CN101528769A - 多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了可衍生自具有非麦芽糖外切淀粉酶活性的母体多肽的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽包含307位替换为赖氨酸(K)或精氨酸(R)的氨基酸替换，参考SEQ ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列的位置编码。该PS4变异体多肽优选进一步包含70位，优选G70D的氨基酸替换。序列272和303位的氨基酸优选为组氨酸(H)和甘氨酸(G)。

Description

多肽
参考2003年7月7日申请的美国临时申请序列号60/485413、60/485539和60/485616。也参考2004年7月7日申请并指定美国(申请人：Genencor International，Inc)的国际申请PCT/US2004/021723和PCT/US2004/021739。也参考美国发明申请序列号10/886905和10/866903，均于2004年7月7日申请。
也参考美国临时申请序列号60/608919(2004年7月7日以美国发明序列号10/887056申请但是于2004年9月15日转成临时申请)。也参考2004年9月22日申请的美国临时申请序列号60/612407。
此外还参考2003年7月7日申请的美国申请序列号60/485539。也参考2004年7月7日申请并指定美国(申请人：Danisco A/S)的国际申请PCT/IB2004/002487。也参考2004年7月7日申请的美国发明申请序列号10/886023。
也参考美国发明申请序列号10/886505、10/886527和10/886504，均于2004年7月7日申请。也参考2004年9月22日申请的美国发明申请序列号10/947612。
也参考2005年7月7日申请并指定美国(申请人：Danisco A/S和Genencor International，Inc，D Young & Co Attorney Reference：P020161WO)的国际申请序列号PCT/GB2005/002675。也参考2005年7月7日申请的美国临时申请序列号60/697302。
上述申请、现有和上述申请所引用或参考的各文件包括在上述申请的审查中所引用和参考的各文件(“申请和文章所引用的文件”)、上述各申请和文章以及申请和文章所引用的任何文件中引用或提及的任何产品的使用说明或目录均以参考形式并于本文。此外，本文引用的任何文件，本文所引用文件中引用或参考的任何文件以及本文或并入本文的任何文件中引用或提及的任何产品的使用说明或目录均以参考形式并于本文。以参考形式并于本文的文件或其中的任何教导可用于实施本发明。以参考形式并于本文的文件不认为其属于现有技术。
技术领域
本发明涉及多肽，尤其是淀粉酶多肽和它们的编码核酸，以及它们在生产食品中作为非麦芽糖生成外切淀粉酶的应用。本发明的淀粉酶已经被设计具有更多有利的性质。特别地，本发明的淀粉酶显示出改良的外切特异性和/或改良的热稳定性。具体而言，这些多肽衍生自具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性(特别是为葡聚糖1，4，-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)活性)的多肽。
发明背景
改良淀粉酶可以改善在特定工艺例如烘焙中固有的问题。烘焙后数日内，在淀粉颗粒中会发生支链淀粉结晶，这导致面包硬度不断增加并使面包老化。面包老化时会失去面包心柔软度和面包心湿度。最终，面包心弹性降低并且面包形成皮质外壳。
支链淀粉侧链的酶水解作用(例如，用淀粉酶)可以降低结晶并增强抗老化。结晶依赖于支链淀粉侧链的长度：支链越长，结晶越高。大部分淀粉颗粒由两种多聚物的混合物构成：支链淀粉和直链淀粉，其中约75％为支链淀粉。支链淀粉是一种非常巨大的分支分子，由经(1-4)键连接的α-D-吡喃型葡萄糖单位的链组成，其中这些链经α-D-(1-6)连接形成分支。直链淀粉是经(1-4)连接的α-D-吡喃型葡萄糖单位形成的直链，含有少量的α-D-(1-6)分支。
通过将面包生面团于180至250℃范围内的烤箱温度烘焙约15至60分钟完成淀粉面包产品例如白面包(用经筛的黑麦面粉和小麦面粉做的面包)和面包卷的烘焙。烘焙工艺中，在生面团层外部(形成烘焙物外皮的部位)采用陡峭温度梯度(200→120℃)。但是，因为蒸汽的缘故，在烘焙工艺结束时面包心的温度仅为约100℃。在温度高于约85℃时，酶会失活并失去抗老化特性。因此，只有热稳定的淀粉酶可以在烘焙时有效修饰淀粉。
内切淀粉酶活性可负面影响终面包产品的质量，因为分支糊精的累积可产生粘性的或胶状的面包心。优选外切淀粉酶活性，因为它可完成需要的淀粉修饰以延缓老化，与内切淀粉酶活性相关的负面作用较少。降低外切淀粉酶活性可得到更高的外切特异性，其可减少分支糊精并产生更高质量的面包。
发明概要
根据本发明我们提供如权利要求所示的PS4变异体多肽。我们进一步提供这种PS4变异体多肽的用途，包括如权利要求所示作为和用于食品添加剂、食物产品、烘烤产品、改进剂组合物、饲料产品(包括动物饲料)等。我们提供如权利要求所示的编码PS4变异体多肽并与其相关的核酸。权利要求也列出了制备这些PS4变异体多肽的方法以及本发明的其它方面。
附图简述
图1显示了质构分析仪曲线的实例。
图2显示了检测本文描述PS4变异体多肽温度稳定性的实验结果。X轴：温度，Y轴：半衰期(分钟)。菱形：pSac-D34/pMD3(SEDID NO：2)，方形：pSac-pMD229(SED ID NO：13)，三角形：pSac-pMS382(SED ID NO：21)。
图3显示了烘焙试验的结果，其中检测了用不同浓度PS4变异体多肽处理以及未处理面包的硬度。X轴显示天数，Y轴显示硬度，以hPa表示(见实施例13)。菱形：20000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。方形：40000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。三角形：60000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。十字：对照(不含酶)。
图4显示了烘焙试验的结果，其中检测了用不同浓度PS4变异体多肽处理以及未处理面包的弹性。X轴显示天数，Y轴显示弹性，以弹性单位表示(见实施例14)。菱形：20000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。方形：40000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。三角形：60000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。十字：对照(不含酶)。
图5显示了烘焙试验的结果，其中检测了用不同浓度PS4变异体多肽处理以及未处理面包的粘性。X轴显示天数，Y轴显示粘性，以粘性单位表示(见实施例15)。菱形：20000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。方形：40000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。三角形：60000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。十字：对照(不含酶)。
图6显示了烘焙试验的结果，其中检测了用具有307位替换的PS4变异体多肽处理的面包的硬度。X轴显示天数，Y轴显示硬度，以hPa表示(见实施例13)。菱形：对照(不含酶)。方形：60000Betamyl单位/千克的pSac-D34/pMD3(SED ID NO：2)。三角形：60000Betamyl单位/千克的pSac-pMD229(SED ID NO：13)。十字：60000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。
图7显示了烘焙试验的结果，其中检测了用具有307位替换的PS4变异体多肽处理的面包的弹性。X轴显示天数，Y轴显示弹性，以弹性单位表示(见实施例14)。菱形：对照(不含酶)。方形：60000Betamyl单位/千克的pSac-D34/pMD3(SED ID NO：2)。三角形：60000Betamyl单位/千克的pSac-pMD229(SED ID NO：13)。十字：60000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。
图8显示了烘焙试验的结果，其中检测了用具有307位替换的PS4变异体多肽处理的面包的粘性。X轴显示天数，Y轴显示粘性，以粘性单位表示(见实施例15)。菱形：对照(不含酶)。方形：60000Betamyl单位/千克的pSac-D34/pMD3(SED ID NO：2)。三角形：60000Betamyl单位/千克的pSac-pMD229(SED ID NO：13)。十字：60000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382。
图9.用400ppm Novamyl(TM)1500和50BMK/kg pSac-pMS382(SED ID NO：21)烘焙玉米饼后第8天的可折叠性检测。
图10.用400ppm NovamylTM1500和50BMK/kgpSac-pMS382(SED ID NO：21)烘焙玉米饼后第8天的可折叠性检测。
图11.用SSM 471B10(SED ID NO：27)和SSM 471C04(SEDID NO：29)制备的美国吐司面包的硬度检测。
图12.用SSM 471B10(SED ID NO：27)和SSM 471C04(SEDID NO：29)制备的美国吐司面包的弹性检测。
图13.用pMS 370(SED ID NO：31)和SSM 471C04(SED IDNO：29)制备的美国吐司面包的弹性检测。
序列表
SED ID NO：1显示了PS4参比序列，衍生自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)麦芽四糖水解酶(maltotetrahydrolase)氨基酸序列。SED ID NO：2显示了pSac-D34序列；含有淀粉结合结构域11处替换和缺失的嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列。SED ID NO：3显示了pSac-D20序列；含有淀粉结合结构域13处替换和缺失的嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列。SED IDNO：4显示了pSac-D14序列；含有淀粉结合结构域14处替换和缺失的嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列。SED ID NO：5显示了嗜糖假单胞菌葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶前体(EC 3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(麦芽四糖-形成淀粉酶)(外切麦芽四糖水解酶)(麦芽四糖-形成外切淀粉酶)。SWISS-PROT登录号P22963。SED ID NO：6显示了编码麦芽四糖水解酶(EC编号＝3.2.1.60)的嗜糖假单胞菌mta基因。GenBank登录号X16732。SED ID NO：7显示了PS4参比序列，衍生自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)麦芽四糖水解酶氨基酸序列。SED ID NO：8显示了PStu-D34序列；含有9处替换的施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列。SED ID NO：9显示了PStu-D20序列；含有11处替换的施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列。SED ID NO：10显示了PStu-D14序列；含有12处替换的施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列。SED ID NO：11显示了施氏假单胞菌(Pseudomonas perfectomarina)葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶前体(EC 3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(麦芽四糖-形成淀粉酶)(外切麦芽四糖水解酶)(麦芽四糖形成外切淀粉酶)。SWISS-PROT登录号P13507。SED ID NO：12显示了施氏假单胞菌麦芽四糖形成淀粉酶(amyP)基因，完整编码序列。GenBank登录号M24516。
SED ID NO：13显示了具有以下突变的pSac-pMD229氨基酸序列：33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P。SED ID NO：14显示了pSac-pMD229核酸序列。SED ID NO：15显示了具有以下突变的pSac-pMD248氨基酸序列：33Y、34N、121F、134R、141P、145D、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L和334P。SED ID NO：16显示了pSac-pMD248核酸序列。SED ID NO：17显示了具有以下突变的pSac-pMD253氨基酸序列：33Y、34N、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P。SED ID NO：18显示了pSac-pMD253核酸序列。SED ID NO：19显示了具有以下突变的pSac-pMD271氨基酸序列：3S、33Y、34N、70D、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P。SEDID NO：20显示了pSac-pMD271核酸序列。
SED ID NO：21显示了具有以下突变的pSac-pMS382氨基酸序列：33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K、309P和334P。SED ID NO：22显示了pSac-pMS382核苷酸序列。SED ID NO：23显示了具有以下突变的pSac-pMS382R氨基酸序列：33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307R、309P和334P。SED ID NO：24显示了pSac-pMS382R核苷酸序列。SED ID NO：25显示了具有以下突变的pSac-pMS382H氨基酸序列：33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、309P和334P。SED ID NO：26显示了pSac-pMS382H核苷酸序列。
SED ID NO：27显示了具有以下突变的SSM471B10氨基酸序列：33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307R、309P和334P。SED ID NO：28显示了SSM471B10核酸序列。SED ID NO：29显示了具有以下突变的SSM471C04氨基酸序列：33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307K、309P和334P。SED ID NO：30显示了SSM471C04核酸序列。SEDID NO：31显示了具有以下突变的PMS 370氨基酸序列：33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、309P和334P。SED ID NO：32显示了PMS 370核酸序列。
发明详述
在以下说明书和实施例中，除非本文另有说明，PS4变异体多肽的剂量以面粉的百万分率(微克每克)表示。例如，“1D34”表示基于重量/重量的百万分之一的pSac-D34。优选基于以牛血清白蛋白(BSA)为标准品采用Bradford描述的测定法(1976，一种利用蛋白质-染色剂结合原理的定量微克级蛋白的快速灵敏的方法(Arapid andsensitive method for the quantification of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.)Anal.Biochem.72：248-254)测量纯酶蛋白同等物的活性测定法检测酶的数量或分量。
在描述根据本发明生产或预期包含于本发明中的不同PS4变异体多肽变异体时，采用下列命名法以便参考：
(i)当替换包括数字和字母时，例如141P，则是指[根据编号系统的位置/被替换的氨基酸]。
因此，举例而言，在141位将氨基酸替换为脯氨酸可表示为141P；
(ii)当替换包括字母、数字和字母时，例如A141P，则是指[原始氨基酸/根据编号系统的位置/被替换氨基酸]。因此，举例而言，在141位将丙氨酸置换为脯氨酸可表示为A141P。
当一个具体位置可能有两个或多个可能替换时则可用连续的字母表示，任选用斜杠标记间隔“/”，例如G303ED或G303E/D。当一个位置上的相关氨基酸可以被任一氨基酸替换时，则可表示为[根据编号系统的位置/X]，例如121X。
多重突变可表示为以斜杠标记“/”(例如A141P/G223A)或逗号“，”(例如A141P，G223A)间隔，表示分别在141位和223位将丙氨酸替换为脯氨酸和甘氨酸替换为丙氨酸的突变。
除非本文另有说明外，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所述领域普通技术人员通常理解的含义一致。Singleton等，微生物和分子生物学辞典，第二版(DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.)，John Wiley和Sons，NewYork(1994)，以及Hale & Marham，哈珀柯林斯生物学辞典(THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了本发明所用很多术语的通用辞典。虽然与本文所述相似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或检测，但仍描述了优选的方法和材料。数值范围包括定义范围的数字。除非另外说明，分别而言，核酸从左到右以5’至3’方向书写；氨基酸序列从左到右以氨基至羧基方向书写。
除非另外说明，本发明的实施将用到化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均在本领域技术人员的能力范围之内。这些技术阐述于文献中。参见，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1-3部，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1995和定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology，第9、13和16章，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree和A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，JohnWiley & Sons；J.M.Polak和James O’D.McGee，1990，In SituHybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA，Methods in Enzymology，Academic Press；Edward Harlow，David Lane，Ed HarloW，Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable ProtocolNO.I(1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN0-87969-544-7)；Ed Harlow(编辑)，David Lane(编辑)，Antibodies：ALaboratory Manual(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN0-87969-314-2)；Lars-Inge Larsson“Immunocytochemistry：Theory andPractice”，1855，CRC Press inc.；Baca Raton，Florida，1988，ISBN0-8493-6078-1，John D.Pound(编辑)；“Immunochemical Protocols，vol80”，属于系列丛书：““Methods in Molecular Biology”，Humana Press，Totowa，New Jersey，1998，ISBN 0-89603-493-3；Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes编辑，Handbook of Drug Screening，(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)；及Lab Ref：AHandbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use atthe Bench，Jane Roskams和Linda Rodgers编辑，2002，Cold SpringHarbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3。这些通用性文献均以参考形式并于本文。
