CN110662836B - α-淀粉酶组合变体 - Google Patents

Abstract

本文公开了与变体α‑淀粉酶有关的组合物和方法。变体α‑淀粉酶可用于例如淀粉液化和糖化，用于清洁衣物中的淀粉污渍、餐具洗涤、和其他应用，用于纺织品加工(例如脱浆)，在动物饲料中用于改善消化率，以及用于烘焙和酿造。

Description

α-淀粉酶组合变体

优先权

本申请要求于2017年3月31日提交的美国临时申请序列号62/479,726的权益，所述临时申请通过引用以其全文特此并入。

技术领域

本文公开了涉及含有多个可组合突变的变体α-淀粉酶的组合物和方法。变体α-淀粉酶可用于例如淀粉液化和糖化、清洁淀粉污渍、纺织品脱浆、烘焙、和酿造。

背景技术

淀粉由直链淀粉(15％-30％w/w)和支链淀粉(70％-85％w/w)的混合物组成。直链淀粉由具有分子量(MW)为从约60,000至约800,000的α-1,4-连接的葡萄糖单元的直链组成。支链淀粉是一种支化聚合物，每24-30个葡萄糖单位含有α-1,6分支点；其MW可能高达1亿。

目前通过酶催化工艺自淀粉产生呈浓缩右旋糖糖浆形式的糖，所述工艺涉及：(1)将具有α-淀粉酶的固体淀粉糊化和液化(或黏度降低)成具有平均聚合度为约7-10的糊精，和(2)用淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)糖化所得的液化淀粉(即淀粉水解产物)。所得的糖浆具有高葡萄糖含量。随后将商业上生产的大部分葡萄糖糖浆酶促地异构化为称为异糖浆的右旋糖/果糖混合物。所得的糖浆也可以用微生物如酵母发酵，以生产商业产品，例如，包括乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一钠、葡糖酸盐、赖氨酸、其他有机酸、其他氨基酸、和其他生物化学品。发酵和糖化可以同时进行(即SSF过程)以实现更高的经济性和效率。

α-淀粉酶通过随机裂解内部的α-1,4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关多糖。α-淀粉酶，特别是来自芽孢杆菌属(Bacilli)的α-淀粉酶已经用于各种不同的目的，包括淀粉液化和糖化、纺织品脱浆、纸和纸浆工业中的淀粉修饰、酿造、烘焙、用于食品工业的糖浆的生产、用于发酵过程的原料的生产、以及用于动物饲料中以增加可消化性。这些酶还可用于在餐具洗涤和衣物洗涤期间除去淀粉污垢和污渍。

许多出版物已经描述了α-淀粉酶中的突变。然而，并非所有突变在不同分子中产生相同的效果，且并非所有突变都可以组合。此外，许多突变产生具有某些所需品质的分子，而牺牲其他特性。对于稳健的工程化α-淀粉酶分子存在需求。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及变体淀粉酶多肽及其使用方法。本发明的组合物和方法的方面和实施例总结在以下分别编号的段落中：

1.在一方面，提供了亲本α-淀粉酶的重组变体，所述重组变体包含：

(a)对应于使用SEQ ID NO:1时R181、G182、T183、和G184的至少一个氨基酸残基的缺失；和任选地在对应于T183、E190、M202、Q172、A186和/或I324的氨基酸残基处的突变；其中所述变体α-淀粉酶或所述亲本α-淀粉酶相对于用于编号的SEQ ID NO:1具有至少91％、任选地92％、任选地93％、任选地94％、任选地95％、任选地96％、任选地97％、任选地98％、或任选地99％氨基酸序列同一性；且其中与所述亲本α-淀粉酶或与所述变体α-淀粉酶不同仅在于没有所述突变的参考α-淀粉酶相比，所述变体在自动餐具洗涤中具有改善的清洁性能；或

(b)(a)中变体的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加并且具有(a)中变体的活性。

2.在一些实施例中，如段落1所述的变体α-淀粉酶包含对应于使用SEQ ID NO:1编号时R181和G182、或T183和G184的氨基酸残基的缺失。

3.在一些实施例中，如前述段落中任一项所述的变体α-淀粉酶在以下位置处具有突变：

T183和E190，

T183和M202，

E190和M202，

T183、E190和M202，

Q172和A186，

A186和I324，

Q172和I324，

Q172、A186和I324，

Q172、A186和M202，

A186、I324和M202，

Q172、I324和M202或

Q172、A186、I324和M202。

4.在一些实施例中，如前述段落中任一项所述的变体α-淀粉酶具有突变：

T183D和E190P，

T183D和M202L，

T183D、E190P和M202L，

Q172R和A186G，

A186G和I324M，

Q172R和I324M，

Q172R、A186G和I324M，

Q172R、A186G和M202L，

A186G、I324M和M202L，

Q172R、I324M和M202L或

Q172R、A186G、I324M和M202L。

5.在如前述段落中任一项所述的变体α-淀粉酶的一些实施例中，所述变体由在严格条件下与SEQ ID NO:2的多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸编码。

6.在另一方面，提供了一种编码如段落1-5中任一项所述的变体淀粉酶的多核苷酸、一种包含所述多核苷酸的表达载体、或一种包含所述多核苷酸或所述表达载体的表达宿主。

7.在另一方面，提供了一种用于液化淀粉的组合物，所述组合物包含如段落1-5中任一项所述的变体淀粉酶。

8.在另一方面，提供了一种洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物包含如段落1-5中任一项所述的变体淀粉酶。

9.在另一方面，提供了一种用于将淀粉转化为寡糖的方法，所述方法包括使淀粉与有效量的如段落1-5中任一项所述的变体淀粉酶接触。

10.在另一方面，提供了一种用于从表面除去淀粉污渍或污垢的方法，所述方法包括使所述表面与有效量的如段落1-4中任一项所述的变体淀粉酶接触，并且允许所述多肽水解存在于所述淀粉污渍中的淀粉组分以产生溶解于水性组合物的较小的衍生自淀粉的分子，从而从所述表面除去所述淀粉污渍。

这些组合物和方法的这些和其他方面以及实施例将从本说明书和附图中显而易见。

附图说明

图1为显示具有灭活酶的PLATINUM^TM餐具洗涤配方中酶的淀粉清洁性能的图。

图2为显示具有灭活酶的PLATINUM^TM餐具洗涤配方中酶的淀粉清洁性能的图。

图3为显示具有灭活酶的PLATINUM^TM餐具洗涤配方中酶的淀粉清洁性能的图。

图4为显示具有灭活酶的QUANTUM^TM餐具洗涤配方中酶的淀粉清洁性能的图。

具体实施方式

描述了与变体α-淀粉酶有关的组合物和方法。变体淀粉酶的示例性应用是用于淀粉液化和糖化、用于清洁衣物中的淀粉污渍、餐具洗涤、和其他应用，用于纺织品加工(例如脱浆)、在动物饲料中用于改善消化率、以及用于烘焙和酿造。下文详细描述了所述组合物和方法的这些和其他方面。

在描述本发明的组合物和方法的各个方面和实施例之前，描述了以下定义和缩写。

1.定义和缩写

根据这一详细说明，以下缩写和定义适用。应当注意单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有清楚地指示。因此，例如提及“酶”包括多个此类酶，并且提及“剂量”包括提及一个或多个剂量以及本领域普通技术人员已知的其等效物，等等。

将本文件组织成几部分以便于阅读；然而，读者将领会的是，在一个部分中进行的陈述可能适用于其他部分。以这种方式，用于本公开的不同部分的标题不应被解释为限制。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。下文提供了以下术语。

1.1.缩写和首字母缩略词

除非另有指定，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

DNA 脱氧核糖核酸

EC 酶学委员会

FH 法国硬度(French hardness)

GA 葡糖淀粉酶

GH 总硬度

HDL 高密度液体洗涤剂

HDD 重垢粉末洗涤剂

HSG 高泡沫颗粒状洗涤剂

HFCS 高果糖玉米糖浆

IRS 不可溶残留淀粉

kDa 千道尔顿

MW 分子量

MWU 经修饰的Wohlgemuth单位；1.6x 10^-5mg/MWU＝活性单位

NCBI 国家生物技术信息中心

PI 性能指数

ppm 百万分率，例如μg蛋白质/克干固体

RCF 相对离心/向心力(即x重力)

RNA 核糖核酸

sp. 物种

Tm 熔融温度

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

v/v 体积/体积

wt％ 重量百分比

℃ 摄氏度

H₂O 水

dH₂O或DI 去离子水

dIH₂O 去离子水，Milli-Q过滤

g或gm 克

μg 微克

mg 毫克

kg 千克

μL和μl 微升

mL和ml 毫升

mm 毫米

μm 微米

M 摩尔

mM 毫摩尔

μM 微摩尔

U 单位

sec 秒

min(s) 分钟/分钟

hr(s) 小时/小时

ETOH 乙醇

N 正常

MWCO 分子量截止值

CAZy 碳水化合物活性酶数据库

1.2.定义

术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指这样的酶：除其他事项之外，其能够催化淀粉的降解。α-淀粉酶是裂解淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。通常，α-淀粉酶(EC3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为内切作用的酶，其以随机方式裂解淀粉分子内的α-D-(1→4)O-糖苷键，产生含有三个或更多个(1-4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖。相反地，外切作用的淀粉分解酶，例如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶(如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133))从底物的非还原端裂解多糖分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡萄糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)和产物特异性淀粉酶(如麦芽四糖苷酶(EC 3.2.1.60)和麦芽六糖苷酶(EC 3.2.1.98))可以生产特定长度的麦芽寡糖或富含糖浆的特定麦芽寡糖。

术语“淀粉”是指由植物的复合多糖碳水化物组成的任何材料，所述复合多糖碳水化物由具有式(C₆H₁₀O₅)_x(其中“X”可以是任何数目)的直链淀粉和支链淀粉组成。所述术语包括植物基材料，如谷物、谷类、草、块茎和根，并且更具体地，从小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸皮、木薯、粟、蜀黍、马铃薯、甘薯、和树薯获得的材料。术语“淀粉”包括颗粒状淀粉。术语“颗粒状淀粉”是指生的(即未烹调的)淀粉，例如，未经历糊化的淀粉。

关于多肽，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指在一个或多个氨基酸位置处不包含人为取代、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“野生型”，“亲本”或“参考”是指不包含人为核苷变化的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型、亲本、或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本、或参考多肽的任何多核苷酸。

参考野生型多肽应理解为包括多肽的成熟形式。“成熟”多肽或其变体是其中不存在信号序列的多肽或变体，例如，在多肽表达期间或之后从未成熟形式的多肽裂解。

关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参考多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然存在的或人造的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参考多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的身份将从上下文中显而易见。

