CN101939421B - 嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请描述了在181位或/和182位上有突变，具有改变的淀粉水解谱的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体。该变体具有提高的热稳定性和增加的比活性，导致在淀粉液化过程中降低的最大粘度和改变的终粘度。该淀粉酶变体用于例如液化和其他淀粉降解过程。

Description

嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体及其用途

优先权

[0001]本申请要求2008年2月4日提交的美国临时申请序列号61/063,639的优先权，该申请以其整体引入作为参考。

技术领域

[0002]本申请描述了用于工业过程，如淀粉的液化的α-淀粉酶变体。α-淀粉酶具有增加的比活性，允许最大粘度在液化过程中更快速地降低。

背景技术

[0003]对于使用淀粉作为起始材料的许多工业过程，期望具有这样的淀粉分解酶，其在高温下起作用以快速降解淀粉，释放更小的糖类，导致粘度降低。粘度降低得越多，该酶更容易进一步切割淀粉，并且需要用于混合反应的机械力更少。许多酶用于淀粉液化，包括分别来自地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)或嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶AmyL和AmyS，其非常适合于在高温下液化淀粉。

[0004]一般地，必须向液化过程中加入足够量的酶，以提供目标的实现，即必须有足够的酶活性(或催化活性)以在预选时间里液化淀粉底物。可测定每单位酶的酶活性，并称为比活性。因此，必须以更高的量使用具有更低比活性的酶，以在给定过程中提供想要量的酶活性。通常有利地是，能够制备高比活性的酶制剂，允许使用更少的量产生想要的效果。例如，这可通过纯化酶粗制剂来实现。然而，即使纯酶在特定测定条件下对给定的底物也有最大的比活性。

[0005]存在适合于在高温下液化淀粉的改良α-淀粉酶的需要。

发明概述

[0006]本文提供用于淀粉降解工业过程的α-淀粉酶变体。变体淀粉酶基于来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生物的野生型α-淀粉酶，尤其是AmySα-淀粉酶的多肽序列。

[0007]变体淀粉酶是有用的，因为它们相对于其来源亲本淀粉酶具有提高的比活性，由此在淀粉水解应用中提供提高的性能。变体淀粉酶尤其用于淀粉降解过程，如用于乙醇生产过程和织物及其他针织材料(wovenmaterial)脱浆过程的液化。酶是相对热稳定的，并且在一般用于淀粉降解的条件下具有良好活性。变体淀粉酶的特征是它们在高温液化过程中降低淀粉浆液初始粘度方面共有改良性质。而且，因为变体淀粉酶可以更少的量单独使用或与其他酶混合使用，它们还为最终用户和生产商提供了经济利益。

[0008]本发明组合物和方法的实施方案包括分离的变体α-淀粉酶、包含这些酶的组合物、和使用所述酶或组合物的方法，以及编码所述变体酶的核酸、表达载体、和表达所述α-淀粉酶变体的宿主细胞。

[0009]一方面，提供来自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶。该变体在成熟蛋白质181和/或182位上发生了改变。具体而言，改变野生型序列，使得181位、182位或这两个位置上天然发生的氨基酸被野生型该位置上不存在的不同氨基酸残基取代。优选地，181位的野生型氨基酸残基取代为Ala、Cys、Asp、Glu、Leu或Pro，和/或182位的野生型氨基酸残基取代为Ala、Ser或Pro。

[0010]另一方面，提供包含一种或多种具有α-淀粉酶活性的变体α-淀粉酶的组合物。该组合物可进一步包含一种或多种其他的酶，如具有用于液化复合糖类(包括直链淀粉和支链淀粉)，例如淀粉的活性的酶。在一个实例中，提供包含本文描述或示例的一种或多种变体α-淀粉酶的食品级冻干组合物。

[0011]还提供编码变体α-淀粉酶，如具有氨基酸序列SEQ ID NO：1-17的那些变体α-淀粉酶的多核苷酸。特定多核苷酸编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、3、4、5、10、15、17或19的多肽。还提供包含多核苷酸的载体、包含多核苷酸或载体中一种的细菌细胞和宿主细胞，和用于表达编码蛋白质的表达系统。

[0012]还提供制备和使用淀粉酶变体和组合物的方法。一方面，提供产生包含来自嗜热脂肪芽孢杆菌的野生型α-淀粉酶的至少一个变体的组合物的方法。该方法包括利用宿主细胞用于发酵过程，其中表达所述至少一个变体α-淀粉酶。如上，所述变体在成熟蛋白质的181位或182位上包含取代。宿主细胞优选为芽孢杆菌属物种，如地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)。该方法使得必须进行最后一步，即至少部分纯化所述至少一个变体α-淀粉酶的最后一步，由此导致包括至少一个变体α-淀粉酶的组合物的产生。

[0013]提供使用如本文提供的淀粉酶变体液化淀粉浆液的方法。所述方法包括制备包含淀粉的浆液，将浆液加热至液化可接受的温度，向浆液中加入如本文描述的包含至少一种变体的组合物，并将浆液与组合物在足以液化淀粉浆液的温度下温育一段时间。

[0014]进一步提供处理针织材料的方法，所述针织材料前面已经与包含淀粉或淀粉衍生物的涂层(coating)接触过。所述方法包括使针织材料与包含如上文提供的α-淀粉酶变体的液体在足以从所述针织材料中基本上去除涂层的条件下接触一段时间。

[0015]本发明还提供酶混合物。酶混合物包含至少第一种和第二种α-淀粉酶。第一种α-淀粉酶具有催化活性，当其用于液化过程时，产生比第二种α-淀粉酶提供的终粘度低的终粘度。当每一种酶单独用于相当液化过程时，第一种α-淀粉酶的活性产生最大粘度，其高于第二种α-淀粉酶活性产生的最大粘度。酶混合物提供全部或组合催化活性，当其用于液化过程时产生与相当液化过程中单独使用第一种α-淀粉酶得到的终粘度大致相同的终粘度，和显著低于相当液化过程中单独使用第二种α-淀粉酶得到的最大粘度的最大粘度。

[0016]还提供使用酶混合物液化淀粉浆液的方法。该方法包括制备包含淀粉的浆液，将浆液加热至液化可接受的温度，向浆液中加入如上提供的酶混合物(例如，包含第一种和第二种α-淀粉酶)，并将浆液与酶混合物在足以液化淀粉浆液的温度下温育一段时间。优选地，该方法提供大约与在相当(comparable)液化过程中单独使用第一种α-淀粉酶获得的终粘度一样低的终粘度，和比在相当液化过程中单独使用第二种α-淀粉酶获得的最大粘度低的最大粘度。

[0017]还提供使用本文公开的淀粉酶变体、组合物和/或酶混合物产生乙醇的方法。

[0018]提供制备变体淀粉酶的方法，和使用α-淀粉酶变体以及包含该用于液化的变体的组合物和混合物，以及加工针织材料以去除涂层的方法。

[0019]还提供用于促进淀粉浆液液化的试剂盒。所述试剂盒包括以下中的至少一种：

如上文提供的变体α-淀粉酶，

如上文提供的包含淀粉酶变体的组合物，

如上文提供的食品级冻干组合物，或

如上文提供的酶混合物；和用于在淀粉浆液液化中使用试剂盒的说明书。

[0020]下文阐明了本发明组合物和方法的特定方面和实施方案：

[0021]一方面，提供基于来自嗜热脂肪芽孢杆菌的亲本α-淀粉酶的变体α-淀粉酶，其中所述变体与亲本α-淀粉酶相比在181位氨基酸、或182位氨基酸或这两个位置的氨基酸上包含取代，其中变体181位上的氨基酸残基选自Pro、Ala、Leu、Cys、Asp和Glu，变体182位上的氨基酸残基选自Pro、Ala和Ser。

[0022]在一些实施方案中，变体α-淀粉酶具有选自SEQ ID NO：3(I181P)、SEQ ID NO：2(I181A)、SEQ ID NO：10(I181L)、SEQ ID NO：4(I181C)、SEQ ID NO：5(I181D)、SEQ ID NO：6(I181E)和SEQ ID NO：15(I181Y)的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体α-淀粉酶具有选自SEQ IDNO：18(G182P)、SEQ ID NO：16(G182A)和SEQ ID NO：17(G182S)的氨基酸序列。

[0023]在一些实施方案中，亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，亲本α-淀粉酶具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

[0024]在一些实施方案中，变体α-淀粉酶在特定测定条件下相比于野生型α-淀粉酶具有增加的比活性。在一些实施方案中，所述变体在约50-90℃之间具有增加的比活性。在特定实施方案中，所述变体α-淀粉酶在约65-85℃之间具有增加的比活性。

[0025]另一方面，提供包含变体α-淀粉酶的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种其他的酶。在一些实施方案中，所述至少一种其他的酶具有用于液化包含直链淀粉和支链淀粉的复合糖类的活性。在特定实施方案中，所述至少一种其他的酶是其他的α-淀粉酶。

[0026]在一些实施方案中，液化过程中的组合物相比于在没有变体α-淀粉酶的情况下用其他的酶液化的相当淀粉浆液的最大粘度，其降低了淀粉浆液的最大粘度。

[0027]在一些实施方案中，配制用于食品或食品加工的组合物。相关实施方案是包含变体α-淀粉酶的食品级冻干组合物。

[0028]另一方面，提供了编码变体α-淀粉酶的多核苷酸。在一些实施方案中，优化多核苷酸的密码子使用以用于在微生物或植物中表达所述变体α-淀粉酶。

[0029]在一些实施方案中，提供包含编码变体α-淀粉酶的多核苷酸的表达载体。在相关实施方案中，提供包含所述表达载体的细菌细胞。在另一实施方案中，提供包含编码变体α-淀粉酶的多核苷酸的宿主细胞。多核苷酸可位于表达载体中。宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。宿主细胞或者可以是植物，并且植物可用于乙醇生产。

[0030]另一方面，提供液化淀粉浆液的方法，其包括：

制备包含淀粉的浆液；将浆液加热至淀粉液化可接受的温度；向浆液中加入项9的组合物；并将浆液与组合物在足以液化淀粉浆液的温度下温育一段时间。

[0031]在该方法的一些实施方案中，温度从约50℃到约95℃。在该方法的一些实施方案中，浆液包含约15-40％基于干重的淀粉。

[0032]在该方法的一些实施方案中，液化是发酵过程的一部分。在该方法的一些实施方案中，发酵用于产生食品产品、食物添加剂、燃料、或燃料添加剂。在该方法的一些实施方案中，所述燃料或燃料添加剂是醇。在特定实施方案中，所述醇是乙醇。

[0033]在该方法的一些实施方案中，温育步骤产生相对于亲本α-淀粉酶液化的相当浆液的最大粘度降低至少25％的最大粘度。

[0034]另一方面，提供处理之前已经与包含淀粉或淀粉衍生物的涂层接触过的针织材料的方法，所述方法包括使所述针织材料与包含变体α-淀粉酶的溶液在足以从该针织材料中基本上去除涂层的情况下接触一段时间。在一些实施方案中，所述针织材料是织物(fabric)。在一些实施方案中，在比周围大气压高的压力下进行接触步骤。