本文提及的所有专利和出版物(包括这些专利和出版物中公开的所有序列)明确以参考形式并于本文。
PS4变异体多肽
我们提供在一个或多个可产生改良特性的位置具有替换的多肽，改良的性质可为与母体酶相比改良的外切特异性，或改良的热稳定性，或改良的操作特性的任意组合。为方便起见本文中将这些变异体多肽称为“PS4变异体多肽”。
PS4变异体多肽优选表现酶活性。PS4变异体多肽更优选包含淀粉酶活性，优选外切淀粉酶活性。在高度优选的实施方案中，PS4变异体多肽表现出非麦芽糖生成外切淀粉酶活性。
我们进一步提供包含这些改良PS4变异体多肽的组合物，包括食品添加剂、食物产品、烘烤产品、改进剂组合物、饲料产品(包括动物饲料)等，优选具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性者，以及制备和使用这些多肽和组合物的方法。
综上所述，PS4变异体多肽可包含一个或多个改进的操作性质，优选改进的烘焙性质。因此，用PS4变异体多肽处理的食物产品具有硬度更低、弹性更高、粘性更高、脆性更低或可折叠性更高中的一个或多个性质(优选全部性质)。PS4变异体多肽展现出的改进操作或烘焙性质在下文中进一步详细阐述。
我们提供用这些多肽处理食物产品尤其是生面团和面包店产品的方法，以使食物产品呈现上述所需特性。
我们提供这种组合物的其它用途，例如用于去污剂的制备，作为增甜剂、糖浆剂等。这些组合物包括多肽以及至少一种其它组分。具体而言，我们提供包含这些多肽的食物或饲料添加剂。
这些多肽和核酸通过引入许多突变而与它们的母体序列不同。换言之，PS4变异体多肽或核酸的序列与它们的母体序列在许多位置或残基上有所不同。在优选的实施方案中，突变包含氨基酸替换，即将一个氨基酸残基替换为另一个。因此，PS4变异体多肽包含很多在母体序列的一个或多个位置氨基酸残基性质的改变。
如本文所使用，术语“变异体”应用来表示衍生自母体分子的分子。变异体包括多肽以及核酸。变异体包括在一个或多个位置上氨基酸水平的缺失、插入及替换和核酸水平的颠换、转换和倒位。变异体还包括截短。变异体包括母体分子的同源物和功能性衍生物。变异体包括可与本文所述核苷酸序列杂交的序列的互补序列。
307位碱性残基突变体
我们提供具有包含淀粉酶序列中氨基酸替换的序列变化的PS4变异体多肽，优选外切淀粉酶活性，更优选非麦芽糖生成外切淀粉酶序列。
具体而言，我们提供衍生自具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽的PS4变异体多肽，参照SED ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列的位置编号其包含307位的氨基酸突变。307位替换优选替换为碱性或正电荷氨基酸，优选赖氨酸(K)或精氨酸(R)。
在一个实施方案中，我们提供307位氨基酸替换为替换至赖氨酸(307K)的PS4变异体多肽，优选H307K。在另一个实施方案中，我们提供根照权利要求1和2的PS4变异体多肽，其中307位氨基酸替换为替换为精氨酸(307R)的替换，优选H307R。
PS4变异体多肽可进一步包含70位突变为天冬氨酸(D)的突变，优选70D。在优选的实施方案中，该替换为G70D。因此，在一些实施方案中，我们提供相对于SED ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列的位置编号包含G70D、H307K或G70D、H307R替换的PS4变异体多肽。
272位和303位残基可为“野生型”，或者它们可被突变。在优选的实施方案中，272位残基为野生型残基，即组氨酸(H)。优选地，303位残基也可为野生型残基，即甘氨酸(G)。因此我们提供相对于SED ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列的位置编号包含替换G70D和H307K替换并且272位残基为H和303位残基为G，或者G70D和H307R替换并且272位残基为H和303位残基为G的PS4变异体多肽。
这些变异体多肽以及本文描述的其它多肽在本文中称作“PS4变异体多肽”。公开了编码这些变异体多肽的核酸，为方便起见称作“PS4变异体核酸”。在下文中进一步详细阐述PS4变异体多肽和核酸。
“母体”序列，即PS4变异体多肽和核酸所基于的序列，优选为具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的多肽。术语“母体酶”和“母体多肽”可作相应解释，用于指PS4变异体多肽所基于的酶和多肽。它们在下文中进一步详细阐述。
可在任何合适的多肽主链或背景、野生型或突变型上进行突变和氨基酸替换，如下文进一步详细阐述。
在具体的优选实施方案中，所述母体序列为非麦芽糖生成外切淀粉酶，优选细菌非麦芽糖生成外切淀粉酶。在高度优选的实施方案中，母体序列包含葡聚糖1，4，-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)。优选地，母体序列衍生自假单胞菌，例如嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌。
在一些实施方案中，母体多肽包含例如来自假单胞菌属的野生型非麦芽糖生成外切淀粉酶序列，或与之同源。
因此，母体多肽可包含具有SED ID NO：1所示序列的嗜糖假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶。在其它优选的实施方案中，母体多肽包含具有SED ID NO：11所示序列的施氏假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶，或SWISS-PROT登录号为P13507的施氏假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶。
另一方面，母体多肽可为任何野生型序列的变异体，换言之，母体多肽本身可被设计成或包含PS4变异体多肽。
在优选的实施方案中，突变和替换均发生在已经突变的PS4序列上，优选pMD229(SED ID NO：13或14)。
然而，技术人员应理解虽然可通过突变已突变序列获得PS4变异体多肽，但是仍有可能通过从野生型序列(或任何合适序列)开始、鉴别起始序列和所需变异体之间的差异、将所需突变引入起始序列以得到所需变异体来构建这些变异体多肽。
优选具有SED ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列或SED ID NO：11所示施氏假单胞菌外切淀粉酶序列或其功能性同源性的相关蛋白质和核酸在本文中被称作“PS4家族”的成员。适用于生成PS4变异体多肽和核酸的“PS4家族”非麦芽糖生成外切淀粉酶的实例将在下文中进一步详细阐述。
本文中描述的PS4变异体多肽优选保留母体多肽的特性，且另外优选具有附加有益特性，例如，活性或热稳定性，或pH抗性增强，或任意组合(优选全部)。这些将在下文中进一步详细阐述。
本文描述的PS4替换突变体可用于任何适当目的。它们优选用于母体酶适用的目的。具体而言，它们可用于任何使用外麦芽四糖水解酶的应用。在高度优选的实施方案中，它们具有更高热稳定性，或更高外切淀粉酶活性或更高pH稳定性的附加优点，或任意组合。PS4变异体多肽和核酸的适当应用的实施例包括食物生产，尤其是烘焙，以及粮食生产；进一步实施例在下文中详细列出。
PS4变异体多肽可包含除上述位置之外的一个或多个其它突变。除已述突变外，可以有一、二、三、四、五、六、七个或更多突变优选替换。也可包括如下所述在一个或更多其它位置的其它突变，例如氨基酸水平的缺失、插入和替换，核酸水平的颠换、转换和倒位。此外，PS4变异体不必具有所有已列位置的替换。事实上，它们可具有一、二、三、四或五个替换遗漏，即在这些位置上为野生型氨基酸残基。
进一步突变
33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309和/或334位
在优选的实施方案中，PS4变异多肽可在其序列的其它位点或位置包含一个或更多的进一步突变。
例如，PS4变异多肽可进一步包含一个或过个选自下列位置的突变：33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309或334。这些位置的残基可优选包含33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K、309P或334P。
除307K/R/H外PS4变异多肽可因此包含33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309或334位的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或全部15个突变。在这些实施方案中，307位残基可包含组氨酸(H)，特别是这些进一步突变存在时。
除307K/R/H外PS4变异多肽可因此包含33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309或334位的任意1个进一步突变，如“附件A：1个突变”所示，即33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、309P、或334P。
换言之，PS4变异多肽可包含下列任意突变；33Y，307K/R/H；34N，307K/R/H；70D，307K/R/H；121F，307K/R/H；134R，307K/R/H；141P，307K/R/H；146G，307K/R/H；157L，307K/R/H；161A，307K/R/H；178F，307K/R/H；179T，307K/R/H；223E，307K/R/H；229P，307K/R/H；309P，307K/R/H；或334P，307K/R/H。
除307K/R/H外PS4变异多肽可选择性包含33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309或334位的任意2个进一步突变，如“附件A：2个突变”所示，即33Y，34N；33Y，70D；33Y，121F；33Y，134R；33Y，141P；33Y，146G；33Y，157L；33Y，161A；33Y，178F；33Y，179T；33Y，223E；33Y，229P；33Y，309P；33Y，334P；34N，70D；34N，121F；34N，134R；34N，141P；34N，146G；34N，157L；34N，161A；34N，178F；34N，179T；34N，223E；34N，229P；34N，309P；34N，334P；70D，121F；70D，134R；70D，141P；70D，146G；70D，157L；70D，161A；70D，178F；70D，179T；70D，223E；70D，229P；70D，309P；70D，334P；121F，134R；121F，141P；121F，146G；121F，157L；121F，161A；121F，178F；121F，179T；121F，223E；121F，229P；121F，309P；121F，334P；134R，141P；134R，146G；134R，157L；134R，161A；134R，178F；134R，179T；134R，223E；134R，229P；134R，309P；134R，334P；141P，146G；141P，157L；141P，161A；141P，178F；141P，179T；141P，223E；141P，229P；141P，309P；141P，334P；146G，157L；146G，161A；146G，178F；146G，179T；146G，223E；146G，229P；146G，309P；146G，334P；157L，161A；157L，178F；157L，179T；157L，223E；157L，229P；157L，309P；157L，334P；161A，178F；161A，179T；161A，223E；161A，229P；161A，309P；161A，334P；178F，179T；178F，223E；178F，229P；178F，309P；178F，334P；179T，223E；179T，229P；179T，309P；179T，334P；223E，229P；223E，309P；223E，334P；229P，309P；229P，334P；或309P，334P。
换言之，PS4变异多肽可包含下列任意突变；33Y，34N，307K/R/H；33Y，70D，307K/R/H；33Y，121F，307K/R/H；33Y，134R，307K/R/H；33Y，141P，307K/R/H；33Y，146G，307K/R/H；33Y，157L，307K/R/H；33Y，161A，307K/R/H；33Y，178F，307K/R/H；33Y，179T，307K/R/H；33Y，223E，307K/R/H；33Y，229P，307K/R/H；33Y，309P，307K/R/H；33Y，334P，307K/R/H；34N，70D，307K/R/H；34N，121F，307K/R/H；34N，134R，307K/R/H；34N，141P，307K/R/H；34N，146G，307K/R/H；34N，157L，307K/R/H；34N，161A，307K/R/H；34N，178F，307K/R/H；34N，179T，307K/R/H；34N，223E，307K/R/H；34N，229P，307K/R/H；34N，309P，307K/R/H；34N，334P，307K/R/H；70D，121F，307K/R/H；70D，134R，307K/R/H；70D，141P，307K/R/H；70D，146G，307K/R/H；70D，157L，307K/R/H；70D，161A，307K/R/H；70D，178F，307K/R/H；70D，179T，307K/R/H；70D，223E，307K/R/H；70D，229P，307K/R/H；70D，309P，307K/R/H；70D，334P，307K/R/H；121F，134R，307K/R/H；121F，141P，307K/R/H；121F，146G，307K/R/H；121F，157L，307K/R/H；121F，161A，307K/R/H；121F，178F，307K/R/H；121F，179T，307K/R/H；121F，223E，307K/R/H；121F，229P，307K/R/H：121F，309P，307K/R/H；121F，334P，307K/R/H；134R，141P，307K/R/H；134R，146G，307K/R/H；134R，157L，307K/R/H；134R，161A，307K/R/H；134R，178F，307K/R/H；134R，179T，307K/R/H；134R，223E，307K/R/H；134R，229P，307K/R/H；134R，309P，307K/R/H；134R，334P，307K/R/H；141P，146G，307K/R/H；141P，157L，307K/R/H；141P，161A，307K/R/H；141P，178F，307K/R/H；141P，179T，307K/R/H；141P，223E，307K/R/H；141P，229P，307K/R/H；141P，309P，307K/R/H；141P，334P，307K/R/H；146G，157L，307K/R/H；146G，161A，307K/R/H；146G，178F，307K/R/H；146G，179T，307K/R/H；146G，223E，307K/R/H；146G，229P，307K/R/H；146G，309P，307K/R/H；146G，334P，307K/R/H；157L，161A，307K/R/H；157L，178F，307K/R/H；157L，179T，307K/R/H；157L，223E，307K/R/H；157L，229P，307K/R/H；157L，309P，307K/R/H；157L，334P，307K/R/H；161A，178F，307K/R/H；161A，179T，307K/R/H；161A，223E，307K/R/H；161A，229P，307K/R/H；161A，309P，307K/R/H；161A，334P，307K/R/H；178F，179T，307K/R/H；178F，223E，307K/R/H；178F，229P，307K/R/H；178F，309P，307K/R/H；178F，334P，307K/R/H；179T，223E，307K/R/H；179T，229P，307K/R/H；179T，309P，307K/R/H；179T，334P，307K/R/H；223E，229P，307K/R/H；223E，309P，307K/R/H；223E，334P，307K/R/H；229P，309P，307K/R/H；229P，334P，307K/R/H；309P，334P，307K/R/H。
除307K/R/H外PS4变异多肽可选择性包含任意33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309或334位的3个进一步突变，如“附件A：3个突变”所示。
除307K/R/H外PS4变异多肽可选择性包含任意33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309或334位的4个进一步突变，如“附件A：4个突变”所示。
除307K/R/H外PS4变异多肽可选择性包含任意33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309或334位的5个进一步突变，如“附件A：5个突变”所示。
除307K/R/H外PS4变异多肽可选择性包含任意33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309或334位的6个进一步突变，如“附件A：6个突变”所示。
除307K/R/H外PS4变异多肽可选择性包含任意33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309或334位的7个进一步突变，如“附件A：7个突变”所示。
PS4变异多肽可包含具有9个突变的序列，即下列各残基33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K/R/H，309P，334P，但不包括如“附件A：7个突变”所示的七残基组。
PS4变异多肽可包含具有10个突变的序列，即下列各残基33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K/R/H、309P、334P，但不包括如“附件A：6个突变”所示的六残基组。
PS4变异多肽可包含具有11个突变的序列，即下列各残基33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K/R/H、309P、334P，但不包括如“附件A：5个突变”所示的五残基组。
PS4变异多肽可包含具有12个突变的序列，即下列各残基33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K/R/H、309P、334P，但不包括如“附件A：4个突变”所示的四残基组。
PS4变异多肽可包含具有13个突变的序列，即下列各残基33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K/R/H、309P、334P，但不包括如“附件A：3个突变”所示的三残基组。
PS4变异多肽可包含具有14个突变的序列，即下列各残基33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K/R/H、309P、334P，但不包括如“附件A：2个突变”所示的二残基组。
PS4变异多肽可包含具有15个突变的序列，即下列各残基33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K/R/H、309P、334P，但不包括如“附件A：1个突变”所示的单个残基。
优选PS4变异体多肽序列
然而，PS4变异体多肽优选进一步包含所有这些位置的突变。
我们特别提供了衍生自具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽的PS4变异体多肽，其中参照SED ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列的位置编号PS4变异体多肽包含以下所有位置的突变：33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、307、309、334。
