CN107849549A - 吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本文披露了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、编码其的核酸以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改进的稳定性和/或污垢去除性的一种或多种吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体。

Description

吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶
本文披露了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、编码其的核酸、以及与其生产和使用有关的组合物和方法，包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改进的稳定性和/或污垢去除的一种或多种吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶变体。含有丝氨酸蛋白酶的组合物适合用于清洁织物和硬表面，以及用于各种工业应用。
丝氨酸蛋白酶是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶(EC编号3.4.21)。基于它们的结构，存在两大类丝氨酸蛋白酶：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶样。原型枯草杆菌蛋白酶(EC编号3.4.21.62)最初从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)获得。枯草杆菌蛋白酶及其同源物是MEROPS分类方案的S8肽酶家族的成员。家族S8的成员在其氨基酸序列中具有顺序为Asp、His和Ser的催化三联体。
尽管在工业酶领域很久以来就已经知道丝氨酸蛋白酶，但是仍然需要适合于特定条件和用途的另外的丝氨酸蛋白酶。
本发明的变体、组合物和方法涉及通过常规分子生物学技术产生的重组丝氨酸蛋白酶(参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning[分子克隆]：Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社])。含有本文披露的吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶的组合物适合用于清洁织物和硬表面，以及用于各种工业应用。
一些实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:85在选自以下的位置处的包含相对于SEQ ID NO:85在选自以下的位置处的两个、三个或四个或更多个变异：(i)1、4、9、21、24、27、36、37、39、42、43、44、47、54、55、56、74、80、85、87、99、102、114、117、119、121、126、128、131、143、144、158、159、160、169、182、188、190、197、198、212、224、231、232、237、242、245、246、254、255、256、和257；(ii)37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；(iii)39、99、126、和128；(iv)39，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；(v)56，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、80、85、87、99、114、126、128、和242；(vi)114，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、126、128、和242；(vii)126，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、128、和242；(viii)242，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；(ix)99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：39、56、114、126和242；(x)39+242，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；或(xi)39+99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、47、56、80、85、87、114、126、和242；条件是所述两个、三个或四个或更多个变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
其他实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，该氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个在选自以下的位置处的氨基酸取代：(i)1、4、9、21、24、27、36、37、39、42、43、44、47、54、55、56、74、80、85、87、99、102、114、117、119、121、126、128、131、143、144、158、159、160、169、182、188、190、197、198、212、224、231、232、237、242、245、246、254、255、256、和257；(ii)37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；(iii)39、99、126、和128；(iv)39，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；(v)56，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、80、85、87、99、114、126、128、和242；(vi)114，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、126、128、和242；(vii)A/S126，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、128、和242；(viii)N242，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；(ix)99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：39、56、114、126和242；(x)39+242，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；或(xi)39+99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、47、56、80、85、87、114、126、和242；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
进一步的实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含：(i)相对于SEQ ID NO:85在选自56、114、和126的位置处的一个或多个变异；(ii)相对于SEQ ID NO:85在选自56N/Y、114A/P/Q、和126T的位置处的一个或多个变异；(iii)在选自56、114、和126的位置处的一个或多个氨基酸取代；(iv)在选自T56、A/T114、和A/S126的位置处的一个或多个氨基酸取代；(v)选自56N/Y、114A/P/Q、和126T的一个或多个氨基酸取代；或(vi)选自T56N/Y、A/T114A/P/Q、和A/S126T的一个或多个氨基酸取代；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代或变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体是吉氏芽孢杆菌进化枝的成员。在仍进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与SEQID NO:18或85的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性。在又仍进一步的实施例中，至少一种本文所述的变体具有蛋白水解活性，或与具有SEQ ID NO:18或85的序列的蛋白酶的蛋白水解或清洁活性相比具有增加的蛋白水解或清洁活性。在另一个实施例中，该蛋白水解活性是酪蛋白水解。
另一个实施例涉及包含表面活性剂和至少一种本文所述的变体的组合物。在一些实施例中，组合物进一步包含至少一种钙离子和/或锌离子、至少一种稳定剂、至少一种漂白剂、磷酸盐或硼。在一些实施例中，组合物不含磷酸盐和/或不含硼。在一些实施例中，组合物是颗粒、粉末、固体、棒状、液体、片剂、凝胶、糊剂或单位剂量组合物。在一些实施例中，该组合物进一步包含一种或多种另外的酶或酶衍生物。
一些实施例涉及清洁的方法，该方法包括使表面或物品与本文所述的至少一种组合物接触。其他实施例涉及用于产生本文所述的变体的方法，该方法包括用包含编码至少一种本文所述的变体的多核苷酸的表达载体稳定地转化宿主细胞。仍进一步的实施例涉及包含编码至少一种本文所述的变体的核酸序列的多核苷酸。
图1提供了BSP-00801(黑线)与迟缓芽孢杆菌(B.lentus)枯草杆菌蛋白酶(中灰线)和枯草杆菌蛋白酶BPN'(浅灰线)的主链折叠的比较。显示BSP-00801中催化三联体的侧链供参考。除了几个外部环，所有三个枯草杆菌蛋白酶中的折叠模式都是保守的。
图2提供了吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶BSP-00801中取代的结构性定位。发现相对于亲本蛋白酶，BSP-00801中的十个取代中的八个(A37T/N、S39E、I43V、A47V、I80V、N85S、E87D和T114A)沿着在第一钙结合位点附近的分子的一个表面。
图3提供了BSP-00801结构的第二个视图，其中催化三联体显示为浅色棒并且所述十个取代的侧链显示为黑色棒。该视图俯视底物结合表面，并且可以看到S99R和F128A位于形成对应于亚位点S4-S1的底物结合表面的三个环中的两个上。
图4提供了BSP-00801上的另外的取代的位置。发现了六个另外的取代增强该变体的性能。发现这些取代中的三个(N42T、S56Y和N74D)是沿着该分子的一个表面，并且发现另外三个(V102I、S126T和S158T)在形成该底物结合区域的环上。
图5提供了具有催化三联体的BSP-00801结构的第二个视图，并且所述10个取代的侧链显示为浅灰色棒。进一步增强所述性能的另外的位点显示为黑色棒。该视图俯视该底物结合表面，并且可以看见三个另外的位点(V102I、S126T和S158T)在形成亚位点S4-S1的三个环中的每一个上的定位。
图6A-F提供了表3的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的预测的成熟形式的氨基酸序列；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶DSM 9728、DSM 9729、DSM 9730、DSM 9731和Bgi02446；以及表6-1和6-2中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列的比对。在比对下面显示了共有序列。
图7A-F提供了表4的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的预测的成熟形式的氨基酸序列；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶Bgi02446；以及表6-1中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列的比对。在比对下面显示了共有序列。
图8A-F提供了表5的多种吉氏芽孢杆菌进化枝BSP-00801变体枯草杆菌蛋白酶的预测的成熟形式的氨基酸序列；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶Bgi02446；以及表6-1中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列的比对。在比对下面显示了共有序列。
图9提供了以下各项的系统发生树：表3的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶DSM 9728、DSM 9729、DSM 9730、DSM 9731和Bgi02446；以及各种其他细菌丝氨酸蛋白酶。
图10提供了以下各项的系统发生树：表4的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶Bgi02446；以及各种其他细菌丝氨酸蛋白酶。
图11提供了以下各项的系统发生树：表5的多种吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶Bgi02446；以及各种其他细菌丝氨酸蛋白酶。
图12A-C提供了表3的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶预测的成熟形式的氨基酸序列与Bgi02446的结构比对，其中显示这些序列共享在Asp(D)32和His(H)65之间延伸的共同基序。
图13提供了N242D取代相对于在这个方向上可见的BSP-00801中的其他位点中的一些的定位。N242D位于远离该底物结合表面和在第一钙结合位点附近的表面。发现N242D靠近第二钙结合位点。
图14A-F提供了Bgi02446、吉氏芽孢杆菌进化枝BSP-00801变体枯草杆菌蛋白酶以及表7的多种吉氏芽孢杆菌进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列的比对。
图15提供了以下各项的系统发生树：表7的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶DSM 9728、DSM 9729、DSM 9730、DSM 9731和Bgi02446；表6-1和6-2中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列；以及BgAP变体ML2、ML4、MT1、MT2、MF1的氨基酸序列。
本文描述了与通过常规分子生物学技术产生的重组丝氨酸蛋白酶有关的变体、组合物和方法(参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning[分子克隆]：Cold SpringHarbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社])。含有本文披露的丝氨酸蛋白酶的组合物适合用于清洁织物和硬表面，以及用于各种工业应用，例如，像纺织品、皮革和羽毛处理。本文披露的至少一种吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶也非常适合包含在用于蛋白质降解的组合物中，所述组合物包括但不限于衣物和餐具洗涤剂；个人护理组合物；和人类食物和动物饲料。
在详细地描述本发明的组合物和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。除非本文另有定义，否则本文所使用的全部科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非另有说明，本披露的实践涉及通常用于分子生物学、蛋白质工程和微生物学的常规技术。尽管与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本披露的实践中，但是本文描述了一些合适的方法和材料。通过参考作为一个整体的说明书，更全面地描述下面即将定义的术语。
除非上下文另有明确指示，如本文所使用的，单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数。除非另有说明，否则分别是，核酸序列从左至右以5'至3'取向写出；并且氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向书写。应当理解的是，在没有相反的指示的情况下，本披露不限于本文所述的具体方法、方案和试剂。
在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。
如本文所使用的，关于数值，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5，除非pH值另有具体定义。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种氨基酸取代或一种或多种变异的命名使用以下中的一种或多种：位置；位置：一种或多种氨基酸取代或一种或多种变异；或一种或多种起始氨基酸：位置：一种或多种氨基酸取代。对“位置”(即5、8、17、22等)的提及涵盖了可能存在于该位置处的任何起始氨基酸，以及来自该起始氨基酸的任何变异或可能存在于该位置处的任何取代。对“位置：一种或多种氨基酸取代和/或一种或多种变异”(即1S/T/G、3G、17T等)的提及涵盖了可能存在于该位置处的任何起始氨基酸和可能与该起始氨基酸不同和/或可能取代该起始氨基酸的一种或多种氨基酸。氨基酸取代将排除该起始氨基酸，其中经取代的氨基酸和起始氨基酸相同。对起始氨基酸或氨基酸取代或氨基酸变异的提及可以进一步表示为由斜线(“/”)分开的若干种起始、经取代的或经变异的氨基酸。例如，D275S/K表示位置275被丝氨酸(S)或赖氨酸(K)取代，并且P/S197K表示位置197处的起始氨基酸脯氨酸(P)或丝氨酸(S)被赖氨酸(K)取代。
给定的氨基酸序列中的氨基酸残基的位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。即，SEQ ID NO:85的氨基酸序列用作参比序列。例如，使用如本文所述的比对算法将本文所述的BG46进化枝枯草杆菌蛋白酶或一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:85的氨基酸序列进行比对，并且与SEQ ID NO:85中的氨基酸残基比对(优选地，最佳比对)的给定的氨基酸序列中的每个氨基酸残基通过参照相应氨基酸残基的数字位置而方便地编号。当与查询序列比较时，例如像本文所述的序列比对算法将鉴定在主题序列中发生插入或缺失的位置。此外，出于编号的目的，将在N-末端具有QTVP的吉氏芽孢杆菌进化枝的成员，例如，像SEQ ID NO:19，与图14中所示的SEQ ID NO:85进行比对。
当在短语“相对于SEQ ID NO:85的两个、三个、或四个或更多个氨基酸变异”中使用时，术语“一个或多个变异”涵盖与存在于SEQ ID NO:85中相应位置处的氨基酸不同的每个氨基酸。例如，将目的变体的序列与SEQ ID NO:85进行比对，并且将该变体中的每个位置与SEQ ID NO:85进行比较，以鉴定每个位置处与存在于SEQ ID NO:85中相应位置处的氨基酸不同的氨基酸，并且与SEQ ID NO:85中相应氨基酸不同的每个氨基酸为变异。
如本文使用的，术语“蛋白酶”(protease和proteinase)是指具有分解蛋白质和肽的能力的酶。蛋白酶具有通过在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解进行“蛋白水解”的能力。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。存在许多熟知的程序用于测量蛋白水解活性。例如，蛋白水解活性可以通过分析各自蛋白酶水解合适底物的能力的比较试验来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(西格玛公司(Sigma)C-9801)、牛胶原(西格玛公司(Sigma)C-9879)、牛弹性蛋白(西格玛公司(Sigma)E-1625)和牛角蛋白(ICN生物医学公司(ICN Biomedical)902111)。使用这些底物的比色测定是本领域熟知的(参见例如WO 99/34011和USPN 6,376,450)。pNA肽基测定(参见例如，Del Mar等人，Anal Biochem[分析生物化学]，99:316-320，1979)还可用于确定活性酶浓度。该测定测量当酶水解可溶性合成底物例如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上在410nm下测量来自水解反应的黄色的生成速率并且该速率与活性酶浓度成正比。另外，在280纳米(nm)处的吸光度测量可以用于确定纯化蛋白质样品中的总蛋白质浓度。底物/蛋白质浓度的活性给出了酶比活性。
关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然存在的或人造的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参比多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参比多肽或多核苷酸的身份将从上下文中显而易见。
如本文所使用的，“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属中的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、库拉奇芽孢杆菌(B.clarkii)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。据认识，芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”)等此类生物体。在胁迫环境条件下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽胞杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
如本文使用的，术语“突变”是指对参比氨基酸或核酸序列进行的改变。该术语旨在涵盖取代、插入和缺失。
如本文使用的，术语“载体”是指用于将一个或多个核酸引入或转移到靶细胞或组织中的核酸构建体。典型地，载体用于将外源DNA引入细胞或组织中。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如病毒载体)、粘粒、表达载体、穿梭载体等。典型地，载体包括复制起点、多克隆位点和可选择标记。典型地，将载体插入靶细胞的过程被称为转化。在一些实施例中，本发明包括：包含有效地连接至合适的前序列(例如分泌、信号肽序列等)的编码丝氨酸蛋白酶多肽(例如，前体或成熟丝氨酸蛋白酶多肽)的DNA序列的载体，该载体能够在合适的宿主中实现DNA序列的表达、以及重组多肽链的折叠和易位。
如本文使用的，术语“表达盒”、“表达质粒”或“表达载体”是指重组或合成产生的用于在靶细胞中表达目的核酸的核酸构建体或载体。典型地，表达载体或表达盒包含驱动外源核酸表达的启动子核苷酸序列。典型地，表达载体或载体盒还包括任何其他的允许靶细胞中特定核酸转录的特定核酸元件。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。许多原核和真核表达载体是可商购的。
如本文使用的，“质粒”是指能够独立于染色体DNA进行复制的染色体外DNA分子。质粒是双链的(ds)，可以是环状的，并且通常被用作克隆载体。
如本文使用的，在将核酸序列引入细胞中的上下文中，术语“引入”是指适合于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。此类引入方法包括但不限于：原生质体融合、转染、转化、电穿孔、轭合和转导。转化是指由摄取、任选的基因组掺入和遗传物质(例如DNA)的表达引起的细胞的遗传改变。
如本文使用的，当将核酸置于与另一个核酸序列的功能关系中时，该核酸与该另一个核酸序列“有效地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，启动子或增强子有效地连接到核苷酸编码序列。如果核糖体结合位点被定位以便促进编码序列的翻译，该核糖体结合位点可以有效地连接到编码序列。典型地，“有效地连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不需要是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果此类位点不存在，则可以按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文使用的，术语“基因”是指编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域的多核苷酸(例如，DNA区段)。在一些情况下，基因包括个体编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
如本文使用的，“重组体”当关于细胞使用时，典型地表明细胞已经通过引入外源核酸序列而被修饰，或者细胞衍生自如此修饰的细胞。例如，重组细胞可以包含在天然(非重组)形式的细胞中不以相同形式存在的基因，或者重组细胞可以包含已经被修饰并且重新引入细胞中的天然基因(发现于细胞的天然形式中)。重组细胞可以包含细胞内源的核酸，该核酸已经被修饰而不从细胞中除去该核酸；此类修饰包括通过基因取代、位点特异性突变以及本领域普通技术人员已知的相关技术获得的那些。重组DNA技术包括用于在体外生产重组DNA并且将该重组DNA转移到其可以被表达或传播的细胞中从而生产重组多肽的技术。多核苷酸或核酸的“重组”(recombination和recombining)通常是指装配或组合两个或更多个核酸或多核苷酸链或片段以产生新的多核苷酸或核酸。
如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员已知的方法操纵时，核酸或多核苷酸可以被转录和/或翻译以生产多肽或其片段，那么将该核酸或多核苷酸称为“编码”该多肽。这样的核酸的反义链也被称为编码该序列。
术语“宿主菌株”和“宿主细胞”是指对于包含感兴趣的DNA序列的表达载体而言合适的宿主。
“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。贯穿本披露使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(JointCommission on Biochemical Nomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。
“前序列”或“前肽序列”是指在信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的、蛋白酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前序列或前肽序列的切割产生成熟的活性蛋白酶。细菌丝氨酸蛋白酶通常表达为前酶。
术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。典型地，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白质中一般不存在信号序列。典型地，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。
术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或肽的功能形式。
术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到该蛋白质的氨基或羧基末端的原序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有有效地连接到原序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。
关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”表示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文使用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质或核酸序列)。相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
如本文使用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文使用的，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。
术语“衍生自”和“获自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，该术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。举例来说，“来源于芽孢杆菌属的蛋白酶”是指由芽孢杆菌属天然生产的具有蛋白水解活性的那些酶，以及丝氨酸蛋白酶，如由芽孢杆菌属来源生产但是通过使用遗传工程技术由用编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的其他宿主细胞生产的那些。
在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”是指在两个序列中的核酸或氨基酸在比对最大对应关系时相同，如使用序列比较或分析算法测量的。
如本文使用的，“％同一性”或“百分比同一性”或“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见，Altschul等人，J Mol Biol[分子生物学杂志]，215:403-410，1990；以及Karlin和Altschul，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院刊]，90:5873-5787，1993)。BLAST程序使用多个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]，25:3389-3402，1997；以及Schaffer等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]29:2994-3005，2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；打分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放(GapOpening)＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长大小＝3；E值截止值＝10；打分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。
如本文使用的，“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul SF、Madde TL、Shaffer AA、Zhang J、Zhang Z、Miller W、Lipman DJ，Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein databasesearch programs[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序]，NucleicAcids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建系统发生树。可以在例如Vector NTI Advance套件等程序中输入氨基酸序列，并且可以使用邻接(Neighbor Joining，NJ)法创建引导树(Saitou和Nei，Mol Biol Evol[分子生物学与进化]，4:406-425，1987)。可以使用针对序列距离的木村(Kimura)校正并且忽略具有空位的位置来计算树结构。程序例如AlignX可以在系统发生树上显示的分子名称之后的括号内显示计算的距离值。