[0035]另一方面，提供用于液化淀粉浆液的酶混合物。所述混合物包含：

至少第一种和第二种α-淀粉酶，

所述第一种α-淀粉酶具有催化活性，当其用于液化过程中时，产生比每一种酶单独用于相当液化过程中时，所述第二种α-淀粉酶的相应催化活性产生的终粘度低的终粘度，但比其产生的最大粘度高的最大粘度，

其中当用于相当液化过程中时，酶混合物提供这样的催化活性，其产生与单独使用所述第一种α-淀粉酶得到的大致相同的终粘度，和显著低于单独使用所述第二种α-淀粉酶得到的最大粘度的最大粘度；

其中相当液化过程包含温度、pH、钙离子浓度和底物浓度的特定条件。

[0036]在相关方面，提供液化淀粉浆液的方法，其包括制备包含淀粉的浆液，将浆液加热至液化可接受的温度，向浆液中加入包含所述第一种和第二种α-淀粉酶的酶混合物，并将浆液与酶混合物在足以液化淀粉浆液的温度下温育一段时间。在一些实施方案中，终粘度大约与相当液化过程中单独使用所述第一种α-淀粉酶获得的终粘度一样低，并且最大粘度低于相当液化过程中单独使用所述第二种α-淀粉酶获得的最大粘度。在一些实施方案中，与每一种酶单独用于相当液化过程时分别加入的第一种和第二种α-淀粉酶的相应量相比，加入的酶混合物的量导致加入更少的第一种和第二种α-淀粉酶中的每一种。在一些实施方案中，第一种和第二种α-淀粉酶中每一种的量约为单独使用每一种时加入的相应量的一半。

[0037]另一方面，提供产生乙醇的方法，其包括：

利用以下中的一种或多种种来液化淀粉浆液：

(a)基于来自嗜热脂肪芽孢杆菌的亲本α-淀粉酶的变体α-淀粉酶，其中所述变体与亲本α-淀粉酶相比在181位氨基酸、或182位氨基酸或这两个位置的氨基酸上包含取代，其中变体181位上的氨基酸残基选自Pro、Ala、Leu、Cys、Asp和Glu，变体182位上的氨基酸残基选自Pro、Ala和Ser，

(b)包含(a)的变体α-淀粉酶的组合物，

(c)包含(a)的变体α-淀粉酶的食品级冻干组合物，或

(d)包含(a)的变体α-淀粉酶和第二种淀粉酶的酶混合物，变体α-淀粉酶具有催化活性，当其用于液化过程中时产生比变体α-淀粉酶和第二种淀粉酶中的每一种酶单独用于相当液化过程中时所述第二种α-淀粉酶的相应催化活性产生的终粘度低的终粘度，但比其产生的最大粘度高的最大粘度；

发酵浆液中的至少一部分糖以产生乙醇；并至少部分纯化所得乙醇。

[0038]在一些实施方案中，向液化的淀粉浆液中加入一种或多种其他酶的任选步骤进一步完成发酵步骤中的乙醇生产。

[0039]在另一方面，提供用于促进淀粉浆液液化的试剂盒，所述试剂盒包含：

至少一种：

(a)基于来自嗜热脂肪芽孢杆菌的亲本α-淀粉酶的变体α-淀粉酶，其中所述变体与亲本α-淀粉酶相比在氨基酸181位氨基酸、或182位氨基酸或这两个位置的氨基酸上包含取代，其中变体181位上的氨基酸残基选自Pro、Ala、Leu、Cys、Asp和Glu，变体182位上的氨基酸残基选自Pro、Ala和Ser，

(b)包含(a)的变体α-淀粉酶的组合物，

(c)包含(a)的变体α-淀粉酶的食品级冻干组合物，或

(d)包含(a)的变体α-淀粉酶和第二种淀粉酶的酶混合物，变体α-淀粉酶具有催化活性，当其用于液化过程中时产生比变体α-淀粉酶和第二种淀粉酶中的每一种酶单独用于相当液化过程中时所述第二种α-淀粉酶的相应催化活性产生的终粘度低的终粘度，但比其产生的最大粘度高的最大粘度；

和用于液化淀粉浆液的试剂盒中的说明书。

[0040]本发明组合物和方法的这些方面和其他方面在以下描述和附图中变得显而易见。

附图简述

[0041]图1显示AmySα-淀粉酶181位上的变体热稳定性筛选的结果。

[0042]图2显示使用淀粉酶SPEZYME

ETHYL的淀粉水解反应(液化)的结果。图A：在65℃温育5分钟后取出的样品的HPLC色谱图。图B、C、D：温度从65℃骤增到85℃后分别5分钟、15分钟和30分钟取出的样品的HPLC色谱图。

[0043]图3显示使用淀粉酶SPEZYME

XTRA的淀粉水解反应的结果。图A：在65℃温育5分钟后取出的样品的HPLC色谱图。图B、C、D：温度从65℃开始骤增到85℃后分别5分钟、15分钟和30分钟取出的样品的HPLC色谱图。

[0044]图4显示使用变体α-淀粉酶AmyS I181P(SEQ ID NO：3)的淀粉水解反应的结果。图A：在65℃温育5分钟后取出的样品的HPLC色谱图。图B、C、D：温度从65℃开始骤增到85℃后分别5分钟、15分钟和30分钟取出的样品的HPLC色谱图。

[0045]图5显示图2、3和4的图B的并列比较。

[0046]图6显示液化过程中粘度计中变体α-淀粉酶与SPEZYME

XTRA的比较。

[0047]图7A-B显示使用粘度测定法，使用市售酶、变体或两者的混合物进行的淀粉液化的比较。

[0048]图8显示本申请中使用的序列列表。

序列简述

[0049]SEQ ID NO：1是亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列。

[0050]SEQ ID NO：2是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181A。

[0051]SEQ ID NO：3是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181P。

[0052]SEQ ID NO：4是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181C。

[0053]SEQ ID NO：5是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181D。

[0054]SEQ ID NO：6是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181E。

[0055]SEQ ID NO：7是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181F。

[0056]SEQ ID NO：8是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181G。

[0057]SEQ ID NO：9是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181H。

[0058]SEQ ID NO：10是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181L。

[0059]SEQ ID NO：11是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181R。

[0060]SEQ ID NO：12是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181S。

[0061]SEQ ID NO：13是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181T。

[0062]SEQ ID NO：14是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181V。

[0063]SEQ ID NO：15是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代I181Y。

[0064]SEQ ID NO：16是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代G182A。

[0065]SEQ ID NO：17是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代G182S。

[0066]SEQ ID NO：18是基于亲本/野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体α-淀粉酶的氨基酸序列，所述变体具有取代G182P。

发明详述

[0067]描述了提供优于目前可得α-淀粉酶的某些优势和优点的α-淀粉酶(α-淀粉酶)。变体α-淀粉酶显示相对良好的热稳定性和宽泛的温度最适条件，允许它们用于高温淀粉液化，例如用于产生发酵产物，如醇，尤其是乙醇。此外，变体α-淀粉酶具有提高的比活性(即，每单位酶的活性)；因此，可使用更少的酶达到亲本/野生型淀粉酶产生的相同结果。

[0068]淀粉酶变体可用于液化过程和其他淀粉降解过程，如脱浆针织材料。变体淀粉酶也可彼此结合使用，和或与一种或多种其他酶结合，例如以混合物使用。优选地，其他酶在如用于变体α-淀粉酶的那些相同或类似反应条件下是有活性的。酶混合物的使用为最终用户提供了更多的灵活性，并为最终用户和生产商提供某些经济和加工优势。

[0069]在如液化应用中提供比活性提高以及性能改变的变体酶的发现为生产商和最终用户提供了生产和使用淀粉酶的选项。可选择加工条件，如pH、温度、离子强度和辅助因子的存在，以支持混合物中存在的变体α-淀粉酶和一种或多种其他酶的活性。这些加工条件可促进使用连续或半连续方法，而不是昂贵且耗时的分批法。

A.定义和缩写

[0070]根据该详细描述，应用以下缩写和定义。单数形式“一个”、“该”和“所述”包括复数，除非上下文另有明确说明。因此，例如，所称“酶”包括多种这样的酶，所称“制剂”包括一种或多种制剂以及本领域技术人员已知的其等同物等。

[0071]数值或范围方面的术语“大约”表示数值可以比所述值高10％或低10％。在其他实施方案中，“大约”表示数值可以比所述值高5％或低5％。

[0072]除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同意思。定义以下术语用于说明：

1.定义

[0073]“淀粉酶”表示其中能够催化淀粉、直链淀粉、支链淀粉等降解的酶。一般地，将α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为内作用酶(endo-acting enzyme)，其切割含有三个或更多α-D-(1→4)连接葡萄糖单位的多糖中的α-D-(1→4)O-糖苷键。α-淀粉酶释放α-构型的还原基团。它们以随机方式在淀粉、糖原和相关多糖和寡糖上起作用。相反，外作用(exo-acting)淀粉酶从非还原末端连续切割底物分子。葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶(麦芽α-淀粉酶；EC 3.2.1.133)产生终产物α-麦芽糖，而β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)产生β-麦芽糖。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡糖苷酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可从其各自底物产生特定长度的低聚麦芽糖(malto-oligosaccharide)。葡糖淀粉酶从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原末端释放葡糖残基。葡糖淀粉酶也催化α-1，6和α-1，3键的水解，尽管速率比催化α-1，4键低得多。

[0074]“α-淀粉酶变体”、“α-淀粉酶变体多肽”和“变体淀粉酶”或“变体酶”表示具有从野生型α-淀粉酶的氨基酸序列修饰的氨基酸序列的α-淀粉酶蛋白质。如本文所用，“亲本酶”、“亲本序列”、“亲本多肽”、“野生型α-淀粉酶蛋白质”和“亲本多肽”表示α-淀粉酶变体多肽所基于的酶和多肽，例如芽孢杆菌属(Bacillus)或地芽孢杆菌属(Geobacillus)物种α-淀粉酶。本文优选为野生型或亲本酶的是来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的那些酶。编码亲本多肽的核酸序列此处称为“亲本核酸”。野生型α-淀粉酶是天然发生的。“α-淀粉酶变体”在成熟蛋白质(即没有信号序列，或翻译后去除的其他天然或人工序列的活性分子)的氨基酸残基上不同于野生型α-淀粉酶。α-淀粉酶变体可以是“嵌合的”或可以是“嵌合分子”，例如含有来自多于一个多肽的序列的融合蛋白。例如，α-淀粉酶蛋白可包含与另一α-淀粉酶的信号肽连接的成熟α-淀粉酶蛋白。α-淀粉酶变体在这个意义上也可以是嵌合的：其含有来自融合一个或更多其他分子的一个或更多部分、区域或结构域的一个分子的部分、区域或结构域，只要在所得分子中存在α-淀粉酶的催化活性。如本文所用，嵌合分子不是天然发生的。本文优选酶变体，其中一个或两个氨基酸残基(181位或182位，或这两者)取代成不在参照位置上天然发生的氨基酸残基。

[0075]酶的“活性”表示催化活性，并包括酶活性的任何可接受量度，如活性等级、活性量、或比活性。“比活性”是每单位酶的活性量度。因此，可通过酶的单位重量或单位体积表示比活性。另外，比活性可包括酶纯度的量度。其他情况下比活性自身将提供纯度指示，例如其中活性标准已知，或可用于比较。

