CN102388131B - 盐单胞菌属菌株WDG195相关α-淀粉酶及其使用方法 - Google Patents

盐单胞菌属菌株WDG195相关α-淀粉酶及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了涉及得自变异盐单胞菌WDG195的α-淀粉酶的组合物和方法。

Description

盐单胞菌属菌株WDG195相关α-淀粉酶及其使用方法
优先权
本申请要求于2009年4月8日提交的美国临时专利申请系列号61/167,612的优先权，其整体并入本文作为参考。
技术领域
本发明公开与得自盐单胞菌属(Halomomas)菌株WDG195的α-淀粉酶以及结构上相关的淀粉酶相关的组合物和方法。
背景技术
淀粉由直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混合物组成。直链淀粉由具有约60,000-约800,000分子量的α-1，4-连接的葡萄糖单位的直链组成。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单位包含α-1，6分支点的分支聚合物；它的MW可以高达100,000,000。
以浓缩葡萄糖糖浆形式来自淀粉的糖目前由酶促催化过程产生，涉及：(1)固体淀粉由α-淀粉酶液化(或粘度减少)成具有约7-10的平均聚合度的糊精，和(2)所得到的液化淀粉(即淀粉水解物)由淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)进行糖化。所得到的糖浆具有高葡萄糖含量。商业上产生的许多葡萄糖糖浆随后酶促异构化为称为异糖浆(isosyrup)的葡萄糖/果糖混合物。
α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)通过随机切割内部α-1，4-糖苷键，水解淀粉、糖原和相关多糖。多年来，α-淀粉酶已用于多种不同用途，包括淀粉液化、纺织品退浆、在纸和纸浆工业中的淀粉改性、和用于酿造。这些酶还可以用于在餐具洗涤和衣物洗涤过程中去除淀粉性污渍。衣物和餐具污垢在组成上并因此在其被去除的能力上十分不同，市场上很少数淀粉酶可以用于衣物和餐具应用两者。
盐单胞菌属(Halomonas)物种是革兰氏阴性、中等嗜盐细菌，其在包含3-15％NaCl的培养基中最佳地生长，尽管大多数可以在非常广的盐度范围上生长。某些物种是嗜碱性的。唯一已经描述的来自盐单胞属物种的淀粉酶是来自南方盐单胞菌(Halomonas meridiana)DSM5425(Coronado，M.J.等人(2000)FEMS Microbiology Letters 183：67-71)的淀粉酶。这种α-淀粉酶(即amyH)已得到克隆，并且预测了推导的氨基酸序列(AmyH)(Coronado，M.J.等人，(2000)Microbiology 146：861-868)。amyH基因的核苷酸序列(AJ239061)和AmyH多肽的预测氨基酸序列(CAB92963)可在GenBank获得。AmyH的氨基酸序列也在SEQ ID NO：1中显示。AmyH预测为457个氨基酸的多肽，包括20个氨基酸的信号序列和437个氨基酸的成熟多肽序列。
虽然AmyH看起来属于糖基水解酶家族13，但其与最接近的同源物具有低序列同一性，如下表中所示：
Figure BDA0000095426290000021
发明概述
本发明组合物和方法涉及来自盐单胞菌属菌株WDG195的α-淀粉酶和相关α-淀粉酶，其代表对于工业应用有用的一个独特淀粉酶家族。这些淀粉酶总称为AmyWDG195相关多肽或AmyWDG195相关淀粉酶。
在一个方面，提供了分离多肽，其与AmyWDG195具有至少80％氨基酸序列同一性，并且包括至少一个在相对于AmyWDG195的所示氨基酸位置(如通过比对多肽的氨基酸序列与AmyWDG195的氨基酸序列确定的位置)上的下述氨基酸残基：在位置3上的E、在位置20上的E、在位置25上的M、在位置26上的N、在位置40上的L、在位置68上的D、在位置82上的E、在位置91上的Q、在位置94上的G、在位置177上的L、在位置179上的H、在位置181上的G、在位置224上的N、在位置267上的L、在位置278上的D、在位置280上的D、在位置281上的V、在位置294上的E、在位置297上的R、在位置298上的T、在位置307上的L、在位置340上的D、在位置350上的V、在位置360上的S、在位置381上的L、在位置386上的E、在位置390上的D、在位置418上的G、在位置449上的M、在位置453上的H、在位置470上的D和在位置479上的Q。
在某些实施方案中，多肽包括至少一个在相对于AmyWDG195的所示氨基酸位置上的下述氨基酸残基：在位置3上的E、在位置20上的E、在位置25上的M、在位置26上的N、在位置68上的D、在位置82上的E、在位置91上的Q、在位置94上的G、在位置177上的L、在位置179上的H、在位置181上的G、在位置224上的N、在位置278上的D、在位置280上的D、在位置281上的V、在位置294上的E、在位置297上的R、在位置298上的T、在位置340上的D、在位置350上的V、在位置360上的S、在位置386上的E、在位置390上的D、在位置418上的G、在位置449上的M、在位置453上的H、在位置470上的D和在位置479上的Q。如上，AmyWDG195相关多肽可以具有在所示位置上的这些氨基酸残基的任何子集，或在所示位置上的所有这些氨基酸残基。
在某些实施方案中，多肽包括至少一个在相对于AmyWDG195的所示氨基酸位置上的下述氨基酸残基：在位置25上的M、在位置26上的N、在位置177上的L、在位置179上的H、在位置294上的E、在位置298上的T和在位置449上的M。
在某些实施方案中，多肽包括至少一个在相对于AmyWDG195的所示氨基酸位置上的下述氨基酸残基的组合：在位置25上的M和在位置26上的N，任选地连同在位置20上的E；在位置91上的Q和在位置94上的G；在位置177上的L、在位置179上的H和在位置181上的G；在位置280上的D和在位置281上的V，任选地连同在位置278上的D；在位置297上的R和在位置298上的T，任选地连同在位置294上的E；在位置386上的E和在位置390上的D，任选地连同在位置381上的L；以及在位置449上的M和在位置453上的H。
在某些实施方案中，多肽包括至少30个谷氨酸残基。
在某些实施方案中，多肽包括至少一个在相对于AmyWDG195的所示氨基酸位置上的下述氨基酸残基：在位置104上的N、在位置194上的D、在位置200上的N和在位置235上的H。
在某些实施方案中，多肽包括至少一个在相对于AmyWDG195的所示氨基酸位置上的下述氨基酸残基：在位置302上的Y、在位置300上的G、在位置427上的N、在位置404上的D和在位置403上的W。
在某些实施方案中，多肽包括至少一个在相对于AmyWDG195的所示氨基酸位置上的下述氨基酸残基：在位置289上的N、在位置324上的V、在位置325上的D和在位置337上的S。
在某些实施方案中，多肽包括在相对于AmyWDG195的所示氨基酸位置上的下述氨基酸残基：在位置197上的L。
在某些实施方案中，AmyWDG195具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，多肽与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性。在特定实施方案中，多肽具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列(AmyWDG195)。
在某些实施方案中，多肽具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列(AmySWT282)。
在某些实施方案中，多肽具有α-淀粉酶活性。在某些实施方案中，活性不依赖于钙。
在另一个方面，提供了包括任何一种或多种上述多肽的培养细胞材料。
在另一个方面，提供了包括任何一种或多种上述多肽的组合物。在某些实施方案中，组合物是清洁组合物。在某些实施方案中，组合物对于自衣物、餐具或纺织品上去除淀粉性污渍有效。
在另一个方面，提供了用于从表面去除淀粉性污渍的方法，其包括
在包括有效量的权利要求1多肽的水性组合物的存在下孵育表面，
允许多肽水解淀粉性污渍中存在的淀粉组分，以产生溶解于水性组合物中的较小淀粉衍生分子，
从而从表面上去除淀粉性污渍。
在某些实施方案中，孵育在不存在钙的情况下进行。在某些实施方案中，在钙螯合剂存在下孵育。在某些实施方案中，表面是纺织品表面。
在另一个方面，提供了用于表达具有淀粉酶活性的多肽的方法，其包括：
构建表达载体，其中该表达载体包括与编码权利要求1多肽的多核苷酸连接的编码信号序列的多核苷酸；
将表达载体引入宿主细胞内，
在至少约1％NaCl存在下表达多肽，
回收所表达的多肽。
在某些实施方案中，在至少约2％NaCl存在下表达多肽。在某些实施方案中，在至少约3％NaCl存在下表达多肽。
在某些实施方案中，在1％NaCl存在下表达的多肽量是在未添加NaCl的基础培养基(minimum medium)中表达的量的至少5倍。在某些实施方案中，在2％NaCl存在下表达的多肽量是在未添加NaCl的基础培养基中表达的量的至少20倍。在某些实施方案中，在1％NaCl存在下表达的多肽量是在未添加NaCl的基础培养基中表达的量的至少20倍。
再一方面，本发明提供了包括编码AmyWDG195相关淀粉酶的多核苷酸序列的载体。AmyWDG195相关淀粉酶编码序列可以与启动子或其他控制元件可操作地连接。在再进一步的方面，提供了包括编码AmyWDG195相关淀粉酶的多核苷酸、或含有此类多核苷酸的载体的宿主细胞。该分离的宿主细胞可以是原核的或真核的。分离的宿主细胞可以是细菌(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus(以前Bacillus)stearothermophilus)、嗜碱性芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、鼠灰链霉菌(S.murinus)、或大肠杆菌(Escherichia coli))。
另一个方面考虑包括AmyWDG195相关淀粉酶的洗涤剂添加剂，其中洗涤剂添加剂任选为无粉尘颗粒、微粒、稳定的液体、凝胶或受保护酶的形式。在洗涤剂添加剂中的多肽可以是如上所述的截短多肽。洗涤剂添加剂可以包含约0.02mg-约200mg多肽/克洗涤剂添加剂。洗涤剂添加剂可以进一步包括选自蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶及其任何组合的酶。
另一个方面考虑包括任何所述洗涤剂添加剂的洗涤剂组合物。洗涤剂组合物可以任选地包括下述中的一种或多种：表面活性剂、漂白系统或漂白剂、洗涤剂助剂、聚合物、稳定剂、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐蚀剂、染料、香料、悬污剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或杀细菌剂。洗涤剂组合物可以包括或进一步包括另外的酶，其中该酶是蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶、或其任何组合。
另一个方面考虑包括AmyWDG195相关淀粉酶的人工或自动餐具洗涤洗涤剂组合物。
再进一步的方面考虑洗涤餐具的方法，其包括将本文描述的人工或自动餐具洗涤洗涤剂应用于有此需要的餐具。洗涤餐具的方法可以考虑将餐具洗涤洗涤剂以这样的量加入，从而使得洗液包含约0.01ppm-约4ppm量的本文描述的多肽。
另一个方面考虑包括本文描述的洗涤剂添加剂的洗衣洗涤剂组合物。再进一步的方面考虑清洁纺织品的方法，其包括在具有本文描述的洗涤剂组合物的溶液中洗涤污染的纺织品。该方法进一步可以考虑在溶液中具有约0.01ppm-约2ppm量的本文描述的多肽。
本发明组合物和方法的这些和其他方面和实施方案从本说明书和附图将是显而易见的。
附图简述
图1显示了载体pRANGER-BTB3-Cat的示意图。
图2显示了Blast搜索结果，显示AmyWDG195属于α-淀粉酶超家族。
图3显示了表达载体pHPLT。
图4和5显示了评估清洁性能的试验结果。
图6是显示AmySWT282表达的考马斯染色凝胶的图像。
图7显示AmyWDG195、AmySWT282和Amy K38的比对，突显在AmyWDG195和AmySWT282之间保守的残基。
图8显示AmyWDG195、AmySWT282和Amy K38的比对，显示保守残基和共有序列。
图9列出本说明书中提及的多肽和核苷酸序列。
序列简述
SEQ ID NO：1是来自南方盐单胞菌的AmyH前体(即，未成熟或全长)多肽的氨基酸序列。信号序列是前约20个残基。
SEQ ID NO：2是盐单胞菌属菌株WDG195的16S rRNA基因的部分核苷酸序列。
SEQ ID NOs：3-8是实施例中描述的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是amyWDG195基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是AmyWDG195前体(即未成熟或全长)多肽的氨基酸序列。信号序列是前约22个残基，而其余残基代表成熟多肽。
SEQ ID NO：11是AmyWDG195信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是AmyWDG195成熟多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NOs：13-17是实施例中描述的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：18是AmySWT282基因的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO：19是编码AmySWT282前体(即未成熟或全长)多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20是编码AmySWT282成熟多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21是编码AmySWT282信号肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22是AmySWT282前体(即未成熟或全长)多肽的氨基酸序列。信号序列是前约22个残基，而其余残基代表成熟多肽。
