BR112014010045B1

BR112014010045B1 - Polipeptídeo de alfa-amilase variante formadoras de malto-hexaose, composição compreendendo o mesmo, célula hospedeira, e métodos para remover uma mancha ou sujeira amilácea, para sacarificar uma composição que compreende amido, produção de uma composição alimentícia de desengomagem de um têxtil

Info

Publication number: BR112014010045B1
Application number: BR112014010045-4A
Authority: BR
Inventors: Luis G. Cascao-Pereira; David A. Estell; Marc Kolkman; Harm Mulder
Original assignee: Danisco Us Inc
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2021-12-21
Also published as: CN103917642A; EP4345161A2; BR112014010045A2; HK1201559A1; EP4345161A3; US20220002696A1; EP2771458A2; EP3572505A2; US20140287477A1; EP3845641A1; WO2013063460A3; EP3246404B1; US20200002693A1; EP3572505A3; US10457924B2; EP2771458B1; US11898177B2; AU2012328562A1; WO2013063460A2; RU2014121491A

Abstract

variantes de alfa-amilase formadoras de malto-hexaose variante. a presente invenção refere-se a composições e a métodos relacionados a alfa-amilases formadoras de malto-hexaose variante. as alfa-amilases variantes são úteis, por exemplo, para liquefação e sacarificação de amido, para limpar manchas amiláceas em lavagem de roupas, louças e outras aplicações, para processamento de matéria têxtil (por exemplo, desengomagem), em ração animal para aprimorar a digestibilidade e para assamento e fermentação.

Description

PRIORIDADE

[0001] O presente pedido reivindica prioridade para o pedidoprovisório US n° de série 61/552,910, depositado em 28 de Outubro de 2011 e para o pedido provisório US n° de série 61/668,359, depositado em 5 de julho de 2012, que estão aqui incorporados, por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] São apresentadas as composições e métodos relacionadosa α-amilases formadoras de malto-hexaose variante. As α-amilases variantes são úteis, por exemplo, para liquefação e sacarificação de amido, limpeza de manchas de amido, desengomagem têxtil, assamento e preparação relatório.

ANTECEDENTES

[0003] O amido consiste em uma mistura de amilose (15 a 30% empeso) e amilopectina (70 a 85% em peso). A amilose consiste em cadeias lineares de unidades de glicose ligadas a α-1,4 tendo um peso molecular de cerca de 60.000 a cerca de 800.000. A amilopectina é um polímero ramificado contendo pontos de ramificação α-1,6 a cada 24 a 30 unidades de glicose; seu peso molecular pode ser de 100 milhões.

[0004] Açúcares de amido, sob a forma de xaropes concentradosde dextrose, são atualmente produzidos por um processo catalisado por enzima envolvendo: (1) liquefação (ou redução de viscosidade) do amido sólido com uma α-amilase em dextrinas tendo um grau médio de polimerização de cerca de 7 a 10 e (2) sacarificação do amido liquefeito resultante (isto é, hidrolisado de amido) com amiloglicosidase (também chamado de glicoamilase ou GA). O xarope resultante tem um alto teor de glicose. Grande parte do xarope de glicose que é produzido comercialmente é, subsequentemente, enzimaticamente isomerizado para uma mistura de dextrose/frutose, conhecida como isoxarope. O xarope resultante podem também ser fermentado com microorganismos, como levedura, para produzir produtos comerciais incluindo etanol, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, ácido itacônico, glutamato monossódico, gluconatos, lisina, outros ácidos orgânicos, outros aminoácidos e outros bioquímicos, por exemplo. A fermentação e a sacarificação podem ser conduzidas simultaneamente (isto é, um processo SSF) para se obter mais economia e eficiência.

[0005] As α-amilases hidrolisam o amido, glicogênio epolissacarídeos relacionados pela clivagem de ligações α-1,4- glucosídicas internas aleatoriamente. As α-amilases, particularmente de Bacilli, foram usadas para uma variedade de propósitos diferentes, incluindo liquefação e sacarificação de amido, desengomagem têxtil, modificação de amigo na indústria de papel e polpa, preparação, assamento, produção de xaropes para a indústria alimentícia, produção de matérias primas para processos de fermentação e em ração animal para aumentar a digestibilidade. Essas enzimas também podem ser usadas para remover sujeiras e manchas amiláceas durante a lavagem de louças e de roupas.

SUMÁRIO

[0006] As presentes composições e métodos se referem apolipeptídeos de amilase formadora de malto-hexaose variante e métodos de uso dos mesmos. Aspectos e modalidades das presentes composições e métodos estão resumidos nos seguintes parágrafos numerados separadamente: 1. Em um aspecto, um polipeptídeo de α-amilase variante derivado de um polipeptídeo de α-amilase parental é fornecido, que compreende ao menos uma mutação combinável em uma posição de aminoácido produtiva; em que: (i) a mutação combinável é a substituição de um resíduo de aminoácido presente na α-amilase parental com um resíduo de aminoácido diferente, o que aprimora ao menos uma propriedade desejável da α-amilase variante em comparação com a α-amilase parental, ao mesmo tempo em que não diminui significantemente a expressão, atividade ou estabilidade da α- amilase variante, em comparação com a α-amilase parental, (ii) a posição produtiva é uma posição de aminoácido que pode ser substituída com uma pluralidade de diferentes resíduos de aminoácidos, em que cada uma das substituições resulta em uma α-amilase variante que atende às exigências de (i), e (iii) a mutação combinável corresponde a uma mutação mencionada nas Listas A, B, C ou D, ou na Tabela C ou D, que utiliza a SEQ ID NO: 3 para numeração. 2. Em algumas modalidades da amilase variante do parágrafo 1, cada um dentre a ao menos uma mutação combinável produz uma amilase variante, em que os índices de desempenho mínimo (PI) em relação à amilase parental para (i) expressão de proteína, (ii) atividade e (iii) a estabilidade ou termoestabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,9 e o PI de qualquer um dentre (i), (ii) ou (iii) que seja maior ou igual a 1,0. 3. Em algumas modalidades da amilase variante do parágrafo 1, cada um dentre a ao menos uma mutação combinável produz uma amilase variante, em que os índices de desempenho mínimo (PI) em relação à amilase parental para (i) expressão de proteína, (ii) atividade e (iii) a estabilidade ou termoestabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,8 e o PI de qualquer um dentre (i), (11) ou (iii) que seja maior ou igual a 1,2. 4. Em algumas modalidades da amilase variante do parágrafo 1, cada um dentre ao menos uma mutação combinável produz uma amilase variante, em que os índices de desempenho mínimo (PI) em relação à amilase parental para (i) expressão de proteína, (ii) atividade e (iii) estabilidade ou termoestabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,5 e o PI de qualquer um dentre (i), (ii) ou (iii) que seja maior ou igual a 1,5. 5. Em algumas modalidades da amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores, cada um dentre a ao menos uma mutação combinável tem uma pontuação de adequação de +++, ++++ ou +++++, com referência à Tabela B. 6. Em algumas modalidades da amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores, cada um dentre a ao menos uma mutação combinável tem uma pontuação de adequação de ++++ ou +++++, com referência à Tabela B. 7. Em algumas modalidades da amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores, cada uma dentre a ao menos uma mutação combinável tem uma pontuação de adequação de +++++, com referência à Tabela B. 8. Em algumas modalidades da amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores, cada uma dentre a ao menos uma mutação combinável tem uma pontuação de produtividade de 1 ou 2. 9. Em algumas modalidades, a amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores inclui uma pluralidade de mutações combináveis. 10. Em algumas modalidades, a amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores compreende, ainda, uma deleção que corresponde a um resíduo selecionado do grupo que consiste em Arg-181, Gly-182, His-183 e Gly-184, com o uso da SEQ ID NO: 3 para numeração. 11. Em algumas modalidades, a amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores compreende, ainda, deleções que correspondem a resíduos Arg-181 e Gly-182, com o uso da SEQ ID NO: 3 para numeração. 12. Em algumas modalidades da amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores, a α-amilase parental ou a α- amilase variante tem ao menos 60% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, ou em que a α-amilase parental ou a α-amilase variante é codificada por um ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes para o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. 13. Em algumas modalidades da amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores, a α-amilase parental ou a α- amilase variante tem ao menos 70% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, ou em que a α-amilase parental ou a α-amilase variante é codificada por um ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes para o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. 14. Em algumas modalidades da amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores, a α-amilase parental ou a α- amilase variante tem ao menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, ou em que a α-amilase parental ou a α-amilase variante é codificada por um ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes para o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. 15. Em algumas modalidades da amilase variante de qualquer um dos parágrafos anteriores, a α-amilase parental ou a α- amilase variante tem ao menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, ou em que a α-amilase parental ou a α-amilase variante é codificada por um ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes para o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. 16. Em um outro aspecto, uma composição que compreende a amilase variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 15 é fornecida. 17. Em algumas modalidades da composição do parágrafo 16, a composição é eficaz para remover manchas amiláceas de roupas, louças ou produtos têxteis. 18. Em algumas modalidades, a composição dos parágrafos 16 ou 17 compreende, ainda, um tensoativo. 19. Em algumas modalidades da composição de parágrafos 16 a 18, a composição é uma composição detergente. 20. Em algumas modalidades da composição de parágrafos 16 a 19, a composição é um detergente para lavagem de roupas ou um aditivo para detergente para lavagem de roupas. 21. Em algumas modalidades da composição de parágrafos 16 a 20, a composição é um detergente lavagem de louças manual ou automática. 22. Em algumas modalidades, a composição de parágrafos 16 a 21 compreende, ainda, uma ou mais enzimas adicionais selecionadas a partir do grupo que consiste em protease, hemicelulase, celulase, peroxidase, enzima lipolítica, enzima metalolipolítica, xilanase, lipase, fosfolipase, esterase, peridrolase, cutinase, pectinase, pectato liase, mananase, queratinase, redutase, oxidase, fenoloxidase, lipoxigenase, ligninase, pululanase, tanase, pentosanase, malanase, β- glucanase, arabinosidase, hialuronidase, condroitinase, lacase e uma amilase diferente da amilase de qualquer um dos parágrafos 1 a 15. 23. Em algumas modalidades, a composição do parágrafo 16 é para liquefação de amido. 24. Em algumas modalidades, a composição do parágrafo 16 é para sacarificação de uma composição que compreende amido, para SSF pós-liquefação ou para SSF direto sem prévia liquefação. 25. Em algumas modalidades, a composição do parágrafo 16 é para produção de uma bebida fermentada. 26. Em algumas modalidades, a composição do parágrafo 16 é para produção de um produto alimentício assado. 27. Em algumas modalidades, a composição do parágrafo 16 é para desengomagem têxtil. 28. Em um outro aspecto, um método para remoção de manchas ou sujeiras amiláceas de uma superfície é fornecido, que compreende: colocar a superfície na presença de uma composição aquosa contendo uma quantidade eficaz da amilase variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 15 e permitir que o polipeptídeo hidrolise os componentes de amido presentes na mancha amilácea para produzir moléculas derivadas de amido menores que se dissolvem na composição aquosa, e enxaguar a superfície, assim removendo a mancha amilácea da superfície. 29. Em algumas modalidades do método do parágrafo 28, a composição aquosa compreende, ainda, um tensoativo. 30. Em algumas modalidades do método dos parágrafos 28 e 29, a superfície é uma superfície têxtil. 31. Em algumas modalidades do método dos parágrafos 28 e 29, a superfície é a superfície de louças. 32. Em algumas modalidades do método dos parágrafos 28 e 29, a superfície é uma superfície dura suja. 33. Em algumas modalidades do método dos parágrafos 28 a 32, a composição compreende, ainda, ao menos uma enzima adicional selecionada do grupo que consiste em protease, hemicelulase, celulase, peroxidase, enzima lipolítica, enzima metalolipolítica, xilanase, lipase, fosfolipase, esterase, peridrolase, cutinase, pectinase, pectato liase, mananase, queratinase, redutase, oxidase, fenoloxidase, lipoxigenase, ligninase, pululanase, tanase, pentosanase, malanase, β-glucanase, arabinosidase, hialuronidase, condroitinase, lacase e uma amilase diferente da amilase de qualquer um dos parágrafos 1 a 15. 34. Em um outro aspecto, um método de sacarificação de uma composição que compreende amido para produzir uma composição que compreende glicose é fornecido, sendo que o método compreende: (i) colocar a solução que compreende amido em contato com uma quantidade eficaz da amilase variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 15; e (ii) sacarificar a solução que compreende amido para produzir a composição que compreende glicose; sendo que a amilase variante catalisa a sacarificação do solução de amido para glicose. 35. Em algumas modalidades do método do parágrafo 34, a composição que compreende amido compreende amido liquefeito, amido gelatinizado ou amido granular. 36. Em algumas modalidades do método dos parágrafos 34 ou 35, a sacarificação é conduzida em uma faixa de temperatura de cerca de 30°C a cerca de 75°C. 37. Em algumas modalidades do método do parágrafo 36, a faixa de temperatura é de 47°C a 74°C. 38. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 34 a 37, a sacarificação é conduzida em uma faixa de pH de 2,0 a 7,5. 39. Em algumas modalidades do método do parágrafo 38, a faixa de pH é de 3,5 a 5,5. 40. Em algumas modalidades do método do parágrafo 39, a faixa de pH é de 3,5 a 4,5. 41. Em algumas modalidades, o método de qualquer um dos parágrafos 34 a 40, compreende, ainda, fermentar a composição de glicose para produzir um produto final de fermentação (EOF). 42. Em algumas modalidades do método do parágrafo 41, a fermentação é uma reação de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). 43. Em algumas modalidades do método dos parágrafos 41 ou 42, a fermentação é conduzida por 48 a 70 horas a pH 2 a 8 e em uma faixa de temperatura de 25°C a 70°C. 44. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 41 a 43, o produto EOF compreende etanol. 45. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 41 a 44, o produto EOF compreende 8 a 18% (v/v) de etanol. 46. Em algumas modalidades do método do parágrafos 41 a 45, o método compreende, ainda, colocar um mingau e/ou um mosto com uma amilase. 47. Em algumas modalidades do método do parágrafo 46, o método compreende, ainda: (a) preparar um mingau; (b) filtrar o mingau para obter um mosto; e (c) fermentar o mosto para obter uma bebida fermentada, em que a amilase variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 16 e 74 a 80 é adicionada a: (i) o mingau da etapa (a) e/ou (ii) o mosto da etapa (b) e/ou (iii) o mosto da etapa (c). 48. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 41 a 47, o produto EOF compreende um metabólito. 49. Em algumas modalidades do método do parágrafo 48, o metabólito é ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glicônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, glucona delta-lactona, eritorbato de sódio, ácido graxo ômega 3, butanol, um aminoácido, lisina, ácido itacônico, 1,3- propanodiol ou isopreno. 50. Em algumas modalidades, o método de qualquer um dos parágrafos 34 a 49 compreende, ainda, adicionar glicoamilase, hexoquinase, xilanase, glicose isomerase, xilose isomerase, fosfatase, fitase, pululanase, β-amilase, α-amilase que não seja a α-amilase variante, protease, celulase, hemicelulase, lipase, cutinase, isoamilase, enzima redox, esterase, transferase, pectinase, alfa-glicosidase, beta- glicosidase ou uma combinação dos mesmos, à solução de amido. 51. Em algumas modalidades do método do parágrafo 50, a glicoamilase é adicionada às unidades de glicoamilase 0,1 a 2 (GAU)/g ds. 52. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 34 a 51, a amilase é expressada e secretada por uma célula hospedeira. 53. Em algumas modalidades do método do parágrafo 52, a composição que compreende amido é colocada em contato com a célula hospedeira. 54. Em algumas modalidades do método dos parágrafos 52 ou 53, a célula hospedeira adicionalmente expressa e secreta uma glicoamilase ou outra enzima. 55. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 52 a 54, a célula hospedeira é capaz de fermentar a composição. 56. Em um outro aspecto, uma composição que compreende glicose produzida pelo método de qualquer um dos parágrafos 34 a 55 é fornecida. 57. Em um outro aspecto, um amido liquefeito produzido pelo método de qualquer um dos parágrafos 34 a 55 é fornecido. 58. Em um outro aspecto, uma bebida fermentada produzida pelo método de qualquer um dos parágrafos 34 a 55 é fornecida. 59. Em um outro aspecto, o uso de uma amilase de qualquer um dos parágrafos 1 a 15 na produção de uma composição que compreende glicose é fornecido. 60. Em um outro aspecto, o uso de uma amilase de qualquer um dos parágrafos 1 a 15 na produção de um amido liquefeito é fornecido. 61. Em um outro aspecto, o uso de uma amilase de qualquer um dos parágrafos 1 a 15 na produção de uma bebida fermentada é fornecido. 62. Em um outro aspecto, o uso de uma amilase de qualquer um dos parágrafos 1 a 15 na limpeza de manchas amiláceas é fornecido. 63. Em um outro aspecto, o uso de uma amilase de qualquer um dos parágrafos 1 a 15 em desengomagem têxtil é fornecido. 64. Em algumas modalidades do método de acordo com qualquer um dos parágrafos 34 a 55, a bebida fermentada do parágrafo 58 ou o uso do parágrafo 61, a bebida fermentada ou produto final de fermentação é selecionado do grupo que consiste em: (i) uma cerveja selecionada do grupo que consiste em cerveja maltada completa, cerveja fermentada de acordo com a "Reinheitsgebot" (Lei da Pureza da Cerveja), "ale", álcool isopropílico, "lager", "bitter", Happoshu (segunda cerveja), terceira cerveja, "dry beer", "near beer", cerveja light, cerveja com baixo teor de álcool, cerveja de baixas calorias, "porter", cerveja bock, "stout", licor de malte, cerveja não alcoólica e licor de malte não alcoólico; e (ii) bebidas de cereais ou malte selecionadas do grupo que consiste em bebidas de malte com sabor de fruta, bebidas de malte com sabor de licor e bebidas de malte com sabor de café. 65. Em um outro aspecto, é fornecido um método de produção de uma composição alimentícia, compreendendo a combinação de: (i) um ou mais ingredientes alimentícios e (ii) uma variante de α-amilase de qualquer um dos parágrafos 1 a 15, em que a variante de α-amilase do mesmo catalise a hidrólise dos componentes de amido presentes nos ingredientes alimentícios para produzir glicose. 66. Em algumas modalidades do método do parágrafo 65, a composição alimentícia é selecionada do grupo que consiste em um produto alimentício, uma composição para assamento, um aditivo alimentar, um produto alimentício animal, um produto de ração, um aditivo para ração, um óleo, uma carne e uma banha. 67. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 65 e 66, os um ou mais ingredientes alimentícios compreendem um ingrediente para assamento ou um aditivo. 68. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 65 e 67, os um ou mais ingredientes alimentícios são selecionados do grupo que consiste em farinha; uma amilase antirrancificação; uma fosfolipase; um fosfolipídeo; uma alfa-amilase maltogênica ou uma variante, homólogo ou mutantes dos mesmos que tenha atividade de alfa-amilase maltogênica; uma xilanase de padaria; e uma lipase. 69. Em algumas modalidades do método do parágrafo 65, os um ou mais ingredientes alimentícios são selecionados do grupo que consiste em: (i) uma alfa-amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus, (ii) uma xilanase de padaria é de Bacillus, Aspergillus, Thermomyces ou Trichoderma, (iii) uma glicolipase de Fusarium heterosporum. 70. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 65 a 69, a composição alimentícia compreende uma massa ou um produto de massa, de preferência um produto de massa processado. 71. Em algumas modalidades, o método de qualquer um dos parágrafos 65 a 70 compreende ainda o assamento da composição alimentícia para produzir um artigo assado. 72. Em algumas modalidades, o método de qualquer um dos parágrafos 65 a 70 compreende ainda: (i) fornecer um meio de amido; (ii) adicionar uma amilase ao meio de amido; e (iii) aplicar calor ao meio de amido durante ou após a etapa (b) para produzir um produto de padaria. 73. Em um outro aspecto, um método de desengomagem de uma matéria têxtil é fornecido, compreendendo colocar uma composição de desengomagem em contato com uma matéria têxtil engomada durante tempo suficiente para desengomar a matéria têxtil, sendo que a composição de desengomagem compreende uma α- amilase variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 15. 74. Em um outro aspecto, um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1 a 15 é fornecido. 75. Em um outro aspecto, um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 74 é fornecido. 76. Em um outro aspecto, a célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão do parágrafo 75 é fornecido.

[0007] Estes e outros aspectos e modalidades das presentescomposições e métodos ficarão evidentes a partir da descrição supracitada e dos desenhos apresentados a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0008] A Figura 1 é um alinhamento Clustal, com o uso deparâmetros padrão, da amilase Amy707 e amilase AA560.

[0009] A Figura 2 é uma mapa do vetor pHPLT compreendendo ogene Amy707 (pHPLT-Amy707).

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[00010] A SEQ ID NO: 1 estabelece uma sequência de nucleotídeo modificada por códon no plasmídeo pHPLT-Amy707 que codifica a forma madura do Bacillus sp. α-amilase 707. A sequência que codifica o peptídeo de sinalização LAT está sublinhada.

[00011] A SEQ ID NO: 2 estabelece a sequência de aminoácidos da forma precursora do Bacillus sp. α-amilase 707 produzida do plasmídeo pHPLT-Amy707. O peptídeo de sinalização LAT está sublinhado.

[00012] A SEQ ID NO: 3 estabelece a sequência de aminoácidos da forma madura do Bacillus sp. α-amilase 707 produzida do plasmídeo pHPLT-Amy707.

[00013] A SEQ ID NO: 4 estabelece a sequência de aminoácidos da forma madura da α-amilase AA560 derivada do Bacillus sp. DSM 12649 (isto é, o original de STAINZYME™).

[00014] A SEQ ID NO: 5 estabelece o Genebank Accession n° M18862, que codifica o Bacillus sp. α-amilase 707.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00015] São descritas composições e métodos relacionados às enzimas amilase variantes formadoras de malto-hexaose. As variantes foram verificadas por uma combinação de abordagens experimentais, conforme detalhado nos Exemplos anexados. As abordagens incluem o uso de bibliotecas de avaliação de sítio (SELs) e análise baseada em estrutura. Aplicações exemplificadoras para as enzimas amilase variante são liquefação e sacarificação de amido, para limpar manchas amiláceas em lavagem de roupas, louças e outras aplicações, para processamento de matéria têxtil (por exemplo, desengomagem), em ração animal para aprimorar a digestibilidade e para assamento e fermentação. Estes e outros aspectos das composições e métodos são descritos em detalhes, abaixo.

[00016] Antes de descrever os vários aspectos e modalidades das presentes composições e métodos, as seguintes definições e abreviações são descritas.

1. Definições e abreviações

[00017] De acordo com esta descrição detalhada, aplicam-se as seguintes abreviações e definições. Observe que as formas singulares "um", "uma", "o", "a" incluem referentes plurais, a não ser que o contexto afirme claramente de outro modo. Dessa forma, por exemplo, a referência a "uma enzima" inclui uma pluralidade de tais enzimas e a referência à "dosagem" inclui a referência a uma ou mais dosagens e equivalentes das mesmas conhecidas pelos versados na técnica, e assim por diante.

[00018] O presente documento é organizado em inúmeras seções para facilidade de leitura; entretanto, o leitor apreciará que as declarações feitas em uma seção pode se aplicar a outras seções. Dessa forma, os cabeçalhos usados para diferentes seções da descrição não devem ser interpretados como limitadores.

[00019] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado conforme é compreendido pelo versado na técnica. Os seguintes termos são fornecidos abaixo.

1.1. Abreaviações e siglas

[00020] As abreviações/acrônimos a seguir têm os seguintes significados, a menos que especificado de outro modo: ABTS ácido 2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico AE ou AEO álcool etoxilato AES ou AEOS etoxissulfato de álcool AkAA Aspergillus kawachiiα-amilase AnGA glicoamilase de Aspergillus niger AOS α-olefina sulfonato AS sulfato de alquilasulfato de alquila cDNA DNA complementar CMC carboximetilcelulose DE equivalente de dextrose DNA ácido desoxirribonucleico DPn grau de polimerização de sacarídeo tendo n subunidades ds ou DS sólidos secos DTMPA ácido dietilenitriaminapenta-acético EC comissão de enzimas EDTA ácido etilenodiaminotetra-acético EO óxido de etileno (fragmento de polímero) EOF Final da fermentação GA glicoamilase GAU/g ds unidade/grama de atividade de glicoamilase de sólidos secos HFCS xarope de milho com alto teor de frutose HgGA glicoamilase de Humicola grisea Iptg isopropil β-D-tiogalactoside IRS amido residual insolúvel kDa quilodalton LAS alquilbenzenossulfonato linear LAT, BLA amilase de B. licheniformis MW peso molecular MWU unidade de Wohlgemuth modificado; 1,6x10-5 mg/MWU = unidade de atividade NCBI Centro Nacional para Informação de Biotecnologia NOBS nonanoiloxibenzenossulfonato NTA ácido nitriloacético OxAm Purastar HPAM 5000L (Danisco US Inc.) PAHBAH hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico PEG polietilenoglicol pI ponto isoelétrico pl índice de desempenho ppm partes por milhão, por exemplo, mg de proteína por grama de sólido seco PVA poli(álcool vinílico) PVP poli(vinilpirrolidona) RCF força centrífuga/centrípeta relativa (isto é, gravidade x) RNA ácido ribonucleico SAS alcano sulfonato SDS-PAGE eletroforese em gel de sódio dodecil sulfato poliacrilamida SSF sacarificação e fermentação simultânea SSU/g de sólido unidade/grama de sólidos secos de amido solúvel sp.espécie taed tetra-acetiletilenodiamina Tm temperatura de fusão TrGA Trichoderma reesei glicoamilase p/v p/p v/v peso/volume peso/peso volume/volume % em peso °C porcento em peso graus centígrados H2O água dH2O ou DI água desionizada dIH2O água desionizada, filtração Milli-Q g ou gm gramas μg microgramas mg miligramas kg quilogramas µL microlitros mL mililitros mm milímetros µm micrômetro M molar mM milimolar µM micromolar U unidades s segundos min(s) minuto/minutos h hora/horas OD oxigênio dissolvido Ncm Newton centímetros EtOH etanol eq. equivalentes N normal uPWA α-amilase variante derivada de Pyrococcus woesei PWA α-amilase de Pyrococcus woesei MWCO valor de corte de peso molecular SSRL Fonte de luz de radiação síncrotron Stanford PDB Banco de dados de proteínas CAZyBanco de dados de enzimas de carboidrato ativo Tris-HCl Cloridrato de tris(hidroximetil)aminometano HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanossulfônico

1.2 Definições

[00021] Os termos "amilase" ou "enzima amilolítica" se referem a uma enzima que é, entre outras coisas, capaz de catalisar a degradação di amido. As α-amilases são hidrolases que clivam as ligações α-D- (1^4) O-glicossíficas no amido. De modo geral, α-amilases (EC 3.2.1.1; α-D-(1^4)-glicano-glicano-hidrolase) são definidas como enzimas endoativas clivando ligações α-D-(1^4) O-glicosídicas na molécula de amido de modo aleatório produzindo polissacarídeos contendo três ou mais unidades de D-glicose (1-4)-α-ligadas. Em contrapartida, as enzimas amilolíticas exoativas, como β-amilases (EC 3.2.1.2; α-D- (1^4)-glucano malto-hidrolase) e algumas amilases produto- específicas como α-amilase maltogênica (EC 3.2.1.133) clivam a molécula de polissacarídeo da extremidade não redutora do substrato. β-amilases, α-glicosidases (EC 3.2.1.20; α-D-glicosideo-glico- hidrolase), glicoamilase (EC 3.2.1.3; α-D-(1^4)-glicano-glico-hidrolase) e amilases produto-específicas como as maltotetraosidases (EC 3.2.1.60) e as malto-hexaosidases (EC 3.2.1.98) podem produzir malto- oligossacarídeos de um comprimento específico ou xaropes enriquecidos de malto-oligossacarídeos específicos. Algumas α- amilases bacterianas predominantemente produzem maltotetraose (G4), maltopentaose (G5) ou malto-hexaose (G6) de amido e α-1,4- glucanos relacionados, enquanto a maioria das α-amilases também convertem-nas em glicose e ou maltose como produtos finais. Amilases G6 como AA560 amilase derivada de Bacillus sp. DSM 12649 (isto é, o progenitor de STAINZYME™) e Bacillus sp. Amilase 707, que é também chamada de α-amilase formadora de malto-hexaose (EC 3.2.1.98), são tecnicamente exoativas, mas têm estruturas similares em comparação com α-amilases, e em alguns casos aparentam responder a algumas das mesmas mutações benéficas.

[00022] "Unidades de enzima", na presente invenção, se referem à quantidade de produto formado por tempo de acordo com as condições especificadas do ensaio. Por exemplo, uma "unidade de atividade de glicoamilase" (GAU) é definida como a quantidade de enzima que produz 1 g de glicose por hora a partir de substrato solúvel de amido (4% DS) a 60°C, pH 4,2. Uma "unidade de amido solúvel"(SSU) é a quantidade de enzima que produz 1 mg de glicose por minuto a partir de substrato solúvel de amido (4% DS) a pH 4,5, 50°C. DS refere-se a "sólidos secos".

[00023] O termo "amido" refere-se a qualquer material que compreende carboidratos de polissacarídeos complexos de plantas, compreendidos por amilose e amilopectina com a fórmula (C6H10O5)x, em que X pode ser qualquer número. O termo inclui materiais à base de plantas como grãos, cereais, gramíneas, tubérculos e raízes, e mais especificamente materiais obtidos a partir de trigo, cevada, milho, centeio, arroz, sorgo, farelos, mandioca, painço, milo, batata, batata- doce e tapioca. O termo "amido" inclui amido granular. O termo "amido granular" refere-se a amido em bruto, isto é, cru, por exemplo, amido que não tenha sido submetido a gelatinização.

[00024] Os termos "de ocorrência natural", "progenitor" ou "de referência", em relação a um polipeptídeo, referem-se a um polipeptídeo de ocorrência natural que não inclui uma substituição, inserção ou deleção produzida por seres humanos em uma ou mais posições de aminoácido. De maneira similar, os termos "de ocorrência natural", "progenitor" ou "de referência", em relação a um polinucleotídeo, referem-se a um polinucleotídeo de ocorrência natural, que não inclui uma alteração no nucleosídeo produzida por seres humanos. Entretanto, deve-se notar que um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de ocorrência natural, progenitor ou de referência não se limita a um polinucleotídeo de ocorrência natural, e abrange quaisquer polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo de ocorrência natural, progenitor ou de referência.

[00025] Referências ao polipeptídeo selvagem incluem a forma madura do polipeptídeo. Um polipeptídeo ou variante do mesmo "maduro"é um no qual uma sequência de sinais está ausente, por exemplo, clivada a partir de uma forma imatura do polipeptídeo durante ou após a expressão do polipeptídeo.

[00026] O termo "variante", com relação a um polipeptídeo, refere-se a um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo tipo selvagem, parental ou de referência especificado pois inclui uma ou mais substituições de ocorrência natural ou artificial, inserções ou deleções de um aminoácido. De modo similar, o termo "variante", com relação a um polinucleotídeo, refere-se a um polinucleotídeo que difere na sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo tipo selvagem, parental ou de referência especificado. A identidade do polipeptídeo ou polinucleotídeo tipo selvagem, parental ou de referência será evidente a partir do contexto.

[00027] No caso de α-amilases presentes, a "atividade" refere-se a uma atividade de α-amilase, que pode ser medido conforme descrito na presente invenção.

[00028] O termo "recombinante", quando usado em referência a uma célula individual, ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que o indivíduo foi modificado de seu estado original. Dessa forma, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula, ou expressam genes nativos em níveis diferentes ou sob condições diferentes das encontradas na natureza. Ácidos nucleicos recombinantes diferem de uma sequência nativa por um ou mais nucleotídeos e/ou são ligadas de maneira funcional a sequências heterólogas, por exemplo, um promotor heterólogo em um vetor de expressão. Proteínas recombinantes podem diferir de uma sequência nativa em um ou mais aminoácidos e/ou são fundidas com sequências heterólogas. Um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma amilase é um vetor recombinante.

[00029] "Variantes combinatórias" são variantes compreendendo duas ou mais mutações, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc., substituições, deleções e/ou inserções.

[00030] Como usado aqui, "mutações combináveis" são mutações em qualquer posição de aminoácido que podem ser usadas para fazer variantes combinatórias. As mutações combináveis otimizam ao menos uma propriedade desejada da molécula (nesse caso, uma α-amilase), ao mesmo tempo em que não diminuem significantemente a expressão, atividade ou estabilidade. As mutações combináveis podem ser agrupadas da seguinte forma:

[00031] Grupo A: Uma mutação que produz uma variante em que os índices de desempenho mínimo (PI) em relação a uma proteína parental definida por: (i) expressão de proteína, (ii) atividade, (iii) atividade em pequena amostra de tecido CS-28 a pH 8 (16°C, 32 °C, ou 50 °C) ou pH10 (16 °C ou 50 °C), e (iv) estabilidade ou termoestabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,9, e além disso têm um PI em qualquer um destes testes que é maior ou igual a 1,0.

[00032] Grupo B: Uma mutação que produz uma variante em que os índices de desempenho mínimo (PI) em relação a uma proteína parental definida por: (i) expressão de proteína, (ii) atividade, (iii) atividade em pequena amostra de tecido CS-28 a pH 8 (16°C, 32°C ou 50°C) ou pH10 (16°C ou 50°C) e (iv) estabilidade ou termoestabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,8, e além disso têm um PI de qualquer um destes testes que seja maior ou igual a 1,2.

[00033] Grupo C: Uma mutação que produz uma variante em que os índices de desempenho mínimo (PI) em relação a uma proteína parental definida por: (i) expressão de proteína, (ii) atividade, (iii) atividade em pequena amostra de tecido CS-28 a pH 8 (16°C, 32°C ou 50°C) ou pH10 (16°C ou 50°C) e (iv) estabilidade ou termoestabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,5, e além disso têm um PI de qualquer um destes testes que seja maior ou igual a 1,5.

[00034] As propriedades de mutações combináveis estão resumidas na seguinte Tabela.

* Estabilidade térmica não medida pelas bibliotecas completas de SEL

[00035] Mutações combináveis preferenciais estão em "posições produtivas", conforme descrito abaixo. No caso de α-amilasespresentes, a "atividade" refere-se a uma atividade de α-amilase, que pode ser medido conforme descrito na presente invenção.

[00036] Como usado aqui, "posições produtivas" são posições de aminoácidos que são tolerantes à substituição por diferentes resíduos de aminoácidos, em que as variantes resultantes atendem um conjunto de critérios de desempenho de combinabilidade, conforme estabelecido acima. Posições produtivas podem ser atribuídas uma Pontuação de Produtividade da seguinte forma:A. Para as bibliotecas SEL de 24 sítios: As posições em que menos de 15% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "1". As posições em que menos de 40%, mas mais ou igual a 15% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "2". As posições em que menos de 75%, mas mais ou igual a 40% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade "3". As posições onde 75% ou mais das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "4".B. Para as bibliotecas completas de SEL: As posições em que menos de 15% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "1". As posições em que menos de 30%, mas mais ou igual a 15% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "2". As posições em que menos de 50%, mas mais ou igual a 30% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade "3". As posições onde 50% ou mais das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "4".

[00037] As posições produtivas preferenciais são mutações combináveis.

[00038] Como usado aqui, "pontuação de adequação"refere-se à habilidade de uma ou mais mutações combináveis ser usada para fazer variantes combinatórias, com base nos critérios de desempenho para combinabilidade, (isto é, A, B, e C, conforme estabelecido acima) em que cada uma dentre as mutações está. Uma pontuação de adequação indica uma mutação ou mutações que são mais adequadas para uso na fabricação de variantes combinatórias.

[00039] As pontuações de adequação são descritas na seguinte Tabela.Tabela B. Definições de pontuações de adequação

[00040] Os termos "recuperado", "isoladas" e "separado" referem-se a um composto, proteína (polipeptídeos), célula, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente especificado que é removido de ao menos um outro material ou componente com que é naturalmente associado conforme encontrado na natureza. Um polipeptídeo "isolado", do mesmo, inclui mas não se limita a um caldo de cultura contendo polipeptídeo secretado expressado em uma célula hospedeira heteróloga.

[00041] O termo "purificado" refere-se a material (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo isolado) que está em um estado relativamente puro, por exemplo, ao menos cerca de 90% em puro, ao menos cerca de 95% em puro, ao menos cerca de 98% em puro ou até mesmo ao menos cerca de 99% em puro.

[00042] O termo "enriquecido" refere-se a material (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo isolado) que está em cerca de 50% em puro, ao menos cerca de 60% em puro, ao menos cerca de 70% em puro, ou até mesmo ao menos cerca de 70% em puro.

[00043] Os termos "termoestável"e "termoestabilidade", com referência a uma enzima, se referem à habilidade da enzima para prender atividade após exposição a uma temperatura elevada. A termoestabilidade de uma enzima, como uma amilase enzima, é medida por sua meia-vida (t1/2) determinada em minutos, horas ou dias, durante o que metade da atividade de enzima é perdida sob condições definidas. A meia-vida pode ser calculada mediante a medição de atividade residual de α-amilase após a exposição a (isto é, desafiada por) temperatura elevada.

[00044] Uma "faixa de pH", com referência a uma enzima, refere-se à faixa de valores de pH sob a qual a enzima exibe atividade catalítica.

[00045] Os termos "pH estável"e "estabilidade de pH", com referência a uma enzima, se referem à capacidade da enzima de reter atividade em uma ampla gama de valores de pH por um período de tempo predeterminado (por exemplo, 15 min., 30 min., 1 hora).

[00046] O termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo dos termos "polipeptídeo", "proteína"e "peptídeo", e são usados de forma intercambiável. Onde tais sequências de aminoácidos exibem atividade, as mesmas podem ser chamadas de uma "enzima". Os códigos convencionais de uma letra ou de três letras para resíduos deaminoácidos são usados, com sequências de aminoácidosapresentadas na orientação de amino a carbóxi terminal padrão (isto é, N^C).

[00047] O termo "ácido nucleico" abrange DNA, RNA, heteroduplexos e moléculas sintéticas capazes de codificar um polipeptídeo. Os ácidos nucléicos podem ser de fita simples ou de fita dupla, e podem conter modificações químicas. Os termos "ácido nucléico"e "polinucleotídeo" são usados de forma intercambiável. Como o código genético é degenerado, mais de um códon pode ser usado para codificar um aminoácido específico, e as composições e os métodos presentes abrangem sequências de nucleotídeo que codificam uma sequência de aminoácidos específica. Exceto onde indicado em contrário, as sequências de ácido nucléico são apresentadas em uma orientação de 5‘ para 3‘.

[00048] "Hibridização"refere-se ao processo pelo qual uma fita de ácido nucleico forma um duplex com, isto é, pares básicos com uma fita complementar, como ocorre durante técnicas Blot de hibridização e técnicas de PCR. As condições de hibridização estringentes são exemplificadas pela hibridização sob as seguintes condições: 65°C e 0,1 X SSC (onde 1 X SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3 citrato, pH 7,0). Os ácidos nucleicos duplex hibridizados são caracterizados por uma temperatura de fusão (Tm), onde metade dos ácidos nucleicos hibridizados são desemparelhados com a fita complementar. Nucleotídeos desalinhados no duplex inferior ao Tm. Um ácido nucleico que codifica uma α-amilase variante pode ter um Tm reduzido em 1°C a 3°C ou mais em comparação com um duplex formado entre o nucleotídeo da SEQ ID NO: 2 e seu complemento idêntico.

[00049] Uma molécula "sintética" é produzida por síntese in vitro química ou enzimática do que por um organismo.

[00050] Os termos "transformado", "transformado de maneira estável"e "transgênico", usados com referência a uma célula significa que a célula contém uma (por exemplo, heteróloga) sequência de ácido nucleico não nativa integrada ao seu genoma ou conduzido como uma epissoma que é mantida através de múltiplas gerações.

[00051] O termo "introduzido" no contexto de inserir uma sequência de ácido nucleico em uma célula, significa "transfecção", "transformação"ou "transdução", conforme conhecido na técnica.

[00052] Uma "cepa hospedeira" ou "célula hospedeira"é um organismo ao qual um vetor de expressão, bacteriófago, vírus ou outro construto de DNA, incluindo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse (por exemplo, uma amilase) foi introduzida. Cepas hospedeiras exemplificadoras são células de micro-organismos (por exemplo, bactérias, fungos filamentosos e levedura) capazes de expressar o polipeptídeo de interesse e/ou fermentar sacarídeos. O termo "célula hospedeira" inclui protoplastos criados a partir de células.

[00053] O termo "heterólogo"com referência a um polinucleotídeo ou a uma proteína refere-se a um polinucleotídeo ou uma proteína que não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira.

[00054] O termo "endógeno(a)"com referência a um polinucleotídeo ou uma proteína refere-se a um polinucleotídeo ou uma proteína que ocorre naturalmente na célula hospedeira.

[00055] O termo "expressão"refere-se ao processo no qual um polipeptídeo é produzido com base em uma sequência de ácido nucleico. O processo inclui tanto transcrição como tradução.

[00056] Um "marcador seletivo" ou "marcador selecionável"refere- se a um gene capaz de ser expresso em um hospedeiro para facilitar a seleção das células hospedeiras transportando o gene. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem mas não se limitam a substâncias microbicidas (por exemplo, higromicina, bleomicina ou cloranfenicol) e/ou genes que conferem uma vantagem metabólica, como uma vantagem nutricional, na célula hospedeira.