在优选的实施方案中，307位的突变包含碱性或正电荷残基。在一些实施方案中，307位的突变包含307K或307R。在另一优选实施方案中，307位的残基为H。我们因此提供衍生自具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽的PS4变异体多肽，其中该PS4变异体多肽包含307位突变为K或R的突变，或者307位残基为H，同时在33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、307、309、334位均有突变。
优选地，33位残基可包含Y，优选33Y，更优选N33Y。优选地，34位残基可包含N，优选34N，更优选D34N。优选地，70位残基可包含D，优选70D，更优选G70D。优选地，121位残基可包含F，优选121F，更优选G121F。优选地，134位残基可包含R，优选134R，更优选G134R。优选地，141位残基可包含P，优选141P，更优选A141P。优选地，146位残基可包含G，优选146G，更优选Y146G。优选地，157位残基可包含L，优选157L，更优选I157L。优选地，161位残基可包含A，优选161A，更优选S161A。优选地，178位残基可包含F，优选178F，更优选L178F。优选地，179位残基可包含T，优选179T，更优选A179T。优选地，223位残基可包含E，优选223E，更优选G223E。优选地，229位残基可包含P，优选229P，更优选S229P。优选地，307位残基可包含K，优选307K，更优选H307K。优选地，309位残基可包含P，优选309P，更优选A309P。优选地，334位残基可包含P，优选334P，更优选S334P。
如上所述，在优选的实施方案中70位突变为70D，优选G70D。我们因此提供衍生自具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽的PS4变异体多肽，其中该PS4变异体多肽包含307位突变为K或R的突变，或者307位残基为H，以及70位突变为70D的突变，同时在33、34、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、307、309、334位均有突变。
在优选实施方案中，272位残基为“野生型”，即非突变的。272位残基因此优选组氨酸(H)。我们因此提供衍生自具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽的PS4变异体多肽，其中该PS4变异体多肽包含307位突变为K或R的突变，或者307位残基为H，以及70位突变为70D的突变其中，272位残基为H，同时在33、34、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、307、309、334位均有突变。
类似地，303位残基为“野生型”或非突变的，且在其它优选实施方案中优选甘氨酸(G)。我们因此提供衍生自具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽的PS4变异体多肽，其中该PS4变异体多肽包含307位突变为K或R的突变，或者307位残基为H，以及70位突变为70D的突变，其中303位残基为G，同时在33、34、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、307、309、334位均有突变。
在优选实施方案中，在包含33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309、334位进一步突变的PS4变异体多肽的上述各实施方案中，33位残基优选Y、34位残基优选N、70位残基优选D、121位残基优选F、134位残基优选R、141位残基优选P、146位残基优选G、157位残基优选L、161位残基优选A、178位残基优选F、179位残基优选T、223位残基优选E、229位残基优选P、309位残基优选P、且334位残基优选P。
在高度优选的实施方案中，我们提供包含以下残基33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K/R/H、309P、334P的PS4变异体多肽。PS4变异体多肽可包含以下各突变N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K/R、A309P和S334P。
我们特别提供包含以下替换的PS4变异体多肽33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K、309P、334P、优选N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P、S334P，参照SED ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列。在这样的实施方案中，PS4变异体多肽可包含SED IDNO：21的序列。
我们进一步提供包含以下替换的PS4变异体多肽33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307R、309P、334P、优选N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307R、A309P、S334P，参照SED ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列。在这样的实施方案中，PS4变异体多肽可包含SED IDNO：23的序列。
我们进一步提供衍生自具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽的PS4变异体多肽，其中PS4变异体多肽包含以下替换33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、309P、334P、优选N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、A309P、S334P，参照SED ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列。在这样的实施方案中，PS4变异体多肽可包含SED ID NO：25的序列。
进一步替换
如下表所示的一个或多个其它突变可进一步出现在本文描述的PS4变异体多肽中。
  位置   突变   替换
  3   3S   A3S
  26   26E、26D   N26E、N26D
  34   34N、34G、34A、34S或34T   D34N、D34G、D34A、D34S或D34T
  46   46G   I46G
  87   87S   G87S
121   121F、121Y、121W、121H、121A、121M、121S、121T、121D、121E、121L、121K、121V G121F、G121Y、G121W、G121H、G121A、G121M、G121G、G121S、G121T、G121D、G121E、G121L、G121K、G121V
  145   145D   N145D
  146   146M、146G   Y146M、Y146G
157   157L、157M、157V、157N、157L I157L、I157M、I157V、I157N、I157L
  158   158T、158A、158S   G158T、G158A、G158S
  160   160D   E160D
  179   179T、179V   A179T、A179V
  188   188、188S、188T或188H   G188、G188S、G188T、G188H
  198   198W、198F   Y198W、Y198F
  179   179T   A179T
223   223A、223E、223K、223L、223I、223S、223T、223V、223R、223P、223D   G223A、G223E、G223K、G223L、G223I、G223S、G223T、G223V、G223R、G223P、G223D
  272   272Q   H272Q
  303   303E、303D   G303E、G303D
  306   306T、306G、306T、306G   H306T、H306G、H306T、H306G
  316   316S、316P、316K、316Q   R316S、R316P、R316K、R316Q
  339   339A、339E   W339A、W339E
  353   353T   R353T
PS4变异体核酸
我们还描述了具有对应于或编码PS4变异体多肽序列中的改变的PS4变异体核酸，用于产生用于本文所述目的的多肽。因此，我们提供可编码本文所示任何多肽序列的核酸。
专业人员应意识到核酸序列和多肽序列，尤其是遗传密码及这一密码简并性之间的关系，也可毫无困难地构建该PS4核酸。例如，他应意识到对于PS4变异体多肽序列中的各氨基酸替换，可有一个或更多密码子编码该替换氨基酸。因此，很明显的是，基于对特定氨基酸残基遗传密码的简并性，可生成一个或多个对应于该PS4变异体多肽序列的PS4核酸序列。此外，当PS4变异体多肽含有一个以上的替换时，例如H307K/G70D，相应PS4核酸可包含分别编码两个氨基酸改变的密码子的配对组合。
PS4变异体核酸序列可衍生自编码上述任意母体多肽的母体核酸。具体地，母体核酸可包含野生型序列，例如，SED ID NO：6或SED ID NO：12。PS4变异体核酸可因此包含编码野生型非麦芽糖生成外切淀粉酶的核酸，但是在相关位置编码其它氨基酸而不是野生型氨基酸残基。PS4变异体核酸序列还可包含具有一个或多个突变的野生型序列，例如，编码上述“组合”中的母体多肽。
应理解的是，与具体PS4变异体核酸序列不相同但是与之相关的核酸序列也可用于本文描述的方法和组合物，例如PS4变异体核酸序列的变异体、同源物、衍生物或片段，或互补序列或可与之杂交的序列。除非本文另有说明，术语“PS4变异体核酸”应包括所有上述已列内容。
可通过本领域任何已知的大量技术实现氨基酸序列和核酸序列中的突变。可用任何已知诱变技术轻易得到变异体序列，例如，使用适当寡核苷酸引物使用PCR的定向诱变、5’加成诱变、错配引物诱变等。或者，或此外，可从头生成PS4变异体核酸序列。
在尤其优选的实施方案中，通过使用适当引物经过PCR(聚合酶链式反应)将突变引入母体序列，如实施例中所示。因此有可能通过向母体多肽引入任何所需氨基酸替换(优选具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性)改变多肽序列，如本文所述例如在氨基酸或核酸水平引入嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌外切淀粉酶序列。我们描述了通过改变编码非麦芽糖生成外切淀粉酶的核酸序列改变非麦芽糖生成外切淀粉酶序列的方法。
然而，人们当然会理解PS4变异体多肽事实上并不需要通过逐步突变衍生自野生型多肽或核酸序列。而是一旦确定了PS4变异体多肽的序列，技术人员可轻易通过本领域已知方法(例如使用适当的寡核苷酸引物和PCR)从野生型获得包含所有突变的序列。事实上，可以通过例如多肽合成方法学从头合成具有所有突变的PS4变异体多肽。
但是一般而言，PS4变异体多肽和/或核酸衍生自或可衍生自“前体”序列。本文使用的术语“前体”意指根照本文描述的方法和组合物修饰的酶之前的酶。因此前体包括用于产生经修饰酶的酶。因此，前体可以是经本文其它部分描述的诱变修饰的酶。同样地，前体可以是野生型酶、变异体野生型酶或已突变的酶。
可通过本领域已知的任何方法生产PS4变异体多肽和核酸。具体而言，它们可以由天然体外或体内表达系统表达。具体而言，我们描述包含PS4核酸序列优选可表达PS4变异体多肽的质粒和表达载体。也公开了包含并优选用这些PS4核酸、质粒和载体转化的细胞和宿主细胞，而且需明确的是这些也涵盖于本文中。
例如可通过如实施例4A所述使用适当寡核苷酸引物的PCR定向诱变、5’加成诱变、错配引物诱变等制备PS4变异体多肽。例如为了生产具有307位突变的PS4变异体多肽，可制备对应于pSac-pMD229序列的核酸序列；可获得具有淀粉结合结构域(SED IDNO：14)的17个替换和缺失的嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶核苷酸序列并引入相关改变。然而，技术人员应意识到可使用任何合适的起始序列，且事实上有可用单个步骤或通过其它中间体序列从野生型外切淀粉酶序列起始获得所需变异体多肽。
在优选的实施方案中，PS4变异体多肽序列以分离形式用作食物添加剂。术语“分离”意指该序列至少基本上不含至少另外一种在天然状态下与其结合或在天然状态下存在的组分。一方面，优选纯化形式的序列。术语“纯化”意指序列处于相对纯的状态，例如，至少90％纯，或至少95％纯或至少98％纯。
在高度优选实施方案中，核酸序列包含SED ID NO：22、24或26所示序列。
位置编号
本文中以编号提及的所有位置是指如下所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶参比序列(SED ID NO：1)的编号。
  1   DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APNDWYNILR QQASTIAADG FSAIWMPVPW
 61   RDFSSWTDGG KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR
121   GYPDKEINLP AGQGFWRNDC ADPGNYPNDC DDGDRFIGGE SDLNTGHPQI YGMFRDELAN
181    LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKGPSEYPSW DWRNTASWQQ
241    IIKDWSDRAK CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG
301    QNGGQHHWAL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWSHMYDWG YGDFIRQLIQ VRRTAGVRAD
361    SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG SFSEAVNASN GQVRVWRSGS
421    GDGGGNDGGE GGLVNVNFRC DNGVTQMGDS VYAVGNVSQL GNWSPASAVR LTDTSSYPTW
481    KGSIALPDGQ NVEWKCLIRN EADATLVRQW QSGGNNQVQA AAGASTSGSF
参比序列衍生自SWISS-PROT登录号为P22963的嗜糖假单胞菌序列，但不含信号序列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA.。
C端淀粉结合结构域EGGLVNVNFR CDNGVTQMGD SVYAVGNVSQLGNWSPASAV RLTDTSSYPT WKGSIALPDG QNVEWKCLIR NEADATLVRQ WQSGGNNQVQAAAGASTSGS F可任选缺失或忽略。或者，它可包含于PS4变异体多肽序列中。
在本说明书内容中，采用了特殊的PS4外切淀粉酶氨基酸残基位置编号。在此方面，通过比对多种已知外切淀粉酶的氨基酸序列，可以确切地将外切淀粉酶氨基酸位置编号分配给任何外切淀粉酶中的任何氨基酸残基位置，该氨基酸序列为已知。使用源自例如从嗜糖假单胞菌获得的外切淀粉酶氨基酸序列的编号系统，与很多其它已知外切淀粉酶的氨基酸序列比对，可确切地指明外切淀粉酶氨基酸残基的位置。
因此，尽管使用具体序列作为基础参点，编号系统也可用于所有相关的同源序列。例如，位置编号可用于来自其它假单胞菌的同源序列，或来自其它细菌的同源序列。优选地，这些同源物与上述参比序列SED ID NO：1或SWISS-PROT登录号P22963或P13507的序列，优选与所有这些序列具有60％或更多同源性，例如70％或更多，80％或更多，90％或更多，或95％或更多同源性。可使用本文所述已知的比对程序和杂交技术确定蛋白质之间的序列同源性。这些同源性序列以及下述功能等价物在本文中称作“PS4家族”。
此外，如上所述，本文中所用编号系统参照参比序列SED IDNO：1，它衍生自嗜糖假单胞菌序列，SWISS-PROT登录号P22963，但不含信号序列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA。该信号序列位于参比序列的N端，由21个氨基酸残基构成。因此，可轻易鉴定包含信号序列的相应序列中需突变或替换的具体残基，或包含任何其它N-或C-端延伸或缺失的相应序列。对于N-端添加或缺失，需要的是将位置编号偏移已插入或却缺失的残基数量。例如，SED ID NO：1的1位对应于于含信号序列序列的22位。
母体酶/多肽
PS4变异体多肽衍生自另一个称作“母体酶”、“母体多肽”或“母体序列”的序列，或为其变异体。
本文所用术语“母体酶”意指与所得变异体即PS4变异体多肽或核酸具有相近(优选最接近)的化学结构的酶。母体酶可为前体酶(即事实上已突变的酶)或可能从头制备。母体酶可以是野生型酶，或包含一个或多个突变的野生型酶。
本文所用术语“前体”意指被修饰后产生此酶的酶之前的酶。因此，前体可为经诱变修饰的酶。相似地，前体可为野生型酶，变异体野生型酶或已突变的酶。
术语“野生型”是本领域技术人员可理解的术语，意指天然存在种的大部分成员特有的表现型，并与突变体表现型相对。因此，在本文中，野生型酶是在相关种的大部分成员中天然存在的酶形式。通常，与本文所述变异体多肽相关的相关野生型酶是就序列同源性而言亲缘关系最近的对应野生型酶。然而，当使用具体野生型序列为基础产生本文所述变异体PS4多肽时，它就是相应的野生型序列而不论是否存在就氨基酸序列同源性而言亲缘更近的其它野生型序列。
母体酶或多肽可以是任何合适的起始多肽。优选具有酶活性。该酶活性优选为淀粉酶活性。更优选地，母体多肽包含外切淀粉酶活性。
母体酶优选为优选呈现非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的多肽。优选地，母体酶本身是非麦芽糖生成外切淀粉酶。例如，母体酶可以是嗜糖假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶，例如具有SWISS-PROT登录号P22963的多肽，或施氏假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶，例如具有SWISS-PROT登录号P13507的多肽。
PS4家族的其它成员可用作母体酶；这些“PS4家族成员”通常与这两种酶之一相似、同源或功能等价，而且可以用标准方法鉴别，例如使用探针杂交筛选的适当文库，或通过基因组序列分析。
具体而言，这两种酶之一的功能等价物以及“PS4家族”的其它成员可以用作生成本文所述PS4变异体多肽的起始物或母体多肽。
蛋白质的“功能等价物”意指与该蛋白共有一个或多个(优选全部)功能的物质。优选地，这些功能为生物学功能，优选酶功能，例如淀粉酶活性，优选非麦芽糖生成外切淀粉酶活性。这些功能可包括蛋白质的任何性质，包括外切特异性、热稳定性以及提高的可操作性例如硬度、弹性、粘性、破碎性和可折叠性(如下所述)。
与母体酶相关，术语“功能等价物”优选意指具有与母体分子相似或相同功能的分子。母体分子可以是嗜糖假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶或施氏假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶或其它来源获得的多肽。
与母体酶为嗜糖假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶(例如具有SWISS-PROT登录号P22963的多肽)或施氏假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶(例如具有SWISS-PROT登录号P13507的多肽)相关的术语“功能等价物”意指可从其它来源获得该功能等价物。该功能等价物酶可具有不同的氨基酸序列但具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性。本文描述了检测功能性测定法的实施例，为本领域技术人员所熟知。
在高度优选的实施方案中，功能等价物与上述嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶之一(优选二者)具有序列同源性。功能等价物还可与如SED ID NO：1至14所示任意序列(优选SED ID NO：1或SED ID NO：7或这二者)具有序列同源性。这些序列之间的序列同源性优选至少60％，优选65％或更多，优选75％或更多，优选80％或更多，优选85％或更多，优选90％或更多，优选95％或更多。可用本领域已知的任意大量计算机程序产生这些序列同源性，例如BLAST或FASTA等。可进行这一比对的适当的电脑程序为GCG Wisconsin Bestfit软件包(University of Wisconsin，U.S.A；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12：387)。可以进行序列比对的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(见Ausubel等，1999ibid-Chapter 18)、FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)以及比对工具的GENEWORKS组件。BLAST和FASTA均可以离线或在线搜索(见Ausubel等，1999ibid，第7-58页至7-60页)。然而优选使用GCG Bestfit程序。