SEQ ID NO：23是AmySWT282成熟多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24是AmySWT282信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NOs：25-33是实施例中所述的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34是AmyK38前体(即未成熟或全长)多肽(gi16874476)的氨基酸序列。信号序列是前约21个残基，而其余残基代表成熟多肽。
SEQ ID NO：35是AmyK38成熟多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NOs：36-41是实施例中所述的引物的核苷酸序列。
发明详述
本发明描述与从盐单胞菌属菌株WDG195中分离的α-淀粉酶(本文称为“AmyWDG195”(SEQ ID NO：12))相关的组合物和方法。虽然这种淀粉酶属于α-淀粉酶超家族，但它与归于糖基水解酶家族13的、从南方盐单胞菌菌株DSM5425中先前分离的淀粉酶AmyH(SEQ ID NO：1)无关。特别地，AmyWDG195和AmyH共享不到11％的序列同一性。
AmyWDG195与来自芽孢杆菌属物种菌株SWT282的另一种迄今未知的淀粉酶，本文称为“AmySWT282”(SEQ ID NO：23)，和来自芽孢杆菌属物种菌株K38的一种已知淀粉酶，本文称为“AmyK38”(SEQ IDNO：35；GenBank登记号BAB71820；Hagihara，H.等人(2001)Appl.Environ.Microbiol.67：1744-50)，共享显著序列同一性。具体地，AmyWDG195与AmySWT282共享约78.1％序列同一性，并且与AmyK38共享81.5％序列同一性。值得注意的是，AmySWT282和AmyK38共享77.9％序列同一性；因此，这3种淀粉酶在进化距离上是大致等距的。然而，更精细的结构分析揭示，虽然AmyWDG195、AmySWT282、AmyK38共享某些共同特征，但AmyWDG195和AmySWT282基于其他特征可容易地与AmyK38区分。
特别地，AmyWDG195和AmySWT282均包括AmyK38中与结合3个钠离子相关的关键残基(Hagihari，H.等人(2001)Eur.J.Biochem.268：3974-82；Nonaka，T.等人(2003)J.Biol.Chem.278：24818-25)。特别地，在位置104上的N、在位置194上的D、在位置200上的N和在位置235上的H的存在，与AmyK38中第一个钠的结合相关，并在AmyWDG195和AmySWT282中都是保守的。类似地，与AmyK38中第二个钠的结合相关的、在位置302上的Y、在位置300上的G、在位置427上的N、在位置404上的D和在位置403上的W，以及与AmyK38中第三个钠的结合相关的、在位置289上的N、在位置324上的V、在位置325上的D和在位置337上的S，在AmyWDG195和AmySWT282中都是保守存在的。相应地，AmyWDG195和AmySWT282预期与AmyK38共享某些嗜盐性质，这通过本文描述的实验得以证实。此外，AmyWDG195、AmySWT282和AmyK38全都共享在位置197上的L，与在这个位置上具有M的许多其他芽孢杆菌淀粉酶不同。这使得这些淀粉酶对化学氧化作用比其他芽孢杆菌淀粉酶较不敏感。
相比之下，基于在如下32个不同位置之每个上存在的氨基酸残基，AmyWDG195和AmySWT282可以与AmyK38容易地区分，在所述氨基酸位置上AmyWDG195和AmySWT282共享相同氨基酸残基，但与AmyK38中存在的氨基酸残基不同。AmyWDG195和AmySWT282还包含明显更大数目的谷氨酸残基，具有比AmyK38低的预测等电点(pI)。因此，AmyWDG195和AmySWT282代表相关的、迄今未知的钙不依赖性淀粉酶，对螯合剂和化学氧化剂具有抗性，这使得它们对于清洁应用非常有吸引力。
为了本说明书的目的，AmyWDG195、AmySWT282和相关多肽总称为AmyWDG195相关多肽或AmyWDG195相关淀粉酶。为了方便起见，参考AmyWDG195和AmyK38多肽(参见例如，图7和8)，使用AmyWDG195和AmyK38的氨基酸位置编号。然而，AmySWT282在N末端上比AmyWDG195和AmyK38短1个氨基酸，因此相对于AmyWDG195和AmyK38，AmySWT282的实际氨基酸位置小1(即，-1)。
现在将描述涉及AmyWDG195相关淀粉酶多肽或编码这些多肽的多核苷酸的各种组合物和方法。
1.定义和缩写
在详述中，应用下述缩写和定义。注意，单数形式“a”、“an”和“the”涵盖对复数的提及，除非上下文明确指出并非如此。因此，例如提及“酶”包括多个此类酶，提及“剂量”包括提及一个或多个剂量及本领域技术人员已知的其等价物，等等。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。为了清楚起见，定义了下述缩写和/或术语。
1.1缩写
除非另有说明，否则下述缩写具有以下含义：
Figure BDA0000095426290000101
Figure BDA0000095426290000111
Figure BDA0000095426290000121
Figure BDA0000095426290000131
1.2定义
术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”指能够例如催化淀粉降解的酶。淀粉酶是断裂淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。通常，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切割淀粉分子内的α-D-(1→4)O-糖苷键的内切作用酶。相比之下，外切作用淀粉分解酶，例如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和某些产物特异性淀粉酶如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)从底物的非还原末端开始切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)、和产物特异性淀粉酶可以由淀粉产生特定长度的麦芽寡糖。
如本文使用的，术语“淀粉”指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何物质，其包括直链淀粉和支链淀粉，具有式(C6H10O5)x，其中X可以是任何数。该术语包括基于植物的物质，例如籽粒、草、块茎和根，且更特别地得自小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、糠、木薯、粟、马铃薯、甘薯和木薯的物质。
就多肽而言，术语“野生型”、“亲本”或“参考”指天然存在的多肽，其不包括在一个或多个氨基酸位置上的人为置换、插入或缺失。类似地，就多核苷酸而言，术语“野生型”、“亲本”或“参考”指天然存在的多核苷酸，其不包括人为核苷改变。然而，注意，编码野生型、亲本或参考多肽的多核苷酸并不限于天然存在的多核苷酸，其涵盖编码野生型、亲本或参考多肽的任何多核苷酸。
就多肽而言，术语“变体”指不同于指定野生型、亲本或参考多肽的多肽，因为它包括在一个或多个氨基酸位置上的人为置换、插入或缺失。类似地，就多核苷酸而言，术语“变体”指核苷酸序列不同于指定野生型、亲本或参考多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的身份根据上下文将是显而易见的。
术语“重组”当与主题细胞、核酸、蛋白质或载体相关使用时，指主题已通过引入异源核酸或蛋白质或通过改变天然核酸或蛋白质而进行了修饰，或该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因，或以与在自然界中不同的水平或不同的条件下表达天然基因。
术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指，化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸、或其他述及的材料或组分从在自然界中与之天然相关的至少一种其他材料或组分中移出。
如本文使用的，术语“纯化的”指物质(例如，分离的多肽或多核苷酸)处于相对纯的状态，例如至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、或甚至至少约99％纯。
就酶而言，术语“热稳定的”和“热稳定性”指酶在暴露于升高温度后保留活性的能力。酶例如淀粉酶的热稳定性通过以分钟、小时或天给出的其半衰期(t1/2)来量度，在所述半衰期期间半数酶活性在指定的条件下丧失。半衰期可以通过在升高温度的暴露(即，攻击)后测量残留的α-淀粉酶活性而计算。
就酶而言，“pH范围”指pH值的范围，其中在所述范围的pH值下，酶显示催化活性。
就酶而言，如本文使用的，术语“pH稳定的”和“pH稳定性”指，酶在宽pH值范围保留活性预定时间段(例如，15分钟、30分钟、1小时)的能力。
如本文使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换使用。当氨基酸序列显示活性时，它们可以被称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码，氨基酸序列以标准氨基至羧基端方向(即N→C)呈现。
术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、杂合双链体和合成分子。核酸可以是单链或双链的，并且可以具有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码的简并性，所以可以使用一个以上密码子编码一个特定氨基酸，本发明组合物和方法包括编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，否则核酸序列以5′至3′方向呈现。
“同源物”应意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有指定相同程度的实体。同源序列意欲包括使用常规序列比对工具(例如，Clustal、BLAST等)，与主题序列至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包括与主题氨基酸序列相同的活性位点残基，除非另有说明。
如本文使用的，“杂交”指，如在印迹杂交技术和PCR技术中发生的，一条核酸链与互补链碱基配对的过程。严格杂交条件通过下述例示：50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl、0.015M Na3柠檬酸盐，pH 7.0)。高严格条件通过下述例示：65℃和0.1X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl、0.015MNa3柠檬酸盐，pH 7.0)]。
如本文使用的，“合成”分子通过体外化学或酶促合成而不是通过生物产生。
如本文使用的，就细胞而言使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”意指，细胞含有整合到其基因组内或作为附加体携带的非天然(例如，异源)核酸序列，所述核酸序列可以被多代维持。
在将核酸序列插入细胞内的上下文中术语“引入”意指如本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。
“宿主株”或“宿主细胞”是其中已经引入了包括编码目的多肽(例如，AmyWDG195相关多肽)的多核苷酸的表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体的生物。示例性宿主株是细菌细胞。术语“宿主细胞”包括由细胞例如芽孢杆菌属物种细胞，产生的原生质体。
就多核苷酸或蛋白质而言的术语“异源的”指不是在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。
就多核苷酸或蛋白质而言的术语“内源的”指在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。
如本文使用的，术语“表达”指基于核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
“选择标记”或“可选标记”指能够在宿主中表达以利于选择携带其的宿主细胞的基因。可选标记的例子包括但不限于抗微生物剂(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予代谢优势的基因，例如赋予宿主细胞营养优势的基因。
“载体”指设计用于将核酸引入一个或多个细胞类型内的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。
“表达载体”指包括编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列与能够实现该DNA在合适宿主中表达的合适控制序列可操作地连接。此种控制序列可以包括启动子以实现转录，任选的操纵子序列以控制转录，在mRNA上编码合适核糖体结合位点的序列，增强子以及控制转录和翻译终止的序列。
术语“可操作地连接”意指所述及的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并置)中。例如调节序列与编码序列可操作地连接，从而使得编码序列的表达在调节序列的控制下。
“信号序列”是与蛋白质的N末端部分附着的氨基酸序列，其促进蛋白质分泌到细胞外。成熟形式的细胞外蛋白质缺乏信号序列，所述信号序列在分泌过程期间被切割掉。
如本文使用的，“生物活性的”指具有所述及的生物活性例如酶促活性的序列。
