CN1231693A - 一种具有淀粉酶活性的酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型碱稳定的淀粉酶,一种包含该淀粉酶的酶组合物,以及该酶和酶组合物在多种工业应用中的用途。

Description

一种具有淀粉酶活性的酶
发明领域
本发明涉及一种新型碱稳定的淀粉酶，一种包含该淀粉酶的酶组合物，以及该酶和酶组合物在多种工业应用中的用途。
发明背景
α-淀粉酶已在工业上使用多年，并用于种种不同的目的，最重要的用途是淀粉液化，纺织原料脱浆，纸和纸浆工业中的淀粉改性，以及用于酿造和焙烤业。近年来日益重要的另一用途是在洗涤和洗碟子过程中去除淀粉性污渍。
由于Ca2+离子干扰在工业中的应用，因此在诸如洗衣和洗碟用的去污剂中不希望存在Ca2+离子，本发明的目的是提供一种碱稳定的淀粉酶，其在宽的金属离子(如Ca2+)浓度范围内稳定。
发明概述
本发明者令人惊奇的从一种中等热嗜碱性厌氧菌株Thermoalcalibacter bogoriae中发现了一种淀粉酶，该菌株属梭状芽孢杆菌/芽孢杆菌亚门。
本发明的α-淀粉酶已被完全表征，酶活性相对独立于特定金属离子(如Ca2+)浓度，即其不被诸如Ca2+激活。
因此，第一方面，本发明涉及一种经分离的α-淀粉酶，其特征为在65℃,pH8.0的包含有0.5％可溶性淀粉(重量/体积)的底物溶液中温育30分钟后，至少具有65％的残留α-淀粉酶活性，该底物溶液中Ca2+浓度在0.5mM和6mM之间。
由于如Ca2+离子干扰在很多工业中的应用，诸如在洗衣和洗碟用的去污剂中，因此，本发明的α-淀粉酶对于特定金属离子(如Ca2+)浓度的相对高的独立性在很多工业应用中十分有利。
此外，本发明的α-淀粉酶目前被认为是获自热嗜碱性厌氧菌的细胞外淀粉分解酶的首次描述和表征。
因而，另一方面，本发明涉及获自Thermoalcalibacter属种菌株中的一种经分离的细胞外α-淀粉酶。
另一方面，本发明涉及制备本发明的α-淀粉酶的方法，该方法包括在允许产生该酶的条件下培养Thermoalcalibacter属种菌株，并且从培养物中回收该酶。
最后，本发明涉及一种酶或酶组合物以及该酶或酶组合物的多种工业应用中的用途。
附图简述
参考附图更清楚地阐明本发明，其中：
图1：各纯化步骤的SDS-PAGE：图1显示生长于淀粉上的Thermoalcalibacter bogoriae的蛋白质电泳分离情况。经过PD-10后浓缩的上清液(泳道1+2),α-淀粉酶(泳道3,4,5)，纯化的α-淀粉酶(泳道5),CGT酶(泳道6+7)，银染(泳道1,3,4,6)，活性染色(泳道2,4,7)。
图2表示获自Thermoalcalibacter bogoriae的预纯化的α-淀粉酶的最适pH条件。用pH4.0-11.0包含0.5％(重量/体积)的可溶性淀粉的通用缓冲液(Britton和Robinson)于65℃温育30分钟来测定最适pH条件。100％残留活性相当于0.28U/ml。
图3表示获自Thermoalcalibacter bogoriae的α-淀粉酶的最适温度。于包含0.5％(重量/体积)的可溶性淀粉的100mM pH9.0的磷酸钠缓冲液中温育30分钟。100％残留活性相当于0.30U/ml。
图4表示金属离子和化学试剂对淀粉酶活性的影响。定义
在详细论述本发明之前，首先定义下列术语。
“一段克隆的DNA序列”：术语“一段克隆的DNA序列”指通过标准的克隆方法克隆的一段DNA序列，该方法常规地用于基因工程中将获自其自然位置的一段DNA片段重组到一个能被复制的不同的位置。克隆方法包括切割和分离目的DNA片段，将DNA片段插入载体分子和将重组载体导入能复制该DNA片段的多重拷贝或克隆的细胞中。术语“克隆的DNA序列”在本发明中也可表达为“DNA构件”或“经分离的DNA序列”。
“获自”：根据本发明的目的，术语“获自”与一种特定的微生物来源相关，意指酶由该特定的微生物源产生，或由已插入了获自该微生物源的基因的细胞产生。
“一种经分离的多肽”：此文中术语“一种经分离的多肽”或用于指关于本发明的α-淀粉酶的“经分离的α-淀粉酶”是指基本上不含其它非α-淀粉酶多肽的α-淀粉酶或α-淀粉酶部分，如，用SDS-PAGE测定，纯度至少约20％，优选的纯度至少约40％，更优选的约60％，更更优选的约80％，最优选的约90％，特别最优选的约95％。术语“经分离的多肽”也可表达为“纯化的多肽”。
“同源杂质”：本文中术语“同源杂质”意指与本发明的酶最初所来源的同源细胞所产生的任何杂质，(如，除本发明的酶之外的其它多肽)。在本发明中，同源细胞可以是如Thermoalcalibacter bogoriae的菌株。
“α-淀粉酶”本文中，根据IUB酶命名法α-淀粉酶编号为EC3.2.1.1，或命名为：1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，糖原酶。催化反应：寡糖和多糖中1,4-α-糖苷键的内水解。
“淀粉分解的”本文中，术语“淀粉分解的”或“淀粉分解的活性”意指所述的酶具有降解淀粉的能力。具有淀粉分解活性的酶的特定的例子如淀粉分解酶，包括α-淀粉酶、支链淀粉酶、新支链淀粉酶、异淀粉酶、β-淀粉酶、CTG酶、生麦芽糖酶以及G-4和G-6淀粉酶。
“中等热嗜碱性”：术语“中等热嗜碱性”指在相对较高温度，如高于55℃，诸如高于60℃或65℃，和相对高的pH值，在pH8.5以上诸如高于pH9或10的条件下可生存的细胞。
“细胞外的”术语“细胞外的”在本文中与一种酶相连，指该酶被运出产生该酶的细胞外，如由细胞分泌或扩散出细胞外。该酶一般包括一个导引该酶分泌(如输送出细胞)的信号肽。发明详述获自Thermoalcalibacter bogoriae的淀粉酶
通过如下方法考察金属离子对本发明的淀粉酶活性的影响：将酶同金属离子于65℃,pH8.0的含有0.5％(重量/体积)可溶性淀粉的底物溶液中预温育30分钟，然后在65℃进行30分钟酶分析，以测定淀粉酶的残留活性。详细细节见本文有效实施例(参见下文)和图4。
用该方法，本发明的淀粉酶优选的于Ca2+浓度范围在0.5mM至6mM之间有至少65％的残留淀粉酶活性，更优选的于Ca2+浓度在1.0mM至5mM之间具有至少65％的残留活性，更优选于Ca2+浓度在2mM至4mM之间具有至少65％的残留淀粉酶活性。
在另一实施方案中，本发明的α-淀粉酶分子量优选的为57±10KDA，更优选的分子量为57±5KDA,甚至更优选的分子量为57±3KDA，最优选的分子量为57±2KA。
分子量是用SDS-PAGE电泳测定的，具体描述见“材料和方法”部分(见下文)。
在另一实施方案中，本发明的α-淀粉酶优选的最适温度为65±10℃，更优选的最适温度为65±5℃，甚至更优选的最适温度为65±2℃。
最适温度测定是通过将酶与0.5％(重量/体积)底物溶液(可溶性淀粉，默克公司)在pH9.0的100mM磷酸钠缓冲液中温育测定的。温育30分钟，温度设在30-80℃之间。更详细细节见本文有效实施例(见下文)。
在另一实施方案中，本发明的α-淀粉酶优选的最适pH范围为pH8-10，更优选的pH范围为pH8.5至pH9.5。
最适pH是通过将酶与0.5％(重量/体积)底物溶液(可溶性淀粉；默克公司)在120mM通用Britton Robinsoon缓冲液中温育来测定的。详细细节见本文有效实施例(见下文)。淀粉酶的克隆：
不受任何理论限制，构思了从Thermoalcalibacter bogoriae菌株中克隆编码本发明的淀粉酶的DNA序列。
如Sambrook等描述了[分子克隆：实验室手册，Cold Spring HarborLab；Cold Sprng Harbor,NY,(1989)]一系列合适的标准DNA克隆方法。
通过纯化该酶(如下述的有效实施例所述)、氨基酸测序和制备基于该氨基酸序列的合适的探针或PCR引物来克隆DNA序列。
本发明的DNA序列也可通过任何普通方法克隆，包括：
-将获自预期可产生目标淀粉酶的任何生物的DNA文库克隆至合适载体，
-将所述载体转化至合适宿主细胞中，
-在合适条件下培养宿主细胞，表达DNA文库中所编码的任意克隆的酶，
-通过测定这些克隆所产生酶的淀粉酶活性筛选阳性克隆，
-从这些克隆中分离编码酶的DNA。微生物源
本发明的CGT酶可获自属于梭状芽孢杆菌/芽孢杆菌属亚门的Thermoalcalibacter系的细菌，尤其是下文所述的Thermoalcalibacterbogoriae菌株。Thermoalcalibacter bogoriae的特征
细胞呈杆状，粗0.3-0.5mm，长3-5mm，菌落直径3-5mm，浅灰色，透镜状。专性厌氧菌。生长温度30℃-65℃，最适生长温度约50℃到55℃。在pH6到pH10.5范围内生长，最适pH为9.5；在0至4％NaCl中生长，最适NaCl量为1％左右，相当于最适Na+浓度为230mM。在蛋白胨中异养型生长。在硫酸盐、硫代硫酸盐或硫存在下生长。在诸如葡萄糖和淀粉的发酵培养基上，硫代硫酸盐促进其生长，导致H2S的生成。在含硫代硫酸盐的淀粉中的发酵产物为乙酸盐和乙醇，细胞壁类型为革兰氏阳性，但细胞壁薄，不典型。在细胞间隔区有片状结构。分枝细胞不规则存在。可观察到部分外表面层。
16SrRNA分析显示，Thermoalcalibacter bogoriae在梭状芽孢杆菌/芽孢杆菌属亚门中属新的一种类型。16S rRNA序列分析由德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)完成。
