50
Y104N I111V 0.21 0.31 0.64
Y104N A114G 0.05 0.06 0.59
Y104N N117S 0.08 0.14 0.45
Y104N S125A 0.06 0.09 0.64
Y104N S132N 0.98 1.07 0.74
Y104N P239V 0.05 0.05 0.69
I111V A114G 0.15 0.16 0.43
I111V N117S 0.45 0.43 0.51
I111V S125A 0.37 0.47 0.62
I111V S132N 0.53 0.58 0.41
I111V P239V 0.24 0.31 0.40
A114G N117S 0.14 0.15 0.48
A114G S125A 0.20 0.29 0.58
A114G S132N 0.24 0.25 0.50
A114G P239V 0.05 0.07 0.48
S53G S78N S125A 0.78 0.82 0.90
S53G S78N S132N 0.96 0.93 0.75
S53G S78N P239V 0.62 0.66 0.44
S53G Y104N I111V 0.25 0.41 0.63
S53G Y104N A114G 0.08 0.09 0.53
S53G Y104N N117S 0 . 05 0.12 0.50
S53G Y104N S125A 0.20 0.23 0.50
S53G Y104N S132N 0.94 1.00 1.21
S53G Y104N P239V 0 . 05 0 . 05 0.54
S53G I111V A114G 0.48 0.51 0.47
S53G I111V N117S 0, 66 0.74 0.48
S53G I111V S125A 0.49 0.64 0.72
S53G I111V S132N 0.78 0.80 0.54
S53G imv P239V 0.32 0.38 0.43
S53G A114G N117S 0.16 0.29 0.47
S53G A114G S125A 0.32 0.44 0.50
S53G A114G S132N 0.44 0.50 0.40
S53G A114G P239V 0.15 0.31 0.44
S53G N117S S125A 0.50 0.56 0.54
S53G N117S S132N 0.54 0.59 0.49
S53G N117S P239V 0.28 0.41 0.50
S53G S125A S132N 0.50 0.55 0.67
S53G S125A P239V 0.06 0.12 0.59
S53G S132N P239V 0.27 0.33 0.49
F58G S78N Y104N 0 . 05 0 . 05 0.67
F58G S78N I111V 0.17 0.18 0.56
F58G S78N A114G 0 . 05 0.07 0.67
F58G S78N N117S 0.11 0.12 0.64
F58G S78N S125A 0.11 0.15 0.65
F58G S78N S132N 0.06 0.12 0.57
F58G S78N P239V 0 . 05 0 . 05 0.60
F58G Y104N I111V 0 . 05 0. 05 0.57
F58G Y104N A114G 0 . 05 0. 05 0.59
F58G S132N P239V 0.05 0.05 0.65
S78N Y104N I111V 0.33 0.44 0.63
S78N Y104N A114G 0.05 0.05 0.68
S78N Y104N N117S 0.05 0.13 0.60
S78N Y104N S125A 0.05 0.06 0.69
S78N Y104N S132N 1.02 1.00 0.77
S78N Y104N P239V 0.05 0.05 0.65
S78N I111V A114G 0.35 0.36 0.60
S78N I111V N117S 0.52 0.53 0.54
S78N I111V S125A 0.51 0.57 0.67
S78N I111V S132N 0.50 0.46 0.49
S78N I111V P239V 0.27 0.29 0.55
S78N A114G N117S 0.11 0.14 0.50
S78N A114G S125A 0.27 0.27 0.51
S78N A114G S132N 0.23 0.21 0.56
S78N A114G P239V 0.12 0.11 0.54
S78N N117S S125A 0.39 0.48 0.62
S78N N117S S132N 0.42 0.47 0.55
S78N N117S P239V 0.09 0.05 0.53
S78N S125A S132N 0.46 0.47 0.56
S78N S125A P239V 0.06 0.08 0.64
S78N S132N P239V 0.21 0.16 0.45
Y104N I111V A114G 0.05 0.06 0.63
Y104N I111V N117S 0.05 0.05 0.57
Y104N I111V S125A 0.05 0.09 0.66
Y104N I111V S132N 0.87 0.91 0.60
Y104N I111V P239V 0.05 0.05 0.61
Y104N A114G N117S 0.05 0.05 0.53
Y104N A114G S125A 0.05 0.05 0.50
Y104N A114G S132N 0.32 0.45 0.50
Y104N A114G P239V 0.05 0.05 0.62
Y104N N117S S125A 0.05 0.05 0.56
Y104N N117S S132N 0.53 0.63 0.54
Y104N N117S P239V 0.06 0.05 0.66
70 A114G S125A P239V 0.05 0.05 0.63 71 A114G S132N P239V 0.05 0.05 0.55 72 N117S S125A S132N 0.05 0.05 0.56 73 N117S S125A P239V 0.05 0.05 0.56 74 N117S S132N P239V 0.05 0.05 0.57 75 S125A S132N P239V 0.05 0.05 0.55 76 N76D D120H K213N M222Q 0.22 0.31 0.68
La estabilidad de LAS/EDTA de las variantes PN1 se probó y se comparó con BPN'-Y217L. La p DTA se realizó como se describe en la sección "P ilidad de LAS" del ejemplo 1, excepto que el r H de estrés contenía 0.1% de LAS + 10 mM de ED s de estrés se incubaron a 35°C durante 25 min onalidad de variantes de BPN' se cuantificó e de rendimiento (Pi) , que es la relación de ren na variante a proteína original BPN* BPN1 -Y21 tados se muestran en la tabla 4-3.