了解分子之间的同源性可以揭示分子的进化历史以及它们的功能信息；如果新测序的蛋白质与已经表征的蛋白质同源，则存在新蛋白质的生物化学功能的强烈指示。两个实体之间最基本的关系是同源性；如果两个分子来源于共同的祖先，则它们被称为是同源的。同源分子或同系物可以分为两类：旁系同源物和直系同源物。旁系同源物是存在于一个物种内的同系物。旁系同源物在它们的详细生物化学功能上往往不同。直系同源物是存在于不同物种内并且具有非常相似或完全相同功能的同系物。蛋白质超家族是可以推断出共同祖先的蛋白质的最大分组(进化枝)。通常这个共同祖先是基于序列比对和机械相似性。典型地，超家族包含几个在该家族内显示序列相似性的蛋白质家族。基于MEROPS蛋白酶分类系统，术语“蛋白质宗族”通常用于蛋白酶超家族。
CLUSTAL W算法是序列比对算法的另一个实例(参见Thompson等人，NucleicAcids Res[核酸研究]，22:4673-4680，1994)。CLUSTAL W算法的默认参数包括：空位开放罚分＝10.0；空位延伸罚分＝0.05；蛋白质重量矩阵＝BLOSUM系列；DNA重量矩阵＝IUB；延迟发散序列％＝40；空位分隔距离＝8；DNA转换重量＝0.50；列表亲水残基＝GPSNDQEKR；使用负性矩阵＝关；切换特殊残基罚分＝开；切换亲水罚分＝开；以及切换结束空位分隔罚分＝关。在CLUSTAL算法中，包括在任一末端发生的缺失。例如，500个氨基酸的多肽的任一末端(或多肽内)具有5个氨基酸缺失的变体相对于“参比”多肽具有99％(495/500个相同残基×100)的百分比序列同一性。这样的变体将被与该多肽具有“至少99％的序列同一性”的变体所涵盖。
当核酸或多核苷酸至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。类似地，当多肽、蛋白质或肽至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔计，在组合物中分离的种类比其他种类更丰富。例如，分离的种类可以包含存在的所有大分子种类的至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％(以摩尔计)。优选地，将目的种类纯化至基本均一性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物种类)。可以分别使用本领域熟知的许多技术例如核酸或蛋白质样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过染色后可视化来确定纯度和均一性。如果需要，可以使用高分辨率技术例如高效液相色谱法(HPLC)或类似方法来纯化物质。
术语“纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子浓度的大幅度增加时，对于该分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定物质或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
短语“一种或多种基本上不含硼的组合物”或“一种或多种基本上不含硼的洗涤剂”是指一种或多种分别含有痕量硼(例如，小于约1000ppm(1mg/kg或L(等于1ppm))、小于约100ppm、小于约50ppm、小于约10ppm、或小于约5ppm、或小于约1ppm)的组合物或洗涤剂，这些硼可能来自其他组合物或洗涤剂成分。
如本文使用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定系统。例如，在蛋白酶的情况下，功能测定涉及确定蛋白酶水解蛋白质底物的有效性。
术语“清洁活性”是指在本披露的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间主要的条件下由丝氨酸蛋白酶多肽或参比蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽或参比蛋白酶的清洁性能可以通过使用用于清洁在物品或表面上的一种或多种不同酶敏感性污渍(例如，由食物、草地、血液、墨汁、奶、油和/或卵蛋白引起的污渍)的各种测定来确定。变体或参比蛋白酶的清洁性能可以通过使在物品或表面上的污渍经受一个或多个标准洗涤条件并且通过使用各种色谱、分光光度计或其他定量方法来评估污渍除去的程度来确定。示例性清洁测定和方法是本领域已知的，并且包括但不限于在WO 99/34011和US6,605,458(两者通过引用结合在此)中描述的那些，以及包括在下面所提供的实例中的那些清洁测定和方法。
术语丝氨酸蛋白酶多肽或参比蛋白酶的“清洁有效量”是指在特定清洁组合物中达到希望的酶活性水平的蛋白酶的量。此类有效量可以由本领域普通技术人员容易地确定，并且基于许多因素，例如所使用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成、以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、片剂、棒状)组合物等。
术语“清洁辅助材料”是指除了本披露的丝氨酸蛋白酶多肽之外在清洁组合物中包含的任何液体、固体或气体物质。在一些实施例中，本披露的清洁组合物包括一种或多种清洁辅助材料。典型地，取决于清洁组合物的具体类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、棒状、糊剂、喷雾、片剂、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁辅助材料。优选地，每种清洁辅助材料与在组合物中使用的蛋白酶相容。
清洁组合物和清洁配制品包括适合于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体、物品和/或表面的任何组合物。此类组合物和配制品包括但不限于例如液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片剂、凝胶、棒状、颗粒和/或固体衣物清洁剂或洗涤剂组合物)和精细织物洗涤剂组合物；硬表面清洁组合物和配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织品、衣物增效清洁或洗涤剂组合物，衣物添加剂清洁组合物和衣物预去污(pre-spotter)清洁组合物；餐具洗涤组合物，包括手洗或手动餐具洗涤组合物(例如“手洗”或“手动”餐具洗涤剂)和自动餐具洗涤组合物(例如“自动餐具洗涤剂”)。本发明还可使用单一剂量单位形式，包括但不限于丸剂、片剂、囊形片(gelcap)或其他单一剂量单位例如预先测量的粉末或液体。
除非另有说明，否则如本文使用的清洁组合物或清洁配制品包括颗粒或粉末形式的通用的或重垢洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片剂、糊剂或单位剂量形式的通用洗涤剂，特别是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢干燥(HDD)洗涤剂类型；液体精细织物洗涤剂；手洗或手动餐具洗涤剂，包括高起泡类型的那些；手洗或手动餐具洗涤剂、自动餐具洗涤剂、或餐具或桌面器具洗涤剂，包括用于家庭和机构使用的各种片剂、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁棒、漱口水、假牙清洁剂、洗车香波、地毯香波、浴室清洁剂；用于人类和其他动物的毛发香波和/或毛发染发剂；沐浴露和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒组合物是处于“紧密”形式；在一些实施例中，液体组合物是处于“浓缩”形式。
如本文使用的，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，其包括衣物添加剂组合物和适合用于带有污渍的织物(例如衣服、亚麻制品和其他纺织材料)的浸泡和/或预处理的组合物。
如本文使用的，“非织物清洁组合物”包括非纺织品(即非织物)表面清洁组合物，包括但不限于例如手洗或手动或自动餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物、隐形眼镜清洁组合物、伤口清创组合物和个人清洁组合物。
如本文使用的，关于旨在用于清洁污染或肮脏物体(包括特定织物和/或非织物物体或物品)的洗涤介质中使用的组合物，使用术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂配制品”。本披露的此类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或配制品。实际上，在一些实施例中，本披露的洗涤剂包含本披露的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽，另外还包含一种或多种表面活性剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在一些情况下，助洗剂盐是硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选具有比磷酸盐(例如三聚磷酸钠)更多的硅酸盐(例如偏硅酸钠)。本披露的一些组合物，例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物，不包含任何磷酸盐(例如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。
如本文使用的，术语“漂白”是指处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面持续足够长的时间和/或在适当的pH和/或温度条件下处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增白(即变白)和/或清洁。适合于漂白的化学品的实例包括但不限于例如ClO2、H2O2、过酸、NO2等。
如本文使用的，蛋白酶(例如，本披露的丝氨酸蛋白酶多肽)的“洗涤性能”是指与不添加丝氨酸蛋白酶多肽至组合物的洗涤剂相比，丝氨酸蛋白酶多肽对洗涤提供另外的清洁性能的贡献。在相关洗涤条件下比较洗涤性能。在一些测试系统中，其他相关因素，例如洗涤剂组合物、泡沫浓度(sud concentration)、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度能按以下这样的方式进行控制：模仿在某些细分市场(例如手洗或手动餐具洗涤、自动餐具洗涤、餐具清洁、桌面器具清洁、织物清洁等)中对于家庭应用典型的一种或多种条件。
本文中使用的术语“相关洗涤条件”表示在手洗餐具洗涤、自动餐具洗涤或衣物洗涤剂细分市场中实际用于家庭中的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
如本文使用的，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及在物品表面上抑制或杀死微生物。本披露并不旨在限于任何特定表面、物品或待除去的一种或多种污染物或微生物。
本文清洁组合物的“紧密”形式最好通过密度来反映，并且就组合物而言通过无机填料盐的量来反映。无机填料盐是处于粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐以相当大的量存在，典型地为总组合物的约17％至约35％(以重量计)。相比之下，在紧密的组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过组合物(以重量计)的约10％、或更优选地约5％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自硫酸盐和氯化物的碱盐和碱土金属盐。在一些实施例中，填料盐是硫酸钠。
本文披露了可用于清洁应用和清洁方法以及各种工业应用的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在一个实施例中，本文所述的一种或多种丝氨酸蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶变体是吉氏芽孢杆菌进化枝的成员。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体是分离的、重组的、基本上纯的和/或非天然存在的多肽。在一些实施例中，可以将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体掺入一种或多种清洁组合物中，所述清洁组合物可用于一种或多种清洁对其有需要的物品或表面的方法中。
一些实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:85在选自以下的位置处的两个、三个或四个或更多个变异：(i)1、4、9、21、24、27、36、37、39、42、43、44、47、54、55、56、74、80、85、87、99、102、114、117、119、121、126、128、131、143、144、158、159、160、169、182、188、190、197、198、212、224、231、232、237、242、245、246、254、255、256、和257；(ii)37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；(iii)39、99、126、和128；(iv)39，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；(v)56，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、80、85、87、99、114、126、128、和242；(vi)114，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、126、128、和242；(vii)126，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、128、和242；(viii)242，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；(ix)99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：39、56、114、126和242；(x)39+242，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；或(xi)39+99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、47、56、80、85、87、114、126、和242；条件是所述两个、三个或四个或更多个变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:85的氨基酸序列相对应来编号。又其他实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:85在选自以下的位置处的两个、三个或四个或更多个变异：(i)1A、4I、9S、21V、24F、27K、36A、37T/N、39E、42T、43V、44S、47V、54S、55M/G、56N/Y、74D、80V、85S、87D、99R、102I、114A/P/Q、117I、119V、121S、126T、128A、131T、143A/T/Q、144G、158T、159I、160S、169L、182S、188A、190L、197I、198G、212S/T/K、224I/V、231K、232N、237T、242D/Q、245L、246S/K、254T、255N、256L、和257Y；(ii)37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；或(iii)39E、99R、126T、和128A；(iv)39E，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；(v)56N/Y，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、39E、47V、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；(vi)114A/P/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、126T、128A、和242D/Q；(vii)126T，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、128A、和242D/Q；(viii)242D/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、和128A；(ix)99R+128A，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：39E、56N/Y、114A/P/Q、126T、和242D/Q；(x)39E+242D/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、和128A；或(xi)39E+99R+128A，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、114A/P/Q、126T、和242D/Q；条件是所述两个、三个或四个或更多个变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
其他实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，该氨基酸序列在选自以下的位置处包含两个、三个或四个或更多个氨基酸取代：(i)1、4、9、21、24、27、36、37、39、42、43、44、47、54、55、56、74、80、85、87、99、102、114、117、119、121、126、128、131、143、144、158、159、160、169、182、188、190、197、198、212、224、231、232、237、242、245、246、254、255、256、和257；(ii)37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；(iii)39、99、126、和128；(iv)39，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；(v)56，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、80、85、87、99、114、126、128、和242；(vi)114，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、126、128、和242；(vii)A/S126，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、128、和242；(viii)N242，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；(ix)99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：39、56、114、126和242；(x)39+242，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；或(xi)39+99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、47、56、80、85、87、114、126、和242；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
仍其他实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，该氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个在选自以下的位置处的氨基酸取代：(i)Q1、V4、S/T9、I/V21、S24、K/R27、S36、Q/T/S/A37、S/P/T39、N/T42、I43、R/S44、A/V47、P/S54、S/T55、T56、N74、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、I/V102、A/T114、M117、I119、N121、A/S126、A/F128、I/S/T131、Q/R143、D/G144、N/S158、I/V159、G160、M169、N/S182、S/T188、I190、V197、G/N198、N/P212、A/V224、K/R231、N/Y232、A/N237、N242、K245、N246、S254、S255、Q256、和F257；(ii)Q/T/S/A37、S/P/T39、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/S126、A/F128、和N242；(iii)S/P/T39、S/R99、A/S126、和A/F128；(iv)S/P/T39，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/S126、A/F128、和N242；(v)T56，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、S/P/T39、A/V47、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/S126、A/F128、和N242；(vi)A/T114，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、S/P/T39、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/S126、A/F128、和N242；(vii)A/S126，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、S/P/T39、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/F128、和N242；(viii)N242，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、S/P/T39、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/S126、和A/F128；(ix)S/R99+A/F128，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：S/P/T39、T56、A/T114、A/S126和N242；(x)S/P/T39+N242，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/S126、和A/F128；或(xi)S/P/T39+S/R99+A/F128，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、A/T114、A/S126、和N242；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。又另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：(i)1A、4I、9S、21V、24F、27K、36A、37T/N、39E、42T、43V、44S、47V、54S、55M/G、56N/Y、74D、80V、85S、87D、99R、102I、114A/P/Q、117I、119V、121S、126T、128A、131T、143A/T/Q、144G、158T、159I、160S、169L、182S、188A、190L、197I、198G、212S/T/K、224I/V、231K、232N、237T、242D/Q、245L、246S/K、254T、255N、256L、和257Y；(ii)37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；(iii)39E、99R、126T、和128A；(iv)39E，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；(v)56N/Y，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、39E、47V、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；(vi)114A/P/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、126T、128A、和242D/Q；(vii)126T，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、128A、和242D/Q；(viii)242D/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、和128A；(ix)99R+128A，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：39E、56N/Y、114A/P/Q、126T、和242D/Q；(x)39E+242D/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、和128A；或(xi)39E+99R+128A，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、114A/P/Q、126T、和242D/Q；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。仍又另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，该氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：Q1A、V4I、T9S、I21V、S24F、R27K、S36A、Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、N42T、I43V、R44S、A47V、P54S、S/T55G/M、T56N/Y、N74D、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、V102I、A/T114A/P/Q、M117I、I119V、N121S、A/S126T、F128A、I/S131T、Q/R143A/Q/T、D144G、N/S158T、V159I、G160S、M169L、N182S、S/T188A、I190L、V197I、N198G、N/P212K/S/T、A/V224I/V、R231K、Y232N、A/N237T、N242D/Q、K245L、N246K/S、S254T、S255N、Q256L、和F257Y；(ii)Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、A/S126T、F128A、和N242D/Q；(iii)S/P/T39E、S99R、A/S126T、和F128A；(iv)S/P/T39E，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、A/S126T、F128A、和N242D/Q；(v)T56N/Y，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、A47V、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、A/S126T、F128A、和N242D/Q；(vi)A/T114A/P/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/S126T、F128A、和N242D/Q；(vii)A/S126T，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、F128A、和N242D/Q；(viii)N242D/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、A/S126T、和F128A；(ix)S99R+F128A，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：S/P/T39E、T56N/Y、A/T114A/P/Q、A/S126T和N242D/Q；(x)S/P/T39E+N242D/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：Q/T/S/A37T/N、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、A/S126T、和F128A；或(xi)S/P/T39E+S99R+F128A，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、A/T114A/P/Q、A/S126T、和N242D/Q；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
另一个实施例涉及本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，条件是：(i)所述相对于SEQ ID NO:85的两个、三个或四个或更多个变异不是S39T+I21V+M122L+N177E；(ii)所述相对于SEQ ID NO:85的两个、三个或四个或更多个变异不是S39E+N74D+D87E；(iii)所述相对于SEQ ID NO:85的两个、三个或四个或更多个变异不是S39E+N74D+D87E+N253D；(iv)所述相对于SEQ ID NO:85的两个、三个或四个或更多个变异不是I21V+S39E+N74D+D87E+M122L+N253D；(v)所述相对于SEQ ID NO:85的两个、三个或四个或更多个变异不是Q37E+Q256E；和/或(vi)当所述变体包含相对于SEQ ID NO:85在选自位置4、36、42、47、56、87、99、102、114、188、224、237、242、和255中的一个或多个位置处的变异时，所述相对于SEQID NO:85在位置21处的变异不是缬氨酸。甚至进一步的实施例涉及本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，条件是：(i)所述两个、三个或四个或更多个取代不是S39T+I21V+M122L+N177E；(ii)所述两个、三个或四个或更多个取代不是S39E+N74D+D87E；(iii)所述两个、三个或四个或更多个取代不是S39E+N74D+D87E+N253D；(iv)所述两个、三个或四个或更多个取代不是I21V+S39E+N74D+D87E+M122L+N253D；(v)所述两个、三个或四个或更多个取代不是Q37E+Q256E；和/或(vi)当所述变体包含在选自位置4、36、42、47、56、87、99、102、114、188、224、237、242、和255中的一个或多个位置处的取代时，所述在位置21处的取代不是缬氨酸。
进一步的实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，该氨基酸序列包含：(i)相对于SEQ ID NO:85在选自位置56、114、和126处的一个或多个变异；(ii)相对于SEQ ID NO:85在选自位置56N/Y、114A/P/Q、和126T处的一个或多个变异；(iii)在选自位置56、114、和126处的一个或多个氨基酸取代；(iv)在选自位置T56、A/T114、和A/S126处的一个或多个氨基酸取代；(v)选自56N/Y、114A/P/Q、和126T的一个或多个氨基酸取代；或(vi)选自T56N/Y、A/T114A/P/Q、和A/S126T的一个或多个氨基酸取代；条件是所述两个、三个或四个或更多个变异或取代中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