在本发明α-淀粉酶的情况下，“活性”是指α-淀粉酶活性，其可以如本文所述测量。

术语“性能益处”是指分子的期望特性上的改善。示例性的性能益处包括但不限于：淀粉底物水解增加，谷物、谷类或其他淀粉底物的液化性能增强，清洁性能增强，热稳定性增强，洗涤剂稳定性增强，储存稳定性增强，溶解度增加，pH曲线改变，钙依赖性降低，比活性增加，底物特异性经修饰，底物结合经修饰，pH依赖性活性经修饰，pH依赖性稳定性经修饰，氧化稳定性增加、和表达增加。在一些情况下，性能益处是在相对较低的温度下实现的。在一些情况下，性能益处是在相对较高的温度下实现的。

术语“蛋白酶”(“protease”和“proteinase”)是指具有进行“蛋白水解”或“蛋白水解裂解”的能力的酶蛋白，所述“蛋白水解”或“蛋白水解裂解”是指水解将形成所述蛋白质的肽或多肽链中的氨基酸连接在一起的肽键。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。

术语“丝氨酸蛋白酶”是指裂解蛋白质中的肽键的酶，其中酶丝氨酸在酶活性位点处充当亲核氨基酸。基于其结构将丝氨酸蛋白酶分为两大类：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)或枯草杆菌蛋白酶样。最常用于衣物和餐具洗涤剂中的是丝氨酸蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白酶。

“组合变体”是包括两个或更多个突变，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个取代、缺失、和/或插入的变体。

“可组合突变”是在可用于制备组合变体的任何氨基酸位置处的突变。可组合的突变改善了分子(在这种情况下，是淀粉酶)的至少一种所需的特性，而不显著降低表达、活性、或稳定性。

术语“重组”当用于提及主题细胞、核酸、蛋白质或载体时，表明受试者已经从其天然状态被修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或以不同于自然界发现的水平或在不同于自然界发现的条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列不同在于一个或多个核苷酸，和/或有效地连接到异源序列，例如表达载体中的异源启动子。重组蛋白质可以与天然序列不同在于一个或多个氨基酸，和/或与异源序列融合。包含编码淀粉酶的核酸的载体是重组载体。

术语“回收的”、“分离的”和“单独的”是指从如天然存在的与其天然相关的至少一种其他材料或组分中除去的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸、或者其他指定材料或组分。其“分离的”多肽包括但不限于含有在异源宿主细胞中表达的分泌多肽的培养肉汤。

术语“纯化的”是指处于相对纯的状态的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)，例如，至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、或甚至至少约99％纯。

术语“富集的”是指处于约50％纯、至少约60％纯、至少约70％纯、或甚至至少约70％纯的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)。

关于酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于升高的温度后保持活性的能力。酶(例如淀粉酶)的热稳定性通过以分钟、小时或天给出的其半衰期(t1/2)来测量，在此期间酶活性的一半在限定条件下丧失。半衰期可以通过测量暴露于(即，受挑战于)升高的温度后的残余α-淀粉酶活性来计算。

关于酶的“pH范围”是指在其下酶显示催化活性的pH值的范围。

关于酶的术语“pH稳定”和“pH稳定性”涉及在一个宽范围内的pH值下，酶保持预定时间段(例如，15min.、30min.、1小时)的活性的能力。

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换地使用。当此类氨基酸序列显示出活性时，它们可以被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基-至-羧基端取向(即N→C)表示的氨基酸序列。

术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以含有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码具体的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，核酸序列以5′-至-3′取向呈现。

“杂交”是指如在印迹杂交技术和PCR技术期间发生的，一条核酸链与互补链形成双链体(即碱基对)的过程。严格杂交条件通过在以下条件下杂交来例证：65℃和0.1X SSC(其中1X SSC＝0.15M NaCl、0.015M Na3柠檬酸盐，pH 7.0)。杂交的双链核酸的特征在于熔融温度(Tm)，其中一半杂交的核酸与互补链不配对。双链体内错配的核苷酸降低Tm。与SEQID NO:2的核苷酸和其同一的互补序列之间形成的双链体相比，编码变体α-淀粉酶的核酸可以具有降低了1℃-3℃或更多的Tm。

“合成的”分子通过体外化学或酶促合成而不是通过生物体产生。

关于细胞使用的术语“转化”，“稳定转化”和“转基因”意指细胞包含整合到其基因组中或作为通过多代维系的附加体的非天然(例如异源)核酸序列。

在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经引入了表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码目的多肽(例如，淀粉酶)的多核苷酸的生物体。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽和/或发酵糖的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指不是天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译。

“选择性标记”或“可选择标记”是指能够在宿主中被表达以促进选择携带所述基因的宿主细胞的基因。可选择标记的实例包括但不限于在宿主细胞上赋予代谢优势(如营养优势)的抗微生物剂(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或基因。

“载体”是指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

“表达载体”是指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列与能够在适合的宿主中影响DNA表达的适合控制序列有效地连接。此类控制序列可以包括影响转录的启动子，控制转录的任选的操纵子序列，编码mRNA上适合的核糖体结合位点的序列，增强子以及控制转录和翻译终止的序列。

术语“有效地连接”意指：指定组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并列)。例如，调控序列与编码序列有效地连接，使得编码序列的表达受调控序列的控制。

“信号序列”是与蛋白质的N-末端部分附接的氨基酸序列，所述氨基酸序列有利于蛋白质在细胞外的分泌。细胞外的蛋白质的成熟形式缺乏在分泌期间被切除的信号序列。

“生物学活性的”是指具有指定生物活性，例如酶活性的序列。

术语“比活性”是指在特定条件下每单位时间通过酶或酶制剂可转化为产物的底物的摩尔数。比活性通常表示为单元(U)/mg蛋白质。

如本文所用，“水硬度”是水中存在的矿物质(例如钙和镁)的量度。

“样本”是一块材料，例如在其上涂有污渍的织物。所述材料可以是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。样本还可以是纸，例如滤纸或硝酸纤维素，或一块硬质材料，例如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但可包括血液、奶、墨水、草、茶、红酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、黏土、颜料、油、或这些化合物的混合物。

“更小的样本”是已经使用单孔打孔装置或者是已经使用定制的96孔打孔装置切割的样本的一部分，其中多孔打孔机的图案与标准96孔微量滴定板匹配，或者所述部分已经从样本中另外除去。样本可以是纺织品、纸、金属或其他适合的材料。更小的样本可以在将其置于24孔、48孔或96孔微量滴定板的孔中之前或之后具有附着的污渍。更小的样本也可以通过在一小块材料上涂上污渍来制作。例如，更小的样本可以是直径为5/8”或0.25”的污染的织物片。定制的打孔器以这样一种方式设计，使得其能够同时向96孔板的所有孔中递送96个样本。通过简单地多次装载相同的96孔板，所述装置允许每孔递送多于一个样本。可以想到多孔打孔装置同时将多个样本递送到任何规格的板，包括但不限于24孔、48孔、和96孔板。在另一种可想到的方法中，污染的测试平台可以是涂覆污垢底物的由金属、塑料、玻璃、陶瓷或其他适合材料制成的珠子。然后将一个或多个涂覆的珠子置于96孔、48孔或24孔板或更大规格板的孔中，所述孔含有适合的缓冲液和酶。

“包含淀粉酶的经培养的细胞材料”或类似语言是指包含淀粉酶作为组分的细胞裂解物或上清液(包括介质)。细胞材料可以来自异源宿主，其在培养物中生长，目的是产生淀粉酶。

“序列同一性百分比”是指当使用具有默认参数的CLUSTAL W算法比对时，具体序列具有与指定参考序列中的氨基酸残基相同的至少一定百分比的氨基酸残基。参见Thompson等人，(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：

空位开放罚分： 10.0

空位延伸罚分： 0.05

蛋白质权重矩阵： BLOSUM系列

DNA权重矩阵： IUB

延迟发散序列％： 40

空位分隔距离： 8

DNA转换权重： 0.50

列表亲水残基： GPSNDQEKR

使用负性矩阵： 关

切换特殊残基罚分： 开

切换亲水罚分： 开

切换结束空位分隔罚分关。

与参考序列相比，缺失被视为不同一的残基。

“融合”多肽序列通过两个受试多肽序列之间的肽键连接，即有效地连接。

术语“丝状真菌”是指所有丝状形式的真菌亚门(Eumycotina)，特别是子囊菌亚门(Pezizomycotina)物种。

术语“干固体含量”(ds)是指基于干重百分比的、浆料的总固体。术语“浆料”指含有不可溶固体的水性混合物。

短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指生物化学品的生产过程，其中在同一工艺步骤中存在微生物，例如产乙醇微生物和至少一种酶，例如淀粉酶。SSF包括在相同的反应容器中同时将淀粉底物(颗粒状、液化的或溶解的)水解为糖类(包括葡萄糖)和将糖类发酵为醇类或其他的生物化学品或生物材料。

“产乙醇微生物”是指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。

术语“发酵饮料”是指通过包括发酵工艺(例如微生物发酵，如细菌和/或真菌发酵)的方法生产的任何饮料。“啤酒”是这种发酵饮料的一个实例，并且所述术语“啤酒”意指包括通过发酵/酿造含淀粉的植物材料生产的任何发酵的麦芽汁。通常，啤酒仅生产自麦芽或辅料、或麦芽与辅料的任何组合。

术语“麦芽”是指任何发芽的谷类谷粒，如发芽的大麦或小麦。

术语“辅料”是指不是麦芽，例如大麦的或小麦的麦芽的任何含有淀粉和/或糖的植物材料。辅料的实例包括，普通玉米糁、精制玉米糁、制啤酒用研磨酵母、稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙谷物、谷物片、黑麦、燕麦、马铃薯、树薯、木薯和糖浆，例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等。

术语“醪液”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅料或其组合的含水浆料，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。

术语“麦芽汁”是指糖化醪制备期间，对谷粉进行提取后，未发酵的液体流出物(run-off)。

术语“约”是指参考值的±15％。

2.α-淀粉酶变体

本发明的组合物和方法的一个方面是变体α-淀粉酶，包括改善其在工业应用中的性能的突变的组合。组合变体基于来自芽孢杆菌属物种的α-淀粉酶，在本文中称为“BspAmy24”。BspAmy24α-淀粉酶多肽的成熟形式的氨基酸序列如下文SEQ ID NO:1所示：