[00057] Um "vetor" refere-se a uma sequência de polinucleotídeos projetados para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de célula. Vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores de transporte, plasmídios, partículas de bacteriófago, cassetes e similares.

[00058] Um "vetor de expressão"refere-se a um construto de DNA compreendendo uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de interesse, cuja sequência de codificação está ligada de maneira funcional a uma sequência de controle adequada capaz de efetuar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais sequências de controle podem incluir um promotor para realizar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência que codifica sítios de ligação do ribossomo adequados, intensificadores e sequências que controlam a terminação de transcrição e translação.

[00059] O termo "ligado de maneira funcional" significa que componentes especificados estão em uma relação (incluindo mas não se limitando a justaposição) permitindo que eles funcionem de maneira intencionada. Por exemplo, uma sequência reguladora está ligada de maneira funcional a uma sequência de codificação de modo que a expressão da sequência de codificação está sob controle das sequências regulatórias.

[00060] Uma "sequência de sinais"é uma sequência de aminoácidos fixada à porção N-terminal de uma proteína, o que facilita a secreção da proteína fora da célula. A forma madura de uma proteína extracelular é desprovida da sequência de sinalização que é removida por clivagem durante o processo de secreção.

[00061] "Biologicamente ativo" refere-se a uma sequência tendo uma atividade biológica especificada, como uma atividade enzimática.

[00062] O termo "atividade específica"refere-se ao número de moles de substrato que pode ser convertido para produto por uma enzima ou preparação de enzima por unidade de tempo sob condições específicas. A atividade específica é de modo geral expressada como unidades (U)/mg de proteína.

[00063] Como usado aqui, "dureza da água" é uma medida dos minerais (por exemplo, cálcio e magnésio) presentes na água.

[00064] Um "retalho"é uma peça de material como um tecido que tem uma mancha aplicada a isso. O material pode ser, por exemplo, tecidos produzidos a partir de algodão, poliéster ou misturas de fibras naturais e sintéticas. O retalho pode adicionalmente ser papel, como papel filtro ou nitrocelulose, ou uma peça de um material rígido como cerâmica, metal ou vidro. Para as amilases, a mancha tem base de amido, mas pode incluir sangue, leite, tinta, grama, chá, vinho, espinafre, caldo de carne, chocolate, ovo, queijo, argila, pigmento, óleo ou misturas desses compostos.

[00065] Um "retalho menor"é uma seção do retalho que foi cortada com um dispositivo de punção de orifício único, ou com um dispositivo de punção de 96 orifícios fabricado sob encomenda, em que o padrão da punção de orifícios múltiplos corresponde a placas de microtitulação padrão com 96 poços, ou a seção foi removida do retalho de outro modo. O retalho pode ser têxtil, de papel, metal, ou outro material adequado. O retalho menor pode ter a mancha afixada antes ou após ele ser colocado na cavidade de uma placa de microtitulação com 24, 48 ou 96 poços. O retalho menor pode também ser produzido pela aplicação de uma mancha a uma pequena peça de material. Por exemplo, o retalho menor pode ser uma peça de tecido com uma mancha de 1,59 cm (5/8'') ou 0,64 cm (0,25'') de diâmetro. A punção fabricada sob medida pode ser desenhada de tal modo que ela forneça 96 retalhos simultaneamente para todas as poços de uma placa com 96 poços. O dispositivo permite a aplicação de mais de um retalho por cavidade simplesmente pelo carregamento da mesma placa com 96 poços múltiplas vezes. Os dispositivos de punção com múltiplos orifícios podem ser concebidos para aplicar retalhos simultaneamente a qualquer formato de placa, incluindo mas não se limitando a placas com 24 poços, 48 poços, e 96 poços. Em outro método concebido, a plataforma de teste suja pode ser uma microesfera produzida de metal, plástico, vidro, cerâmica, ou outro material adequado que é revestido com o substrato sujo. A uma ou mais microesferas revestidas são então colocadas em placas com 96, 48 ou 24 poços ou formatos maiores, contendo tampão adequado e enzima.

[00066] "Um material celular cultivado compreendendo uma amilase" ou linguagem similar, refere-se a um lisato celular ou sobrenadante (incluindo meio) que inclui uma amilase como um componente. O material celular pode ser de um hospedeiro heterólogo que é cultivado em cultura com o propósito de produzir a amilase.

[00067] "Percentagem de identidade de sequência"significa que uma sequência específica tem ao menos uma determinada porcentagem de resíduos de aminoácidos idênticos aos de uma sequência de referência especificada, quando alinhadas com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâmetros padrão. Consulte Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. Os parâmetros padrão do algoritmo CLUSTAL W são: Penalidade para abertura de vão: 10,0 Penalidade por extensão da lacuna: 0,05 Matriz do peso da proteína: série BLOSUM Matriz do peso do DNA: IUB Sequências divergentes de retardo %: 40 Distância de separação do vão: 8 Peso das transições de DNA: 0,50 Lista de resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR Uso de matriz negativa: DESLIGADO Alternar penalidades específicas de resíduo: LIGADO Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO Alternar penalidade para separação de vão final DESLIGADO

[00068] Deleções são contadas como resíduos não idênticos, em comparação com uma sequência de referência. Deleções ocorrendo em quaisquer terminações são incluídas. Por exemplo, uma variante com cinco deleções de aminoácido do C-terminal do polipeptídeo CspAmy2 maduro da SEQ ID NO: 1 teria uma percentagem de identidade de sequência de 99% (612/617 resíduos idênticos x 100, arredondados para o número inteiro mais próximo) em relação ao polipeptídeo maduro. Tal variante seria englobada por uma variante tendo "ao menos 99% de identidade de sequência" com um polipeptídeo de amilase maduro.

[00069] Sequências de polipeptídeo "fundidas" são conectadas, isto é, ligadas de maneira funcional, via uma ligação de peptídeo entre duas sequências de polipeptídeo individuais.

[00070] O termo "fungos filamentosos" refere-se a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina, particularmente a espécie Pezizomycotina.

[00071] O termo "grau de polimerização" (DP) refere-se ao número (n) de unidades de anidro-glicopiranose em um determinado sacarídeo. Exemplos de DP1 são os monossacarídeos glicose e frutose. Exemplos de DP2 são os dissacarídeos maltose e sacarose. O termo "DE", ou "equivalente de dextrose", é definido como a porcentagem de açúcar redutor, isto é, D-glicose, como uma fração do carboidrato total em um xarope.

[00072] O termo "teor de sólidos secos" (ds) refere-se aos sólidos totais de uma pasta aquosa em uma base de percentagem de sólido seco. O termo "pasta fluida" refere-se a uma mistura aquosa contendo sólidos insolúveis.

[00073] A frase "sacarificação e fermentação simultânea (SSF)" refere-se a um processo na produção de bioquímicos em que um organismo microbiano, como um micro-organismo etanologênico, e ao menos uma enzima, como uma amilase, estão presentes durante a mesma etapa de processo. A SSF inclui a hidrólise contemporânea dos substratos de amido (granulares, liquefeitos ou solubilizados) para sacarídeos, incluindo glicose, e a fermentação dos sacarídeos em álcool ou outro bioquímico ou biomaterial no mesmo vaso reator.

[00074] Um "micro-organismo etanologênico"refere-se a um micro-organismo com a capacidade de converter um açúcar ou oligossacarídeo para etanol.

[00075] O termo "bebida fermentada" refere-se a qualquerbebida produzida por um método compreendendo um processo de fermentação, como uma fermentação microbiana, por exemplo, uma fermentação bacteriana e/ou fúngica. "Cerveja"é um exemplo dessa bebida fermentada, e o termo "cerveja" compreende qualquer mosto fermentado produzido por fermentação de um material de origem vegetal contendo amido. Com frequência, a cerveja é produzida exclusivamente a partir de malte ou composto auxiliar, ou qualquer combinação de malte e composto auxiliar. Exemplos de cervejas incluem: cerveja maltada completa, cerveja fermentada de acordo com a "Reinheitsgebot" (Lei da Pureza da Cerveja), ale, India pale ale, lager, pilsner, bitter, Happoshu (segunda cerveja), terceira cerveja, "dry beer", "near beer", cerveja light, cerveja com baixo teor de álcool, cerveja de baixas calorias, porter, bock, dopplebock, stout, porter, licor de malte, cerveja não alcoólica, licor de malte não alcoólico e similares, mas também bebidas alternativas de cereal e malte como bebidas de malte com sabor de frutas, por exemplo, bebidas de malte com sabor de cítricos, como limão, laranja, lima ou de frutas vermelhas, bebidas de malte com sabor de destilados, por exemplo, licor de malte com sabor de vodka, rum ou tequila, ou bebidas de malte com sabor de café, como bebidas de malte com sabor de cafeína e similares.

[00076] O termo "malte" refere-se a qualquer grão de cereal maltado, como cevada ou trigo maltado.

[00077] O termo "composto auxiliar" refere-se a qualquer material de origem vegetal contendo amido e/ou açúcar que não seja malte, como malte de cevada ou de trigo. Exemplos de compostos auxiliares incluem grits de milho comuns, grits de milho refinados, levedura triturada de cervejaria, arroz, sorgo, amido de milho refinado, cevada, amido de cevada, cevada descascada, trigo, amido de trigo, cereal torrado, flocos de cereais, centeio, aveia, batata, tapioca, mandioca e xaropes, como xarope de milho, xarope de cana de açúcar, xarope de açúcar invertido, xarope de cevada e/ou de trigo e similares.

[00078] O termo "mingau" refere-se a uma pasta fluida aquosa de qualquer amido e/ou açúcar contendo material de origem vegetal, como grist, por exemplo, compreendendo malte de cevada moída, cevada moída e/ou outro composto auxiliar ou uma combinação dos mesmos, misturado com água posteriormente para ser separado em mosto e grãos gastos.

[00079] O termo "mosto" refere-se ao licor não fermentado escorrido em seguida à extração dos grãos para moagem durante o processo de mostura.

[00080] "Amido iodo-positivo" ou "IPS" refere-se a (1) amilose que não é hidrolizada após a liquefação e sacarificação ou (2) um polímero de amido retrogradado. Quando o amido sacarificado ou liquor sacarídico é testado com iodo, a amilose de alto DPn ou o polímero de amido retrogradado liga-se ao iodo e produz uma cor azul característica. O liquor sacarídico é assim chamado "sacarídeo iodo-positivo", "sacarídeo azul" ou "sac. azul"

[00081] Os termos "amido retrogradado" ou "retrogradação de amido" refere-se a alterações que ocorrem espontaneamente em uma pasta de amido ou gel durante o envelhecimento.

[00082] O termo "cerca de" refere-se a ±15% ao valor referenciado.

2. Variantes de α-amilase

[00083] Um aspecto das presentes composições e métodos é as enzimas de amilase variante verificadas com o uso de uma combinação de abordagens experimentais, incluindo o uso de bibliotecas de avaliação de sítio (SELs) e análise com base em estrutura.

2.1 Variantes de α-amilase com base em bibliotecas SEL de α-amilase Amy707

[00084] Em um aspecto, são fornecidos polipeptídeos da α-amilase variante. As amilases variantes têm uma ou mais mutações, conforme estabelecido, na presente invenção, com relação a uma α-amilase parental tendo uma dobra similar e/ou 60% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com Bacillus sp. 707 amilase (SEQ ID NO: 3) ou amilase AA560 (SEQ ID NO: 4).

[00085] Em algumas modalidades, a enzima parental é α-amilase Amy707 derivada do Bacillus sp. 707 (#707) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3: THSSFKWRWY HFDGVDWDQS RRLNNRIYKF RGHGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADIDMDH PEVVNELRNW GVWYTNTLGL DGFRIDAVKH IKYSFTRDWI NHVRSATGKN MFAVAEFWKN DLGAIENYLQ KTNWNHSVFD VPLHYNLYNA SKSGGNYDMR NIFNGTVVQR HPSHAVTFVD NHDSQPEEAL ESFVEEWFKP LAYALTLTRE QGYPSVFYGD YYGIPTHGVP AMRSKIDPIL EARQKYAYGK QNDYLDHHNI IGWTREGNTA HPNSGLATIM SDGAGGSKWM FVGRNKAGQV WSDITGNRTG TVTINADGWG NFSVNGGSVS IWVNK

[00086] Em algumas modalidades, a enzima parental é α-amilase AA560 derivada de Bacillus sp. DSM 12649 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4HHNGTNGTMM QYFEWYLPND GNHWNRLRSD ASNLKDKGIS AVWIPPAWKG ASQNDVGYGA YDLYDLGEFN QKGTIRTKYG TRNQLQAAVN ALKSNGIQVY GDVVMNHKGG ADATEMVRAV EVNPNNRNQE VSGEYTIEAW TKFDFPGRGN THSNFKWRWY HFDGVDWDQS RKLNNRIYKF RGDGKGWDWE VDTENGNYDY LMYADIDMDH PEVVNELRNW GVWYTNTLGL DGFRIDAVKH IKYSFTRDWI NHVRSATGKN MFAVAEFWKN DLGAIENYLN KTNWNHSVFD VPLHYNLYNASKSGGNYDMR QIFNGTVVQR HPMHAVTFVD NHDSQPEEAL ESFVEEWFKP LAYALTLTRE QGYPSVFYGD YYGIPTHGVP AMKSKIDPIL EARQKYAYGRQNDYLDHHNI IGWTREGNTA HPNSGLATIM SDGAGGNKWM FVGRNKAGQV WTDITGNRAG TVTINADGWG NFSVNGGSVS IWVNK

[00087] Variantes de α-amilase que incluem mutações combináveis foram identificados fazendo-se uma biblioteca de avaliação de sítiol (SEL) com base na Amy707 (SEQ ID NO: 3) e testar as variantes resultantes de vários critérios de desempenho, como estabilidade, termoestabilidade, desempenho da limpeza e níveis de expressão de detergente, cujos procedimentos detalhados são descritos nos Exemplos ou conhecidos de outro modo. Cada variante foi testada para diferentes propriedades enzimáticas e bioquímicas, e caracterizada por um valor de índice de desempenho (PI), que compara o desempenho relativo da variante com a amilase Amy707 quanto a cada critério de desempenho. Um PI que é maior que 1 (isto é, PI>1) indicava aprimoramento do desempenho por uma variante em comparação com Amy707, enquanto um PI de 1 (isto é, PI=1) indicava uma variante que teve o mesmo desempenho de Amy707 e um PI que é menor que 1 (isto é, PI<1) indicava uma variante que teve desempenho pior que Amy707. Os valores de PI foram então usados para identificar mutações combináveis e posições produtivas.

[00088] Mutações combináveis são mutações em qualquer posição de aminoácido que otimizam ao menos uma propriedade desejada da molécula, ao mesmo tempo em que não diminuem significantemente a expressão, atividade ou estabilidade. Mutações combináveis são atribuídas a um dos três Grupos (isto é, A, B ou C), conforme estabelecido na presente invenção. Mutações combináveis preferenciais estão em posições produtivas. Posições produtivas são posições de aminoácidos que são tolerantes à substituição por diferentes resíduos de aminoácidos, em que as variantes resultantes atendem um conjunto de critérios de desempenho de combinabilidade, conforme estabelecido acima.

[00089] As mutações combináveis e as posições produtivas não devem ser confundidas com mutações anteriormente identificadas, em um único sítio, alguns dos quais foram subsequentemente verificados por meio de tentativa e erro de trabalhar em combinação com as outras mutações. As mutações em um único sítio anteriormente identificadas são invariavelmente "vencedoras" com relação ao aprimoramento de qualquer recurso de desempenho ou estabilidade. Ao mesmo tempo em que isto as torna mutações atraentes para incluir em amilases variantes, essas "vencedoras" tendem a afetar adversamente outros recursos de desempenho ou estabilidade das variantes, o que com frequência exige fazer mutações adicionais para corrigir os defeitos.

[00090] Em contraste, as mutações combináveis podem ser apenas gradativamente benéficas no aprimoramento de qualquer recurso de realização ou estabilidade de uma amilase variante. Entretanto, elas são cuidadosamente selecionadas para ser minimamente prejudiciais a outros recursos de desempenho ou estabilidade desejados, tornando- as adequadas para uso em combinação com outras mutações combináveis para construir amilases variantes tendo propriedades ernzimáticas e bioquímicas aprimoradas desejadas sem ser defeituosas em outras áreas, resultando em variantes robustas tendo um bom equilíbrio de desempenho, estabilidade e potencial de expressão.

[00091] Também com base nas propriedades enzimáticas e bioquímicas medidas das amilases variantes, as pontuações de adequação das diferentes mutações para fabricação de variantes combinatórias foram determinadas. A pontuação de adequação refere- se à habilidade de uma ou mais mutações combináveis de ser usada para fazer variantes combinatórias, com base nos critérios de desempenho para combinabilidade, (isto é, A, B, e C, conforme estabelecido acima) em que cada uma dentre as mutações está.

[00092] As pontuações de adequação das substituições individuais na Amy707 são mostradas na Tabela C. A numeração de posição se baseia na sequência de aminoácidos do polipeptídeo Amy707 maduro (SEQ ID NO: 3). Os resíduos tipo selvagem nas posições indicadas recebem uma pontuação de adequação de +++. As substituições mais provavelmente combináveis com outras mutações recebem uma pontuação de adequação de ++++ ou até mesmo +++++. Em geral, pontuações de adequação preferenciais são +++, ++++ ou +++++, ++++ ou +++++, ou até mesmo +++++. Tabela C. Pontuações de adequação das substituições individuais em Amy707

[00093] As pontuações de adequação de um subconjunto de substituições em Amy707, que foram identificadas em bibliotecas SEL de 24 sítios, limitadas, são mostrados na Tabela D. Tal como antes, a numeração de posição tem por base a sequência de aminoácidos do polipeptídeo Amy707 maduro (SEQ ID NO: 3), resíduos tipo selvagem nas posições indicadas recebem uma pontuação de adequação de +++, as substituições mais provavelmente combináveis com outras mutações recebem uma pontuação de adequação de ++++ ou até mesmo +++++ e, em geral, pontuações de adequação preferenciais são +++, ++++ ou +++++, ++++ ou +++++, ou até mesmo +++++.

[00094] Ao mesmo tempo em que avaliar mutações à base de pontuação de adequação representa um aspecto refinado das presentes composições e métodos, a identificação das posições produtivas, que são tolerantes à substituição com diferentes resíduos de aminoácidos, representa inúmeras modalidades significativas.

[00095] Cada posição produtiva identificada nas seguintes listas com critérios especificados, e cada substituição identificada em parênteses após o identificador de posição numérica em cada uma dessas listas representa uma mutação, identificada por dados experimentais, que diretamente contribui para o desempenho de uma variante de amilase, ou é determinado para ser combinável com outras mutações para produzir uma variante de amilase com desempenho aprimorado.

[00096] As posições produtivas em Amy 707 que estão dentro das Pontuações de Produtividade anteriormente descritas de "4" (para as bibliotecas completas de SEL) e as substituições dentro dessas posições que são combináveis são listadas, abaixo, na LISTA A. A numeração de posição tem por base a proteína madura Amy707 listada na SEQ ID NO: 3. Lista A 1(H,A,C,E,F,I,K,L,M,N,Q,R,T,W); 2(H,A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,W); 3(N,A,C,D,E,F,K,L,M,Q,S,T,V); 4(G,D,E,F,H,I,K,L,M,P,S,T,W); 5(T,A,C,D,G,H,I,M,N,Q,S,V,W); 7(G,A,D,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 22(N,E,G,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 25(N,A,C,G,K,M,S,T,V,Y); 28(N,A,C,D,E,G,H,K,Q,R,W,Y); 29(S,A,C,D,E,F,H,K,M,N,R,T,V,W,Y); 32(S,C,D,E,G,I,L,M,N,Q,R,W,Y); 33(N,C,D,H,I,K,M,Q,R,T,V,W,Y); 35(K,A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q); 54(N,A,C,D,E,F,G,M,Q,S,V,W); 70(N,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,R,S,V); 73(G,D,E,K,M,Q,R,S,T,W,Y); 86(Q,E,H,I,K,R,T,V,W,Y); 94(N,A,C,D,F,G,H,K,L,M,Q,R); 95(N,A,C,D,F,G,H,I,Q,R,S,T,Y); 113(A,C,E,F,G,H,I,K,M,R,V,Y); 116(M,A,C,D,E,F,G,I,L,N,P,Q,R,T,V,W); 125(N,C,F,G,H,I,L,M,R,S,T,W,Y); 136(T,C,D,F,G,K,L,M,N,P,Q,R,Y); 146(P,A,C,D,E,F,G,H,M,R,S,W,Y); 149(G,A,C,D,E,F,H,K,L,P,R,V,W); 151(T,D,E,G,H,I,L,M,Q,V); 160(Y,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S); 169(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,S,V,W,Y); 172(R,A,C,E,G,H,M,Q,S,Y); 173(L,A,C,D,F,H,K,N,W,Y); 174(N,D,G,H,I,L,P,S,T,V); 181(R,A,C,E,F,I,L,M,N,Q,S,T,V,Y); 183(H,A,C,D,E,F,L,M,N,P,Q,V,W,Y); 211(P,A,C,D,F,K,L,M,N,Q,S,V); 222(V,A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,R,S,T,Y); 251(N,A,C,G,H,K,L,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 262(F,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,R,S,Y); 273(G,C,D,E,H,K,L,M,P,Q,S,T,V,Y); 303(S,A,C,D,E,G,L,M,Q,R); 311(N,D,E,F,G,H,K,L,M,Q,R,T,Y); 314(N,A,D,E,G,H,I,K,L,M,Q,S,T,V,Y); 320(R,A,D,E,H,K,M,N,Q,S,T,Y); 323(S,A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,R,T,V,Y); 345(E,A,G,H,K,L,M,N,Q,S,T,Y); 346(E,A,C,D,G,H,K,M,N,Q,R,S,T,V,Y); 360(E,A,C,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V,Y); 361(Q,A,C,D,E,G,H,S,T,V,W); 375(P,A,D,E,G,H,I,K,M,Q,R,T,V,Y); 388(P,A,C,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 391(E,A,C,G,H,I,K,L,N,R,S,W); 395(K,A,D,E,G,M,Q,R,S,T,V); 400(K,A,F,G,H,I,L,M,Q,T,V,W); 408(H,E,G,K,M,N,P,Q,R,S,T); 416(E,A,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,T,V,W,Y); 418(N,A,D,I,K,L,M,Q,S,T,V); 419(T,D,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y); 420(A,D,F,G,H,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 421(H,A,C,D,E,I,K,L,M,N,R,V,W,Y); 422(P,A,C,E,F,G,L,M,T,V,Y); 423(N,C,D,E,F,H,I,L,R,S,T); 424(S,A,C,D,E,G,I,N,Q,T,V,W); 434(A,C,D,E,F,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V); 435(G,A,C,E,K,M,N,P,Q,R,T); 452(S,A,C,E,F,H,K,N,Q,T,W,Y); 458(R,C,D,E,H,K,L,M,N,S,T,V,Y); 459(T,A,C,D,E,G,H,L,N,P,S); 461(T,A,C,D,E,F,G,K,L,N,P,Q,R,V,Y); e 466(A,D,E,G,K,N,P,Q,R,S).

[00097] As posições produtivas em Amy 707 que estão dentro das Pontuações de Produtividade anteriormente descritas de "3 e 4" (para as bibliotecas completas de SEL) e as substituições nessas posições que são combináveis são listadas, abaixo, na LISTA B. A numeração de posição tem por base a proteína Amy707 madura listada na SEQ ID NO: 3. Lista B 1(H,A,C,E,F,I,K,L,M,N,Q,R,T,W); 2(H,A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,W); 3(N,A,C,D,E,F,K,L,M,Q,S,T,V); 4(G,D,E,F,H,I,K,L,M,P,S,T,W); 5(T,A,C,D,G,H,I,M,N,Q,S,V,W); 6(N,A,E,G,Q,S,T); 7(G,A,D,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 16(Y,A,D,E,H,N,T,W); 17(L,A,D,G,S,T,V); 20(D,A,C,E,G,H,I,N,S,Y); 22(N,E,G,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 25(N,A,C,G,K,M,S,T,V,Y); 28(N,A,C,D,E,G,H,K,Q,R,W,Y); 29(S,A,C,D,E,F,H,K,M,N,R,T,V,W,Y); 32(S,C,D,E,G,I,L,M,N,Q,R,W,Y); 33(N,C,D,H,I,K,M,Q,R,T,V,W,Y); 35(K,A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q); 41(A,C,D,I,K,M,Q,S); 54(N,A,C,D,E,F,G,M,Q,S,V,W); 70(N,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,R,S,V); 73(G,D,E,K,M,Q,R,S,T,W,Y); 81(T,A,C,D,F,I,K,N,P,S); 82(R,A,C,F,I,K,M,Q,S,V,Y); 84(Q,C,D,E,F,K,L,M,N); 86(Q,E,H,I,K,R,T,V,W,Y); 87(A,D,K,M,T); 91(S,A,E,H,K,M,N,Q,R,T,V); 94(N,A,C,D,F,G,H,K,L,M,Q,R); 95(N,A,C,D,F,G,H,I,Q,R,S,T,Y); 98(Q,A,C,D,E,G,H,K,R); 113(A,C,E,F,G,H,I,K,M,R,V,Y); 116(M,A,C,D,E,F,G,I,L,N,P,Q,R,T,V,W); 117(V,E,L,P,R,S,T); 118(R,D,E,G,L,Q,T,V,W); 125(N,C,F,G,H,I,L,M,R,S,T,W,Y); 133(G,A,D,H,P,Q,S,T); 136(T,C,D,F,G,K,L,M,N,P,Q,R,Y); 142(R,C,E,F,G,H,K,S,T,Y); 144(D,E,I,K,M,S,Y); 146(P,A,C,D,E,F,G,H,M,R,S,W,Y); 149(G,A,C,D,E,F,H,K,L,P,R,V,W); 151(T,D,E,G,H,I,L,M,Q,V); 160(Y,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S); 169(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,S,V,W,Y); 172(R,A,C,E,G,H,M,Q,S,Y); 173(L,A,C,D,F,H,K,N,W,Y); 174(N,D,G,H,I,L,P,S,T,V); 175(N,A,D,E,L,M,R,S); 181(R,A,C,E,F,I,L,M,N,Q,S,T,V,Y); 183(H,A,C,D,E,F,L,M,N,P,Q,V,W,Y); 210(H,A,C,D,E,M,N,Q,R,S); 211(P,A,C,D,F,K,L,M,N,Q,S,V); 215(N,D,F,K,L,M,Q); 216(E,A,C,G,H,L,N,Q,S,T,Y); 218(R,A,C,E,F,H,K,M); 219(N,A,C,D,M,R,T); 222(V,A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,R,S,T,Y); 233(F,A,C,H,L,M,W,Y); 251(N,A,C,G,H,K,L,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 258(G,D,I,K,M,N,P,R,S,V); 259(K,A,C,D,E,G,H,P,Q,R,T); 261(M,A,C,E,G,I,Q,T); 262(F,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,R,S,Y); 273(G,C,D,E,H,K,L,M,P,Q,S,T,V,Y); 286(H,A,C,E,F,L,M,N,T,V); 299(N,G,H,M,R,S,T,Y); 303(S,A,C,D,E,G,L,M,Q,R); 311(N,D,E,F,G,H,K,L,M,Q,R,T,Y); 314(N,A,D,E,G,H,I,K,L,M,Q,S,T,V,Y); 319(Q,A,D,E,G,H,N,R,Y); 320(R,A,D,E,H,K,M,N,Q,S,T,Y); 323(S,A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,R,T,V,Y); 326(V,A,C,H,M,N,T); 337(E,A,C,D,N,Q,S,T,Y); 345(E,A,G,H,K,L,M,N,Q,S,T,Y); 346(E,A,C,D,G,H,K,M,N,Q,R,S,T,V,Y); 360(E,A,C,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V,Y); 361(Q,A,C,D,E,G,H,S,T,V,W); 363(Y,A,D,E,I,K,M,N,Q,V,W); 372(Y,H,I,K,M,Q,R,T,V); 375(P,A,D,E,G,H,I,K,M,Q,R,T,V,Y); 379(V,A,I,L,M,N,Q,R,S,Y); 388(P,A,C,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 389(I,E,F,G,L,M,Q,S,V); 391(E,A,C,G,H,I,K,L,N,R,S,W); 394(Q,C,D,E,G,H,L,R,V,Y); 395(K,A,D,E,G,M,Q,R,S,T,V); 400(K,A,F,G,H,I,L,M,Q,T,V,W); 402(N,C,I,K,L,S,V,Y); 408(H,E,G,K,M,N,P,Q,R,S,T); 416(E,A,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,T,V,W,Y); 418(N,A,D,I,K,L,M,Q,S,T,V); 419(T,D,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y); 420(A,D,F,G,H,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 421(H,A,C,D,E,I,K,L,M,N,R,V,W,Y); 422(P,A,C,E,F,G,L,M,T,V,Y); 423(N,C,D,E,F,H,I,L,R,S,T); 424(S,A,C,D,E,G,I,N,Q,T,V,W); 433(G,A,C,D,E,K,M,N,R); 434(A,C,D,E,F,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V); 435(G,A,C,E,K,M,N,P,Q,R,T); 437(S,A,C,D,K,N,T); 445(N,A,C,E,G,K,Q,R,T); 446(K,A,C,F,H,M,Q,S,T,Y); 450(V,A,E,I,L,Q,R,S,T); 452(S,A,C,E,F,H,K,N,Q,T,W,Y); 454(I,A,C,F,L,M,S,V); 458(R,C,D,E,H,K,L,M,N,S,T,V,Y); 459(T,A,C,D,E,G,H,L,N,P,S); 460(G,E,H,K,N,Q,S); 461(T,A,C,D,E,F,G,K,L,N,P,Q,R,V,Y); 466(A,D,E,G,K,N,P,Q,R,S); 471(N,C,D,E,H,Q,R,Y); 477(G,A,D,K,N,P,Q,R,T); 483(V,C,G,H,M,R,S,T); 484(N,A,E,G,H,Q,R,S); e 485(K,H,M,P,Q,S,T).

[00098] As posições produtivas em Amy 707 que estão dentro das Pontuações de Produtividade anteriormente descritas de "2, 3 e 4" (para as bibliotecas completas de SEL) e as substituições nessas posições que são combináveis são listadas, abaixo, na LISTA C. A numeração de posição tem por base a proteína Amy707 madura listada na SEQ ID NO: 3. Lista C 1(H,A,C,E,F,I,K,L,M,N,Q,R,T,W); 2(H,A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,W); 3(N,A,C,D,E,F,K,L,M,Q,S,T,V); 4(G,D,E,F,H,I,K,L,M,P,S,T,W); 5(T,A,C,D,G,H,I,M,N,Q,S,V,W); 6(N,A,E,G,Q,S,T); 7(G,A,D,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 16(Y,A,D,E,H,N,T,W); 17(L,A,D,G,S,T,V); 20(D,A,C,E,G,H,I,N,S,Y); 22(N,E,G,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 23(H,F,M,Q,T); 25(N,A,C,G,K,M,S,T,V,Y); 26(R,K,Q,T); 27(L,A,I,V); 28(N,A,C,D,E,G,H,K,Q,R,W,Y); 29(S,A,C,D,E,F,H,K,M,N,R,T,V,W,Y); 30(D,E,M,N,Q,R); 32(S,C,D,E,G,I,L,M,N,Q,R,W,Y); 33(N,C,D,H,I,K,M,Q,R,T,V,W,Y); 35(K,A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q); 36(S,D,G,K,Q,T); 41(A,C,D,I,K,M,Q,S); 47(A,G,M,P,S); 50(G,C,S); 52(S,K,L,M,R,T); 54(N,A,C,D,E,F,G,M,Q,S,V,W); 56(V,E,N,S); 63(L,M,N,Q); 68(E,A,D,Q); 70(N,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,R,S,V); 73(G,D,E,K,M,Q,R,S,T,W,Y); 74(T,G,S); 77(T,A,I,N,S,V); 81(T,A,C,D,F,I,K,N,P,S); 82(R,A,C,F,I,K,M,Q,S,V,Y); 83(S,K,M,N,Q,R,T); 84(Q,C,D,E,F,K,L,M,N); 86(Q,E,H,I,K,R,T,V,W,Y); 87(A,D,K,M,T); 89(V,A,C,I); 90(T,G,M,Q,R,S); 91(S,A,E,H,K,M,N,Q,R,T,V); 94(N,A,C,D,F,G,H,K,L,M,Q,R); 95(N,A,C,D,F,G,H,I,Q,R,S,T,Y); 96(G,D,E,N); 98(Q,A,C,D,E,G,H,K,R); 99(V,A,C,I); 100(Y,C,F,I); 103(V,A,C,F,I,L,T); 110(G,A,P,S); 113(A,C,E,F,G,H,I,K,M,R,V,Y); 116(M,A,C,D,E,F,G,I,L,N,P,Q,R,T,V,W); 117(V,E,L,P,R,S,T); 118(R,D,E,G,L,Q,T,V,W); 123(N,A,C,L); 125(N,C,F,G,H,I,L,M,R,S,T,W,Y); 128(N,C,E,L,Y); 133(G,A,D,H,P,Q,S,T); 134(E,D,P,S,T,V); 135(Y,C,F,L,M,Q); 136(T,C,D,F,G,K,L,M,N,P,Q,R,Y); 138(E,D,L,M,N); 139(A,C,G); 142(R,C,E,F,G,H,K,S,T,Y); 144(D,E,I,K,M,S,Y); 146(P,A,C,D,E,F,G,H,M,R,S,W,Y); 147(G,A,D,I,L); 149(G,A,C,D,E,F,H,K,L,P,R,V,W); 150(N,H,L,M,P,R,S); 151(T,D,E,G,H,I,L,M,Q,V); 154(S,L,R,Y); 156(K,A,D,S); 158(R,A,C,K,L,N,Q); 160(Y,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S); 169(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,S,V,W,Y); 170(S,A,C,E,K); 171(R,M,S,T); 172(R,A,C,E,G,H,M,Q,S,Y); 173(L,A,C,D,F,H,K,N,W,Y); 174(N,D,G,H,I,L,P,S,T,V); 175(N,A,D,E,L,M,R,S); 179(K,C,L,M,Q); 181(R,A,C,E,F,I,L,M,N,Q,S,T,V,Y); 183(H,A,C,D,E,F,L,M,N,P,Q,V,W,Y); 184(G,A,C,D,E,L,N); 186(A,D,E,G,N); 195(N,F,L,W,Y); 206(I,C,H,M,N,S,T); 210(H,A,C,D,E,M,N,Q,R,S); 211(P,A,C,D,F,K,L,M,N,Q,S,V); 215(N,D,F,K,L,M,Q); 216(E,A,C,G,H,L,N,Q,S,T,Y); 218(R,A,C,E,F,H,K,M); 219(N,A,C,D,M,R,T); 222(V,A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,R,S,T,Y); 225(T,A,K,R); 226(N,A,D,E,K,Y); 227(T,A,E,K); 229(G,C,F,V); 231(D,E,G,T); 233(F,A,C,H,L,M,W,Y); 235(I,L,M,V); 244(S,D,E,H,N,Q); 247(R,A,E,L,T); 249(W,F,L,M); 250(I,L,M,V); 251(N,A,C,G,H,K,L,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 252(H,D,E,K,N); 257(T,A,M,S); 258(G,D,I,K,M,N,P,R,S,V); 259(K,A,C,D,E,G,H,P,Q,R,T); 260(N,D,K,P,R); 261(M,A,C,E,G,I,Q,T); 262(F,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,R,S,Y); 273(G,C,D,E,H,K,L,M,P,Q,S,T,V,Y); 280(Q,D,H,K,M,N,V); 285(N,E,K,M,S,T); 286(H,A,C,E,F,L,M,N,T,V); 287(S,A,D,N,Y); 288(V,C,I,L,T); 298(Y,F,R,W); 299(N,G,H,M,R,S,T,Y); 302(K,C,E,M,Q,R,S,T); 303(S,A,C,D,E,G,L,M,Q,R); 304(G,C,K,R,S,V); 306(N,A,D,G); 311(N,D,E,F,G,H,K,L,M,Q,R,T,Y); 312(I,L,M,V); 314(N,A,D,E,G,H,I,K,L,M,Q,S,T,V,Y); 318(V,C,I,L,M,S,T); 319(Q,A,D,E,G,H,N,R,Y); 320(R,A,D,E,H,K,M,N,Q,S,T,Y); 323(S,A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,R,T,V,Y); 324(H,A,C,K,M,Y); 326(V,A,C,H,M,N,T); 337(E,A,C,D,N,Q,S,T,Y); 339(A,G,S,T); 341(E,A,D,F,G,H,K,Y); 345(E,A,G,H,K,L,M,N,Q,S,T,Y); 346(E,A,C,D,G,H,K,M,N,Q,R,S,T,V,Y); 351(L,A,C,M,Q); 355(L,I,K,M,V); 356(T,C,I,L,Q,V); 357(L,A,H,M); 358(T,A,C,G,I,; 359(R,I,V,W); 360(E,A,C,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V,Y); 361(Q,A,C,D,E,G,H,S,T,V,W); 363(Y,A,D,E,I,K,M,N,Q,V,W); 364(P,A,C,G); 365(S,A,G,N,V); 366(V,C,I,L); 368(Y,G,L,M,Q); 372(Y,H,I,K,M,Q,R,T,V); 374(I,C,N,Q,S); 375(P,A,D,E,G,H,I,K,M,Q,R,T,V,Y); 377(H,A,G,K,M,T); 378(G,E,H,L,M,N); 379(V,A,I,L,M,N,Q,R,S,Y); 380(P,D,E,G,H,K,Q,S); 381(A,G,N,Q,R,S,T); 387(D,E,G,N); 388(P,A,C,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 389(I,E,F,G,L,M,Q,S,V); 391(E,A,C,G,H,I,K,L,N,R,S,W); 392(A,C,G,S); 394(Q,C,D,E,G,H,L,R,V,Y); 395(K,A,D,E,G,M,Q,R,S,T,V); 396(Y,K,M,N); 400(K,A,F,G,H,I,L,M,Q,T,V,W); 402(N,C,I,K,L,S,V,Y); 405(L,A,C,M,N,T,V); 406(D,A,C,L,N,Q); 408(H,E,G,K,M,N,P,Q,R,S,T); 413(W,F,H,I,L,Y); 414(T,A,C,S,V); 415(R,C,W,Y); 416(E,A,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,T,V,W,Y); 418(N,A,D,I,K,L,M,Q,S,T,V); 419(T,D,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y); 420(A,D,F,G,H,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 421(H,A,C,D,E,I,K,L,M,N,R,V,W,Y); 422(P,A,C,E,F,G,L,M,T,V,Y); 423(N,C,D,E,F,H,I,L,R,S,T); 424(S,A,C,D,E,G,I,N,Q,T,V,W); 426(L,A,N,S); 430(M,G,I,L,V); 433(G,A,C,D,E,K,M,N,R); 434(A,C,D,E,F,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V); 435(G,A,C,E,K,M,N,P,Q,R,T); 436(G,A,C,D,Q,S); 437(S,A,C,D,K,N,T); 438(K,C,E,H,S); 439(W,H,L,M,Q); 441(F,H,N,Y); 444(R,A,K,Q); 445(N,A,C,E,G,K,Q,R,T); 446(K,A,C,F,H,M,Q,S,T,Y); 450(V,A,E,I,L,Q,R,S,T); 452(S,A,C,E,F,H,K,N,Q,T,W,Y); 454(I,A,C,F,L,M,S,V); 457(N,G,H,Q,R,T); 458(R,C,D,E,H,K,L,M,N,S,T,V,Y); 459(T,A,C,D,E,G,H,L,N,P,S); 460(G,E,H,K,N,Q,S); 461(T,A,C,D,E,F,G,K,L,N,P,Q,R,V,Y); 463(T,E,K,L,P,Q,R); 465(N,D,G,Q); 466(A,D,E,G,K,N,P,Q,R,S); 471(N,C,D,E,H,Q,R,Y); 476(G,D,E,H,N,R); 477(G,A,D,K,N,P,Q,R,T); 481(I,L,T,V); 483(V,C,G,H,M,R,S,T); 484(N,A,E,G,H,Q,R,S); e 485(K,H,M,P,Q,S,T).