在其它实施方案中，功能等价物可与任意上述序列特异性杂交。检测一个序列是否可与另一序列杂交的方法为领域已知，例如描述于Sambrook，等(supra)和Ausubel，F.M.等(上文)。在高度优选的实施方案中，功能等价物可在严格条件下杂交，例如65℃和0.1×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)。
例如，与嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶具有序列同源性的功能等价物可用作母体酶。这些序列可与嗜糖假单胞菌序列在任意一个或多个位置不同。此外，来自其它假单胞菌，例如ATCC17686的非麦芽糖生成外切淀粉酶，也可用作母体多肽。可将PS4变异体多肽残基插入任意这些母体序列以生成变异体PS4多肽序列。
应理解的是，当需要PS4变异体多肽额外包含一个或过个突变时(如上所述)，应在假单胞菌属非麦芽糖生成外切淀粉酶以及“PS4家族”其它成员的功能等价物的核酸序列中产生相应突变，这样它们可用作生成本文所述PS4变异体多肽的起始物或母体多肽。
术语“PS4变异体多肽”中具体包括US 60/485413、60/485539和60/485616；PCT/US2004/021723和PCT/US2004/021739；US10/886905和10/866903；US 60/608919；US 60/612407；US 60/485,539；PCT/IB2004/002487；US 10/886023；US 10/886505US 10/886527和US10/886504；US 10/947612中公开的多肽。然而这些文件并不属于现有技术。
母体序列修饰
可在氨基酸水平或核酸水平修饰母体酶生成本文所述PS4变异体序列。因此，我们提供通过向编码非麦芽糖生成外切淀粉酶多肽的核苷酸序列引入一个或多个相应密码子改变产生PS4变异体多肽。
核酸编号应优选参照SED ID NO：6所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶核苷酸序列的位置编号。或者，或此外，可参照GenBank登录号为X16732的序列。在优选实的施方案中，核酸编号可参照SED IDNO：6所示核苷酸序列。但是，与氨基酸残基编号类似，该序列的残基编号仅用于参照目的。尤其应理解可在任意PS4家族核酸序列中产生上述密码子改变。例如，可对嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶核酸序列(例如，X16732，SED ID NO：6或M24516，SED ID NO：12)进行序列改变。
母体酶可包含“完整”酶，即以其天然形式(或已突变)的全长，或者可包含其截短形式。由此获得的PS4变异体可相应为截短的，或者为“全长”。截短可在N末端或C末端，优选C末端。母体酶或PS4变异体可缺少一个或多个部分，例如亚序列、信号序列、结构域或部分、不论有活性与否等。例如，如上所述母体酶或PS4变异体多肽可缺少信号序列。或者，或此外，母体酶或PS4变异体可缺少一个或多个催化或结合结构域。
在高度优选的实施方案中，母体酶或PS4变异体可缺少非麦芽糖生成外切淀粉酶的一个或多个结构域，例如淀粉结合结构域。例如参照SED ID NO：1所示嗜糖假单胞菌非麦芽糖生成外切淀粉酶的编号PS4多肽可仅含有到429位的序列。需要注意的是这是对PS4变异体pSac-pMS382、pSac-pMS382R和pSac-pMS382H而言的情况。
在其它实施方案中，母体酶或PS4变异体可包含“完整”酶，即以其天然形式(或已突变)的全长，同时在N端或C端有一个或多个附加氨基酸序列。例如，母体酶或PS4变异体多肽可在C端或N端包含单个附加氨基酸残基，例如，M、A、G等。附加氨基酸残基优选出现在N端。当包括一个或多个附加氨基酸残基时，将位置编号便宜添加的长度。
淀粉酶
PS4变异体多肽通常包含淀粉酶活性。
术语“淀粉酶”以其普通含义使用-例如，尤其能催化淀粉降解的酶。具体而言，它们是可剪切淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。
淀粉酶是淀粉降解酶，属于水解酶，可剪切淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷键。通常，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1，α-D-(1→4)葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式剪切淀粉分子内α-D-(1→4)O-糖苷键的内作用酶。相反地，外作用淀粉酶，例如β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2，α-D-(1→4)葡聚糖麦芽糖水解酶)，以及一些产物特异性淀粉酶如麦芽糖生成α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)从底物的非还原末端剪切淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.20，α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶)、葡萄糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3，α-D-(1→4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)以及产物特异性淀粉酶可从淀粉产生有特定长度的麦芽寡聚糖。
非麦芽糖生成外切淀粉酶
本文所述PS4变异体多肽衍生自优选显示非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的多肽(或为其变异体)。优选地，这些母体酶本身是非麦芽糖生成外切淀粉酶。在高度优选的实施方案中，PS4变异体多肽本身也显示出非麦芽糖生成外切淀粉酶活性。
在高度优选的实施方案中，本文所用术语“非麦芽糖生成外切淀粉酶”意指根据如本文所述的产物检测方法分析该酶不会将淀粉起始降解为大量的麦芽糖。
在高度优选的实施方案中，非麦芽糖生成外切淀粉酶包含外切麦芽四糖水解酶。外切麦芽四糖水解酶(E.C.3.2.1.60)更加正式的名称为葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶。该酶水解淀粉状多糖的1，4-α-D糖苷键以去除从非还原链端开始的连续麦芽四糖残基。
美国专利第6667065号详细描述了非麦芽糖生成外切淀粉酶，以参考形式并于本文。
非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的测定
以下系统用于表征具有根据本文所述方法和组合物适合使用的非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的多肽。该系统可用于例如表征本文所述PS4母体或变异体多肽。
根据原始背景信息，糯玉米支链淀粉(从法国Roquette以WAXILYS 200获得)为具有很高支链淀粉含量(高于90％)的淀粉。在含有50mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、2mM氯化钙，pH 6.0的缓冲液中将20mg/ml糯玉米淀粉煮沸3分钟，接着于50℃温育并在半小时内使用。
一个单位的非麦芽糖生成外切淀粉酶定义为当于50℃在试管中与4ml在如上所述制备的50mMMES、2mM氯化钙，pH 6.0中的10mg/ml糯玉米淀粉温育时可每分钟释放相当于1μmol还原糖的水解产物的酶量。使用麦芽糖作为标准品使用Bernfeld，Methods Enzymol.，(1954)，1，149-158的二硝基水杨酸法或本领域已知的其它定量还原糖的方法测量还原糖。
通过将0.7单位非麦芽糖生成外切淀粉酶于50℃在试管中与4ml在如上所述制备的缓冲液中的10mg/ml糯玉米淀粉温育15或300分钟测定非-麦芽糖生成外切淀粉酶的水解产物类型。通过将试管在沸水浴中浸没3分钟终止反应。
用阴离子交换HPLC，使用Dionex PA 100柱并以乙酸钠、氢氧化钠和水作为洗脱剂，使用脉冲安培检测器并将已知的从葡萄糖至麦芽糖庚糖的线性麦芽糖寡聚糖作为标准品分析和定量水解产物。用于麦芽糖辛糖至麦芽糖癸糖的响应因子为麦芽糖庚糖的响应因子。
S4变异体多肽优选具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性，这样如果将0.7单位的所述非麦芽糖生成外切淀粉酶于50℃，pH 6.0与4ml10mg预煮沸糯玉米淀粉/毫升缓冲液(含有50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸和2mM氯化钙)的溶液温育15分钟后该酶可产生由一个或多个线性麦芽糖-寡聚糖(二至十个D-吡喃型葡萄糖单位)和任选的葡萄糖组成的水解产物；这样所述水解产物重量的至少60％，优选至少70％，更优选至少80％并最优选至少85％由从三至十个D-吡喃型葡萄糖单位优选由四至八个D-吡喃型葡萄糖单位组成的线性麦芽糖寡聚糖组成。
为便于参考及为了本发明目的，可将0.7单位非麦芽糖生成外切淀粉酶于50℃，pH 6.0与4ml 10mg预煮沸糯玉米淀粉/毫升缓冲液(含有50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸和2mM氯化钙)的溶液温育15分钟的特性称作“糯玉米淀粉温育检测”。
因此，换而言之，优选的PS4变异体多肽(非麦芽糖生成外切淀粉酶)的特性为在糯玉米淀粉温育检测中可产生由一个或多个线性麦芽糖-寡聚糖(二至十个D-吡喃型葡萄糖单位)和任选的葡萄糖组成的水解产物；这样所述水解产物重量的至少60％，优选至少70％，更优选至少80％并最优选至少85％由三至十个D-吡喃型葡萄糖单位的线性麦芽糖寡聚糖，优选由四至八个D-吡喃型葡萄糖单位组成的线性麦芽糖寡聚糖组成。
糯玉米淀粉温育检测的水解产物可包括一个或多个二至十个D-吡喃型葡萄糖单位的线性麦芽糖寡聚糖和任选的葡萄糖。玉米淀粉温育检测的水解产物也可包括其它水解产物。而且，含有三至十个D-吡喃型葡萄糖单位的线性麦芽糖寡聚糖的重量百分比基于由一个或多个含有二至十个D-吡喃型葡萄糖单位的线性麦芽糖寡聚糖和任选的葡萄糖组成的水解产物的量。换而言之，含有三至十个D-吡喃型葡萄糖单位的线性麦芽糖寡聚糖的重量百分比不是基于除了一个或多个含有二至十个D-吡喃型葡萄糖单位和葡萄糖的线性麦芽糖寡聚糖之外的水解产物的量。
可通过任何适当方法分析这些水解产物。例如，可通过阴离子交换HPLC，使用Dionex PA 100柱，使用脉冲安培检测器并将例如已知的从葡萄糖至麦芽糖庚糖的线性麦芽糖寡聚糖作为标准品分析这些水解产物。
为便于参考及为了本发明目的，使用阴离子交换HPLC，使用Dionex PA 100柱，使用脉冲安培检测器并将已知的从葡萄糖至麦芽糖庚糖的线性麦芽糖寡聚糖作为标准品分析这些水解产物的特性可称作“阴离子交换分析”。当然，正如刚才所指明，也可使用其它分析技术以及其它具体的阴离子交换技术。
因此，换而言之，优选的PS4变异体多肽为含有非麦芽糖生成外切淀粉酶者，这样它在糯玉米淀粉温育检测中具有可产生由一个或多个含有二至十个D-吡喃型葡萄糖单位的线性麦芽糖寡聚糖和任选的葡萄糖组成的水解产物的能力；这样所述水解产物重量的至少60％，优选至少70％，更优选至少80％并最优选至少85％由含有三至十个D-吡喃型葡萄糖单位的线性麦芽糖寡聚糖，优选由四至八个D-吡喃型葡萄糖单位组成的线性麦芽糖寡聚糖组成。
如本文所使用，术语“线性麦芽糖寡聚糖”以其通常意义使用，指由α-(1→4)键连接的2-10个D-吡喃型葡萄糖单位。
在非常优选的实施方案中，本文所述PS4多肽与母体多肽相比在相同检测条件下优选具有改善的外切淀粉酶活性，优选非麦芽糖生成外切淀粉酶活性。具体而言，在高度优选的实施方案中，与它们的母体相比，优选在糯玉米淀粉检测中测定时该PS4变异体多肽具有10％或更多，优选20％或更多，优选50％或更多的外切淀粉酶活性。
可通过任何适当方法分析这些水解产物。例如，可通过阴离子交换HPLC，使用Dionex PA 100柱，使用脉冲安培检测器并将例如已知的从葡萄糖至麦芽糖庚糖的线性麦芽糖寡聚糖作为标准品分析这些水解产物。
如本文所使用，术语“线性麦芽糖寡聚糖”以其通常意义使用，指由α-(1→4)键连接的2-20个D-吡喃型葡萄糖单位。
改良的操作性质
当与它们的母体酶相比时本文所述PS4变异体优选具有改良的性质，例如一种或多种改良的热稳定性、改良的pH稳定性或改良的外-特异性。本文所述PS4变异体也优选具有改良的操作性质，这样与用母体多肽或野生型多肽处理的食品相比用PS4变异体多肽处理的食品具有以下性质之一或全部：硬度更低、弹性更高、粘性更高、破碎性更低或可折叠性更高。
不希望被任何具体的理论束缚，我们认为具体位点的突变对包含该突变多肽的性质具有单独和累积作用。
热稳定性和pH稳定性
PS4变异体多肽优选热稳定的，优选比母体酶具有更高的热稳定性。
在小麦和其它谷类中支链淀粉的外部侧链在DP 12-19的范围内。因此用如本文所述具有非-麦芽糖生成外切淀粉酶活性的PS4变异体多肽酶水解支链淀粉侧链可显著降低它们的结晶趋势。
用于烘焙目的的小麦和其它谷类中的淀粉以淀粉颗粒的形式存在，其通常可抗拒淀粉酶的降解。因此淀粉改良主要限于被破坏的淀粉并且在生面团加工和起始烘焙中进展非常缓慢直至在约60℃凝胶化作用开始。因此只有高度热稳定性的淀粉酶才可以在烘焙中有效修饰淀粉。通常随着热稳定性的增加淀粉酶的效率增加。这是由于酶的热稳定性越强其在烘焙中可以保持更长时间的活性并因此提供更多的抗老化作用。
因此，当在淀粉被加工成食物产品的任何阶段(例如烘焙成面包之前，之中或之后)将其加入淀粉中时，本文所述PS4变异体多肽的使用可延缓或阻碍或减慢凝沉。这一使用在下文中进一步详细描述。
如本文所使用，术语“热稳定性”与酶在暴露于升高的温度之后保持活性的能力相关。优选PS4变异体多肽可在约55℃至约80℃或更高的温度降解淀粉。适当的情况下，该酶可在暴露于高至约95℃的温度后仍保持其活性。
通过其半衰期测量酶(例如非麦芽糖生成外切淀粉酶)的热稳定性。因此，本文描述的PS4变异体多肽具有比母体酶的半衰期优选在从55℃至约95℃或更高，优选在约80℃的升高的温度下延长了优选10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多。
如本文所使用，半衰期(t1/2)为在确定的加热条件下酶活性的一半失活的时间(以分钟计)。在优选的实施方案中，在80℃测定半衰期。优选将样品于80℃或更高温度加热1-10分钟。然后通过本文描述的任何方法通过测量残余淀粉酶活性计算半衰期值。优选按照实施例中更详细的描述进行半衰期测定。
本文所述PS4变异体优选在烘焙中具有活性并在淀粉颗粒凝胶化(在约55℃时开始)过程中或之后水解淀粉。非麦芽糖生成外切淀粉酶的热稳定性越高，其保持活性的时间越长，因此可提供更多的抗老化作用。但是，在高于约85℃烘焙时酶会失活。如果这一情况发生，非麦芽糖生成外切淀粉酶可逐渐失活以致于在烘焙过程之后最终的面包中几乎没有活性。因此该非麦芽糖生成外切淀粉酶适用于所述用途的最佳温度高于50℃并低于98℃。
可通过使用蛋白质工程提高本文所述PS4变异体的热稳定性使其热稳定性更强并更好地适用于本文所述用途；因此我们涵盖经蛋白质工程修饰变得热稳定性更强的PS4变异体的使用。
该PS4变异体多肽优选为pH稳定的；更优选其比同源母体多肽具有更高的pH稳定性。如本文所使用，术语“pH稳定”指在一定的pH宽度范围内该酶保持活性的能力。优选该PS4变异体多肽可在约5至约10.5的pH范围内降解淀粉。在一个实施方案中，可通过测量酶在具体pH条件下的半衰期测定pH稳定性的程度。在另一个实施方案中，可通过测量具体pH条件下酶的活性或比活测定pH稳定性的程度。具体pH条件可为从pH5至pH10.5之间的任何pH。
因此，该PS4多肽与母体多肽相比在相同条件下可具有更长的半衰期或更高的活性(取决于测定法)。该PS4变异体多肽与它们的母体多肽相比在相同pH条件下具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更长的半衰期。或者，或此外，它们比母体多肽在相同pH条件下具有更高的活性。
外切-特异性
已知一些非麦芽糖生成外切淀粉酶具有一些程度的内切淀粉酶活性。在一些情况下，由于内切淀粉酶活性可能会由于支链糊精的积累产生粘性或胶状的面包心从而负面影响最终面包产品的质量，所以需要降低或消除这一类型的活性。
可通过测定总淀粉酶活性与总内切淀粉酶活性的比值测量外切特异性。在本文件中该比值被称作“外切特异性指数”。在优选的实施方案中，如果一种酶的外切特异性指数为20或更大则其被认为是外切淀粉酶，即其总淀粉酶活性(包括外切淀粉酶活性)是其内切淀粉酶活性的20或更多倍。在更优选的实施方案中，外切淀粉酶的外特异性指数为30或更大，40或更大，50或更大，60或更大，70或更大，80或更大，90或更大，100或更大。在非常优选的实施方案中，该外切特异性指数为150或更大，200或更大，300或更大，400或更大，500或更大或600或更大。
可通过本领域已知的任何方法测量总淀粉酶活性和内切淀粉酶活性。例如可通过测定淀粉底物释放的还原末端的总量测量总淀粉酶活性。或者，使用实施例中进一步详细描述的Betamyl测定法，为方便起见，实施例中测定的淀粉酶活性在表中以“Betamyl单位”描述。
可通过使用Phadebas试剂盒(Pharmacia and Upjohn)测定内切淀粉酶活性。其利用蓝色标记交联淀粉(用偶氮染料标记)；只有淀粉分子中的内部酶切释放标记，而外部酶切不会释放。可通过分光光度法测定染料的释放。因此，Phadebas试剂盒测量内切淀粉酶活性，为方便起见，本文中这一测定的结果(描述于实施例中)以“Phadebas单位”表示。
因此在非常优选的实施方案中外切特异性指数以Betamyl单位/Phadeba单位表示，也表示为“B/Phad”。
也可根据现有技术中描述的方法测定外切特异性，例如在我们的国际专利出版物编号WO99/50399中所述。这一方法通过测定内切淀粉酶活性和外切淀粉酶活性的比值测量外切特异性。因此，在优选的方面，本文所述PS4变异体每单位外切淀粉酶活性中含有小于0.5个内切淀粉酶(EAU)单位。适用于根据本发明用途的非麦芽糖生成外切淀粉酶优选每单位外切淀粉酶活性含有小于0.05EAU，更优选每单位外切淀粉酶活性小于0.01EAU。
本文所述PS4变异体优选具有与它们是外切淀粉酶一致的例如通过上述外切特异性指数测量的外切特异性。此外，它们优选与所衍生自的母体酶或多肽相比外切特异性更高或增强。因此，例如该PS4变异体多肽与它们的母体多肽优选在相同条件下相比具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高的外切特异性指数。它们与母体肽优选在相同条件下比较具有1.5x或更高、2x或更高、5x或更高、10x或更高、50x或更高、100x或更高。
改良的操作性质
本文所述PS4变异体与母体多肽或野生型多肽相比优选包含一种或多种改良的操作性质。在优选的实施方案中改良的操作性质包括改良的烘焙性质。
因此，该PS4变异体为用该PS4变异体多肽处理的食品与用母体多肽或野生型多肽处理的食品相比具有改良的操作或优选烘焙性质。该操作或烘焙性质可选自：硬度、弹性、粘性、破碎性和可折叠性。
可通过本领域已知的任何方法检测这些操作性质。例如可如实施例中所述通过质构曲线分析(使用例如质构分析仪)分析面包切片测定硬度、弹性和粘性。
硬度
本文所述的PS4变异体优选为用该PS4变异体多肽处理的食品与用母体多肽或野生型多肽处理的食品相比硬度更低。
优选的实施方案中硬度与食品的软度反向相关，因此更高的软度反映更低的硬度，反之亦然。
优选通过实施例13中列出的“硬度评价方案”测量硬度。
因此本文所述PS4变异体优选为用PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食品相比具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更低的硬度。用PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比具有1.1x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更低的硬度。
弹性
本文所述的PS4变异体优选为用该PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比弹性更高。
优选通过实施例14中列出的“弹性评价方案”测量弹性。
因此本文所述PS4变异体优选为用PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高的弹性。用PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比具有1.1x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更高的弹性。
粘性
本文所述的PS4变异体优选为用该PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比粘性更高。
优选通过实施例15中列出的“粘性评价方案”测量粘性。
