KR20210005227A - 말토덱스트린 및 특수 시럽 제조를 위한 단순화된 공정 - Google Patents
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Abstract
현행 효소 공정에 필요한 것보다 더 적은 수의 효소 및 덜 복잡한 조건을 사용하여 말토덱스트린 및 특수 시럽을 생성하기 위한 단순화된 공정과 관련된 조성물 및 방법이 개시된다.
Description
본 발명의 조성물 및 방법은 현재의 효소 공정에 필요한 것보다 더 적은 수의 효소 및 덜 복잡한 조건을 사용하여 말토덱스트린 및 특수 시럽을 생성하는 단순화된 공정에 관한 것이다.
옥수수 시럽, 포도당 시럽, 말토덱스트린 및 고 과당 시럽(high fructose syrup)과 같은 전분 기반 감미료는 통상적으로 산 또는 효소 처리를 사용한 전분의 액화, 이어서 원하는 덱스트로스 당량(dextrose equivalent; DE)이 달성될 때까지의 효소 당화에 의해 생성된다. 옥수수 시럽의 물리적 특성은 그의 조성에 따라 상당히 달라진다. 옥수수 시럽은 덱스트로스 당량(DE)을 바탕으로 4가지 유형으로 분류된다. 제1형 옥수수 시럽은 DE가 20 내지 38이다. 제2형 옥수수 시럽은 DE가 38~58이다. 제3형 옥수수 시럽은 DE가 58~73이다. 제4형 옥수수 시럽은 DE가 73보다 크다. 도 1의 표에는 종래의 공정에서 생성되는 다양한 시럽의 DE가 더욱 상세하게 서술되어 있다.
효소적 가공이 산 처리 공정보다 선호되고 있으며, 34~43의 범위의 DE를 갖는 특수 시럽은 현재 α-아밀라아제 및 말토제닉(maltogenic) 효소, 예컨대 말토제닉 아밀라아제, β-아밀라아제, 풀룰라나아제 및 글루코아밀라아제에 의해 지원되는 부분 당화와 액화의 조합에 의해 생성되고 있다. 이러한 말토제닉 효소는 원하는 당 프로파일에 따라 조합되어 사용되거나 개별적으로 사용된다.
효소들의 배터리에 더하여, 액화 후 덱스트린화 전분의 전환은 16~18시간이 필요하고 엄격하게 따라야 할 필요가 있는 일련의 단계를 필요로 한다. 이러한 단계는 (i) HCl을 사용하여 90℃에서 pH를 4.50 미만(바람직하게는 pH 4.20~4.30)까지 감소시켜 액화 α-아밀라아제를 불활성화시키는 것, (ii) 글루코아밀라아제 또는 다른 말토제닉 효소의 최적 성능을 위하여 액화물을 60℃까지 냉각시키는 것, (iii) 당화된 액화물을 85~90℃까지 가열하여 글루코아밀라아제 또는 다른 말토제닉 효소를 불활성화시키는 것 및 (iv) 당화된 액화을 60℃까지 냉각시켜 생성물을 원하는 수준의 DS까지 농축시키는 것을 포함한다. 이 공정은 번거롭고 에너지, 시간 및 인력 집약적이다.
말토덱스트린 분말 및 특수 시럽을 생성하기 위한 개선된 공정에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 조성물 및 방법은 말토덱스트린 및 특수 시럽을 생성하는 단순화된 공정에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법의 양태 및 실시 형태는 개별적으로 넘버링된 하기 파라그래프에 요약되어 있다:
1. 일 양태에서, 말토덱스트린 및/또는 특수 시럽을 생성하기 위한 방법이 제공되며, 이는 말토제닉 아밀라아제(EC 3.2.1.133), β-아밀라아제(EC 3.2.1.2), 풀룰라나아제(EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(EC 3.2.1.3) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 말토제닉 효소의 실질적인 부재 하에 전분 기질을, 말토제닉 효소를 포함하는 통상적인, 다중-효소, 산 전처리 조건에 의해 생성되는 DE 프로파일과 동등한 DE 프로파일을 포함하는 시럽을 생성할 수 있는 α-아밀라아제(EC 3.2.1.1)와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 본 방법에서는 상이한 통상적인 액화 α-아밀라아제를 사용하는 동일 공정에서 적어도 하나의 pH 조정 또는 온도 조정 단계가 실질적으로 제거된다.
2. 일부 실시 형태에서, 파라그래프 1의 방법은 말토제닉 아밀라아제 활성을 가질 수 있는 소정의 말토제닉 효소(α-아밀라아제는 제외)의 부재 하에 수행된다.
