CN101883841A - 具有增强的热稳定性和/或减少的钙依赖性的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体 - Google Patents

Abstract

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体显示出改善的酶学性能，包括增强的热稳定性和减少的钙依赖性。包含所述变体的组合物可用于淀粉加工、淀粉液化、发酵、淀粉糖化、清洁、洗衣、织物脱浆、烘焙和生物膜去除的方法中。还公开了编码所述变体的核酸。

Description

具有增强的热稳定性和/或减少的钙依赖性的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体

序列表

同时附有序列表，该序列表包含SEQ ID NOS：1-6，在此以其整体引入作为参考。

发明领域

公开了核酸和其编码的多肽。所述多肽具有α-淀粉酶活性，其中的多肽是芽孢杆菌α-淀粉酶(特别是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)的修饰形式，并且与所述的亲本α-淀粉酶相比，该多肽在至少一种下述性质中显示出改变：底物特异性、底物结合、底物切割模式、热稳定性、pH活性谱、pH稳定性谱、氧化稳定性、钙离子依赖性、减少和增加的pI和改善的清洗表现、比活性、如高温和/或低pH条件下，尤其是低钙浓度下的稳定性。

此处描述的多肽适用于淀粉加工、乙醇生产、洗涤剂开发、餐具(dish)洗涤、硬表面清洁、织物脱浆和/或甜味剂生产。

背景

淀粉由直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混合物组成。直链淀粉由α-1，4-连接的葡萄糖单元的线性链组成，分子量(MW)大约在60000到800000。支链淀粉是含有相同的α-1，4-连接的葡萄糖单元以及每24-30个葡萄糖单元α-1，6分支点的分支多聚体，其分子量可高达1亿。

来自淀粉的浓缩葡萄糖浆形式的糖，目前是以酶催化的方法生产，该方法包含(1)用α-淀粉酶将固态淀粉液化(或减薄)成平均聚合程度约为7-10的糊精；和(2)用淀粉葡糖苷酶(又称葡糖淀粉酶)将所得的液化淀粉(即淀粉水解物)糖化。所得的糖浆有高的葡萄糖含量。许多商业生产的葡萄糖浆随后用酶进行异构化，成为称作异构糖浆的葡萄糖/果糖混合物。

α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)通过随机切割内部的α-1，4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关的多糖。这些酶有一些重要的商业应用，包括淀粉液化、织物脱浆、纸和纸浆工业中的淀粉改性、谷物加工、烘焙和酿造。α-淀粉酶也可使用在自动餐具清洗洗涤剂和洗衣用洗涤剂制剂(包含含有漂白剂的洗涤剂)里，用于在清洗中去除淀粉污渍。

α-淀粉酶可从品种多样的细菌、真菌、植物和动物来源中分离出来。许多工业上很重要的α-淀粉酶分离自芽孢杆菌属物种(例如地衣芽孢杆菌)，其部分原因是芽孢杆菌具有很强的将淀粉酶分泌到培养基中的能力。虽然地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可以经济地生产出来，但是在一些应用中这种酶并不像其他α-淀粉酶那样表现良好，即使地衣芽孢杆菌α-淀粉酶跟这些α-淀粉酶有显著的结构同源性。近年来已经有一些尝试，去构建在特定用途(如淀粉液化和织物脱浆中)有改善性质的α-淀粉酶变体。

工业中存在对可应用在包括商业液化过程等多种用途中的淀粉酶进行鉴定和优化的需要。与如来自地衣芽孢杆菌的工业标准酶相比，这些第二代酸性淀粉酶将提供改善的生产和/或性能特征。因此，仍存在对α-淀粉酶变体的需要，该变体与相应的亲本α-淀粉酶(即未突变的α-淀粉酶)相比，具有α-淀粉酶活性，并且在至少一种上面提到的性质中，显示出相对于所述亲本α-淀粉酶的改变。

概述

一方面考虑亲本地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，其中该变体具有与SEQ ID NO：4有至少约90％序列同一性的氨基酸序列，并包含与SEQ IDNO：4相应的S239的替换，并且其中所述的变体显示出α-淀粉酶活性。该变体可包含SEQ ID NO：2，备选地，该变体可基本上由SEQ ID NO：2组成或由SEQ ID NO：2组成。该变体可以是S239Q或S239A任意一种的S239替换。另一方面考虑一种变体，该变体与SEQ ID NO：4至少有约95％的序列同一性或至少有约98％的序列同一性。

另一方面考虑与SEQ ID NO：4的α-淀粉酶相比，具有改变的熔点的变体。

备选地，考虑的变体可不需要额外的钙。

另一方面考虑分离的核酸，该核酸编码亲本地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，其中所述的变体有与SEQ ID NO：4相应的S239的替换，并且与SEQ ID NO：4有至少约90％的序列同一性，并且其中所述的变体显示出α-淀粉酶活性。分离的核酸可包含SEQ ID NO：2，或者是编码任意一种前面和此处讨论的变体的核酸。另一方面考虑载体，该载体含有以有效连接形式的核酸。在另外的方面，考虑核酸在宿主细胞里，可能在宿主细胞里包含所述核酸的载体中。宿主细胞可以是细菌或真菌。细菌可以是革兰氏阳性细菌，其选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、浅青紫链霉菌和鼠灰链霉菌；或者革兰氏阴性细菌，其中所述的革兰氏阴性细菌是大肠杆菌和假单胞菌。

另一方面考虑用于液化淀粉的组合物，该组合物包含以上或此处讨论的变体，其中所述的组合物在溶液中。另外的实施方案考虑液化淀粉的方法，该方法包含向研磨的玉米或淀粉浆中施用组合物，维持足够液化所述淀粉的时间。可以以40-60μg/g干固体向研磨的玉米或淀粉浆添加该组合物。淀粉溶液可以是玉米淀粉溶液。另外的方面考虑在约85℃到约105℃下液化淀粉浆。备选地或附加地，在约pH 4.5到约pH 6.5下液化淀粉浆。液化物可进一步发酵来生产乙醇。另外考虑的是发酵步骤至少比野生型多产生约2.5％v/v的乙醇。另外，与商业相关地，所述液化和所述发酵步骤可在同一反应容器中同时进行。这可在存在钙的情况下进行，但也可以在不向反应混合物中添加额外钙的情况下进行。

另一方面，考虑使用任意一种前面或此处讨论的变体来糖化淀粉的组合物。糖化淀粉的方法考虑施用含有变体的组合物，维持足够糖化所述淀粉的时间。不必须添加额外的钙。

另一方面考虑洗涤剂添加剂。洗涤剂添加剂可包含以上或此处讨论的变体。洗涤剂添加剂可另外包含酶，该酶选自：纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶(pectinolyticenzyme)、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶和角叉菜胶酶或其组合。洗涤剂添加剂还可以以非粉化颗粒、微粒、稳定化液体或受保护酶的形式存在。

另一方面考虑洗涤剂组合物(用于清洁表面、洗衣和餐具清洗)。考虑的洗涤剂组合物可包含以上和此处讨论的洗涤剂添加剂。其还可包含一种或多种酶，这些酶选自：纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶和角叉菜胶酶或其组合。洗涤剂组合物可以进一步以上面任意组合包含表面活性剂。洗涤剂组合物还可包含一种或多种表面活性剂、洗涤剂助洗剂、络合剂、聚合物、漂白系统、稳定剂、起泡剂、抑泡剂、防蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶助长剂、明亮剂、织物柔顺剂(fabric conditioner)和香料。

另一个考虑的方面是水溶液中的织物脱浆组合物，该组合物包含以上或此处讨论的变体，任选地，包含另一种酶。同时考虑的是将织物脱浆的方法，该方法包括施用脱浆组合物，维持足够使所述织物脱浆的时间。该方法不需要加入额外的钙。

另外考虑的方面是包含以上或此处讨论的变体的淀粉加工组合物。淀粉加工组合物还可包含葡糖淀粉酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、植酸酶或其组合。可利用淀粉加工组合物来加工淀粉，可通过施用组合物足够时间以加工所述淀粉。不需要加入额外的钙。

另外的方面考虑烘焙组合物，该组合物包含以上或此处描述的变体。另一个方面考虑使用所述组合物的烘焙方法，该方法包括施用烘焙组合物。

附图简述

引入附图并且其构成本说明书的部分，图解实施方案。图中：

图1描述用于产生LAT S239变体的质粒pHPLT-LAT。

图2描述在95℃30分钟的热胁迫后LAT S239变体的百分比残留活性。垂直轴代表热胁迫后的残留活性百分比。虚线代表野生型LAT现有残留活性标准差以上的2X和3X。S239Q和S239A变体都显示出相对于野生型LAT增强的热稳定性。观察到的热稳定性增强是统计学上显著的。

图3描述缓冲液中与亲本野生型LAT相比较的LAT S239Q变体的残留活性。通过将百分比剩余淀粉酶活性对反应时间和反应pH作图，来产生该图。参考实施例3。

图4描述与底物中亲本野生型LAT相比较的LAT S239Q变体的残留活性。通过将百分比剩余淀粉酶活性对反应时间和反应pH作图，来产生该图。参考实施例3。

图5描述与亲本野生型LAT相比较的LAT S239Q变体的pH谱。通过将百分比剩余淀粉酶活性对反应pH作图来产生该图。参考实施例3。

图6描述与野生型LAT相比较的LAT S239Q变体的温度谱。通过将全部还原糖(作为淀粉酶反应的产物)对反应温度作图来产生该图。参考实施例3。

图7描述108℃和115℃下，与使用Fred相比，使用LAT S239Q变体处理的全研磨玉米的DE进展。通过将观察到的DE值对二次液化时间作图来产生该图。参考实施例6。

图8描述多种pH下，与使用Fred相比，使用LAT S239Q变体来处理全研磨玉米的DE进展。通过将观察到的DE值对二次液化时间作图来产生该图。参考实施例6。

图9描述pH5.6和低钙条件下，与使用Fred相比，使用LAT S239Q变体来处理全研磨玉米的DE进展。通过将观察到的DE值对二次液化时间作图来产生该图。参考实施例6。

详述

1.定义和缩写

根据这一详述，应用以下缩写和定义。应该注意，如此处所用，除非另有明文说明，单数形式包含复数指代。所以，例如，提及“多肽”包含多种多肽，同时，提及“制剂”包含提及一种或多种制剂和其中本领域人员已知的其等同物，等等。

除非另有定义，此处所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员的一般理解相同的意义。以下提供下述术语。

1.1.定义

“淀粉”表示包含植物复杂多糖碳水化合物的任意物质，该碳水化合物包含分子式为(C₆H₁₀O₅)_x(其中X可为任意数字)的直链淀粉和支链淀粉。特别地，该术语表示任意基于植物的物质，该物质包含但不限于谷物、草、块茎和根，更特别地，包括但不限于小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸、木薯、粟、马铃薯、红薯和木薯淀粉。

“淀粉酶”表示能够催化淀粉降解的酶。“淀粉酶”包含任意淀粉酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和芽孢杆菌属，特别是地衣芽孢杆菌的野生型α-淀粉酶。淀粉酶是切割淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。通常，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为在淀粉分子内以随机方式切割α-D-(1→4)O-糖苷键的内部作用酶。相反，外部作用的淀粉分解酶，如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异的淀粉酶(如产麦芽糖的α-淀粉酶(EC 3.2.1.133))从底物的非还原端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)和产物特异的淀粉酶可从淀粉产生特定长度的麦芽糖寡糖。

“变体”是指多肽和核酸两者。术语“变体”可与术语“突变体”互换使用。变体包括在亲本序列的氨基酸或核苷酸序列的一个或多个位置上的插入、替换、颠换、截短和/或倒置。变体核酸可包括序列，该序列和能够与此处给出的核苷酸序列进行杂交的序列是互补的。例如，变体序列与以下序列互补，该序列在严格条件(例如，50℃和0.2X SSC{1X SSC＝0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下能够与此处给出的核苷酸序列杂交。更特别地，术语变体包含序列，该序列和在高度严格条件(例如，65℃和0.1X SSC)下能够与此处给出的核苷酸序列杂交的序列是互补的。

“分离的”表示序列至少基本上没有至少一种其他组分，该组分与该序列天然结合并可在自然中找到。

“纯化的”表示处于相对纯净状态的物质，例如，至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯或者至少约99％纯。

“热稳定的”表示酶比参照酶更加热稳定。本申请中，如果在同一实验条件(例如同一温度、底物浓度等)下特定时间间隔后，变体有相对较高的酶活性，那么α-淀粉酶变体就比野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶更加热稳定。备选地，与参照酶相比更加热稳定的酶有更高的热容量，该热容量用示差扫描量热法测定。

多肽的“解链温度”是50％多肽样品完全变性时的温度。

“钙依赖性”表示存在对添加额外的钙的需要，以便酶在指定应用中工作。

“pH范围”表示pH值，在该pH值以上或以下酶显示活性。

如此处所用，“pH稳定的”表示酶在特定pH下比参照酶更稳定。在本申请中，如果在同一实验条件(例如同一pH等)下特定时间间隔后，变体有相对较高的活性，那么α-淀粉酶变体就比野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶更加pH稳定。

在涉及细胞、核酸、蛋白质或载体时使用的“重组”，表示已经通过异源核酸或蛋白质的导入或天然核酸或蛋白质的改变，修饰了细胞、核酸、蛋白质或载体，或者细胞是源自这样修饰的细胞。所以，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不能找到的基因，或表达其他情况下异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。

如此处所用，“食品”包括准备好的食品和食品的成分(例如面粉)。

如此处所用，“食品成分”包括就是或可加入功能食品或粮食的制剂，并且包括以低水平使用于品种多样产品中的制剂，所述产品需要如酸化或乳化。食品成分可以以溶液或固体的形式存在，这依赖于用途和/或应用方式和/或施用方式。

如此处所用，“功能食品”表示食品，该食品不仅能够提供营养效果和/或味觉满足，还能对消费者提供任意进一步的有益效果。

如此处所用，“氨基酸序列”与术语“多肽”同义，并可与术语“蛋白质”互换使用。在一些情况下，术语“氨基酸序列”、“肽”和“氨基酸序列”，和“酶”。

如此处所用，“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因组、合成或重组来源的，可以是双链或单链的，代表有义链或反义链。如此处所用，术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。

“载体”是指设计用于将核苷酸引入一种或多种细胞类别的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等等。

如此处所用的“表达载体”表示DNA构建体，该构建体包含有效连接到合适的控制序列的DNA序列，该控制序列能够实现该DNA在合适宿主中的表达。这样的控制序列可以包括实现转录的启动子、控制转录的任选操纵基因序列、编码mRNA上的合适核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译终止的序列。

“信号序列”表示与蛋白质N端部分结合的氨基酸序列，该序列促进细胞外的蛋白质成熟形式进行分泌。信号序列的定义是功能性的。细胞外蛋白质的成熟形式缺少信号序列，该序列在分泌过程中被切除。

“基因”是指DNA区段，该区段与产生多肽有关，并包括编码区域之前和之后的区域，以及个体编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

“启动子”是调节序列，该参与结合RNA聚合酶以启动基因转录。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。此处所用的示例性启动子是诱导型启动子里氏木霉cbh 1。

“在转录控制下”是本领域内公知的术语，该术语表明多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录依赖于其有效连接促进转录开始或促进转录的元件。

“在翻译控制下”是本领域内公知的术语，该术语表明mRNA形成后发生的调控过程。

如此处所用，在描述蛋白质和编码蛋白质的基因时，基因的术语用斜体字标识(例如，编码amyL(地衣芽孢杆菌AA)的基因可表示为amyL)。蛋白质的术语通常不用斜体字，并且第一个字母通常大写(例如，amyL基因编码的蛋白质可表示为AmyL或amyL)。

术语“源自”包含术语“源于”、“获得”或“从...获得”和“从...分离”。

“有效连接“是指并置，其中元件的排列容许其功能上相关。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么启动子有效连接于该编码序列

“选择标记”是指能够在宿主中表达的基因，其允许容易地选择含有引入的核酸或载体的那些宿主。选择标记的例子包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予代谢优势(例如对宿主细胞的营养优势)的基因。

在将核苷酸序列插入细胞情况下的“引入”表示“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提到将核苷酸序列掺入到真核或原核细胞中，其中核酸序列可掺入到细胞基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转变为自主复制子，或瞬时表达(如转染的mRNA)。

如此处所用，“转化的细胞”包括已经通过重组DNA技术转化的细胞。典型地，通过将一个或更多核苷酸序列插入细胞发生转化。插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列，即，该序列对将要转化的细胞(如融合蛋白)并不是天然的。

“宿主菌株”或“宿主细胞”表示对表达载体或DNA构建体合适的宿主，所述的表达载体或DNA构建体包含编码根据本公开内容的变体α-淀粉酶的多核苷酸。特别地，宿主菌株可以是细菌细胞。在本公开内容的实施方案中，“宿主细胞”表示细胞和从微生物菌株特别是芽孢杆菌属细胞产生的原生质体。

与另一序列有某一百分比(例如，至少约80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性的多核苷酸或多肽表示比对时，比较两个序列中碱基或氨基酸残基相同的百分比。可通过本领域内任意合适的软件程序来确定这种比对和百分比同源性或同一性，例如CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等.(eds)1987，Supplement 30，section 7.7.18)中所述的那些程序。这些程序可包括GCG Pileup程序、FASTA(Pearson等.(1988)Proc.Natl，Acad.Sci USA 85：2444-2448)和BLAST(BLAST Manual，Altschul等，Nat’l Cent.Biotechnol.Inf.，NatlLib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，Md.和Altschul等，(1997)NAR25：3389-3402)。另一比对程序是使用缺省参数的ALIGN Plus(Scientificand Educational Software，PA)。另一有用的序列软件程序是在SequenceSoftware Package Version 6.0(Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，WI)中可得的TFASTA数据搜索程序(DataSearching Program)。