仍甚至进一步的实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自：N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-S158T-V159I-N242D-F257Y；N074D-N085S-E087D-S099R-V102I-S126T-F128A-I190L-N242D-F257Y；R027K-S099R-V102I-T114Q-I119V-S126T-F128A-S158T-V159I-G160S-T188A-N242D；N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-N242D；R027K-S099R-V102I-S126T-F128A-R143A-S158T-V159I-G160S；N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-I190L-N242D-F257Y；N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-R143A-I190L-N242D-F257Y；N074D-S099R-V102I-S126T-F128A-R143A-S158T-N212S；N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-R143A-N242D；N085S-E087D-S099R-T114Q-I119V-S126T-F128A-R143A-G160S-F257Y；N074D-I080V-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-R143A-N212S-N242D；N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-S126T-F128A-R143A-I190L-N242D-F257Y；N074D-I080V-S099R-V102I-T114Q-I119V-S126T-F128A-S158T-G160S-N212S-F257Y；I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-I119V-S126T-F128A-R143A-N242D；N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S158T-V159I-G160S-N212S-N242D-F257Y；R027K-N074D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-T188A-I190L-N212S-N242D；R027K-N074D-S099R-V102I-I119V-S126T-F128A-R143A-G160S-N212S-
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A；S039E-E087D-S099R-S126T；S039E-N085S-S099R-F128A；S039E-S099R-T114A-S126T；S039E-E087D-S099R-F128A；S039E-S099R-S126T-F128A；S039E-T056Y-E087D-T114Q；S039E-E087D-S099R-S126T-F128A；S039E-T056Y-S099R-S126T-F128A；S039E-E087D-S099R-F128A-N242D；A037T-S039E-E087D-S099R-T114A-F128A；S039E-T056Y-E087D-S099R-S126T-F128A；S039E-S099R-T114Q-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-S099R-T114Q-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-T056Y-S099R-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-T056Y-N085S-E087D-S099R-T114Q-F128A；A037T-S039E-A047V-T056Y-S099R-T114Q-S126T-F128A；A037T-S039E-A047V-T056Y-S099R-T114A-S126T-F128A；A037T-S039E-T056Y-S099R-T114Q-S126T-F128A-N242D；S039E-A047V-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-N242D；S039E-A047V-T056Y-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A；S039E-A047V-I080V-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-T056Y-N085S-S099R-T114Q-S126T-F128A-N242D；S039E-A047V-T056Y-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-N242D；S039E-A047V-T056Y-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A；A037T-S039E-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-T056Y-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-A047V-T056Y-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-N242D；及其组合，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
一个实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含氨基酸取代S39E+S99R+F128A，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:85的氨基酸序列相对应来编号。仍进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含氨基酸取代S39E+S99R+F128A+N242D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。又进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含氨基酸取代S39E+S99R+F128A+I43V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。仍进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含氨基酸取代S39E+S99R+F128A+A47V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。一些实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含氨基酸取代S39E+S99R+F128A+I80V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。仍进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含氨基酸取代S39E+S99R+F128A和选自以下的一个或多个氨基酸取代：(i)Q1A、V4I、T9S、I21V、S24F、R27K、S36A、A37T/N、N42T、I43V、R44S、A47V、P54S、T55M/G、T56N/Y、N74D、I80V、N85S、E87D、V102I、T114A/P/Q、M117I、I119V、N121S、S126T、S131T、R143A/T/Q、D144G、S158T、V159I、G160S、M169L、N182S、T188A、I190L、V197I、N198G、N212S/T/K、A224I/V、R231K、Y232N、A237T、N242D/Q、K245L、N246S/K、A254T、S255N、Q256L、和F257Y；(ii)Q1A、I21V、R27K、N42T、N74D、I80V、N85S、E87D、V102I、T114A/Q、M117I、I119V、S126T、S131T、R143A/Q、D144G、S158T、V159I、G160S、M169L、T188A、I190L、N198G、N212S、A224V、N242D、S254T、S255N、Q256L、和F257Y；(iii)V4I、T9S、S24F、R27K、S36A、A37T/N、N42T、I43V、R44S、A47V、P54S、T55M/G、T56N/Y、A57Q、N74D、I80V、N85S、E87D、V102I、T114A/P/Q、I119V、N121S、S126T、R143A/T/Q、S158T、V159I、G160S、N182S、T188A、I190L、V197I、N212S/T/K、A224I/V、R231K、Y232N、A237T、N242D/Q、K245L、N246S/K、S255N、和F257Y；(iv)T9S、R27K、A37T/N、N42T、I43V、A47V、T55G、T56Y、N74D、I80V、N85S、E87D、V102I、T114A/Q、I119V、S126T、R143A/Q、S158T、G160S、N212S、N242D、K245L、N246S、S255N、和F257Y；(v)T9S、R27K、N42T、T55G、I119V、G160S、K245L、N246S、S255N、和F257Y；(vi)N74D、V102I、R143A/Q、S158T、和N212S；(vii)A37T/N、I43V、A47V、I80V、N85S、E87D、和T114A；(viii)N42T、T56Y、N74D、V102I、S126T、S158T、和N242D；(ix)T56Y、T114Q、S126T、和N242D；(x)I43V、A47V、I80V和N242D；(xi)I43V；(xii)A47V；(xiii)I80V；(xiv)N242D；或(xv)组(i)至(xiv)中的一组或多组的组合；其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含氨基酸取代N242D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。仍进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含氨基酸取代N242D和选自以下的一个或多个氨基酸取代：(i)Q1A、V4I、T9S、I21V、S24F、R27K、S36A、A37T/N、S39E、N42T、I43V、R44S、A47V、P54S、T55M/G、T56N/Y、N74D、I80V、N85S、E87D、S99R、V102I、T114A/P/Q、M117I、I119V、N121S、S126T、F128A、S131T、R143A/T/Q、D144G、S158T、V159I、G160S、M169L、N182S、T188A、I190L、V197I、N198G、N212S/T/K、A224I/V、R231K、Y232N、A237T、K245L、N246S/K、A254T、S255N、Q256L、和F257Y；(ii)Q1A、I21V、R27K、S39E、N42T、N74D、I80V、N85S、E87D、S99R、V102I、T114A/Q、M117I、I119V、S126T、F128A、S131T、R143A/Q、D144G、S158T、V159I、G160S、M169L、T188A、I190L、N198G、N212S、A224V、S254T、S255N、Q256L、和F257Y；(iii)V4I、T9S、S24F、R27K、S36A、A37T/N、S39E、N42T、I43V、R44S、A47V、P54S、T55M/G、T56N/Y、A57Q、N74D、I80V、N85S、E87D、S99R、V102I、T114A/P/Q、I119V、N121S、S126T、F128A、R143A/T/Q、S158T、V159I、G160S、N182S、T188A、I190L、V197I、N212S/T/K、A224I/V、R231K、Y232N、A237T、K245L、N246S/K、S255N、和F257Y；(iv)T9S、R27K、A37T/N、S39E、N42T、I43V、A47V、T55G、T56Y、N74D、I80V、N85S、E87D、S99R、V102I、T114A/Q、I119V、S126T、F128A、R143A/Q、S158T、G160S、N212S、K245L、N246S、S255N、和F257Y；(v)S39E、S99R、F128A、T56Y、T114Q、和S126T；(vi)S39E、N42T、T56Y、N74D、S99R、V102I、S126T、F128A、和S158T；(vii)I43V、A47V、和I80V；(viii)I43V；(ix)A47V；(x)I80V；和/或(xi)组(i)至(x)中的一组或多组的组合；其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含氨基酸取代I80V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。仍进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含氨基酸取代I80V和选自以下的一个或多个氨基酸取代：(i)Q1A、V4I、T9S、I21V、S24F、R27K、S36A、A37T/N、S39E、N42T、I43V、R44S、A47V、P54S、T55M/G、T56N/Y、N74D、N85S、E87D、S99R、V102I、T114A/P/Q、M117I、I119V、N121S、S126T、F128A、S131T、R143A/T/Q、D144G、S158T、V159I、G160S、M169L、N182S、T188A、I190L、V197I、N198G、N212S/T/K、A224I/V、R231K、Y232N、A237T、N242D、K245L、N246S/K、A254T、S255N、Q256L、和F257Y；(ii)Q1A、I21V、R27K、S39E、N42T、N74D、N85S、E87D、S99R、V102I、T114A/Q、M117I、I119V、S126T、F128A、S131T、R143A/Q、D144G、S158T、V159I、G160S、M169L、T188A、I190L、N198G、N212S、A224V、N242D、S254T、S255N、Q256L、和F257Y；(iii)V4I、T9S、S24F、R27K、S36A、A37T/N、S39E、N42T、I43V、R44S、A47V、P54S、T55M/G、T56N/Y、A57Q、N74D、N85S、E87D、S99R、V102I、T114A/P/Q、I119V、N121S、S126T、F128A、R143A/T/Q、S158T、V159I、G160S、N182S、T188A、I190L、V197I、N212S/T/K、A224I/V、R231K、Y232N、A237T、N242D、K245L、N246S/K、S255N、和F257Y；(iv)T9S、R27K、A37T/N、S39E、N42T、I43V、A47V、T55G、T56Y、N74D、N85S、E87D、S99R、V102I、T114A/Q、I119V、S126T、F128A、R143A/Q、S158T、G160S、N212S、N242D、K245L、N246S、S255N、和F257Y；(v)S39E、S99R、F128A、T56Y、T114Q、S126T、和N242D；(vi)S39E、N42T、T56Y、N74D、S99R、V102I、S126T、F128A、S158T、和N242D；(vii)I43V、A47V、和N242D；(viii)I43V；(ix)A47V；(x)N242D；和/或(xi)组(i)至(x)中的一组或多组的组合；其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
仍进一步的实施例涉及本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体是吉氏芽孢杆菌进化枝的成员。另一个实施例涉及本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体进一步包含DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXPTTADLNXH GTH(SEQ ID NO:71)或DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXXTTADLXXHGTH(SEQ ID NO:72)基序，其中起始D是活性位点天冬氨酸残基，倒数第二个H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸。
在另一个实施例中，本文所述的一种或多种变体来自亲本氨基酸序列，其中所述亲本是吉氏芽孢杆菌进化枝的成员。在仍又另一个实施例中，本文所述的一种或多种变体来自如下亲本氨基酸序列，所述亲本氨基酸序列包含DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXPTTADLNXHGTH(SEQ ID NO:71)或DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXXTTADLXXHGTH(SEQ ID NO:72)基序，其中起始D是活性位点天冬氨酸残基，倒数第二个H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸。又在甚至仍进一步的实施例中，本文所述的一种或多种变体来自亲本氨基酸序列，其中所述亲本氨基酸序列与SEQID NO:18或85的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。
甚至仍进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含选自N74D、I80V、V102I、T114Q、I119V、S126T、R143A、S158T、G160S、N212S、N242D、S255N、和F257Y的一个或多个氨基酸取代，以及DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXPTTADLNXHGTH(SEQ ID NO:71)或DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXXTTADLXXHGTH(SEQ ID NO:72)基序，其中起始D是活性位点天冬氨酸残基，倒数第二个H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。又甚至仍进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含(i)选自N74D、I80V、V102I、T114Q、I119V、S126T、R143A、S158T、G160S、N212S、N242D、S255N、和F257Y的一个或多个氨基酸取代；(ii)选自N42T、N85S、E87D、S99R、和F128A的一个或多个氨基酸取代；以及(iii)DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXPTTADLNXHGTH(SEQ ID NO:71)或DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXXTTADLXXHGTH(SEQ ID NO:72)基序，其中起始D是活性位点天冬氨酸残基，倒数第二个H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。又另一个实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含选自N74D、I80V、V102I、T114Q、I119V、S126T、R143A、S158T、G160S、N212S、N242D、S255N、和F257Y的一个或多个氨基酸取代，以及DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXPTTADLNXHGTH(SEQ ID NO:71)基序，其中起始D是活性位点天冬氨酸残基，倒数第二个H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。仍又进一步的实施例涉及包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含选自N74D、I80V、V102I、T114Q、I119V、S126T、R143A、S158T、G160S、N212S、N242D、S255N、和F257Y的一个或多个氨基酸取代，以及DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXXTTADLXXHGTH(SEQ ID NO:72)基序，其中起始D是活性位点天冬氨酸残基，倒数第二个H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。仍进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含选自N74D、I80V、V102I、T114Q、I119V、S126T、R143A、S158T、G160S、N212S、N242D、S255N、和F257Y的一个或多个氨基酸取代；选自N42T、N85S、E87D、S99R、和F128A的一个或多个氨基酸取代；以及DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXPTTADLNXHGTH(SEQ ID NO:71)或DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXXTTADLXXHGTH(SEQ ID NO:72)基序，其中起始D是活性位点天冬氨酸残基，倒数第二个H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
在进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18或85的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸同一性。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18或85的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18或85的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性。在仍其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ IDNO:85的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性。在进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18或85的氨基酸序列具有90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性。在又甚至仍其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性。
如上文所述，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有酶活性(例如，蛋白酶活性)并且因此可用于清洁应用中，该清洁应用包括但不限于用于清洁餐具物品、桌面器具物品、织物和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板等的硬表面)的方法。一些实施例涉及一种或多种清洁组合物，该清洁组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的酶活性(例如，蛋白酶活性)可以容易地通过本领域普通技术人员熟知的程序来确定。下面提供的实例描述用于评估酶活性和清洁性能的方法。使用本领域中熟知的程序和/或通过使用例如像在实例中列出的那些程序，可以容易地确定本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在除去污渍(例如，蛋白质污渍例如血液/奶/墨汁或蛋黄)、清洁硬表面、或清洁衣物、餐具或一种或多种桌面器具物品方面的性能。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在表面活性剂的存在下具有蛋白酶活性。在其他实施例中，表面活性剂选自下组，该组由以下组成：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其组合。在一些实施例中，该蛋白酶活性包含酪蛋白水解活性。在一些实施例中，该蛋白酶活性包含二甲基酪蛋白水解活性。
在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与具有SEQ ID NO:85的序列的蛋白酶的蛋白水解活性相比，具有增加的蛋白水解活性，和/或与具有SEQ IDNO:85的序列的蛋白酶的清洁活性相比，具有增加的清洁活性。在仍其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与具有SEQ ID NO:18的序列的蛋白酶的蛋白水解活性相比，具有增加的蛋白水解活性，和/或与具有SEQ ID NO:18的序列的蛋白酶的清洁活性相比，具有增加的清洁活性。在甚至进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体当与参比枯草杆菌蛋白酶相比时具有一种或多种改进的性质；其中该改进的性质选自改进的蛋白酶活性、改进的洗涤剂清洁性能和改进的洗涤剂热稳定性；并且其中所述洗涤剂任选地是无硼洗涤剂。在又甚至进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体当与参比枯草杆菌蛋白酶相比时具有一种或多种改进的性质；其中该改进的性质选自改进的蛋白酶活性、改进的洗涤剂清洁性能和改进的洗涤剂热稳定性；并且其中所述洗涤剂是无硼洗涤剂。在仍其他的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体当与参比枯草杆菌蛋白酶相比时具有一种或多种改进的性质；其中该改进的性质是(i)改进的蛋白酶活性，其中所述变体针对N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物具有PI>1；(ii)改进的洗涤剂清洁性能，其中所述变体具有BMI和/或蛋污渍清洁PI>1；和/或(iii)改进的洗涤剂热稳定性，其中所述变体具有稳定性PI>1；并且其中所述洗涤剂任选地是无硼洗涤剂。在仍又甚至进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体当与参比枯草杆菌蛋白酶相比时具有一种或多种改进的性质；其中该改进的性质是(i)改进的蛋白酶活性，其中所述变体针对N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物具有PI>1；(ii)改进的洗涤剂清洁性能，其中所述变体具有BMI和/或蛋污渍清洁PI>1；和/或(iii)改进的洗涤剂热稳定性，其中所述变体具有稳定性PI>1；并且其中所述洗涤剂是无硼洗涤剂。另一个实施例涉及本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中蛋白酶活性根据实例3的蛋白酶活性测定进行测量；洗涤剂清洁性能根据实例4的衣物和ADW洗涤剂测定中的清洁性能进行测量；和/或洗涤剂热稳定性根据实例4的稳定性测定来测量。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在宽范围的pH条件内具有蛋白酶活性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体针对作为底物的偶氮酪蛋白具有蛋白酶活性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在从约4.0至约12.0的pH处具有蛋白酶活性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在从约8.0至约12.0的pH处具有蛋白酶活性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在从约8.0至约12.0的pH处具有至少50％、60％、70％、80％或90％的最大蛋白酶活性。在一些实施例中，一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在高于8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0或11.5的pH处具有蛋白酶活性。在一些实施例中，一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在低于12.0、11.5、11.0、10.5、10.0、9.5、9.0或8.5的pH处具有蛋白酶活性。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在从约10℃至约90℃的温度范围下具有蛋白酶活性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在从约50℃至约75℃的温度范围下具有蛋白酶活性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在从约50℃至约75℃的温度下具有至少50％、60％、70％、80％或90％的最大蛋白酶活性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在高于50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃的温度下具有活性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在低于75℃、70℃、65℃、60℃、或55℃的温度下具有活性。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在清洁组合物中表现出清洁性能。清洁组合物通常包括对酶的稳定性和性能有害的成分，这些成分使清洁组合物成为酶例如丝氨酸蛋白酶保留功能的恶劣环境。因此，将酶置于清洁组合物中并且期望发挥酶功能(例如丝氨酸蛋白酶活性，例如通过清洁性能表现的)是重要的。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物中表现出清洁性能。在一些实施例中，在自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物中的清洁性能包括清洁蛋黄污渍。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在衣物洗涤剂组合物中表现出清洁性能。在一些实施例中，在衣物洗涤剂组合物中的清洁性能包括清洁血液/奶/墨汁污渍。在本文所述的一种或多种清洁组合物中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在具有或不具有漂白组分情况下表现出清洁性能。
可以使本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体经历各种改变，例如一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代(保守或非保守的)，包括此类改变基本上不改变多肽的酶活性的情况。类似地，也可以使本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体经历各种变化，例如在一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸的一个或多个取代(这样使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，导致沉默变异(例如，当编码的氨基酸不被核苷酸突变改变时)或非沉默变异)、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个缺失、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个添加或插入、和/或序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个截短的切割。与由原始核酸序列编码的多肽酶相比，核酸序列中的许多这样的变化本质上可能不会改变所得的编码的多肽酶的酶活性。还可以对本文所述的一个或多个核酸序列进行修饰以便包括一个或多个密码子，所述一个或多个密码子在表达系统(例如，细菌表达系统)中提供了最佳表达，同时，若希望，所述一个或多个密码子仍编码一个或多个相同的氨基酸。