因此本文所述PS4变异体优选为用PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高的粘性。用PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品具有1.1x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更高的粘性。
破碎性
本文所述的PS4变异体优选为用该PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比破碎性更低。
优选通过实施例16中列出的“破碎性评价方案”测量破碎性。
因此本文所述PS4变异体优选为用PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更低的破碎性。用PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比具有1.1x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更低的破碎性。
可折叠性
本文所述的PS4变异体优选为用该PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比可折叠性更高。
优选通过实施例17中列出的“可折叠性评价方案”测量可折叠性。
因此本文所述PS4变异体优选为用PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高的可折叠性。用PS4变异体多肽处理的食物产品与用母体多肽或野生型多肽处理的食物产品相比具有1.1x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更高的可折叠性。
我们具体描述了与木聚糖酶(提高其折叠性)一起使用本文所述PS4变异体多肽。
PS4变异体多肽和核酸的使用
PS4变异体多肽、核酸、宿主细胞、表达载体等可用于使用淀粉酶的任何应用中。具体而言，它们可用来替换任何非麦芽糖生成外切淀粉酶。它们可用于补充淀粉酶或非麦芽糖生成外切淀粉酶活性，可单独使用或与其它已知的淀粉酶或非麦芽糖生成外切淀粉酶联合使用。
本文所述PS4变异体序列可用于食品工业中的各种应用-例如面包房和饮料产品，它们也可用于其它应用例如药用组合物或甚至用于化学工业中。具体而言，该PS4多肽和核酸可用于各种工业应用包括烘焙(如WO 99/50399中公开)和面粉标准化(增加或改良体积)。它们可用于从淀粉或其它底物生产麦芽四糖。
因此我们描述了制备食物产品的方法，该方法包括：(a)获得非麦芽糖生成外切淀粉酶；(b)如本文件所述在非麦芽糖生成外切淀粉酶的一个或多个位置引入突变；(c)将所得多肽与食物成分混合。
PS4变异体多肽可用于增加烘烤产品例如面包的体积。不希望被任何具体的理论束缚，我们认为这是由于外切淀粉酶缩短了淀粉分子使得在加热中(例如烘焙)生面团的粘性降低引起的。这使得发酵产生的二氧化碳可以更小的阻碍增加面包的体积。
因此包含或经PS4变异体多肽处理的食物产品与未经此处理或用母体多肽处理的产品相比体积增加。换而言之，食物产品具有更大的每单位食品体积的气体体积。或者，或除此之外，用PS4变异体多肽处理的食物产品密度更低或重量(或质量)体积比更低。在尤其优选的实施方案中，PS4变异体多肽可用于增加面包的体积。体积增加或膨胀是有利的因为它可降低食物的粘性和淀粉质。消费者更喜欢清淡的食物，增强了消费者的体验。在优选的实施方案中，使用PS4变异体多肽可将体积增加10％、20％、30％、40％、50％或更多。
实施例中详细描述了使用PS4变异体多肽增加食物的体积。
食物中的使用
本文所述PS4变异体多肽和核酸可用作或用于制备食物。具体而言，它们可加入至食物中，即食品添加剂。术语“食物”包括制备的食物以及食物成分，例如面粉。在优选的方面，该食物用于人消费。该食物可为溶液或固体形式-取决于使用和/或应用方式和/或食用方式。
本文所述PS4变异体多肽和核酸可用作食品成分。如本文所使用“食品成分”包括配方，其可被加入功能性食品或食物中并包括可在需要例如酸化或乳化的多种产品中低水平使用的配方。该食品成分可为液体或固体形式-取决于使用和/或应用方式和/或食用方式。
本文所述PS4变异体多肽和核酸可作为或加入食品补充剂。本文所述PS4变异体多肽和核酸可作为或加入功能性食品。如本文所使用，术语“功能性食品”指不仅可提供营养作用和/或味觉满足并对消费者具有其它有利作用的食品。虽然功能性食品没有法律定义，但是这一领域的绝大多数成员认为它们是以具有特定健康作用被销售的食品。
PS4变异体多肽也可用于生产食物产品或食物。通常的食物包括乳产品、肉产品、家禽产品、鱼产品和生面产品。该生面产品可为任何被加工的生面产品，包括油炸、深度油炸、烘烤、烘焙、蒸或水煮的生面制品，例如馒头和年糕。在尤其优选的实施方案中，该食物产品为烘烤产品。
该食物优选为面包房产品。典型的面包房(烘焙)产品包括面包-例如面包条、面包卷、小圆面包、皮萨坯等，面粉糕饼、椒盐卷饼、玉米饼、蛋糕、曲奇饼、饼干、士力架等。
食物产品优选获益于本文所述PS4变异体的一种或多种改良的操作或烘焙性质。改良的操作或烘焙性质选自改良的硬度、改良的弹性、改良的粘性、改良的破碎性和改良的可折叠性。
因此我们描述了修饰包含非麦芽糖生成外切淀粉酶的食品添加剂的方法，该方法包括在本文所述的非麦芽糖生成外切淀粉酶的一个或多个位点引入突变。该相同的方法可用于修饰食品成分或食品补充剂、食物产品或食物。
凝沉(retrograde)/老化
我们描述了可减缓淀粉介质例如淀粉凝胶老化的PS4变异体蛋白的用途。该PS4变异体多肽尤其可阻碍有害的淀粉凝沉。
绝大多数淀粉颗粒由两种聚合物的混合物组成：基本为线性的直链淀粉和高度分支的支链淀粉。支链淀粉为巨大的分支分子，由经(1-4)键连接的α-D-吡喃型葡萄糖链组成，其中所述链经α-D-(1-6)键结合形成分支。支链淀粉存在于所有的天然淀粉中，占大多数普通淀粉的约75％。直链淀粉为具有少数α-D-(1-6)分支的经(1-4)连接的α-D-吡喃型葡萄糖单位的基本为线性的链。大多数淀粉含有约25％直链淀粉。
在水存在下被加热的淀粉颗粒经历被称作凝胶化的有序-无序相转变，其中液体被膨胀的颗粒吸收。不同淀粉的凝胶化温度不同。当新鲜烘焙的面包降温时直链淀粉部分在数小时内凝沉形成网状。这一过程是有利的因为它可产生硬度低并且切割性质改善的期望的面包心结构。在烘焙数天之后凝胶化淀粉颗粒中发生更缓慢的支链淀粉结晶。在这一过程中人们认为支链淀粉增强了淀粉颗粒嵌入的直链淀粉网状结构。这一强化作用增加了面包心的硬度。这一强化作用是面包老化的主要原因。
已知在贮藏中烘焙产品的性质会逐渐恶化。由于淀粉再结晶(也称作凝沉)，面包心的存水体积发生了对感官和使用价值具有重要意义的变化。面包心失去软度和弹性并且变硬易碎。面包心硬度的增加常被用作面包老化的量度。
支链淀粉有害凝沉的速度取决于支链淀粉侧链的长度。因此酶水解支链淀粉侧链(例如使用具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的PS4变异体多肽)可显著降低它们的结晶趋势。
因此，当在淀粉被加工成食物产品的任何阶段(例如烘焙成面包之前，之中或之后)将其加入淀粉中时，本文所述PS4变异体多肽的使用可延缓或阻碍或减慢凝沉。这一使用在下文中进一步详细描述。
因此我们描述了提高非麦芽糖生成外切淀粉酶防止老化优选有害凝沉的能力的方法，该方法包括在本文件所述的非麦芽糖生成外切淀粉酶的一个或多个位点引入突变。
测量凝沉(Inc.老化)的测定法
对于本文描述的具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的PS4变异体多肽抗老化作用的评价，可使用Instron 4301 Universal食物质构分析仪或本领域已知的其它仪器在烘焙后1、3或7天测量面包心硬度。
本领域另一种常用的评价具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的PS4变异体多肽对淀粉凝沉的作用的方法以DSC(差示扫描热量法)为基础。测量包含或不含酶(对照)烘焙的面包心或来自模型系统生面团的面包心中凝沉支链淀粉的熔化焓。所述实施例中使用的DSC仪器为Mettler-Toledo DSC 820，以从20至95℃每分钟10℃的温度梯度运行。制备样品时称量10-20mg面包心并转移至Mettler-Toledo铝盘中并密封。
所述实施例使用的模型系统生面团包含标准小麦面粉和最佳含量的水或缓冲液，包含或不含非麦芽糖生成PS4变异体外切淀粉酶。在10或50g Brabender Farinograph中分别混合6或7分钟。将生面团试样置于有盖子的玻璃试管(15*0.8cm)中。将这些试管在水浴中进行烘焙过程，33℃烘焙30分钟，然后以每分钟1.1℃的梯度从33℃加热至95℃，最后于95℃烘焙5分钟。接着在DSC分析之前将试管20℃保存于恒温器中。
在优选的实施方案中，所述PS4变异体与对照相比熔化焓降低。在非常优选的实施方案中，该PS4变异体的熔化焓降低了10％或更多。优选与对照相比熔化焓降低了20％或更多、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
制备淀粉产品
我们提供了在制备食物产品尤其是淀粉产品中使用PS4变异体多肽。该方法包括通过向淀粉介质中加入非麦芽糖生成外切淀粉酶例如PS4变异体多肽形成淀粉产品。如果淀粉介质为生面团，然后通过将面粉、水、非麦芽糖生成外切淀粉酶(为PS4变异体多肽)和任选其它可能的成分和添加剂一起混合制备该生面团。
术语“淀粉”应理解为淀粉本身或其成分，尤其是支链淀粉。术语“淀粉介质”指包含淀粉的任何适当介质。术语“淀粉产品”指包含或基于或衍生自淀粉的任何产品。该淀粉产品优选包含或基于或衍生自小麦面粉。本文所使用的术语“面粉”为小麦或其它谷物细磨食物的同义词。但是该术语优选指从小麦本身而不是其它谷物获得的面粉。因此，除非另外指明，本文使用的“小麦面粉”优选指小麦面粉本身以及存在于介质中例如生面团中的小麦面粉。
优选面粉为小麦面粉或黑麦面粉或小麦和黑麦面粉的混合物。但是也涵盖含有衍生自其它类型谷物例如大米、玉米、大麦和蜀黍的面粉的生面团。该淀粉产品优选为烘烤产品。该淀粉产品更优选为面包产品。该淀粉产品甚至更优选为烘焙的含淀粉面包产品。术语“烘焙的含淀粉面包产品”指以在生面团形成条件下通过混合面粉、水和膨发剂得到的生面团为基础的烘焙产品。当然也可在生面团混合物中加入其它组分。
因此，如果该淀粉产品为烘焙的含淀粉面包产品，那么该过程包括以任何适当的顺序在生面团形成条件下混合面粉、水和膨发剂并任选以预混合形式进一步加入PS4变异体多肽。该膨发剂可为化学膨发剂例如碳酸钠或任何酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株(Baker’s Yeast)。
该PS4变异体非麦芽糖生成外切淀粉酶可与任何生面团成分包括水或生面团成分混合物或与任何添加剂或添加剂混合物一起加入。可通过烘焙工业或任何其它生产以生面团为基础的产品的工业中常规的生面团制备方法制备生面团。
通常通过在180至250℃范围内的烘箱温度下烘焙面包生面团15至60分钟完成含淀粉面包产品(例如白面包、用经筛黑麦和小麦面粉制作的面包，面包卷等)的烘焙。烘焙工艺中，在生面团层外部(形成烘焙产品特性外皮的部位)采用陡峭温度梯度(200→120℃)。但是，由于蒸汽产生引起的耗热量，烘焙过程最终的面包心温度仅接近于100℃。
因此我们描述了制作面包产品的方法，包括(a)提供淀粉介质；(b)向淀粉介质中加入本文所述的PS4变异体多肽；(c)在(b)步骤中或之后加热淀粉介质生产面包产品。我们也描述了包括向淀粉介质中加入本文所述PS4变异体多肽制作面包产品的方法。
非麦芽糖生成外切淀粉酶PS4变异体多肽可以液体制剂或干燥粉状组合物形式或者包含酶作为仅有的活性组分或与一种或多种其它生面团成分或生面团添加剂混合加入。
改良组合物
我们描述了改良组合物，其包括面包改良组合物和生面团改良组合物。这些包括PS4变异体多肽，任选与其它成分或其它酶或二者一起。
我们也提供这些面包和生面团改良组合物在烘焙中的用途。在另一方面我们提供从面包改良组合物或生面团改良组合物得到的烘焙产品或生面团。在另一方面，我们描述了使用面包改良组合物或生面团改良组合物获得的烘焙产品或生面团。
生面团制备
可通过将面粉、水、包含PS4变异体多肽(如上所述)的生面团改良组合物和任选其它成分和添加剂混合制作生面团。
生面团改良组合物可与任何生面团成分包括面粉、水或任选其它成分或添加剂一起加入。可在面粉或水或任选其它成分和添加剂之前加入面团改良组合物。可在面粉或水或任选其它成分和添加剂之后加入生面团改良组合物。可通过烘焙工业或任何其它生产以生面团为基础的产品的工业中常规的生面团制备方法制备生面团。
生面团改良组合物可以液体制剂或干燥粉状组合物的形式或者包含酶作为仅有的活性组分或与一种或多种其它面团成分或添加剂混合加入。
加入的PS4变异体多肽非麦芽糖生成外切淀粉酶的量通常为使得终生面团中存在每千克面粉50至100000单位，优选每千克面粉100至50000单位的量。该用量优选在每千克面粉200至20000单位的范围内。或者以可得到终生面团中面粉0.02-50ppm(优选0.2-10ppm)的酶(每千克面粉0.02-50mg酶)的量加入PS4变异体多肽非麦芽糖生成外切淀粉酶。
在本文中，一个单位的非麦芽糖生成外切淀粉酶定义为当于50℃在试管中与4ml在如下文所述制备的50mM MES、2mM氯化钙，pH 6.0中的10mg/ml糯玉米淀粉温育时可每分钟释放相当于1μmol还原糖的水解产物的酶量。
如本文所述的生面团通常包含粗麦粉或小麦面粉和/或其它类型的粗面粉，面粉或淀粉例如玉米粉、玉米淀粉、蜀黍粉、大米粉、黑麦粗粉、黑麦粉、燕麦粉、燕麦粗粉、大豆粉、高粱粗粉、高粱粉、马铃薯粗粉、马铃薯粉或马铃薯淀粉。生面团可为新鲜、冰冻或部分烘焙的。
面团可为已发酵的面团或准备进行发酵的面团。可以多种方法发酵该面团，例如加入化学膨发剂，例如碳酸氢钠或通过加入曲(发酵的面团)，但是优选通过加入适当的酵母培养物例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株(Baker’s Yeast)发酵面团。
生面团可包含脂肪，例如颗粒脂肪或酥油。面团可进一步包含其它乳化剂例甘油一酯或二酯，脂肪酸糖酯、脂肪酸聚甘油酯，甘油一酯的乳酸酯、甘油一酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或溶血卵磷脂。
我们也描述了包含面粉和本文所述组合物一起的预混合物。该预混合物包含其它生面团-改良和/或面包改良添加剂，例如任何添加剂包括本文所述的酶。
其它生面团添加剂或成分
为了进一步改良烘焙产品的性质并赋予烘焙产品出众的质量可在生面团中加入其它生面团成分和/或生面团添加剂。通常，这些进一步加入的组分可包括生面团成分例如盐、谷物、脂肪和油、糖或增甜剂、饮食纤维、蛋白质源例如奶粉、谷蛋白大豆或鸡蛋以及生面团添加剂例如乳化剂，其它酶、水胶体、芳香剂、氧化剂、矿物和维生素。
乳化剂可用作生面团强化剂和面包心软化剂。作为生面团强化剂，乳化剂可提供醒发时间有关的耐受性和发酵(proofing)阶段对冲击(shock)的耐受性。此外，面团强化剂可提高给定生面团对发酵时间变化的耐受性。大多数生面团强化剂也可提高烘焙弹性，其意指从发酵产品至烘焙产品体积的增加。最后生面团强化剂可乳化任何存在于配方混合物中的脂肪。
适当的乳化剂包括卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和二酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和二酯的乙酸酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和二酯的乳酸酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和二酯的柠檬酸酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和二酯的二乙酰基酒石酸酯、可食用脂肪酸的蔗糖酯、2-硬脂酰乳酸钠和2-硬脂酰乳酸钙。
其它生面团添加剂或成分可与任何生面团成分包括面粉、水或任选其它成分或添加剂或生面团改进组合物一起加入。可在面粉、水、任选其它成分和添加剂或面团改良组合物之前加入其它生面团添加剂或成分。可在面粉、水、任选其它成分和添加剂或面团改良组合物之后加入其它生面团添加剂或成分。
其它生面团添加剂或成分可为液体制剂。但是其它生面团添加剂或成分也可适当为干燥组合物形式。
优选其它生面团添加剂或成分至少为生面团面粉组分重量的1％。更优选其它生面团添加剂或成分至少为2％，优选至少3％，优选至少4％，优选至少5％，优选至少6％。如果添加剂为脂肪，那么通常脂肪的量为1至5％，通常为1至3％，更通常约2％。
其它酶
一种或多种其它酶与PS4变异体多肽组合在一起使用。这些组合物可加入例如食品、生面团制备物、食物或淀粉组合物中。
其它酶可选自例如以下任意组合：(a)Novamyl，或具有麦芽糖生成α-淀粉酶活性的变异体、同源物或突变体；(b)木聚糖酶例如GRINDAMYLTM POWERBake 900(Danisco A/S)；(c)细菌α-淀粉酶例如Max-Life U4(Danisco A/S)；以及(d)脂肪酶例如GRINDAMYLTMPOWERBake 4050(Danisco A/S)。
在一个实施方案中将根据本发明的PS4变异体多肽与至少一种选自氧化还原酶、水解酶、脂肪酶、酯酶、糖苷酶、淀粉酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉降解酶、蛋白酶和脂氧合酶之一的酶组合使用。在优选的实施方案中，该组合物包含至少一种PS4变异体和如WO91/04669公开的来自杆菌的麦芽糖生成淀粉酶。优选的实施方案包含PS4变异体和面粉。
可加入生面团中的其它酶包括氧化还原酶、水解酶，例如脂肪酶和酯酶以及糖苷酶如α-淀粉酶、支链淀粉酶和木聚糖酶。氧化还原酶，例如葡萄糖氧化酶和己糖氧化酶可用于生面团强化和控制烘焙产品的体积，可加入木聚糖酶和其它半纤维素酶改良生面团操作性质、面包心硬度和面包体积。脂肪酶可用作生面团强化剂和面包心软化剂，可在面团中包含α-淀粉酶和其它淀粉分解酶控制面包体积并进一步降低面包心硬度。
可使用的其它酶选自纤维素酶、半纤维素酶、淀粉降解酶、蛋白酶和脂氧合酶。
可用氧化还原酶的实例包括氧化酶例如麦芽糖氧化酶、葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)、碳水化合物氧化酶、甘油氧化酶、吡喃糖氧化酶、半乳糖氧化酶(EC 1.1.3.10)和己糖氧化酶(EC 1.1.3.5)。这些酶可用于生面团强化和控制烘焙产品的体积。
在淀粉降解酶中，淀粉酶尤其可用作生面团改良添加剂。α-淀粉酶将淀粉降解至糊精，糊精可进一步被β-淀粉酶降解至麦芽糖。适当淀粉酶的实例包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的麦芽糖生成α-淀粉酶(例如NovamylTM(Novozymes))，也称作葡聚糖1，4-a-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133)，来自淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliqufaciens)的α-淀粉酶(EC3.2.1.1)(例如Max Life U4(Danisco A/S))，B.flavothermus淀粉酶(US 20050048611A1)，插入了来自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(EC3.2.1.133)的真菌淀粉酶变异体(WO2005019443)，如US20060147581A1所述的淀粉酶杂交体，以及它们具有麦芽糖生成α-淀粉酶活性的变异体、同源物和衍生物。在优选的实施方案中，PS4变异体多肽可与淀粉酶尤其是麦芽糖生成淀粉酶组合。麦芽糖生成α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133))可水解直链淀粉和支链淀粉至α-构型的麦芽糖。可加入生面团组合物中的其它可用的淀粉降解酶包括葡萄糖淀粉酶和支链淀粉酶。
其它酶优选至少为木聚糖酶和/或淀粉酶。本文所使用术语“木聚糖酶”指可水解木糖苷(xylosidic)键的木聚糖酶(EC 3.2.1.32)。也可加入脂肪酶。适当木聚糖酶的实例包括来自例如杆菌属、曲霉属、嗜热真菌属或木霉属的烘焙木聚糖酶(EC 3.2.1.8)(例如GRINDAMYLTMPOWERBake 900(Danisco A/S))以及例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanoginosus)(以前称作特异腐质霉(Humicolainsolens))、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 94/21785)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)(WO 2005/059084)、杆菌属(EP 0720649B1)，B.agadeherens(US 5,770,424)的属于科10或11的木聚糖酶，以及它们的变异体、同源物和衍生物。
如本文使用的术语“淀粉酶”指淀粉酶例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和γ-淀粉酶(EC 3.2.1.3).