根据关于专利申请中微生物保藏的国际公约的布达佩斯条约，能产生本发明的CGT酶的分离的Thermoalcalibacter bogoriae菌株由发明者保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心，Mascheroder Weg 16 D-38124 Braunschweig，联邦德国，(DSMZ)。
保藏日期：1996年9月11日
保藏者：NN049260
DSM编号：Thermoalcalibacter bogoriae DSM NO.9380。制备淀粉酶的方法
本发明的淀粉酶可通过同源菌株如上文提到的保藏菌株，在允许产生该酶的条件下的合适培养基中培养产生。
用于培养该菌株的培养基可以是任何适合于目的细胞生长的任何常规培养基。分泌入培养基中的淀粉酶可通过公知的过程回收，包括，通过离心或过滤从培养基中分出细胞，通过如硫酸铵等盐沉淀培养基中的蛋白质组分，然后通过如离子交换色谱、亲和色谱等色谱过程分离。酶组合物：
在另一方面，本发明涉及包含上文所述的酶的酶组合物。
本发明的酶组合物可包含一种或多种其它的酶，如蛋白酶，脂酶，淀粉分解酶，氧化酶(包括过氧化物酶)或纤维素酶(所提到的实例均是用于去污剂的优选实例)，如Savinase、Durazyme、Esperase、Alcalase、Termamyl或CelluzymeTM(可从Novo Nordisk A/S获得)。
酶组合物可根据在本领域中熟知的方法制备，可制成液态形式或干燥的组合物形式。如酶组合物可以是颗粒或微粒形式(US 4106991,US5324649)。包含于该组合物中的酶可根据本领域熟知的方法使之稳定。
下面给出了本发明的酶组合物优选用途的实施例。本发明的酶组合物的用量以及该组合物的使用条件可根据本领域众所周知的方法决定。
根据本发明的该酶和/或酶组合物可有至少一种以下用途。本发明的淀粉酶的应用：
本发明的淀粉酶可用于淀粉酶的常规应用中，特别在只有低浓度Ca2+存在条件下，如在洗衣和洗碟用的去污剂中、在常规的和工业的清洗中。
本发明的淀粉酶也可用于淀粉液化、纺织原料脱浆、纸和纸浆工业的淀粉改性，以及用于酿造和焙烤业。去污剂的公开内容和实施例表面活性剂体系
根据本发明的去污剂组合物包括一个表面活性剂体系，该表面活性剂可选自于非离子和/或阴离子和/或阳离子和/或两性的和/或两性离子的和/或半极性表面活性剂。
表面活性剂的量一般占总重量的0.1％到60％。
表面活性剂优选的与该组合物中存在的酶相容地配制。在液态或胶态组合物中表面活性剂最优选的以促进、或至少不降低这些组合物中任何酶的稳定性的方式配制。
本发明所用的表面活性剂的优选体系包括如本文所述的一种或多种非离子和/或阴离子表面活性剂。
烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧丙烯醚、聚氧丁烯醚适用于作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂，优选的是聚氧乙烯醚，这些化合物包括烷基酚与环氧化物的缩合产物，其具有一个包含具有直链或支链构型的从约6至约14个碳原子的烷基基团，约8至约14个碳原子是优选的。在优选的实施方案中，环氧化物的量等于每摩尔烷基酚约2到约25摩尔环氧化物，更优选的为约3到约15摩尔。这种类型的商品化的非离子表面活性剂包括GAF公司销售的IgepalTM CO-630；Rohm&Haas公司销售的TritonTM X-45、X-114、X-100和X-102。这些表面活性剂一般归于烷基酚烷氧基化物(如烷基酚乙氧基化物)。
由伯和仲脂族醇与约1到约25摩尔环氧乙烷的缩合产物适合用作本发明的非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂。脂族醇的烷基链可以是直链也可是支链，可为伯醇也可为仲醇，一般包括从约8至约22个碳原子。优选的醇与环氧乙烷的缩合产物中，醇的烷基基团含有从约8到约20个碳原子，更优选的烷基基团含约10到18个碳原子，每摩尔醇与从约2到约10摩尔环氧乙烷缩合。所述的缩合产物中每摩尔醇与约2到约7摩尔环氧乙烷缩合，最优选的与约2到约5摩尔环氧乙烷。这种类型的商品化的非离子表面活性剂包括Union Carbide公司销售的TergitolTM15-S-9(C11-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、TergitolTM 24-L-6 NMW(窄分子量分布的C12-C14初级醇与6摩尔环氧乙烷的缩合物)；Shell Chemical公司销售的NeodolTM45-9(C14-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM 23-3(C12-C13直链醇与3.0摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM45-7(C14-C15直链醇与7摩尔环氧乙烷的缩合物)、NeodolTM(C14-C15直链醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)；Procter&Gamble公司销售的KyroTM EOB(C13-C15醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)；Hoechst销售的Genapol LA 050(C12-C14醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)。这些产物中优选的HLB范围是从8到11，最优选的范围从8到10。
公开于US4,565,647的烷基多糖也用作本发明的表面活性剂体系的非离子表面活性剂，其具有一个含从约6到约30个碳原子的疏水性基团，优选的从约10到16个碳原子以及一个多糖如聚糖苷，亲水基团含有从约1.3到约10、优选的从约1.3到约3、最优选的从约1.3到约2.7个糖单位。可用任何含有5或6个碳原子的还原糖，如葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分取代葡萄糖基部分(疏水基团任选地连接于2-、3-、4-等位置，产生不同于葡萄糖苷或半乳糖苷的葡萄糖或半乳糖)。糖内部键可位于如添加的糖单位的某一位置和位于其前面的糖单位的2-、3-、4-和/或6位之间。
优选的烷基聚糖苷的化学式如下：
R2O(CnH2nO)t(糖基)x
其中，R2选自烷基、烷基苯基、羟烷基、羟烷基苯基和其混合的基团，其中烷基基团含有从约10到约18个碳原子，优选的含从约12到约14个碳原子；n为2或3，优选为2；t可从0到约10，优选为0；X可从约1.3到约10，优选从约1.3到约3，最优选从约1.3到约2.7。糖基优选获自葡萄糖。要制备这些化合物，需先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后再与葡萄糖或葡萄糖源反应，形成葡萄糖苷(连接于1位)。添加的糖基单位的1位再与前面糖基单位的2-、3-、4-和/或6位相连，优选的主要在2位。
由环氧丙烷同丙二醇缩合而成的疏水骨架与环氧乙烷形成的缩合产物也适合用作本发明的另外的非离子表面活性剂体系。这些化合物的疏水部分优选的具有从约1500到约1800的分子量，且表现出水不溶性。在疏水部分上添加的聚氧乙烯部分有助于增加整个分子的水溶性，产物的液态性质一直保留，直到聚氧乙烯含量占缩合产物总重量的约50％，相当于同直到约40摩尔的环氧乙烷缩合。这种类型化合物的实例包括BASF销售的某些商品化的PluronicTM表面活性剂。
由环氧乙烷与由环氧丙烷和乙二胺反应产物缩合的产物也适合用作本发明的非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂。这些产物的疏水部分含有由乙二胺与过量环氧丙烷的反应产物，一般分子量从约2500到约3000。该疏水部分再与环氧乙烷缩合直到缩合产物中所含聚氧乙烯占重量的从约40％到约80％，分子量从约5000到约11000。这种类型非离子表面活性剂的实例包括BASF销售的某些商品化的TetronicTM化合物。
优选的用作本发明的表面活性剂体系的非离子表面活性剂有烷基酚-聚氧乙烯醚、伯和仲脂族醇与从约1到约25摩尔环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖和它们的混合物。最优选的为具有3到15个乙氧基的C8-C14烷基酚的乙氧基化物和具有从2到10个乙氧基(优选约10个)的C8-C18醇的乙氧基化物以及它们的混合物。
高度优选的非离子表面活性剂是多羟基脂肪酸酰胺表面活性剂，化学式如下：
Figure A9719826200121
其中R1为H，或R1为C1-4烃基、2-羟乙基、2-羟丙基或它们的混合物，R2为C5-31烃基、Z为具有至少直接连在链上的3个羟基的直链烃基链的多羟基烃，或它的烷氧化衍生物。优选的R1为甲基，R2为直链C11-15烷基或C16-18烷基或诸如椰子烷基的链烯基链或它们的混合物，且Z为获自还原胺化反应中的诸如葡萄糖、果糖、麦芽糖或乳糖的还原糖。