本领域技术人员将认识到本公开内容包含的序列也通过其在严格杂交条件下与示例的amyL序列(如WO 06/002643的SEQ ID NO：7)杂交的能力来定义。在适当的温度和溶液离子强度条件下，核酸的单链形式可与另一核酸退火时，核酸与另一核酸序列可以杂交。杂交和洗涤条件是本领域公知的(如见Sambrook(1989)supra，特别是第9和第11章)。在一些实施方案中，严格条件对应于65℃的T_m和0.1×SSC，0.1％SDS。

“培养”是指在合适的条件下在液体或固体培养基中培养微生物细胞群体。在一个实施方案中，培养是指含有颗粒淀粉的淀粉底物发酵生物转化为终产物(典型地，在容器或反应器中)。

“发酵”是由微生物对有机物质进行酶学和厌氧降解，产生更简单的有机化合物。发酵发生在厌氧条件下时，并不意味着该术语只限制于严格的厌氧条件，因为发酵同样在氧存在时发生。

“接触”是指将各个酶放置在足够靠近各自底物的临近处，使酶能够将底物转变为终产物。本领域技术人员将认识到，将酶溶液与各自底物混合可实现接触。

“酶转化”通常指通过酶作用修饰底物。如此处所用的术语也指通过酶的作用对淀粉底物进行修饰。

如此处所用，“糖化”是指将淀粉酶促转化为葡萄糖。

“凝胶化”表示通过蒸煮使淀粉分子溶解形成粘稠的悬浮液。

“液化”是指淀粉转化的阶段，该阶段中胶凝化淀粉水解以提供低分子量的可溶糊精。

“聚合度(DP)”是指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数量(n)。DP1的例子是单糖，如葡萄糖和果糖，DP2的例子是2糖，如麦芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合物的聚合度大于3。

“终产物”或“期望的终产物”是指源自任意碳源的分子产物，其中分子产物是从淀粉底物酶促转化而来的。

如此处所用，“干固体含量”是指基于干重浆液的总固体(％形式)。术语“浆液”是指含有不可溶固体的水性混合物。

术语“残留淀粉”是指含有淀粉的底物发酵后组合物中剩下的残余淀粉(可溶或不可溶)。

“回收步骤”是指醪液组分的回收，该组分可包括残留淀粉、用于发酵包含淀粉的底物的酶和/或微生物。

术语“醪液”是指用于产生发酵产物(例如醇)的水中的可发酵碳源(碳水化合物)混合物。在一些实施方案中，术语“啤酒”和“醪液”是互换使用的。

“釜馏物”表示非发酵固体和水的混合物，该混合物是从发酵醪液中除去醇后的残留物。

术语“干酒糟”(DDG)和“具有可溶物的干酒糟”(DDGS)是指谷物发酵的有用副产物。

如此处所用的“产乙醇微生物”是指能够将糖或寡糖转变为乙醇的微生物。产乙醇的微生物产生乙醇，是因为它们能够表达一个或多个酶，这些酶能单独或一起将糖转变为乙醇。

如此处所用的“乙醇产生者”或产生乙醇的微生物，是指能够从己糖或戊糖产生乙醇的任意生物或细胞。通常，产生乙醇的细胞含有醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产生乙醇的微生物的例子包含如酵母等真菌微生物。

关于多核苷酸或蛋白质的“异源”，是指并不天然存在于宿主细胞中的核苷酸或蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。该术语意图包含由天然存在基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。

关于多核苷酸或蛋白质的“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

如此处所用，关于细胞的“转化”、“稳定转化”和“转基因的”，表示细胞具有非天然的(如异源的)核酸序列，该序列整合到其基因组或作为维持多个世代的游离型质粒存在。

如此处所用，“表达”是指在基因的核酸序列基础上生产多肽的过程。该过程包括转录和翻译两者。

如此处所用，“比活性”表示酶单位，该单位定义为特定条件下单位时间内被酶制剂转化为产物的底物摩尔数。比活性表示为单位(U)/mg蛋白质。

“产率”是指使用本公开内容的方法产生的终产物或期望终产物的量。在一些实施方案中，产率比用本领域已知方法产生的高。在一些实施方案中，该术语是指终产物的体积，在其他实施方案中，该术语是指终产物浓度。

如此处所用，“生物学活性”是指序列，该序列具有与天然存在序列相似的结构、调控或生化功能，虽然不必定是相同程度。

“ATCC”是指位于Manassas，Va.20108的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

“NRRL”是指伊利诺斯州Peoria的国家农业应用研究中心，农业研究局培养物保藏中心(以前称为USDA北方地区研究实验室)。

1.2.缩写

除非另有说明，应用以下的缩写：

AE           醇乙氧基化物

AEO          醇乙氧基化物

AEOS         醇乙氧基硫酸酯

AES          醇乙氧基硫酸酯

AFAU         酸性真菌α-淀粉酶单位

AGU          葡糖淀粉酶活性单位

AOS          α-烯属磺酸酯

AS           醇硫酸酯

BAA          细菌α-淀粉酶

cDNA         互补DNA

CMC          羧甲基纤维素

DE           葡萄糖当量

DNA          脱氧核糖核酸

DNS          3，5-二硝基水杨酸

DP3          三亚基聚合度

DPn          n亚基聚合度

DS           干物质

DSC              示差扫描量热法

DTMPA            二乙基三胺五乙酸

EC               酶学委员会的酶分类法

EDTA             乙二胺四乙酸

EDTMPA           乙二胺四亚甲基膦酸

EO               环氧乙烷

F&HC             织物和家庭护理

HFCS             高果糖谷物糖浆

HFSS             高果糖淀粉基糖浆

HPAEC-PAD        带脉冲电流测定的高性能阴离子交换层析

IPTG             异丙基β-D-硫代半乳糖苷

LAS              线性烷基苯磺酸酯

LU               脂肪酶单位

MES              2-(N-吗啉代)乙磺酸

MW               分子量

nm               纳米

NOBS             壬酰氧基苯磺酸酯

NTA              次氮基三乙酸

PCR              聚合酶链反应

PEG              聚乙二醇

pI               等电点

ppm              百万分率

PVA              聚乙烯醇

PVP              聚乙烯吡咯烷酮

RAU              参考淀粉酶单位

RMS              均方根

RNA              核糖核酸

rpm              每分钟转数

SAS            仲烷烃磺酸盐

1X SSC         0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0

SSF            同时糖化和发酵

TAED           四乙酰基乙二胺

TNBS           三硝基苯磺酸

w/v            重量/体积

w/w            重量/重量

wt             野生型

μL            微升

1.3命名法

在本描述和权利要求书中，对氨基酸残基使用常规的单字母和三字母代码。为方便参考，通过以下命名法的使用来描述本申请的α-淀粉酶变体：

原氨基酸：位置：替换氨基酸

根据本命名法，例如，位置242上丝氨酸被丙氨酸取代表示为：

Ser242Ala或S242A。

位置30的丙氨酸缺失表示为：

Ala30＊或A30＊或ΔA30。

额外氨基酸残基的插入，例如赖氨酸，表示为：

Ala30AlaLys或A30AK。

连续一段氨基酸残基缺失，例如氨基酸残基30-33，表示为

(30-33)＊或Δ(A30-N33)或Δ30-33。

两个连续氨基酸缺失，例如氨基酸残基R180-S181，表示为

ΔRS或Δ180-181。

与其他α-淀粉酶相比，特定α-淀粉酶含有“缺失”并且在这一位置有插入，表示为：

＊36Asp或＊36D

表示在位置36插入天冬氨酸。多个突变通过加号分开，即：

Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S

代表在位置30和34丙氨酸和谷氨酸分别被取代为天冬酰胺和丝氨酸的突变。当给定位置可以插入一个或更多备选氨基酸残基时，表示为：

A30N，E或A30N或A30E。

此外，此处鉴定了适合修饰的位置，且未建议任何特定修饰时，应理解该位置现存氨基酸残基可用任意氨基酸残基替换。因此，例如，提到位置30上的丙氨酸修饰而未指定时，应理解丙氨酸可以被缺失或被其他任意氨基酸替换，即被以下任一氨基酸替换：

R，N，D，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V。

另外，″A30X″表示以下替换的任意一种：

A30R，A30N，A30D，A30C，A30Q，A30E，A30G，A30H，A30I，A30L，A30K，A30M，A30F，A30P，A30S，A30T，A30W，A30Y，或A30V；

或简称：

A30R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V。

在例如N或V中的一个存在于野生型中的情况下，如果用于编号的亲本酶在建议用于替换的位置上具有所讨论的氨基酸残基，那么使用以下命名法：

″X30N″或″X30N，V″。

因此这表示其他相应的亲本酶在位置30中被替换为天冬酰胺或缬氨酸。

2.α-淀粉酶变体

此处的α-淀粉酶变体从野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶产生。本变体可以有增强的比活性、pH谱、热稳定性、温度范围谱、钙离子需要或其他增强的特性。变体通常含有野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶氨基酸序列的一个或多个修饰。野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可从任意天然存在的地衣芽孢杆菌菌株中分离出来。

为了本公开内容的目的，氨基酸替换例如可以称作M15T。“M15T”表示在位置15上甲硫氨酸(M)被替换为苏氨酸(T)残基，其中氨基酸是用本领域公知的单字母缩写来表示的。

野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的蛋白质工程产生了多种能有改善性质的α-淀粉酶。在一个方面，变体酶的一个或更多氨基酸残基被随机修饰，在变体的宿主细胞表达后，修饰的效应由变体性能特征的后续分析测定。在另一方面，使用“模式”α-淀粉酶(该淀粉酶有与野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶非常类似的结构)作为引导，系统性修饰变体氨基酸序列，以便预测修饰的效果。在一个实施方案中，与野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶相比，模式α-淀粉酶有一种或更多改善的特性。例如，模式α-淀粉酶可能有更高的比活性、pH依赖性、稳定性、半衰期或钙结合常数，或者它可能有特别有用的底物特异性，等等。

如果使用模式α-淀粉酶来引导变体α-淀粉酶的氨基酸改变的设计，则不需要精确知道模式α-淀粉酶的哪一些残基对该酶的性能有贡献。作为替换，变体α-淀粉酶中一个或更多氨基酸，甚至全套氨基酸，修饰为模式α-淀粉酶相应的氨基酸。这里的“相应”氨基酸不是由一级氨基酸序列的常规比对决定的，而是由两种酶多肽骨架的3D结构比对决定。因此，变体中修饰的氨基酸可选择例如酶表面的带电残基、活性部位残基或对模式酶特有的具体二级结构元件有贡献的残基。也可能在修饰不会破坏两个酶间保守3D结构(特别是保守的二级结构元件，如α-螺旋、β-折叠和转角)的基础上，选择要被修饰的残基。

例如，已知改变酶表面上的带电氨基酸分布通常能改变其酶性质。如见Russell等人，“Rational modification of enzyme catalysis by engineeringsurface charge，”Nature 328：496-500(1987)。同样地，可修饰地衣芽孢杆菌α-淀粉酶表面上的一个或更多残基，来改变变体α-淀粉酶的酶性质，此处可用模式α-淀粉酶的表面电荷分布来引导修饰的选择。为此目的，用至少部分暴露在溶剂中的氨基酸带电侧链来促进“表面电荷”。

可将变体α-淀粉酶残基分类，可将其归于三个结构域之一，此处称A、B和C域。为本公开内容的目的，A域从残基2延伸至105，和从残基208延伸至396；B域从残基106延伸至207；C域从残基397延伸至蛋白C端。氨基酸也可分类为活性部位残基。活性部位残基至少位于位置49，52，163，167，170，172，187，188，190，238，262，264，293，297和332-334。残基“位置”编号如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶序列(SEQ ID NO：4)所描述。

在变体α-淀粉酶中，一个或更多氨基酸可被修饰为模式α-淀粉酶中的相应氨基酸。修饰按结构域聚簇，和/或按带电并存在于酶表面的氨基酸聚簇。备选地或附加地，可对一个或更多活性部位残基进行修饰。用这种方式，令多重氨基酸修饰成为可能，其中修饰对变体α-淀粉酶的性能特征有可预测的效应。例如，变体可以将一个或更多域上的每个表面带电残基改变为模式α-淀粉酶的相应残基。在另一实施方案中，变体可以有残基插入或缺失，如可以有环插入或缺失，使变体的多肽骨架更近似于模式α-淀粉酶的结构。相应地，以变体保持α-淀粉酶活性为条件，变体可包含1，2，3，4，5，10，15，20，30，40，50，60或70个氨基酸替换、缺失或插入，或之间的任何整数值。变体的表面电荷也可以以任一数量改变。例如，酶表面上带正电的氨基酸残基数量可以减少1，2，3，4，5，6，7或8个。除了别的以外，预期这样的氨基酸替换会改变变体的等电点(pI)。变体的其他特征可以不同于野生型酶，如下述。

α-淀粉酶变体可以是融合蛋白、“杂合体”或“嵌合蛋白”，包含非地衣芽孢杆菌内源的多肽序列。在一个实施方案中，多肽序列促进所表达蛋白的纯化。在另一实施方案中，异源序列是源自与地衣芽孢杆菌异属或异种的α-淀粉酶多肽。例如，α-淀粉酶变体可包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，该变体连接到另一种芽孢杆菌(例如但不限于嗜热脂肪芽孢杆菌)α-淀粉酶的信号肽。

2.1.α-淀粉酶变体表征

酶变体可通过核酸和多肽序列、如上所述的它们的3D结构和/或它们的比活性表征。α-淀粉酶变体的其他特征包括半衰期、低水平钙离子(Ca²⁺)下的稳定性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。在一个方面，清洁制剂中的α-淀粉酶变体有更高的比活性，这可用本领域技术人员已知的标准测定方法进行评价。在另一个方面，变体显示出其他改善的性能特征，例如高温(如70-120℃)和/或极端pH(即约pH 4.0到约6.0或约pH 8.0到约11.0)和/或低于约60ppm的钙浓度情况下改善的稳定性。

改变的Ca²⁺稳定性表示，在Ca²⁺耗竭的情况下酶的稳定性发生了改变，即增加或减少。重要的突变包含改变的Ca²⁺稳定性和需要性的突变，特别是在高pH(即pH8.0到10.5)下有降低的Ca²⁺依赖性的突变。

在另一方面，对于用在清洁组合物中，重要的突变显示出改变的比活性，特别是在从约10℃到约60℃的温度下，特别地在约20℃到约50℃下，更特别地在约30℃到约40℃下。对烘焙产品，重要的突变可以在较高的温度范围内显示改变的比活性。

与亲本α-淀粉酶相比，α-淀粉酶变体也可以有改变的氧化稳定性，特别是较高的氧化稳定性。例如，增加的氧化稳定性在洗涤剂组合物中有优势，降低的氧化稳定性可以在用于淀粉液化组合物的中有优势。

变体α-淀粉酶可以比野生型α-淀粉酶更加热稳定。这样的α-淀粉酶在烘焙或其他需要升温方法的使用中有优势。例如，热稳定的α-淀粉酶变体可在约55℃到约80℃或更高的温度下降解淀粉。暴露在高达约95℃的温度后，热稳定的α-淀粉酶变体可保持其活性。

此处所述的α-淀粉酶变体多肽也可以有突变，该突变相对于亲本酶，延长了半衰期至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或更多，特别是在至少约55℃到约95℃或更高的升高温度下，特别是在约80℃下。在一个实施方案中，α-淀粉酶变体可在约80℃或更高温度下加热约1-10分钟。

α-淀粉酶变体可以有外特异性，例如以外特异性指数测量。α-淀粉酶变体包含那些变体，该变体典型地在同一条件下测量时，具有比其源自的亲本酶或多肽更高或增加的外特异性。因此，例如，与其亲本多肽相比，α-淀粉酶变体多肽可以有10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，150％，200％，500％，1000％，5000％，10,000％或更高的外特异性指数。

在一个方面，由核酸编码的α-淀粉酶变体多肽与亲本序列有相同的pH稳定性。在另一方面，变体包含了突变，该突变赋予了更大的pH稳定范围或将pH范围转移到酶的最终商业目的希望的区域。例如，在一个实施方案中，变体可在约pH5.0到约pH10.5下降解淀粉。在同一条件下，与亲本多肽相比，α-淀粉酶变体多肽可以有更长的半衰期或更高的活性(依赖于测定)，或者α-淀粉酶变体可以有和亲本多肽相同的活性。同一pH条件下与其亲本多肽相比，α-淀粉酶变体多肽也可以有约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或更长的半衰期。备选地，或附加地，在同一pH条件下与亲本多肽相比，酶变体多肽可以有更高的比活性。

在另一个方面，提供了核酸，其与此处陈述的编码任一α-淀粉酶变体的核酸互补。另外，提供了能够与互补核酸杂交的核酸。在另一实施方案中，用于此处描述的方法和组合物中的序列是合成序列。其包括但不限于以最佳密码子选择制备的序列，该最佳密码子选择是为了在宿主生物(例如甲基营养酵母毕赤酵母和汉逊酵母)中进行表达。

3.α-淀粉酶变体的生产

编码酶变体的DNA序列(该酶变体用此处描述或本领域中任一其他已知方法进行生产)可以使用表达载体以酶形式表达，所述表达载体典型地包括控制序列，该序列编码合适的启动子、操纵基因、核糖体结合部位、翻译起始信号和典型地阻遏基因或各种活化基因。

