CN107835855A - AprL‑进化枝蛋白酶变体及其用途 - Google Patents

AprL‑进化枝蛋白酶变体及其用途 Download PDF

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Abstract

本披露提供了AprL‑进化枝蛋白酶，所述AprL‑进化枝蛋白酶包括变体AprL‑进化枝蛋白酶、编码其的核酸、以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述变体AprL‑进化枝蛋白酶包括AprL‑进化枝变体枯草杆菌蛋白酶，所述AprL‑进化枝变体枯草杆菌蛋白酶与亲本AprL‑进化枝枯草杆菌蛋白酶相比具有改进的稳定性和/或污垢去除性。

Description

AprL-进化枝蛋白酶变体及其用途
本文披露了一种或多种AprL-进化枝蛋白酶，包括一种或多种AprL-进化枝蛋白酶变体、编码其的核酸、以及涉及其生产和使用的组合物和方法，所述AprL-进化枝蛋白酶变体包括AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶，所述AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比具有改进的稳定性和/或污垢去除性。
丝氨酸蛋白酶是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶(EC编号3.4.21)。基于它们的结构，存在两大类丝氨酸蛋白酶：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶样。原型枯草杆菌蛋白酶(EC编号3.4.21.62)最初从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)获得。枯草杆菌蛋白酶及其同源物是MEROPS分类方案的S8肽酶家族的成员。家族S8的成员在其氨基酸序列中具有顺序为Asp、His和Ser的催化三联体。尽管在工业酶领域很久以来就已经知道丝氨酸蛋白酶，但是仍然需要适合于特定条件和用途的工程化的蛋白酶。
一些实施例涉及包含相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的一个或多个氨基酸修饰的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰选自：(i)A001C、A001D、A001E、A001Q、A001S、L010M、L010Q、S100G、S102K、S102R、Y103F、Y103M、S104D、G105M、G105R、S108F、S108H、S108K、S108R、E111Q、T114D、T115D、T115E、T115F、T115K、T115Q、N116E、K012C、K012F、K012H、K012M、K012N、K012Q、K012Y、V120S、M123C、M123I、L125I、G127A、G127D、G127I、G127M、G127S、G127T、G127V、A128E、A128H、A128K、A128P、A128R、A128S、A128T、S129H、S129Q、S129R、S129T、S129V、T132C、T132D、T132E、T132K、T132N、T132P、Q136A、Q136C、Q136K、Q136R、V138C、A143D、A143N、G145S、V147L、V148A、V148C、V148M、V148Q、K015A、K015C、K015E、K015I、K015M、K015S、K015T、K015V、S155D、S155F、S155K、S155N、S155R、S157D、S158D、S158I、S158K、S158R、N160C、N160D、N160I、N160M、N160R、T161C、T161D、T161E、T161K、T161Q、T161R、G165A、G165E、G165Q、G165R、G165S、Q017H、A018D、A018E、S181Q、N182D、S183A、S183G、N184C、N184E、N184Q、A186C、S187D、S187E、S187P、Q019D、Q019E、A193D、A193R、A202D、A202E、A202K、A202Q、A202V、G203A、G203C、G203E、G203N、G203Q、Y205E、T210C、T210E、T210I、T210P、T210V、A214E、T215C、L216C、L216H、L216K、L216M、N217S、L234E、L234F、L234Q、L234S、S235D、S235E、P238T、N239A、N239D、N239H、N239M、N239S、N239T、A024E、A024Q、L240D、S241E、S241N、S241Q、S241V、A242G、A242N、S243E、S243Q、S243V、Q244C、Q244E、V245A、V245C、V245T、N247D、N247W、N025D、N025G、N025Q、S250G、S251E、S258C、S258D、S258E、S258H、S258P、S259E、S259P、S259Q、V026A、V026C、V026E、V026H、V026Q、V026R、F260W、K264A、K264C、K264D、K264H、K264M、K264Q、K264S、K264Y、I267C、N268D、N268E、N268Q、V269C、K027C、K027D、K027E、K027M、K027P、A271E、Q274A、Q274C、Q274D、Q274E、Q274G、A029S、T003E、T003I、T003Q、T003V、V030C、I035A、I035S、I035T、I035V、S038T、N043A、N043C、N043F、N043H、N043Q、V044P、V045A、V045C、V045D、V045E、V045F、V045G、V045M、V045N、V045Q、V045R、V045S、V045T、G046D、A048N、A048W、F050H、V051I、A052F、A052G、A052K、A052N、A052P、A052R、A052V、G053N、G053R、A055C、A055D、A055E、A055G、A055H、A055N、A055S、A055V、N057C、N057E、N057G、N057V、T058C、T058I、T058K、T058W、A068C、A068N、A068S、V071A、L074G、D075E、N076K、T077C、T077D、T077H、T077M、T077N、T077P、T077Q、T077S、T078D、T078I、T078V、S086E、S086H、S086R、V087C、V087G、V087S、V087T、S088E、S088N、S088R、L089N、P009C、P009D、P009E、P009N、P009T、L095A、L095V、N096S、S098K、S098R、和G099Q；(ii)A001Q、T003V、K015I、I035A、A068S、V071A、T077N、S086H、V087S、L095A、T115F、M123I、G127T、A128P、A128S、V147L、G165Q、G165S、N184Q、A202V、T210P、N217S、N239S、A242G、S250G、S258P、和Q274A；或(iii)T003V、A068S、T077N、S086H、T115F、M123I、G127T、A128P、G165Q、N184Q、A202V、T210P、N217S、和S258P；其中该AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的芽孢杆菌属物种AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，当与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比时，本文所述的一种或多种Apr1-进化枝变体具有改进的稳定性。在其他实施例中，改进的稳定性是(i)稳定性PI>1.2，或(ii)稳定性PI>1.2以及以下中的一个或多个：HDD清洁PI>0.8，HDLpH 6或pH 8清洁PI>0.8，ADW清洁PI>0.8，或表达PI>0.8。在仍又其他实施例中，亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶和/或所述的变体包含：(i)Asp32和His63之间的YNT(SEQ ID NO:46)基序；(ii)Y56N57T58(SEQ ID NO:45)基序；(iii)F50V51X152G53E54X355Y56N57T58(SEQID NO:48)基序，其中X1是A或S并且X3是A或S；(iv)Lys236和Arg246之间的LSX4S(SEQ IDNO:55)基序，其中X4是A或G；(v)L240S241A242S243(SEQ ID NO:50)基序；(vi)L240S241G242S243(SEQ ID NO:56)基序；(vii)KXXXLSX4SQX5R(SEQ ID NO:57)基序，其中X是任意氨基酸，X4是A或G，并且X5是I或V；(viii)K236XXXLSASQX5R246(SEQ ID NO:52)基序，其中X是任意氨基酸并且X5是I或V；(ix)K236XXXLSGSQX5R246(SEQ ID NO:60)基序，其中X是任意氨基酸并且X5是I或V；或(viii)选自(i)、(ii)、和(iii)的基序1，与选自(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、和(ix)的基序2组合。
在一些实施例中，本发明是包含相对于亲本AprL-进化枝酶的氨基酸修饰的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝酶变体的生产性位置处，该组由以下组成：12、15、26、27、43、45、48、52、55、57、58、60、77、78、88、96、97、98、99、102、116、117、126、127、129、132、136、143、144、160、161、165、171、210、238、239、241、247、和274，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的芽孢杆菌属物种AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，本发明是包含相对于亲本AprL-进化枝酶的氨基酸修饰的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于AprL-进化枝酶变体的生产性位置处，其中至少60％的在生产性位置处测试的修改至少符合下列标准之一：a)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH 8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.9并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.0的PI；b)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.2的PI；或者c)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.5的PI；并且其中所述生产性位置处选自由以下组成的组：12、15、26、27、43、45、48、52、55、57、58、60、77、78、88、96、97、98、99、102、116、117、126、127、129、132、136、143、144、160、161、165、171、210、238、239、241、247、和274，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的芽孢杆菌属物种AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，所述修饰选自由以下组成的组：12(K、A、C、F、G、H、L、M、N、Q、S、Y)；15(K、A、C、E、F、H、I、M、N、R、S、T、V)；26(V、A、C、E、H、I、M、N、Q、R、S、T)；27(K、A、C、D、E、L、M、N、P、Q、R、T)；43(N、A、C、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、W、Y)；45(V、A、C、D、E、F、G、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、Y)；48(A、C、D、E、F、H、I、K、M、N、Q、R、W、Y)；52(A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y)；55(A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V)；57(N、A、C、D、E、G、H、P、R、S、V、Y)；58(T、C、D、F、H、I、K、L、M、P、R、S、V、W、Y)；60(G、C、E、F、H、I、K、L、M、Q、R、T、Y)；77(T、C、D、F、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、W)；78(T、C、D、G、I、L、N、Q、S、V、W、Y)；88(S、A、E、F、G、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y)；96(N、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、Q、S、V、Y)；97(S、A、C、D、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、T、W、Y)；98(S、A、D、E、F、H、K、L、N、P、R、T、V、Y)；99(G、A、C、D、E、L、M、Q、S、T、V、W)；102(S、A、D、E、F、G、K、L、N、P、Q、R、T)；116(N、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、T、V、Y)；117(G、C、D、E、H、K、M、N、Q、R、T、V)；126(G、A、C、E、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y)；127(G、A、D、E、F、I、L、M、Q、S、T、V、W、Y)；129(S、C、E、F、H、I、M、N、Q、R、T、V、W、Y)；132(T、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、V、W、Y)；136(Q、A、C、D、F、G、H、K、L、N、R、S、T、W)；143(A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、S、T、Y)；144(R、A、C、D、E、F、G、H、L、M、N、Q、V、Y)；160(N、A、C、D、G、I、K、M、P、R)；161(T、A、C、D、E、I、K、L、M、Q、R、W)；165(G、A、E、I、K、L、P、Q、R、S、T、Y)；171(D、A、C、G、H、I、K、N、P、Q、S、T、V)；210(T、C、D、E、F、H、I、M、N、P、V、Y)；238(P、A、C、D、E、F、G、I、L、M、N、Q、R、S、T、W)；239(N、A、C、D、E、H、I、K、L、M、S、T、V、Y)；241(S、C、D、E、H、L、N、P、Q、T、V)；247(N、A、D、E、F、H、I、L、M、Q、S、V、W、Y)；和274(Q、A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、S、T、V、W)，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
在一些实施例中，本发明是包含相对于亲本AprL-进化枝酶的氨基酸修饰的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝酶变体的生产性位置处，该组由以下组成：1、9、22、24、25、53、86、89、95、100、105、108、114、115、119、125、128、140、146、155、158、187、202、203、234、237、240、243、244、和264，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的芽孢杆菌属物种AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，本发明是包含相对于亲本AprL-进化枝酶的氨基酸修饰的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于AprL-进化枝酶变体的生产性位置处，其中至少40％但是小于60％的在生产性位置处测试的修改至少符合下列标准之一：a)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH 8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.9并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.0的PI；b)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH 8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.2的PI；或者c)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH6、pH 8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.5的PI；并且其中所述生产性位置处选自由以下组成的组：1、9、22、24、25、53、86、89、95、100、105、108、114、115、119、125、128、140、146、155、158、187、202、203、234、237、240、243、244、和264，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的芽孢杆菌属物种AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，所述修饰选自由以下组成的组：1(A、D、E、F、G、N、Q、S、T、V)；9(P、A、C、D、E、G、N、Q、S、T)；22(K、A、F、M、Q、R、S、T、VY)；24(A、C、D、E、G、N、Q、S、W)；25(N、D、E、F、G、H、L、M、P、Q、R、S)；53(G、C、D、E、H、K、N、Q、R)；86(S、C、E、H、K、L、N、R)；89(L、A、C、F、G、I、M、N、S、V)；95(L、A、F、G、I、M、Q、S、V)；100(S、C、F、G、M、N、R、T、Y)；105(G、A、C、D、I、M、N、R、S、T)；108(S、E、F、G、H、K、L、N、Q、R、Y)；114(T、A、C、D、F、I、K、L、N、Q、S、V)；115(T、D、E、F、H、I、K、Q、S、W)；119(D、A、E、F、G、H、M、Q、S)；125(L、A、E、F、I、N、S、V、Y)；128(A、C、D、E、H、K、N、P、Q、R、S、T)；140(N、C、D、F、G、H、M、R、T、V)；146(V、A、E、H、I、K、L、N、Q、S、T)；155(S、A、D、E、F、G、H、K、N、Q、R、W)；158(S、A、D、E、I、K、N、Q、R)；187(S、A、C、D、E、H、K、P、Q、W)；202(A、C、D、E、I、K、L、M、Q、S、T、V)；203(G、A、C、E、H、K、M、N、Q、R、S)；234(L、E、F、H、Q、S、W、Y)；237(H、A、C、D、G、I、M、N、Q、S)；240(L、A、D、E、F、I、M、N、Q、T)；243(S、C、E、F、I、N、Q、T、V、W)；244(Q、A、C、D、E、G、H、I、N、R、S、V)；和264(K、A、C、D、H、M、Q、R、S、Y)，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
在一些实施例中，本发明是包含相对于亲本AprL-进化枝酶的氨基酸修饰的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝酶变体的生产性位置处，该组由以下组成：2、3、10、18、19、28、29、31、35、37、38、40、44、46、50、54、56、61、67、68、71、87、90、91、92、101、103、104、113、118、120、123、130、131、133、139、145、147、148、181、182、184、193、205、211、212、214、216、217、221、235、242、245、248、251、258、259、和268，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:2中所示的芽孢杆菌属物种AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，本发明是包含相对于亲本AprL-进化枝酶的氨基酸修饰的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于AprL-进化枝酶变体的生产性位置处，其中至少15％但是小于40％的在生产性位置处测试的修改至少符合下列标准之一：a)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.9并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.0的PI；b)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH6、pH 8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.2的PI；或者c)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH 8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.5的PI；并且其中所述生产性位置处选自由以下组成的组：2、3、10、18、19、28、29、31、35、37、38、40、44、46、50、54、56、61、67、68、71、87、90、91、92、101、103、104、113、118、120、123、130、131、133、139、145、147、148、181、182、184、193、205、211、212、214、216、217、221、235、242、245、248、251、258、259、和268，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的芽孢杆菌属物种AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，所述修饰选自由以下组成的组：2(Q、A、I、N)；3(T、E、I、Q、V)；10(L、F、M、Q)；18(A、C、D、E、S)；19(Q、A、D、E、G、M)；28(V、A、C、S)；29(A、C、S、T、V)；31(L、C、I、V)；35(I、A、C、G、M、S、T、V)；37(A、E、G、S)；38(S、A、C、E、G、N、T)；40(P、A、C、D、E、M、V)；44(V、C、E、P、S、T)；46(G、A、C、D、W)；50(F、H、K、M、Q、R、V、Y)；54(E、Q、R、T)；56(Y、C、E、F、H、P)；61(N、A、D、F、H、K、Q)；67(V、M、N、Q)；68(A、C、G、N、S、T)；71(V、A、G、L、S)；87(V、C、G、S、T)；90(Y、A、C、F、H、N、V)；91(A、G、M、P、V)；92(V、A、C、I、T)；101(G、A、C、N、S、T)；103(Y、A、F、I、L、M、V、W)；104(S、A、D、E)；113(A、C、G、S)；118(M、F、H、P、Q)；120(V、A、C、I、S、T)；123(M、C、I、L、N、Q、S)；130(G、D、E、H、S)；131(S、D、R、T)；133(A、G、M、P、S、T、V)；139(D、G、K、N、S、T)；145(G、D、N、S)；147(V、A、L、M、N)；148(V、A、C、F、M、Q、S)；181(S、A、C、D、H、Q)；182(N、C、D、E、Q)；184(N、C、E、H、M、Q)；193(A、D、P、Q、R)；205(Y、C、E、F、I、M、V)；211(N、C、E、S)；212(T、A、D、S)；214(A、E、H、L、T)；216(L、A、C、H、K、M)；217(N、C、E、S)；221(M、C、H、K)；235(S、C、D、E、G)；242(A、E、G、N、S)；245(V、A、C、I、T)；248(R、A、N、Q、S)；251(S、A、C、E、G、N)；258(S、C、D、E、H、P)；259(S、E、P、Q)；和268(N、D、E、Q)，其中所述AprL-进化枝变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
在一些实施例中，本发明是包含相对于亲本AprL-进化枝酶的氨基酸修饰的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝酶变体的生产性位置处，该组由以下组成：4、17、21、30、33、36、47、49、51、62、66、72、74、75、76、93、106、107、110、111、112、121、134、135、137、138、141、149、151、156、157、159、163、169、175、183、186、188、191、204、207、208、209、215、223、224、227、229、230、231、232、233、236、249、250、254、255、260、267、269、271、和273，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的芽孢杆菌属物种AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，本发明是包含相对于亲本AprL-进化枝酶的氨基酸修饰的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于AprL-进化枝酶变体的生产性位置处，其中至少一个修饰但是小于15％的在生产性位置处测试的修改至少符合下列标准之一：a)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH 8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.9并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.0的PI；b)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH 8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.2的PI；或者c)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、二甲基酪蛋白(DMC)水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH 8、或pH 10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且对于这些测试中任意一个，另外具有大于或等于1.5的PI；并且其中所述生产性位置处选自由以下组成的组：4、17、21、30、33、36、47、49、51、62、66、72、74、75、76、93、106、107、110、111、112、121、134、135、137、138、141、149、151、156、157、159、163、169、175、183、186、188、191、204、207、208、209、215、223、224、227、229、230、231、232、233、236、249、250、254、255、260、267、269、271、和273，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的芽孢杆菌属物种AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，所述修饰选自由以下组成的组：4(V、I)；17(Q、H、M)；21(F、Y)；30(V、C、T)；33(T、C、M)；36(Q、E、H)；47(G、A、M)；49(S、I、T)；51(V、C、I)；62(G、S)；66(H、R)；72(A、G、S)；74(L、G)；75(D、C、E)；76(N、K)；93(K、D)；106(I、G、M)；107(V、F、I)；110(I、F)；111(E、D、Q)；112(W、A)；121(I、L、M)；134(M、L)；135(K、E、H)；137(A、S)；138(V、C、S)；141(A、S)；149(V、C)；151(A、G、P)；156(G、E)；157(S、D、R)；159(G、A、F)；163(T、E)；169(K、R)；175(A、C)；183(S、A、G)；186(A、C)；188(F、W)；191(V、C)；204(V、I)；207(T、C)；208(Y、F)；209(P、S)；215(T、C、V)；223(S、A、C)；224(P、A)；227(A、S)；229(A、G、S)；230(A、\G)；231(A、C)；232(L、Q)；233(I、V)；236(K、A)；249(L、I、M)；250(S、A、G)；254(T、D)；255(Y、C、E)；260(F、C、W)；267(I、C)；269(V、A、C)；271(A、D、E)；和273(A、S)，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
一些实施例涉及包含至少一种如上所列的变体的组合物。一些实施例涉及使用如上所列的清洁组合物进行清洁的方法。
图1提供了用于表达AprL野生型和变体蛋白酶的pHYT-AprL的质粒图谱。
图2A-F提供了使用CLUSTALW软件进行的AprL蛋白与多个枯草杆菌蛋白酶序列的子集的比对。
图3提供了ApriL、Blid02339和相关枯草杆菌蛋白酶的CLUSTALW序列比对。
图4提供了用于表达BliD02339野生型和变体蛋白酶的pHYT-BliD02339的质粒图谱。
图5显示了BliD02339蛋白酶对DMC底物的蛋白酶活性。
图6显示了BliD02339在HDL洗涤剂中的清洁性能。
图7显示了BliD02339在HDD洗涤剂中的清洁性能。
图8显示了BliD02339在ADW洗涤剂中的清洁性能。
图9显示了枯草杆菌蛋白酶的系统发育树，不包括AprL、BliD02339和AprL-进化枝的其他成员。
图10显示了与BPN'(灰色)和迟缓芽孢杆菌(浅灰色)枯草杆菌蛋白酶中的同源区域相比，涵盖AprL(黑色)的Y56N57T58(侧链显示为棒状)的环区域的结构示意图。
图11显示了残基L240S241A242S243的结构示意图。在AprL(黑色)中，Leu240和Arg248的侧链显示为棒状。为了比较，将AprL(黑色)和枯草杆菌蛋白酶BPN'(灰色)侧链的其余部分显示为细线。
图12显示了在AprL中与Ser98的主链酰胺形成氢键以稳定通向作为底物结合位点的一部分的链101-104的转角的Asn96的结构示意图。
本发明提供了新颖的丝氨酸蛋白酶，特别是AprL-进化枝丝氨酸蛋白酶的变体，和尤其是用于洗涤剂组合物的酶。在一些实施例中，与亲本丝氨酸蛋白酶相比，本发明提供了具有一个或多个修饰(例如取代)的丝氨酸蛋白酶变体。在一些实施例中，本发明提供了AprL-进化枝丝氨酸蛋白酶的新颖的丝氨酸蛋白酶变体。在上述各项中，本发明的丝氨酸蛋白酶可用于多种工业，包括污垢去除、谷物乙醇生产、动物饲料、食品加工和消化助剂、皮革加工和个人护理。这可以通过改进清洁性能、酶的稳定性和化学试剂的存在、和/或改善酶的有效性的酶的热稳定性来改进酶，从而实现。本发明提供了变体丝氨酸蛋白酶，包括但不限于变体AprL-进化枝丝氨酸蛋白酶，其特别适合于并可用于各种清洁应用。本发明包括包含至少一种本文所述的变体丝氨酸蛋白酶(例如，AprL-进化枝变体)的组合物。一些此类组合物包含洗涤剂组合物。本发明提供了各种物种(包括芽孢杆菌属物种)变体丝氨酸蛋白酶和包含一种或多种此类变体AprL-进化枝丝氨酸蛋白酶的组合物。本发明的丝氨酸蛋白酶的酶变体可以与用于洗涤剂组合物中的其他酶组合。本发明还提供了使用本发明的丝氨酸蛋白酶变体进行清洁的方法。
本发明包括具有相对于亲本丝氨酸蛋白酶的一种或多种修饰的丝氨酸蛋白酶的酶变体。通过具有针对洗涤性能、洗涤剂组合物中的酶的稳定性和酶的热稳定性的最低性能指数，同时具有相对于亲本丝氨酸蛋白酶改进的这些特性中的至少一个，酶变体可以用于洗涤剂组合物中。
此外，本发明提供在丝氨酸蛋白酶的一个或多个氨基酸位置处的修饰，例如取代，所述丝氨酸蛋白酶可用于洗涤剂组合物中，其中有利的修饰导致针对清洁性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性和酶的热稳定性的最低性能指数，同时具有相对于其亲本丝氨酸蛋白酶改进的这些特征中的至少一个。这些修饰被认为是本发明的合适修饰。这些氨基酸位置可被认为是对亲本丝氨酸蛋白酶的组合修饰有用的位置。发现是有用的位置的丝氨酸蛋白酶氨基酸位置可以通过具有适用于洗涤剂组合物的多种修饰来进一步表征。对于每个位置，较大数目的可能合适的修饰表示特定位置的较高生产力。
另外，本发明提供了包含这些丝氨酸蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，本发明提供了包含这些丝氨酸蛋白酶变体中的至少一种的清洁组合物。
应当理解，为清楚起见，在单独实施例的背景中在上文和下文描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中以组合的方式提供。相反，为简洁起见在单个实施例的背景下描述的本发明的各个特征也可单独提供或以任何子组合的方式提供。
在详细地描述本发明的组合物和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。除非另有说明，本发明的实践涉及在本领域技术范围内的分子生物学、蛋白质工程、微生物学和重组DNA中通常使用的常规技术。这些技术是本领域技术人员已知的，并且在本领域技术人员公知的众多文本和参考文献中进行了描述。本文上下文所提及的所有专利、专利申请、文章和出版物特此通过引用明确地结合在此。
除非本文另有定义，否则本文所使用的全部科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非另有说明，本披露的实践涉及通常用于分子生物学、蛋白质工程和微生物学的常规技术。尽管与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本披露的实践，但是本文描述了一些合适的方法和材料。把说明书作为一个整体参考时，以下即将定义的术语得以更全面地定义。
除非上下文另有明确指示，如本文所使用的，单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数。除非另有说明，否则分别地，核酸序列从左至右以5'至3’方向写出；并且氨基酸序列从左向右以氨基到羧基方向写出。应当理解的是，在没有相反的指示的情况下，本披露不限于本文所述的具体方法、方案和试剂。
除非另外指明，本发明的实践采用处于本领域技能范围内的蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和蛋白质测序的常规技术。
此外，本文提供的标题并不是对本披露发明的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此，把说明书作为一个整体参考时，以下即将定义的术语得以更全面地定义。然而，为了便于理解本发明，以下定义了多个术语。
在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。
如本文所使用的，关于数值，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5，除非pH值另有具体定义。
如本文使用的，术语“蛋白酶”(protease和proteinase)是指具有分解蛋白质和肽的能力的酶。蛋白酶具有通过在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解进行“蛋白水解”的能力。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。存在用于测量蛋白水解活性的许多众所周知的方法(参见例如Kalisz，“MicrobialProteinases[微生物朊酶]”，在：Fiechter(编辑)，AdvancesinBiochemical Engineering/ Biotechnology[生化工程/生物技术进展]，(1988)中)。例如，蛋白水解活性可以通过分析各自蛋白酶水解合适底物的能力的比较试验来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(西格玛(Sigma)C-9801)、牛胶原(西格玛C-9879)、牛弹性蛋白(西格玛E-1625)和牛角蛋白(ICN生物医学公司902111)。使用这些底物的比色测定是本领域熟知的(参见例如WO 99/34011和美国专利号6,376,450)。pNA肽基测定(参见例如，德尔玛(Del Mar)等人，分析生物化学(Anal Biochem)，99:316-320，1979)还可用于确定活性酶浓度。该测定测量当酶水解可溶性合成底物例如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上在410nm测量来自水解反应的黄色的生成速率并且该速率与活性酶浓度成正比。另外，在280纳米(nm)处的吸光度测量可以用于确定纯化的蛋白质样品中的总蛋白质浓度。底物/蛋白质浓度的活性给出了酶比活性。
如在此处关于多肽例如蛋白酶所使用的，术语“变体”是指包含如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列的至少一个氨基酸残基与亲本多肽或参比多肽(包括但不限于野生型多肽)的氨基酸序列不同。在一些实施例中，与亲本或参比多肽的氨基酸序列不同的多肽变体含有一个或多个天然存在的或人造的氨基酸取代、插入或缺失。在其他实施例中，与亲本或参比多肽的氨基酸序列不同的多肽变体含有一个或多个天然存在的氨基酸取代、插入或缺失。在进一步的实施例中，与亲本或参比多肽的氨基酸序列不同的多肽变体含有一个或多个人造的氨基酸取代、插入或缺失。
如本文所使用的，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的属“芽孢杆菌”内的所有物种，这些所有物种包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌、饲料芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、黏琼脂芽孢杆菌、秋叶氏芽孢杆菌、库拉奇芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌、列城芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。据认识，芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”)的此类生物体。在应激环境条件下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
短语“一个或多个基本上不含硼的组合物”或“一个或多个基本上不含硼的洗涤剂”是指一个或多个分别含有痕量硼(例如，约1000ppm(1mg/kg或L(等于1ppm))、约100ppm、约50ppm、约10ppm、或约5ppm、或约1ppm)的组合物或洗涤剂，这些硼可能来自其他组合物或洗涤剂成分。
在本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指在链中共价键合的任何长度的核苷酸单体的聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)(包含脱氧核糖核苷酸的多核苷酸)和RNA(核糖核酸)(核糖核苷酸聚合物)是具有不同生物功能的多核苷酸或核酸的实例。多核苷酸或核酸包括但不限于：单链、双链或三链的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤碱和嘧啶碱，或其他天然的、经化学或生物化学修饰的、非天然的、或衍生的核苷酸碱的聚合物。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因、基因片段、染色体片段、一个或多个表达序列标签(EST)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。在一些实施例中，多核苷酸包含经修饰的核苷酸，例如经甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团(例如氟核糖和硫醇盐)、和核苷酸分支。在具体实施例中，核苷酸序列被非核苷酸组分打断。
如本文使用的，术语“突变”是指对参比氨基酸或核酸序列进行的改变。该术语旨在涵盖取代、插入和缺失。
如本文使用的，术语“载体”是指用于将一个或多个核酸引入或转移到靶细胞或组织中的核酸构建体。典型地，载体用于将外源DNA引入细胞或组织中。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如病毒载体)、粘粒、表达载体、穿梭载体等。典型地，载体包括复制起点、多克隆位点和可选择标记。典型地，将载体插入靶细胞的过程被称为转化。在一些实施例中，本发明包括：包含有效地连接到合适的前序列(例如分泌、信号肽序列等)的、编码丝氨酸蛋白酶多肽(例如，前体或成熟丝氨酸蛋白酶多肽)的DNA序列的载体，该载体能够在合适的宿主中实现DNA序列的表达，以及重组多肽链的折叠和易位。
如在此处所使用的，术语“表达盒”、“表达质粒”或“表达载体”是指重组或合成产生的用于在靶细胞中表达目的核酸的核酸构建体或载体。典型地，表达载体或表达盒包含驱动外源核酸表达的启动子核苷酸序列。典型地，表达载体或载体盒还包括任何其他的允许靶细胞中特定核酸转录的特定核酸元件。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。许多原核和真核表达载体是可商购的。
如在此处所使用的，“质粒”是指能够独立于染色体DNA进行复制的染色体外DNA分子。质粒是双链的(ds)，可以是环状的，并且通常被用作克隆载体。
如本文使用的，在将核酸序列引入细胞中的背景下，术语“引入”是指适合于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。这样的引入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、电穿孔、接合和转导(参见例如，Ferrari等人，“Genetics”[遗传学]，在：Hardwood等人(编辑)，Bacillus[芽孢杆菌]，Plenum Publishing Corp.[普莱南出版公司]，第57-72页[1989])。
转化是指由摄取、任选的基因组掺入和遗传物质(例如DNA)的表达引起的细胞的遗传改变。
如在此处所使用的，当核酸与另一个核酸序列一起置于功能关系时，该核酸与另一个核酸序列“有效地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，启动子或增强子有效地连接到核苷酸编码序列。如果核糖体结合位点被定位以便促进编码序列的翻译，该核糖体结合位点可以有效地连接到编码序列。典型地，“有效地连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不需要是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果这样的位点不存在，则可以按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文使用的，术语“基因”是指编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域的多核苷酸(例如，DNA区段)。在一些情况下，基因包括个体编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
如本文使用的，当关于细胞使用时，“重组体”典型地表明细胞已经通过引入外源核酸序列而被修饰，或者细胞衍生自如此修饰的细胞。例如，重组细胞可以包含在天然(非重组)形式的细胞中不以相同形式存在的基因，或者重组细胞可以包含已经被修饰并且重新引入细胞中的天然基因(发现于细胞的天然形式中)。重组细胞可以包含细胞内源的核酸，该核酸已经被修饰而不从细胞中除去该核酸；此类修饰包括通过基因取代、位点特异性突变以及本领域普通技术人员已知的相关技术获得的那些。重组DNA技术包括用于在体外生产重组DNA并且将该重组DNA转移到其可以被表达或传播的细胞中从而生产重组多肽的技术。多核苷酸或核酸的“重组”(recombination和recombining)通常是指装配或组合两个或更多个核酸或多核苷酸链或片段以产生新的多核苷酸或核酸。
如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员已知的方法操纵时，核酸或多核苷酸可以被转录和/或翻译以生产多肽或其片段，那么称该核酸或多核苷酸“编码”该多肽。这样的核酸的反义链也被称为编码该序列。
术语“宿主菌株”和“宿主细胞”是指对于包含感兴趣的DNA序列的表达载体而言合适的宿主。
“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。在本公开全文中使用了符合IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(JointCommission on Biochemical Nomenclature，JCBN)而定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。突变也可以通过使用氨基酸的三字母代码，随后是其在多肽链中的位置(从N端开始计数)来命名；例如，Ala10代表在位置10处的丙氨酸。通过在突变之间插入“-、”、“+、”、“/、”或“、”来表示多个突变。位置87和90处的突变表示为“G087S-A090Y”或“G87S-A90Y”或“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。对于插入，可以在一个位置之后列出一个或多个插入的氨基酸。例如，“G087GS”描述了在位置87处的甘氨酸之后插入的丝氨酸；作为第二个例子，“G087GSA”描述了在位置87处的甘氨酸之后插入的丝氨酸和丙氨酸。插入可以与取代组合进行；因此，“G087RS”描述了在位置87处的从甘氨酸至精氨酸的取代，然后是插入的丝氨酸残基。对于缺失，在位置编号之后使用“Δ”或“del”。因此，例如，“G087del”描述了在位置87处的甘氨酸的缺失。当描述修饰时，位置后面在括号中列出的氨基酸表示任何列出的氨基酸在该位置处的取代清单。例如，6(L,I)意指位置6可以被亮氨酸或异亮氨酸取代。有时，在序列中，将斜线(/)用于定义取代，例如，F/V表示特定位置，在该位置处可以具有苯丙氨酸或缬氨酸。