3. 일부 실시 형태에서, 파라그래프 2의 방법은 말토제닉 아밀라아제 활성을 가질 수 있는 모든 말토제닉 효소(α-아밀라아제는 제외)의 부재 하에 수행된다.
4. 파라그래프 1 내지 3 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, 공정 단계는 액화물의 pH를 감소시켜 상이한 통상적인 액화 α-아밀라아제를 불활성화시키는 것, 액화물을 냉각시켜 말토제닉 효소의 최적의 성능을 촉진하는 것, 당화된 액화물을 가열하여 말토제닉 효소를 불활성화시키는 것, 및 당화된 액화물을 냉각시켜 생성물을 농축시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
5. 파라그래프 1 내지 4 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, α-아밀라아제는 사이토파가(Cytophaga) sp.로부터 유래된다.
6. 파라그래프 1 내지 5 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, α-아밀라아제는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 사이토파가 sp. 유래의 α-아밀라아제, 또는 이의 변이체이다.
7. 파라그래프 1 내지 5 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, 통상적인 액화 α-아밀라아제는 바실러스(Bacillus)로부터 유래된다.
본 조성물 및 방법의 이들 및 다른 양태 및 실시 형태는 본 설명 및 도면으로부터 명백할 것이다.
도 1은 현재 효소 공정에 의해 생성되는 다양한 시럽의 DE를 상술한 표를 나타낸다.
1. 서문
현재의 효소 공정에 필요한 것보다 더 적은 수의 효소 및 덜 복잡한 조건을 사용하여 말토덱스트린 및 특수 시럽을 생성하기 위한 단순화된 공정과 관련된 조성물 및 방법이 개시된다. 특정 α-아밀라아제는 말토덱스트린과 DE가 30~46의 범위인 제1형 및 제2형 특수 시럽(도 1)을 생성하는 능력을 갖고 있음이 발견된 바 있는데, 이는 더 전통적인 산-효소 공정을 이용하여 생성된 상업용 시럽의 프로파일과 일치한다(예를 들어, 문헌[Shukla, P. and Pletschke, B.I. (eds.) Advances in Enzyme Biotechnology, Springer Science & Business Media, 2013] 참조). 개선된 공정은 추가적인 말토제닉 효소를 필요로 하지 않으며 훨씬 더 간단한 공정 조건을 필요로 한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 이점은 (i) 더 적은 냉각 및 가열 단계의 결과로 인한 에너지 절약, (ii) 증가된 공장 처리량 및 더 원활한 작업 및 (iii) 냉각 및 가열 단계의 제거로 인한 시간 절약을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법의 다양한 양태 및 실시 형태를 설명하기 전에, 하기 정의 및 약어가 설명된다.
2. 정의 및 약어
이러한 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]에 따라, 하기 약어 및 정의가 적용된다. 단수형("a", "an" 및 "the")은 그 문맥에서 명확하게 달리 기술되지 않으면 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의한다. 따라서, 예를 들어, "효소"에 대한 언급은 복수의 이러한 효소를 포함하고, "투여량"에 대한 언급은 하나 이상의 투여량 및 당업자에게 알려진 이들의 등가량에 대한 언급을 포함하며, 기타 등등이다.
본 명세서는 읽기 쉽도록 다수의 섹션으로 구성되어 있지만, 독자는 한 섹션의 서술이 다른 섹션에도 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 방식으로, 본 명세서의 상이한 섹션에 사용된 표제가 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 명확성을 위해 아래에 정의되어 있다.
2.1. 약어 및
두문자어
하기 약어/두문자어는 달리 명시되지 않는 한 하기 의미를 갖는다:
EC
효소 위원회
DE
덱스트로스 당량
DP
중합도
GA
글루코아밀라아제
ppm
백만분율, 예를 들어, 건조 고형분 1 g당 단백질의 mg
sp.