3.1.载体

带有编码α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是能方便地经历重组DNA操作的任一载体，并且载体的选择通常依赖于其将要引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即，以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、噬菌体或染色体外元件、微染色体或人工染色体。备选地，载体可以是这样一种载体，它在引入宿主细胞时，整合进入宿主细胞基因组，且与其整合进去的染色体一起复制。整合的基因可以通过可扩增的构建体扩增来产生染色体中该基因的多个拷贝，所述构建体是通过抗生素选择或其他选择压力(例如必需调控基因，或必需代谢途径基因的互补)驱动的。

典型地，表达载体包括克隆载体的组分，例如允许载体在所选宿主生物中进行自主复制的元件，和一个或更多为选择目的在表型上可检测的标记。表达载体通常包含控制核苷酸序列，该序列编码启动子、操纵基因、核糖体结合部位、翻译起始信号和典型地阻遏基因或者一个或更多活化基因。在一个方面，为了更容易的酶收集和纯化，使用的所有信号序列将物质靶向细胞培养基。分别用于连接编码α-淀粉酶变体、启动子、终止子和其他元素的DNA构建体，和将它们插入到含有复制所需信息的合适载体的方法是本领域技术人员所公知的(如见Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989 and3rd ed.，2001)。

载体中，DNA序列应该有效连接合适的启动子序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任一DNA序列，并且可源自编码宿主细胞同源或异源蛋白的基因。用于指导编码α-淀粉酶变体的DNA序列转录(特别是在细菌宿主中)的合适启动子的示例是大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶dagA或celA的启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子，等等。对真菌宿主中的转录，有用启动子的实例是那些源自编码米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的基因的启动子。在编码α-淀粉酶变体多肽的基因在例如大肠杆菌的细菌种类中表达时，可选择合适的启动子，可从例如包括T7启动子和λ噬菌体启动子的噬菌体启动子选择。适合在酵母种类中表达的启动子实例，包括但不限于酿酒酵母菌的Gal 1和Gal 10启动子，和巴斯德毕赤酵母的AOX1或AOX2启动子。对在里氏木霉中的表达，也可用CBHII启动子。

表达载体也可以包含适合的转录终止子，和有效连接编码α-淀粉酶变体的DNA序列的多腺苷酸序列(在真核生物中)。终止和多腺苷酸序列可合适地与启动子源自相同来源。载体还可包含DNA序列，该序列使载体能够在讨论中的宿主细胞里复制。这种序列的例子是质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1，pICatH和pIJ702的复制起点。

载体也可以包含选择标记，例如其产物补足宿主细胞中缺陷的基因，如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗药性(如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素抗药性)的基因。此外，载体可包含赋予潮霉素抗药性的曲霉菌属选择标记(例如amdS，argB，niaD和xxsC)，或者通过本领域已知的共转化来完成选择。例如见WO 91/17243。

3.2.变体表达和宿主生物

虽然在某些方面，例如在宿主细胞中使用某些细菌或真菌时，细胞内表达或固态发酵可以更有优势，但变体表达在细胞外并进入培养基中通常更有优势。一般来说，此处提到的芽孢杆菌α-淀粉酶包含允许所表达蛋白酶分泌到培养基中的信号序列。如果需要，这一信号序列可用不同的信号序列替换，该替换可便利地通过编码各个信号序列的DNA序列的替换来完成。信号序列的典型特征是有三个结构域，N端域、H域和C端域，且长度在18-35个残基范围内。

成熟蛋白可以最初以融合到前蛋白的融合蛋白形式存在，所述前蛋白源自另一种芽孢杆菌或者与亲本序列来自同一物种。为在地衣芽孢杆菌中分泌蛋白，经常使用地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽；然而，也可以替换成其他芽孢杆菌属α-淀粉酶的信号蛋白。

分离的包含DNA构建体或表达载体的细胞，在α-淀粉酶变体重组生产中作为宿主细胞有利地使用。细胞可以编码变体的DNA构建体，便利地通过将DNA构建体(一个或更多拷贝)整合到宿主染色体中来转化。这一整合通常认为是有优势的，因为DNA序列更有可能保持在细胞中。DNA构建体整合进入宿主染色体可根据常规方法进行，如通过同源或异源重组。备选地，细胞可用表达载体转化，该表达载体如上关于不同类型的宿主细胞所述。

合适的细菌宿主生物的例子是革兰氏阳性细菌物种，例如芽孢杆菌科，包含枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝固芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；链霉菌属，例如鼠灰链霉菌；乳酸细菌，包括乳球菌属，例如乳乳球菌；乳杆菌属，包含路氏乳杆菌；明串球菌属；片球菌属和链球菌属。备选地，属于肠杆菌科(包含大肠杆菌)或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种可被选作宿主生物。

合适的酵母宿主生物可从生物技术上相关的酵母物种中选择，例如，但不限于毕赤酵母属，汉逊酵母属，克鲁维酵母属，Yarrowinia sp.，酵母属，包括酿酒酵母，或属于裂殖酵母属的物种，例如栗酒裂殖酵母。可用甲基营养酵母物种毕赤酵母作为宿主生物。备选地，宿主生物可以是汉逊酵母物种。丝状真菌中合适的宿主生物包括曲霉菌属的种类，如黑曲霉、米曲霉、Aspergillus tubigensis、泡盛曲霉或构巢曲霉。备选地，镰孢属的种类，如尖镰孢，或根毛霉菌属，如米赫根毛霉可用作宿主生物。其他合适的酵母包括Thermomyces sp和毛霉菌属。通过包括原生质体形成和原生质体转化，随后以本领域已知的方式重新生成细胞壁的方法转化真菌细胞。例如，欧洲专利号238023描述了转化曲霉属宿主细胞的合适步骤。

在更进一步的方面，提供了产生α-淀粉酶变体的方法，该方法包括在有助于变体产生的条件下培养如上所述的宿主细胞并从细胞和/或培养基中回收变体。用于培养细胞的培养基可以是适合所述细胞生长并获得α-淀粉酶变体表达的任意常规培养基。合适的培养基和培养基组分可从供货商获得，或者根据例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)目录所述的已公布配方制备。示例性培养基包括但不限于那些下文提供的实施例中所用的，在例如三千升(3,000L)搅拌釜发酵罐中进行补料分批发酵所用的培养基。所用培养基会是最适合所培养宿主细胞的，例如下面讨论的用于培养地衣芽孢杆菌的培养基。那种情况下的培养基可由以下物质组成：作为有机化合物来源的玉米浸提固体和大豆粉，以及作为钠、钾、磷、镁、硫酸盐来源的无机盐和微量元素。典型地，如葡萄糖等糖类来源也是初始培养基的一部分。如本领域已知，一旦培养确定并开始生长，糖类按量加入发酵罐来维持培养物。按规则间隔从发酵罐中取出样品，通过如比色测定方法来测量酶滴定度。根据测量结果，酶生产率停止上升时，停止发酵过程。

从宿主细胞分泌的α-淀粉酶变体可便利地通过公知步骤从培养基中回收，所述公知步骤包括通过离心或过滤将细胞从培养基中分离，并通过例如硫酸铵等盐的方法沉淀蛋白质性质的组分，随后是使用层析步骤如离子交换层析、亲和层析等等。

宿主细胞可在允许α-淀粉酶变体蛋白表达的合适条件下培养。蛋白质的表达可以是组成性的，以致其持续产生，或者可诱导的，需要刺激物来启动表达。在可诱导表达的情况下，例如需要的时候向培养基添加诱导物质如地塞米松、IPTG或琼脂糖，可启动蛋白质的产生。多肽也可以在例如TnT^TM(Promega)兔网织红细胞系统等体外无细胞体系中重组产生。

表达α-淀粉酶变体的宿主也可以是在好氧条件下，对宿主合适的培养基中培养。可提供摇动或搅拌和通气的组合，生产发生在对宿主合适的温度下，如从约30℃到约75℃，这取决于宿主和所需α-淀粉酶变体产生的需要。培养可持续约12到约100小时或更长(和其中任何小时值)，或更特别地，从约24到约72小时。典型地，培养液pH在约5.5到约8.0，也取决于宿主细胞相对于α-淀粉酶变体产生所需要的培养条件。

4.α-淀粉酶变体的纯化

发酵、分离和浓缩技术是本领域已知的，且可用常规方法来制备含有浓缩α-淀粉酶变体的溶液。发酵后得到发酵液，并通过常规分离技术将微生物细胞以及各种悬浮固体(包括残留发酵原料)去除，得到淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空滚筒过滤(rotary vacuum drumfiltration)，随后是超滤、提取或层析等。

期望对含有α-淀粉酶变体的溶液进行浓缩来优化回收率，因为未浓缩溶液的使用需要增加的温育时间来收集含有纯化α-淀粉酶变体的沉淀物。用常规技术浓缩溶液，直到获得期望的酶水平。含有酶变体的溶液的浓缩可通过以上讨论的任意技术得到。在一个实施方案中，使用旋转真空蒸发和/或超滤。备选地，可使用超滤。

为纯化目的的“沉淀剂”意思是可从浓缩酶变体溶液中有效沉淀固体形式(无论其是何性质，也就是说，结晶的，无定形或两者混合)α-淀粉酶变体的化合物。可用例如金属卤化物沉淀剂等来进行沉淀。金属卤化物沉淀剂包括：碱金属氯化物，碱金属溴化物和两者或更多这些金属卤化物的混合物。金属卤化物可从由氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和两种或更多这些金属卤化物的混合物组成的组中选择。合适的金属卤化物包括氯化钠和氯化钾，特别是还可作为防腐剂使用的氯化钠。

金属卤化物沉淀剂按能有效沉淀α-淀粉酶变体的量来使用。在常规试验后，能有效导致酶变体沉淀的金属卤化物的至少有效量和最佳量的选择，以及用于最大回收率的沉淀条件，包括温育时间，pH，温度和α-淀粉酶变体浓度等的选择对本领域中普通技术人员之一是十分明显的。

一般来说，向浓缩酶变体溶液中加入至少约5％w/v(重量/体积)到约25％w/v，通常是至少8％w/v的金属卤化物。一般来说，向浓缩酶变体溶液加入不超过约25％w/v的金属卤化物，通常不超过约20％w/v。除了别的以外，金属卤化物沉淀剂的最佳浓度依赖于特定α-淀粉酶变体的性质及其在浓缩α-淀粉酶变体溶液中的浓度。

实现酶沉淀的另一备选方案是使用有机化合物，其可向浓缩酶变体溶液中加入。有机化合物沉淀剂可包括：4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲酸的碱金属盐，4-羟基苯甲酸的烷基酯，以及两种或更多这些有机化合物的混合物。有机化合物沉淀剂的添加可在金属卤化物沉淀剂的添加之前、同时或之后进行，并且这两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加可顺序或同时进行。例如更进一步的描述，如见美国专利号5,281,526。

一般来说，有机化合物沉淀剂从由4-羟基苯甲酸的碱金属盐(如钠或钾盐)和4-羟基苯甲酸线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1到12个碳原子)两种或更多这些有机化合物的混合物组成的组中选择。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯甲酸线性或分支的烷基酯，其烷基含有1到10个碳原子，以及两种或更多这些有机化合物的混合物。合适的有机化合物包括4-羟基苯甲酸线性烷基酯，其中烷基含有1到6个碳原子，以及两种或更多这些有机化合物的混合物。也可以使用4-羟基苯甲酸甲酯，4-羟基苯甲酸丙酯，4-羟基苯甲酸丁酯，4-羟基苯甲酸乙酯，以及两种或更多这些有机化合物的混合物。另外的有机化合物也包括但不限于也是淀粉酶防腐剂的4-羟基苯甲酸甲酯(甲基PARABEN)和4-羟基苯甲酸丙酯(丙基PARABEN)。

有机化合物沉淀剂的添加提供了关于pH、温度、α-淀粉酶变体浓度、沉淀剂浓度和温育时间的沉淀条件的高灵活性优势。

以有效的剂量使用有机化合物沉淀剂，该有效剂量能改善通过金属卤化物沉淀剂对酶变体的沉淀。常规试验后，根据本公开，至少有效剂量和最佳剂量的有机化合物沉淀剂，以及最大回收率的沉淀条件(包含时间、pH、温度和酶变体浓度)的选择对本领域技术人员来说是显而易见。

通常，向浓缩酶变体溶液加入至少约0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，通常至少加入约0.02％w/v。通常，向浓缩酶变体溶液加入不超过约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，并且常常不超过约0.2％w/v。

调节含有金属卤化物沉淀剂和(在一个方面)有机化合物沉淀剂的浓缩酶变体溶液到必定会依赖于待纯化酶变体的pH。通常，将pH调节到接近淀粉酶等电点(pI)的水平。例如，可在从pI以下约2.5pH单位到pI以上约2.5pH单位的范围内调节pH。为具体说明，α-淀粉酶变体来自地衣芽孢杆菌时，浓缩酶变体溶液pH通常将被调至约5.5到9.7之间，特别调至约pH 6.5-9.0之间。如果变体pI与野生型pI不同，pH可相应调节。

得到纯化的酶变体沉淀物所需的温育时间依赖于特定酶变体的性质、酶的浓度、特定沉淀剂及其浓度。通常，沉淀酶变体的有效时间在约1小时到约30小时之间，常常不超过约25小时。存在有机化合物沉淀剂时，温育时间仍可降低到少于约10个小时，大多数情况下甚至少于约6个小时。

通常，温育中温度在约4℃到约50℃之间。通常，方法在约10℃到约45℃之间实施，特别在约20℃到约40℃间。诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶变体或所用沉淀剂而有所不同。

纯化酶变体沉淀物的总回收率和进行该过程的效率是通过搅拌包含酶变体、所加金属卤化物和所加有机化合物的溶液来提高的。搅拌步骤在加入金属卤化物和有机化合物，和后续的温育期间都进行。合适的搅拌方法包括机械搅拌或摇动、剧烈通气或任一相似的技术。

温育阶段以后，纯化的酶变体随后从分离的色素和其他杂质中分离出来，并用例如过滤，离心，微滤，旋转真空过滤，超滤，加压过滤，跨膜微滤，交叉流动膜微滤等等的常规分离技术来收集。跨膜微滤可以是所用的一种方法。纯化酶变体沉淀物的进一步纯化可通过用水清洗沉淀物得到。例如，纯化酶变体沉淀物用含有金属卤化物沉淀剂的水洗涤，例如，用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水洗涤。

在培养时，热稳定的淀粉酶在培养液中在细胞外积累。为了期望的α-淀粉酶变体的分离和纯化，将培养液离心或过滤以除去细胞，所得的无细胞液体用于酶的纯化。在一个实施方案中，无细胞培养液用饱和度约70％的硫酸铵进行盐析，70％饱和沉淀的级分随后在缓冲液中溶解，应用到例如Sephadex G-100的柱子上，洗脱以回收酶变体活性级分。为了进一步纯化，可使用例如离子交换层析等常规步骤。

纯化的酶变体在一般使用酶变体的所有应用中都是有用的。例如，它们可用于洗衣洗涤剂和污点去除剂、食品工业、淀粉加工和烘焙，以及药物组合物中作为消化助剂。它们可制成液态(溶液和浆液)或固态(颗粒和粉末)的最终产品。

备选地，酶产物可回收，并且为了在酶不进一步纯化的情况下通过过滤或离心来除去细胞和细胞碎片，向培养基加入絮凝剂。

用以上所述方法产生和纯化的α-淀粉酶变体可用在多种有用的工业应用中。变体具有有价值的性质，这些性质促进了织物与家庭护理(F&HC)相关的应用。这些变体可用于从淀粉生产甜味剂和乙醇和/或织物脱浆。变体α-淀粉酶在淀粉转变过程中特别有用，所述转变包括淀粉液化和/或糖化过程，例如WO 2005/111203和美国公布的申请号2006/0014265(GenencorInternational，Inc.)中所述。变体也可用作洗涤、餐具清洗和硬表面清洁洗涤剂组合物中的组分。α-淀粉酶变体的这些多种用途在下面更加详细地描述。

5.淀粉加工组合物和用途

在另一方面，具有公开的α-淀粉酶变体的组合物可用于淀粉液化和/或糖化。淀粉加工用于生产甜味剂，生产用作燃料或饮料(即可饮用乙醇)的乙醇，生产饮料，加工蔗糖或生产期望的有机化合物，例如柠檬酸，衣康酸，乳酸，葡糖酸，酮类，氨基酸，抗生素，酶，维生素和激素。淀粉转变为果糖糖浆通常由三个连续的酶过程组成：液化过程，糖化过程和异构化过程。在液化过程期间，变体地衣芽孢杆菌α-淀粉酶在约pH 5.5到约pH6.2之间的pH，在约95℃到约160℃之间的温度和约2小时内将淀粉降解为糊精。典型地，加入约1mM的钙(约40ppm游离钙离子)，以便优化这些条件下的酶稳定性。其他α-淀粉酶变体可以需要不同的条件。

液化过程后，可通过添加葡糖淀粉酶(如AMG^TM)和如异构淀粉酶或支链淀粉酶(如

))等典型的脱支酶，将糊精转变为葡萄糖。这一步骤以前，pH降低到低于约4.5的值，保持高温(高于95℃)，液化α-淀粉酶变体的活性被变性。温度降低到约60℃，可添加葡糖淀粉酶和脱支酶。典型地，糖化过程进行约24到约72小时。