“前序列”或“前肽序列”是指在信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的、蛋白酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前序列或前肽序列的切割导致成熟的活性蛋白酶。细菌丝氨酸蛋白酶通常表达为前酶。
术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。典型地，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。典型地，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。
术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或肽的功能形式。
术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到该蛋白质的氨基或羰基末端的原序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有有效地连接到原序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割的多肽以留下成熟形式的蛋白质或肽)。
关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”表示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文使用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。
相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
如本文使用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文使用的，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。
术语“衍生自”和“获自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，该术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。举例来说，“来源于芽孢杆菌属的蛋白酶”是指具有由芽孢杆菌属天然生产的蛋白水解活性的那些酶，以及丝氨酸蛋白酶，如由芽孢杆菌属来源生产但是通过使用遗传工程技术由用编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的其他宿主细胞生产的那些。
在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”是指在两个序列中的核酸或氨基酸在比对最大对应关系时相同，如使用容易获得的序列比较或分析算法测量的。
如本文所使用的，“同源基因”是指来自不同的、但通常相关的物种的基因对，这些基因彼此对应并且彼此相同或非常相似。该术语涵盖通过物种形成(即，新物种的发育)(例如，直系同源基因)分离的基因、以及通过遗传重复分离的基因(例如，旁系同源基因)。
如本文所使用的，“同源性”是指序列相似性或同一性，同一性优先。同源性可以使用本领域已知的标准技术来确定(参见例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报]85:2444[1988]；软件程序，如Wisconsin Genetics Software Package[威斯康星州遗传学软件包]中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Genetics Computer Group,Madison,WI[遗传学计算机组，麦迪逊，威斯康星州])；和Devereux等人，Nucl.Acid Res.[核酸研究]12:387-395[1984])。有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以标绘显示用于创建该比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(参见Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.[分子进化杂志]，35:351-360[1987])。该方法类似于Higgins和Sharp所述的方法(参见Higgins和Sharp，CABIOS 5:151-153[1989])。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。
本领域技术人员可以容易地确定参比序列和目的测试序列之间的百分比序列同一性。通过直接比较分子之间的序列信息(通过比对序列和通过本领域已知的方法来确定同一性)来确定多核苷酸或多肽序列共享的百分比同一性。适合用于确定序列相似性的算法的实例是BLAST算法，(参见Altschul,等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，215:403-410(1990)中)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公开获得。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字而鉴定高得分序列对(HSP)，这些短字当与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配抑或满足一些正值阈值得分T。这些初始相邻字命中用作起始点以找到包含它们的更长HSP。按沿着进行比较的两个序列中每个序列的两个方向对字命中进行延伸，直到累积比对得分可以增加。当累计比对得分从其最大获得值以数量X降低时，当累计得分为零或低于零时，或当达到任一序列末端时，字命中的延伸就停止。BLAST算法参数W、T、以及X确定了该比对的灵敏度与速度。该BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915[1992])比对(B)为50、期望值(E)为10、M’5、N’-4、以及两条链的比较作为默认值。
BLAST算法然后对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul，同上)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(P(N))，它提供了由此将偶然发生在两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配的概率的一个指示。例如，如果测试核酸与丝氨酸蛋白酶核酸比较的最小总和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为核酸与本发明的丝氨酸蛋白酶核酸相似。在测试核酸编码丝氨酸蛋白酶多肽的情况下，如果比较产生小于约0.5，并且更优选小于约0.2的最小总和概率，则认为其与特定的丝氨酸蛋白酶核酸相似。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，百分比“同一”或“同一性”是指当进行比较和比对最大相似性时(如使用序列比较算法或目视检查确定的)，两个或更多个序列是相同的、或分别具有相同的特定百分比的核酸残基或氨基酸残基。主题氨基酸序列与参比(即，查询)氨基酸序列的“百分比序列同一性”或“％同一性”或“％序列同一性”或“％氨基酸序列同一性”是指当序列进行最佳比对时，在比较长度上，主题氨基酸序列以指定百分比与查询氨基酸序列相同(即以氨基酸比氨基酸计)。因此，就两个氨基酸序列而言，80％氨基酸序列同一性或80％同一性是指两个最佳比对的氨基酸序列中80％氨基酸残基是相同的。
主题核酸序列与参比(即，查询)核酸序列的“百分比序列同一性”或“％同一性”或“％序列同一性”或“％核苷酸序列同一性”意指当序列进行最佳比对时，在比较长度上，主题核酸序列以指定百分比与查询序列相同(即，在多核苷酸序列的一个核苷酸接一个核苷酸的基础上)。因此，就两个核酸序列而言，80％核苷酸序列同一性或80％同一性是指两个最佳比对的核酸序列中80％核苷酸残基是相同的。
主题蛋白质序列与参比(即，查询)蛋白质序列的“百分比序列同一性”或“％同一性”或“％序列同一性”或“％蛋白质序列同一性”意指当序列进行最佳比对时，在比较长度上，主题蛋白质序列以指定百分比与查询序列相同(即，在多肽序列的一个残基接一个残基的基础上)。因此，就两个多肽序列而言，80％蛋白质序列同一性或80％同一性意指两个最佳比对的蛋白质序列中的80％的残基是相同的。
在一些实施例中，主题序列与查询序列的“百分比序列同一性”或“％序列同一性”或“％同一性”可以通过对两个序列进行最佳比对和在比较长度上对两个最佳比对序列进行比较来计算。在最佳比对中，在两个序列中存在相同残基的位置数，从而提供匹配位置数，然后将匹配位置数除以比较长度(除非另外指明，该长度是查询序列的长度)的总位置数。所得数字乘以100，以产生主题序列与查询序列的百分比序列同一性。
“最佳的比对”或“最佳地比对的”是指给出最高百分比同一性得分的两个(或更多个)序列的比对。例如，两个蛋白质序列的最佳比对可以通过手动比对序列使得每个序列中相同氨基酸残基的最大数一起比对、或者通过使用本文所述或本领域已知的软件程序或方法来实现。两个核酸序列的最佳比对可以通过手动比对序列使得每个序列中相同核苷酸残基的最大数、连同或者通过使用本文所述或本领域已知的软件程序或方法来实现。
在一些实施例中，当使用定义的参数(例如定义的氨基酸取代基团，空位存在罚分(也称为空位开放罚分))和空位延伸罚分进行比对，从而达到该对序列可能的最高相似性得分时，两个多肽序列被认为是“最佳比对”。在多肽序列比对算法(例如BLASTP)中，通常将BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，同上)用作默认评分替代矩阵。对比对序列之一引入单个氨基酸空位采取空位存在罚分，并且对空位中的每个残基位置采取空位延伸罚分。所采用的示例性比对参数是：BLOSUM62评分矩阵，空位存在罚分＝11，空位延伸罚分＝1。比对分数由每条序列的比对开始和结束的氨基酸位置(例如比对窗口)，以及任选由一条或两条序列中一个空位或多个空位的插入来限定以实现可能的最高相似性分数。
两个或更多个序列之间的最佳比对可通过视觉检查或通过使用计算机手动确定，所述计算机例如但不限于例如用于氨基酸序列的BLASTP程序和用于核酸序列的BLASTN程序(参见例如，Altschul等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]25(17):第3389页-第3402页(1997)：也参见美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站)。
如果目的多肽包含与参比多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的氨基酸序列，则目的多肽可被认为与参比多肽是“基本上相似的”。两个此类的多肽之间的百分比同一性可以通过检查两个最佳比对的多肽序列或通过使用软件程序或算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL和MUSCLE)使用标准参数手动确定。两种多肽基本上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅仅在保守氨基酸取代或一个或多个保守氨基酸取代上是不同的。
如果目的核酸包含与参比核酸的核苷酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的核苷酸序列，则目的核酸可被认为与参比核酸是“基本上相似的”。两个此类的核酸之间的百分比同一性可以通过检查两个最佳比对的核酸序列或通过使用软件程序或算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL和MUSCLE)使用标准参数手动确定。两个核酸序列基本上相同的一个指示是两个核酸分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。
当核酸或多核苷酸至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。类似地，当多肽、蛋白质或肽至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔计，在组合物中分离的种类比其他种类更丰富。例如，分离的种类可以包含存在的所有大分子种类的至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％(以摩尔计)。优选地，将目的种类纯化至基本均一性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物种类)。可以分别使用本领域熟知的许多技术例如核酸或蛋白质样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过染色后可视化来确定纯度和均一性。如果需要，可以使用高分辨率技术例如高效液相色谱法(HPLC)或类似方法来纯化物质。
术语“纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在相关意义上，本发明提供了对于本发明的一个或多个分子(例如一个或多个本发明的多肽或多核苷酸)而言富集组合物的方法。当在应用纯化或富集技术之后存在一种分子的浓度的大幅度增加时，对于该分子而言组合物被富集了。典型地，本发明的基本上纯的多肽或多核苷酸(例如，分别为基本上纯的变体蛋白酶或编码本发明的变体蛋白酶的多核苷酸)将包含特定组合物中所有大分子种类的至少约55％、约60％、约70％、约80％、约90％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98、约99％、约99.5％或更多重量(以摩尔计的)。
在相关意义上，本发明提供了对于本发明的一个或多个分子(例如一个或多个本发明的多肽(例如一个或多个本发明的变体蛋白酶)或一个或多个本发明的核酸(例如一个或多个编码本发明的一个或多个变体蛋白酶的核酸))而言富集组合物的方法。当在应用纯化或富集技术之后存在一种分子的浓度的大幅度增加时，对于该分子而言组合物被富集了。基本上纯的多肽或多核苷酸通常将包含特定组合物中所有大分子种类的至少约55％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或更多重量(以摩尔计的)。
如在此处所使用的，术语“组合诱变”或“组合的”是指其中产生参比核酸序列的核酸变体的文库的方法。在这些文库中，变体含有选自预定义的一组突变的一个或多个突变。该方法还提供了引入不是预定义的一组突变的成员的随机突变的方法。一些此类的方法包括在美国专利号6,582,914中示出的那些方法，将其通过引用结合在此。一些此类的组合诱变方法包括和/或涵盖可商购的试剂盒(例如Multi Site-DirectedMutagenesis Kit[多定点诱变试剂盒](Stratagene)，PCR融合/延伸PCR)中包含的方法。
如本文所使用的，与变体蛋白酶有关的“具有改进的特性”是指相对于相应的参比蛋白酶(例如野生型或天然存在的蛋白酶)，具有改进的或增强的洗涤或清洁性能和/或改进的或增强的稳定性，任选地具有保留的洗涤或清洁性能的变体蛋白酶。变体蛋白酶的改进的特性可以包含改进的洗涤或清洁性能和/或改进的稳定性。在一些实施例中，本发明提供了显示以下特性中的一种或多种的本发明的变体蛋白酶：相对于参比蛋白酶(例如野生型蛋白酶，像野生型AprL)，改进的手洗洗涤性能、改进的手洗或手动餐具洗涤性能、改进的自动餐具洗涤性能、改进的衣物洗涤性能、和/或改进的稳定性。
如本文使用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定系统。例如，在酶的情况下，功能测定涉及确定酶在催化反应中的有效性。
如本文所用，术语“目标特性”是指起始基因的待改变的特性。本发明并不旨在限于任何具体的目标特性。然而，在一些实施例中，目标特性是基因产物的稳定性(例如，对变性、蛋白水解或其他降解因子的抗性)，而在其他实施例中，生产宿主中的生产水平被改变。
如本文所用，在核酸的语境中术语“特性”或其语法上等同的术语指核酸的可被选择或检测的任何特征或属性。这些特性包括但不限于影响与多肽结合的特性、赋予包含特定核酸的细胞的特性、影响基因转录(例如启动子强度、启动子识别、启动子调节、增强子功能)的特性、影响RNA加工(例如RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象、和转录后修饰)的特性、影响翻译(例如，水平、调节、mRNA与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)的特性。例如，可以改变核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点以产生期望的特征或鉴定不期望的特征。
如本文所用，在多肽(包括蛋白质)的语境中术语“特性”或其语法上等同的术语指多肽的可被选择或检测的任何特征或属性。这些特性包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、酶活性、热稳定性、碱性稳定性、pH活性曲线、对蛋白降解的抗性、KM、kcat、kcat/kM比率、蛋白质折叠、诱导免疫应答、与配体结合的能力、与受体结合的能力、分泌的能力、展示在细胞表面上的能力、寡聚体化的能力、信号传导能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导细胞凋亡的能力、通过磷酸化作用或糖基化作用被修饰的能力、和/或治疗疾病的能力等。
如在此处所使用的，术语“筛选”具有其在本领域中的通常含义。在一个示例性筛选过程中，提供了由其编码的突变核酸或变体多肽，并分别评估或确定了突变核酸或变体多肽的特性。可以将突变核酸或变体多肽的确定的特性分别地与相应的前体(亲本)核酸的特性或相应的亲本多肽的特性进行比较。
对本领域技术人员显而易见的是，用于获得具有改变的特性的核酸或蛋白质的筛选程序取决于起始材料的特性，所述突变核酸的产生旨在促进所述起始材料的修饰。本领域技术人员因此将认识到，本发明不限于要筛选的任何特定特性，并且以下对特性的描述仅列出了说明性实例。用于筛选任何特定特性的方法在本领域中具有一般性描述。例如，可以测量突变之前和之后的结合、pH、特异性等，其中变化表示改变。优选地，筛选以高通量方式进行，包括同时筛选的多个样品，包括但不限于利用芯片、噬菌体展示和多个底物和/或指示物的测定。
如在此处所使用的，在一些实施例中，筛选过程涵盖一个或多个选择步骤，其中目的变体从变体群中富集。这些实施例的实例包括赋予宿主生物体生长优势的变体的选择、以及噬菌体展示或任何其他展示方法，其中变体可以基于它们的结合或催化特性从变体群中获得。在一些实施例中，变体文库暴露于压力(例如，热、变性等)，并且随后在筛选中鉴定或通过选择富集仍然完整的变体。这个术语旨在涵盖任何合适的选择方式。事实上，本发明并不限于任何具体的筛选方法。
术语“修饰的核酸序列”和“修饰的基因”在此处可互换使用，是指包括天然存在的(即野生型)核酸序列的缺失、插入或中断的核酸序列。在一些实施例中，修饰的核酸序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果修饰是序列的缺失或中断)。在一些实施例中，截短的蛋白质保留了生物学活性。在可替代的实施例中，修饰的核酸序列的表达产物是延长的蛋白质(例如包含在核酸序列中的插入的修饰)。在一些实施例中，核酸序列中的核苷酸插入导致截短的蛋白质(例如，当插入导致终止密码子形成时)。因此，插入可导致截短的蛋白质或延长的蛋白质(作为表达产物)。
“突变体”核酸序列通常是指具有宿主细胞的野生型序列中出现的至少一个密码子的改变的核酸序列，使得突变体核酸序列的表达产物相对于野生型蛋白质是具有改变的氨基序列的蛋白质。表达产物可能具有改变的功能性能力(例如增强的酶活性)。
如在此处所使用的，短语“底物特异性的改变”是指酶的底物特异性的改变。在一些实施例中，底物特异性的变化被定义为特定底物的kcat和/或Km的变化，其由酶的突变或反应条件的改变而产生。酶的底物特异性通过将其针对不同底物显示的催化效率进行比较来确定。这些测定发现了在评估突变体酶的效率方面的特定用途，因为通常期望产生对于目的底物显示出更高的kcat/Km比率的变体酶。然而，本发明不限于任何特定的底物组合物或底物特异性。
如在此处所使用的，“表面特性”用于指静电电荷、以及诸如蛋白质表面显示的疏水性和亲水性等的特性。
如在此处所使用的，术语“净电荷”被定义为分子中存在的所有电荷的总和。对亲本蛋白质分子进行“净电荷改变”，以提供具有不同于亲本分子的净电荷的变体(即，变体具有与亲本分子的净电荷不同的净电荷)。例如，用带负电荷的氨基酸取代中性氨基酸或用中性氨基酸取代带正电荷的氨基酸导致相对于亲本分子的净电荷为-1。用带负电荷的氨基酸取代带正电荷的氨基酸导致相对于亲本的净电荷为-2。用带正电荷的氨基酸取代中性氨基酸或用中性氨基酸取代带负电荷的氨基酸导致相对于亲本的净电荷为+1。用带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸导致相对于亲本的净电荷为+2。亲本蛋白质的净电荷也可以通过带电氨基酸的缺失和/或插入来改变。
术语“热稳定(thermally stable)”和“热稳定的(thermostable)”和“热稳定性(thermostability)”是指在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间主要的条件下、在给定的时间段暴露于指定的温度后，蛋白酶保留特定量的酶活性。“改变的温度”包括温度升高或降低。在一些实施例中，在给定的时间段(例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)暴露于改变的温度后，蛋白酶保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的蛋白水解活性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶的背景下，术语“增强的稳定性”是指与其他蛋白酶(例如，AprL蛋白酶)和/或野生型酶相比，随时间推移的较高地保留的蛋白水解活性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶的背景下，术语“减弱的稳定性”是指与其他蛋白酶(例如，AprL蛋白酶)和/或野生型酶相比，随时间推移的较低地保留的蛋白水解活性。
术语“清洁活性”是指在本发明的蛋白水解、水解、清洁、污垢/污渍去除、或其他过程期间主要的条件下由变体蛋白酶或参比蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，变体蛋白酶或参比蛋白酶的清洁性能可以通过使用用于清洁在物品或表面上的一种或多种不同酶敏感性污渍(例如，由食物、草、血液、墨汁、奶、油和/或卵蛋白引起的污渍)的各种测定来确定。变体或参比蛋白酶的清洁性能可以通过使在物品或表面上的污渍经受一个或多个标准洗涤条件并且通过使用各种色谱、分光光度计或其他定量方法来评估污渍除去的程度来确定。示例性清洁测定和方法是本领域已知的，并且包括但不限于在WO 99/34011和US6,605,458中描述的那些，以及包括在下面所提供的实例中的那些清洁性测定和方法。
术语变体蛋白酶或参比蛋白酶的“清洁有效量”是指在特定清洁组合物中达到希望的酶活性水平的蛋白酶的量。此类有效量可以由本领域普通技术人员容易地确定，并且基于许多因素，例如所使用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成、以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、片剂、棒状)组合物等。变体蛋白酶或参比蛋白酶的“污垢去除指数”(soil removal index，SRI)一词是指通过一定量酶或酶活性而实现的污垢去除程度。
术语“清洁辅助材料”是指除了本发明的变体蛋白酶之外在清洁组合物中包含的任何液体、固体或气体物质。在一些实施例中，本发明的清洁组合物包括一种或多种清洁辅助材料。典型地，取决于清洁组合物的具体类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、棒状、糊状、喷雾、片剂、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁辅助材料。优选地，每种清洁辅助材料与在组合物中使用的蛋白酶相容。
术语“增强的性能”是指在清洁活性的背景下，酶对某些酶敏感性污渍(例如蛋、奶、草、墨汁、油、和/或血液引起的污渍)的增加的或更大的清洁活性(通过一次标准洗涤循环和/或多次洗涤循环后的一般评估来确定)。
术语“减弱的性能”是指在清洁活性的背景下，酶对某些酶敏感性污渍(例如蛋、奶、草或血液引起的污渍)的减少的或更小的清洁活性(通过一次标准洗涤循环后的一般评估来确定)。
清洁性能可以通过在各种关于酶敏感性污渍(例如草、血液、墨汁、油、和/或奶引起的污渍)的清洁性测定中(通过标准洗涤循环条件后的一般分光光度法或分析方法来确定)对本发明的变体蛋白酶与参比蛋白酶进行比较来确定。
如在此处所使用的，术语“消费者产品”是指织物产品和家庭护理产品。如在此处所使用的，术语“织物产品和家庭护理产品(home care product)”或“织物产品和家居护理产品(fabric and household care product)”包括通常以销售形式使用或消耗，用于处理织物、硬表面和任何其他表面的产品，和清洁系统(全部用于护理和清洁无生命表面)，以及织物调理剂产品和其他专门设计用于织物护理和维护的产品，以及空气护理产品，包括：空气护理品(包括空气清新剂和气味递送系统)、汽车护理品、宠物护理品、家畜护理品、个人护理品、珠宝护理品、餐具洗涤剂、织物调理剂(包括柔顺和/或清新剂)、衣物洗涤剂、衣物和漂洗添加剂和/或护理剂、预处理清洁组合物、硬表面清洁剂和/或处理剂(包括地板和抽水马桶清洁剂)、玻璃清洁剂和/或处理剂、墙砖清洁剂和/或处理剂、陶瓷清洁剂和/或处理剂、以及其他用于消费者或机构使用的清洁剂。在一些实施例中，织物产品和家庭护理产品适合用于伤口和/或皮肤。“织物产品和家庭护理产品”包括消费者产品和机构产品。
如在此处所使用的，术语“非织物和家庭护理产品”是指添加到其他组合物中以产生可以是织物和家庭护理产品的最终产品的组合物。
如在此处所使用的,术语“机构清洁组合物”是指适合用于机构(包括但不限于学校、医院、工厂、商场、公司、建筑物、餐馆、办公楼和商厦、加工和/或制造车间、兽医院、工厂化农场、工厂化牧场等)的产品。
如在此处所使用的，术语“清洁和/或处理组合物”是织物和家庭护理产品的亚组，除非另有说明，否则包括适用于清洁和/或处理物品的组合物。这类产品包括但不限于：用于处理织物、硬表面以及织物和家庭护理区域中的任何其他表面的产品，包括：空气护理品(包括空气清新剂和气味递送系统)、汽车护理品、餐具洗涤剂、织物调理剂(包括柔顺和/或清新剂)、衣物洗涤剂、衣物和漂洗添加剂和/或护理剂、硬表面清洁剂和/或处理剂(包括地板和抽水马桶清洁剂)、颗粒或粉末状的通用或“重垢”洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的通用洗涤剂，特别是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，特别是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于家庭和机构使用的各种片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型：洗车或地毯香波、浴室清洁剂包括抽水马桶清洁剂；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型、装有基质的产品(例如添加干燥剂的片层)。
事实上，如在此处所使用的，本发明的“清洁组合物”或“清洁配制品”是指用于从待清洁的物体、物品或表面去除或消除合物(例如，不希望的化合物)的本发明的任何组合物，这些待清洁的物体、物品或表面包括但不限于例如织物、织物物品、餐具物品、食具物品、玻璃器皿物品、隐形眼镜、其他固体底物、头发(香波)(包括人或动物毛发)、皮肤(肥皂或乳液)、牙齿(漱口水、牙膏)、物品或物体的表面(例如，硬表面，诸如桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板、非餐具物品、非桌面器具物品等的硬表面)、过滤器、膜(例如，过滤膜，包括但不限于超滤膜)等。该术语涵盖为所希望的清洁组合物的特定类型和产品的形式(例如液体、凝胶、颗粒、喷雾或其他组合物)选择的任何材料和/或添加的化合物，只要该组合物与该组合物中使用的蛋白酶和一种或多种其他酶相容即可。通过考虑待清洁的表面、物体、物品或织物，以及针对使用期间的清洁条件的所希望的组合物形式而容易地进行清洁组合物的具体选择。
清洁组合物和清洁配制品包括适合于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体、物品和/或表面的任何组合物。此类组合物和配制品包括但不限于例如液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片剂、凝胶、棒状、颗粒和/或固体衣物清洁剂或洗涤剂组合物)和精细织物洗涤剂组合物；硬表面清洁组合物和配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔顺剂；以及纺织品、衣物增效清洁或洗涤剂组合物，衣物添加剂清洁组合物和衣物预去污(pre-spotter)清洁组合物；餐具洗涤组合物，包括手洗或手动餐具洗涤组合物(例如“手洗”或“手动”餐具洗涤剂)和自动餐具洗涤组合物(例如“自动餐具洗涤剂”)。本发明还可使用单一剂量单位形式，包括但不限于丸剂、片剂、囊形片(gelca)或其他单一剂量单位例如预先测量的粉末、悬浮液、或液体。
除非另有说明，否则如本文使用的清洁组合物或清洁配制品包括颗粒或粉末形式的通用的或重垢洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片剂、糊剂、或单位剂量形式的通用洗涤剂，特别是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢干燥洗涤剂(HDD)类型；液体精细织物洗涤剂；水溶性单室或多室容器袋、手动或手动洗碗剂，包括高发泡型的那些；手洗或手动餐具洗涤剂、自动餐具洗涤剂、或餐具或桌面器具洗涤剂，包括用于家庭和机构使用的各种片剂、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁棒、漱口水、假牙清洁剂、洗车香波、地毯香波、浴室清洁剂；用于人类和其他动物的毛发香波和/或毛发染发剂；沐浴露和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒组合物是处于“紧密”形式；在一些实施例中，液体组合物是处于“浓缩”形式。
如本文使用的，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，其包括衣物添加剂组合物和适合用于带有污渍的织物(例如衣服、亚麻制品和其他纺织材料)的浸泡和/或预处理的组合物。
如本文使用的，“非织物清洁组合物”包括非纺织品(即非织物)表面清洁组合物，包括但不限于例如手洗或手动或自动餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物、隐形眼镜清洁组合物、伤口清创组合物和个人清洁组合物。
如在此处所使用的，术语“织物和/或硬表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的亚组，除非另有说明，否则这些清洁和处理组合物包括颗粒或粉末形式的通用或“重垢”洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的通用洗涤剂，特别是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，特别是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于家庭和机构的各种片剂、颗粒状、液体和漂洗助剂类型：液体清洁和消毒剂、洗车或地毯香波、浴室清洁剂(包括抽水马桶清洁剂)；的织物调理产品(包括柔顺和/或清新剂)，可以处于液体、固体和/或干燥剂片层形式；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型、装有基质的产品(例如添加干燥剂的片层)。所有的可应用的此类产品可以是处于标准的、浓缩的或甚至高度浓缩的形式，甚至到此类产品可以在某些方面呈非水性的程度。
如本文使用的，关于旨在用于清洁污染或肮脏物体(包括特定织物和/或非织物物体或物品)的洗涤介质中的组合物，使用术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂配制品”。本发明的此类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或配制品。实际上，在一些实施例中，本发明的洗涤剂包含本发明的至少一种变体蛋白酶，另外还包含一种或多种表面活性剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在一些情况下，助洗剂盐是硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选具有比磷酸盐(例如三聚磷酸钠)更多的硅酸盐(例如偏硅酸钠)。本发明的一些组合物，例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物，不包含任何磷酸盐(例如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。
如本文使用的，术语“漂白”是指处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面持续足够长的时间和/或在适当的pH和/或温度条件下处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增白(即变白)和/或清洁。适合于漂白的化学品的实施例包括但不限于例如ClO2、H2O2、过酸、NO2等。
如在此处所使用的，蛋白酶(例如，本发明的变体蛋白酶)的“洗涤性能”是指与不向组合物中添加变体蛋白酶的洗涤剂相比，变体蛋白酶对洗涤的贡献，即为洗涤剂提供另外的清洁性能。在相关洗涤条件下比较洗涤性能。在一些测试系统中，其他相关因素，例如洗涤剂组合物、泡沫浓度(sud concentration)、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度能按以下这样的方式进行控制：模仿在某些细分市场(例如手洗或手动餐具洗涤、自动餐具洗涤、餐具清洁、桌面器具清洁、织物清洁等)中对于家庭应用典型的一种或多种条件。
本文中使用的术语“相关洗涤条件”表示在手洗餐具洗涤、自动餐具洗涤或衣物洗涤剂细分市场中实际用于家庭中的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
术语“改进的洗涤性能”用于表示在相关的洗涤条件下去除污渍时获得更好的最终结果，或者需要更少的变体蛋白酶(以重量为基础)来获得与相应的野生型或起始亲本蛋白酶相比相同的最终结果。
如本文使用的，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及在物品表面上抑制或杀死微生物。本发明并不旨在限于任何特定表面、物品或待除去的一种或多种污染物或微生物。
本文清洁组合物的“紧密”形式最好通过密度来反映，并且就组合物而言通过无机填料盐的量来反映。无机填料盐是处于粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐以相当大的量存在，典型地为总组合物的约17％至约35％(以重量计)。相比之下，在紧密的组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过组合物(以重量计)的约10％、或更优选地约5％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自硫酸盐和氯化物的碱盐和碱土金属盐。在一些实施例中，填料盐是硫酸钠。
在此处，给定氨基酸序列中的氨基酸残基的位置通常使用如在SEQ ID NO:2中所示的AprL氨基酸序列的相应氨基酸残基的位置编号来编号。因此，将SEQ ID NO:2所示的AprL氨基酸序列用作参比序列。给定的氨基酸序列(例如在此处所述的变体蛋白酶氨基酸序列)可以使用如在此处所述的比对算法与AprL序列(SEQ ID NO:2)进行比对，并且与AprL序列中的氨基酸残基比对(优选最佳比对)的给定氨基酸序列中的基酸残基可以常规地通过参考与AprL序列中相对应的氨基酸残基来进行编号。
通常，在此处所使用的命名法和以下描述的细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学和蛋白质化学中的许多实验室程序是本领域普通技术人员熟知和通常使用的。用于生产的方法和操纵重组核酸方法、核酸合成、细胞培养方法和转基因掺入(例如转染、电穿孔)是本领域技术人员已知的并且描述于许多标准文本中。通常根据说明书进行寡核苷酸合成和纯化步骤。通常根据本领域众所周知的常规方法和在本文全文中提供的各种一般性参考文献来进行技术和程序。其中的过程被认为是本领域普通技术人员所熟知的，并且为了读者的方便而提供。
本发明的AprL-进化枝酶
如在此处所使用的，AprL-进化枝蛋白酶包括酶、多肽、或蛋白质、或其活性片段(表现出蛋白水解活性)。这包括如实例4中所述的AprL-进化枝的成员，图2和图3中所示的比对以及图9的系统发育树。通过选择与AprL具有亲密同源性的枯草杆菌蛋白酶分子来鉴定AprL-进化枝的成员，产生这些序列与其他枯草杆菌蛋白酶的基于结构的比对，以及鉴定对于所有AprL-进化枝酶保守的独特序列的区域。
在一些实施例中，AprL-进化枝酶包含含有YNT(SEQ ID NO:46)基序的枯草杆菌蛋白酶。在仍其他实施例中，AprL-进化枝酶包含含有Y56N57T58(SEQ ID NO:45)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在仍又其他实施例中，AprL-进化枝酶包含在Asp32和His63之间包含YNT(SEQ IDNO:46)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，AprL-进化枝酶包含了残基52-60之间包含环区域的枯草杆菌蛋白酶，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
在进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含含有FVX1GEX2X3YNT(SEQ ID NO:47)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中X1是A或S，X2不存在或是任何氨基酸，并且X3是A或S。在仍然进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含含有F50V51X152G53E54X355Y56N57T58(SEQ ID NO:48)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中X1是A或S且X3是A或S；并且进一步地，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
在其他实施例中，AprL-进化枝酶包含含有LSX4S(SEQ ID NO:55)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中X4是A或G。在其他实施例中，AprL-进化枝酶包含含有LSAS(SEQ ID NO:49)基序的枯草杆菌蛋白酶。在另一个实施例中，AprL-进化枝酶包含含有LSGS(SEQ ID NO:58)基序的枯草杆菌蛋白酶。在甚至仍又其他实施例中，AprL-进化枝酶包含在Lys236和Arg246之间包含SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:58的枯草杆菌蛋白酶，其中氨基酸位置通过与SEQ IDNO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，AprL-进化枝酶包含含有L240S241A242S243(SEQ ID NO:50)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含含有L240S241G242S243(SEQ ID NO:56)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在仍然进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含含有KXXXLSX4SQX5R(SEQ ID NO:57)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中X是任意氨基酸，X4是A或G，并且X5是I或V。在仍然进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含含有KXXXLSASQX5R(SEQ ID NO:51)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中X是任意氨基酸且X5是I或V。在甚至仍然进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含含有KXXXLSGSQX5R(SEQ ID NO:59)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中X是任意氨基酸且X5是I或V。在仍然进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含含有K236XXXLSASQX5R246(SEQ ID NO:52)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中X是任意氨基酸并且X5是I或V；并且进一步地，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在甚至仍然进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含含有K236XXXLSGSQX5R246(SEQ ID NO:60)基序的枯草杆菌蛋白酶，其中X是任意氨基酸并且X5是I或V；并且进一步地，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
在甚至进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含含有SEQ ID NO:45、46、47、或48和SEQ ID NO:49、50、51或52的枯草杆菌蛋白酶。在另一个实施例中，AprL-进化枝酶包含含有SEQ ID NO:45、46、47、或48和SEQ ID NO:49、50、51、52、55、56、57、58、59、或60的枯草杆菌蛋白酶。在仍然甚至进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含含有SEQ ID NO:45、46、47、或48和SEQ ID NO:49或50的枯草杆菌蛋白酶。在进一步的另一个实施例中，AprL-进化枝酶包含含有在Lys236与Arg246之间的SEQ ID NO:58和在Asp32与His63之间的SEQ ID NO:46的枯草杆菌蛋白酶，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在进一步的另一个实施例中，AprL-进化枝酶包含含有在Lys236与Arg246之间的SEQ ID NO:49和在Asp32与His63之间的SEQ ID NO:46的枯草杆菌蛋白酶，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在甚至仍其他实施例中，AprL-进化枝酶包含含有SEQ ID NO:47或48和SEQ ID NO:50、52、55、56或60的枯草杆菌蛋白酶。
在一些实施例中，AprL-进化枝酶包含含有Arg248残基的枯草杆菌蛋白酶。在一些实施例中，AprL-进化枝酶包含含有Asn96残基的枯草杆菌蛋白酶。在一些实施例中，AprL-进化枝酶包含在残基96和98之间包含氢键的枯草杆菌蛋白酶。在每种情况下，残基编号通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