[0076]如本文所用“变体”指多肽或核酸。术语“变体”有时候可与术语“突变体”同义使用。相对于亲本多肽或核酸，变体多肽或核酸在氨基酸或核苷酸序列中一个或更多位置上包括插入、取代、缺失、易位、截短和/或倒转。变体核酸可包括与能够与本文所示的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。例如，变体序列与在严格条件，例如50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)下能够与本文所示的核苷酸序列杂交的序列互补。具体而言，术语变体包括在高度严格条件下，例如65℃和0.1X SSC下能够与本文所示的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。在多个实施方案中，变体与本文明确提供的序列具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或甚至99％相同。

[0077]如本文所用，术语“表达”指在基因或人工序列的核酸序列基础上产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。“表达产物”一般指体内或体外翻译的蛋白质。类似地，如果基因表达了，那么在细胞，如包含基因的宿主细胞中产生了基因产物(一般是蛋白质，但有时候也会是RNA)。

[0078]如本文所用，“微生物”包括任何细菌、酵母或真菌物种。

[0079]“分离的”蛋白质或核酸序列表示所述序列至少基本上没有该序列天然结合的并见于自然界的至少一种其他组分。在核酸序列的实例中，分离的表示从基因组序列中分离出来的。

[0080]“纯化的”表示材料处于相对纯的状态，例如至少约90％纯，至少约95％纯，或至少约98％纯。“部分纯化的”包括更低程度的纯度，只要所述蛋白质或核酸是如本文所用术语“分离的”。

[0081]“热稳定的”表示酶暴露在升高温度后保留可测定活性。通过半衰期(t1/2)测定酶，如α-淀粉酶热稳定性的一种量度，其中一半的酶活性到达半衰期时丧失。在确定条件下通过测定剩余的淀粉酶活性计算半衰期值。在一些实施方案中，热稳定性的其他量度可能更重要或更实用，并可测定并表述为例如特定暴露时间和目标温度后保留的百分比活性。一般地，酶暴露在目标温度期望时间后，在标准测定条件(包括温度)下测定酶。热稳定的酶也可以是热活性酶，即当在高温下测定时它们可显示活性。如本文所用，热稳定酶可对热变性具有抵抗力，并在高温下有活性。

[0082]“pH范围”表示从酸性条件到碱性条件下酶显示催化活性的能力。使用α-淀粉酶的常见过程可包括横跨5或更高pH单位的pH条件。如本文所用，“pH稳定的”涉及酶在宽pH范围，例如1、2、3、4、5或甚至更高pH单位内保留可测定活性的能力。除了pH稳定性，本文描述的变体α-淀粉酶也可提供pH最佳值，其中在温度、时间、底物浓度和钙离子浓度保持恒定的条件下，活性在某一pH或pH范围内最大。

[0083]如本文所用，在本文中“氨基酸序列”有时候与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义使用。一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义；一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。在上下文清晰可见的其他情况下，“氨基酸序列”指氨基酸侧链或多肽主链中“残基”的实际序列(“一级序列”)。例如，本文提供的序列表提供了几个多肽或多肽结构域的氨基酸序列。

[0084]如本文所用，“核苷酸序列”或“核酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列(“多核苷酸”)及其变体、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因组、合成或重组来源，并可以是双链或单链，无论代表正义链还是反义链。如本文所用，术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。对于多肽，在讨论多核苷酸主链的核苷酸或碱基的实际序列，即一级序列时也使用术语“核苷酸序列”。

[0085]“同源物”表示与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定程度同一性或“同源性”的实体。通常，同源物包含与目标氨基酸序列相同的活性位点残基。同源物还保留了α-淀粉酶活性，尽管所述同源物具有与目标蛋白质不同的酶促性质。“同源序列”包括多核苷酸或多肽，其与另一序列具有某一百分比的同一性，例如80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

[0086]例如当在比对中比较两条多肽序列时，“百分比同一性”表示目标序列或蛋白质中给定百分比的碱基或氨基酸残基与参考序列或蛋白质中存在的碱基或残基完全相同。氨基酸可以相似，但不相同，其中目标序列中的氨基酸相对于参考序列中的氨基酸被取代、缺失或插入。对于蛋白质，优选在翻译后修饰方面相似状态中的序列之间测定百分比序列同一性。通常，目标蛋白质的“成熟序列”(即，加工去除信号序列后保留的序列)与参考蛋白质的成熟序列进行比较。在其他情况下，目标多肽序列的前体序列与参考序列的前体进行比较。

[0087]如本文所用，如果变体多肽包括与亲本多肽相同或基本相同的氨基酸序列，除了特定取代、缺失、插入、化学修饰等，变体多肽“基于”或“来自”亲本(或野生型)参考多肽。“基本相同”表示除了特定取代、缺失、插入、化学修饰等，变体的氨基酸序列不包括其他显著改变亲本多肽性质的取代、缺失、插入、化学修饰等。

[0088]如本文所用，“杂交”包括核酸链与互补链通过碱基配对进行连接的过程，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。编码变体α-淀粉酶的核酸可以以单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链体，或RNA/DNA共聚物存在。如本文所用，“共聚物”指包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的单条核酸链。对特定生物“优化”α-淀粉酶编码核酸，以通过定制核酸来包含在该生物翻译天然蛋白质中优先利用的那些密码子来增强表达。

[0089]如本文所用，通过化学或酶促合成产生“合成的”化合物。合成化合物包括，但不限于编码α-淀粉酶变体的核酸，优选由所选宿主生物为了表达选择的最佳密码子使用制成。也可使用体外技术，如体外转录或翻译，或PCR等制备合成的多肽或核酸。

[0090]如本文所用，“转化细胞”包括细胞，包括细菌和真菌细胞，其已经通过使用重组DNA技术进行了转化。转化通常通过将一个或更多核苷酸序列插入细胞中发生。插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列，即待转化细胞中非天然存在的序列，如编码变体、融合蛋白或嵌合多肽的核酸。

[0091]如本文所用，“有效连接的”表示所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。例如，调节序列可以以这样的方式“有效连接”编码序列：在与调节序列相容的条件下完成编码序列的表达。

[0092]如本文所用，“生物活性的”指序列与天然发生的序列具有相似的结构、调节或生物化学功能，尽管不必是相同程度。例如，生物活性的α-淀粉酶是具有可测定α-淀粉酶活性的多肽。

[0093]如本文所用，“淀粉”指包含植物多糖糖类的任何材料。淀粉一般包含具有化学式(C₆H₁₀O₅)_x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何整数。术语“颗粒淀粉(granular starch)”指生的，即未烹饪过的，例如未胶凝化的淀粉。

[0094]如本文所用，术语“糖化”指淀粉到葡萄糖的酶促转化。

[0095]术语“液化”指淀粉转化中的阶段，其中将胶凝淀粉水解，给出低分子量的可溶性糊精。术语“聚合程度”(DP)指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单位的数量。DP1的实例是单糖葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖麦芽糖和蔗糖。为此，本文的“相当液化过程”是在相当条件，优选温度、pH、底物浓度、钙离子浓度等标准化的条件下进行的那些过程。优选相当液化过程在等量蛋白质或等量活性单位基础上相当，然而在一些实施方案中，任一蛋白质或活性单位或这两者在相当液化过程中可发生变化。技术人员将理解液化过程“相当”的基础。

[0096]在液化过程中，淀粉浆液粘度频繁地用作淀粉向更小的DP单位转化的量度。本文有时候使用表述“初始粘度”。技术人员将理解这是专业术语，并且期望的并不是真实的初始粘度，而是例如在底物胶凝化点周围发生的最大粘度。使用初始粘度来与液化过程结束时底物，例如淀粉浆液的粘度(“终粘度”)区分开。因此，如从液化过程的随时间的粘度变化图(raph of the viscosity over the time-course)上显而易见，初始或最大粘度不是立即出现的，而是在某一段时间，例如低于总时间50％后，并更优选在液化总时间约第一个1/3或甚至1/4或1/5内出现。例如，在本文示例的液化中，最大粘度通常在第一个10分钟内出现，在该时间后加入酶，粘度开始降低。随着淀粉颗粒在胶凝化过程中打开，颗粒内部更易接近酶活性，并且更容易切割，导致粘度的降低。

[0097]如本文所用，术语“干固体含量”(ds)指在干重基础上浆液中固体的总量。干固体含量和干重基础一般表述为目标材料的重量占总干材料重量的百分比。术语“浆液”指在液体，通常是水或类似溶剂中含有不可溶固体的混合物。淀粉或面粉经常悬浮于水溶液中以形成浆液用于检测淀粉酶，或用于液化过程。

[0098]术语“葡萄糖当量”或“DE”定义为还原糖占总糖类部分的百分比。术语“聚合程度”或“DP”指淀粉酶降解淀粉的产物大小。DP越高，糖类就越复杂。α-淀粉酶优选产生低DP，如DP2的产物。

[0099]“混合物”或“酶混合物”指包含两种或更多酶的混合物的组合物，由此提供组合的催化活性，其限定混合物中存在的每一种酶的活性。酶混合物不需要等量的两种或更多酶中的每一种，但需要酶混合物可在等量蛋白质，或等量活性基础上配制。组合的催化活性可以仅是累加的或平均的，或可以是拮抗的或协同的。本文使用的优选混合物提供至少一种累加催化活性，更优选提供协同催化效果。

[00100]为此，“相当液化过程”表示在可控和特定条件(例如温度、pH、钙离子浓度和底物浓度方面)下使用不同或“对照”淀粉酶进行的类似过程，并且其可与目标液化过程相当。

[00101]如本文所用，一个“α淀粉酶单位(AAU)”是在特定条件下每分钟水解10mg淀粉需要的细菌α淀粉酶活性。

[00102]“SPEZYME

XTRA”是Genencor，International生产的市售酶制剂，其包括作为活性成分的C末端截短(即C末端29个残基)的或嗜热脂肪地芽孢杆菌野生型α-淀粉酶的变体。比活性通常是14,000AAU/g。

[00103]“SPEZYME

FRED”是Genencor International，Inc.生产的市售酶制剂，其包括作为活性成分的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶的改造变体，其具有取代M15T、H133Y、N188S和A209V。比活性最小值是17,400AAU/g。

[00104]“SPEZYME

ETHYL”是Genencor International生产的市售酶制剂，其包括作为活性成分的或嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，其具有RG缺失(即，R179和G180)。加工淀粉酶多肽以去除C末端29个残基。比活性是6,700-7,300AAU/g。

2.缩写

[00105]应用以下缩写，除非另有说明：

AAU       α淀粉酶单位

ATCC      美国标准生物品收藏中心

cDNA      互补DNA

CFU       菌落形成单位

DE        葡萄糖当量

DEAE      二乙氨基乙醇

DNA       脱氧核糖核酸

DNS       3，5-二硝基水杨酸

DP或DPn   聚合程度(n亚基)

ds        干固体

EC        酶分类酶学委员会

FDA       食品药品管理局

FAO       联合国粮食及农业组织

GLP       最佳实验室管理规范

GMP       优良制造标准

HPLC      高效液相层析

HPAEC-PAD 具有脉冲电流计检测的高效液相阴离子交换色谱

HS        高糖(DPn，其中n＞3)

JECFA     FWO/WHO食品添加剂联合专家委员会

kb        千碱基

LAT       地衣芽孢杆菌α-淀粉酶

LU        液化单位

MALDI-TOF 衬质辅助激光解吸与电离飞行时间质谱学

mRNA      信使核糖核酸

mL        毫升

mt        公吨(1000kg)