一些实施例涉及具有所希望的酶活性(例如蛋白酶活性或清洁性能活性)的一种或多种多肽，所述多肽包含具有本文所述的氨基酸取代和/或变异的序列，并且还包含一个或多个另外的氨基酸取代或变异，例如保守的和非保守的取代或变异，其中所述多肽显示、维持或近似维持所希望的酶活性(例如蛋白水解活性)。在一些实施例中，该蛋白水解活性反映在本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的清洁活性或性能上。例如，氨基酸取代可以包括但不限于一个或多个非保守取代和/或一个或多个保守氨基酸取代。典型地，保守氨基酸残基取代涉及将在氨基酸残基的一个功能类别内的成员交换属于相同功能类别的残基(在计算百分比功能同源性时，保守的氨基酸残基被认为是功能同源的或保守的)。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、和苏氨酸在功能上相似，因此可以相互用作保守氨基酸取代。天冬氨酸和谷氨酸可以相互用作保守取代。天冬酰胺和谷氨酰胺可以相互用作保守取代。精氨酸、赖氨酸、和组氨酸可以相互用作保守取代。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、和缬氨酸可以相互用作保守取代。苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸可以相互用作保守取代。
可以设想其他保守氨基酸取代组。例如，氨基酸可以通过类似的功能或化学结构或组成(例如酸性的、碱性的、脂肪族的、芳香族的、含硫的)进行分组。例如，脂肪族分组可以包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。含有被认为相互为保守取代的氨基酸的其他组包括：芳香族的：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性的：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性的：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；非极性不带电残基，半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、和脯氨酸(P)；亲水不带电残基：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、和谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组是本领域技术人员所熟知的并且描述于各种标准教科书中。本文的多肽序列表(结合上述取代组)，提供了所有保守取代的多肽序列的表达列表。
在上述氨基酸残基类别中存在更保守的取代，其也或可替代地可以是合适的。更保守的取代的保守组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的保守取代或变异包括小百分比、有时小于5％、4％、3％、2％、或1％，或小于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸的取代或变异(被相同保守取代组的保守选择的氨基酸取代或变异)。
本文所述的一种或多种核酸可用于本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的重组生产(例如表达)中，典型地通过表达包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的序列的质粒表达载体。
一些实施例涉及一种或多种核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:15、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、或69的核酸序列具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。其他实施例涉及一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:15、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、或69的核酸序列互补的核酸序列。仍其他的实施例涉及一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸序列。在甚至进一步的实施例中，本文所述的一种或多种多核苷酸或核酸是分离的、重组的、基本上纯的和/或非天然存在的多核苷酸或核酸。
一些实施例涉及合成衍生的核酸，该核酸包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核苷酸序列。在一些实施例中，重组表达具有同源前肽序列(例如Bgi02446前肽)的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。
本发明的核酸可以通过使用任何合适的合成、操作和/或分离技术或其组合来产生。例如，本发明的多核苷酸可以使用本领域技术人员熟知的标准核酸合成技术、例如固相合成技术来生产。在此类技术中，典型地合成高达50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(例如通过酶或化学连接方法)以基本上形成任何希望的连续核酸序列。还可以通过本领域已知的任何合适的方法来促进本发明的核酸的合成，包括但不限于使用以下方法的化学合成：经典的亚磷酰胺方法(参见例如Beaucage等人，Tetrahedron Letters[四面体快报]22:1859-69[1981])；或Matthes等人描述的方法(参见Matthes等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:801-805[1984])，如典型地在自动合成方法中所实践的。本发明的核酸还可以通过使用自动DNA合成仪来产生。可以从各种商业来源订购定制的核酸(例如，米德兰认证试剂公司(The Midland Certified Reagent Company)、大美国基因公司(GreatAmerican Gene Company)、操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.)和DNA2.0)。用于合成核酸和相关原理的其他技术是本领域已知的(参见例如，Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴]53:323[1984]；和Itakura等人，Science[科学]198:1056[1984])。
如上所述，可用于核酸修饰的重组DNA技术是本领域熟知的。例如，技术例如限制性内切核酸酶消化、连接、逆转录和cDNA生产以及聚合酶链反应(例如PCR)是本领域技术人员已知和容易使用的。本文所述的一种或多种核苷酸还可以通过使用一个或多个寡核苷酸探针来筛选cDNA文库而获得，所述探针可以与编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸杂交或对其进行PCR扩增。用于筛选和分离cDNA克隆和PCR扩增程序的方法是本领域技术人员熟知的并且描述于本领域技术人员已知的标准参考文献中。本文所述的一些核酸可以通过例如已知的诱变程序(例如，定点诱变、位点饱和诱变和体外重组)改变天然存在的多核苷酸主链(例如，编码酶或亲本蛋白酶的多核苷酸主链)来获得。适合于产生可以编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的经修饰的多核苷酸的多种方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化、以及各种其他重组方法。
一些实施例提供了一种或多种载体，该载体包含本文所述的一种或多种多核苷酸；一种或多种表达载体或表达盒，该表达载体或表达盒包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸；一种或多种分离的、基本上纯的、或重组的DNA构建体，该构建体包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸；一种或多种分离的或重组的细胞，该细胞包含本文所述的一种或多种多核苷酸；以及一种或多种组合物，该组合物包含一种或多种这样的载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或其任何组合或混合物。
一些实施例提供了一种或多种重组细胞，该重组细胞包含本文所述的一种或多种载体(例如表达载体或DNA构建体)，该载体包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸。将一些此类重组细胞用此类一种或多种载体进行转化或转染，但是其他方法在本领域中是可获得且已知的。此类细胞典型地被称为宿主细胞。一些此类细胞包含细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。本发明还提供了包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。
其他实施例提供了一种或多种载体，该载体包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸。在一些实施例中，该载体是表达载体或表达盒，其中本文所述的一种或多种多核苷酸序列有效地连接至有效的基因表达所需的一种或多种另外的核酸区段上(例如，有效地连接至本文所述的多核苷酸的启动子)。载体可以包括转录终止子和/或能够通过在含有抗菌剂的培养基中生长来实现质粒感染的宿主细胞的连续培养维持的选择基因，例如抗生素抗性基因。
表达载体可以衍生自质粒或病毒DNA，或在可替代实施例中，含有两者的元件。示例性载体包括但不限于pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood和Cutting[编辑]，第3章，Molecular Biological Methods for Bacillus[用于芽孢杆菌的分子生物学方法]，John Wiley&Sons[约翰威利父子公司][1990]；针对枯草芽孢杆菌的合适的复制质粒包括第92页列出的那些)。还参见，Perego，Integrational Vectors for GeneticManipulations in B.subtilis[在枯草芽孢杆菌中用于遗传操作的整合载体]，在：Sonenshein等人，[编辑]B.subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry,Physiology and Molecular Genetic[枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌：生物化学、生理学和分子遗传学]，American Society for Microbiology[美国微生物学会]，华盛顿特区[1993]，pp.615-624)和p2JM103BBI中。
为了在细胞中表达和生产感兴趣的蛋白质(例如，丝氨酸蛋白酶多肽)，包含编码丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸的至少一个拷贝(并且在一些情况下包含多个拷贝)的至少一种表达载体在适合于丝氨酸蛋白酶表达的条件下被转化到细胞中。在一些实施例中，将本文所述的一种或多种多核苷酸序列(以及包含在载体中的其他序列)整合到宿主细胞的基因组中；然而在其他实施例中，包含本文所述的一种或多种多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保持为自主的染色体外元件。本发明提供染色体外核酸元件以及整合到宿主细胞基因组中的进入的核苷酸序列。本文所述的一种或多种载体可用于产生本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体存在于能够将该多核苷酸整合到宿主染色体中并且任选地在宿主染色体中扩增的整合载体上。整合位点的实例是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，本文所述的一种或多种多核苷酸的转录通过如下启动子来实现，该启动子是所选前体蛋白酶的野生型启动子。在其他实施例中，该启动子与前体蛋白酶是异源的，但是在宿主细胞中发挥功能。用于细菌宿主细胞的合适的启动子的实例包括但不限于amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子；嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌cryIIIA的启动子、和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子、以及噬菌体λPR或PL启动子、以及大肠杆菌lac、trp或tac启动子。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中产生。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在革兰氏阳性细菌中产生。在一些实施例中，宿主细胞是芽孢杆菌属物种(Bacillusspp.)、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)、埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)、曲霉属物种(Aspergillus spp.)、木霉属物种(Trichoderma spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp.)、酵母属物种(Saccharomyces spp.)和毕赤酵母属物种(Pichia spp.)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体由芽孢杆菌属宿主细胞产生。芽孢杆菌属宿主细胞的实例包括但不限于：地衣芽孢杆菌、迟缓芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽胞杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽胞杆菌、环状芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、Myceliopthera spp和亚罗酵母属物种，以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌宿主细胞被用于生产丝氨酸蛋白酶多肽。USPN 5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述了可以用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的各种芽孢杆菌属宿主菌株，但是可以使用其他合适的菌株。
可以用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的几种细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌属菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码目的多肽的多核苷酸已经被引入宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，特别是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110、和PEP 211菌株(参见例如Hoch等人，Genetics[遗传学]73:215-228[1973]；还参见USPN 4,450,235和4,302,544，以及EP0134048)。使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞是本领域熟知的(参见例如，Palva等人，Gene[基因]19:81-87[1982]；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，165:796-804[1986]；和Wang等人，Gene[基因]69:39-47[1988])。
在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞是在以下基因中的至少一个中包括突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degU、degS、degR和degQ。在一些实施例中，突变是在degU基因中，并且在一些实施例中，突变为degU(Hy)32(参见例如，Msadek等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]172:824-834[1990]；以及Olmos等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]253:562-567[1997])。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主在scoC4(参见例如Caldwell等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]183:7329-7340[2001])；spoIIE(参见例如Arigoni等人，Mol.Microbiol.[分子微生物学]31:1407-1415[1999])；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如，Perego等人，Mol.Microbiol.[分子微生物学]5:173-185[1991])中包含突变或缺失。实际上，预期引起与oppA基因中的突变相同的表型的opp操纵子中的任何突变将可用于本发明的经改变的芽孢杆菌属菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独发生，而在其他实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可以用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的经改变的芽孢杆菌属宿主细胞菌株是已经包含上述基因中的一个或多个中的突变的芽孢杆菌属宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的一个或多个突变和/或缺失的芽孢杆菌属宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如，US2005/0202535)。
使用本领域已知的任何合适的方法用本文所述的一种或多种核酸转化宿主细胞。利用质粒DNA构建体或载体将核酸(例如DNA)引入芽孢杆菌属细胞或大肠杆菌细胞并且将这样的质粒DNA构建体或载体转化到这样的细胞中的方法是熟知的。在一些实施例中，质粒随后从大肠杆菌细胞中分离并且转化到芽孢杆菌属细胞中。然而，没有必要使用介入微生物例如大肠杆菌，并且在一些实施例中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌属宿主中。
本领域技术人员非常了解将本文所述的一种或多种核酸序列引入芽孢杆菌属细胞的合适方法(参见例如，Ferrari等人，“Genetics[遗传学]”，在Hardwood等人(编辑)，Bacillus[芽孢杆菌属]，Plenum Publishing Corp.[普莱南出版公司][1989]，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，157:718-726[1984]；Hoch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，93:1925-1937[1967]；Mann等人，Current Microbiol.[当代微生物学]，13:131-135[1986]；Holubova，Folia Microbiol.[微生物学大观]，30:97[1985]；Chang等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]，168:11-115[1979]；Vorobjeva等人，FEMSMicrobiol.Lett.[FEMS微生物学快报]，7:261-263[1980]；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.[应用与环境微生物学]，51:634(1986)；Fisher等人，Arch.Microbiol.[微生物学文献集]，139:213-217[1981]；以及McDonald，J.Gen.Microbiol.[普通微生物学杂志]，130:203[1984]。实际上，包括原生质体转化和转染、转导和原生质体融合在内的转化方法是熟知的并且适合用于本文。本领域已知的用于转化芽孢杆菌属细胞的方法包括例如质粒标记拯救转化等方法，其涉及通过携带部分同源的驻留质粒的感受态细胞摄取供体质粒(参见，Contente等人，Plasmid[质粒]2:555-571[1979]；Haima等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]223:185-191[1990]；Weinrauch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]154:1077-1087[1983]；和Weinrauch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:1205-1211[1987])。在该方法中，进入的供体质粒在模拟染色体转化的过程中与驻留的“辅助”质粒的同源区重组。
除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，用包含本文所述的一种或多种核酸的DNA构建体或载体直接转化宿主细胞(即，在引入宿主细胞之前，中间细胞不用于扩增或以其他方式处理DNA构建体或载体)。将本文所述的一种或多种DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的将核酸序列(例如DNA序列)引入宿主细胞而不插入宿主基因组中的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在另外的实施例中，DNA构建体或载体与质粒一起共转化而不插入质粒。在进一步的实施例中，通过本领域已知的方法从经改变的芽孢杆菌属菌株中缺失选择标记(参见Stahl等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]158:411-418[1984]；以及Palmeros等人，Gene[基因]247:255-264[2000])。
在一些实施例中，将本文所述的转化细胞在常规营养培养基中培养。合适的特定培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且详细描述于科学文献中。在一些实施例中，本发明提供包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或本文所述的一种或多种核酸的培养物(例如细胞培养物)。
在一些实施例中，将用本文所述的一种或多种多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体表达的条件下在合适的营养培养基中培养，其后从该培养物中回收所得的变体。在一些实施例中，通过常规程序从培养基中回收由细胞生产的变体，该常规程序包括但不限于例如通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞、借助于盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白质组分、层析法纯化(例如离子交换、凝胶过滤、亲和等)。
在一些实施例中，由重组宿主细胞生产的丝氨酸蛋白酶多肽被分泌到培养基中。编码纯化促进结构域的核酸序列可以用于促进蛋白质的纯化。包含编码丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸序列的载体或DNA构建体可以进一步包含编码促进丝氨酸蛋白酶多肽纯化的纯化促进结构域的核酸序列(参见例如，Kroll等人，DNA Cell Biol.[DNA细胞生物学]12:441-53[1993])。此类纯化促进结构域包括但不限于例如金属螯合肽，例如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath，Protein Expr.Purif.[蛋白质表达与纯化]3:263-281[1992])；允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域；以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的结构域。在纯化结构域和异源蛋白之间包含可切割的接头序列例如因子XA或肠激酶(例如，可获自加利福尼亚州圣地亚哥市英杰公司(Invitrogen)的序列)还可用于促进纯化。
用于检测和测量酶(例如本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体)的酶活性的测定法是熟知的。用于检测和测量蛋白酶(例如本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体)的活性的各种测定法也是本领域普通技术人员已知的。具体地，测定可用于测量基于酪蛋白或血红蛋白的酸可溶性肽的释放的蛋白酶活性，其作为280nm下的吸光度测量或使用Folin方法进行比色测定。其他示例性测定涉及显色底物的溶解(参见例如，Ward，“Proteinases[蛋白酶]”，在：Fogarty(编辑)，Microbial Enzymes and Biotechnology[微生物酶与生物技术]，Applied Science[应用科学出版社]，伦敦，[1983]，pp.251-317)。其他示例性测定包括但不限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺测定(suc-AAPF-pNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定(TNBS测定)。本领域技术人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如，Wells等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]11:7911-7925[1983]；Christianson等人，Anal.Biochem.[分析生物化学]223:119-129[1994]；以及Hsia等人，Anal.Biochem.[分析生物化学]242:221-227[1999])。
可以使用各种方法来确定宿主细胞中成熟蛋白酶(例如，本文所述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体)的生产水平。此类方法包括但不限于例如利用对蛋白酶特异的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。这些和其他测定法是本领域熟知的(参见例如，Maddox等人，J.Exp.Med.[实验医学杂志]158:1211[1983])。
一些其他实施例提供了用于制备或产生本文所述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体的方法。成熟的丝氨酸蛋白酶多肽不包括信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞(例如像芽孢杆菌属细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞))中制备或生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。一些实施例提供了生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，该方法包括在有利于生产该变体的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸。一些这样的方法进一步包括从培养物中回收变体。
一些实施例提供了生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，该方法包括：(a)将包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸的重组表达载体引入细胞群体(例如细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞)中；并且(b)在有助于生产由表达载体编码的变体的条件下在培养基中培养细胞。一些这样的方法进一步包括：(c)从细胞或培养基中分离变体。
除非另外指出，本文提供的所有组分或组合物水平参考该组分或组合物的活性水平给出，并且不包括可能存在于可商购的来源中的杂质，例如残余溶剂或副产品。酶组分重量是基于总的活性蛋白。除非另外指明，所有百分比和比率均按重量计算。除非另外指明，所有百分比和比率均基于总组合物计算。本发明的组合物包括清洁组合物，例如洗涤剂组合物。在例示的洗涤剂组合物中，通过按总组合物的重量计的纯酶表示酶水平并且除非另外说明，按总组合物的重量计表示洗涤剂成分。
虽然对于本发明的目的不是必需的，但是下文所示的辅助剂的非限制性列表适合用于即时清洁组合物。在一些实施例中，掺入这些辅助剂例如以便辅助或增强清洁性能(用于处理待清洁的基材)，或者以便改变清洁组合物的美观性(例如用香料、色素、染料等的情况)。一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种辅助材料和一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。在任何具体组合物中重新使用的辅助材料的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将使用组合物的清洁操作的性质。
合适的辅助材料包括但不限于漂白催化剂、另外的酶、酶稳定剂(包括，例如酶稳定系统)、螯合剂、光亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、色素、填料盐、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料、和pH控制剂、表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、附加的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢来源、预成型过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增白剂、泡沫抑制剂、染料、香料、结构弹性剂、织物软化剂、载体、助水溶物、加工助剂和/或颜料。其他辅助材料和使用水平的合适实例可以在USPN 5,576,282；6,306,812；6,326,348；6,610,642；6,605,458；5,705,464；5,710,115；5,698,504；5,695,679；5,686,014；和5,646,101中找到。在一种或多种辅助材料与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体不相容的实施例中，可以使用将一种或多种辅助材料和一种或多种变体保持分离(即彼此不接触)的合适方法，直到两种组分的组合合适为止。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法(例如，囊形片、包封、片剂、物理分离等)。上述辅助材料可以构成本文所述的清洁组合物的余量。
本文所述的一种或多种清洁组合物有利地用于例如洗衣应用、硬表面清洁应用、餐具洗涤应用(包括自动餐具洗涤和手洗餐具洗涤)、以及装饰品应用(例如假牙、牙齿、头发和皮肤清洁)和消毒应用(例如但不限于消毒自动餐具洗涤机或洗衣机)。本发明的酶还适合用于隐形眼镜清洁和伤口清创应用。另外，由于在较低温度溶液中增加有效性的独特优点，本发明的酶理想地适合于洗衣应用。此外，本发明的酶可用于颗粒和液体组合物。