在一些实施例中，任意野生型AprL-进化枝酶序列可以用作产生本发明的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的亲本序列。在进一步的实施例中，本文所述的一种或多种AprL-进化枝蛋白酶变体的亲本是野生型AprL-进化枝酶。在一些实施例中，如上所示，AprL酶进化枝枯草杆菌蛋白酶可以具有一个或多个签名基序(signature motif)。AprL-进化枝酶的成员被证实聚集到使用邻接法(Saitou,N.和Nei,M.(1987)MolBiol.Evol[分子生物学与进化]4:406-425)创建的系统发育树中相同的分支点。AprL-进化枝酶的序列同一性包括与AprL序列(SEQ ID NO:2)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的酶。AprL-进化枝的成员包括：AprL(SEQ ID NO:2)、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶CAA62667(SEQ ID NO:12)、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶YP_006712489(SEQ ID NO:14)、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BliD02339(SEQ ID NO:9)、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶AEU12640(SEQ ID NO:13)、地衣芽孢杆菌_DY_P00781枯草杆菌蛋白酶(SEQ ID NO:15)、和索诺拉沙漠芽孢杆菌_WP_006636716枯草杆菌蛋白酶(SEQ ID NO:16)。在其他实施例中，Aprl-进化枝蛋白酶变体的亲本是选自以下的Aprl-进化枝酶：AprL(SEQ ID NO:2)、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶CAA62667(SEQ ID NO:12)、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶YP_006712489(SEQ ID NO:14)、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BliD02339(SEQ ID NO:9)、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶AEU12640(SEQ ID NO:13)、地衣芽孢杆菌_DY_P00781枯草杆菌蛋白酶(SEQ ID NO:15)、和索诺拉沙漠芽孢杆菌_WP_006636716枯草杆菌蛋白酶(SEQ ID NO:16)。在仍其他实施例中，Apr1-进化枝蛋白酶变体的亲本是AprL(SEQ ID NO:2)或地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BliD02339(SEQ ID NO:9)。在然而甚至仍又其他实施例中，Aprl-进化枝蛋白酶变体的亲本是与SEQ ID NO:2的AprL序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的AprL-进化枝酶。在仍又其他实施例中，Aprl-进化枝蛋白酶变体的亲本是与SEQ ID NO:2的AprL序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的AprL-进化枝酶。在仍然又其他的实施例中，Aprl-进化枝蛋白酶变体的亲本是与SEQ ID NO:2的AprL序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的AprL-进化枝酶。在仍然又其他的实施例中，Aprl-进化枝蛋白酶变体的亲本是与SEQID NO:2的AprL序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的AprL-进化枝酶。
在一些实施例中，本发明包括新颖的酶和AprL-进化枝的变体。在一些实施例中，本发明包括AprL的变体酶，其中所述变体与SEQ ID NO:2的AprL序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施例中，本发明包括地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶CAA62667的变体酶，其中所述变体与SEQ ID NO:12的地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶CAA62667序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施例中，本发明包括地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶YP_006712489的变体酶，其中所述变体与SEQ ID NO:14的地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶YP_006712489序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施例中，本发明包括地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BliD02339的变体酶，其中所述变体与SEQ ID NO:9的地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BliD02339序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施例中，本发明包括地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶AEU12640的变体酶，其中所述变体与SEQ ID NO:13的地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶AEU12640序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施例中，本发明包括地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶DY_P00781的变体酶，其中所述变体与SEQ ID NO:15的地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶DY_P00781序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施例中，本发明包括索诺拉沙漠芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶WP_006636716的变体酶，其中所述变体与SEQ ID NO:16的索诺拉沙漠芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶WP_006636716序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
AprL-进化枝酶的生产性位置
本发明提供了AprL-进化枝酶中的氨基酸位置，例如AprL丝氨酸蛋白酶，所述AprL丝氨酸蛋白酶可用于洗涤剂组合物中，其中有利的修饰导致针对清洁性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性和酶的热稳定性的最低性能指数，同时具有相对于其亲本AprL进化枝酶(例如以上描述中的SEQ ID NO:2的AprL)改进的这些特征中的至少一个。这些修饰被认为是本发明的合适修饰。
术语“热稳定性(thermal stability和thermostability)”是指通常在本披露的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间主要的条件下、在给定的时间段内暴露于指定的温度下，例如当暴露于改变的温度下之后，本发明的AprL-进化枝丝氨酸蛋白酶保留特定量的酶活性。改变的温度包括温度升高或降低。在一些实施例中，在给定的时间段内(例如至少约60分钟、120分钟、180分钟、240分钟和300分钟)暴露于改变的温度之后，AprL-进化枝蛋白酶保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的蛋白酶活性。
如在此处所使用的，AprL-进化枝蛋白酶的改进的特性包括相对于相应的亲本AprL-进化枝酶(例如野生型或天然存在的AprL-进化枝酶)具有改进的或增强的洗涤或清洁性能的、和/或改进的或增强的稳定性，任选地具有保留的洗涤或清洁性能的变体AprL-进化枝蛋白酶变体酶。变体AprL-进化枝酶的改进的特性可以包含改进的洗涤或清洁性能和/或改进的稳定性。在一些实施例中，本发明提供了显示以下特性中的一种或多种的本发明的变体AprL-进化枝酶：相对于参比亲本AprL-进化枝酶(例如，野生型AprL酶，例如具有SEQ ID NO:2的野生型AprL蛋白酶)，改进的手洗洗涤性能、改进的手洗或手动餐具洗涤性能、改进的自动餐具洗涤性能、改进的衣物洗涤性能、和/或改进的稳定性。
生产性位置被描述为分子内最适用于制备表现改进的特征的组合变体的那些位置，其中位置本身允许至少一种可组合突变。可以将可组合突变描述为可用于制造组合变体的分子中的那些取代。可组合突变是改善分子的至少一种所希望的特性而不显著降低表达、活性或稳定性中任意一者的那些。
可组合突变是改善分子的至少一种所希望的特性而不显著降低表达、活性或稳定性中任意一者的那些。例如，AprL-进化枝蛋白酶中的可组合突变可使用从实例1中描述的测定得到的性能指数(PI)值来确定：N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白(DMC)蛋白酶测定(活性)、EMPA-116、PAS-38微样品测定(活性)、洗涤剂稳定性和热稳定性测定、以及蛋白质测定(表达)。
发现是有用的位置的AprL-进化枝蛋白酶氨基酸位置可以具有适合用于洗涤剂组合物的不同修饰。修饰可包括在具体位置处的插入、缺失或置换。在一个实施例中，修饰为取代。在其他实施例中，天然存在的氨基酸被取代为非天然存在的氨基酸，其中AprL-进化枝蛋白酶变体的亲本是野生型AprL-进化枝酶。在仍一些其他实施例中，AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段包含相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸修饰，其中AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比具有改进的清洁特性。
对于每个位置，较大数目的可能合适的修饰产生对于该位置而言较高的生产力得分。例如，氨基酸位置可以具有在生产性位置上测试的修饰的至少60％、40％或15％作为合适的修饰，其中修饰满足以下适合性标准中的至少一个：
a)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、DMC水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH 8、或pH10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低PI≥0.9，并且对于这些测试中任意一个，另外具有≥1.0的PI；
b)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、DMC水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH 8、或pH10的EMPA-116微型样品清洁的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低PI≥0.8，并且对于这些测试中任意一个，另外具有≥1.2的PI；或
c)如下位置，其中相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的：1)表达；2)选自N-suc-AAPF-pNA水解、DMC水解、在pH 9或pH 10的PAS-38微型样品清洁；和在pH 6、pH 8、或pH10的EMPA-116微型样品清洁性的至少一种蛋白酶活性测定；和3)在应激条件下的洗涤剂稳定性，最低PI≥0.5，并且对于这些测试中任意一个，另外具有≥1.5的PI。
具有测试的修饰的至少60％作为合适修饰的本发明的AprL-进化枝酶位置包括位置12、15、26、27、43、45、48、52、55、57、58、60、77、78、88、96、97、98、99、102、116、117、126、127、129、132、136、143、144、160、161、165、171、210、238、239、241、247、和274，其中AprL-进化枝变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。合适的修饰包括12(K、A、C、F、G、H、L、M、N、Q、S、Y)；15(K、A、C、E、F、H、I、M、N、R、S、T、V)；26(V、A、C、E、H、I、M、N、Q、R、S、T)；27(K、A、C、D、E、L、M、N、P、Q、R、T)；43(N、A、C、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、W、Y)；45(V、A、C、D、E、F、G、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、Y)；48(A、C、D、E、F、H、I、K、M、N、Q、R、W、Y)；52(A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y)；55(A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V)；57(N、A、C、D、E、G、H、P、R、S、V、Y)；58(T、C、D、F、H、I、K、L、M、P、R、S、V、W、Y)；60(G、C、E、F、H、I、K、L、M、Q、R、T、Y)；77(T、C、D、F、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、W)；78(T、C、D、G、I、L、N、Q、S、V、W、Y)；88(S、A、E、F、G、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y)；96(N、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、Q、S、V、Y)；97(S、A、C、D、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、T、W、Y)；98(S、A、D、E、F、H、K、L、N、P、R、T、V、Y)；99(G、A、C、D、E、L、M、Q、S、T、V、W)；102(S、A、D、E、F、G、K、L、N、P、Q、R、T)；116(N、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、T、V、Y)；117(G、C、D、E、H、K、M、N、Q、R、T、V)；126(G、A、C、E、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y)；127(G、A、D、E、F、I、L、M、Q、S、T、V、W、Y)；129(S、C、E、F、H、I、M、N、Q、R、T、V、W、Y)；132(T、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、V、W、Y)；136(Q、A、C、D、F、G、H、K、L、N、R、S、T、W)；143(A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、S、T、Y)；144(R、A、C、D、E、F、G、H、L、M、N、Q、V、Y)；160(N、A、C、D、G、I、K、M、P、R)；161(T、A、C、D、E、I、K、L、M、Q、R、W)；165(G、A、E、I、K、L、P、Q、R、S、T、Y)；171(D、A、C、G、H、I、K、N、P、Q、S、T、V)；210(T、C、D、E、F、H、I、M、N、P、V、Y)；238(P、A、C、D、E、F、G、I、L、M、N、Q、R、S、T、W)；239(N、A、C、D、E、H、I、K、L、M、S、T、V、Y)；241(S、C、D、E、H、L、N、P、Q、T、V)；247(N、A、D、E、F、H、I、L、M、Q、S、V、W、Y)；和274(Q、A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、S、T、V、W)，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
具有测试的修饰的至少40％但<60％作为合适修饰的本发明的AprL-进化枝酶位置包括位置1、9、22、24、25、53、86、89、95、100、105、108、114、115、119、125、128、140、146、155、158、187、202、203、234、237、240、243、244、和264，其中AprL-进化枝变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。合适的修饰包括1(A、D、E、F、G、N、Q、S、T、V)；9(P、A、C、D、E、G、N、Q、S、T)；22(K、A、F、M、Q、R、S、T、VY)；24(A、C、D、E、G、N、Q、S、W)；25(N、D、E、F、G、H、L、M、P、Q、R、S)；53(G、C、D、E、H、K、N、Q、R)；86(S、C、E、H、K、L、N、R)；89(L、A、C、F、G、I、M、N、S、V)；95(L、A、F、G、I、M、Q、S、V)；100(S、C、F、G、M、N、R、T、Y)；105(G、A、C、D、I、M、N、R、S、T)；108(S、E、F、G、H、K、L、N、Q、R、Y)；114(T、A、C、D、F、I、K、L、N、Q、S、V)；115(T、D、E、F、H、I、K、Q、S、W)；119(D、A、E、F、G、H、M、Q、S)；125(L、A、E、F、I、N、S、V、Y)；128(A、C、D、E、H、K、N、P、Q、R、S、T)；140(N、C、D、F、G、H、M、R、T、V)；146(V、A、E、H、I、K、L、N、Q、S、T)；155(S、A、D、E、F、G、H、K、N、Q、R、W)；158(S、A、D、E、I、K、N、Q、R)；187(S、A、C、D、E、H、K、P、Q、W)；202(A、C、D、E、I、K、L、M、Q、S、T、V)；203(G、A、C、E、H、K、M、N、Q、R、S)；234(L、E、F、H、Q、S、W、Y)；237(H、A、C、D、G、I、M、N、Q、S)；240(L、A、D、E、F、I、M、N、Q、T)；243(S、C、E、F、I、N、Q、T、V、W)；244(Q、A、C、D、E、G、H、I、N、R、S、V)；和264(K、A、C、D、H、M、Q、R、S、Y)，其中所述AprL-进化枝变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
具有测试的修饰的至少15％但<40％作为合适修饰的本发明的AprL-进化枝酶位置包括位置2、3、10、18、19、28、29、31、35、37、38、40、44、46、50、54、56、61、67、68、71、87、90、91、92、101、103、104、113、118、120、123、130、131、133、139、145、147、148、181、182、184、193、205、211、212、214、216、217、221、235、242、245、248、251、258、259、和268，其中AprL-进化枝变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。合适的修饰包括2(Q、A、I、N)；3(T、E、I、Q、V)；10(L、F、M、Q)；18(A、C、D、E、S)；19(Q、A、D、E、G、M)；28(V、A、C、S)；29(A、C、S、T、V)；31(L、C、I、V)；35(I、A、C、G、M、S、T、V)；37(A、E、G、S)；38(S、A、C、E、G、N、T)；40(P、A、C、D、E、M、V)；44(V、C、E、P、S、T)；46(G、A、C、D、W)；50(F、H、K、M、Q、R、V、Y)；54(E、Q、R、T)；56(Y、C、E、F、H、P)；61(N、A、D、F、H、K、Q)；67(V、M、N、Q)；68(A、C、G、N、S、T)；71(V、A、G、L、S)；87(V、C、G、S、T)；90(Y、A、C、F、H、N、V)；91(A、G、M、P、V)；92(V、A、C、I、T)；101(G、A、C、N、S、T)；103(Y、A、F、I、L、M、V、W)；104(S、A、D、E)；113(A、C、G、S)；118(M、F、H、P、Q)；120(V、A、C、I、S、T)；123(M、C、I、L、N、Q、S)；130(G、D、E、H、S)；131(S、D、R、T)；133(A、G、M、P、S、T、V)；139(D、G、K、N、S、T)；145(G、D、N、S)；147(V、A、L、M、N)；148(V、A、C、F、M、Q、S)；181(S、A、C、D、H、Q)；182(N、C、D、E、Q)；184(N、C、E、H、M、Q)；193(A、D、P、Q、R)；205(Y、C、E、F、I、M、V)；211(N、C、E、S)；212(T、A、D、S)；214(A、E、H、L、T)；216(L、A、C、H、K、M)；217(N、C、E、S)；221(M、C、H、K)；235(S、C、D、E、G)；242(A、E、G、N、S)；245(V、A、C、I、T)；248(R、A、N、Q、S)；251(S、A、C、E、G、N)；258(S、C、D、E、H、P)；259(S、E、P、Q)；和268(N、D、E、Q)，其中所述AprL-进化枝变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。对于上述突变组中的每一个，第一个列出的取代代表AprL的天然氨基酸(SEQ ID NO:2)。在本发明的一些实施例中，变体是AprL-进化枝变体，其中所述突变是上述列出的组中的那些的任何变体，不包括第一个列出的取代。
具有测试的修饰中的至少一个修饰但<15％的修饰作为合适修饰的本发明的AprL-进化枝酶位置包括位置4、17、21、30、33、36、47、49、51、62、66、72、74、75、76、93、106、107、110、111、112、121、134、135、137、138、141、149、151、156、157、159、163、169、175、183、186、188、191、204、207、208、209、215、223、224、227、229、230、231、232、233、236、249、250、254、255、260、267、269、271、和273，其中AprL-进化枝变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。合适的修饰包括4(V、I)；17(Q、H、M)；21(F、Y)；30(V、C、T)；33(T、C、M)；36(Q、E、H)；47(G、A、M)；49(S、I、T)；51(V、C、I)；62(G、S)；66(H、R)；72(A、G、S)；74(L、G)；75(D、C、E)；76(N、K)；93(K、D)；106(I、G、M)；107(V、F、I)；110(I、F)；111(E、D、Q)；112(W、A)；121(I、L、M)；134(M、L)；135(K、E、H)；137(A、S)；138(V、C、S)；141(A、S)；149(V、C)；151(A、G、P)；156(G、E)；157(S、D、R)；159(G、A、F)；163(T、E)；169(K、R)；175(A、C)；183(S、A、G)；186(A、C)；188(F、W)；191(V、C)；204(V、I)；207(T、C)；208(Y、F)；209(P、S)；215(T、C、V)；223(S、A、C)；224(P、A)；227(A、S)；229(A、G、S)；230(A、G)；231(A、C)；232(L、Q)；233(I、V)；236(K、A)；249(L、I、M)；250(S、A、G)；254(T、D)；255(Y、C、E)；260(F、C、W)；267(I、C)；269(V、A、C)；271(A、D、E)；和273(A、S)，其中所述AprL-进化枝变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
在一些实施例中，AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的生产性位置处，该组由以下组成：A001C、A001D、A024E、A024G、A048C、A048D、A048K、A048N、A052F、A052M、A052V、A052Y、A055C、A072G、A091G、A113C、A128P、A128Q、A133G、A133S、A133T、A143E、A143F、A143H、A143N、A143S、A143W、A193D、A202C、A202D、A202E、A202Q、A227S、D119F、D119S、D119Y、G053C、G053E、G053N、G053Q、G060L、G060Y、G099A、G099T、G101A、G117D、G117V、G127A、G127S、G127T、G130D、G130H、G203A、G203C、G203E、G203M、H237I、I035A、I035C、I035M、I035T、I121L、K012N、K015M、K027C、K027L、K027M、K027R、K264A、K264S、L010M、L095F、L125V、L234Q、L240N、L249I、M123C、M123I、M123L、N025F、N025G、N025L、N025S、N057C、N061A、N076G、N096D、N096G、N116A、N116C、N116L、N116Y、N140A、N160C、N182C、N182D、N184C、N211S、N247F、N247H、N247I、N247L、N247Q、N247S、N247V、N247W、N247Y、P009E、P009T、P238A、P238C、P238D、P238F、P238I、P238R、Q017H、Q136A、Q136C、Q136F、Q136H、Q136K、Q136L、R144F、R144L、R248K、S086R、S088N、S088Y、S097G、S097H、S097Y、S098H、S098L、S100L、S102D、S102E、S102G、S102K、S129E、S129H、S155A、S155D、S155E、S155H、S157D、S158I、S158Q、S181A、S181Q、S183G、S241R、S241T、S243I、S243N、S243T、S243V、S243Y、S251E、S258C、S258D、S258P、T058C、T058D、T058F、T058I、T077C、T077F、T077L、T077M、T078Q、T132A、T132Q、T132V、T132Y、T161Q、T210I、T215C、V026Q、V026R、V026T、V028A、V028C、V045I、V071A、V071L、V120A、V120C、V120I、V146A、V146H、V146K、V147L、V149C、Y056H、和Y255C，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，以上列表具有改进的ADW清洁性。在其他实施例中，改进的ADW清洁性是(i)ADW清洁PI>1.1，或(ii)ADW清洁PI>1.1，以及以下中的一个或多个：HDL pH 6清洁PI>0.8，HDL pH 8清洁PI>0.8，HDD清洁PI>0.8，表达PI>0.8，或稳定性PI>0.8。
在一些实施例中，AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的生产性位置处，该组由以下组成：A029T、A048K、A048R、A052F、A052R、A068G、A113C、D119H、E111Q、G099A、G099S、G127A、G127T、G165A、K012G、K012H、K027C、K027E、K027M、L095F、L125I、L125V、L240Q、N025F、N025G、N025L、N043R、N116R、N140R、N160C、N184C、N239K、P238C、P238I、P238M、Q136F、Q136H、Q136K、Q136R、Q136W、S098F、S098H、S104A、S158Q、S241R、V045R、和Y103M，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，当与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比时，上述列表具有改进的HDD清洁性。在其他实施例中，改进的HDD清洁性是(i)HDD清洁PI>1.1，或(ii)HDD清洁PI>1.1，以及以下中的一个或多个：HDL pH 6清洁PI>0.8，HDL pH 8清洁PI>0.8，ADW清洁PI>0.8，表达PI>0.8，或稳定性PI>0.8。
在一些实施例中，AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的生产性位置处，该组由以下组成：A001C、A048R、A052F、G099S、G099T、G101A、G127F、G127I、G127M、G127Q、G127T、G127V、I121M、L010M、L095A、L095F、L095Q、L095S、L125I、L125V、M123C、M123I、N025F、N025S、N116C、N140R、N184C、P238C、P238D、P238I、P238M、P238N、Q136A、S098F、S098H、S102D、S158Q、S241R、T077C、T077F、T215C、V026I、V026Q、V045R、和V149C，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，当与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比时，上述列表在pH 8下具有改进的HDL清洁性。在其他实施例中，在pH 8的改进的HDL清洁性是(i)HDL pH 8清洁PI>1.1，或(ii)HDL pH 8清洁PI>1.1，以及以下中的一个或多个：HDD清洁PI>0.8，HDL pH 6清洁PI>0.8，ADW清洁PI>0.8，表达PI>0.8，或稳定性PI>0.8。
在一些实施例中，AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的生产性位置处，该组由以下组成：A001C、A024E、A128D、G053C、G099T、G101A、G101N、G165E、G203C、L095Q、L095S、L125S、N061E、N116C、N184C、S098D、S102D、S102E、S104D、S129E、S155D、S158E、和V026T，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，当与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比时，上述列表在pH 6下具有改进的HDL清洁性。在其他实施例中，在pH 6的改进的HDL清洁性是(i)HDL pH 6清洁PI>1.1，或(ii)HDL pH 6清洁PI>1.1，以及以下中的一个或多个：HDD清洁PI>0.8，HDL pH 8清洁PI>0.8，ADW清洁PI>0.8，表达PI>0.8，或稳定性PI>0.8。
在一些实施例中，AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的生产性位置处，该组由以下组成：A001C、A001D、A001E、A001Q、A001S、L010M、L010Q、S100G、S102K、S102R、Y103F、Y103M、S104D、G105M、G105R、S108F、S108H、S108K、S108R、E111Q、T114D、T115D、T115E、T115F、T115K、T115Q、N116E、K012C、K012F、K012H、K012M、K012N、K012Q、K012Y、V120S、M123C、M123I、L125I、G127A、G127D、G127I、G127M、G127S、G127T、G127V、A128E、A128H、A128K、A128P、A128R、A128S、A128T、S129H、S129Q、S129R、S129T、S129V、T132C、T132D、T132E、T132K、T132N、T132P、Q136A、Q136C、Q136K、Q136R、V138C、A143D、A143N、G145S、V147L、V148A、V148C、V148M、V148Q、K015A、K015C、K015E、K015I、K015M、K015S、K015T、K015V、S155D、S155F、S155K、S155N、S155R、S157D、S158D、S158I、S158K、S158R、N160C、N160D、N160I、N160M、N160R、T161C、T161D、T161E、T161K、T161Q、T161R、G165A、G165E、G165Q、G165R、G165S、Q017H、A018D、A018E、S181Q、N182D、S183A、S183G、N184C、N184E、N184Q、A186C、S187D、S187E、S187P、Q019D、Q019E、A193D、A193R、A202D、A202E、A202K、A202Q、A202V、G203A、G203C、G203E、G203N、G203Q、Y205E、T210C、T210E、T210I、T210P、T210V、A214E、T215C、L216C、L216H、L216K、L216M、N217S、L234E、L234F、L234Q、L234S、S235D、S235E、P238T、N239A、N239D、N239H、N239M、N239S、N239T、A024E、A024Q、L240D、S241E、S241N、S241Q、S241V、A242G、A242N、S243E、S243Q、S243V、Q244C、Q244E、V245A、V245C、V245T、N247D、N247W、N025D、N025G、N025Q、S250G、S251E、S258C、S258D、S258E、S258H、S258P、S259E、S259P、S259Q、V026A、V026C、V026E、V026H、V026Q、V026R、F260W、K264A、K264C、K264D、K264H、K264M、K264Q、K264S、K264Y、I267C、N268D、N268E、N268Q、V269C、K027C、K027D、K027E、K027M、K027P、A271E、Q274A、Q274C、Q274D、Q274E、Q274G、A029S、T003E、T003I、T003Q、T003V、V030C、I035A、I035S、I035T、I035V、S038T、N043A、N043C、N043F、N043H、N043Q、V044P、V045A、V045C、V045D、V045E、V045F、V045G、V045M、V045N、V045Q、V045R、V045S、V045T、G046D、A048N、A048W、F050H、V051I、A052F、A052G、A052K、A052N、A052P、A052R、A052V、G053N、G053R、A055C、A055D、A055E、A055G、A055H、A055N、A055S、A055V、N057C、N057E、N057G、N057V、T058C、T058I、T058K、T058W、A068C、A068N、A068S、V071A、L074G、D075E、N076K、T077C、T077D、T077H、T077M、T077N、T077P、T077Q、T077S、T078D、T078I、T078V、S086E、S086H、S086R、V087C、V087G、V087S、V087T、S088E、S088N、S088R、L089N、P009C、P009D、P009E、P009N、P009T、L095A、L095V、N096S、S098K、S098R、和G099Q，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，当与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比时，上述列表具有改进的稳定性。在其他实施例中，改进的稳定性是(i)稳定性PI>1.2，或(ii)稳定性PI>1.2以及以下中的一个或多个：HDD清洁PI>0.8，HDL pH 6或pH 8清洁PI>0.8，ADW清洁PI>0.8，或表达PI>0.8。
在仍然进一步的实施例中，稳定性PI是根据实例1的稳定性测定来测量的，HDD清洁PI是根据实例1的HDD清洁性测定来测量的，HDL清洁PI是根据实例1的HDL清洁性测定来测量的，ADW清洁PI是根据实例1的ADW清洁性测定来测量的，并且/或者表达PI是根据实例1的蛋白质测定分析来测量的。
在一些实施例中，AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的生产性位置处，该组由以下组成：P009E、S038G、V045R、A052V、T077Q、A091G、S098R、M123I、T132N、T132S、A133S、Q136A、Q136S、G145S、N160R、G165Q、P238R、N239K、A242N、S243Q、S243T、S258E、和Q274F，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比，上述列表具有改进的污垢去除性。在其他实施例中，AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰位于选自下组的AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的生产性位置处，该组由以下组成：P009E、V045R、A052V、T077Q、S098R、M123I、T132N、Q136A、G145S、N160R、G165Q、A242N、S243Q、和S258E，其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。在一些实施例中，与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比，上述列表具有改进的污垢去除性。
本发明的多肽
本发明提供了新颖的多肽，其可以统称为“本发明的多肽”。本发明的多肽包括分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的变体和新发现的AprL-进化枝酶多肽，包括例如具有酶活性(例如蛋白酶活性)的变体AprL-进化枝酶多肽。在一些实施例中，本发明的多肽可用于清洁应用中并且可以掺入可用于清洁需要清洁的物品或表面(例如物品的表面)的方法中的清洁组合物中。
在一些实施例中，AprL-进化枝酶变体可以是来自芽孢杆菌属(Bacillus)的亲本AprL-进化枝酶的变体。已经在芽孢杆菌属中发现了彼此具有高度同一性并且与在SEQ IDNO:2中所示的来自AprL的AprL成熟酶具有高度同一性的多种AprL-进化枝酶。参见例如表8和9、以及实例4中的图2、实例6中的图3和实例12中的图9。在不同的实施例中，AprL-进化枝酶变体可以是来自在表8或9、或图2、3或9中所述的任意物种的亲本AprL-进化枝酶的变体。
在一些实施例中，AprL-进化枝酶变体可以是与在表8或9、或图2、3或9中所述的AprL-进化枝酶具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的变体；例如，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9的AprL蛋白酶。
描述了与AprL-进化枝酶有关的组合物和方法。该组合物和方法部分基于在洗涤剂组合物存在下克隆的和表达的AprL具有蛋白水解活性的观察。AprL在洗涤剂组合物中也表现出优异的稳定性。AprL的这些特征使其非常合适用于各种各样的清洁应用，在表面活性剂和洗涤剂组合物中发现的其他组分存在的情况下，酶可以水解蛋白质。
一方面，本发明的组合物和方法提供了变体AprL-进化枝多肽。成熟的AprL-进化枝多肽具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。类似的，基本上相同的AprL-进化枝多肽可以天然存在，例如存在于其他的菌株或分离物中。这些和其他重组AprL-进化枝多肽涵盖在本发明组合物和方法中。
在一些实施例中，本发明包括具有蛋白酶活性的分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的变体AprL-进化枝酶，其多肽包含与在此处所提供的亲本AprL-进化枝酶具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％的序列同一性的多肽序列。
在一些实施例中，变体多肽是与示例性AprL-进化枝多肽具有特定程度的氨基酸序列同源性的变体，例如与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的序列同源性的变体。如在此处所述，同源性可以通过氨基酸序列比对例如，使用程序例如BLAST、ALIGN、或CLUSTAL来确定。
还提供了编码具有蛋白酶活性的变体AprL-进化枝酶的分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的序列，所述变体AprL-进化枝酶(例如变体AprL)包含氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相差不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过35个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个氨基酸残基，其中变体AprL-进化枝酶的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:2所示的AprL的氨基酸序列中相应的氨基酸位置的编号来编号的，如通过比对变体AprL-进化枝酶氨基酸序列与AprL氨基酸序列所测定。
如上文所述，本发明的变体AprL-进化枝酶多肽具有酶活性(例如，蛋白水解活性)并且因此可用于清洁应用中，该清洁应用包括但不限于用于清洁餐具物品、桌面器具物品、织物和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板等的硬表面)的方法。以下描述了包含本发明的一种或多种变体AprL-进化枝酶多肽的示例性清洁组合物。本发明的变体AprL-进化枝酶多肽的酶活性(例如，AprL-进化枝酶活性)可以容易地用本领域普通技术人员熟知的程序来确定。以下呈现的实例描述了评估酶活性、清洁性能、洗涤剂稳定性和/或热稳定性的方法。可以容易地使用本领域中熟知的程序和/或通过使用在实例中所示的程序来确定本发明的变体AprL-进化枝酶在去除污渍(例如，蛋白质污渍)、清洁硬表面、或清洁衣物、餐具或一种或多种桌面器具物品方面的性能。
可以使本发明的多肽经历各种改变，例如一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代(保守或非保守的)，包括此类改变基本上不改变多肽的酶活性的情况。类似地，本发明的核酸也可以经历不同的变化，例如在一个或多个密码子中的一个或多个核酸的一个或多个取代，这样使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，导致沉默变异(例如，当编码的氨基酸不被核酸突变改变时，核苷酸序列的突变导致了氨基酸序列的沉默突变)或非沉默突变、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个缺失、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个添加或插入、和/或序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个截短的切割。与由原始核酸序列编码的变体AprL-进化枝酶相比，核酸序列中的许多这样的变化本质上可能不会改变所得的编码的变体AprL-进化枝酶的酶活性。还可以对本发明的核酸进行修饰以便包括一个或多个密码子，这种或这些密码子在一个表达系统(例如，细菌表达系统)中提供了最佳表达，同时，若希望，所述一个或多个密码子仍编码一个或多个相同的氨基酸。
在一些实施例中，本发明提供了包含变体AprL-进化枝酶多肽的一类多肽，该AprL-进化枝酶多肽具有所希望的酶活性(例如AprL-进化枝酶活性或清洁性能活性)，这些多肽包含具有在此处所述的氨基酸取代的序列并且还包含一个或多个另外的氨基酸取代，例如保守和非保守取代，其中多肽显示、保持或大致保持所希望的酶活性(例如，AprL-进化枝酶活性或蛋白水解活性，如在变体AprL-进化枝酶的清洁活性或性能中所反映)。根据本发明的氨基酸取代可以包括但不限于一个或多个非保守取代和/或一个或多个保守氨基酸取代。典型地，保守氨基酸残基取代涉及在一个氨基酸残基的功能类别内交换属于相同功能类别的残基的成员(在计算百分比功能同源性时，相同的氨基酸残基被认为是功能同源的或保守的)。典型地，保守氨基酸取代涉及用功能上相似的氨基酸来取代氨基酸序列中的氨基酸。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、和苏氨酸在功能上相似，因此可以相互用作保守氨基酸取代。天冬氨酸和谷氨酸可以相互用作保守取代。天冬酰胺和谷氨酰胺可以相互用作保守取代。精氨酸、赖氨酸、和组氨酸可以相互用作保守取代。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、和缬氨酸可以相互用作保守取代。苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸可以相互用作保守取代。
可以设想其他保守氨基酸取代组。例如，氨基酸可以通过类似的功能或化学结构或组成(例如酸性的、碱性的、脂肪族的、芳香族的、含硫的)进行分组。例如，脂肪族分组可以包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。其他包含被认为相互为保守取代的氨基酸的组包括：芳香族的：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性的：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性的：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；非极性不带电残基，半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、和脯氨酸(P)；亲水性不带电残基：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、和谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组是本领域技术人员所熟知并描述于各种标准教科书中。本文的多肽序列表(结合上述取代组)，提供了所有保守取代的多肽序列的表达列表。
在上述氨基酸残基类别中存在更保守的取代，其也或可替代地可以是合适的。更保守的取代的保守组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本发明的多肽序列的保守取代的变化(例如本发明的变体蛋白酶)包括小百分比、有时小于25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％或6％的多肽序列的氨基酸的取代，或小于5％、4％、3％、2％或1％、或小于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个多肽序列的氨基酸的氨基酸取代(具有相同保守取代组的保守选择的氨基酸)。