“水硬度”是水中存在的矿物质(例如，钙和镁)的量度。
如本文使用的，“包括AmyWDG195相关淀粉酶的培养细胞物质”或相似语言，指包括AmyWDG195相关淀粉酶作为组分的细胞裂解物或上清液。细胞物质优选来自为了生产AmyWDG195相关淀粉酶的目的在培养中生长的异源宿主。
本文引用的所有参考文献在此整体并入作为参考。
2.AmyWDG195相关淀粉酶核酸和多肽
本发明组合物和方法的一个方面是AmyWDG195相关多肽。所述多肽可以对应于AmyWDG195，AmySWT282，与AmyWDG195或AmySWT282具有规定的相同程度的淀粉酶，包括人为置换、插入或缺失的AmyWDG195或AmySWT282的变体，或其嵌合体。示例性AmyWDG195和AmySWT282多肽分别具有SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：23的氨基酸序列。另外的多肽与AmyWDG195或AmySWT282多肽，例如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：23的多肽，具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同源性/同一性。本发明组合物和方法排除Amy K38多肽，例如具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽。
如上所述，基于在如下32个不同位置之每个上存在的氨基酸残基，AmyWDG195和AmySWT282可以与AmyK38区分，在所述氨基酸位置上AmyWDG195和AmySWT282共享相同氨基酸残基，但与AmyK38中存在的氨基酸残基不同。在AmyWDG195和AmySWT282(使用AmyWDG195编号)中由相同氨基酸残基占据但在Amy K38中由不同氨基酸残基占据的位置在下表中列出。
Figure BDA0000095426290000181
Figure BDA0000095426290000191
参考上表和图7中所示的比对，在某些实施方案中，AmyWDG195相关多肽具有在所示位置上的下述氨基酸残基中的一个或多个：在位置3上的E、在位置20上的E、在位置25上的M、在位置26上的N、在位置40上的L、在位置68上的D、在位置82上的E、在位置91上的Q、在位置94上的G、在位置177上的L、在位置179上的H、在位置181上的G、在位置224上的N、在位置267上的L、在位置278上的D、在位置280上的D、在位置281上的V、在位置294上的E、在位置297上的R、在位置298上的T、在位置307上的L、在位置340上的D、在位置350上的V、在位置360上的S、在位置381上的L、在位置386上的E、在位置390上的D、在位置418上的G、在位置449上的M、在位置453上的H、在位置470上的D和在位置479上的Q。AmyWDG195相关多肽可以具有这些在所示位置上的氨基酸残基的任何子集，或所有这些在所示位置上的氨基酸残基。
在某些实施方案中，AmyWDG195相关多肽具有下述氨基酸残基中的一个或多个：在位置3上的E、在位置20上的E、在位置25上的M、在位置26上的N、在位置68上的D、在位置82上的E、在位置91上的Q、在位置94上的G、在位置177上的L、在位置179上的H、在位置181上的G、在位置224上的N、在位置278上的D、在位置280上的D、在位置281上的V、在位置294上的E、在位置297上的R、在位置298上的T、在位置340上的D、在位置350上的V、在位置360上的S、在位置386上的E、在位置390上的D、在位置418上的G、在位置449上的M、在位置453上的H、在位置470上的D和在位置479上的Q。如上，AmyWDG195相关多肽可以具有这些在所示位置上的氨基酸残基的任何子集，或所有这些在所示位置上的氨基酸残基。
在某些实施方案中，AmyWDG195相关多肽具有下述氨基酸残基中的一个或多个：在位置25上的M、在位置26上的N、在位置177上的L、在位置179上的H、在位置294上的E、在位置298上的T和在位置449上的M。再次，AmyWDG195相关多肽可以具有这些在所示位置上的氨基酸残基的任何子集，或所有这些在所示位置上的氨基酸残基。
在某些实施方案中，AmyWDG195相关多肽具有下述在所示位置的氨基酸残基组合中的一个或多个：在位置25上的M和在位置26上的N，任选地连同在位置20上的E；在位置91上的Q和在位置94上的G；在位置177上的L、在位置179上的H和在位置181上的G；在位置280上的D和在位置281上的V，任选地连同在位置278上的D；在位置297上的R和在位置298上的T，任选地连同在位置294上的E；在位置386上的E和在位置390上的D，任选地连同在位置381上的L；以及在位置449上的M和在位置453上的H。AmyWDG195相关多肽可以具有这些氨基酸残基组合的任何子集，或所有这些氨基酸残基组合。
在某些实施方案中，AmyWDG195相关多肽保留：被认为与第一个钠的结合相关的在位置104上的N、在位置194上的D、在位置200上的N和/或在位置235上的H，被认为与第二个钠的结合相关的在位置302上的Y、在位置300上的G、在位置427上的N、在位置404上的D和/或在位置403上的W，和/或被认为与第三个钠的结合相关的在位置289上的N、在位置324上的V、在位置325上的D和在位置337上的S。在某些实施方案中，AmyWDG195相关多肽保留被认为与减少的化学氧化敏感性相关的在位置197上的L。
同样如上所述，与AmyK38相比，AmyWDG195和AmySWT282包含明显更大数目的谷氨酸残基，具有更低的预测等电点(Pi)。这些差异总结在下表中：
  淀粉酶   谷氨酸数目   pI
  AmyWDG195   36   4.42
  AmySWT282   33   4.47
  AmyK38   23   4.73
因此，在某些实施方案中，AmyWDG195相关多肽具有至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、或甚至至少36个谷氨酸残基。在某些实施方案中，AmyWDG195相关多肽具有小于4.7、小于4.6、或甚至小于4.5的pI。
当AmyWDG195相关多肽是与AmyWDG195或AmySWT282具有指定同源性程度的变体时，一个或多个指定氨基酸位置(或其组合)可以是固定的，从而它们在变体中不发生改变(即，保守或保持)，而其余残基可以发生变化。可替代地或另外地，多肽中的谷氨酸残基数目被维持。
多肽可以是包括信号序列的“全长”AmyWDG195相关淀粉酶，或缺乏信号序列的成熟形式的AmyWDG195相关淀粉酶。示例性未成熟形式的AmyWDG195和AmySWT282多肽分别具有SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：22的氨基酸序列，而示例性成熟形式的AmyWDG195和AmySWT282多肽分别具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：23的氨基酸序列。成熟形式的多肽对于在清洁组合物中的使用是最有用的。多肽还可以是缺乏成熟形式的N或C末端的截短形式的AmyWDG195相关淀粉酶，或保留亲本AmyWDG195相关淀粉酶的至少部分α-淀粉酶活性特征的AmyWDG195相关淀粉酶的片段。
如上所述，多肽包括变体多肽，例如包括人为置换的那些。示例性置换是保守氨基酸置换，例如下表中列出的那些。
Figure BDA0000095426290000221
Figure BDA0000095426290000231
优选多肽保留α-淀粉酶活性，但相对于天然存在的亲本多肽可以具有改变的生物化学性质。在某些情况下，亲本多肽是SEQ ID NOs：12或23的多肽。
多肽还可以是包括如所述的AmyWDG195相关淀粉酶的至少部分和第二多肽的至少部分的嵌合多肽。第二多肽可以是例如第二淀粉酶、异源信号序列、或允许跟踪或纯化的表位，等。示例性异源信号序列来自枯草芽孢杆菌淀粉酶(AmyE)或AprE和链霉菌CelA。
本发明组合物和方法的另一个方面是编码AmyWDG195相关多肽的核酸。核酸可以编码AmyWDG195，AmySWT282，与AmyWDG195或AmySWT282具有指定相同程度的淀粉酶，包括人为置换、插入或缺失的AmyWDG195或AmySWT282的变体，或其嵌合体。在一个例子中，核酸编码与AmyWDG195或AmySWT282多肽，例如分别地SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：20的多肽，具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同源性/同一性的淀粉酶。由于遗传密码的简并性，应当理解不止一种核酸可以编码相同多肽。
核酸还可以与编码AmyWDG195相关淀粉酶的示例性多核苷酸，例如编码AmyWDG195的SEQ ID NO：9，或编码AmySWT282的SEQ ID NO：20，具有规定的同源性程度。在一个例子中，核酸与这些示例性序列中的一个或两个具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性。在另一个例子中，核酸在严格或非常严格的条件下与这些示例性序列之一杂交。
核酸可以编码包括信号序列的“全长”或“fl”AmyWDG195相关淀粉酶，缺乏信号序列的仅成熟形式的AmyWDG195相关淀粉酶，缺乏成熟形式的N或C末端的截短形式的AmyWDG195相关淀粉酶，或保留AmyWDG195相关淀粉酶的至少部分α-淀粉酶活性特征的其片段。
编码AmyWDG195相关淀粉酶的核酸可以在载体中与各种启动子和调节子可操作地连接，以在多种宿主细胞中表达。编码AmyWDG195相关淀粉酶的核酸还可以与其他编码序列连接，例如以编码嵌合多肽。示例性启动子是枯草芽孢杆菌AmyE和AprE启动子、和链霉菌CelA启动子。
3.产生和纯化蛋白质的方法
产生和纯化从芽孢杆菌中分泌到培养基内的蛋白质的方法是本领域已知的，用于产生α-淀粉酶的合适宿主细胞也是本领域已知的。用于产生α-淀粉酶的示例性方法在下文公开。
3.1用于产生α-淀粉酶的材料与方法
AmyWDG195相关淀粉酶可以使用表达载体以酶形式表达，其中表达载体一般包括编码合适启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏基因或各种激活基因的控制序列。大量载体可市售获得用于重组DNA操作，并且载体的选择通常将依赖于它待引入的宿主细胞。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。可替代地，载体可以是当引入分离的宿主细胞内时整合到宿主细胞基因组内且与整合其的染色体(一个或多个)一起复制的载体。通过使用可扩增构建体，也可以使整合的基因扩增以在染色体中产生该基因的多个拷贝，所述可扩增构建体可以通过抗生素选择或其他选择性压力(例如必需调节基因)来驱动或通过必需代谢途径基因的剂量效应经由互补作用来驱动。
载体中，该DNA序列应与适宜的启动子序列有效连接。启动子可以是任何在所选宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，并且可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。可用于指导编码AmyWDG195相关淀粉酶的DNA序列转录(尤其在细菌宿主中)的示例性启动子是大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的那些启动子。当在诸如大肠杆菌的细菌物种中表达编码AmyWDG195相关淀粉酶多肽的基因时，可以例如从噬菌体启动子(包括T7启动子和λ噬菌体启动子)选择适宜的启动子。适于在酵母物种中表达的适宜启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的AOX1或AOX2启动子。对于在里氏木霉(Trichodermareesei)中的表达，可以使用CBHII(纤维二糖水解酶II)启动子。
表达载体还可以包括适宜的转录终止子以及，在真核生物中，多腺苷酸化序列，与编码AmyWDG195相关淀粉酶的DNA序列可操作地连接。终止序列和多腺苷酸化序列可以适宜地源自与启动子相同的来源。
载体可以进一步包括使得载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此种序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
载体也可包括选择标记，例如其产物能弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包括曲霉属(Aspergillus)选择标记，例如amdS、argB、niaD和xxsC，产生潮霉素抗性的标记，或者可通过例如本领域已知的共转化实现选择。参见例如，国际PCT申请WO 91/17243。
虽然细胞内表达或固态发酵在某些方面可以是有利的，例如当使用某一细菌或真菌作为宿主细胞时，但一个方面考虑了AmyWDG195相关淀粉酶表达到培养基内。通常，α-淀粉酶在氨基末端上包括允许分泌到培养基内的信号序列。需要时，这个信号肽可以由不同序列替换，方便地用编码相应信号多肽的DNA序列进行置换而实现。
表达载体一般包括克隆载体的组分，例如允许载体在所选择的宿主生物中自主复制的组分、和用于选择目的的一种或多种表型可检测标记。表达载体通常包括控制核苷酸序列，例如启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏基因或一种或多种激活基因。另外，表达载体可以包括编码如下氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能够将AmyWDG195相关多肽靶向宿主细胞的细胞器例如过氧化物酶体，或靶向特定宿主细胞区室。此类靶向序列包括但不限于序列SKL。为了在控制序列指导下表达，AmyWDG195相关多肽的核酸序列以就表达而言合适的方式与控制序列可操作地连接。一个示例性载体的部分在图3中描述。