N         正常

M         摩尔

nC        纳库伦

PCR       聚合酶链式反应

PEG       聚乙二醇

ppm       百万分之一

RO        反渗透

RT-PCR    逆转录酶聚合酶链式反应

SDS-PAGE  十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SKBU/g ds 每克干固体的α-淀粉酶单位。测定条件下一个α-淀粉

          酶单位每小时糊精化(dextrinize)1.0g极限糊精底物。

1X SSC    0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0

WHO       世界卫生组织

w/v       重量/体积

w/w       重量/重量

μg       微克

μL       微升

B.变体α-淀粉酶

[00106]在几个方面的第一个方面，提供来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的α-淀粉酶的变体。变体基于对成熟蛋白质181位或182位上野生型淀粉酶序列的修饰，其中取代了181位和182位，或这两个位置上的野生型氨基酸。181位上野生型氨基酸的取代包括Ala、Cys、Asp、Glu、Leu或Pro，182位上野生型氨基酸的取代包括Ala、Ser或Pro。在一个实施方案中，变体淀粉酶在特定测定条件下相比于野生型α-淀粉酶具有增加的比活性。在多个实施方案中，变体的比活性具有约10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、100％或更高的提高。其他情况下，变体淀粉酶相对于野生型具有2倍、3倍、4倍或更高的比活性。这进一步提供了其他的优势，允许在给定应用中使用更少的酶，并将生产能力的问题降至最小。优选地，变体在约50-90℃之间具有增加的比活性。在其他实施方案中，变体在约65-85℃之间具有增加的比活性。

[00107]在一些实施方案中，变体α-淀粉酶具有SEQ ID NO：2、3、4、5、6、10或15的氨基酸序列。这些序列在野生型氨基酸序列181位上包含单个突变或变异。在一些实施方案中，野生型/亲本序列是AmyS的序列，其中突变或变异位于I181位上。一般地，“X₁POSX₂”形式的命名表示变体在“POS”位上含有变异的氨基酸序列，其中野生型氨基酸残基，X₁取代为不同的氨基酸残基X₂，其中X₁和X₂是氨基酸的标准单字母密码，并且“POS”是野生型成熟序列的一级氨基酸序列内的任何位置。因此，I181上的变体是淀粉酶序列，其中在野生型序列181位上具有异亮氨酸的野生型序列取代为另一氨基酸。目前优选I181P、I181A和I181L变体。在其他实施方案中，包括I181C、I181D、I181E和I181Y的变体是重要的。还包括变体I181F、I181G、I181H和I181V。

[00108]在优选的实施方案中，变体具有SEQ ID NO：2、3或10的序列。野生型/亲本序列是AmyS的序列时，这些突变或变异分别对应于I181I、I181A和I181L。在一个实施方案中，当用于液化过程时，相对于用相应野生型α-淀粉酶液化的相当淀粉浆液的最大粘度，淀粉酶活性降低了淀粉浆液的最大粘度。

[00109]在一些实施方案中，变体α-淀粉酶具有SEQ ID NO：16、17或18的氨基酸序列。这些序列在野生型氨基酸序列182位上包含单个突变或变异。在一些实施方案中，野生型/亲本序列是AmyS的序列，其中突变或变异位于G182位上。目前优选G182A、G181S和G182P变体。

[00110]变体没有其他已知α-淀粉酶(例如在Van Der Laan和Aehle的美国专利号6,939,703和Svendsen等的6,143,708或

-Frantzen等的5,830,837中公开的那些α-淀粉酶)的序列。类似地，本文描述的变体淀粉酶不包括其他已知序列，例如Sajedi等在J.Biochem.Mol.Biol.40：315-324(2006)中公开的序列也特异地排除在外。也明确排除EuropeanMolecular Biology Laboratories(EMBL)或National Center forBiotechnology Information(NCBI)的公共数据库中在本公开内容提交日期之前超过一年提供的α-淀粉酶序列作为本发明α-淀粉酶变体的序列。可使用附带条件从本发明组合物和方法中单独排除任何这种已知的序列。

[00111]本发明组合物和方法包括的变体α-淀粉酶具有α-淀粉酶的基本催化活性，其允许它们攻击(即，水解)底物如直链淀粉和/或支链淀粉的α-1，4键，将其转化成更低DP的糊精。在这样的过程中，α-淀粉酶降低了粘度，并增加了葡萄糖当量(DE)，使得它们液化并糊精化通常处于浆液中的淀粉。α-淀粉酶也用于其他淀粉降解过程，例如脱浆针织材料和清洗过程，其中必须去除不想要的淀粉。

[00112]本发明α-淀粉酶变体的特征是它们相对于其来源的野生型/亲本淀粉酶显示提高的性能特征。在其他实施方案中，变体相对于其他α-淀粉酶，如AmyL或AmyS具有提高的性能。在一些实施方案中，变体淀粉酶显示优于用于同一目的的常规市售酶制剂的提高的应用性能。

[00113]提高的性能特征包括提高的稳定性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。具体而言，α-淀粉酶变体在高温(例如70-90℃)下提供更好的稳定性，和/或在高温提供增加的比活性。本文提供的热稳定变体淀粉酶有利地用于高温液化，以及使用或需要升高温度的其他过程(如烹饪、烘烤等)。

[00114]本发明变体的另一性能特征是它们降低淀粉浆液的最大粘度。这通过需要更少能量用于混合并允许淀粉更快向更低DP产物转化对液化过程有利。

C.包含变体α-淀粉酶的组合物

[00115]还提供多种组合物，其包含具有α-淀粉酶催化活性的一种或多种α-淀粉酶突变体。组合物包括例如含有变体α-淀粉酶的酶浓缩物、酶混合物、纯化的酶、部分纯化的酶产品、食品添加剂和清洗产品。

[00116]在一个实施方案中，组合物包括如本文描述或示例的变体淀粉酶。这种组合物具有多种用途。组合物还可提供多于一种的淀粉酶变体，或其他淀粉酶，或其组合。可高度纯化或仅部分纯化组合物。在某些实施方案中，组合物在活性单位方面进行标准化。可以多种物理形式，包括多种浓度和纯度的液体、凝胶、团块(cake)、半固体或固体提供组合物。组合适合任何物理形式，只要在最终组合物中保留可测定活性。因此，可方便地冻干、浓缩、冷冻、喷雾干燥或以多种已知或重要方式加工组合物。可以以标准尺寸提供组合物，用于某些商业应用，或进行常规包装，或在以任何类型的散装容器(bulk container)提供。

[00117]组合物和酶混合物可进一步包含和用于与一种或多种其他多肽组合。优选地，所述一种或多种其他的多肽包含至少一种酶。因此，任何已知的酶可与组合物或酶混合物，当然还可以与α-淀粉酶本身一起使用。可向本文公开的组合物、酶混合物或α-淀粉酶中加入任何多种其他的酶，以提供技术人员期望的其他功用或便利。在多个实施方案中，其他的酶可包含一种或多种细菌α-淀粉酶或β-淀粉酶，例如BBA，真菌α-淀粉酶，例如CLARASE

L，或葡糖淀粉酶、异淀粉酶、异构酶、蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶、纤维素酶、lignase、半纤维素酶、脂肪酶、磷脂酶和cutinase。本文包括使用包含如本文公开的一种或多种α-淀粉酶变体彼此一起，或与任何一种或多种前述淀粉酶的组合。如上文公布，真菌蛋白酶包括例如从曲霉属物种(Aspergillus spp.)，如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)；毛霉属物种(Mucor spp.)，例如，米黑毛霉(M.miehei)；根霉属(Rhizopus spp.)等获得的任何蛋白质降解酶活性。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外作用麦芽糖(maltogenic)淀粉酶，其催化1，4-α-糖苷键水解成支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物，由此释放麦芽糖。已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶。参阅Fogart等PROGRESSIN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，第15卷，112-115页(1979)。这些β-淀粉酶在40℃到65℃的范围内具有最佳温度，在约4.5到约7.0的范围内具有最佳pH。涵盖的β-淀粉酶包括但不限于来自大麦的β-淀粉酶SPEZYMEBBA 1500、SPEZYME

DBA、OPTIMALT^TM ME、OPTIMALT^TM BBA(Genencor International，Inc.)；和NOVOZYM^TMWBA(Novozymes A/S)。

[00118]在一个实施方案中，组合物或酶混合物包含用于液化包含直链淀粉和支链淀粉的复合糖类的一种或多种其他酶。在一个实施方案中，所述其他的酶是α-淀粉酶。任何已知的α-淀粉酶可与淀粉酶、组合物或酶混合物，包括细菌α-淀粉酶，例如来自芽孢杆菌的α-淀粉酶，如AmyL-、AmyS-、AmyQ-或AmyM-类型的淀粉酶、真菌淀粉酶，或植物或动物淀粉酶组合使用。当用于液化过程时，相对于用单个酶，尤其是野生型酶液化的相当淀粉浆液的最大粘度，这种组合物或混合物优选降低淀粉浆液的最大粘度。在一个实施方案中，包含两种或更多酶的组合物或混合物将淀粉浆液的最大粘度降到至少任何两种或更多酶单独使用时产生的粘度，并产生与任何两种或更多酶单独使用时产生的终粘度至少一样低的淀粉浆液的终粘度。

[00119]制备或配制一个实施方案中的组合物，用作食品添加剂或适合于食品加工的加工助剂。还提供包含如本文公开的α-淀粉酶变体的食品级冻干组合物。当制备或配制用作食品添加剂或用于食品加工时，组合物必须满足或超过某些调控需要。这些需要作为技术人员在制备组合物中的指导。因此，技术人员将理解尽管调控需要在多个国家可能不同，但一般地，组合物的重金属含量非常低，并且铅和砷也低。尤其是，总重金属含量优选不超过约40ppm，更优选低于约30ppm。组合物的铅含量不超过约10pm，更优选低于约5或3ppm。组合物的砷含量低于约3ppm。当用标准方法检测时，组合物对真菌毒素和抗菌内容也是阴性的。组合物在其微生物内容方面也是干净的，当旨在用作食品添加剂或食品加工助剂时，其优选在GMP或GLP标准下以最小量微生物内容产生。具体而言，总活菌数不超过每克组合物约5x10⁴CFU。组合物优选具有不超过每克组合物约40CFU的大肠芽孢杆菌计数。更优选地，大肠芽孢杆菌的计数不超过每克约30CFU。此外，如标准微生物方法测定，组合物没有可检测的沙门氏菌(Salmonella)或志贺氏菌(Shigella)。当在宿主细胞中产生变体淀粉酶时，组合物具有低于每克1CFU宿主生物。

[00120]另外，组合物在毒性等方面具有令人满意的安全标准。在一个实施方案中，组合物在合适的体外测定中没有显示出潜在的毒性。组合物在动物急性和/或亚慢性剂量研究中也没有显示出毒性效应。