如本文其他地方更详细地描述的和在此处所提供的实例中所述的，本发明的多肽可具有可与已知的蛋白酶(包括已知的丝氨酸蛋白酶)相比的清洁能力。在一些实施例中，蛋白酶变体包含一个或多个突变，并且相对于AprL(SEQ ID NO:2)具有-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、或5的总净电荷。在一些实施例中，本发明提供了具有蛋白水解活性的分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的变体蛋白酶(例如变体AprL)，所述变体蛋白酶包含氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2、9、12、13、14、15、或16所示的氨基酸序列相差不超过50个、不超过45个、不超过40个、不超过35个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、或不超过8个氨基酸残基，其中氨基酸位置是根据SEQ ID NO:2中所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列中的相应氨基酸位置的编号来编号的，如通过比对变体蛋白酶氨基酸序列与AprL氨基酸序列所测定。
本发明的核酸
本发明提供分离的、非天然存在的或重组的核酸(本文也称为“多核苷酸”)，其可统称为编码本发明多肽的“本发明的核酸”或“本发明的多核苷酸”。本发明的核酸，包括下面描述的全部，可用于本发明多肽的重组生产(例如，表达)，典型地通过包含编码目的多肽或其片段的序列的质粒表达载体进行表达。如上所讨论，多肽包括含有具有酶活性(例如，蛋白水解活性)的变体AprL-进化枝多肽的变体蛋白酶多肽，该多肽可用于清洁应用和用于清洁需要清洁的物品或表面(例如物品的表面)的清洁组合物中。
在一些实施例中，本发明提供分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的核酸，该核酸包含编码在上文标题为“本发明的多肽”的部分和本文的其他地方中描述的本发明的任何多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本发明还提供了分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的核酸，该核酸包含编码上文和本文其他地方所描述的本发明的任何多肽中的两个或更多个的组合的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明包括编码具有蛋白酶活性的分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的变体AprL-进化枝酶的多核苷酸，所述多核苷酸包含与在此处所提供的亲本AprL-进化枝酶核苷酸序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％的序列同一性的多核苷酸序列。
其他的实施例涉及包含核酸序列的多核苷酸，该核酸序列：(i)编码与SEQ ID NO:9具有至少99％同一性的氨基酸序列；(ii)编码SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(iii)编码SEQID NO:45、46、47、48、49、50、51、或52的氨基酸序列，并进一步编码与SEQ ID NO:9具有至少99％同一性的氨基酸序列；(iv)编码SEQ ID NO:45、46、47、48、49、50、51、或52的氨基酸序列，并进一步编码SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(v)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7具有至少99％的同一性；并且(vi)具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的互补性。
在一些实施例中，本发明包括编码具有蛋白酶活性的分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的变体AprL-进化枝酶的多核苷酸，所述多肽包含与在此处所提供的亲本AprL-进化枝酶多肽序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％的序列同一性的多肽序列。
在一些实施例中，变体多肽是与示例性AprL-进化枝多肽具有特定程度的氨基酸序列同源性的变体，例如与SEQ ID NO:2、9、12、13、14、15、或16的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的序列同源性的变体。如本文所述，同源性可以通过氨基酸序列比对例如，使用程序例如BLAST、ALIGN、或CLUSTAL来确定。
还提供了包含编码具有蛋白水解活性的变体蛋白酶的多核苷酸序列的分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的核酸，所述变体蛋白酶(例如变体AprL)包含氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2、9、12、13、14、15或16的氨基酸序列相差不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过35个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸残基，其中变体AprL-进化枝酶的氨基酸位置是根据SEQ IDNO:2所示的AprL的氨基酸序列中对应的氨基酸位置的编号进行编号的，如通过比对变体蛋白酶氨基酸序列与AprL氨基酸序列所测定。
本发明提供了编码AprL-进化枝变体的核酸，例如SEQ ID NO:2的氨基酸序列中所示的AprL蛋白酶，其中AprL-进化枝变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并且包含含有如本说明书中通篇列出的氨基酸取代的组合的氨基酸序列，其中所述AprL-进化枝变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2所示的AprL蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
本发明的核酸可以通过使用任何合适的合成、操作和/或分离技术或其组合来产生。例如，本发明的多核苷酸可以使用本领域技术人员熟知的标准核酸合成技术，例如固相合成技术来生产。在这样的技术中，典型地合成高达50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(例如通过酶或化学连接方法或聚合酶介导的重组方法)以基本上形成任何希望的连续核酸序列。本发明的核酸的合成还可以通过本领域已知的任何合适的方法来促进(或可替代地实现)，包括但不限于使用经典的亚磷酰胺方法的化学合成(参见例如Beaucage等人，Tetrahedron Letters[四面体快报]22:1859-69[1981])；或Matthes等人描述的方法(参见Matthes等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:801-805[1984])，如典型地在自动合成方法中所实践的。本发明的核酸还可以通过使用自动DNA合成仪来产生。可以从各种商业来源订购定制的核酸(例如，米德兰认证试剂公司(The Midland Certified ReagentCompany)、大美国基因公司(Great American Gene Company)、操纵子技术公司(OperonTechnologies Inc.)和DNA2.0)。用于合成核酸和相关原理的其他技术是本领域已知的(参见例如，Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴]53:323[1984]；和Itakura等人，Science[科学]198:1056[1984])。
如上所述，可用于核酸修饰的重组DNA技术是本领域熟知的。例如，技术例如限制性内切核酸酶消化、连接、逆转录和cDNA生产以及聚合酶链反应(例如PCR)是本领域技术人员已知和容易使用的。本发明的核苷酸还可以通过使用一个或多个可以杂交至或PCR-扩增编码本发明的一个或多个变体蛋白酶多肽的多核苷酸的寡核苷酸探针来筛选cDNA文库(例如使用本领域通常使用的诱变技术产生的cDNA文库，包括本文所述的那些)而获得。用于筛选和分离cDNA克隆和PCR扩增程序的方法是本领域技术人员熟知的并且描述于本领域技术人员已知的标准参考文献中。本发明的一些核酸可以通过例如已知的诱变程序(例如，定点诱变、位点饱和诱变和体外重组)改变天然存在的多核苷酸主链(例如，编码酶或亲本蛋白酶的多核苷酸主链)来获得。
制备本发明的修饰的变体蛋白酶的方法
适合用于产生编码本发明的变体蛋白酶的本发明的经修饰的多核苷酸的各种方法是本领域已知的，这些方法包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变、通过寡核苷酸合成和连接的合成基因构建体和定向进化、以及各种其他重组方法。制备经修饰的多核苷酸和蛋白质(例如变体蛋白酶)的方法包括DNA改组方法、基于基因的非同源重组的方法，例如ITCHY(参见，Ostermeier等人，7:2139-44[1999])，SCRACHY(参见，Lutz等人，98:11248-53[2001])、SHIPREC(参见，Sieber等人，19:456-60[2001])和NRR(参见，Bittker等人，20:1024-9[2001]；Bittker等人，101:7011-6[2004]))、和依赖于使用寡核苷酸随机插入和靶向突变、缺失和/或插入的方法(参见，Ness等人，20:1251-5[2002]；Coco等人，20:1246-50[2002]；Zha等人，4:34-9[2003]；Glaser等人，149:3903-13[1992])。
用于生产本发明的变体蛋白酶的载体、细胞和方法
本发明提供了包含本文所述的本发明的至少一种多核苷酸(例如，编码本文所述的本发明的变体蛋白酶的多核苷酸)的分离的或重组的载体，包含本发明的至少一种核酸或多核苷酸的分离的或重组的表达载体或表达盒，包含本发明的至少一种核酸或多核苷酸的分离的、基本上纯的或重组的DNA构建体，包含本发明的至少一种多核苷酸的分离的或重组的细胞，包含具有本发明的至少一种多核苷酸的细胞的细胞培养物、包含本发明的至少一种核酸或多核苷酸的细胞培养物、以及包含一种或多种这样的载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或其任何组合或混合物的组合物。
在一些实施例中，本发明提供包含具有本发明的至少一种核酸或多核苷酸的本发明的至少一种载体(例如表达载体或DNA构建体)的重组细胞。一些这样的重组细胞用这样的至少一种载体转化或转染。这样的细胞典型地称为宿主细胞。一些这样的细胞包含细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。本发明还提供了包含本发明的至少一种变体蛋白酶的重组细胞(例如重组宿主细胞)。
在一些实施例中，本发明提供了包含本发明的核酸或多核苷酸的载体。在一些实施例中，载体是一种表达载体或表达盒，其中编码本发明的变体蛋白酶的本发明的多核苷酸序列有效地连接到有效基因表达所需的一个或另外的核酸区段(例如与编码本发明的变体蛋白酶的本发明的多核苷酸有效地连接的启动子)。载体可以包括转录终止子和/或能够通过在含有抗菌剂的培养基中生长来实现质粒感染的宿主细胞的连续培养维持的选择基因，例如抗生素抗性基因。
表达载体可以衍生自质粒或病毒DNA，或在可替代实施例中，含有两者的元件。示例性载体包括但不限于pXX、pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood和Cutting[编辑]，第3章，“Molecular Biological Methods for Bacillus[用于芽孢杆菌的分子生物学方 法]”，John Wiley&Sons[约翰威利父子公司][1990]；枯草芽孢杆菌的适合的复制质粒包括第92页列出的那些；还参见，Perego，Integrational Vectors for GeneticManipulations in Bacillus subtilis[在枯草芽孢杆菌中用于遗传操作的整合载体]，在：Sonenshein等人，[编辑]“Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry,Physiology and Molecular Genetic[枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细 菌：生物化学、生理学和分子遗传学]”，American Society for Microbiology[美国微生物学会]，华盛顿特区[1993]，pp.615-624)。
为了在细胞中表达和生产目的蛋白(例如，变体蛋白酶)，包含编码经修饰的蛋白酶的多核苷酸的至少一个拷贝(并且优选包含多个拷贝)的至少一种表达载体在适合于蛋白酶表达的条件下被转化到细胞中。在本发明的一些实施例中，将编码变体蛋白酶的多核苷酸序列(以及在载体中包含的其他序列)整合到宿主细胞的基因组中，然而在其他实施例中，包含编码变体蛋白酶的多核苷酸序列的质粒载体在细胞内保持为自主的染色体外元件。本发明提供染色体外核酸元件以及整合到宿主细胞基因组中的进入的核苷酸序列。本文描述的载体可用于生产本发明的变体蛋白酶。在一些实施例中，编码变体蛋白酶的多核苷酸构建体存在于能够将编码变体蛋白酶的多核苷酸整合并且任选地扩增入细菌染色体中的整合载体上。整合位点的实施例是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，编码本发明的变体蛋白酶的多核苷酸的转录通过启动子来实现，该启动子是所选前体蛋白酶的野生型启动子。在一些其他实施例中，启动子与前体蛋白酶是异源的，但是在宿主细胞中发挥功能。具体地，用于细菌宿主细胞的合适的启动子的实例包括但不限于例如AprE、amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pVeg、pHpaII启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌cryIIIA的启动子、和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子，以及噬菌体λPR或PL启动子，以及大肠杆菌lac、trp或tac启动子。
本发明的变体蛋白酶可以在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中生产。例如，在一些实施例中，变体蛋白酶在真菌和/或细菌来源的宿主细胞中生产。在一些实施例中，宿主细胞是芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、链霉菌属物种(Streptomycesspp.)、埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)、曲霉属物种(Aspergillus spp.)、木霉属物种(Trichoderma spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp.)、酵母属物种(Saccharomyces spp.)和毕赤酵母属物种(Pichiaspp.)。在一些实施例中，变体蛋白酶由芽孢杆菌属宿主细胞生产。可用于本发明的变体蛋白酶的生产的芽孢杆菌属宿主细胞的实例包括但不限于：地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌宿主细胞被用于生产变体蛋白酶。US5,264,366和RE 34,606描述了可以用于生产本发明的变体蛋白酶的不同的芽孢杆菌属宿主菌株，尽管可以使用其他合适的菌株。
可以用于生产本发明的变体蛋白酶的几种工业细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌属菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码目的多肽的多核苷酸已经被引入宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，特别是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC39,094)、GX4931、PBT 110、和PEP 211菌株(参见例如Hoch等人，Genetics[遗传学]73:215-228[1973]；还参见美国专利号4,450,235和4,302,544，以及EP 0134048，其各自通过引用以其整体结合)。使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞是本领域熟知的(参见例如，Palva等人，Gene[基因]19:81-87[1982]；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，165:796-804[1986]；和Wang等人，Gene[基因]69:39-47[1988])。
在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞是包含以下基因中的至少一个的突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degU、degS、degR和degQ。优选地，突变是在degU基因中发生，并且更优选地，突变为degU(Hy)32(参见例如，Msadek等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]172:824-834[1990]；以及Olmos等人，Mol.Gen.Gene[分子遗传学和基因组学]253:562-567[1997])。一种合适的宿主菌株是携带degU32(Hy)突变的枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，芽孢杆菌宿主包括在下组中的突变或缺失：scoC4(参见，Caldwell等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，183:7329-7340[2001])；spoIIE(参见，[Arigoni等人，Mol.Microbiol.[分子微生物学]，31:1407-1415[1999])；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见，Perego等人，Mol.Microbiol.[分子微生物学]，5:173-185[1991])。实际上，预期引起与oppA基因突变相同的表型的opp操纵子中的任何突变将可用于本发明的经改变的芽孢杆菌属菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独发生，而在其他实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可以用于生产本发明的变体蛋白酶的改经变的芽孢杆菌属宿主细胞株是已经包含上述基因中的一个或多个的突变的芽孢杆菌属宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的一个或多个突变和/或缺失的芽孢杆菌属宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如，美国专利申请公开号2005/0202535，通过引用结合在此)。
使用本领域已知的任何合适的方法，用编码本发明的至少一种变体蛋白酶的至少一种核酸转化宿主细胞。无论核酸是否并入载体中或在质粒DNA的不存在下使用，典型地将其引入微生物，在一些实施例中，优选大肠杆菌细胞或感受态芽孢杆菌细胞。利用质粒DNA构建体或载体将核酸(例如DNA)引入芽孢杆菌属细胞或大肠杆菌细胞并且将这样的质粒DNA构建体或载体转化到这样的细胞中的方法是熟知的。在一些实施例中，质粒随后从大肠杆菌细胞中分离并且转化到芽孢杆菌属细胞中。然而，没有必要使用介入微生物例如大肠杆菌，并且在一些实施例中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌属宿主中。
本领域技术人员非常了解将本发明的核酸或多核苷酸序列引入芽孢杆菌属细胞的合适方法(参见例如，Ferrari等人，“Ferrari[遗传学]”，在Hardwood等人(编辑)，Bacillus[芽孢杆菌]，Plenum Publishing Corp.[普莱南出版公司][1989]，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，157:718-726[1984]；Hoch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，93:1925-1937[1967]；Mann等人，Current Microbiol.[当代微生物学]，13:131-135[1986]；和Holubova，Folia Microbiol.[微生物学大观]，30:97[1985]；Chang等人，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]，168:11-115[1979]；Vorobjeva等人，FEMSMicrobiol.Lett.[FEMS微生物学快报]，7:261-263[1980]；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.[应用与环境微生物学]，51:634(1986)；Fisher等人，Arch.Microbiol.[微生物学文献集]，139:213-217[1981]；以及McDonald，J.Gen.Microbiol.[普通微生物学杂志]，130:203[1984])。实际上，包括原生质体转化和中板集合、转导、和原生质体融合在内的转化方法是熟知的并且适合用于本发明。使用转化方法将包含编码本发明的变体蛋白酶的核酸的DNA构建体或载体引入宿主细胞。本领域已知的用于转化芽孢杆菌属细胞的方法包括例如质粒标记物拯救转化的方法，其涉及通过携带部分同源的驻留质粒的感受态细胞摄取供体质粒(参见，Contente等人，Plasmid[质粒]2:555-571[1979]；Haima等人，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和基因组学]223:185-191[1990]；Weinrauch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]154:1077-1087[1983]；和Weinrauch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:1205-1211[1987])。在该方法中，进入的供体质粒在模拟染色体转化的过程中与驻留的“辅助”质粒的同源区重组。
除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，用包含编码本发明的变体蛋白酶的核酸的DNA构建体或载体直接转化宿主细胞(即，在引入宿主细胞之前，中间细胞不用于扩增或以其他方式处理DNA构建体或载体)。将本发明的DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的那些物理和化学方法以将核酸序列(例如DNA序列)引入宿主细胞而不插入质粒或载体中。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在另外的实施例中，DNA构建体或载体与质粒一起共转化而不插入质粒。在进一步的实施例中，通过本领域已知的方法从经改变的芽孢杆菌属菌株中缺失选择标记(参见Stahl等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]158:411-418[1984]；以及Palmeros等人，Gene[基因]247:255-264[2000])。
在一些实施例中，将本发明的转化细胞在常规营养培养基中培养。合适的特定培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且详细描述于科学文献中。在一些实施例中，本发明提供包含本发明的至少一种变体蛋白酶或至少一种核酸的培养物(例如细胞培养物)。还提供了包含至少一种本发明的核酸、载体、或DNA构建体的组合物。
在一些实施例中，用编码本发明的至少一种变体蛋白酶的至少一种多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本发明的蛋白酶表达的条件下在合适的营养培养基中培养，其后从培养物中回收所得的蛋白酶。用于培养细胞的培养基包括适合于宿主细胞生长的任何常规培养基，例如含有适当补充剂的基本培养基或复杂培养基。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)的目录中)来制备。在一些实施例中，通过常规程序从培养基中回收由细胞生产的蛋白酶，该常规程序包括但不限于例如通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞、借助于盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白质组分、层析法纯化(例如离子交换、凝胶过滤、亲和等)。任何适合用于回收或纯化变体蛋白酶的方法都可用于本发明。
在一些实施例中，由重组宿主细胞生产的变体蛋白酶被分泌到培养基中。编码纯化促进结构域的核酸序列可以用于促进可溶性蛋白质的纯化。包含编码变体蛋白酶的多核苷酸序列的载体或DNA构建体可以进一步包含编码促进变体蛋白酶纯化的纯化促进结构域的核酸序列(参见例如，Kroll等人，DNA Cell Biol.[DNA细胞生物学]12:441-53[1993])。此类纯化促进结构域包括但不限于例如金属螯合肽，例如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath，Protein Expr.Purif.[蛋白表达与纯化]3:263-281[1992])；允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域；以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的结构域(例如，蛋白质A结构域可从华盛顿州西雅图的英姆纳克斯公司(ImmunexCorp.，Seattle，WA)获得)。在纯化结构域和异源蛋白之间包含可切割的接头序列例如因子XA或肠激酶(例如，可获自加利福尼亚州圣地亚哥市英杰公司(Invitrogen)的序列)还可用于促进纯化。
用于检测和测量酶(例如本发明的变体蛋白酶)的酶活性的测定法是熟知的。用于检测和测量蛋白酶(例如本发明的变体蛋白酶)的活性的各种测定法也是本领域普通技术人员已知的。具体地，测定可用于测量基于从酪蛋白或血红蛋白释放酸可溶性肽的蛋白酶活性，其作为280nm下的吸光度测量或使用Folin方法(本领域技术人员熟知的)进行比色测量。其他示例性测定涉及显色底物的溶解(参见例如，Ward,“Proteinases[蛋白酶]”，于：Fogarty(编辑)，Microbial Enzymes and Biotechnology[微生物酶与生物技术]，AppliedScience[应用科学出版社]，伦敦，[1983]，第251页至第317页中)。其他示例性测定包括但不限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺测定(suc-AAPF-pNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定(TNBS测定)。本领域技术人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如，Wells等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]11:7911-7925[1983]；Christianson等人，Anal.Biochem.[分析生物化学]，223:119-129[1994]；以及Hsia等人，Anal.Biochem.[分析生物化学]，242:221-227[1999])。
可以使用各种方法来确定宿主细胞中的成熟蛋白酶(例如，本发明的变体蛋白酶)的生产水平。此类方法包括但不限于例如利用对蛋白酶特异的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。这些和其他测定法是本领域熟知的(参见例如，Maddox等人，J.Exp.Med.[实验医学杂志]158:1211[1983])。
在一些其他实施例中，本发明提供了制备或生产本发明的成熟变体蛋白酶的方法。成熟的变体蛋白酶不包括信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞(例如像芽孢杆菌属细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞))中制备或生产本发明的变体蛋白酶。在一些实施例中，本发明提供了生产本发明的变体蛋白酶的方法，该方法包括在有利于生产变体蛋白酶的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本发明的变体蛋白酶的核酸。一些这样的方法进一步包括从培养物中回收变体蛋白酶。
在一些实施例中，本发明提供了生产本发明的变体蛋白酶的方法，该方法包括：(a)将包含编码本发明的变体蛋白酶的核酸的重组表达载体引入细胞(例如细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞)群体中；并且(b)在有助于生产由表达载体编码的变体蛋白酶的条件下在培养基中培养细胞。一些这样的方法进一步包括：(c)从细胞或从培养基中分离变体蛋白酶。
清洁组合物
除非另外指出，本文提供的所有组分或组合物水平参照该组分或组合物的活性水平给出，并且不包括可能存在于可商购来源中的杂质，例如残余溶剂或副产品。酶组分重量是基于总的活性蛋白。除非另外指明，所有百分比和比率均按重量计算。除非另外指明，所有百分比和比率均基于总组合物计算。本发明的组合物包括清洁组合物，例如洗涤剂组合物。在例示洗涤剂组合物中，通过按总组合物的重量计的纯酶表示酶水平并且除非另外说明，按总组合物的重量计表示洗涤剂成分。
甚至进一步的实施例涉及包含一个或多个本文所述的AprL-进化枝变体、或重组多肽或其活性片段的组合物。在仍又甚至进一步的实施例中，本文所述的组合物包含磷酸盐、不含磷酸盐、包含硼酸盐、不含硼、或是其组合。在其他实施例中，该组合物是不含硼的组合物。在一些实施例中，不含硼的组合物是未添加硼酸盐稳定剂的组合物。在另一个实施例中，不含硼的组合物是含有少于5.5％硼的组合物。在仍进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于4.5％硼的组合物。在仍又另一个实施例中，不含硼的组合物是含有少于3.5％硼的组合物。在仍又进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于2.5％硼的组合物。在甚至进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于1.5％硼的组合物。在另一个实施例中，不含硼的组合物是含有少于1.0％硼的组合物。在仍进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于0.5％硼的组合物。在仍进一步的实施例中，不含硼的组合物是基本上不含硼的组合物。
虽然对于本发明的目的不是必需的，但是下文所示的辅助剂的非限制性列表适合用于即时清洁组合物。在一些实施例中，掺入这些辅助剂例如以便辅助或增强清洁性能，用于处理待清洁的基材，或者以便改变清洁组合物的美观性，如香料、色素、染料等的情况。应当理解，此类辅助剂是本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的补充。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在使用组合物的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括但不限于漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、色素、填料盐、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色斑点、银护理、抗晦暗和/或抗腐蚀剂、碱源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料、和pH控制剂、表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、附加的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成型过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增白剂、泡沫抑制剂、染料、香料、结构弹性剂、织物柔顺剂、载体、助水溶物、加工助剂和/或颜料。除了以下公开，此类其他辅助剂的适合实施例以及使用水平发现于USPN5,576,282；6,306,812；6,326,348；6,610,642；6,605,458；5,705,464；5,710,115；5,698,504；5,695,679；5,686,014；和5,646,101中。在清洁辅助材料与本发明的丝氨酸蛋白酶多肽在清洁组合物中不相容的实施例中，那么使用合适的方法保持清洁辅助材料和一种或多种蛋白酶分离(即彼此不接触)直到两个组分的组合适当时。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法(例如，囊形片、包封、片剂化、物理分离等)。上述辅助成分可以构成余量的本发明的清洁组合物。
本发明的清洁组合物有利地用于例如洗衣应用、硬表面清洁应用、餐具洗涤应用(包括自动餐具洗涤和手洗餐具洗涤)、以及装饰品应用(例如假牙、牙齿、头发和皮肤清洁)。本发明的酶还适合用于隐形眼镜清洁和伤口清创应用。
本发明的变体蛋白酶还可用于清洁添加剂产品。在一些实施例中，可使用低温溶液清洁应用。在一些实施例中，本发明提供了包括本发明的至少一种酶的清洁添加剂产品，当希望另外的漂白效果时，该酶理想地适合于包含在洗涤过程中。此类实施例包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施例中，添加剂产品处于其最简单的形式，一种或多种蛋白酶。在一个实施例中，该添加剂被包封于剂型中用于添加至清洁过程中。在一些实施例中，该添加剂被包封于剂型中用于添加至清洁过程中，其中使用过氧源并且希望得到增加的漂白效果。本发明可使用任何适合的单一剂量单位形式，包括但不限于丸剂、片剂、囊形片或其他单一剂量单位例如预先测量的粉末或液体。在一些实施例中，包括一种或多种填料或一种或多种载体材料以增加此类组合物的体积。适合的填料或载体材料包括但不限于：硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐以及滑石、粘土等。用于液体组合物的适合的填料或载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。此类醇的实施例包括但不限于：甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物包含从约5％至约90％的此类材料。酸性填料可用于降低pH值。可替代地，在一些实施例中，清洁添加剂包括辅助成分，如下面更全面地描述的。
本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的本文提供的蛋白酶变体中的至少一种，单独的或与其他蛋白酶和/或另外的酶组合。所需的酶水平通过添加本发明的一种或多种蛋白酶变体来实现。典型地本发明的清洁组合物包含至少约0.0001重量百分比、从约0.0001至约10重量百分比、从约0.001至约1重量百分比、或甚至从约0.01至约0.1重量百分比的至少一种本发明的变体蛋白酶。
典型地本文的清洁组合物被配制使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水将具有的pH为从约4.0至约11.5、或甚至从约5.0至约11.5、或甚至从约5.0至约8.0、或甚至从约7.5至约10.5。液体产品配制品典型地被配制成具有从约3.0至约9.0或甚至从约3至约5的pH。颗粒状洗衣产品典型地被配制成具有从约9至约11的pH。在一些实施例中，本发明的清洁组合物可以被配制成在洗涤条件下具有碱性pH，例如从约8.0至约12.0、或从约8.5至约11.0、或从约9.0至约11.0的pH。在一些实施例中，本发明的清洁组合物可以被配制成在洗涤条件下具有中性pH，例如从约5.0至约8.0、或从约5.5至约8.0、或从约6.0至约8.0、或从约6.0至约7.5的pH。在一些实施例中，当清洁组合物在20℃下以1:100(wt:wt)溶解于去离子水中时，可以测量中性pH条件，使用常规pH计进行测量。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。
在一些实施例中，当一种或多种变体蛋白酶应用于颗粒组合物或液体中时，希望变体蛋白酶将处于包封的颗粒的形式以保护变体蛋白酶免受储存期间的颗粒组合物的其他组分的影响。另外，包封还是在清洁过程中控制变体蛋白酶的可用性的手段。在一些实施例中，包封增强了一种或多种变体蛋白酶和/或另外的酶的性能。就这一点而言，本发明的变体蛋白酶使用本领域已知的任何合适的包封材料进行包封。在一些实施例中，包封材料典型地包封本发明的一种或多种变体蛋白酶的至少一部分。典型地，包封材料是水溶性和/或水分散性的。在一些实施例中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。玻璃化转变温度在WO 97/11151中有更详细的描述。包封材料典型地选自由以下组成的组：碳水化合物、天然或合成胶、甲壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡及其组合。当包封材料是碳水化合物时，其典型地选自单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些典型的实施例中，包封材料是淀粉(参见例如EP0922499；US 4,977,252；US 5,354,559；和US 5,935,826)。在一些实施例中，包封材料是由塑料(例如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物)制成的微球；可使用的可商购的微球包括但不限于由(Stockviksverken，瑞典)、以及PM 6545、PM6550、PM 7220、PM 7228、和(PQ公司，宾夕法尼亚州福吉谷市(Valley Forge,PA))供应的那些。
如本文描述的，本发明的变体蛋白酶尤其可用于清洁工业，包括但不限于衣物和餐具洗涤剂。这些应用使酶处于各种环境应激下。由于它们在各种条件下具有稳定性，本发明的变体蛋白酶提供了优于许多目前使用的酶的优点。
实际上，存在各种洗涤条件，包括涉及洗涤的蛋白酶所暴露的不同的洗涤剂配制品、洗涤水体积、洗涤水温度、和洗涤时间的长短。此外，在不同地理区域使用的洗涤剂配制品在洗涤水中存在不同浓度的其相关成分。例如，欧洲洗涤剂典型地在洗涤水中具有约4500-5000ppm的洗涤剂组分，而日本洗涤剂典型地在洗涤水中具有约667ppm的洗涤剂组分。在北美，特别是美国，洗涤剂典型地在洗涤水中存在约975ppm的洗涤剂组分。
低洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。日本洗涤剂典型地被认为是低洗涤剂浓度系统，因为它们在洗涤水中存在大约667ppm的洗涤剂组分。
中洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm和约2000ppm之间的洗涤剂组分。通常将北美洗涤剂视为中洗涤剂浓度系统，因为它们在洗涤水中存在大约975ppm的洗涤剂组分。典型地，巴西洗涤剂在洗涤水中存在大约1500ppm的洗涤剂组分。
高洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度系统，因为它们在洗涤水中具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。
拉丁美洲洗涤剂通常是高泡沫磷酸盐助洗剂洗涤剂，拉丁美洲使用的洗涤剂的范围可以同时在中洗涤剂浓度和高洗涤剂浓度，因为拉丁美洲使用的洗涤剂在洗涤水中的洗涤剂组分的范围为1500ppm至6000ppm。如上所述，典型地，巴西洗涤剂在洗涤水中存在大约1500ppm的洗涤剂组分。然而，其他高泡沫磷酸盐助洗剂地理位置(不限于其他拉丁美洲国家)可能具有高洗涤剂浓度系统(在洗涤水中存在具有高达约6000ppm洗涤剂组分)。
鉴于上述情况，显而易见的是，全世界典型的洗涤溶液中的洗涤剂组合物的浓度从洗涤剂组合物的小于约800ppm(“低洗涤剂浓度地理位置”)(例如在日本为约667ppm)变化至在约800ppm至约2000ppm之间(“中洗涤剂浓度地理位置”)(例如在美国为约975ppm和在巴西为约1500ppm)，变化至大于约2000ppm(“高洗涤剂浓度地理位置”)(例如在欧洲为约4500ppm至约5000ppm，在高泡沫磷酸盐助洗剂地理位置为约为6000ppm)。
根据经验确定典型的洗涤溶液的浓度。例如，在美国，典型的洗涤机器容纳约64.4L的洗涤溶液体积。因此，为了在洗涤溶液中获得约975ppm的洗涤剂的浓度，必须在64.4L的洗涤溶液中加入约62.79g的洗涤剂组合物。该量是消费者使用提供洗涤剂的量杯在洗涤水中测量的典型量。
作为进一步的实例，不同的地理位置使用不同的洗涤温度。典型地，日本洗涤水的温度低于欧洲使用的洗涤水温度。例如，北美和日本的洗涤水的温度典型地在约10℃与约30℃之间(例如约20℃)，然而在欧洲的洗涤水的温度典型地在约30℃与约60℃之间(例如约40℃)。然而，为了节约能源，许多消费者正在转向使用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域中，冷水典型地用于衣物洗涤以及餐具洗涤应用。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”使用适合于在从约10℃至约40℃、或从约20℃至约30℃、或从约15℃至约25℃、以及在约15℃至约35℃范围内并且在10℃至40℃之间所有范围的所有其他组合的温度下洗涤的“冷水洗涤剂”。
作为进一步的实例，不同的地理位置具有不同的水硬度。通常按照每加仑颗粒数混合的Ca2+/Mg2+来描述水硬度。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的量度。美国大部分水都是硬水，但是硬度却不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181份/百万份(份/百万份转化为颗粒/美国加仑为ppm#除以17.1等于颗粒/加仑)的硬度矿物。
水 每加仑颗粒数 百万分率
软 小于1.0 小于17
略硬 1.0至3.5 17至60
中等硬 3.5至7.0 60至120
硬 7.0至10.5 120至180
非常硬 大于10.5 大于180
典型地，欧洲水硬度大于约10.5(例如约10.5至约20.0)颗粒/加仑混合的Ca2+/Mg2 +(例如约15颗粒/加仑混合的Ca2+/Mg2+)。典型地，北美水硬度大于日本水硬度、但低于欧洲水硬度。例如，北美水硬度可以在约3至约10颗粒之间、约3至约8颗粒或约6颗粒。典型地，日本水硬度低于北美水硬度，通常小于约4，例如约3颗粒/加仑混合的Ca2+/Mg2+。
因此，在一些实施例中，本发明提供在至少一组洗涤条件(例如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)中显示令人惊讶的洗涤性能的变体蛋白酶。在一些实施例中，本发明的变体蛋白酶与其他AprL蛋白酶的洗涤性能相当。在本发明的一些实施例中，本文提供的变体蛋白酶显示增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、在各种条件下增强的清洁能力、和/或增强的螯合剂稳定性。另外，本发明的变体蛋白酶也可单独地或与助洗剂和稳定剂组合地用于不含洗涤剂的清洁组合物中。
在本发明的一些实施例中，清洁组合物包含至少一种本发明的变体蛋白酶(水平为以组合物的重量计从约0.00001％至约10％)和包括以组合物的重量计的余量的清洁辅助材料(例如，约99.999％至约90.0％)。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物包含至少一种变体蛋白酶(水平为以组合物重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％)并且余量的清洁组合物包含清洁辅助材料(例如，以重量计约99.9999％至约90.0％、约99.999％至约98％、约99.995％至约99.5％)。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种另外的洗涤剂酶，该洗涤剂酶提供清洁性能和/或织物护理和/或餐具洗涤益处。适合的酶的实施例包含但不限于：另外的丝氨酸蛋白酶、酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、非丝氨酸蛋白酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶，和木糖苷酶，或其任意组合或混合物。在一些实施例中，使用酶的组合(即，“混合物”)，该酶包含常规可适用的酶如淀粉酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶，与蛋白酶结合。