tos en la técnica a los cuales incumbe la invenc tos en la técnica apreciarán fácilmente que la ción está bien adaptada para llevar a cabo los o er los extremos y ventajas mencionadas, a los inherentes en la misma. Las composiciones y itos en la presente son representativos de mod ridas, son ilustrativos, y no se pretende que lit ce de la invención. Es fácilmente evidente to en la técnica que se pueden hacer substitu icaciones variables a la invención descrita arse del alcance y esencia de la invención.
La invención ilustrativamente descrit adamente se puede poner en práctica en ause uier elemento o elementos, limitación o limitaci se describen específicamente aquí. Los tér siones que se han utilizado se usan como tér
itos pueden ser redistribuidos por los experto ca, y que esas modificaciones y variaciones se c stán dentro del alcance de esta invención como s a presente.
La invención se ha descrito amplíam icamente aquí. Cada una de las especies y agru néricas más estrechas que caen dentro de la des ica también forma parte de la invención. Esta in ipción genérica de la invención con una con ación negativa de eliminar cualquier materia del endientemente de si el material eliminado e íficamente mencionado en la presente.
Se hace constar que con relación a esta f método conocido por la solicitante para llev ica la citada invención, es el que resulta cia nte descripción de la invención.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones . 1. Una variante de subtilisina terizada porque comprende por lo menos un conj siguientes conjuntos de sustitución: 3128A-Y217Q, G97A-L126A-G128A, G97A-L126A-G128A-Y217Q, G97A-L126A , G97A-M124V-G128A, G97A-M124V-G128A-Y217Q, G97A-M124V-L126A, G9 -G128A, G97A-M124V-L126A-Y217Q, G97A-M124V-Y217Q, G97A-N123G-G12 -G128A-Y217Q, G97A-N123G-L126A, G97A-N123G-L126A-G128A, G97A-N123 , G97A-N123G-M124V, G97A-N123G-M124V-G128A, G97A-N123G-M124V-L12 J-M124V-Y217Q, G97A-N123G-Y217Q, L126A-G128A-Y217Q, L96T-G128A-Y21 -G128A, L96T-G97A-G128A-Y217Q, L96T-G97A-L126A, L96T-G97A-L126A-G12 -L126A-Y217Q, L96T-G97A-M124V, L96T-G97A-M124V-G128A, L96T-G97A-M1 , L96T-G97A-M124V-Y217Q, L96T-G97A-N123G, L96T-G97A-N123G-G128A, L -L126A, L96T-G97A-N123G-M124V, L96T-G97A-N123G-Y217Q, L96T-G97A-Y -G128A, L96T-L126A-G128A-Y217Q, L96T-L126A-Y217Q, L96T-M124V-G128A V-G128A-Y217Q, L96T-M124V-L126A, L96T-M124V-L126A-G128A, L96T-M124 -L126A-Y217Q, N62Q-L96T-G128A, N62Q-L96T-G128A-Y217Q, N62Q-L96T-G9 -G97A-G128A, N62Q-L96T-G97A-L126A, N62Q-L96T-G97A-M124V, N62Q-L96T G, N62Q-L96T-G97A-Y217Q, N62Q-L96T-L126A, N62Q-L96T-L126A-G128A, N6 -Y217Q, N62Q-L96T-M124V, N62Q-L96T-M124V-G128A, N62Q-L96T-M124V- -L96T-M124V-Y217Q, N62Q-L96T-N123G, N62Q-L96T-N123G-G128A, N62Q-L9 A, N62Q-L96T-N123G-M124V, N62Q-L96T-N123G-Y217Q, N62Q-L96T-Y217Q, N V-G128A, N62Q-M124V-G128A-Y217Q, N62Q-M124V-L126A, N62Q-M124V-L1 -M124V-L126A-Y217Q, N62Q-M124V-Y217Q, N62Q-N123G-G128A, N62Q-N123 Q, N62Q-N123G-L126A, N62Q-N123G-L126A-G128A, N62Q-N123G-L126A-Y217 