糖化过程后，pH增加到范围在约6.0到约8.0的值，如pH7.5，通过离子交换去除钙。例如，葡萄糖浆随后以固定化的葡萄糖异构酶(如

)转变为高果糖糖浆。

5.1.液化组合物和用途

美国专利号3,912,590和欧洲专利公布号252,730和63,909(在此引入作为参考)中描述了常规的淀粉转化方法，如液化和糖化。在实施方案中，将淀粉转化为如糖或脂肪替代物等低分子量糖类组分的淀粉转化过程包括脱支的步骤。在将淀粉转化为糖的情况下，淀粉被解聚。这样的解聚过程由预处理步骤和两个或三个连续的方法步骤(例如液化过程、糖化过程，和依赖于期望的最终产物，典型地异构化过程)组成。天然淀粉由显微颗粒组成，这些颗粒在室温下不溶于水。水性淀粉浆液被加热时，颗粒膨胀并最终爆裂，将淀粉分子分散到溶液中。在这一“凝胶化”过程期间，粘度急剧上升。由于典型工业过程中固体水平在30-40％之间，淀粉必须变稀或“液化”以便于处理。粘度的这一降低当今大部分通过酶降解得到。

在液化步骤中，用α-淀粉酶将长链淀粉降解为分支和线性的较短的单元(麦芽糊精)。液化过程的实施是在约105-110℃5到10分钟后在约95℃1-2小时。pH在约5.5和约6.2之间。为保证这些条件下有最佳的酶稳定性，添加1mM钙(40ppm游离钙离子)。这一处理后液化淀粉的“葡萄糖当量”(DE)为约10-15。

α-淀粉酶变体可为实施液化过程提供至少一种改善的酶性质。例如，变体α-淀粉酶可以有更高的活性，和/或可以有降低的钙需要性。典型地，需要加入游离钙来保证α-淀粉酶有足够高的稳定性，然而，游离钙对葡萄糖异构酶的活性有强烈抑制。因此，应通过昂贵的单元操作，在异构化阶段之前将钙去除到游离钙水平在3-5ppm以下的程度。因此，不需要钙的变体代表了商业上的费用节省。所以，不需要钙离子或对钙离子的需要降低的α-淀粉酶变体是特别有利的。例如，钙依赖性降低的α-淀粉酶变体可用在组合物和步骤中，所述变体在低游离钙浓度(＜40ppm)下是稳定和高活性的。这样的α-淀粉酶变体应在例如约4.5到约6.5的范围中有pH最佳值。α-淀粉酶变体可单独用于提供特异水解，或与其他淀粉酶组合来提供具有广谱活性的“混合物”。

要加工的淀粉可以是高度精炼的淀粉质量，例如，至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯。备选地，淀粉可以是更粗制的淀粉，含有的物质包含碾磨的完整谷物，包括如胚芽残余物和纤维等非淀粉部分。将如完整谷物等原料碾磨来打开结构，容许进一步的加工。有两种适合的碾磨方法：湿碾磨和干碾磨。同样，可应用玉米渣和碾磨的玉米渣。干的碾磨谷物将除了淀粉以外还包含显著数量的非淀粉糖类化合物。用蒸汽加压锅蒸煮来加工这样的异质性物质时，常仅仅实现淀粉的部分凝胶化。因此，对非凝胶化淀粉有高活性的α-淀粉酶变体可有利地用于包括液化和/或糖化蒸汽加压锅蒸煮的干碾磨淀粉的方法中。

5.2.糖化组合物和用途

液化过程后，麦芽糖糊精通过葡糖淀粉酶(如，

L-400)和例如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或支链淀粉酶等脱支酶的加入转化为葡萄糖。这一步骤之前，pH降到4.5以下的值，维持高温(95℃以上)使用于液化的α-淀粉酶失活，以减少称为“潘糖前体”的短寡糖的形成，所述“潘糖前体”不能被脱支酶恰当水解。温度降低到约60℃，加入葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化过程进行约24-72小时。

一般来说，液化步骤后α-淀粉酶变性时，约0.2-0.5％的糖化产物是不能被支链淀粉酶降解的分支三糖Glc pα1-6Glc pα1-4Glc(潘糖)。如果糖化期间存在来自液化步骤的活性淀粉酶(即不变性)，这一水平可高达约1-2％，这是非常不合期望的，因为它显著降低了糖化产率。

期望的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，葡萄糖浆可转变为果糖。糖化过程后pH上升到约6-8范围内的值，如pH 7.5，并通过离子交换除去钙。葡萄糖浆随后用例如固定化葡萄糖异构酶(例如

IGI-HF)转变为高果糖糖浆。

6.乙醇生产方法

一般来说，从完整谷物的生产醇(乙醇)可分为4个主要步骤：碾磨、液化、糖化和发酵。

碾磨谷物是为了将结构打开，容许进一步的加工。通常使用的两种过程是湿碾磨或干碾磨。干碾磨中，碾磨完整的谷仁并用于过程的剩余部分。湿碾磨给予胚芽和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好的分离，除了一些例外，湿碾磨应用在存在糖浆平行生产的地方。

在液化过程中，通过水解为DP大部分高于4的麦芽糖糊精来溶解淀粉颗粒。可通过酸处理或α-淀粉酶的酶处理来实施水解。有限地使用酸水解。原料可以是碾磨的完整谷物或来自淀粉加工的侧流。酶液化典型地作为三步热浆液过程进行。将浆液加热到在约60-95℃间，典型地在约80-85℃间，并加入酶。随后浆液在约95-140℃间(典型地在约105-125℃)高压蒸煮，冷却到约60-95℃，加入更多的酶以得到最后的水解。液化过程在约pH 4.5-6.5下进行，典型地在pH约5.0到约6.0间进行。碾磨并液化的谷物也称为醪液。

为了产生能被酵母代谢的低分子糖DP1-3，来自液化的麦芽糖糊精必须被进一步水解。典型地，水解使用葡糖淀粉酶，备选地α-葡糖苷酶或酸性α-淀粉酶酶促进行。完整的糖化步骤可持续长达72小时，然而，通常只进行典型40-90分钟的预糖化，随后在发酵期间进行完全糖化(SSF)。糖化通常进行在pH约4.5，温度约30-65℃下，典型地在约60℃下进行。

通常将来自酵母菌属的酵母加入到醪液中，发酵进行24-96小时，例如典型地35-60小时。温度在约26-34℃之间，典型地在约32℃下，且pH在约pH 3-6，典型地在约pH 4-5。注意最广泛使用的过程是同时糖化与发酵(SSF)过程，其中没有糖化的保持阶段，表示酵母和酶是一起加入的。进行SSF时，通常在即将发酵之前，在温度50℃以上引入预糖化步骤。

发酵之后，蒸馏醪液以提取乙醇。根据本公开的方法获得的乙醇可用作，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即适于饮用的中性酒精或工业乙醇。发酵剩余物是谷物，其典型地用作液体形式或干燥的动物饲料。如何进行液化、糖化、发酵、蒸馏和乙醇回收的进一步细节为技术人员所公知。根据本公开的方法，糖化和发酵可同时或分别进行。

7.洗涤剂组合物和用途

此处讨论的α-淀粉酶变体可在洗涤剂组合物中配制，用于洗衣、清洁餐具或其他清洁组合物中。

7.1.洗衣，清洁和餐具清洗组合物及其用途

根据一个实施方案，一种或更多α-淀粉酶变体可以典型地是洗涤剂组合物的组分和/或洗涤剂添加剂。像这样，它可以以非粉化颗粒、稳定液体或受保护酶的形式包含在洗涤剂组合物中。可如美国专利号4,106，和4,661,452中所公开的来产生非粉化颗粒，并且可典型地用本领域已知方法进行包衣。蜡状包衣物质的例子是聚环氧乙烷产品；平均摩尔质量为1000到20,000的(聚乙二醇，PEG)；具有16到50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪族醇类，其中醇含有12到20个碳原子，并存在15到80个环氧乙烷单元；脂肪醇类；脂肪酸；和脂肪酸的甘油单酯、二酯和三酯。适合通过流化床技术应用的成膜包衣物质的例子在例如GB专利号1483591中给出。例如，可以根据已建立的方法，通过添加多元醇，例如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸来稳定液态酶制剂。其他酶稳定剂是本领域公知的。可根据例如美国专利号5,879,920(Genencor Int’l，Inc.)或欧洲专利号238216所公开的方法来制备受保护的酶。很久以来多元醇被认为是蛋白质稳定剂，并且提高蛋白质溶解性，如见Kaushik等人，“Why is trehalosean exceptional protein stabilizer？An analysis of the thermal stability ofproteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose”J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)和其中引用的参考文献；以及M.Conti等人，“Capillary isoelectric focusing：the problem of protein solubility，”J.Chromatography 757：237-245(1997)。

洗涤剂组合物可以以任意便利的形式存在，例如，作为凝胶剂、粉剂、粒剂、糊剂或液体。液态洗涤剂可以是水性的，典型地含有高达约70％的水和0％到约30％有机溶剂，也可以是以只含有约30％水的致密凝胶类型的形式存在。

洗涤剂组合物包含一种或更多种表面活性剂，每一种表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的或兼性离子的。洗涤剂通常含有0％到约50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲链烷磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基丁二酸；或者肥皂。组合物可含有0％到约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)，羧化醇乙氧基化物，壬基酚醇乙氧基化物，烷基多苷(alkylpolyglycoside)，烷基二甲基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)，乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺，脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺，例如WO 92/06154中所描述的。

洗涤剂组合物可额外包含任意组合的一种或多种其他酶，例如脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶和/或漆酶。

洗涤剂可含有约1％到约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基丁二酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是未助洗的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。可以在与酶稳定性相容的任意组合物中使用酶。通过已知的封装形式，例如通过粒化或水凝胶中隔离，来针对通常有害的组分保护酶。酶，特别是含有或不含淀粉结合域的α-淀粉酶，并不限于洗衣和餐具清洗的应用，而可用于表面清洁剂和从淀粉或生物量制取乙醇。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子包含羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、和聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白系统，该系统可包含例如过硼酸盐和过碳酸盐的H₂O₂源，其通常与形成过酸的漂白活化剂(如TAED或壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS))组合。备选地，漂白系统可包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统也可以是酶漂白系统，其中过水解酶激活过氧化物，如WO2005/056783中所述。

洗涤剂组合物的酶可用常规稳定剂来稳定，例如多元醇，如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯；可以如WO92/19709和WO 92/19708中所描述的配制组合物。

洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如，织物柔顺剂，包括如粘土、起泡剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉积剂、染料、杀菌剂、明亮剂或香料。pH(水溶液以使用的浓度测量)常常是中性或碱性的，例如约7.0到约11.0的pH。

α-淀粉酶变体可以以常规应用于洗涤剂中的浓度引入。现在考虑，在洗涤剂组合物里，以对应于每升洗涤液0.00001-1.0mg(以纯酶蛋白计算)α-淀粉酶变体的量加入α-淀粉酶变体。包含α-淀粉酶变体的特定形式的洗涤剂组合物可经配制而包括：

(1)洗涤剂组合物，其配制为颗粒，具有至少600g/L的堆积密度，包含线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)约7％到约12％；醇乙氧基硫酸盐(如，C_12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(如，C_16-18)约1％到约4％；醇乙氧基化物(如，C_14-15醇，7EO)约5％到约9％；碳酸钠(如，Na₂CO₃)约14％到约20％；可溶性硅酸盐约2到约6％；沸石(如NaAlSiO₄)约15％到约22％；硫酸钠(如，Na₂SO₄)0％到约6％；柠檬酸钠/柠檬酸(如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)约0％到约15％；过硼酸钠(如，NaBO₃H₂O)约11％到约18％；TAED约2％到约6％；羧甲基纤维素(CMC)0％到约2％；聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)0-3％；酶(按纯酶计算)0.0001-0.1％蛋白质；以及次要成分(如抑泡剂，香料，明亮剂，光学漂白剂)0％到约5％。

(2)洗涤剂组合物，其配制为颗粒，具有至少600g/L的堆积密度，包含线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)约6％到约11％；醇乙氧基硫酸盐(如，C_12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(如，C_16-18)约1％到约3％；醇乙氧基化物(如，C_14-15醇，7EO)约5％到约9％；碳酸钠(如，Na₂CO₃)约15％到约21％；可溶性硅酸盐约1％到约4％；沸石(如NaAlSiO₄)约24％到约34％；硫酸钠(如，Na₂SO₄)约4％到约10％；柠檬酸钠/柠檬酸(如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)约0％到约15％；羧甲基纤维素(CMC)0％到约2％；聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)1-6％；酶(按纯酶计算)0.0001-0.1％蛋白质；以及次要成分(如抑泡剂，香料)0％到约5％。

(3)洗涤剂组合物，其配制为颗粒，具有至少600g/L的堆积密度，包含线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)约5％到约9％；醇乙氧基化物(如，C_12-15醇，7EO)约7％到约14％；作为脂肪酸的肥皂(如，C^16-22脂肪酸)约1到约3％；碳酸钠(作为Na₂CO₃)约10％到约17％；可溶性硅酸盐约3％到约9％；沸石(作为NaAlSiO₄)约23％到约33％；硫酸钠(如，Na₂SO₄)0％到约4％；过硼酸钠(如，NaBO₃H₂O)约8％到约16％；TAED约2％到约8％；膦酸盐(如，EDTMPA)0％到约1％；羧甲基纤维素(CMC)0％到约2％；聚合物(如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)0-3％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；次要成分(如，抑泡剂，香料，明亮剂)0％到约5％。

(4)洗涤剂组合物，其配制为颗粒，具有至少600g/L的堆积密度，包含线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)约8％到约12％；醇乙氧基化物(如，C_12-15醇，7EO)约10％到约25％；碳酸钠(作为Na₂CO₃)约14％到约22％；可溶性硅酸盐约1％到约5％；沸石(如，NaAlSiO₄)约25％到约35％；硫酸钠(如，Na₂SO₄)0％到约10％；羧甲基纤维素(CMC)0％到约2％；聚合物(如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)1-3％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；以及次要成分(如，抑泡剂，香料)0％到约5％。

(5)水性液体洗涤剂组合物，包含线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)约15％到约21％；醇乙氧基化物(如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)约12％到约18％；作为脂肪酸的肥皂(如，油酸)约3％到约13％；烯基丁二酸(C_12-14)0％到约13％；氨基乙醇约8％到约18％；柠檬酸约2％到约8％；膦酸盐0％到约3％；聚合物(如，PVP，PEG)0％到约3％；硼酸盐(如，B₄O₇)0％到约2％；乙醇0％到约3％；丙二醇约8％到约14％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；以及次要成分(如，分散剂，抑泡剂，香料，明亮剂)0％到约5％。

(6)水性结构液态洗涤剂组合物，包含线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)约15％到约21％；醇乙氧基化物(如，C_12-15醇，7EO，或C_12-15醇，5EO)3-9％；作为脂肪酸的肥皂(如，油酸)约3％到约10％；沸石(作为NaAlSiO₄)约14％到约22％；柠檬酸钾约9％到约18％；硼酸盐(如，B₄O₇)0％到约2％；羧甲基纤维素(CMC)0％到约2％；聚合物(如，PEG，PVP)0％到约3％；锚定聚合物(如，十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物)；摩尔比25∶1，MW 3800)0％到约3％；甘油0％到约5％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；以及次要成分(如，分散剂，抑泡剂，香料，明亮剂)0％到约5％。

(7)洗涤剂组合物，其配制为颗粒，具有至少600g/L的堆积密度，包含脂肪醇硫酸酯约5％到约10％；乙氧基脂肪酸单乙醇酰胺约3％到约9％；作为脂肪酸的肥皂0-3％；碳酸钠(如，Na₂CO₃)约5％到约10％；可溶性硅酸盐约1％到约4％；沸石(如，NaAlSiO₄)约20％到约40％；硫酸钠(如，Na₂SO₄)约2％到约8％；过硼酸钠(如，NaBO₃H₂O)约12％到约18％；TAED约2％到约7％；聚合物(如，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)约1％到约5％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；以及次要成分(如，明亮剂，抑泡剂，香料)0％到约5％。

(8)洗涤剂组合物，其配制为颗粒，包含线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)约8％到约14％；乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺约5％到约11％；作为脂肪酸的肥皂0％到约3％；碳酸钠(如，Na₂CO₃)约4％到约10％；可溶性硅酸盐约1％到约4％；沸石(如，NaAlSiO₄)约30％到约50％；硫酸钠(如，Na₂SO₄)约3％到约11％；柠檬酸钠(如，C₆H₅Na₃O₇)约5％到约12％；聚合物(如，PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)约1％到约5％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；以及次要成分(如，抑泡剂，香料)0％到约5％。

(9)洗涤剂组合物，其配制为颗粒，包含线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)约6％到约12％；非离子表面活性剂约1％到约4％；作为脂肪酸的肥皂约2％到约6％；碳酸钠(如，Na₂CO₃)约14％到约22％；沸石(如，NaAlSiO₄)约18％到约32％；硫酸钠(如，Na₂SO₄)约5％到约20％；柠檬酸钠(如，C₆H₅Na₃O₇)约3％到约8％；过硼酸钠(如，NaBO₃H₂O)约4％到约9％；漂白活化剂(如，NOBS或TAED)约1％到约5％；羧甲基纤维素(CMC)0％到约2％；聚合物(如，聚羧酸酯或PEG)约1％到约5％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；以及次要成分(如，明亮剂，香料)0％到约5％。

(10)水性液体洗涤剂组合物，包含线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)约15％到约23％；醇乙氧基硫酸盐(如，C_12-15醇，2-3EO)约8％到约15％；醇乙氧基化物(如，C_12-15醇，7EO，或C_12-15醇，5EO)约3％到约9％；作为脂肪酸的肥皂(如，十二烷酸)0％到约3％；氨基乙醇约1％到约5％；柠檬酸钠约5％到约10％；水溶助长剂(如，甲苯磺酸钠)约2％到约6％；硼酸盐(如，B₄O₇)0％到约2％；羧甲基纤维素0％到约1％；乙醇约1％到约3％；丙二醇约2％到约5％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；以及次要成分(如，聚合物，分散剂，香料，明亮剂)0％到约5％。