另一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，该组合物是清洁组合物。在其他实施例中，该组合物是洗涤剂组合物。在又其他实施例中，该组合物选自衣物洗涤剂组合物、自动餐具洗涤(ADW)组合物、手洗(手动)餐具洗涤剂组合物、硬表面清洁组合物、眼镜清洁组合物、医疗器械清洁组合物、消毒剂(例如恶臭或微生物)组合物、和个人护理清洁组合物。在仍其他的实施例中，该组合物是衣物洗涤剂组合物、ADW组合物、或手洗(手动)餐具洗涤剂组合物。甚至仍进一步的实施例涉及织物清洁组合物，而其他实施例涉及非织物清洁组合物。在一些实施例中，该清洁组合物不含硼。在其他实施例中，该清洁组合物不含磷酸盐。在仍其他的实施例中，该组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及一种或多种赋形剂、辅助材料、和/或另外的酶。
在仍又进一步的实施例中，本文所述的组合物包含磷酸盐、不含磷酸盐、包含硼、不含硼、或是其组合。在其他实施例中，该组合物是不含硼的组合物。在一些实施例中，不含硼的组合物是未添加硼酸盐稳定剂的组合物。在另一个实施例中，不含硼的组合物是含有少于5.5％硼的组合物。在仍进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于4.5％硼的组合物。在仍又另一个实施例中，不含硼的组合物是含有少于3.5％硼的组合物。在仍又进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于2.5％硼的组合物。在甚至进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于1.5％硼的组合物。在另一个实施例中，不含硼的组合物是含有少于1.0％硼的组合物。在仍进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于0.5％硼的组合物。在仍进一步的实施例中，不含硼的组合物是基本上不含硼的组合物。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体也可用于清洁添加剂产品。在一些实施例中，可使用低温溶液清洁应用。一些实施例提供了包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的清洁添加剂产品，当希望得到另外的漂白效果时，该添加剂理想地适合于包含在洗涤过程中。此类情况包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施例中，添加剂产品处于其最简单的形式，即本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，该添加剂被包封于剂型中用于添加至清洁过程中。在一些实施例中，该添加剂被包封于剂型中用于添加至使用过氧化物来源并且希望得到增加的漂白效果的清洁过程中。
用于颗粒组合物的示例性填料或载体包括但不限于例如硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐；滑石；和粘土。用于液体组合物的示例性填料或载体包括但不限于，例如水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二元醇(例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇)。在一些实施例中，组合物包含从约5％至约90％的此类填料或载体。在此类组合物中可包含酸性填料以降低清洁方法或应用中所得溶液的pH。
在另一个实施例中，本文所述的一种或多种组合物是处于选自凝胶、片剂、粉末、颗粒、固体、液体、单位剂量及其组合的形式。在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种组合物是处于选自低水紧密配方、低水HDL或UD、或高水配方或HDL的形式。在一些实施例中，本文所述的清洁组合物是处于单位剂量形式。在其他实施例中，该单位剂量形式选自丸剂、片剂、胶囊、囊形片、小药囊、小袋、多隔室小袋和预先测量的粉末或液体。在一些实施例中，单位剂量形式被设计成在多隔室小袋(或其他单位剂量形式)内提供对成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式描述于例如EP2100949；WO 02/102955；US 4,765,916；US 4,972,017；和WO 04/111178中。在一些实施例中，该单位剂量形式是包含在水溶性膜或小袋中的片剂或粉末。
本发明的清洁组合物或清洁添加剂包含有效量的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，该变体是单独的或与一种或多种另外的酶组合的。典型地本发明的清洁组合物包含至少约0.0001重量百分比、从约0.0001至约10重量百分比、从约0.001至约1重量百分比、或从约0.01至约0.1重量百分比的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种清洁组合物包含从约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.01至约2mg、约0.01至约1mg、约0.05至约1mg、约0.5至约10mg、约0.5至约5mg、约0.5至约4mg、约0.5至约4mg、约0.5至约3mg、约0.5至约2mg、约0.5至约1mg、约0.1至约10mg、约0.1至约5mg、约0.1至约4mg、约0.1至约3mg、约0.1至约2mg、约0.1至约2mg、约0.1至约1mg、或约0.1至约0.5mg的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体/克组合物。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在低温下清洁。在其他实施例中，本文所述的一种或多种组合物在低温下清洁。在其他实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含有效量的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，该变体对于清洁需要蛋白质污渍去除的表面有用或有效。
典型地配制本文的清洁组合物使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水将具有从约4.0至约11.5、或甚至从约5.0至约11.5、或甚至从约5.0至约8.0、或甚至从约7.5至约10.5的pH。液体产品配制品典型地被配制成具有从约3.0至约9.0或甚至从约3至约5的pH。颗粒洗衣产品典型地被配制成具有从约9至约11的pH。一些实施例提供了一种或多种清洁组合物，该清洁组合物被配制成在洗涤条件下具有碱性pH，例如从约8.0至约12.0、或从约8.5至约11.0、或从约9.0至约11.0的pH。在一些实施例中，本文所述的一种或多种清洁组合物被配制成在洗涤条件下具有中性pH，例如从约5.0至约8.0、或从约5.5至约8.0、或从约6.0至约8.0、或从约6.0至约7.5的pH。在一些实施例中，当清洁组合物在20℃下以1:100(wt:wt)溶解于去离子水中时，可以测量中性pH条件，使用常规pH计进行测量。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。
在一些实施例中，当本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体应用于颗粒组合物或液体中时，令人希望的是该变体将处于包封的颗粒的形式以便在储存期间保护该变体免受颗粒组合物的其他组分的影响。另外，包封还是在清洁过程中控制该变体的可用性的手段。在一些实施例中，包封增强了变体和/或另外的酶的性能。就这一点而言，将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体用本领域已知的任何合适的包封材料进行包封。在一些实施例中，该包封材料典型地包封该变体的至少一部分。典型地，包封材料是水溶性和/或水分散性的。在一些实施例中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。Tg在WO97/11151中有更详细的描述。该包封材料典型地选自：碳水化合物、天然或合成胶、甲壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡及其组合。当包封材料是碳水化合物时，其典型地选自单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些典型的实施例中，包封材料是淀粉(参见例如EP 0922499；US 4,977,252；US5,354,559；和US 5,935,826)。在一些实施例中，包封材料是由塑料(例如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物)制成的微球；可使用的可商购的微球包括但不限于由(Stockviksverken，瑞典)、以及PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、和(PQ公司，宾夕法尼亚州福吉谷市(Valley Forge,PA))供应的那些。
存在各种洗涤条件，包括洗涤中涉及的蛋白酶所暴露的不同的洗涤剂配制品、洗涤水体积、洗涤水温度、和洗涤时间的长短。低洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。中洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm和约2000ppm之间的洗涤剂组分。高洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”使用适合于在从约10℃至约40℃、或从约20℃至约30℃、或从约15℃至约25℃、以及在约15℃至约35℃范围内的所有其他组合、和在10℃至40℃之间所有范围的温度下洗涤的“冷水洗涤剂”。
典型地，不同的地理位置具有不同的水硬度。通常按照每加仑混合Ca2+/Mg2+的颗粒数来描述水硬度。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的量度。美国大部分水都是硬水，但是硬度却不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181百万分率。
水 每加仑颗粒数 百万分率
软 小于1.0 小于17
略硬 1.0至3.5 17至60
中等硬 3.5至7.0 60至120
硬 7.0至10.5 120至180
非常硬 大于10.5 大于180
在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在至少一组洗涤条件(例如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)中显示令人惊讶的洗涤性能。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与其他丝氨酸蛋白酶多肽蛋白酶在洗涤性能方面相当。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体显示增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、在各种条件下增强的清洁能力、和/或增强的螯合剂稳定性。
其他实施例涉及一种或多种清洁组合物，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，和按组合物重量计从约99.999％至约90.0％的一种或多种辅助材料。其他实施例提供了一种或多种清洁组合物，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，和按组合物重量计从约99.999％至约90.0％、约99.999％至约98％、约99.995％至约99.5％的一种或多种辅助材料。
在其他实施例中，本文所述的组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种另外的酶。该一种或多种另外的酶选自另外的丝氨酸蛋白酶、酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、非丝氨酸蛋白酶、氧化酶、果胶裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、和木糖苷酶、或其任何组合或混合物。一些实施例涉及包含常规酶(如淀粉酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶)的酶的组合(即“混合物”)，所述酶的组合与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和/或一种或多种另外的丝氨酸蛋白酶结合。
在另一个实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种另外的蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。在一些实施例中，使用微生物蛋白酶。在一些实施例中，包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例包括枯草杆菌蛋白酶，特别是衍生自芽孢杆菌的那些(例如，枯草杆菌蛋白酶迟缓、枯草杆菌蛋白酶解淀粉、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。示例性另外的蛋白酶包括但不限于描述于WO 92/21760、WO 95/23221、WO 2008/010925、WO 09/149200、WO 09/149144、WO09/149145、WO 10/056640、WO 10/056653、WO 2010/0566356、WO 11/072099、WO 2011/13022、WO 11/140364、WO 12/151534、WO 2015/038792、WO 2015/089447、WO 2015/089441、美国公开号2008/0090747、US 5,801,039、US 5,340,735、US 5,500,364、US 5,855,625、RE34,606、US 5,955,340、US 5,700,676US 6,312,936、US 6,482,628、US 8,530,219、美国临时申请号62/180673和62/161077、和PCT申请号PCT/US 2015/021813、PCT/US 2015/055900、PCT/US 2015/057497、PCT/US 2015/057492、PCT/US 2015/057512、PCT/US 2015/057526、PCT/US 2015/057520、PCT/US 2015/057502、PCT/US 2016/022282、和PCT/US 16/32514中的那些，以及描述于WO 1999014341、WO 1999033960、WO 1999014342、WO1999034003、WO 2007044993、WO 2009058303、WO 2009058661、WO 2014071410、WO2014194032、WO 2014194034、WO 2014194054、和WO 2014/194117中的金属蛋白酶。另外的蛋白酶实例包括但不限于胰蛋白酶(例如猪或牛起源的)和在WO 89/06270中描述的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。示例性商业蛋白酶包括但不限于MAXACALTM、MAXAPEMTM、 OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM、PREFERENZTM蛋白酶(例如P100、P110、P280)、EFFECTENZTM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZTM EXCELLENZTM蛋白酶(例如P1000)、和PURAFASTTM(杜邦公司(DuPont))； 16L、ULTRA、DURAZYMTM、LIQUANASE和(诺维信公司(Novozymes))；BLAPTM和BLAPTM变体(汉高公司(Henkel))；和KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(花王公司(Kao)))。示例性金属蛋白酶包括在枯草芽孢杆菌中表达的重组形式的中性金属蛋白酶nprE(参见例如WO 07/044993)和来自解淀粉芽孢杆菌的纯化的中性金属蛋白酶PMN。
另一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种脂肪酶的组合物。在一些实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的脂肪酶。示例性脂肪酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些脂肪酶。示例性脂肪酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性脂肪酶包括但不限于绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP 258068和EP 305216)；米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶(参见例如EP 238023)；假丝酵母属脂肪酶，例如南极洲假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极洲假丝酵母脂肪酶A或B；参见例如，EP 214761)；假单胞菌脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如，EP 218 272)；洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如，EP 331376)；施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如，GB 1,372,034)；萤光假单胞菌脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶[Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1131:253-260[1993])；嗜热脂肪芽胞杆菌脂肪酶[参见例如，JP 64/744992]；以及短小芽胞杆菌脂肪酶(参见例如，WO 91/16422)。示例性经克隆的脂肪酶包括但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人，Gene[基因]103:61-67[1991])；白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，J.Biochem.[生物化学杂志]，106:383-388[1989])；以及各种根霉属脂肪酶例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass等人，Gene[基因]109:117-113[1991])；雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学、生物技术与生物化学]56:716-719[1992])和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。其他类型的脂肪酶多肽酶例如角质酶还可用于一些实施例中，包括但不限于源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见WO88/09367)和源自豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见，WO 90/09446)。示例性商业脂肪酶包括但不限于M1LIPASETM、LUMA FASTTM、和LIPOMAXTM(杜邦公司)； 和ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE PTM(日本天野制药有限公司(Amano PharmaceuticalCo.Ltd.))。
仍进一步的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种淀粉酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的淀粉酶。适合用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如，α淀粉酶和/或β淀粉酶)可以用于包含在此类组合物中。示例性淀粉酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性淀粉酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些淀粉酶，例如像GB 1,296,839、WO 9100353、WO9402597、WO 94183314、WO 9510603、WO 9526397、WO 9535382、WO 9605295、WO 9623873、WO9623874、WO 9630481、WO 9710342、WO 9741213、WO 9743424、WO 9813481、WO 9826078、WO9902702、WO 9909183、WO 9919467、WO 9923211、WO 9929876、WO 9942567、WO 9943793、WO9943794、WO 9946399、WO 0029560、WO 0060058、WO 0060059、WO 0060060、WO 0114532、WO0134784、WO 0164852、WO 0166712、WO 0188107、WO 0196537、WO 02092797、WO 0210355、WO0231124、WO 2004055178、WO 2004113551、WO 2005001064、WO 2005003311、WO2005018336、WO 2005019443、WO 2005066338、WO 2006002643、WO 2006012899、WO2006012902、WO 2006031554、WO 2006063594、WO 2006066594、WO 2006066596、WO2006136161、WO 2008000825、WO 2008088493、WO 2008092919、WO 2008101894、WO 2008/112459、WO 2009061380、WO 2009061381、WO 2009100102、WO 2009140504、WO 2009149419、WO 2010/059413、WO 2010088447、WO 2010091221、WO 2010104675、WO 2010115021、WO10115028、WO 2010117511、WO 2011076123、WO 2011076897、WO 2011080352、WO2011080353、WO 2011080354、WO 2011082425、WO 2011082429、WO 2011087836、WO2011098531、WO 2013063460、WO 2013184577、WO 2014099523、WO 2014164777、和WO2015077126中所描述的淀粉酶。示例性商业淀粉酶包括但不限于 STAINZYMESTAINZYMESTAINZYME和BANTM(诺维信公司)；EFFECTENZTMS1000、POWERASETM、PREFERENZTMS 100、PREFERENZTMS 110、EXCELLENZTMS2000、和P(杜邦公司)。
仍又进一步的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种纤维素酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的纤维素酶。任何合适的纤维素酶可以用于本文所述的组合物中。示例性纤维素酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性纤维素酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些纤维素酶，例如像WO 2005054475、WO 2005056787、US 7,449,318、US 7,833,773、US4,435,307；EP 0495257；和美国临时申请号62/296,678中所描述的。示例性商业纤维素酶包括但不限于 和PREMIUM(诺维信公司)；REVITALENZTM100、REVITALENZTM200/220、和2000(杜邦公司)；和KAC-500(B)TM(花王公司)。在一些实实施例中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分被缺失(参见例如US 5,874,276)。
甚至仍进一步的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种甘露聚糖酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的甘露聚糖酶。示例性甘露聚糖酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性甘露聚糖酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些甘露聚糖酶，例如像如WO 2016/007929；USPN6,566,114、6,602,842、和6,440,991；以及美国临时申请号62/251516、62/278383、和62/278387中所描述的。示例性商业甘露聚糖酶包括但不限于(诺维信公司)以及EFFECTENZTMM 1000、M100、和PURABRITETM(杜邦公司)。
又甚至仍进一步的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及一种或多种过氧化物酶和/或氧化酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的过氧化物酶或氧化酶。过氧化物酶可以与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合使用，并且氧化酶可以与氧气组合使用。将单独的或与增效剂组合的过氧化物酶和氧化酶用于“溶液漂白”(即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织染料从一种染色的织物转移到另一种织物上)(参见例如WO 94/12621和WO95/01426)。示例性过氧化物酶和/或氧化酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌来源的那些。
在一些实施例中，可使用另外的酶，包括但不限于过水解酶(参见例如WO 2005/056782、WO 2007106293、WO 2008063400、WO 2008106214、和WO 2008106215)。
在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及在本文所述的一种或多种组合物中包含的一种或多种另外的酶可以各自独立地变动至约10％，其中该清洁组合物的余量为一种或多种辅助材料。
在一些实施例中，有效量的本文提供的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含在用于清洁需要蛋白质污渍去除的各种表面的组合物中。此类清洁组合物包括用于例如清洁硬表面、织物和餐具等应用的清洁组合物。实际上，一些实施例提供了织物清洁组合物；而其他实施例提供了非织物清洁组合物。一些实施例还提供了适合用于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理(包括牙粉、牙膏、漱口水等、以及假牙清洁组合物)、皮肤和毛发清洁组合物。本发明旨在涵盖处于任何形式(即，液体、颗粒、棒状、半固体、凝胶、乳剂、片剂、胶囊等)的洗涤剂组合物。
举例来说，下面将更详细地描述可使用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的几种清洁组合物。在一些实施例中，配制清洁组合物用于一种或多种洗衣机洗涤方法中，其中该组合物含有至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物、以及一种或多种辅助材料，该辅助材料选自有机聚合化合物、漂白剂、另外的酶、泡沫抑制剂、分散剂、钙皂分散剂、污垢悬浮液和抗再沉积剂和腐蚀抑制剂。在一些实施例中，衣物洗涤组合物还含有柔顺剂(即，作为另外的辅助材料)。
本文所述的组合物还可用于处于固体或液体形式的洗涤剂添加剂产品中。此类添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可以在清洁过程的任何阶段添加。在一些实施例中，本文的衣物洗涤剂组合物的密度范围为从约400g/升至约1200g/升，而在其他实施例中，其范围为在20℃下测量的500g/升至约950g/升的组合物。
在配制为用于在手动餐具洗涤方法中使用的组合物的实施例中，组合物含有至少一种表面活性剂和至少一种另外的辅助材料，该辅助材料选自有机聚合化合物、增泡剂、II族金属离子、溶剂、助水溶物和另外的酶。
在一些实施例中，各种清洁组合物(例如在USPN 6,605,458中提供的那些)可与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体一起使用。因此，在一些实施例中，包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物是紧密颗粒状织物清洁组合物。在其他实施例中，该组合物是用于有色织物洗涤的颗粒状织物清洁组合物。在进一步的实施例中，该组合物是通过洗涤能力提供柔顺的颗粒状织物清洁组合物。在另外的实施例中，该组合物是重垢液体织物清洁组合物。在一些实施例中，包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物是织物清洁组合物，例如在USPN 6,610,642和6,376,450中描述的那些。另外，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于在欧洲或日本洗涤条件下特别实用的颗粒状衣物洗涤剂组合物中(参见例如US6,610,642)。
又进一步的实施例提供了包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的餐具洗涤组合物。因此，在一些实施例中，包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物是硬表面清洁组合物，例如USPN 6,610,642和6,376,450中的那些。一些进一步的实施例提供了包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的口腔护理组合物，例如在USPN 6,376,450和6,376,450中的那些。
本文所述的一种或多种清洁组合物可以配制成任何合适的形式，并通过由配制者所选择的任何方法进行制备(参见例如USPN 5,879,584；5,691,297；5,574,005；5,569,645；5,565,422；5,516,448；5,489,392；和5,486,303。当希望低pH清洁组合物时，此类组合物的pH经由添加例如单乙醇胺或酸性物质例如HCl等物质来调节。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种清洁组合物包含酸化颗粒或氨基羧酸助洗剂。氨基羧酸助洗剂的实例包括氨基羧酸、其盐和衍生物。在一些实施例中，氨基羧酸助洗剂是氨基多羧酸助洗剂，例如甘氨酸-N,N-二乙酸或具有通式MOOC-CHR-N(CH2COOM)2(其中R是C1-12烷基并且M是碱金属)的衍生物。在一些实施例中，氨基羧酸助洗剂可以是甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、羧基甲基菊粉及其盐及其衍生物、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺基甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺基乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺基甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺基乙基)谷氨酸(SEGL)、IDS(亚氨基二乙酸)及其盐及其衍生物例如N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺基甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、以及碱金属盐及其衍生物。在一些实施例中，酸化颗粒的重量几何平均粒度为从约400μ至约1200μ，并且体积密度为至少550g/L。在一些实施例中，酸化颗粒包含至少约5％的助洗剂。