用于分别地连接编码AmyWDG195相关多肽的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件、和将它们插入包含复制所需信息的合适载体内的操作，是本领域技术人员公知的(参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989和第3版，2001)。
有益地，可以将含有DNA构建体或表达载体的分离的细胞用作重组生产AmyWDG195相关淀粉酶的宿主细胞。可用编码酶的DNA构建体，方便地通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中，而转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。可以根据常规方法，例如通过同源或异源重组，实现DNA构建体向宿主染色体的整合。或者，可以用上述与不同类型宿主细胞有关的表达载体，转化细胞。
适宜的细菌宿主生物的实例为革兰氏阳性细菌物种，例如芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌；链霉菌属物种如鼠灰链霉菌；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种(Lactococcus spp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)，片球菌属物种(Pediococcus spp.)和链球菌属物种(Streptococcus spp.)。或者，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或者属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物。
适宜的酵母宿主生物可以选自生物技术相关酵母物种，例如但不限于酵母物种，例如毕赤酵母属物种、汉逊酵母属物种、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种、耶氏酵母属(Yarrowinia)物种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种或酵母属(Saccharomyces)物种，包括酿酒酵母或属于裂殖酵母属的物种，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养酵母物种巴斯德毕赤酵母的菌株可以用作宿主生物。或者，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适宜的宿主生物包括曲霉属物种，例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。或者，镰孢霉属(Fusarium)物种，如尖镰孢(Fusariumoxysporum)或根毛霉属(Rhizomucor)物种，如米黑根毛霉，可以用作宿主生物。其他适宜的菌株包括嗜热丝孢菌属(Thermomyces)和毛霉属(Mucor)物种。此外，里氏木霉可以用作宿主。用于转化曲霉属宿主细胞的适宜操作包括例如EP238023中所述的技术。
在再进一步的方面，提供了产生AmyWDG195相关淀粉酶的方法，所述方法包括在有利于酶生产的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基中回收酶。
用于培养细胞的培养基可以是任何适于生长所讨论宿主细胞和获得AmyWDG195相关淀粉酶表达的常规培养基。适宜的培养基和培养基组分可获自商品供应商或可根据公开的配方(例如在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的目录中所述的配方)制备。
在一个方面，由宿主细胞分泌的酶以全肉汤制备物的形式使用。在本发明方法中，可以使用本领域已知的任何培养方法，制备重组微生物的用过的(spent)全发酵肉汤，导致α-淀粉酶的表达。发酵因此可以理解为包括：在合适培养基中和在允许淀粉酶表达或分离的条件下执行的，摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中的小或大规模发酵(包括连续、分批、分批给料或固态发酵)。术语“用过的全发酵肉汤”在本文中定义为发酵物质的未经分级分离的内含物，其包括培养基、细胞外蛋白质(例如酶)和细胞生物质。应当理解，术语“用过的全发酵肉汤”还涵盖已使用本领域公知的方法裂解或透化处理的细胞生物质。
可通过公知的方法，从培养基中方便地回收自宿主细胞分泌的酶，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换色谱、亲和色谱等的色谱方法。
一个方面考虑载体中的多核苷酸与控制序列可操作地连接，所述控制序列能够提供编码序列由宿主细胞的表达，即载体是表达载体。控制序列可以例如通过添加进一步的转录调节元件进行修饰，以使得由控制序列指导的转录水平更响应于转录调节剂。控制序列可以特别包括启动子。
可在允许AmyWDG195相关淀粉酶表达的适宜条件下培养宿主细胞。酶的表达可以是组成型的，从而它们可以连续生产，或可以是诱导型的，从而需要刺激来起始表达。在诱导型表达的情况下，可以在需要时通过例如向培养基中加入诱导物(例如地塞米松或IPTG或Sepharose)来起始蛋白质生产。也可以在体外无细胞体系(例如TNTTM(Promega)兔网织红细胞体系)中重组生产多肽。
也可以在有氧条件下，于对宿主合适的培养基中培养表达AmyWDG195相关淀粉酶的宿主。可以提供振荡或搅拌及通风的组合，在对于该宿主适合的温度例如约25℃至约75℃(例如30℃-45℃)进行生产，这取决于宿主的需要以及生产期望AmyWDG195相关多肽的需要。可以培养约12至约100小时或更长时间(以及其间的任何小时值，例如24-72小时)。通常，培养物肉汤在约5.5至约8.0的pH，这也取决于相对于AmyWDG195相关淀粉酶的生产，宿主所需的培养条件。
在某些实施方案中，在与例如基础培养基相比存在加入培养基中的额外NaCl的情况下，表达AmyWDG195相关淀粉酶。本文使用的基础培养基，除了由其他组分贡献的小量NaCl外，还包括约50mM NaCl。1％、2％或甚至3％盐的添加导致了AmyWDG195相关淀粉酶的产生量的显著增加。先前研究提示NaCl对于AmyK38的活性而非表达是重要的。
本发明组合物和方法的一个方面是在额外NaCl存在下表达AmyWDG195相关多肽，这增加在宿主细胞中表达的多肽产量。在某些实施方案中，NaCl的量是约1％，并且产量的增加为至少3、至少6和甚至至少9倍。在某些实施方案中，NaCl的量是约2％，并且产量的增加是至少4、至少8、至少12和甚至至少16倍。在某些实施方案中，NaCl的量是约3％，并且产量的增加是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30和甚至至少35倍。
通常，根据本发明方法，构建包含与编码信号序列的多核苷酸连接的编码AmyWDG195相关多肽的多核苷酸的表达载体，且引入宿主细胞内。AmyWDG195相关多肽随后如所述的使用富含NaCl的培养基在宿主细胞中表达，其中信号肽指导AmyWDG195相关多肽分泌，并且该额外的盐增加产量。最后，如希望，可以回收且纯化AmyWDG195相关多肽。
3.2用于蛋白质纯化的材料与方法
发酵、分离和浓缩技术是本领域公知的，并且可以使用常规方法以制备浓缩的含AmyWDG195相关淀粉酶的溶液。
在发酵后，获得发酵肉汤，通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮的固形物(包括残留的发酵原料)以便获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微量过滤、转鼓真空过滤、超滤、离心随后超滤、提取或色谱法等。
为优化回收，浓缩含AmyWDG195相关淀粉酶的溶液是期望的。使用未浓缩的溶液将需要增加的孵育时间以收集纯化的酶沉淀物。
可以使用常规浓缩技术将含酶溶液浓缩，直到获得期望的酶水平。可使用本文讨论或本领域另外已知的任何技术实现含酶溶液的浓缩。示例性浓缩方法包括但不限于转鼓真空过滤和/或超滤。
可以使用例如沉淀剂例如金属卤化物沉淀剂进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。示例性金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。金属卤化物沉淀剂氯化钠还可以用作防腐剂。
金属卤化物沉淀剂以有效沉淀AmyWDG195相关多肽的量使用。在常规试验后，本领域普通技术人员可以容易地选择出金属卤化物沉淀剂有效促使酶沉淀的至少有效量和最佳量、以及用于最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和酶的浓度。
通常，向浓缩的酶溶液中加入至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，且通常是至少8％w/v。通常，向浓缩的酶溶液中加入不超过约25％w/v的金属卤化物，且通常是不超过约20％w/v。金属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于例如具体的AmyWDG195相关淀粉酶的性质以及其在浓缩酶溶液中的浓度等。
另一可选的实现酶沉淀的方法是应用有机化合物。示例性有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在金属卤化物沉淀剂的添加之前、与其同时或在其后发生，并且两类沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加都可顺序进行或同时进行。
通常，有机沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(例如钠或钾盐)，以及4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-12个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-10个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。示例性有机化合物是4-羟基苯甲酸的线性烷基酯(其中烷基含有1-6个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲基酯、4-羟基苯甲酸的丙基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。其它有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(命名为甲基PARABEN)、4-羟基苯甲酸丙酯(命名为丙基PARABEN)，它们也是淀粉酶防腐剂。关于进一步描述，参见例如美国专利号5,281,526。
所述有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件高度灵活性的优势(就pH、温度、AmyWDG195相关多肽浓度、沉淀剂浓度和孵育时间而言)。
有机化合物沉淀剂可以以有效改善金属卤化物沉淀剂的酶沉淀的量使用。根据本公开内容，在常规试验后，本领域普通技术人员可以容易地选择出有机化合物沉淀剂的至少有效量和最佳量，以及用于最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和酶的浓度。
通常，向浓缩的AmyWDG195相关多肽溶液中加入至少约0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常至少约0.02％w/v。通常向浓缩的AmyWDG195相关多肽溶液中加入不多于约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常不多于约0.2％w/v。
可以调整含有金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的浓缩酶溶液的pH，该pH必然地将取决于待纯化的酶。通常，将pH调整至淀粉酶等电点(pI)附近的水平。可以将pH调整至位于如下pH范围内：低于等电点(pI)约2.5个pH单位至高于等电点约2.5个pH单位。
获得纯化的酶沉淀物所需的孵育时间取决于具体酶的性质、酶浓度、以及具体的沉淀剂(一种或多种)及其浓度。通常，有效沉淀酶的时间为约1至约30小时；通常不超过约25小时。在有机化合物沉淀剂存在下，孵育时间还可以减至小于约10小时，且在大多数情况下甚至是约6小时。
通常，孵育期间的温度为约4℃至约50℃。通常，在约10℃至约45℃(例如约20℃至约40℃)的温度进行所述方法。用于引起沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶或所用沉淀剂而变化。
可以通过搅拌包括酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液，提高纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。可以在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的孵育期均进行搅拌步骤。适宜的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强有力的通风或任何类似的技术。
在孵育期后，随后使纯化的酶与分离的色素和其他杂质分开，并且通过常规分离技术收集，例如过滤、离心、微量过滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微量过滤(cross membrane microfiltration)、交叉流膜微量过滤等。可以通过用水洗涤沉淀物，对纯化的酶沉淀物进一步纯化。例如，用含有金属卤化物沉淀剂的水，或用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水，洗涤该纯化的酶沉淀物。
在发酵期间，AmyWDG195相关淀粉酶累积在培养物肉汤中。为了分离和纯化期望的AmyWDG195相关淀粉酶，可以离心或过滤培养物肉汤以除去细胞，并利用所得的无细胞液体进行酶纯化。在一个实施方案中，使用约70％饱和度的硫酸铵对无细胞肉汤进行盐析；然后将该70％饱和度-沉淀级分溶解在缓冲液中并施加到诸如Sephadex G-100柱等柱中，然后洗脱以回收酶活性级分。为了进一步的纯化，可使用诸如离子交换色谱等常规方法。