[00121]为了食品添加剂或食品加工助剂的目的，优选标准生产如许多商业使用的食品酶。因此，在生产过程中使用GMP，满足例如FDA或国际权利机构，例如Food Chemicals Codex(第4版，1996)，FWO/WHO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)在Compendium of Food AdditivesSpecifications，第1卷，附件1附录9(2001)(和更早期相关附录)中确定的食品酶的需要和技术要求。例如，使用如补料分批发酵，例如，例如生物体中的深层补料分批发酵(submerged fed-batch fermentation)的方法生产包含α-淀粉酶变体的组合物，所述submerged补料分批发酵一般认为是安全的，或用于该目的，例如生产食品级酶制剂的历史悠久。

[00122]为了本文的一些目的，合适的宿主生物包括来自芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌，包括例如嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短芽孢杆菌(B.brevis)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。包括凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)的其他芽孢杆菌也是重要的。可用于生产本文描述的一些组合物的其他革兰氏阳性菌包括变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(S.murinus)。包括大肠芽孢杆菌(Escherichia coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)物种的革兰氏阴性菌也可用于生产本文提供的某些组合物。

[00123]本文还提供包含α-淀粉酶变体的组合物，所述α-淀粉酶变体用于促进从多种非淀粉(因此非底物)材料如织品(textile)、纸、玻璃、塑料、金属、帆布、瓷器等中去除酶的底物(例如淀粉)。因为在洗涤或清洗过程中频繁地去除此类材料，一个实施方案中的组合物包括一种或多种肥皂、去污剂、清洗剂、氧化剂或螯合剂。在一个实施方案中，组合物用作洗衣清洁剂，在另一实施方案中其用作餐具去污剂。为本文描述的这些目的以及其他目的，组合物可配制成凝胶。多种此类凝胶为本领域已知，并且除了提供对消费者或使用者有吸引力并且便利的使用形式外，还提供某些优势，例如酶在待去除底物上的工作接触时间和条件。标准清洗剂，以及去污剂、肥皂、氧化剂和/或螯合剂的包含物(inclusion)需要α-淀粉酶活性不仅在最终使用中发现的条件下稳定，在产品自身中发现的更集中或极端条件也下稳定。

D.变体α-淀粉酶的表征

[00124]可通过本领域已知的多种方法和技术表征本文提供的酶，如α-淀粉酶变体。核酸和一级多肽序列是比较并分析本文提供的淀粉酶的重要手段。三维结构模型和/或物理结晶也是重要的。比活性的测定经常用于表征酶。可使用本领域技术人员已知的标准测定，或通过在测定淀粉酶的已知技术基础上设计新测定法来评估在底物、温度、pH、钙离子浓度和其他因素多种条件下的酶活性。测定酶的动力学性质，包括动力学常数如特定条件下的V_max或K_m也用于表征本文提供的变体淀粉酶。如用于测定实现最大活性的最佳钙离子浓度，并实现在存储α-淀粉酶变体过程中最大稳定性的条件的方法，用于测定稳定性或测定法的最佳pH的方法为本领域所知。

[00125]应用表征包括在模拟加工条件下产生的结果方面表征酶活性。桌面(bench-top)液化方法等可用于在更接近实际使用条件的条件下测定或评估变体的性能。粘度测定研究可帮助表征淀粉酶在所述方法中达到的最大粘度，或淀粉酶变体降解或处理的淀粉浆液的终粘度方面的催化活性。在许多重要实施方案中，与野生型淀粉酶、对照淀粉酶，或用于相似条件的市售淀粉酶进行比较。与其他淀粉酶变体的比较也用于评估特定酶的相对值或功效。

[00126]表征宿主细胞中变体淀粉酶的表达例如在测定制备淀粉酶变体的方法的商业潜能中是个重要特征。为了提高宿主细胞中变体α-淀粉酶的表达，可测定表达的蛋白质、相应的mRNA，或酶活性。合适的测定包括Northern和Southern印迹、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)和使用适当标记的杂交探针的原位杂交。特定宿主细胞中产生的淀粉酶的表达量、表达速率或最大回收率的测定均是与变体淀粉酶表达相关的重要特征实例。

[00127]本文描述的α-淀粉酶变体在给定温度下相对于AmyS或AmyL酶也显示延长的半衰期。在多个实施方案中，半衰期尤其是在约55℃到约95℃或更高，尤其在约75℃、80℃、85℃或更高的升高温度下可以增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高。

[00128]在一些实施方案中，α-淀粉酶变体相对于变体来源的野生型序列其比活性提高了。约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或甚至更高的比活性提高可在变体淀粉酶中产生。

[00129]在一个实施方案中，本文提供的α-淀粉酶变体与亲本序列，如AmyS酶具有相同的pH稳定性。在另一方面，变体淀粉酶显示对pH变化的更大范围的稳定性，或将pH最佳值或稳定范围转换到为了酶最终商业目的的期望范围。例如，在一个实施方案中，变体淀粉酶可在约pH 4.5到约pH 10.5降解淀粉。α-淀粉酶变体在相同条件下相对于AmyS具有更长的半衰期或更高的活性(取决于测定)。α-淀粉酶变体在相同pH条件下也具有约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更长的半衰期。在另一实施方案中，α-淀粉酶在相同pH条件下与野生型序列或亲本序列，例如AmyS相比具有更高的比活性。本文提供的α-淀粉酶变体可具有上文列出的期望特征的任何组合。

E.编码变体α-淀粉酶的多核苷酸

[00130]在其多个方面的另一方面，提供编码如本文所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的多核苷酸。因为在自然界中未发现所编码的多肽，所以必须通过手工制备，例如合成或例如通过定点突变和筛选方法产生多肽。具体而言，多核苷酸编码多肽，其包含野生型淀粉酶序列，除了在成熟蛋白质181或182位上的取代，其中181和182位或这两个位置上的野生型氨基酸发生了取代。181位上野生型氨基酸的取代包括Ala、Cys、Asp、Glu、Leu或Pro，182位上野生型氨基酸的取代包括Ala、Ser或Pro。

[00131]在多个实施方案中，多核苷酸编码I181P、I181A和I181L变体多肽。在其他实施方案中，多核苷酸编码包括I181C、I181D、I181E和I181Y，或甚至，I181G、I181H和I181V的变体。

[00132]在多个实施方案中，多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2-18，优选SEQ ID NO：2-6、10、15和17-19，一些情况下SEQ ID NO：2、3、10、16和18的氨基酸序列的多肽。在特定实施方案中，编码的变体多肽具有SEQ ID NO：2或3的序列。

[00133]在一个实施方案中，多核苷酸是基因组DNA，而在另一实施方案中，多核苷酸是cDNA。由于遗传密码的简并，具有根据本公开内容提供的多个多核苷酸，其编码同一多肽。多核苷酸也包括编码如本文提供的淀粉酶变体的mRNA。

[00134]在一个目前优选的实施方案中，通过改变多核苷酸的组成来满足优先用于宿主细胞中的那些密码子来优化编码α-淀粉酶变体多肽的多核苷酸，用于变体多肽在来自微生物或植物的宿主细胞中进行表达。用于优化密码子使用的技术为本领域已知并且多种生物的密码子使用表可在标准资源如生物技术的文本或实际手册中得到。

[00135]还提供包含编码变体淀粉酶的多核苷酸的载体。本文包括使用用于维持多核苷酸、产生多核苷酸量、操作多核苷酸序列或在体外或宿主细胞中表达多核苷酸的任何载体。在标准生物技术手册和文本，例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(2001)中提供合适载体的实例。

[00136]在一个实施方案中，优选的载体用于在宿主细胞，尤其在微生物细胞，如细菌细胞或植物细胞中表达编码的多肽。可调整表达载体用于瞬时表达变体α-淀粉酶，例如以证实放大之前的催化和其他性质。长期使用并大规模生产的表达载体例如通过整合到宿主染色体内，或通过稳定掺入到自我复制多核苷酸序列中得以优选调整用于稳定表达。在一个实施方案中，通过包含与α-淀粉酶变体的编码序列有效连接的调节序列的表达载体将载体、DNA构建体转移到宿主细胞中。

[00137]还提供微生物细胞，包括酵母、真菌或细菌细胞，其包含含有编码变体α-淀粉酶的多核苷酸的载体。在一个实施方案中，载体是适合于在宿主细胞中表达编码多肽的表达载体。在另一实施方案中，提供包含植物表达载体的植物细胞。用于在多种宿主细胞中表达的载体为本领域已知并含有所需调节序列，如启动子等，以促进编码多肽的表达。用于芽孢杆菌中的示例性启动子包括来自AmyL、AmyQ、AmyM或AmyS中的淀粉酶基因的启动子，以及来自枯草芽孢杆菌中xylA和xylB基因的启动子。在一个实施方案中，表达载体含有一个或更多或者是组成型的或者是诱导型的强启动子，用于表达或过表达编码的多肽。在另一实施方案中，多核苷酸包括用于翻译后修饰肽，如将表达多肽转运到细胞外，或转运到宿主细胞内特定区室内以促进从宿主细胞中产生、分离或纯化多肽的序列。例如，多核苷酸可包括一个或更多序列，以便最初产生其一端附着异源多肽(如来自地衣芽孢杆菌的信号肽)以促进表达蛋白质从细菌宿主细胞中分泌的变体淀粉酶。多核苷酸也可包括这样的序列，其使得最初产生具有“纯化序列”，即促进表达蛋白质纯化的序列的变体淀粉酶，其中在纯化过程中切割所述“纯化序列”。

[00138]宿主细胞是植物时，预期在一个实施方案中植物是用于淀粉生产的农作物。可在植物中过度生产淀粉酶变体。可用储存淀粉的植物部分，例如种子过度生产并区室化所述淀粉酶变体。因此，可收获植物，分离淀粉，并且α-淀粉酶变体可与淀粉一起纯化。该实施方案在植物待用于醇发酵，尤其例如用于燃料乙醇发酵时特别有用。

[00139]在一个实施方案中，宿主细胞来自生产食品加工助剂或食品添加剂可接受的生物。目前，优选来自芽孢杆菌，尤其是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的宿主细胞。用于细菌细胞的合适质粒(包括用于在芽孢杆菌中自我复制的载体)为本领域已知。

F.制备和使用变体α-淀粉酶的方法

[00140]根据本文公开内容另一方面提供的是产生嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的方法。在一个实施方案中，提供的方法产生了包含如上文所述至少一种野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的组合物。变体淀粉酶具有可测定的α-淀粉酶活性。该方法包括利用本文提供的宿主细胞用于发酵过程，其中表达至少一种变体淀粉酶。表达后，表达的变体淀粉酶分子至少是部分纯化的，由此产生包含变体α-淀粉酶的组合物。在一个实施方案中，表达变体在成熟野生型蛋白质181位或182位上包含变体，其中181位和182位上的野生型氨基酸发生取代，181位上野生型氨基酸残基的取代分别包括Ala、Cys、Asp、Glu、Leu或Pro，182位上野生型氨基酸残基的取代分别包括Ala、Ser或Pro。在一个实施方案中，变体在特定测定条件下与对应的野生型α-淀粉酶相比具有提高的或增加的比活性。

[00141]在一个实施方案中，宿主细胞来自芽孢杆菌属物种。发酵方法可以是任何类型的，尽管补料分批发酵过程，如深层补料分批发酵在本文中是重要的。

[00142]提供的方法进一步包括在某些实施方案中进一步纯化变体淀粉酶，以制备纯化的组合物的步骤，所述纯化的组合物在体外测定中不显示任何潜在的毒性；在动物急性和亚慢性剂量研究中也不显示任何毒性效应。这种组合物用作食品加工助剂，或在一些情况下用作直接的食品添加剂。