高度优选的阴离子表面活性剂包括烷氧基化的硫酸烷基酯表面活性剂。其实例为化学式为RO(A)mSO3M的水溶性盐或酸，其中R为未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基组分的羟烷基基团，优选C12-C20烷基或羟烷基，更优选C12-C18烷基或羟烷基，A为乙氧基或丙氧基单位，m大于零，一般约在0.5与约6之间，更优选地在约0.5与约3之间，M为H或一种阳离子，如金属阳离子(如，钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取代的铵阳离子。此处构思了乙氧基化硫酸烷基酯以及丙氧基化硫酸烷基酯。取代的铵离子的具体实例包括甲基、二甲基、三甲基铵离子和诸如四甲基铵的季铵离子和二甲基哌啶鎓阳离子以及诸如乙基胺、二乙胺、三乙胺及其混合物的烷基胺的衍生物等等。典型的表面活性剂有C12-C18烷基聚乙氧基(1.0)硫酸酯(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基(2.25)硫酸酯(C12-C18E(2.25)M)、C12-C18烷基聚乙氧基(3.0)硫酸酯(C12-C18E(3.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基(4.0)硫酸酯(C12-C18E(4.0)M)，其中M一般选自于钠和钾。
应用的合适的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂，包括根据“美国油化学家协会杂志”(The Journal of the American oil ChemistsSociety),52(1975),pp.323-329，用气态SO3磺化C8-C20羧酸(如，脂肪酸)产生的线性酯。合适的起始原料包括获自动物脂肪、棕榈油等的天然脂肪物质。
优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂，特别是用于洗衣的，包括如下结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂：
其中R3为C8-C20烃基，优选为烷基或它们的组合，R4为C1-C6烃基，优选烷基或它们的组合，M为与烷基酯磺酸盐形成水溶性盐的阳离子。合适的成盐阳离子包括诸如钠、钾和锂的金属离子，以及诸如单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的取代或未取代的铵阳离子。优选的，R3为C10-C10烷基，R4为甲基、乙基或异丙基。特别优选的为R3是C10-C16烷基的甲基酯磺酸盐。
其它的合适的阴离子表面活性剂包括化学式为ROSO3M的水溶性盐或酸的烷基硫酸盐表面活性剂，其中R优选为C10-C24烃基，优选具有C10-C20烷基组分的烷基或羟烷基，更优选C12-C18烷基或羟烷基，M为H或阳离子，如碱金属阳离子(如钠、钾、锂)，或铵或取代铵(如甲基、二甲基和三甲基铵阳离子和诸如四甲基铵的季铵阳离子和二甲基哌啶鎓阳离子和获自诸如单乙胺、二乙胺、三乙胺以及它们混合物的烷基胺的季胺阳离子，等等)。通常，C12-C16烷基链优选适用于较低的洗涤温度(如低于约50℃),C16-C18烷基链优选适用于较高的洗涤温度(如高于约50℃)。
其它用于洗涤目的的阴离子表面活性剂也可包括于本发明的洗衣用去污剂组合物中。它们包括皂盐(包括如钠、钾、铵和诸如单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺盐的取代铵盐)、C8-C22初级或次级烷基磺酸盐、C8-C24烯属磺酸盐、通过碱土金属柠檬酸盐热解产物磺化制备的磺化的多羧酸盐(如英国专利说明书NO.1,082,179中所述)，C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸盐(包含多达10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂酰基甘油磺酸盐、脂肪油酰甘油硫酸盐、烷基酚环氧乙烷醚硫酸盐，链烷烃磺酸盐、烷基磷酸盐、诸如酰基羟乙磺酸盐的羟乙磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸盐单酯(主要是饱和及不饱和C12-C18单酯)和磺基琥珀酸双酯(主要是饱和及不饱和C6-C12双酯)，酰基肌氨酸盐、诸如烷基多糖苷的硫酸盐的烷基多糖硫酸盐(非离子非硫酸盐化合物，见下文)、支链的初级烷基硫酸盐和诸如具有结构式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的烷基聚乙氧基羧酸盐，其中R为C8-C22烷基，K为一个从1到10的整数，M为形成可溶性盐的阳离子。树脂酸和氢化的树脂酸也适合，如松香、氢化松香和存在于或获自木浆浮油的树脂酸和氢化树脂酸。
烷基苯磺酸盐是高度优选的。特别优选线性(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中烷基基团优选的包含从10到18个碳原子。
另外的实施例可见“表面活性剂和去污剂”(卷Ⅰ和Ⅱ，作者Schwartz,Perry和Berch)。种种这样的表面活性剂也公开于US3,929,678(23栏58行直到29栏23行，此处引入作为参考)。
如果包括在本文，本发明的洗衣用去污剂组合物一般包含总重量的从约1％到约40％，优选重量从约3％到约20％的这种阴离子表面活性剂。
本发明的洗衣用去污剂组合物也可包含阳离子、两性的、两性离子和半极性表面活性剂，以及除了文中已描述之外的非离子和/或阴离子表面活性剂。
适用于本发明的洗衣用去污剂中的阳离子洗涤用表面活性剂，其具有一个长链烃基基团。这些阳离子表面活性剂的实例包括诸如烷基三甲基铵卤化物的铵表面活性剂，和那些化学式如下的表面活性剂：
[R2(OR3)y[R4(OR3)y]2R5N+X-
其中R2为烷基链中有约8到约18个碳原子的烷基或烷基苄基基团，每一个R3都选自于由-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-以及它们混合物组成的一组基团；每个R4选自于由C1-C4烷基、C1-C4羟烷基、由两个以R4基团连接形成的苄基环结构、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6为任何己糖或分子量低于约1000的己糖聚合物)、和氢(当y不为零时)组成的一组基团；R5与R4相同或为烷基链，其中总碳原子数或R2加R5碳原子数不超过约18；每个y从0到大约10,y值的和从0到大约15；X为任何可相容的阴离子。
高度优选的阳离子表面活性剂为可用于本组合物的水溶性季铵化合物，具有以下化学式：
R1R2R3R4N+X-(ⅰ)
其中R1为C8-C16烷基，R2、R3和R4为独立的C1-C4烷基、C1-C4羟烷基、苄基和-(C2H40)xH，其中X的值从2到5,X为一种阴离子。R2、R3和R4中至多一个为苄基。
R1优选的烷基链长度为C12-C15，尤其是烷基基团为获自椰子或棕榈仁脂肪的多种链长的混合物，或是通过烯烃合成或OXO醇合成衍生而来。
R2、R3和R4优选的基团为甲基和羟乙基基团。阴离子X可选自卤离子、甲硫酸根、乙酸根和磷酸根离子。用于此处具有化学式(ⅰ)的合适的季铵化合物有：
椰子三甲基氯(或溴)化铵；
椰子甲基二羟乙基氯(或溴)化铵；
癸基三乙基氯化铵；
癸基二甲基羟乙基氯(或溴)化铵；
C12-C15二甲基羟乙基氯(或溴)化铵；
椰子二甲基羟乙基氯(或溴)化铵；
十四烷基三甲基甲基硫酸铵；
十二烷基二甲基苄基氯(或溴)化铵；
十二烷基二甲基(乙氧基)4氯(或溴)化铵；
胆碱酯(R1为
Figure A9719826200151
烷基，R2、R3、R4为甲基的化学式(ⅰ)的化合物)
二烷基咪唑啉[化学式(ⅰ)的化合物]
用于此处的其它阳离子表面活性也可见于US 4,228,044和EP000224。
如果包括在本文，本发明的洗衣用去污剂组合物一般包含总重量的从约0.2％到约25％，优选重量从约1％到约8％的这种阳离子表面活性剂。
两性的表面活性剂也适合用于本发明的洗衣用去污剂组合物中。这些表面活性剂广义地说有仲胺或叔胺的脂族衍生物，或杂环仲胺和叔胺的脂族衍生物，其中脂基可为直链或支链。脂族取代基中有一个包含至少约8个碳原子，一般为从约8到约18个碳原子，并且至少有一个包含一种阴离子水溶性基团，如羧基、磺酸根、硫酸根。两性表面活性剂的实例见US3,929,678(19栏，18-35行)。
如果此处包含的话，本发明的洗衣用去污剂组合物一般包含总重量的从约0.2％到约15％，优选重量从约1％到约10％的这种两性表面活性剂。
两性离子表面活性剂也适合用于本发明的洗衣用去污剂组合物中。这些表面活性剂广义地说有仲胺和叔胺的衍生物，杂环仲胺和叔胺的衍生物，或季铵的衍生物，季鏻或叔锍化合物。两性离子表面活性剂的实例见US3,929,678(19栏38行到22栏48行)。
如果此处包含的话，本发明的洗衣用去污剂组合物一般包含总重量的从约0.2％到约15％，优选重量从约1％到约10％的这种两性离子表面活性剂。
半极性非离子表面活性剂是非离子表面活性剂的一个特殊类型，其包括水溶性氧化胺，其含有一个从约10到约18个碳原子的烷基部分和两个选自于含有从约1到约3个碳原子的烷基和羟烷基的部分；水溶性氧化膦，含有一个从约10到约18个碳原子的烷基部分和两个选自于含有从约1到约3个碳原子的烷基和羟烷基的部分；以及水溶性亚砜，含有一个从约10到约18个碳原子的烷基部分和选自于含有约1到3个碳原子的烷基和羟烷基的部分。
半极性非离子去污剂用表面活性剂包括氧化胺表面活性剂，其化学式如下：