除了本文提供的变体蛋白酶之外，任何其他合适的蛋白酶都可用于本发明的组合物中。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。在一些实施例中，使用微生物蛋白酶。在一些实施例中，包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例包括枯草杆菌蛋白酶，特别是来源于芽孢杆菌属的那些(例如，枯草杆菌蛋白酶迟缓、枯草杆菌蛋白酶解淀粉、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。另外的实例包括在以下各项中描述的那些突变体蛋白酶：USPN RE 34,606；5,955,340；5,700,676；6,312,936；和6,482,628。另外的蛋白酶实施例包括但不限于胰蛋白酶(例如猪或牛起源的)和在WO 89/06270中描述的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。在一些实施例中，可用于本发明的可商购的蛋白酶包括但不限于：MAXACALTM、MAXAPEMTM、 OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM、PREFERENZTM蛋白酶(例如P100、P110、P280)、EFFECTENZTM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZTM蛋白酶(例如P1000)、和PURAFASTTM(杜邦公司)； DURAZYMTM、 和(诺维信公司)；BLAPTM和BLAPTM变体(汉高公司)、和KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶；花王公司)。在WO 92/21760、WO95/23221、WO 2008/010925、WO09/149200、WO 09/149144、WO 09/149145、WO 10/056640、WO10/056653、WO 2010/0566356、WO 11/072099、WO 2011/13022、WO11/140364、WO 12/151534、WO 2015/038792、WO 2015/089447、WO2015/089441、美国公开号2008/0090747、US 5,801,039、US 5,340,735、US5,500,364、US 5,855,625、RE 34,606、US5,955,340、US 5,700,676、US6,312,936、US 6,482,628、US 8,530,219、美国临时专利申请号62/180673和62/161077、和PCT申请号PCT/US 2015/021813、PCT/US 2015/055900、PCT/US 2015/057497、PCT/US 2015/057492、PCT/US 2015/057512、PCT/US2015/057526、PCT/US2015/057520、PCT/US 2015/057502、和PCT/US2016/022282中描述了不同的蛋白酶。在一些进一步的实施例中，金属蛋白酶用于本发明中，包括但不限于在WO 1999014341、WO1999033960、WO1999014342、WO 1999034003、WO 2007044993、WO 2009058303、WO2009058661、WO 2014071410、WO 2014194032、WO 2014194034、WO2014194054、和WO2014/194117中描述的金属蛋白酶。示例性金属蛋白酶包括在枯草芽孢杆菌中表达的重组形式的中性金属蛋白酶nprE(参见例如WO07/044993)和来自解淀粉芽孢杆菌的纯化的中性金属蛋白酶PMN。
另外，任何合适的脂肪酶都可用于本发明。适合的脂肪酶包括但不限于细菌或真菌起源的脂肪酶。在本发明中涵盖化学或遗传修饰的突变体。有用的脂肪酶的实例包括绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP 258068、和EP 305216)；米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP 238023)；假丝酵母属脂肪酶，例如南极洲假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极洲假丝酵母脂肪酶A或B；参见例如，EP214761)；假单胞菌脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如，EP 218272)；洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如，EP 331376)；施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如，GB 1,372,034)；萤光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1131:253-260[1993])；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶[参见例如，JP 64/744992]；和短小芽孢杆菌脂肪酶[参见例如，WO 91/16422])。
此外，许多克隆的脂肪酶可用于本发明的一些实施例中，包括但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人，基因[Gene]103:61-67[1991])；白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，生物化学杂志[J.Biochem.]，106:383-388[1989])；以及不同的根霉属脂肪酶例如德氏根霉(R.Delemar)脂肪酶(参见哈斯(Hass)等人，基因[Gene]109:117-113[1991])，雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学、生物技术与生物化学]56:716-719[1992])和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。
其他类型的脂肪酶多肽酶例如角质酶还可用于本发明的一些实施例中，包括但不限于源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(参见WO 88/09367)的角质酶和源自豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见，WO 90/09446)。
另外的合适的脂肪酶包括脂肪酶例如M1LIPASETM、LUMA FASTTM、和LIPOMAXTM(杜邦公司)； 和ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE PTM“Amano”(天野药业有限公司[Amano Pharmaceutical Co.Ltd.])。
在本发明的一些实施例中，本发明的清洁组合物进一步包含以组合物重量计的另外的脂肪酶的从约0.00001％至约10％的水平的脂肪酶，以及以组合物重量计的余量的清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含以组合物重量计在约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％脂肪酶水平的脂肪酶。
在本发明的一些实施例中，任何合适的淀粉酶可用于本发明。在一些实施例中，还可使用适合用于碱性溶液的任何淀粉酶(例如α和/或β)。适合的淀粉酶包括但不限于细菌或真菌起源的那些。在一些实施例中包括化学或遗传修饰的突变体。可用于本发明的淀粉酶包括但不限于从地衣芽孢杆菌获得的α-淀粉酶(参见例如GB 1,296,839)。另外的适合的淀粉酶包括在下面的专利中发现的那些：WO 9100353、WO 9402597、WO 94183314、WO9510603、WO 9526397、WO 9535382、WO 9605295、WO 9623873、WO9623874、WO 9630481、WO9710342、WO 9741213、WO 9743424、WO9813481、WO 9826078、WO 9902702、WO 9909183、WO9919467、WO9923211、WO 9929876、WO 9942567、WO 9943793、WO 9943794、WO9946399、WO0029560、WO 0060058、WO 0060059、WO 0060060、WO0114532、WO 0134784、WO0164852、WO0166712、WO 0188107、WO0196537、WO 02092797、WO 0210355、WO 0231124、WO 2004055178、WO 2004113551、WO 2005001064、WO 2005003311、WO 2005018336、WO2005019443、WO2005066338、WO 2006002643、WO 2006012899、WO2006012902、WO 2006031554、WO2006063594、WO 2006066594、WO2006066596、WO 2006136161、WO 2008000825、WO2008088493、WO2008092919、WO 2008101894、WO 2008/112459、WO 2009061380、WO2009061381、WO 2009100102、WO 2009140504、WO2009149419、WO2010/059413、WO2010088447、WO 2010091221、WO 2010104675、WO2010115021、WO 10115028、WO 2010117511、WO2011076123、WO2011076897、WO 2011080352、WO 2011080353、WO 2011080354、WO 2011082425、WO 2011082429、WO 2011087836、WO 2011098531、WO 2013063460、WO 2013184577、WO2014099523、WO 2014164777、和WO 2015077126。可用于本发明的可商购的淀粉酶包括但不限于拖麦米尔真菌淀粉酶污渍酶污渍酶加超级污渍酶和BANTM(诺维信公司)、以及EFFECTENZTMS 1000、强力酶(POWERASE)TM、PREFERENZTMS 100、PREFERENZTMS110、EXCELLENZTMS 2000、快速酶和P(杜邦公司)。
在本发明的一些实施例中，本发明的清洁组合物进一步包含以组合物重量计的另外的淀粉酶的从约0.00001％至约10％的水平的淀粉酶，以及以组合物重量计的余量的清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含以组合物重量计在约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％淀粉酶水平的淀粉酶。
在一些另外的实施例中，在本发明的清洁组合物中可使用任何适合的纤维素酶。适合的纤维素酶包括但不限于细菌或真菌起源的那些。在一些实施例中包括化学或遗传修饰的突变体。适合的纤维素酶包括但不限于腐质霉(H.insolens)纤维素酶(参见例如US 4,435,307)。尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶(参见例如EP 0495257)。在本发明中可使用的可商购的纤维素酶包括但不限于纤维素酶护理酶和PREMIUM(诺维信公司)、REVITALENZTM100和2000(杜邦公司)和KAC-500(B)TM(花王公司)。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N-末端的一部分缺失(参见例如US 5,874,276)。另外的合适的纤维素酶包括在下列专利中发现的那些：WO 2005054475、WO2005056787、US 7,449,318、US 7,833,773、US 4,435,307、EP 0495257、和美国临时专利申请号62/296,678中。在一些实施例中，本发明的清洁组合物进一步包含以组合物重量计的另外的纤维素酶的从约0.00001％至约10％的水平的纤维素酶，以及以组合物重量计的余量的清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含以组合物重量计在约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％纤维素酶水平的纤维素酶。
适合用于洗涤剂组合物的任何甘露聚糖酶也可用于本发明。适合的甘露聚糖酶包括但不限于细菌或真菌起源的那些。在一些实施例中包括化学或遗传修饰的突变体。已知不同的甘露聚糖酶可用于本发明(参见例如，USPN 6,566,114、6,602,842、6,440,991、和美国临时专利申请号62/251516、62/278383、和62/278387)。在本发明中可使用的可商购的甘露聚糖酶包括但不限于：EFFECTENZTMM 1000、M 100、和PURABRITETM(杜邦公司)、以及(诺维信公司)。在一些实施例中，本发明的清洁组合物进一步包含以组合物重量计的另外的甘露聚糖酶的从约0.00001％至约10％的水平的甘露聚糖酶，以及以组合物重量计的余量的清洁辅助材料。在本发明的一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含以组合物重量计在约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶。
在一些实施例中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合用于本发明的组合物中。在一些可替代的实施例中，氧化酶与氧组合使用。两种类型的酶都用于“溶液漂白”，即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织染料从一种染色的织物转移到另一种织物上)，优选与增效剂一起使用(参见例如WO 9412621和WO9501426)。适合的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌起源的那些。在一些实施例中包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，本发明的清洁组合物进一步包含以组合物重量计的另外的过氧化物酶和/或氧化酶的从约0.00001％至约10％的水平的过氧化物酶和/或氧化酶，以及以组合物重量计的余量的清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含以组合物重量计在约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％过氧化物酶和/或氧化酶水平的过氧化物酶和/或氧化酶。
在一些实施例中，可使用的另外的酶，包括但不限于过水解酶(perhydrolase)(参见例如WO 2005056782、WO 2007106293、WO 2008063400、WO 2008106214、和WO2008106215)。另外，在一些实施例中，上述酶的混合物涵盖在本文中，特别是一种或多种另外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，预期这些酶的各种混合物将用于本发明。还预期一种或多种变体蛋白酶和一种或多种另外的酶的不同水平可以都独立地变化至约10％，清洁组合物的余量为清洁辅助材料。通过考虑待清洁的表面、物品或织物，以及针对使用过程中(例如在整个清洁洗涤剂使用中)的清洁条件的组合物的所希望的形式而容易地具体选择清洁辅助材料。
合适的清洁辅助材料的实例包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预成型过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂、结构弹性剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、着色剂、填料盐、助水溶剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、织物柔顺剂、载体、助水溶剂、加工助剂、溶剂、颜料、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料、和pH控制剂(参见，例如，USPN6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101)。具体的清洁组合物材料的实施例在下面详细举例说明。在清洁辅助材料与本发明的变体蛋白酶在清洁组合物中不相容的实施例中，则使用合适的方法保持清洁辅助材料和一种或多种蛋白酶分离(即彼此不接触)直到两个组分的组合适当时。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法(例如，囊形片、包封、片剂化、物理分离等)。
在一些实施例中，本文提供的有效量的一种或多种变体蛋白酶包含在用于清洁需要蛋白质去污的各种表面的组合物中。此类清洁组合物包括用于清洁硬表面、织物和餐具等应用的清洁组合物。实际上，在一些实施例中，本发明提供织物清洁组合物，而在其他实施例中，本发明提供非织物清洁组合物。值得注意的是，本发明还提供适用于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理(包括牙粉、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁组合物)、皮肤和毛发清洁组合物。本发明旨在涵盖处于任何形式的洗涤剂组合物(即，液体、颗粒、棒状、半固体、凝胶、乳剂、片剂、胶囊等)。
举例来说，下面将更详细地描述其中可使用本发明的变体蛋白酶的几种清洁组合物。在将本发明的清洁组合物配制成适合用于一种或多种洗衣机洗涤方法中的组合物的一些实施例中，本发明的组合物优选含有至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及一种或多种优选地选自有机聚合化合物、漂白剂、另外的酶、泡沫抑制剂、分散剂、钙皂分散剂、污垢悬浮液和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂的清洁辅助材料。在一些实施例中，衣物洗涤组合物还含有柔顺剂(即，作为另外的清洁辅助材料)。本发明的组合物还可用于处于固体或液体形式的洗涤剂添加剂产品中。此类添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可以在清洁过程的任何阶段添加。在一些实施例中，本文的衣物洗涤剂组合物的密度范围为从约400g/升至约1200g/升，而在其他实施例中，其范围为在20℃下测量的组合物的500g/升至约950g/升。
在配制为用于在手动餐具洗涤方法中使用的组合物的实施例中，本发明的组合物优选含有至少一种表面活性剂以及优选至少一种另外的清洁辅助材料，该清洁辅助材料选自有机聚合化合物、增泡剂、II族金属离子、溶剂、助水溶物和另外的酶。
在一些实施例中，各种清洁组合物(例如在US 6,605,458中提供的那些)可与本发明的变体蛋白酶一起使用。因此，在一些实施例中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物是紧密的颗粒状织物清洁组合物，而在其他实施例中，组合物是用于有色织物洗涤的颗粒状织物清洁组合物，在进一步的实施例中，组合物是通过洗涤能力提供柔顺的颗粒状织物清洁组合物，在另外的实施例中，组合物是重垢液体织物清洁组合物。在一些实施例中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物是织物清洁组合物，例如在USPN 6,610,642和6,376,450中描述的那些。另外，本发明的变体蛋白酶可用于在欧洲或日本洗涤条件下特别实用的颗粒状衣物洗涤剂组合物中(参见例如US 6,610,642)。
在一些替代性实施例中，本发明提供了包含本文提供的至少一种变体蛋白酶的硬表面清洁组合物。因此，在一些实施例中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物是硬表面清洁组合物，例如在USPN 6,610,642；6,376,450；和6,376,450中描述的那些。
在又进一步的实施例中，本发明提供了包含本文提供的至少一种变体蛋白酶的餐具洗涤组合物。因此，在一些实施例中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物是硬表面清洁组合物，例如在USPN 6,610,642和6,376,450中的那些。在一些仍进一步的实施例中，本发明提供了包含本文提供的至少一种变体蛋白酶的餐具洗涤组合物。在一些进一步的实施例中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物包括口腔护理组合物，例如在USPN6,376,450和6,376,450中描述的那些。在上述USPN 6,376,450；6,605,458；6,605,458；和6,610,642中包含的化合物和清洁辅助材料的配制品和描述可用于本文提供的变体蛋白酶。
将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式并且通过由配制者选择的任何方法来制备(参见例如USPN 5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392；和5,486,303)。当希望低pH清洁组合物时，此类组合物的pH经由添加例如单乙醇胺或酸性物质例如HCl的物质来调节。
在一些实施例中，根据本发明的清洁组合物包含酸化颗粒或氨基羧酸助洗剂。氨基羧酸助洗剂的实施例包括氨基羧酸、其盐和衍生物。在一些实施例中，氨基羧酸助洗剂是氨基多羧酸助洗剂，例如甘氨酸-N,N-二乙酸或具有通式MOOC-CHR-N(CH2COOM)2(其中R是C1-12烷基并且M是碱金属)的衍生物。在一些实施例中，氨基羧酸助洗剂可以是甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、羧基甲基菊粉及其盐及其衍生物、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺基甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺基乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺基甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺基乙基)谷氨酸(SEGL)、IDS(亚氨基二乙酸)及其盐及其衍生物例如N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺基甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、以及碱金属盐及其衍生物。在一些实施例中，酸化颗粒的重量几何平均粒度为从约400μ至约1200μ，并且体积密度为至少550g/L。在一些实施例中，酸化颗粒包含至少约5％的助洗剂。
在一些实施例中，酸化颗粒可以包含任何酸，包括有机酸和无机酸。有机酸可以具有一个或两个羧基，并且在一些情况下可以具有多达15个碳，特别是多达10个碳，如甲酸、乙酸、丙酸、癸酸、草酸、琥珀酸、己二酸、马来酸、富马酸、癸二酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸和水合乙醛酸。在一些实施例中，该酸是柠檬酸。无机酸包括盐酸和硫酸。在一些情况下，本发明的酸化颗粒是包含高水平氨基羧酸助洗剂的高活性颗粒。已经发现硫酸进一步有助于最终颗粒的稳定性。
虽然对于本发明的目的不是必需的，但是下文所示的辅助剂的非限制性列表适合用于即时清洁组合物。在一些实施例中，掺入这些辅助剂例如以便辅助或增强清洁性能，用于处理待清洁的基材，或者以便改变清洁组合物的美观性，如香料、色素、染料等的情况。应当理解，此类辅助剂是本发明的变体蛋白酶的补充。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在使用组合物的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、另外的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成型过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增白剂、泡沫抑制剂、染料、香料、结构弹性剂、织物柔顺剂、载体、助水溶剂、加工助剂和/或颜料。除了以下披露内容，此类其他辅助剂的适合实例以及使用水平发现于USPN 5,576,282、6,306,812和6,326,348中。上述辅助成分可以构成余量的本发明的清洁组合物。
在一些实施例中，根据本发明的清洁组合物包括至少一种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中所述表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其混合物。在一些低pH清洁组合物实施例(例如具有约3至约5净pH的组合物)中，组合物典型地不含有烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信这样的表面活性剂可以被这些组合物中的酸性物质水解。在一些实施例中，表面活性剂以从约0.1％至约60％的水平存在，而在可替代的实施例中，该水平为从约1％至约50％，而在又进一步的实施例中，该水平为从约5％至约40％，以清洁组合物的重量计。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统。在掺入至少一种助洗剂的一些实施例中，清洁组合物包含以清洁组合物的重量计至少约1％、从约3％至约60％、或甚至从约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于，聚磷酸盐的碱金属、铵和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸化合物；醚羟基聚羧酸酯；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸、和羧基甲基氧基琥珀酸的共聚物；聚乙酸的各种碱金属、铵和取代的铵盐，例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；连同聚羧酸酯，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀酸(oxydisuccinic acid)、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸及其可溶性盐。实际上，预期任何适合的助洗剂将用于本发明的各种实施例中。
在一些实施例中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，例如柠檬酸盐和多磷酸盐(例如三聚磷酸钠和三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾、以及混合的三聚磷酸钠和钾等)。预期任何适合的助洗剂可用于本发明，包括本领域已知的那些(参见例如EP 2100949)。
在一些实施例中，本文使用的助洗剂包括磷酸盐助洗剂和非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是非磷酸盐助洗剂。如果存在，助洗剂以按组合物的重量计从0.1％至80％、或从5％至60％、或从10％至50％的水平使用。在一些实施例中，产品包括磷酸盐和非磷酸盐助洗剂的混合物。适合的磷酸盐助洗剂包括单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚多磷酸盐，包括这些化合物的碱金属盐，包括钠盐。在一些实施例中，助洗剂可以是三聚磷酸钠(STPP)。另外，组合物可以包含有助于实现本发明的中性pH组合物的碳酸盐和/或柠檬酸盐，优选柠檬酸盐。其他适合的非磷酸盐助洗剂包括多羧酸及其部分或完全中和盐、单体型多羧酸和羟基羧酸及其盐的均聚物和共聚物。在一些实施例中，上述化合物的盐包括铵盐和/或碱金属盐，即锂盐、钠盐和钾盐，包括钠盐。适合的多元羧酸包括无环的、脂环族的、杂环的和芳香族的羧酸，其中在一些实施例中，它们可以包含至少两个羧基基团，这些羧基基团在每种情况下彼此分离，在某些情况下被不超过两个碳原子分离。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物含有至少一种螯合剂。适合的螯合剂包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂及其混合物。在使用至少一种螯合剂的实施例中，本发明的清洁组合物包含以主题清洁组合物重量计从约0.1％至约15％或甚至从约3.0％至约10％的螯合剂。
在一些又进一步的实施例中，本文提供的清洁组合物包含至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸盐、去污聚合物(例如聚对苯二甲酸)、粘土例如高岭土、蒙脱石、绿坡缕石、伊利石、膨润土、多水高岭土及其混合物。
如本文所示，在一些实施例中，抗再沉积剂可用于本发明的一些实施例中。在一些实施例中，可使用非离子表面活性剂。例如，在自动餐具洗涤实施例中，非离子表面活性剂可用于表面改性目的(特别是用于薄片)以避免成膜和沾上污渍并且改善光泽。这些非离子表面活性剂还可用于防止土壤的再沉积。在一些实施例中，抗再沉积剂是本领域已知的非离子表面活性剂(参见例如EP2100949)。在一些实施例中，非离子表面活性剂可以是乙氧基化非离子表面活性剂，环氧树脂封端的聚(烷氧基化)醇和氧化胺表面活性剂。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮以及聚乙烯基咪唑或其混合物。在使用至少一种染料转移抑制剂的实施例中，本发明的清洁组合物包含以清洁组合物的重量计的从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％、或甚至从约0.1％至约3％的该至少一种染料转移抑制剂。
在一些实施例中，硅酸盐包括在本发明的组合物内。在一些这样的实施例中，可使用硅酸钠(例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)。在一些实施例中，硅酸盐以从约1％至约20％的水平存在。在一些实施例中，硅酸盐以按该组合物的重量计从约5％至约15％的水平存在。
在一些又另外的实施例中，本发明的清洁组合物还含有分散剂。适合的水溶性有机材料包括但不限于均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此分开的羧基自由基。
在一些进一步的实施例中，用于清洁组合物中的酶通过任何适合的技术来稳定。在一些实施例中，本文使用的酶通过在向这些酶提供钙和/或镁离子的成品组合物中钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。在一些实施例中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐，包括碱土金属，例如钙盐，例如甲酸钙。预想用于酶稳定化的各种技术将在本发明中使用。例如，在一些实施例中，本文使用的这些酶通过存在于为这些酶提供以下这样的离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，连同其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))来稳定。氯化物和硫酸盐也可用于本发明的一些实施例中。适合的寡糖和多糖(例如糊精)的实施例是本领域已知的(参见例如WO 07145964)。在一些实施例中，根据需要还可使用可逆的蛋白酶抑制剂，例如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或三肽醛来进一步改善稳定性。
在一些实施例中，漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂存在于本发明的组合物中。在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐(例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括的无机过氧化氢合物盐为结晶固体，没有另外的保护，尽管在一些其他实施例中，该盐被包被。本领域已知的任何适合的盐都可用于本发明(参见例如EP 2100949)。
在一些实施例中，漂白活化剂用于本发明的组合物中。漂白活化剂通常为有机过酸前体，其在60℃及以下的温度下在清洁过程中增强漂白作用。适合本文使用的漂白活化剂包括在过水解条件下给出优选具有从约1至约10个碳原子，尤其是从约2至约4个碳原子的脂肪族过氧羧酸的化合物，和/或任选地取代的过氧苯甲酸。其他漂白活化剂是本领域已知的，并且可用于本发明(参见例如EP 2100949)。
另外，在一些实施例中并且如本文进一步描述的，本发明的清洁组合物进一步包含至少一种漂白催化剂。在一些实施例中，可使用锰三氮杂环壬烷和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。另外的漂白催化剂可用于本发明(参见，例如，US 4,246,612、US 5,227,084、US 4,810410、WO9906521、和EP 2100949)。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些实施例中，金属漂白催化剂包含一种催化体系，该催化体系包括：具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的螯合物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐(参见例如US4,430,243)。在一些实施例中，本发明的清洁组合物用锰化合物来催化。此类化合物和使用水平是本领域熟知的(参见例如US 5,576,282)。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于本发明的清洁组合物中。各种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见例如USPN 5,597,936和5,595,967)，并且通过已知的程序容易地制备。
在一些另外的实施例中，本发明的清洁组合物包含大多环刚性配体(macropolycyclic rigid ligand，MRL)的过渡金属络合物。作为实际问题而不当作限制，在一些实施例中，对本发明提供的组合物和清洁方法进行调节以在水性洗涤介质中提供至少一亿分之一数量级的活性MRL种类，并且在一些实施例中，在洗涤液中提供从约0.005ppm至约25ppm、更优选地从约0.05ppm至约10ppm、以及最优选地从约0.1ppm至约5ppm的MRL。
在一些实施例中，在瞬时过渡金属漂白催化剂中的过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。MRL还包括但不限于形成交联桥接的特殊超刚性配体(例如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。适合的过渡金属MRL通过已知的程序容易地制备(参见例如WO200032601和US6,225,464)。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于预防和/或减少金属的锈蚀、腐蚀和/或氧化，该金属包括铝、不锈钢和非铁金属(例如银和铜)。适合的金属护理剂包括描述于EP 2100949、WO 9426860和WO 94/26859中的那些。在一些实施例中，金属护理剂是锌盐。在一些进一步的实施例中，本发明的清洁组合物包含以重量计从约0.1％至约5％的一种或多种金属护理剂。
在一些实施例中，清洁组合物是具有变体AprL-进化枝蛋白酶的高密度液体(HDL)组合物。HDL液体衣物洗涤剂可以包含清洁型表面活性剂(10％-40％wt/wt)，该清洁型表面活性剂包括：阴离子清洁型表面活性剂(其选自下组：直链或支链或无规链、取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐、和/或其混合物)；以及任选地非离子表面活性剂(其选自下组：直链或支链或无规链、取代的或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化醇和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)，任选地其中阴离子清洁型表面活性剂(亲水指数(HIc)为从6.0至9)与非离子清洁型表面活性剂的重量比大于1:1。适合的清洁型表面活性剂还包括阳离子清洁型表面活性剂(选自下组：烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物和/或其混合物)；兼性离子和/或两性清洁型表面活性剂(选自一组链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂；及其混合物。
该组合物可以任选地包含由以下组成的表面活性增强聚合物：两亲烷氧基化油脂清洁聚合物(选自下组：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物，例如烷氧基化聚亚烷基亚胺(在0.05wt％-10wt％范围内))和/或无规接枝聚合物(典型地包含含有选自下组的单体的亲水主链，该组由以下组成：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(例如甘油)及其混合物；以及一个或多个疏水侧链，该疏水侧链选自由以下组成的组：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的C1-C6单羧酸的乙烯酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯及其混合物。
组合物可以包括另外的聚合物，例如去污聚合物(包括阴离子封端的聚酯(例如SRP1)；包含至少一种选自糖、二羧酸、多元醇及其组合的单体单元的处于无规或嵌段构型的聚合物；基于乙二醇对苯二甲酸酯的聚合物及其处于无规或嵌段构型的共聚物，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6、Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325、Marloquest SL)；抗再沉积聚合物(0.1wt％至10wt％)，包括羧酸酯聚合物，例如包含至少一种选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物的聚合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或聚乙二醇，分子量范围为从500至100,000Da)；纤维素聚合物(包括选自以下各项的那些：烷基纤维素；烷基烷氧基烷基纤维素；羧基烷基纤维素；烷基羧基烷基纤维素，其实例包括羧基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧基甲基纤维素；及其混合物)；以及聚合羧酸酯(例如，马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。
组合物可以进一步包含：饱和或不饱和的脂肪酸，优选饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0wt％-10wt％)；沉积助剂(其实例包括多糖；优选纤维素聚合物；聚联丙烯二甲基卤化铵(DADMAC))；和DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉卤化物及其混合物的共聚物(处于无规或嵌段构型)；阳离子瓜尔胶；阳离子纤维素，例如阳离子羟乙基纤维素；阳离子淀粉；阳离子聚丙烯酰胺，及其混合物。
该组合物可以进一步包含染料转移抑制剂，其实例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)；二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)；羟基-乙烷二膦酸(HEDP)；乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；二乙三胺五乙酸(DTPA)；丙二胺四乙酸(PDTA)；2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)；或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)；次氮基三乙酸(NTA)；4,5-二羟基间苯二磺酸；柠檬酸及其任何盐；N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)及其衍生物。
组合物可以进一步包含选自以下的酶(通常约0.01wt％活性酶至0.5wt％活性酶)：蛋白酶；淀粉酶；脂肪酶；纤维素酶；胆碱氧化酶；过氧化物酶/氧化酶；果胶酸裂合酶；甘露聚糖酶；角质酶；漆酶；磷脂酶；溶血磷脂酶；酰基转移酶；过水解酶；芳基酯酶；及其任何混合物。组合物可以包含酶稳定剂(其实例包括多元醇，例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；可逆蛋白酶抑制剂；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯；或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸)。
该组合物可以进一步包含硅树脂或基于脂肪酸的泡沫抑制剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、抗泡沫剂(0.001wt％至约4.0wt％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％至5wt％，选自由以下组成的组：甘油二酸酯和甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、及其混合物)。
该组合物可以是任何液体形式，例如液体或凝胶形式，或其任何组合。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物以单位剂量形式提供，包括片剂、胶囊、药袋、小袋和多室袋。在一些实施例中，单位剂量形式被设计成在多室袋(或其他单位剂量形式)内提供对成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式是本领域已知的(对于适合于单位剂量和控制释放形式的材料，参见例如EP 2100949、WO 02102955、US 4,765,916、US4,972,017、以及WO 04111178)。在一些实施例中，单位剂量形式由用水溶性膜或水溶性袋包裹的片剂提供。不同的单位剂量形式的实例提供于EP2100947和WO 2013165725中。
在一些实施例中，该清洁组合物是具有变体AprL-进化枝蛋白酶的高密度粉末(HDD)组合物。该HDD粉末衣物洗涤剂可以包括清洁型表面活性剂，其包括阴离子清洁型表面活性剂(例如，直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)；非离子清洁型表面活性剂(例如，直链或支链或无规链、取代或未取代的C8-C18烷基乙氧基化物和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)；阳离子清洁型表面活性剂(例如，烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物，烷基三元锍化合物及其混合物)；兼性离子和/或两性清洁型表面活性剂(例如，链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂及其混合物；助洗剂(无磷酸盐助洗剂(例如沸石助洗剂，其实例包括在0wt％至小于10wt％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)；磷酸盐助洗剂(例如，在0wt％至小于10wt％范围内的三聚磷酸钠)；在小于15wt％范围内的柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸或其盐)；硅酸盐(例如，在0wt％至小于10wt％范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠)或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(例如，在0wt％至小于10wt％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂(包括光漂白剂，(例如，磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物)；疏水或亲水漂白活化剂(例如，十二烷酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、壬酰基氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵盐(nitrilequats)、及其混合物)；过氧化氢源(例如，无机过氧化氢合物盐，其实例包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单或四水合钠盐)；预先形成的亲水和/或疏水性过酸(例如，过羧酸和盐、过碳酸和盐、过亚胺酸和盐、和过氧单硫酸和盐)及其混合物和/或漂白催化剂(例如亚胺漂白增效剂(例如，亚胺阳离子和聚离子)；亚胺兼性离子；改性胺；改性氧化胺；N-磺酰亚胺；N-膦酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物；和含金属的漂白催化剂(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼、或锰阳离子以及辅助金属阳离子(例如锌或铝)以及螯合剂例如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐)。
组合物可以进一步包含酶，该酶选自蛋白酶；淀粉酶；脂肪酶；纤维素酶；胆碱氧化酶；过氧化物酶/氧化酶；果胶酸裂合酶；甘露聚糖酶；角质酶；漆酶；磷脂酶；溶血磷脂酶；酰基转移酶；过水解酶；芳基酯酶；及其任何混合物。
该组合物可以进一步包含另外的洗涤剂成分，包括香料微囊剂、淀粉包封的香料协调剂、调色剂、包括织物完整性的另外的聚合物和阳离子聚合物、染料锁定成分、织物柔顺剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化多胺、织物沉积助剂和/或环糊精。