[00143]该方法产生纯化的或部分纯化的组合物，其包含不超过40ppm的总重金属，不超过5ppm的砷、不超过10ppm的铅、不超过5x10⁴的总活生物(CFU/g)、不超过30大肠杆菌(CFU/g)，并通标准测试没有可检测的沙门氏菌、真菌毒素或抗菌活性。

[00144]在多个实施方案中，该方法还用于制备部分纯化或纯化的组合物，其包含多于一种α-淀粉酶活性，并且在一些实施方案中还包含至少一种其他酶活性。在一个实施方案中，所述纯化或部分纯化的组合物包含用于液化过程的至少一种其他酶活性。当用于液化过程时，纯化或部分纯化的组合物降低了淀粉浆液相对于用单个酶液化的相当淀粉浆液的最大粘度的最大粘度。

[00145]还提供使用包含α-淀粉酶变体的组合物的方法。尤其提供液化复合糖类，如淀粉浆液的方法。该方法包括制备包含复合糖类的浆液，将浆液加热至液化可接受的温度，向浆液中加入包含如本文提供的至少一个α-淀粉酶变体的组合物，并将浆液与组合物在足以液化复合糖类的温度下温育一段时间。在优选实施方案中，复合糖类是淀粉。如本文所用，“液化”不表示切割每一可得到的底物键，而表示至少部分水解复合糖类，如终粘度的可测定降低、浆液DE增加、低DP片段/产物释放，或还原基团、糊精或α-麦芽糖单位增加的另一量度所证明的。

[00146]在所要求保护的方法的一个实施方案中，底物，即复合糖类是淀粉、淀粉酶或支链淀粉。液化方法的温度可从室温变化到超过100℃，但更优选从约50℃到约90℃。液化可限定随着时间的复杂温度曲线，例如反应在低温下开始，并通过本领域已知的方法升高到期望的最终温度。也可以在一定时间，或在达到粘度、DE值或液化另一量度方面的期望终点后降低温度。技术人员因此将理解所述方法不需要限特定温度持续特定时间，只要淀粉酶活性可以在所提供的温度和条件下起作用。除了抑制剂等的存在或缺失外，影响活性的其他条件包括pH和钙离子浓度。

[00147]在一个实施方案中，浆液包含基于干重约20-40％的淀粉，而在另一实施方案中，浆液包含约30到约36或37.5％的淀粉。但从经济考虑上进行限制，可使用更少量的淀粉。最大粘度和相关因素，如混合所需的能量输入可限制待用于浆液中的淀粉的最大量。技术人员将理解在制备淀粉浆液中进行的实际考虑。

[00148]在一个实施方案中，液化是发酵的一部分。本发明人已经发现本文公开的淀粉酶变体，包括具有SEQ ID NO：2或3氨基酸序列的那些淀粉酶变体的性质在淀粉发酵过程中非常有用，因为相对于用变体来源野生型酶处理或用目前市售酶制剂处理的相当浆液(的最大粘度)的最大粘度，它们可大大降低淀粉浆液的最大粘度。在一些实施方案中，发酵用于产生食品产品、食品添加剂、燃料或燃料添加剂。在优选实施方案中，发酵用于产生燃料或燃料添加剂，其为醇，优选乙醇或另一低级醇。

[00149]技术人员将理解，粘度降低得越多，淀粉液化得越彻底，糊精产生得越多(或所得液化淀粉的DE越高)。因此在一个实施方案中，最大粘度相对于变体来源野生型酶液化的或用目前市售酶制剂处理的相当浆液的最大粘度降低了至少10、20、25、30、40或甚至50％或更高。

[00150]本文提供清洗表面以去除不想要的或非期望淀粉残余的方法。该方法包括这样的步骤，其提供具有待去除淀粉残余的表面，使表面与包含一个或更多变体α-淀粉酶的组合物在足够温度以及允许导致淀粉残余去除的条件下接触一段时间。该表面可以在任何材料上；例如，其可以在盘子、平板、玻璃等上面，或其可以在服装(clothing)或织物上面。其例如也可以是柜台面或工作台面，或必须定期或规律地清洗的任何类型的市售容器。

[00151]在一个实施方案中，用于方法中的组合物包含至少一种其他酶，例如一种或多种蛋白酶、脂肪酶、其他的淀粉酶，或其组合。在另一实施方案中，在接触步骤前完成冲洗或批量去除残余的步骤。该步骤从清洗过程中去除了大量淀粉，以使得酶能够在残留且更难以去除的底物上作用。可在任何温度，但优选在接触步骤达到至少50-90℃的温度下进行清洗方法。在一个实施方案中，该方法包括在去除残余后对表面消毒，或蒸气处理表面的步骤。在几个实施方案中，该组合物还包含至少一种去污剂、氧化剂、螯合剂或其组合。

[00152]本文还提供使用本文所述α-淀粉酶变体处理针织材料的方法。用淀粉酶处理处理针织材料，如织物的方法为本领域所知。所提供的方法可提高针织材料，如织品或织物的质感和/或外观。该方法包括使针织材料与包含α-淀粉酶变体的液体或包含变体的组合物接触。在一个实施方案中，针织材料是织物或织品。在另一实施方案中，在压力下用液体处理针织材料。液体一般是水溶液。

[00153]该方法通常在编织过程，例如编织织物或织品过程中或之后应用。或者，在脱浆阶段，或在进一步加工针织材料的一个或更多其他步骤中使用该方法。因为在编织过程中，材料(例如线)暴露在巨大机械牵拉下，所以该方法是有用的。在编织过程之前，特别是在市售织布机上，待编织的材料经常涂层包含淀粉或淀粉衍生物的“涂料(sizing)”，以增加其牵引力并防止断裂。本文提供的变体淀粉酶可在编织过程中或之后应用，以去除该涂料淀粉或淀粉衍生物。

[00154]本文提供的α-淀粉酶变体可单独使用或与其他脱浆化学试剂，如去污剂和/或脱浆酶一起使用，以脱浆针织材料，如织物，包括棉花和含棉花的织物。

[00155]本文公开的α-淀粉酶变体在酶促修整方法(finishing method)中也有应用。已经开发该方法用于服装，例如在制造厚牛仔裤中。淀粉酶的作用是为织物提供柔软度，并使得棉花更易于随后的酶促修整步骤(例如以实现石洗效果)。

G.酶混合物和试剂盒，以及使用所述酶混合物和试剂盒的方法

[00156]本文还提供包含至少第一种和第二种α-淀粉酶的酶混合物。当每一种淀粉酶单独用于相当的液化过程时，第一种α-淀粉酶具有催化活性，其产生比第二种α-淀粉酶产生的终粘度低的终粘度。然而，第一种淀粉酶的催化活性产生比第二种α-淀粉酶相应催化活性产生的最大粘度高的最大粘度。令人惊奇的是，酶混合物提供组合催化活性，当其用于液化过程时，产生与第一种α-淀粉酶单独用于相当液化过程时获得的终粘度大致相同的终浓度。混合物还提供最大粘度，其显著低于第二种α-淀粉酶单独用于相当液化过程时获得的最大粘度。如本文所用，“相当液化过程”包括温度、pH、钙离子浓度和底物浓度的特定条件。

[00157]如上包含α-淀粉酶的组合物，酶混合物可进一步包含或与一种或多种其他的多肽，如至少一种酶组合使用。技术人员将理解任何已知的酶可与本文公开的酶混合物一起使用。可向酶混合物中加入任何多种其他的酶，以如技术人员所期望的提高功效或便利。其他的酶可包含具有淀粉或糖类修饰活性的酶，包括脱支酶、麦芽糖酶等。例如，本文可使用一种或多种细菌α-或β-淀粉酶，例如BBA，真菌α-淀粉酶，例如ClaraseL，或葡糖淀粉酶、异淀粉酶或异构酶。预期用于本文的其他酶包括蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶、纤维素酶、lignase、半纤维素酶和cutinase，以及脂肪酶，和/或磷脂酶。本文明确期望使用包含本文公开的一种或多种其他α-淀粉酶变体，或彼此在一起，或与任何一种或多种上述淀粉酶活性组合的其他淀粉酶活性。如上公开，真菌蛋白酶包括，例如从曲霉属物种，如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉；毛霉属物种，例如，米黑毛霉；根霉属等获得的任何蛋白质降解酶活性。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外作用麦芽糖淀粉酶，其催化1，4-α-糖苷键水解成支链淀粉和相关葡萄糖聚合物，由此释放麦芽糖。已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶。参阅Fogarty等，PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，第15卷，第112-115页(1979)。这些β-淀粉酶在40℃到65℃范围内具有最佳温度，在约4.5到约7.0范围内具有最佳pH。期望的β-淀粉酶包括，但不限于来自大麦的β-淀粉酶SPEZYME

BBA 1500、SPEZYME

DBA、Optimalt^TM ME、Optimalt^TM BBA(Genencor International，Inc.)；和Novozym^TM WBA(Novozymes A/S)。多个种类或活性的其他酶的实例已经商品化并为本领域所知，且适合于用于本文。在一个实施方案中，已经特定配制为食品加工助剂或食品添加剂的其他酶与本文公开的酶混合物或其他组合物组合使用。

[00158]在一个实施方案中，酶混合物包含用于液化淀粉或包含直链淀粉和/或支链淀粉的其他复合糖类的一种或多种其他酶。在一个实施方案中，所述其他的酶是α-淀粉酶。任何已知的α-淀粉酶可与淀粉酶、组合物或本文提供的酶混合物，包括细菌α-淀粉酶，例如来自任何芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)的α-淀粉酶，如AmyL-、AmyS-、AmyQ-或AmyM-类型的淀粉酶、真菌淀粉酶，或植物或动物淀粉酶组合使用。当用于液化过程时，相对于用单个酶，尤其是野生型酶液化的相当淀粉浆液的最大粘度，这种混合物或组合物优选降低淀粉浆液的最大粘度。在一个实施方案中，包含两种或更多酶的酶混合物将淀粉浆液的最大粘度降到至少任何两种或更多酶单独使用时产生的粘度，并还导致淀粉浆液的终粘度与任何两种或更多酶单独使用时产生的终粘度至少一样低。

[00159]还提供液化淀粉浆液的方法，其包括制备包含淀粉的浆液，将浆液加热至液化可接受的温度，向浆液中加入包含如本文所述第一种和第二种α-淀粉酶的上述酶混合物，并将浆液与酶混合物在足以液化淀粉浆液的温度下温育一段时间。浆液的终粘度大约与相当液化过程中单独使用第一种α-淀粉酶获得的终粘度一样低，并且浆液的最大粘度比在相当液化过程中单独使用第二种α-淀粉酶获得的最大粘度低。在一个实施方案中，和分别加入第一种和第二种α-淀粉酶单独用于相当液化过程时的相应量相比，加入的酶混合物的量导致加入更少的每一种第一种和第二种α-淀粉酶。第一种和第二种α-淀粉酶每一种的量分别是每一种单独使用时加入相应量的大约一半。

[00160]还提供包含变体淀粉酶的药盒(即试剂盒)。在一个实施方案中，提供用于促进淀粉浆液液化的试剂盒。所述试剂盒包括至少一种：本文所述变体α-淀粉酶、本文所述包含变体淀粉酶的组合物、本文所述食品级冻干组合物，或本文所述酶混合物；和用于在淀粉浆液液化过程中使用试剂盒的说明书。