其中R3为包含有从约8到约22个碳原子的烷基、羟烷基、或烷基苯基基团、或它们的混合物；R4为含从约2到约3个碳原子的亚烷基或羟亚烷基基团或它们的混合物；X从0到约3；每个R5为含约1到约3个碳原子的烷基或羟烷基，或含从约1到约3个环氧乙烷基团的聚环氧乙烷基团。R5的基团可互相连接，如，通过一个氧或氮原子形成一个环状结构。
这些氧化胺表面活性剂尤其包括C10-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C12烷氧乙基二羟乙基氧化胺。
如果此处包含的话，本发明的洗衣用去污剂组合物一般包含总重量的从约0.2％到约15％，优选从约1％到约10％的这种半极性非离子表面活性剂。助洗剂体系
本发明的组合物另外也可包含助洗剂体系。适用于此的常规助洗剂体系包括硅铝酸盐物质，硅酸盐，多羧化物和脂肪酸，诸如乙二胺四乙酸盐的物质，诸如氨基聚膦酸盐的金属离子螯合剂，尤其是乙二胺四亚甲基膦酸和二乙三胺五亚甲基膦酸。虽然因为环境原因而较少优选，但磷酸盐助洗剂也可用于此。
合适的助洗剂可以是无机离子交换物质，一般为无机水合的硅铝酸盐物质、尤其是诸如水合的沸石A、X、B、HS或MAP的水合的合成沸石。
另一种合适的无机助洗剂材料是层状硅酸盐，如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是包含硅酸钠(Na2Si2O5)的结晶层状硅酸盐。
包含有一个羧基基团的合适的多羧化物包括乳酸、乙醇酸以及它们的醚衍生物，见比利时专利NO.831,368；821,369和821,370。含二个羧基基团的多羧化物包括水溶性琥珀酸盐、丙二酸盐、(亚乙二氧基)双乙酸盐、马来酸盐、二乙二醇酸盐、酒石酸盐、丙醇二酸盐和富马酸盐、以及德国专利说明书2,446,686和2,446,487,US3,935,257中所述的醚羧化物和描述于比利时专利NO.840,623中的亚硫酰基羧化物。含三个羧基基团的多羧化物包括，特别是水溶性柠檬酸盐，乌头酸盐和柠康酸盐以及诸如英国专利NO.1,379,241中所述的羧甲氧基琥珀酸盐的琥珀酸盐衍生物，荷兰申请7205873中所述的乳氧基琥珀酸盐，和英国专利NO.1,387,447中所述的诸如2-氧杂-1,1,3-丙烷三羧酸盐的羟基多羧化物。
含四个羧基基团的多羧化物包括：英国专利NO.1,261,829中所公开的氧二琥珀酸盐，1,1,2,2-乙烷四羧酸盐，包含磺基取代基的1,1,3,3-丙烷四羧酸盐，包括英国专利NOs,1,398,421和1,398,422以及US3,936,448中公开的磺化琥珀酸盐衍生物，和英国专利NO.1,082,179中所述的磺化的热解的柠檬酸盐，而包含膦取代基的多羧化物则公开于英国专利NO.1,439,000。
脂环族和杂环族多羧化物包括：环戊烷-顺，顺-顺-四羧酸盐；环戊二烯五羧酸盐；2,3,4,5-四氢呋喃-顺，顺，顺-四羧酸盐；2,5-四氢呋喃-顺-二羧酸盐、2,2,5,5-四氢呋喃-四羧酸盐；1,2,3,4,5,6-己烷-六羧酸盐和诸如山梨醇、甘露醇和木糖醇的多元醇的羧甲基衍生物。芳香族多羧化物包括公开于英国专利NO.1,425,343中的苯六甲酸、1,2,4,5-苯四酸和苯二甲酸衍生物。
综上所述，优选的多羧化物为每分子包含多达3个羧基基团的羟基-羧酸盐，特别是柠檬酸盐。
用于本组合物的优选的助洗剂体系包括：诸如沸石A的水不溶性硅铝酸盐助洗剂混合物或层状硅酸盐(SKS-6)及诸如柠檬酸的水溶性羧酸盐螯合剂的混合物。
根据本发明的去污剂组合物中的合适的螯合剂有乙二胺-N,N′-二琥珀酸(EDDS)或它的碱金属、碱土金属、铵或取代的铵盐，或它们的混合物。优选的EDDS化合物为其游离酸形式和它的钠或镁盐。优选的EDDS钠盐的实例包括Na2EDDS和Na4EDDS。优选的EDDS镁盐的实例包括MgEDDS和Mg2EDDS。镁盐存在于本发明之组合物中是最优选的。
优选的助洗剂体系包括：诸如沸石A的水不溶性硅铝酸盐助洗剂的混合物，和诸如柠檬酸的水溶性羧酸盐螯合剂的混合物。
其它构成助洗剂体系组成部分用于颗粒状组合物中的助洗剂材料包括：诸如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐的无机材料，和诸如有机膦酸盐，氨基聚亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐的有机材料。
其它的合适的水溶性有机盐有均聚或共聚酸或它们的盐，其中多羧酸包括至少两个相互之间隔开最多两个碳原子的羧基基团。
这种类型的聚合物公开于GB-A-1,596,756。这种盐的实例有分子量为2000-5000的聚丙烯酸酯，和它们与马来酐的共聚物，这些共聚物的分子量从20,000到70,000，尤其是约40,000。
洗涤用助洗剂盐含量一般占组合物重量的5％到80％。液态去污剂优选的助洗剂量从5％到30％。酶
优选的去污剂组合物，除本发明制备的酶之外，还包括其它用于提供清洁效果和/或保护织物的酶。
这些酶包括：蛋白酶、角质酶、其它的脂酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(如漆酶)。蛋白酶：任何适合用于碱性溶液中的蛋白酶均可使用。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的酶。微生物来源是优选的。化学地或遗传修饰的变异体也包括在内。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例有枯草杆菌蛋白酶，尤其是获自芽孢杆菌属如枯草杆菌蛋白酶NOVO，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(见WO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶有胰蛋白酶(如获自猪或牛的)和WO89/06270中描述的镰孢菌属蛋白酶。
优选的商品化蛋白酶包括：NOVO Nordisk A/S(丹麦)销售的商品名为Alcalase、Savinase,Primase,Durazym和Esperase的蛋白酶，Gist-Brocades销售的商品名为Maxatase,Maxacal,Maxapem和Properase的蛋白酶，Genencor International销售的商品名为Purafect和Purafect OXP的蛋白酶，和Solvay Enzymes销售的商品名为Opticlean和Optimase的蛋白酶。加入本发明组合物中蛋白酶蛋白质的量可占组合物重量的0.0001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。脂酶：任何适用于碱性溶液中的脂酶均可使用。合适的脂酶包括细菌来源或真菌来源的。化学或遗传修饰的变异体也包括在内。
适用的脂酶实施例包括：Humicola lanuqinosa脂酶，如EP258068和EP305216中所述；Rhizomucor miehei脂酶，如EP 238023中所述；假丝酵母(Candida)脂酶，诸如C.antarctica脂酶，如EP214761中所述的C.antantica脂酶A或B；如EP218272中所述的假单胞菌脂酶，诸如产碱假单胞菌(P.alcacaligenes)和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂酶；如EP331376中所述的洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂酶；如GB1,372,034中公开的施氏假单胞菌(P.stutzeri)的脂酶；荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂酶；芽孢杆菌脂酶，如枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)脂酶(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica acta 1131253-260)；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)脂酶(JP 64/744992)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂酶(WO 91/16422)。
另外，很多克隆的脂酶也可使用，包括Yamaguchi等人(1991)，基团103,61-67)中所述的沙门柏干酪青霉(Penicillim camembertii)脂酶；Geotricum candidum脂酶(Schimada,Y.等人，(1989)，生物化学杂志(J.Biochem.),106,383-388)，和诸如R.delemar脂酶(Hass.M.J等人，(1991)，基因109,117-113)，雪白根霉(R.niveus)脂酶(Kugimiya等人，(1992),Biosci.Biotech.Biachem.56,716-719)和米根霉(R.oryzae)脂酶的根霉菌脂酶。
诸如角质酶的其它的类型的脂解酶也可使用，如WO88/09367中所述的获自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶，或获自Fusarium solani pisi的角质酶(如，WO90/09446中所述)。特别适用的脂酶诸如：M1 LipaseTM,Luma fastTM和LipomaxTM(Genencor),LipolaseTM和Lipolase UltraTM(NOVO Nordisk A/S)，和脂酶P″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。