[00099] As posições produtivas em Amy 707 que estão dentro das Pontuações de Produtividade anteriormente descritas de "1, 2, 3 e 4" (para as bibliotecas completas de SEL) e as substituições nessas posições que são combináveis são listadas, abaixo, na LISTA D. A numeração de posição tem por base a proteína Amy707 madura listada na SEQ ID NO: 3. Lista D 1(H,A,C,E,F,I,K,L,M,N,Q,R,T,W); 2(H,A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,W); 3(N,A,C,D,E,F,K,L,M,Q,S,T,V); 4(G,D,E,F,H,I,K,L,M,P,S,T,W); 5(T,A,C,D,G,H,I,M,N,Q,S,V,W); 6(N,A,E,G,Q,S,T); 7(G,A,D,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 10(M,I,L); 12(Y,A); 16(Y,A,D,E,H,N,T,W); 17(L,A,D,G,S,T,V); 18(P,A,E); 19(N,D,L); 20(D,A,C,E,G,H,I,N,S,Y); 22(N,E,G,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 23(H,F,M,Q,T); 25(N,A,C,G,K,M,S,T,V,Y); 26(R,K,Q,T); 27(L,A,I,V); 28(N,A,C,D,E,G,H,K,Q,R,W,Y); 29(S,A,C,D,E,F,H,K,M,N,R,T,V,W,Y); 30(D,E,M,N,Q,R); 31(A,S); 32(S,C,D,E,G,I,L,M,N,Q,R,W,Y); 33(N,C,D,H,I,K,M,Q,R,T,V,W,Y); 34(L,F,M); 35(K,A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q); 36(S,D,G,K,Q,T); 40(T,K,N); 41(A,C,D,I,K,M,Q,S); 47(A,G,M,P,S); 50(G,C,S); 52(S,K,L,M,R,T); 53(Q,A); 54(N,A,C,D,E,F,G,M,Q,S,V,W); 56(V,E,N,S); 61(Y,F); 63(L,M,N,Q); 64(Y,H); 66(L,M,V); 68(E,A,D,Q); 70(N,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,R,S,V); 72(K,R); 73(G,D,E,K,M,Q,R,S,T,W,Y); 74(T,G,S); 75(V,I,M); 77(T,A,I,N,S,V); 81(T,A,C,D,F,I,K,N,P,S); 82(R,A,C,F,I,K,M,Q,S,V,Y); 83(S,K,M,N,Q,R,T); 84(Q,C,D,E,F,K,L,M,N); 86(Q,E,H,I,K,R,T,V,W,Y); 87(A,D,K,M,T); 88(A,M); 89(V,A,C,I); 90(T,G,M,Q,R,S); 91(S,A,E,H,K,M,N,Q,R,T,V); 93(K,H,R); 94(N,A,C,D,F,G,H,K,L,M,Q,R); 95(N,A,C,D,F,G,H,I,Q,R,S,T,Y); 96(G,D,E,N); 97(I,V); 98(Q,A,C,D,E,G,H,K,R); 99(V,A,C,I); 100(Y,C,F,I); 101(G,A); 103(V,A,C,F,I,L,T); 110(G,A,P,S); 111(A,S); 112(D,C,E); 113(A,C,E,F,G,H,I,K,M,R,V,Y); 115(E,Q); 116(M,A,C,D,E,F,G,I,L,N,P,Q,R,T,V,W); 117(V,E,L,P,R,S,T); 118(R,D,E,G,L,Q,T,V,W); 119(A,C,S); 122(V,C); 123(N,A,C,L); 124(P,N,T); 125(N,C,F,G,H,I,L,M,R,S,T,W,Y); 126(N,D); 128(N,C,E,L,Y); 129(Q,V); 132(T,S); 133(G,A,D,H,P,Q,S,T); 134(E,D,P,S,T,V); 135(Y,C,F,L,M,Q); 136(T,C,D,F,G,K,L,M,N,P,Q,R,Y); 138(E,D,L,M,N); 139(A,C,G); 140(W,F,Y); 142(R,C,E,F,G,H,K,S,T,Y); 144(D,E,I,K,M,S,Y); 145(F,M,Y); 146(P,A,C,D,E,F,G,H,M,R,S,W,Y); 147(G,A,D,I,L); 149(G,A,C,D,E,F,H,K,L,P,R,V,W); 150(N,H,L,M,P,R,S); 151(T,D,E,G,H,I,L,M,Q,V); 153(S,N); 154(S,L,R,Y); 155(F,W); 156(K,A,D,S); 158(R,A,C,K,L,N,Q); 160(Y,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S); 162(F,M); 165(V,C,T); 167(W,F,M); 168(D,C); 169(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,S,V,W,Y); 170(S,A,C,E,K); 171(R,M,S,T); 172(R,A,C,E,G,H,M,Q,S,Y); 173(L,A,C,D,F,H,K,N,W,Y); 174(N,D,G,H,I,L,P,S,T,V); 175(N,A,D,E,L,M,R,S); 176(R,K,T); 178(Y,W); 179(K,C,L,M,Q); 181(R,A,C,E,F,I,L,M,N,Q,S,T,V,Y); 182(G,C,D); 183(H,A,C,D,E,F,L,M,N,P,Q,V,W,Y); 184(G,A,C,D,E,L,N); 186(A,D,E,G,N); 195(N,F,L,W,Y); 196(G,C); 203(Y,N); 206(I,C,H,M,N,S,T); 210(H,A,C,D,E,M,N,Q,R,S); 211(P,A,C,D,F,K,L,M,N,Q,S,V); 215(N,D,F,K,L,M,Q); 216(E,A,C,G,H,L,N,Q,S,T,Y); 217(L,M); 218(R,A,C,E,F,H,K,M); 219(N,A,C,D,M,R,T); 221(G,I,V); 222(V,A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,R,S,T,Y); 225(T,A,K,R); 226(N,A,D,E,K,Y); 227(T,A,E,K); 228(L,I,M); 229(G,C,F,V); 230(L,M); 231(D,E,G,T); 233(F,A,C,H,L,M,W,Y); 235(I,L,M,V); 238(V,I); 243(Y,F); 244(S,D,E,H,N,Q); 245(F,E,M); 247(R,A,E,L,T); 249(W,F,L,M); 250(I,L,M,V); 251(N,A,C,G,H,K,L,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 252(H,D,E,K,N); 253(V,M); 257(T,A,M,S); 258(G,D,I,K,M,N,P,R,S,V); 259(K,A,C,D,E,G,H,P,Q,R,T); 260(N,D,K,P,R); 261(M,A,C,E,G,I,Q,T); 262(F,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,R,S,Y); 263(A,S); 265(A,G,S); 273(G,C,D,E,H,K,L,M,P,Q,S,T,V,Y); 276(E,C,T); 280(Q,D,H,K,M,N,V); 283(N,D,G); 285(N,E,K,M,S,T); 286(H,A,C,E,F,L,M,N,T,V); 287(S,A,D,N,Y); 288(V,C,I,L,T); 292(P,L,M); 296(N,Q); 297(L,M); 298(Y,F,R,W); 299(N,G,H,M,R,S,T,Y); 301(S,A,G); 302(K,C,E,M,Q,R,S,T); 303(S,A,C,D,E,G,L,M,Q,R); 304(G,C,K,R,S,V); 306(N,A,D,G); 307(Y,A,F); 310(R,Q,S); 311(N,D,E,F,G,H,K,L,M,Q,R,T,Y); 312(I,L,M,V); 313(F,M,Y); 314(N,A,D,E,G,H,I,K,L,M,Q,S,T,V,Y); 317(V,L); 318(V,C,I,L,M,S,T); 319(Q,A,D,E,G,H,N,R,Y); 320(R,A,D,E,H,K,M,N,Q,S,T,Y); 321(H,W,Y); 322(P,D); 323(S,A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,R,T,V,Y); 324(H,A,C,K,M,Y); 326(V,A,C,H,M,N,T); 327(T,L); 328(F,V); 329(V,I); 334(S,T); 337(E,A,C,D,N,Q,S,T,Y); 339(A,G,S,T); 341(E,A,D,F,G,H,K,Y); 343(F,T,Y); 344(V,C,I); 345(E,A,G,H,K,L,M,N,Q,S,T,Y); 346(E,A,C,D,G,H,K,M,N,Q,R,S,T,V,Y); 347(W,A,D); 350(P,E); 351(L,A,C,M,Q); 352(A,S); 354(A,S); 355(L,I,K,M,V); 356(T,C,I,L,Q,V); 357(L,A,H,M); 358(T,A,C,G,I,; 359(R,I,V,W); 360(E,A,C,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V,Y); 361(Q,A,C,D,E,G,H,S,T,V,W); 363(Y,A,D,E,I,K,M,N,Q,V,W); 364(P,A,C,G); 365(S,A,G,N,V); 366(V,C,I,L); 367(F,Y); 368(Y,G,L,M,Q); 369(G,A,S); 372(Y,H,I,K,M,Q,R,T,V); 374(I,C,N,Q,S); 375(P,A,D,E,G,H,I,K,M,Q,R,T,V,Y); 377(H,A,G,K,M,T); 378(G,E,H,L,M,N); 379(V,A,I,L,M,N,Q,R,S,Y); 380(P,D,E,G,H,K,Q,S); 381(A,G,N,Q,R,S,T); 382(M,K); 386(I,L,V); 387(D,E,G,N); 388(P,A,C,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 389(I,E,F,G,L,M,Q,S,V); 390(L,M,V); 391(E,A,C,G,H,I,K,L,N,R,S,W); 392(A,C,G,S); 394(Q,C,D,E,G,H,L,R,V,Y); 395(K,A,D,E,G,M,Q,R,S,T,V); 396(Y,K,M,N); 397(A,G); 400(K,A,F,G,H,I,L,M,Q,T,V,W); 401(Q,H,M); 402(N,C,I,K,L,S,V,Y); 403(D,E,T); 405(L,A,C,M,N,T,V); 406(D,A,C,L,N,Q); 408(H,E,G,K,M,N,P,Q,R,S,T); 410(I,N); 411(I,V); 412(G,A,S); 413(W,F,H,I,L,Y); 414(T,A,C,S,V); 415(R,C,W,Y); 416(E,A,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,T,V,W,Y); 417(G,A); 418(N,A,D,I,K,L,M,Q,S,T,V); 419(T,D,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y); 420(A,D,F,G,H,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 421(H,A,C,D,E,I,K,L,M,N,R,V,W,Y); 422(P,A,C,E,F,G,L,M,T,V,Y); 423(N,C,D,E,F,H,I,L,R,S,T); 424(S,A,C,D,E,G,I,N,Q,T,V,W); 425(G,A); 426(L,A,N,S); 427(A,C,T); 428(T,N,S); 429(I,M); 430(M,G,I,L,V); 431(S,A,C); 433(G,A,C,D,E,K,M,N,R); 434(A,C,D,E,F,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V); 435(G,A,C,E,K,M,N,P,Q,R,T); 436(G,A,C,D,Q,S); 437(S,A,C,D,K,N,T); 438(K,C,E,H,S); 439(W,H,L,M,Q); 441(F,H,N,Y); 442(V,A,C); 444(R,A,K,Q); 445(N,A,C,E,G,K,Q,R,T); 446(K,A,C,F,H,M,Q,S,T,Y); 448(G,F,N); 450(V,A,E,I,L,Q,R,S,T); 451(W,F); 452(S,A,C,E,F,H,K,N,Q,T,W,Y); 454(I,A,C,F,L,M,S,V); 457(N,G,H,Q,R,T); 458(R,C,D,E,H,K,L,M,N,S,T,V,Y); 459(T,A,C,D,E,G,H,L,N,P,S); 460(G,E,H,K,N,Q,S); 461(T,A,C,D,E,F,G,K,L,N,P,Q,R,V,Y); 463(T,E,K,L,P,Q,R); 465(N,D,G,Q); 466(A,D,E,G,K,N,P,Q,R,S); 467(D,E); 469(W,Y); 471(N,C,D,E,H,Q,R,Y); 473(S,P); 474(V,S); 475(N,D,E); 476(G,D,E,H,N,R); 477(G,A,D,K,N,P,Q,R,T); 478(S,A,G); 479(V,T); 481(I,L,T,V); 482(W,Y); 483(V,C,G,H,M,R,S,T);484(N,A,E,G,H,Q,R,S); e 485(K,H,M,P,Q,S,T).

[000100] Embora as mutações supracitadas tenham sido identificadas com o uso de bibliotecas SEL à base de Amy707 (SEQ ID NO: 3), sabe- se que muitas α-amilases bacterianas (e outras) compartilham a mesma dobra, e com frequência compartilham identidade significativa de sequência de aminoácidos, e com frequência se beneficiam das mesmas mutações. No caso presente, posições de aminoácidos correspondentes em outras α-amilases podem ser prontamente identificadas pelo alinhamento de sequência de aminoácidos com Amy707 (SEQ ID NO: 7) com o uso de Clustal W com parâmetros padrão. α-amilases em que as mutações supracitadas são propensas a produzir um benefício de desempenho incluem aqueles tendo uma dobra similar e/ou tendo 60% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer uma das amilases de Bacillus conhecidas (por exemplo, de B. lichenifomis, B. stearothermophilus, e B. amyloliquifaciens), banco de dados de Enzimas Ativas por Carboidrato (CAZy) da família 13, ou qualquer amilase que tenha sido referida até o momento pelo termo descritivo, "tipo Termamyl." O leitor apreciará que onde uma α-amilase naturalmente tem uma mutação listada acima (isto é, onde a α-amilase tipo selvagem já compreende um resíduo identificado como uma mutação), então essa mutação específica não se aplica a essa α-amilase. Entretanto, outras mutações descritas podem funcionar em combinação com o resíduo que ocorre naturalmente nessa posição. Por causa de sua rente identidade de sequência (mais de 95%; Figura 1), e o fato de que ambos são amilases G6, mutações (incluindo substituições, inserções e deleções, que produzem um efeito benéfico em Amy707 são propensos a produzir um efeito similar na amilase AA560 e vice versa.

[000101] Em algumas modalidades, as presentes variantes de α- amilase têm ao menos uma mutação combinável em uma posição produtiva que corresponde às mutações combináveis nas posições produtivas descritas acima nas Listas A, B, C e/ou D, e/ou uma mutação combinável conforme descrita na Tabela C ou D (que usam SEQ ID NO: 3 para numeração) e um grau definido de homologia/identidade de sequência de aminoácidos para a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, por exemplo, ao menos 60%, ao menos 65%, ao menos 70%, ao menos 75%, ao menos 76%, ao menos 77%, ao menos 78%, ao menos 79%, ao menos 80%, ao menos 81%, ao menos 82%, ao menos 83%, ao menos 84%, ao menos 85%, ao menos 86%, ao menos 87%, ao menos 88%, ao menos 89%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98% ou até mesmo ao menos 99% de homologia/identidade de sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, a pontuação de adequação de a ao menos uma mutação é +++, ++++ ou +++++. Em algumas modalidades, a pontuação de adequação de a ao menos uma mutação é ++++ ou +++++. Em algumas modalidades, a pontuação de adequação de a ao menos uma mutação é +++++. Em algumas modalidades, as variantes têm uma pluralidade (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ou mais) mutações combináveis.

[000102] Em algumas modalidades, as presentes variantes de α- amilase têm ao menos uma mutação combinável em uma posição produtiva que corresponde às mutações combináveis nas posições produtivas descritas acima nas Listas A, B, C e/ou D, e/ou uma mutação combinável conforme descrito na Tabela C ou D (que usa a SEQ ID NO: 3 para numeração) e são derivados de uma amilase parental tendo um grau definido de homologia/identidade de sequência de aminoácidos para SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, por exemplo, ao menos 60%, ao menos 65%, ao menos 70%, ao menos 75%, ao menos 76%, ao menos 77%, ao menos 78%, ao menos 79%, ao menos 80%, ao menos 81%, ao menos 82%, ao menos 83%, ao menos 84%, ao menos 85%, ao menos 86%, ao menos 87%, ao menos 88%, ao menos 89%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98% ou até mesmo ao menos 99% de homologia/identidade de sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, a pontuação de adequação de a ao menos uma mutação é +++, ++++ ou +++++. Em algumasmodalidades, a pontuação de adequação de a ao menos uma mutação é ++++ ou +++++. Em algumas modalidades, a pontuação de adequação de a ao menos uma mutação é +++++. Em algumas modalidades, as variantes têm 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais mutações combináveis.

2.2 Mutações adicionais

[000103] Em algumas modalidades, em adição a uma ou mais dentre as mutações descritas acima (por exemplo, na Seção 2.1), as presentes amilases incluem, ainda, uma ou mais mutações que fornecem um benefício extra de desempenho ou estabilidade. Benefícios de desempenho exemplificadores incluem, mas não se limitam a, aumento de hidrólise de um substrato de amido, aumento de desempenho de liquefação de grãos, cereais ou outro substrato de amido, aumento de desempenho da limpeza, aumento de estabilidade térmica, aumento de estabilidade em armazenamento, aumento de solubilidade, perfil de pH alterado, diminuição da dependência de cálcio, aumento de atividade específica, modificação da especificidade de substrato, modificação da ligação de substrato, modificação da atividade dependente de pH, modificação da estabilidade dependente de pH, aumento da estabilidade oxidante e aumento da expressão. Em alguns casos, o benefício de desempenho é realizado em uma temperatura relativamente baixa. Em alguns casos, o benefício de desempenho é realizado em temperatura relativamente alta.

[000104] Em algumas modalidades, as presentes variantes de α- amilase adicionalmente têm ao menos uma mutação no laço de ligação de cálcio com base no trabalho de Suzuki et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:18933-938. Mutações exemplificadoras incluem uma deleção ou substituição em um ou mais resíduos que correspondem a Arg-181, Gly- 182, His-183 ou Gly-184 na SEQ ID NO: 3. Em modalidades específicas, a mutação corresponde à deleção de Arg-181 e Gly-182 ou His-183 e Gly-184 (com o uso da numeração da SEQ ID NO: 3). Resíduos homólogos em outras amilases podem ser determinados por alinhamento estrutural ou por alinhamento de estrutura primária.

[000105] Em algumas modalidades, as presentes variantes de α- amilase adicionalmente têm ao menos uma mutação conhecida por produzir um benefício de desempenho, estabilidade ou solubilidade em outras α-amilases microbianas, incluindo mas não se limitando aos tendo uma dobra similar e/ou tendo 60% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos para Amy707 (SEQ ID NO: 3) ou AA560 (SEQ ID NO: 4), qualquer uma das conhecidas amilases de Bacillus (por exemplo, de B. lichenifomis, B. stearothermophilus e B.amyloliquifaciens), as amilases da Família 13 do banco de dados de Enzimas Ativas por Carboidrato (CAZy) ou qualquer amilase que tenha até o momento sido chamada pelo termo descritivo, "tipo Termamyl". A identidade de sequência de aminoácidos pode ser determinada com o uso de Clustal W com parâmetros padrão.

[000106] Ademais, as presentes amilases podem incluir qualquer número de substituições conservadoras de aminoácido. Substituições conservadoras de aminoácido exemplificadoras são listadas na Tabela E.Tabela E. Substituições conservadoras de aminoácido

[000107] O leitor apreciará que algumas das mutações conservadoras acima mencionadas podem ser produzidas por manipulação genética, enquanto outras são produzidas pela introdução de aminoácidos sintéticos em um polipeptídeo por genética ou outros meios.

[000108] A presente amilase pode ser "precursora", "imatura" ou "comprimento total", e nesse caso elas incluem uma sequência de sinais, ou "maduras", quando não têm uma sequência de sinais. Formas maduras dos polipeptídeos são geralmente as mais úteis. Exceto onde especificado em contrário, a numeração de resíduo de aminoácido usada na presente invenção refere-se às formas maduras dos respectivos polipeptídeos de amilase. Os presentes polipeptídeos de amilase também podem ser truncados para remover as N ou C- terminações, contanto que os polipeptídeos resultantes retenham atividade de amilase.

[000109] A presente amilase pode ser um polipeptídeo "quimérico"ou "híbrido", que inclui ao menos uma porção de um primeiro polipeptídeo de amilase, e ao menos uma porção de um segundo polipeptídeo de amilase (tais amilases quiméricas foram recentemente "redescobertas" como amilases de troca de domínio). As amilases presentes podem incluir, também, sequência de sinais heteróloga, um epítopo para permitir o rastreamento ou purificação, ou similares. Sequências de sinais heterólogas exemplificadoras são da amilase (LAT) de B. licheniformis, (AmyE ou AprE) de B. subtilis e CelA de Streptomyces.

2.3 . Nucleotídeos que codificam polipeptídeos de amilase variante

[000110] Em um outro aspecto, ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo de amilase variante são fornecidos. O ácido nucleico pode codificar um polipeptídeo de amilase específico ou uma amilase tendo um grau especificado de identidade de sequência de aminoácidos para a amilase específica.

[000111] Em um exemplo, o ácido nucleico codifica uma amilase tendo ao menos 60%, ao menos 65%, ao menos 70%, ao menos 75%, ao menos 76%, ao menos 77%, ao menos 78%, ao menos 79%, ao menos 80%, ao menos 81%, ao menos 82%, ao menos 83%, ao menos 84%, ao menos 85%, ao menos 86%, ao menos 87%, ao menos 88%, ao menos 89%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98% ou até mesmo ao menos 99% de homologia/identidade com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 (excluindo a porção do ácido nucleico que codifica a sequência de sinais). Será entendido que devido à degenerescência do código genético, uma pluralidade de ácidos nucleicos pode codificar o mesmo polipeptídeo.

[000112] Em outro exemplo, o ácido nucleico hibridiza sob condições estringentes ou muito estringentes para um ácido nucleico que codifica (ou é complementar a um ácido nucleico que codifica) uma amilase tendo ao menos 60%, ao menos 65%, ao menos 70%, ao menos 75%, ao menos 76%, ao menos 77%, ao menos 78%, ao menos 79%, ao menos 80%, ao menos 81%, ao menos 82%, ao menos 83%, ao menos 84%, ao menos 85%, ao menos 86%, ao menos 87%, ao menos 88%, ao menos 89%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98% ou até mesmo ao menos 99% de homologia/identidade com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 (excluindo a porção do ácido nucleico que codifica a sequência de sinais). Tais condições de hibridização são descritos na presente invenção mas também são bem conhecidas na técnica.

[000113] Em um exemplo específico, o ácido nucleico hibridiza sob condições estringentes ou muito estringentes para o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5, que são mostradas abaixo.SEQ ID NO: 1: ácido nucleico otimizado por códon que codifica SEQ ID NO: 3.ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTA TTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACATC ATAATGGCACAAACGGCACGATGATGCAGTATTTTGAATGGTATCT GCCGAACGATGGAAACCATTGGAACCGCCTGAATAGCGATGCGA GCAACCTGAAAAGCAAAGGCATCACAGCAGTTTGGATTCCGCCGG CATGGAAAGGAGCAAGCCAAAACGACGTCGGCTATGGAGCGTAT GATCTGTATGACCTGGGCGAATTTAACCAAAAAGGCACGGTCCGC ACGAAATATGGCACGCGCAGCCAACTTCAAGCAGCAGTCACGAG CCTTAAAAACAACGGCATCCAGGTCTATGGAGATGTCGTCATGAA CCATAAAGGCGGAGCAGATGCGACAGAAATGGTCAGAGCGGTCG AAGTCAACCCGAACAACCGCAATCAAGAAGTCACGGGCGAATATA CAATCGAAGCGTGGACGCGCTTTGATTTTCCGGGCAGAGGCAATA CACATAGCAGCTTTAAATGGCGCTGGTATCATTTTGATGGCGTCG ATTGGGATCAAAGCCGCAGACTGAACAACCGCATCTATAAATTTC GCGGCCATGGCAAAGCATGGGATTGGGAAGTCGATACGGAAAAC GGCAACTATGACTATCTGATGTATGCGGACATCGATATGGATCAT CCGGAAGTCGTCAACGAACTGAGAAATTGGGGCGTCTGGTATACA AATACGCTGGGCCTGGATGGCTTTAGAATCGACGCGGTCAAACAT ATCAAATATAGCTTTACGCGCGACTGGATCAATCATGTCAGAAGC GCGACGGGCAAAAATATGTTTGCGGTCGCGGAATTTTGGAAAAAT GATCTGGGCGCGATCGAAAACTATCTGCAAAAAACGAACTGGAAC CATAGCGTCTTTGATGTCCCGCTGCATTATAACCTGTATAACGCGA GCAAAAGCGGCGGCAATTATGATATGCGCAACATCTTTAACGGCA CGGTCGTTCAAAGACATCCGAGCCATGCGGTCACGTTTGTCGATA ACCATGATAGCCAACCGGAAGAAGCGCTGGAAAGCTTTGTCGAAG AATGGTTTAAACCGCTGGCGTATGCACTGACACTGACGAGAGAAC AAGGATATCCGAGCGTCTTTTATGGCGACTATTATGGCATCCCGA CACATGGAGTTCCGGCGATGAGAAGCAAAATCGACCCGATCCTG GAAGCGAGACAGAAATATGCGTATGGCAAACAGAACGACTATCTG GACCATCATAACATCATCGGCTGGACGAGAGAAGGAAATACGGC GCATCCGAATTCAGGACTGGCGACGATTATGTCAGATGGAGCGG GCGGAAGCAAATGGATGTTTGTCGGCAGAAACAAAGCAGGACAA GTCTGGAGCGATATCACGGGCAATAGAACGGGAACGGTCACGAT CAATGCAGATGGCTGGGGCAACTTTAGCGTTAATGGCGGAAGCG TCAGCATCTGGGTCAACAAASEQ ID NO: 5: Acesso ao Genebank n° M18862GGATCCCGTCTACGGAGAAGCGAGTATTGAATTTTTTGCTGTAAC AGAAAGCGAGCGTGGGAAAGGATTTGGCTTTCAATTACTAACGGT TGCTTTAAATTGGCTATTTACGATTGATACGATTCATTCAATTACAC TCTGTGTCGATTCTAGTAATGAACATGCGATTCATTTATATAAAAAA GTTGGATTCAGGCATGTTCATGATTTGAGTTATTTTACTAAAGAAG TATCTCATTAAAAACATGATTGAGGAAAGACGGTTTTCGACTAATT GTGGTCAAAGTAGAAAATTGAATGAATATTACGAAGCATGAGGCTA AGACATAACTAAAGTGTCTAAATGAAAAACCGAACGAAAAATGAAC GAAGCGAAGTGTATTTCAAGAAAGGTTACCGTTCGCTATTTATCAC CGTTCGGTTATTTTTTAGATAAGCCACTTTTGTCGCGGCCTCTTTT TGGTGCCGATAAATGAGAATAAAGAATAAAAAGTCAATATTGCTTA GCTAAATGAATGTCAAGGTGGTTATATTATCCTATTTATTTTCAGAA AATAAAAAAACGTTTGCGCAATTGTTTTATAGCATAATAATATAACC TTGCCAATTGATATTTAAGTCGAGTGAAATCAATTGCGCAAATTAA TGAGTGTGTTCAAGGAGAGTGATGAATGTAGCAGTTTAGTCATGT ACTTGTTTTTGGAAAGCGCTTACAATTAGGAGGGTGGATGAAAAT GAGAACAGGAAAAAAGGGTTTTTTAAGTATTTTATTAGCGTTCTTAT TGGTGATTACTTCAATACCGTTTACTTTAGTAGATGTAGAAGCACA TCATAACGGTACGAACGGGACAATGATGCAATACTTTGAATGGTAT CTACCTAATGACGGAAATCATTGGAATCGATTAAACTCTGATGCGA GTAACCTTAAAAGCAAAGGGATTACAGCGGTGTGGATTCCTCCAG CATGGAAGGGCGCTTCTCAAAATGACGTAGGATACGGAGCCTATG ACCTGTATGATCTGGGAGAATTTAATCAAAAAGGTACCGTCCGTAC AAAATATGGAACACGTAGTCAGTTACAAGCTGCGGTAACCTCCTTA AAAAATAATGGAATTCAAGTATATGGTGACGTTGTTATGAATCACA AAGGTGGCGCAGACGCTACTGAAATGGTAAGGGCCGTTGAAGTG AATCCCAATAACCGTAACCAAGAAGTGACTGGTGAATATACCATTG AAGCTTGGACTAGATTTGATTTTCCAGGGCGAGGAAATACTCATTC TAGCTTTAAATGGAGATGGTATCATTTTGATGGTGTGGATTGGGAT CAGTCACGTAGACTGAACAATCGCATCTATAAATTTAGAGGTCATG GCAAAGCTTGGGATTGGGAAGTTGATACGGAAAATGGTAATTATG ATTATTTAATGTACGCTGATATTGATATGGATCACCCAGAAGTAGT AAATGAATTAAGAAATTGGGGTGTTTGGTACACAAACACATTAGGA CTCGATGGATTTAGAATAGATGCGGTTAAACATATAAAGTATAGCT TTACGCGCGATTGGATTAATCACGTTAGAAGTGCAACAGGTAAAA ATATGTTTGCGGTTGCTGAGTTTTGGAAGAATGATTTAGGTGCAAT TGAAAACTATCTGCAGAAAACAAACTGGAACCATTCAGTCTTTGAT GTGCCGTTACATTATAATCTTTATAATGCATCAAAAAGCGGAGGGA ACTATGATATGCGAAACATATTTAATGGAACGGTTGTTCAACGACA TCCAAGTCATGCTGTAACATTTGTTGATAATCATGATTCGCAGCCT GAAGAAGCATTAGAATCTTTTGTTGAAGAATGGTTTAAACCATTAG CGTATGCGCTTACATTAACGCGTGAACAAGGATACCCTTCTGTATT TTACGGAGATTATTATGGGATTCCAACACATGGAGTGCCAGCAAT GAGATCAAAAATCGATCCGATTTTAGAAGCACGTCAAAAGTATGCA TACGGAAAACAAAATGATTACTTAGACCATCATAATATCATTGGTT GGACGCGTGAAGGGAATACAGCACACCCCAATTCAGGTCTAGCTA CCATCATGTCTGATGGAGCGGGTGGAAGTAAGTGGATGTTTGTTG GGCGTAATAAGGCTGGTCAAGTATGGAGTGATATTACAGGAAACC GTACAGGTACGGTTACAATCAATGCAGACGGTTGGGGCAATTTCT CTGTGAATGGAGGGTCAGTTTCTATTTGGGTCAACAAATAAAAGTG GAAAAGAAGAGGCCGTAGGTTAATATGGTCTTTTCTTTTCTTTTAA GGAGGTTCAATGAATTTGTCGGTTATCCAATTATTACATGCTGAGC TGTTAGATTATTCGT

[000114] Os ácidos nucleicos podem codificar uma amilase de "comprimento total" ("fl" ou "FL"), que inclui uma sequência de sinais, apenas a forma madura de uma amilase, que não tenha a sequência de sinais, ou uma forma truncada de uma amilase, que não tenha o N ou C-terminal da forma madura.

[000115] Um ácido nucleico que codifica uma α-amilase pode ser ligado de maneira funcional a vários promotores e entidades reguladoras em um vetor adequado para expressar a α-amilase em células hospedeiras. Promotores exemplificadores são da amilase de B. licheniformis (LAT), B. subtilis (AmyE ou AprE) e Streptomyces CelA. Tal ácido nucleico também pode ser ligado a outras sequências de codificação, por exemplo, para codificar um polipeptídeo quimérico.

3. Produção de amilases variantes

[000116] As presentes amilases variantes podem ser produzidas nas células hospedeiras, por exemplo, pela secreção ou expressão intracelular. Um material celular cultivado (por exemplo, um caldo de célula integral) compreendendo uma amilase variante pode ser obtido após a secreção da amilase variante no meio celular. Opcionalmente, a amilase variante pode ser isolada das células hospedeiras, ou até mesmo isoladas do caldo de células, dependendo da pureza desejada da amilase variante final. Um gene que codifica uma amilase variante pode ser clonado e expressado de acordo com métodos conhecidos na técnica. Células hospedeiras adequadas incluem células bacterianas, fúngicas (incluindo leveduras e fungos filamentosos) e células vegetais (incluindo algas). Células hospedeiras especificamente úteis incluem Aspergillus niger, Aspergillus oryzae ou Trichoderma reesei. Outras células hospedeiras incluem células bacterianas, por exemplo, Bacillus subtilis ou B. licheniformis, assim como Streptomyces.

[000117] A célula hospedeira pode adicionalmente expressar um ácido nucleico que codifica uma glicoamilase homóloga ou heteróloga, isto é, uma glicoamilase que não seja da mesma espécie da célula hospedeira, ou uma ou mais de outras enzimas. A glicoamilase pode ser uma glicoamilase variante, como uma das variantes de glicoamilase reveladas na patente US n° 8.058.033 (Danisco US Inc.), por exemplo. Adicionalmente, o hospedeiro pode expressar uma ou mais enzimas, proteínas, peptídeos acessórios. Esses podem se beneficiar dos processos de liquefação, sacarificação, fermentação, SSF, etc. Ademais, a célula hospedeira pode produzir bioquímicos em adição às enzimas usadas para digerir as várias matérias-primas. Tais células hospedeiras podem ser úteis para processos de fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas para reduzir ou eliminar a necessidade de adicionar enzimas.

3.1 Vetores

[000118] Um construto de DNA compreendendo um ácido nucleico que codifica amilases variantes pode ser construído para ser expressado em uma célula hospedeira. Ácidos nucleicos representativos que codificam amilases variantes incluem a SEQ ID NO: 4. Por causa da degenerescência conhecida no código genético, polinucleotídeos variantes que codificam uma sequência de aminoácidos idêntica podem ser projetados e feitos com habilidades rotineiras. É também bem conhecido na técnica otimizar o uso de códon de uma célula hospedeira específica. Ácidos nucleicos que codificam amilases variantes podem ser incorporados a um vetor. Os vetores podem ser transferidos para uma célula hospedeira com o uso de técnicas de transformação bem conhecidas, como apresentadas abaixo.

[000119] O vetor pode ser qualquer vetor que possa ser transformado e replicado em uma célula hospedeira. Por exemplo, um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma amilase variante pode ser transformado e replicado em uma célula hospedeira bacteriana como meio de propagar e amplificar o vetor. O vetor também pode ser transformado em um hospedeiro de expressão, para que os ácidos nucleicos codificadores possam ser expressados como uma amilase funcional. As células hospedeiras que servem como hospedeiros de expressão podem incluir fungos filamentosos, por exemplo. O catálogo de cepas "Fungal Genetics Stock Center" (FGSC) lista vetores adequados para expressão em células hospedeiras fúngicas. Consulte FGSC, Catalogue of Strains, University of Missouri, emwww.fgsc.net (modificado pela última vez em 17 de janeiro de 2007). Um vetor representativo é pJG153, um vetor de expressão Cre sem promotor que pode ser replicado em um hospedeiro bacteriano. Consulte Harrison et al. (junho de 2011) Applied Environ. Microbiol. 77: 3916-22. pJG153pode ser modificado com habilidade rotineira para compreender e expressar um ácido nucleico que codifica uma variante de amilase.

[000120] Um ácido nucleico que codifica uma amilase variante pode ser ligado de maneira funcional a um promotor adequado, o que permite a transcrição em uma célula hospedeira. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA que apresenta atividade transcricional na célula hospedeira de escolha, e pode ser derivado de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogas para a célula hospedeira. Promotores exemplificadores para direcionar a transcrição da sequência de DNA que codifica uma amilase variante, especificamente em um hospedeiro bacteriano, são os promotores do operon lac de E. coli, os promotores do gene para agarase de Streptomyces coelicolor dagA ou celA, os promotores do gene de α-amilase Bacillus licheniformis (amyL), os promotores do gene de amilase maltogênico Bacillus stearothermophilus (amyM), os promotores da α-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilisetc. Para transcrição em um hospedeiro fúngico, exemplos de promotores úteis são os derivados do gene que codifica TAKA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, α-amilase neutra de Aspergillus niger, α-amilase em relação a ácidos de A. niger, glicoamilase de A. niger, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A. oryzae ou acetamidase de A. nidulans. Quando um gene que codifica uma alfa-amilase é expresso em uma espécie bacteriana como E. coli, um promotor adequado pode ser selecionado, por exemplo, a partir de um promotor de bacteriófago incluindo um promotor T7 e um promotor do fago lambda. Exemplos de promotores adequados para expressão em uma espécie de levedura incluem mas não se limitam aos promotores Gal 1 e Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae e os promotores AOX1 ou AOX2 de Pichia pastoris. cbh1é um promotor induzível endógeno de T. reesei. Consulte Liu et al. (2008) "Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cellobiohydrolase I gene (cbh1) promoter optimization", Acta Biochim. Biophys. Sin (Shanghai) 40(2): 158-65.

[000121] A sequência de codificação pode estar ligada de maneira funcional à sequência de sinais. O DNA que codifica a sequência de sinais pode ser a sequência de DNA naturalmente associada ao gene da amilase a ser expressado ou de um gênero ou espécie diferente. Uma sequência de sinais e uma sequência de promotor que compreende um construto de DNA ou vetor podem ser introduzidas em uma célula hospedeira fúngica e podem ser derivadas da mesma fonte. Por exemplo, a sequência de sinais é a sequência de sinais cbh1 que é ligada de maneira funcional a um promotor cbh1.

[000122] Um vetor de expressão pode, também, compreender um terminador de transcrição adequado e, em eucariotos, sequências de poliadenilação conectadas de maneira funcional à sequência de DNA que codifica uma amilase variante. As sequências de terminação e poliadenilação podem ser convenientemente derivadas das mesma fontes assim como o promotor.

[000123] O vetor pode compreender adicionalmente uma sequência de DNA que permite ao vetor replicar-se na célula hospedeira. Exemplos de tais sequências são as origens de replicação de plasmídeos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 e pIJ702.

[000124] O vetor pode, também, compreender um marcador selecionável, por exemplo, um gene cujo produto complementa um defeito na célula hospedeira isolada, como os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis ou um gene que confere resistência a antibióticos, por exemplo, como resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Além disso, o vetor pode compreender marcadores de seleção de Aspergillus como amdS, argB, niaD e xxsC, um marcador que dá origem à resistência a higromicina ou a seleção pode ser efetuada por co-transformação, conforme é conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, o pedido PCT de patente internacional WO 91/17243.

[000125] A expressão intracelular pode ser vantajosa em alguns aspectos, por exemplo, quando se usar certas bactérias ou fungos como células hospedeiras para produzir grandes quantidades de amilase para subsequente enriquecimento ou purificação. A secreção extracelular de amilase no meio de cultura também pode ser usada para fazer um material celular cultivado compreendendo a amilase isolada.

[000126] O vetor de expressão inclui, tipicamente, os componentes de um vetor de clonagem como, por exemplo, um elemento que permite a replicação autônoma do vetor no organismo hospedeiro selecionado e um ou mais marcadores detectáveis por fenótipo para propósitos de seleção. O vetor de expressão compreende normalmente, sequências de nucleotídeos de controle como um um promotor, operador, sítio de ligação a ribossoma, sinal de iniciação de translação e, opcionalmente, um gene repressor ou um ou mais genes ativadores. Adicionalmente, o vetor de expressão pode compreender uma codificação de sequência de uma sequência de aminoácidos capaz de direcionar a amilase para uma organela de célula hospedeira como uma peroxissoma ou a um compartimento específico de célula hospedeira. Essa sequência de direcionamento inclui mas não se limita à sequência, SKL. Para expressão sob a direção de sequências de controle, a sequência de ácido nucleico da amilase é ligada de maneira funcional às sequências de controle de maneira adequada com relação à expressão.

[000127] Os procedimentos usados para ligar o construto de DNA que codifica uma amilase, o promoter, terminador e outros elementos, respectivamente, e para inserí-los em vetores adequados contendo as informações necessárias para replicação, são bem familiares para pessoas versadas na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2aedição, Cold Spring Harbor, 1989, e 3aedição, 2001).

3.2 Transformação e cultura de células hospedeiras

[000128] Uma célula isolada, que compreende um construto de DNA ou um vetor de expressão, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de uma alfa-amilase. A célula pode ser transformada com o construto de DNA que codifica a enzima, convenientemente pela integração do construto de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossomo hospedeiro. Esta integração é considerada, em geral, como uma vantagem, visto que é mais provável que a sequência de DNA seja mantida de maneira estável dentro da célula. A integração dos construtos de DNA no cromossomo hospedeiro pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por recombinação homóloga ou heteróloga. Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão conforme descrito acima em conjunto com os diferentes tipos de células hospedeiras.

[000129] Exemplos de organismos hospedeiros bacterianos adequados são espécies bacterianas gram-positivas como Bacillaceae incluindo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus (anteriormente Bacillus) stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, e Bacillus thuringiensis; Espécies Streptomyces como Streptomyces murinus; espécies bacterianas de ácido láctico incluindo Lactococcus sp. como Lactococcus lactis; Lactobacillus sp. incluindo Lactobacillus reuteri; Leuconostoc sp.; Pediococcus sp.; e Streptococcus sp. Alternativamente, cepas de uma espécie bacteriana Gramnegativa pertencente a Enterobacteriaceae incluindo E. coli, ou a Pseudomonadaceae podem ser selecionadas como o organismo hospedeiro.

[000130] Um organismo hospedeiro de levedura adequado pode ser selecionado dentre as espécies de levedura biotecnologicamente relevantes por exemplo, mas não se limitando a, espécies de levedura como Pichia sp., Hansenula sp., ou Kluyveromyces, Yarrowinia, espécie Schizosaccharomyces ou uma espécie de Saccharomyces, incluindo Saccharomyces cerevisiae ou uma espécie pertencente a Schizosaccharomyces como, por exemplo, espécie S. pombe. Uma cepa das espécies de leveduras metilotróficas, Pichia pastoris, pode ser usada como organismo hospedeiro. Alternativamente, o organismo hospedeiro pode ser uma espécie de Hansenula. Organismos hospedeiros adequados entre fungos filamentosos incluem espécies de Aspergillus, por exemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori ou Aspergillus nidulans. Alternativamente, cepas de uma espécie Fusarium, por exemplo, Fusarium oxysporum ou de uma espécie Rhizomucor como Rhizomucor miehei podem ser usadas como organismo hospedeiro. Outras cepas adequadas incluem espécies Thermomyces e Mucor. Além disso, Trichoderma sp. pode ser usado como um hospedeiro. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Aspergillus inclui, por exemplo, o descrito em EP 238023. Uma amilase expressada por uma célula hospedeira fúngica pode ser glicosilada, isto é, compreender uma porção de glicosil. O padrão de glicosilação pode ser o mesmo ou diferente como presente na amilase tipo selvagem. O tipo e/ou grau de glicosilação pode conferir alterações às propriedades enzimáticas e/ou bioquímicas.