[00161]还提供试剂盒，其用于实践前述从表面清洗淀粉残余的方法，并用于处理针织材料以去除包含淀粉或淀粉衍生物的涂层。试剂盒包括至少一种本文所述的α-淀粉酶变体，或本文所述一种组合物或酶混合物，以及用于实践相应方法的说明书。

[00162]还提供使用本文公开的α-淀粉酶、组合物或酶混合物生产乙醇的方法。该方法包括用以下中的一种或多种种液化淀粉浆液：(a)来自嗜热脂肪芽孢杆菌的变体α-淀粉酶，其中所述α-淀粉酶至少181位和182位或这两个位置上的氨基酸相对于来自嗜热脂肪芽孢杆菌的野生型α-淀粉酶发生取代，181位上的野生型氨基酸残基取代分别包括Ala、Cys、Asp、Glu、Leu或Pro，182位上野生型氨基酸残基取代分别包括Ala、Ser或Pro；(b)包含所述α-淀粉酶的组合物；(c)包含所述淀粉酶的食品级冻干组合物；或(d)包含所述淀粉酶和第二种淀粉酶的酶混合物，所述α-淀粉酶具有催化活性，当其用于液化过程时产生比每一种淀粉酶单独用于相当液化过程时第二种α-淀粉酶的相应催化活性产生的终粘度低的终粘度，但比其最大粘度高的最大粘度。加入酶后，用能够生产乙醇的一种或多种生物在适合在发酵中产生乙醇的条件下发酵所得液化淀粉浆液一段时间。技术人员将理解任何多种生物可用于通过发酵此类液化糖类来产生乙醇。优选地，例如通过本领域已知的任何多种方法，如通过蒸馏和浓缩至少部分纯化所得乙醇。

[00163]技术人员将理解选来发酵的特定生物可提供更高的产量或更有效地发酵糖类，如果浆液进一步例如酶促加工或转化成甚至更小的DP聚合物——例如单糖，如葡萄糖，或葡萄糖和果糖的组合物。因此，在一个实施方案中，该方法包括向液化淀粉浆液中加入一种或多种其他的酶以在发酵步骤中进一步完成乙醇生产的任选步骤。此类酶包括淀粉酶，例如麦芽糖淀粉酶或糖酵解淀粉酶(glucolytic amylase)、异构酶或甚至蛋白酶或脂肪酶。在一个实施方案中，充分纯化乙醇以用作食品或饮料、食品添加剂，或燃料或燃料添加剂。

[00164]上文引用的所有参考文献为了所有目的以其整体引入作为参考。提供下文提供的操作实例以进一步描述并阐明α-淀粉酶变体的某些方面，并因此不应理解为限制。

实施例

实施例1：基于嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶序列的α-淀粉酶变体的热稳定性

[00165]筛选在181位具有取代的AmySα-淀粉酶变体文库相对于两种对照即亲本α-淀粉酶AmyS(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌)和市售酶制剂SPEZYMEETHYL(Genencor International，Palo Alto，CA；如上描述)的热稳定性。通过标准技术生成文库。包括I181K、I181N、I181Q和I181W在内的某些变体不呈现在文库中。制备并筛选文库中每一变体的热稳定性。在纯化的或平板样品上进行蛋白质测定。在所有测定中，将等量的α-淀粉酶蛋白质加入反应中。

[00166]使用pH 5.6的苹果酸缓冲液将平板或纯化的变体稀释至蛋白质浓度约为20ppm。在相同的缓冲液中悬浮由15％的玉米淀粉组成的底物。将反应管中400μl的淀粉悬浮液平衡至70℃2.5分钟。随后将7μL稀释的酶加入至平衡后的淀粉悬浮液中使蛋白质终浓度约为0.35ppm。随后将反应混合物放在预热到85℃的振荡加热器中并在300转/分钟下进行混合。

[00167]在预设的温育时间(20分钟)时，通过加入50μL 125mMNaOH来终止反应。随后旋转反应管并且用10mM NaOH将上清液稀释10倍，用于HPAEC-PAD进行DP谱分析。计算每种检测酶的活性，在未进行85℃热攻击的酶的活性基础上计算每种酶剩余的百分比活性。

结果：

[00168]以上测定结果显示于图1中。柱高代表85℃温育20分钟后的剩余百分比活性(Y轴)。每个柱都用一个字母表示，该字母对应用于取代AmySα-淀粉酶的181位天然存在的异亮氨酸的氨基酸残基的单字母缩写。在不存在值(即，柱高为零)的地方，未检测对应于该取代的变体。标注为“Z”的柱代表野生型AmySα-淀粉酶。标注为“$”的柱代表使用市售酶制剂SPEZYMEETHYL(Genencor International)的对比对照。

[00169]相对于野生型AmyS，许多变体显示出了提高的热稳定性。在这些变体中，I181P、I181A和I181L在热攻击后保留了最高的活性。I181P和I181A的误差棒表明差异是显著的。如热激发后保留活性所示，包括I181C、I181D、I181E和I181Y在内的其他变体平均都显示出至少在数字上增加的热稳定性。考虑到误差棒的重叠，变体I181F、I181G、I181H和I181V看起来均具有与野生型/亲本酶相当的热稳定性。

实施例2：变体相对于市售酶制剂的活性谱

[00170]比较了两种市售酶与在初期筛选中显示最高热稳定性的变体的活性谱。先测定纯化的样品及来自平板的样品的蛋白质浓度并且所有淀粉酶以相同的蛋白质浓度进行检测。

[00171]使用pH 5.6的苹果酸缓冲液将平板或纯化的α-淀粉酶变体稀释至蛋白质浓度约为20ppm。底物由相同缓冲液中的15％玉米淀粉组成。将反应管中400μl的淀粉悬浮液底物平衡至65℃2.5分钟。将稀释的酶(10μL)加入到平衡后的淀粉悬浮液中至蛋白质终浓度约为1ppm。将反应混合物温育5分钟，随后放置在预热至85℃的振荡加热器中并在300转/分钟下进行混合。在预设的时间间隔处，用50μL 125mM的NaOH对反应进行淬灭。随后旋转反应管并用10mM NaOH将上清液稀释10倍，以用于通过HPAEC-PAD来进行DP谱分析，这是支链淀粉的链长度分析的常用技术。

[00172]在65℃放置5分钟后取初始样品。在温度从65℃骤增至85℃后，在5分钟、15分钟和30分钟时取下一步的样品。整合从DP2至HPLC运行结束的总面积，并使所述面积除以总蛋白质和反应时间。对于高温温育，5分钟的反应提供了酶如何快速开始破坏底物的指示；15分钟的反应提供了酶的热活性的指示，并且30分钟提供了酶的热稳定性的指示。

结果：

[00173]结果显示于图2、图3和图4中。每一色谱中的Y轴表示通过脉冲电流检测(PAD)的分析物定量检测，以纳库仑(nC)表示。X轴表示从柱子上的洗脱时间。

[00174]图2显示了市售酶制剂SPEZYMEETHYL(GenencorInternational)的结果。如从图A-D中可见，如从温育5分钟至15分钟至30分钟的更快洗脱峰的增加所示，在30分钟的时间过程中酶活性持续从浆液中释放出更低的DP片段。30分钟的样品(图D)在DP2片段上较图C(15分钟)显示出16％的增加，所述图C(15分钟)在DP2碎片上较图B(5分钟)显示出33％的增加。图B在DP2碎片上较图A(仅65℃温育)显示出34％的增加。

[00175]图3显示了另一种市售酶制剂SPEZYME

XTRA(GenencorInternational；上文描述)的结果。该酶最初反应更迅速；然而，它的热稳定性看起来较低，因为更低DP片段释放的增长速率持续下降(例如图D相对于图C)。30分钟样品(图D)在释放的DP2片段上较15分钟样品(图C)显示出2％的增加，所述15分钟样品较图B中显示的5分钟样品显示出26％的增加。图B在释放的DP2片段上较在65℃温育了5分钟的样品显示出40％的增加。

[00176]图4显示了AmyS变体I181P的结果。该变体酶活性提供了更低DP片段的更快初始释放，说明该变体具有非常迅速的起始活性。与初始样品(65℃5分钟)相比，在85℃5分钟后(图B)存在45％的增加。15分钟后(图C)，在DP2片段的释放上存在进一步6％的增加。从图C至图D(30分钟)，在DP2片段的释放上存在进一步7％的增加。还不清楚从图B至图C至图D的增加下降是热失活的结果，还是由于其他因素例如底物的实际早期切割(并因此而损失)、或可能是由于例如产物抑制的其他因素所导致的底物切割上的降低的结果。淀粉降解的初始速率对市售产品而言是非常重要的因素，而AmyS I181P变体显示出了高的初始降解率。

[00177]图5显示了图2、图3和图4每幅图的图B中显示的信息的并列比对。该时间点代表了温度从65℃骤增到85℃后的5分钟的温育，并且提供了对酶能力有用评估。

[00178]如图2、图3和图4中，Y轴提供了使用脉冲安培检测的以纳库仑(nC)表示的检测定量结果，且X轴代表以分钟计的洗脱时间。变体具有不同的活性谱并且一般在降解底物释放更低DP产物，例如DP2片段方面优于市售酶。

实施例3：AmyS变体与市售酶制剂的粘度测定法比较

[00179]本实施例显示该AmyS变体与包括市售制剂在内的其他α-淀粉酶相比表现出改变的性能。这些改变的性能一般包括改变的热稳定性、改变的水解率和改变的比活性。在淀粉浆液的水解过程中(例如液化)观察到的其他改变的性能，包括改变的最大粘度和/或改变的终粘度。

[00180]纯化了四个α-淀粉酶变体并表征了总蛋白质和比活性，随后如通过粘度测定法(HAAKE Viscotester 550仪器)监测来检测了它们在浆液中水解/切割玉米淀粉的能力。每日生产一批具有30％玉米粉干固体的底物浆液。使用硫酸调节pH为5.8。称取50g浆液(15g干固体)并在搅拌下预温育10分钟至70℃。除非另行说明，酶均单独加入到各反应中。检测的酶和使用的量如下：

变体：

AmySI181P变体(SEQ ID NO：3)：44μg，

AmySI181A变体(SEQ ID NO：2)：44μg，

AmySG182A变体(SEQ ID NO：16)：27.5μg，

AmySG182S变体(SEQ ID NO：17)：27.5μg，

AmySG182P变体(SEQ ID NO：17)：27.5μg，687.5μg(结果未显示).