一般加入去污剂组合物中的脂酶蛋白质的量占组合物重量的0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。淀粉酶：任何适合用于碱性溶液中的淀粉酶α和/或β均可使用。合适的淀粉酶包括细菌或真菌来源的淀粉酶。化学或遗传修饰的变异体也包括在内。淀粉酶包括：如GB1,296,839中详细描述的获自地衣芽孢杆菌的特定菌株的α-淀粉酶。商品化的淀粉酶有DuramyTM,TermamylTM,FungamylTM和BANTM(Novo Nordisk A/S有售)和RapidaseTM和Maxamyl pTM(Genencor有售)。
一般加入去污剂组合物中的淀粉酶蛋白质的量占组合物重量的0.0001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。纤维素酶：任何合适用于碱性溶液中的纤维素酶均可使用。合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。化学或遗传修饰的变异体也包括在内。合适的纤维素酶公开于US4,435,307，其中公开了产生于Humicolainsolens的真菌纤维素酶。特别合适的纤维素酶是具有保护颜色的益处的纤维素酶。这些纤维素酶的实例有欧洲专利申请NO.0495257中所述的纤维素酶。
商品化的纤维素酶包括产生于Humicola insolens菌株的CelluzymeTM(Novo Nordisk A/S)，和KAC500(B)TM(Kao公司)。
一般加入去污剂组合物中的酶蛋白质的量占组合物重量的0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选的占组合物重量的0.001％到0.5％，十分优选占组合物重量的0.01％到0.2％。过氧化物酶/氧化酶：过氧化物酶与过氧化氢或其来源(如，过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)结合使用。氧化酶与氧结合使用。两种类型的酶均用于“溶液漂白”，如当织物一起在洗涤液中洗涤时阻止染色的织物上的染料转移到另一件织物上，优选与如WO94/12621和WO95/01426中所述的增强剂一起使用。合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的酶。化学或遗传修饰的变异体也包括在内。
一般加入去污剂组合物中的过氧化物酶和/或氧化酶的蛋白质的量占组合物重量的0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选的占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
上述酶的混合物都包含在本文中，特别是蛋白酶、淀粉酶、脂酶和/或纤维素酶混合物。
本发明的酶或任何其它加入去污剂组合物中的酶，通常加入去污剂组合物中的量一般占组合物重量的0.00001％到2％，优选占组合物重量的的0.0001％到1％，更优选的占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。漂白剂：包含于本发明的去污剂组合物中的附加的去污剂组分可包括诸如PB1,PB4和大小为400-800微米的过碳酸盐漂白剂。这些漂白剂组分可包括一种或多种氧漂白剂和根据漂白剂选择的一种或多种白活化剂。氧漂白剂的量一般在从约1％到约25％。一般漂白化合物在非液态制剂中是任选添加的组分，如在颗粒状去污剂中。
用于此处的漂白剂组分可以是任何可用于去污剂组合物中的漂白剂，包括氧漂白剂以及本领域中熟知的其它漂白剂。
适用于本发明中漂白剂可以是活化的或非活化的漂白剂。
可应用的一类氧漂白剂包括过羧酸漂白剂以及它们的盐。这类漂白剂合适的实例包括：六水合单过氧邻苯二甲酸镁，间氯过苯甲酸镁，4一壬氨基-4-氧代过氧丁酸镁盐和双过氧十二双酸镁盐。这些漂白剂公开于US4,483,781,US740,446,EP0133354和US4,412,934。十分优选的漂白剂也包括如US4,634,551中所述的6-壬氨基-6-氧代过氧己酸。
可应用的另一类漂白剂包括卤漂白剂。次卤化物漂白剂的实例包括如三氯异氰尿酸和二氯异氰尿酸钠和钾，以及N-氯和N-溴烷基氨磺酰钠和钾。这些材料一般加入量为终产物重量的0.5％-10％，优选占重量的1％-5％。
过氧化氢释放剂与漂白活化剂联合使用，如四乙酰乙二胺(TAED)，壬酰羟苯磺酸盐(NOBS，见US4,412,934),3,5-三甲基-己酰氧苯磺酸盐(ISONOBS，见EP 120591)或五乙酰葡萄糖(PAG)，它们经全水解后形成过酸作为活性漂白剂，以改善漂白效果。另外，十分合适的漂白剂活化剂有C8(6-辛酰胺基-己酰基)氧苯磺酸盐，C9(6-壬酰胺基-己酰基)氧苯磺酸盐和C10(6-癸酰胺基-己酰基)氧苯磺酸盐或它们的混合物。其它合适的活化剂有，如公开于欧洲专利中请No.91870207.7.中酰化的柠檬酸酯。
实用的漂白剂，包括过氧酸和专利申请USSN 08/136,626中所述的漂白体系，包含用于本发明清洁去污剂组合物中的漂白活化剂和过氧漂白化合物。
过氧化氢也可通过加入酶体系(如酶与其底物)而产生，其能在洗衣和/或漂洗过程开始或过程中产生过氧化氢。该酶体系公开于欧洲专利申请EP 0537381中。
除了氧漂白剂外的漂白剂也在本领域熟知，也可用于此。一种特别重要的非氧漂白剂包括诸如磺化的锌和/或铝酞菁的光活化的漂白剂。这些物质在洗涤过程中沉积于作用物上，经光照和氧存在条件下，如衣服白天悬挂于室外晾干时，磺化的锌酞菁被激活，随之作用物就被漂白了。优选的锌酞菁及其光活化漂白过程公开于US 4,033,718。一般去污剂组合物中包含占重量的约0.025％到1.25％的磺化的锌酞菁。
漂白剂中也可包含锰催化剂。锰催化剂可以是例如一种描述于“低温漂白的有效锰催化剂”，自然(Nature)369,1994,PP.637-639中的化合物。抑泡剂：另一个任选的组分为抑泡剂，如聚硅氧烷和硅石-聚硅氧烷混合物。聚硅氧烷一般为烷基化的聚硅氧烷材料，而常用的硅石一般为如硅石空气凝胶和干凝胶以及各种类型的疏水性硅石的细小颗粒。这些物质可以颗粒形式加入，在其中，抑泡剂便利地可释放地加入水溶性或水分散的、基本上非表面活性剂不可渗透的载体中。抑泡剂也可溶解或分散在液态载体中，然后通过喷洒于一种或多种其它组分上而使用。
优选的聚硅氧烷抑泡剂公开于US 3,933,672中。其它的特别有用的抑泡剂有自乳化聚硅氧烷抑泡剂，公开于德国专利申请DTOS 2,646,126中。这种化合物的一个实例为DC-544，可从Dow Corning购得，它是硅氧烷-乙二醇共聚物。特别优选的抑泡剂是包含硅油和2-烷基-链烷醇的混合物的抑泡剂体系。合适的2-烷基-链烷醇为2-丁基-辛醇，其商品名为Isofol 12R。
该抑泡剂体系描述于欧洲专利申请EP 0593841中。
特别优选的硅氧烷抑泡剂描述于欧洲专利申请No.92201649.8.中。该组合物可包括与诸如Aerosil的熏制无孔硅石结合的聚硅氧烷/硅石混合物。
上述抑泡剂一般用量为组合物重量的0.001％到2％，优选为0.01％到1％。其它组分：用于去污剂组合物中的其它组分可采用诸如污垢悬浮剂、污垢释放剂、光亮剂、研磨剂、杀菌剂、晦暗抑制剂、着色剂、和/或包封的或不包封的香料。
特别适用的包封材料为水溶性胶囊，其由多糖及多羟基化合物基质组成，如GB1,464,616中所述。
其它适用的水溶性包封材料，包括获自非凝胶化淀粉的取代二羧酸酸性酯的糊精，如US3,455,838中所述。这些酸性酯糊精优选由蜡状玉米、蜡样高梁、西米、木薯淀粉和马铃薯淀粉制备。合适的上述包封材料的实例包括National Starch生产的N-Lok。N-Lok包封材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖组成。这种淀粉通过添加诸如辛烯基琥珀酸酐的单功能取代基改性。
适用于此的抗再沉积剂和污垢悬浮剂包括诸如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素的纤维素衍生物，和均聚或共聚的多羧酸或它们的盐。这种类型的聚和物包括前述用作助洗剂的聚丙烯酸酯类和马来酐丙烯酸共聚物，以及马来酐与乙烯、甲基乙烯基醚或异丁烯酸的共聚物。马来酸酐组成至少20％摩尔百分含量的共聚物。这些材料用量占组合物重量的0.5％到10％，更优选为0.75％到8％，最优选占1％到6％。
优选的光亮剂为阴离子，其实例有4,4′-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-均三嗪基-6-基氨基)芪-2:2′-二磺酸二钠，4,4′-双(2-吗啉代-4-苯胺基-均三嗪基-6-基氨基)芪-2:2′二磺酸二钠，4,4-′双-(2,4-二苯胺基-均三嗪基-6-基氨基)芪-2:2′-二磺酸二钠，4′4″-双-(2,4-二苯胺基-均三嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸钠，4,4′-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙胺基)-均三嗪-6-基氨基)芪-2,2′-二磺酸二钠，4,4′-双-(4-苯基-2,1,3-三唑基-2-基)芪-2,2′-二磺酸二钠，4,4′-双-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙胺基)-均三嗪基-6-基氨基)芪-2,2′-二磺酸二钠，2(芪基-4″-(萘并-1′,2′:4,5)-1,2,3，-三唑-2″-磺酸钠和4,4′-双-(2-磺基苯乙烯基)联苯。