纯化的酶可用于洗衣和清洁应用中。例如，它们可以用于洗衣洗涤剂和除斑剂中。可以将它们制成液体(溶液，浆液)或固体(颗粒，粉末)终产物。
更具体的纯化例子在Sumitani，J.等人(2000)Biochem.J.350：477-484中描述，并且在此处简要概括。得自4升变铅青链霉菌TK24培养上清液的酶以80％饱和度(NH4)2SO4处理。沉淀物通过以10,000x g(20分钟和4℃)离心进行回收，并且再溶解于包含5mM CaCl2的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)中。溶解的沉淀物随后针对相同缓冲液透析。透析后的样品随后应用于Sephacryl S-200柱(该柱先前已用20mM Tris/HCl缓冲液(pH7.0)、5mM CaCl2平衡)，并且用相同缓冲液以7cm/小时的线性流速洗脱。收集来自柱的级分，并且通过酶测定试验和SDS-PAGE判断来评价活性。蛋白质如下进一步纯化。用包含5mM CaCl2和1.5M(NH4)2SO4的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡Toyopearl HW55柱(Tosoh Bioscience，Montgomeryville，PA；目录号19812)。用1.5-0M(NH4)2SO4线性梯度(在包含5mM CaCl2的20mM Tris/HCL缓冲液pH 7.0中)洗脱酶。收集活性级分，并且用80％饱和度(NH4)2SO4沉淀酶。沉淀物如上所述进行回收、再溶解且透析。透析的样品随后以60mL/小时的流速应用于Mono QHR5/5柱(Amersham Pharmacia；目录号17-5167-01)，该柱先前用包含5mM CaCl2的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡过。收集活性级分且加入1.5M(NH4)2SO4溶液中。活性酶级分如前在Toyopearl HW55柱上再次层析，以获得通过SDS-PAGE测定为均质的酶。关于该方法和其变型方式的一般讨论，参见J.Sumitani等人，“New type of starch-binding domain：the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp.no.195α-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading，”Biochem.J.350：477-484(2000)。
对于生产规模的回收，可以如上文一般描述的，用聚合物经由絮凝去除细胞，而部分纯化AmyWDG195相关淀粉酶。或者，可以使用可得的膜和设备进行微量过滤随后通过超滤进行浓缩，而纯化酶。然而，对于某些应用，酶无需纯化，可以裂解全肉汤培养物并无需进一步处理而使用之。酶随后可以加工成例如颗粒。
4.清洁组合物
本发明组合物和方法的一个方面是包括AmyWDG195相关淀粉酶作为组分的清洁组合物。AmyWDG195相关淀粉酶可以在洗涤剂组合物中用作组分用于洗手、衣物洗涤、餐具洗涤和其他硬表面清洁。优选地，AmyWDG195相关淀粉酶以洗涤剂中的淀粉酶常规所用的浓度或以接近的浓度，掺入洗涤剂内。例如，AmyWDG195相关淀粉酶可以以相应于0.00001-1mg(计算为纯酶蛋白质)α-淀粉酶/升洗涤/餐具洗液的量加入。示例性制剂在本文中提供，如通过下述例示的：
4.1洗衣洗涤剂组合物
AmyWDG195相关淀粉酶一般可为洗涤剂组合物的组分，作为唯一的酶或与其他酶，包括其他淀粉分解酶，组合。如此，它可以以无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式包括在洗涤剂组合物中。无粉尘颗粒可以例如，按美国专利号4,106,991和4,661,452所公开的那样来生产，并且可任选地由本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如英国专利号1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。其它酶稳定剂是本领域公知的。可按照例如EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，以及提高蛋白质的溶解性。参见例如，Kaushik，J.K.等人(2003)J.Biol.Chem.278：26458-65以及其中引用的参考文献；和Monica Conti，M.等人(1997)J.Chromatography A757：237-245。
洗涤剂组合物可以是任何有用的形式，例如粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂。它也可以是只含有约30％水的压缩凝胶(compact gel)类型的形式。
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂各自可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂将通常包含0％至约50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。组合物也可包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如在WO 92/06154中所述)。
洗涤剂组合物可另外包括一种或多种其他酶，例如，脂肪酶、其它淀粉分解酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶和/或漆酶之任何组合。
洗涤剂可含有约1％到约65％的洗涤剂助剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是未加强的，即基本上不含洗涤剂助剂。可以在与酶的稳定性兼容的任何组合物中使用酶。通常可以用已知的包囊化形式(例如通过造粒或隔离在水凝胶中)来保护酶免于遭遇有害组分。酶且尤其是α-淀粉酶例如AmyWDG195分子(具有或不具有淀粉结合结构域)可以在各种组合物中使用，包括洗衣和餐具洗涤应用、表面清洁、以及用于由淀粉或生物质生产乙醇的组合物中。
洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可含有漂白体系，其可以包括H2O2来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，这可以与形成过酸的漂白活性剂，如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用。或者，漂白体系可包括过氧酸(例如酰胺、亚胺或砜类过氧酸)。漂白体系也可以是酶促漂白体系，例如过水解酶(perhydrolase)，例如国际PCT申请WO 2005/056783中所述的那些。
可使用常规稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳香酯；并且可按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制组合物。
洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或香料。
pH(在使用浓度下于水性溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。
可以配制包括AmyWDG195相关多肽的特定形式的洗涤剂组合物，包括：
1)配制为具有至少600g/L堆密度(bulk density)的颗粒剂的洗涤剂组合物，包括约7％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约2％至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约15％至约22％的沸石(例如NaA1SiO4)；0％至约6％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na3O7/C6H8O7)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0-5％次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。
2)配制为具有至少600g/L堆密度的颗粒剂的洗涤剂组合物，包括约6％至约11％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约24％至约34％的沸石(例如NaA1SiO4)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na3O7/C6H8O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
3)配制为具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约9％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO)；约1％至约3％的皂如脂肪酸(例如C16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na2CO3)；约3％至约9％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约23％至约33％的沸石(如NaA1SiO4)；0％至约4％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约8％TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
4)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na2CO3)；约1％至约5％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约25％至约35％的沸石(例如NaA1SiO4)；0％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
5)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
6)水性结构型液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；3-9％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaA1SiO4)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG，PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(anchoring polymer)(例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
7)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约20％至约40％的沸石(例如NaA1SiO4)；约2％至约8％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂、抑泡剂、香料)。
8)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约14％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约30％至约50％的沸石(例如NaA1SiO4)；约3％至约11％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如C6H5Na3O7)；约1％至约5％的聚合物(例如PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
9)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约6％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约18％至约32％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约5％至约20％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如C6H5Na3O7)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯或PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、香料)。
10)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约23％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的助水溶物(例如甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。
11)水性液体洗涤剂组合物，包括约20％至约32％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；6-12％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如助水溶物、分散剂、香料、荧光增白剂)。
12)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；0％至约5％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约15％至约28％的沸石(NaA1SiO4)；0％至约20％的过硼酸钠(例如NaBO3·4H2O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-3％的次要成分(例如香料、荧光增白剂)。