其它酶可与任何生面团成分包括面粉、水或任选其它成分或添加剂或生面团改良组合物一起加入。可在面粉、水或任选其它成分和添加剂或生面团改良组合物之前加入其它酶。可在面粉、水或任选其它成分和添加剂或生面团改良组合物之后加入其它酶。其它酶可为液体制剂。但是该组合物也可适当为干燥组合物形式。
生面团改良组合物的一些酶在生面团条件下可相互作用以致酶对面粉生面团的流变和/或机械制造性质和/或用生面团制作的产品的性质的改良作用不仅是附加的而且是协同的。
与改良用面团制作的产品(终产品)相关，可发现该组合引起对面包心结构的实质协同作用。而且也可发现对烘焙产品具体体积的协同作用。
其它的酶可水解羧酸酯键释放羧化物的脂肪酶(EC 3.1.1)。脂肪酶实例包括但不限于三酰基甘油酯酶(EC 3.1.1.3)、半乳糖脂(肪)酶(EC 3.1.1.26)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)和脂蛋白脂肪酶(EC 3.1.1.34)。更具体而言，适当的脂肪酶包括来自米黑毛霉(Mucor miehei)、镰孢霉(F.venenatum)、H.lanuginosa、米黑根毛霉南极假丝酵母(Rhizomucor miehei candida antarctica)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的脂肪酶，来自异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)(例如GRINDAMYLTM POWERBake 4050(Danisco A/S))的糖脂酶，以及它们的变异体、同源物和衍生物。
其它用途
PS4变异体适用于生产麦芽糖和高麦芽糖糖浆。由于吸湿性低、低粘性、良好的热稳定性和温和的并不是很甜的麦芽糖甜味，这些产品非常适用于生产某些糕点。生产麦芽糖糖浆的工业方法包括溶解淀粉、接着用麦芽糖产生酶进行糖化，任选用酶断裂支链淀粉的1，6-分支点，例如α-1，6-淀粉葡萄糖甙酶。
可将本文所述PS4变异体加入去污剂组合物中并因此成为其组分。该去污剂组合物可配制成例如手工或机器洗衣去污剂组合物包括适于污渍纤维预处理的洗衣添加剂组合物和辅助漂洗的纤维软化组合物的或配制成用于普通家用硬表面清洗操作中的去污剂组合物，或配制用于手工或及其洗盘操作。在具体方面，我们描述了包含PS4变异体的去污剂添加剂。该去污添加剂和去污组合物可包含一种或多种其它的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或过氧化物酶。一般而言，所选酶的性质应与所选去污剂相容(即，最适-pH、与其它酶成分或非酶成分的相容性，等等)，并且该酶应以有效量存在。
PS4变异体也可用于从淀粉强化的废纸和卡纸板生产木质纤维材料，例如纸浆、纸和卡纸板，尤其在pH高于7重新制浆时并且淀粉酶可通过降解强化淀粉辅助废物材料的分解。PS4变异体尤其适用于从淀粉涂布的印刷纸生产造纸纸浆。可如WO 95/14807所述进行该方法，包括以下步骤：a)分解纸形成纸浆，b)在步骤a之前、之中或之后用淀粉降解酶处理，以及c)在a)和b)步骤之后分离墨颗粒和纸浆。PS4变异体也非常适用于修饰淀粉，其中被酶修饰的淀粉和碱性填充剂例如碳酸钙、高岭土和粘土一起用于造纸。有了本文所述PS4变异体使得在填充剂存在下修饰淀粉成为可能因此得到更简单的整合方法。PS4变异体也非常适用于纺织品脱浆。在纺织品加工工业中，通常使用淀粉酶作为脱浆工艺的辅料以辅助去除在纺织中作为织品纱线的保护性涂层的含淀粉浆料。纺织后完全去除浆料涂层对于确保之后纤维被洗刷、漂白和染色的工艺中的最佳结果是重要的。优选酶催化淀粉降解，因为其不涉及任何对纤维材料的有害作用。可单独使用PS4变异体或在脱浆含纤维素的织物或纺织品时与纤维素酶一起使用。
PS4变异体也可为从淀粉生产增甜剂可选择的淀粉酶。传统的转化淀粉至果糖糖浆的方法通常由三步连续的酶催化过程组成，即液化过程然后是糖化过程最后为异构化过程。在液化过程中，在pH5.5-6.2之间于95-160℃用淀粉酶降解淀粉约2小时形成糊精。为了确保这些条件下最佳的酶稳定性，加入1mM钙(40ppm游离钙离子)。液化过程之后通过加入葡萄糖淀粉酶和脱支酶例如异淀粉酶或支链淀粉酶将糊精转化为右旋糖。在这一步骤之前将pH降低至4.5以下，保持高温(高于95℃)，将液化淀粉酶活性变性。将温度降低至60°C，加入葡萄糖淀粉酶和脱支酶。
洗衣去污剂组合物及用途
本文讨论的α-淀粉酶变异体可加入用于清洗盘子的去污剂组合物或其它洗涤组合物中。这些可为凝胶、粉末或液体。这些组合物可仅包含α-淀粉酶变异体、其它淀粉分解酶、其它洗涤酶以及其它洗涤组合物中常用的组分。
因此，洗盘去污剂组合物可包含表面活性剂。该表面活性剂可为阴离子、非离子、阳离子、两性离子型或这些类型的混合物。该去污剂可含有0％至约90％重量比的非离子型去污剂，例如低泡沫至无泡沫的乙氧基化丙氧基化直链醇。
在去污剂的应用中，通常以含有丙二醇的液体组合物使用α-淀粉酶变异体。例如，可通过在含有10％氯化钙的25％体积比丙二醇溶液中循环将α-淀粉酶变异体溶解于丙二醇中。
该洗盘去污剂组合物可包含无机和/或有机类型的去污剂助剂盐。这些去污剂助剂可分为含磷和不含磷类型。去污剂组合物通常含有约1％至约90％的去污剂助剂。含磷无机碱性去污剂助剂(当存在时)的实例包括水溶性盐，尤其是碱土金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多聚磷酸盐。含磷有机碱性去污剂助剂(当存在时)的实例包括碳磷酸盐的水溶性盐。不含磷无机助剂(当存在时)的实例包括水溶性碱土金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐，以及各种类型的水不溶性结晶或无定形硅酸铝，其最为熟知的代表为沸石。
适当无机助剂的实例包括碱土金属、铵和经取代的铵；柠檬酸盐；琥珀酸盐；丙二酸盐；脂肪酸磺酸盐；羧甲氧基琥珀酸盐；聚乙酸铵；羧酸盐；聚羧酸盐；氨基聚羧酸盐；聚乙烯羧酸盐和多羟基磺酸盐。
其它适当的有机助剂包括已知具有助剂性质的高分子量聚合物和共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物以及它们的盐。
洗涤组合物可包含氯/溴型或氧型漂白剂。无机氯/溴型漂白剂包括锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴型漂白剂的实例为杂环N-溴和N-氯-亚胺，例如三氯异氰尿酸、三溴异氰尿酸、二溴异氰尿酸和二氯异氰尿酸，以及它们的盐和水溶性阳离子，例如钾和钠。海因化合物也适用。
洗涤组合物也包含氧漂白剂，例如无机过酸盐的形式，任选含有漂白剂前体或过氧酸化合物。适当过氧漂白剂化合物的典型实例为碱土金属过硼酸盐，四水合物和一水合物二者，碱土金属过碳酸盐，过硅酸盐和过磷酸盐。适当的活化剂材料包括四乙酰乙二胺(TAED)和甘油三乙酸酯。也可存在酶催化漂白剂活化系统，例如WO2005/056783公开的过硼酸盐或过碳酸盐，甘油三乙酸酯和过水解酶。
该洗涤组合物可使用该酶的常规稳定剂稳定化，例如多元醇，如丙二醇，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物(例如芳香硼酸酯)。该洗涤组合物也可包含其它常规去污剂成分，例如反絮凝剂、填充材料、泡沫抑制剂、防蚀剂、土壤悬浮剂、掩蔽剂、抗-土壤再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和芳香剂。
最后，该α-淀粉酶变异体可用于常规洗盘去污剂中，例如以下专利申请中描述的任何去污剂，并考虑用本文描述的α-淀粉酶变异体替代所列专利和出版申请书中公开的任何α-淀粉酶或与其一起使用：CA 2006687、GB 2200132、GB 2234980、GB 2228945、DE 3741617、DE 3727911、DE 4212166、DE 4137470、DE 3833047、DE 4205071、WO 93/25651、WO 93/18129、WO 93/04153、WO 92/06157、WO92/08777、WO 93/21299、WO 93/17089、WO 93/03129、EP 481547、EP 530870、EP 533239、EP 554943、EP 429124、EP 346137、EP 561452、EP 318204、EP 318279、EP 271155、EP 271156、EP 346136、EP 518719、EP 518720、EP 518721、EP 516553、EP 561446、EP 516554、EP 516555、EP 530635、EP 414197和美国专利第5112518、5141664和5240632号。
根据本实施方案，一种或多种α-淀粉酶变异体可通常为去污剂组合物的组分。这样它可以无粉尘颗粒、稳定化液体或经保护的酶的形式包括于该去污剂组合物中。例如可如美国专利第4106991和4661452号所公开生产无粉尘颗粒并任选用本领域已知方法涂层。蜡状涂层材料的实例为聚(氧化乙烯)产品；平均摩尔重量为1000至20000的(聚乙烯二醇，PEG)；含有16至50个氧化乙烯单位的乙氧化壬酚；其中的醇包含12至20个碳原子并且具有15至80个氧化乙烯单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的甘油一、二和三酯。适用于通过流化床技术应用的膜形成涂层材料的实例见例如GB专利第1483591号。例如可根据已建立的方法通过加入多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定化液体酶制剂。其它酶稳定剂为本领域熟知。可根据例如US 5879920(Genencor International，Inc.)或EP 238216公开的方法制备经保护的酶。多元醇长久以来被认为是蛋白质的稳定剂并可提高蛋白质的稳定性。参见，例如Kaushik等，“为什么海藻糖为特殊的蛋白质稳定剂？分析可溶性渗透物海藻糖存在时蛋白质的热稳定性”(“Why is trehalose an exceptional proteinstabilizer？An analysis of the thermal stability of proteins in the presenceof the compatible osmolyte trehalose”)J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)和其中引用的参考文献；以及M.Conti等，“毛细管等电聚焦：蛋白质溶解度问题”(“Capillary isoelectric focusing：the problem ofprotein solubility，”)J.Chromatography 757：237-245(1997)。
该去污剂组合物可为任何适当的形式，例如凝胶、粉末、颗粒、糊剂或液体。液体去污剂为含水的，通常含有约70％的水，0％至约30％的有机溶剂，其也可为仅含有约30％水的致密凝胶型。
该去污剂组合物包含一种或多种表面活性剂，各表面活性剂可为阴离子、非离子、阳离子或两性离子。该去污剂通常含有0％至约50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸酯或盐(LAS)；α-烯烃磺酸酯或盐(AOS)；烷基硫酸酯或盐(脂肪醇硫酸酯或盐)(AS)；醇乙氧基硫酸酯或盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸酯或盐(SAS)，α-硫代脂肪酸甲基酯；烷基或烯基琥珀酸；或肥皂。该组合物也可包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如WO 92/06154中所述的醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧基醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚葡萄糖苷、氧化烷基二甲基胺、乙氧化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺。
该去污剂组合物可另外包含一种或多种酶，例如任意组合的脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶和/或漆酶。
该去污剂组合物可包含约1％至约65％的去污剂助剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、碳磷酸盐、柠檬酸盐、氨基三乙酸(NTA)，乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTMPA)、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，Hoechs的t SKS-6)。该去污剂也可为无助剂的，即基本不含去污剂助剂。酶可用于任何与酶的稳定性相容的组合物中。可通过已知形式的包封例如通过制粒或在水凝胶中隔离保护酶不受有害组分的影响。含有或不含淀粉结合结构域的酶尤其是α-淀粉酶不限于洗衣和洗盘应用，但是可结合用于表面清洁剂和从淀粉或生物菌体生产乙醇。
该去污剂可包含一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙烯二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸盐例如聚丙烯酸盐、马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。
该去污剂可包含漂白体系，其含有H2O2源例如过硼酸盐或过碳酸盐。任选与过酸-形成漂白活化剂例如TAED或壬酰氧苯磺酸(NOBS)组合。或者，该漂白体系可包含例如酰胺、亚胺或砜型过氧酸。该漂白体系也可为酶漂白体系，其中过水解酶活化过氧化物，如WO 2005/056783中所述。
可使用常规稳定剂稳定该去污剂组合物的酶，例如多元醇，如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯；可如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制该组合物。
该去污剂也可含有其它常规去污剂成分例如织物柔软剂包括粘土、起泡剂、抑泡剂、防蚀剂、土壤悬浮剂、掩蔽剂、抗-土壤再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂，荧光增白剂，增稠剂和芳香剂。pH(以使用浓度在含水溶液中测量)通常为中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。
可以适于应用的浓度将α-淀粉酶变异体加入去污剂中。目前在去污剂组合物中以对应于每升洗涤液体0.00001-1.0mg(以纯酶蛋白计算)α-淀粉酶的量加入α-淀粉酶变异体。包含α-淀粉酶变异体的具体形式的去污剂组合物可配制成包括：
(1)配制成堆积密度至少为600g/L的颗粒的去污剂组合物，其包含约7％至约12％的线性烷基苯磺酸酯或盐(以酸计算)；约1％至约4％的脂肪醇乙氧基硫酸酯或盐(例如，C12-18醇、1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸酯或盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧化物(例如C14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约2％至约6％的可溶性硅酸盐；约15％至约22％的沸石(例如，NaAlSiO4)；0％至约6％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约11％至约18％的高硼酸钠(例如，NaBO3·H2O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％蛋白的酶(以纯酶计算)；以及0-5％的次要成分(例如，抑泡剂、芳香剂、荧光增白剂、光漂白剂)。
(2)配制成堆积密度至少为600g/L的颗粒的去污剂组合物，其包含约6％至约11％的线性烷基苯磺酸盐或酯(以酸计算)；约1％至约3％的脂肪醇乙氧基硫酸盐或酯(例如，C12-18醇、1-2EO)或烷基硫酸盐或酯(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧化物(例如C14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至4％的可溶性硅酸盐；约24％至约34％的沸石(例如，NaAlSiO4)；约4％至约10％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如，C6H5Na3O7/C6H8O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶计算)；以及0-5％的次要成分(例如，抑泡剂、芳香剂)。
(3)配制成堆积密度至少为600g/L的颗粒的去污剂组合物，其包含约5％至约9％的烷基苯磺酸盐或酯(以酸计算)；约7％至约14％醇乙氧化物(例如C12-15醇，7EO)；约1％至约3％的肥皂作为脂肪酸(例如，C16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约3％至9％的可溶性硅酸盐；约23％至约33％的沸石(例如，NaAlSiO4)；0％至约4％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约8％至约16％的高硼酸钠(例如，NaBO3·H2O)；约2％至约8％的TAED；0％至约1％的碳磷酸盐(例如，EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-5％的次要成分(例如，抑泡剂、芳香剂、荧光增白剂)。
(4)配制成堆积密度至少为600g/L的颗粒的去污剂组合物，其包含约8％至约12％的烷基苯磺酸盐或酯(以酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧化物(例如C12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约1％至5％的可溶性硅酸盐；约25％至约35％的沸石(例如，NaAlSiO4)；0％至约10％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶计算)；以及0-5％的次要成分(例如，抑泡剂、芳香剂)。
(5)含水液体去污剂组合物，其包含约15％至约21％的烷基苯磺酸盐或酯(以酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧化物(例如C12-15醇、7EO或C12-15醇、5EO)；约3％至约13％的肥皂作为脂肪酸(例如，油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；约0％至约3％的磷酸盐；0％至约3％的聚合物(例如，PVP、PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-5％的次要成分(例如，分散剂、抑泡剂、芳香剂、荧光增白剂)。
(6)含水液体去污剂组合物，其包含约15％至约21％的烷基苯磺酸盐或酯(以酸计算)；约3-9％的醇乙氧化物(例如C12-15醇、7EO或C12-15醇、5EO)；约3％至约10％的肥皂作为脂肪酸(例如，油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaAlSiO4)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0至约3％的聚合物(例如，PVP、PEG)；0％至约3％的锚定聚合物(例如十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物，摩尔比为25∶1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-5％的次要成分(例如，分散剂、抑泡剂、芳香剂、荧光增白剂)。
(7)配制成堆积密度至少为600g/L的颗粒的去污剂组合物，其包含约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐或酯；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的肥皂作为脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约1％至4％的可溶性硅酸盐；约20％至约40％的沸石(例如，NaAlSiO4)；约2％至约8％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约12％至约18％的高硼酸钠(例如，NaBO3·H2O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、抑泡剂、芳香剂)。