其它有用的聚合物材料为聚乙二醇，尤其是分子量范围1000-10000的聚乙二醇，更优选分子量范围2000到8000，最优选分子量为约4000的聚乙二醇。其用量为重量的0.20％到5％，更优选为0.25％到2.5％。这些聚合物和前述的均聚或共聚多羧酸盐，并且需在过渡金属杂质存在下可用于增白、织物灰尘沉积，以及增加对尘土、蛋白质和可氧化污垢的清洁效果。
本发明组合物中有用的污垢释放剂一般为对苯二酸与乙二醇和/或丙二醇单位按各种方式组合的共聚体或三元聚合物。这些聚合物的实例公开于US,4,116,885和4,711,730和EP0272033中。根据EP0272033，特别优选的聚合物化学式如下：(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25-((PEG)43CH3)0.75其中PEG为-(OC2H4)O-,PO为(OC3H6O),T为(POOC6H4CO)。
改性的聚酯也非常实用，其为对苯二酸二甲基酯，磺基间苯二酸二甲基酯、乙二醇和1,2-丙二醇的无规则共聚物，其端基主要由苯甲酸磺基酯组成，其次为乙二醇和/或1,2-丙二醇单酯组成。目的是要获得两端均由苯甲酸磺基酯基团封端的聚合物，“主要”根据上下文是指所述共聚合物大多由苯甲酸磺基酯封端。然而有些共聚合物没有完全封端，因此它们的端基可由乙二醇和/或1,2-丙二醇单酯组成，因此组成“次要的”种类。
此处所选用的聚酯包含占重量约46％的对苯二羧酸二甲基酯，约16％的1,2-丙二醇，约10％的乙二醇，约13％的磺基苯甲酸二甲基酯和约15％磺基间苯二甲酸，分子量约为3000。这些聚酯及其制备方法详细公开于EP311342。柔顺剂：织物柔顺剂也可加入本发明的洗衣用去污剂组合物中。这些柔顺剂可为无机型或有机型。无机柔顺剂有公开于GB-A-1400898和US5,019,292中的绿土。有机织物柔顺剂包括：公开于GB-A1514276和EP0011340中的水不溶性叔胺和公开于EP-B-O026528中的它们与单C12-C14季铵盐的混合物以及公开于EP0242919中的双长链酰胺。织物柔顺剂体系中的其它有用的有机组分包括公开于EP0299575和0313146中的高分子量的聚环氧乙烷材料。
绿土的用量一般为5％到15％，更优选占重量的8％到12％，其以干燥的混合组分加入制剂剩余物中。诸如水不溶的叔胺或双长锭酰胺物质的有机织物柔顺剂的用量为重量的0.5％到5％，一般为1％到3％，而高分子量的聚环氧乙烷物质和水溶性阳离子物质的用量为重量的0.1％到2％，一般为重量的0.15％到1.5％。这些物质一般加入组合物的喷雾干燥部分中，在有些例子中也可更方便地以干混颗粒加入，或以熔化的液体形式喷入组合物中其它固体组分上。聚合的染料转移抑制剂：本发明的去污剂组合物也可包括占重量0.001％到10％，优选0.01％到2％，更优选0.05％到1％的聚合的染料转移抑制剂。一般去污剂组合物中加入所述聚合的染料转移抑制剂用于抑制染料由染色的织物转移到与之一起洗涤的织物上。在洗涤过程中，在从染色的织物上洗出的染色剂有机会吸附于其它物品之前这些聚合物能络合或吸附它们。
特别适用的聚合的染料转移抑制剂有聚胺N-氧化聚合物，N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑共聚物，聚乙烯基吡咯烷酮聚合物，聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。
这些聚合物的加入也能增强本发明的酶的功效。
本发明的去污剂组合物可以是液体、糊状、凝胶、棒状或颗粒等形式。无粉尘颗粒可根据如公开于US4,106,991和4,661,452(都是Novo InclustriA/S的)生产，可任选地用本领域熟知的方法包衣。蜡状包衣材料的实例有：聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)，其平均分子量1000至2000；具有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；醇部分包含12到20个碳原子且具有15到80个环氧乙烷的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸甘油单、双和三酯。适合于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例可见于GB1483591中。
本发明的颗粒状组合物也可是“致密形式”，如可比常规颗粒状去污剂具有相对较高的密度，如从550g/l到950g/l；这样，本发明的颗粒去污剂组合物与常规颗粒去污剂相比，将含有较低量的“无机填料盐”；典型的填料盐为碱土金属硫酸盐和盐酸盐，一般为硫酸钠；“致密”去污剂一般包含不超过10％的填料盐。本发明的液体去污剂组合物也可是“浓缩形式”，这样，本发明的液体组合物与常规液体去污剂相比，将包含较少量的水。一般浓缩的液体去污剂水含量少于重量的30％，更优选少于20％，最优选少于去污剂组合物重量的10％。
本发明的组合物可例如制成机洗和手洗的洗衣用去污剂组合物，包括洗衣添加组合物和适用于污染织物的预处理的组合物，漂洗添加的织物柔顺剂组合物，以及用于一般家庭坚硬表面的清洗和洗碟的组合物。
下面的实施例是解释本发明组合物的例子，但并不意味限制或另外地限定本发明的范围。
在去污剂组合物中，缩写的部分名意思如下：LAS：线性C12烷基苯磺酸钠TAS：动物脂烷基硫酸钠XYAS:C1x-C1y烷基硫酸钠SS：化学式2-丁基辛酸次级皂表面活性剂25EY：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的C12-C15主要为线性的伯醇45EY：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的C14-C15主要为线性的伯醇XYEZS：每摩尔与平均Z摩尔环氧乙烷缩合的C1x-C1y烷基硫酸钠Nonionic：由BASF Gmbh销售的商品名为Plurafax LF404的乙氧基化平均程度为3.8，丙氧基化平均程度为4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化脂肪醇。CFAA:C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAA:C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸盐：无定形硅酸钠(SiO2∶Na2O=2.0)NaSKS-6：分子式为δ-Na2Si2O5的结晶层状硅酸盐碳酸盐：无水碳酸钠磷酸盐：三聚磷酸钠MA/AA:1∶4马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约80,000聚丙烯酸酯：由BASF Gmbh销售的商品名为PA30的平均分子量为8000的聚丙烯酸酯均聚物沸石A：初级粒子大小范围为1到10微米的分子式为Na12(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅铝酸钠柠檬酸盐：二水合柠檬酸三钠柠檬酸：柠檬酸过硼酸盐：无水的过硼酸钠一水化漂白剂，实验式NaBO2·H2O2PB4：无水的四水合过硼酸钠过碳酸盐：实验式为2Na2CO3·3H2O2的无水的过碳酸钠漂白剂TAED：四乙酰基乙二胺CMC：羧甲基纤维素钠DETPMP：Monsanto销售的商品名为Dequest 2060的二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)PVP：聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS：亚乙基二胺-N,N′-二琥珀酸，钠盐形式的[S,S]异构体抑泡剂：熔点为50℃的链烷烃蜡25％，疏水硅石17％，石蜡油58％。颗粒抑泡剂：硅氧烷/硅石12％,十八烷醇18％，颗粒状淀粉70％硫酸盐：无水硫酸钠HMWPEO：高分子量聚环氧乙烷TAE25：乙氧基化动物脂肪醇(25)去污剂实施例Ⅰ
本发明的一种颗粒状织物清洗剂组合物可按如下制备：线性C12烷基苯磺酸钠   6.5硫酸钠                 1.05沸石A                  26.0次氮基三乙酸钠         5.0本发明的酶             0.1PVP                    0.5TAED                   3.0硼酸                   4.0过硼酸盐               18.0苯酚磺酸盐             0.1其它                   加到100去污剂实施例Ⅱ