13)如上面组合物1)-12)所述的洗涤剂组合物，其中所有或者部分的线性烷基苯磺酸盐被(C12-C18)烷基硫酸盐代替。
14)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约9％至约15％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如NaA1SiO4)；约10％至约20％的层状焦硅酸盐(例如来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如Na2CO3)；0％至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。
15)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约4％至约8％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na2CO3)；0％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约13％至约22％的过碳酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-3％的次要成分(例如荧光增白剂、膦酸盐、香料)。
16)上面1)-15)所述的洗涤剂制剂，其含有被稳定化的或包囊化的过酸作为额外组分或者作为已经述及的漂白体系的替代物。
17)上面1)、3)、7)、9)和12)所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。
18)上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的洗涤剂组合物，还含有锰催化剂。锰催化剂例如是Rage等人(1994)Nature 369：637-639中描述的化合物之一。
19)配制成非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，包括液态非离子表面活性剂，例如，线性烷氧基化伯醇、助洗剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。该洗涤剂也可包括阴离子表面活性剂和/或漂白体系。
AmyWDG195相关淀粉酶可以以常规采用的浓度掺入洗涤剂中。目前考虑在洗涤剂组合物中，该酶可以以相应于0.00001-1.0mg(以纯酶蛋白质计)AmyWDG195相关淀粉酶/升洗液的量加入。
在另一个实施方案中，其他酶例如2，6-β-D-果聚糖水解酶可以掺入包括AmyWDG195相关淀粉酶的洗涤剂组合物中，用于去除/清洁家居和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜。
洗涤剂组合物可以例如配制成手洗(人工)或机洗(自动)的洗衣洗涤剂组合物，包括适于预处理污染的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制成用于人工或自动餐具洗涤操作。
在一个特定方面，洗涤剂组合物可以包括2，6-β-D-果聚糖水解酶、以及AmyWDG195相关α-淀粉酶、和一种或多种其它清洁酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、其它淀粉分解酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶、和/或过氧化物酶、和/或其组合。
通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如pH最适、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且酶应以有效量存在。
蛋白酶：适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体，以及天然加工的蛋白质。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如源于猪或牛)和镰孢霉属蛋白酶(参见例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例也包括但不限于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中所述的变体。市售可得的蛋白酶包括但不限于：
Figure BDA0000095426290000421
PrimaseTM、DuralaseTM、
Figure BDA0000095426290000422
和KannaseTM(Novo Nordisk A/S)；
Figure BDA0000095426290000423
MaxacalTM、MaxapemTM、
Figure BDA0000095426290000424
Purafect OxPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International，Inc.)。
脂肪酶：适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰、蛋白酶解修饰或蛋白质改造的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于：来自腐质霉属(Humicola)(与嗜热丝孢菌属同义)的脂肪酶，例如来自疏毛腐质霉(H.lanuginose)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见例如，EP258068和EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如，WO96/13580)；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(参见例如EP 218272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(参见例如，WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(参见例如WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(参见例如Dartois等人，Biochemica et Biophysica Acta，1131：253-360(1993))，嗜热脂肪芽孢杆菌(参见例如JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如WO 91/16422)的脂肪酶。其它可以考虑在制剂中使用的脂肪酶变体包括例如在WO 92/05249、WO 94/01541、WO95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些。一些市售可得的脂肪酶包括
Figure BDA0000095426290000425
和LipolaseUltraTM(Novo Nordisk A/S)。
聚酯酶：适宜的聚酯酶可以包括在组合物中，例如在WO 01/34899和WO 01/14629中描述的那些。
淀粉酶：组合物可以与其它α-淀粉酶，例如非生产增强的α-淀粉酶组合。这些可以包括市售可得的淀粉酶，例如但不限于
Figure BDA0000095426290000431
Figure BDA0000095426290000432
和BANTM(Novo Nordisk A/S)；
Figure BDA0000095426290000433
和
Figure BDA0000095426290000434
(来自Genencor International，Inc.)。
纤维素酶：可以向组合物中加入纤维素酶。适宜的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。适宜的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如如美国专利号4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757和WO 89/09259公开的自特异腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。可以考虑使用的示例性纤维素酶为对于纺织品具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的实例是例如EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397和WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如WO 94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK98/00299；EP 531315；美国专利号5,457,046；5,686,593和5,763,254中描述的那些。市售可得的纤维素酶包括
Figure BDA0000095426290000435
和(Novo Nordisk A/S)；和
Figure BDA0000095426290000438
(Genencor International，Inc.)；以及KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶：考虑用于组合物中的适宜过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶，及其变体如在WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所述的那些。市售可得的过氧化物酶包括例如GuardzymeTM(Novo Nordisk A/S)。
可以通过加入包含一种或多种酶的分开添加剂，或通过加入包括所有这些酶的组合添加剂，将洗涤剂酶(一种或多种)包括在洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，即分开的添加剂或组合添加剂，可以配制为例如颗粒、液体、浆液等。示例性洗涤剂添加剂制剂包括但不限于颗粒，特别是无粉尘颗粒、液体，特别是稳定的液体或浆液。
无粉尘颗粒可以例如，按美国专利号4,106,991和4,661,452所公开的那样来生产，并且可任选地由本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(例如聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如英国专利号1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。可按照例如EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。
洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如条、片、粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂。还考虑含有约30％或更少水的压缩洗涤剂凝胶(compact detergent gel)。洗涤剂组合物可以任选地包括一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子型，包括半极性的，和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。表面活性剂可以以0.1％至60％重量的宽范围量存在。
当在其中包括时，洗涤剂将典型地包含约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸、或皂。
当在其中包括时，洗涤剂通常将包含约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
洗涤剂可含有0％到约65％的洗涤剂助剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可包括一种或多种聚合物。示例性聚合物包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚(乙二醇)(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物)和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
可使用常规稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶(一种或多种)，稳定剂例如多元醇(例如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如硼酸芳香酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)。可按WO92/19709和WO 92/19708所述配制组合物。
目前考虑在洗涤剂组合物中，AmyWDG195相关多肽可以以对应于约0.01-约100mg酶蛋白质/升洗液(例如约0.05-约5.0mg酶蛋白质/升洗液，或0.1-约1.0mg酶蛋白质/升洗液)的量加入。
4.2清洁组合物
在洗涤剂应用中，AmyWDG195相关淀粉酶通常在包含丙二醇的液体组合物中使用。可以通过在包含10％氯化钙的25％体积/体积丙二醇溶液中混合，使酶溶解于例如丙二醇中。
可以将本文讨论的AmyWDG195相关淀粉酶配制在用于清洁餐具的洗涤剂组合物中或其他清洁组合物中。这些可以是粉末、凝胶或液体。组合物可以包括该酶(单独地，或组合其他淀粉分解酶和/或其他清洁酶或漂白活化体系)、和清洁组合物通常的其他组分。
因此，餐具洗涤洗涤剂组合物可以包括表面活性剂。该表面活性剂可以是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性离子型或这些类型的混合。洗涤剂可以含有按重量计0％至约90％的非离子表面活性剂，例如低泡至无泡的乙氧基化丙氧基化直链醇。