종
w/v
중량/부피
w/w
중량/중량
v/v
부피/부피
wt%
중량%
℃
섭씨 온도
dH2O 또는 DI
탈이온수
dIH2O
탈이온수, Milli-Q 여과
g 또는 gm
그램
μg
마이크로그램
mg
밀리그램
kg
킬로그램
μL 및 μl
마이크로리터
mL 및 ml
밀리리터
mm
밀리미터
μm
마이크로미터
M
몰랄
mM
밀리몰랄
μM
마이크로몰랄
U
단위
min
분
hr
시간
N
노르말
T
미터 톤
2.2. 정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전분"은 화학식 (C6H10O5)x를 갖는 아밀로스 및 아밀로펙틴으로 이루어진 식물의 복합 다당류 탄수화물로 이루어진 임의의 물질을 지칭하며, 여기서, X는 임의의 수일 수 있다. 이 용어는 곡류, 곡물, 볏과 식물(grasses), 괴경 및 뿌리와 같은 식물 기반 물질, 더 구체적으로 밀, 보리, 옥수수, 호밀, 쌀, 수수, 겨(bran), 카사바, 기장, 마일로, 감자, 고구마, 및 타피오카로부터 수득되는 물질을 포함한다. 용어 "전분"은 과립형 전분을 포함한다. 용어 "과립형 전분"은 생전분, 즉, 미조리 전분, 예를 들어 젤라틴화되지 않은 전분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "α-아밀라아제"(EC 3.2.1.1)는 3개 이상의 (1-> 4)-α-연결 D-포도당 단위를 함유하는 다당류에서 (1-> 4)-α-D-글루코시드 결합의 내부 가수분해(endohydrolysis)를 촉매하는 효소이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "β-아밀라아제"(EC 3.2.1.2)는 사슬의 비환원 말단으로부터 연속 말토스 단위를 제거하도록 다당류에서 (1->4)-α-D-글루코시드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "풀룰라나아제"(EC 3.2.1.41)는 풀룰란, 아밀로펙틴 및 글리코겐에서, 그리고 아밀로펙틴 및 글리코겐의 α- 및 α-한계 덱스트린에서 (1->6)-α-D-글루코시드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "글루코아밀라아제"(EC 3.2.1.3)는 β-D-포도당의 방출과 함께 사슬의 비환원 말단으로부터의 연속적인 말단 (1->4)-연결 α-D-포도당 잔기들의 가수분해를 촉매하는 효소이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "말토제닉 아밀라아제"(EC 3.2.1.133)는 사슬의 비환원 말단으로부터 연속 α-말토스 단위를 제거하도록 다당류에서 (1->4)-α-D-글루코시드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "액화" 또는 "액화시키다"는 전분을 더 작은 점성 및 더 짧은 사슬의 덱스트린으로 전환시키는 공정을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드와 관련하여 용어 "야생형", "모" 또는 "기준"은 하나 이상의 아미노산 위치에서의 인공 치환, 삽입 또는 결실을 포함하지 않는 자연 발생 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드와 관련하여 용어 "변이체"는 아미노산의 하나 이상의 자연-발생 또는 인공 치환, 삽입, 또는 결실을 포함한다는 점에서 명시된 야생형, 모, 또는 기준 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 이와 유사하게, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 용어 "변이체"는 명시된 야생형, 모, 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 상이한 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 야생형, 모, 또는 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 동일성은 맥락으로부터 자명할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조합 변이체"는 2개 이상의 돌연변이, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 변이체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합"은, 대상 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때, 이것이 그의 천연 상태로부터 변형되었음을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 그 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 자연에서 발견되는 것과는 상이한 수준으로 또는 자연에서 발견되는 것과는 상이한 조건 하에 천연 유전자를 발현한다. 재조합 핵산은 하나 이상의 뉴클레오티드만큼 천연 서열과 상이하고/하거나 발현 벡터에서 이종 서열, 예를 들어, 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 재조합 단백질은 하나 이상의 아미노산만큼 천연 서열과 상이할 수 있고/있거나 이종 서열과 융합된다. 아밀라아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 재조합 벡터이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "회수된", "단리된" 및 "분리된"은 화합물, 단백질(폴리펩티드), 세포, 핵산, 아미노산, 또는 기타 특정 물질 또는 성분이, 자연에서 발견되는 바와 같이 자연적으로 결부된 적어도 하나의 다른 물질 또는 성분으로부터 제거됨을 지칭한다. 이의 "단리된" 폴리펩티드는 이종 숙주 세포에서 발현된 분비형 폴리펩티드를 함유하는 배양 브로쓰를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 효소와 관련하여 용어 "내열성(thermostable)" 및 "열안정성(thermostable)"은 승온에의 노출 후 활성을 유지하는 효소의 능력을 지칭한다. 