HHNGTNGTMMQYFEWHLPNDGQHWNRLRNDAANLKNLGITAVWIPPAWKGTSQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTRSQLQSAIASLQNNGIQVYGDVVMNHKGGADGTEWVQAVEVNPSNRNQEVTGEYTIEAWTKFDFPGRGNTHSSFKWRWYHFDGTDWDQSRQLNNRIYKFRGTGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADVDMDHPEVINELRRWGVWYTNTLNLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWLNHVRSTTGKNNMFAVAEFWKNDLGAIENYLHKTNWNHSVFDVPLHYNLYNASKSGGNYDMRQILNGTVVSKHPIHAVTFVDNHDSQPAEALESFVEAWFKPLAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHGVAAMKGKIDPILEARQKYAYGTQHDYLDHHNIIGWTREGNSAHPNSGLATIMSDGPGGSKWMYVGRHKAGQVWRDITGNRTGTVTINADGWGNFSVNGGSVSIWVNK

以SEQ ID NO:1作为起始点，制备并测试了许多组合变体，尤其着重于鉴别在北美自动餐具洗涤(ADW)条件下具有高清洁性能的变体。确定了几种具有出色清洁性能的变体。

表现最佳的变体BspAmy24α-淀粉酶中的一些(但不是全部)包含与对应于使用SEQID NO:1编号时R181、G182、T183和G184的钙结合环相邻的X₁G/S₁X₂G₂基序中的缺失。由于X₁G/S₁X₂G₂基序的性质，对应于R181和G182、或T183和G184的氨基酸残基的成对缺失通常在改善稳定性和减少钙依赖性方面同样有效。对应于R181和G182的氨基酸残基中的缺失可以称为“ΔRG”，而对应于T183和G184的氨基酸残基中的缺失可以称为“ΔTG”。

表现最佳的变体中存在的其他突变在下文显示的位置处(使用SEQ ID NO:1编号)：

T183、E190、M202、Q172、A186、和/或I324，例如，

T183+E190，

T183+M202，

T183+E190+M202，

Q172+A186+I324以及

A186+I324。

表现最佳的变体中存在的特定突变在下文显示(使用SEQ ID NO:1编号)：

T183D、E190P、M202L、Q172R、A186G、和/或I324M，例如，

T183D+E190P，

T183D+M202L，

T183D+E190P+M202L，

Q172R+A186G+I324M以及

A186G+I324M。

这些突变组合可以与在对应于R181、G182、T183和/或G184的位置处的前述缺失结合使用。取代T183D可能对溶解度有影响，但被认为不会显著影响性能。前述突变很可能与α-淀粉酶中描述的其他突变相结合，对此已有大量公开的专利文献。

在一些实施例中，本发明的α-淀粉酶变体具有指示的突变组合和与SEQ ID NO:1具有确定程度的氨基酸序列同源性/同一性，例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％氨基酸序列同源性/同一性。

在一些实施例中，本发明的α-淀粉酶变体具有指示的突变组合，并且衍生自与SEQID NO:1具有确定程度的氨基酸序列同源性/同一性(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％氨基酸序列同源性/同一性)的亲本淀粉酶。

此外，本发明的淀粉酶可以包含任何数量的保守氨基酸取代。示例性保守氨基酸取代列于表1中

表1.保守氨基酸取代

本发明的淀粉酶还可以衍生自通过在氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸(例如小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3或甚至小于2个取代、缺失或添加)的任何上述淀粉酶变体。此类变体应具有与其衍生的淀粉酶相同的活性。

读者将理解，一些前述保守突变可以通过遗传操作产生，而其他通过用遗传或其他方式将合成的氨基酸引入多肽中产生。

本发明的淀粉酶可以是“前体”、“未成熟”或“全长”，在这种情况下，它们包含信号序列；或“成熟”，在这种情况下，它们缺乏信号序列。成熟形式的多肽通常是最有用的。除非另有说明，本文使用的氨基酸残基编号是指相应淀粉酶多肽的成熟形式。只要所得的多肽保留淀粉酶活性，本发明的淀粉酶多肽也可被截短以除去N或C-末端。

本发明的淀粉酶可以是“嵌合”或“杂合”多肽，因为它包含至少一部分的第一淀粉酶多肽和至少一部分的第二淀粉酶多肽(这种嵌合淀粉酶最近已经被“重新发现”为结构域交换淀粉酶)。本发明的淀粉酶可进一步包含异源信号序列，即允许跟踪或纯化等的表位。示例性异源信号序列来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(AmyE或AprE)、和链霉菌属(Streptomyces)CelA。

2.5.编码变体淀粉酶多肽的核苷酸

在另一方面，提供了编码变体淀粉酶多肽的核酸。所述核酸可以编码具体的淀粉酶多肽，或与具体淀粉酶具有指定程度的氨基酸序列同一性的淀粉酶。

在一些实例中，核酸编码与SEQ ID NO:1具有至少60％、至少65％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％同源性/同一性的淀粉酶(排除编码信号序列的核酸部分)。应当理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸可以编码相同的多肽。

在一些实例中，核酸在严格或非常严格的条件下与编码如下淀粉酶的核酸(或与编码如下淀粉酶的核酸互补的核酸)杂交，所述淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％同源性/同一性(排除编码信号序列的核酸部分)。

在一些实施例中，核酸与SEQ ID NO:2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％同一性。在一些实施例中，核酸在严格或非常严格的条件下与SEQ ID NO:2或其互补序列的核酸杂交：

CACCATAATGGTACGAATGGAACGATGATGCAATACTTTGAGTGGCATTTACCAAATGATGGTCAGCATTGGAATCGGTTAAGAAATGATGCCGCAAATTTAAAGAATCTAGGAATTACAGCAGTTTGGATTCCACCTGCTTGGAAAGGCACATCACAAAATGATGTCGGCTACGGGGCTTATGATTTATATGACCTTGGTGAATTTAATCAAAAAGGAACAATTCGAACGAAATATGGTACGCGGAGTCAATTACAATCAGCAATTGCCTCATTACAAAATAATGGTATTCAAGTTTACGGCGATGTTGTTATGAATCACAAAGGCGGTGCAGATGGAACTGAATGGGTTCAAGCTGTTGAAGTAAATCCAAGTAACCGCAATCAAGAAGTGACTGGCGAATATACAATTGAAGCATGGACAAAATTCGATTTTCCAGGGAGAGGGAATACGCATTCAAGTTTTAAATGGAGATGGTACCATTTTGATGGAACAGATTGGGACCAATCTCGGCAACTTAACAATCGCATCTATAAATTCCGCGGGACCGGAAAAGCATGGGACTGGGAAGTTGATACGGAGAACGGAAATTATGATTACTTAATGTATGCTGATGTTGATATGGATCATCCAGAAGTAATTAATGAACTAAGGAGATGGGGTGTTTGGTACACAAATACACTAAATCTTGATGGATTCAGAATTGACGCTGTTAAACATATTAAATATAGTTTTACTAGAGACTGGCTAAATCATGTAAGAAGTACAACTGGTAAGAATAATATGTTCGCTGTGGCAGAGTTTTGGAAAAATGACTTAGGTGCCATTGAAAATTACTTACACAAAACGAACTGGAATCACTCTGTATTCGATGTTCCACTACATTACAACCTTTATAATGCGTCTAAAAGTGGTGGTAATTACGATATGCGTCAGATTTTAAATGGTACAGTAGTATCAAAACATCCAATACATGCTGTTACTTTTGTTGATAATCATGATTCTCAACCTGCAGAAGCATTGGAATCGTTTGTTGAAGCGTGGTTTAAACCATTAGCTTATGCGCTTATCTTAACACGCGAGCAAGGATATCCTTCGGTGTTTTATGGAGATTATTATGGAATTCCTACTCATGGAGTAGCTGCAATGAAAGGTAAGATTGACCCTATTTTAGAAGCACGTCAAAAATATGCATATGGAACACAGCATGATTATTTAGATCATCATAATATCATTGGTTGGACACGAGAAGGAAATTCAGCACACCCTAATTCCGGTCTTGCAACGATTATGTCCGATGGCCCTGGTGGTAGTAAATGGATGTATGTTGGTCGTCATAAAGCAGGCCAAGTGTGGCGTGATATTACTGGTAACAGAACAGGCACTGTTACGATAAATGCCGATGGTTGGGGTAATTTCTCCGTTAATGGTGGATCTGTATCGATTTGGGTAAATAAA

3.变体淀粉酶的生产

本发明的变体淀粉酶可以使用本领域熟知的方法，例如通过分泌或细胞内表达，在宿主细胞中产生。发酵、分离和浓缩技术是本领域熟知的，并且常规方法可用于制备浓缩的、含有变体α-淀粉酶多肽的溶液。

对于生产规模的回收，可以如上一般情况下所述通过用聚合物絮凝除去细胞来富集或部分纯化变体α-淀粉酶多肽。可替代地，可以通过微滤富集或纯化酶，随后使用可用的膜和设备通过超滤进行浓缩。然而，对于一些应用，酶不需要富集或纯化，并且可以裂解和使用全肉汤培养物而无需进一步处理。然后可以将酶加工成例如颗粒。

4.变体淀粉酶的组成和用途

变体淀粉酶可用于各种工业应用。例如，变体淀粉酶可用于淀粉转化过程，特别是在经历了液化的淀粉的糖化过程中。所需的终产物可以是通过淀粉底物的酶促转化可以产生的任何产物。例如，所需的产物可以是富含葡萄糖和麦芽糖的糖浆，所述糖浆可以用于其他工艺(例如HFCS的制备)，或可以被转化成许多其他有用的产物，例如抗坏血酸中间体(例如葡糖酸盐；2-酮-L-古洛糖酸；5-酮-葡糖酸盐；和2,5-二酮葡糖酸盐)；1,3-丙二醇；芳香族氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有机酸(例如乳酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、异柠檬酸盐、和草酰乙酸盐)；氨基酸(例如丝氨酸和甘氨酸)；抗生素；抗菌剂；酶；维生素；和激素。

淀粉转化过程可以是设计用于产生用于燃料或饮用的醇(即，可饮用的醇)的发酵过程的前体或与其同时进行。本领域普通技术人员知道可以用于生产这些终产物的各种发酵条件。变体淀粉酶也可用于食物制备的组合物和方法中。变体淀粉酶的这些各种用途在下文更详细地描述。