(11)水性液体洗涤剂组合物，包含线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)约20％到约32％；醇乙氧基化物(如，C_12-15醇，7EO，或C_12-15醇，5EO)6-12％；氨基乙醇约2％到约6％；柠檬酸约8％到约14％；硼酸盐(如，B₄O₇)约1％到约3％；聚合物(如，马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物，例如十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物)0％到约3％；甘油约3％到约8％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；以及次要成分(如，水溶助长剂，分散剂，香料，明亮剂)0％到约5％。

(12)洗涤剂组合物，其配制为颗粒，具有至少600g/L的堆积密度，包含阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐，α-磺基脂肪酸甲酯，链烷磺酸盐，肥皂)约25％到约40％；非离子型表面活性剂(如，醇乙氧基化物)约1％到约10％；碳酸钠(如，Na₂CO₃)约8％到约25％；可溶性硅酸盐约5％到约15％；硫酸钠(如，Na₂SO₄)0％到约5％；沸石(NaAlSiO₄)约15％到约28％；过硼酸钠(如，NaBO₃·4H₂O)0％到约20％；漂白活化剂(TAED或NOBS)约0％到约5％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；次要成分(如香料和明亮剂)0％到约3％。

(13)如以上组合物1)到12)描述的洗涤剂组合物，其中所有或部分的线性烷基苯磺酸盐被(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐取代。

(14)洗涤剂组合物，其配制为颗粒，具有至少600g/L的堆积密度，包含(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐约9％到约15％；醇乙氧基化物约3％到约6％；多羟基烷基脂肪酸酰胺约1％到约5％；沸石(如，NaAlSiO₄)约10％到约20％；层状二硅酸盐(如，来自Hoechst的SK56)约10％到约20％；碳酸钠(如，Na₂CO₃)约3％到约12％；可溶性硅酸盐0％到约6％；柠檬酸钠约4％到约8％；过硼酸钠约13％到约22％；TAED约3％到约8％；聚合物(如，聚羧酸酯和PVP)0％到约5％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；以及次要成分(如，明亮剂，光学漂白剂，香料，抑泡剂)0％到约5％。

(15)洗涤剂组合物，其配制为颗粒，具有至少600g/L的堆积密度，包含(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸酯约4％到约8％；醇乙氧基化物约11％到约15％；肥皂约1％到约4％；沸石MAP或沸石A约35％到约45％；碳酸钠(作为Na₂CO₃)约2％到约8％；可溶性硅酸盐0％到约4％；过碳酸钠约13％到约22％；TAED 1-8％；羧甲基纤维素(CMC)0％到约3％；聚合物(如，聚羧酸酯和PVP)0％到约3％；酶(按纯酶蛋白计算)0.0001-0.1％；以及次要成分(如，明亮剂，膦酸酯，香料)0％到约3％。

(16)如以上1)-15)所描述的洗涤剂制剂，其含有稳定的或包囊的过酸，作为额外的组分，或者作为已指定漂白系统的替代物。

(17)如以上1)，3)，7)，9)和12)所描述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐替代。

(18)如以上1)，3)，7)，9)，12)，14)和15)中描述的洗涤剂组合物，其额外地含有锰催化剂。

(19)洗涤剂组合物，其配制为非水相洗涤剂液体，其包含液态非离子表面活性剂，例如线性烷氧基化伯醇，助洗剂系统(如，磷酸盐)，酶和碱。洗涤剂也可包含阴离子表面活性剂和/或漂白系统。

在另一实施方案中，2，6-β-D-果聚糖水解酶可掺入洗涤剂组合物，用于存在于家居和/或工业织物/衣物上的生物膜的去除/清洁。

洗涤剂组合物可以是例如配制为手或机器洗衣洗涤剂组合物，所述组合物包括适合于玷污织物预处理和冲洗添加的织物柔顺剂组合物的洗衣添加组合物，或者是配制为用于一般家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者是为手或机器餐具清洗操作配制的。

在特别的方面，洗涤剂组合物可包含2，6-β-D-果聚糖水解酶，一种或更多α-淀粉酶变体，一种或更多其他清洁酶，例如蛋白酶，脂肪酶，角质酶，糖酶，纤维素酶，果胶酶，甘露聚糖酶，阿拉伯糖酶，半乳聚糖酶，木聚糖酶，氧化酶，漆酶和/或过氧化物酶，和/或它们的组合。一般来说，所选酶的性质应当与所选洗涤剂相容(如pH最佳值，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且酶应以有效量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。化学修饰或蛋白质工程化的突变体也是合适的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，如碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。示例性碱性蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶类，特别是那些源自芽孢杆菌属的，如枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309(如见美国专利号6,287,841)，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(如见WO89/06279)。示例性胰蛋白酶样蛋白酶是胰蛋白酶(如来自猪或牛)，和镰孢属蛋白酶(如见WO 89/06270和WO 94/25583)。示例性蛋白酶也包括但不限于WO 92/19729和WO 98/20115中描述的变体。合适的商业上可得到的蛋白酶包括

Primase^TM，Duralase^TM，and Kannase^TM(Novo Nordisk A/S)；

Maxacal^TM，Maxapem^TM，Properase^TM，

Purafect OxP^TM，FN2^TM，和FN3^TM(Genencorlnternational，Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的酶。包括化学修饰或蛋白质改造的突变体。示例性脂肪酶包含但不限于来自腐质霉属(同义词Thermomyces)，例如H.lanuginosa(T.lanuginosus)(例见欧洲专利号258068和305216)和H.insolens(例见WO 96/13580)，假单胞菌脂肪酶(例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)，例见欧洲专利号218272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(例见欧洲专利号331376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(例见GB 1,372,034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌属菌株SD 705(例见WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(例见WO 96/12012)；芽孢杆菌脂肪酶(例如，来自枯草芽孢杆菌，例见Dartois等人，Biochemica Biophysica Acta，1131：253-360(1993))，嗜热脂肪芽孢杆菌(例见JP 64/744992)，或短小芽孢杆菌(例见WO 91/16422)。考虑使用在制剂中的额外脂肪酶变体包括例如以下文件所述的变体：WO 92/05249，WO 94/01541，WO 95/35381，WO96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO 95/14783，WO 95/22615，WO97/04079，WO 97/07202，欧洲专利号407225和260105。一些商业上可得到的脂肪酶包括

和Ultra(Novo Nordisk A/S)。

聚酯酶：合适的聚酯酶包括但不限于在WO 01/34899(GenencorInternational，Inc.)和WO 01/14629(Geneneor International，Inc.)中所述的那些，且可与此处讨论的其他酶组合被包括在其中。

淀粉酶：组合物可与其他α-淀粉酶，例如非变体α-淀粉酶组合。这些可包括商业上可得到的淀粉酶，例如但不限于

Termamyl^TM，

和BAN^TM(Novo Nordisk A/S)，

以及

(Genencor International，Inc.)。

纤维素酶：纤维素酶可加入组合物中。合适的纤维素酶包括来源于细菌或真菌的那些。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属，假单胞菌属，腐质霉属，镰孢属，梭孢壳属和支顶孢属的纤维素酶，例如美国专利号4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757；和WO 89/09259中公开的产自Humicola insolens，Myceliophthora thermophila和尖镰孢的真菌纤维素酶。考虑应用的示例性纤维素酶是对织物有颜色护理益处的那些。这些纤维素酶的例子是例如欧洲专利号495257和531372；WO 99/25846(Genencor International，Inc.)，WO 96/34108(Genencor International，Inc.)，WO 96/11262；WO 96/29397和WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他例子是纤维素酶变体，例如在WO 94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK98/00299；欧洲专利号531315(Novo Nordisk)；美国专利号5,457,046；5,686,593和5,763,254中描述的那些。商业上可得到的纤维素酶包括

和

(Novo Nordisk A/S)；Clazinase^TM和

HA(GenencorInternational，Inc.)；以及KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：考虑的用于组合物中的合适过氧化物酶/氧化酶包括来自植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的例子包括来自鬼伞属(Coprinus)，如，来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶，以及它们如WO 93/24618，WO95/10602和WO 98/15257所述的变体。商业上可得到的过氧化物酶包括例如Guardzyme^TM(Novo Nordisk A/S)。

可通过加入含有一种或更多酶的单独添加剂，或通过加入包含所有这些酶的组合添加剂，将洗涤剂酶包括到洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，即单独添加剂或组合添加剂，可配制为颗粒、液体和浆液等。合适的颗粒洗涤剂添加剂制剂包括非粉化颗粒。

非粉化颗粒可如美国专利号4,106,991和4,661,452所公开的进行生产，并且典型地可通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的例子是平均摩尔质量为1000到20,000的聚环氧乙烷产品(例如聚乙二醇，PEG)；具有16到50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪族醇类，其中醇含有12到20个碳原子，并存在15到80个环氧乙烷单元；脂肪族醇类；脂肪酸；和脂肪酸的甘油单-和二-和三酯。适合通过流化床技术应用的成膜包衣材料的例子，在例如GB 1483591中给出。例如，可以根据已建立的方法，通过添加多元醇，例如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸，来稳定液态酶制剂。受保护的酶可根据欧洲专利号238216中公开的方法制备。

洗涤剂组合物可以是任一便利的形式，例如，棒状，片剂，凝胶，粉末，颗粒，糊剂或液体。液态洗涤剂可以是水相的，典型地含有高达约70％的水和0％到约30％的有机溶剂。也考虑含有30％或更少水的致密洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物包含一种或更多种表面活性剂，其可以是非离子的，包括半极性的，阴离子的，阳离子的或兼性离子的，及其任一组合。表面活性剂典型地以按重量计0.1％到60％的水平存在。

此处包括时，洗涤剂典型地将含有从约1％到约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐；α-烯烃磺酸盐；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)；醇乙氧基硫酸盐；仲链烷磺酸盐；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基丁二酸；或者肥皂。

此处包括时，洗涤剂通常含有从约0.2％到约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基多苷，烷基二甲基氧化胺，乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺，脂肪酸单乙醇酰胺，多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“glucamides”)。

洗涤剂可含有0％到约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基丁二酸、可溶性硅酸盐或如来自Hoechst的SKS-6的层状硅酸盐。

洗涤剂可包含一种或更多聚合物。例子是羧甲基纤维素(CMC))、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚乙烯咪唑、聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白系统，该漂白系统可包含H₂O₂源，例如过硼酸盐或过碳酸盐，所述盐可与产生过酸的漂白活性剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐)组合。备选地，漂白系统可包含过氧酸(如酰胺类、酰亚胺类或砜类过氧酸)。漂白系统也可以是酶漂白系统。

可使用常规稳定剂稳定洗涤剂组合物的酶，所述稳定剂为例如多元醇(如丙二醇或甘油)，糖或糖醇，乳酸，硼酸，硼酸衍生物(如芳香硼酸酯)，或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰基苯基硼酸)。组合物可按WO 92/19709和WO 92/19708所描述的配制。

洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如，包括粘土的织物柔顺剂、起泡剂、抑泡剂、防蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉积剂、染料、杀菌剂、明亮剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂或香料。

考虑到在洗涤剂组合物中，添加的酶变体的量相应于约0.01到约100mg酶蛋白/升洗涤液，特别地，约0.05到约5.0mg酶蛋白/升洗涤液，或更特别地，0.1到约1.0mg酶蛋白/升洗涤液。

例如，此处讨论的α-淀粉酶变体可配制在洗涤剂组合物中，用于清洁餐具或其他清洁组合物。这些组合物可为凝胶、粉末或液体。组合物可包含单独的α-淀粉酶变体、其他淀粉酶、其他清洁酶和其他清洁组合物中常有的组分。

因此，餐具清洗洗涤剂组合物可包含表面活性剂。表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、两性的或这些类型的混合物。洗涤剂可含有0％到约90％重量的非离子表面活性剂，如低泡沫到无泡沫的乙氧基化丙氧基化直链醇类。

在洗涤剂应用中，通常在含有丙二醇的液体组合物中使用α-淀粉酶变体。可通过在含有10％氯化钙的25％体积/体积丙二醇溶液中循环，来将α-淀粉酶变体溶解于例如丙二醇中。

餐具清洗洗涤剂组合物可含有无机和/或有机类型的洗涤剂助洗剂盐。洗涤剂助洗剂可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1％到约90％的洗涤剂助洗剂。存在时，含磷无机碱性洗涤剂助洗剂的例子包括水溶性盐，特别是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多磷酸盐。存在时，含磷有机碱性洗涤剂助洗剂的例子包括水溶性膦酸盐。存在时，无磷无机助洗剂的例子包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐，以及各种水溶性晶体或无定形铝硅酸盐，其中最为人所知的代表是沸石。

合适的有机助洗剂的例子包括碱金属、铵和取代铵、柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、脂肪酸磺酸盐、羧基甲氧基琥珀酸盐、聚乙酸铵、羧酸盐、聚羧酸盐、氨基聚羧酸盐、聚乙酰羧酸盐和聚羟基磺酸盐。

其他合适的有机助洗剂包括已知具有助洗剂性质的高分子量聚合物和共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，及其盐。

清洁组合物可含有氯/溴型或氧型漂白剂。无机氯/溴型漂白剂的例子是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴型漂白剂的实例是杂环N-溴或N-氯酰亚胺，例如三氯异氰脲酸，三溴异氰脲酸，二溴异氰脲酸和二氯异氰脲酸，及其带有水溶性阳离子的盐(例如钾和钠)。乙内酰脲化合物也是合适的。

清洁组合物可含有氧漂白剂，例如以无机过盐酸的形式，典型地含有漂白前体或作为过氧酸化合物。合适的过氧酸漂白化合物的典型例子是碱金属过硼酸盐的四水合物和一水合物，碱金属过碳酸盐，过硅酸盐和过磷酸盐。合适的活化剂材料包括四乙酰基亚乙基二胺(TAED)和三乙酸甘油酯。也存在酶漂白活化系统，例如过硼酸盐或过碳酸盐，三乙酸甘油酯和过水解酶，如WO 2005/056783所公开。

清洁组合物可用酶的常规稳定剂来稳定，例如多元醇如丙二醇；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯。清洁组合物也可含有其他常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂，填充剂，抑泡剂，抗腐蚀剂，污物悬浮剂，掩蔽剂，抗污物再沉积剂，脱水剂，染料，杀菌剂，荧光剂，增稠剂和香料。

最后，α-淀粉酶变体可用在常规餐具清洗洗涤剂，如以下专利出版物描述的任一洗涤剂中所述，考虑此处公开的α-淀粉酶变体用于替代或附加于所列专利和公布的申请所公开的任一α-淀粉酶：CA 2006687，GB2200132，GB 2234980，GB 2228945，DE 3741617，DE 3727911，DE 4212166，DE 4137470，DE 3833047，DE 4205071，WO 93/25651，WO 93/18129，WO93/04153，WO 92/06157，WO 92/08777，WO 93/21299，WO 93/17089，WO93/03129，欧洲专利号481547，530870，533239，554943，429124，346137，561452，318204，318279，271155，271156，346136，518719，518720，518721，516553，561446，516554，516555，530635，and 414197，and U.S.Patent Nos.5,112,518；5,141,664和5,240,632。

7.2.评估洗涤剂组合物的方法

存在为数众多的α-淀粉酶清洁测定法。测试清洁的示例性描述包括以下的。“样品”是一块材料，如织物，有污渍附在其上。材料可以是，例如用棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制造的织物。备选地，材料可以是纸，例如滤纸或硝酸纤维素，或一块硬物，例如陶瓷，金属或玻璃。对α-淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但可包括血，奶，墨水，草，茶，酒，菠菜，肉汁，巧克力蛋，乳酪，粘土，色素，油或这些化合物的混合物。在一个实施方案中，α-淀粉酶变体在BMI(血/奶/墨水)测定法中测试。

“较小样品”是一块样品，该样品已经用例如单孔穿孔机或者定制的96孔穿孔机切割过(其中多孔穿孔机的式样与标准96孔微量滴定板相配)，或者以别的方式从样品上去除。样品可以是织物，纸，金属或其他合适的材料。较小样品可在其置入24-，48-或96-孔微量滴定板的孔之前或之后将污渍附着上去。也可以通过将污渍应用到一小片材料上来制作较小样品。例如，较小样品可以是带有直径5/8″或0.25′污渍的一块织物。定制的穿孔机是以这样的方式设计的，其将96块样品同时递送到96孔板的所有孔中。这一装置通过简单地装载同一96孔板数次，允许递送每孔多于一个样品。可构想多孔打孔装置，用于将样品同时递送到任一形式的板上，包括但不限于24孔，48孔和96孔板。在另一构想的方法中，弄脏的测试平台可以是用污渍底物涂布的金属、塑料、玻璃、陶瓷或其他合适材料制作的小珠。一个或更多经涂布的小珠随后被置于96-，48-或24-孔板或形式更大板上的孔中，所述孔含有合适的缓冲液和酶。在这种情况下，可通过直接吸收测量或在二次显色反应后检查上清液中释放的污物。释放的污物的分析也可通过质谱分析进行。

在一个实施方案中，处理方案提供了对污渍固定程度的控制。因此，可能产生这样的样品，其例如在不含所测酶时清洗时释放不同量的污渍。已固定样品的使用导致清洗测定中的信噪比显著提高。此外，通过改变固定化程度，可产生在多种清洗条件下给出最佳结果的污渍。