洗涤剂组合物可含有无机和/或有机类型的洗涤剂助剂盐。洗涤剂助剂可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1％至约90％的洗涤剂助剂。当存在时，含磷的无机碱性洗涤剂助剂的实例包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和聚磷酸盐。当存在时，含磷的有机碱性洗涤剂助剂的实例包括水溶性膦酸盐。当存在时，不含磷的无机助剂的实例包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及多种类型的水不溶性晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。
适宜的有机助剂的实例包括碱金属；铵和取代的铵；柠檬酸盐；琥珀酸盐；丙二酸盐；脂肪酸磺酸盐；羧基甲氧基琥珀酸盐；聚乙酸铵；羧酸盐；聚羧酸盐；氨基聚羧酸盐；聚乙酰基羧酸盐；和多羟基磺酸盐。
其它适宜的有机助剂包括已知具有助剂性能的高分子量聚合物和共聚物，例如适宜的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，及它们的盐。
清洁组合物可含有氯/溴类型或氧类型的漂白剂。无机氯/溴类型漂白剂的实例是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴类型漂白剂的实例是杂环N-溴和N-氯酰亚胺类，如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸、和二氯异氰脲酸，及其与水增溶性阳离子(如钾和钠)的盐。乙内酰脲化合物也是适宜的。
清洁组合物可含有氧漂白剂，例如以无机过酸盐的形式，任选地与漂白前体一起，或以过氧酸化合物的形式。适宜的过氧漂白化合物的典型实例是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物)，碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和过磷酸盐。示例性活化剂物质是TAED和三乙酸甘油酯。酶促漂白活化体系也可以存在于制剂中，例如过硼酸盐或过碳酸盐、三乙酸甘油酯和过水解酶(参见例如WO 2005/056783)。
可使用常规用于酶的稳定剂来稳定清洁组合物，该稳定剂例如多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳族硼酸酯)。
清洁组合物也可含有其它常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂物质、填充剂物质、消泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、多价螯合剂、防污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。
尽管本组合物和方法已参考下文细节进行描述，但应当理解可以做出各种修改。
4.3评价洗涤剂组合物的方法
存在众多α-淀粉酶清洁测定试验。以下给出测试清洁的示例性描述。
“样片”是其上已经施加了污物的材料，例如织物块。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。样片可以进一步是纸，例如滤纸或硝酸纤维素，或硬材料块，例如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但可以包括血、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、干酪、粘土、色素、油或这些化合物的混合物。
“小样片”是已用单孔打孔装置切割、或已用定制的96孔打孔装置切割(其中该多孔打孔模式与标准96孔微量滴定板匹配)的样片部分，或该部分已以其他方式从样片上取下。该样片可以是纺织品、纸、金属或其他合适材料。小样片可以在被置于24、48或96孔微量滴定板的孔内之前或之后附着污渍。“小样片”还可以通过将污渍应用于小块材料进行制备。例如，小样片可以是直径5/8″或0.25″的染污织物块。可以设计定制打孔机，使得它将96个样片同时递送至96孔板的所有孔。通过简单地多次装载相同96孔板，该装置允许递送超过一个样片/孔。多孔打孔装置可以设想为将样片同时递送至任何形式的板，包括但不限于24孔、48孔和96孔板。在另一种可以想到的方法中，污染的测试平台可以是由被污垢底物包被的金属、塑料、玻璃、陶瓷或其他适宜材料制成的珠。一个或多个包被珠随后置于包含适宜的缓冲液和酶的96、48或24孔板或更大格式的板的孔内。在这种情况下，可以通过直接吸光度测量或在二次显色反应后，就释放的污垢检查上清液。所释放的污垢的分析也可以通过质谱分析进行。其它的微量筛选试验可以是将样片例如靛蓝染色的粗斜棉布递送且固定至多孔板的孔，并且加入颗粒例如砂粒或较大颗粒，例如过筛以包括6-8或9号规格(gauge)颗粒的石榴石，并且搅拌板以便促使样片被加入的颗粒磨损。这个试验已经用于评价在石洗应用中的纤维素酶。酶的有效性可以通过释放至反应缓冲液的颜色(例如释放的靛蓝溶解于二甲亚砜中，并且测量在A600nm的吸光度)，或通过对磨损样片的反射度测量，进行判断。
当例如未处理的BMI(血/乳/墨)样片在不含漂白剂的洗涤剂中洗涤时，大部分墨甚至无蛋白酶的帮助也可释放。加入蛋白酶导致墨释放的小量增加，这在大本底上可以是难以定量的。本发明组合物和方法提供了允许控制污渍的固着程度的处理方案。因此，可以产生例如当在不存在待测试的酶的情况下洗涤时释放变化量污渍的样片。固着样片的使用导致在洗涤测定试验中信噪比的急剧改善。此外，通过改变固着程度，可以产生在不同的清洁条件下给出最佳结果的污渍。
在各种材料类型上具有已知“强度”的污渍的样片是市售可得的(EMPA，St.Gallen，瑞士；wfk-Testgewebe GmbH，Krefeld德国；或Center for Test Materials，Vlaardingen，荷兰)和/或可以由从业者制得(Morris和Prato，Textile Research Journal 52(4)：280286(1982))。其他测试样片包括但不限于在含棉织物上的血/乳/墨(BMI)污渍、在含棉织物上的菠菜污渍、或在含棉织物上的草污渍、和在含棉织物上的巧克力/乳/烟灰。
可以用0.0003％至0.3％的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。其他组合包括用0.001％-1％戊二醛固着的草或菠菜、用0.001％-1％戊二醛固着的明胶和考马斯染料、或用0.001％-1％戊二醛固着的巧克力、乳和烟灰。
也可以在用酶和/或洗涤剂制剂孵育期间搅拌样片。洗涤性能数据取决于孔中，尤其是在96孔板中的样片的取向(水平对垂直)。这表明在孵育期间混合是不充分的。尽管存在许多方式来保证孵育期间充分的搅拌，但可以构建将微滴定板夹在两个铝板之间的板夹。这可以简单地实现，例如在孔上方放置粘性板密封物，然后用任何类型的合适的、市售可得的夹子将两个铝板与96孔板夹紧。然后可以将它放到商品化的孵育摇床中。将摇床设定为约400rpm可以导致非常有效的混合，而板夹有效地阻止了泄漏或交叉污染。
可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来量化洗液中的氨基基团浓度。这可以用作从样片中去除的蛋白质量的量度(参见例如Cayot和Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200(1997))。然而，如果洗涤剂或酶样品导致异乎寻常小的肽片段的形成(例如，因样品中存在肽酶所致)，那么将获得较大的TNBS信号，即更多“噪音”。
另一用于测量对血/乳/墨或其他污渍的洗涤性能的手段是基于墨释放的方法。在样片上的蛋白质的蛋白酶解导致墨颗粒的释放，这可以通过测量洗液的吸光度而量化。吸光度可以在350和800nm之间的任何波长测量。吸光度可以在410nm或620nm测量。也可以检查洗液以确定对于含有草、菠菜、明胶或考马斯染料的污渍的洗涤性能。对于这些污渍，示例性波长包括对于菠菜或草的670nm和对于明胶或考马斯染料的620nm。例如，移出等份试样的洗液(例如，通常来自96孔微板的100-150μL)并放到小杯或多孔微板中。然后将它放到分光光度计中并在适当的波长读取吸光度。
也可以使用该体系，例如通过使用在诸如布、塑料或陶瓷的适宜载污体上的血/乳/墨污渍，测定用于餐具洗涤的增强的酶和/或洗涤剂组合物。
在一个方面，可以通过在25℃将0.3％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟或通过在60℃将0.03％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟，在棉上固着BMI污渍。从BMI/棉样片上切下约0.25″的小样片并放入96孔微滴定板的孔中。向各孔中放入已知的洗涤剂组合物和酶的混合物。向微滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微滴定板与铝板夹在一起，并在定轨摇床上以约250rpm搅拌约10-60分钟。这个时间结束后，将上清液转移到新的微滴定板的孔中并测量620nm的墨吸光度。这可以类似地用于检测通过在25℃向菠菜/棉样片或草/棉样片施加0.01％戊二醛30分钟而固着在棉上的菠菜污渍或草污渍。这也可以用于巧克力、乳和/或烟灰污渍。
为了方便阅读，本申请被组织成多个章节；然而，读者应当理解在一个章节中做出的陈述可以应用于其他章节。因此，用于本公开内容的不同章节的标题不应解释为限制性的。
为了进一步举例说明本发明组合物和方法及其优点，给出下述具体实施例，应当理解它们是举例说明性而不是限制性的。
实施例
实施例1
自变异盐单胞菌(Halomonas variabilis)
WDG195表达文库鉴定变异盐单胞菌WDG195α-淀粉酶
菌株WDG195得自Grant教授，University of Leicester，UK。该菌株从美国加利福利亚Mono湖岸上的苏打土(soda soil)中分离。16S rRNA基因的部分测序(429bp)指出该菌株属于物种变异盐单胞菌。该部分16SrRNA基因序列显示于SEQ ID NO：2中。
变异盐单胞菌WDG195的细胞在碱性培养基上培养，例如使用根据Duckworth等人，FEMS Microbiology Letters 19(1996)181-191的方法。使用来自Epicentre(http://www.epibio.com/item.asp？id＝429)的MasterPure革兰氏阳性DNA纯化试剂盒，按照制造商的方案(http://www.epibio.com/pdftechlit/209pl085.pdf)，制备基因组DNA(＞4μg)。所得到的基因组DNA由Eurofins Medigenomix GmbH(Martinsried，德国)用于构建表达文库。通过随机剪切，获得3-5kb片段，并且将片段克隆到低拷贝数载体pRANGER-BTB3-Cat(LucigenCorporation，Middleton，WI USA，DQ058731)内(图1)。该载体首先由Medigenomix修饰用于TA鸟枪法克隆。
将连接混合物转化到电感受态TOP10大肠杆菌细胞(InvitrogenCarlsbad，CA，USA)内，并且在RBB板上铺平板。这些琼脂板包含每升10g酵母提取物、16g胰蛋白胨、5g NaCl、15g琼脂、25mg氯霉素和5g由Remazol亮蓝R染色的淀粉(Fluka/Sigma-Aldrich Chemie B.V.，Zwijndrecht，荷兰)。选择在RBB板上形成晕圈的大肠杆菌克隆用于进一步分析，所述晕圈指示存在源自变异盐单胞菌WG195的淀粉酶基因。插入片段由Baseclear(Leiden，荷兰)，使用与pRANGER载体杂交的引物pRANGER-FW(SEQ ID NO：3)和pRANGER-RV(SEQ ID NO：4)进行测序。基于此最初序列分析，使用4个内部引物(SEQ ID NO：5、6、7和8)测定amyWDG195基因的全序列(SEQ ID NO：9)。amyWDG195基因编码502个氨基酸的前体蛋白质(SEQ ID NO：10)。前体蛋白质由22个氨基酸的信号肽(SEQ ID NO：11)和480个氨基酸的成熟蛋白质(AmyWDG195，SEQ ID NO：12)组成。通过NCBI执行的Blast搜索结果提示，AmyWDG195属于α-淀粉酶超家族(图2)，其最近的邻居是来自芽孢杆菌属物种KSM-K38的AmyK38，它与之共享79％序列同一性。
实施例2
变异盐单胞菌WDG195α-淀粉酶的蛋白质表达
为了在枯草芽孢杆菌中表达AmyWDG195淀粉酶，基于pHPLT载体制备表达构建体/质粒，所述pHPLT载体包含地衣芽孢杆菌的热稳定淀粉酶LAT启动子(pLAT)和LAT信号肽(pre LAT)，随后为PstI和HpaI限制位点以利于克隆(图3；参见例如，美国专利号5,871,550和6,562,612；美国专利公开号20060014265；和Solingen等人(2001)Extremophiles5：333-341)。
使用来自Epicentre(http://www.epibio.com/item.asp？id＝429)的MasterPure革兰氏阳性DNA纯化试剂盒，根据制造商的方案(http://www.epibio.com/pdftechlit/209pl085.pdf)，由过夜培养物(37℃，Tryptic Soy Broth)的1ml细胞沉淀物，制备盐单胞菌属菌株WDG195基因组DNA。用Phusion High Fidelity DNA聚合酶(Finnzymes OY，Espoo，芬兰)，根据制造商的说明书(退火温度55℃)，在MJ Research PTC-200热循环仪上，执行PCR，由基因组DNA样品扩增amyWDG195淀粉酶基因。使用的2种引物是：PstI-Amy195-I-Fw(SEQ ID NO：13)和HpaI-Amy195-Rv(SEQ ID NO：14)。