本发明的一种致密颗粒状织物清洗剂组合物可按如下制备：45AS                8.025E3S               2.025E5                3.025E3                3.0TFAA                2.5沸石A               17.0NaSKS-6             12.0柠檬酸              3.0碳酸盐              7.0MA/AA               5.0CMC                 0.4本发明的酶          0.1TAED                6.0过碳酸盐            22.0EDDS                0.3颗粒抑泡剂          3.5水/其它             加到100％去污剂实施例Ⅲ
本发明的特别适用于有色织物洗涤的颗粒状清洗剂组合物可按如下制备：LAS                 10.7      -TAS                 2.4       -TFAA                -         4.045AS                3.1       10.045E7                4.0       -25E3S               -         3.068E11               1.8       -25E5                -         8.0柠檬酸盐                           15.0      7.0碳酸盐                             -         10柠檬酸                             2.5       3.0沸石A                              32.1      25.0Na-SKS-6                           -         9.0MA/AA                              5.0       5.0DETPMP                             0.2       0.8本发明的酶                         0.10      0.05硅酸盐                             2.5       -硫酸盐                             5.2       3.0PVP                                0.5       -聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/乙烯基咪 -         0.2唑与乙烯基吡咯烷酮共聚物过硼酸盐                           1.0       -苯酚磺酸盐                         0.2       -水/其它                            加到100％去污剂实施例Ⅳ
本发明的具有“在洗涤过程中软化”能力的颗粒状织物清洁剂组合物按如下制备：45AS                               -         10.0LAS                                7.6       -68AS                               1.3       -45E7                               4.0       -25E3                               -         5.0椰子烷基-二甲基羟乙基氯化铵        1.4       1.0柠檬酸盐                           5.0       3.0Na-SKS-6                           -         11.0沸石A                              15.0      15.0MA/AA                                   4.0      4.0DETPMP                                  0.4      0.4过硼酸盐                                15.0     -过碳酸盐                                -        15.0TAED                                    5.0      5.0绿土                                    10.0     10.0HMWPEO                                  -        0.1本发明的酶                              0.10     0.05硅酸盐                                  3.0      5.0碳酸盐                                  10.0     10.0颗粒状抑泡剂                            1.0      4.0CMC                                     0.2      0.1水/其它                                 加到100％去污剂实施例Ⅴ
本发明的高效液态织物清洗组合物按如下制备：
                                   Ⅰ        Ⅱ酸型LAS                                 -        25.0柠檬酸                                  5.0      2.0酸型25AS                                8.0      -酸型25AE2S                              3.0      -25AE7                                   8.0      -CFAA                                    5        -DETPMP                                  1.0      1.0脂肪酸                                  8        -油酸                                    -        1.0乙醇                                    4.0      6.0丙二醇                                  2.0      6.0本发明的酶                              0.10     0.05椰子烷基二甲基羟乙基氯化铵    -      3.0绿土                          -      5.0PVP                           2.0    -水/其它                       加到100％
以下实施例进一步详细说明本发明，但并不是将限制如权利要求的本发明的范围。材料和方法保藏的菌种：
Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380包含本发明的CGT酶。培养条件：
Thermoalcalibacter bogoriae在如下培养基中厌氧条件下培养：(NH4)2SO4,1.0；NH4Cl,0.4；Na2S2O4,0.1；K2HPO4,0.5；MgSO4,0.1；CaCl2,0.05；NaCl,10.0；胰化蛋白胨，0.25；酵母提取物，0.25；FeCl3,0.01；刃天青，0.001；NaHCO3,2.2；Na2CO3,2.2；半胱氨酸，0.5；淀粉，5.0；所有浓度均为克每升。微量元素溶液141,10ml/L，维生素溶液141,10ml/L，两种溶液均按DSM菌株目录(1993年)配制。
大规模培养于19升发酵罐中(Bioengineering Wald，瑞士)中进行，pH调节为9.0,50℃，搅拌速度300转/分，通入氮气流速10升/小时。用1升预培养物接种发酵罐，预培养物于50℃2升烧瓶中培养8小时，不振摇。淀粉分解酶的纯化：
除非另外说明，所有纯化步骤均在室温下进行。于19升发酵罐中培养8小时后，16升的肉汤培养基用连续式离心转子(Heraeus,Osterode，德国)于41℃ 12000转/分离心，直到细胞与培养物上清液分离。培养物上清液然后用10KDa滤器(Filtron)通过错流过滤浓缩至1升。接着用10KDa滤器(Amicon)于Amicon过滤室中进一步浓缩。为了去掉干扰量的H2S和改变缓冲液，浓缩的上清液上PD-10离子交换柱(Pharmacia)用10mM磷酸钠缓冲液pH9.0洗脱。收集包含淀粉分解活性的洗脱液在Amicon室中(10KDa滤器，Amicon)浓缩十倍。然后将溶液样品上Q-Sepharose阴离子交换色谱柱(15×2.5cm)(Pharmacia)，色谱柱先用100mM磷酸钠缓冲溶液pH9.0平衡。用90ml平衡缓冲液冲洗柱子。用NaCl梯度从0到300mM和300到500mM，流速0.2ml/分钟洗脱酶溶液，酶溶液用包含有1M NaCl的平衡缓冲液洗脱。收集各级分(每管2ml)用文中所述方法测定淀粉分解活性。收集活性级分，合并然后在Amicon室中浓缩10倍。预纯化的淀粉酶样品上Superose 75凝胶过滤柱(Pharmacia)，柱子先用50mM磷酸钠缓冲液pH9.0预平衡。酶用平衡缓冲液以0.1ml/分钟流速洗脱。收集各级分(每管1ml)合并活性级分，然后在Amicon室中用10KDa膜浓缩。电泳和分子量测定