효소, 예컨대 아밀라아제 효소의 열안정성은 분 단위, 시간 단위, 또는 일 단위로 주어진 이의 반감기(t1/2)(규정된 조건 하에서 효소 활성의 절반이 상실됨)로 측정된다. 반감기는 승온에의 노출(즉, 승온에 의한 챌린지) 후 잔존 α-아밀라아제 활성을 측정하여 계산될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 효소와 관련하여 "pH 범위"는 효소가 촉매 활성을 나타내는 pH 값의 범위를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 효소와 관련하여 용어 "pH 안정한" 및 "pH 안정성"은 소정의 시간(예를 들어, 15분, 30분, 1시간) 동안 넓은 범위의 pH 값에 걸쳐 활성을 유지하는 효소의 능력과 관련된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"와 동의어이며 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 아미노산 서열이 활성을 나타내는 경우 이는 "효소"로 지칭될 수 있다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 또는 3문자 코드가 사용되며, 이때 아미노산 서열은 표준 아미노-카르복시 말단 배향(즉, N→C)으로 제시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 DNA, RNA, 헤테로듀플렉스 및 합성 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "혼성화"는, 블롯 혼성화 기술 및 PCR 기술 동안 발생하는 바와 같이, 핵산의 한 가닥이 상보성 가닥과 듀플렉스, 즉 염기 쌍을 형성하는 과정을 지칭한다. 엄격한 혼성화 조건은 다음 조건 하에서의 혼성화로 예시된다: 65℃ 및 0.1X SSC(여기서, 1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0임). 혼성화 듀플렉스 핵산은 혼성화 핵산의 절반이 상보성 가닥과 쌍을 형성하지 않는 융점(Tm)에 의해 특성화된다. 듀플렉스 내의 미스매치 뉴클레오티드는 Tm을 낮춘다. 변이 α-아밀라아제를 코딩하는 핵산은 서열 번호 2의 뉴클레오티드와 그의 동일한 상보체 사이에 형성된 듀플렉스에 비해 Tm이 1℃~3℃ 이상 감소될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "생물학적 활성"은 서열이 특정 생물학적 활성, 예컨대 효소 활성을 가짐을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비활성"은 특정 조건 하에서 단위 시간당 효소 또는 효소 제제에 의해 생성물로 전환될 수 있는 기질의 몰수를 지칭한다. 비활성은 일반적으로 단백질 1 mg당 단위(U)로 표현된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "물 경도"는 물에 존재하는 미네랄(예를 들어, 칼슘 및 마그네슘)의 척도이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "% 서열 동일성"은 기본 매개 변수를 이용하여 CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 정렬될 때, 특정 서열이 적어도 특정한 백분율의, 명시된 기준 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기를 가짐을 의미한다. 문헌[Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680]을 참조한다. CLUSTAL W 알고리즘에 대한 기본 매개 변수로는 다음이 있다:
갭 오프닝 페널티(Gap opening penalty):
10.0
갭 연장 페널티(Gap extension penalty):
0.05
단백질 가중 매트릭스:
BLOSUM 시리즈
DNA 가중 매트릭스:
IUB
지연 발산(Delay divergent) 서열 %:
40
갭 분리 거리:
8
DNA 전이 가중치(transitions weight):
0.50
친수성 잔기의 목록:
GPSNDQEKR
음의 매트릭스의 이용:
OFF
토글 잔기 특이적 페널티(Toggle Residue specific penalties):
ON
토글 친수성 페널티(Toggle hydrophilic penalties):
ON
토글 말단 갭 분리 페널티
OFF.
결실은 기준 서열과 비교하여 동일하지 않은 잔기로 카운트된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "건조 고형분 함량"(ds 또는 DS)은 건조 중량 퍼센트 기준으로 슬러리의 총 고형분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "슬러리"는 불용성 고형분을 함유하는 수성 혼합물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 기준 값에 대해 ± 15%를 지칭한다.
3. 적합한 α-아밀라아제
본 발명의 조성물 및 방법의 일 양태는 말토제닉 아밀라아제 활성을 갖는 추가 효소의 실질적인 또는 완전한 부재 하에 사용될 수 있는 α-아밀라아제 효소이다. 예시적인 α-아밀라아제로는 사이토파가 sp. 유래의 야생형 α-아밀라아제(본원에서 "CspAmy2 아밀라아제"로 지칭됨)가 있으며, 이는 이전에 문헌[Jeang, C-L et al. ((2002) Applied and Environmental Microbiology, 68:3651-54)]에 설명되었다. CspAmy2 α-아밀라아제 폴리펩티드의 성숙형의 아미노산 서열이 아래에 서열 번호 1로 예시되어 있다:
CspAmy2 α-아밀라아제는 낮은 pH에서의 활성 및 열안정성을 필요로 하는 곡류 가공 응용과 중간 내지 높은 pH에서의 활성 및 계면활성제 안정성을 필요로 하는 세정 응용 둘 다에 적합한 극도로 다재다능한 분자인 것으로 입증되었다. 어느 한 쪽의 응용에서 개선된 특성을 갖는 CspAmy2 α-아밀라아제의 변이체가 제조된 바 있지만, 이러한 효소는 주어진 응용에 맞추어졌음에도 불구하고 여전히 다재다능한 채로 남아 있다.