在一些实施例中，清洁组合物是具有变体AprL-进化枝蛋白酶的自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物。该ADW洗涤剂组合物可以包含两种或多种选自下组的非离子表面活性剂：乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇或胺氧化物表面活性剂，它们以0％至10％(以重量计)的量存在；在5％-60％的范围内的助洗剂，该助洗剂包括：磷酸盐助洗剂(单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚磷酸盐)，优选三聚磷酸钠-STPP，或无磷酸盐助洗剂[基于氨基酸的化合物，其实例包括MGDA(甲基-甘氨酸-二乙酸)及其盐和衍生物、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)及其盐和衍生物、IDS(亚氨基二琥珀酸)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物及其混合物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)及其盐]，多元羧酸及其部分或完全中和盐的均聚物和共聚物，单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐，它们在0.5％-50％重量％的范围内；磺化/羧化聚合物(为产品提供尺寸稳定性)，其在约0.1％至约50％(以重量计)的范围内；在约0.1％至约10％(以重量计)的范围内的干燥助剂(选自聚酯，特别是任选地与有助于缩聚作用的具有3至6个官能团(特别是酸、醇或酯官能团)的另外的单体一起的阴离子聚酯，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其反应性环状碳酸酯和尿素型的前体化合物)；在从约1％至约20％(以重量计)的范围内的硅酸盐(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)；无机漂白剂(例如过氧化氢合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，特别是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸和二过氧十六烷二酸)。漂白活化剂-有机过酸前体，其在约0.1％至约10％(以重量计)范围内；漂白催化剂(选自锰三氮环壬烷及相关络合物，Co、Cu、Mn和Fe双吡啶胺及相关络合物，以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物)；在从约0.1％至5％(以重量计)的范围内的金属护理剂(选自苯并三氮唑、金属盐和络合物、和/或硅酸盐)；每克自动餐具洗涤剂组合物的从约0.01mg至5.0mg范围内的活性酶的酶(酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶，和木糖苷酶，及其任何混合物)；以及酶稳定剂组分(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。
如上所述，将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式并且通过由配制者选择的任何方法来制备，其非限制性实施例描述于USPN5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,516,448、5,489,392和5,486,303中。在一些希望低pH清洁组合物的实施例中，此类组合物的pH经由添加酸性物质例如HCl来调节。
本文披露的清洁组合物可用于部位清洁(例如表面、物品、餐具或织物)。典型地，将该部位的至少一部分与本发明清洁组合物(纯净形式或在洗涤液中稀释)的实施例进行接触，然后任选地洗涤和/或漂洗该部位。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械搅拌。在一些实施例中，清洁组合物典型地在溶液中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂为水时，水温典型地在约5℃至约90℃的范围内，并且当该部位包含织物时，水与织物的质量比通常为从约1:1至约30:1。
制造和使用清洁组合物的方法
将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式并且通过由配制者选择的任何合适的方法来制备(参见例如USPN 5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392、5,486,303、4,515,705、4,537,706、4,515,707、4,550,862、4,561,998、4,597,898、4,968,451、5,565,145、5,929,022、6,294,514和6,376,445)。
使用方法
在一些实施例中，本发明的清洁组合物可用于清洁表面(例如餐具)、衣物、硬表面、隐形眼镜等。在一些实施例中，表面的至少一部分与本发明的清洁组合物(处于纯净形式或稀释在洗涤液中)的至少一个实施例进行接触，然后任选地洗涤和/或漂洗该表面。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械洗涤。在一些实施例中，本发明的清洁组合物在溶液中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。在一些洗涤溶剂为水的实施例中，水温典型地在约5℃至约90℃的范围内。
本发明提供了用于清洁或洗涤需要清洁的物品或表面(例如硬表面)的方法，包括但不限于：用于清洁或洗涤餐具物品、桌面器具物品、织物物品、衣物物品、个人护理物品等的方法，以及用于清洁或洗涤硬表面或软表面(例如，物品的硬表面)的方法。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于清洁需要清洁的物品、物体或表面的方法，该方法包括在足够的时间内和/或在适合和/或有效地清洁物品、物体或表面至所希望的程度的条件下使该物品或表面(或待清洁的物品或表面的一部分)与至少一个本发明的变体AprL-进化枝蛋白酶或本发明的组合物接触。一些这样的方法进一步包括用水冲洗物品、物体或表面。对于一些这样的方法，清洁组合物是餐具洗涤剂组合物，并且待清洁的物品或物体是餐具物品或桌面器具物品。如本文使用的，“餐具物品”是通常用于服务或食用食物的物品。餐具物品可以是但不限于例如：餐具、盘、杯、碗等。如本文使用的，“桌面器具”是广义的术语，包括但不限于例如：餐具、刀具、刀、叉、勺子、筷子、玻璃器皿、罐、调味汁碟、饮用容器、服务物品等。“桌面器具物品”包括用于服务或食用食物的这些或类似物品中的任何一种。对于一些这样的方法，清洁组合物是自动餐具洗涤剂组合物或手洗餐具洗涤剂组合物，并且待清洁的物品或物体是餐具或桌面器具。对于一些这样的方法，清洁组合物是衣物洗涤剂组合物(例如强力衣物洗涤剂组合物或液体衣物洗涤剂组合物)，并且待清洁的物品是织物物品。在一些其他实施例中，清洁组合物是衣物预处理组合物。
在一些实施例中，本发明提供了分别用于清洁或洗涤织物物品(任选地需要清洁或洗涤)的方法。在一些实施例中，该方法包含提供包含变体蛋白酶的组合物(包括但不限于织物或衣物清洁组合物)，和需要清洁的织物物品或衣物物品，以及将织物物品或衣物物品(或期望清洁的物品的一部分)与该组合物进行接触(在足够或有效地将织物或衣物物品清洁或洗涤至所希望的程度的条件下)。
在一些实施例中，本发明提供了用于清洁或洗涤物品或表面(例如硬表面)(任选地需要清洁)的方法，该方法包含提供待清洁或洗涤的物品或表面，和将物品或表面(或期望被清洁或洗涤的物品或表面的一部分)与本发明的至少一种Aprl-进化枝变体或包含至少一种这样的AprL-进化枝变体的本发明组合物接触足够的时间，和/或在足够或有效地将物品或表面清洁或洗涤至所希望的程度的条件下。这类组合物包括但不限于例如，本发明的清洁组合物或洗涤剂组合物(例如手洗餐具洗涤剂组合物、手洗餐具洗涤清洁组合物、衣物洗涤剂或织物洗涤剂或衣物或织物清洁组合物、液体衣物洗涤剂、液体衣物清洁组合物、粉末衣物洗涤剂组合物、粉末衣物清洁组合物、自动餐具洗涤剂组合物、衣物增效清洁或洗涤剂组合物、衣物清洁添加剂，和衣物预去污(pre-spotter)组合物，等)。在一些实施例中，该方法重复一次或多次，特别是如果需要另外的清洁或洗涤。例如，在一些情况下，该方法任选地进一步包括允许物品或表面与所述至少一种变体蛋白酶或组合物在一段时间内保持接触，该时间足够或有效地将物品或表面清洁或洗涤至所希望的程度。在一些实施例中，该方法进一步包含用水和/或其他液体冲洗物品或表面。在一些实施例中，该方法进一步包含使物品或表面与至少一种本发明的变体蛋白酶或本发明的组合物再次接触，并允许物品或表面与至少一种变体蛋白酶或组合物在一段时间内保持接触，该时间足够使物品或表面清洁或洗涤至所希望的程度。在一些实施例中，清洁组合物是餐具洗涤剂组合物，并且待清洁的物品是餐具物品或桌面器具物品。在本方法的一些实施例中，清洁组合物是自动餐具洗涤剂组合物或手洗餐具洗涤剂组合物，并且待清洁的物品是餐具或桌面器具。在本方法的一些实施例中，清洁组合物是衣物洗涤剂组合物，并且待清洁的物品是织物物品。
本发明还提供了一种在自动餐具洗涤机器中清洁桌面器具或餐具物品的方法，该方法包括提供自动餐具洗涤机器，放置一定量的包含本发明的至少一种AprL-进化枝变体的自动餐具洗涤组合物或足以在机器中清洁桌面器具或餐具物品(例如，通过在机器中将组合物置于适当的或提供的洗涤剂隔室或分配器中)的本发明的组合物，将餐具或桌面器具放入机器中，以及操作机器以清洁桌面器具或餐具物品(例如，按照制造商的说明)。在一些实施例中，该方法包括本文所述的任何自动餐具洗涤组合物，该组合物包含但不限于本文提供的至少一种AprL-进化枝变体。自动餐具洗涤组合物的量可以根据制造商的说明书或建议容易地确定，并且可以采用任何形式(例如液体、粉末、固体、凝胶、片剂等)的包含本发明的至少一种变体蛋白酶(包括任何本文所描述的)的自动餐具洗涤组合物。
本发明还提供了用于清洁表面、物品或物体(任选地需要清洁)的方法，该方法包含将物品或表面(或所希望清洁的物品或表面的一部分)与本发明的至少一种AprL-进化枝变体或本发明的清洁组合物(纯净形式或在洗涤液中稀释)接触足够的时间，和/或在足够或有效地将物品或表面清洁或洗涤至所希望的程度的条件下。然后，如果需要，可以(任选地)洗涤和/或冲洗表面、物品或物体。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于例如擦洗和机械搅拌。在一些实施例中，清洁组合物在溶液(例如水溶液)中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂为水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内。
本发明还提供了在洗涤机器中清洁衣物或织物物品的方法，该方法包含提供洗涤机器、放置一定量的包含本发明的至少一种变体AprL-进化枝酶的衣物洗涤组合物(足以在机器中清洁衣物或织物物品(例如，通过在机器中将组合物置于适当的或提供的洗涤剂隔室或分配器中))，将衣物或织物物品放入机器中，以及操作机器以清洁衣物或织物物品(例如，按照制造商的说明)。本发明的方法包括本文所述的任何衣物洗涤剂组合物，包含但不限于本文提供的至少一种任何变体AprL-进化枝酶。衣物洗涤剂组合物的量可以根据制造商的说明书或建议容易地确定，并且可以采用任何形式(例如固体、粉末、液体、片剂、凝胶等)的包含本发明的至少一种变体蛋白酶(包括本文所描述的任何一种)的衣物洗涤剂组合物。
有益地包含本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的代表性洗涤剂配制品包括在WO2013063460，第78-152页中找到的洗涤剂配制品，并且特别是将第94至152页的表格通过引用特此结合。丝氨酸蛋白酶通常以按组合物重量计的从0.00001％至10％的酶蛋白的水平掺入洗涤剂组合物中。在一些实施例中，洗涤剂组合物包含以组合物重量计超过0.0001％、0.001％、0.01％、或0.1％的丝氨酸蛋白酶。在一些实施例中，洗涤剂组合物包含以组合物重量计少于1％、0.1％、0.01％、或0.001％的丝氨酸蛋白酶。
用于动物饲料的本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽
在本发明的进一步方面，本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽可用作包含AprL-进化枝蛋白酶及其变体的动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品的组分。本发明进一步涉及制备这样一种动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，该方法包括将AprL-进化枝蛋白酶多肽与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分进行混合。此外，本发明涉及AprL-进化枝蛋白酶多肽在制备动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品中的用途。
术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在一个具体实施例中，该动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于：猪(pig和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、小鸡、肉仔鸡、蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类，例如虾和对虾。在进一步的实施例中，动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
在当下语境中，术语“宠物食品”旨在被理解为意指用于以下各项的食物：家庭动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行动物宠物，例如海龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。
术语“动物饲料组合物”、“饲料”和“喂养料”可互换地使用，并且包含选自下组的一种或多种饲料原料，该组包括：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，例如玉米或高粱；b)来自谷类的副产品，例如玉米谷蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(Distillers DriedGrain Solubles)(DDGS)(特别是基于玉米的干酒糟谷物可溶物(cDDGS))、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘洛；c)获自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
用于织物脱浆的本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽
还考虑了使用本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。织物处理的方法是本领域中熟知的(参见例如，US 6,077,316)。例如，可以通过包括使织物与溶液中的AprL-进化枝蛋白酶接触的方法来改善织物的手感和外观。织物可以在压力下用溶液进行处理。
可以在纺织品的编织期间或之后或在脱浆阶段期间或一个或多个另外的织物加工步骤中应用本发明的AprL-进化枝蛋白酶。在纺织品的编织中，使线暴露于可观的机械应变。在机械织机上编织之前，常常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆经纱以增加其抗张强度并防止断开。可以在编织期间或之后应用本发明的AprL-进化枝蛋白酶以除去上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，可以在进一步处理织物之前使用AprL-进化枝蛋白酶来除去浆涂层以确保均一和耐洗的结果。
本发明的AprL-进化枝蛋白酶可以单独使用或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用，以作为清洁添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉的织物)脱浆。淀粉酶还可以用于在靛蓝染色的牛仔织物和服装上产生石磨的外观的组合物和方法中使用。对于服装生产而言，所述织物可被裁剪和缝制成为服装或衣服，其随后被精整(finish)。特别地，对于牛仔布的生产，开发了不同的酶促精整方法。牛仔衣服的精整加工通常是以酶促脱浆步骤开始的，其中使衣服经受淀粉水解酶的作用以为织物提供柔软性，并且使棉更易于进行随后的酶促精整加工步骤。Aprl-进化枝蛋白酶可以用于下列方法中：精整加工牛仔服装(例如“生物磨砂方法”)、酶促脱浆并为织物提供柔软性和/或精整加工方法。
用于纸浆漂白的本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽
本文所述的AprL-进化枝蛋白酶多肽可进一步用于纸浆(例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐法制备的纸浆)的酶辅助漂白。一般来说，将纸浆与本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽在适合于漂白纸浆的条件下一起孵育。
在一些实施例中，纸浆是不含氯的纸浆，该纸浆经氧、臭氧、过氧化氢或过氧酸进行漂白。在一些实施例中，AprL-进化枝蛋白酶多肽用于展示出低木质素含量的纸浆的酶辅助漂白，该纸浆是通过经改良的制浆方法或连续制浆方法生产的。在一些其他实施例中，AprL-进化枝蛋白酶多肽单独地应用或优选地与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合应用。
用于蛋白质降解的本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽
本文所述的AprL-进化枝蛋白酶多肽可进一步用于酶辅助去除蛋白质，该蛋白质来自动物及其随后的降解或处理，例如羽毛、皮肤、毛发、兽皮等。在一些情况下，与在滚烫的水或去毛工艺中的传统浸泡相比，将动物尸体浸泡在包含本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽的溶液中可以起到保护皮肤免受损伤的作用。在一个实施例中，羽毛可以在适合于消化或引发羽化退化的条件下用本发明的分离的金属蛋白酶多肽进行喷雾。在一些实施例中，如上所述，本发明的AprL-进化枝蛋白酶可以与氧化剂组合使用。
在一些实施例中，通过使用本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽来辅助与未加工的羽毛相关的油或脂肪的去除。在一些实施例中，将AprL-进化枝蛋白酶多肽在用于清洁羽毛的组合物中使用，并且用来对纤维进行消毒和部分脱水。在一些其他实施例中，在具有或没有约0.5％(v/v)的表面活性剂的情况下，将AprL-进化枝蛋白酶多肽与95％乙醇或其他极性有机溶剂组合应用于洗涤溶液中。
在又其他实施例中，所披露的AprL-进化枝蛋白酶多肽可用于从羽毛中回收蛋白质。所披露的AprL-进化枝蛋白酶多肽可以单独或与其他的酶或预处理例如加热和加压组合，在合适的羽毛加工和蛋白水解方法(例如PCT/EP 2013/065362、PCT/EP 2013/065363、和PCT/EP 2013/065364中披露的那些，其通过引用结合在此)中使用。在一些实施例中，回收的蛋白质随后可以用于动物或鱼类饲料中。
用于组织清创的本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽
本文所述的AprL-进化枝蛋白酶多肽可进一步用于组织的酶辅助清创。这涉及去除死亡或受损的组织，例如从伤口去除以帮助愈合。
用于组织培养的本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽
本文所述的AprL-进化枝蛋白酶多肽可进一步用于组织培养。具体地，本发明的AprL-进化枝蛋白酶可用于(例如在收获细胞过程中)悬浮或再悬浮附着于细胞培养壁的细胞。本发明的AprL-进化枝蛋白酶可用于切割培养细胞与培养皿之间的蛋白质键，以允许细胞悬浮于溶液中。
在食品应用中的本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽
本文所述的AprL-进化枝蛋白酶多肽可进一步用作食品添加剂、消化助剂或食品加工助剂。
用于皮革加工的本发明的AprL-进化枝蛋白酶多肽
本文所述的AprL-进化枝蛋白酶多肽进一步通过从动物兽皮中除去毛发、浸泡、脱脂或软化(这是涉及皮革制造期间非结构蛋白质降解的过程)来用于皮革加工。
实例1
测定
以下测定是在下述实例中使用的标准测定。有时特定的方案要求偏离这些标准测定。在这些情况下，在实例中鉴定了与以下这些标准测定方案的偏离。
性能指数
酶的性能指数(PI)比较了在相同蛋白质浓度下，变体(测量值)与亲本酶(理论值或测量值)的性能。可以使用从亲本酶标准曲线的Langmuir拟合提取的参数计算亲本酶的理论浓度。PI大于1(PI>1)表明与亲本(例如，AprL成熟蛋白，SEQ ID NO:2)相比，变体的性能得到改进，而PI为1(PI＝1)被鉴定为变体与其亲本具有相同的性能，并且PI小于1(PI<1)被鉴定为变体的性能不如其亲本。
蛋白质测定分析
使用高效液相色谱法(HPLC)进行蛋白质浓缩以测量来源于96孔微量滴定板(MTP)中生长的培养物的上清液的积分峰面积。使用配备有Acquity UPLC BEH 125SEC(沃特斯)尺寸排阻柱的安捷伦1200或1260HPLC。使用含250mM氯化钠的25mM磷酸钠缓冲溶液(pH为6.8)，从色谱柱中洗脱样品。在220nm处测量吸光度，并使用ChemStation软件(安捷伦科技公司)对峰进行积分。基于纯化的亲本酶的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。
蛋白酶活性
通过测量N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白(DMC)底物的水解来测试AprL蛋白酶及其变体的蛋白酶活性。对于AAPF测定，使用的试剂溶液是：100mM Tris pH 8.6，10mMCalCl2，0.005％(Tris/Ca缓冲液)和在DMSO中的160mM suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA原液)(西格玛：S-7388)。为了制备工作溶液，将1mL suc-AAPF-pNA原液添加到100mL Tris/Ca缓冲液中并混合。将酶样品添加到含有1mg/mL suc-AAPF-pNA工作溶液的MTP(Greiner 781101)中，并且使用SpectraMax酶标仪(plate reader)以动力学方式在室温下经3分钟在405nm下测量活性。蛋白酶活性以mOD*min-1表示。
对于DMC测定，所使用的试剂溶液是：在100mM碳酸钠(pH9.5)中的2.5％二甲基酪蛋白(DMC，西格玛)、在试剂A中的0.075％TNBSA(2,4,6-三硝基苯磺酸，赛默科技公司(Thermo Scientific))。试剂A：在15mL 4N NaOH中的45.4g Na2B4O7.10H2O(默克公司(Merck))，在MQ水中达到1000mL的终体积，稀释溶液：10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％吐温(Tween)-80和0.02％叠氮化钠。加入2.5uL 20ppm蛋白酶上清液后，用47.5uL DMC底物填充MTP(Greiner PS-微孔384)。然后添加50μL在试剂A中的TNBSA，同时缓慢混合。使用SpectraMax酶标仪以动力学方式在室温下经5min在405nm下测量活性。如上针对AAPF测定所述，活性以mOD/min表示。
为稳定性测定设置的通用样品
通过在升高的温度下孵育之后测量残余活性，在各种应激条件(缓冲液和洗涤剂，如下表所示)下测试变体的稳定性。设置升高的温度以获得应激的样品的约30％的残留活性(相比于无应激的样品)。将稀释的酶样品在应激源中混合，并测量无应激的蛋白酶活性。将应激源中稀释的样品在升高的温度下孵育，然后通过AAPF或DMC水解测量应激蛋白酶活性。
稳定性测定条件描述于下表1中，洗涤剂在用于稳定性测定之前被灭活：
对于非应激条件，立即测定酶对AAPF或DMC的活性(见上文)。对于应激条件，将PCR板密封并使用Eppendorf 385MasterCycler Pro Thermocycler在升高的温度下孵育5分钟，然后测定活性。如上所述，通过水解合成底物或通过DMC法测量有应激的和无应激的活性。％残留活性是通过取应激与非应激活性的比并将其乘以100来计算的。通过将变体的残留活性除以野生型的残留活性获得稳定性PI。
衣物和自动餐具洗涤剂的清洁性能
针对基于衣物的应用，测试变体相对于野生型AprL对BMI(棉花上的血液/奶/墨水)微样品(EMPA-116)的清洁性能，且针对基于餐具的应用，测试其对蛋黄(在风化并且用炭黑染料染色的聚丙烯织物上的蛋黄)微样品(PAS-38)的清洁性能。预先冲穿(以放入MPT)的、经冲洗的和填充的含样品的板(康宁(Corning)3641)由荷兰符拉尔丁根(Vlaardingen)的测试材料BV中心(Center for Testmaterials BV)制备。在添加酶之前，在微样品板上装入洗涤剂。将商业洗涤剂热灭活以除去酶活性并如表2所述给予剂量。
用于酶失活的洗涤剂处理如下。将纯液体在水浴中加热至95℃持续16小时，使HDL衣物洗涤剂失活。使用AAPF底物灭活后测定蛋白酶活性，以确保完全失活。通过制备在最终清洁性测定中使用的10X浓缩溶液并将其在95℃下加热16小时，将HDD衣物洗涤剂灭活。使用AAPF底物灭活后测定蛋白酶活性。加热HDD和HDL洗涤剂16小时后，蛋白酶活性不存在。表3显示了GSM-B pH 10.5ADW洗涤剂(购自德国布鲁伊根(Brüggen)的WFK Testgewebe GmbH(www.testgewebe.de)的组成。
*为这些洗涤剂设定了pH，提供了值，不为标记ND的那些洗涤剂设定pH。洗涤剂来源：于2012年从当地超市采购了超级科克兰和科克兰超净(Sun Products[太阳产品公司])、彩色奥妙(OMO Color)、和奥妙克莱因&克拉克蒂格、Surf Excel(联合利华)、和蓝月亮(广州蓝月亮公司)。
将酶的等分试样添加到洗涤剂填充的微样品板中以达到终体积为200μL，用于进行最终酶浓度在5-0.5ppm之间的衣物洗涤测定。使用HDL或HDD配方的衣物洗涤清洁测定在25℃下进行15-20分钟，同时在40℃下进行自动餐具(ADW)测定30分钟。孵育后，将100uL上清液转移到新鲜的MTP(Costar 9017)中，并且使用SpectraMax酶标仪在600nm处读取EMPA-116样品的吸光度或在405nm处读取PAS-38样品的吸光度。通过从每个样品值中减去空白对照(无酶)的值来获得吸光度结果。通过将给定变体的吸光度值除以相同浓度的预测野生型的吸光度值来获得每中测定条件下的清洁PI。通过将纯化的亲本的标准曲线拟合成朗缪尔(Langmuir)拟合来确定野生型值。
实例2
生成AprL蛋白酶的位点评估文库(SEL)
编码AprL序列的合成基因是由GeneArt，Life Technologies[生命技术公司]合成并克隆到表达载体“pHYT”(来自pHY300PLK(Takara))中的。pHYT表达载体含有aprE启动子和前导序列。图1中显示了含有AprL基因的pHYT载体(pHYT-AprL)的图谱。AprL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。AprL蛋白成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。aprE启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。前肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
使用本领域中已知的分子生物学技术，在AprL成熟蛋白的每个位点上产生位置性文库。每个位点的相应密码子被至少10个(可能的19个中的)不同氨基酸的密码子取代。用含有变体的表达质粒转化合适的枯草芽孢杆菌宿主菌株。将这些变体提供在96孔MTP中。在32℃、300rpm、于80％湿度的振荡培养箱中，在正方形enzyscreen板中的含有25ppm四环素的培养基(基于MOP缓冲液的富集的半限定培养基，以尿素为主要氮源，以葡萄糖为主要碳源，并补充有1％大豆蛋白胨用于稳健的细胞生长)中，使变体生长2天。
实例3
生产性位置和可组合突变
“生产性位置”是分子中最适用于制备表现改进的特征的组合变体的位置，其中位置本身允许至少一种可组合突变。可组合突变是可用于制造组合变体的取代。
可组合突变是改善分子的至少一种所希望的特性而不显著降低表达、活性或稳定性中任意一者的那些。AprL中的可组合突变使用从实例1中描述的以下测定得到的PI值来确定：表达(蛋白质测定法)；蛋白酶活性(AAPF测定和DMC测定)；在如下洗涤剂中的清洁活性：超级科克兰HDD pH 10.6、彩色奥妙HDD pH 10.6、Surf Excel HDD pH 10.6、科克兰超净、HDL pH 8.2、奥妙克莱因&克拉克蒂格HDL pH 8.2、蓝月亮HDL pH6.5、GSM-B pH 10、GSM-B pH 9；在下列洗涤剂和缓冲液中的稳定性测定：在53.5℃下的LAS-EDTA缓冲液、在56℃下的10％超级科克兰、和在51℃下的10％奥妙克莱因&克拉克蒂格。
根据以下标准对可组合突变进行了分组：(i)如下变体，其中相对于AprL亲本的表达、包括在一个或多个清洁活性测定和一个或多个稳定性测定中的活性的蛋白酶活性的最低PI≥0.9，并且对于这些测试中任意一个，另外具有≥1.0的PI(A组)；(ii)如下变体，其中相对于AprL亲本的表达、包括在一个或多个清洁活性测定和一个或多个稳定性测定中的活性的蛋白酶活性的最低PI≥0.8，并且对于这些测试中任意一个，另外具有≥1.2的PI(B组)；或(iii)如下变体，其中相对于AprL亲本的表达、包括在一个或多个清洁活性测定和一个或多个稳定性测定中的活性的蛋白酶活性的最低PI≥0.5，并且对于这些测试中任意一个，另外具有≥1.5的PI(C组)。
表4总结了可组合突变的特性。
组A、B和C还包含对多个取代具有不同程度的耐受性的氨基酸位置。为了鉴定生产性位置，我们测量每个位置所耐受的取代程度，并为每个位置分配一个生产力得分。使用如下所示的标准，根据在组A、B或C内每个位置内的取代百分比分配生产力得分。
生产性位置被定义为对多个取代已经表现出一定程度的耐受性，而同时满足如下所示的一组可组合性的标准的位置。用于确定生产性位置的生产力得分的标准示出如下：(i)在给定位置<15％的取代在组A、B或C内的位置，被给予生产力得分“1”；(ii)在给定位置<40％，但≥15％的取代在组A、B或C内的位置，被给予生产力得分“2”；(iii)在给定位置<60％，但≥40％的取代在组A、B或C内的位置，被给予生产力得分“3”；并且(iv)在给定位置60％或更多的取代在组A、B或C内的位置，被给予生产力得分“4”。
具有生产力得分“1”的位置是：4、17、21、30、33、36、47、49、51、62、66、72、74、75、76、93、106、107、110、111、112、121、134、135、137、138、141、149、151、156、157、159、163、169、175、183、186、188、191、204、207、208、209、215、223、224、227、229、230、231、232、233、236、249、250、254、255、260、267、269、271、和273。
具有生产力得分“1”的位置和相对应的突变是4(V、I)；17(Q、H、M)；21(F、Y)；30(V、C、T)；33(T、C、M)；36(Q、E、H)；47(G、A、M)；49(S、I、T)；51(V、C、I)；62(G、S)；66(H、R)；72(A、G、S)；74(L、G)；75(D、C、E)；76(N、K)；93(K、D)；106(I、G、M)；107(V、F、I)；110(I、F)；111(E、D、Q)；112(W、A)；121(I、L、M)；134(M、L)；135(K、E、H)；137(A、S)；138(V、C、S)；141(A、S)；149
(V、C)；151(A、G、P)；156(G、E)；157(S、D、R)；159(G、A、F)；163(T、E)；169(K、R)；175(A、C)；183(S、A、G)；186(A、C)；188(F、W)；191(V、C)；204(V、I)；207(T、C)；208(Y、F)；209(P、S)；215(T、C、V)；223(S、A、C)；224(P、A)；227(A、S)；229(A、G、S)；230(A、\G)；231(A、C)；232(L、Q)；233(I、V)；236(K、A)；249(L、I、M)；250(S、A、G)；254(T、D)；255(Y、C、E)；260(F、C、W)；267(I、C)；269(V、A、C)；271(A、D、E)；和273(A、S)。
具有生产力得分“2”的位置是：2、3、10、18、19、28、29、31、35、37、38、40、44、46、50、54、56、61、67、68、71、87、90、91、92、101、103、104、113、118、120、123、130、131、133、139、145、147、148、181、182、184、193、205、211、212、214、216、217、221、235、242、245、248、251、258、259、和268。
具有生产力得分“2”的位置和相对应的突变是：2(Q、A、I、N)；3(T、E、I、Q、V)；10(L、F、M、Q)；18(A、C、D、E、S)；19(Q、A、D、E、G、M)；28(V、A、C、S)；29(A、C、S、T、V)；31(L、C、I、V)；35(I、A、C、G、M、S、T、V)；37(A、E、G、S)；38(S、A、C、E、G、N、T)；40(P、A、C、D、E、M、V)；44(V、C、E、P、S、T)；46(G、A、C、D、W)；50(F、H、K、M、Q、R、V、Y)；54(E、Q、R、T)；56(Y、C、E、F、H、P)；61(N、A、D、F、H、K、Q)；67(V、M、N、Q)；68(A、C、G、N、S、T)；71(V、A、G、L、S)；87(V、C、G、S、T)；90(Y、A、C、F、H、N、V)；91(A、G、M、P、V)；92(V、A、C、I、T)；101(G、A、C、N、S、T)；103(Y、A、F、I、L、M、V、W)；104(S、A、D、E)；113(A、C、G、S)；118(M、F、H、P、Q)；120(V、A、C、I、S、T)；123(M、C、I、L、N、Q、S)；130(G、D、E、H、S)；131(S、D、R、T)；133(A、G、M、P、S、T、V)；139(D、G、K、N、S、T)；145(G、D、N、S)；147(V、A、L、M、N)；148(V、A、C、F、M、Q、S)；181(S、A、C、D、H、Q)；182(N、C、D、E、Q)；184(N、C、E、H、M、Q)；193(A、D、P、Q、R)；205(Y、C、E、F、I、M、V)；211(N、C、E、S)；212(T、A、D、S)；214(A、E、H、L、T)；216(L、A、C、H、K、M)；217(N、C、E、S)；221(M、C、H、K)；235(S、C、D、E、G)；242(A、E、G、N、S)；245(V、A、C、I、T)；248(R、A、N、Q、S)；251(S、A、C、E、G、N)；258(S、C、D、E、H、P)；259(S、E、P、Q)；和268(N、D、E、Q)。
具有生产力得分“3”的位置是：1、9、22、24、25、53、86、89、95、100、105、108、114、115、119、125、128、140、146、155、158、187、202、203、234、237、240、243、244、和264。
具有生产力得分“3”的位置和相对应的突变是：1(A、D、E、F、G、N、Q、S、T、V)；9(P、A、C、D、E、G、N、Q、S、T)；22(K、A、F、M、Q、R、S、T、VY)；24(A、C、D、E、G、N、Q、S、W)；25(N、D、E、F、G、H、L、M、P、Q、R、S)；53(G、C、D、E、H、K、N、Q、R)；86(S、C、E、H、K、L、N、R)；89(L、A、C、F、G、I、M、N、S、V)；95(L、A、F、G、I、M、Q、S、V)；100(S、C、F、G、M、N、R、T、Y)；105(G、A、C、D、I、M、N、R、S、T)；108(S、E、F、G、H、K、L、N、Q、R、Y)；114(T、A、C、D、F、I、K、L、N、Q、S、V)；115(T、D、E、F、H、I、K、Q、S、W)；119(D、A、E、F、G、H、M、Q、S)；125(L、A、E、F、I、N、S、V、Y)；128(A、C、D、E、H、K、N、P、Q、R、S、T)；140(N、C、D、F、G、H、M、R、T、V)；146(V、A、E、H、I、K、L、N、Q、S、T)；155(S、A、D、E、F、G、H、K、N、Q、R、W)；158(S、A、D、E、I、K、N、Q、R)；187(S、A、C、D、E、H、K、P、Q、W)；202(A、C、D、E、I、K、L、M、Q、S、T、V)；203(G、A、C、E、H、K、M、N、Q、R、S)；234(L、E、F、H、Q、S、W、Y)；237(H、A、C、D、G、I、M、N、Q、S)；240(L、A、D、E、F、I、M、N、Q、T)；243(S、C、E、F、I、N、Q、T、V、W)；244(Q、A、C、D、E、G、H、I、N、R、S、V)；和264(K、A、C、D、H、M、Q、R、S、Y)。
具有生产力得分“4”的位置是：12、15、26、27、43、45、48、52、55、57、58、60、77、78、88、96、97、98、99、102、116、117、126、127、129、132、136、143、144、160、161、165、171、210、238、239、241、247、和274。
具有生产力得分“4”的位置和相对应的突变是12(K、A、C、F、G、H、L、M、N、Q、S、Y)；15(K、A、C、E、F、H、I、M、N、R、S、T、V)；26(V、A、C、E、H、I、M、N、Q、R、S、T)；27(K、A、C、D、E、L、M、N、P、Q、R、T)；43(N、A、C、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、W、Y)；45(V、A、C、D、E、F、G、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、Y)；48(A、C、D、E、F、H、I、K、M、N、Q、R、W、Y)；52(A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y)；55(A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V)；57(N、A、C、D、E、G、H、P、R、S、V、Y)；58(T、C、D、F、H、I、K、L、M、P、R、S、V、W、Y)；60(G、C、E、F、H、I、K、L、M、Q、R、T、Y)；77(T、C、D、F、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、W)；78(T、C、D、G、I、L、N、Q、S、V、W、Y)；88(S、A、E、F、G、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y)；96(N、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、Q、S、V、Y)；97(S、A、C、D、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、T、W、Y)；98(S、A、D、E、F、H、K、L、N、P、R、T、V、Y)；99(G、A、C、D、E、L、M、Q、S、T、V、W)；102(S、A、D、E、F、G、K、L、N、P、Q、R、T)；116(N、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、T、V、Y)；117(G、C、D、E、H、K、M、N、Q、R、T、V)；126(G、A、C、E、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y)；127(G、A、D、E、F、I、L、M、Q、S、T、V、W、Y)；129(S、C、E、F、H、I、M、N、Q、R、T、V、W、Y)；132(T、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、V、W、Y)；136(Q、A、C、D、F、G、H、K、L、N、R、S、T、W)；143(A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、S、T、Y)；144(R、A、C、D、E、F、G、H、L、M、N、Q、V、Y)；160(N、A、C、D、G、I、K、M、P、R)；161(T、A、C、D、E、I、K、L、M、Q、R、W)；165(G、A、E、I、K、L、P、Q、R、S、T、Y)；171(D、A、C、G、H、I、K、N、P、Q、S、T、V)；210(T、C、D、E、F、H、I、M、N、P、V、Y)；238(P、A、C、D、E、F、G、I、L、M、N、Q、R、S、T、W)；239(N、A、C、D、E、H、I、K、L、M、S、T、V、Y)；241(S、C、D、E、H、L、N、P、Q、T、V)；247(N、A、D、E、F、H、I、L、M、Q、S、V、W、Y)；和274(Q、A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、S、T、V、W)。
AprL中的可组合突变使用从实例1中描述的测定得到的PI值来确定：在如下洗涤剂(超级科克兰HDD pH 10.6、彩色奥妙HDD pH 10.6、Surf Excel HDD pH 10.6、科克兰超净、HDL pH 8.2、奥妙克莱因&克拉克蒂格HDL pH 8.2、蓝月亮HDL pH 6.5、GSM-B pH 10、和GSM-B pH 9)中的蛋白质测定(表达)、蛋白酶活性测定(AAPF、DMC)、清洁活性和在下列洗涤剂和缓冲液(在53.5℃下的LAS-EDTA缓冲液、在56℃下的10％超级科克兰、和在51℃下的10％奥妙克莱因&克拉克蒂格)中的稳定性测定。根据实例4中示出的标准将可组合突变分配到组A、B或C。在出现取代的情况下，基于组(A、B、C)，这些取代进一步被赋予适合性得分，并且其中较高的适合性得分代表更适合用于制备组合变体的取代。表5中定义了适合性得分。表6中报告了适合上述标准的AprL的单个取代的适合性得分。
评估某些清洁应用中有益的AprL突变
如下所述，SEL变体基于其在不同测定条件下的性能进一步被分组成不同的类别。对于该分析，排除了其中HPLC PI值为0或0.1的SEL变体。另外，对于每个测定，将PI值设为空白，这时相应的CV值小于0或大于100。
为了获得每类性能的最佳突变，除了HPLC PI值和HDL pH 6PI值之外，还计算了4个替代PI值：1)HDD PI值，是BMI-奥妙-HDD PI或BMI-科克兰-HDD PI中较大的那个；2)HDLPI值，是BMI-奥妙-HDL PI或BMI-科克兰-HDL PI中较大的那个；3)ADW PI值，是EGG-GSM9PI或EGG GSM10PI中较大的那个；和4)稳定性PI，是LAS/EDTA稳定性PI、HDL科克兰(Kirkland)稳定性PI或HDL奥妙(OMO)稳定性PI中的最大值。
为了在HDL pH 8应用中对最有益的突变进行分组，将替代HDL pH 8PI值设定为大于1.1，并将所有其他PI值截断值设定为大于0.8。对于HDD应用中最有益的突变，HDD替代PI被设定为大于1.1，并且所有其他PI值截断值被设定为大于0.8。对于ADW应用中最有益的突变，替代ADW PI被设定为大于1.1，并且所有其他PI值截断值被设定为大于0.8。对于HDL pH6应用中的大多数有益突变，将替代HDL pH 6PI值设定为大于1.1，并且将所有其他PI值截断值设定为大于0.8。对于最有益的稳定性突变，将稳定性PI值设定为大于1.2，并且所有其他PI值截断值被设定为大于0.8。每个类别获得的突变数量如下表7所示，并且每个类别的具体突变如下所列出。
各类别的分组标准：对于特定类别，即ADW、HDL pH 6、HDL pH 8或HDD，PI>1.1；并且对于所有测试的特性，包括表达，PI>0.8；或者对于稳定性，PI>1.2，并且对于包括表达的所有特性，PI>0.8。
针对ADW应用的最有益突变的列表：A001C、A001D、A024E、A024G、A048C、A048D、A048K、A048N、A052F、A052M、A052V、A052Y、A055C、A072G、A091G、A113C、A128P、A128Q、A133G、A133S、A133T、A143E、A143F、A143H、A143N、A143S、A143W、A193D、A202C、A202D、A202E、A202Q、A227S、D119F、D119S、D119Y、G053C、G053E、G053N、G053Q、G060L、G060Y、G099A、G099T、G101A、G117D、G117V、G127A、G127S、G127T、G130D、G130H、G203A、G203C、G203E、G203M、H237I、I035A、I035C、I035M、I035T、I121L、K012N、K015M、K027C、K027L、K027M、K027R、K264A、K264S、L010M、L095F、L125V、L234Q、L240N、L249I、M123C、M123I、M123L、N025F、N025G、N025L、N025S、N057C、N061A、N076G、N096D、N096G、N116A、N116C、N116L、N116Y、N140A、N160C、N182C、N182D、N184C、N211S、N247F、N247H、N247I、N247L、N247Q、N247S、N247V、N247W、N247Y、P009E、P009T、P238A、P238C、P238D、P238F、P238I、P238R、Q017H、Q136A、Q136C、Q136F、Q136H、Q136K、Q136L、R144F、R144L、R248K、S086R、S088N、S088Y、S097G、S097H、S097Y、S098H、S098L、S100L、S102D、S102E、S102G、S102K、S129E、S129H、S155A、S155D、S155E、S155H、S157D、S158I、S158Q、S181A、S181Q、S183G、S241R、S241T、S243I、S243N、S243T、S243V、S243Y、S251E、S258C、S258D、S258P、T058C、T058D、T058F、T058I、T077C、T077F、T077L、T077M、T078Q、T132A、T132Q、T132V、T132Y、T161Q、T210I、T215C、V026Q、V026R、V026T、V028A、V028C、V045I、V071A、V071L、V120A、V120C、V120I、V146A、V146H、V146K、V147L、V149C、Y056H、和Y255C。
针对HDD应用的最有益突变的列表：A029T、A048K、A048R、A052F、A052R、A068G、A113C、D119H、E111Q、G099A、G099S、G127A、G127T、G165A、K012G、K012H、K027C、K027E、K027M、L095F、L125I、L125V、L240Q、N025F、N025G、N025L、N043R、N116R、N140R、N160C、N184C、N239K、P238C、P238I、P238M、Q136F、Q136H、Q136K、Q136R、Q136W、S098F、S098H、S104A、S158Q、S241R、V045R、和Y103M。