[000131] É vantajoso excluir genes dos hospedeiros de expressão, onde a deficiência no gene pode ser curada pelo vetor de expressão transformado. Métodos conhecidos podem ser usados para obter uma célula hospedeira fúngica tendo um ou mais genes inativados. A inativação do gene pode ser realizada por deleção completa ou parcial, pela inativação insercional ou por quaisquer outros meios que apresentem um gene não funcional para o propósito ao qual se destina, de modo que a expressão de uma proteína funcional pelo gene seja evitada. Qualquer gene de um Trichoderma sp. ou outro hospedeiro fúngico filamentoso que tenha sido clonado pode ser deletado, por exemplo, genes cbh1, cbh2, egl1 e egl2. A deleção de gene pode ser realizada pela inserção de uma forma do gene desejado a ser inativado dentro deum plasmídeo pelos métodos conhecidos na técnica.

[000132] A introdução de um construto de DNA em uma célula hospedeira inclui técnicas como a transformação; eletroporação; microinjeção nuclear; transdução; transfecção, por exemplo, lipofecção mediada e transfecção mediada por DEAE-Dextrina; incubação com precipitado de DNA com fosfato de cálcio; bombardeamento de alta velocidade com microprojéteis revestidos com DNA; e fusão de protoplasto. Técnicas gerais de transformação são conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Sambrook et al. (2001), supra. Aexpressão de proteína heteróloga em Trichodermaé descrita, por exemplo, na patente US n° 6.022.725. Referência também é feita a Cao et al. (2000) Science 9:991-1001 para transformação de cepas de Aspergillus. Transformantes estáveis geneticamente podem ser construídos com sistemas de vetor pelos quais o ácido nucleico que codifica uma amilase é integrado cell de maneira estável ao cromossomo da célula hospedeira. Os transformantes são então selecionados e purificados por técnicas conhecidas.

[000133] A preparação de Trichoderma sp. para transformação, por exemplo, pode envolver a preparação de protoplastos de micélio fúngico. Consulte Campbell et al. (1989) Curr. Genet. 16: 53-56. O micélio pode ser obtido a partir de esporos vegetativos germinados. O micélio é tratado com uma enzima que digere a parede celular, resultando em protoplastos. Os protoplastos são protegidos pela presença de um estabilizador osmótico no meio de cultura de suspensão. Os estabilizadores incluem sorbitol, manitol, cloreto de potássio, sulfato de magnésio e similares. Normalmente, a concentração desses estabilizantes varia entre 0,8 M e 1,2 M, por exemplo, 1,2 M solução de sorbitol pode ser usada no meio de suspensão.

[000134] A absorção de DNA na cepa hospedeira de Trichoderma sp. é dependente da concentração do íon de cálcio. De modo geral, entre cerca de 10 a 50 mm CaCl2 é usado em uma solução de absorção. Compostos adequados adicionais incluem um sistema de tamponagem, como tampão TE (10 mm Tris, pH 7,4; 1 mm EDTA) ou 10 mm MOPS, pH 6,0 e polietilenoglicol. Acredita-se que o polietilenoglicol funda as membranas celulares, permitindo assim que o conteúdo do meio seja entregue ao citoplasma da cepa de Trichoderma sp. Essa fusão em geral, deixa cópias múltiplas do DNA do plasmídeo integradas dentro do cromossomo do hospedeiro.

[000135] Normalmente, a transformação de Trichoderma sp. utiliza protoplastos ou células que tenham sido submetidas a um tratamento de permeabilidade, tipicamente a uma densidade de 105 a 107/mL, particularmente 2x106/mL. Um volume de 100 μL desses protoplastos ou células em uma solução adequada (por exemplo, 1,2 M de sorbitol e 50 mm CaCl2) pode ser misturado com o DNA desejado. Em geral, uma alta concentração de PEG é adicionada à solução de absorção. Um volume de 0,1 a 1 de 25% de PEG 4000 pode ser adicionado à suspensão de protoplasto; Entretanto, é útil adicionar cerca de 0,25 volumes à suspensão de protoplasto. Aditivos, como sulfóxido de dimetila, heparina, espermidina, cloreto de potássio e similares, podem também ser adicionados à solução de absorção para facilitar na transformação. Procedimentos similares estão disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas. Consulte, por exemplo, a patente US n° 6.022.725.

3.3 Expressão

[000136] Um método de produção de uma amilase pode compreender cultivar uma célula hospedeira conforme descrita acima sob condições propícias à produção da enzima e recuperar a enzima das células e/ou do meio de cultura.

[000137] O meio usado para cultivo das células pode ser qualquer meio convencional adequado para crescimento da célula hospedeira em questão e obtenção da expressão de uma alfa-amilase. O meio e os componentes do meio adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as receitas publicadas (por exemplo, conforme descritas nos catálogos do American Type Culture Collection).

[000138] Uma enzima secretada das células hospedeiras pode ser usada em uma preparação de caldo integral. Nos presentes métodos, a preparação de um caldo de fermentação integral gasto de um micro-organismo recombinante pode ser obtida com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica resultando na expressão de uma α- amilase. A fermentação pode, portanto, ser entendida como compreendendo cultivo de frasco com agitação escala, fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações por lote contínuo, lote alimentado, ou em estado sólido) em laboratório ou fermentadores industriais realizados em um meio adequado e sob condições que permitam que a amilase seja expressada ou isolada. O termo "caldo de fermentação integral gasto"é aqui definido como conteúdos não fracionadso de material de fermentação que inclui meio de cultura, proteínas extracelulares (por exemplo, enzimas) e biomassa celular. Entende-se que o termo "caldo de fermentação integral gasto"também abrange biomassa celular que foi lisada ou permeabilizada com o uso de métodos conhecidos na técnica.

[000139] Uma enzima secretada a partir das células hospedeiras podem ser recuperadas de maneira conveniente a partir do meio de cultura por procedimentos bem conhecidos, incluindo separação de células do meio por centrifugação ou filtração e precipitação de componentes proteináceos do meio por um sal como sulfato de amônio, seguido do uso de procedimentos cromatográficos como a cromatografia de troca de íons, cromatografia por afinidade ou similares.

[000140] O polinucleotídeo que codifica uma amilase em um vetor pode ser ligado de maneira funcional a uma sequência de controle que é capaz de fornecer para a expressão da sequência de codificação por uma célula hospedeira, isto é, o vetor é um vetor de expressão. As sequências de controle podem ser modificadas, por exemplo, mediante a adição de mais elementos regulatórios de transcrição direcionados pelas sequências de controle mais responsivas a moduladores transcricionais. As sequências de controle podem compreender, especificamente, promotores.

[000141] As células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas que permitam a expressão de uma alfa-amilase. A expressão das enzimas pode ser constitutiva, de modo que elas sejam continuamente produzidas, ou induzível, exigindo um estímulo para iniciar a expressão. No caso da expressão induzível, a produção de proteína pode ser iniciada quando exigida, por exemplo, pela adição de uma substância indutora ao meio de cultura, por exemplo, dexametasona IPTG ou Sefarose. Os polipeptídeos podem também ser produzidos de maneira recombinante em um sistema isento de células in vitro, como o sistema TNT™ de reticulócito de coelho (Promega).

[000142] Um hospedeiro de expressão também pode ser cultivado no meio adequado para o hospedeiro, sob condições aeróbicas. Podem ser fornecidas agitação ou uma combinação de agitação e aeração, com a produção ocorrendo na temperatura adequada para aquele hospedeiro, por exemplo, de cerca de 25°C a cerca de 75°C (por exemplo, 30°C a 45°C), dependendo das necessidades do hospedeiro e da produção de amilase variantedesejada. A cultura pode ocorrer de cerca de 12 a cerca de 100 horas ou mais (e qualquer valor-hora entre esses, por exemplo, de cerca de 24 a 72 horas). Tipicamente, o caldo de cultura está em um pH de cerca de 4,0 a cerca de 8,0, dependendo novamente das condições de cultura necessárias para a célula hospedeira em relação à produção de uma amilase.

3.4 Identificação da atividade da amilase

[000143] Para avaliar a expressão de uma amilase em uma célula hospedeira, ensaios podem medir a proteína expressa, mRNA correspondente ou atividade de α-amilase. Por exemplo, ensaios adequados incluem Northern blotting, reação em cadeia de polimerasede transcriptase reversa e hibridização in situ, com o uso de uma sonda de hibridização adequadamente identificada. Ensaios adequados também incluem medir a atividade de amilase em uma amostra, por exemplo, por ensaios medindo diretamente a redução de açúcares como glicose nos meios de cultura. Por exemplo, a concentração de glicose pode ser determinada com o uso de kit de reagente de glicose n° 15-UV (Sigma Chemical Co.) ou um instrumento, como Technicon Autoanalyzer. A atividade de α-amilase também pode ser medida por qualquer método conhecido, como os ensaios PAHBAH ou ABTS, descritos a seguir.

3.5 Métodos para enriquecimento e purificação de amilases variants

[000144] Técnicas de fermentação, separação e concentração são bem conhecidas na técnica e métodos convencionais podem ser usados para preparar uma solução concentrada contendo polipeptídeo de α- amilase variante.

[000145] Após a fermentação, um caldo de fermentação é obtido, as células microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo materiais de fermentação bruta residuais, são removidos por técnicas de separação convencionais a fim de obter uma solução de amilase. São geralmente usadas filtração, centrifugação, microfiltração, filtração em tambor a vácuo giratório, ultrafiltração, centrifugação seguida por ultrafiltração, extração ou cromatografia, ou similares.

[000146] É desejável concentrar uma solução contendo α- polipeptídeo de amilase variante para otimizar a recuperação. O uso de soluções não concentradas exige aumento do tempo de incubação a fim de coletar o precipitado de enzima enriquecido ou purificado.

[000147] A solução contendo enzima é concentrada com o uso de técnicas de concentração convencionais até ser obtido o teor desejado de enzimas. A concentração da solução contendo enzima pode ser alcançada por qualquer uma das técnicas discutidas na presente invenção. Métodos de enriquecimento e purificação exemplificadores incluem, mas não se limitam a, filtração e/ou ultrafiltração giratória a vácuo.

[000148] A solução de enzimas é concentrada em uma solução concentrada de enzimas até que a atividade enzimática da solução contendo polipeptídeo de α-amilase variante esteja a um teor desejado.

[000149] A concentração pode ser feita com o uso, por exemplo, de um agente de precipitação, como um agente de precipitação de haleto de metal. Os agentes de precipitação de haleto de metal incluem mas não se limitam a cloretos de metal alcalino, brometos de metal alcalino e blendas de dois ou mais desses haletos de metal. Haletos de metal exemplificadores incluem cloreto de sódio, cloreto de potássio, brometo de sódio, brometo de potássio e blendas de dois ou mais desses haletos de metal. O agente de precipitação de haleto de metal, cloreto de sódio, também pode ser usado como preservativo.

[000150] O agente de precipitação de haleto de metal é usado em uma quantidade eficaz para precipitar uma amilase. A seleção de ao menos uma quantidade eficaz e uma quantidade ideal de haleto de metal eficaz para causar a precipitação da enzima, assim como as condições da precipitação para máxima recuperação incluindo tempo de incubação, pH, temperatura e concentração de enzima, serão prontamente aparentes para o versado na técnica, após os testes de rotina.

[000151] Em geral, pelo menos cerca de 5% em p/v (peso/volume) a cerca de 25% em p/v de haleto de metal é adicionado à solução concentrada de enzima, e normalmente pelo menos cerca de 8% em p/v. Em geral, não mais que cerca de 25% em p/v do haleto de metal é adicionado à solução concentrada de enzima e normalmente não mais que cerca de 20% em p/v. A concentração ideal do agente de precipitação de haleto de metal dependerá, entre outros fatores, da natureza do polipeptídeo de α-amilase variante específico e de sua concentração na solução de enzima concentrada.

[000152] Outra forma alternativa de precipitar a enzima é usar compostos orgânicos. Agentes precipitadores de composto orgânico exemplificadores incluem: ácido 4-hidroxibenzoico, sais de metal alcalino de ácido 4-hidroxibenzoico, alquilésteres de ácido 4- hidroxibenzoico e blendas de dois ou mais desses compostos orgânicos. A adição dos ditos agentes de precipitação de compostos orgânicos pode ocorrer antes, simultaneamente ou subsequentemente à adição do agente de precipitação de haleto de metal e a adição de ambos os agentes de precipitação, composto orgânico e haleto de metal pode ser executada sequencialmente ou simultaneamente.

[000153] Em geral, os agentes de precipitação orgânica são selecionados do grupo consistindo em sais de metal alcalino de ácido 4-hidroxibenzoico, como sais de sódio ou potássio, e ésteres de alquila lineares ou ramificados de ácido 4-hidroxibenzoico, sendo que o grupo alquila contém de 1 a 12 átomos de carbono e blendas de dois ou mais desses compostos orgânicos. Os agentes de precipitação de compostos orgânicos podem ser, por exemplo, ésteres de alquila lineares ou ramificados de ácido 4-hidroxibenzoico, sendo que o grupo alquila contém de 1 a 10 átomos de carbono e blendas de dois ou mais desses compostos orgânicos. Compostos orgânicos exemplificadores são ésteres de alquila lineares de ácido 4-hidroxibenzoico, sendo que o grupo alquila contém de 1 a 6 átomos de carbono e blendas de dois ou mais desses compostos orgânicos. Metil ésteres de ácido 4- hidroxibenzoico, propil ésteres de ácido 4-hidroxibenzoico, butil ésteres de ácido 4-hidroxibenzoico, etil ésteres de ácido 4-hidroxibenzoico e blendas de dois ou mais desses compostos orgânicos podem também ser usados. Compostos orgânicos adicionais também incluem mas não se limitam a metil éster de ácido 4-hidroxibenzoico (chamado de metil PARABENO) e propil éster de ácido 4-hidroxibenzoico (chamado de propilparabeno, que são também agentes conservantes de amilase. Para mais descrições, consulte, por exemplo, a patente US n° 5.281.526.

[000154] A adição do agente de precipitação de composto orgânico fornece a vantagem de alta flexibilidade das condições de precipitação que dizem respeito a pH, temperatura, concentração da amilase variante, concentração de agente de precipitação e tempo de incubação.

[000155] O agente de precipitação de composto orgânico é usado em uma quantidade eficaz para otimizar a precipitação da enzima por meio do agente de precipitação de haleto de metal. A seleção de ao menos uma quantidade eficaz e uma quantidade ideal de agente de precipitação de composto orgânico, assim como as condições da precipitação para máxima recuperação incluindo tempo de incubação, pH, temperatura e concentração de enzima, serão prontamente aparentes para o versado na técnica, face à presente descrição, após os testes de rotina.

[000156] Em geral, pelo menos cerca de 0,01% em p/v de agente de precipitação de composto orgânico é adicionado à solução concentrada de enzima e usualmente pelo menos cerca de 0,02% em p/v. Em geral, não mais que cerca de 0,3% em p/v de agente de precipitação de composto orgânico é adicionado à solução concentrada de enzima e normalmente não mais que cerca de 0,2% em p/v.

[000157] A solução concentrada de polipeptídeo, contendo o agente de precipitação de haleto de metal e o agente de precipitação de composto orgânico, pode ser ajustada a um pH, que de necessidade dependerá da enzima para ser enriquecida ou purificada. Em geral, o pH é ajustado para um teor próximo ao ponto isoelétrico da amilase. O pH pode ser ajustado a um pH em um faixa de cerca de 2,5 unidades de pH abaixo do ponto isoelétrico (pI) até cerca de 2,5 unidades de pH acima do ponto isoelétrico.

[000158] O tempo de incubação necessário para obter um precipitado de enzima enriquecido ou purificado depende da natureza da enzima específica, da concentração da enzima, e do(s) agente(s) de precipitação específico(s) e sua(s) concentração(ões). De modo geral, o tempo eficaz para precipitar a enzima está entre cerca de 1 a cerca de 30 horas; normalmente não excede cerca de 25 horas. Na presença do agente de precipitação do composto orgânico, o tempo de incubação pode ser ainda reduzido para menos que cerca de 10 horas, e na maioria dos casos até cerca de 6 horas.

[000159] De modo geral, a temperatura durante a incubação está entre cerca de 4°C e cerca de 50°C. Normalmente, o método é executado a uma temperatura entre cerca de 10°C e cerca de 45°C (por exemplo, entre cerca de 20°C e cerca de 40°C). A temperatura ótima para induzir a precipitação varia de acordo com as condições da solução e da enzima ou do(s) agente(s) de precipitação usado(s).

[000160] A recuperação do precipitado de enzima enriquecido ou purificada, como um todo, e a eficiência com a qual o processo é conduzido, é aprimorada pela agitação da solução que compreende a enzima, o haleto de metal adicionado e o composto orgânico adicionado. A etapa de agitação é feita durante a adição do haleto de metal e do composto orgânico, e durante o período de incubação subsequente. Os métodos de agitação adequados incluem agitação ou vibração mecânica, aeração vigorosa, ou qualquer técnica similar.

[000161] Após o período de incubação, a enzima enriquecida ou purificada é então separada do pigmento dissociado e outras impurezas e coletada por técnicas de separação convencionais, como filtração, centrifugação, microfiltração, filtragem giratória a vácuo, ultrafiltração, filtração por prensa, microfiltração por membrana transversal, microfiltração por membrana de fluxo transversal ou similares. A enriquecimento ou purificação adicional do precipitado de enzima pode ser obtida lavando-se o precipitado com água. Por exemplo, o precipitado de enzima enriquecido ou precipitado é lavado com água contendo o agente de precipitação de haleto de metal, por exemplo, com água contendo o haleto de metal e os agentes de precipitação de composto orgânico.

[000162] Durante a fermentação, um a-polipeptídeo de amilase variante se acumula no caldo de cultura. Para o isolamento, enriquecimento ou purificação da α-amilase variante desejada, o caldo de cultura é centrifugado ou filtrado para eliminar células e o líquido isento de células resultante é usado para enriquecimento ou purificação de enzima. Em uma modalidade, o caldo isento de células é submetido a dessalificação com o uso do sulfato de amônio a cerca de 70% de saturação; a fração de 70% de saturação-precipitação é então dissolvida em um tampão e aplicada a uma coluna, como uma coluna Sephadex G-100 e eluída para recuperar a fração ativa de enzima. Durante um enriquecimento ou purificação adicional, um procedimento convencional como cromatografia de troca iônica pode ser usado.

[000163] Enzimas enriquecidas ou purificadas são úteis para aplicações de lavanderia e limpeza. Por exemplo, elas podem ser usadas em detergentes de lavanderia e removedores de manchas. Elas podem constituir um produto final que é líquido (solução, pasta fluida) ou sólido (granular, pó).

[000164] Um exemplo mais específico de enriquecimento ou purificação é described em Sumitani et al. (2000) "New type of starch- binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. 195 α-amilase contributes to starch binding e raw starch degrading", Biochem. J., 350: 477-484 e é brevemente resumido aqui. A enzima obtida de 4 litros de um sobrenadante de cultura Streptomyces lividans TK24 foi tratada com (NH4)2SO4 a 80% saturação. O precipitado foi recuperado por centrifugação a 10.000 x g (20 min. e 4°C) e re- dissolvido em 20 mm de tampão Tris/HCl (pH 7,0) contendo 5 mm CaCl2. O precipitado solubilizado foi, então, dialisado contra o mesmo tampão. A amostra dialisada foi, então, aplicada a uma coluna Sephacryl S-200, que foi anteriormente equilibrada com 20 mm de tampão Tris/HCl, (pH 7,0), 5 mm CaCl2 e eluída em uma vazão linear de 7 mL/hora com o mesmo tampão. Frações da coluna foram coletadas e avaliadas quanto à atividade conforme avaliado pelo ensaio de enzima e SDS-PAGE. A proteína foi ainda purificada da seguinte forma. Uma coluna Toyopearl HW55 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA, EUA; Cat. n° 19812) foi equilibrada com 20 mm de tampão Tris/HCl (pH 7,0) contendo 5 mm CaCl2 e 1,5 M (NH4)2SO4. A enzima foi eluída com um gradiente linear de 1,5 a 0 M (NH4)2SO4 em 20 mm de tampão Tris/HCL, pH 7,0 contendo 5 mm de CaCl2. As frações ativas foram coletadas e a enzima precipitada com (NH4)2SO4 a 80% de saturação. O precipitado foi recuperado, re-dissolvido e dialisado conforme descrito acima. A amostra dialisada foi, então, aplicada a uma coluna Mono Q HR5/5 (Amersham Pharmacia; Cat. n° 17-5167-01) anteriormente equilibrada com 20 mm de tampão Tris/HCl (pH 7,0) contendo 5 mm de CaCl2 a uma taxa de fluxo de 60 mL/hora. As frações ativas são coletadas e adicionadas a uma solução de 1,5 M (NH4)2SO4. As frações ativas de enzima foram re-cromatografadas em uma coluna Toyopearl HW55, como antes, para produzir uma enzima homogênea como determinada por SDS-PAGE. Consulte Sumitani et al. (2000) Biochem. J., 350: 477484, para discussão geral do método e variações sobre o mesmo.

[000165] Para produção de recuperação de escala, polipeptídeos de α-amilase variante podem ser enriquecidos ou parcialmente purificados conforme geralmente descritos acima pela remoção de células via floculação com polímeros. Alternativamente, a enzima pode ser enriquecida ou purificada por microfiltração seguida de concentração por ultrafiltração com o uso de membranas e equipamentos disponíveis. Entretanto, para algumas aplicações, a enzima não precisa ser enriquecida ou purificada e o caldo de cultura integral pode ser lisado e usado sem tratamento adicional. A enzima pode então ser processada, por exemplo, em grânulos.

4. Composições e usos de amilases variantes

[000166] Amilases variantes são úteis para uma variedade de aplicações industriais. Por exemplo, amilases variantes são úteis em um processo de conversão de amido, particularmente em um processo de sacarificação de um amido que tenha sido submetido a liquefação. O produto final desejado pode ser qualquer produto que pode ser produzido pela conversão enzimática do substrato de amido. Por exemplo, o produto desejado pode ser um xarope rico em glicose e maltose, que pode ser usado em outros processos, como a preparação de HFCS, ou que pode ser convertido em vários outros produtos úteis, como intermediários de ácido ascórbico (por exemplo, gluconato; ácido 2-ceto-L-gulônico; 5-cetogluconato; e 2,5-dicetogluconato); 1,3- propanodiol; aminoácidos aromáticos (por exemplo, tirosina, fenilalanina e triptofano); ácidos orgânicos (por exemplo, lactato, piruvato, succinato, isocitrato e oxaloacetato); aminoácidos (por exemplo, serina e glicina); antibióticos; microbicidas; enzimas; vitaminas; e hormônios.

[000167] O processo de conversão de amido pode ser um precursor para ou simultâneo a um processo de fermentação projetado para produzir álcool para combustível ou bebidas (isto é, álcool potável). Uma pessoa versada na técnica conhecerá várias condições de fermentação que podem ser aplicadas na produção desses produtos finais. Amilases variantes também são uteís nas composições e métodos de preparo de alimentos. Esses vários usos para amilases variantes são descritos em mais detalhes abaixo.

4.1 Preparação de substratos de amido

[000168] A pessoa geralmente versada na técnica é suficientemente ciente do métodos disponíveis que podem ser usados para preparar substratos de amido para uso nos processos apresentados na presente invenção. Por exemplo, um substrato de amido útil pode ser obtido a partir de tubérculos, raízes, caules, legumes, cereais ou grãos integrais. Mais especificamente, o amido granular pode ser obtido a partir de milho, sabugo, trigo, cevada, centeio, triticale, milo, sagú, painço, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batata. O milho contém cerca de 60-68% de amido; A cevada contém cerca de 55-65% de amido; O painço contém cerca de 75-80% de amido; O trigo contém cerca de 60-65% de amido; e arroz polido contém cerca de 70 a 72% de amido. Substratos de amido especificamente contemplados são amido de milho e amido de trigo. O amido proveniente de um grão pode ser moído ou integral e inclui sólidos de milho, como grãos, fibras e/ou sabugo. O amido também pode ser amido em bruto altamente refinado ou matéria-prima de processos de refinaria de amido. Vários amidos são também comercialmente disponíveis. Por exemplo, o amido de milho está disponível junto à Cerestar, Sigma, e Katayama Chemical Industry Co. (Japão); o amido de trigo está disponível junto à Sigma; o amido de batata doce está disponível junto à Wako Pure Chemical Industry Co. (Japão); e o amido de batata está disponível junto à Nakaari Chemical Pharmaceutical Co. (Japão).

[000169] O substrato de amido pode ser um amido em bruto do grão integral moído, que contém frações não amido, por exemplo, resíduos de germe e fibras. A moagem pode compreender a moagem a úmido ou a seco, ou trituração. Na moagem a úmido, o grão integral é encharcado com água e ácido diluído para separar o grão em suas partes componentes, por exemplo, amido, proteína, gérmen, óleo, fibras de núcleo. A moagem a úmido separa eficientemente o gérmen e a farinha (isto é, grânulos de amido e proteína) e é especialmente adequada para a produção de xaropes. Na moagem ou trituração a seco, os núcleos inteiros são moídos até obter um pó fino e com frequência processado sem fracionar o grão em suas partes componentes. Em alguns casos, o óleo dos grãos é recuperado. O grão moído a seco compreenderrá assim quantidades significativas de compostos de carboidrato não amido, em adição ao amido. A trituração a seco do substrato de amido pode ser usada para produção de etanol e outros bioquímicos. O amido a ser processado pode ser uma qualidade de amido altamente refinado, por exemplo, com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 97% ou pelo menos 99,5% de pureza.

4.2 Gelatinização e liquefação de amido

[000170] Para uso na presente invenção, o termo "liquefação" ou "liquefazer" significa um processo pelo qual o amido é convertido em dextrinas menos viscosas e de cadeia mais curta. De modo geral, esse processo envolve gelatinização de amido simultaneamente ou seguida de adição de uma α-amilase, embora possam ser opcionalmente adicionadas enzimas indutoras de liquefação adicionais. Em algumas modalidades, o substrato de amido preparado conforme descrito acima é transformado em pasta fluida com água. A pasta fluida de amido pode conter amido como uma porcentagem em peso de sólidos secos de cerca de 10 a 55%, cerca de 20 a 45%, cerca de 30 a 45%, cerca de 30 a 40% ou cerca de 30 a 35%. A α-amilase (EC 3.2.1.1) pode ser adicionada à pasta fluida, com uma bomba medidora, por exemplo. A α- amilase tipicamente usada para essa pedido é uma α-amilase bacteriana termicamente estável, como uma α-amilase Geobacillus stearothermophilus. A α-amilase é normalmente fornecida, por exemplo, a cerca de 1500 unidades por kg de matéria seca de amido. Para otimizar a estabilidade e atividade de α-amilase, o pH da pasta fluida é tipicamente ajustada a cerca de pH 5,5 a 6,5 e cerca de 1 mm de cálcio (cerca de 40 ppm íons de cálcio livres) também podem ser adicionados. Variantes Geobacillus stearothermophilus ou outras α-amilases podem exigir condições diferentes. A α-amilase bacteriana restante na pasta fluida após a liquefação pode ser desativada por vários métodos, incluindo diminuir o pH em uma etapa de reação subsequente ou remover o cálcio da pasta fluida nos casos onde a enzima é dependente do cálcio.

[000171] A pasta fluida de amido mais a α-amilase pode ser bombeada continuamente através de um cozinhador a jato, que é aquecido a vapor d'água até 105°C. A gelatinização ocorre rapidamente sob essas condições, e a atividade enzimática, combinada com forças de cisalhamento significativas, iniciam a hidrólise do substrato de amido. O tempo de residência no cozinhador a jato é breve. O amido parcialmente gelatinizado pode ser passado em uma série de tubos de retenção mantidos a cerca de 105 a 110°C e retidos durante cerca de 5 a 8 min. para completar o processo de gelatinização ("liquefação primária"). A hidrólise para o DE necessário é concluído em tanques a 85 a 95°C ou temperaturas mais elevadas por cerca de 1 a 2 horas ("liquefação secundária"). Esses tanques podem conter defletores para desencorajar a retro-mistura. Para uso na presente invenção, o termo "minutos de liquefação secundária" refere-se ao tempo que transcorreu do início da liquefação secundária até o tempo no qual o Equivalente de Dextrose (DE) é medido. A pasta fluida é então deixada resfriar até a temperatura ambiente. Essa etapa de resfriamento pode ser de 30 minutos a 180 minutos, por exemplo, cerca de 90 minutos a 120 minutos. O amido liquefeito está tipicamente sob a forma de uma pasta fluida tendo um teor de sólidos secos (em peso) de cerca de 10 a 50%; cerca de 10 a 45%; cerca de 15 a 40%; cerca de 20 a 40%; cerca de 25 a 40%; ou cerca de 25 a 35%.

[000172] A liquefação com amilases variantes pode ser vantajosamente conduzida em baixo pH, eliminando o requisito de ajustar o pH a cerca de pH 5,5 a 6,5. Amilases variantes podem ser usadas para liquefação a uma faixa de pH de 2 a 7, por exemplo, pH 3,0 a 7,5, pH 4,0 a 6,0 ou pH 4,5 a 5,8. Amilases variantes pode manter a atividade liquefaciente a uma faixa de temperatura de cerca de 85°C a 95°C, por exemplo, 85°C, 90°C ou 95°C. Por exemplo, a liquefação pode ser conduzida com 800 μg de uma amilase em uma solução de 25% amigo de milho DS por 10 min a pH 5,8 e 85°C ou pH 4,5 e 95°C, por exemplo. A atividade liquefaciente pode ser ensaiada com o uso de qualquer dentre inúmeros ensaios de viscosidade conhecidos na técnica.

4.3 Sacarificação

[000173] O amido liquefeito pode ser sacarificado em um xarope rico em sacarídeos DP inferiores (por exemplo, DP1 + DP2), com o uso de amilases variantes, opcionalmente na presença de outra(s) enzima(s). A composição exata dos produtos de sacarificação depende da combinação de enzimas usada, assim como o tipo de amido granular processado. Vantajosamente, o xarope alcançável com o uso das amilases variantes fornecidas pode conter uma porcentagem em peso de DP2 do total de oligossacarídeos no amido sacarificado excedendo 30%, por exemplo, 45% a 65% ou 55% a 65%. A porcentagem em peso de (DP1 + DP2) no amido sacarificado pode exceder cerca de 70%, por exemplo, 75% a 85% ou 80% a 85%. As amilases presentes também produzem um rendimento de glicose relativamente alto, por exemplo, DP1 > 20%, no produto de xarope.

[000174] Enquanto a liquefação é geralmente testada como um processo contínuo, a sacarificação é com frequência conduzida como um processo em batelada. A sacarificação é tipicamente mais eficaz a temperaturas de cerca de 60 a 65°C e um pH de cerca de 4,0 a 4,5, por exemplo, pH 4,3, necessitando resfriamento e ajustando o pH do amido liquefeito. A sacarificação pode ser feita, por exemplo, a uma temperatura entre cerca de 40°C, cerca de 50°C ou cerca de 55°C a cerca de 60°C ou cerca de 65°C. A sacarificação é normalmente conduzida em tanques agitados, que pode levar várias horas para preencher ou esvaziar. As enzimas são tipicamente adicionadas a uma razão fixa a sólidos secos conforme os tanques são preenchidos ou adicionados como uma dose única no início do estágio de preenchimento. Uma reação de sacarificação para fazer um xarope tipicamente é testada por cerca de 24 a 72 horas, por exemplo, 24 a 48 horas. Quando um DE máximo ou desejado tiver sido obtido, a reação é parada aquecendo-se a 85°C durante 5 minutos, por exemplo. A incubação adicional resultará em um DE inferior, eventualmente a cerca de 90 DE, conforme a glicose acumulada repolimeriza para isomaltose e/ou outros produtos de reversão via uma reação de reversão enzimática e/ou com a abordagem de equilíbrio termodinâmico. Ao utilizar uma amilase, a sacarificação é idealmente conduzida a uma faixa de temperatura de cerca de 30°C a cerca de 75°C, por exemplo, 45°C a 75°C ou 47°C a 74°C. A sacarificação pode ser conduzida a uma faixa de pH de cerca de pH 3 a cerca de pH 7, por exemplo, pH 3,0 a pH 7,5, pH 3,5 a pH 5,5, pH 3,5, pH 3,8 ou pH 4,5.

[000175] Uma amilase pode ser adicionada à pasta fluida sob a forma de uma composição. A amilase pode ser adicionada a uma pasta fluida de um substrato de amido granular em uma quantidade de cerca de 0,6 a 10 ppm ds, por exemplo, 2 ppm ds. Uma amilase pode ser adicionada na forma de uma enzima em caldo integral, clarificada, enriquecida, parcialmente purificada ou purificada. A atividade específica da amilase pode ser cerca de 300 U/mg de enzima, por exemplo, medida com o ensaio de PAHBAH. A amilase também pode ser adicionada como um produto em caldo integral.

[000176] Uma amilase pode ser adicionada à pasta fluida como uma solução de enzima isolada. Por exemplo, uma amilase pode ser adicionada sob a forma de um material celular cultivado produzido por células hospedeiras expressando uma amilase. Uma amilase também pode ser secretada por uma célula hospedeira no meio de reação durante o processo de fermentação ou SSF, de modo que a enzima é fornecida continuamente à reação. A célula hospedeira que produz e secreta amilase também pode expressar uma enzima adicional, como uma glicoamilase. Por exemplo, a patente US n° 5.422.267 apresenta o uso de uma glicoamilase em levedura para produção de bebidas alcoólicas. Por exemplo, uma célula hospedeira, por exemplo, Trichoderma reesei ou Aspergillus niger, pode ser manipulada para coexpressar uma amilase e uma glicoamilase, por exemplo, HgGA, TrGA, ou uma variante de TrGA, durante a sacarificação. A célula hospedeira pode ser geneticamente modificada para não expressar sua glicoamilase endógena e/ou outras enzimas, proteínas ou outros materiais. A célula hospedeira pode ser manipulada para expressar um amplo espectro de várias enzimas sacarolíticas. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura recombinante pode compreender ácidos nucleicos que codificam uma glicoamilase, uma alfa-glicosidase, uma enzima que utiliza pentose açúcar, uma α-amilase, uma pululase, uma isoamilase e/ou isopululanase. Consulte, por exemplo, WO 2011/153516 A2.

4.4 Isomerização

[000177] O hidrolisado de amido solúvel produzido pelo tratamento com amilase pode ser convertido em xarope à base de amido com alto teor de frutose (HFSS), como xarope de milho com alto teor de frutose (HFCS). Essa conversão pode ser alcançada com o uso de glicose isomerase, particularmente uma glicose isomerase imobilizada em um suporte sólido. O pH é aumentado a cerca de 6,0 a cerca de 8,0, por exemplo, pH 7,5 (dependendo da isomerase) e Ca2+ é removido por troca iônica. Isomerases adequadas incluem Sweetzyme®, IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI e G-zyme® G993, Ketomax®, G- zyme® G993, G-zyme® G993 líquido e GenSweet® IGI. Após a isomerização, a mistura tipicamente contém cerca de 40 a 45% frutose, por exemplo, 42% frutose.

4.5 Fermentação

[000178] O hidrolisado de amido solúvel, particularmente um xarope rico em glicose, pode ser fermentado colocadno-se o hidrolisado de amido em contato com um organismo de fermentação tipicamente a uma temperatura em torno de 32°C, como de 30°C a 35°C para levedura para produção de álcool. A temperatura e pH da fermentação dependerão do organismo de fermentação. Produtos de EOF incluem metabólitos, como ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glicônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, ácido itacônico e outros ácidos carboxílicos, glucona delta-lactona, eritorbato de sódio, lisina e outros aminoácidos, ácido graxo ômega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol e outros biomateriais.

[000179] Micro-organismos etanologênicos incluem levedura, como Saccharomyces cerevisiae e bactérias, por exemplo, Zymomonas moblis, expressando álcool desidrogenase e piruvato descarboxilase. O micro-organismo etanologênico pode expressar xilose redutase e xilitol des-hidrogenase, que convertem xilose para xilulose. Cepas aprimoradas de micro-organismos etanologênicos, que podem suportar temperaturas mais altas, por exemplo, são conhecidas na técnica e podem ser usadas. Consulte Liu et al. (2011) Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 27(7): 1049-56. Fontes comerciais de levedura incluemETHANOL REDÒ (LeSaffre); ThermosaccÒ (Lallemand); RED STARÒ (Red Star); FERMIOLÒ (DSM Specialties); e SUPERSTARTÒ (Alltech). Micro-organismos que produzem outros metabólitos como ácido cítrico e ácido láctico, por fermentação, também são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Papagianni (2007) "Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: biochemical aspects, membrane transport and modeling", Biotechnol. Adv. 25(3): 244-63; John et al. (2009) "Direct lactic acid fermentation: focus on simultaneous sacarification and lactic acid production", Biotechnol. Adv. 27(2): 14552.

[000180] Os processos de sacarificação e fermentação podem ser executados como um processo de SSF. A fermentação pode compreender subsequentes enriquecimento, purificação e recuperação de etanol, por exemplo. Durante a fermentação, o teor de etanol do caldo ou "cerveja" pode alcançar cerca de 8 a 18% v/v, por exemplo, 14 e 15% v/v. O caldo pode ser destilado para produzir soluções de etanol enriquecidas, por exemplo, 96% puras. Adicionalmente, o CO2 gerado pela fermentação pode ser coletado com um purificador de CO2, compactado e comercializado para outros usos, por exemplo, bebida carbonatada ou produção de gelo seco. O resíduo sólido da processo de fermentação pode ser usado como produto rico em proteína, por exemplo, ração para gado.

[000181] Conforme mencionado acima, um processo de SSF pode ser conduzido com células fúngicas que expressam e secretam amilase continuamente por todo o SSF. As células fúngicas expressando amilase também podem ser o micro-organismo de fermentação, por exemplo, um micro-organismo etanologênico. A produção de etanol pode ser assim executada com o uso de uma célula fúngica que expressa amilase suficiente para que menos ou nenhuma enzima tenha de ser adicionada exogenamente. A célula hospedeira fúngica pode ser de uma cepa fúngica adequadamente manipulada. Células fúngicas hospedeiras que expressam e secretam outras enzimas, em adição à amilase, também podem ser usadas. Tais células podem expressar glicoamilase e/ou uma pululanase, fitase, alfa-glicosidase, isoamilase, beta-amilase celulase, xilanase, outras hemicelulases, protease, beta- glicosidase, pectinase, esterase, enzimas redox, transferase ou outra enzima.

[000182] Uma variação desse processo é um sistema de "fermentação alimentada em bateladas", onde o substrato é adicionado em incrementos conforme a fermentação progride. Os sistemas de batelada alimentada são úteis quando a repressão catabólita pode inibir o metabolismo das células e onde é desejável haver quantidades limitadas de substrato no meio. A concentração real de substrato em sistemas de batelada alimentada é estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis, como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, como CO2. As fermentações em batelada e batelada alimentada são comuns e bem conhecidas na técnica.

[000183] A fermentação contínua é um sistema aberto no qual um meio de fermentação definido é adicionado continuamente em um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. A fermentação contínua em geral mantém as culturas em uma alta densidade constante onde as células estão primeiramente em crescimento de fase logarítmica. A fermentação contínua permite a modulação do crescimento celular e/ou concentração do produto. Por exemplo, um nutriente limitador como a fonte de carbono ou a fonte de nitrogênio é mantido em uma taxa fixa e todos os outros parâmetros são permitidos moderar. Como o crescimento é mantido em um estado estável, a perda celular devido ao meio ser drenado deve ser equilibrada com a taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de otimização de processos contínuos de fermentação e maximização da taxa de formação de produto são bem conhecidos na técnica da microbiologia industrial.

4.6 Composições que compreendem amilases variantes

[000184] Amilases variantes podem ser combinadas com uma glicoamilase (EC 3.2.1.3), por exemplo, uma glicoamilase Trichoderma ou variante da mesma. Uma glicoamilase exemplificadora é a glicoamilase Trichoderma reesei (TrGA) e variantes da mesma que possuam atividade específica superior e estabilidade térmica. Consulte os pedidos publicados n° US 2006/0094080, 2007/0004018 e2007/0015266 (Danisco US Inc.). Variantes adequadas de TrGA incluem as com atividade de glicoamilase e ao menos 80%, ao menos 90% ou ao menos 95% de identidade de sequência para TrGA tipo selvagem. Amilases variantes vantajosamente aumentam o rendimento de glicose produzida em um processo de sacarificação catalisado por TrGA.

[000185] Alternativamente, a glicoamilase pode ser outra glicoamilase derivada das plantas (incluindo algas), fungos ou bactérias. Por exemplo, as glicoamilases podem ser a glicoamilase Aspergillus niger G1 ou G2 ou suas variantes (por exemplo, Boel et al. (1984) EMBO J. 3: 1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S)); e a glicoamilase A. awamori (por exemplo, WO 84/02921 (Cetus Corp.)). Outra glicoamilase Aspergillus contemplada incluem variantes com estabilidade térmica otimizada, por exemplo, G137A e G139A (Chen et al. (1996) Prot. Eng. 9: 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al. (1994) Biochem. J. 301: 275281); A246C (Fierobe et al. (1996) Biochemistry, 35: 8698-8704); e variantes com resíduos de Pro nas posições A435 e S436 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204). Outras glicoamilases contempladas incluem glicoamilases Talaromyces, em particular as derivadas de T. emersonii (por exemplo, WO 99/28448 (Novo Nordisk A/S), T. leycettanus (por exemplo, a patente US n° RE 32.153 (CPC International, Inc.)), T. duponti ou T. thermophilus (por exemplo, patente US n° 4.587.215). As glicoamilases bacterianas contempladas incluem glicoamilases do gênero Clostridium, em particular C.thermoamylolyticum (por exemplo, EP 135.138 (CPC International, Inc.) e C. thermohydrosulfuricum (por exemplo, WO 86/01831 (Michigan Biotechnology Institute)). Glicoamilases adequadas incluem as glicoamilases derivadas de Aspergillus oryzae, como uma glicoamilase mostrada na SEQ ID NO:2 em WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S). São adequadas, também, glicoamilases comerciais, como AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER e AMG™ E (Novozymes); OPTIDEX® 300 e OPTIDEX L-400 (Danisco US Inc.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (DSM); G-ZYME® G900 (Enzyme Bio-Systems); e glicoamilase G- ZYME® G990 ZR (A. niger com um baixo teor de protease). Outras glicoamilases adequadas incluem ainda glicoamilase Aspergillus fumigatus, glicoamilase Talaromyces, glicoamilase Thielavia, glicoamilase Trametes, glicoamilase Thermomyces glicoamilase, Athelia glicoamilase ou glicoamilase Humicola (por exemplo, HgGA). As glicoamilases são tipicamente adicionadas em uma quantidade de cerca de 0,1 a 2 unidades de glicoamilase (GAU)/g ds, por exemplo, cerca de 0,16 GAU/g ds, 0,23 GAU/g ds ou 0,33 GAU/g ds.