상기 서열 번호 1에서, R178, G179, T180 및 G181에 밑줄이 그어져 있다. 일부 실시 형태에서, 변이형 α-아밀라아제는 칼슘-결합 루프에 인접한 이 X1G/S1X2G2 모티프의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이형 α-아밀라아제는 R178 및 G179, 또는 T180 및 G181에 상응하는 아미노산 잔기의 인접한 쌍별 결실들을 포함한다. R178 및 G179 둘 다가 결실된 사이토파가 sp. α-아밀라아제의 변이체(본원에서, "CspAmy2-v1")가 또한 기술된 바 있다(문헌[Shiau, R-J. et al. (2003) Applied and Environmental Microbiology, 69:2383-85]). 성숙 CspAmy2-v1 α-아밀라아제 폴리펩티드의 아미노산 서열이 아래에 서열 번호 2로 예시되어 있다:
서열 번호 2를 출발점으로 사용하여, 국제 공개 제2014/164777호에 기재된 바와 같이 다수의 조합적 CspAmy2 변이체가 이전에 제조되고 테스트되었다. 가장 성능이 좋은 변이체는 일반적으로 E187 또는 S241에 상응하는 아미노산 위치에서의 안정화 돌연변이를, 바람직한 특성을 개선시킨 추가 돌연변이와 함께 포함하였다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 R377, S362 및/또는 Y303에 상응하는 아미노산 잔기에서의 돌연변이와 선택적으로 조합된, E187, S241, N126, F153, T180, E187, 및 I203에 상응하는 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이를 갖는 변이형 CspAmy2 α-아밀라아제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 변이체에 포함된 특정 돌연변이는 E187P, S241Q, N126Y, F153W, T180H, T180D, E187P, I203Y, Y303A, R377Y 및 S362A, R377Y, S362A 및/또는 Y303A이다. 일부 실시 형태에서, 변이형 α-아밀라아제는 G476, G477, E132, Q167, A277, R458, T459, 및/또는 D460에 상응하는 아미노산 잔기에서 하나 이상의 이전에 기술된 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정 조합 변이체는 잔기 R178 및 G179의 결실 및 치환 N126Y, F153W, T180H, E187P 및 I203Y를 갖는 CspAmy2-C16E, 치환 S362A 및 R377Y를 추가로 갖는 C16E-AY 및 치환 Y303A를 추가로 갖는 C16E-AY-Y303A를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 조합 변이체들은 국제 공개 제2017/100720호에 기술되어 있다.
독자는 α-아밀라아제가 자연적으로 위에 나열된 돌연변이를 갖는 경우(즉, 야생형 α-아밀라아제가 돌연변이로 확인된 잔기를 이미 포함하는 경우), 그 특정 돌연변이가 그 α-아밀라아제에 적용되지 않음을 인식할 것이다. 그러나, 다른 기술된 돌연변이는 그 위치에서의 자연 발생 잔기와 조합되어 작동할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 α-아밀라아제 변이체는 상기 표시된 돌연변이 조합, 및 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 대한 소정의 정도의 아미노산 서열 상동성/동일성, 예를 들어, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 심지어 적어도 99%의 아미노산 서열 상동성/동일성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 α-아밀라아제 변이체는 상기 표시된 돌연변이 조합을 가지며, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 대한 소정의 정도의 아미노산 서열 상동성/동일성, 예를 들어, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 심지어 적어도 99%의 아미노산 서열 상동성/동일성을 갖는 모 아밀라아제로부터 유래된다.
더욱이, 본 발명의 α-아밀라아제는 임의의 수의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예시적인 보존적 아미노산 치환은 수많은 간행물에 설명되어 있다.
본 발명의 α-아밀라아제는 또한 아미노산 서열에서의 하나 또는 몇 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해, 예를 들어 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 또는 심지어 2개 미만의 치환, 결실 또는 부가에 의해 상기 아밀라아제 변이체들 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 이러한 변이체는 이들이 유래된 α-아밀라아제와 동일한 활성을 가져야 한다.
본 발명의 아밀라아제는 "전구체", "미성숙" 또는 "전장"(이 경우 이들은 신호 서열을 포함함), 또는 "성숙"(이 경우 이들은 신호 서열이 결여됨)일 수 있다. 일반적으로 성숙한 형태의 폴리펩티드가 가장 유용하다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 아미노산 잔기 넘버링은 각각의 아밀라아제 폴리펩티드의 성숙한 형태를 지칭한다. 본 발명의 아밀라아제 폴리펩티드는 또한, 생성된 폴리펩티드가 아밀라아제 활성을 유지하는 한, N 또는 C-말단이 제거되도록 절단될 수 있다.