根据Laemmli(Laemmli等)方法进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以11.5％聚丙烯酰胺凝胶置于Mini Protean Ⅱ电泳系统(Bio-Rad)中，在24mA恒流和高电压下电泳。根据Blum等人的方法银染蛋白质。为了测定分子量，使用宽范围分子量的蛋白混合物(Bio-rad)作标准。SDS-PAGE中淀粉分解酶活性的活性染色。
为了去掉SDS，在活性染色之前，将SDS凝胶置于2.5％Triton X-100溶液中保温30分钟。将凝胶于65℃，添加了0.5％可溶性淀粉(Merck)的100mM磷酸钠缓冲液的淀粉酶pH9.0中温育10分钟，以检测淀粉分解蛋白带。分解淀粉的蛋白质带可用KJ-J2溶液染色凝胶而看见，(每升aqua dest 3gKJ,2gI2)，白色活性带出现在棕色背景中。淀粉分解分析
常规的酶分析方法是用带有各个预纯化的酶与底物的溶液(0.5％可溶性淀粉(Merk,Darmstadt，德国)或0.2％的直链淀粉或0.2％支链淀粉(均为重量/体积))在100mMpH9.0的磷酸钠缓冲溶液中进行，终体积0.1ml，如不另外说明，温育条件均为65℃,30分钟。还原糖的量用Somogyi-Nelson方法测定(Somogyi,M.生物化学杂志(1945)160:61-68；Nelson,N.生物化学杂志(1944)153:375-380)。酶活性用0-1％(重量/体积)麦芽糖标准曲线计算。一个单位(U)淀粉分解活性定义为在标准条件下(pH9.0；65℃)每分钟酶产生1mmol还原糖的量。蛋白质测定
蛋白质的浓度通过Lowry方法测定。进行微量分析，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。pH和温度的影响
使用预纯化的酶溶液研究pH和温度对淀粉酶活性的影响。10ml酶溶液与90ml 0.5％(重量/体积)底物溶液(可溶性淀粉；Merck)在120mM通用Britlon&Robinsson缓冲溶液中混合，pH4.0到11.0。测定酶与底物溶液混合物引起的pH值的变化。将该混合物在冰上预温育30分钟，然后在65℃进行30分钟酶分析。以产生的还原糖量对各自的pH作图。
用预纯化的酶研究温度对淀粉酶活性的影响。10ml酶溶液与90ml0.5％底物溶液(可溶性淀粉，Merck)在100mM最适pH9.0的磷酸钠缓冲液中混合。温育30分钟，温度在30℃到80℃之间。为考察温度稳定性，酶溶液置于螺旋盖Ependorf管中在60℃,70℃和80℃温育直达21小时，在一定时间间隔采样测定残留淀粉酶活性。底物特异性
为了测定α-淀粉酶的底物特异性，将酶分别与包含可溶性淀粉(Merck)(0.5％)，支链淀粉(0.2％)，直链淀粉(0.2％)，普鲁兰(0.2％)，麦芽三糖(0.1％)麦芽四糖(0.1％)和麦芽五糖(0.1％)的底物溶液(重量/体积)温育。在标准条件下(65℃,pH8.0)温育30分钟，对于α-淀粉酶，通过测定还原糖的量确定酶活性。水解产物分析
通过高效液相色谱(HPLC)(Knauer GmbH,Berlin，德国)分析淀粉酶作用于不同底物的水解模式，用Aminex-HPX-42A柱(300mm×7.8mm；Bio-Rad,Henules,Calif.)。一份预纯化的各种酶与9份淀粉酶底物溶液pH9.0于65℃温育长达16小时，温育后样品于-20℃冰冻保存，直到进行分析。我们所用淀粉酶底物溶液：可溶性淀粉(0.5％)，普鲁兰(0.5％)，直链淀粉(0.2％)，支链淀粉(0.2％)，麦芽寡糖DP1到DP5(DP=聚合程度)，环糊精混合物(0.1％)和纯环糊精(α,β,γ)(重量/体积)分别溶于100mMpH9.0的磷酸钠缓冲溶液中。化学试剂
普鲁兰环糊精和麦芽寡糖获自Sigma(St.Louis,Mo.)，电泳试剂购于Serva(heidelberg，德国)。其它化学试剂均获自Merck(Darmstadt，德国)。实施例1：淀粉酶的纯化
浓缩70倍的培养液上清液的淀粉酶特定活性为0.096U/mg，如前所述，因发酵过程中产生了H2S，因此需用PD-10离子交换柱纯化以除去H2S、硫化物和其它活性干扰剂。经过这一步之后，可检测的活性上升为0.48U/mg。这个结果没有涉及还原糖的测定方法(数据略)。活性染色法显示，在SDS-PAGE电泳胶上，浓缩的培养液上清液呈现三个活性带(图1，泳道2)。表观分子量为57±3KDa的最低的活性带呈现α-淀粉酶活性，(见下文)。浓缩10倍的PD-10洗脱液样品上Q-Sepharose阴离子交换色谱柱(Pharmacia，瑞典；25×200mm)，用平衡缓冲液(100mM磷酸钠pH8.0)以1.0ml/分钟冲洗柱子(使用Bio-Rad Econo系统)，α-淀粉酶通过直到500mM的NaCl梯度洗脱，于250mM盐时洗脱下来。收集包含α-淀粉酶活性的级分将其合并。将浓缩10倍的该淀粉酶样品的收集液(图1，泳道3)上Superdex 75凝胶过滤柱(Pharmacia，瑞典；15×300mm)，使用Bio-Rad Econo系统，用100mMpH8.0磷酸钠缓冲液以0.1ml/分钟流速洗脱。收集活性级分，这些活性级分浓缩物经电泳，银染呈现单一带。经纯化的酶其特定活性为2.8U/mg蛋白质。银染的单一蛋白质带与活性染色的活性淀粉酶带相符合。(图1，泳道4和5)实施例2纯化的淀粉酶的表征：分子量测定
淀粉酶的分子量用活性染色和银染测定，单一带的分子量估计为57±3KDa(图1，泳道4和5)pH和温度对酶活性的影响
预纯化的酶显示最优pH范围在8.0到9.0之间，在pH5和10.5之间的宽pH范围具有活性(图2)。在分析条件下(65℃,60分钟)于此宽pH范围内淀粉酶稳定。淀粉酶最佳pH与菌株最佳生长条件相适应(pH9.5)。与0.5％可溶性淀粉(重量/体积)在碱性pH10.0条件下温育60分钟之后该淀粉酶呈现高稳定性，而活性只丧失30％(图2)。
预纯化的淀粉酶的温度曲线呈现明显的最佳活性温度为65℃(图3)在测定条件下，与0.5％可溶性淀粉pH9.0温育60分钟，该酶在温度低于45℃和高于75℃只呈现较低的活性。金属离子与化学试剂的影响
在浓度为1mM、2mM和5mM各种金属离子浓度和一些化学试剂(图4)存在下于pH8.0(更高的pH会干扰金属离子溶液)65℃测定淀粉酶活性。添加诸如Co2+、Ca2+和EDTA等各种金属离子对淀粉酶活性没有或只有轻微的抑制。Mg2+,Mo7+,Zn2+和Ni2+产生中等强度抑制。添加Cu2+,Fe2+,Fe3+,V4+和Cr6+可观察到强的抑制作用。虽然添加Mn2+对酶活性有中等刺激作用，但只有在100mM磷酸钠缓冲溶液中温育酶才有活性。
化学试剂浓度为1mM时对酶活性均有刺激作用(图4)，而当添加蛋白伸展去污剂SDS和DTT浓度为5mM时酶活性完全被抑制。添加N-溴-丁二酰亚胺产生57％的抑制作用，而丝氨酸抑制剂Pefabloc SC不干扰淀粉酶活性。而5mM盐酸胍对淀粉酶活性仍可观察到刺激作用。
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Claims (11)

1．一种经分离的α-淀粉酶，其特征为在65℃,pH8.0的包含0.5％(重量/体积)可溶性淀粉的底物溶液中温育30分钟后具有至少65％残留α-淀粉酶活性，底物溶液中Ca2+浓度在0.5mM到6mM之间。
2．如权利要求1的α-淀粉酶，其中的α-淀粉酶获自Thermoalcalibacter属种菌株。
3．一种经分离的细胞外α-淀粉酶，其获自Thermoalcalibacter属种菌株。
4．如权利要求2或3中任一项的α-淀粉酶，其中Thermoalcalibacter属种菌株是一种中等热嗜碱性厌氧菌株。
5．如权利要求4的α-淀粉酶，其中菌株为Thermoalcalibacterbogoriae，尤其为Thermoalcalibacter bogoriae DSM NO.9380。
6．如权利要求1-5中任一项的α-淀粉酶，其中的α-淀粉酶分子量为57±10KDA，在pH9.0测得的最适温度为65±10℃，和/或最适pH范围pH8～10之间。
7．一种制备如权利要求1-4中任一项的α-淀粉酶的方法，其包括在允许产生该酶的条件下培养Thermoalcalibacter属种菌株，并且从培养物中回收该酶。
8．如权利要求7的方法，其中Thermoalcalibacter属种是Thermoalcalibacter bogoriae菌株，尤其是Thermoalcalibacter bogoriaeDSM No.9380。
9．一种酶组合物，其包括权利要求1-6中任一项的α-淀粉酶。
10．如权利要求9的酶组合物，其还包括蛋白酶、脂酶、淀粉分解酶、氧化酶(包括过氧化物酶)或纤维素酶。
11．如权利要求1-6中任一项的α-淀粉酶或如权利要求9或10的酶组合物在洗衣和/或洗碟用去污剂中的用途。
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