在一些实施例中，酸化颗粒可以包含任何酸，包括有机酸和无机酸。有机酸可以具有一个或两个羧基，并且在一些情况下可以具有多达15个碳，特别是多达10个碳，例如甲酸、乙酸、丙酸、癸酸、草酸、琥珀酸、己二酸、马来酸、富马酸、癸二酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸和水合乙醛酸。在一些实施例中，该酸是柠檬酸。无机酸包括盐酸和硫酸。在一些情况下，酸化颗粒是包含高水平氨基羧酸助洗剂的高活性颗粒。已经发现硫酸进一步有助于最终颗粒的稳定性。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中该表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其混合物。在一些实施例中，该表面活性剂以从约0.1％至约60％的水平存在，而在可替代的实施例中，该水平为从约1％至约50％，而在仍进一步的实施例中，该水平为从约5％至约40％，以清洁组合物的重量计。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统。在掺入至少一种助洗剂的一些实施例中，清洁组合物包含以该清洁组合物重量计至少约1％、从约3％至约60％、或甚至从约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于，聚磷酸盐的碱金属、铵和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸化合物；醚羟基聚羧酸酯；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸、和羧基甲基氧基琥珀酸的共聚物；聚乙酸的各种碱金属、铵和取代的铵盐，例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；连同聚羧酸酯，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀酸(oxydisuccinic acid)、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸及其可溶性盐。实际上，预期任何合适的助洗剂将可用于本文所述的一个或多个实施例中。
在一些实施例中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，例如柠檬酸盐和多磷酸盐(例如三聚磷酸钠和三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾、以及混合的三聚磷酸钠和三聚磷酸钾等)。预期任何合适的助洗剂将可用于本文所述的一种或多种组合物中，包括本领域已知的那些(参见例如EP 2100 949)。
在一些实施例中，本文使用的助洗剂包括磷酸盐助洗剂和非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是非磷酸盐助洗剂。如果存在，助洗剂以按组合物的重量计从0.1％至80％、或从5％至60％、或从10％至50％的水平使用。在一些实施例中，产品包括磷酸盐和非磷酸盐助洗剂的混合物。适合的磷酸盐助洗剂包括单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚多磷酸盐，包括这些化合物的碱金属盐，包括钠盐。在一些实施例中，助洗剂可以是三聚磷酸钠(STPP)。另外，组合物可以包含有助于实现中性pH的碳酸盐和/或柠檬酸盐、优选柠檬酸盐。其他适合的非磷酸盐助洗剂包括多元羧酸及其部分或完全中和盐、单体型多羧酸和羟基羧酸及其盐的均聚物和共聚物。在一些实施例中，上述化合物的盐包括铵盐和/或碱金属盐，即锂盐、钠盐和钾盐，包括钠盐。适合的多元羧酸包括无环的、脂环族的、杂环的和芳香族的羧酸，其中在一些实施例中，它们可以包含至少两个羧基基团，这些羧基基团在每种情况下彼此分离，在某些情况下被不超过两个碳原子分离。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含至少一种螯合剂。适合的螯合剂包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂及其混合物。在使用至少一种螯合剂的实施例中，清洁组合物包含以组合物重量计从约0.1％至约15％或甚至从约3.0％至约10％的螯合剂。
在一些仍进一步的实施例中，本文提供的清洁组合物包含至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸盐、去污聚合物(例如聚对苯二甲酸)、粘土例如高岭土、蒙脱石、绿坡缕石、伊利石、膨润土、多水高岭土及其混合物。
在一些实施例中，抗再沉积剂可用于本文所述的一些实施例中。在一些实施例中，可使用非离子表面活性剂。例如，在自动餐具洗涤实施例中，非离子表面活性剂可用于表面改性目的(特别是用于薄片)以避免成膜和沾上污渍并且改善光泽。这些非离子表面活性剂还可用于防止污垢的再沉积。在一些实施例中，抗再沉积剂是如本领域已知的非离子表面活性剂(参见例如EP 2100 949)。在一些实施例中，非离子表面活性剂可以是乙氧基化非离子表面活性剂、环氧树脂封端的聚(烷氧基化)醇和氧化胺表面活性剂。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种清洁组合物包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮以及聚乙烯基咪唑或其混合物。在使用至少一种染料转移抑制剂的实施例中，清洁组合物包含以组合物重量计从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％、或甚至从约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。
在一些实施例中，硅酸盐包含在本文所述的一种或多种组合物中。在一些这样的实施例中，可使用硅酸钠(例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)。在一些实施例中，硅酸盐以从约1％至约20％的水平存在。在一些实施例中，硅酸盐以按该组合物的重量计从约5％至约15％的水平存在。
在一些仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种清洁组合物含有分散剂。适合的水溶性有机材料包括但不限于均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此分开的羧基自由基。
在一些进一步的实施例中，将在本文所述的一种或多种组合物中使用的酶通过任何合适的技术进行稳定。在一些实施例中，本文使用的酶通过在向这些酶提供钙和/或镁离子的成品组合物中钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。在一些实施例中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐，包括碱土金属，例如钙盐，例如甲酸钙。预想用于酶稳定化的各种技术将在本发明中使用。例如，在一些实施例中，本文使用的酶通过存在于为这些酶提供以下这样的离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))来稳定。氯化物和硫酸盐也可用于本发明的一些实施例中。合适的寡糖和多糖(例如糊精)的实例是本领域已知的(参见例如WO 07/145964)。在一些实施例中，可逆蛋白酶抑制剂也可用于例如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、和苯基硼酸衍生物(例如在WO 96/41859中描述的那些))和/或肽醛(例如像在WO 2009/118375和WO 2013004636中进一步描述的)中。
在一些实施例中，漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂存在于本文所述的一种或多种组合物中。在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐(例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括的无机过氧化氢合物盐为结晶固体，没有另外的保护，但是在一些其他实施例中，该盐被包被。本领域已知的任何合适的盐可用于本文中(参见例如EP 2100 949)。
在一些实施例中，漂白活化剂用于本文所述的一种或多种组合物中。漂白活化剂通常为有机过酸前体，其在60℃及以下的温度下在清洁过程中增强漂白作用。适合本文使用的漂白活化剂包括在过水解条件下给出优选具有从约1至约10个碳原子(尤其是从约2至约4个碳原子)的脂肪族过氧羧酸的化合物、和/或任选地取代的过氧苯甲酸。另外的漂白活化剂是本领域已知的，并且可用于本文中(参见例如EP 2100949)。
另外，在一些实施例中并且如本文进一步描述的，本文所述的一种或多种组合物进一步包含至少一种漂白催化剂。在一些实施例中，可使用锰三氮杂环壬烷和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。另外的漂白催化剂可用于本文中(参见例如US 4,246,612；US5,227,084；US 4,810410；WO 99/06521；和EP 2100949)。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，含金属的漂白催化剂可用于本文中。在一些实施例中，金属漂白催化剂包含一种催化体系，该催化体系包括：具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)、以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的螯合物(特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐)(参见例如U.S.4,430,243)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物用锰化合物来催化。此类化合物和使用水平是本领域熟知的(参见例如US 5,576,282)。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于本文所述的一种或多种组合物中。各种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见例如USPN 5,597,936和5,595,967)，并且通过已知的程序容易地制备。
在一些另外的实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含大多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为实际问题而不当作限制，在一些实施例中，对本文所述的一种或多种组合物和清洁方法进行调节以在水性洗涤介质中提供至少0.01百万分率数量级的活性MRL种类，并且在一些实施例中，在洗涤液中提供从约0.005ppm至约25ppm、从约0.05ppm至约10ppm、或从约0.1ppm至约5ppm的MRL。在一些实施例中，在瞬时过渡金属漂白催化剂中的过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。MRL还包括但不限于形成交联桥接的特殊超刚性配体(例如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。合适的过渡金属MRL通过已知的程序容易地制备(参见例如WO2000/32601和US 6,225,464)。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于预防和/或减少金属的锈蚀、腐蚀和/或氧化，该金属包括铝、不锈钢和非铁金属(例如银和铜)。合适的金属护理剂包括描述于EP 2100949、WO 9426860和WO 94/26859中的那些金属护理剂。在一些实施例中，金属护理剂是锌盐。在一些进一步的实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含以重量计从约0.1％至约5％的一种或多种金属护理剂。
在一些实施例中，清洁组合物是包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的高密度液体(HDL)组合物。HDL液体衣物洗涤剂可以包含清洁表面活性剂(10％-40％wt/wt)，该清洁表面活性剂包括：阴离子清洁表面活性剂(选自以下组：直链或支链或无规链的、取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐、和/或其混合物)；以及任选地非离子表面活性剂(选自以下组：直链或支链或无规链的、取代的或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化醇和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)，任选地其中阴离子清洁表面活性剂(亲水指数(HIc)为从6.0至9)与非离子清洁表面活性剂的重量比大于1:1。合适的清洁表面活性剂还包括阳离子清洁型表面活性剂(选自以下组：烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物和/或其混合物)；兼性离子和/或两性清洁表面活性剂(选自以下组：链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂；及其混合物。
组合物可以任选地包含由两亲烷氧基化油脂清洁聚合物组成的表面活性增强聚合物(选自以下组：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物，例如烷氧基化聚亚烷基亚胺(在0.05wt％-10wt％范围内))，和/或无规接枝聚合物(典型地包含亲水主链，该亲水主链含有选自下组的单体，该组由以下组成：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(例如甘油)及其混合物；以及一个或多个疏水侧链，该疏水侧链选自下组，该组由以下组成：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的C1-C6单羧酸的乙烯酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯及其混合物)。
组合物可以包含另外的聚合物，例如污垢释放聚合物(包括阴离子封端的聚酯(例如SRP1)；包含至少一种单体单元的聚合物(处于无规或嵌段构型)，该单体单元选自糖、二羧酸、多元醇及其组合；基于乙二醇对苯二甲酸酯的聚合物及其处于无规或嵌段构型的共聚物，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6、Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325、Marloquest SL)；抗再沉积聚合物(0.1wt％至10wt％，包括羧酸酯聚合物，例如包含至少一种单体的聚合物，该单体选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或聚乙二醇，分子量范围为从500至100,000Da)；纤维素聚合物(包括选自以下各项的那些：烷基纤维素；烷基烷氧基烷基纤维素；羧基烷基纤维素；烷基羧基烷基纤维素，其实例包括羧基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧基甲基纤维素；及其混合物)；以及聚合羧酸酯(例如，马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。
组合物可以进一步包含：饱和或不饱和的脂肪酸，优选饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0wt％至10wt％)；沉积助剂(其实例包括多糖；优选纤维素聚合物；聚联丙烯二甲基卤化铵(DADMAC))；和DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉卤化物及其混合物的共聚物(处于无规或嵌段构型)；阳离子瓜尔胶；阳离子纤维素，例如阳离子羟乙基纤维素；阳离子淀粉；阳离子聚丙烯酰胺；及其混合物。
该组合物可以进一步包含染料转移抑制剂，其实例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)；二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)；羟基乙烷二膦酸(HEDP)；乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；二乙撑三胺五乙酸(DTPA)；丙二胺四乙酸(PDTA)；2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)；或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)；次氮基三乙酸(NTA)；4,5-二羟基间苯二磺酸；柠檬酸及其任何盐；N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)及其衍生物。
组合物可以任选地包含选自以下的酶(通常约0.01wt％活性酶至0.5wt％活性酶)：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其任何混合物。组合物可以包含酶稳定剂(其实例包括多元醇，例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；可逆蛋白酶抑制剂；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯；或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸)。
该组合物可以进一步包含硅树脂或基于脂肪酸的泡沫抑制剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、抗泡沫剂(0.001wt％至约4.0wt％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％至5wt％，选自下组，该组由以下组成：甘油二酸酯和甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、及其混合物)。
组合物可以是任何液体形式，例如液体或凝胶形式，或其任何组合。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物以单位剂量形式提供，包括片剂、胶囊、药袋、小袋和多隔室小袋。在一些实施例中，单位剂量形式被设计成在多隔室小袋(或其他单位剂量形式)内提供对成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式是本领域已知的(对于适合用于单位剂量和控制释放形式的材料，参见例如EP 2100949、WO 02/102955、US 4,765,916、US 4,972,017以及WO 04/111178)。在一些实施例中，单位剂量形式由用水溶性膜或水溶性小袋包裹的片剂提供。在EP 2100947和WO 2013/165725中提供了各种单位剂量形式，并且是本领域已知的。
在一些实施例中，该清洁组合物是具有变体丝氨酸蛋白酶多肽蛋白酶的高密度粉末(HDD)组合物。该HDD粉末衣物洗涤剂可以包含清洁表面活性剂，该清洁表面活性剂包括阴离子清洁表面活性剂(例如直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)、非离子清洁表面活性剂(例如直链或支链或无规链、取代或未取代的C8-C18烷基乙氧基化物和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)、阳离子清洁表面活性剂(例如烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物，烷基三元锍化合物及其混合物)、兼性离子和/或两性清洁表面活性剂(例如链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂及其混合物；助洗剂(无磷酸盐助洗剂(例如沸石助洗剂，其实例包括在0wt％至小于10wt％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)；磷酸盐助洗剂[其实例包括在0wt％至小于10wt％范围内的三聚磷酸钠]；在小于15wt％范围内的柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸或其盐)；硅酸盐(例如，在0wt％至小于10wt％范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠)或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(例如，在0wt％至小于10wt％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂(包括光漂白剂(例如磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物))；疏水或亲水漂白活化剂(例如，十二烷酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基邻羟苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、和壬酰基氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵盐(nitrile quats)、及其混合物)；过氧化氢源(例如，无机过氧化氢合物盐，其实例包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单或四水合钠盐)；预成型的亲水和/或疏水性过酸(例如过羧酸和盐、过碳酸和盐、过亚胺酸和盐、过氧单硫酸和盐)及其混合物和/或漂白催化剂(例如亚胺漂白增效剂(例如亚胺阳离子和聚离子))；亚胺兼性离子；改性胺；改性氧化胺；N-磺酰亚胺；N-膦酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物；和含金属的漂白催化剂(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子(例如锌或铝)以及螯合剂例如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐)。
组合物可以进一步包含酶，例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其任何混合物。
组合物可以进一步包含另外的洗涤剂成分，包括香料微囊剂、淀粉包封的香料协调剂、调色剂、另外的聚合物(包括织物完整性和阳离子聚合物)、染料锁定成分、织物柔顺剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化多胺、织物沉积助剂和/或环糊精。
在一些实施例中，清洁组合物是具有本发明的丝氨酸蛋白酶的自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物。该ADW洗涤剂组合物可以包含两种或更多种选自下组的非离子表面活性剂：乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇或胺氧化物表面活性剂，它们以0％至10％(以重量计)的量存在；在5％-60％范围内的助洗剂，该助洗剂包括：磷酸盐助洗剂(单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚磷酸盐，优选三聚磷酸钠-STPP)，或无磷酸盐助洗剂[基于氨基酸的化合物，其实例包括MGDA(甲基-甘氨酸-二乙酸)及其盐和衍生物、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)及其盐和衍生物、IDS(亚氨基二琥珀酸)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物及其混合物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)及其盐]，多元羧酸及其部分或完全中和盐的均聚物和共聚物，单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐，它们在0.5％至50％(以重量计)的范围内；磺化/羧化聚合物(为产品提供尺寸稳定性)，其在约0.1％至约50％(以重量计)的范围内；在约0.1％至约10％(以重量计)的范围内的干燥助剂(选自聚酯，特别是任选地与有助于缩聚作用的具有3至6个官能团(特别是酸、醇或酯官能团)的另外的单体一起的阴离子聚酯，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其反应性环状碳酸酯和脲的前体化合物)；在约1％至约20％(以重量计)的范围内的硅酸盐(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)；无机漂白剂(例如过氧化氢合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，特别是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸和二过氧十六烷二酸)。漂白活化剂-有机过酸前体，其在约0.1％至约10％(以重量计)的范围内；漂白催化剂(选自锰三氮杂环壬烷及相关络合物、Co、Cu、Mn和Fe双吡啶胺及相关络合物、以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物)；在约0.1％至5％(以重量计)的范围内的金属护理剂(选自苯并三氮唑、金属盐和络合物、和/或硅酸盐)；每克自动餐具洗涤剂组合物的在约0.01mg至5.0mg范围内的活性酶的酶(酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、和木糖苷酶、及其任何混合物)；以及酶稳定剂组分(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。
可以包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的代表性洗涤剂配制品可以在WO 2013063460，第78-152页，并且特别是第94-152页的表格中找到。丝氨酸蛋白酶典型地以按组合物重量计的从0.00001％至10％的酶蛋白质的水平掺入洗涤剂组合物中。在一些实施例中，洗涤剂组合物包含以组合物重量计超过0.0001％、0.001％、0.01％、或0.1％的丝氨酸蛋白酶。在一些实施例中，洗涤剂组合物包含以组合物重量计少于1％、0.1％、0.01％、或0.001％的丝氨酸蛋白酶。
还提供了使用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。织物处理的方法是本领域中熟知的(参见例如，US 6,077,316)。例如，可以通过包括使织物与溶液中的丝氨酸蛋白酶接触的方法来改善织物的手感和外观。织物可以在压力下用溶液进行处理。
可以在纺织品的编织期间或之后或在脱浆阶段期间或一个或多个另外的织物加工步骤中应用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在纺织品的编织期间，使线暴露于相当大的机械应变。在机械织机上编织之前，常常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆经纱以增加其抗张强度并防止断开。可在编织期间或之后应用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以除去这些上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，可以在进一步处理织物之前使用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来除去浆涂层以确保均一和耐洗的结果。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以单独使用或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用，以作为清洁剂添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉的织物)脱浆。淀粉酶还可以用于在靛蓝染色的牛仔织物和服装上产生石磨的外观的组合物和方法中使用。对于服装生产而言，织物可被裁剪和缝制成服装或衣服，其随后被精整(finish)。特别地，对于牛仔布的生产，开发了不同的酶促精整方法。牛仔衣服的精整加工通常是以酶促脱浆步骤开始的，其中使衣服经受淀粉水解酶的作用以为织物提供柔软性，并且使棉更易于进行随后的酶促精整加工步骤。丝氨酸蛋白酶可以用于下列方法中：精整加工牛仔服装(例如“生物磨砂方法”)、酶促脱浆并为织物提供柔软性和/或精整加工方法。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于酶辅助去除蛋白质，该蛋白质来自动物及其随后的降解或处理，例如羽毛、皮肤、毛发、兽皮等。在一些情况下，与在滚烫的水或去毛工艺中的传统浸泡相比，将动物尸体浸泡在包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的溶液中可以起到保护皮肤免受损伤的作用。在一个实施例中，羽毛可以在适合于消化或引发羽毛退化的条件下用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进行喷雾。在一些实施例中，如上所述，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以与氧化剂组合使用。
在一些实施例中，通过使用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来辅助与未加工的羽毛相关的油或脂肪的去除。在一些实施例中，将丝氨酸蛋白酶多肽在用于清洁羽毛的组合物中使用，并且用来对纤维进行消毒和部分脱水。在又其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于从羽毛中回收蛋白质。在一些其他实施例中，在具有或没有约0.5％(v/v)的表面活性剂的情况下，将丝氨酸蛋白酶多肽与95％乙醇或其他极性有机溶剂组合应用于洗涤溶液中。在又其他实施例中，所披露的蛋白酶多肽可用于从羽毛中回收蛋白质。所披露的蛋白酶多肽可以单独使用或与合适的羽毛加工和蛋白水解方法(例如在PCT/EP 2013/065362、PCT/EP 2013/065363、和PCT/EP 2013/065364中公开的那些，其通过引用特此结合)组合使用。在一些实施例中，回收的蛋白质随后可以用于动物或鱼类饲料中。
在本发明的进一步方面，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用作动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品的组分。另一个实施例涉及制备这样的动物饲料、动物饲料添加剂和/或宠物食品组合物的方法，该方法包括将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分进行混合。另外，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于制备动物饲料和/或动物饲料添加剂和/或宠物食品组合物。
术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在具体的实施例中，该动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于：猪(pig和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、小鸡、肉仔鸡、蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类，例如虾和对虾。在进一步的实施例中，动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