4.1.淀粉底物的制备

本领域普通技术人员充分了解可用于制备用于本文公开的工艺中的淀粉底物的可用方法。例如，可以从块茎、根、茎、豆类、谷物或全谷物获得有用的淀粉底物。更具体地，可以从玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、蜀黍、西米、粟、木薯、树薯(tapioca)、高粱、稻、碗豆、菜豆、香蕉、或马铃薯中获得颗粒状淀粉。玉米含有约60％-68％的淀粉；大麦含有约55％-65％的淀粉；粟含有约75％-80％的淀粉；小麦含有约60％-65％的淀粉；以及精米含有70％-72％的淀粉。具体考虑的淀粉底物是玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷粒的淀粉可以是磨碎的或完整的，并且包括玉米固体，例如籽粒、麸皮和/或穗轴。淀粉也可以是高度精制的生淀粉或来自淀粉精制过程的原料。各种淀粉也是可商购的。例如，玉米淀粉可从赛力事达公司(Cerestar)、西格玛公司(Sigma)和片山化学工业公司(Katayama ChemicalIndustry Co.)(日本)获得；小麦淀粉可从西格玛公司获得；甘薯淀粉可从和光纯药工业株式会社(Wako Pure Chemical Industry Co.)(日本)获得；以及马铃薯淀粉可从纳卡里化学制药公司(Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.)(日本)获得。

淀粉底物可以是来自研磨的全谷物的粗淀粉，其含有非淀粉级分，例如胚芽残余物和纤维。研磨可包括湿研磨或干研磨或碾磨。在湿研磨中，将全谷物浸泡在水或稀释的酸中以将谷粒分离成为其组成部分，例如淀粉、蛋白质、胚芽、油、籽粒纤维。湿研磨有效地分离胚芽与粉(即淀粉颗粒与蛋白质)并且尤其适合生产糖浆。大约90％的玉米油存在于胚芽中。在干研磨或碾磨中，不将谷粒分级成为其组成部分而将全籽粒碾磨为细粉并通常进行加工。在一些情况下，回收来自籽粒的油和/或纤维。因此除了淀粉之外，干碾磨的谷粒将包含大量的非淀粉碳水化合物。淀粉底物的干碾磨可用于生产乙醇和其他生物化学品。待加工的淀粉可以是高度精制的淀粉质量，例如，至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％的纯度。

4.2.淀粉的糊化和液化

如本文所用，术语“液化”或“使液化”是指淀粉转化为黏度更低和更短链糊精的过程。通常，所述过程涉及淀粉的糊化，同时添加或随后添加α-淀粉酶，尽管可以任选地添加另外的液化诱导酶。在一些实施例中，将如上文所述制备的淀粉底物用水制成浆料。淀粉浆料可以含有淀粉，其干固体的重量百分比为约10％-55％、约20％-45％、约30％-45％、约30％-40％或约30％-35％。例如，可以用计量泵将α-淀粉酶添加到浆料中。通常用于所述应用的α-淀粉酶是热稳定的细菌α-淀粉酶，例如嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶。α-淀粉酶通常以例如约1500单位/kg淀粉的干物质提供。为了优化α-淀粉酶的稳定性和活性，取决于所用淀粉酶的特性，通常将浆料的pH调节至约pH 4.5-6.5，并且还可以添加约1mM的钙(约40ppm的游离钙离子)。液化后剩余在浆料中的细菌α-淀粉酶可以经由许多方法进行灭活，包括在随后的反应步骤中降低pH或在酶依赖于钙的情况下从浆料中除去钙。

淀粉加α-淀粉酶的浆料可以通过喷射式蒸煮锅(将其蒸汽加热至105℃)连续泵送。在这些条件下，糊化快速发生，并且酶活性与显著的剪切力相结合而开始水解淀粉底物。在喷射式蒸煮锅中的停留时间是短暂的。部分糊化的淀粉可以进入一系列保持在105℃-110℃的保留管中并保持5-8min，以完成糊化过程(“初次液化”)。在85℃-95℃或更高温度下的保留槽中完成针对所需DE的水解持续约1至2小时(“二次液化”)。这些槽可含有挡板以阻止反混。如本文所用，术语“二次液化的分钟”是指从二次液化开始到测量右旋糖当量(DE)时消逝的时间。然后使浆料冷却至室温。此冷却步骤可以为30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。液化的淀粉通常为浆料的形式，其干固体含量(w/w)为约10％-50％；约10％-45％；约15％-40％；约20％-40％；约25％-40％；或约25％-35％。

使用变体淀粉酶的液化有利地可以在低pH下进行，消除了将pH调节至约pH 5.5-6.5的要求。变体淀粉酶可用于在2-7的pH范围内液化，例如pH 3.0-7.5、pH 4.0-6.0或pH4.5-5.8。变体淀粉酶可以在约85℃-95℃的温度范围内保持液化活性,例如85℃、90℃或95℃。例如，可以在pH5.8和85℃，或pH 4.5和95℃下，在25％DS玉米淀粉的溶液中用800μg淀粉酶进行液化10min。可以使用本领域中许多已知的黏度测定中的任何一个来测定液化活性。

在使用本发明的淀粉酶变体的具体实施例中，淀粉液化在90℃-115℃的温度范围内进行，目的是产生高纯度葡萄糖糖浆、HFCS、麦芽糖糊精等。

4.3.糖化

可以使用变体淀粉酶，任选地在另外一种或多种酶的存在下，将液化淀粉糖化成富含低DP(例如DP1+DP2)糖的糖浆。糖化的产物的确切组成取决于所使用的酶的组合以及所加工的颗粒状淀粉的类型。有利地，使用所提供的变体淀粉酶可获得的糖浆可以含有糖化淀粉中总寡糖的DP2的重量百分比超过30％，例如45％-65％或55％-65％。糖化淀粉中(DP1+DP2)的重量百分比可以超过约70％，例如75％-85％或80％-85％。本发明的淀粉酶还在糖浆产品中产生相对高产率的葡萄糖，例如DP1>20％。

液化通常作为连续工艺进行，而糖化通常作为分批工艺进行。糖化通常在约60℃-65℃的温度和约4.0-4.5的pH(例如pH 4.3)下最有效，有必要冷却液化淀粉和调节液化淀粉的pH。温度和pH范围可以取决于酶的特性而变化。糖化可以在例如约40℃、约50℃、或约55℃至约60℃或约65℃的温度下进行。糖化通常在搅拌槽中进行，这可能需要几个小时来填充或清空。酶通常以固定比率添加到干燥固体中(槽被填充时)，或者以单剂量添加(在填充阶段开始时)。制备糖浆的糖化反应通常进行约24-72小时，例如24-48小时。例如，当已经获得最大或所需的DE时，通过加热至85℃持续5min来停止反应。随着累积的葡萄糖经由酶促逆转反应和/或用热力学平衡的方法再聚合成异麦芽糖和/或其他逆转产物，进一步孵育将导致更低的DE，最终达到约90DE。当使用淀粉酶时，糖化最佳地在约30℃至约75℃的温度范围内进行，例如45℃-75℃或47℃-74℃。糖化可以在约pH 3至约pH 7的pH范围内进行，例如pH 3.0-pH 7.5、pH 3.5-pH 5.5、pH 3.5、pH 3.8或pH 4.5。

α-淀粉酶可以按组合物的形式添加到浆料中。α-淀粉酶可以按约0.6ppm ds-10ppm ds，例如2ppm ds的量添加到颗粒状淀粉底物的浆料中。α-淀粉酶可以作为全肉汤，澄清、富集、部分纯化、或纯化的酶添加。淀粉酶的比活性可以是约300U/mg的酶，例如，用PAHBAH测定测量。α-淀粉酶也可以作为全肉汤产品添加。

可以将α-淀粉酶作为分离的酶溶液添加到浆料中。例如，α-淀粉酶可以按由表达淀粉酶的宿主细胞产生的培养细胞材料的形式添加。在发酵或SSF过程期间，α-淀粉酶也可以由宿主细胞分泌到反应介质中，使得酶连续地提供到反应中。产生和分泌淀粉酶的宿主细胞也可以表达另外的酶，例如葡糖淀粉酶。例如，美国专利号5,422,267公开了在酵母中使用葡糖淀粉酶来生产酒精饮料。例如，可以将宿主细胞(例如里氏木霉(Trichodermareesei)或黑曲霉(Aspergillus niger))工程化为在糖化期间共表达α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，例如HgGA、TrGA、或TrGA变体。可以对宿主细胞进行遗传修饰，以便不表达其内源性葡糖淀粉酶和/或其他酶、蛋白质或其他材料。宿主细胞可以被工程化以表达广谱的各种糖解酶。例如，重组酵母宿主细胞可以包含编码以下的核酸：葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、利用戊糖的酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、和/或异支链淀粉酶。参加例如WO 2011/153516A2。

4.4.异构化

可以将通过用淀粉酶处理生产的可溶性淀粉水解产物转化为基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。可以使用葡萄糖异构酶(特别是固定在固体支持物上的葡萄糖异构酶)来实现所述转化。将pH增加至约6.0至约8.0，例如pH 7.5(取决于异构酶)，并通过离子交换除去Ca²⁺。适合的异构酶包括IT(诺维信公司(Novozymes A/S))；/>IMGI、和/>G993、/>G993、G993液体，和/>IGI。异构化后，混合物通常含有约40％-45％的果糖，例如42％的果糖。

4.5.发酵

可溶性淀粉水解产物，特别是富含葡萄糖的糖浆，可以通过通常在约32℃的温度下，例如从30℃至35℃(对于产生醇的酵母)，使淀粉水解产物与发酵生物接触来发酵。发酵的温度和pH将取决于发酵生物。EOF产品包括代谢产物，如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡萄糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、衣康酸和其他羧酸、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸和其他氨基酸、ω3脂肪酸、丁醇、异戊二烯、1,3-丙二醇和其他生物材料。

产乙醇微生物包括表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和细菌(例如运动发酵单胞菌(Zymomonas moblis))。产乙醇微生物可以表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，上述两种酶将木糖转化为木酮糖。例如，可以承受更高温度的改善的产乙醇微生物菌株是本领域已知的并且可以使用的。参见Liu等人，(2011)Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao[生物工程学报]27:1049-56。酵母菌的商业来源包括ETHANOL(乐斯福公司(LeSaffre))；FERMAX^TM(玛翠公司(Martrex))、(拉勒曼德公司(Lallemand))；RED/>(红星公司(RedStar))；/>(帝斯曼配料部(DSM Specialties))和/>(阿尔泰克公司(Alltech))。通过发酵产生其他代谢产物如柠檬酸和乳酸的微生物也是本领域已知的。参见例如Papagianni(2007)Biotechnol.Adv.[生物技术进展]25:244-63；John等人,2009,Biotechnol.Adv.[生物技术进展]27:145-52。