G-M124V, N62Q-N123G-M124V-G 128A, N62Q-N123G-M124V-L126A, N62Q-N1 Q, y N62Q-N123G-Y217Q, onde las sustituciones están en posiciones equiva osiciones de subtilisina BPN' expuestas en SEQ I 2. Una variante de subtilisina C terizada porque comprende por lo menos un con siguientes conjuntos de sustitución: -G128A-Y217M, G97G-G128S-Y217E, G97A-G128A-Y217Q, G97M-G128S-Y -G128S-Y217Q, G97D-G128S-Y217Q, G97M-G128G-Y217M, G97G-G128S-Y S-Y217Q, G97G-G128A-Y217Q, G97S-G128A-Y217E, G97A-G128S-Y217L, G N, G97Q-G128S-Y217L, G97A-G128A-Y217M, G97A-G128A-Y217S, G97D-G os iciones de subt i l i s ina BPN ' expuestas en SEQ I 3 . Una variante de subt i l i s ina teri zada porque comprende por lo menos un conj iguientes conj untos de sust i tuc ión : -S87D-Q206E, P40E-A144K-K213L, N61E-P129E-S159K, S87D-S 162K-K265N, S R-Q275E, N61E-Q103E-N240K, S87D-T242R-K265N, N62R-K265N-Q275E, P129 K, P129E-P239R-K265N, Q103E-P129E-T242R, P40E-N61E-S87D-S 162K-T242R, -S145D-K265N, P40E-N62R-S87D-Q103E-S162K, S24R-P40E-S145D-S159K-K21 -A144K-K265N-Q275E, N61E-P129E-S162K-K213L-N240K, N61E-S145D-S162K R, S87D-A144K-S145D-S159K-Q275E, S24R-P129E-Q206E-N240K-K265N, N61E K-K213L-T242R, N62R-S159K-Q206E-K265N-Q275E, S24R-Q103E-P129E-N240 -Q103E-P129E-P239R-N240K, P129E-S145D-N240 -T242R-K265N, Q103E-S162 L-P239R, P40E-N61 E-N62R-S87D- S 159K-S 162K-K265N, S24R-P40E-N61 E- A 144 L-T242R, P40E-N61E-S87D-P129E-S159K-S162K-T242R, P40E-N62R-S87D-S14 K-Q275E, P40E-N62R-S87D-Q103E-A144K-S159K-Q275E, P40E-N62R-S87D-S15 N-Q275 E, P40E-N61 E-P 129E-A 144K-S 162K-K213L-N240K, P40E-N61 E-Q 103E-K-S162K-Q275E, P40E-N61E-Q103E-S159K-S162K-K213L-P239R, P40E-N61E-Q K-K213L-N240K, N62R-S87D-P129E-S145D-S159K-S162K-Q275E, S24R-N61E- L-N240K-T242R, P40E-N62R-S 145D-S 159K-S 162K-Q206E-Q275E, N62R-S87D-K-K265N-Q275E, N61E-S87D-Q103E-S159K-S162K-K213L-T242R, S24R-N61E- E-P239R-N240K, S24R-N62R-P129E-S145D-P239R-K265N-Q275E, S24R-N62R-P , S24R-P40E-N61E-Q103E-P129E-A144K-S145D-K213L-P239R-N240K-T242R, S -Q103E-P129E-A144K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, P40E-N61E-S87D-Q1 -S 162K-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-P40E-N61 E-Q 103E- 129E-S 162K-Q -N240K-T242R, S24R-N61E-Q103E-P129E-A144K-S145D-Q206E-K213L-P239R- , P40E-N61E-Q103E-P129E-A144K-S162K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, -P 129E-A 144K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R-K265N, y S24R-P40E-N61 -P129E-A144K-S 162K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, nde las sustituciones están en posiciones equiva osiciones de subtil isina BPN ' expuestas en SEQ I 4 . Una variante de subti l is ina caracterizad ende las sustituciones G97A/G128A/Y217Q y que ende por lo menos una modi f icación de conformida ndicación 3 , y en donde las posiciones corres osiciones de subtil isina de BPN' de SEQ ID NO : 1 . 