在多种类型材料上具有已知“强度”污渍的样品可通过商业途径获得(EMPA，St.Gallen，Switzerland；Testgewebe GmbH，Krefeld Germany；或Center for Test Materials，Vlaardingen，The Netherlands)和/或可由从业者制作(Morris and Prato，Textile Research Journal 52(4)：280-286，1982)。样品可包含，例如，含有用血/奶/墨水(BMI)、菠菜、草或巧克力/奶/煤烟制作的污渍的含棉织物。例如BMI污渍可用0.0003％到0.3％的过氧化氢固定到棉上。其他组合包括用0.001％到1％戊二醛固定的草或菠菜，0.001％到1％戊二醛固定的明胶和考马斯污渍，或者用0.001％到1％戊二醛固定的巧克力、奶和煤烟。

也可在用酶和/或洗涤剂制剂温育期间搅动样品。清洗性能数据依赖于孔中样品的朝向(水平对垂直)，特别是在96孔板中。这会表明温育期间混合是不足够的。虽然有一些保证温育期间足够搅拌的方法，可制作板固定器，其中微量滴定板夹在两块铝板之间。这可像放置一样简单，例如，孔上的粘性板密封器，随后用任一类型的适当的可商业得到的夹子，将两块铝板夹住96孔板。随后可将其安装到商业培养箱振荡器上。设置振荡器到约400rpm，导致非常有效的混合，同时固定器有效避免了泄露或交叉污染。

也可使用三硝基苯磺酸(TNBS)来定量清洗液中氨基的浓度。这可作为对从样品中除去的蛋白质的量的测量(如见Cayot and Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200，1997)。然而，如果洗涤剂或酶导致了异常的小肽片段的形成(例如来自样品中肽酶的存在)，则会得到更大的TNBS信号，即更多“噪音”。

测量血/奶/墨水清洗性能的另一种方法是建立在可通过测量清洗液吸光度来定量墨水释放的基础上。可在350和800nm间的任一波长测量吸光度。在一个实施方案中，波长在410nm或620nm处测量。也可检测清洗液以测定对含有草，菠菜，明胶或考马斯污迹的污渍的清洗性能。这些污渍的合适波长包括，对菠菜或草670nm，对明胶或考马斯620nm。例如，移出等分试样的清洗液(典型地，例如从96孔微量培养板中移出100-150μL)，置入比色皿或多孔微量培养板。随即将其置入分光光度计，在适当的波长读出吸光度。也可用该系统来测定用于餐具清洗(例如在诸如布、塑料或陶瓷的合适基质上使用血/奶/墨水污渍)的合适的酶和/或洗涤剂组合物。

在一个方面，通过在25℃下对BMI/棉样品应用0.3％过氧化氢30分钟，或在60℃下对BMI/棉样品应用0.03％过氧化氢30分钟，将BMI污渍固定到棉上。从BMI/棉样品上切下约0.25″的较小样品，置于96孔微量滴定板的孔中。向每个孔放置洗涤剂组合物与例如变体蛋白的酶的已知混合物。将粘性板密封器置于微量滴定板顶上以后，将微量滴定板夹到铝板，在有轨振荡器上以约250rpm摇动约10到60分钟。这一时间结束时，将上清液转移到新的微量滴定板的孔中，测量620nm处的墨水吸光度。对于通过在25℃下向菠菜/棉样品或草/棉样品应用0.01％戊二醛30分钟将菠菜污渍或草污渍固定在棉上的情况，也可以进行相似的测试。也可用巧克力、奶和/或煤灰污渍做相同的测试。

8.织物脱浆组合物和用途

还考虑的是用一种或更多种α-淀粉酶变体处理织物(例如使织物脱浆)的组合物和方法。α-淀粉酶变体可在本领域公知的任一织物处理方法(如见美国专利号6,077,316)中使用。例如，在一个方面，通过包括将织物与溶液中的酶变体接触的方法，改善织物的手感和外观。在一个方面，在压力下用溶液处理织物。

在一个方面，可在纺织品织造期间或以后，或在脱浆阶段中或一个或更多附加的织物处理步骤中应用酶。在纺织品织造期间，线暴露在可观的机械应力之下。在机械织机上纺织以前，常常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂布经纱，以增加其拉伸强度和避免断裂。可应用α-淀粉酶变体去除这些上浆淀粉或淀粉衍生物。在织物完成纺织后，织物可进入脱浆阶段。随之而来的是一个或更多额外的织物加工步骤。脱浆是从织物上去除浆料的行为。纺织以后，浆料涂料应在进一步加工织物以前除去，以便确保均一和防水的结果。同时提供了脱浆方法，所述方法包括通过酶变体的作用进行浆料的酶水解。

为了使包括含棉织物的织物脱浆，α-淀粉酶变体可作为如在水性组合物中的洗涤剂添加剂单独使用或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用。α-淀粉酶变体也可用于组合物，和用于在靛蓝染的牛仔布织物和衣服上产生石洗外观的方法。为了生产衣物，织物可裁剪并缝进衣服或衣物，其之后进行整理。特别地，对牛仔裤的生产，发展了不同的酶整理方法。牛仔布衣物的整理通常以酶脱浆步骤开始，脱浆步骤期间衣物经受淀粉分解酶的作用，以便为织物提供柔软性，并使棉在后续酶整理步骤中更容易接近。α-淀粉酶变体可用在整理牛仔布衣物(例如“生物石化方法”)、酶脱浆和向织物提供柔软性和/或整理加工的方法中。

本公开包括以下例子的进一步细节，其无论如何不意图限制权利要求的范围。所附的图是所提供说明书和描述的整体部分。引用的所有参考资料在此明确引入作为对其中所述所有内容的参考。因此提供下述实施例是用于说明，但不限制权利要求。

9.生物膜去除组合物和用途

组合物可包含一种作为主要酶组分的α-淀粉酶变体，例如，用于去除生物膜的单组分组合物。备选地，组合物可包含多种酶活性，例如多种淀粉酶或者包括以下酶的混合物：氨肽酶，淀粉酶(β-或α-或葡糖淀粉酶)，糖酶，羧肽酶，过氧化氢酶，纤维素酶，壳多糖酶，角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶或其任一组合用于去除生物膜。额外的酶可以是通过微生物能生产的，所述微生物属于曲霉菌属，例如棘孢曲霉(A.aculeatus)，泡盛曲霉(A.awamori)，黑曲霉或米曲霉；或者属于木霉属和腐质霉属，例如H.insolens；或者镰孢属，如杆孢状镰孢(F.bactridioides)，F.cerealis，F.crookwellense，大刀镰孢(F.culmorum)，禾本科镰孢(F.graminearum)，禾赤镰孢(F.graminum)，异孢镰孢(F.heterosporum)，合欢木镰孢(F.negundi)，尖镰孢(F.oxysporum)，多枝镰孢(F.reticulatum)，粉红镰孢(F.roseum)，接骨木镰孢(F.sambucinum)，肤色镰孢(F.sarcochroum)，F.sulphureum，F.toruloseum，F.trichothecioides，或F.venenatum。

包含α-淀粉酶变体的组合物可依据本领域已知方法制备，且可以是液态或干组合物的形式。例如，含有α-淀粉酶变体的组合物可以是颗粒或微粒的形式。可依据本领域已知方法稳定组合物中将要包括的多肽。

下面给出多肽组合物用途的例子。含有α-淀粉酶变体组合物的剂量和该组合物使用的其他条件，可在本领域已知方法的基础上确定。进一步考虑将α-淀粉酶与2，6-β-D-果聚糖水解酶或其变体在组合物中一起使用。

一个方面是生物膜的崩解和/或去除。此处所用的术语“崩解”应理解为，将生物膜中个体微生物细胞连接和结合在一起的生物膜基质中的多糖的水解，从而微生物细胞可从生物膜上释放并去除。生物膜可在表面存在；生物膜的崩解可通过将表面与水性培养基接触来实现，例如，通过浸渍、覆盖或飞溅，此处，水性培养基包含α-淀粉酶变体，任选地，包含一种或更多负责水解生物膜的其他酶，例如但不限于2，6-β-D-果聚糖水解酶。组合物可用于水解粘土，例如在制浆和造纸工业的白水中。

α-淀粉酶变体可以以0.0001到10000mg/L，0.001-1000mg/L，0.01-100mg/L，或者甚至0.1-10mg/L的量存在。另外的酶和酶变体可以以相似或较少的量存在。该方法可在从大约室温到约70℃的温度下进行。合适的温度范围是从约30℃到约60℃，例如，约40℃到约50℃。

对水解生物膜合适的pH在从约3.5到约8.5之间。特别合适的pH范围是从约5.5到约8，例如从约6.5到约7.5。酶变体能有效去除生物膜的接触时间或反应时间可以差异相当大，其依赖于生物膜的性质和单独用酶变体或与其他酶(例如2，6-β-D-果聚糖水解酶)组合处理表面的频率，但是合适的反应时间在约0.25到约25小时之间。特别合适的反应时间是从约1到约10小时，例如约2小时。

可将另外的酶与α-淀粉酶变体和2，6-β-D-果聚糖水解酶组合，所述另外的酶包括但不限于纤维素酶，半纤维素酶，木聚糖酶，其他淀粉酶，包括其他α-淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶和/或果胶酶。酶可进一步与抗微生物剂例如酶或非酶杀生物剂组合。酶杀生物剂可以是包含氧化还原酶的组合物，所述氧化还原酶例如漆酶或过氧化物酶，特别是卤素过氧化物酶，任选地增强剂，例如烷基丁香酸酯，例如WO 97/42825和DK 97/1273中所述。

生物膜将要从其上去除和/或清除的表面可以是硬表面，该硬表面在定义上涉及微生物基本不能渗透的任何表面。例子是金属制作的表面，例如不锈钢合金，塑料/合成聚合物，橡胶，板材，玻璃，木头，纸，织物，混凝土，岩石，大理石，石膏和陶瓷材料，其任选地可用涂料，搪瓷，聚合物等涂布。相应地，表面可以是保持，运输，加工或接触水溶液的系统的一员，例如供水系统，食品加工系统，冷却系统，化学加工系统，药物加工系统或木材加工系统，例如在制浆和/或造纸工业中发现的。相应地，酶变体和含有酶变体的组合物在常规定置洗净(C-I-P)系统中有用。表面可以是系统单元的一员，例如管，槽，泵，膜，滤器，热交换器，离心机，蒸发器，搅拌器，喷淋塔，阀门和反应器等。表面也可以是用于医学和工业的器具或其一部分，例如被污染的内窥镜，假肢装置或医学植入物。

也考虑将用于生物膜去除的组合物用于避免金属表面(如管道)被微生物生物膜攻击时发生所谓的生物腐蚀。组合物崩解生物膜，从而避免生物膜的微生物细胞形成会腐蚀其附着的金属表面的生物膜环境。

9.1.口腔护理组合物

抗-生物膜组合物的额外应用包括口腔护理。因此表面包括带有牙菌斑的牙齿。相应地，变体酶可用于组合物例如牙膏和制备药物的方法，所述药物包含用于崩解人或动物牙齿上所存在牙菌斑的酶变体。进一步的用途是从粘膜上崩解生物膜，例如患囊性纤维化病人肺中的生物膜。表面也可以是生物来源的其他表面，例如皮肤，牙齿，头发，指甲或可以是污染的隐形眼镜。

其他在口腔护理组合物中有用的酶包括但不限于2，6-β-D-果聚糖水解酶；葡聚糖酶；齿斑葡聚糖酶(mutanases)；氧化酶，例如葡萄糖氧化酶；L-氨基酸氧化酶；过氧化物酶，例如WO 95/10602中描述的鬼伞属(Coprinus sp.)过氧化物酶或乳过氧化物酶；卤素过氧化物酶，特别是来自弯孢属(Curvularia sp)的卤素过氧化物酶，特别是来自C.verruculosa和不等弯孢(C.inaequalis)的卤素过氧化物酶；漆酶；蛋白酶，例如木瓜蛋白酶；酸性蛋白酶(例如WO 95/02044中描述的酸性蛋白酶)；内切葡糖苷酶；脂肪酶；淀粉酶，包括淀粉葡糖苷酶，例如AMG^TM(来自NovoNordisk A/S)；抗微生物酶及其混合物。口腔护理产品可任选包含淀粉结合域，例如美国专利号6,207,149所公开的。

口腔护理组合物可以具有任一合适的物理形式，即，粉剂，糊剂，凝胶剂，液体剂，软膏剂，片剂等等。“口腔护理组合物”包括可通过预防龋齿、预防牙菌斑和牙垢形成、去除牙菌斑和牙垢、预防和/或治疗牙病等，用于维持或改善人和动物嘴里口腔卫生的组合物。口腔护理组合物也包括清洁义齿、假牙等等的产品。口腔护理组合物的例子包括牙膏，牙霜(dentalcream)，凝胶或牙粉，牙漱口剂，刷牙前或刷牙后冲洗制剂，口香糖，锭剂和糖果。牙膏和牙胶典型地包括摩擦磨光材料，起泡剂，调味剂，保湿剂，粘合剂，增稠剂，甜味剂，增白/漂白/除渍剂，水，和任选地酶。漱口剂，包括去除牙菌斑的液体，典型地包含水/醇溶液，香料，保湿剂，甜味剂，起泡剂，着色剂，和任选地酶。

摩擦磨光材料也可以掺入到口腔护理复合物中。相应地，摩擦磨光材料可包括氧化铝及其水合物，例如α-氢氧化铝；三硅酸镁；碳酸镁；高岭土；铝硅酸盐，例如煅烧硅酸铝和硅酸铝；碳酸钙；硅酸锆；和粉末塑料，例如聚氯乙烯；聚酰胺；聚甲基异丁烯酸酯；聚苯乙烯；酚醛树脂；三聚氰胺甲醛树脂；尿素甲醛树脂；环氧树脂；粉状聚乙烯；硅石干凝胶；水凝胶和气凝胶等等。也适合作为摩擦剂的是焦磷酸钙；不溶于水的碱性偏磷酸盐；磷酸二钙和/或其二水化物，磷酸氢钙；磷酸三钙；颗粒羟基磷灰石等等。也可以使用这些物质的混合物。依赖于口腔护理组合物，摩擦产品可以以约0％到约70％的重量存在，例如，从约1％到约70％。对于牙膏，摩擦材料含量通常占最终牙膏重量的10％到70％之间。

使用保湿剂来避免例如水从牙膏的损失。用于口腔护理组合物的合适保湿剂包括甘油；多元醇；山梨醇；聚乙二醇(PEG)；丙二醇；1，3-丙二醇；1，4-丁二醇；氢化的部分水解多糖等及其混合物。保湿剂在重量上一般占牙膏的0％到约80％，或者约5％到约70％。

硅石，淀粉，黄蓍胶，黄原胶，鹿角菜提取物，藻酸盐，果胶，纤维素衍生物，例如羟乙基纤维素，羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素，聚丙烯酸及其盐，聚乙烯吡咯烷酮是帮助稳定洁齿剂产品的合适增稠剂和粘合剂的例子。牙膏乳膏和凝胶中的增稠剂重量上占约0.1％到约20％，而粘合剂占最终产品重量的约0.01到约10％。

可使用起泡剂，包括肥皂，阴离子的、阳离子的、非离子的、两性和/或兼性离子的表面活性剂。这些起泡剂存在的水平按重量计可以为最终产品的0％到约15％，约0.1到约13％，或者甚至约0.25％到约10％。表面活性剂仅仅在其不会使现有酶失活的程度上是合适的。表面活性剂包括脂肪醇硫酸盐，具有10到20个碳原子的磺酸化单甘油酯或脂肪酸的盐，脂肪酸-白蛋白缩合产物，脂肪酰胺和牛磺酸的盐和/或羟乙磺酸脂肪酸酯的盐。

合适的甜味剂包括用在制剂中的糖精。香料，例如绿薄荷，也通常以较低的量存在，例如按重量计约0.01％到约5％，特别是从约0.1％到约5％。增白/漂白剂包括H₂O₂，并且按终产物重量计算，可以以少于约5％或从约0.25％到约4％的量添加。增白/漂白剂可以是酶，例如氧化还原酶。合适的牙齿漂白酶的例子描述在WO 97/06775(Novo Nordisk A/S)中。通常以赋予组合物(如牙膏)可流动形式的量来添加水。也可以包括水溶性抗细菌剂，例如氯己定二葡糖酸，海克替啶，双胍啶，三氯生

季铵抗细菌化合物，和特定金属离子如锌，铜，银和二价锡(如氯化锌，氯化铜和氯化亚锡，以及硝酸银)的水溶性来源。可用的其他化合物包括氟化物源，染料/着色剂，防腐剂，维生素，pH调节剂，抗龋剂和脱敏剂等等。

酶在如上所述的口腔护理组合物中也是有用的。用于清洁口腔时，酶提供了几个优势。蛋白酶分解唾液蛋白，其被吸附到牙齿表面的并形成菌膜(所得牙菌斑的第一层)。蛋白酶与脂肪酶一起通过裂解形成细菌细胞壁和细胞膜结构组分的蛋白质和脂类来破坏细菌。葡聚糖酶和其他糖酶，例如2，6-β-D-果聚糖水解酶分解为细菌粘附形成基质的细菌所产生的有机骨架结构。蛋白酶和淀粉酶不仅防止牙菌斑形成，也通过分解结合钙的糖类-蛋白复合物来避免矿化的发展。

牙膏可典型地包含以下成分(按最终牙膏组合物的重量％)：摩擦材料到约70％；保湿剂：0％到约80％；增稠剂：约0.1％到约20％；粘合剂：约0.01％到约10％；甜味剂：约0.1％到约5％；起泡剂：0％到约15％；增白剂：0％到约5％；和酶：约0.0001％到约20％。在一个实施方案中，牙膏具有约6.0到约8.0的pH，且包含：约10％到约70％摩擦材料；0％到约80％保湿剂；0.1％到约20％增稠剂；0.01％到约10％粘合剂；约0.1％到约5％甜味剂；0％到约15％起泡剂；0％到约5％增白剂；和约0.0001％到约20％的酶。这些酶包括α-淀粉酶变体单独或和其他酶组合，例如与2，6-β-D-果聚糖水解酶，任选地上面提到的其他类型酶组合。