糖化和发酵过程可以作为SSF过程进行。例如，发酵可以包括乙醇的随后的富集、纯化和回收。在发酵期间，肉汤或“啤酒”的乙醇含量可以达到约8％-18％v/v，例如14％-15％v/v。可以蒸馏肉汤以产生富集的，例如96％纯的乙醇溶液。此外，可以用CO₂洗涤器收集通过发酵产生的CO₂、压缩并销售用于其他用途，例如碳酸饮料或干冰生产。来自发酵过程的固体废物可用作富含蛋白质的产品，例如牲畜饲料。

如前所述，可以用在整个SSF中连续表达和分泌淀粉酶的真菌细胞进行SSF过程。表达淀粉酶的真菌细胞也可以是发酵微生物，例如产乙醇微生物。因此，可以使用表达足够淀粉酶的真菌细胞进行乙醇生产，从而更少地需要或不需要外源地添加酶。真菌宿主细胞可以来自适当工程化的真菌菌株。除了淀粉酶之外，还可以使用表达和分泌其他酶的真菌宿主细胞。此类细胞可以表达葡糖淀粉酶和/或支链淀粉酶、植酸酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、β-淀粉酶纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、蛋白酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶、或其他酶。

所述过程的变化是“补料分批发酵”系统，其中随着发酵的进行以增量添加底物。当分解代谢物抑制可能抑制细胞的代谢时并且在培养基中希望具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。补料分批系统中的实际底物浓度通过可测量因子的变化来估算，所述因子为例如pH、溶解的氧和废气(例如CO₂)的分压。分批和补料分批发酵是常用的并且在本领域中是熟知的。

连续发酵是开放的系统，在所述系统中，将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵允许调节细胞生长和/或产物浓度。例如，将限制营养素(例如碳源或氮源)维持在固定的速率，并且允许调节所有其他参数。因为生长保持在稳态，所以由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。优化连续发酵过程和最大化产物形成的速率的方法在工业微生物学领域中是熟知的。

4.6.包含变体淀粉酶的组合物

变体淀粉酶可以与葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)组合，例如木霉属(Trichoderma)葡糖淀粉酶或其变体。示例性葡糖淀粉酶是里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)及其变体，其具有优异的比活性和热稳定性。参见美国公开申请号2006/0094080、2007/0004018、和2007/0015266(美国丹尼斯科公司(Danisco US Inc.))。TrGA的适合变体包括具有葡糖淀粉酶活性并且与野生型TrGA具有至少80％、至少90％、或至少95％序列同一性的变体。变体淀粉酶有利地增加由TrGA催化的糖化过程中产生的葡萄糖的产率。

可替代地，葡糖淀粉酶可以是衍生自植物(包括藻类)、真菌、或细菌的另一种葡糖淀粉酶。例如，葡糖淀粉酶可以是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶或其变体(例如Boel等人，(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:1097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136(诺和诺德公司(Novo Nordisk A/S))；和泡盛曲霉葡糖淀粉酶(例如WO 84/02921(Cetus公司))。其他考虑的曲霉属葡糖淀粉酶包括具有增强的热稳定性的变体，例如，G137A和G139A(Chen等人，(1996)Prot.Eng.[蛋白质工程]9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人，(1995)Prot.Eng.[蛋白质工程]8:575-582)；N182(Chen等人，(1994)Biochem.J.[生物化学杂志]301:275-281)；A246C(Fierobe等人，(1996)Biochemistry[生物化学]35:8698-8704)；以及具有位置A435和S436中的Pro残基的变体(Li等人，(1997)Protein Eng.[蛋白质工程]10:1199-1204)。其他考虑的葡糖淀粉酶包括踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是衍生自埃默森踝节菌(T.emersonii)(例如WO 99/28448(诺和诺德公司))、嗜热篮状菌(T.leycettanus)(例如美国专利号RE 32,153(CPC国际公司))、T.duponti或嗜热踝节菌(T.thermophilus)(例如美国专利号4,587,215)。考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶，特别是热淀粉酶梭状芽孢杆菌(C.thermoamylolyticum)(例如EP 135,138(CPC国际公司))和热氢硫酸梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(例如WO 86/01831(密歇根大学生物技术研究所(Michigan Biotechnology Institute))。适合的葡糖淀粉酶包括衍生自米曲霉(Aspergillus oryzae)的葡糖淀粉酶，例如WO 00/04136(诺和诺德公司)中的葡糖淀粉酶。同样适合的是葡糖淀粉酶，例如AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER和AMG^TM E(诺维信公司)；300和OPTIDEX L-400(美国丹尼斯科公司)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(DSM)；/>G900(酶生物系统公司(Enzyme Bio-Systems))；和G/>G990ZR(具有低蛋白酶含量的黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶)。仍其他适合的葡糖淀粉酶包括烟曲霉(Aspergillus fumigatus)葡糖淀粉酶、踝节菌属葡糖淀粉酶、梭孢壳属(Thielavia)葡糖淀粉酶、栓菌属(Trametes)葡糖淀粉酶、噬热真菌属(Thermomyces)葡糖淀粉酶、阿太菌属(Athelia)葡糖淀粉酶、腐质酶属(Humicola)葡糖淀粉酶(例如HgGA)、青霉菌属(Penicillium)葡糖淀粉酶、弓形虫属(Artomyces)葡糖淀粉酶、褶菌属(Gloeophyllum)葡糖淀粉酶、密孔菌属(Pycnoporus)葡糖淀粉酶、或齿耳菌属(Steccherinum)葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶通常以约0.1-2葡糖淀粉酶单元(GAU)/g ds的量添加，例如约0.16GAU/g ds、0.23GAU/g ds、或0.33GAU/g ds。

可以与淀粉酶一起使用的其他适合的酶包括植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、不同的α-淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、β-葡糖苷酶、转移酶、果胶酶、脂肪酶、角质酶、酯酶、氧化还原酶、或其组合。例如，脱支酶，如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)，可以按本领域普通技术人员熟知的有效量添加。支链淀粉酶(EC3.2.1.41)，例如也是适合的。支链淀粉酶通常以100U/kg ds添加。其他适合的酶包括蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括从曲霉属，例如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉；毛霉属(Mucor)(例如米黑毛霉(M.miehei))；根霉属(Rhizopus)；和木霉属获得的那些。

β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外切作用的生麦芽糖淀粉酶，其催化支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中1,4-α-糖苷键的水解，从而释放麦芽糖。已经从各种植物和微生物中分离出β-淀粉酶。参见Fogarty等人，(1979)，Progress in Industrial Microbiology[工业微生物学进展],卷15,第112-115页。这些β-淀粉酶的最佳温度范围为40℃至65℃，并且最佳pH范围为约4.5至约7.0。考虑的β-淀粉酶包括但不限于来自大麦的β-淀粉酶BBA 1500、/>DBA、OPTIMALT^TM ME、OPTIMALT^TM BBA(美国丹尼斯科公司)；和NOVOZYM^TM WBA(诺维信公司)。

包含本发明淀粉酶的组合物可以是水性或非水性配制品、颗粒、粉末、凝胶、浆料、糊剂等，其可进一步包含本文列出的另外的酶中的任何一种或多种，以及缓冲液、盐、防腐剂、水、共溶剂、表面活性剂等。此类组合物可与内源酶或已存在于浆料、水浴、洗衣机、食品或饮料产品等中的其他成分(例如，内源植物(包括藻类)酶，来自先前加工步骤的残留酶等)组合起作用。

5.用于烘焙和食物制备的组合物和方法

本发明还涉及“食物组合物”，包括但不限于食品、动物饲料和/或食物/饲料添加剂(包含淀粉酶)，和用于制备这种食物组合物的方法(所述方法包括将变体淀粉酶与一种或多种食物成分混合)，或其用途。

此外，本发明涉及淀粉酶在制备食物组合物中的用途，其中在添加本发明的多肽后烘焙食物组合物。如本文所用，术语“烘焙组合物”意指在提供烘焙食品的过程中制备的任何组合物和/或添加剂，包括但不限于焙烤食品用面粉、生面团、烘焙添加剂和/或烘焙产品。食物组合物或添加剂可以是液体或固体。

6.纺织品脱浆组合物和用途

还考虑了使用淀粉酶处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域中熟知的(参见例如，美国专利号6,077,316)。例如，可以通过包括使织物与溶液中的淀粉酶接触的方法来改善织物的手感和外观。织物可以在压力下用溶液进行处理。

可以在纺织品的编织期间或之后或在脱浆阶段期间或一个或多个另外的织物加工步骤中应用淀粉酶。在纺织品的编织期间，线暴露于相当大的机械应变。在机械织机上编织之前，通常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆经纱以增加其抗张强度并防止断开。可在编织之中或之后施用淀粉酶以除去这些上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，可以在进一步处理织物之前使用淀粉酶来除去浆涂层以确保均一和耐洗的结果。

淀粉酶可以单独使用或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用，以作为洗涤剂添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉的织物)脱浆。淀粉酶还可以用于在靛蓝染色的牛仔织物和服装上产生石磨的外观的组合物和方法中使用。对于服装生产而言，织物可被裁剪和缝制成服装或衣服，其随后被精整(finish)。特别地，对于牛仔布的生产，开发了不同的酶促精整方法。牛仔衣服的精整通常是以酶促脱浆步骤开始的，其中使衣服经受淀粉分解酶的作用以为织物提供柔软性，使棉更易于进行随后的酶促精整步骤。淀粉酶可以用于下列方法中：精整加工牛仔服装(例如“生物磨砂工艺”)、酶促脱浆并为织物提供柔软性和/或精整加工方法。

7.清洁组合物

本发明的组合物和方法的一个方面是包含淀粉酶作为组分的清洁组合物。淀粉酶多肽可以用作洗涤剂组合物中的组分，用于例如手洗、衣物洗涤、餐具洗涤、和其他硬表面清洁。此类组合物包括重垢液体(HDL)、重垢干(HDD)和手洗(手动)衣物洗涤剂组合物，包括单位剂量形式的衣物洗涤剂组合物，和自动餐具洗涤(ADW)和手洗(手动)餐具洗涤组合物，包括单位剂量形式的餐具洗涤组合物。

7.1.概述

优选地，淀粉酶以常规用于洗涤剂中的淀粉酶的浓度或接近所述浓度掺入洗涤剂中。例如，淀粉酶多肽可以按对应于每升洗涤/餐具洗涤液0.00001mg-1mg(以纯酶蛋白计算)的淀粉酶的量添加。本文提供了示例性配制品，如下所示：

淀粉酶多肽可以是洗涤剂组合物的组分，作为唯一的酶或与包括其他淀粉分解酶的其他酶一起。由此，它可以按无尘颗粒、稳定化液体、或受保护的酶的形式包含在洗涤剂组合物中。可以生产无尘颗粒，例如，如美国专利号4,106,991和4,661,452中所公开的，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡质涂层材料的实例是聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)，其平均摩尔重量为1,000至20,000；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。适合通过流化床技术应用的成膜涂层材料的实例在例如GB 1483591中给出。例如，液体酶制剂可以通过根据已建立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。其他酶稳定剂是本领域已知的。受保护的酶可以根据例如EP 238 216中公开的方法制备。多元醇长期以来已经被认为是蛋白质的稳定剂，并且还提高了蛋白质溶解度。