5 . Una variante de subtilisina teri zada porque comprende por lo menos un conj iguientes conj untos de sustitución : -F58G, S53G-S78N, S53G-Y104N, S53G-I111V, S53G-A114G, S53G-N117S, S53 , S53G-S132N, S53G-P239V, F58G-S78N, F58G-Y104N, F58G-I111V, F58G-A11 A-S132N, S53G-S125A-P239V, S53G-S132N-P239V, F58G-S78N-Y104N, F58G-S7 -S78N-A114G, F58G-S78N-N117S, F58G-S78N-S125A, F58G-S78N-S 132N, F58G V, F58G-Y104N-I11 1V, F58G-Y104N-A114G, F58G-Y104N-N117S, F58G-Y104N- -Y104N-S132N, F58G-Y104N-P239V, F58G-I111V-A114G, F58G-I111V-N117S, F A, F58G-I11 1V-S132N, F58G-I111V-P239V, F58G-A114G-N117S, F58G-A1 14G-S G-S132N, F58G-A1 14G-P239V, F58G-N117S-S125A, F58G-N1 17S-S132N, F58G-V, F58G-S125A-S132N, F58G-S125A-P239V, F58G-S132N-P239V, S78N-Y104N-I N-A114G, S78N-Y104N-N117S, S78N-Y104N-S125A, S78N-Y104N-S 132N, S78N V, S78N-I111V-A114G, S78N-I111V-N117S, S78N-I111V-S125A, S78N-I11 1V-S 1 -P239V, S78N-A114G-N117S, S78N-A1 14G-S125A, S78N-A114G-S132N, S78N-V, S78N-N117S-S125A, S78N-N117S-S132N, S78N-N117S-P239V, S78N-S125A-S A-P239V, S78N-S132N-P239V, Y104N-I111 V-Al 14G, Y104N-I111 V-Nl 17S, Y104 A, Y104N-I111V-S132N, Y104N-I111V-P239V, Y104N-A114G-N117S, Y104N-A1 N-A114G-S132N, Y104N-A114G-P239V, Y104N-N117S-S 125A, Y104N-N117S-S S-P239V, Y104N-S125A-S132N, Y104N-S 125A-P239V, Y104N-S132N-P239V, II 1 S, II 11 V-Al 14G-S125 A, II 11 V-Al 14G-S132N, II 11 V-Al 14G-P239V, II 11 V-Nl 1 -Nl 17S-S 132N, II 11 V-Nl 17S-P239V, 1111 V-S 125 A-S132N, II 11 V-S125 A-P239V N-P239V, A114G-N117S-S125A, A1 14G-N117S-S132N, A114G-N117S-P239V, ? N, A114G-S125A-P239V, A114G-S132N-P239V, N117S-S125A-S132N, N117S-S1 S-S132N-P239V, S125A-S132N-P239V, N76D-D120H-K213N-M222Q, nde las sustituciones están en posiciones equiva 8. Un vector de expresión caracterizado porque ido nucleico de conformidad con la reivindicación 7. 9. Una célula hospedera caracterizada ende el vector de expresión de conformidad indicación . 10. Una composición de limpieza carac e comprende por lo menos una variante de sub sta de conformidad con cualquiera indicaciones 1-7. 11. La composición de limpieza de conform eivindicación 10, caracterizada porque es un de lavandería. 12. El detergente para lavandería de con la reivindicación 11, caracterizado porque gente para lavandería líquido de trabajo pesado. 13. La composición de limpieza de conform anasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glu nosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, lacasa y a clas de las mismas. 15. La composición de limpieza de conform eivindicación 10, caracterizada porque comprende un agente estabilizador. 16. Una composición de limpieza carac e comprende por lo menos 0.0001 por ciento en lo menos una variante de subtilisina de conform uiera de las reivindicaciones 1-7, y opcionalme ños un ingrediente auxiliar adecuado. 17. Un método de limpieza, caracterizado ende los pasos de : a) poner en contacto una superficie y/o un comprende una tela con la composición de lim rmidad con cualquiera de las reivindicaciones 10
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