본 발명의 아밀라아제는 제1 α-아밀라아제 폴리펩티드의 적어도 일부 및 제2 α-아밀라아제 폴리펩티드의 적어도 일부를 포함한다는 점에서 "키메라", "하이브리드" 또는 "도메인 스왑(swap)" 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 아밀라아제는 이종 신호 서열, 추적 또는 정제를 허용하는 에피토프 등을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, α-아밀라아제는 α-아밀라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특정한 양의 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 코딩된다. 예시적인 핵산은 아래에 나타낸 서열 번호 3으로 제공된다(밑줄이 그어진 서열은 LAT 신호 펩티드를 코딩함).
일부 실시 형태에서, 본 핵산은 서열 번호 3에 대하여 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 핵산 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 본 핵산은 엄격하거나 매우 엄격한 조건 하에서, 서열 번호 3에 대하여 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 핵산 서열 동일성을 갖는 α-아밀라아제를 코딩하는(또는 이를 코딩하는 핵산에 대하여 상보성인) 핵산에 혼성화된다.
일부 실시 형태에서, 조성물 및 방법에 사용하기 위한 α-아밀라아제는 CspAmy2 및 그의 변이체와 유사한 특성을 가지며, 이러한 특성은 본원에 설명된 조건 하에서 스크리닝될 수 있다. 특수 시럽 생성에서 CspAmy2의 고유한 특성은 지금까지 알려지지 않았기 때문에 이러한 특성에 대해 α-아밀라아제를 스크리닝하기 위한 원동력은 인식되지 않았다.
4. 다른 효소에 대한 필요성의 제거
말토덱스트린 분말 및 특수 시럽을 생성하는 데 사용되는 현행 효소 가공 조건에서 사용되는 효소가 일반적으로 본원에 설명되어 있다. 효소는 말토제닉 아밀라아제(EC 3.2.1.133), β-아밀라아제(EC 3.2.1.2), 풀룰라나아제(EC 3.2.1.41) 및 글루코아밀라아제(EC 3.2.1.3)를 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 이들 효소 중 하나 이상에 대한 필요성을 감소시키거나 제거한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 또는 모든 말토제닉 효소에 대한 필요성을 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99% 감소시킨다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 말토덱스트린 분말 및 특수 시럽을 생성하는 데 있어서 임의의 또는 모든 말토제닉 효소에 대한 필요성을 완전히 제거한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법과 관련하여 유의한 이점이 없는 사소하거나 하찮은 양의 말토제닉 효소의 포함은 본 발명을 무효화하지 않는다.
5. 단순화된 공정의 조건
말토덱스트린 분말 및 특수 시럽을 생성하는 데 사용되는 현행 가공 조건이 일반적으로 본원에 설명되어 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 특수 시럽의 효소적 제조에 현재 요구되는 하나 이상의 공정 단계에 대한 필요성을 제거한다. 예를 들어, 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 통상적인 액화 α-아밀라아제(이는 본 발명의 α-아밀라아제와 구별되는 α-아밀라아제임)를 불활성화시키기 위하여 90℃에서 액화물의 pH를 4.50 미만, 4.40 미만, 4.30 미만, 또는 심지어 4.20 미만까지 감소시킬 필요성을 제거한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 액화를 수행하기 위하여 통상적인 α-아밀라아제를 사용한 후 글루코아밀라아제 또는 다른 말토제닉 효소의 최적 성능을 위하여 액화물을 55~65℃까지 냉각시킬 필요성을 제거한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 글루코아밀라아제 또는 다른 말토제닉 효소를 불활성화시키기 위하여 당화 액화물을 85~90℃, 예를 들어 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃ 또는 90℃까지 가열할 필요성을 제거한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 생성물을 원하는 수준의 DS까지 농축시키기 위하여 당화 액화물을 55~60℃까지 냉각시킬 필요성을 제거한다.
제거되는 단계들 각각은 개별적으로 또는 조합되어 제거될 수 있으며, 이는 기존 특수 시럽 생성에서의 사소하거나 중대한 개선으로 이어진다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌은 모든 목적을 위하여 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 조성물 및 방법과 이의 장점을 추가로 예시하기 위하여, 하기 특정 실시예가 제공되며, 이때 실시예는 제한적이기보다는 예시적임이 이해된다.
실시예
본원에 개시된 방법은 하기 실시예에 예시되어 있다. 위의 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 다양한 실시 형태를 확인할 수 있을 것이고, 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 이것이 다양한 용도 및 조건에 맞게 조정되도록 본원에 개시된 방법 및 조성물을 다양하게 변화시키고 변경할 수 있을 것이다.