[000186] Outras enzimas adequadas que podem ser usadas com amilase incluem uma fitase, protease, pululanase, β-amilase, isoamilase, uma α-amilase diferente, alfa-glicosidase, celulase, xilanase, outras hemicelulases, beta-glicosidase, transferase, pectinase, lipase, cutinase, esterase, enzimas redox ou umacombinação das mesmas. Por exemplo, uma enzima desramificadora, como uma isoamilase (EC 3.2.1.68), pode ser adicionada emquantidades eficazes conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Uma pululanase (EC 3.2.1.41), por exemplo, Promozyme®, também é adequada. A pululanase é tipicamente adicionada a 100 U/kg ds. Outras enzimas adequadas incluem proteases, como proteases fúngicas e bactérias. Proteases fúngicas incluem as obtido a partir de Aspergillus, como A. niger, A. awamori, A. oryzae; Mucor (por exemplo, M. miehei); Rhizopus; e Trichoderma.

[000187] β-amilases (EC 3.2.1.2) são amilases maltogênicas exoativas, que catalisam a hidrólise das ligações 1,4-a-glucosídicas em amilopectina e polímeros de glicose relacionados, liberando assim a maltose. As β-amilases foram isoladas de várias plantas e micro-organismos. Consulte Fogarty et al. (1979) em PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, pp. 112-115. Essas β-amilases têm temperaturas ideais na faixa de 40°C a 65°C e pH ideal na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 7,0. β-amilases contempladas incluem, mas não se limitam a, β-amilases de cevada Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Danisco US Inc.); e Novozym™ WBA (Novozymes A/S).

[000188] Composições compreendendo as presentes amilases podem ser formulações aquosas ou não aquosas, grânulos, pós, géis, pastas aquosas, massas, etc., que podem compreender, adicionalmente, qualquer uma ou mais das enzimas adicionais listadas, na presente invenção, juntamente com tampões, sais, preservativos, água, cossolventes, tensoativos e similares. Tais composições podem funcionar em combinação com enzimas endógenas ou outros ingredientes já presentes em uma pasta fluida, banho de água, máquina de lavar, comida ou bebida, etc, por exemplo, enzimas, enzimas residuais de uma etapa de processamento prévia de planta endógena (incluindo algal) e similares.

5. Composições e métodos para assamento e preparo de alimentos

[000189] A presente invenção também está relacionada a uma "composição alimentícia", incluindo mas não se limitando a um produto alimentício, ração animal e/ou aditivos de alimento/ração, compreendendo uma amilase e métodos para preparar tal composição alimentícia compreendendo a mistura de amilase variante com um ou mais ingredientes alimentícios ou usos dos mesmos.

[000190] Ademais, a presente invenção refere-se ao uso de uma amilase na preparação de uma composição alimentícia, em que a composição alimentícia é assada subsequentemente à adição do polipeptídeo da invenção. Como usado aqui, o termo "composição para assamento" significa qualquer composição e/ou aditivo preparado no processo de fornecer um produto alimentício assado, incluindo mas não se limitando a farinha de trigo, uma massa, um aditivo de assamento e/ou um produto assado. A composição alimentícia ou aditivo pode ser líquida ou sólida.

[000191] Como usado aqui, o termo "farinha" significa grão de cereal moído ou triturada. O termo "farinha"também pode significar produtos de sagú ou tubérculo que foram triturados ou amassados. Em algumas modalidades, a farinha também pode conter componentes em adição ao cereal ou matéria vegetal moído ou amassado. Um exemplo de um componente adicional, embora sem a intenção de ser limitante, é um agente de fermentação. Grãos de cereal incluem trigo, aveia, centeio e cevada. Produtos de tubérculo incluem farinha de tapioca, farinha de mandioca e pó para creme de ovos. O termo "farinha"também inclui farinha de milho triturada, farinha de milho, farinha de arroz, farinha de trigo integral, farinha com fermento, farinha de tapioca, farinha de mandioca, arroz triturado, farinha enriquecida e pó para creme de ovos.

[000192] Para uso comercial e doméstico da farinha para assamento e produção alimentícia, é importante manter um teor adequado de atividade de α-amilase na farinha. Um teor de atividade que seja muito alto pode resultar em um produto que é pegajoso e/ou pastoso e portanto invendável. Farinha com atividade insuficiente de α-amilase pode não conter açúcar suficiente para função adequada de levedura, resultando em produtos secos, quebradiços ou assados. Consequentemente, uma amilase, por si só ou em combinação com outra(s) α-amilase(s), pode ser adicionada à farinha para aumentar o teor de atividade endógena de α-amilase na farinha.

[000193] Uma amilase pode ainda ser adicionada sozinha ou em combinação com outras amilases para impedir ou retardar a rancificação, isto é, o endurecimento das migalhas dos produtos assados. A quantidade de amilase antirrancificação estará tipicamente na faixa de 0,01 a 10 mg de proteína de enzima por kg de farinha, por exemplo, 0,5 mg/kg ds. Amilases antirrancificação adicionais que podem ser usadas em combinação com uma amilase incluem uma endoamilase, por exemplo, uma endoamilase bacteriana de Bacillus. A amilase adicional pode ser outra α-amilase maltogênica (EC 3.2.1.133), por exemplo, de Bacillus. Novamyl® é uma α-amilase maltogênica exemplificadora da cepa B. stearothermophilus NCIB 11837 e é descrito em Christophersen et al. (1997) Starch 50: 39-45. Outros exemplos de endoamilases antirrancificação incluem α-amilases bacterianas derivadas de Bacillus, como B. licheniformis ou B. amyloliquefaciens. A amilase antirrancificação pode ser uma exoamilase, como β-amilase, por exemplo, de fontes vegetais, como soja, ou de fontes microbianas, como Bacillus.

[000194] A composição para assamento compreendendo uma amilase pode compreender ainda uma fosfolipase ou enzima com atividade de fosfolipase. Uma enzima com atividade de fosfolipase tem uma atividade que pode ser medida em unidades de lipase (LU). A fosfolipase pode ter atividade de A1 ou A2 para remover o ácido graxo dos fosfolipídeos, formando um lisofosfolipídio. Ela pode ou não ter atividade de lipase, isto é, atividade nos substratos de triglicerídeos. A fosfolipase tipicamente tem uma temperatura ideal na faixa de 30 a 90°C., por exemplo, 30 a 70°C. As fosfolipases adicionadas podem ser de origem animal, por exemplo, do pâncreas, por exemplo, pâncreas bovino ou suíno, veneno de cobra ou de abelha. Alternativamente, a fosfolipase pode ser de origem microbiana, por exemplo, de fungos filamentosos, levedura ou bactérias, por exemplo.

[000195] A fosfolipase é adicionada em uma quantidade que aprimora a maciez do pão durante o período inicial após o assamento, particularmente as primeiras 24 horas. A quantidade de fosfolipase estará tipicamente na faixa de 0,01 a 10 mg de proteína de enzima por kg de farinha, por exemplo, 0,1 a 5 mg/kg. Ou seja, a atividade de fosfolipase geralmente estará na faixa de 20 a 1000 LU/kg de farinha, onde uma unidade de Lipase é definida como a quantidade de enzima necessária para liberação de 1 μmol de ácido butírico por minuto a 30°C, pH 7,0, com goma arábica como emulsilficante e tributirina como substrato.

[000196] Composições de massa geralmente compreendem farinha grossa ou fina de trigo e/ou outros tipos de farinha grossa, farinha ou amido como farinha de milho, amido de milho, farinha de centeio grossa ou fina, farinha de aveia grossa ou fina, farinha de soja, farinha de sorgo grossa ou fina, farinha de batata grossa ou fina ou amido de batata. A massa pode ser fresca, congelada ou parcialmente assada. A massa pode ser uma massa levedada ou uma massa a ser submetida a levedação. A massa pode ser levedada de várias maneiras, como pela adição de agentes químicos de levedação, por exemplo, bicarbonato de sódio ou pela adição de um levedo, isto é, massa fermentada. A massa também pode ser levedada pela adição de uma cultura de levedura adequada, como uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (fermento de padeiro), por exemplo, uma cepa disponível para comercialização de S. cerevisiae.

[000197] A massa também pode compreender outros ingredientes de massa convencionais, por exemplo, proteínas, como leite em pó, glúten e soja; ovos (por exemplo, ovos inteiros, gemas de ovos ou claras de ovos); um oxidante, como ácido ascórbico, bromato de potássio, iodato de potássio, azodicarbonamida (ADA) ou persulfato de amônio; um aminoácido como L-cisteina; um açúcar; ou um sal, como cloreto de sódio, acetato de cálcio, sulfato de sódio ou sulfato de cálcio. A massa pode compreender ainda gordura, por exemplo, triglicerídeo, como gordura granulada ou redução. A massa pode compreender ainda um emulsificante como mono- ou diglicerídeos, ésteres de diacetil ácido tartárico de mono- ou diglicerídeos, ésteres de açúcar de ácidos graxos, ésteres de poliglicerol ácidos graxos, ésteres de ácido láctico de monoglicerídeos, ésteres de ácido acético de monoglicerídeos, estearatos de polióxi etileno ou lisolecitina. Em particular, a massa pode ser feita sem adição de emulsificantes.

[000198] O produto de massa pode ser qualquer produto de massa processado, incluindo massa frita, frita por imersão, torrada, assada, cozida no vapor e fervida, como pão cozido no vapor e bolo de arroz. Em uma modalidade, o produto alimentício é um produto de padaria. Produtos típicos de padaria (assados) incluem pãos - como pães grandes, pequenos, bisnaguinhas, "bagels", bases para pizza etc. doces, pretzels, tortillas, bolos, "cookies", biscoitos, bolachas, etc.

[000199] Opcionalmente, uma enzima adicional pode ser usada junto com a amilase antirrancificação e a fosfolipase. A enzima adicional pode ser uma segunda amilase, como uma amiloglicosidase, uma β-amilase, uma ciclodextrina glucanotransferase ou a enzima adicional pode ser uma peptidase, em particular uma exopeptidase, uma transglutaminase, uma lipase, uma celulase, uma xilanase, uma protease, uma dissulfeto isomerase proteica, por exemplo, um dissulfeto isomerase proteica como revelado em WO 95/00636, por exemplo, um glicosiltransferase, uma enzima de ramificação (enzima de ramificação 1,4-α-glucano), uma 4-α-glucanotransferase (glicosiltransferase de dextrina) ou uma oxidorredutase, por exemplo, uma peroxidase, uma lacase, uma glicose oxidase, uma piranose oxidase, uma lipo-oxigenase, uma oxidase de L- aminoácido ou uma oxidase de carboidrato. A enzima adicional pode ser de qualquer origem, incluindo mamíferos e plantas, e particularmente de origem microbiana (bacteriana, levedura ou fungal) e pode ser obtida por técnicas convencionalmente usadas na técnica.

[000200] A xilanase é tipicamente de origem microbiana, por exemplo, derivada de uma bactéria ou fungo, como uma cepa de Aspergillus. Xilanases incluem Pentopan® e Novozym 384®, por exemplo, que são preparações de xilanase comercialmente disponíveis produzidas a partir de Trichoderma reesei. A amiloglicosidase pode ser uma amiloglicosidase A. niger (como AMG®). Outros produtos de amilase úteis incluem Grindamyl® A 1000 ou A 5000 (Grindsted Products, Dinamarca) e Amylase® H ou Amylase® P (DSM). A glicose oxidase pode ser uma glicose oxidase fúngica, em particular uma glicose oxidase Aspergillus niger (como Gluzyme®). Uma protease exemplificadora é Neutrase®.

[000201] O processo pode ser usado para qualquer tipo de produto assado preparado a partir de massa, seja macio ou crocante, seja do tipo branco, claro ou escuro. Exemplos são o pão, particularmente pão branco, de farinha integral ou de centeio, tipicamente sob a forma de pães grandes ou pãezinhos, como por exemplo, mas não se limitando a, baguete francesa, pão sírio, tortillas, bolos, panquecas, biscoitos, cookies, massa de torta, tostas, pão cozido no vapor, pizza e similares.

[000202] Uma amilase pode ser usada em uma pré-mistura, compreendendo farinha junto com uma amilase antirrancificação, uma fosfolipase e/ou um fosfolipídeo. A pré-mistura pode conter outros aditivos aprimoradores de massa e/ou pão, por exemplo, qualquer um dentre os aditivos, incluindo enzimas, mencionados acima. Uma amilase pode ser um componente de uma preparação de enzimas compreendendo uma amilase antirrancificação e uma fosfolipase, para uso como aditivo de assamento.

[000203] A preparação de enzimas está opcionalmente sob a forma de um granulado ou pó aglomerado. A preparação pode ter um distribuição estreita de tamanho de partícula com mais de 95% (em peso) das partículas na faixa de 25 a 500 μm. Granulados e pós aglomerados podem ser preparados de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por aspersão de uma amilase em um veículo em um granulador de leito fluido. O veículo pode consistir em núcleos particulados tendo um tamanho de partícula adequado. O veículo pode ser solúvel ou insolúvel, por exemplo, um sal (como NaCl ou sulfato de sódio), um açúcar (como sacarose ou lactose), um álcool de açúcar (como sorbitol), amido, arroz, grits de milho ou soja.

[000204] Partículas envelopadas, isto é, partículas de α-amilase, podem compreender uma amilase. Para preparar partículas envelopadas de α-amilase, a enzima é colocada em contato com um lipídio de grau alimentício em quantidade suficiente para suspender todas as partículas de α-amilase. Lipídios de grau alimentício, como usado aqui, pode ser qualquer composto naturalmente orgânico que é insolúvel em água, mas é solúvel em solventes orgânicos não polares como hidrocarboneto ou éter dietílico. Lipídios de grau alimentício adequados incluem, mas não se limitam a, triglicerídeos sob a forma de gorduras ou óleos que sejam saturados ou insaturados. Exemplos de ácidos graxos e combinações dos mesmos que compensam os triglicerídeos saturados incluem, mas não se limitam a, ácido butírico (derivado de gordura do leite), palmítico (derivado de gordura animal e vegetal) e/ou ácido esteárico (derivado de gordura animal e vegetal). Exemplos de ácidos graxos e combinações dos mesmos que compensam os triglicerídeos insaturados incluem, mas não se limitam a, ácido palmitoléico (derivado de gordura animal e vegetal), oleic (derivado de gordura animal e vegetal), linoléico (derivado de óleos vegetais) e/ou linolênico (derivado de óleo de linhaça). Outros lipídios de grau alimentício adequados incluem, mas não se limitam a, monoglicerídeos e diglicerídeos derivados dos triglicerídeos discutidos acima, fosfolipídeos e glicolipídios.

[000205] O lipídio de grau alimentício, particularmente na forma líquida, é colocado em contato com uma forma em pó das partículas de α-amilase de modo que o material lipídico cubra ao menos uma porção da superfície de ao menos a maior parte, por exemplo, 100% das partículas de α-amilase. Dessa forma, cada partícula de α-amilase é individualmente envelopada em um lipídio. Por exemplo, todas ou substancialmente todas as partículas de α-amilase são dotadas de um filme de lipídio fino, contínuo, envolvente. Isso pode ser obtido primeiramente colocando-se uma quantidade de lipídio em um recipiente, e então empastar as partículas de α-amilase para que o lipídio molha bem a superfície de cada partícula de α-amilase. Após um curto período de agitação, as partículas de α-amilase envelopadas, transportando uma quantidade substancial dos lipídios em suas superfícies, são recuperadas. A espessura do revestimento assim aplicado às partículas de α-amilase pode ser controlada pela seleção do tipo de lipídio usado e pela repetição da operação para construir um filme mais espesso, quando desejado.

[000206] O armazenamento, o manuseio e a incorporação do veículo de aplicação carregado podem ser obtidos por meio de uma mistura embalada. A mistura embalada pode compreender a α-amilase envelopada. Entretanto, a mistura embalada pode, ainda, conter ingredientes adicionais como necessário pelo fabricante ou padeiro. Após a α-amilase envelopada ter sido incorporado à massa, o padeiro continua o processo normal de produção desse produto.

[000207] As vantagens de envelopar as partículas de α-amilase são a dupla dobra. Primeiramente, o lipídio de grau alimentício protege a enzima de desnaturação térmica durante o processo de assamento das enzimas que são acionável por calor. Consequentemente, enquanto uma α-amilase é estabilizada e protegida durante os estágios de prova e assamento, é liberada do revestimento protetor no produto final assado, onde hidrolisa as ligações glicossídicas em poliglucanos. O veículo de aplicação carregado também fornece uma liberação sustentada da enzima ativa no artigo assado. Ou seja, após o processo de assamento, a α-amilase ativa é continuamente liberada do revestimento protetor a uma taxa que neutraliza, e portanto reduz a taxa de mecanismos de rancificação.

[000208] Em geral, a quantidade de lipídio aplicada às partículas de α-amilase pode variar de uma pequena percentagem do peso total da α-amilase a muitas vezes esse peso, dependendo da natureza do lipídio, a maneira em que é aplicado às partículas de α-amilase, a composição da mistura de massa a ser tratada e a gravidade da operação de misturação de massa envolvida.

[000209] O veículo de aplicação carregado, isto é, a enzima envelopada por lipídio, é adicionado aos ingredientes usados para preparar um artigo assado em uma quantidade eficaz para estender a vida útil do artigo assado. O padeiro computa a quantidade de α-amilase envelopada, preparada como discutido acima, que será necessária para alcançar o efeito antirrancificação desejado. A quantidade da α-amilase envelopada necessária é calculada com base na concentração da enzima envelopada e na proporção de α-amilase para farinha especificada. Foi verificado que uma ampla gama de concentrações é eficaz embora, conforme foi discutido, aprimoramentos observáveis na antirrancificação não correspondem linearmente à concentração de α- amilase, mas acima de certos teores mínimos, o aumento grande de uma concentração de α-amilase produz um aprimoramento adicional. A concentração de α-amilase realmente usada em uma produção específica de padaria poderia ser muito maior do que o mínimo necessário para fornecer ao padeiro segurança contra erros inadvertidos abaixo da medição por parte do padeiro. O limite inferior da concentração de enzimas é determinado pelo efeito antirrancificação mínimo que o padeiro deseja alcançar.

[000210] Um método de preparação de um artigo assado pode compreender: a) preparar partículas de α-amilase revestidas de lipídio, onde substancialmente todas as partículas de α-amilase são revestidas; b) misturar uma massa contendo farinha; c) adicionar a α-amilase revestida de lipídio à massa antes da mistura ser completa e terminar a mistura antes do revestimento de lipídio ser removido da α-amilase; d) fazer prova da massa; e e) assar a massa para fornecer o artigo assado, onde a α-amilase está inativa durante as etapas de mistura, prova e assamento e está ativa no artigo assado.

[000211] A α-amilase envelopada pode ser adicionada à massa durante o ciclo de mistura, por exemplo, próximo ao fim do ciclo de mistura. A α-amilase envelopada é adicionada a um ponto na etapa de mistura que permite distribuição suficiente da α-amilase envelopada por toda a massa; entretanto, a etapa de mistura é interrompida antes do revestimento protetor ser removido por evaporação instantânea das partículas de α-amilase. Dependendo do tipo e volume de massa, e da ação e velocidade do misturador, qualquer um dentre um a seis minutos ou mais podem ser necessários para misturar a α-amilase envelopada à massa, mas dois a quatro minutos é a média. Dessa forma, várias variáveis podem determinar o procedimento preciso. Primeiramente, a quantidade de α-amilase envelopada deve ter um volume total suficiente para permitir que a α-amilase envelopada se espalhe pela mistura de massa. Se a preparação de α-amilase envelopada for altamente concentrada, pode ser necessário adicionar óleo extra à pré-mistura antes de a α-amilase envelopada ser adicionada à massa. Receitas e processos de produção podem exigir modificações específicas; entretanto, bons resultados geralmente podem ser obtidos quando 25% do óleo especificado em uma fórmula de massa de pão é retirado da massa e é usado como um veículo para uma α-amilase envelopada concentrada quando adicionado próximo ao final do ciclo de mistura. Em pães ou outros artigos assados, particularmente aqueles tendo um baixo teor de gordura, por exemplo, pães franceses, uma mistura de α-amilase envelopada de aproximadamente 1% do peso de farinha seca é suficiente para admisturar a α-amilase envelopada devidamente com a massa. A faixa de porcentagens adequada é ampla e depende da fórmula, produto final e exigências de metodologia de produção de cada padeiro. Em segundo lugar, a suspensão de α-amilase envelopada deve ser adicionada à mistura com tempo suficiente para completa mistura na massa, mas não por um tempo que o excesso de ação mecânica remova o revestimento lipídico protetor das partículas envelopadas de α-amilase.

[000212] Em um outro aspecto da invenção, a composição alimentícia é uma composição de óleo, carne, banha, compreendendo uma amilase. Neste contexto, o termo "composição de óleo/carne/banha"significa qualquer composição, à base de, produzida a partir de e/ou contendo óleo, carne ou banha, respectivamente. Um outro aspecto da invenção está relacionado a um método de preparar uma composição de óleo ou carne ou banha e/ou aditivo compreendendo uma amilase, compreendendo a mistura do polipeptídeo da invenção com uma composição de óleo/carne/banha e/ou ingredientes aditivos.

[000213] Em um outro aspecto da invenção, a composição alimentícia é uma composição para ração animal, aditivo para ração animal selvagem e/ou de estimação compreendendo uma amilase e variantes dos mesmos. A presente invenção refere-se, adicionalmente, a um método para o preparo dessa composição de ração para animais, composição aditiva para animais e/ou alimento para animais de estimação compreendendo misturar uma amilase e variantes da mesma com um ou mais ingredientes de ração para animais, e/ou ingredientes aditivos de ração para animais e/ou ingredientes de alimento para animais de estimação. Além do mais, a presente invenção refere-se ao uso de uma amylase na preparação de uma composição de ração para animais e/ou de uma composição aditiva de ração para animais e/ou um alimento para animais de estimação.

[000214] O termo "animal" inclui todos os animais não ruminantes e ruminantes. Em uma modalidade específica, o animal é um animal não ruminante, como um cavalo e um animal monogástrico. Exemplos de animal monogástrico incluem, mas não se limitam a, porcos e suínos, como leitões, porcos em crescimento, porcas; aves como perus, patos, frango, galinhas de corte, galinhas poentes; peixes como salmão, truta, tilápia, bagre e carpas; e crustáceos como camarões pequenos e grandes. Em uma outra modalidade, o animal é um animal ruminante incluindo, mas não se limitando a, gado, bezerros jovens, cabras, ovelhas, girafas, bisões, alces, renas, iaques, búfalos d'água, veados, camelos, alpacas, lhamas, antílopes, antilocapras e nilgós.

[000215] No presente contexto, é intencionado que o termo "alimento para animais de estimação"signifque um alimento para um animal doméstico como, mas não se limitando a, cães, gatos, gerbos, hamsters, chinchilas, ratos, cobaias; aves de estimação, como canários, periquitos e papagaios; répteis de estimação, como tartarugas, lagartos e cobras; e animais de estimação aquáticos, como peixes tropicais e rãs.

[000216] Os termos "composição para ração animal", "ração"e "forragem"são usados de forma intercambiável e podem compreender um ou mais materiais de ração selecionados a partir do grupo compreendendo a) cereais, como grãos pequenos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como milho ou sorgo; b) subprodutos de cereais, como farinha de glúten de milho, solúveis de grão seco de destilaria (DDGS) (particularmente solúveis de grão seco de destilaria à base de milho (cDDGS), fibra de trigo, farelo de trigo, fragmentos de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, palmiste e polpa de cítricos, c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, favas, algodão, canola, farinha de peixe, proteína plasmática seca, farinha de carne e ossos, proteína de batata, soro de leite, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidas a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.

6. Composições e uso para desengomadura têxtil

[000217] Também são contempladas composições e métodos de tratamento de tecidos (por exemplo, para desengomar uma matéria têxtil) com o uso de uma amilase. Métodos para tratamento de tecido são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, a patente US n° 6.077.316). Por exemplo, a sensação tátil e aparência de um tecido podem ser aprimoradas por um método que compreende colocar o tecido em contato com uma uma amilase em uma solução. O tecido pode ser tratado com a solução sob pressão.

[000218] Uma amilase pode ser aplicada durante ou após a tecelagem de uma matéria têxtil ou durante o estágio de desengomadura, ou uma ou mais etapas de processamento de tecido adicionais. Durante a tecelagem dos têxteis, os fios são expostos a um alongamento mecânico considerável. Antes da tecelagem em teares mecânicos, os fios de urdidura são com frequência revestidos com amido de engomadura ou derivados de amido para aumentar sua resistência à tração e para evitar a ruptura. Uma amilase pode ser aplicada durante ou após a tecelagem para remover esses amido de engomadura ou derivado de amido. Após a tecelagem, uma amilase pode ser usada para remover o revestimento antes do processamento adicional do tecido para assegurar um resultado homogêneo e à prova de lavagem.

[000219] Uma amilase pode ser usada sozinha ou com outros reagentes químicos para desengomadura e/ou enzimas de desengomadura para desengomar tecidos, incluindo tecidos contendo algodão, como aditivos de detergentes, por exemplo, em composições aquosas. Uma amilase também pode ser usada em composições e métodos para produção de uma aparência desgastada em tecidos e roupas de brim tingidos de índigo. Para a fabricação de roupas, o tecido pode ser cortado e costurado em roupas ou peças de vestuário, que são acabadas posteriormente. Em particular, para a fabricação de jeans índigo, diferentes métodos de acabamento enzimático foram desenvolvidos. O acabamento de peças de vestuário em índigo é iniciado com uma etapa de desengomadura enzimática, durante a qual as peças são submetidas à ação de enzimas amilolíticas para fornecer maciez ao tecido e tornar o algodão mais acessível às etapas de acabamento enzimático subsequentes. Uma amilase pode ser usada em métodos de acabamento de peças de vestuário em índigo (por exemplo, um processo de "lavagem a pedra"biológico), desengomadura enzimática e proporcionando maciez aos tecidos e/ou processos de acabamento.

7. Composições de limpeza

[000220] Um aspecto das presentes composições e métodos é uma composição de limpeza que inclui uma amilase como um componente. Um polipeptídeo de amilase pode ser usado como um componente em composições detergentes para lavagem das mãos, lavagem de roupas, lavagem de louças e limpeza de outras superfícies duras.

7.1. Visão geral

[000221] De preferência, uma amilase é incorporada a detergentes em ou próximo a uma concentração convencionalmente usada para amilase em detergentes. Por exemplo, um polipeptídeo de amilase pode ser adicionado em quantidade que corresponde a 0,00001 - 1 mg (calculada como proteína de enzima pura) de amilase por litro de líquido para lavagem. Formulações exemplificadoras são aqui fornecidas, como exemplificado pelos seguintes:

[000222] Um polipeptídeo de amilase pode ser um componente de uma composição detergente, como a única enzima ou com outras enzimas incluindo outras enzimas amilolíticas. Como tal, ela pode ser incluída na composição detergente sob a forma de um granulado sem pulverização, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida. Granulados sem pulverização podem ser produzidos, por exemplo, conforme apresentado nas patentes US n°s 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente revestidos pelo métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento ceroso são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com peso molar médio de 1.000 a 20.000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno álcoois graxos; ácidos graxos; e mono e di e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dadas em, por exemplo, GB 1483591. As preparações de enzima líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol como propilenoglicol, ou um açúcar ou ácool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico, de acordo com métodos estabelecidos. Outros estabilizantes enzimáticos são conhecidos na técnica. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método apresentado em EP 238 216. Os polióis a longo tempo têm sido reconhecidos como estabilizantes de proteína, e também para melhorar a solubilidade de proteínas.

[000223] A composição detergente pode estar em qualquer forma útil, por exemplo, na forma de pós, grânulos, pasta ou líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, contendo tipicamente até cerca de 70% de água e 0% a cerca de 30% de solvente orgânico. Também pode ser sob a forma de um gel compacto contendo apenas cerca de 30% de água.

[000224] As composições detergentes compreendem um ou mais tensoativos, cada um dos quais pode ser aniônico, não iônico, catiônico, ou zwiteriônico. O detergente normalmente conterá 0% a cerca de 50% de tensoativo aniônico, como alquilbenzenossulfonato linear (LAS); sulfonato de α-olefina (AOS); sulfato de alquilasulfato de alquila (sulfato de álcool graxo) (AS); etoxissulfato de álcool (AEOS ou AES); alcanossulfonatos secundários (SAS); metil ésteres de α-sulfo ácido graxo; ácido alquil- ou alquenilsuccínico; ou sabão. A composição pode conter também 0% a cerca de 40% de tensoativo não iônico como etoxilato de álcool (AEO ou AE), etoxilatos de álcool carboxilado, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graxo etoxilato, monoetanolamida de ácido graxo ou amida de ácido poli(hidroxialquil)-graxo (conforme descrito, por exemplo, em WO 92/06154).

[000225] A composição detergente pode, adicionalmente, compreender uma ou mais outras enzimas, como proteases, outra enzima amilolítica, cutinase, lipase, celulase, pectato liase, peridrolase, xilanase, peroxidase e/ou lacase em qualquer combinação.

[000226] O detergente pode conter cerca de 1% a cerca de 65% de um coadjuvante de detergente ou agente complexante como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA), ácido dietilenotriaminapenta- acético (DTMPA), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst). O detergente pode também ser sem coadjuvante, isto é, essencialmente livre de coadjuvante de detergente. As enzimas podem ser usadas em qualquer composição compatível com a estabilidade da enzima. As enzimas podem geralmente ser protegidas contra componentes com efeito prejudicial por formas conhecidas de encapsulação, por exemplo, por granulação ou sequestro de hidrogéis. As enzimas, e especificamente amilases, seja com ou sem domínios de ligação de amido, podem ser usadas em uma variedade de composições incluindo aplicações de lavagem de roupas e louças, limpadores de superfícies, assim como nas composições para produção de etanol de amido ou biomassa.

[000227] O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos incluem carboximetilcelulose (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietileneglicol (PEG), poli(vinil álcool) (PVA), policarboxilatos como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico e copolímeros de laurilmetacrilato/ácido acrílico.

[000228] O detergente pode conter um sistema de alvejamento que pode compreender uma fonte de H2O2 como peróxido de hidrogênio como perborato ou percarbonato, que pode ser combinado com um ativador de alvejamento de formação de perácido como tetra- acetiletilenodiamina (TAED) ou nonanoiloxibenzenossulfonato (NOBS). Alternativamente, o sistema de alvejante pode compreender peroxiácidos (por exemplo, os peroxiácidos do tipo amida, imida ou sulfona). O sistema de alvejamento também pode ser um sistema de alvejamento enzimático, por exemplo, peridrolase, como a descrita no pedido PCT internacional WO 2005/056783.

[000229] As enzimas da composição detergente podem ser estabilizadas com o uso de agentes estabilizantes convencionais, por exemplo, um poliol como propilenoglicol ou glicerol; um açúcar ou álcool de açúcar; ácido láctico; ácido bórico ou um derivado de ácido bórico como, por exemplo, um éster de borato aromático; e a composição pode ser formulada conforme descrito em, por exemplo, WO 92/19709 e WO 92/19708.

[000230] O detergente pode conter, também, outros ingredientes detergentes convencionais como, por exemplo, condicionadores de tecido incluindo argilas reforçadores de espuma, supressores de bolhas, agentes anticorrosão, agentes de suspensão de sujeira, agente antirredeposição de sujeira, corantes, bactericidas, inibidores de manchas, alvejantees ópticos ou perfumes.

[000231] O pH (medido em solução aquosa em concetração de uso) é geralmente neutral ou alcalino, por exemplo, pH de cerca de 7,0 a cerca de 11,0.

[000232] Formas específicas de composições detergentes para inclusão da presente α-amilase são descritas abaixo.

72..Composição detergente líquida para lavagem de roupas para tarefas pesadas (DLTP)

[000233] As composições detergentes líquida para lavagem de roupas para tarefas pesadas (DLTP) exemplificadoras incluem um tensoativo detersivo (10% a 40% em peso), incluindo um tensoativo aniônico detersivo (selecionado dentre um grupo de cadeia linear, ramificada ou aleatória, sulfato de alquilasulfato de alquilas substituídos ou não substituídos, alquilsulfonatos, sulfato alcoxilado de alquila, alquilfosfatos, alquilfosfonatos, alquilcarboxilatos e/ou misturas dos mesmos) e opcionalmente tensoativo não iônico (selecionado dentre um grupo de cadeia linear, ramificada ou aleatória, álcool alcoxilado de alquila substituído ou não substituído, por exemplo um C8-C18 álcool alcoxilado de alquila e/ou alcoxilatos de alquilfenol C6-C12), em que a razão entre o peso do tensoativo aniônico detersivo (com um índice hidrofílico (HIc) de 6,0 a 9) e o peso do tensoativo detersivo não iônico é maior que 1: 1. Tensoativos detersivos adequados também incluem tensoativos detersivos catiônicos (selecionados dentre um grupo de compostos de alquilpiridínio, compostos de amônio quaternário de alquila, compostos de fosfônio quaternário de alquila, compostos de sulfônio ternário de alquila e/ou misturas dos mesmos); tensoativos detersivos zwiteriônicos e/ou anfotéricos (selecionados dentre um grupo de alcanolamina sulfobetaínas); tensoativos anfolíticos; tensoativos não iônicos semipolares e misturas dos mesmos.

[000234] A composição pode opcionalmente incluir um polímero de reforço de surfactância que consiste em polímeros para limpeza de graxas\gorduras anfifílicas alcoxiladas (selecionado dentre um grupo de polímeros alcoxilados tendo propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas ramificadas, como polialquileno iminas alcoxiladas na faixa de 0,05 % em peso a 10 % em peso) e/ou polímeros de enxerto aleatório(tipicamente compreendendo cadeia principal hidrofílicacompreendendo monômeros selecionados do grupo que consiste em: Ácidos carboxílicos insaturados C1-C6, éteres, álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres, unidades de açúcar, unidades de alcóxi, anidrido maléico, poliálcoois saturados como glicerol e misturas dos mesmos; e cadeia(s) lateral(é) hidrofóbica(s) selecionada(s) do grupo que consiste em: grupo alquila, polipropileno, polibutileno, éster vinílico C4-C25 de um ácido monocarboxílico C1-C6 saturado, éster alquílico C1-C6 de ácido acrílico ou metacrílico e misturas dos mesmos.

[000235] A composição pode incluir polímeros adicionais como polímeros de liberação de sujeiras (incluem poliésteres com terminal de cadeia anionicamente bloqueado, por exemplo SRP1, polímeros compreendendo ao menos uma unidade monomérica selecionada dentre sacarídeo, ácido dicarboxílico, poliol e combinações dos mesmos, em configuração aleatória ou em bloco, polímeros à base de tereftalato de etileno e copolímeros dos mesmos em configuração aleatória ou em bloco, por exemplo Repel-o-tex SF, SF-2 e SRP6, Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 e SRN325, Marloquest SL), polímeros antirredeposição (0,1 % em peso a 10 % em peso, incluem polímeros de carboxilato, como polímeros compreendendo ao menos um monômero selecionado dentre ácido acrílico, ácido maleico (ou anidrido maléico), ácido fumárico, ácido itacônico, ácido aconítico, ácido mesacônico, ácido citracônico, ácido metileno malônico e qualquer mistura dos mesmos, homopolímero vinilpirrolidona e/ou polietilenoglicol, peso molecular na faixa de 500 a 100.000 Da); polímero celulósico (incluindo aqueles selecionados dentre alquilcelulose, alquilalcoxialquilcelulose, carboxialquilcelulose, alquilcarboxialquilcelulose, cujos exemplos incluemcarboximetilcelulose, metilcelulose, metil-hidroxietilcelulose,metilcarboximetilcelulose e misturas dos mesmos) e carboxilato polimérico (como copolímero aleatório de maleato/acrilato ou homopolímero poliacrilato).

[000236] A composição pode incluir ainda ácido graxo saturado ou insaturado, de preferência ácido graxo C12-C24 saturado ou insaturado (0 % em peso a 10 % em peso); auxiliares para deposição (cujos exemplos incluem polissacarídeos, de preferência polímeros celulósicos, haletos de polidialildimetilamônio (DADMAC) e copolímeros de DAD MAC com vinilpirrolidona, acrilamidas, imidazolas, haletos de imidazolínio e misturas dos mesmos, em configuração aleatória ou em bloco, goma guar catiônica, celulose catiônica como hidroxietilcelulose catiônica, amido catiônico, poliacilamidas catiônicas e misturas dos mesmos.

[000237] A composição pode incluir ainda agentes inibidores de transferência de corantes, cujos exemplos incluem ftalocianina de manganês, peroxidases, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de poliamina N-óxido, copolímeros de N-vinil pirrolidona e N-vinil imidazol, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazoles e/ou misturas dos mesmos; agentes quelantes, cujos exemplos incluem ácido etilenodiaminatetra- acético (EDTA), ácido de dietilenotriaminapenta(metilenofosfônico) (DTPMP), ácido hidroxietanodifosfônico (HEDP), ácido etilenodiamina N,N'-dissuccínico (EDDS), ácido metilglicinadiacético (MGDA), ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA), ácido propilenodiaminatetra- acético (PDT A), 2-hidroxipiridina-N-óxido (HPNO) ou ácido metilglicinadiacético (MGDA), ácido glutâmico ácido N,N-diacético (sal de ácido N,N-dicarboximetilglutâmico tetrassódio (GLDA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido 4,5-di-hidróxi-m-benzenodissulfônico, ácido cítrico e qualquer sais dos mesmos, ácido N- hidroxietiletilenodiaminatriacético (HEDTA) ácido trietilenotetra-amina- hexacético (TTHA), ácido N-hidroxietiliminodiacético (HEIDA), di- hidroxietilglicina (DHEG), ácido etilenodiaminatetrapropiônico (EDTP) e derivados dos mesmos.

[000238] A composição incluía de preferência enzimas (geralmente cerca de 0,01 % em peso de enzima ativo a 0,03 % em peso de enzima ativa) selecionado dentre proteases, amilases, lipases, celulases, colina oxidases, peroxidases/oxidases, pectato liases, mananases, cutinases, lacases, fosfolipases, lisofosfolipases, aciltransferases, peridrolases, arilesterases e qualquer mistura dos mesmos. A composição pode incluir um estabilizante de enzima (exemplos dos quais incluem polióis como propilenoglicol ou glicerol, açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, inibidores reversíveis de protease, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático ou um derivado de ácido fenilborônico como ácido 4-formilfenilborônico).

[000239] A composição opcionalmente inclui silicone ou supressores de espuma à base de ácido graxo; corantes, cátions de cálcio e magnésio, ingredientes de sinalização visual, antiespuma (0,001 % em peso a cerca de 4,0 % em peso) e/ou estruturante/espessante (0,01 % em peso a 5 % em peso, selecionada do grupo que consiste em diglicerídeos e triglicerídeos, diestearato de etilenoglicol, celulose microcristalina, materiais à base de celulose, celulose de microfibra, biopolímeros, Goma xantana, goma gelana e misturas dos mesmos).

[000240] A composição pode ser qualquer forma líquida, por exemplo uma forma líquida ou gel, ou qualquer combinação das mesmas. A composição pode estar em qualquer forma de dose unitária, por exemplo, um saco de contenção.