在本发明上下文中，术语“宠物食品”旨在被理解为意指用于以下各项的食物：家庭动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行动物宠物，例如海龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。
术语“动物饲料组合物”、“饲料”和“喂养料”可互换地使用，并且包含选自以下组的一种或多种饲料原料，该组包括：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，例如玉米或高粱；b)来自谷类的副产品，例如玉米谷蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(Distillers DriedGrain Solubles)(DDGS)(特别是基于玉米的干酒糟谷物可溶物(cDDGS))、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘洛；c)获自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于纸浆(例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐法制备的纸浆)的酶辅助漂白。一般来说，将纸浆与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在适合于漂白纸浆的条件下一起孵育。在一些实施例中，纸浆是不含氯的纸浆，该纸浆经氧、臭氧、过氧化氢或过氧酸进行漂白。在一些实施例中，枯草杆菌蛋白酶变体用于展示出低木质素含量的纸浆的酶辅助漂白，该纸浆是通过经改良的制浆方法或连续制浆方法生产的。在一些其他实施例中，枯草杆菌蛋白酶变体单独地应用或优选地与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合应用。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于组织的酶辅助清创。这涉及去除死亡或受损的组织，例如从伤口去除以帮助愈合。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于组织培养。具体地，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以用于(例如在收获细胞过程中)悬浮或再悬浮附着于细胞培养壁的细胞。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以用于切割培养细胞与培养皿之间的蛋白质键，从而允许细胞悬浮于溶液中。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用作食品添加剂、消化助剂或食品加工助剂。
实例
提供以下实例以证明和说明本披露的某些优选实施例和方面，并且不应被解释为限制性的。
在下面的实验披露中，应用以下缩写：ADW(自动餐具洗涤)；BMI(血液、奶和墨汁)；BSA(牛血清白蛋白)；CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)；CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)；DMC(二甲基酪蛋白)；HDD(重垢干/粉末)；HDL(重垢液体)；HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；MTP(微量滴定板)；ND(未完成)；OD(光密度)；PAS(丙烯酸纤维样品)；PCR(聚合酶链反应)；ppm(百万分率)；QS(数量足够)；rpm(每分钟转动次数)；AAPF(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺)；TNBSA(2,4,6-三硝基苯磺酸)；v/v(体积比体积)；w/v(重量比体积)。
实例1
吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的异源表达
使用常规分子生物学技术进行产生吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的DNA操作(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning[分子克隆]：Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社])。如随后实例中所述地表达和回收所有枯草杆菌蛋白酶。产生一系列人工DNA序列，所述人工DNA序列编码将多个氨基酸修饰引入野生型吉氏芽孢杆菌进化枝Bgi02446蛋白酶的序列中的成熟吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶序列，该野生型蛋白酶更全面地描述于国际专利申请号PCT/US 2014/070107中，并且作为AprBG描述于Deng等人，J.Microbiol.Biotechnol.[微生物学与生物技术杂志](2014),24(2),197-198(登录号AGS78407.1)中。
实例2
使用天然Bgi02446前肽序列或来自迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的前肽序列
表达成熟枯草杆菌蛋白酶的吉氏芽孢杆菌进化枝BSP-00801
表征在迟缓芽孢杆菌前序列(SEQ ID NO:5)的控制下表达的经加工的成熟酶BSP-00801，并显示其氨基酸序列为在N末端具有QQ的269个氨基酸(氨基酸序列为SEQ ID NO:18，并且核苷酸序列为SEQ ID NO:15)。表征在Bgi02446前序列(SEQ ID NO:4)的控制下表达的经加工的成熟酶BSP-00801，并显示其氨基酸序列为在N末端具有单个Q的268个氨基酸(SEQ ID NO:20)。BSP-00801的前酶原的氨基酸序列是SEQ ID NO:16。该酶原的氨基酸序列为SEQ ID NO:17。
表征在迟缓芽孢杆菌前序列(SEQ ID NO:5)的控制下表达的经加工的成熟酶Bgi02446，并显示其氨基酸序列为在N末端具有QQ的269个氨基酸(SEQ ID NO:85)。表征在Bgi02446前序列(SEQ ID NO:4)的控制下表达的经加工的成熟酶Bgi02446，并显示其氨基酸序列为在N末端具有单个Q的268个氨基酸(SEQ ID NO:19)。
在表3、4和5中鉴定的经加工的成熟酶的氨基酸序列在Bgi02446前序列的控制下表达，并且基于对同源丝氨酸蛋白酶如BPN'(Wells等人，1983，Nucleic Acids Res[核酸研究]，11:7911-25)和PB92蛋白酶(van der Laan等人，1991，Appl Environ Microbiol[应用与环境微生物学]，57:901-909)中过早接合的知识，预测该氨基酸序列为在N末端具有QQTVP的269个氨基酸，但是相反地观察到了QTVP。
根据以下方法，在实例5中使用的经加工的成熟酶BSP-00801(SEQ ID NO:18)在迟缓芽孢杆菌前序列(SEQ ID NO:5)的控制下表达。2015年6月17日提交的美国临时专利申请号62/181192(代理人案号：40947)中阐述了经由Bgi02446前序列和迟缓芽孢杆菌前序列表达BSP-00801成熟酶的方法的更详细描述。
将包含枯草芽孢杆菌aprE启动子(SEQ ID NO:1)、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列(核苷酸序列为SEQ ID NO:2并且氨基酸序列为SEQ ID NO:3)、来自吉氏芽孢杆菌Bgi02446(SEQ ID NO:4)或来自迟缓芽孢杆菌(SEQ ID NO:5)的前序列、以及对应于吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶BSP-00801(SEQ ID NO:6)的基因的序列的DNA盒通过使用表1中列出的引物进行扩增来合成。使用本领域已知的技术，使用Gibson组件(SGI DNA Cat#GA1100-10)组装PCR片段以制备最终表达盒。在氯霉素选择下将细胞进行转化并在脱脂乳板上生长。
表3、4和5中所示的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶是使用如下表达盒在枯草芽孢杆菌中产生的，该表达盒由以下组成：枯草芽孢杆菌aprE启动子、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列(SEQ ID NO:3)、Bgi02446前序列、每种人工序列的成熟蛋白酶序列和BPN'终止子。将每个表达盒克隆到pHYT复制穿梭载体中并转化到合适的枯草芽孢杆菌菌株中。通过使用BstEII和EcoRI位点在四环素抗性基因之后添加终止子(SEQ ID NO:13)，从pHY300PLK(宝生物公司(Takara))衍生出pHYT载体。也使用克隆到BamHI和HindIII位点中的接头(SEQID NO:14)除去pHY300PLK中的HindIII位点。
为了生产表3、4和5中所示的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶，将用各种pHYT质粒转化的枯草芽孢杆菌宿主菌株在基于MOP缓冲液的富集的半定义培养基(以尿素为主要氮源、葡萄糖为主要碳源、并补充有1％大豆胨用于稳健的细胞生长)中培养。孵育后，通过离心和过滤从生长培养基中分离分泌的蛋白酶。如下所述，将澄清的培养物上清液用于测定和纯化。
实例3
吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶活性
通过测量二甲基酪蛋白(DMC)底物的水解来测试在表3、4和5中所示的Bgi02446和吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶活性。用于DMC测定的试剂溶液是：在100mM碳酸钠缓冲液(pH 9.5)中的2.5％w/v DMC(西格玛公司(Sigma)C-9801)，在试剂A中的0.075％TNBSA(赛默科技公司(Thermo Scientific))。试剂A：在15mL 4N NaOH中的45.4gNa2B4O7.10H20(默克公司(Merck))以在去离子水中达到1000mL的最终体积。将蛋白酶上清液在稀释溶液(10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％Tween-80)中稀释至所希望的浓度，以在5min的水解期间获得线性响应。向96孔微量滴定板(MTP)装填95μl DMC底物，随后添加5μl稀释的蛋白酶上清液。然后添加100μL在试剂A中的TNBSA，缓慢混合。使用SpectraMax板读数器以动力学方式在室温下经5min在405nm下测量活性。从每个样品读数中减去不含蛋白酶的空白的吸光度。将蛋白酶活性表达为mOD/min。
通过测量N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白(DMC)的水解来测试表7中所示的Bgi02446和吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶活性。用于AAPF水解测定的试剂溶液是：含有0.005％的100mM Tris/HCl(pH 8.6)(Tris稀释缓冲液)；含有10mM CaCl2和0.005％(Tris/Ca缓冲液)的100mM Tris缓冲液(pH 8.6)；和在DMSO(suc-AAPF-pNA储备溶液)(西格玛公司：S-7388)中的160mM suc-AAPF-pNA。为了制备底物工作溶液，将1ml的suc-AAPF-pNA储备溶液添加到100ml Tris/Ca缓冲液中并充分混合。将酶样品添加到含有1mg/suc-AAPF-pNA工作溶液的MTP板(Greiner 781101)中，并且使用SpectraMax板读数器以动力学方式在室温下经3分钟内在405nm下测量活性。从每个样品读数中减去不含蛋白酶的空白的吸光度。将蛋白酶活性表达为mOD min-1。
实例4
吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的清洁性能和稳定性的测量
使用Zorbax 300SB-C3柱通过UHPLC测定培养物上清液中蛋白酶的浓度。将培养物上清液在稀释缓冲液(Tris 25mM，pH 7.4，5mM CaCl2)中适当稀释。用缓冲液A(0.1％三氟乙酸)和缓冲液B(0.07％乙腈)的梯度从该柱中洗脱样品。基于纯化的亲本酶的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。
使用GSM-B配方(参见表2)(pH 10.5)和蛋黄微型样品(PAS-38，荷兰符拉尔丁根(Vlaardingen)测试材料BV中心(Center for Testmaterials BV))在基于餐具的应用(ADW)中测量每种吉氏芽孢杆菌进化枝蛋白酶的清洁性能。在ADW性能测定中使用的预先穿孔的PAS-38样品是冲洗过的或未冲洗的。为了制备冲洗过的PAS38样品，将180μl的10mMCAPS缓冲液(pH 11)添加到含有PAS38微型样品的MTP中。将板密封并在iEMS培养箱中在60℃和1100rpm摇动下孵育30min。孵育后，除去缓冲液，并用去离子水冲洗样品以除去任何残留的缓冲液。用于性能测定之前将板风干。在酶添加之前，在374ppm水硬度下，用3g/l的GSM-B溶液装填微型样品板。
使用BMI微型样品(棉布上的血液/奶/墨汁)(EMPA-116，荷兰符拉尔丁根的测试材料BV中心)测试每种吉氏芽孢杆菌进化枝蛋白酶的衣物(HDL)清洁性能。使用预先穿孔(以适应MTP)和装填的含有微型样品的板。在酶添加之前，在250ppm水硬度下，用2.7g/lPersil Non-Bio(联合利华公司(Unilever))液体洗涤剂装填微型样品板，所述液体洗涤剂是不含硼或酶的商业液体洗涤剂并购买其用于本测试中。
孵育后(PAS-38样品在40℃孵育30分钟并且EMPA116样品在25℃孵育15分钟)，使用SpectraMax板读数器在405nm处读取EMPA-116和PAS-38样品的吸光度。通过从每个样品值中减去空白对照(无酶)的值(以下为“减去空白的吸光度”)来获得吸光度结果。对于每种条件和吉氏芽孢杆菌进化枝蛋白酶，通过将减去空白的吸光度除以相同浓度的亲本蛋白酶的吸光度来计算性能指数(PI)。从亲本蛋白酶的标准曲线确定亲本蛋白酶的值，该亲本蛋白酶包括在该测试中并拟合至朗缪尔(Langmuir)拟合或Hill Sigmoidal拟合。
为了测量稳定性，在胁迫缓冲液中进行吉氏芽孢杆菌进化枝蛋白酶的适当稀释。随后使用实例3中所述的DMC测定在加热孵育步骤之前和之后测量蛋白酶的蛋白水解活性。选择热孵育步骤的温度和持续时间，使得参比蛋白酶显示约30％的残留活性。在Tris-EDTA(50mM Tris pH 9；1mM EDTA；0.005％Tween)缓冲的条件下测量稳定性。％残留活性是通过取胁迫活性与非胁迫活性的比例并乘以100来计算的。稳定性PI通过将吉氏芽孢杆菌进化枝蛋白酶的残留活性除以亲本蛋白酶的残留活性而获得。
将表4中所示的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶BSP-00801用作亲本蛋白酶，并进行进一步诱变以提供表5中所示的BSP-00801变体。如下文所述的表中所用的ND意指未确定。
实例5
吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶BSP-00801的晶体结构
在迟缓芽孢杆菌前序列的控制下，根据实例1和2中所示的方法产生吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶BSP-00801。
为了纯化吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶BSP-00801，将培养物上清液用1mM氯化钙对25mM MES(pH 5.4)进行透析。然后将样品过滤并应用到用25mM MES(pH 5.4)和1mM氯化钙平衡的阴离子交换色谱柱(Source 15S，美国GE医疗集团(GE Healthcare))上。将蛋白质用线性氯化钠梯度洗脱。分离目的蛋白质并添加丙二醇至40％终浓度。
吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶BSP-00801(SEQ ID NO:18)的三维结构使用X射线晶体学测定。在具有单位晶胞大小a＝75.19、b＝75.19、c＝和γ＝120°的不对称单位中具有1个分子的分辨率为的空间群P6122中测定BSP-00801枯草杆菌蛋白酶的结构。从在25mM MES pH 5.4+1mM氯化钙+40％丙二醇溶液中的22.2mg/mL蛋白质开始通过悬滴法获得晶体。储库溶液(reservoir solution)含有2.0M硫酸铵+5％异丙醇。将等量的蛋白质溶液和储库溶液混合并允许其平衡。在Bruker X8Proteum系统(布鲁克轴线有限公司(Bruker Axis Inc.)，美国威斯康星州麦迪逊)上收集数据。使用以迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶pdb条目1JEA的坐标作为起始模型的分子置换来确定结构。使用程序COOT(Emsley，P等人，Acta Cryst.[晶体学报]D66486-501，2010)将BSP-00801的坐标拟合在所得的电子密度中。在拟合和重新拟合调节之后，使用具有CCP4软件套件中的标准默认值的REFMAC程序对坐标进行了细化。最终的模型具有良好的立体化学，并且对于分辨率至的所有数据R-work为0.19以及R-free为0.25。
在图1中将吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶BSP-00801的结构与另一商业枯草杆菌蛋白酶：枯草杆菌蛋白酶BPN'和迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的主链折叠进行了比较。这些结构是同源的，具有共同的催化三联体，在BSP-00801的情况下，该三联体对应于残基Asp 32、His 62和Ser 215。
相对于亲本吉氏芽孢杆菌进化枝Bgi02446，存在于BSP-00801变体中的取代(A37T/N；S39E；I43V；A47V；I80V；N85S；E87D；S99R；T114A；F128A)显示于图2中。发现这些取代分布在结构的两个区域中。像大多数枯草杆菌蛋白酶一样，BSP-00801具有两个钙结合位点。第一个位点的特征在于具有非常高的亲和力并且与洗涤剂中分子的稳定性相关。如图2所示，当与Bgi02446相比时，在BSP-00801中发现的十个取代中的八个取代位于形成该紧密结合位点的环上，或者位于沿着从该钙位点延伸的表面上。刚刚提到的表面由一系列外部环组成，该外部环包括以下残基：25-27、37-43、47-48、55-57、72-74、85-87和114-117。对应于亚位点S4-S1的底物结合区域的三个环，它们对应于BSP-00801：97-102、124-130和154-161中的残基。在这些环中的两个环上发现了其他两个取代S99R和F128A，如图3所示。
已经鉴定了进一步增强吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶BSP-00801变体的性能的另外的位点，并且发现这些位点中的六个位点沿着先前鉴定的两个区域均匀分布。图4的方向与图2相同以便于比较。在图4中，十个原始取代以浅灰色显示，并且另外六个位点处的残基的侧链显示为黑色棒。位点N42T、S56Y和N74D位于沿着发现了BSP-00801取代中的八个取代的同一表面上。图5以与图3类似的视图显示，其允许观察N74D位点，以与形成亚位点S4-S1的环上发现的三个另外的位点V102I、S126T和S158T进行比较。
在图13中显示了在上述区域没有发现的一个取代。在该图中，相对于在这个方向上可见的其他位点中的一些，可以看见N242D取代的位置。令人惊奇地，该位点位于远离底物结合表面和在第一钙结合位点附近的表面。发现N242D靠近第二钙结合位点。
实例6
同源蛋白酶的鉴定
依靠NCBI非冗余蛋白质数据库，对预测的BSP-00801成熟形式(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列(269个残基)进行BLAST搜索(Altschul等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]，25:3389-402，1997)。使用SEQ ID NO:18作为查询序列，将搜索参数设置为默认值，依靠基因组查询专利(Genome Quest Patent)数据库进行类似的搜索。表6-1和6-2中显示了搜索结果的子集。将两个搜索集的百分比同一性(PID)定义为相同残基的数量除以成对比对中比对的残基的数量。标记为“序列长度”的栏是指与列出的登记号相关的蛋白质序列的长度(以氨基酸计)，而标记为“比对长度”的栏是指用于PID计算的比对的蛋白质序列的长度(以氨基酸计)。
实例7
吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的序列分析
表3的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的预测的成熟形式的氨基酸序列；披露于国际专利申请号PCT/US 2014/070107中的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶DSM 9728、DSM9729、DSM 9730、DSM 9731和Bgi02446；以及表6-1和6-2中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列的比对显示于图6A-F中。表4的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的预测的成熟形式的氨基酸序列；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶Bgi02446；以及表6-1中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列的比对显示于图7A-F中。表5的多个吉氏芽孢杆菌进化枝BSP-00801变体枯草杆菌蛋白酶的预测的成熟形式的氨基酸序列；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶Bgi02446；以及表6-1中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列的比对显示于图8A-F中。使用CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680，1994)用默认参数对这些序列进行比对。
使用表3的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的预测的成熟形式的氨基酸序列；披露于国际专利申请号PCT/US 2014/070107中的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶DSM 9728、DSM 9729、DSM 9730、DSM 9731和Bgi02446；以及表6-1和6-2中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列建立图9中所示的系统发生树。从图9中可见，表3枯草杆菌蛋白酶聚集在与形成吉氏芽孢杆菌进化枝的WO 2015/089447中披露的DSM 9728、DSM 9729、DSM 9730、DSM 9731和Bgi02446枯草杆菌蛋白酶相同的区域中，并且因此表3枯草杆菌蛋白酶是吉氏芽孢杆菌进化枝的一部分。
使用表4的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的预测的成熟形式的氨基酸序列；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶Bgi02446；以及表7-1中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列建立图10中所示的系统发生树。从图9和10中可见，表4枯草杆菌蛋白酶聚集在与DSM9728、DSM 9729、DSM 9730、DSM 9731和Bgi02446枯草杆菌蛋白酶相同的区域中，并且因此表4枯草杆菌蛋白酶是吉氏芽孢杆菌进化枝的一部分。
使用表5的多种吉氏芽孢杆菌进化枝BSP-00801变体枯草杆菌蛋白酶的预测的成熟形式的氨基酸序列；吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶Bgi02446；以及表7-1中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列建立图11中所示的系统发生树。从图9和11中可见，表5枯草杆菌蛋白酶聚集在与DSM 9728、DSM 9729、DSM 9730、DSM 9731和Bgi02446枯草杆菌蛋白酶相同的区域中，并且因此表5枯草杆菌蛋白酶是吉氏芽孢杆菌进化枝的一部分。当生成表5的所有吉氏芽孢杆菌进化枝BSP-00801变体枯草杆菌蛋白酶的系统发生树时，它们都落在吉氏芽孢杆菌进化枝中(数据未显示)。
在Vector NTI Advance套件中输入序列，并且使用邻接(NJ)法创建引导树(GuideTree)(Saitou和Nei，Mol Biol Evol[分子生物学与进化]，4:406-425，1987)。NJ方法对在待分析的所有序列对之间的距离矩阵产生影响。这些距离与序列之间的散度有关。在序列比对后计算引导树。使用以下参数计算树构建：针对序列距离的木村(Kimura)校正并且忽略具有空位的位置。使用MEGA 6程序来显示图9-11中所显示的系统发生树。
实例8
列于表3中的吉氏芽孢杆菌进化枝蛋白酶的独特特征
使用CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]，22:4673-4680，1994)用默认参数比对表3的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的预测的成熟形式的氨基酸序列和Bgi02446。比对显示，表3枯草杆菌蛋白酶共享在Asp(D)32和His(H)65之间延伸的基序，其中该比对显示于图12A-C中。在所有这些酶中，该催化三联体由Asp(D)32、His(H)62和Ser(S)215形成。基序DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXPTTADLNX HGTH(SEQ ID NO:71)或DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXXTTADLXXHGTH(SEQ ID NO:72)含有对表3的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶以及先前鉴定的在WO 2015/089447中披露的吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶来说是独特的序列TTADL。在图6A-F中进行比对的所有吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶共享基序DXGIXXHSDLXXXGG ASXXXXXPTTADLNXHGTH(SEQ ID NO:71)或DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXXTTADLXXHGTH(SEQ ID NO:72)，所述基序更全面地描述于WO 2015/089447中。
实例9
测量另外的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的清洁性能和稳定性
在实例3中所述的微型样品规模清洁性能和稳定性测试中测试在以下表7中所显示的另外的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶。使用迟缓芽孢杆菌前肽序列用于表达，如实例2中所述产生这些蛋白质。
实例10
吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的序列分析
Bgi02446、吉氏芽孢杆菌进化枝BSP-00801变体枯草杆菌蛋白酶以及表7的多种吉氏芽孢杆菌进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列比对显示于图14A-F中。使用CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680，1994)用默认参数对这些序列进行比对。使用表7的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列，在WO 2015/089447中所披露的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶DSM 9728、DSM 9729、DSM 9730、DSM 9731和Bgi02446；表6-1和6-2中列出的多种蛋白酶的氨基酸序列；以及BgAP变体ML2、ML4、MT1、MT2、MF1的氨基酸序列(描述于Martinez等人，Biotechnology and Bioengineering[生物技术和生物工程]，2012)建立图15中所示的系统发生树。

Claims (31)

1.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:85在选自以下的位置处的两个、三个或四个或更多个变异：
(i)1、4、9、21、24、27、36、37、39、42、43、44、47、54、55、56、74、80、85、87、99、102、114、117、119、121、126、128、131、143、144、158、159、160、169、182、188、190、197、198、212、224、231、232、237、242、245、246、254、255、256、和257；
(ii)37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；
(iii)39、99、126、和128；
(iv)39，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；
(v)56，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、80、85、87、99、114、126、128、和242；
(vi)114，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、126、128、和242；
(vii)126，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、128、和242；
(viii)242，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；
(ix)99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：39、56、114、126和242；
(x)39+242，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；或
(xi)39+99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37、47、56、80、85、87、114、126、和242；
条件是所述两个、三个或四个或更多个变异中的一个或多个是非天然存在的；
其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
2.如权利要求1所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:85的选自以下的两个、三个或四个或更多个变异：
(i)1A、4I、9S、21V、24F、27K、36A、37T/N、39E、42T、43V、44S、47V、54S、55M/G、56N/Y、74D、80V、85S、87D、99R、102I、114A/P/Q、117I、119V、121S、126T、128A、131T、143A/T/Q、144G、158T、159I、160S、169L、182S、188A、190L、197I、198G、212S/T/K、224I/V、231K、232N、237T、242D/Q、245L、246S/K、254T、255N、256L、和257Y；
(ii)37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；或
(iii)39E、99R、126T、和128A；