针对HDL(pH 8)应用的最有益突变的列表：A001C、A048R、A052F、G099S、G099T、G101A、G127F、G127I、G127M、G127Q、G127T、G127V、I121M、L010M、L095A、L095F、L095Q、L095S、L125I、L125V、M123C、M123I、N025F、N025S、N116C、N140R、N184C、P238C、P238D、P238I、P238M、P238N、Q136A、S098F、S098H、S102D、S158Q、S241R、T077C、T077F、T215C、V026I、V026Q、V045R、和V149C。
针对HDL(pH 6)应用的最有益突变的列表：A001C、A024E、A128D、G053C、G099T、G101A、G101N、G165E、G203C、L095Q、L095S、L125S、N061E、N116C、N184C、S098D、S102D、S102E、S104D、S129E、S155D、S158E、和V026T。
针对稳定性的最有益突变的列表：A001C；A001D；A001E；A001Q；A001S；L010M；L010Q；S100G；S102K；S102R；Y103F；Y103M；S104D；G105M；G105R；S108F；S108H；S108K；S108R；E111Q；T114D；T115D；T115E；T115F；T115K；T115Q；N116E；K012C；K012F；K012H；K012M；K012N；K012Q；K012Y；V120S；M123C；M123I；L125I；G127A；G127D；G127I；G127M；G127S；G127T；G127V；A128E；A128H；A128K；A128P；A128R；A128S；A128T；S129H；S129Q；S129R；S129T；S129V；T132C；T132D；T132E；T132K；T132N；T132P；Q136A；Q136C；Q136K；Q136R；V138C；A143D；A143N；G145S；V147L；V148A；V148C；V148M；V148Q；K015A；K015C；K015E；K015I；K015M；K015S；K015T；K015V；S155D；S155F；S155K；S155N；S155R；S157D；S158D；S158I；S158K；S158R；N160C；N160D；N160I；N160M；N160R；T161C；T161D；T161E；T161K；T161Q；T161R；G165A；G165E；G165Q；G165R；G165S；Q017H；A018D；A018E；S181Q；N182D；S183A；S183G；N184C；N184E；N184Q；A186C；S187D；S187E；S187P；Q019D；Q019E；A193D；A193R；A202D；A202E；A202K；A202Q；A202V；G203A；G203C；G203E；G203N；G203Q；Y205E；T210C；T210E；T210I；T210P；T210V；A214E；T215C；L216C；L216H；L216K；L216M；N217S；L234E；L234F；L234Q；L234S；S235D；S235E；P238T；N239A；N239D；N239H；N239M；N239S；N239T；A024E；A024Q；L240D；S241E；S241N；S241Q；S241V；A242G；A242N；S243E；S243Q；S243V；Q244C；Q244E；V245A；V245C；V245T；N247D；N247W；N025D；N025G；N025Q；S250G；S251E；S258C；S258D；S258E；S258H；S258P；S259E；S259P；S259Q；V026A；V026C；V026E；V026H；V026Q；V026R；F260W；K264A；K264C；K264D；K264H；K264M；K264Q；K264S；K264Y；I267C；N268D；N268E；N268Q；V269C；K027C；K027D；K027E；K027M；K027P；A271E；Q274A；Q274C；Q274D；Q274E；Q274G；A029S；T003E；T003I；T003Q；T003V；V030C；I035A；I035S；I035T；I035V；S038T；N043A；N043C；N043F；N043H；N043Q；V044P；V045A；V045C；V045D；V045E；V045F；V045G；V045M；V045N；V045Q；V045R；V045S；V045T；G046D；A048N；A048W；F050H；V051I；A052F；A052G；A052K；A052N；A052P；A052R；A052V；G053N；G053R；A055C；A055D；A055E；A055G；A055H；A055N；A055S；A055V；N057C；N057E；N057G；N057V；T058C；T058I；T058K；T058W；A068C；A068N；A068S；V071A；L074G；D075E；N076K；T077C；T077D；T077H；T077M；T077N；T077P；T077Q；T077S；T078D；T078I；T078V；S086E；S086H；S086R；V087C；V087G；V087S；V087T；S088E；S088N；S088R；L089N；P009C；P009D；P009E；P009N；P009T；L095A；L095V；N096S；S098K；S098R；和G099Q。
实例4
AprL蛋白酶与相关分子的比较
鉴定同源蛋白酶
针对NCBI非冗余蛋白质数据库(NCBI non-redundant protein database)，通过BLAST搜索(Altschul等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]，25:3389-402,1997)鉴定了相关蛋白质，并在表8中示出了一个子集。针对基因组查询专利(Genome Quest Patent)数据库，使用AprL蛋白酶(SEQ ID NO:2)的成熟蛋白氨基酸序列作为查询序列，将搜索参数设置为默认值进行类似的搜索，并且在表9中示出了一个子集。将两个搜索集的百分比同一性(PID)定义为相同残基的数量除以成对比对中经比对残基的数量。表上标有“序列长度”的值对应于以所列出的登录号提及的蛋白质的长度(以氨基酸计)，而“比对长度”是针对用于比对和PID计算的序列。
枯草杆菌蛋白酶序列与AprL的比对
使用具有默认参数的CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]，22:4673-4680,1994)将成熟AprL(SEQ ID NO:2)蛋白质的氨基酸序列与多个枯草杆菌蛋白酶序列比对。图2显示了AprL蛋白与这些蛋白酶序列的子集的比对。
实例5
枯草杆菌蛋白酶BliD02339的发现和鉴定
地衣芽孢杆菌菌株Bra7(杜邦培养物保藏中心)的基因组的测序揭示了该菌株产生不同于枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(NCBI数据库登录号CAJ70731.1)和来自地衣芽孢杆菌菌种的其他枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶。编码地衣芽孢杆菌Bra7的枯草杆菌蛋白酶(前体)的基因BliD02339.n的序列描述于SEQ ID NO:7中。
由BliD02339.n基因编码的前酶原描述于SEQ ID NO:8中。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP-NN(Emanuelsson等人，Nature Protocols[自然试验方案](2007)2:953-971)预测的长度为29个氨基酸的信号肽。该信号肽序列在SEQ ID NO:8中加下划线并以粗体显示。信号肽的存在表明该丝氨酸蛋白酶是分泌的酶。像其他丝氨酸蛋白酶一样，该酶具有预测为76个氨基酸的前序列(在SEQ ID NO:8中以斜体表示)。该预测基于在同源丝氨酸蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(Waldeck等人，Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学](2006)72:7879-7885)中的前成熟连接。预测的完全加工的成熟链的序列(BliD02339，274个氨基酸)描述于SEQ ID NO:9中。BliD02339前酶原的氨基酸序列如SEQID NO:8所示：MMRKKSFWLGMLTALMLVFTMAFSDSASAAQPAKNVEKDYIVGFKSGVKTASVKKDIIKESGGKVDKQFRIINAAKAKLDKEALKEVKNDPDVAYVEEDHVAH ALAQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASFVAGEAYNTDGNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPNVSLYAVKVLNSSGSGSYSGIVSGIEWATTNGMDVINMSLGGPSGSTAMKQAVDNAYARGVVVVAAAGNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASFSSVGAKLEVMAPGAGVYSTYPTSTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ。
实例6
BliD02339蛋白酶与枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的比较
BliD02339蛋白酶与枯草杆菌蛋白酶AprL的序列比对在图3中示出。BliD02339与枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在4个位置上是不同的，其分别是：位置86、128、194和211。最引人注目的是BliD02339(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在此位置上具有天冬氨酸残基)的位置194上的赖氨酸残基，因为这导致BliD02339与枯草杆菌蛋白酶Carlsberg和本领域已知的其他地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶之间电荷的显著差异。对于枯草杆菌蛋白酶Carlsberg-0.80，BliD02339在pH 7下计算的电荷是1.19。这种电荷差异可能影响酶的特性，如清洁性能、稳定性和/或生产率。
实例7
BliD02339的异源表达
使用由枯草芽孢杆菌aprE启动子、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列、天然BliD02339蛋白酶原肽、成熟BliD02339蛋白酶和BPN'终止子组成的表达盒，在枯草芽孢杆菌中生产BliD02339蛋白酶。将该盒克隆到pHYT复制穿梭载体中并转化到合适的枯草芽孢杆菌菌株中。通过使用BstEII和EcoRI位点(终止子序列(SEQ ID NO:10))在四环素抗性基因之后添加终止子，从pHY300PLK(Takara)获得了pHYT载体。还使用克隆到BamHI和HindIII位点的接头(新接头序列，(SEQ ID NO:11))除去pHY300PLK中的HindIII位点。图4中显示了含有BliD02339基因的pHYT载体(pHYT-BliD02339)的图谱。
为产生BliD02339，将合适的含有pHYT-BliD02339的枯草芽孢杆菌菌株在基于MOP缓冲液的富集的半限定培养基中培养，以尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并补充1％大豆蛋白胨以稳健细胞生长。培养基中补充了25ppm的四环素。孵育后(在32℃下2天)，在生长培养基中检测到BliD02339蛋白酶。离心和过滤后，使用培养上清液和BliD02339蛋白酶进行测定。
蛋白质通过标准无污渍成像仪法进行定量。该方法基于无污渍预制PAGE凝胶的应用，其中每个条带的强度将取决于在目的蛋白中呈现的色氨酸残基的量。用于PAGE的CriterionTMTGX(Tris-甘氨酸延伸型)无污渍(Stain-Free)TM预制凝胶包括独特的三卤代化合物。这允许使用Gel DocTMEZ成像系统进行蛋白质的快速荧光检测。三卤代化合物与UV诱导反应中的色氨酸残基反应产生荧光，该荧光可以很容易地通过Gel Doc EZ成像仪在凝胶内检测到。测定中使用的试剂：浓缩的(10x)Laemmli样品缓冲液(Kem-En-Tec公司，目录#42556)；18或26孔标准TGX无污渍预制凝胶(伯乐公司(Bio-Rad)，分别为目录#567-8124和567-8125)；和蛋白质标记“精密加蛋白质标准(Precision Plus Protein Standards)”(伯乐公司(Bio-Rad)，目录#161-0363)。如下进行测定：将25μl蛋白质样品和25μl 0.5M HCL添加到96孔PCR板上，该PCR板在冰上以灭活蛋白酶并防止自水解。在96孔PCR板中，向50μl酸性蛋白质混合物中添加含有0.385mg DTT的50μL样品缓冲液。之后，通过运行缓冲液填充腔室，设置凝胶盒。然后，将每个样品10μL与标记物一起加载到每个袋中。之后，在200V下启动电泳，持续35min。电泳后，将凝胶转移到成像仪中。使用成像实验室(Image Lab)软件来计算每个条带的强度。通过已知标准样品的蛋白的量和色氨酸含量，可以制作校准曲线。实验样品的量可以通过将条带强度和色氨酸数量外推到蛋白质浓度来确定。使用该蛋白质定量方法来制备用于随后实例中所示的测定的BliD02339蛋白酶的样品。
如后续所述通过LC-MS/MS分析分离的BliD02339蛋白酶样品。在准备序列确认时(包括N-和C-末端测定)，将BliD02339蛋白酶样品在10kDa旋转过滤器中经受一系列化学处理。样品通过尿素和DTT/碘乙酰胺处理进行变性和还原/烷基化。进行了胍基化步骤将赖氨酸转化为高精氨酸以保护赖氨酸侧链免于乙酰化。使用磺基-NHS-乙酸酯(磺基琥珀酰亚胺乙酸酯)的乙酰化反应仅修饰蛋白质N-末端残基。然后将样品与含有40v/v％18O水：60v/v％16O水的缓冲液和用于蛋白质消化的蛋白水解酶混合。除了将保留天然16O的羧基末端之外，得到的肽将含有18O和16O的混合物，这将从肽的同位素模式中显而易见。源自蛋白质N-末端的肽将显示为唯一的乙酰化的肽。使用纳米LC系统，然后使用LTQ轨道阱(赛默飞世尔公司)高分辨质谱仪分离和分析所得的肽。氨基酸序列由肽的MS/MS片段谱推导出。基于此分析，分离的蛋白质的N-末端被证实从预测的成熟序列的位置1以A开始。测定成熟蛋白的序列，对应于由SEQ ID:9所列的序列(由274个氨基酸组成)。
实例8
BliD02339的蛋白酶活性
通过测量DMC底物的水解来测试BliD02339蛋白酶的蛋白酶活性。用于DMC测定的试剂溶液是：在100mM碳酸钠缓冲液(pH 9.5)中的2.5％w/v二甲基酪蛋白(DMC，西格玛C-9801)、在试剂A中的0.075％TNBSA(2,4,6-三硝基苯磺酸，赛默科技公司(ThermoScientific))。试剂A：在15mL 4N NaOH中的45.4g Na2B4O7.10H2O(默克公司(Merck))，在去离子水中达到1000mL的终体积。将蛋白酶上清稀释成稀释溶液：10mM NaCl，0.1mM CaCl2，0.005％Tween-80，达到适当的浓度，以在5分钟的水解期间获得线性响应。向96孔MTP板装填95μl DMC底物，随后添加5μl稀释的蛋白酶上清液。然后添加100μL在试剂A中的TNBSA，同时缓慢混合。使用SpectraMax酶标仪以动力学方式在室温下经5min在405nm下测量活性。从值中减去不含蛋白酶的空白的吸光度。活性以mOD/min表示。BliD02339的蛋白酶活性曲线显示于图5中。发现DMC测定中BliD02339蛋白酶的比活性为26mOD/min/ppm(其中ppm是测定中蛋白酶的最终浓度)。在相同的测定条件下，发现GG36和BPN’蛋白酶的比活性分别为54和23mOD/min/ppm。
实例9
BliD02339的ph曲线
在含有50mM CaCl2的50mM乙酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中，使用偶氮酪蛋白底物研究BliD02339蛋白酶的蛋白水解活性的pH依赖性。以1pH单位增量测量pH在4至12之间的效应。将一个普罗塔克森(Protaxyme)AK片剂(梅格泽姆公司(Megazyme)，爱尔兰)与1.9mL适当的缓冲液和磁力搅拌器一起添加到玻璃测试管中，随后在装有磁力搅拌器的温度受控的水浴中在40℃下持续5min进行温和的水合作用。将新鲜制备的蛋白酶(在去离子水中稀释至用于测定的适当浓度)的100μl样品添加到预水合的底物中，并在40℃下进行反应，持续10分钟。为停止反应，添加10mL 2％w/v Tris缓冲液pH 12，并且搅拌溶液并立即通过沃特曼(Whatman)1号过滤器过滤。收集上清液，并测量该上清液在590nm处的吸光度以定量反应产物。从每个样品读数中减去来自仅有缓冲液的对照的吸光度，通过将在最佳pH下的活性定义为100％，将得到的值转化为相对活性百分率。在本测定的条件下，确定BliD02339在6-12的pH范围内维持≥50％的活性。
实例10
BliD02339的温度曲线
在pH 9下，在含有50mM CaCl2的50mM乙酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中，使用偶氮酪蛋白底物测量BliD02339蛋白酶的蛋白水解活性的温度依赖性。在30℃和80℃之间的温度下以10℃增量测量活性。将一个普罗塔克森(Protaxyme)AK片剂(梅格泽姆公司(Megazyme)，爱尔兰)与1.9mL适当的缓冲液和磁体搅拌器一起添加到玻璃测试管中，随后在装有磁力搅拌器的温度受控的水浴中在设定温度下持续5min进行温和的水合作用。将新鲜制备的蛋白酶(在去离子水中稀释至用于测定的适当浓度)的100μl样品添加到预水合的底物中，并在30℃和80℃之间的温度下进行反应，持续10分钟。为终止反应，添加10mL 2％w/v Tris缓冲液pH 12，并且搅拌溶液并立即通过沃特曼1号过滤器过滤。收集上清液，并测量该上清液在590nm处的吸光度以定量反应产物。从每个样品读数中减去来自仅有缓冲液的对照的吸光度，通过将在最佳温度下的活性定义为100％，将得到的值转化为相对活性百分率。在本测定条件下，确定BliD02339在55℃-75℃的范围内保持≥50％的活性。
实例11
BliD02339的清洁性能
针对基于衣物的应用，测试BliD02339对BMI(棉花上的血液/奶/墨水)微样品(EMPA-116，测试材料BV中心，荷兰)的清洁性能，且针对基于餐具的应用，测试对蛋黄(在风化并且用炭黑染料染色的聚丙烯织物上的蛋黄)微样品(PAS-38，测试材料中心，荷兰)的清洁性能。冲洗包含预冲穿的(为适合MTP)样品的MTP(康宁3641)，并且在添加酶之前用洗涤剂填充。如上表2或表3中所述，给予洗涤剂彩色奥妙HDD、超级科克兰HDD、奥妙克莱因&克拉克蒂格HDL、科克兰超净HDL、GSM-B 10.5ADW、和GSM-B 9ADW。
在水浴中加热至95℃持续4小时，使商购的HDL衣物洗涤剂失活。通过制备10％w/v溶液并在95℃下加热4小时使商购的HDD衣物洗涤剂失活。使用AAPF底物灭活后测定蛋白酶活性。加热HDD和HDL洗涤剂4小时后，蛋白酶活性不存在。
将酶的等分试样添加到洗涤剂填充的微样品板中以达到最终体积200μL以用于衣物洗涤测定，达到0.04ppm至10ppm的最终酶浓度。使用HDL或HDD配方的衣物清洁测定在25℃下进行15分钟，而ADW测定在40℃下进行30分钟。
孵育后，将100uL上清液转移到新鲜的MTP(Costar 9017)中，并且使用SpectraMax酶标仪在600nm处读取EMPA-116样品的吸光度或在405nm处读取PAS-38样品的吸光度。减去来自仅有缓冲液的对照的吸光度，并将在600nm(对于HDL和HDD洗涤剂)和405nm(对于ADW洗涤剂)中所得的OD值作为蛋白酶浓度的函数绘图。数据符合朗缪尔方程。BliD02339的清洁性能图解地显示于图6-8中。
实例12
包括AprL和BliD02339的枯草杆菌蛋白酶的系统发育树
使用表8中所示的枯草杆菌蛋白酶序列子集建立AprL蛋白(SEQ ID NO:2)和BliD02339(SEQ ID NO:9)的成熟序列的系统发育树。在Vector NTI Advance套件中输入序列，并且使用邻接(NJ)法创建引导树(Guide Tree)(Saitou,N.；和Nei,M.(1987)Mol BiolEvol[分子生物学与进化]4,406-425)。NJ方法用于待分析的所有序列对之间的距离矩阵。这些距离与序列之间的散度有关。引导树是在序列对齐后计算的。使用以下参数计算树结构：针对序列距离的木村(Kimura)校正并且忽略具有空位的位置。AlignX在系统发育树上显示的分子名称之后的括号内显示计算的距离值，如图9所示。基于系统发育树的分布，某些枯草杆菌蛋白酶如图9所示被分组以形成AprL进化枝。
实例13
AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的独特特征
如图9所示，枯草杆菌蛋白酶AprL(地衣芽孢杆菌Carlsberg)、其近同源物BliD02339、以及所有其他的地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶和索诺拉沙漠芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶分享足以产生进化枝的特征，既而称其为AprL-进化枝。使用AprL(pdb 3UNX)的高分辨率结构来评估AprL-进化枝中酶分享的不变残基的位置。使用其他枯草杆菌蛋白酶的高分辨率结构作为比较(BPN'pdb 2St1和迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶pdb 1JEA)。这些结构的比较用于鉴定在AprL-进化枝酶和其他枯草杆菌蛋白酶之间具有显著差异的一系列序列/结构基序。以下描述了这些重要的不变区域中的一些。
环52-60在AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶和其他枯草杆菌蛋白酶之间差异很大，如BPN'和迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶所例证。AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶序列中的一个特征是在位置56-58处的Tyr-Asn-Thr(“YNT”)残基，其将确定AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶中该环的末端进程，参见图10。在图10中，我们发现了独特的YNT序列出现在环的顶端。该环52-60的构象在所示的不同枯草杆菌蛋白酶结构中是异源的。我们将这种差异部分归因于这一独特的序列。该环有时是自溶切割的位点，并且因此未剪切的AprL环的构象对其功能是至关重要的。
AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶中的残基240-243具有共同的序列Leu-Ser-Ala-Ser(“LSAS”)。在这个区域中，Leu240小于在其他枯草杆菌蛋白酶中发现的较大的疏水性残基，如BPN'和在其中发现了色氨酸侧链的迟缓芽孢杆菌，参见图11。AprL-进化枝中较小的Leu可以容纳Arg248侧链，从而在AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的这个位置上允许保持转角并在这个表面上引入正电荷。
另外，AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶中的Asn 96可以与残基Ser 98的主链酰胺形成氢键，以稳定通向作为底物结合位点的一部分的链101-104的转角，参见图12。

Claims (36)

1.一种AprL-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，其包含相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰选自：(i)A001C、A001D、A001E、A001Q、A001S、L010M、L010Q、S100G、S102K、S102R、Y103F、Y103M、S104D、G105M、G105R、S108F、S108H、S108K、S108R、E111Q、T114D、T115D、T115E、T115F、T115K、T115Q、N116E、K012C、K012F、K012H、K012M、K012N、K012Q、K012Y、V120S、M123C、M123I、L125I、G127A、G127D、G127I、G127M、G127S、G127T、G127V、A128E、A128H、A128K、A128P、A128R、A128S、A128T、S129H、S129Q、S129R、S129T、S129V、T132C、T132D、T132E、T132K、T132N、T132P、Q136A、Q136C、Q136K、Q136R、V138C、A143D、A143N、G145S、V147L、V148A、V148C、V148M、V148Q、K015A、K015C、K015E、K015I、K015M、K015S、K015T、K015V、S155D、S155F、S155K、S155N、S155R、S157D、S158D、S158I、S158K、S158R、N160C、N160D、N160I、N160M、N160R、T161C、T161D、T161E、T161K、T161Q、T161R、G165A、G165E、G165Q、G165R、G165S、Q017H、A018D、A018E、S181Q、N182D、S183A、S183G、N184C、N184E、N184Q、A186C、S187D、S187E、S187P、Q019D、Q019E、A193D、A193R、A202D、A202E、A202K、A202Q、A202V、G203A、G203C、G203E、G203N、G203Q、Y205E、T210C、T210E、T210I、T210P、T210V、A214E、T215C、L216C、L216H、L216K、L216M、N217S、L234E、L234F、L234Q、L234S、S235D、S235E、P238T、N239A、N239D、N239H、N239M、N239S、N239T、A024E、A024Q、L240D、S241E、S241N、S241Q、S241V、A242G、A242N、S243E、S243Q、S243V、Q244C、Q244E、V245A、V245C、V245T、N247D、N247W、N025D、N025G、N025Q、S250G、S251E、S258C、S258D、S258E、S258H、S258P、S259E、S259P、S259Q、V026A、V026C、V026E、V026H、V026Q、V026R、F260W、K264A、K264C、K264D、K264H、K264M、K264Q、K264S、K264Y、I267C、N268D、N268E、N268Q、V269C、K027C、K027D、K027E、K027M、K027P、A271E、Q274A、Q274C、Q274D、Q274E、Q274G、A029S、T003E、T003I、T003Q、T003V、V030C、I035A、I035S、I035T、I035V、S038T、N043A、N043C、N043F、N043H、N043Q、V044P、V045A、V045C、V045D、V045E、V045F、V045G、V045M、V045N、V045Q、V045R、V045S、V045T、G046D、A048N、A048W、F050H、V051I、A052F、A052G、A052K、A052N、A052P、A052R、A052V、G053N、G053R、A055C、A055D、A055E、A055G、A055H、A055N、A055S、A055V、N057C、N057E、N057G、N057V、T058C、T058I、T058K、T058W、A068C、A068N、A068S、V071A、L074G、D075E、N076K、T077C、T077D、T077H、T077M、T077N、T077P、T077Q、T077S、T078D、T078I、T078V、S086E、S086H、S086R、V087C、V087G、V087S、V087T、S088E、S088N、S088R、L089N、P009C、P009D、P009E、P009N、P009T、L095A、L095V、N096S、S098K、S098R、和G099Q；
(ii)A001Q、T003V、K015I、I035A、A068S、V071A、T077N、S086H、V087S、L095A、T115F、M123I、G127T、A128P、A128S、V147L、G165Q、G165S、N184Q、A202V、T210P、N217S、N239S、A242G、S250G、S258P、和Q274A；或
(iii)T003V、A068S、T077N、S086H、T115F、M123I、G127T、A128P、G165Q、N184Q、A202V、T210P、N217S、和S258P；其中所述AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2中所示的芽孢杆菌属物种AprL枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相对应来编号。
2.如权利要求1所述的变体，其中当与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比时，所述变体具有改进的稳定性。
3.如权利要求2所述的变体，其中所述改进的稳定性是(i)稳定性PI>1.2，或(ii)稳定性PI>1.2，以及以下中的一个或多个：HDD清洁PI>0.8，HDL pH 6或pH 8清洁PI>0.8，ADW清洁PI>0.8，或表达PI>0.8。
4.如前述权利要求中任一项所述的变体，其还包含相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰选自：
(i)A001C、A048R、A052F、G099S、G099T、G101A、G127F、G127I、G127M、G127Q、G127T、G127V、I121M、L010M、L095A、L095F、L095Q、L095S、L125I、L125V、M123C、M123I、N025F、N025S、N116C、N140R、N184C、P238C、P238D、P238I、P238M、P238N、Q136A、S098F、S098H、S102D、S158Q、S241R、T077C、T077F、T215C、V026I、V026Q、V045R、和V149C；或
(ii)A001C、A024E、A128D、G053C、G099T、G101A、G101N、G165E、G203C、L095Q、L095S、L125S、N061E、N116C、N184C、S098D、S102D、S102E、S104D、S129E、S155D、S158E、和V026T。
5.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中当与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比时，所述变体在pH 6和/或pH 8具有改进的HDL清洁性。
6.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中在pH 6的所述改进的HDL清洁性是(i)HDL pH 6清洁PI>1.1，或(ii)HDL pH 6清洁PI>1.1，以及以下中的一个或多个：HDD清洁PI>0.8，HDL pH 8清洁PI>0.8，ADW清洁PI>0.8，表达PI>0.8，或稳定性PI>0.8；并且其中在pH 8的所述改进的HDL清洁性是(i)HDL pH 8清洁PI>1.1，或(ii)HDL pH 8清洁PI>1.1，以及以下中的一个或多个：HDD清洁PI>0.8，HDL pH 6清洁PI>0.8，ADW清洁PI>0.8，表达PI>0.8，或稳定性PI>0.8。
7.如前述权利要求中任一项所述的变体，其还包含相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰选自：A029T、A048K、A048R、A052F、A052R、A068G、A113C、D119H、E111Q、G099A、G099S、G127A、G127T、G165A、K012G、K012H、K027C、K027E、K027M、L095F、L125I、L125V、L240Q、N025F、N025G、N025L、N043R、N116R、N140R、N160C、N184C、N239K、P238C、P238I、P238M、Q136F、Q136H、Q136K、Q136R、Q136W、S098F、S098H、S104A、S158Q、S241R、V045R、和Y103M。
8.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中当与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比时，所述变体具有改进的HDD清洁性。
9.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述改进的HDD清洁性是(i)HDD清洁PI>1.1，或(ii)HDD清洁PI>1.1，以及以下中的一个或多个：HDL pH 6清洁PI>0.8，HDL pH 8清洁PI>0.8，ADW清洁PI>0.8，表达PI>0.8，或稳定性PI>0.8。
10.如前述权利要求中任一项所述的变体，其还包含相对于亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的一个或多个氨基酸修饰，其中所述修饰选自：A001C、A001D、A024E、A024G、A048C、A048D、A048K、A048N、A052F、A052M、A052V、A052Y、A055C、A072G、A091G、A113C、A128P、A128Q、A133G、A133S、A133T、A143E、A143F、A143H、A143N、A143S、A143W、A193D、A202C、A202D、A202E、A202Q、A227S、D119F、D119S、D119Y、G053C、G053E、G053N、G053Q、G060L、G060Y、G099A、G099T、G101A、G117D、G117V、G127A、G127S、G127T、G130D、G130H、G203A、G203C、G203E、G203M、H237I、I035A、I035C、I035M、I035T、I121L、K012N、K015M、K027C、K027L、K027M、K027R、K264A、K264S、L010M、L095F、L125V、L234Q、L240N、L249I、M123C、M123I、M123L、N025F、N025G、N025L、N025S、N057C、N061A、N076G、N096D、N096G、N116A、N116C、N116L、N116Y、N140A、N160C、N182C、N182D、N184C、N211S、N247F、N247H、N247I、N247L、N247Q、N247S、N247V、N247W、N247Y、P009E、P009T、P238A、P238C、P238D、P238F、P238I、P238R、Q017H、Q136A、Q136C、Q136F、Q136H、Q136K、Q136L、R144F、R144L、R248K、S086R、S088N、S088Y、S097G、S097H、S097Y、S098H、S098L、S100L、S102D、S102E、S102G、S102K、S129E、S129H、S155A、S155D、S155E、S155H、S157D、S158I、S158Q、S181A、S181Q、S183G、S241R、S241T、S243I、S243N、S243T、S243V、S243Y、S251E、S258C、S258D、S258P、T058C、T058D、T058F、T058I、T077C、T077F、T077L、T077M、T078Q、T132A、T132Q、T132V、T132Y、T161Q、T210I、T215C、V026Q、V026R、V026T、V028A、V028C、V045I、V071A、V071L、V120A、V120C、V120I、V146A、V146H、V146K、V147L、V149C、Y056H、和Y255C。
11.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中当与亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比时，所述变体具有改进的ADW清洁性。
12.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述改进的ADW清洁性是(i)ADW清洁PI>1.1，或(ii)ADW清洁PI>1.1，以及以下中的一个或多个：HDL pH 6清洁PI>0.8，HDL pH 8清洁PI>0.8，HDD清洁PI>0.8，表达PI>0.8，或稳定性PI>0.8。
13.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述稳定性PI是根据实例1的稳定性测定来测量的，HDD清洁PI是根据实例1的HDD清洁性测定来测量的，HDL清洁PI是根据实例1的HDL清洁性测定来测量的，ADW清洁PI是根据实例1的ADW清洁性测定来测量的，并且/或者表达PI是根据实例1的蛋白质测定分析来测量的。
14.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含SEQ ID NO:2、9、12、13、14、15或16的氨基酸序列。
15.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含SEQ ID NO:2或9的氨基酸序列。
16.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
17.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶和/或所述变体包含：
(i)Asp32和His63之间的YNT(SEQ ID NO:46)基序；
(ii)Y56N57T58(SEQ ID NO:45)基序；
(iii)F50V51X152G53E54X355Y56N57T58(SEQ ID NO:48)基序，其中X1是A或S并且X3是A或S；
(iv)Lys236和Arg246之间的LSX4S(SEQ ID NO:55)基序，其中X4是A或G；
(v)L240S241A242S243(SEQ ID NO:50)基序；
(vi)L240S241G242S243(SEQ ID NO:56)基序；
(vii)KXXXLSX4SQX5R(SEQ ID NO:57)基序，其中X是任意氨基酸，X4是A或G，并且X5是I或V；
(viii)K236XXXLSASQX5R246(SEQ ID NO:52)基序，其中X是任意氨基酸并且X5是I或V；
(ix)K236XXXLSGSQX5R246(SEQ ID NO:60)基序，其中X是任意氨基酸并且X5是I或V；或
(viii)选自(i)、(ii)、和(iii)的基序1，与选自(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、和(ix)的基序2组合。
18.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶和/或所述变体包含残基52-60之间的环区域。
19.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶和/或所述变体包含Arg248残基。
20.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶和/或所述变体包含(i)SEQ ID NO:45、46、47或48的氨基酸序列；和(ii)SEQ ID NO:49、50、51、52、55、56、57、58、59或60的氨基酸序列。
21.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶和/或所述变体包含Lys236和Arg246之间的SEQ ID NO:49或58的氨基酸序列，和Asp32和His63之间的SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
22.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶和/或所述变体包含Asn96残基。
23.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶和/或所述变体包含残基96和98之间的氢键。
24.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％的氨基酸序列同一性。
25.一种组合物，其包含至少一种如权利要求1-24中任一项所述的变体。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述组合物是清洁组合物或洗涤剂组合物。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述洗涤剂组合物选自由以下组成的组：衣物洗涤剂、织物柔顺洗涤剂、餐具洗涤剂和硬表面清洁洗涤剂。
28.如权利要求25-27中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含表面活性剂；至少一种稳定剂；至少一种漂白剂；至少一种辅助成分；一种或多种选自由以下组成的组的另外的酶或酶衍生物：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶，和木糖苷酶，另外的金属蛋白酶及其组合。
29.如权利要求25-28中任一项所述的组合物，其中所述清洁组合物是无磷酸盐的或含有磷酸盐。
30.如权利要求25-29中任一项所述的组合物，其中所述清洁组合物是无硼的或含有硼酸盐。
31.如权利要求25-30中任一项所述的组合物，其中所述组合物是颗粒、粉末、固体、棒状、液体、片剂、凝胶、单位剂量或糊状组合物。
32.一种清洁需要清洁的表面或物品的方法，所述方法包括：将所述需要清洁的表面或物品与如权利要求1-24中任一项所述的变体或如权利要求25-31中任一项所述的组合物接触，以产生经清洁的表面或物品。
33.一种纺织品加工、动物饲料、皮革加工、羽毛加工、谷物加工、纤维素乙醇加工、镜片清洁、组织清创或组织细胞培养添加剂组合物，其包含如权利要求1-24中任一项所述的变体。
34.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求1-24中任一项所述的变体的核酸序列，其中所述多核苷酸是任选地分离的。
35.一种包含如权利要求34所述的多核苷酸的表达载体。
36.一种用如权利要求35所述的载体转化的宿主细胞。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109477112A (zh) * 2016-05-31 2019-03-15 丹尼斯科美国公司 蛋白酶变体及其用途
CN110846299A (zh) * 2019-11-22 2020-02-28 江南大学 一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用
CN115960862A (zh) * 2022-12-30 2023-04-14 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种角质酶突变体及其在合成1，4-二乙酰哌嗪中的应用

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180362946A1 (en) 2015-12-18 2018-12-20 Danisco Us Inc. Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof
WO2017192692A1 (en) 2016-05-03 2017-11-09 Danisco Us Inc Protease variants and uses thereof
WO2017192300A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Danisco Us Inc Protease variants and uses thereof
US11946081B2 (en) 2016-12-21 2024-04-02 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
WO2018169750A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Danisco Us Inc Trypsin-like serine proteases and uses thereof
CN110662836B (zh) 2017-03-31 2024-04-12 丹尼斯科美国公司 α-淀粉酶组合变体
CN111212906B (zh) 2017-08-18 2024-02-02 丹尼斯科美国公司 α-淀粉酶变体
WO2020028443A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Danisco Us Inc Variant alpha-amylases having amino acid substitutions that lower the pka of the general acid
WO2020077331A2 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Danisco Us Inc Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants
US11312922B2 (en) 2019-04-12 2022-04-26 Ecolab Usa Inc. Antimicrobial multi-purpose cleaner comprising a sulfonic acid-containing surfactant and methods of making and using the same
US11001608B2 (en) * 2019-07-11 2021-05-11 King Faisal University Arid5a peptide inhibitors