市售制剂：

SPEZYME

XTRA(第1批)：27.5μg，

SPEZYMEXTRA(第2批)：27.5μg，

[00181]加入α-淀粉酶后，伴随75转/分钟搅拌，温度从70℃骤增至85℃。达到85℃后保持浆液和酶混合物的温度恒定。在整个温育过程中及随后的30分钟内监测粘度，以μNm指示。

结果：

[00182]结果显示于图6中。Y轴显示了以μNm计的相对粘度，而X轴显示以分钟计的时间。最大粘度在约10分钟处可获得并随使用的酶而有所改变。所有样品的粘度在后期阶段随淀粉胶凝化增加。

[00183]与市售酶SPEZYMEXTRA相比，变体I181P和I181A产生大大降低的最大粘度。I181变体还较市售酶制剂产生了更高的终粘度。使用两批单独的SPEZYME

XTRA，一批是新鲜制备以确保所观察到的差异不是由于例如贮藏过程中诸如活性丧失等任何混杂因素而导致。两批均产生了相似的结果。因此，变体的催化活性导致了较市售酶的催化活性产生的最大粘度更低的最大粘度，而较市售酶的催化活性产生的终粘度更高的终粘度。

[00184]G182变体未能与I181变体或标准α-淀粉酶SPEZYME

XTRA表现地一样好。尽管G182P变体必须以更高剂量来使用，但G182A和G182P变体均用于应用。在检测中，使用687.5μg(约50AAU/g)的剂量(结果未显示)。

[00185]一般地，I181变体在降低最大粘度方面比G182变体或SPEZYME

XTRA表现得更好，然而，SPEZYME

XTRA比任一变体类型产生更低的终粘度。

实施例4：使用AmyS变体的酶混合物

[00186]除了比较本发明α-淀粉酶变体与市售酶制剂外，还制备并检测了两种市售酶，或α-淀粉酶和市售酶的组合物(即混合物)。此类组合的表现优于包括两种市售酶的混合物在内的任何其他酶制剂。

[00187]制备用于取样的淀粉浆液和酶反应物，并如上文实施例3中详细描述的进行。检测以下酶活性或活性组合：

图7A

SPEZYME

FRED，以390μg使用，

SPEZYME

XTRA，以30μg使用，

SPEZYME

FRED和SPEZYME

XTRA的混合物，分别使用195μg和15μg。

图7B

SPEZYME

FRED，以390μg使用，

AmyS I181P变体(SEQ ID NO：3)，以88μg使用，

SPEZYME

FRED和AmyS I181变体的混合物，分别使用195μg和44μg。

结果：

[00188]结果显示于图7A和图7B中。如图7A中显示的，市售酶制剂SPEZYME

XTRA和SPEZYME

FRED(Genencor，International；如上描述)均产生低的终粘度，并且SPEZYME

FRED活性比SPEZYME

XTRA提供更低的终粘度。然而，SPEZYME

FRED的最大粘度明显高于SPEZYMEXTRA的最大粘度。此外，SPEZYME

FRED以高于SPEZYMEXTRA浓度10倍的量使用。有趣的是，包含有SPEZYME

FRED和SPEZYME

XTRA的酶混合物仅以每种单独使用时浓度的一半来使用，并产生了与SPEZYME

FRED提供的最大粘度一样低的最大粘度。此外，该最大粘度降低到SPEZYME

XTRA活性提供的最大粘度。因此，该混合物提供两种酶活性的优点，并且没有任一种酶的缺点；然而，无协同作用并且几乎没有或无累加作用是明显的。SPEZYME

FRED和SPEZYME

XTRA的最大粘度仍比期望的高，并且显著高于某些α-淀粉酶变体所观察到的。

[00189]图7B显示了用I181P变体和SPEZYMEFRED进行相当浆液消化物的粘度数据。使用变体所获得的最大粘度显著低于市售淀粉酶制剂的最大粘度。然而，终粘度显著高于SPEZYME

FRED或SPEZYME

XTRA(未显示，见图7A)的终粘度。此外，含SPEZYME

FRED和AmyS变体I181P的酶混合物提供两种酶的优点，即比SPEZYME

FRED更低的最大粘度和比变体淀粉酶更低的终粘度。此外，SPEZYME

FRED和I181淀粉酶变体的组合混合物提供比任何一种酶单独提供的更低的最大粘度以及与SPEZYME

FRED提供的终粘度一样低的终粘度。因此，该混合物产生了与更低的终浓度组合的更低的最大粘度，并在组合使用时在两种酶之间显示出了协同作用。因此，本发明α-淀粉酶变体特别用于与其他淀粉酶组合。

[00190]对于本领域技术人员显而易见的是，α-淀粉酶变体以及制备和使用这些淀粉酶变体的方法是可以改变或修饰的，而不背离本公开内容的范围或精神。因此，此类改变和修饰包括在所附的权利要求的范围内。尽管本申请已经被分为几部分来帮助读者，但某一部分中的描述是可以用于其他部分中的。因此不应该将标题理解为限制。

Claims (36)

1.基于来自嗜热脂肪芽孢杆菌的亲本α-淀粉酶的变体α-淀粉酶，其中所述变体与亲本α-淀粉酶相比，在181位氨基酸上包含取代，其中变体181位上的氨基酸残基选自Pro、Ala、Leu、Cys、Asp、Tyr和Glu，其中所述亲本α-淀粉酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

2.权利要求1的变体α-淀粉酶，其氨基酸序列选自SEQ ID NO：3，I181P、SEQ ID NO：2，I181A、SEQ ID NO：10，I181L、SEQ ID NO：4，I181C、SEQ ID NO：5，I181D、SEQ ID NO：6，I181E和SEQ ID NO：15，I181Y。

3.权利要求1的变体α-淀粉酶，其相比于野生型α-淀粉酶在65-85℃之间具有增加的比活性。

4.组合物，其包含权利要求1的变体α-淀粉酶。

5.权利要求4的组合物，其还包含至少一种其他的酶。

6.权利要求5的组合物，其中所述至少一种其他的酶具有用于液化复合糖类的活性，所述复合糖类包含直链淀粉和支链淀粉。

7.权利要求6的组合物，其中所述至少一种其他的酶是其他的α-淀粉酶。

8.权利要求5的组合物，所述组合物在液化过程中，相对于在缺乏变体α-淀粉酶时用其他酶液化的相当淀粉浆液的最大粘度，降低淀粉浆液的最大粘度。

9.权利要求6的组合物，其配制用于食品或食品加工。

10.食品级冻干组合物，其包含权利要求1的变体α-淀粉酶。

11.多核苷酸，其编码权利要求1的变体α-淀粉酶。

12.权利要求11的多核苷酸，其中优化密码子使用以用于在微生物或植物中表达所述变体α-淀粉酶。

13.表达载体，其包含权利要求11的多核苷酸。

14.细菌细胞，其包含权利要求13的表达载体。

15.宿主细胞，其包含权利要求11的多核苷酸。

16.权利要求15的宿主细胞，其中所述宿主细胞是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。

17.液化淀粉浆液的方法，其包括：

制备包含淀粉的浆液；

将所述浆液加热至淀粉液化可接受的温度；

向所述浆液中加入权利要求4的组合物；并

将所述浆液与所述组合物在足以液化淀粉浆液的温度下温育一段时间。

18.权利要求17的方法，其中温度从50℃到95℃。

19.权利要求18的方法，其中所述浆液包含15-40％以干重计的淀粉。

20.权利要求17的方法，其中液化是发酵过程的部分。

21.权利要求20的方法，其中所述发酵用于产生食品产品、食品添加剂、燃料或燃料添加剂。

22.权利要求21的方法，其中所述燃料或燃料添加剂是醇。

23.权利要求22的方法，其中所述醇是乙醇。

24.权利要求17的方法，其中与亲本α-淀粉酶液化的相当浆液的最大粘度相比，温育步骤产生降低最大粘度至少25％。

25.处理之前已经与包含淀粉或淀粉衍生物的涂层接触的针织材料的方法，所述方法包括：

使所述针织材料与包含权利要求1的变体α-淀粉酶的溶液在足以从所述针织材料去除涂层的条件下接触一段时间。

26.权利要求25的方法，其中所述针织材料是织物。

27.用于液化淀粉浆液的酶混合物，所述混合物包含：

至少第一种和第二种α-淀粉酶，其中所述第一种α-淀粉酶是权利要求1中定义的变体α-淀粉酶；

所述第一种α-淀粉酶具有催化活性，当其用于液化过程中时，产生比每一种酶单独用于相当液化过程中时所述第二种α-淀粉酶的相应催化活性产生的终粘度低的终粘度，但比其产生的最大粘度高的最大粘度，

其中当用于相当液化过程中时，所述酶混合物提供这样的催化活性，其产生与单独使用所述第一种α-淀粉酶得到的终粘度大致相同的终粘度，和显著低于单独使用所述第二种α-淀粉酶得到的最大粘度的最大粘度；

其中相当液化过程包含温度、pH、钙离子浓度和底物浓度的特定条件。

28.权利要求27的方法，其中所述终粘度与相当液化过程中单独使用所述第一种α-淀粉酶获得的终粘度一样低，并且最大粘度比相当液化过程中单独使用所述第二种α-淀粉酶获得的最大粘度低。

29.权利要求27的方法，其中与每一种酶单独用于相当液化过程时分别加入的第一种和第二种α-淀粉酶的相应量相比，加入的酶混合物的量导致加入更少的第一种和第二种α-淀粉酶中的每一种。

30.权利要求29的方法，其中第一种和第二种α-淀粉酶每一种的量分别为单独使用每一种时加入的相应量的一半。

31.液化淀粉浆液的方法，其包括制备包含淀粉的浆液，将浆液加热至液化可接受的温度，向浆液中加入包含所述第一种和第二种α-淀粉酶的权利要求27的酶混合物，并将浆液与所述酶混合物在足以液化淀粉浆液的温度下温育一段时间。

32.生产乙醇的方法，其包括：

利用以下中的一个和多个来液化淀粉浆液：

(a)基于来自嗜热脂肪芽孢杆菌的亲本α-淀粉酶的变体α-淀粉酶，其中所述变体α-淀粉酶是权利要求1中定义的变体α-淀粉酶，

(b)包含(a)的变体α-淀粉酶的组合物，或

(c)包含(a)的变体α-淀粉酶和第二种淀粉酶的酶混合物，变体α-淀粉酶具有催化活性，当其用于液化过程中时，产生比变体α-淀粉酶和第二种淀粉酶每一种酶单独用于相当液化过程中时所述第二种α-淀粉酶的相应催化活性产生的终粘度低的终粘度，但比其产生的最大粘度高的最大粘度；

发酵浆液中的至少一部分糖以生产乙醇；并

至少部分纯化所得乙醇。

33.权利要求32的方法，其中所述包含(a)的变体α-淀粉酶的组合物是包含(a)的变体α-淀粉酶的食品级冻干组合物。

34.权利要求32或33的方法，其包括向液化的淀粉浆液中加入一种或多种其他酶的任选步骤，以进一步完成发酵步骤中的乙醇生产。

35.促进淀粉浆液液化的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种：

(a)基于来自嗜热脂肪芽孢杆菌的亲本α-淀粉酶的变体α-淀粉酶，其中所述变体α-淀粉酶是权利要求1中定义的变体α-淀粉酶，

(b)包含(a)的变体α-淀粉酶的组合物，或

(c)包含(a)的变体α-淀粉酶和第二种淀粉酶的酶混合物，所述变体α-淀粉酶具有催化活性，当其用于液化过程中时，产生比变体α-淀粉酶和第二种淀粉酶每一种酶单独用于相当液化过程中时所述第二种α-淀粉酶的相应催化活性产生的终粘度低的终粘度，但比其产生的最大粘度高的最大粘度；

和用于液化淀粉浆液的试剂盒中的说明书。

36.权利要求35的试剂盒，其中所述包含(a)的变体α-淀粉酶的组合物是包含(a)的变体α-淀粉酶的食品级冻干组合物。

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