洗涤剂组合物可以是任何有用的形式，例如粉末、颗粒、糊剂、条状、或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂。它也可以是仅含有约30％水的紧密凝胶类型的形式。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，每种表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、或兼性离子的。洗涤剂通常含有0％至约50％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲链烷磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基-或烯基琥珀酸；或皂。所述组合物还可以含有0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如描述于WO 92/06154中的)。

所述洗涤剂组合物可以另外包含一种或多种其他酶，例如任何组合的蛋白酶、另一种淀粉分解酶、角质酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酸裂合酶、过水解酶、木聚糖酶、过氧化物酶、和/或漆酶。

所述洗涤剂可以含有约1％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(如，来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)。所述洗涤剂也可以是不加助洗剂的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。所述酶可以用于与酶的稳定性相容的任何组合物中。通常可以通过已知形式的包封(例如通过在水凝胶中造粒或螯合)来保护酶免受有害组分的影响。具有或不具有淀粉结合结构域的酶，并且具体地是淀粉酶，可以用于各种组合物中，包括衣物和餐具洗涤应用、表面清洁剂、连同用于从淀粉或生物质生产乙醇的组合物。

洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。实例包括羧基甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物、和月桂酰甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以含有漂白系统，所述系统可包含H₂O₂源例如过硼酸或过碳酸，其可以与形成过酸的漂白活化剂(例如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸酯(NOBS))组合。可替代地，漂白系统可以包含过氧酸(例如，酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸等)。所述漂白系统也可以是酶促漂白系统，例如过水解酶，如描述于国际PCT申请WO2005/056783中的那些。

洗涤剂组合物的酶可以使用以下的常规稳定剂稳定：例如多元醇(例如丙二醇或甘油)；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物(像例如，芳香族硼酸酯)；并且可以如例如WO92/19709和WO 92/19708中所述配制组合物。

所述洗涤剂还可以含有其他常规的洗涤剂成分，例如像织物调理剂(包括黏土)、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、变色抑制剂、光增白剂、或香料。

所述pH(在使用浓度的水溶液中测量)通常为中性或碱性(例如，pH为约7.0至约11.0)。

用于包含本发明的α-淀粉酶的具体形式的洗涤剂组合物描述如下。这些组合物中的许多可以按单位剂量形式提供以便于使用。单位剂量配制品和包装描述于例如US20090209445 A1、US 20100081598 A1、US 7001878 B2、EP 1504994 B1、WO 2001085888A2、WO 2003089562 A1、WO 2009098659 A1、WO 2009098660 A1、WO 2009112992 A1、WO2009124160 A1、WO 2009152031 A1、WO 2010059483 A1、WO 2010088112 A1、WO2010090915 A1、WO 2010135238 A1、WO 2011094687 A1、WO 2011094690 A1、WO2011127102 A1、WO 2011163428 A1、WO 2008000567 A1、WO 2006045391 A1、WO2006007911 A1、WO 2012027404 A1、EP 1740690 B1、WO 2012059336A1、US 6730646 B1、WO2008087426 A1、WO 2010116139A1、和WO 2012104613 A1中。

7.2.重垢液体(HDL)衣物洗涤剂组合物

示例性HDL衣物洗涤剂组合物包含去污表面活性剂(10％至40％wt/wt)，包括阴离子清洁表面活性剂(选自以下组：直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)和任选地非离子表面活性剂(选自以下组：直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化醇和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)，其中阴离子清洁表面活性剂(具有从6.0至9的亲水指数(HIc))与非离子清洁表面活性剂的重量比大于1:1。适合的去污表面活性剂还包括阳离子去污表面活性剂(选自以下的组：烃基吡啶鎓化合物、烃基季铵化合物、烃基季鏻化合物、烃基叔锍化合物、和/或其混合物)；兼性离子和/或两性去污表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱的组)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂及其混合物。

所述组合物可以任选地包含表面活性增强聚合物，该表面活性增强聚合物由以下组成：两亲烷氧基化油脂清洁聚合物(选自以下组：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物，例如在0.05wt％-10wt％范围内的烷氧基化聚亚烷基亚胺)和/或无规接枝聚合物(通常由亲水主链和一个或多个疏水侧链构成，该亲水主链包含选自由以下组成的组的单体：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(例如甘油)及其混合物；该一个或多个疏水侧链选自由以下组成的组：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的C1-C6单羧酸的乙烯酯，丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯及其混合物)。

所述组合物可以包含另外的聚合物，例如污垢释放聚合物(包括阴离子封端的聚酯(例如SRP1)；包含至少一种单体单元的聚合物(处于无规或嵌段构型)，所述单体单元选自糖、二羧酸、多元醇及其组合；基于乙二醇对苯二甲酸酯的聚合物及其处于无规或嵌段构型的共聚物，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6、Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325、Marloquest SL)；抗再沉积聚合物(0.1wt％至10wt％，包括羧酸酯聚合物，例如包含至少一种单体的聚合物，所述单体选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或聚乙二醇，分子量范围为从500至100,000Da)；纤维素聚合物(包括选自以下的那些：烷基纤维素；烷基烷氧基烷基纤维素；羧基烷基纤维素；烷基羧基烷基纤维素，其实例包括羧基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧基甲基纤维素；及其混合物)；以及聚合羧酸酯(如，马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。

所述组合物可以进一步包含饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0wt％至10wt％)；沉积助剂(其实例包括多糖；优选纤维素聚合物；聚联丙烯二甲基卤化铵(DADMAC))；和DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉卤化物及其混合物的共聚物(处于无规或嵌段构型)；阳离子瓜耳胶；阳离子纤维素，例如阳离子羟乙基纤维素；阳离子淀粉；阳离子聚丙烯酰胺，及其混合物。

所述组合物可以进一步包含染料转移抑制剂，其实例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)、次氮基三乙酸(NTA)、4,5-二羟基间苯二磺酸、柠檬酸及其任何盐、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)、及其衍生物。

所述组合物优选地包含选自以下的酶(通常约0.01wt％活性酶至0.03wt％活性酶)：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其任何混合物。组合物可以包含酶稳定剂(其实例包括多元醇，例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；可逆蛋白酶抑制剂；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯；或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸)。

所述组合物任选地包含硅树脂或基于脂肪酸的泡沫抑制剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、抗泡沫剂(0.001wt％至约4.0wt％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％至5wt％，选自由以下组成的组：甘油二酸酯和甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、及其混合物)。

组合物可以是任何液体形式，例如液体或凝胶形式，或其任何组合。所述组合物可以处于任何单位剂量形式，例如小袋。

7.3.重垢干/固体(HDD)衣物洗涤剂组合物

示例性HDD衣物洗涤剂组合物包含去污表面活性剂，其包括阴离子去污表面活性剂(例如，直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)；非离子去污表面活性剂(例如，直链或支链或无规链、取代或未取代的C8-C18烷基乙氧基化物和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)；阳离子去污表面活性剂(例如，烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物，烷基三元锍化合物及其混合物)；兼性离子和/或两性去污表面活性剂(例如，链烷醇胺磺基甜菜碱)、两性表面活性剂、半极性非离子表面活性剂；及其混合物；助洗剂，包括无磷酸盐助洗剂(例如沸石助洗剂，其实例包括在0wt％至小于10wt％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)，磷酸盐助洗剂(例如在0wt％至小于10wt％范围内的三聚磷酸钠)，柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸，硅酸盐(例如，在0wt％至小于10wt％的范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠，或层状硅酸盐(SKS-6)))；碳酸盐(例如，在0wt％至小于80wt％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂，包括光漂白剂(例如磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物)；疏水或亲水性漂白活化剂(例如十二烷酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、壬酰基氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵盐(nitrile quats)及其混合物)；过氧化氢源(例如，无机过氧水合物盐，其实例包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单或四水合钠盐)；预成型的亲水和/或疏水过酸(例如过羧酸和盐、过碳酸和盐、过碘酸和盐，过氧单硫酸和盐、及其混合物)；和/或漂白催化剂(例如亚胺漂白增效剂(其实例包括亚胺阳离子和聚离子))；亚胺兼性离子、改性胺、改性氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮及其混合物)；以及含金属的漂白催化剂(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子(例如锌或铝)和螯合剂(例如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)、及其水溶性盐))。

组合物优选地包含酶，例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其任何混合物。

所述组合物可以任选地包含另外的洗涤剂成分，包括香料微囊剂、淀粉包封的香料协调剂、调色剂、另外的聚合物(包括织物完整性和阳离子聚合物)、染料锁定成分、织物柔顺剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化聚胺、织物沉积助剂和/或环糊精。

7.4.自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物

如上所述，本发明的α-淀粉酶变体在ADW应用中特别有效。示例性ADW洗涤剂组合物包含非离子表面活性剂，包括乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇或胺氧化物表面活性剂，它们以0％至10％(按重量计)的量存在；在5％-60％范围内的助洗剂，所述助洗剂包括：磷酸盐助洗剂(例如单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐、其他低聚磷酸盐、三聚磷酸钠-STPP)，和无磷酸盐助洗剂(例如基于氨基酸的化合物，包括甲基-甘氨酸-二乙酸(MGDA)及其盐和衍生物、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其盐和衍生物、亚氨基二琥珀酸(IDS)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)及其盐)，多元羧酸及其部分或完全中和盐的均聚物和共聚物，单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐，它们在0.5％至50％(按重量计)的范围内；在约0.1％至约50％(按重量计)的范围内的磺化/羧化聚合物以提供尺寸稳定性；在约0.1％至约10％(按重量计)范围内的干燥助剂(例如，聚酯，尤其是阴离子聚酯(任选地与具有利于缩聚的3至6个官能团-通常是酸、醇或酯官能团的另外的单体一起)，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其前体化合物，特别是反应性环状碳酸酯和尿素类型)；在约1％至约20％(按重量计)的范围内的硅酸盐(包括硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)；无机漂白剂(例如，过氧水合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸、和二过氧十六烷二酸)；漂白活化剂(即有机过酸前体，其在约0.1％至约10％(按重量计)的范围内)；漂白催化剂(例如锰三氮杂环壬烷及相关络合物、Co、Cu、Mn和Fe双吡啶胺及相关络合物、以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物)；在约0.1％至5％(按重量计)的范围内的金属护理剂(例如苯并三氮唑、金属盐和络合物、和/或硅酸盐)；每克自动餐具洗涤剂组合物的从约0.01mg至5.0mg活性酶范围内的酶(例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其混合物)；以及酶稳定剂组分(例如寡糖、多糖、和无机二价金属盐)。