실시예
1
단일 효소 공정을 사용한 특수 시럽
60 g의 옥수수 전분(Sigma Aldrich 카탈로그 번호 S4126)을 칭량하고 이어서 132 g의 물을 500 mL 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 첨가하여 전분 슬러리를 제조하였다. 1 N HCl을 사용하여 슬러리 pH를 5.60 ± 0.10으로 조정하고, 이어서 SPEZYME® HT TG (N126Y, F153W, T180H, E187P, I203Y, Y303A, S362A, R377Y의 치환 및 R178 및 G179의 결실을 갖는 사이토파가 sp. 유래의 변이형 α-아밀라아제)를 전분 1 T당 0.45, 0.75, 1.00, 1.50, 2.00 및 2.50 kg의 양으로 첨가하였다. 최종 슬러리 부피를 물로 200 ml로 조정하였다. 액화를 92℃에서 실시하였으며, 이때 수조에서 4시간 동안 350 rpm에서 계속 혼합하였다. HPLC를 사용하여 DP 프로파일을 결정하고 Lane 및 Eynon의 환원력에 대한 방법을 사용하여 DE를 결정하기 위하여 플라스크를 4시간에 샘플링하였으며, 여기서, 메틸렌 블루를 지시약으로 사용하여 혼합 Fehling 용액을 샘플로 적정하였다. 1%(w/v) 포도당 용액을 사용하여 Fehling 용액을 표준화하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[표 1]
SPEZYME® HT TG를 전분 액화물에 첨가하면 DE 값이 32~40%의 범위인 특수 시럽이 생성되었다. SPEZYME® HT TG를 사용한 단일 효소 공정으로 얻어진 특수 시럽의 DP 프로파일은 말토제닉 효소를 사용하거나 사용하지 않고서 산 가수분해 방법을 사용하여 생성한 시럽과 유사하다.
실시예
2
다양한 DP 프로파일을 가진 특수 시럽의 생성을 위한 시간 및 용량의 영향
60 g의 옥수수 전분(Sigma Aldrich 카탈로그 번호 S4126)을 칭량하고 이어서 132 g의 물을 500 mL 삼각 플라스크에 첨가하여 전분 슬러리를 제조하였다. 1 N HCl을 사용하여 슬러리 pH를 5.60 ± 0.10으로 조정하고, 이어서 SPEZYME® HT TG를 전분 1 T당 2.40 및 2.90 kg의 양으로 첨가하였다. 최종 슬러리 부피를 물로 200 ml로 조정하였다. 액화를 92℃에서 실시하였으며, 이때 수조에서 24시간 동안 350 rpm에서 계속 혼합하였다. HPLC를 사용하여 DP 프로파일을 결정하고 Lane 및 Eynon의 방법을 사용하여 DE를 결정하기 위하여 플라스크를 6시간, 8시간, 10시간 및 24시간에 샘플링하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
SPEZYME® HT TG를 사용한 장시간의 전분 액화는 DP1 및 DP2 함량 증가로 인해 DE가 더 높은 시럽을 생성한다. 효소 투입량의 증가는 특수 시럽의 DP1 및 DP2 함량을 더 향상시킨다. 원하는 DP 프로파일을 갖는 특수 시럽은 SPEZYME HT TG 용량 및 액화 시간을 조절하여 얻을 수 있다.
실시예
3
특수 시럽의 제조에서의 DP 프로파일 진행에 대한 고 고형분의 영향
80 g의 옥수수 전분(Sigma Aldrich 카탈로그 번호 S4126)을 칭량하고 이어서 132 g의 물을 500 mL 삼각 플라스크에 첨가하여 전분 슬러리를 제조하였다. 1 N HCl을 사용하여 슬러리 pH를 5.60 ± 0.10으로 조정하고, 이어서 SPEZYME® HT TG를 전분 1 T당 1.00, 1.50, 2.00, 2.50 및 2.90 kg의 양으로 첨가하였다. 최종 슬러리 부피를 물로 200 ml로 조정하였다. 액화를 92℃에서 실시하였으며, 이때 수조에서 24시간 동안 350 rpm에서 계속 혼합하였다. HPLC를 사용하여 DP 프로파일을 결정하기 위하여 플라스크를 6시간, 8시간, 10시간 및 24시간에 샘플링하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
30%(w/v) 전분을 사용하여 실시예 2에서 얻은 결과는 일반적으로 40%(w/v) 전분을 사용할 경우 반복되었다.