漱口剂典型地可包含以下成分(按最终漱口剂组合物的重量％计)：0％到约20％保湿剂；0％到约2％表面活性剂；0％到约5％酶；0％到约20％乙醇；0％到约2％其他成分(如香料，甜味剂，活性成分例如氟化物)。组合物也可含有从约0％到约70％的水。漱口剂组合物可用适当的缓冲剂(例如在约6.0到约7.5pH范围内的柠檬酸钠或磷酸钠)来缓冲。漱口剂可以是非稀释形式的，也就是说，在使用前应稀释。口腔护理组合物可用口腔护理领域内已知的任一常规方法来产生。

实施例

实施例1-变体的构建

野生型LAT序列的S239Q突变是用位点定向诱变法构建的。诱变的模板是通过使用New England Biolabs(Beverly，MA)的dam-甲基化酶得到的甲基化pHPLT-LAT(图1)。5个最初的带有互补序列的磷酸化正向和反向引物是通过Integrated DNA Technologies，Coralville，IA合成的，在TE缓冲液中稀释到50μM。以Stratagene QuikChange Multi Site-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)，使用侧翼为239残基上游和下游序列的谷氨酰胺突变含有CAA密码子的寡核苷酸引物，来产生突变体。将239位的丝氨酸(S)残基突变成谷氨酰胺(Q)。用于诱变的引物是：LAT-S239Q-F：GTCAAACACATTAAATTTCAATTTTTGCGGGATTGGGLAT-S239Q-R：CCCAATCCCGCAAAAATTGAAATTTAATGTGTTTGAC

反应如下进行：

QuikChange反应：

反应液共25μL，由以下成分组成：13μL无菌蒸馏水，来自试剂盒的2.5μL 10X缓冲液，来自试剂盒的1μL dNTPs，0.25μL正向引物(50μM贮存液)，0.25uL反向引物(50μM贮存液)，7μL作为模板的pHPLT-LAT质粒DNA(约98ng)，和1μL来自试剂盒的酶混合物。

循环条件：

循环条件是在DNA Engine Dyad热循环仪(Bio-Rad，Hercules，CA)中，95℃1分钟一次，随后95℃1分钟，55℃1分钟，65℃10分30秒，进行30个循环。

进行QuickChange反应后向反应混合物加入1μL的Dpn I(10U/μl)，37℃下温育18小时，随后另加入0.5μl温育3小时。

使用2微升Dpn I消化反应物作为用Templiphi扩增试剂盒(GEHealthcare，Piscataway，NJ)进行滚环扩增的模板，根据制造商说明书进行反应。1微升滚环DNA转化进入100μl的枯草芽孢杆菌感受态细胞(缺失2个蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株(ΔaprE，ΔnprE，degUHy32，oppA，ΔspoIIE3501，amyE::xylRPxylAcomK-phleo))中，在37℃下摇动1小时。然后整个转化物接种在LA+10ppm新霉素+1％不溶淀粉平板(一个平板上25μL，另一个平板上75μL)上。用Illustra PureTaq Ready-To-GoPCR珠(GE Healthcare，Piscataway，NJ)和基5’和3’端侧翼的寡核苷酸引物PCR来进行菌落PCR。菌落PCR的引物在TE缓冲液(Integrated DNATechnologies，Coralville，IA)中稀释到50μM。菌落PCR所用引物是：

pHPLT-F1：TACATATGAGTTATGCAGTTTG

pHPLT-R1：GTTATGAGTTAGTTCAAATTCG

反应液由24μL无菌蒸馏水，0.5μL正向引物(50μM贮存液)，0.5μL反向引物(50μM贮存液)，非常少量的目的菌落在单独的1.5mL管中混合在一起组成。将这一混合物加入到PCR珠。

菌落PCR的循环条件：

循环条件是在DNA Engine Dyad热循环仪(Bio-Rad，Hercules，CA)中，95℃10分钟一次，随后95℃1分钟，53℃1分钟，72℃2分钟进行25个循环，随后最后步骤为72℃下1分钟。

使用ExoSAP-IT(USB Corp.，Cleveland，OH)，通过将10μL PCR产物与4μL的ExoSAP混合，随后在37℃温育15分钟，80℃温育15分钟，来净化PCR产物以便除去过量的dNTPs。净化的菌落PCR产物由Quintara Biosciences(Berkeley，CA)测序。

LAT-S239SEL：

用DNA 2.0(Menlo Park，CA)合成制备对位置239的丝氨酸残基的位点评价库(SEL)。在pHPLT-LAT质粒中产生突变体，并转化到枯草芽孢杆菌宿主(2个蛋白酶缺失(ΔaprE，ΔnprE，ΔspoIIE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo))中。进行的氨基酸替换是：A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W和Y。

实施例2-变体的表达，纯化和表征

挑选LAT S239变体进入含有125μlLB和10ppm新霉素的96孔微量滴定板，并与对照排列成四方形式。排列好的微孔滴定板在37℃250rpm下培育6小时。使用复制工具(Enzyscreen，Leiden，The Netherlands)，微量滴定培养板用于接种新的微量滴定板(来自Enzyscreen，Leiden，TheNetherlands的微量滴定板和板盖)，其中新板含有用于蛋白质表达(G.Vogtentanz et al，A Bacillus subtilis fusion protein system to producesoybean Bowman-Birk protease inhibitor，Prot.Expr.& Purif.，55：40-52(2007))的175μl MBD培养基，并补充10ppm新霉素和5mM氯化钙。表达板在37℃、25rpm和70％湿度下培育64小时。表达培养物随后通过微滤板(0.22μm，Millipore，Billerica，MA)过滤以便扫描。

淀粉酶的发酵在500mL摇瓶里发生，在含有1％(w/v)大豆胨(Soytone)的基本MOPS培养基中37℃下培育60小时(Neidhardt等人，J.Bacteriol.，119(3)：736-747，1974)。

用Phenyl SEPHAROSE 6 Fast Flow(high sub)(GE healthcare，17-0973-05)，使用疏水作用层析从发酵液中纯化S239Q变体和野生型α-淀粉酶(分别是SEQ ID NOS：2和4)。简言之，发酵液浓缩10倍，随后用50mM MES，2mM CaCl₂，pH 6.8(含1M硫酸铵)稀释，并用12.5cm玻璃纤维滤器(Watman，1825-125)进行过滤除菌。随后样品装载到已用相同缓冲液预平衡的苯基琼脂糖FF高密度柱(20 x 95mm；Amersham，GEHealthcare Bio-Sciences，Sweden)。用10个柱体积的不含硫酸铵的相同缓冲液，随后用5个柱体积的水洗除非淀粉酶蛋白。最后，目的酶用pH 6.8，含有40％丙二醇的50mM MES，2mM CaCl₂进行稀释。

通过标准定量SDS page凝胶光密度测定法，或通过来自Megazyme(Wicklow，Ireland)的标准淀粉酶测定试剂盒的活性测定方法测定蛋白质浓度。

实施例3-改变性质的测定

这一实施例显示，此处描述的变体可以相对于野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶具有改变的性质。进行了变体的高通量热稳定性筛选。

研究并选择了热胁迫条件，使得在热胁迫后，起始的野生型酶(SEQ IDNO：4)显示出其未胁迫活性的约40％(也就是说，热胁迫后活性/热胁迫前活性约为0.4)。突变体文库以一式四份筛选，那些在热胁迫后显示出比初始野生型酶的平均残留活性高至少两个标准差的残留活性的酶被鉴定为潜在的胜利者。

表达板的培养上清液中淀粉酶表达约为100ppm。在增湿振荡器里(250rpm和70％相对湿度)37℃下培养60-65小时后，用滤板澄清培养上清液以去除细胞物质。澄清的上清液稀释10倍进入含有50mM NaOAc，2.6mM CaCl₂，0.002％TWEEN 20，pH 5.8的缓冲液，至大约10ppm的终浓度。一等分试样的上清液进一步稀释到0.02ppm，使用荧光标记玉米淀粉底物(Invitrogen，San Diego CA，E33651)如下所述测定酶变体的活性。上清液的另一等分试样在热循环器中95℃下在接受30分钟的热胁迫，随后在50mM NaOAc，2.6mM CaCl₂，0.002％TWEEN 20，pH 5.8中稀释到0.02ppm，用如下所述相同的荧光底物和测定法测定残留活性。

用淀粉酶EnzCheck测定法，基本如生产商(Invitrogen，San Diego，CA)所述，测定α-淀粉酶活性。测定中淀粉酶的终浓度是约0.02ppm。测定缓冲液是50mM NaOAc，2.6mM CaCl₂，0.002％TWEEN 20，pH 5.8。底物是来自玉米(Invitrogen，Eugene，OR)的BODIPY荧光染料结合的100μg/mLDQ^TM淀粉。用Spectomax M2(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)来测量增加的荧光，其表明淀粉酶活性。在室温下监测反应5分钟，用仪器记录动力学模式。激活波长是485nm；用515nm处的截断滤光片来监测520nm处的发射。

在95℃受热胁迫30分钟后，野生型LAT显示了约43-55％的残留活性。在同样的热胁迫条件下LAT S239Q变体(LAT-Q可与S239Q或239Q互换使用)保持了约73-75％的残留活性。在相同热胁迫条件下LAT S239A变体保持了约61％的残留活性。见图2。这些残留活性测量结果表明S239Q和S239A变体两者均比野生型α-淀粉酶更加热稳定。

表1：在95℃受热胁迫30分钟后每种变体样品的百分比残留活性

变体	平均％残留活性	标准差
			239A	61.44	5.34
239C	45.47	3.05
			239D	55.35	6.78
239E	56.49	9.41
			239G	42.46	5.75
239H	27.58	4.90
			239I	42.33	3.62
239K	20.86	7.27
			239L	33.19	1.75
239M	53.59	5.25
			变体	平均％残留活性	标准差

变体	平均％残留活性	标准差
			239P	18.51	3.09
239Q	75.89	13.55
			239R	17.65	1.14
239S	55.65	5.07
			239T	44.29	3.99
239V	41.33	5.73
			239W	7.64	1.05
239Y	26.17	3.20
			LAT-Q	73.74	6.14
LAT	43.08	9.02

另外，生化表征了LAT S239变体。典型的生化测定如下所述。酶制备为在50mM乙酸钠，pH 5.8中0.2mg/mL。通过将40μL来自土豆的7.5％(w/v)支链淀粉(Sigma-Fluka 10118)与10μL 250mM乙酸钠，pH5.8在0.2ml PCR型管条中混合制备底物。通过向预温育的底物加入10μL稀释的酶样品，以涡旋快速混合来开始酶反应。在带有加热盖(80℃)的PCR型热循环加热块(Mastercycler Gradient，Eppendorf)上50℃进行温育。刚好4分钟后，通过加入60μl 0.1N NaOH并以涡旋快速混合来终止反应。所有反应一式两份进行。反应物中存在的总还原糖如下所述用DNS法测定：20μl样品与40μL水在0.2mL管PCR型96孔板中混合。60微升DNS试剂(2.5N NaOH，43.8mM 3-5二硝基水杨酸[Sigma D-0550]，1.06M酒石酸钾钠[Sigma S6170])通过上下移液完全混合到每个管中。用PCR型热循环加热块，96孔板在95℃下温育2分钟，随后快速冷却到25℃。从每个管中转移100微升混合物到96孔平底微量滴定板，在543nm测定整个板的光密度。

不同缓冲液中测量LAT S239Q变体和野生型LAT的残留活性。将pH3.5，4.0，4.5，5.0，5.25，5.5，5.75和6.25的10微升等分试样的300mM乙酸钠缓冲液分别置入PCR型管条的8个0.2mL管的各管中。为每种酶准备了4个这样的条(一共8个条)，并置入冰浴中。用含有0.005％TWEEN80的水制备0.12mg/ml的酶。50微升每种酶等分到4个管条中，盖好，以涡旋快速混合。对每一种酶，放置3个条在预热的85℃加热块(如上所述)上。刚好30，60和120秒后，代表各酶的一个条从加热块上移出，并返回冰浴。所有管中存在的活性使用以上所述方法，50℃pH 5.8下从5％支链淀粉中释放的总还原糖的方法来测定。热处理过的管中存在的活性据报告与留在冰上的管中存在的活性成比例。尽管0.1mg/ml的两种酶在85℃pH5或更高pH时，在缓冲液中温育长达2分钟后有相似的稳定性/残留活性，但是LAT S239Q变体显示了较低pH值下更大的残留活性(图3)。

LAT S239Q变体和野生型LAT在底物中的残留活性是准确按上面测定的，具有以下例外：每种酶准备了5个管条(共10个)。在所有管中40微升7.5％支链淀粉与缓冲液等分试样混合。向所有管加入并混合10微升含有0.005％TWEEN 80的水中的0.6mg/ml酶，并置于冰浴中。管如上进行热处理，只是每种酶4管置于85℃下1.25，2.5，5，10分钟。如生产商的说明(Invitrogen)用Bodipy测定法测定活性之前，所有管中的物质在pH5.8的50mM乙酸钠中按1∶10稀释。与以上结果相似，在5％支链淀粉，0.1mg/ml总蛋白质中温育时，较低pH值下LAT S239Q变体有更高的残留活性。支链淀粉的存在似乎增加了稳定性/残留活性(图4)。

为比较S239Q变体和野生型LAT之间的pH谱，将10微升如上所述范围的300mM缓冲液置入8管PCR型管条的各个管中。向所有管加入40微升7.5％支链淀粉，快速混合，随后如上所述在85℃进行预温育。通过快速添加10μL 0.15mg/ml的酶，随后以涡旋快速混合开始反应。如上所述在45秒后终止反应。所有反应一式三份进行。如上所述通过DNS测定来决定总还原糖。结果显示，LAT S239Q变体似乎在pH＜5.0下有比野生型LAT更多的活性(图5)。

评估了LAT S239Q变体和野生型LAT两者的温度谱。10微升250mM乙酸钠，pH 5.8置入PCR型0.2ml管条的所有六个管。准备了12个条。将40微升7.5％支链淀粉混合到所有管中。给梯度PCR加热块(Mastercycler Gradient，Eppendorf)编程到在大约45-99℃的温度范围内为5℃增量。酶制备为在50mM乙酸钠，pH 5.8中0.15mg/ml；各酶取200μL置于0.2mL管条的6个管的3个中，用作酶贮库。含有底物/缓冲液混合物的管在期望的温度下预温育1-2分钟。通过从加入来自贮库的10μl各酶(得到3个平行反应)，并快速短暂混合开始酶反应。如上在30秒后终止反应。用前面所述的DNS测定法来测定存在的总还原糖。在分辨各温度(在似乎对于稳定性的最佳pH，pH5.8)下酶稳定性和反应速率的持续努力中，使用30秒的短暂温育时间。不幸的是，这样短暂的温育可导致重复数据的较高偏差。反应一式三份进行，标准差显示在报告数据的误差线中(图6)。两种酶在它们的温度谱中几乎相互反映，LAT S239Q变体似乎有更高的比活性(虽然这可能是由于它是纯的，且酶以相同蛋白质水平使用的事实)。重要的是两者在90℃下活性有显著提高。90℃以上，LATS239Q变体看来也比野生型LAT保持了更多的相对活性。

实施例4-改变性质的测定：DSC

S239Q变体和野生型α-淀粉酶(分别是SEQ ID NOS：2和4)是用疏水作用层析从摇瓶发酵液(见例2)中纯化出来的。pH 6.8，含有40％丙二醇和2mM CaCl₂的50mM MES从柱中洗脱纯化形式的蛋白质。

用超灵敏扫描高通量微量热计VP-Cap DSC(MicroCal，Inc.，Northampton，MA)来测量过热容量曲线。DSC测量的标准步骤和技术原理先前已经发表(Freire，E.(1995)Differential Scanning Calorimetry，Methods.Mol.Biol.41，191-218)。存在多种浓度氯化钙(0，0.1，0.15，0.2，0.5，1和2mM)的情况下，约500μL的0.5mg/ml LAT，LAT S239Q和

Fred(Genencor)在30-125℃的温度范围下进行扫描。同一样品随后重新扫描以检查该过程的可逆性。对α-淀粉酶，热解折叠过程是不可逆的。所用缓冲液是10mM乙酸钠，pH5.5。使用200℃/小时的扫描速度使可以由聚集产生的任何假象最小化。用DSC曲线的热中点(T_m)作为热稳定性的指征。

此外，LAT S239Q变体和野生型LAT的热解折叠谱在钙缺失、存在2mM氯化钙和存在2mM阿卡波糖的情况下进行比较。α-淀粉酶的底物类似物阿卡波糖能够模拟结合到α-淀粉酶上底物的潜在稳定化效应。表2显示所测淀粉酶蛋白的热熔点。

在缺失和存在2mM氯化钙的情况下S239Q变体的热解折叠显示，与野生型LAT相比，变体的熔点显著提高。不存在添加的氯化钙时，LAT热熔点为90.1℃；S239Q变体的T_m为109.1℃。因此，S239Q替换导致T_m上升19℃。

2mM氯化钙存在时，表征的LAT具有102.1℃的热熔点，而S239Q变体的T_m是110.2℃。因此，2mM氯化钙存在时，两种蛋白都显示了提高的T_m值。LAT和S239Q变体的T_m提高分别是12℃和1.1℃。这显示了S239Q变体的稳定性较少依赖于钙。