7.3. Composição detergente sólida/líquida para lavagem de roupas para tarefas pesadas (HDD)

[000241] As composições detergentes para lavagem de roupas HDD exemplificadoras incluem um tensoativo detersivo, incluindo tensoativos detersivos aniônicos (por exemplo, cadeia linear, ramificada ou aleatória, sulfato de alquilasulfato de alquilas substituídos ou não substituídos, alquilsulfonatos, sulfato alcoxilado de alquila, fosfatos de alquila, fosfonatos de alquila, carboxilatos de alquila e/ou misturas dos mesmos), tensoativo detersivo não iônico (por exemplo, cadeia linear, ramificada ou aleatória, etoxilatos de alquila C8-C18 e/ou alcoxilatos de alquilfenol C6-C12) substituídos ou não substituídos, tensoativos detersivos catiônicos (por exemplo, compostos de alquilpiridínio, compostos de amônio alquil quaternário, compostos de fosfônio alquil quaternário, compostos de alquilsulfônio ternário e misturas dos mesmos), tensoativos detersivos zwiteriônicos e/ou anfotéricos (por exemplo, alcanolamina sulfobetaínas), tensoativos anfolíticos, tensoativos semipolares não iônicos e misturas dos mesmos; agentes reforçadores incluindo agentes reforçadores isentos de fosfato (por exemplo, exemplos de agentes reforçadores de zeólito que incluem zeólito A, zeólito X, zeólito P e zeólito MAP na faixa de 0 % em peso a menos de 10 % em peso), agentes reforçadores à base de fostato (por exemplo, tripolifosfato de sódio na faixa de 0 % em peso a menos de 10 % em peso), ácido cítrico, sais de citrato e ácido nitrilotriacético, sal de silicato (por exemplo, silicato de sódio ou potássio ou metassilicato de sódio na faixa de 0 % em peso a menos de 10 % em peso, ou silicato em camadas (SKS-6)); sal de carbonato (por exemplo, carbonato de sódio e/ou bicarbonato de sódio na faixa de 0 % em peso a menos de 80 % em peso); e agentes alvejantes incluindo fotobranqueadores (por exemplo, ftalocianinas de zinco sulfonatadas, ftalocianinas de alumínio sulfonatadas, corantes de xanteno e misturas dos mesmos) ativadores de alvejante hidrofóbicos ou hidrofílicos (por exemplo, oxibenzenossulfonato de dodecanoila, oxibenzenossulfonato de decanoíla, ácido oxibenzoico de decanoíla ou sais dos mesmos, oxibenzenossulfonato de 3,5,5-trimetil-hexanoíla, tetra-acetiletilenodiamina-TAED, nonanoiloxibenzenossulfonato-NOBS,nitrilo quaternários e misturas dos mesmos), fontes de peróxido de hidrogênio (por exemplo, sais de peridrato inorgânico cujos exemplos incluem sal de sódio mono ou tetra-hidrato de perborato, percarbonato, persulfato, perfosfato ou persilicato), perácidos pré-formada hidrofílico e/ou hidrofóbicos (por exemplo, ácidos e sais percarboxílicos, ácidos e sais percarbônicos, ácidos e sais perimídicos, ácidos e sais peroximonossulfúricos e misturas dos mesmos) e/ou catalisadores de alvejamento (por exemplo, reforçadores de alvejante imina (cujos exemplos incluem cátions e poli-íons de imínio), zwiteríons de imínio, aminas modificadas, óxidos de amina modificados, N-sulfoniliminas, N- fosfoniliminas, N-aciliminas, dióxidos de tiadiazol, perfluoroiminas, cetonas de açúcar cíclico e misturas dos mesmos e catalisadores de alvejamento contendo metal (por exemplo, cátions de cobre, ferro, titânio, rutênio, tungstênio, molibdênio ou manganês junto com cátions de metal auxiliares como zinco ou alumínio e um sequestrado como ácido etilenodiaminotetra-acético, ácidoetilenodiaminatetra(metilenofosfônico) e sais solúveis em água dos mesmos).

[000242] A composição de preferência inclui enzimas, por exemplo, proteases, amilases, lipases, celulases, oxidases de colina, peroxidases/oxidases, pectato liases, mananases, cutinases, lacases, fosfolipases, lisofosfolipases, aciltransferase, peridrolase, arilesterase e qualquer mistura dos mesmos.

[000243] A composição pode incluir opcionalmente ingredientes detergentes adicionais incluindo microcápsulas de perfume, acorde de perfume encapsulado em amido, agentes de matiz, polímeros adicionais, incluindo integridade de tecidos e polímeros catiônicos, ingredientes corante-trava, agentes amaciantes de tecido, alvejantees (por exemplo, alvejantees fluorescentes I.C.), agentes floculantes, agentes quelantes, poliaminas alcoxiladas, auxiliares de deposição de tecido e/ou ciclodextrina.

7.4. Composição detergente para lavagem de louças automática (ADW)

[000244] A composição detergente ADW exemplificadora inclui tensoativos não iônicos, incluindo tensoativos etoxilados não iônicos, tensoativos de álcool alcoxilado, álcoois poli(oxialquilados) terminados com epóxi ou tensoativos de óxido de amina presentes em quantidades de 0 a 10% em peso; agentes reforçadores na faixa de 5 a 60% incluindo agentes reforçadores à base de fostato (por exemplo, monofosfatos, difosfatos, tripolifosfatos, outros polifosfatos oligomèricos, tripolifosfato de sódio-STPP) e agentes reforçadores livres de fosfato (por exemplo, compostos à base de aminoácido incluindo ácido metilglicinadiacético (MGDA) e sais e derivados dos mesmos, ácido glutâmico-N,N-diacético (GLDA) e sais e derivados dos mesmos, ácido iminodissuccínico (IDS) e sais e derivados dos mesmos, carboximetilinulina e sais e derivados dos mesmos, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido dietilenotriaminapenta- acético (DTPA), ácido B-alaninadiacético (B-ADA) e seus sais, homopolímeros e copolímeros de ácidos policarboxílicos e seus sais parcial ou completamente neutralizados, ácidos monoméricos policarboxílicos e ácidos hidroxicarboxílicos e seus sais na faixa de 0,5% a 50% em peso; polímeros sulfonatados/carboxilados na faixa de cerca de 0,1% a cerca de 50% em peso para fornecer estabilidade dimensional; auxiliares de secagem na faixa de cerca de 0,1% a cerca de 10% em peso (por exemplo, poliésteres, especificamente poliésteres aniônicos, opcionalmente junto com outros monômeros com 3 a 6 funcionalidades - tipicamente funcionalidades de ácido, álcool ou éster que são propícias para compostos ou compostos precursores de policondensação, policarbonato-, poliuretano- e/ou poliureia- poliorganossiloxano dos mesmos, particularmente do tipo carbonato cíclico reativo e ureia); silicatos na faixa de cerca de 1 % a cerca de 20% em peso (incluindo silicatos de sódio ou potássio, por exemplo, dissilicato de sódio, metassilicato de sódio e filossilicatos cristalinos); alvejante inorgânico (por exemplo, sais de peridrato como sais de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato e persilicato) e alvejante orgânico (por exemplo, peroxiácidos orgânicos, incluindo diacil e tetra- acil peróxidos, especificamente ácido diperoxidodecanodioico, ácido diperoxitetradecanodioico e ácido diperóoxi-hexadecanodioico); ativadores de alvejante (isto é, precursores de perácidos orgânicos na faixa de cerca de 0,1% a cerca de 10% em peso); catalisadores de alvejamento (por exemplo, triazociclononano de manganês e complexos relacionados, Co, Cu, Mn e Fe bispiridilamina e complexos relacionados e acetato de penta-amina de cobalto(III) e complexos relacionados); agentes para tratamento de metais na faixa de cerca de 0,1% a 5% em peso (por exemplo, benzatriazolas, sais de metal e complexos e/ou silicatos); enzimas na faixa de cerca de 0,01 a 5,0 mg de enzima ativa por grama de composição detergente para lavagem de louças automática (por exemplo, proteases, amilases, lipases, celulases, oxidases de colina, peroxidases/oxidases, pectato liases, mananases, cutinases, lacases, fosfolipases, lisofosfolipases, aciltransferase, peridrolase, arilesterase e misturas dos mesmos); e componentes estabilizantes de enzima (por exemplo, oligossacarídeos, polissacarídeos e sais de metal inorgânico divalente).

7.5. Composições detergentes adicionais

[000245] Formulações detergentes adicionais exemplificadoras às quais a presente amilase pode ser adicionada são descritas, abaixo, nos parágrafos numerados.

[000246] 1) Uma composição detergente formulada como umgranulado tendo uma densidade aparente de ao menos 600 g/l compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 7% a cerca de 12%; etoxissulfato de álcool (por exemplo, álcool C12-18, 1-2 óxido de etileno (EO)) ou sulfato de alquilasulfato de alquila (por exemplo, C16-18) cerca de 1% a cerca de 4%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C14-15, 7 EO) cerca de 5% a cerca de 9%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) cerca de 14% a cerca de 20%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2SiO2) cerca de 2 a cerca de 6%; zeólito (por exemplo, NaA1SiO4) cerca de 15% a cerca de 22%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a cerca de 6%; citrato de sódio/ácido cítrico (por exemplo, C6H5Na3O7/C6H8O7) cerca de 0% a cerca de 15%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3H2O) cerca de 11% a cerca de 18%; TAED cerca de 2% a cerca de 6%; carboximetilcelulose (CMC) e 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, ácido maleico/acrílico, copolímero, PVP, PEG) 0 a 3%; enzimas (calculadas como enzima pura) 0,0001 a 0,1% de proteína; e ingredientes secundários (por exemplo, supressores de espuma, perfumes, alvejante óptico, fotobranqueador) 0 a 5%.

[000247] 2) Uma composição detergente formulada como umgranulado tendo uma densidade aparente de ao menos 600 g/l compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 6% a cerca de 11%; etoxissulfato de álcool (por exemplo, álcool C12-18, 1-2 EO) ou sulfato de alquilasulfato de alquila (por exemplo, C16-18) cerca de 1% a cerca de 3%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C14-15, 7 EO) cerca de 5% a cerca de 9%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) cerca de 15% a cerca de 21%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2SiO2) cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito (por exemplo, NaA1SiO4) cerca de 24% a cerca de 34%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) cerca de 4% a cerca de 10%; citrato de sódio/ácido cítrico (por exemplo, C6H5Na3O7/ C6H8O7) 0% a cerca de 15%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, ácido maleico/acrílico copolímero, PVP, PEG) 1 a 6%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; ingredientes secundários (por exemplo, supressores de espuma, perfume) 0 a 5%.

[000248] 3) Uma composição detergente formulada como umgranulado tendo uma densidade aparente de ao menos 600 g/l compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 5% a cerca de 9%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO) cerca de 7% a cerca de 14%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido graxo C16-22) cerca de 1 a cerca de 3%; carbonato de sódio (como Na2CO3) cerca de 10% a cerca de 17%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2SiO2) cerca de 3% a cerca de 9%; zeólito (como NaA1SiO4) cerca de 23% a cerca de 33%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a cerca de 4%; perborato de sódio (por exemplo,NaBO3H2O) cerca de 8% a cerca de 16%; TAED cerca de 2% a cerca de 8%; fosfonato (por exemplo, EDTMPA) 0% a cerca de 1%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, ácido maleico/acrílico copolímero, PVP, PEG) 0 a 3%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; ingredientes secundários (por exemplo, supressores de espuma, perfume, alvejante óptico) 0 a 5%.

[000249] 4) Uma composição detergente formulada como umgranulado tendo uma densidade aparente de ao menos 600 g/l compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 8% a cerca de 12%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C1215, 7 EO) cerca de 10% a cerca de 25%; carbonato de sódio (como Na2CO3) cerca de 14% a cerca de 22%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2SiO2) cerca de 1% a cerca de 5%; zeólito (por exemplo, NaA1SiO4) cerca de 25% a cerca de 35%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a cerca de 10%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, ácido maleico/acrílico copolímero, PVP, PEG) 1 a 3%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, supressores de espuma, perfume) 0 a 5%.

[000250] 5) Uma composição detergente líquida aquosacompreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 15% a cerca de 21%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C1215, 7 EO ou álcool C12-15, 5 EO) cerca de 12% a cerca de 18%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido oléico) cerca de 3% a cerca de 13%; ácido alquenilsuccínico (C12-14) 0% a cerca de 13%; aminoetanol cerca de 8% a cerca de 18%; ácido cítrico cerca de 2% a cerca de 8%; fosfonato 0% a cerca de 3%; polímeros (por exemplo, PVP, PEG) 0% a cerca de 3%; borato (por exemplo, B4O7) 0% a cerca de 2%; etanol 0% a cerca de 3%; propilenoglicol cerca de 8% a cerca de 14%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, dispersantes, supressores de espuma, perfume, alvejante óptico) 0 a 5%.

[000251] 6) Uma composição detergente líquida aquosa estruturadacompreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 15% a cerca de 21%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C1215, 7 EO ou álcool C12-15, 5 EO) 3 a 9%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido oléico) cerca de 3% a cerca de 10%; zeólito (como NaA1SiO4) cerca de 14% a cerca de 22%; citrato de potássio cerca de 9% a cerca de 18%; borato (por exemplo, B4O7) 0% a cerca de 2%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, PEG, PVP) 0% a cerca de 3%; polímeros de ancoramento como, por exemplo, laurilmetacrilato/copolímero de ácido acrílico; razão molar 25:1, MW 3800) 0% a cerca de 3%; glicerol 0% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, dispersantes, supressores de espuma, perfume, alvejantees ópticos) 0 a 5%.

[000252] 7) Uma composição detergente formulada como umgranulado tendo uma densidade aparente de ao menos 600 g/l compreendendo sulfato de álcool graxo cerca de 5% a cerca de 10%; monoetanolamida de ácido graxo etoxilado cerca de 3% a cerca de 9%; sabão como ácido graxo 0 a 3%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) cerca de 5% a cerca de 10%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2SiO2) cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito (por exemplo, NaA1SiO4) cerca de 20% a cerca de 40%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) cerca de 2% a cerca de 8%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3H2O) cerca de 12% a cerca de 18%; TAED cerca de 2% a cerca de 7%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG) cerca de 1% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, alvejante óptico, supressores de espuma, perfume) 0 a 5%.

[000253] 8) Uma composição detergente formulada como umgranulado compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 8% a cerca de 14%; monoetanolamida de ácido graxo etoxilado cerca de 5% a cerca de 11%; sabão como ácido graxo 0% a cerca de 3%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) cerca de 4% a cerca de 10%; silicato solúvel (Na2O, 2SiO2) cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito (por exemplo, NaA1SiO4) cerca de 30% a cerca de 50%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) cerca de 3% a cerca de 11%; citrato de sódio (por exemplo, C6H5Na3O7) cerca de 5% a cerca de 12%; polímeros (por exemplo, PVP, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG) cerca de 1% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, supressores de espuma, perfume) 0 a 5%.

[000254] 9) Uma composição detergente formulada como umgranulado compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 6% a cerca de 12%; tensoativo não iônico cerca de 1% a cerca de 4%; sabão como ácido graxo cerca de 2% a cerca de 6%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) cerca de 14% a cerca de 22%; zeólito (por exemplo, NaA1SiO4) cerca de 18% a cerca de 32%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) cerca de 5% a cerca de 20%; citrato de sódio (por exemplo, C6H5Na3O7) cerca de 3% a cerca de 8%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3H2O) cerca de 4% a cerca de 9%; ativador de alvejante (por exemplo, NOBS ou TAED) cerca de 1% a cerca de 5%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, policarboxilato ou PEG) cerca de 1% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, alvejante óptico, perfume) 0 a 5%.

[000255] 10) Uma composição detergente líquida aquosacompreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 15% a cerca de 23%; etoxissulfato de álcool (por exemplo, álcool C12-15, 2-3 EO) cerca de 8% a cerca de 15%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO ou álcool C12-15, 5 EO) cerca de 3% a cerca de 9%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido láurico) 0% a cerca de 3%; aminoetanol cerca de 1% a cerca de 5%; citrato de sódio cerca de 5% a cerca de 10%; hidrótropo (por exemplo, toluenssulfonato de sódio) cerca de 2% a cerca de 6%; borato (por exemplo, B4O7) 0% a cerca de 2%; carboximetilcelulose 0% a cerca de 1%; etanol cerca de 1% a cerca de 3%; propilenoglicol cerca de 2% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, polímeros, dispersantes, perfume, alvejantees ópticos) 0 a 5%.

[000256] 11) Uma composição detergente líquida aquosacompreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 20% a cerca de 32%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C12- 15, 7 EO ou álcool C12-15, 5 EO) 6 a 12%; aminoetanol cerca de 2% a cerca de 6%; ácido cítrico cerca de 8% a cerca de 14%; borato (por exemplo, B4O7) cerca de 1% a cerca de 3%; polímero (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, polímero de ancoramento como, por exemplo, copolímero de ácido laurilmetacrilato/acrílico) 0% a cerca de 3%; glicerol cerca de 3% a cerca de 8%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, hidrótropos, dispersantes, perfume, alvejantees ópticos) 0 a 5%.

[000257] 12) Uma composição detergente formulada como umgranulado tendo uma densidade aparente de ao menos 600 g/l compreendendo tensoativo aniônico (alquilbenzenossulfonato linear, sulfato de alquilasulfato de alquila, α-olefinsulfonato, α-sulfo ácido graxo metil ésteres, alcanossulfatos, sabão) cerca de 25% a cerca de 40%; tensoativo não iônico (por exemplo, etoxilato de álcool) cerca de 1% a cerca de 10%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) cerca de 8% a cerca de 25%; silicatos solúveis (por exemplo, Na2O, 2SiO2) cerca de 5% a cerca de 15%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a cerca de 5%; zeólito (NaA1SiO4) cerca de 15% a cerca de 28%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3'4H2O) 0% a cerca de 20%; ativador de alvejante (TAED ou NOBS) cerca de 0% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; ingredientes secundários (por exemplo, perfume, alvejantees ópticos) 0 a 3%.

[000258] 13) Composições de detergente conforme descrito nas composições 1)-12) supra, sendo que todo ou parte do alquilbenzenossulfonato linear é substituído por sulfato de alquilasulfato de alquila (C12-C18).

[000259] 14) Uma composição detergente formulada como umgranulado tendo uma densidade aparente de ao menos 600 g/l (C12-C18) compreendendo sulfato de alquilasulfato de alquila cerca de 9% a cerca de 15%; álcool etoxilato cerca de 3% a cerca de 6%; amida de ácido poli-hidroxialquil-graxo cerca de 1% a cerca de 5%; zeólito (por exemplo, NaA1SiO4) cerca de 10% a cerca de 20%; dissilicato em camadas (por exemplo, SK56 da Hoechst) cerca de 10% a cerca de 20%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) cerca de 3% a cerca de 12%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2SiO2) 0% a cerca de 6%; citrato de sódio cerca de 4% a cerca de 8%; percarbonato de sódio cerca de 13% a cerca de 22%; TAED cerca de 3% a cerca de 8%; polímeros (por exemplo, policarboxilatos e PVP) 0% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, alvejante óptico, fotobranqueador, perfume, supressores de espuma) 0 a 5%.

[000260] 15) Uma composição detergente formulada como umgranulado tendo uma densidade aparente de ao menos 600 g/l (C12-C18) compreendendo sulfato de alquilasulfato de alquila cerca de 4% a cerca de 8%; álcool etoxilato cerca de 11% a cerca de 15%; sabão cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito MAP ou zeólito A cerca de 35% a cerca de 45%; carbonato de sódio (como Na2CO3) cerca de 2% a cerca de 8%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2SiO2) 0% a cerca de 4%; percarbonato de sódio cerca de 13% a cerca de 22%; TAED 1 a 8%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 3%; polímeros (por exemplo, policarboxilatos e PVP) 0% a cerca de 3%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, alvejante óptico, fosfonato, perfume) 0 a 3%.

[000261] 16) As formulações de detergentes são descritas em 1)-15)supra, que contém um perácido estabilizado ou encapsulado, seja como um componente adicional ou como um substituto para sistemas alvejantes já especificados.

[000262] 17) As composições detergentes conforme descrito supraem 1), 3), 7), 9), e 12), sendo que o perborato é substituído por percarbonato.

[000263] 18) As composições detergentes são descritas supra em 1),3), 7), 9), 12), 14) e 15), que contêm adicionalmente um catalisador de manganês. O catalisador de manganês, por exemplo, é um dos compostos descritos em "Catalisadores eficientes de manganês para alvejamento em baixa temperatura,"Nature 369: 637-639 (1994).

[000264] 19) A composição detergente formulada como um líquidodetergente não aquoso que compreende um tensoativo líquido não iônico como, por exemplo, álcool primário alcoxilado linear, um sistema coadjuvante (por exemplo, fosfato), uma enzima e álcali. O detergente pode, também, compreender o tensoativo aniônico e/ou um sistema de alvejamento.

[000265] Como acima, o polipeptídeo de amilase presente pode ser incorporado a uma concentração convencionalmente empregada em detergentes. Contempla-se atualmente que, na composição detergente, a enzima pode ser adicionada em uma quantidade correspondente a 0,00001 a 1,0 mg (calculada como proteína de enzima pura) de polipeptídeo de amilase por litro de líquido de lavagem.

[000266] A composição detergente pode, também, conter ingredientes detergentes convencionais, por exemplo, material defloculante, material de carga, depressores de espuma, agentes anticorrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes sequestrantes, agente de antirredeposição de sujeira, agentes desidratantes, corantes, bactericidas, fluorescedores, espessantes e perfumes.

[000267] A composição detergente pode ser formulada como uma composição detergente para lavagem manual (à mão) ou à máquina, incluindo uma composição aditiva para lavagem adequada para pré- tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciante de tecidos com enxaguante adicionado, ou pode ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza doméstica geral de superfícies duras, ou pode ser formulada para operações de lavagem de louças manual ou automática.

[000268] Quaisquer composições de limpeza descritas na presente invenção pode incluir qualquer número de enzimas adicionais. Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) escolhida(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado (por exemplo, com relação a pH ideal, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos e outros) e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes. As seguintes enzimas são fornecidas como exemplos.

[000269] Proteases: As proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. Mutantes quimicamente modificado ou obtido mediante engenharia de proteínas são incluídos, assim como proteínas naturalmente processadas. A protease pode ser uma protease de serina ou uma metaloprotease, uma protease microbiana alcalina, uma protease tipo tripsina ou uma protease tipo quimotripsina. Exemplos de proteases alcalinas são as subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (consulte, por exemplo, WO 89/06279). Exemplos de proteases tipo tripsina são tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina), e Fusarium proteases (consulte, por exemplo, WO 89/06270 e WO 94/25583). Exemplos de proteases úteis incluem, mas não se limitam às variantes descritas no WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 e WO 98/34946. Enzimas protease disponíveis para comercialização incluem mas não se limitam a: ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE™, DURALASE™, ESPERASE®, KANNASE™ e BLAZE™ (Novo Nordisk A/S e Novozymes A/S); MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT OXP™, FN2™ e FN3™ (Danisco US Inc.). Outras proteases exemplificadoras incluem NprE from Bacillus amyloliquifaciens e ASP da cepa Cellulomonas sp. 69B4.

[000270] Lipases: Lipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes quimicamente modificado, proteoliticamente modificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas são incluídos. Exemplos de lipases úteis incluem mas não se limitam a lipases de Humicola(sinônimo de Thermomyces), por exemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) (consulte, por exemplo, EP 258068 e EP 305216), de H. insolens (consulte, por exemplo, WO 96/13580); uma lipase de Pseudomonas (por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes; consulte, por exemplo, EP 218 272), P. cepacia (consulte, por exemplo, EP 331 376), P. stutzeri (consulte, por exemplo, GB 1.372.034), P. fluorescens, cepa Pseudomonas sp. SD 705 (consulte, por exemplo, WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (consulte, por exemplo, WO 96/12012); uma lipase Bacillus (por exemplo, de B. subtilis; consulte, por exemplo, Dartois et al. Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)), B. stearothermophilus (consulte, por exemplo, JP 64/744992) ou B. pumilus (consulte, por exemplo, WO 91/16422). Lipases variantes adicionais contempladas para uso nas formulações incluem as descritas, por exemplo, em: WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225 e EP 260105. Algumas enzimas lipase comercialmente disponíveis incluem LIPOLASE® e LIPOLASE ULTRA™ (Novo Nordisk A/S e Novozymes A/S).

[000271] Poliesterases: Poliesterases adequadas pode ser incluídas na composição, como as descritas em, por exemplo, WO 01/34899, WO 01/14629 e US6933140.

[000272] Amilases: As composições podem ser combinadas com outras amilases, como amilase aprimorada sem produção. Essas incluem amilases disponíveis comercialmente, como por exemplo, mas sem limitação, STAINZYME®, NATALASE®, DURAMYL®,TERMAMYL®, FUNGAMYL® e BAN™ (Novo Nordisk A/S e Novozymes A/S); RAPIDASE®, POWERASE®, e PURASTAR® (da Danisco US Inc.).

[000273] Celulases: As celulases podem ser adicionadas às composições. Celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes quimicamente modificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas são incluídos. Celulases adequadas incluem Celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celulases fúngicas produzidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum apresentados, por exemplo, nas patentes US n°s 4.435.307; 5.648.263; 5.691.178; 5.776.757; e WO 89/09259. Celulases exemplificadoras contempladas para uso são aquelas tendo benefício de proteção da cor para os têxteis. Exemplos de tais celulases são as celulases descritas em, por exemplo, EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397 e WO 98/08940. Outros exemplos são as variantes de celulase, como aquelas descritas no WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315; patentes US n°s 5.457.046; 5.686.593; e 5.763.254. Celulases comercialmentedisponíveis incluem CELLUZYME® e CAREZYME® (Novo Nordisk A/S e Novozymes A/S); CLAZINASE® e PURADAX HA® (Danisco US Inc.); e KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

[000274] Peroxidases/Oxidases: As peroxidases/oxidases adequadas contempladas para uso nas composições incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. Mutantes quimicamente modificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas são incluídos. Exemplos úteis de peroxidases incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus, e variantes das mesmas como aquelas descritas no WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257. Peroxidases comercialmente disponíveis incluem, por exemplo GUARDZYME™ (Novo Nordisk A/S e Novozymes A/S).

[000275] A composição detergente também pode compreender 2,6-β- D-fructan hidrolase, que é eficaz para remoção/limpeza de biofilme presente em matéria têxtil/lavanderia doméstica e/ou industrial.

[000276] A(s) enzima(s) detergente(s) pode(m) ser incluída(s) em uma composição detergente pela adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou pela adição de uma aditiva combinada compreendendo todas essas enzimas. Um aditivo detergente, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, um líquido, uma pasta fluida e similares. Formulações detergentes aditivas exemplficadoras incluem, mas não se limitam a, granulados, em particular granulados sem salpicamento de pó, líquidos, em particular líquidos ou pastas aquosas estabilizadas.

[000277] Granulados sem pulverização podem ser produzidos, por exemplo, conforme apresentado nas patentes US n°s 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente revestidos pelo métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento ceroso são produtos de poli(óxido de etileno) (, por exemplo, polietilenoglicol, PEG) com peso molar médio de 1.000 a 20.000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dadas em, por exemplo, GB 1483591. As preparações de enzima líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol como propilenoglicol, ou um açúcar ou ácool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico, de acordo com métodos estabelecidos. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método apresentado em EP 238.216.

[000278] A composição detergente pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, contendo tipicamente até cerca de 70% de água, e 0% a cerca de 30% de solvente orgânico. Os géis de detergente compactos contendo cerca de 30% ou menos água são também contemplados. A composição detergente pode, opcionalmente, compreender também um ou mais tensoativos adicionais, que podem ser não iônicos, incluindo semipolares e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou zwiteriônicos. Os tensoativos podem estar presentes em uma ampla gama, de cerca de 0,1% a cerca de 60% em peso.

[000279] Quando incluído nisso, o detergente conterá tipicamente de cerca de 1% a cerca de 40% de um tensoativo aniônico, como alquilbenzeno sulfonato linear, α-olefinsulfonato, sulfato de alquilasulfato de alquila (sulfato de álcool graxo), etoxissulfato de álcool, alcanossulfonato secundário, metil éster de ácido α-sulfo graxo, ácido alquil- ou alquenilsuccínico ou sabão.

[000280] Quando incluído nisso, o detergente conterá normalmente de cerca de 0,2% a cerca de 40% de um tensoativo não iônico como álcool etoxilato, nonilfenol etoxilato, alquilpoliglicosídeo, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graxo etoxilato, monoetanolamida de ácido graxo, amida de ácido poli-hidroxialquil- graxos, derivados N-acil-N-alquil de glucosamina ("glucamidas").

[000281] O detergente pode conter 0% a cerca de 65% de um coadjuvante de detergente ou agente complexante como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), ácido dietilenitriaminapenta- acético, ácido alquil- ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst).

[000282] O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Polímeros exemplificadores de incluem carboximetilcelulose (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenoglicol) (PEG), poli(vinil álcool) (PVA), poli(N-óxido de vinilpiridina), poli(vinilimidazol), policarboxilatos, por exemplo, poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico) e copolímeros de metacrilato/ácido acrílico.

[000283] A(s) enzima(s) da composição detergente pode(m) ser estabilizada(s) com o uso de agentes estabilizantes convencionais, por exemplo, poliol (por exemplo, propilenoglicol ou glicerol), um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico (por exemplo, um éster de borato aromático) ou um derivado de ácido fenilborônico (por exemplo, ácido 4-formilfenilborônico). A composição pode ser formulada conforme descrito no WO 92/19709 e WO 92/19708.

[000284] É contemplado que nas composições detergentes, em particular as variantes de enzima, pode ser adicionada uma quantidade correspondente a cerca de 0,01 a cerca de 100 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem (por exemplo, cerca de 0,05 a cerca de 5,0 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, ou 0,1 a cerca de 1,0 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem).

[000285] Mais formulações detergentes adicionais exemplificadoras às quais a presente amilase pode ser adicionada (ou é em alguns casos identificados como um componente) são mencionados nas seguintes Tabelas:

:

1Copolímero compreendendoi) monômeros do grupo de ácidos carboxílicos mono- ou poli- insaturadosii) monômeros com a seguinte fórmula geral R1(R2)C=C(R3)-X-R4, em que R1 a R3 denotam mútua e independentemente -H,-CH3 ou -C2H5, X denota um grupo espaçador opcionalmente presente que é selecionado dentre -CH2-,-C(O)O- e -C(O)-NH-, e R4 denota uma cadeia linear ou ramificada de resíduo de alquila saturada com 2 a 22 átomos de carbono ou denota um resíduo aromático insaturado de preferência com 6 a 22 átomos de carbonoiii) opcionalmente outros monômeros2 Tensoativo não iônico com a seguinte fórmula geral R1-CH(OH)CH20- (AO)w-(A'0)x-(A"0)y-(A"'0)z-R2, em que R1 denota um resíduo de alquila ou alquenila C6-24 de cadeia linear ou ramificada, saturada, ou monoou poli-insaturada; R2 denota um resíduo de hidrocarboneto linear ou ramificado com 2 a 26 átomos de carbono; A, A', A" e A'" denotam mútua e independentemente um resíduo do grupo compreendendo ---CH2CH2, -CH2CH2---CH2, ---CH2CH2--CH(CH3), CH2-CH2-CH2CH2, -CH2-CH- (CH3)-CH2-, -CH2-CH(CH2-CH3), w, x, y e z denotam valores entre 0,5 e 120, em que x, y e/ou z também pode ser 0.

[000286] A matriz à base de ácido graxo 1 é compreendida de 20 % em peso do sal de sódio de ácido graxo de coco, 50 % em peso de polióis não poliméricos (sorbitol, glicerina, propilenoglicol, sacarose e glicose), 15 % em peso de tensoativos aniônicos e não iônicos e 15 % em peso de água.

[000287] A matriz à base de ácido graxo 2 é compreendida de 20 % em peso do sal de sódio de ácido esteárico, 3 % em peso do sal de sódio de ácido láurico, 3 % em peso do sal de sódio de ácido mirístico, 50 % em peso de polióis não poliméricos (sorbitol, glicerina epropilenoglicol), 2 % em peso de ácido láurico, 2 % em peso de ácido esteárico, 10 % em peso de tensoativo aniônico e 10 % em peso de água.

7.6. Métodos de avaliação de atividade da amilase em composições detergentes

[000288] Inúmeros ensaios de limpeza de α-amilase são conhecidos na técnica, incluindo ensaios de retalho e microrretalho. Os Exemplos anexados descrevem apenas alguns desses ensaios.

[000289] Para ilustrar ainda mais as composições e métodos e vantagens dos mesmos, os seguintesexemplos específicos são dados com o entendimento de que são para fins ilustrativos e não limitadores.

8. Composições de fermentação

[000290] A presente amilase variante pode ser um componente de uma composição de fermentação usada em um processo de fermentação, isto é, fabricação de uma bebida de malte fermentada. Carboidratos não fermentáveis formam a maior parte dos sólidos dissolvidos na cerveja final. Esse resíduo permanece por causa da incapacidade das amilases de malte de hidrolisar as alfa-1,6-ligações do amido. Os carboidratos não fermentáveis contribuem com cerca de 50 calorias por 0,35 L (12 onças) de cerveja. Uma amilase, em combinação com uma glicoamilase e opcionalmente uma pululanase e/ou isoamilase, ajuda a converter o amido em dextrinas e açúcares fermentáveis, reduzindo os carboidratos não fermentáveis residuais na cerveja final.

[000291] As principais matérias-primas usadas na fabricação dessas bebidas são água, lúpulo e malte. Além disso, compostos auxiliares como grits de milho comuns, grits de milho refinados, levedura triturada de cervejaria, arroz, sorgo, amido de milho refinado, cevada, amido de cevada, cevada descascada, trigo, amido de trigo, cereal torrado, flocos de cereais, centeio, aveia, batata, tapioca, mandioca e xaropes, como xarope de milho, xarope de cana de açúcar, xarope de açúcar invertido, xarope de cevada e/ou de trigo e similares que possam ser usados como uma fonte de amido

[000292] Por várias razões, o malte, que é produzido principalmente a partir de variedades selecionadas de cevada, tem o maior efeito sobre o caráter geral e qualidade da cerveja. Primeiro, o malte é o agente flavorizante primário da cerveja. Segundo, o malte fornece a maior porção de açúcar fermentável. Terceiro, o malte fornece as proteínas, que contribuirão para o estrutura e caráter da espuma da cerveja. Quarto, o malte fornece a atividade enzimática necessária durante a maceração. O lúpulo também contribui significativamente para a qualidade da cerveja, incluindo especiarias. Em particular, lúpulo (ou constituintes de lúpulo) adicionam as substâncias amargas necessárias para a cerveja. Além disso, o lúpulo age como precipitante de proteína, estabelece agentes preservativos e auxiliam na formação e estabilização de espuma.

[000293] Grãos, como cevada, aveia, trigo, assim como componentes de plantas como milho, lúpulo e arroz, também são usados para fermentação, tanto na indústria como na produção caseira. Os componentes usados na fermentação podem ser maltados ou não, isto é, parcialmente germinados, resultando em um aumento dos níveis de enzimas, incluindo α-amilase. Para uma bem-sucedida fermentação, níveis adequados de atividade enzimática de α-amilase são necessários para assegurar os teores adequados de açúcares para fermentação. Uma amilase, isolada ou em combinação com outra(s) α-amilase(s), consequentemente pode ser adicionada aos componentes usados na fermentação.

[000294] Como usado aqui, o termo "solução estoque" significa grãos e componentes de plantas que são esmagados ou rompidos. Por exemplo, a cevada usada na produção de cerveja é um grão que foi grosseiramente moído ou esmagado para produzir uma consistência adequada para produção de um mingau para fermentação. Como usado aqui, o termo "solução estoque" inclui qualquer um dos tipos de plantas e grãos supracitados na forma esmagada ou grosseiramente moída. Os métodos da presente invenção aqui descritos podem ser usados para determinar os níveis de atividade de α-amilase tanto em farinha como em solução estoque.

[000295] Processos para fabricação de cerveja são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Wolfgang Kunze (2004) "Technology Brewing and Malting", Research and Teaching Institute of Brewing, Berlim, Alemanha (VLB), 3aedição. Resumidamente, o processo envolve: (a) preparar um mingau, (b) filtrar o mingau para preparar um mosto e (c) fermentar o mosto para obter uma bebida fermentada, como cerveja. Tipicamente, malte moído ou esmagado é misturado com água e mantido durante um período de tempo sob temperaturas controladas para permitir que as enzimas presentes no malte convertam o amido presente no malte em açúcares fermentáveis. O mingau é então transferido para um filtro de mingau onde o líquido é separado do resíduo de grãos. Esse líquido doce é chamado de "mosto", e o resíduo de grãos que sobra é chamado de "grão gasto", O mingau é tipicamente submetido a uma extração, que envolve adicionar água ao mingau para recuperar o extrato residual solúvel do grão gasto. O mosto é então vigorosamente fervido para ser esterilizado e ajudar a desenvolver a cor, sabor e aroma. O lúpulo é adicionado em algum momento durante a fervura. O mosto é resfriado e transferido para um fermentador.

[000296] O mosto é então posto em contato com levedura em um fermentador. O fermentador pode ser resfriado para parar a fermentação. A levedura flocula e é removida. Finalmente, a cerveja é resfriada e armazenada durante um período de tempo, durante o qual a cerveja clarifica e seu sabor se desenvolve, e qualquer material que possa prejudicar a aparência, sabor e vida útil da cerveja sedimenta. A cerveja normalmente contém de cerca de 2% a cerca de 10% v/v álcool, embora possa ser obtida cerveja com um teor mais alto de álcool, por exemplo, 18% v/v. Antes da embalagem, a cerveja é carbonatada e, opcionalmente, filtrada e pasteurizada.

[000297] A composição de fermentação compreendendo uma amilase, em combinação com uma glicoamilase e opcionalmente uma pululanase e/ou isoamilase, pode ser adicionada ao mingau da etapa (a) acima, isto é, durante a preparação do mingau. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição de fermentação pode ser adicionada ao mingau da etapa (b) acima, isto é, durante a filtração do mingau. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição de fermentação pode ser adicionada ao mosto da etapa (c) acima, isto é, durante a fermentação do mosto.

[000298] Uma bebida fermentada, como uma cerveja, pode ser produzida por um dos métodos acima. A bebida fermentada pode ser uma cerveja, como cerveja maltada completa, cerveja fermentada de acordo com a "Reinheitsgebot" (Lei da Pureza da Cerveja), ale, IPA, lager, bitter, Happoshu (segunda cerveja), terceira cerveja, "dry beer", "near beer", cerveja light, cerveja com baixo teor de álcool, cerveja de baixas calorias, porter, bock, stout, licor de malte, cerveja não alcoólica, licor de malte não alcoólico e similares, mas também bebidas alternativas de cereal e malte, como bebidas de malte com sabor de frutas, por exemplo, bebidas de malte com sabor de cítricos, como limão, laranja, lima ou de frutas vermelhas, bebidas de malte com sabor de destilados, por exemplo, licor de malte com sabor de vodka, rum ou tequila, ou bebidas de malte com sabor de café, como bebidas de malte com sabor de cafeína e similares.

9. Redução de amido iodo-positivo

[000299] Amilases variantes podem reduzir o amido iodo-positivo (IPS), quando usados em um método de liquefação e/ou sacarificação. Uma fonte de IPS é de amilose que escapa da hidrólise e/ou do polímero de amido retrogradado. A retrogradação de amido ocorre espontaneamente em uma pasta de amido ou gel em envelhecimento, por causa da tendência das moléculas de amido de se ligar umas às outras seguida de um aumento da cristalinidade. As soluções de baixa concentração tornam-se crescentemente turvas devido à associação progressiva de moléculas de amido em artigos maiores. A precipitação espontânea ocorre e o amido precipitado parece reverter-se à sua condição original de insolubilidade em água fria. As pastas de concentração mais alta durante o resfriamento formam um gel, que durante o envelhecimento torna-se mais firme de forma constante devido à associação crescente das moléculas de amido. Isso surge por causa da forte tendência de formação de ligação de hidrogênio entre os grupos hidróxi nas moléculas de amido adjacentes. Consulte J.A. Radley, ed., STARCH AND ITS DERIVATIVES 194-201 (Chapman e Hall, Londres (1968)).

[000300] A presença de IPS no liquor sacarídico afeta negativamente a qualidade do produto final e representa um problema importante no processamento a jusante. O IPS atua como um plugue ou retarda o sistema de filtração e obstrui as colunas de carbono usadas para purificação. Quando o IPS atinge níveis suficientemente altos, ele pode vazar através das colunas de carbono e diminuir a eficiência de produção. Adicionalmente, isso pode tornar o produto final nebuloso na armazenagem, o que é inaceitável para a qualidade do produto final. A quantidade de IPS pode ser reduzido isolando-se o tanque de sacarificação e misturando-se o conteúdo de volta. O IPS, porém, irá se acumular em colunas de carbono e sistemas de filtragem, entre outras coisas. Espera-se que o uso de amilases variantes otimize o desempenho geral do processo pela redução da quantidade de IPS.

[000301] Todas as referências mencionadas na presente invenção estão aqui incorporados, a título de referência em sua totalidade para todos os fins. Para ilustrar ainda mais as composições e métodos e vantagens dos mesmos, os seguintes exemplos específicos são dados com o entendimento de que são para fins ilustrativos e não limitadores.

Exemplos Exemplo 1: Ensaios

[000302] Nos exemplos a seguir, vários ensaios foram usados conforme estabelecido abaixo para facilidade de leitura. Quaisquer desvios dos protocolos fornecidos abaixo são indicados nas seções relevantes. Nesses experimentos, um espectrofotômetro foi usado para medir a absorbância dos produtos formados após o término das reações.

A. Índice de desempenho

[000303] O índice de desempenho (PI) compara o desempenho ou estabilidade da variante (valor medido) e da enzima padrão (valor teórico) na mesma concentração de proteína. Além disso, os valores teóricos podem ser calculados usando os parâmetros de uma equação de Langmuir da enzima padrão. Um índice de desempenho (PI) que é maior que 1 (PI>1) indica desempenho aprimorado por uma variante em comparação com o padrão (por exemplo, a α-amilase do tipo selvagem de Bacillus sp. α-amylase 707, também chamada de Amy707 ou Amy#707), enquanto um PI de 1 (PI=1) identifica uma variante que tem o mesmo desempenho do padrão e um PI que é menor que 1 (PI<1) identifica uma variante que tem desempenho pior que o do padrão.