所得到的PCR片段用限制性酶PstI和HpaI消化，并且在T4DNA连接酶的存在下根据供应商的说明书(Roche Applied Science，Indianapolis，IN，USA)与pHPLT DNA(50ng/μl，也用PstI和HpaI消化)一起孵育。将连接混合物转化到枯草芽孢杆菌菌株BG6006内，该菌株缺失9种蛋白酶(即，degUHy32，oppA，DspoII3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC，DaprE，DnprE，Depr，DispA，Dbpr，Dvpr，DwprA，Dmpr-ybfJ，DnprB)[参见例如美国专利公开号20050202535和20020182734(WO 02/14490)]。将转化混合物铺平板到DifcoTM Heart Infusion琼脂板上，所述板包含10mg/L新霉素和0.5％由Remazol亮蓝R染色的淀粉。选择淀粉-晕圈阳性菌落，并且使用菌落PCR和测序，证实pHPLT中AmyWDG195淀粉酶基因的存在。对于菌落PCR，将经转化的细菌重悬浮于100μL无菌水中，其中1μL在包含Invitrogen Platinum Taq DNA聚合酶和2种引物：pHPLT-F1(SEQ ID NO：15)和pHPLT-R1(SEQ ID NO：16)的PCR反应中使用。
PCR在95℃执行2分钟，随后为在95℃0.5分钟、55℃1分钟和68℃2分钟的25个循环。反应在68℃最后孵育5分钟后终止。PCR产物使用引物pHPLT-F1(SEQ ID NO：15)，pHPLT-R1(SEQ ID NO：16)和Amy195.int.-Rv(SEQ ID NO：17)在BaseClear(Leiden，荷兰)测序。
序列分析证实在pHPLT-AmyWDG195载体中AmyWDG195淀粉酶编码序列的存在。
具有pHPLT-AmyWDG195载体的枯草芽孢杆菌转化体在包含25mlMBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基：Neidhardt等人(1974)J.Bacteriol.，119：736-747)和10mg/L新霉素的摇瓶中生长。该生长导致具有淀粉水解活性的分泌AmyWDG195淀粉酶的产生。将额外的NaCl加入生长培养基中，增加分泌和活性的AmyWDG195蛋白质的产生，如下表中所示。
  生产培养基   相对淀粉酶表达
  MBD   1x
  +1％NaCl   9x
  +2％NaCl   16x
  +3％NaCl   35x
实施例3
AmySWT282的鉴定、克隆和表达
从嗜碱性芽孢杆菌菌株SWT282(在碱性番茄泥琼脂上从Dr.DimitriSorokin(Inst.of Microbiology，Moscow，俄罗斯)提供的样品中分离)，该样片收集自俄罗斯的Novosibirsk地区Karasuk周围的Kalunda Steppe(北方))，鉴定到类似于AmyWDG195(～78％氨基酸同一性)的淀粉酶(AmySWT282)。最初，使用简并引物DVVMNH-正向(5′-GAYGTNGTNATGAAYCAY-3′；SEQ ID NO：25；编码128种可能氨基酸序列)和VTFVDNHD-反向(5′-TCRTGRTTITCIACRAANGTNAC-3′；SEQ ID NO：26；编码256种可能氨基酸序列)，从该菌株的基因组DNA中扩增AmySWT282基因的小片段。2μL基因组DNA模板和每种引物各1μM(终浓度)与水和PCR珠(GE Healthcare)混合至25μL的终体积。循环条件如下：95℃，4′；95℃1′；50℃，1′；72℃，1′30″；72℃，5′；4℃。扩增了大致700bp的短DNA片段(在1.2％琼脂糖凝胶上显现)，且测序。这个片段的DNA序列作为SEQ ID NO：18显示于图9中。BlastX搜索证明这个片段确实编码α-淀粉酶片段。
为了鉴定尽可能多的AmySWT282淀粉酶基因，设计与预测的AmySWT282淀粉酶基因片段的N和C末端接近的简并引物，具体地，对应于N末端MMQ F/Y FEW基序的简并正向引物(5′-ATGATGCARTWYTTYGARTGG-3′；SEQ ID NO：27；编码32种可能氨基酸序列)和对应于C末端VTIN G/A DGWG E/N F基序的反向引物(5′-AAITYICCCCAICCRTCNSCRTTNGTNAC-3′；SEQ ID NO：28)或NGGSVSVYVN基序(5′-TTIACRAAIACISWIACISWICCNCCRTT-3′；SEQ ID NO：29)(图9)。使用MMQFEW正向引物分别与上文列出的各反向引物组合，设置简并PCR反应。2μL基因组DNA模板和1μM每种引物(终浓度)与水和PCR珠(GE Healthcare)组合至25μL的终体积。循环条件如下：95℃，4′；95℃1′；50℃，1′；72℃，1′30″；72℃，5′；4℃。在1.2％琼脂糖凝胶上分析了PCR反应的2.5μl样品。正向MMQFEW和反向VTINGDGWGEF引物在凝胶上产生1.4kb条带。
条带使用Qiagen凝胶纯化试剂盒进行凝胶纯化，并且DNA洗脱在35μl缓冲液EB中。在室温使用30分钟
Figure BDA0000095426290000541
克隆反应(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，将4μl纯化片段克隆到PCR2.1
Figure BDA0000095426290000542
载体内。将2.5μl反应物转化到50μlTop 10化学感受态细胞内。在冰和热休克后，将250μlSOC培养基加入细胞中，并且使样品在37℃振荡1小时。在1小时后，将200μl细胞悬浮液铺平板到包含100ppm羧苄青霉素的IPTG-X-gal板上，并且使板在37℃孵育过夜。从X-gal板中挑出4个白色菌落，并且与TOPOF(5′-cactttatgcttccggctcgtatg-3′；SEQ ID NO：40)和TOPO R引物(5′-TCGCCATTCAGGCTGCGCAACTG-3；SEQ ID NO：41)一起用于菌落PCR。3个菌落产生期望的1.7kb条带，用TOPO seq F和R引物进行测序。此程序扩展了AmySWT282基因的编码基因的序列信息。
为了获得有关全长amySWT282基因的更多序列信息，基于扩展的序列信息设计了下述4种引物。这些引物在2个不同PCR反应中使用，并且设计用于与Takara LA体外克隆试剂盒(Takara Bio USA，Madison，WI)一起使用。
N-端SWT282引物2(SEQ ID NO：30)
5′-CTAAATCATACAAGTCATAGGCACCATAGCCGAC-3′
N-端SWT282引物1(SEQ ID NO：31)
5′-GCAGCTCCTGCTTTGTGCCGTACTTCGTG-3′
C-端SWT282引物2(SEQ ID NO：32)
5′-GACCACTGGGATATCGTTGGTTGGACGAG-3′
C-端SWT282引物1(SEQ ID NO：33)
5′-CACGCACGGATTATTCTTACGGCACACAG-3′
遵循制造商的方案，用XbaI消化AmySWT282基因组DNA，并且与XbaI盒连接。针对基因的N端部分的第一PCR反应用引物282N3(5′-TACGCCGTTAAAATGGTACCAGTGCCAG-3′；SEQ ID NO：36)+试剂盒引物C1执行，而C端PCR反应使用引物282C1(5′-cacgcacggattattcttacggcacacag-3′；SEQ ID NO：37)+试剂盒引物C1执行。PCR产物在凝胶上证实，并且在用作模板用于在相应末端上进行巢式PCR反应前，稀释10-1、10-2和10-4。N端巢式PCR反应使用引物对282N5(5′ATTCACCTGCACCGCATCCACCGCTTCGG 3′；SEQ IDNO：38)+试剂盒引物C2，而C端巢式PCR反应使用引物对282C2(5′-gaccactgggatatcgttggttggacgag-3′；SEQ ID NO：39)+试剂盒引物C2。所得到的PCR产物进行凝胶纯化，并且连接到Topo TA载体内，随后转化到50μlTop 10化学感受态细胞内。各挑选出4个菌落与引物Topo F和TOPO R(上文描述)一起用于PCR，并且测序PCR产物。这导致SWT282淀粉酶基因的新序列信息。
通过直接测序芽孢杆菌菌株SWT282的基因组DNA(Fidelitysystems，Cessna Avenue，Gaithersburg，MD)，寻回amySWT282基因的最后一段序列信息，从而完成amySWT282基因的序列。全长amySWT282基因和AmySWT282(前体)蛋白质序列分别显示为SEQ ID NOs：19和NO：22。AmySWT282具有信号肽(SEQ ID NO：21和NO：24)，并且因此是细胞外蛋白质。成熟的AmySWT282多肽具有479个氨基酸残基(SEQ IDNO：23)，并且由SEQ ID NO：20的多核苷酸编码。成熟的AmySWT282多肽显示与来自地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的中等同源性(＜61％同一性)。
如实施例2中针对amyWDG195描述的，将amySWT282基因克隆到pHPLT枯草芽孢杆菌表达载体内。具有pHPLT-AmySWT282的枯草芽孢杆菌转化体在包含MBD培养基的摇瓶中生长，所述MBD培养基具有10mg/L新霉素、20mM额外CaCl2、且具有和不具有额外的NaCl(3％)。在72小时生长后，通过SDS-PAGE分析培养上清液(图6)。额外NaCl向生长培养基的添加对于AmySWT282生产是必需的，与就AmyWDG195所观察到的一样。相比之下，CaCl2的添加对AmySWT282的异源表达未显示有益影响。
实施例4
清洁测定试验
来自生长在MBD培养基中的pHPLT-AmyWDG195载体转化细胞(实施例2)的培养物上清液，在96孔CS28橙染色的米淀粉污染织物样片微量应用清洁测定试验中，分析活性。使用织物打孔机，从CS28着色米淀粉染污的织物样片上切下1/4英寸盘。该淀粉包括结合的指示剂染料，以利于追踪(Test Fabrics目录号CS-28；Center for Test Materials，Vlaardingen，荷兰)。在平底96孔测定板的每个孔中放置2个盘片。
对于α-淀粉酶清洁测定试验，将预先选择的缓冲液加入孔中，且平衡至预先选择的温度。对于初始测试，缓冲液是25mM HEPES(pH 8.0)或25mM CAPS(pH 10.0)，另外包含2mM CaCl2和0.0005％TWEEN 80。约200μL缓冲液加入不同孔，并且允许在40℃平衡。10-20μL稀释的培养上清液溶液(淀粉酶终浓度0ppm-2ppm)加入选择的孔中，并且使板在1150rpm振荡孵育1小时。酶清洁性能基于依赖于酶而释放到洗液内的颜色的量来确定。通过将100μL最终洗液转移至新鲜微量滴定板中，在488nm分光光度计定量颜色释放。借助于来自Erithicus Software的Grafit，对数据作图。数据点用Langmuir等温拟合算法进行拟合，所述算法与Michaelis-Menten拟合算法采用相同的形式。
这个测定试验的结果证实，AmyWDG195在40℃在pH 8.0高度有效地从纺织品样片去除淀粉质污渍，但在pH 10.0效率稍低(图4和5)。
实施例5
关于α-淀粉酶活性的Megazyme测定试验
使用经改良用于96孔微量滴定板的Ceralpha法(MegazymeInternational，爱尔兰)，测定来自生长在MBD培养基上的转化细胞(实施例2)的AmyWDG195培养上清液的α-淀粉酶活性。25μl封闭的对硝基苯基麦芽庚糖苷(＝BPNPG7)底物，5.45mg/mL(Amylase HR Reagent，Catalogue Number R-AMHR4Megazyme International)，加入每个孔中，并且在25℃预平衡10分钟。将稀释的培养上清液(25μl)转移到孔内，并且与底物混合。稀释在具有50mM NaCl和0.1mM CaCl2的50mM MOPS缓冲液pH 7.15中执行。
板在650rpm振荡下在温箱(iEMS，Labsystems)中孵育30分钟，并通过将50μl200mM硼酸/NaOH，pH 10.2溶液加入每个孔中终止反应。400nm的吸光度指示在稀释样品中的α-淀粉酶水平。
本文引用的所有参考文献为了所有目的整体并入本文作为参考。

Claims (16)

1.一种分离的多肽，其具有α淀粉酶活性，其为SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
2.权利要求1的多肽，其中所述活性不依赖于钙。
3.一种培养的细胞，其包括权利要求1-2中任一项的多肽。
4.一种组合物，其包括权利要求1-2中任一项的多肽。
5.权利要求4的组合物，其中所述组合物是清洁组合物。
6.权利要求5的组合物，其中所述组合物对于去除衣物、餐具或纺织品上的淀粉性污渍有效。
7.一种用于从表面上去除淀粉性污渍的方法，其包括
在包括有效量的权利要求1或2的多肽的水性组合物的存在下孵育所述表面，
允许所述多肽水解淀粉性污渍中存在的淀粉组分，以产生溶解于水性组合物中的较小淀粉衍生分子，
从而从所述表面去除所述淀粉性污渍。
8.权利要求7的方法，其中所述孵育在不存在钙的情况下进行。
9.权利要求7的方法，其中所述孵育在钙螯合剂存在下进行。
10.权利要求7的方法，其中所述表面是纺织品表面。
11.一种用于表达具有淀粉酶活性的多肽的方法，其包括：
构建包括与编码信号序列的多核苷酸连接的编码权利要求1或2的多肽的多核苷酸的表达载体；
将所述表达载体引入宿主细胞内，
在至少1％NaCl的存在下表达所述多肽，
回收所表达的多肽。
12.权利要求11的方法，其中在至少2％NaCl的存在下执行所述多肽的表达。
13.权利要求11的方法，其中在至少3％NaCl的存在下执行所述多肽的表达。
14.权利要求11的方法，其中在1％NaCl存在下表达的多肽量是在未添加NaCl的基础培养基中表达的量的至少5倍。
15.权利要求12的方法，其中在2％NaCl存在下表达的多肽量是在未添加NaCl的基础培养基中表达的量的至少20倍。
16.权利要求11的方法，其中在1％NaCl存在下表达的多肽量是在未添加NaCl的基础培养基中表达的量的至少20倍。
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