7.5.另外的洗涤剂组合物

可以添加本发明的淀粉酶的另外的示例性洗涤剂配制品描述于下文的编号段落中。

1)配制成体积密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，所述组合物包含：约7％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇、1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠；约2％至约6％的可溶性硅酸盐；约15％至约22％的沸石；0％至约6％的硫酸钠；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸约11％至约18％的过硼酸钠；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001％-0.1％蛋白质的酶(以纯酶计算)；以及0％-5％的次要成分(例如泡沫抑制剂、香料、光增白剂、光漂白剂)。

2)配制成体积密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，所述组合物包含：约6％至约11％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇、1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠；约1％至约4％的可溶性硅酸盐；约24％至约34％的沸石；约4％至约10％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1％-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；0％-5％的次要成分(例如泡沫抑制剂、香料)。

3)配制成体积密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，所述组合物包含：约5％至约9％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO)；约1％至约3％的为脂肪酸(例如C16-22脂肪酸)的皂；约10％至约17％的碳酸钠；约3％至约9％的可溶性硅酸盐；约23％至约33％的沸石；0％至约4％的硫酸钠；约8％至约16％的过硼酸钠；约2％至约8％的TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；0％-5％的次要成分(例如泡沫抑制剂、香料、光增白剂)。

4)配制成体积密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，所述组合物包含：约8％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠；约1％至约5％的可溶性硅酸盐；约25％至约35％的沸石；0％至约10％的硫酸钠；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1％-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0％-5％的次要成分(例如泡沫抑制剂、香料)。

5)水性液体洗涤剂组合物，所述组合物包含：约15％至约21％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约13％的为脂肪酸(例如油酸)的皂；0％至约13％的烯基琥珀酸(C12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如PVP、PEG)；0％至约2％的硼酸盐0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0％-5％的次要成分(例如分散剂、泡沫抑制剂、香料、光增白剂)。

6)水性结构化液体洗涤剂组合物，所述组合物包含：约15％至约21％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计算)；3％-9％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇、7EO；或C12-15醇、5EO)；约3％至约10％的为脂肪酸(例如油酸)的皂；约14％至约22％的沸石；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG、PVP)；锚定聚合物，例如像甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25:1，MW 3800)0％至约3％；甘油0％至约5％；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0％-5％的次要成分(例如分散剂、泡沫抑制剂、香料、光增白剂)。

7)配制成体积密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，所述组合物包含：约5％至约10％的脂肪醇硫酸酯；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的为脂肪酸的皂；约5％至约10％的碳酸钠；约1％至约4％的可溶性硅酸盐；约20％至约40％的沸石；约2％至约8％的硫酸钠；约12％至约18％的过硼酸钠；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0％-5％的次要成分(例如光增白剂、泡沫抑制剂、香料)。

8)配制成颗粒的洗涤剂组合物，所述组合物包含：约8％至约14％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的为脂肪酸的皂；约4％至约10％的碳酸钠；约1％至约4％的可溶性硅酸盐；约30％至约50％的沸石；约3％至约11％的硫酸钠；约5％至约12％的柠檬酸钠；约1％至约5％的聚合物(例如PVP、马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0％-5％的次要成分(例如泡沫抑制剂、香料)。

9)配制成颗粒的洗涤剂组合物，所述组合物包含：约6％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的为脂肪酸的皂；约14％至约22％的碳酸钠；约18％至约32％的沸石；约5％至约20％的硫酸钠；约3％至约8％的柠檬酸钠；约4％至约9％的过硼酸钠；约1％至约5％的漂白活化剂(例如NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯或PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0％-5％的次要成分(例如光增白剂、香料)。

10)水性液体洗涤剂组合物，所述组合物包含：约15％至约23％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如，C12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约0％至约3％的为脂肪酸(例如月桂酸)的皂；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的助水溶物(例如甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0％-5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、光增白剂)。

11)水性液体洗涤剂组合物，所述组合物包含：约20％至约32％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计算)；6％-12％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇、7EO；或C12-15醇、5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物、锚定聚合物例如像月桂酰甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0％-5％的次要成分(例如助水溶物、分散剂、香料、光增白剂)。

12)配制成体积密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，所述组合物包含约25％至约40％的阴离子表面活性剂(直链烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、链烷磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠；约5％至约15％的可溶性硅酸盐；0％至约5％的硫酸钠；约15％至约28％的沸石；0％至约20％的过碳酸钠；约0％至约5％的漂白活化剂(TAED或NOBS)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；0-3％的次要成分(例如香料、光增白剂)。

13)如上述组合物1)-12)所述的洗涤剂组合物，其中全部或部分直链烷基苯磺酸盐被(C12-C18)烷基硫酸盐代替。

14)配制成体积密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，所述组合物包含：约9％至约15％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石；约10％至约20％的层状二硅酸盐(例如，来自赫斯特公司的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠；0％至约6％的可溶性硅酸盐；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0％-5％的次要成分(例如，光增白剂、光漂白剂、香料、泡沫抑制剂)。

15)配制成体积密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，所述组合物包含：约4％至约8％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠；0％至约4％的可溶性硅酸盐；约13％至约22％的过碳酸钠；1％-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0％-3％的次要成分(例如光增白剂、磷酸盐、香料)。

16)如上述1)-15)所述的洗涤剂配制品，所述洗涤剂配制品含有稳定的或包封的过酸，所述过酸作为另外的组分或作为已经指定的漂白系统的替代物。

17)如上述在1)、3)、7)、9)和12)中所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。

18)如上述1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的洗涤剂组合物，所述组合物另外含有锰催化剂。例如，锰催化剂是Hage等人((1994),Nature[自然]369:637-639)描述的化合物之一。

19)配制成非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，所述组合物包含液体非离子表面活性剂(例如，直链烷氧基化伯醇)、助洗剂系统(例如磷酸盐)、一种或多种酶、和碱。洗涤剂还可以包含阴离子表面活性剂和/或漂白系统。

如上所述，本发明的淀粉酶多肽可以按常规用于洗涤剂中的浓度掺入。目前考虑的是，在洗涤剂组合物中，酶可以按对应于每升洗涤液0.00001mg-1.0mg(以纯酶蛋白计算)的淀粉酶多肽的量添加。

洗涤剂组合物还可以含有其他常规洗涤剂成分，例如抗絮凝剂材料、填充材料、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、多价螯合剂(sequestering agent)、抗污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀细菌剂、荧光剂、增稠剂、和香料。

洗涤剂组合物可以配制成手洗(手动)或机器(自动)衣物洗涤剂组合物(包括适合经染色织物的预处理的衣物添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物)，或配制成用于一般家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手动或自动餐具洗涤操作。

本文描述的清洁组合物中的任何一个均可以包含任何数量的另外的酶。通常，所述一种或多种酶应与所选择的洗涤剂相容(例如，在pH最佳、与其他酶和非酶成分的相容性等方面)，并且所述一种或多种酶应以有效量存在。提供以下酶作为实例。

蛋白酶：适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体，连同天然加工的蛋白质。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶、碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 89/06279)。示例性蛋白酶包括但不限于WO 95/23221、WO 92/21760、WO2008010925、WO 20100566356、WO 2011072099、WO 201113022、WO 2011140364、WO2012151534、WO 2015038792、WO 2015089441、WO 2015089447、WO 2015143360、WO2016001449、WO 2016001450、WO 2016061438、WO 2016069544、WO 2016069548、WO2016069552、WO 2016069557、WO 2016069563、WO 2016069569、WO 2016087617、WO2016087619、WO 2016145428、WO 2016174234、WO 2016183509、WO 2016202835、WO2016205755、US 20080090747、US 5,801,039、US 5,340,735、US 5,500,364、US 5,855,625、RE 34,606、US 5,955,340、US 5,700,676、US 6,312,936、US 6,482,628、US 8530219，美国临时申请号62/331282、62/343618、62/351649、62/437171、62/437174、和62/437509，和PCT申请号PCT/CN 2017/076749中描述的那些；以及WO 2007/044993、WO 2009/058303、WO 2009/058661、WO 2014/071410、WO 2014/194032、WO 2014/194034、WO 2014/194054和WO 2014/194117中描述的金属蛋白酶。

示例性商业蛋白酶包括但不限于MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、 OXP、PURAMAX^TM、EXCELLASE^TM、PREFERENZ^TM蛋白酶(例如P100、P110、P280)、EFFECTENZ^TM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZ^TM蛋白酶(例如P1000)、/>和PURAFAST^TM(美国丹尼斯克公司(Danisco US))；/>ULTRA、/> 16L、ULTRA、PRIMASE、DURAZYM、 PROGRESS/> 和/>(诺维信公司(Novozymes))；BLAP^TM和BLAP^TM变体(汉高公司(Henkel))；LAVERGY^TM PRO 104L(BASF)、和/>(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌(B.alkalophilussubtilisin)蛋白酶(花王公司(Kao)))。适合的蛋白酶包括特别选择或工程化以在相对低温下起作用的天然存在的蛋白酶或者工程化变体。

脂肪酶：适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的、蛋白水解修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质酶属(Humicola)(同义词噬热真菌属)的脂肪酶，例如来自绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见例如EP 258068和EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如WO 96/13580)；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)；参见例如EP 218 272)；洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331 376)；施氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如GB1,372,034)；萤光假单胞菌(P.fluorescens)；假单胞菌属物种菌株SD 705(参见例如WO95/06720和WO 96/27002)；威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(参见例如WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶(例如，来自枯草芽孢杆菌；参见例如，Dartois等人，Biochemicaet Biophysica Acta[生物化学与生物物理学报],1131:253-360(1993))；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(参见例如JP 64/744992)；或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如WO 91/16422)。考虑用于配制品中的另外的脂肪酶变体包括例如WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些。

示例性商业脂肪酶包括但不限于M1 LIPASE、LUMA FAST和LIPOMAX(杰能科公司(Genencor))； 和/>ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE P(天野药业有限公司(Amano Pharmaceutical Co.Ltd))。