실시예
4
특수 시럽의 제조에서의 상이한 α-아밀라아제들의 영향
80 g의 옥수수 전분(Sigma Aldrich 카탈로그 번호 S4126)을 칭량하고 이어서 132 g의 물을 500 mL 삼각 플라스크에 첨가하여 전분 슬러리를 제조하였다. 1 N HCl을 사용하여 슬러리 pH를 5.60 ± 0.10으로 조정하고, 이어서 SPEZYME® HT TG, SPEZYME® ALPHA, SPEZYME® RSL, SPEZYME® FRED를 전분 1 T당 1.00 kg의 양으로 첨가하였다. 최종 슬러리 부피를 물로 200 ml로 조정하였다. 액화를 92℃에서 실시하였으며, 이때 수조에서 24시간 동안 350 rpm에서 계속 혼합하였다. HPLC를 사용하여 DP 프로파일을 결정하기 위하여 플라스크를 6시간 및 24시간에 샘플링하였다. 결과를 표 5에 나타낸다.
[표 5]
특히, SPEZYME® HT TG는 말토제닉 효소를 사용하거나 사용하지 않고서 산 가수분해 방법을 사용하여 생성된 시럽과 유사한 DP 프로파일을 갖는 특수 시럽을 생성할 수 있는, 테스트된 유일한 효소였다.
실시예
6
특수 시럽의 제조에서의 DP 프로파일 진행에 대한 pH 4.50의 영향
80 g의 옥수수 전분(Sigma Aldrich 카탈로그 번호 S4126)을 칭량하고 이어서 132 g의 물을 500 mL 삼각 플라스크에 첨가하여 전분 슬러리를 제조하였다. 1 N HCl을 사용하여 슬러리 pH를 4.50 ± 0.10으로 조정하고, 이어서 전분 1 T당 2.00 kg의 SPEZYME® HT TG를 첨가하였다. 최종 슬러리 부피를 물로 200 ml로 조정하였다. 액화를 92℃에서 실시하였으며, 이때 수조에서 24시간 동안 350 rpm에서 계속 혼합하였다. HPLC를 사용하여 DP 프로파일을 결정하기 위하여 플라스크를 6시간 및 24시간에 샘플링하였다. 결과를 표 6에 나타낸다.
[표 6]
전분 액화 시간이 길어지면 더 낮은 액화 pH는 더 높은 액화 pH에 비해 더 낮은 DP1, DP2 및 DP3 함량으로 이어졌다. 낮은 pH(즉, 4.50)에서 SPEZYME® HT TG에 의한 DP 프로파일은 더 높은 pH(즉, 5.50)에서 SPEZYME® A, SPEZYME® RSL 및 SPEZYME® FRED에 의해 얻어진 DP 프로파일보다 더 우수하였다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
Claims (7)
- 말토덱스트린 및/또는 특수 시럽의 제조 방법으로서, 상기 방법은 말토제닉(maltogenic) 아밀라아제(EC 3.2.1.133), β-아밀라아제(EC 3.2.1.2), 풀룰라나아제(EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(EC 3.2.1.3) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 말토제닉 효소의 실질적인 부재 하에 전분 기질을, 말토제닉 효소를 포함하는 통상적인, 다중-효소, 산 전처리 조건에 의해 생성되는 DE 프로파일과 동등한 DE 프로파일을 포함하는 시럽을 생성할 수 있는 α-아밀라아제(EC 3.2.1.1)와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 방법에서는 상이한 통상적인 액화 α-아밀라아제를 사용하는 동일 공정에서 적어도 하나의 pH 조정 또는 온도 조정 단계가 실질적으로 제거된, 방법.
- 제1항에 있어서, 말토제닉 아밀라아제 활성을 가질 수 있는 소정의 말토제닉 효소(α-아밀라아제는 제외)의 부재 하에 수행되는 방법.
- 제2항에 있어서, 말토제닉 아밀라아제 활성을 가질 수 있는 모든 말토제닉 효소(α-아밀라아제는 제외)의 부재 하에 수행되는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 단계는 액화물의 pH를 감소시켜 상이한 통상적인 액화 α-아밀라아제를 불활성화시키는 것, 액화물을 냉각시켜 말토제닉 효소의 최적의 성능을 촉진하는 것, 당화된 액화물을 가열하여 말토제닉 효소를 불활성화시키는 것, 및 당화된 액화물을 냉각시켜 생성물을 농축시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, α-아밀라아제는 사이토파가(Cytophaga) sp.로부터 유래된 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, α-아밀라아제는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 사이토파가 sp. 유래의 α-아밀라아제, 또는 이의 변이체인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 통상적인 액화 α-아밀라아제는 바실러스(Bacillus)로부터 유래된 방법.
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