B. Ensaio de teor de proteína

[000304] Este ensaio é realizado com o uso de sobrenadante de cultura filtrada de culturas cultivadas em placas de microtitulação (MTPs - microtiter plates) por 3 dias a 37°C com agitação a 300 rpm e 80% umidade. Uma MTP de fundo V de 96 poços contendo 50 μL de sobrenadante por poço é usada para o método de determinação de proteína por Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

[000305] Nas bibliotecas SEL de 24 sítios descritas no Exemplo 3, os sobrenadantes foram triplamente diluídos em 10 mm de tampão de fosfato de potássio a pH 7,25 contendo 5% acetonitrila e 10% cloreto de sódio e 10 μL de cada amostra diluída foi analisada. Um HPLC Agilent 1100 (Hewlet Packard) equipado com uma coluna Swift™ RP-all PN 68-1030-041 (Teledyne Isco, Inc.) foi usado. Nas bibliotecas completas SEL descritas no Exemplo 4, os sobrenadantes foram diluídos nove vezes em 25 mm de MOPS, 0,1 mm de CaCl2, pH 7,15, 10%TFA e 20 μL de cada amostra diluída foram analisados. Um HPLC Agilent 1200 (Hewlet Packard) equipado com uma coluna Poroshell 300SB-C8 (Agilent Technologies) foi usado.

[000306] Em ambos os casos, o sistema solvente consiste em 0,1% ácido trifluoroacético em fase aquosa e 0,07% ácido trifluoroacético em acetonitrila. A absorbância é lida a 222 nm e a concentração de proteína das amostras é determinada com base em uma curva de calibração (18 ppm a 400 ppm) com o uso de proteína Amy707 tipo selvagem purificada.

C. Ensaio de atividade da α-amilase Ceralpha

[000307] O ensaio da α-amilase Ceralpha é realizado com o uso do kit Ceralpha HR (Megazyme, Wicklow, Irlanda). O ensaio envolve incubar o supernatante de cultura com uma mistura de substrato sob condições definidas e a reação é interrompida (e a cor é desenvolvida) mediante a adição de solução de base Trizma. O substrato é uma mistura do oligossacarídeo "malto heptaosídeo de p-nitrofenila bloqueado de extremidade não redutora" (BPNPG7) definido e níveis excessivos de glicoamilase e β-glicosidase (que não têm ação sobre o substrato nativo devido à presença do "grupo de bloqueio"). Na hidrólise do oligossacarídeo por α-amilase endoativa, as quantidasdes excessivas de α-glicosidase e glicoamilase presente na mistura dão instantânea e quantitativa hidrólise do fragmento de p-nitrofenil maltossacarídeo para a glicose e p-nitrofenol livre. A absorbância a 405 nm é medida e isso se refere diretamente ao teor de α-amilase na amostra analisada.

[000308] O equipamento usado neste conjunto de ensaios inclui um robô Biomek FX (Beckman Coulter); um leitor SpectraMAX MTP (tipo 340-dispositivos moleculares) e incubador/agitador iEMS (Thermo Scientific). Neste sistema de ensaio, o reagente e as soluções usados são:1) substrato de malto heptaosídeo de p-nitrofenila (BPNPG7) (kit Megazyme Ceralpha HR);2) 50 mm MOPS, 50 mm NaCl, 0,1 mm CaCl2, 0,005% tampão TWEEN® 80, pH 7,15 (para as bibliotecas SEL de 24 sítios descritas no Exemplo 3) ou 50 mm MOPS, 0,005% tampão TWEEN® 80, pH 7 (para as bibliotecas completas de SEL descritas no Exemplo 4); e3) 200 mm de tampão de ácido bórico/NaOH, pH 10,2 (tampão STOP).

[000309] Um frasco contendo 54,5 mg de substrato BPNPG7 é dissolvido em 10 mL de água milliQ. As amostras de amilase (sobrenadante de fermentação) são diluídas no tampão de MOPS. O ensaio é realizado pela adição de 25 μL de solução diluída de amilase nos poços de uma MTP seguido de adição de 25 μL de solução com 5,45 mg/mL de substrato BPNPG7. As soluções são misturadas e a MTP é vedada com uma placa de vedação e colocadas em um incubador/agitador (iEMS- Thermo Scientific) por 30 minutos a 25°C e 900 rpm. A reação é interrompida pela adição de 50 μL de tampão STOP e a absorbância é lida a um comprimento de onda 405 nm em um leitor de MTP. Um controle não enzima é usado para corrigir valores de absorbância antecedentes.

D. CS-28 Ensaio de uma pequena amostra de tecido de amido de arroz

[000310] O princípio desse ensaio de α-amilase é a liberação de um corante laranja devido à hidrólise de amido de arroz incorporada na pequena amostra de tecido. A absorbância a 488 nm é medida e isso está relacionado ao teor de atividade de amilase na amostra analisada, nas condições desejadas (pH, temperatura e tampão).

[000311] O equipamento usado para este conjunto de ensaios inclui um Biomek FX Robot (Beckman Coulter), um leitor SpectraMAX MTP (tipo 340 - dispositivos moleculares) e incubador/agitador iEMS (Thermo Scientific). Neste sistema de ensaio, o reagente e as soluções usados são:1) Pequenas amostras de tecido CS-28 (amido de arroz, colorido);2) 25 mm HEPES, 2 mm CaCl2, 0,005% tampão TWEEN 80, pH 8,0 (para as bibliotecas SEL de 24 sítios descritas no Exemplo 3) ou 10 mm HEPES, 2 mm CaCl2, 0,005% tampão TWEEN 80, pH 8,0, condutividade 1 mS/cm (para as bibliotecas completas de SEL descritas no Exemplo 4);3) 25 mm CAPS, 2 mm CaCl2, 0,005% tampão TWEEN 80, pH 10,0; e4) 10 mm NaCl, 0,1 mm CaCl2, 0,005% TWEEN 80 (tampão de diluição).

[000312] Pequenas amostras de tecido CS-28 de 5,5 mm diâmetro circulares foram entregados pelo Centro de Materiais de Teste (CFT, Vlaardingen, Países Baixos). Duas pequenas amostras de tecido são colocadas em cada poço de um MTP de 96 poços. As amostras de amilase (sobrenadante de fermentação) são testadas em concentrações adequadas em várias condições, pré-diluídas em 10 mm NaCl, 0,1 mm CaCl2, 0,005% solução de TWEEN®80: 1) pH 8 (25 mm tampão HEPES) e 16°C; amilase final concentrada em ensaio < 0,3 μg/mL; 2) pH 8 (25 mm tampão HEPES) e 32°C; amilase final concentrada em ensaio < 0,05 μg/mL; 3) pH 8 (25 mm tampão HEPES) e 50°C; amilase final concentrada em ensaio < 0,005 μg/mL; 4) pH 10 (25 mm tampão CAPS) e 16°C; amilase final concentrada em ensaio < 0,75 μg/mL; e 5) pH 10 (25 mm tampão CAPS) e 50°C; amilase final concentrada em ensaio < 0,0075 μg/mL.

[000313] O incubador/agitador é ajustado na temperatura desejada, 16°C (câmara ou refrigerador em armazenamento frio), 32°C ou 50°C. As amostras de sobrenadante de cultura são diluídas em tampão de diluição para 20X a concentração final desejada. 190 μL de tampão HEPES ou CAPS é adicionado a cada poço de um microswatch-MTP e subsequentemente 10 μL de solução de enzima é adicionado a cada poço resultando em um volume total de 200 μL/poço. A MTP é vedada com uma placa de vedação e colocada no incubador/agitador iEMS e incubada por 60 minutos a 1150 rpm na desejada temperatura (16°, 32° ou 50°C). Após a incubação sob condições adequadas, 100 μL de solução de cada poço é transferido para uma nova MTP, e a absorbância a 488 nm é medida com o uso de um espectrofotômetro de MTP. Controles contendo duas pequenas amostras de tecido e tampão mas nenhuma enzima é incluída para subtração de fundo.

[000314] Para calcular o desempenho de lavagem, o valor obtido de absorbância é corrigido para o valor em branco (obtido após a incubação de pequenas amostras de tecido na ausência de enzima), e a absorbância resultante é uma medida de atividade hidrolítica. Um índice de desempenho (PI) é calculado para cada amostra. Para o cálculo de PI dos índices de desempenho de lavagem, é feito um ajuste de curva com base na enzima tipo selvagem Amy707 (SEQ ID NO: 3), com o uso da equação de Langmuir. Usando a concentração de proteína das variantes, o desempenho esperado com base no ajuste de curva é calculado. O desempenho observado é dividido pelo desempenho calculado e isso é então dividido pelo desempenho da enzima tipo selvagem Amy707 (SEQ ID NO: 3).

E. Ensaio de termoestabilidade - determinação de atividades iniciais e residuais

[000315] A termoestabilidade da variante de amilase em relação a uma amilase de referência (Amy707 tipo selvagem, SEQ ID NO: 3) é determinada pela incubação das amostras de amilase sob condições definidas em tampão de MOPS, pH 7,15. A temperatura da incubação é selecionada de modo que aproximadamente 70% da atividade inicial da amilase de referência seja perdida. As atividades de amilase iniciais e residuais são determinadas com o uso do método α-amilase Ceralpha descrito na seção C acima.

[000316] O equipamento usado neste conjunto de ensaios inclui um robô Biomek FX (Beckman Coulter); um leitor SpectraMAX MTP (tipo 340-dispositivos moleculares) e incubador/agitador iEMS (Thermo Scientific). Neste sistema de ensaio, as soluções reagentes usadas são: 1) substrato de malto heptaosídeo de p-nitrofenila (BPNPG7) (kit Megazyme Ceralpha HR);2) 10 mm NaCl, 0,1 mm CaCl2, 0,005% tampão TWEEN® 80 (tampão de diluição);3) 50 mm MOPS, 50 mm NaCl, 0,1 mm CaCl2, 0,005% tampão TWEEN®80, pH 7,15;4) 200 mm de tampão de ácido bórico/NaOH, pH 10,2 (tampão STOP); e5) Sobrenadantes de cultura de amilase, contendo 50 a 150 μg/mL proteína.

[000317] Uma placa de "diluição master" é preparada pela diluição do sobrenadante de cultura 20X em tampão de diluição, seguido de uma etapa de diluição 42X em tampão MOPS. Da diluição mestre, 25 μL é usado para determinar a atividade inicial de amilase e 100 μL é usado para incubação por calor. A amostra de 100 μL é colocada em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços (VWR 211-0297) que é vedada com uma vedação de alumínio e incubada a 69°C por 30 minutos em um bloco de Tetrad PCR (Biorad). Para determinar a atividade inicial (t00) e residual (t30), uma amostra de 25 μL é transferida para uma MTP, contendo 25 μL de solução BPNPG7 por poço e incubada a 25°C por 30 minutos. O ensaio de α-amilase Ceralpha é feito conforme descrito acima na Seção C.

[000318] Para cada variante, a razão entre as atividades de amilase residual e de amilase inicial é usada para calcular a termoestabilidade de detergente da seguinte forma: Termoestabilidade = [valor t-30] / [valor t-00], para que a razão de atividade de termoestabilidade seja calculada com base em atividade enzimática após a incubação por calor, dividido pela atividade enzimática antes da incubação por calor. O índice de desempenho de termoestabilidade é determinado mediante a divisão da razão da atividade da enzima variante com a da enzima tipo selvagem Amy707 similarmente tratada (SEQ ID NO: 3). Os ensaios de termoestabilidade foram apenas realizados para as bibliotecas SEL de 24 sítios descritas no Exemplo 3.

F. Ensaio de estabilidade de detergente

[000319] A estabilidade da amilase de referência e variantes da mesma é medida após a incubação sob condições definidas na presença de 10% de detergente Persil Color disponível comercialmente, Henkel (adquirido em 2008). O detergente é inativado por calor antes do uso, e as atividades de iniciais e residuais são determinadas com o uso do ensaio de α-amilase Ceralpha conforme descrito na seção C acima.

[000320] O equipamento usado neste conjunto de ensaios inclui um robô Biomek FX (Beckman Coulter); um leitor SpectraMAX MTP (tipo 340-dispositivos moleculares) e incubador/agitador iEMS (Thermo Scientific). Neste sistema de ensaio, as soluções reagentes usadas são:1) substrato de malto heptaosídeo de p-nitrofenila (BPNPG7) (kit: Megazyme Ceralpha HR)2) detergente líquido (produto comercial HDL, inativado por enzima, 2 horas a 60°C);3) 10,5% detergente em 25 mm de tampão HEPES, pH 8,0;4) 50 mm MOPS, 50 mm NaCl, 0,1 mm CaCl2, 0,005% tampão TWEEN® 80, pH 7,15 (para as bibliotecas SEL de 24 sítios descritas no Exemplo 3) ou 50 mm MOPS, 0,1 mm CaCl2, 0,005% tampão TWEEN® 80, pH 7 (para as bibliotecas completas de SEL descritas no Exemplo 4);5) 200 mm de tampão de ácido bórico/NaOH, pH 10,2 (tampão STOP); e6) Sobrenadantes de cultura de amilase contendo 50 a 150 μg/mL proteína.

[000321] A uma placa PCR de 96 poços, 95 μL de uma solução detergente a 10,5% são adicionados e misturados com 5 μL de sobrenadante de cultura. Uma alíquota de 3 μL é removida para determinação da atividade de amilase inicial. A placa de PCR é incubada em um bloco de Tetrad PCR a 41° por 30 minutos. Após a incubação, a atividade residual de amilase é medida com o uso de 3 μL da mistura de detergente-enzima. Para determinar a atividade de amilase inicial (t0) e residual (t30), 3 μL de mistura de 'detergente-enzima' são diluídos em 122 μL tampão de MOPS e subsequentemente 25 μL são usados para determinar a atividade de amilase com o uso do ensaio de α-amilase Ceralpha acima descrito na seção C.

[000322] Para cada variante, a razão entre as atividades de amilase residual e inicial é usada para calcular a estabilidade de detergente da seguinte forma: A estabilidade do detergente = [valor t-30] / [valor t-00], para que a razão de atividade de estabilidadedo detergente seja calculada com base em atividade enzimática após a incubação por calor, dividida pela atividade enzimática antes da incubação por calor.

[000323] Para cada amostra (variantes), o índice de desempenho (PI) é calculado. O índice de desempenho para estabilidade de detergente é determinado pela comparação da estabilidade de detergente da enzima variante, com o da enzima Amy707 tipo selvagem similarmente tratada (SEQ ID NO: 3).

Exemplo 2: Geração de cepas de B. subtilis que expressam Amy707 e variantes das mesmas

[000324] Neste exemplo, a construção de cepas de Bacillus subtilis expressando α-amilase Amy707 tipo selvagem e variantes dos mesmos, são descritos. Amy707 é a amilase G6 (1,4-α-D-glucano malto-hexa- hidrolase) de Bacillus sp. alcalofílica #707 para os quais a sequência de nucleotídeos foi descrita por Tsukamoto et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 151: 25-31.

[000325] Um fragmento sintético de DNA (SEQ ID NO: 1, mencionado, na presente invenção, como "Amy707 DNA") que codifica a α-amilase Amy707 (SEQ ID NO: 3) foi produzido pela GENEART AG (Regensburg, Alemanha) e serviu como modelo de DNA para a construção de cepas de Bacillus subtilis expressando α-amilase Amy707 e variantes dos mesmos.

[000326] SEQ ID NO:1 inclui a sequência de nucleotídeo modificada por códon que codifica a forma madura de α-amilase Amy707 adjacente a uma sequência que codifica o peptídeo de sinalização LAT (sublinhada):ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTA TTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACATC ATAATGGCACAAACGGCACGATGATGCAGTATTTTGAATGGTATCT GCCGAACGATGGAAACCATTGGAACCGCCTGAATAGCGATGCGA GCAACCTGAAAAGCAAAGGCATCACAGCAGTTTGGATTCCGCCGG CATGGAAAGGAGCAAGCCAAAACGACGTCGGCTATGGAGCGTAT GATCTGTATGACCTGGGCGAATTTAACCAAAAAGGCACGGTCCGC ACGAAATATGGCACGCGCAGCCAACTTCAAGCAGCAGTCACGAG CCTTAAAAACAACGGCATCCAGGTCTATGGAGATGTCGTCATGAA CCATAAAGGCGGAGCAGATGCGACAGAAATGGTCAGAGCGGTCG AAGTCAACCCGAACAACCGCAATCAAGAAGTCACGGGCGAATATA CAATCGAAGCGTGGACGCGCTTTGATTTTCCGGGCAGAGGCAATA CACATAGCAGCTTTAAATGGCGCTGGTATCATTTTGATGGCGTCG ATTGGGATCAAAGCCGCAGACTGAACAACCGCATCTATAAATTTC GCGGCCATGGCAAAGCATGGGATTGGGAAGTCGATACGGAAAAC GGCAACTATGACTATCTGATGTATGCGGACATCGATATGGATCAT CCGGAAGTCGTCAACGAACTGAGAAATTGGGGCGTCTGGTATACA AATACGCTGGGCCTGGATGGCTTTAGAATCGACGCGGTCAAACAT ATCAAATATAGCTTTACGCGCGACTGGATCAATCATGTCAGAAGC GCGACGGGCAAAAATATGTTTGCGGTCGCGGAATTTTGGAAAAAT GATCTGGGCGCGATCGAAAACTATCTGCAAAAAACGAACTGGAAC CATAGCGTCTTTGATGTCCCGCTGCATTATAACCTGTATAACGCGA GCAAAAGCGGCGGCAATTATGATATGCGCAACATCTTTAACGGCA CGGTCGTTCAAAGACATCCGAGCCATGCGGTCACGTTTGTCGATA ACCATGATAGCCAACCGGAAGAAGCGCTGGAAAGCTTTGTCGAAG AATGGTTTAAACCGCTGGCGTATGCACTGACACTGACGAGAGAAC AAGGATATCCGAGCGTCTTTTATGGCGACTATTATGGCATCCCGA CACATGGAGTTCCGGCGATGAGAAGCAAAATCGACCCGATCCTG GAAGCGAGACAGAAATATGCGTATGGCAAACAGAACGACTATCTG GACCATCATAACATCATCGGCTGGACGAGAGAAGGAAATACGGC GCATCCGAATTCAGGACTGGCGACGATTATGTCAGATGGAGCGG GCGGAAGCAAATGGATGTTTGTCGGCAGAAACAAAGCAGGACAA GTCTGGAGCGATATCACGGGCAATAGAACGGGAACGGTCACGAT CAATGCAGATGGCTGGGGCAACTTTAGCGTTAATGGCGGAAGCG TCAGCATCTGGGTCAACAAA

[000327] A forma precursora do polipeptídeo Amy707 produzido a partir do vetor pHPLT-Amy707 é mostrada, abaixo, como SEQ ID NO: 2. O peptídeo de sinalização LAT está sublinhado: MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASAHHNGTNGTMMQYFEWYLP NDGNHWNRLNSDASNLKSKGITAVWIPPAWKGASQNDVGYGAYDL YDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLQAAVTSLKNNGIQVYGDVVMNHKG GADATEMVRAVEVNPNNRNQEVTGEYTIEAWTRFDFPGRGNTHSSF KWRWYHFDGVDWDQSRRLNNRIYKFRGHGKAWDWEVDTENGNYD YLMYADIDMDHPEVVNELRNWGVWYTNTLGLDGFRIDAVKHIKYSFT RDWINHVRSATGKNMFAVAEFWKNDLGAIENYLQKTNWNHSVFDVP LHYNLYNASKSGGNYDMRNIFNGTVVQRHPSHAVTFVDNHDSQPEE ALESFVEEWFKPLAYALTLTREQGYPSVFYGDYYGIPTHGVPAMRSK IDPILEARQKYAYGKQNDYLDHHNIIGWTREGNTAHPNSGLATIMSDG AGGSKWMFVGRNKAGQVWSDITGNRTGTVTINADGWGNFSVNGGS VSIWVNK

[000328] A forma madura do polipeptídeo Amy707 produzido a partir do vetor pHPLT-Amy707 é mostrada, abaixo, como SEQ ID NO: 3.HHNGTNGTMMQYFEWYLPNDGNHWNRLNSDASNLKSKGITAVWIP PAWKGASQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLQAAVT SLKNNGIQVYGDVVMNHKGGADATEMVRAVEVNPNNRNQEVTGEY TIEAWTRFDFPGRGNTHSSFKWRWYHFDGVDWDQSRRLNNRIYKF RGHGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADIDMDHPEVVNELRNWGVWY TNTLGLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWINHVRSATGKNMFAVAEFWKND LGAIENYLQKTNWNHSVFDVPLHYNLYNASKSGGNYDMRNIFNGTVV QRHPSHAVTFVDNHDSQPEEALESFVEEWFKPLAYALTLTREQGYP SVFYGDYYGIPTHGVPAMRSKIDPILEARQKYAYGKQNDYLDHHNIIG WTREGNTAHPNSGLATIMSDGAGGSKWMFVGRNKAGQVWSDITGN RTGTVTINADGWGNFSVNGGSVSIWVNK

[000329] Para expressar Amy707, o fragmento de DNA Amy707 foi clonado no vetor de pHPLT (Solingen et al.(2001) Extremophiles 5:333-341) por GENEART e fundido in-frame ao peptídeo de sinalização AmyL (LAT) com o uso dos exclusivos sítios de restrição PstI e HpaI, resultando em plasmídeo pHPLT-Amy707. O vetor de expressão pHPLT contém o promotor B. licheniformis LAT (Plat) e elementos adicionais de pUB110 (McKenzie et al. (1986) Plasmid, 15: 93-103) incluindo uma gene de replicase (reppUB), um gene de resistência a neomicina/canamicina (neo) e um marcador de resistência a bleomicina (bleo). Uma mapa do vetor de pHPLT contendo o gene de Amy707 (pHPLT-Amy707) é mostrado na Figura 2.

[000330] Uma cepa adequada de B. subtilis foi transformada com DNA de plasmídeo pHPLT-Amy707 com o uso de um método conhecido na técnica (WO 02/14490). Os transformantes de B. subtilis foram selecionados em placas de ágar contendo ágar para infusão cardíaca (Difco, catálogo n° 244400) e 10 mg/l sulfato de neomicina (Sigma, catálogo n° N-1876; contém 732 mg de necaomicina por mg). O crescimento seletivo de transformantes B. subtilis colhendo o plasmídeo pHPLT-Amy707 foi realizado em frascos de agitação contendo meio MBD (um meio definido à base de MOPS), 5 mm de CaCl2 e 10 mg/l neomicina. O crescimento resultou na produção de amilase Amy707 secretada com atividade hidrolisadora de amido.

Exemplo 3: Geração e avaliação de uma biblioteca de avaliação de sítio de 24 sítios Amy707 A. Geração da biblioteca

[000331] Bibliotecas de avaliação de sítio (SELs) foram criadas pela GENEART com o uso de um processo proprietário (WO 2004/059556A3) e com o uso de métodos e dispositivos para otimizar uma sequência de nucleotídeos com o propósito de expressão de uma proteína por PCR, e a fabricação de moléculas de DNA utilizou tecnologia de propriedade ou licenciada para a GENEART (patente europeia n°s 0 200 362 e 0 201 184; e patentes US n°s 4.683.195, 4.683.202 e 6.472.184). A construção de SELs Amy707 descrita neste exemplo foi realizada pela GENEART com o uso de sua plataforma de tecnologia de otimização genética, síntese genética e geração de biblioteca sob "know-how" e/ou propriedade intelectual proprietário da GENEART. A abordagem de permutação sequencial da GENEART, para produzir SELs, é descrita em geral no site da empresa.

[000332] O DNA de plasmídeo pHPLT-Amy707 serviu como modelo para produzir SELs em sítios pré-selecionados na região madura (SEQ ID NO: 3) mostrados na Tabela 3.1. A GENEART foi comissionada para criar as SELs nessas posições com o uso de seus protocolos padrão. Os códons correspondentes de cada sítio foram cada um substituídos por códons por ao menos 16 (de possíveis 19) aminoácidos diferentes. As misturas de pHPLT-Amy707 mutagenizadas por códon foram usadas para transformar células competentes de B. subtilis conforme conhecido na técnica (WO 2002/014490) para gerar as Amy707 SELs. As misturas de transformação foram colocadas em placas de HI-ágar (ágar de infusão cardíaca) contendo 10 mg/l de sulfato de neomicina. Para cada biblioteca, colônias bacterianas únicas foram colhidas e cultivadas em meio líquido de TSB (caldo à base de triptona e soja) com 10 mg/mL de seleção de neomicina para subsequente isolamento de DNA e análise de sequência de genes. Dados de análise de sequências revelaram um máximo de 19 variantes maduras de Amy707 por biblioteca. Para gerar Amy707 e amostras variantes de enzima para caracterização bioquímica, o crescimento seletivo das variantes foi realizado em MTPs de 96 poços a 37°C por 68 horas em meio MBD. Um total de 402 das 456 possíveis variantes foi obtido para as 24 posições mutagenizadas. Tabela 3.1. Posições de Amy707 SEL.

B. Identificação de mutações combináveis e produtivas

[000333] Os valores de índice de desempenho (PI) foram determinados para todas as variantes de amilase Amy707 testadas com o uso dos ensaios descritos no Exemplo 1: a atividade de α-amilase, ensaio de pequena amostra de tecido CS-28 (em ambos pH8 e pH10), estabilidade de detergente, ensaios de termoestabilidade e determinação de proteína.

[000334] As posições produtivas são descritas como aquelas posições dentro de uma molécula, que são mais úteis para a produção de variantes combinatórias que exibem uma característica aprimorada, onde a posição em si permite pelo menos uma mutação combinável. Mutações combináveis são mutações em qualquer posição de aminoácido que podem ser usadas para fazer variantes combinatórias. As mutações combináveis otimizam ao menos uma propriedade desejada da molécula, ao mesmo tempo em que não diminuem significantemente a expressão, atividade ou estabilidade. As mutações combináveis podem ser agrupadas da seguinte forma:

[000335] Grupo A: Uma mutação que produz uma variante em que os índices de desempenho mínimo (PI) em relação a uma proteína parental definida por: (i) expressão de proteína, (ii) atividade, (iii) atividade em pequena amostra de tecido CS-28 a pH 8 (16°C, 32 °C, ou 50 °C) ou pH10 (16 °C ou 50 °C), e (iv) estabilidade ou termoestabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,9, e além disso têm um PI em qualquer um destes testes que é maior ou igual a 1,0.

[000336] Grupo B: Uma mutação que produz uma variante em que os índices de desempenho (PI) mínimo em relação a uma proteína parental definida por: (i) expressão de proteína, (ii) atividade, (iii) atividade em pequena amostra de tecido CS-28 a pH 8 (16°C, 32 °C, ou 50 °C) ou pH10 (16 °C ou 50 °C), e (iv) estabilidade ou termoestabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,8 e além disso têm um PI em qualquer um destes testes que é maior ou igual a 1,2.

[000337] Grupo C: Uma mutação que produz uma variante em que os índices de desempenho (PI) mínimo em relação a uma proteína parental definida por: (i) expressão de proteína, (ii) atividade, (iii) atividade em pequena amostra de tecido CS-28 a pH 8 (16°C, 32 °C, ou 50 °C) ou pH10 (16 °C ou 50 °C), e (iv) estabilidade ou termoestabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,5 e além disso têm um PI em qualquer um destes testes que é maior ou igual a 1,5.

[000338] As propriedades das mutações combináveis são resumidas na seguinte Tabela.Tabela 3.2. Propriedades de cada grupo de mutações combináveis

[000339] Mutações combináveis preferenciais estão em "posições produtivas", conforme descrito abaixo. No caso de α-amilases presentes, a "atividade" refere-se a uma atividade de α-amilase, que pode ser medido conforme descrito na presente invenção.

[000340] Posições produtivas são posições de aminoácidos que são tolerantes à substituição por diferentes resíduos de aminoácidos, em que as variantes resultantes atendem um conjunto de critérios de desempenho de combinabilidade, conforme estabelecido acima. Posições produtivas podem ser atribuídas uma Pontuação de Produtividade da seguinte forma: As posições em que menos de 15% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "1". As posições em que menos de 40%, mas mais ou igual a 15% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "2". As posições em que menos de 75%, mas mais ou igual a 40% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade "3. As posições onde 75% ou mais das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "4". As posições preferenciais são mutações combináveis.

[000341] A pontuação de adequação refere-se à habilidade de uma ou mais mutações combináveis ser usada para fazer variantes combinatórias, com base nos critérios de desempenho para combinabilidade, (isto é, A, B, e C, conforme estabelecido acima) em que cada uma das mutações está. Uma pontuação de adequação indica uma mutação ou mutações que são mais adequadas para uso na fabricação de variantes combinatórias. As pontuações de adequação são descritas na seguinte Tabela.Tabela 3.3. Definições de pontuações de adequação

[000342] A Tabela 3.4 mostra a Pontuação de Produtividade (4, 3 ou 2,) calculada para cada posição na proteína Amy707. Nenhuma posição foi calculada para ter uma pontuação de produtividade de 1. Para cada posição Amy707, as variantes são listadas de acordo com a pontuação de adequação que elas receberam (+, ++, +++, ++++ ou +++++). A numeração da posição tem por base a proteína madura Amy707 listada na SEQ ID NO: 3.Tabela 3.4. Pontuação de produtividade de cada posição na protein<Amy707.

* O primeiro resíduo de aminoácido listado é o resíduo tipo selvagem.

Exemplo 4: Geração e avaliação de bibliotecas de avaliação de sítio Amy707 completa A. Geração das bibliotecas

[000343] Bibliotecas de avaliação de sítio (SELs) foram criadas pela GENEART com o uso de um processo proprietário (WO 2004/059556A3) e com o uso de métodos e dispositivos para otimizar uma sequência de nucleotídeos com o propósito de expressão de uma proteína por PCR, e a fabricação de moléculas de DNA utilizou tecnologia de propriedade ou licenciada para a GENEART (patente europeia n°s 0 200 362 e 0 201 184; e patentes US n°s 4.683.195, 4.683.202 e 6.472.184). A construção de SELs Amy707 descrita neste exemplo foi realizada pela GENEART com o uso de sua plataforma de tecnologia de otimização genética, síntese genética e geração de biblioteca sob "know-how" e/ou propriedade intelectual proprietário da GENEART. A abordagem de permutação sequencial da GENEART, para produzir SELs, é descrita em geral no site da empresa.

[000344] O DNA de plasmídeo pHPLT-Amy707 serviu como modelo para produzir SELs em todos os sítios na região madura (SEQ ID NO: 3). A GENEART foi comissionada para criar as SELs nessas posições com o uso de seus protocolos padrão. Os códons correspondentes de cada sítio foram cada um substituídos por códons por ao menos 16 (de possíveis 19) aminoácidos diferentes. As misturas de pHPLT-Amy707 mutagenizadas por códon foram usadas para transformar células competentes de B. subtilis conforme conhecido na técnica (WO 2002/014490) para gerar as Amy707 SELs. As misturas de transformação foram colocadas em placas de HI-ágar (ágar de infusão cardíaca) contendo 10 mg/l de sulfato de neomicina. Para cada biblioteca, colônias bacterianas únicas foram colhidas e cultivadas em meio líquido de TSB (caldo à base de triptona e soja) com 10 mg/mL de seleção de neomicina para subsequente isolamento de DNA e análise de sequência de genes. Dados de análise de sequências revelaram um máximo de 19 variantes maduras de Amy707 por biblioteca. Para gerar Amy707 e amostras variantes de enzima para caracterização bioquímica, o crescimento seletivo das variantes foi realizado em MTPs de 96 poços a 37°C por 68 horas em meio MBD.

B. Identificação de mutações combináveis e produtivas

[000345] Os valores de índice de desempenho (PI) foram determinados para todas as variantes de amilase Amy707 testadas com o uso dos ensaios descritos no Exemplo 1: a atividade de α-amilase, ensaio de pequena amostra de tecido CS-28 (em ambos pH8 e pH10), estabilidade de detergente, ensaios de termoestabilidade e determinação de proteína.

[000346] As posições produtivas são descritas como aquelas posições dentro de uma molécula, que são mais úteis para a produção de variantes combinatórias que exibem uma característica aprimorada, onde a posição em si permite pelo menos uma mutação combinável. Mutações combináveis são mutações em qualquer posição de aminoácido que pdem ser usadas para fazer variantes combinatórias. As mutações combináveis otimizam ao menos uma propriedade desejada da molécula, ao mesmo tempo em que não diminuem significantemente a expressão, atividade ou estabilidade. As mutações combináveis podem ser agrupadas da seguinte forma:

[000347] Grupo A: Uma mutação que produz uma variante em que os índices de desempenho mínimo (PI) em relação a uma proteína parental definida para: (i) expressão de proteína, (ii) atividade, (iii) atividade em pequena amostra de tecido CS-28 a pH 8 (16°C, 32 °C, ou 50 °C) ou pH10 (16 °C ou 50 °C), e (iv) estabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,9, e além disso têm um PI em qualquer um destes testes que é maior ou igual a 1,0.

[000348] Grupo B: Uma mutação que produz uma variante em que os índices de desempenho mínimo (PI) em relação a uma proteína parental definida por: (i) expressão de proteína, (ii) atividade, (iii) atividade em pequena amostra de tecido CS-28 a pH 8 (16°C, 32 °C ou 50 °C) ou pH10 (16 °C ou 50 °C), e (iv) estabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,8 e além disso têm um PI em qualquer um destes testes que é maior ou igual a 1,2.

[000349] Grupo C: Uma mutação que produz uma variante em que os índices de desempenho (PI) mínimo em relação a uma proteína parental definida por: (i) expressão de proteína, (ii) atividade, (iii) atividade em pequena amostra de tecido CS-28 a pH 8 (16°C, 32 °C ou 50 °C) ou pH10 (16 °C ou 50 °C), e (iv) estabilidade de detergente são maiores ou iguais a 0,5 e além disso têm um PI em qualquer um destes testes que é maior ou igual a 1,5.

[000350] As propriedades das mutações combináveis estão resumidas na seguinte Tabela.Tabela 4.1. Propriedades de cada grupo de mutações combináveis

[000351] Mutações combináveis preferenciais estão em "posições produtivas", conforme descrito abaixo. No caso de α-amilases presentes, a "atividade" refere-se a uma atividade de α-amilase, que pode ser medido conforme descrito na presente invenção.

[000352] Posições produtivas são posições de aminoácidos que são tolerantes à substituição por diferentes resíduos de aminoácidos, em que as variantes resultantes atendem um conjunto de critérios de desempenho de combinabilidade, conforme estabelecido acima. Posições produtivas podem ser atribuídas uma Pontuação de Produtividade da seguinte forma: As posições em que menos de 15% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "1". As posições em que menos de 30%, mas mais ou igual a 15% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "2". As posições em que menos de 50%, mas mais ou igual a 30% das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade "3. As posições onde 50% ou mais das substituições em uma determinada posição fazem parte dos grupos A, B, ou C recebem uma Pontuação de Produtividade de "4". As posições preferenciais são mutações combináveis.

[000353] A pontuação de adequação refere-se à habilidade de uma ou mais mutações combináveis ser usada para fazer variantes combinatórias, com base nos critérios de desempenho para combinabilidade, (isto é, A, B, e C, conforme estabelecido acima) em que cada uma das mutações está. Uma pontuação de adequação indica uma mutação ou mutações que são mais adequadas para uso na fabricação de variantes combinatórias. As pontuações de adequação são descritas na seguinte Tabela.Tabela 4.2. Definições de pontuações de adequação

[000354] A Tabela 4.3 mostra a Pontuação de Produtividade (Pont. Prod., 4, 3, 2 ou 1) calculada para cada posição na proteína Amy707. Para cada posição Amy707, as variantes são listadas de acordo com a pontuação de adequação que elas receberam (+, ++, +++, ++++ ou +++++). A numeração da posição tem por base a proteína madura Amy707 listada na SEQ ID NO: 3.Tabela 4.3. Pontuação de Produtividade para cada posição na proteínaAmy707.

* O primeiro resíduo de aminoácido listado é o resíduo tipo selvagem.

[000355] As posições produtivas em Amy 707 que estão dentro das Pontuações de Produtividade anteriormente descritas de "4" e assubstituições naquelas posições que são combináveis são listadas abaixo. A numeração da posição tem por base a proteína madura Amy707 listada na SEQ ID NO: 3. 1(H,A,C,E,F,I,K,L,M,N,Q,R,T,W); 2(H,A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,W); 3(N,A,C,D,E,F,K,L,M,Q,S,T,V); 4(G,D,E,F,H,I,K,L,M,P,S,T,W); 5(T,A,C,D,G,H,I,M,N,Q,S,V,W); 7(G,A,D,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 22(N,E,G,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 25(N,A,C,G,K,M,S,T,V,Y); 28(N,A,C,D,E,G,H,K,Q,R,W,Y); 29(S,A,C,D,E,F,H,K,M,N,R,T,V,W,Y); 32(S,C,D,E,G,I,L,M,N,Q,R,W,Y); 33(N,C,D,H,I,K,M,Q,R,T,V,W,Y); 35(K,A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q); 54(N,A,C,D,E,F,G,M,Q,S,V,W); 70(N,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,R,S,V); 73(G,D,E,K,M,Q,R,S,T,W,Y); 86(Q,E,H,I,K,R,T,V,W,Y); 94(N,A,C,D,F,G,H,K,L,M,Q,R); 95(N,A,C,D,F,G,H,I,Q,R,S,T,Y); 113(A,C,E,F,G,H,I,K,M,R,V,Y); 116(M,A,C,D,E,F,G,I,L,N,P,Q,R,T,V,W); 125(N,C,F,G,H,I,L,M,R,S,T,W,Y); 136(T,C,D,F,G,K,L,M,N,P,Q,R,Y); 146(P,A,C,D,E,F,G,H,M,R,S,W,Y); 149(G,A,C,D,E,F,H,K,L,P,R,V,W); 151(T,D,E,G,H,I,L,M,Q,V); 160(Y,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S); 169(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,S,V,W,Y); 172(R,A,C,E,G,H,M,Q,S,Y); 173(L,A,C,D,F,H,K,N,W,Y); 174(N,D,G,H,I,L,P,S,T,V); 181(R,A,C,E,F,I,L,M,N,Q,S,T,V,Y); 183(H,A,C,D,E,F,L,M,N,P,Q,V,W,Y); 211(P,A,C,D,F,K,L,M,N,Q,S,V); 222(V,A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,R,S,T,Y); 251(N,A,C,G,H,K,L,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 262(F,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,R,S,Y); 273(G,C,D,E,H,K,L,M,P,Q,S,T,V,Y); 303(S,A,C,D,E,G,L,M,Q,R); 311(N,D,E,F,G,H,K,L,M,Q,R,T,Y); 314(N,A,D,E,G,H,I,K,L,M,Q,S,T,V,Y); 320(R,A,D,E,H,K,M,N,Q,S,T,Y); 323(S,A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,R,T,V,Y); 345(E,A,G,H,K,L,M,N,Q,S,T,Y); 346(E,A,C,D,G,H,K,M,N,Q,R,S,T,V,Y); 360(E,A,C,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V,Y); 361(Q,A,C,D,E,G,H,S,T,V,W); 375(P,A,D,E,G,H,I,K,M,Q,R,T,V,Y); 388(P,A,C,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 391(E,A,C,G,H,I,K,L,N,R,S,W); 395(K,A,D,E,G,M,Q,R,S,T,V); 400(K,A,F,G,H,I,L,M,Q,T,V,W); 408(H,E,G,K,M,N,P,Q,R,S,T); 416(E,A,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,T,V,W,Y); 418(N,A,D,I,K,L,M,Q,S,T,V); 419(T,D,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y); 420(A,D,F,G,H,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 421(H,A,C,D,E,I,K,L,M,N,R,V,W,Y); 422(P,A,C,E,F,G,L,M,T,V,Y); 423(N,C,D,E,F,H,I,L,R,S,T); 424(S,A,C,D,E,G,I,N,Q,T,V,W); 434(A,C,D,E,F,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V); 435(G,A,C,E,K,M,N,P,Q,R,T); 452(S,A,C,E,F,H,K,N,Q,T,W,Y); 458(R,C,D,E,H,K,L,M,N,S,T,V,Y); 459(T,A,C,D,E,G,H,L,N,P,S); 461(T,A,C,D,E,F,G,K,L,N,P,Q,R,V,Y); e 466(A,D,E,G,K,N,P,Q,R,S).