聚酯酶：适合的聚酯酶可以包括在组合物中，例如描述于例如WO 01/34899、WO01/14629、和US 6933140中的那些。

淀粉酶：本发明的组合物可以与其他淀粉酶组合，包括其他α-淀粉酶。当不同的α-淀粉酶表现出不同的性能特征并且多种不同的α-淀粉酶的组合导致提供不同α-淀粉酶的益处的组合物时，这种组合是特别令人希望的。其他淀粉酶包括可商购的淀粉酶，例如但不限于 和BAN^TM(诺和诺德公司和诺维信公司)；/> 和PREFERENZ^TM(来自杜邦工业生物科学公司(DuPont IndustrialBiosciences.))。示例性α-淀粉酶描述于WO 9418314A1、US20080293607、WO 2013063460、WO 10115028、WO 2009061380A2、WO 2014099523、WO 2015077126A1、WO 2013184577、WO2014164777、W0 9510603、WO 9526397、WO 9623874、WO 9623873、WO 9741213、WO 9919467、WO 0060060、WO 0029560、WO 9923211、WO 9946399、WO 0060058、WO 0060059、WO 9942567、WO 0114532、WO 02092797、WO 0166712、WO 0188107、WO 0196537、WO 0210355、WO2006002643、WO 2004055178、和WO 9813481中。

纤维素酶：可以将纤维素酶添加到组合物中。适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属(Fusarium)、梭孢壳属、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如，在例如美国专利号4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757；和WO89/09259中公开的从特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。考虑使用的示例性纤维素酶是对纺织品具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的实例是描述于例如EP0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、和WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，例如WO 94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK 98/00299；EP531315；美国专利号5,457,046；5,686,593；和5,763,254中描述的那些。示例性纤维素酶包括WO 2005054475、WO 2005056787、US 7,449,318、US 7,833,773、US 4,435,307、EP0495257、和美国临时申请号62/296,678和62/435340中描述的那些。示例性商业纤维素酶包括但不限于 和/>PREMIUM(诺维信公司)；/>100、/>200/220和2000(美国丹尼斯克公司)；以及KAC-500(B)(花王公司(KaoCorporation))。

甘露聚糖酶：示例性甘露聚糖酶包括但不限于：细菌或真菌来源的那些，例如像WO2016007929；USPN 6566114、6602842、和6440991，以及国际申请号PCT/US 2016/060850和PCT/US 2016/060844中所述的。示例性甘露聚糖酶包括但不限于：细菌或真菌来源的那些，例如像WO 2016007929；USPN 6566114、6602842、和6440991，以及国际申请号PCT/US 2016/060850和PCT/US 2016/060844中所述的。

过氧化物酶/氧化酶：考虑用于组合物中的适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)(例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶、及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中所述的那些。可商购的过氧化物酶包括例如GUARDZYME^TM(诺和诺德公司和诺维信公司)。

洗涤剂组合物还可以包含2,6-β-D-果聚糖水解酶，其对于除去/清洁存在于家用和/或工业纺织品/衣物上的生物膜是有效的。

通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂，可以将一种或多种洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆料等。示例性洗涤剂添加剂配制品包括但不限于颗粒(特别是无尘颗粒)、液体(特别是稳定的液体)或浆料。

可以生产无尘颗粒，例如，如美国专利号4,106,991和4,661,452中所公开的，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡质涂层材料的实例是聚(环氧乙烷)产品(例如聚乙二醇，PEG)，其平均摩尔重量为1,000至20,000；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。适合通过流化床技术应用的成膜涂层材料的实例在例如GB 1483591中给出。例如，液体酶制剂可以通过根据已建立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。受保护的酶可以根据EP 238,216中公开的方法制备。

洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如条状、片剂、粉末、颗粒、糊剂、或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂。还考虑了含有约30％或更少水的紧密洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物可以任选地包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子的，包括半极性，和/或阴离子的，和/或阳离子的，和/或兼性离子的。表面活性剂可以按从约0.1％至约60％(按重量计)的宽范围存在。

当包含在其中时，洗涤剂通常含有从约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸、或皂。

当包含在其中时，洗涤剂通常含有从约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基氧化胺、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

洗涤剂可以含有0％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司的SKS-6)。

洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。示例性聚合物包括羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(例如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂组合物的一种或多种酶可以使用常规稳定剂，例如作为多元醇(例如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如芳香族硼酸酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)来稳定。可以如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制组合物。

考虑的是在洗涤剂组合物中，特别是酶变体，可以按对应于每升洗涤液约0.01mg至约100mg酶蛋白(例如，每升洗涤液约0.05mg至约5.0mg酶蛋白或每升洗液约0.1mg至约1.0mg酶蛋白)的量添加。

WO 2013063460中描述了许多示例性洗涤剂配制品，其中可以向这些配制品中添加本发明的淀粉酶(或在一些情况下所述淀粉酶被鉴定为这些配制品的组分)。这些包括可商购的单位剂量洗涤剂配制品/包装，例如UltraPacks(汉高公司)、Quantum(利洁时公司(Reckitt Benckiser))、CLOROX^TM 2Packs(高乐士公司(Clorox))、OxiClean Max Force Power Paks(杜威公司(Church&Dwight))、/>Stain Release、/>ActionPacs、和/>Pods(宝洁公司(Procter&Gamble))、PS。

7.6.评估洗涤剂组合物中淀粉酶活性的方法

本领域已知许多α-淀粉酶清洁测定，包括样本和微样本测定。所附实例仅描述了少数此类测定。

为了进一步说明组合物和方法及其优点，给出以下具体实例，应理解它们是说明性的而不是限制性的。

8.酿造组合物

本发明的变体淀粉酶可以是在酿造过程(即制备发酵的麦芽饮料)中使用的酿造组合物的组分。非可发酵碳水化合物形成最终啤酒中的大部分溶解固体。这种残余物的存留是因为麦芽淀粉酶不能够水解淀粉的α-1,6-键。非可发酵碳水化合物贡献约50卡路里/12盎司啤酒。淀粉酶，其与葡糖淀粉酶和任选的支链淀粉酶和/或异淀粉酶组合，有助于将淀粉转化为糊精和可发酵糖，降低最终啤酒中残留的非可发酵碳水化合物。

9.碘阳性淀粉的减少

当用于液化和/或糖化的方法中时，变体淀粉酶可以减少碘阳性淀粉(IPS)。IPS的一个来源是从水解逃逸的直链淀粉和/或来自凝沉的淀粉聚合物。淀粉凝沉在淀粉糊剂中或在凝胶老化时自发发生，因为淀粉分子倾向于彼此结合，随后结晶度增加。由于淀粉分子逐渐结合成更大的物质，所以低浓度的溶液变得越来越混浊。发生自发沉淀，并且沉淀的淀粉似乎回复到其冷水不溶的原始状态。冷却时浓度更高的糊剂凝成凝胶，所述凝胶在老化时由于淀粉分子的结合增加逐步变得更坚硬。这是因为相邻淀粉分子上的羟基基团之间形成氢键的强烈趋势导致的。参见J.A.Radley(编辑),Starch and its Derivatives[淀粉及其衍生物]194-201(Chapman和Hall，伦敦(1968))。预期使用变体淀粉酶可通过减少IPS的量来改善整体工艺性能。

出于所有目的，本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文并入本文。为了进一步说明组合物和方法及其优点，给出以下具体实例，应理解它们是说明性的而不是限制性的。

实例

BspAmy24变体的产生

以如下方式制备蛋白质。从商业供应商处订购了编码目的蛋白的DNA序列、用于分泌的信号肽以及用于扩增和亚克隆的另外的5′和3′序列。使用标准程序将这些DNA序列插入细菌载体中，以在枯草芽孢杆菌细胞中表达分泌蛋白。通过DNA测序验证构建体。细胞在适于枯草芽孢杆菌分泌蛋白表达的表达培养基中生长68小时。通过离心将细胞与含蛋白的上清液分离，随后通过0.45μm膜(EMD密理博公司(EMD Millipore))过滤。通过使用苯基琼脂糖6快速流动树脂(通用电气医疗公司(GE Healthcare))进行离子交换色谱法可实现另外的纯化。通过高效液相色谱法(HPLC)和在280nm处的吸光度确定蛋白质浓度。表2中显示了表达和纯化的BspAmy24的变体(SEQ ID NO:1)。

表2.BspAmy24变体

用大米淀粉在切成5.5mm圆形样本的棉商业测试织物(CS28，测试材料中心(Center for Test Materials)，荷兰)上评估变体的淀粉清洁活性。将两个样本置于96孔Corning 9017平底聚苯乙烯微量滴定板的每个孔中。将具有灭活酶的商业自动餐具洗涤配方中的蛋白质溶液添加到测试织物中。将溶液在50℃振荡15分钟。通过用分光光度计测量溶液在488nm处的吸光度来评估上清液样品中染料的释放。

以如下方式制备具有灭活酶的商业自动餐具洗涤配方。将一个单独剂量包装的PLATINUM^TM或/>QUANTUM^TM餐具洗涤配方置于1升蒸馏水中，并搅拌使其溶解。将溶液在85℃到90℃之间孵育10小时。冷却后，将溶液的体积用蒸馏水升至北美餐具洗涤机(North American dishwasher)的大约体积(3.3L)，并以钙镁比为3:1的比例将水硬度升至150PPM(8.76GPG)。清洁测定的结果如图1-4所示。与熟知的清洁淀粉酶(诺维信公司)相比，BspAmy24变体表现良好。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的通过引用以其全文特此并入，并且其程度就像明确且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入一样。

Claims (8)

1.一种亲本α-淀粉酶的重组变体，所述重组变体包含：

(a) 对应于使用SEQ ID NO: 1时R181和G182的氨基酸残基的缺失；和对应于Q172R、A186G和I324M的氨基酸残基的突变；其中SEQ ID NO: 1所示的亲本α-淀粉酶用于编号；且其中与所述亲本α-淀粉酶相比，所述变体α-淀粉酶在自动餐具洗涤中具有改善的清洁性能，其中所述亲本α-淀粉酶与所述变体α-淀粉酶的不同仅在于没有所述缺失和所述突变。

2.一种编码如权利要求1所述的变体α-淀粉酶的多核苷酸。

3.一种包含如权利要求2所述多核苷酸的表达载体。

4.一种包含如权利要求2所述多核苷酸或如权利要求3所述表达载体的表达宿主。

5.一种用于液化淀粉的组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的变体α-淀粉酶。

6.一种洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物包含如权利要求1所述的变体α-淀粉酶。

7.一种用于将淀粉转化为寡糖的方法，所述方法包括使淀粉与有效量的如权利要求1所述的变体α-淀粉酶接触。

8.一种用于从表面除去淀粉污渍或污垢的方法，所述方法包括使所述表面与有效量的如权利要求1所述的变体α-淀粉酶接触，并且允许所述变体α-淀粉酶水解存在于所述淀粉污渍中的淀粉组分以产生溶解于水性组合物的较小的衍生自淀粉的分子，从而从所述表面除去所述淀粉污渍。