US20220403359A1 (en) 2019-10-24 2022-12-22 Danisco Us Inc Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2022178432A1 (en) 2021-02-22 2022-08-25 Danisco Us Inc. Methods and compositions for producing proteins of interest in pigment deficient bacillus cells
EP4448707A1 (en) 2021-12-16 2024-10-23 The Procter & Gamble Company Home care composition
WO2023114794A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 The Procter & Gamble Company Fabric and home care composition comprising a protease
CN118369413A (zh) 2021-12-16 2024-07-19 宝洁公司 包含淀粉酶的家庭护理组合物
US20240166973A1 (en) 2021-12-16 2024-05-23 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing composition comprising a protease
CA3241094A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Jonathan LASSILA Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases
WO2024050343A1 (en) * 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods related thereto

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6780629B2 (en) * 1997-11-21 2004-08-24 Novozymes A/S Subtilase enzymes

Family Cites Families (174)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (zh) 1969-05-29 1972-11-22
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
GB2048606B (en) 1979-02-28 1983-03-16 Barr & Stroud Ltd Optical scanning system
US4302544A (en) 1979-10-15 1981-11-24 University Of Rochester Asporogenous mutant of B. subtilis for use as host component of HV1 system
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
GR76237B (zh) 1981-08-08 1984-08-04 Procter & Gamble
US4450235A (en) 1982-04-21 1984-05-22 Cpc International Inc. Asporogenic mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
NZ208806A (en) 1983-07-06 1988-07-28 Gist Brocades Nv Genetic engineering of industrial microorganism species: readily-transformable host used as intermediate in transfer of dna to the industrial species; plasmids
US5264366A (en) 1984-05-29 1993-11-23 Genencor, Inc. Protease deficient bacillus
US5972682A (en) 1984-05-29 1999-10-26 Genencor International, Inc. Enzymatically active modified subtilisins
US5700676A (en) 1984-05-29 1997-12-23 Genencor International Inc. Modified subtilisins having amino acid alterations
DK154572C (da) 1985-08-07 1989-04-24 Novo Industri As Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler
JPH0697997B2 (ja) 1985-08-09 1994-12-07 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ 新規の酵素的洗浄剤添加物
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
ES2058119T3 (es) 1986-08-29 1994-11-01 Novo Nordisk As Aditivo detergente enzimatico.
GB8629837D0 (en) 1986-12-13 1987-01-21 Interox Chemicals Ltd Bleach activation
US4972017A (en) 1987-03-24 1990-11-20 The Clorox Company Rinse soluble polymer film composition for wash additives
US4765916A (en) 1987-03-24 1988-08-23 The Clorox Company Polymer film composition for rinse release of wash additives
WO1988009367A1 (en) 1987-05-29 1988-12-01 Genencor, Inc. Cutinase cleaning composition
ATE125865T1 (de) 1987-08-28 1995-08-15 Novo Nordisk As Rekombinante humicola-lipase und verfahren zur herstellung von rekombinanten humicola-lipasen.
JPS6474992A (en) 1987-09-16 1989-03-20 Fuji Oil Co Ltd Dna sequence, plasmid and production of lipase
DE68924654T2 (de) 1988-01-07 1996-04-04 Novonordisk As Spezifische Protease.
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
US4977252A (en) 1988-03-11 1990-12-11 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Modified starch emulsifier characterized by shelf stability
WO1990009446A1 (en) 1989-02-17 1990-08-23 Plant Genetic Systems N.V. Cutinase
JPH04500385A (ja) * 1989-06-26 1992-01-23 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ 酵素洗剤組成物
BR9006818A (pt) 1989-06-29 1991-08-06 Gist Brocades Nv Amilases microbianas mutantes com maior estabilidade termica,acida e/ou alcalina
DE59101948D1 (de) 1990-04-14 1994-07-21 Kali Chemie Ag Alkalische bacillus-lipasen, hierfür codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren.
US5354559A (en) 1990-05-29 1994-10-11 Grain Processing Corporation Encapsulation with starch hydrolyzate acid esters
EP0495257B1 (en) 1991-01-16 2002-06-12 The Procter & Gamble Company Compact detergent compositions with high activity cellulase
GB9108136D0 (en) 1991-04-17 1991-06-05 Unilever Plc Concentrated detergent powder compositions
US5340735A (en) 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
JP3678309B2 (ja) 1992-07-23 2005-08-03 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 突然変異α−アミラーゼ、洗剤、皿洗い剤及び液化剤
BR9307576A (pt) 1992-12-01 1999-06-15 Novo Nordisk As Processo para oxidar um substrato com uma enzima peroxidase ou um composto atuando como peroxidase na presença de uma fonte de peróxido de hidrogênio aditivo detergente e composição detergente
DK0867504T4 (da) 1993-02-11 2011-08-29 Genencor Int Oxidativ stabil alfa-amylase
DK0697036T3 (da) 1993-05-08 2000-01-31 Henkel Kgaa Sølvkorrosionsbeskyttelsesmiddel II
ATE163191T1 (de) 1993-05-08 1998-02-15 Henkel Kgaa Silberkorrosionsschutzmittel i
DK77393D0 (da) 1993-06-29 1993-06-29 Novo Nordisk As Aktivering af enzymer
WO1995010603A1 (en) 1993-10-08 1995-04-20 Novo Nordisk A/S Amylase variants
MA23346A1 (fr) * 1993-10-14 1995-04-01 Genencor Int Variantes de la subtilisine
DE4342680A1 (de) 1993-12-15 1995-06-22 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5861271A (en) 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
US5691295A (en) 1995-01-17 1997-11-25 Cognis Gesellschaft Fuer Biotechnologie Mbh Detergent compositions
DK1921147T3 (da) 1994-02-24 2011-09-19 Henkel Ag & Co Kgaa Forbedrede enzymer og detergenter indeholdende disse
ES2364776T3 (es) 1994-02-24 2011-09-14 HENKEL AG &amp; CO. KGAA Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
US5824531A (en) 1994-03-29 1998-10-20 Novid Nordisk Alkaline bacilus amylase
DE69534369T2 (de) 1994-06-17 2006-03-09 Genencor International, Inc., Palo Alto Von der alpha-amylase aus b. licheniformis abgeleitete amylolytische enzyme mit verbesserten eigenschaften
PL318209A1 (en) 1994-08-11 1997-05-26 Genencor Int Improved cleaning composition
CA2211316C (en) 1995-02-03 2013-10-01 Novo Nordisk A/S Method of designing alpha-amylase mutants with predetermined properties
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
US6455295B1 (en) * 1995-03-08 2002-09-24 The Procter & Gamble Company Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6475765B1 (en) * 1995-03-09 2002-11-05 Procter & Gamble Company Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
KR19980702783A (ko) 1995-03-24 1998-08-05 혼 마가렛 에이 아밀라제를 포함하는 개선된 세탁 세제 조성물
AU6513096A (en) 1995-07-19 1997-02-18 Novo Nordisk A/S Treatment of fabrics
US5576282A (en) 1995-09-11 1996-11-19 The Procter & Gamble Company Color-safe bleach boosters, compositions and laundry methods employing same
DK0850307T3 (da) 1995-09-13 2006-03-06 Genencor Int Alkalifile og termofile mikroorganismer og enzymer, der opnås derfra
ATE321119T1 (de) 1995-09-18 2006-04-15 Procter & Gamble Riechstofffreisetzungssystem
DK0904360T3 (en) 1996-04-30 2013-10-14 Novozymes As Alpha-amylasemutanter
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
US6211134B1 (en) 1996-05-14 2001-04-03 Genecor International, Inc. Mutant α-amylase
EP0939801A1 (en) 1996-09-26 1999-09-08 Novo Nordisk A/S An enzyme with amylase activity
EP0942994B1 (en) 1996-12-09 2005-04-20 Genencor International, Inc. H mutant alpha-amylase enzymes
US6225464B1 (en) 1997-03-07 2001-05-01 The Procter & Gamble Company Methods of making cross-bridged macropolycycles
US6008026A (en) 1997-07-11 1999-12-28 Genencor International, Inc. Mutant α-amylase having introduced therein a disulfide bond
GB2327947A (en) 1997-08-02 1999-02-10 Procter & Gamble Detergent tablet
US6080568A (en) 1997-08-19 2000-06-27 Genencor International, Inc. Mutant α-amylase comprising modification at residues corresponding to A210, H405 and/or T412 in Bacillus licheniformis
GB9719637D0 (en) 1997-09-15 1997-11-19 Genencor Int Bv Proteases from gram-positive organisms
GB9719636D0 (en) 1997-09-15 1997-11-19 Genencor Int Bv Proteases from gram-positive organisms
KR20010015754A (ko) 1997-10-13 2001-02-26 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 α-아밀라제 변이체
MA25044A1 (fr) 1997-10-23 2000-10-01 Procter & Gamble Compositions de lavage contenant des variants de proteases multisubstituees.
CA2308119C (en) 1997-10-30 2014-06-03 Novo Nordisk A/S .alpha.-amylase mutants
US5935826A (en) 1997-10-31 1999-08-10 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Glucoamylase converted starch derivatives and their use as emulsifying and encapsulating agents
BR9814236A (pt) 1997-11-21 2000-10-03 Novo Nordisk As Enzima subtilase, sua variante, sequência de dna isolada, vetor de expressão, célula microbiana hospedeira, processo para produzir uma subtilase ou uma variante de subtilase, composição, e, uso de uma subtilase ou de uma variante de subtilase.
AU2207099A (en) 1997-12-24 1999-07-19 Genencor International, Inc. An improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergentcomposition
GB9727471D0 (en) 1997-12-30 1998-02-25 Genencor Int Bv Proteases from gram positive organisms
GB9727464D0 (en) 1997-12-30 1998-02-25 Genencor Int Bv Proteases from gram positive organisms
AU2411699A (en) 1998-02-18 1999-09-06 Novo Nordisk A/S Alkaline bacillus amylase
EP1066374B1 (en) 1998-02-27 2006-05-31 Novozymes A/S Amylolytic enzyme variants
CN1292028B (zh) 1998-02-27 2013-08-14 诺维信公司 麦芽α淀粉酶变体
WO1999046399A1 (en) 1998-03-09 1999-09-16 Novo Nordisk A/S Enzymatic preparation of glucose syrup from starch
US6376450B1 (en) 1998-10-23 2002-04-23 Chanchal Kumar Ghosh Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants
US6197565B1 (en) 1998-11-16 2001-03-06 Novo-Nordisk A/S α-Amylase variants
JP2002531457A (ja) 1998-11-30 2002-09-24 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 架橋テトラアザマクロサイクル類の製造方法
BRPI0009362B8 (pt) 1999-03-30 2019-08-20 Novozymes As variante de uma alfa-amilase precursora, e, uso de uma variante de alfa-amilase
CA2365446C (en) 1999-03-31 2012-07-10 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
EP1169434B1 (en) 1999-03-31 2009-02-11 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
AU6686200A (en) 1999-08-20 2001-03-19 Novozymes A/S Alkaline bacillus amylase
JP4500385B2 (ja) 1999-10-04 2010-07-14 株式会社リコー 光走査装置及びカラー記録装置
EP1980614A3 (en) 1999-11-10 2009-04-08 Novozymes A/S Fungamyl-like Alpha-Amylase Variants
AU3724801A (en) 2000-03-03 2001-09-12 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
WO2001066712A2 (en) 2000-03-08 2001-09-13 Novozymes A/S Variants with altered properties
WO2001088107A2 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Novozymes A/S Alpha-amylase variants with altered 1,6-activity
WO2001096537A2 (en) 2000-06-14 2001-12-20 Novozymes A/S Pre-oxidized alpha-amylase
EP1370648A2 (en) 2000-08-01 2003-12-17 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
AU2002210380A1 (en) 2000-10-13 2002-04-22 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
US6582914B1 (en) 2000-10-26 2003-06-24 Genencor International, Inc. Method for generating a library of oligonucleotides comprising a controlled distribution of mutations
EP1423513B1 (en) 2001-05-15 2009-11-25 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
GB0114847D0 (en) 2001-06-18 2001-08-08 Unilever Plc Water soluble package and liquid contents thereof
US7189552B2 (en) 2002-12-17 2007-03-13 Novozymes A/S Thermostable alpha-amylases
US7449318B2 (en) 2003-04-30 2008-11-11 Danisco A/S, Genencor Division Bacillus mHKcel cellulase
ATE387487T1 (de) 2003-05-23 2008-03-15 Procter & Gamble Waschmittelzusammensetzung zum gebrauch in einer textilwasch- oder geschirrspülmaschine
WO2005003311A2 (en) 2003-06-25 2005-01-13 Novozymes A/S Enzymes for starch processing
ES2383366T3 (es) 2003-06-25 2012-06-20 Novozymes A/S Enzimas para el tratamiento de almidón
CA2538349C (en) 2003-06-25 2014-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
US20080124427A1 (en) 2003-08-22 2008-05-29 Novozymes A/S Process for preparing a dough comprising a starch-degrading glucogenic exo-amy-lase of family 13
WO2005019443A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Novozymes A/S Fungal alpha-amylase variants
EP1692159B1 (en) 2003-11-06 2010-09-29 Danisco US Inc. Tgf-beta1 binding and supported peptides
EP1700917B1 (en) 2003-12-03 2016-04-13 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Endoglucanase stce and cellulase preparation containing the same
DE602004031662D1 (de) 2003-12-03 2011-04-14 Procter & Gamble Perhydrolase
US7754460B2 (en) 2003-12-03 2010-07-13 Danisco Us Inc. Enzyme for the production of long chain peracid
ES2539955T3 (es) 2003-12-08 2015-07-07 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Celulasa tolerante a los tensioactivos y procedimiento de modificación de la misma
DK1709167T3 (da) 2004-01-08 2010-08-16 Novozymes As Amylase
DK1781790T3 (en) 2004-07-05 2016-01-18 Novozymes As ALFA-amylase variants WITH CHANGED PROPERTIES
WO2006012899A1 (en) 2004-08-02 2006-02-09 Novozymes A/S Maltogenic alpha-amylase variants
EP1781779A2 (en) 2004-08-02 2007-05-09 Novozymes A/S Creation of diversity in polypeptides
WO2006031554A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Novozymes North America, Inc. Methods for preventing, removing, reducing, or disrupting biofilm
WO2006063594A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Novozymes A/S Alkaline bacillus amylase
ATE489404T1 (de) 2004-12-22 2010-12-15 Novozymes As Hybridenzyme, bestehend aus einer ersten endoamylaseaminosäuresequenz und einem kohlenhydratbindenden modul als zweiter aminosäuresequenz
CN101128579B (zh) 2004-12-23 2013-10-02 诺维信公司 α-淀粉酶变体
RU2008102650A (ru) 2005-06-24 2009-07-27 Новозимс А/С (Dk) Амилазы для фармацевтического применения
KR20140027423A (ko) 2005-10-12 2014-03-06 다니스코 유에스 인크. 저장-안정성 중성 메탈로프로테아제의 용도 및 제조
EP1991651B2 (en) 2006-03-02 2022-07-06 The Procter & Gamble Company Surface active bleach at dynamic ph
JP2010501024A (ja) 2006-06-05 2010-01-14 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 酵素安定剤
AU2007264932A1 (en) 2006-06-30 2008-01-03 Novozymes A/S Bacterial alpha-amylase variants
EP2059591B1 (en) 2006-07-18 2012-09-05 Danisco US Inc. Dishwashing composition that contains a protease variant
RU2459867C2 (ru) 2006-12-21 2012-08-27 ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ПОЛИПЕПТИДА α-АМИЛАЗЫ ИЗ BACILLUS, ВИД 195, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EP2121910A1 (en) 2007-02-01 2009-11-25 Novozymes A/S Alpha-amylase and its use
US8021863B2 (en) 2007-02-19 2011-09-20 Novozymes A/S Polypeptides with starch debranching activity
US20100151542A1 (en) 2007-02-27 2010-06-17 Mcauliffe Joseph C Cleaning Enzymes and Fragrance Production
RU2479628C2 (ru) 2007-02-27 2013-04-20 ДАНИСКО ЮЭс, ИНК. Композиция и способ для очистки ткани или поверхности от загрязняющего вещества, содержащего триглицерид (варианты)
RU2009137386A (ru) 2007-03-09 2011-04-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН (US) Варианты амилазы алкалифильных видов bacillus, композиции, содержащие варианты амилазы, и способы применения
BRPI0818788A2 (pt) 2007-10-31 2016-10-25 Danisco Us Inc uso e produção de metaloproteases neutras, estáveis, em citrato.
CA2704311C (en) 2007-11-01 2018-02-13 Danisco Us Inc. Production of thermolysin and variants thereof, and use in liquid detergents
NZ584434A (en) 2007-11-05 2011-12-22 Danisco Us Inc VARIANTS OF BACILLUS sp. TS-23 ALPHA-AMYLASE WITH ALTERED PROPERTIES
JP2011505121A (ja) 2007-11-05 2011-02-24 ダニスコ・ユーエス・インク 改変された性質を有するアルファ−アミラーゼ
MX2010008359A (es) 2008-02-04 2010-08-30 Danisco Us Inc Variantes de alfa-amilasa ts23 con propiedades alteradas.
EP2100947A1 (en) 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
US8530216B2 (en) 2008-05-16 2013-09-10 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
BRPI0913367A2 (pt) 2008-06-06 2015-08-04 Danisco Us Inc Alfa-amilases variantes de bacillus subtilis e métodos de uso das mesmas
EP2578680B1 (en) 2008-06-06 2016-04-27 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising variant microbial proteases
EP2362902B1 (en) 2008-11-11 2012-10-24 Danisco US, Inc., Genencor Division Compositions and methods comprising a subtilisin variant
WO2010056653A2 (en) 2008-11-11 2010-05-20 Danisco Us Inc. Proteases comprising one or more combinable mutations
WO2010056640A2 (en) 2008-11-11 2010-05-20 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising serine protease variants
US20100122864A1 (en) 2008-11-17 2010-05-20 Allan Rosman Hybrid hydraulic drive system for all terrestrial vehicles, with the hydraulic accumulator as the vehicle chassis
EP2358878B1 (en) 2008-11-20 2014-10-15 Novozymes Inc. Polypeptides having amylolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2010088447A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
WO2010091221A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
US20120172275A1 (en) 2009-03-10 2012-07-05 Danisco Us Inc. Bacillus Megaterium Strain DSM90-Related Alpha-Amylases, and Methods of Use, Thereof
MX2011010040A (es) 2009-04-01 2011-11-18 Danisco Us Inc Sistema de limpieza que comprende una alfa-amilasa y una proteasa.
BRPI1012590A2 (pt) 2009-04-08 2015-09-22 Danisco Us Inc Genencor Div alfa-amilases relacionadas à cepa wdg-195 de halomonas e métodos de uso das mesmas
EP2279804A1 (en) 2009-07-28 2011-02-02 Koninklijke Philips Electronics N.V. Washing and sterilizing unit
AR079338A1 (es) 2009-12-09 2012-01-18 Danisco Us Inc Variantes de proteasa de bacillus y acidos nucleicos que codifican dichas variantes
US20130071913A1 (en) 2009-12-22 2013-03-21 Novozymes A/S Use of amylase variants at low temperature
WO2011076123A1 (en) 2009-12-22 2011-06-30 Novozymes A/S Compositions comprising boosting polypeptide and starch degrading enzyme and uses thereof
EP2521773A1 (en) 2010-01-04 2012-11-14 Novozymes A/S Alpha-amylases
CN113186178A (zh) 2010-02-10 2021-07-30 诺维信公司 在螯合剂存在下具有高稳定性的变体和包含变体的组合物
US20130260438A1 (en) 2010-05-06 2013-10-03 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising serine protease variants (as amended)
BR112013027963A2 (pt) 2011-05-05 2016-11-29 Danisco Us Inc "variante de subtilisina com atividade proteolítica, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição e método de limpeza".
BR112014010045B1 (pt) 2011-10-28 2021-12-21 Danisco Us Inc Polipeptídeo de alfa-amilase variante formadoras de malto-hexaose, composição compreendendo o mesmo, célula hospedeira, e métodos para remover uma mancha ou sujeira amilácea, para sacarificar uma composição que compreende amido, produção de uma composição alimentícia de desengomagem de um têxtil
US20140342433A1 (en) * 2011-11-25 2014-11-20 Novozymes A/S Subtilase Variants and Polynucleotides Encoding Same
US20130284637A1 (en) 2012-04-30 2013-10-31 Danisco Us Inc. Unit-dose format perhydrolase systems
US20150141316A1 (en) 2012-06-08 2015-05-21 Danisco Us Inc. Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers
EP2914720B1 (en) 2012-11-05 2022-08-31 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising thermolysin protease variants
DK3354728T3 (da) 2012-12-21 2020-07-27 Danisco Us Inc Alpha-amylase-varianter
WO2014164777A1 (en) 2013-03-11 2014-10-09 Danisco Us Inc. Alpha-amylase combinatorial variants
WO2014194034A2 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
EP3882346A1 (en) 2013-05-29 2021-09-22 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
EP3004342B1 (en) 2013-05-29 2023-01-11 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
EP3004314B1 (en) 2013-05-29 2018-06-20 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
EP3653707A1 (en) 2013-09-12 2020-05-20 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising lg12-clade protease variants
US20160272957A1 (en) 2013-11-20 2016-09-22 Danisco Us Inc. Variant alpha-amylases having reduced susceptibility to protease cleavage, and methods of use, thereof
EP3514230B1 (en) * 2013-12-13 2021-09-22 Danisco US Inc. Serine proteases of bacillus species
DK3080263T3 (da) 2013-12-13 2019-10-07 Danisco Us Inc Serinproteaser af bacillus gibsonii-clade

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6780629B2 (en) * 1997-11-21 2004-08-24 Novozymes A/S Subtilase enzymes

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109477112A (zh) * 2016-05-31 2019-03-15 丹尼斯科美国公司 蛋白酶变体及其用途
CN109477112B (zh) * 2016-05-31 2024-09-06 丹尼斯科美国公司 蛋白酶变体及其用途
CN110846299A (zh) * 2019-11-22 2020-02-28 江南大学 一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用
CN110846299B (zh) * 2019-11-22 2021-09-24 江南大学 一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用
CN115960862A (zh) * 2022-12-30 2023-04-14 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种角质酶突变体及其在合成1，4-二乙酰哌嗪中的应用
CN115960862B (zh) * 2022-12-30 2024-05-24 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种角质酶突变体及其在合成1，4-二乙酰哌嗪中的应用

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