[000356] As posições produtivas em Amy 707 que estão dentro das Pontuações de Produtividade anteriormente descritas de "3 e 4" e as substituições naquelas posições que são combináveis são listadas abaixo. A numeração da posição tem por base a proteína madura Amy707 listada na SEQ ID NO: 3. 1(H,A,C,E,F,I,K,L,M,N,Q,R,T,W); 2(H,A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,W); 3(N,A,C,D,E,F,K,L,M,Q,S,T,V); 4(G,D,E,F,H,I,K,L,M,P,S,T,W); 5(T,A,C,D,G,H,I,M,N,Q,S,V,W); 6(N,A,E,G,Q,S,T); 7(G,A,D,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 16(Y,A,D,E,H,N,T,W); 17(L,A,D,G,S,T,V); 20(D,A,C,E,G,H,I,N,S,Y); 22(N,E,G,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 25(N,A,C,G,K,M,S,T,V,Y); 28(N,A,C,D,E,G,H,K,Q,R,W,Y); 29(S,A,C,D,E,F,H,K,M,N,R,T,V,W,Y); 32(S,C,D,E,G,I,L,M,N,Q,R,W,Y); 33(N,C,D,H,I,K,M,Q,R,T,V,W,Y) 35(K,A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q); 41(A,C,D,I,K,M,Q,S) 54(N,A,C,D,E,F,G,M,Q,S,V,W); 70(N,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,R,S,V) 73(G,D,E,K,M,Q,R,S,T,W,Y); 81(T,A,C,D,F,I,K,N,P,S) 82(R,A,C,F,I,K,M,Q,S,V,Y); 84(Q,C,D,E,F,K,L,M,N) 86(Q,E,H,I,K,R,T,V,W,Y); 87(A,D,K,M,T); 91(S,A,E,H,K,M,N,Q,R,T,V) 94(N,A,C,D,F,G,H,K,L,M,Q,R); 95(N,A,C,D,F,G,H,I,Q,R,S,T,Y) 98(Q,A,C,D,E,G,H,K,R); 113(A,C,E,F,G,H,I,K,M,R,V,Y) 116(M,A,C,D,E,F,G,I,L,N,P,Q,R,T,V,W); 117(V,E,L,P,R,S,T) 118(R,D,E,G,L,Q,T,V,W); 125(N,C,F,G,H,I,L,M,R,S,T,W,Y) 133(G,A,D,H,P,Q,S,T); 136(T,C,D,F,G,K,L,M,N,P,Q,R,Y) 142(R,C,E,F,G,H,K,S,T,Y); 144(D,E,I,K,M,S,Y) 146(P,A,C,D,E,F,G,H,M,R,S,W,Y); 149(G,A,C,D,E,F,H,K,L,P,R,V,W) 151(T,D,E,G,H,I,L,M,Q,V); 160(Y,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S) 169(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,S,V,W,Y); 172(R,A,C,E,G,H,M,Q,S,Y) 173(L,A,C,D,F,H,K,N,W,Y); 174(N,D,G,H,I,L,P,S,T,V) 175(N,A,D,E,L,M,R,S); 181(R,A,C,E,F,I,L,M,N,Q,S,T,V,Y) 183(H,A,C,D,E,F,L,M,N,P,Q,V,W,Y); 210(H,A,C,D,E,M,N,Q,R,S) 215(N,D,F,K,L,M,Q) 218(R,A,C,E,F,H,K,M) 222(V,A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,R,S,T,Y) 251(N,A,C,G,H,K,L,P,Q,R,S,T,V,W,Y) 259(K,A,C,D,E,G,H,P,Q,R,T) 262(F,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,R,S,Y) 273(G,C,D,E,H,K,L,M,P,Q,S,T,V,Y); 299(N,G,H,M,R,S,T,Y); 311(N,D,E,F,G,H,K,L,M,Q,R,T,Y); 314(N,A,D,E,G,H,I,K,L,M,Q,S,T,V,Y); 320(R,A,D,E,H,K,M,N,Q,S,T,Y); 323(S,A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,R,T,V,Y); 345(E,A,G,H,K,L,M,N,Q,S,T,Y); 346(E,A,C,D,G,H,K,M,N,Q,R,S,T,V,Y); 360(E,A,C,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V,Y); 363(Y,A,D,E,I,K,M,N,Q,V,W); 375(P,A,D,E,G,H,I,K,M,Q,R,T,V,Y); 388(P,A,C,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 391(E,A,C,G,H,I,K,L,N,R,S,W); 395(K,A,D,E,G,M,Q,R,S,T,V); 402(N,C,I,K,L,S,V,Y); 416(E,A,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,T,V,W,Y); 419(T,D,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y); 420(A,D,F,G,H,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 421(H,A,C,D,E,I,K,L,M,N,R,V,W,Y); 423(N,C,D,E,F,H,I,L,R,S,T); 433(G,A,C,D,E,K,M,N,R); 434(A,C,D,E,F,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V); 471(N,C,D,E,H,Q,R,Y); 477(G,A,D,K,N,P,Q,R,T); 483(V,C,G,H,M,R,S,T); 484(N,A,E,G,H,Q,R,S); e 485(K,H,M,P,Q,S,T).

[000357] As posições produtivas em Amy 707 que estão dentro das Pontuações de Produtividade anteriormente descritas de "2, 3 e 4" e as substituições naquelas posições que são combináveis são listadas abaixo. A numeração da posição tem por base a proteína madura Amy707 listada na SEQ ID NO: 3. 1(H,A,C,E,F,I,K,L,M,N,Q,R,T,W); 2(H,A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,W); 3(N,A,C,D,E,F,K,L,M,Q,S,T,V); 4(G,D,E,F,H,I,K,L,M,P,S,T,W); 5(T,A,C,D,G,H,I,M,N,Q,S,V,W); 6(N,A,E,G,Q,S,T) 7(G,A,D,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 16(Y,A,D,E,H,N,T,W) 17(L,A,D,G,S,T,V); 20(D,A,C,E,G,H,I,N,S,Y) 22(N,E,G,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 23(H,F,M,Q,T) 25(N,A,C,G,K,M,S,T,V,Y); 26(R,K,Q,T); 27(L,A,I,V) 28(N,A,C,D,E,G,H,K,Q,R,W,Y); 29(S,A,C,D,E,F,H,K,M,N,R,T,V,W,Y) 30(D,E,M,N,Q,R); 32(S,C,D,E,G,I,L,M,N,Q,R,W,Y) 33(N,C,D,H,I,K,M,Q,R,T,V,W,Y); 35(K,A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q) 36(S,D,G,K,Q,T); 41(A,C,D,I,K,M,Q,S); 47(A,G,M,P,S); 50(G,C,S) 52(S,K,L,M,R,T); 54(N,A,C,D,E,F,G,M,Q,S,V,W); 56(V,E,N,S) 63(L,M,N,Q); 68(E,A,D,Q); 70(N,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,R,S,V) 73(G,D,E,K,M,Q,R,S,T,W,Y); 74(T,G,S); 77(T,A,I,N,S,V) 81(T,A,C,D,F,I,K,N,P,S); 82(R,A,C,F,I,K,M,Q,S,V,Y) 83(S,K,M,N,Q,R,T); 84(Q,C,D,E,F,K,L,M,N); 86(Q,E,H,I,K,R,T,V,W,Y) 87(A,D,K,M,T); 89(V,A,C,I); 90(T,G,M,Q,R,S) 91(S,A,E,H,K,M,N,Q,R,T,V); 94(N,A,C,D,F,G,H,K,L,M,Q,R) 95(N,A,C,D,F,G,H,I,Q,R,S,T,Y); 96(G,D,E,N); 98(Q,A,C,D,E,G,H,K,R) 99(V,A,C,I); 100(Y,C,F,I); 103(V,A,C,F,I,L,T); 110(G,A,P,S) 113(A,C,E,F,G,H,I,K,M,R,V,Y); 116(M,A,C,D,E,F,G,I,L,N,P,Q,R,T,V,W) 117(V,E,L,P,R,S,T); 118(R,D,E,G,L,Q,T,V,W); 123(N,A,C,L) 125(N,C,F,G,H,I,L,M,R,S,T,W,Y); 128(N,C,E,L,Y) 133(G,A,D,H,P,Q,S,T); 134(E,D,P,S,T,V); 135(Y,C,F,L,M,Q) 136(T,C,D,F,G,K,L,M,N,P,Q,R,Y); 138(E,D,L,M,N); 139(A,C,G) 142(R,C,E,F,G,H,K,S,T,Y); 144(D,E,I,K,M,S,Y) 146(P,A,C,D,E,F,G,H,M,R,S,W,Y); 147(G,A,D,I,L) 149(G,A,C,D,E,F,H,K,L,P,R,V,W); 150(N,H,L,M,P,R,S) 151(T,D,E,G,H,I,L,M,Q,V); 154(S,L,R,Y); 156(K,A,D,S) 158(R,A,C,K,L,N,Q); 160(Y,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S) 169(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,S,V,W,Y); 170(S,A,C,E,K) 171(R,M,S,T); 172(R,A,C,E,G,H,M,Q,S,Y); 173(L,A,C,D,F,H,K,N,W,Y) 174(N,D,G,H,I,L,P,S,T,V); 175(N,A,D,E,L,M,R,S); 179(K,C,L,M,Q); 181(R,A,C,E,F,I,L,M,N,Q,S,T,V,Y); 183(H,A,C,D,E,F,L,M,N,P,Q,V,W,Y); 184(G,A,C,D,E,L,N); 186(A,D,E,G,N); 195(N,F,L,W,Y); 206(I,C,H,M,N,S,T); 210(H,A,C,D,E,M,N,Q,R,S); 211(P,A,C,D,F,K,L,M,N,Q,S,V); 215(N,D,F,K,L,M,Q); 216(E,A,C,G,H,L,N,Q,S,T,Y); 218(R,A,C,E,F,H,K,M); 219(N,A,C,D,M,R,T); 222(V,A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,R,S,T,Y); 225(T,A,K,R); 226(N,A,D,E,K,Y); 227(T,A,E,K); 229(G,C,F,V); 231(D,E,G,T); 233(F,A,C,H,L,M,W,Y); 235(I,L,M,V); 244(S,D,E,H,N,Q); 247(R,A,E,L,T); 249(W,F,L,M); 250(I,L,M,V); 251(N,A,C,G,H,K,L,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 252(H,D,E,K,N); 257(T,A,M,S); 258(G,D,I,K,M,N,P,R,S,V); 259(K,A,C,D,E,G,H,P,Q,R,T); 260(N,D,K,P,R); 261(M,A,C,E,G,I,Q,T); 262(F,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,R,S,Y); 273(G,C,D,E,H,K,L,M,P,Q,S,T,V,Y); 280(Q,D,H,K,M,N,V); 285(N,E,K,M,S,T); 286(H,A,C,E,F,L,M,N,T,V); 287(S,A,D,N,Y); 288(V,C,I,L,T); 298(Y,F,R,W); 299(N,G,H,M,R,S,T,Y); 302(K,C,E,M,Q,R,S,T); 303(S,A,C,D,E,G,L,M,Q,R); 304(G,C,K,R,S,V); 306(N,A,D,G); 311(N,D,E,F,G,H,K,L,M,Q,R,T,Y); 312(I,L,M,V); 314(N,A,D,E,G,H,I,K,L,M,Q,S,T,V,Y); 318(V,C,I,L,M,S,T); 319(Q,A,D,E,G,H,N,R,Y); 320(R,A,D,E,H,K,M,N,Q,S,T,Y); 323(S,A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,R,T,V,Y); 324(H,A,C,K,M,Y); 326(V,A,C,H,M,N,T); 337(E,A,C,D,N,Q,S,T,Y); 339(A,G,S,T); 341(E,A,D,F,G,H,K,Y); 345(E,A,G,H,K,L,M,N,Q,S,T,Y); 346(E,A,C,D,G,H,K,M,N,Q,R,S,T,V,Y); 351(L,A,C,M,Q); 355(L,I,K,M,V); 356(T,C,I,L,Q,V); 357(L,A,H,M); 358(T,A,C,G,I,; 359(R,I,V,W); 360(E,A,C,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V,Y); 361(Q,A,C,D,E,G,H,S,T,V,W); 363(Y,A,D,E,I,K,M,N,Q,V,W); 364(P,A,C,G); 365(S,A,G,N,V); 366(V,C,I,L); 368(Y,G,L,M,Q); 372(Y,H,I,K,M,Q,R,T,V); 374(I,C,N,Q,S); 375(P,A,D,E,G,H,I,K,M,Q,R,T,V,Y); 377(H,A,G,K,M,T); 378(G,E,H,L,M,N); 379(V,A,I,L,M,N,Q,R,S,Y); 380(P,D,E,G,H,K,Q,S); 381(A,G,N,Q,R,S,T); 387(D,E,G,N); 388(P,A,C,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 389(I,E,F,G,L,M,Q,S,V); 391(E,A,C,G,H,I,K,L,N,R,S,W); 392(A,C,G,S); 394(Q,C,D,E,G,H,L,R,V,Y); 395(K,A,D,E,G,M,Q,R,S,T,V); 396(Y,K,M,N); 400(K,A,F,G,H,I,L,M,Q,T,V,W); 402(N,C,I,K,L,S,V,Y); 405(L,A,C,M,N,T,V); 406(D,A,C,L,N,Q); 408(H,E,G,K,M,N,P,Q,R,S,T); 413(W,F,H,I,L,Y); 414(T,A,C,S,V); 415(R,C,W,Y); 416(E,A,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,T,V,W,Y); 418(N,A,D,I,K,L,M,Q,S,T,V); 419(T,D,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y); 420(A,D,F,G,H,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 421(H,A,C,D,E,I,K,L,M,N,R,V,W,Y); 422(P,A,C,E,F,G,L,M,T,V,Y); 423(N,C,D,E,F,H,I,L,R,S,T); 424(S,A,C,D,E,G,I,N,Q,T,V,W); 426(L,A,N,S); 430(M,G,I,L,V); 433(G,A,C,D,E,K,M,N,R); 434(A,C,D,E,F,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V); 435(G,A,C,E,K,M,N,P,Q,R,T); 436(G,A,C,D,Q,S); 437(S,A,C,D,K,N,T); 438(K,C,E,H,S); 439(W,H,L,M,Q); 441(F,H,N,Y); 444(R,A,K,Q); 445(N,A,C,E,G,K,Q,R,T); 446(K,A,C,F,H,M,Q,S,T,Y); 450(V,A,E,I,L,Q,R,S,T); 452(S,A,C,E,F,H,K,N,Q,T,W,Y); 454(I,A,C,F,L,M,S,V); 457(N,G,H,Q,R,T); 458(R,C,D,E,H,K,L,M,N,S,T,V,Y); 459(T,A,C,D,E,G,H,L,N,P,S); 460(G,E,H,K,N,Q,S); 461(T,A,C,D,E,F,G,K,L,N,P,Q,R,V,Y); 463(T,E,K,L,P,Q,R); 465(N,D,G,Q); 466(A,D,E,G,K,N,P,Q,R,S); 471(N,C,D,E,H,Q,R,Y); 476(G,D,E,H,N,R); 477(G,A,D,K,N,P,Q,R,T); 481(I,L,T,V); 483(V,C,G,H,M,R,S,T); 484(N,A,E,G,H,Q,R,S); e 485(K,H,M,P,Q,S,T).

[000358] As posições produtivas em Amy 707 que estão dentro das Pontuações de Produtividade anteriormente descritas de "1, 2, 3 e 4" e as substituições naquelas posições que são combináveis são listadas abaixo. A numeração da posição tem por base a proteína madura Amy707 listada na SEQ ID NO: 3. 1(H,A,C,E,F,I,K,L,M,N,Q,R,T,W); 2(H,A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,W) 3(N,A,C,D,E,F,K,L,M,Q,S,T,V); 4(G,D,E,F,H,I,K,L,M,P,S,T,W) 5(T,A,C,D,G,H,I,M,N,Q,S,V,W); 6(N,A,E,G,Q,S,T) 7(G,A,D,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 10(M,I,L); 12(Y,A) 16(Y,A,D,E,H,N,T,W); 17(L,A,D,G,S,T,V); 18(P,A,E); 19(N,D,L) 20(D,A,C,E,G,H,I,N,S,Y); 22(N,E,G,I,L,M,Q,R,S,T,V,W) 23(H,F,M,Q,T); 25(N,A,C,G,K,M,S,T,V,Y); 26(R,K,Q,T); 27(L,A,I,V) 28(N,A,C,D,E,G,H,K,Q,R,W,Y); 29(S,A,C,D,E,F,H,K,M,N,R,T,V,W,Y) 30(D,E,M,N,Q,R); 31(A,S); 32(S,C,D,E,G,I,L,M,N,Q,R,W,Y) 33(N,C,D,H,I,K,M,Q,R,T,V,W,Y); 34(L,F,M) 35(K,A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q); 36(S,D,G,K,Q,T); 40(T,K,N) 41(A,C,D,I,K,M,Q,S); 47(A,G,M,P,S); 50(G,C,S); 52(S,K,L,M,R,T) 53(Q,A); 54(N,A,C,D,E,F,G,M,Q,S,V,W); 56(V,E,N,S); 61(Y,F) 63(L,M,N,Q); 64(Y,H); 66(L,M,V); 68(E,A,D,Q) 70(N,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,R,S,V); 72(K,R) 73(G,D,E,K,M,Q,R,S,T,W,Y); 74(T,G,S); 75(V,I,M); 77(T,A,I,N,S,V) 81(T,A,C,D,F,I,K,N,P,S); 82(R,A,C,F,I,K,M,Q,S,V,Y) 83(S,K,M,N,Q,R,T); 84(Q,C,D,E,F,K,L,M,N); 86(Q,E,H,I,K,R,T,V,W,Y) 87(A,D,K,M,T); 88(A,M); 89(V,A,C,I); 90(T,G,M,Q,R,S) 91(S,A,E,H,K,M,N,Q,R,T,V); 93(K,H,R); 94(N,A,C,D,F,G,H,K,L,M,Q,R) 95(N,A,C,D,F,G,H,I,Q,R,S,T,Y); 96(G,D,E,N); 97(I,V) 98(Q,A,C,D,E,G,H,K,R); 99(V,A,C,I); 100(Y,C,F,I); 101(G,A) 103(V,A,C,F,I,L,T); 110(G,A,P,S); 111(A,S); 112(D,C,E) 113(A,C,E,F,G,H,I,K,M,R,V,Y); 115(E,Q) 116(M,A,C,D,E,F,G,I,L,N,P,Q,R,T,V,W); 117(V,E,L,P,R,S,T) 118(R,D,E,G,L,Q,T,V,W); 119(A,C,S); 122(V,C); 123(N,A,C,L) 124(P,N,T); 125(N,C,F,G,H,I,L,M,R,S,T,W,Y); 126(N,D) 128(N,C,E,L,Y); 129(Q,V); 132(T,S); 133(G,A,D,H,P,Q,S,T) 134(E,D,P,S,T,V); 135(Y,C,F,L,M,Q); 136(T,C,D,F,G,K,L,M,N,P,Q,R,Y) 138(E,D,L,M,N); 139(A,C,G); 140(W,F,Y); 142(R,C,E,F,G,H,K,S,T,Y) 144(D,E,I,K,M,S,Y); 145(F,M,Y); 146(P,A,C,D,E,F,G,H,M,R,S,W,Y) 147(G,A,D,I,L); 149(G,A,C,D,E,F,H,K,L,P,R,V,W); 150(N,H,L,M,P,R,S) 151(T,D,E,G,H,I,L,M,Q,V); 153(S,N); 154(S,L,R,Y); 155(F,W) 156(K,A,D,S); 158(R,A,C,K,L,N,Q) 160(Y,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S); 162(F,M); 165(V,C,T) 167(W,F,M); 168(D,C); 169(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,S,V,W,Y) 170(S,A,C,E,K); 171(R,M,S,T); 172(R,A,C,E,G,H,M,Q,S,Y) 173(L,A,C,D,F,H,K,N,W,Y); 174(N,D,G,H,I,L,P,S,T,V) 175(N,A,D,E,L,M,R,S); 176(R,K,T); 178(Y,W); 179(K,C,L,M,Q) 181(R,A,C,E,F,I,L,M,N,Q,S,T,V,Y); 182(G,C,D) 183(H,A,C,D,E,F,L,M,N,P,Q,V,W,Y); 184(G,A,C,D,E,L,N) 186(A,D,E,G,N); 195(N,F,L,W,Y); 196(G,C); 203(Y,N) 206(I,C,H,M,N,S,T); 210(H,A,C,D,E,M,N,Q,R,S) 211(P,A,C,D,F,K,L,M,N,Q,S,V); 215(N,D,F,K,L,M,Q) 216(E,A,C,G,H,L,N,Q,S,T,Y); 217(L,M); 218(R,A,C,E,F,H,K,M) 219(N,A,C,D,M,R,T); 221(G,I,V); 222(V,A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,R,S,T,Y) 225(T,A,K,R); 226(N,A,D,E,K,Y); 227(T,A,E,K); 228(L,I,M) 229(G,C,F,V); 230(L,M); 231(D,E,G,T); 233(F,A,C,H,L,M,W,Y) 235(I,L,M,V); 238(V,I); 243(Y,F); 244(S,D,E,H,N,Q); 245(F,E,M) 247(R,A,E,L,T); 249(W,F,L,M); 250(I,L,M,V) 251(N,A,C,G,H,K,L,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 252(H,D,E,K,N); 253(V,M) 257(T,A,M,S); 258(G,D,I,K,M,N,P,R,S,V); 259(K,A,C,D,E,G,H,P,Q,R,T) 260(N,D,K,P,R); 261(M,A,C,E,G,I,Q,T) 262(F,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,R,S,Y); 263(A,S); 265(A,G,S) 273(G,C,D,E,H,K,L,M,P,Q,S,T,V,Y); 276(E,C,T); 280(Q,D,H,K,M,N,V) 283(N,D,G); 285(N,E,K,M,S,T); 286(H,A,C,E,F,L,M,N,T,V) 287(S,A,D,N,Y); 288(V,C,I,L,T); 292(P,L,M); 296(N,Q); 297(L,M) 298(Y,F,R,W); 299(N,G,H,M,R,S,T,Y); 301(S,A,G) 302(K,C,E,M,Q,R,S,T); 303(S,A,C,D,E,G,L,M,Q,R); 304(G,C,K,R,S,V) 306(N,A,D,G); 307(Y,A,F); 310(R,Q,S); 311(N,D,E,F,G,H,K,L,M,Q,R,T,Y); 312(I,L,M,V); 313(F,M,Y); 314(N,A,D,E,G,H,I,K,L,M,Q,S,T,V,Y); 317(V,L); 318(V,C,I,L,M,S,T); 319(Q,A,D,E,G,H,N,R,Y); 320(R,A,D,E,H,K,M,N,Q,S,T,Y); 321(H,W,Y); 322(P,D); 323(S,A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,R,T,V,Y); 324(H,A,C,K,M,Y); 326(V,A,C,H,M,N,T); 327(T,L); 328(F,V); 329(V,I); 334(S,T); 337(E,A,C,D,N,Q,S,T,Y); 339(A,G,S,T); 341(E,A,D,F,G,H,K,Y); 343(F,T,Y); 344(V,C,I); 345(E,A,G,H,K,L,M,N,Q,S,T,Y); 346(E,A,C,D,G,H,K,M,N,Q,R,S,T,V,Y); 347(W,A,D); 350(P,E); 351(L,A,C,M,Q); 352(A,S); 354(A,S); 355(L,I,K,M,V); 356(T,C,I,L,Q,V); 357(L,A,H,M); 358(T,A,C,G,I,; 359(R,I,V,W); 360(E,A,C,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V,Y); 361(Q,A,C,D,E,G,H,S,T,V,W); 363(Y,A,D,E,I,K,M,N,Q,V,W); 364(P,A,C,G); 365(S,A,G,N,V); 366(V,C,I,L); 367(F,Y); 368(Y,G,L,M,Q); 369(G,A,S); 372(Y,H,I,K,M,Q,R,T,V); 374(I,C,N,Q,S); 375(P,A,D,E,G,H,I,K,M,Q,R,T,V,Y); 377(H,A,G,K,M,T); 378(G,E,H,L,M,N); 379(V,A,I,L,M,N,Q,R,S,Y); 380(P,D,E,G,H,K,Q,S); 381(A,G,N,Q,R,S,T); 382(M,K); 386(I,L,V); 387(D,E,G,N); 388(P,A,C,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 389(I,E,F,G,L,M,Q,S,V); 390(L,M,V); 391(E,A,C,G,H,I,K,L,N,R,S,W); 392(A,C,G,S); 394(Q,C,D,E,G,H,L,R,V,Y); 395(K,A,D,E,G,M,Q,R,S,T,V); 396(Y,K,M,N); 397(A,G); 400(K,A,F,G,H,I,L,M,Q,T,V,W); 401(Q,H,M); 402(N,C,I,K,L,S,V,Y); 403(D,E,T); 405(L,A,C,M,N,T,V); 406(D,A,C,L,N,Q); 408(H,E,G,K,M,N,P,Q,R,S,T); 410(I,N); 411(I,V); 412(G,A,S); 413(W,F,H,I,L,Y); 414(T,A,C,S,V); 415(R,C,W,Y); 416(E,A,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,T,V,W,Y); 417(G,A); 418(N,A,D,I,K,L,M,Q,S,T,V); 419(T,D,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y); 420(A,D,F,G,H,I,L,M,Q,R,S,T,V,W); 421(H,A,C,D,E,I,K,L,M,N,R,V,W,Y); 422(P,A,C,E,F,G,L,M,T,V,Y); 423(N,C,D,E,F,H,I,L,R,S,T); 424(S,A,C,D,E,G,I,N,Q,T,V,W); 425(G,A); 426(L,A,N,S); 427(A,C,T); 428(T,N,S); 429(I,M); 430(M,G,I,L,V) 431(S,A,C); 433(G,A,C,D,E,K,M,N,R) 434(A,C,D,E,F,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V); 435(G,A,C,E,K,M,N,P,Q,R,T) 436(G,A,C,D,Q,S); 437(S,A,C,D,K,N,T); 438(K,C,E,H,S) 439(W,H,L,M,Q); 441(F,H,N,Y); 442(V,A,C); 444(R,A,K,Q) 445(N,A,C,E,G,K,Q,R,T); 446(K,A,C,F,H,M,Q,S,T,Y); 448(G,F,N) 450(V,A,E,I,L,Q,R,S,T); 451(W,F); 452(S,A,C,E,F,H,K,N,Q,T,W,Y) 454(I,A,C,F,L,M,S,V); 457(N,G,H,Q,R,T) 458(R,C,D,E,H,K,L,M,N,S,T,V,Y); 459(T,A,C,D,E,G,H,L,N,P,S) 460(G,E,H,K,N,Q,S); 461(T,A,C,D,E,F,G,K,L,N,P,Q,R,V,Y) 463(T,E,K,L,P,Q,R); 465(N,D,G,Q); 466(A,D,E,G,K,N,P,Q,R,S) 467(D,E); 469(W,Y); 471(N,C,D,E,H,Q,R,Y); 473(S,P); 474(V,S) 475(N,D,E); 476(G,D,E,H,N,R); 477(G,A,D,K,N,P,Q,R,T); 478(S,A,G) 479(V,T); 481(I,L,T,V); 482(W,Y); 483(V,C,G,H,M,R,S,T) 484(N,A,E,G,H,Q,R,S); e 485(K,H,M,P,Q,S,T).

Claims

1. Polipeptídeo de alfa-amilase variante, caracterizada pelo fato de que apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 com uma ou mais mutações, sendo que pelo menos uma das mutações é uma mutação na posição 5 para A, C, D, G, H, I, M, N, Q, S ou W, usando SEQ ID NO: 3 para numeração, sendo que a α-amilase variante apresenta atividade de α- amilase, sendo que a α-amilase variante tem um índice de desempenho (PI) em relação à amilase parental para estabilidade em detergente que é maior do que 1,0, sendo que a variante não tem expressão, atividade ou estabilidade significativamente diminuídas em relação à molécula parental, sendo que o PI para a variante é calculado tratando-se a α- amilase variante e a amilase parental com o mesmo detergente, sob as mesmas condições, na mesma concentração de proteína e comparando a estabilidade em detergente da variante com a estabilidade em detergente da amilase parental, sendo que a variante opcionalmente compreende ainda uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em: 1(A,F,I,K,L,M,N,Q,R,T,W); 2(C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,W); 3(A,C,D,E,F,K,L,M,Q,S,T,V); 4(E,F,H,I,L,P,S,T,W); 5(D,G,H,I,M,Q,S,W); 6(A,S); 7(H,M,P,Q,R,S,V); 12(A); 16(A,D,E,N,W); 17(A,G,S,T); 19(D); 20(A,C,G,N,S,Y); 22(E,L,Q,R,S,T,W); 23(F,M,Q,T); 25(A,C,G,K,S,T,V,Y); 26(K,Q,T); 27(I,V); 28(N,A,C,D,E,G,H,K,Q,R,W,Y); 29(A,C,D,E,F,H,K,M,N,R,T,V,W,Y); 30(E,M,N,Q,R); 31(S); 32(I,L,M,N,Q,R,W,Y); 33(C,D,H,I,K,M,Q,R,T,V,W,Y); 34(F,M); 35(A,G,H,M,N,Q); 36(S,D,G,K,Q,T); 40(T,N); 41(C,S); 47(S); 50(C,S); 52(K,M,R,T); 53(A); 54(A,C,D,E,F,G,Q,S,V,W); 56(E); 61(F); 63(M); 64(H); 66(M); 68(A,Q); 70(C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,S,V); 72(R); 73(K,M,Q,R,S,T,Y); 74(S); 75(V,I) 77(I,N,V); 81(A,C,D,F,I,K,N,P,S); 82(A,C,F,I,K,M,S,V,Y) 83(S,K,N,Q,R,T); 84(D,E,K,M,N); 86(E,I,K,R,T,V,W,Y); 87(D,K,M,T) 88(M); 89(A,C,I); 90(G,M,Q,R,S); 91(S,A,E,H,K,N,Q,R,T,V); 93(R) 94(N,A,C,D,F,G,H,K,L,M,Q,R); 95(A,C,F,H,I,Q,R,S,T,Y) 98(A,C,D,E,G,H,K,R); 99(C,I); 100(C,F,I); 103(A,C, L,T); 110(A); 112(E) 113(C,E,F,G,H,K,M,R); 115(Q); 116(A,C,D,E,F,G,I,L,N,Q,R,T,W) 117(E,P,R,S,T); 118(E,G,Q,T,W); 119(C,S); 122(C) 125(C,F,G,H,I,L,M,R,S,T,W); 126(D); 128(C,L,Y); 132(T,S) 133(A,D,H,P,Q,S,T); 134(D,P,S,T); 135(C,F,L,M) 136(C,D,G,K,L,M,N,P,Q,R); 140(F,Y); 142(R,C,E,F,G,H,K,S,Y) 144(E,I,K,M,S,Y); 145(M,Y); 147(A,D,I,L); 149(A,C,D,E,F,H,K,L,R,V) 150(P,R,S); 151(E,G,H,I,L,M,Q,V); 154(S); 156(S); 158(C,K,N,Q) 160(A,C,D,E,F,H,K,N,Q,R,S); 165(C,T); 169(A,C,D,E,H,M,N,S,V) 170(A,C,E,K); 171(M,S,T); 172(R,A,C,E,G,H,M,Q,S) 173(A,C,F,H,W,Y); 174(D,G,H,I,L,P,S,T,V); 175(A,D,E,L,R,S) 179(M,Q); 181(C,E,F,I,M,Q,S,V,Y); 182(D) 183(H,A,C,D,E,F,L,M,P,Q,V,W,Y); 184(C,N); 186(A,D,E,G,N) 195(L,W); 196(C); 203(Y,N); 206(C,M,T); 210(D,) 211(A,C,D,F,K,M,N,Q,S,V); 215(D,K,M,Q); 216(A,C,H,Q,S,T,Y) 219(D,R,T); 222(A,D,F,G,H,I,L,N,R,S,T,Y); 225(K,R); 226(A,D,E,K) 227(A,E,K); 228(I,M); 231(E,G,T); 233(A,W); 235(L,M,V); 243(F) 244(D,E,H,N,Q); 247(A,E,T); 250(L,M,V) 251(C,G,K,L,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 252(D,E,K,N); 257(A,M,S) 258(D,K,N,R); 259(A,C,G,H,P,Q); 260(D,K,P,R); 261(A,C,E,I,Q,T) 262(M); 263(S); 265(G,S); 273(D,E,H,L,M,P,Q,S,T,V,Y); 276(T) 280(Q,D,H,K,N); 283(D,G); 285(E,K,M,S,T); 286(A,C,E,L,M,T,V) 288(I,T); 296(Q); 297(M); 298(F,R,W); 299(G,H,R,S,T); 301(A,G) 302(C,E,M,Q,R,S); 303(A,C,D,E,G,L,M,Q,R); 304(K,R,S,V) 306(A,D,G); 307(A,F); 310(Q,S); 311(N,D,E,F,G,H,K,L,M,Q,R,T,Y) 312(M,V); 314(A,D,E,G,H,I,K,L,Q,S,T,V,Y); 318(C,I,L,T) 319(A,D,E,G,H,N,R); 320(A,E,H,K,M,N,Q,S,T); 321(W,Y) 323(S,C,D,E,F,G,H,I,L,M,R,T,V,Y); 324(Y); 326(A,M,N,T); 327(L); 328(V); 329(I); 337(C,D,N,Q,S,T); 339(S); 341(A,D,H,Y); 343(T,Y); 344(C,I); 345(A,G,H,K,L,M,N,Q,S,T,Y); 346(A,C,D,G,H,K,M,N,Q,R,S,T,V,Y); 350(E); 351(M,Q); 352(S); 354(S); 355(I,K,M,V); 356(I,L); 357(M); 358(C); 359(V); 360(A,C,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V,Y); 361(A,C,D,E,G,S,W); 363(A,D,E,K,M,N,Q); 364(A); 365(A,N); 366(I,L); 367(Y); 368(M,Q); 372(H,I,K,M,Q,T,V); 374(N,Q,S); 375(A,D,E,G,H,I,K,M,R,T,V,Y); 377(G,K,M,T); 378(E,H,M,N); 379(I,M,N,Q,R,S,Y); 380(D,E,G,H,K,Q,S); 381(G,N,Q,R,S,T); 387(G); 388(A,C,D,F,G,K,L,Q,R,T,V,Y); 389(E,G,L,M,Q,S,V); 390(V); 391(A,C,G,H,I,K,L,N,R,W); 392(C,G,S); 394(C,D,G,L,R,V,Y); 395(A,D,E,G,M,Q,R,S,T); 396(K,M,N); 397(G); 400(K,F,G,H,L,M,Q,T,V,W); 401(H,M); 402(C,I,K,L,S,Y); 405(C,M,N,T,V); 406(N); 408(E,G,K,M,N,P,Q,R,S,T); 411(V); 412(A,S); 413(F,H,I,L,Y); 414(A,C,S,V); 416(A,D,F,G,H,K,L,N,Q,R,T,V,W,Y); 418(A,D,K,L,M,Q,S,T,V); 419(D,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y); 421(A,C,D,E,I,K,L,M,N,R,W,Y); 422(C,E,F,G,L,M,T,V,Y); 423(C,D,E,F,H,I,L,R,S,T); 424(A,C,D,G,I,Q,T,W); 425(A); 426(A,N,S); 427(C,T); 428(N,S); 429(M); 430(G,I,L,V); 433(A,D,E,K,N,R); 434(C,D,E,F,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V); 435(A,C,K,M,N,P,Q,R); 436(S); 437(S,A,D,K,N,T); 438(H,S); 439(H,M,Q); 441(H,N,Y); 442(C); 444(K); 445(A,E,G,K,Q,R,T); 446(A,C,F,H,M,Q,S); 450(E,I,Q,R,S,T); 451(F); 452(S,A,C,E,F,K,N,Q,T,W,Y); 454(A,L,V); 457(G,H,Q,R); 458(C,E,H,K,M,N,S,T,V,Y); 459(T,L,N,S); 460(E,H,Q,S); 461(A,C,D,E,G,K,L,N,P,Q,R,V,Y); 463(E,K,P,Q,R); 465(D,G); 466(D,E,G,K,N,P,Q,R,S); 467(E); 471(C,D,E,H,Q,R,Y); 473(P); 474(S); 475(D,E); 476(D,E,R); 477(A,N,Q,R); 478(G); 479(T); 481(L,T,V); 482(Y); 483(C,G,H,M,R,S,T); 484(A,E,G,H,Q,R,S); e 485(H,Q,S,T), sendo que cada mutação é identificada entre parênteses após a posição numérica usando a SEQ ID NO: 3 para numeração, em que a variante opcionalmente compreende ainda uma deleção correspondente a um resíduo selecionado a partir do grupo que consiste em Arg-181, Gly-182, His-183 e Gly-184, usando a SEQ ID NO: 3 para numeração, mais preferencialmente, deleções correspondentes aos resíduos Arg-181 e Gly-182, usando a SEQ ID NO: 3 para numeração.

2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a alfa-amilase variante conforme definida na reivindicação 1, compreendendo ainda(a) um tensoativo, em que a composição é opcionalmente uma composição detergente, e/ou(b) uma ou mais enzimas adicionais selecionadas do grupo que consiste em protease, hemicelulase, celulase, peroxidase, enzima lipolítica, enzima metalolipolítica, xilanase, lipase, fosfolipase, esterase, peridrolase, cutinase, pectinase, pectato liase, mananase, queratinase, redutase, oxidase, fenoloxidase, lipoxigenase, ligninase, pululanase, tanase, pentosanase, malanase, β-glucanase, arabinosidase, hialuronidase, condroitinase, lacase e uma amilase diferente da amilase conforme definida na reivindicação 1.

3. Método para remover uma mancha ou sujeira amilácea de uma superfície, que é opcionalmente um têxtil ou superfície de louça, caracterizado pelo fato de que compreende:colocar a superfície em contato com uma composição aquosa que compreende uma quantidade eficaz da alfa-amilase variante conforme definida na reivindicação 1, ou com a composição como definida na reivindicação 2,permitir que o polipeptídeo hidrolise os componentes amiláceos presentes na mancha amilácea para produzir moléculas derivadas de amido menores que se dissolvem na composição aquosa, e enxaguar a superfície, removendo assim a mancha amilácea da superfície.

4. Método para sacarificar uma composição que compreende amido, que é opcionalmente amido liquefeito, amido gelatinizado ou amido granular, para produzir uma composição que compreende glicose, caracterizado pelo fato de que compreende:(i) colocar a solução que compreende amido em contato com uma quantidade eficaz da alfa-amilase variante conforme definida na reivindicação 1; e(ii) sacarificar a solução que compreende amido para produzir a composição que compreende glicose; em que a alfa-amilase variante catalisa a sacarificação da solução de amido em glicose.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sacarificação é conduzida sob qualquer uma das seguintes condições: (a) em uma faixa de temperatura de cerca de 30 °C a cerca de 75 °C, mais preferencialmente 47°C a 74 °C; e/ou (b) uma faixa de pH de pH 2,0 a 7,5, mais preferencialmente pH 3,5 a 5,5 ou pH 3,5 a 4,5.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda fermentar a composição de glicose para produzir um produto de fim de fermentação (EOF).

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a fermentação é uma reação simultânea de sacarificação e fermentação (SSF), que é opcionalmente conduzida por 48 a 70 horas em pH 2 a 8 e em uma faixa de temperatura de 25 °C a 70 °C.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o compreende ainda o contato de um mingau e/ou um mosto com uma amilase, em que o método opcionalmente compreende ainda: (a) preparar um mingau; (b) filtrar o mingau para obter um mosto; e (c) fermentar o mosto para obter uma bebida fermentada, em que a alfa-amilase variante conforme definida na reivindicação 1 é adicionada a: (i) o mingau da etapa (a) e/ou (ii) o mosto da etapa (b) e/ou (iii) o mosto da etapa (c).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o produto EOF compreende: (a) etanol, que é opcionalmente etanol a 8 a 18% (v/v); ou (b) um metabólito, que é opcionalmente ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glucônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, glucono delta-lactona, eritorbato de sódio, ácido graxo ômega 3, butanol, um amino ácido, lisina, ácido itacônico, 1,3-propanodiol ou isopreno; ou (c) uma cerveja selecionada do grupo que consiste em cerveja puro malte, cerveja fabricada sob o "Reinheitsgebot", ale, IPA, lager, amarga, Happoshu (segunda cerveja), terceira cerveja, cerveja seca, quase cerveja, cerveja light, cerveja com baixo teor de álcool, cerveja com baixas calorias, porter, cerveja bock, stout, licor de malte, cerveja não alcoólica e licor de Malte não alcoólico; ou (d) uma bebida de cereal ou malte selecionada do grupo que consiste em bebidas de malte com sabor de frutas, bebidas de malte com sabor de licor e bebidas de malte com sabor de café.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a adição de glicoamilase, hexoquinase, xilanase, glicose isomerase, xilose isomerase, fosfatase, fitase, pululanase, β-amilase, alfa-amilase que não é a alfa-amilase variante, protease, celulase, hemicelulase, lipase, cutinase, isoamilase, enzima redox, esterase, transferase, pectinase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase ou uma combinação destes, à solução de amido.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10, caracterizado pelo fato de que a alfa-amilase variante é expressa e segretada por uma célula hospedeira, em que a composição que compreende amido é opcionalmente colocada em contato com a célula hospedeira e/ou em que a célula hospedeira expressa e secreta ainda uma glicoamilase ou outra enzima, e é opcionalmente capaz de fermentar a composição.

12. Método de produção de uma composição alimentícia, caracterizado pelo fato de que compreende: combinar (i) um ou mais ingredientes alimentícios, e (ii) uma alfa-amilase variante, conforme definida na reivindicação 1, em que a alfa-amilase variante catalisa a hidrólise dos componentes de amido presentes nos ingredientes alimentícios para produzir glicose.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a composição alimentícia é selecionada a partir do grupo que consiste em um produto alimentício, uma composição de panificação, um aditivo alimentício, um produto alimentício animal, um produto de ração, um aditivo alimentício, um óleo, uma carne, uma banha, e em que a composição alimentícia compreende opcionalmente uma massa ou um produto de massa, de preferência um produto de massa processado.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que um ou mais ingredientes alimentícios: (a) compreendem um ingrediente de panificação ou um aditivo; e/ou (b) é selecionado do grupo que consiste em farinha; uma amilase anti-envelhecimento; uma fosfolipase; um fosfolipídio; uma alfa- amilase maltogênica ou uma variante, homólogo ou mutantes desta que tem atividade de alfa-amilase maltogênica; uma xilanase de panificação; e uma lipase; e/ou (c) é/são selecionados a partir do grupo que consiste em: (i) uma alfa-amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus, (ii) uma xilanase de panificação de Bacillus, Aspergillus, Thermomyces ou Trichoderma, (iii) uma glicolipase de Fusarium heterosporum.

15. Método de desengomagem de um têxtil, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma composição de desengomagem em contato com um têxtil engomado por um tempo suficiente para desengomar o têxtil, em que a composição de desengomagem compreende uma alfa-amilase variante como definida em na reivindicação 1.

16. Célula hospedeira de bactéria, fungo filamentoso e/ou levedura, caracterizada pelo fato de que expressa a alfa-amilase variante como definida na reivindicação 1.