(iv)39E，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；
(v)56N/Y，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、39E、47V、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；
(vi)114A/P/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、126T、128A、和242D/Q；
(vii)126T，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、128A、和242D/Q；
(viii)242D/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、和128A；
(ix)99R+128A，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：39E、56N/Y、114A/P/Q、126T、和242D/Q；
(x)39E+242D/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、和128A；或
(xi)39E+99R+128A，其与一个或多个在选自以下的位置处的变异相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、114A/P/Q、126T、和242D/Q。
3.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个在选自以下的位置处的氨基酸取代：
(i)1、4、9、21、24、27、36、37、39、42、43、44、47、54、55、56、74、80、85、87、99、102、114、117、119、121、126、128、131、143、144、158、159、160、169、182、188、190、197、198、212、224、231、232、237、242、245、246、254、255、256、和257；
(ii)37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；
(iii)39、99、126、和128；
(iv)39，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、128、和242；
(v)56，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、80、85、87、99、114、126、128、和242；
(vi)114，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、126、128、和242；
(vii)A/S126，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、128、和242；
(viii)N242，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、39、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；
(ix)99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：39、56、114、126和242；
(x)39+242，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、47、56、80、85、87、99、114、126、和128；或
(xi)39+99+128，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：37、47、56、80、85、87、114、126、和242；
条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的；
其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:85的氨基酸序列相对应来编号。
4.如权利要求3所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：
(i)Q1、V4、S/T9、I/V21、S24、K/R27、S36、Q/T/S/A37、S/P/T39、N/T42、I43、R/S44、A/V47、P/S54、S/T55、T56、N74、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、I/V102、A/T114、M117、I119、N121、A/S126、A/F128、I/S/T131、Q/R143、D/G144、N/S158、I/V159、G160、M169、N/S182、S/T188、I190、V197、G/N198、N/P212、A/V224、K/R231、N/Y232、A/N237、N242、K245、N246、S254、S255、Q256、和F257；
(ii)Q/T/S/A37、S/P/T39、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/S126、A/F128、和N242；
(iii)S/P/T39、S/R99、A/S126、和A/F128；
(iv)S/P/T39，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/S126、A/F128、和N242；
(v)T56，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、S/P/T39、A/V47、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/S126、A/F128、和N242；
(vi)A/T114，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、S/P/T39、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/S126、A/F128、和N242；
(vii)A/S126，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、S/P/T39、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/F128、和N242；
(viii)N242，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、S/P/T39、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/S126、和A/F128；
(ix)S/R99+A/F128，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：S/P/T39、T56、A/T114、A/S126和N242；
(x)S/P/T39+N242，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、S/R99、A/T114、A/S126、和A/F128；或
(xi)S/P/T39+S/R99+A/F128，其与一个或多个在选自以下的位置处的氨基酸取代相组合：Q/T/S/A37、A/V47、T56、I/V80、N/S85、D/E/Q87、A/T114、A/S126、和N242。
5.如权利要求3所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：
(i)1A、4I、9S、21V、24F、27K、36A、37T/N、39E、42T、43V、44S、47V、54S、55M/G、56N/Y、74D、80V、85S、87D、99R、102I、114A/P/Q、117I、119V、121S、126T、128A、131T、143A/T/Q、144G、158T、159I、160S、169L、182S、188A、190L、197I、198G、212S/T/K、224I/V、231K、232N、237T、242D/Q、245L、246S/K、254T、255N、256L、和257Y；
(ii)37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；
(iii)39E、99R、126T、和128A；
(iv)39E，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；
(v)56N/Y，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、39E、47V、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、128A、和242D/Q；
(vi)114A/P/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、126T、128A、和242D/Q；
(vii)126T，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、128A、和242D/Q；
(viii)242D/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、39E、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、和128A；
(ix)99R+128A，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：39E、56N/Y、114A/P/Q、126T、和242D/Q；
(x)39E+242D/Q，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、99R、114A/P/Q、126T、和128A；或
(xi)39E+99R+128A，其与一个或多个在选自以下的位置处的取代相组合：37T/N、47V、56N/Y、80V、85S、87D、114A/P/Q、126T、和242D/Q。
6.如权利要求3-5中任一项所述的分离的枯草杆菌蛋白酶，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：
(i)Q1A、V4I、T9S、I21V、S24F、R27K、S36A、Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、N42T、I43V、R44S、A47V、P54S、S/T55G/M、T56N/Y、N74D、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、V102I、A/T114A/P/Q、M117I、I119V、N121S、A/S126T、F128A、I/S131T、Q/R143A/Q/T、D144G、N/S158T、V159I、G160S、M169L、N182S、S/T188A、I190L、V197I、N198G、N/P212K/S/T、A/V224I/V、R231K、Y232N、A/N237T、N242D/Q、K245L、N246K/S、S254T、S255N、Q256L、和F257Y；
(ii)Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、A/S126T、F128A、和N242D/Q；
(iii)S/P/T39E、S99R、A/S126T、和F128A；
(iv)S/P/T39E，其与一个或多个选自以下位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、A/S126T、F128A、和N242D/Q；
(v)T56N/Y，其与一个或多个选自以下位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、A47V、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、A/S126T、F128A、和N242D/Q；
(vi)A/T114A/P/Q，其与一个或多个选自以下位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/S126T、F128A、和N242D/Q；
(vii)A/S126T，其与一个或多个选自以下位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、F128A、和N242D/Q；
(viii)N242D/Q，其与一个或多个选自以下位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、S/P/T39E、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、A/S126T、和F128A；
(ix)S99R+F128A，其与一个或多个选自以下位置处的取代相组合：S/P/T39E、T56N/Y、A/T114A/P/Q、A/S126T和N242D/Q；
(x)S/P/T39E+N242D/Q，其与一个或多个选自以下位置处的取代相组合：Q/T/S/A37T/N、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、S99R、A/T114A/P/Q、A/S126T、和F128A；或
(xi)S/P/T39E+S99R+F128A，其与一个或多个选自以下位置处的取代相组合：Q/T/S/A37N/T、A47V、T56N/Y、I80V、N85S、E/Q87D、A/T114A/P/Q、A/S126T、和N242D/Q。
7.如权利要求1或2所述的分离的枯草杆菌蛋白酶，条件是：
(i)所述相对于SEQ ID NO:85的两个、三个或四个或更多个变异不是S39T+I21V+M122L+N177E；
(ii)所述相对于SEQ ID NO:85的两个、三个或四个或更多个变异不是S39E+N74D+D87E；
(iii)所述相对于SEQ ID NO:85的两个、三个或四个或更多个变异不是S39E+N74D+D87E+N253D；
(iv)所述相对于SEQ ID NO:85的两个、三个或四个或更多个变异不是I21V+S39E+N74D+D87E+M122L+N253D；
(v)所述相对于SEQ ID NO:85的两个、三个或四个或更多个变异不是Q37E+Q256E；和/或
(vi)当所述变体包含相对于SEQ ID NO:85在选自4、36、42、47、56、87、99、102、114、188、224、237、242、和255中的一个或多个位置处的变异时，所述相对于SEQ ID NO:85在位置21处的变异不是缬氨酸。
8.如权利要求3-6中任一项所述的分离的枯草杆菌蛋白酶，条件是：
(i)所述两个、三个或四个或更多个取代不是S39T+I21V+M122L+N177E；
(ii)所述两个、三个或四个或更多个取代不是S39E+N74D+D87E；
(iii)所述两个、三个或四个或更多个取代不是S39E+N74D+D87E+N253D；
(iv)所述两个、三个或四个或更多个取代不是I21V+S39E+N74D+D87E+M122L+N253D；
(v)所述两个、三个或四个或更多个取代不是Q37E+Q256E；和/或
(vi)当所述变体包含在选自4、36、42、47、56、87、99、102、114、188、224、237、242、和255中的一个或多个位置处的取代时，所述在位置21处的取代不是缬氨酸。
9.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含：
(i)相对于SEQ ID NO:85在选自56、114、和126的位置处的一个或多个变异；
(ii)相对于SEQ ID NO:85在选自56N/Y、114A/P/Q、和126T的位置处的一个或多个变异；
(iii)在选自56、114、和126的位置处的一个或多个氨基酸取代；
(iv)在选自T56、A/T114、和A/S126的位置处的一个或多个氨基酸取代；
(v)选自56N/Y、114A/P/Q、和126T的一个或多个氨基酸取代；或
(vi)选自T56N/Y、A/T114A/P/Q、和A/S126T的一个或多个氨基酸取代；
条件是所述两个、三个或四个或更多个取代或变异中的一个或多个是非天然存在的；
其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO：85的氨基酸序列相对应来编号。
10.如任一前述权利要求所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含一个或多个选自以下的氨基酸取代：
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42D；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-F128A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-F128A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-R143A；A037T-S039E-I043V-A047V-T055G-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-F128A-S158T-N212S；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-A237T-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-N242D；R027K-A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-R143A；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-N121S-F128A-N246S-S255N；A037T-S039E-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-F128A-R143A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-N085S-E087D-S099R-T114A-F128A-S158T-N212S；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-I119V-S126T-F128A；A037T-S039E-I043V-A047V-T055G-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114A-S126T-F128A-S158T；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-R143A-S158T-N242D；A037T-S039E-N042T-I043V-R044S-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A；A037T-S039E-N042T-I043V-R044S-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114A-I119V-S126T-F128A-F257Y；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114A-N121S-F128A-R143Q；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-S158T-N212S；S036A-S039E-I043V-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-F128A-A224V-S255N；A037T-S039E-I043V-A047V-T055G-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-T055G-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-R143A；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-R143A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-S158T-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-I119V-S126T-F128A-F257Y；A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-I119V-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-S158T-N212S-N242Q；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-T188A-I190L-F257Y；V004I-T009S-A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-F128A-A224V-K245L-S255N；A037T-S039E-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-R143A-N242D；A037T-S039E-N042T-A047V-T056Y-N074D-1080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-S158T-N212S-N242Q；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-S158T-N212S-K245L；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114P-S126T-F128A-R143T-S158T-N212K-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-R143A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-T055G-T056Y-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A；S036A-A037N-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-F128A-N242D-K245L-N246S-S255N；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-S158T-N212S-N242Q-K245L；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-I119V-S126T-F128A-S158T-G160S-N242D-F257Y；A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-N121S-F128A-N182S-I190L-K245L-N246S-S255N；A037T-S039E-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-R143A；A037T-S039E-I043V-A047V-T055G-N074D-I080V-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-I080V-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-S158T-N242D；A037T-S039E-N042T-A047V-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-N074D-N085S-E087D-S099R-T114A-S126T-F128A-S158T-N212S-N242Q-K245L；T009S-S036A-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-F128A-R143Q-N182S-T188A-I190L；A037T-S039E-I043V-A047V-T055G-N074D-1080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-S158T-N242D；A037T-S039E-I043V-A047V-T055G-N074D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-R143A-S158T-N212S；A037T-S039E-1043V-A047V-1080V-N085S-E087D-S099R-T114A-F128A-R143Q-N212S-A224V-Y232N-K245L-N246S-S255N；V004I-T000S-A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114A-N121S-F128A-R143Q-A224I-R231K-K245L；R027K-A037T-S039E-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-I119V-S126T-F128A-G160S-N242D-F257Y；R027K-A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126T-F128A-S158T-G160S-N242D-F257Y；R027K-A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-V102I-T114Q-S126T-F128A-T188A-I190L-F257Y；R027K-A037T-S039E-I043V-A047V-T056N-I080V-N085S-E087D-S099R-T114P-S126T-F128A-R143T-V159I-N212T-F257Y；A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099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11.如任一前述权利要求所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体进一步包含DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXPTTADLNXHGTH(SEQ ID NO：71)或DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXXTTADLXXHGTH(SEQ ID NO：72)基序，其中起始D是活性位点天冬氨酸残基，倒数第二个H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸。
12.如任一前述权利要求所述的变体，其中所述变体是吉氏芽孢杆菌(BacillusGibsonii)进化枝的成员。
13.如任一前述权利要求所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含与SEQID NO：18或85的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
14.如任一前述权利要求所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体来自包含DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXPTTADLNXHGTH(SEQ ID NO：71)或DXGIXXHSDLXXXGGASXXXXXXTTADLXXHGTH(SEQ ID NO：72)基序的亲本氨基酸序列，其中起始D是活性位点天冬氨酸残基，倒数第二个H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸。
15.如任一前述权利要求所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体来自与SEQID NO:18或85的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的亲本氨基酸序列。
16.如任一前述权利要求所述的变体，其中所述变体具有蛋白水解活性。
17.如任一前述权利要求所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中当与参比枯草杆菌蛋白酶相比时，所述变体具有一种或多种改进的性质；其中所述改进的性质选自改进的蛋白酶活性、改进的洗涤剂清洁性能和改进的洗涤剂热稳定性；并且其中所述洗涤剂任选地是无硼洗涤剂。
18.如权利要求17所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述改进的性质是
(i)改进的蛋白酶活性，其中所述变体对于N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物具有PI＞1；
(ii)改进的洗涤剂清洁性能，其中所述变体具有BMI和/或蛋污渍清洁PI＞1；和/或
(iii)改进的洗涤剂热稳定性，其中所述变体具有稳定性PI＞1。
19.如权利要求17或18所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述：
(i)蛋白酶活性根据实例3所述的蛋白酶活性测定进行测量；
(ii)洗涤剂清洁性能根据实例4所述的衣物和ADW洗涤剂测定中的清洁性能进行测量；和/或
(iii)洗涤剂热稳定性根据实例4所述的稳定性测定进行测量。
20.一种组合物，所述组合物包含一种或多种如任一前述权利要求所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述洗涤剂组合物选自衣物洗涤剂、织物柔顺洗涤剂、餐具洗涤剂和硬表面清洁洗涤剂。
23.如权利要求20-22中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种钙离子和/或锌离子；一种或多种酶稳定剂；从约0.001％至约1.0重量％的所述变体；一种或多种漂白剂；一种或多种辅助材料；和/或一种或多种选自下组的另外的酶或酶衍生物，该组由以下各项组成：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金属蛋白酶、另外的丝氨酸蛋白酶、及其组合。
24.如权利要求20-23中任一项所述的组合物，其中所述组合物不包含磷酸盐或包含磷酸盐和/或不包含硼或包含硼。
25.如权利要求20-24中任一项所述的组合物，其中所述组合物是颗粒、粉末、固体、棒状、液体、片剂、凝胶、糊剂或单位剂量组合物。
26.一种清洁方法，所述方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的如权利要求1-19中任一项所述的变体或如权利要求20-25中任一项所述的组合物接触；并且所述方法任选地进一步包括在使所述表面或物品与所述变体或组合物接触之后漂洗所述表面或物品的步骤。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述物品是餐具或织物。
28.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如权利要求1-19中任一项所述的变体的核酸序列。
29.一种表达载体或表达盒，所述表达载体或表达盒包含如权利要求28所述的多核苷酸。
30.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如权利要求28所述的多核苷酸或如权利要求29所述的载体或盒。
31.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-19中任一项所述的变体，其中所述组合物是消毒剂组合物、医疗器械清洁组合物、动物饲料组合物、隐形眼镜清洁组合物、伤口清洁组合物、或纺织品加工组合物、皮革加工组合物或羽毛加工组合物。
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