(8)配制成颗粒的去污剂组合物，其包含约8％至约14％的烷基苯磺酸盐或酯(以酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-约3％的肥皂作为脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约1％至4％的可溶性硅酸盐；约30％至约50％的沸石(例如，NaAlSiO4)；约3％至约11％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如，C6H5Na3O7)；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-5％的次要成分(例如，抑泡剂、芳香剂)。
(9)配制成颗粒的去污剂组合物，其包含约6％至约12％的烷基苯磺酸盐或酯(以酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％-约6％的肥皂作为脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约18％至约32％的沸石(例如，NaAlSiO4)；约5％至约20％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如，C6H5Na3O7)；约4％至约9％的高硼酸钠(例如NaBO3·H2O)；约1％至约5％的漂白活化剂(例如，NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸盐或PEG)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、芳香剂)。
(10)含水液体去污剂组合物，其包含约15％至约23％的烷基苯磺酸盐或酯(以酸计算)；约8至约15％的醇乙氧基硫酸盐或酯(例如，C12-15醇、2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧化物(例如C12-15醇、7EO或C12-15醇、5EO)；0％至约9％的肥皂作为脂肪酸(例如，月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的助水溶物(例如，甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约1％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-5％的次要成分(例如，聚合物、分散剂、芳香剂、荧光增白剂)。
(11)含水液体去污剂组合物，其包含约20％至约32％的线性烷基苯磺酸盐或酯(以酸计算)；6％-约12％的醇乙氧化物(例如C12-15醇、7EO或C12-15醇、5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物，例如十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-5％的次要成分(例如，助水溶物、分散剂、芳香剂、荧光增白剂)。
(12)配制成堆积密度至少为600g/L的颗粒的去污剂组合物，其包含约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐或酯、烷基硫酸盐或酯、α-烯烃磺酸盐或酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐或酯、肥皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如，醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约5％至15％的可溶性硅酸盐；0％至约5％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约15％至约28％的沸石(例如，NaAlSiO4)；0％至约20％的高硼酸钠(例如，NaBO3·H2O)；约0％至约5％的漂白活化剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-3％的次要成分(例如，芳香剂、荧光增白剂)。
(13)如上述组合物1)-12)所述的去污剂组合物，其中全部或部分线性烷基苯磺酸盐或酯被((C12-C18)烷基硫酸盐或酯取代。
(14)配制成堆积密度至少为600g/L的颗粒的去污剂组合物，其包含约9％至约15％的(C12-C18)烷基硫酸盐或酯；约3％至约6％的醇乙氧基化合物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酰胺；约10％至约20％的沸石(例如，NaAlSiO4)；约10％至约20％的层状二硅酸盐(例如，Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；0％至约6％的可溶性硅酸盐；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的高硼酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸和PVP)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、光漂白剂、芳香剂、抑泡剂)。
(15)配制成堆积密度至少为600g/L的颗粒的去污剂组合物，其包含约4％至约8％的(C12-C18)烷基硫酸盐或酯；约11％至约15％的醇乙氧基化合物；约1％至约4％的肥皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；0％至约4％的可溶性硅酸盐；约13％至约22％的高硼酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如，聚羧酸和PVP)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计算)；以及0-3％的次要成分(例如，荧光增白剂、碳磷酸盐、芳香剂)。
(16)如上文1)-15)所述的去污剂组合物，其包含经稳定化或经包囊化的过酸，或者作为附加组分或作为已特定的漂白体系的替代品。
(17)如上文1)、3)、7)、9)和12)所述的去污剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐取代。
(18)如上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的去污剂组合物，其另外包含锰催化剂。
(19)以非含水去污剂液体制备的去污剂组合物，其包含液体非离子表面活性剂，例如线性烷氧基化伯醇、助剂体系(例如，磷酸盐)、酶(多种酶)和碱。该去污剂也可包含阴离子表面活性剂和/或漂白体系。
在另一个实施方案中，可将2，6-β-D-果聚糖水解酶并入去污剂组合物中并用于去除/清除家用和/或工业纺织物/待洗衣物中存在的生物被膜。
去污剂组合物可配制成例如手工或机器洗衣去污剂组合物，包括适于污渍纤维预处理的洗衣添加剂组合物和辅助漂洗的纤维软化组合物或配置成用于手工或机器洗盘操作。
就具体方面而言，去污剂组合物可包含2，6-β-D-果聚糖水解酶，一种或多种α-淀粉酶变异体，一种或多种其它洗涤酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或它们的组合。一般而言，所选酶的性质应与所选去污剂相容(即，最适-pH、与其它酶成分或非酶成分等的相容性)，并且该酶应以有效量存在。
蛋白酶：适当的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源者。化学修饰或蛋白工程变异体也适用。蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶或胰岛素酶-样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草菌溶素，尤其是衍生自杆菌属者，例如枯草菌溶素Novo、枯草菌溶素Carlsberg、枯草菌溶素309(参见，例如，美国专利第6287841号)、枯草菌溶素147和枯草菌溶素168(参见，例如，WO89/06279)。胰岛素酶-样蛋白酶的实例为胰岛素酶(例如猪或牛源)，镰孢菌属蛋白酶(参见，例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。可用蛋白酶的实例也包括但是不限于WO 92/19729和WO 98/20115中所述的变异体。适当的可商业购买的蛋白酶包括
Figure A20078003052700711
Figure A20078003052700712
和KannaseTM(Novozymes，以前为NovoNordisk A/S)；
Figure A20078003052700713
MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、
Figure A20078003052700714
Purafect OxPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International，Inc.)。
脂肪酶：适当的脂肪酶包括细菌或真菌来源者。也包括化学修饰或蛋白工程变异体。可用脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质霉属(嗜热真菌的同义词)例如疏棉状腐质霉菌(疏棉状嗜热真菌)(参见，例如，EP 258068和EP 305216)和特异腐质霉(参见，例如WO96/13580)的脂肪酶；假单胞菌属脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌和假产碱假单胞菌(参见，例如，EP 218272)、洋葱假单胞菌(参见，例如，EP 331376)、斯氏假单胞菌(参见，例如，GB 1372034)、荧光假单胞菌、假单胞菌属菌株SD 705(参见，例如，WO 95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(参见，例如，WO 96/12012)；杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌；参见，例如，Dartois等，BiochemicaBiophysica Acta，1131：253-360(1993))、嗜热脂肪芽胞杆菌(参见，例如，JP 64/744992)或短小芽胞杆菌(参见，例如WO 91/16422)。预期用于该制剂的其它脂肪酶变异体包括例如WO 92/05249、WO94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中所述者。一些可商业购买的脂肪酶包括
Figure A20078003052700721
and
Figure A20078003052700722
Ultra(Novozymes，formerly Novo Nordisk A/S)。
聚酯酶：适当的聚酯酶包括但是不限于WO 01/34899(GenencorInternational，Inc.)和WO 01/14629(Genencor International，Inc.)所述者并可包括在与本文所述其它酶的任意组合中。
淀粉酶：该组合物可与其它α-淀粉酶组合，例如非变异体α-淀粉酶；这些可包括商业购买的淀粉酶，例如但不限于
Figure A20078003052700723
TermamylTM、
Figure A20078003052700724
和BANTM(Novozymes，formerly NovoNordisk A/S)、
Figure A20078003052700725
和
Figure A20078003052700726
(Genencor International，Inc.)。
纤维素酶：可将纤维素酶加入组合物中。适当的纤维素酶包括细菌或真菌来源者。包括化学修饰或蛋白质工程变异体。适当的纤维素酶包括来自杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、孢壳菌属、支顶孢属等的纤维素酶，例如美国专利第4435307、5648263、5691178、5776757号以及WO 89/09259中公开的由特异腐质霉、Myceliophthora thermophila和尖孢镰刀菌产生的纤维素酶。预期使用的示例性纤维素酶为对纺织品的颜色有利者。这些纤维素酶的实例为例如EP 0495257、EP 531372、WO 99/25846(Genencor International，Inc.)、WO 96/34108(Genencor International，Inc.)、WO 96/11262、WO96/29397和WO 98/08940中所述纤维素酶。其它实例为纤维素酶变异体，例如WO 94/07998、WO 98/12307、WO 95/24471、PCT/DK98/00299、EP 531315、美国专利第5457046、5686593和5763254号所述者。可商业购买的纤维素酶包括
Figure A20078003052700731
和
Figure A20078003052700732
(Novozymes，formerly Novo Nordisk A/S)；ClazinaseTM和
Figure A20078003052700733
HA(Genencor International，Inc.)；以及KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。
过氧化物酶/氧化酶：可预期用于该组合物中的适当过氧化物酶/氧化酶包括动物、植物或微生物来源者。包括化学修饰或蛋白质工程突变体。可用过氧化酶的实例包括如WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257所述来自鬼伞属(Coprinus)例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶以及它们的变异体。
可通过加入包含一种或多种酶的单独的添加剂或通过加入含有所有酶的混合添加剂将去污剂酶包括于去污剂组合物中。去污剂添加剂，即单独添加剂或混合添加剂，可配制成颗粒、液体、浆等。适当的颗粒去污剂添加剂包括无粉尘颗粒。
可如美国专利第4106911和4661452号所公开生产无粉尘颗粒并任选根据本领域已知方法涂渍。蜡质涂渍材料的实例包平均摩尔重量为1000至2000的聚(氧化乙烯)产品(例如，聚乙烯二醇，PEG)；含有16至50个氧化乙烯单位的乙氧化壬酚；其中的醇包含12至20个碳原子并且具有15至80个氧化乙烯单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的甘油一、二和三酯。适用于通过流化床技术应用的膜形成涂层材料的实例例如见GB专利第1483591号。例如可根据已建立的方法通过加入多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定化液体酶制剂。其它酶稳定剂为本领域熟知。可根据EP 238216公开的方法制备经保护的酶。
该去污剂组合物可为任何适当的形式，例如条状、片状、凝胶、粉末、颗粒、糊剂或液体。液体去污剂为含水的，通常含有约70％的水、0％至约30％的有机溶剂。也预期含有30％或更少的水的致密去污剂凝胶。该去污剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可为非离子包括半极性、阴离子、氧离子或两性离子，或它们的任意组合。表面活性剂通常以0.1％至60％质量比的水平存在。
当包含于其中时，去污剂通常含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐或酯、α-烯烃磺酸盐或酯、烷基硫酸盐或酯(脂肪酸硫酸盐)、脂肪醇乙氧基硫酸盐或酯、仲烷基磺酸盐或酯、α-硫代甲基脂肪酸酯；烷基或烯基琥珀酸；或肥皂。
当包含于其中时，去污剂通常包含约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物，烷基聚葡萄糖苷、氧化烷基二甲基胺、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺(“葡萄糖胺”)的N-芳基-N-烷基衍生物。
去污剂可包含0％至约65％的去污剂助剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、碳磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨基三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，Hoechs的SKS-6)。
去污剂可包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸盐例如聚丙烯酸盐、马来酸/丙烯酸共聚物)以及十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。
去污剂可包含漂白体系，其含有H2O2源例如过硼酸盐或过碳酸盐，任选与过酸-形成漂白活化剂(例如TAED或壬酰氧苯磺酸盐或酯)组合。或者，该漂白体系可包含过氧酸(例如酰胺、亚胺或砜型过氧酸)。该漂白体系也可为酶漂白体系。
该去污剂组合物的酶可使用常规稳定剂稳定化，例如多元醇(如丙二醇或甘油)；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物(例如芳香硼酸酯)；或苯基硼酸衍生物(例如，4-甲酰基苯硼酸)。该组合物可如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制。
该去污剂也可含有其它常规去污剂成分例如织物柔软剂包括粘土、起泡剂、抑泡剂、防蚀剂、土壤悬浮剂、掩蔽剂、抗-土壤再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂、助水溶剂、生锈抑制剂或芳香剂。
预期在去污剂组合物中以对应于每升洗涤液约0.01至约100mg酶蛋白，优选每升洗涤液约0.05至约5.0mg酶蛋白，或甚至更优选每升洗涤液约0.1至约1.0mg酶蛋白的量加入α-淀粉酶变异体。
淀粉加工组合物及用途
在另一方面，含有已公开的α-淀粉酶变异体的组合物可用于淀粉液化作用和/或糖化作用。淀粉加工可用于生产增甜剂，生产用于燃料或酒的醇(即可饮用醇)，生产饮料，加工蔗糖或生产需要的有机化合物，例如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、酮、氨基酸、抗生素、酶、维生素和激素。将淀粉转化成果糖糖浆通常由三步连续的酶催化过程组成：液化过程、糖化过程和异构化过程。在液化过程中，在pH约5.5至约6.2之间于约95℃至约160℃用淀粉酶降解淀粉约2小时形成糊精。通常加入1mM钙(40ppm游离钙离子)优化这些条件下的酶稳定性。其它α-淀粉酶变异体可能需要不同的条件。
液化过程之后通过加入葡萄糖淀粉酶(例如，AMGTM)和任选脱支酶例如异淀粉酶或支链淀粉酶(例如，
Figure A20078003052700751
)将糊精转化为右旋糖。在这一步骤之前将pH降低至约4.5以下，保持高温(高于95℃)，将液化α-淀粉酶变异体活性变性。将温度降低至60℃，加入葡萄糖淀粉酶和脱支酶。该糖化过程通常进行约24至约72小时。
糖化过程之后，将pH升高至约6.0至约8.0的范围内，例如pH7.5并通过离子交换移除去钙。然后使用例如固定化葡萄糖异构酶(例如)将右旋糖糖浆转化成高果糖浆。
α-淀粉酶变异体可提供至少一种用于进行液化过程的被改良的酶性质。例如α-淀粉酶变异体具有高活性，或其对钙的要求降低。需要加入游离钙确保α-淀粉酶充足的高稳定性；但是游离钙强烈抑制葡萄糖异构酶的活性。因此，在异构化步骤之前需通过昂贵的单位操作去除钙使得游离钙的水平降低至3-5ppm以下。如果可以避免这一操作将会节省成本。因此不需要钙离子或对钙的要求降低的α-淀粉酶变异体尤其有利。例如，在低浓度游离钙(＜40ppm)时稳定并高活性的较少钙-依赖α-淀粉酶变异体可用于该组合物和操作中。这一α-淀粉酶变异体的最佳pH在约4.5至约6.5的范围内，例如约4.5至约5.5。可单独使用α-淀粉酶变异体提供特异水解或与其它淀粉酶组合提供具有广谱活性的“鸡尾酒”。