2mM阿卡波糖存在时，表征的LAT具有95.2℃的热熔点。S239Q的T_m是109.8℃。因此，2mM阿卡波糖存在时，两种蛋白都显示了提高的T_m值，表明阿卡波糖能够在结构上稳定α-淀粉酶。LAT和S239Q变体的T_m提高分别是5.1℃和0.7℃。这说明S239Q变体的热稳定性较少受阿卡波糖存在的影响。

这说明S239Q变体的热动力学性质与LAT的不同，并与S239Q变体在应用研究中的增强性能相一致(见例5-6)。T_m改变和钙结合曲线表明LAT S239Q变体内在地比野生型LAT更加热稳定，并且与野生型LAT相比其热稳定性较少依赖于钙。

表2：由T_m(℃)反映的热解折叠谱

	野生型LAT	FRED	LAT S239Q
				单独	90.1	95.2	109.1
2mM阿卡波糖	95.2	未进行	109.8
				2mM CaCl2	102.1	108.0	110.2

实施例5-活性谱

这一实施例表明S239Q变体(SEQ ID NO：2)不仅相对于野生型α-淀粉酶(SEQ ID NO：4)，也相对于工业标准

Fred(Genencor)有改变的活性谱。蛋白质测定是用纯化的或平板样品进行的。实验变体和野生型α-淀粉酶两者都是以相同蛋白质浓度施用的。

平板或纯化的变体之任一种用pH 5.6的苹果酸缓冲液稀释到大约20ppm。底物是由pH 5.6的相同的50mM苹果酸缓冲液中的15％玉米淀粉组成的。四百微升淀粉悬浮液平衡在70℃下2.5分钟。随后7μL稀释的酶快速添加到平衡的淀粉(最终蛋白浓度约0.36ppm)中。反应混合物随后置于预热的85℃摇动加热块，以300rpm混合。在预设的时间间隔下，用50μL的125mM NaOH来淬灭反应。随后旋转反应管，上清液10倍稀释到10mM NaOH中，以便用HPAEC-PAD分析DP谱，所述HPAEC-PAD是分辨和定量大小在约DP1-DP40范围内的糖聚合物的灵敏方法。

反应设定为4，10和20分钟。将从DP2到HPLC运行结束的总峰面积积分，将面积除以总蛋白质和反应时间，产生任意单位的代表相对活性的值。

4分钟的反应提供了对酶开始分解底物有多快的指示；10分钟的反应提供了酶的热活性的指示，20分钟的反应提供了酶的热稳定性的指示。结果在表3提供。

Table 3：野生型LAT、LAT S239Q变体和FRED的活性谱

实施例6-蒸煮锅中的液化

35％DC淀粉浆液用20％碳酸钠溶液调至pH 5.8。加入没有钙的100ppm二氧化硫。在夹层锅中用水和蒸汽将浆液加热到70℃(158°F)。加入液化酶LAT S239Q变体(SEQ ID NO：2)和

Fred(Genencor)到浆液以实现10LUs/g的DS。在约10分钟内加热混合物到85℃(185°F)。在85℃下再温育10分钟后，用大的中试喷嘴(large pilot plan jet)(配备来自Hydro-thermal Corp.，Waukesha，Wisconsin的M103 hydro加热器)，浆液穿过维持在108.4℃的蒸煮锅，维持时间3分钟。液化物从喷嘴中收集并放置在85℃水浴中。在喷射后加入第二剂液化酶。液化物持续搅拌，在95℃下维持120分钟。在0、30、60、90和120分钟收集样品。在喷射后测试所有样品的DE和粘度。DE用Schoorls的方法测试(有方法备索)。

LAT S239Q变体的DE进展斜率与Fred是可比较的，Fred是比野生型LAT明显更加热稳定的工业标准酶。台式锅温度上升到115℃，来研究LAT S239Q变体和Fred的热稳定性。对Fred，DE进展下降，LAT S239Q变体也以相似比例下降(基于达到10DE的时间，Fred下降50％，LATS239Q变体66％)，显示出其与Fred相当的热稳定性。见图7。

在3个不同pH5.8、5.5和5.2下通过台式锅比较LAT S239Q变体和Fred的DE形成。以上pH值下未观察到LAT S239Q和Fred在DE进展上的不同，证实了它们在较低pH下相等的稳定性。见图8。

为测量淀粉浆液中钙浓度的效应，在pH5.6下通过台式锅比较LATS239Q和Fred的DE形成。所用淀粉浆液在pH3.0下清洗3次来降低钙和钠含量，并回调到pH5.6用于测试。约90％的游离钙被这一清洗步骤去除，得到的游离钙水平在约3ppm。结果如图9所示，表明LAT S239Q变体在耐受低钙和较低pH(5.6)(对野生型LAT性能非常有害的条件，数据未显示)方面与Fred一样好。

序列表

 

<110>丹尼斯科美国公司

 

<120>具有增强的热稳定性和/或减少的钙依赖性的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体

 

<130>48452-0026-00-WO

 

<140>

<141>

 

<150>60/985,619

<151>2007-11-05

 

<160>6

 

<170>PatentIn版本3.5

 

<210>1

<211>1536

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″人工序列描述：合成的多核苷酸″

 

<400>1

atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc   60

ttgctgcctc attctgcagc ttcagcagca aatcttaatg ggacgctgat gcagtatttt  120

gaatggtaca tgcccaatga cggccaacat tggaagcgtt tgcaaaacga ctcggcatat  180

ttggctgaac acggtattac tgccgtctgg attcccccgg catataaggg aacgagccaa  240

gcggatgtgg gctacggtgc ttacgacctt tatgatttag gggagtttca tcaaaaaggg  300

acggttcgga caaagtacgg cacaaaagga gagctgcaat ctgcgatcaa aagtcttcat  360

tcccgcgaca ttaacgttta cggggatgtg gtcatcaacc acaaaggcgg cgctgatgcg  420

accgaagatg taaccgcggt tgaagtcgat cccgctgacc gcaaccgcgt aatttcagga  480

gaacacctaa ttaaagcctg gacacatttt cattttccgg ggcgcggcag cacatacagc  540

gattttaaat ggcattggta ccattttgac ggaaccgatt gggacgagtc ccgaaagctg  600

aaccgcatct ataagtttca aggaaaggct tgggattggg aagtttccaa tgaaaacggc  660

aactatgatt atttgatgta tgccgacatc gattatgacc atcctgatgt cgcagcagaa  720

attaagagat ggggcacttg gtatgccaat gaactgcaat tggacggttt ccgtcttgat  780

gctgtcaaac acattaaatt tcaatttttg cgggattggg ttaatcatgt cagggaaaaa  840

acggggaagg aaatgtttac ggtagctgaa tattggcaga atgacttggg cgcgctggaa  900

aactatttga acaaaacaaa ttttaatcat tcagtgtttg acgtgccgct tcattatcag  960

ttccatgctg catcgacaca gggaggcggc tatgatatga ggaaattgct gaacggtacg 1020

gtcgtttcca agcatccgtt gaaatcggtt acatttgtcg ataaccatga tacacagccg 1080

gggcaatcgc ttgagtcgac tgtccaaaca tggtttaagc cgcttgctta cgcttttatt 1140

ctcacaaggg aatctggata ccctcaggtt ttctacgggg atatgtacgg gacgaaagga 1200

gactcccagc gcgaaattcc tgccttgaaa cacaaaattg aaccgatctt aaaagcgaga 1260

aaacagtatg cgtacggagc acagcatgat tatttcgacc accatgacat tgtcggctgg 1320

acaagggaag gcgacagctc ggttgcaaat tcaggtttgg cggcattaat aacagacgga 1380

cccggtgggg caaagcgaat gtatgtcggc cggcaaaacg ccggtgagac atggcatgac 1440

attaccggaa accgttcgga gccggttgtc atcaattcgg aaggctgggg agagtttcac 1500

gtaaacggcg ggtcggtttc aatttatgtt caaaga                           1536

 

<210>2

<211>483

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″人工序列描述：合成的多肽″

 

<400>2

Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro

1               5                   10                  15

Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

            20                  25                  30

Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

        35                  40                  45

Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

    50                  55                  60

Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys

65                  70                  75                  80

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

                85                  90                  95

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr

            100                 105                 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

        115                 120                 125

Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

    130                 135                 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe

145                 150                 155                 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys

                165                 170                 175

Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn

            180                 185                 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

        195                 200                 205

Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

    210                 215                 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Gln Phe

225                 230                 235                 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

                245                 250                 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

            260                 265                 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

        275                 280                 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

    290                 295                 300

Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser

305                 310                 315                 320

Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

                325                 330                 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

            340                 345                 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

        355                 360                 365

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile

    370                 375                 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His

385                 390                 395                 400

Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

                405                 410                 415

Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

            420                 425                 430

Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr

        435                 440                 445

Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val lle Asn Ser

    450                 455                 460

Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465                 470                 475                 480

Val Gln Arg

 

<210>3

<211>1536

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌

<400>3

atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc     60

ttgctgcctc attctgcagc ttcagcagca aatcttaatg ggacgctgat gcagtatttt    120

gaatggtaca tgcccaatga cggccaacat tggaagcgtt tgcaaaacga ctcggcatat    180

ttggctgaac acggtattac tgccgtctgg attcccccgg catataaggg aacgagccaa    240

gcggatgtgg gctacggtgc ttacgacctt tatgatttag gggagtttca tcaaaaaggg    300

acggttcgga caaagtacgg cacaaaagga gagctgcaat ctgcgatcaa aagtcttcat    360

tcccgcgaca ttaacgttta cggggatgtg gtcatcaacc acaaaggcgg cgctgatgcg    420

accgaagatg taaccgcggt tgaagtcgat cccgctgacc gcaaccgcgt aatttcagga    480

gaacacctaa ttaaagcctg gacacatttt cattttccgg ggcgcggcag cacatacagc    540

gattttaaat ggcattggta ccattttgac ggaaccgatt gggacgagtc ccgaaagctg    600

aaccgcatct ataagtttca aggaaaggct tgggattggg aagtttccaa tgaaaacggc    660

aactatgatt atttgatgta tgccgacatc gattatgacc atcctgatgt cgcagcagaa    720

attaagagat ggggcacttg gtatgccaat gaactgcaat tggacggttt ccgtcttgat    780

gctgtcaaac acattaaatt ttcttttttg cgggattggg ttaatcatgt cagggaaaaa    840

acggggaagg aaatgtttac ggtagctgaa tattggcaga atgacttggg cgcgctggaa    900

aactatttga acaaaacaaa ttttaatcat tcagtgtttg acgtgccgct tcattatcag    960

ttccatgctg catcgacaca gggaggcggc tatgatatga ggaaattgct gaacggtacg   1020

gtcgtttcca agcatccgtt gaaatcggtt acatttgtcg ataaccatga tacacagccg   1080

gggcaatcgc ttgagtcgac tgtccaaaca tggtttaagc cgcttgctta cgcttttatt   1140

ctcacaaggg aatctggata ccctcaggtt ttctacgggg atatgtacgg gacgaaagga   1200

gactcccagc gcgaaattcc tgccttgaaa cacaaaattg aaccgatctt aaaagcgaga   1260

aaacagtatg cgtacggagc acagcatgat tatttcgacc accatgacat tgtcggctgg 1320

acaagggaag gcgacagctc ggttgcaaat tcaggtttgg cggcattaat aacagacgga 1380

cccggtgggg caaagcgaat gtatgtcggc cggcaaaacg ccggtgagac atggcatgac 1440

attaccggaa accgttcgga gccggttgtc atcaattcgg aaggctgggg agagtttcac 1500

gtaaacggcg ggtcggtttc aatttatgtt caaaga                           1536

 

<210>4

<211>483

<212>PRT

<213>地衣芽孢杆菌

 

<400>4

Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro

1               5                   10                  15

Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

            20                  25                  30

Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

        35                  40                  45

Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

    50                  55                  60

Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys

65                  70                  75                  80

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

                85                  90                  95

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr

            100                 105                 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

        115                 120                 125

Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

    130                 135                 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe

145                 150                 155                 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys

                165                 170                 175

Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn

            180                 185                 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

        195                 200                 205

Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

    210                 215                 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225                 230                 235                 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

                245                 250                 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

            260                 265                 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

        275                 280                 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

    290                 295                 300

Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser

305                 310                 315                 320

Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

                325                 330                 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

            340                 345                 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

        355                 360                 365

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile

    370                 375                 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His

385                 390                 395                 400

Asp Tyr PheAsp Hi s His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

                405                 410                 415

Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

            420                 425                 430

Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr

        435                 440                 445

Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser

    450                 455                 460

Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465                 470                 475                 480

Val Gln Arg

 

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″人工序列描述：合成肽″

 

<400>5

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile

1               5

 

<210>6

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″人工序列描述：合成肽″

 

<400>6

Ile Pro Thr His Gly Val

1               5

Claims (47)

1.亲本地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，其中该变体具有与SEQ IDNO：4有至少约90％的序列同一性的氨基酸序列，并包含对应于SEQ IDNO：4的S239的替换，并且其中所述变体显示出α-淀粉酶活性。

2.权利要求1的变体，其中该变体包含SEQ ID NO：2。

3.权利要求1的变体，其中所述变体由SEQ ID NO：2组成。

4.权利要求1的变体，其中S239替换是S239Q。

5.权利要求1的变体，其中S239替换是S239A。

6.权利要求1的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：4有至少约95％的序列同一性。

7.权利要求6的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：4有至少约98％的序列同一性。

8.权利要求1的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：4的α-淀粉酶相比具有改变的解链温度。

9.权利要求8的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：4的α-淀粉酶相比具有提高的解链温度。

10.权利要求9的变体，其中所述变体的提高的解链温度不需要额外的钙。

11.分离的编码亲本地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体的核酸，其中所述变体具有对应于SEQ ID NO：4的S239替换，并且与SEQ ID NO：4有至少约90％的序列同一性，并且其中所述变体显示出α-淀粉酶活性。

12.权利要求11的分离的核酸，其中所述变体包含SEQ ID NO：2。

13.分离的核酸，其编码权利要求1到10任一项的变体。

14.载体，其包含权利要求11到13任一项的分离的核酸。

15.分离的宿主细胞，其包含权利要求11到13任一项的分离的核酸。

16.分离的宿主细胞，其包含权利要求14的载体。

17.权利要求15或16任一项的分离的宿主细胞，其中该宿主细胞是细菌或真菌。

18.权利要求17的分离的宿主细胞，其中所述细菌是革兰氏阳性细菌，所述革兰氏阳性细菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、浅青紫链霉菌和鼠灰链霉菌；或者革兰氏阴性细菌，其中所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌或假单胞菌。

19.用于液化淀粉的组合物，其包含权利要求1到10任一项的变体，其中所述组合物在溶液中。

20.液化淀粉的方法，该方法包括向经碾磨的玉米或淀粉浆液施用权利要求19的组合物，维持足够液化所述淀粉的时间。

21.权利要求20的方法，其中所述组合物以约40-60μg/g干固体加入经碾磨的玉米或淀粉浆液。

22.权利要求20的方法，其中所述经碾磨的玉米是玉米淀粉溶液。

23.权利要求20的方法，其中所述经碾磨的玉米或淀粉浆液在约85℃到约105℃下液化。

24.权利要求20的方法，其中经碾磨的玉米或淀粉浆液在约pH 4.5到约pH 6.5下液化。

25.权利要求20的方法，该方法进一步包括发酵液化物来产生乙醇。

26.权利要求25的方法，其中所述发酵产生比野生型多至少约2.5％v/v的乙醇。

27.权利要求25的方法，其中所述液化和所述发酵在同一反应容器中同时进行。

28.权利要求20的方法，其中不加入额外的钙。

29.用于糖化淀粉的组合物，该组合物包含溶液中的权利要求1到10任一项的变体。

30.用于糖化淀粉的方法，该方法包括施用权利要求29的组合物，维持足够糖化所述淀粉的时间。

31.权利要求30的方法，其中不添加额外的钙。

32.洗涤剂添加剂，其包含权利要求1到10任一项的变体。

33.权利要求32的洗涤剂添加剂，进一步包含选自以下的酶：纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶和角叉菜胶酶或其任一组合。

34.权利要求32的洗涤剂添加剂，以为非粉化颗粒、微粒、稳定化液体或受保护酶的形式存在。

35.包含权利要求32的洗涤剂添加剂的洗涤剂组合物。

36.权利要求35的洗涤剂组合物，其进一步包含选自以下的一种或多种酶：纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、角叉菜胶酶和其任一组合。

37.洗涤剂组合物，其包含权利要求1到10任一项的变体和表面活性剂。

38.洗衣洗涤剂组合物，其包含权利要求32的洗涤剂添加剂，并且进一步包含以下的一种或多种：表面活性剂、洗涤剂助洗剂、络合剂、聚合物、漂白系统、稳定剂、起泡剂、抑泡剂、防蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶助长剂、明亮剂、织物柔顺剂和香料。

39.织物脱浆组合物，其在水溶液中包含权利要求1到10任一项的变体，任选地包含至少一种额外的酶。

40.织物脱浆方法，其包括施用权利要求39的织物脱浆组合物，维持足够使所述织物脱浆的时间。

41.权利要求40的方法，其中不添加额外的钙。

42.包含权利要求1到10任一项的变体的淀粉加工组合物。

43.权利要求42的淀粉加工组合物，进一步包含葡糖淀粉酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、植酸酶或其组合。

44.加工淀粉的方法，其包括施用权利要求42的淀粉加工组合物足够加工所述淀粉的时间。

45.权利要求44的方法，其中不添加额外的钙。

46.烘焙组合物，其包含溶液或凝胶中的权利要求1到10任一项的变体。

47.烘焙方法，其包括施用权利要求46的烘焙组合物。

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