被加工的淀粉为高度精制的淀粉质量，例如至少90％、至少95％、至少97％至少99.5％纯。或者，该淀粉可为包含由研磨全谷粒组成的材料的更粗的淀粉，包括非淀粉部分例如细菌残渣和纤维。研磨原材料例如全谷粒将其结构打开使得可进一步加工。有两种适当的研磨方法：湿研磨和干研磨。也可应用粗玉米粉或经研磨的粗玉米粉。干燥研磨的谷粒除淀粉外还包含大量的非淀粉碳水化合物。当通过喷射蒸煮加工这一非均匀的材料时通常只能达到部分淀粉凝胶化作用。因此，对未凝胶化的淀粉具有高活性的α-淀粉酶变异体可有利地应用于包含被喷射蒸煮的干燥研磨淀粉的液化作用和/或糖化作用的方法中。
在液化过程中具有优良水解活性的α-淀粉酶的变异体可有利增加糖化步骤的效率(见WO 98/22613)和糖化步骤中对葡萄糖淀粉酶的需求。葡萄糖淀粉酶的有利存在量不大于甚至小于0.5葡萄糖淀粉酶活力单位(AGU)/g DS(即，每克干固体的葡萄糖淀粉酶活力单位)。葡萄糖淀粉酶可衍生自曲霉属、踝节菌属、厚孢孔菌属或栓菌属菌株，示例性实例为黑曲霉(Aspergillus niger)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、瓣环栓菌(Trametes cingulata)或纸质大纹饰饱(Pachykytospora papyracea)。在一个实施方案中，该方法也包含WO 98/22613中所公开类型的碳水化合物-结合结构域的用途。
在另一方面，该过程包含在低于颗粒淀粉的起始凝胶化温度下水解凝胶化或颗粒淀粉的浆液，尤其是水解颗粒淀粉生成可溶性淀粉水解产物。除了与α-淀粉酶变异体接触外，该淀粉也可与选自真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)的一种或多种酶接触。在一个实施方案中可将其它另一种淀粉酶或脱支酶例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)加入α-淀粉酶变异体。
在一个实施方案中，在低于起始凝胶化温度的温度下进行该过程。通常在至少为30℃、至少31℃、至少32℃、至少33℃、至少34℃、至少35℃、至少36℃、至少37℃、至少38℃、至少39℃、至少40℃、至少41℃、至少42℃、至少43℃、至少44℃、至少45℃、至少46℃、至少47℃、至少48℃、至少49℃、至少50℃、至少51℃、至少52℃、至少53℃、至少54℃、至少55℃、至少56℃、至少57℃、至少58℃、至少59℃或至少60℃进行该过程。进行该过程的pH在约3.0至约7.0、约3.5至约6.0、或约4.0至约5.0的范围内。一方面预期包含例如用酵母发酵在约32℃(例如从30℃至35℃)的温度生产乙醇的方法。在另一方面，该方法包含同时进行糖化作用和例如在30℃至35℃，例如约32℃用酵母发酵生产乙醇或用其它适合发酵的生物体生产需要的有机化合物。在上述发酵过程中，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％或至少约16％乙醇。
用于上述任何方面的淀粉浆液含有约20％至55％的干固体颗粒淀粉、约25％至40％的干固体颗粒淀粉或约30％至35％的干固体颗粒淀粉。酶变异体将可溶性淀粉转化成含量为至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的颗粒淀粉的可溶性淀粉水解产物。
在另一个实施方案中，该α-淀粉酶变异体被用于凝胶化淀粉的液化或糖化过程中，包括但不限于用喷射蒸煮法凝胶化。该过程包括发酵生产发酵产物，例如乙醇。通过发酵从含淀粉材料生产乙醇的方法包括：(i)用α-淀粉酶变异体液化含淀粉材料；(ii)将所得液化麦芽浆糖化；以及(iii)在发酵生物体存在下将步骤(ii)得到的材料发酵。该方法任选进一步包括回收乙醇。可以同时糖化和发酵(SSF)过程进行该糖化和发酵过程。在发酵中，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％例如至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少15％或至少16％乙醇。
在上述方面被加工的淀粉可从块茎、根、茎、豆荚、谷类或全谷粒获得。更具体而言，所述颗粒淀粉可从玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、高粱、西米、木薯、树薯、高粱、水稻、豌豆、黄豆、橡胶或马铃薯获得。尤其预期糯和非糯型玉米和大麦。
如本文所使用，术语“液化作用”或“液化”指将淀粉转化成粘性更小并更短链的右旋糖的过程。一般而言，这一过程涉及在加入α-淀粉酶变异体同时或之后淀粉凝胶化。如本文所使用，术语“初级液化作用”指当浆液的温度升高至或接近其凝胶化温度的液化步骤。温度升高后，通过热交换器或喷射蒸煮器将浆液升高至90-150℃的温度，例如，100-110℃。应用了热交换或喷射蒸煮温度之后将浆液于该温度保持3-10分钟。这一保持浆液在90-150℃的步骤被称作初级液化作用。
如本文使用，术语“二次液化作用”指当浆液降低至室温时初级液化作用(加热至90-150℃)之后的液化步骤。该降温步骤可为30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。如本文所使用，术语“二次液化作用的分钟数”指从开始二次液化作用至测量葡萄糖当量经过的时间。
另一方面预期β-淀粉酶在包含α-淀粉酶变异体组合物中的其它用途。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)为外作用麦芽糖生成淀粉酶，其可催化1，4-α-糖苷键连接水解至直链淀粉、支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物，藉此释放麦芽糖。已从多种植物和微生物(Fogarty等，PROGRESS ININDUSTRIAL MICROBIOLOGY，第15卷，第112-115页，1979)中分离出β-淀粉酶。这些β-淀粉酶的特点为最佳温度在40℃至65℃的范围内，最佳pH在约4.5至约7.0的范围内。预期β-淀粉酶包括但是不限于来自barley
Figure A20078003052700791
BBA 1500、
Figure A20078003052700792
DBA、OptimaltTM ME、OptimaltTM BBA(Genencor International，Inc.)；和NovozymTM WBA(Novozymes A/S)的淀粉酶。
预期用于组合物中的另一种酶为葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。葡萄糖淀粉酶衍生自微生物或植物。例如葡萄糖淀粉酶可为真菌或细菌来源。示例性细菌葡萄糖淀粉酶为曲霉属葡萄糖淀粉酶，尤其是黑曲霉G1或G2葡萄糖淀粉酶(Boel等，(1984)，EMBO J.3(5)：1097-1102)或其变异体，如WO 92/00381和WO 00/04136所公开；泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉葡萄糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)：941-949)，或它们的变异体或片段。
其它预期曲霉属葡萄糖淀粉酶变异体包括热稳定性增强的变异体：G137A和G139A(Chen等，(1996)，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，(1995)，Prot.Eng.8：575-582)；N182(Chen等，(1994)，Biochem.J.301：275281)；双硫键，A246C(Fierobe等，(1996)，Biochemistry，35：8698-8704)；以及在A435位和S436位引入脯氨酸残基(Li等，(1997)Protein Eng.10：1199-1204)。其它预期的葡萄糖淀粉酶包括踝节菌属葡萄糖淀粉酶，尤其是衍生自埃默森篮状菌(WO99/28448)、T.leycettanus(美国专利第RE 32153号)、T.duponti或嗜热踝节菌(美国专利第458721号)者。预期的细菌葡萄糖淀粉酶包括来自梭菌属，尤其是C.thermoamylolyticum(EP 135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)的葡萄糖淀粉酶。适当的葡萄糖淀粉酶包括衍生自米曲霉(Aspergillus oryzae)的葡萄糖淀粉酶，例如与WO 00/04136中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的葡萄糖淀粉酶。商业葡萄糖淀粉酶也适用，例如AMG 200L、AMG 300L、SANTM SUPER和AMGTM E(Novozymes)、
Figure A20078003052700801
300(GenencorInternational，Inc.)、AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(from DSM)、G900(Enzyme Bio-Systems)以及
Figure A20078003052700803
G990ZR(黑曲霉葡萄糖淀粉酶并且蛋白酶含量低)。葡萄糖淀粉酶的加入量可为0.02-2.0AGU/g DS或0.1-1.0AGU/g DS，例如0.2AGU/g DS。
该组合物中可包括其它酶变异体。可单独使用两种或多种α-淀粉酶变异体或与本文讨论的其它酶组合。例如，第三种酶可为另一种α-淀粉酶，例如酵母α-淀粉酶，或另一种α-淀粉酶变异体。这些可为杆菌α-淀粉酶或非杆菌α-淀粉酶。
可任选加入的另一种酶为脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1，6-D-糖苷键分支连键并可通过异淀粉酶不能作用于支链淀粉以及通过异淀粉酶对α-极限糊精的有限作用将其与支链淀粉酶区分开来。可加入本领域技术人员熟知的有效量的脱支酶。
该方法产品的具体组合物取决于所应用酶的组合以及被加工的颗粒淀粉的类型。可溶性水解产物可为麦芽糖，纯度至少约85％、至少约90％、至少约95.0％、至少约95.5％、至少约96.0％、至少约96.5％、至少约97.0％、至少约97.5％、至少约98.0％、至少约98.5％、至少约99.0％或至少约99.5％。或者，该可溶性淀粉水解产物为葡萄糖或该淀粉水解产物具有至少94.5％、至少95.0％、至少95.5％、至少96.0％、至少96.5％、至少97.0％、至少97.5％、至少98.0％、至少98.5％、至少99.0％或至少99.5％的DE(总溶解干燥固体的葡萄糖百分比)。在一个实施方案中，生产冰激凌、蛋糕、糖果、水果罐头的方法使用包含葡萄糖、麦芽糖DP3和DPn混合物的专业糖浆。
两种研磨方法适用：湿研磨和干研磨。在干研磨中，将完整的核仁研磨并使用。湿研磨可很好地分离胚和粗粉(germ and meal)(淀粉颗粒和蛋白质)，通常在生产糖浆中使用该淀粉水解产物时使用。干研磨和湿研磨二者均为淀粉加工领域熟知也预期与公开的组合物和方法一起使用。该方法可在超滤系统中进行，其中在酶、生淀粉和水存在下再循环保持截留物，其中渗透物为可溶性淀粉水解产物。另一种方法为在具有超滤膜的连续膜反应器中进行，其中在酶、生淀粉和水存在下再循环保持截留物，其中渗透物为可溶性淀粉水解产物。也预期在具有微量过滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中在酶、生淀粉和水存在下再循环保持截留物，其中渗透物为可溶性淀粉水解产物。
在一方面，将该方法的可溶性淀粉水解产物转化成高果糖淀粉糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。可使用葡萄糖异构酶尤其是固定化在固体载体上的葡萄糖异构酶完成该转化。预期的异构酶包括商业产品
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IT(Novozymes A/S)；
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IMGI和
Figure A20078003052700813
G993、
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Figure A20078003052700815
G993、
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G993液体和
Figure A20078003052700817
IGI。
在另一方面，可溶性淀粉水解产物可用于生产燃料和可饮用乙醇。在第三个方面的方法中可同时或单独/依次进行发酵和颗粒淀粉糖浆的水解。当发酵与水解同时进行时，温度可在30℃和35℃之间，尤其31℃和34℃之间。该过程可在超滤系统中进行，其中在酶、生淀粉和水存在下再循环保持截留物，其中渗透物为包含液体的乙醇。也预期该过程在具有超滤膜的连续膜反应器中进行，其中在酶、生淀粉和水存在下再循环保持截留物，其中渗透物为包含液体的乙醇。
该方法中的可溶性淀粉水解产物可用于生产发酵产品，包括将已处理的淀粉发酵成发酵产品，例如柠檬酸、谷氨酸单钠盐、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸内酯或异抗坏血酸钠。
可使用马铃薯淀粉作为底物测定α-淀粉酶变异体的淀粉酶活性。该方法基于通过酶降解被修饰的马铃薯淀粉，该反应之后将淀粉/酶溶液试样与碘溶液混合。起初形成黑蓝色，但是在淀粉的降解中该蓝色变得越来越浅并逐渐转变成赤褐色，与有色玻璃标准对比。
乙醇生产
PS4变异体多肽可普遍用于转化淀粉生成可被进一步加工成乙醇或其它附加值产品例如高果糖玉米增甜剂的糖。因此，我们公开在乙醇尤其是生物乙醇(在本文件中应被认为是通过生物菌体发酵生产的任何乙醇)的生产中使用PS4变异体多肽。
所生产的乙醇可用作燃料或饮料或用于生产有机化合物例如柠檬酸、抗坏血酸、赖氨酸、谷氨酸的发酵过程中。下文中进行了详细描述。
乙醇(或乙基醇)是酒精饮料如烈酒、啤酒和葡萄酒最熟知的基础。此外，乙醇在生产工业化学品、药物和作为运输燃料中具有多种用途。
可从几乎任何包含糖或碳水化合物的原料生产乙醇。因此，可从多种生物材料中生产乙醇。用于生产乙醇的3类主要的生物原料包括糖料作物例如甘蔗；淀粉作物，包括小麦和玉米以及纤维素材料例如作物残体(稻草等)和林木废料。从易获取来源的纤维的乙醇生产可提供稳定，可更新的燃料资源。
最常用的加工技术为干谷粒研磨。在这一方法中，首先将谷粒研磨至谷粉的稠度(grain meal consistency)。然后将谷粉(meal)与水和淀粉酶混合并通过蒸煮器将谷粒中的淀粉液化。加入葡萄糖淀粉酶后已液化的淀粉被转化成可发酵的糖。然后向麦芽浆中加入酵母发酵糖生成乙醇。发酵后，麦芽浆通过蒸馏和脱水过程，其中从固体和水中去除醇。在实践中约三分之二的每吨谷粒被转化成燃料乙醇。剩余的副产物(稀薄的釜馏物和湿蒸馏谷粒)为高蛋白家畜饲料，其尤其适用于例如牛或羊这样的动物。
也可从含纤维素来源例如木质纸浆生产乙醇。以纤维素为基础的原料由农业废物、草和树木以及其它低价值生物体例如城市废物(例如回收纸、草木剪取物(yard clippings)等)组成。可从任何这些含纤维素的原料发酵生产乙醇。但是必须在转化成乙醇之前首先通过用适当的酶例如纤维素酶处理将纤维素转化成糖。
当乙醇离开加工厂之后，理论上它自身或以85比15的比例与汽油混合形成所谓的“干净乙醇燃料”可用作汽车燃料。然而在绝大多数情况下，乙醇与汽油以7至10％体积浓度比混合。乙醇可用作辛烷增值剂。乙醇作为燃料比石油衍生产品更环保。已知使用乙醇可提高空气质量并可能降低局部臭氧水平和烟雾。而且，使用乙醇代替汽油为缓冲不可再生能源和石油-化学品供应中的突然变化带来的影响的重要策略。
酿酒厂应用
乙醇(或乙基醇)是最为熟知的酒精饮料如烈性酒、啤酒和葡萄酒的基础。因此，本文描述的PS4变异体多肽可用于酿造尤其是酿造啤酒。所有的啤酒均使用基于简单配方的方法酿造。
酿造方法涉及使用发芽谷粒，这取决于当地通常使用的可为大麦、小麦或有时为黑麦。通过使谷粒发芽得到麦芽，然后在干燥器中干燥有时烘烤。发芽过程中产生数种酶，主要为α-淀粉酶和β-淀粉酶，其可用于转化谷粒中的淀粉生成糖。根据烘烤程度麦芽会呈现深色并大大影响啤酒的颜色和风味。
将麦芽粉碎以破裂谷粒核仁，增加它们的表面积并将小碎片从谷壳中分离出来。将所得麦芽与热水混合在“糖化桶(mash tun)”中用于进行被称作“淀粉糖化”的过程。在这一过程中，麦芽中的天然酶降解多数淀粉生成在发酵过程中发挥重要作用的糖。淀粉糖化通常进行1至2小时，这一时间中各种温度静置(rest)(等待期间)活化不同的酶，这取决于所使用麦芽的类型、其修饰水平和酿酒师傅的期望。这些酶的活性将谷粒淀粉转化成糊精，进而转化成可发酵糖例如麦芽糖。糖化桶一般包含有滤槽的“假底面”或其它形式歧管，其作为滤网使得液体和谷粒分离。
从120°F至130°F(49℃至55℃)的液化静置可活化多种蛋白酶，其降解蛋白质，否则该蛋白质会使啤酒变得浑浊。但是关键要小心，因为啤酒头也主要由蛋白质组成，如果蛋白质静置过度会产生无头啤酒。这一静置一般仅用于未修饰(即麦芽化不足)的麦芽(在德国和捷克共和国流行度日减)或用于未麦芽化的谷粒，例如玉米和大米(北美啤酒中广泛使用)。在60℃或140°F的糖化静置可活化β-葡聚糖酶，其可降解麦芽浆中的粘性β-葡聚糖，使糖在加工后期可自由流动。在现代淀粉糖化工艺中可加入商业真菌来源的β-葡聚糖酶作为添加剂。最后使用149至160°F(65至71℃)的糖化静置温度转化麦芽中的淀粉至糖，其之后在酿酒过程中被酵母利用。在温度范围较低一端进行后一次静置可产生更多的更易被酵母发酵的低级糖(low-order sugars)。这可进一步产生酒体更低并且醇含量更高的啤酒。接近温度范围高端的静置可产生更多较不易被酵母发酵的高级糖(higher-order sugar)，从而得到酒体更满但醇含量较低的啤酒。
淀粉糖化后在已知的过滤工艺中将所得液体与谷粒分离。在过滤前，将麦芽浆温度升高至165°F至170°F(约75℃)(称作糖化结束(mashout))使酶失活。将更多的水喷撒至谷粒以萃取更多的糖(这一过程被称作喷洒)。
这时的液体称作麦汁。将麦汁转移至被称作“煮沸锅(copper)”的大桶或罐(kettle)中，与酒花有时和其它成分例如草或糖一起煮沸。该煮沸过程可终止酶反应，沉淀蛋白、异构化酒花树脂、浓缩并消毒麦芽汁。酒花可增加啤酒的风味、芳香和苦味。在煮沸结束时，将加入酒花的麦汁在被称作“回旋槽(whirl-pool)”的容器中静止澄清然后将已澄清的麦汁冷却。
然后将麦芽转移至“发酵罐”中，向其中加入酵母或用酵母“调节(pitched)”。经过被称作糖酵解的过程，酵母转化麦芽中的糖形成醇、二氧化碳和其它组分。一周至三周后，将新鲜(或“绿色”)啤酒流至调节罐。在调节罐中停留一周至数月后通常将啤酒过滤除去酵母和颗粒物。该“清(啤)酒”就可以饮用或包装了。
因此在酿酒过程的任何阶段可加入本文描述的一种或多种PS4变异体多肽补充天然产生的淀粉酶活性。
饲料应用
在一个实施方案中，该PS4变异体多肽可降解抗性淀粉。
如本文所使用术语“降解”指部分或完全水解或降解抗性淀粉生成葡萄糖和/或寡糖，例如麦芽糖和/或糊精。
该PS4变异体多肽可降解不能被动物淀粉酶完全降解的残留抗性淀粉。举例而言，PS4变异体多肽可辅助动物淀粉酶(例如胰淀粉酶)提高对抗性淀粉的降解。胰α-淀粉酶由动物的消化系统分泌。胰α-淀粉酶降解食物中的淀粉。但是，一部分淀粉即抗性淀粉不能被胰α-淀粉酶完全降解，因此不能在小肠中吸收(见抗性淀粉的定义)。一些实施方案中的PS4变异体多肽也可辅助消化系统中胰α-淀粉酶对淀粉的降解并因此增加动物对淀粉的利用。
可通过例如Megazyme International Ireland Ltd研发并公开的方法分析酶降解抗性淀粉的能力以测定试样的抗性淀粉、可溶性淀粉和总淀粉含量(抗性淀粉测定方法，AOAC Method 2002.02，AACCMethod 32-40)。
因此，动物可摄入PS4变异体多肽用于有利目的并因此可加入动物饲料中。
因此我们公开使用PS4变异体多肽作为用于含淀粉饲料的组分或用于饲料改善组合物中，其中PS4变异体多肽可降解抗性淀粉。我们也公开包含淀粉和PS4变异体多肽的饲料。我们进一步公开降解饲料中抗性淀粉的方法，其包括将所述抗性淀粉与PS4变异体多肽接触。
我们进一步描述在制备包含淀粉的饲料中使用PS4变异体多肽降解抗性淀粉。此外，我们公开了在饲料制备中使用PS4变异体多肽以提高所述饲料的卡值。我们公开了在饲料制备中使用酶以提高动物性能。在进一步的实施方案中，我们描述了制备饲料的方法，其包括将淀粉与PS4变异体多肽酶混合。
举例而言，使用包含PS4变异体多肽并可降解抗性淀粉的组分是有利的，因为动物中淀粉和/或淀粉降解产物的可消化性显著增加。此外，这一使用是有利的，因为其可提供增强通过动物从饲料衍生能量的方法。而且，这一使用是有利的因为其可提供增强抗性淀粉生物利用度的方法。
动物饲料
PS4变异体多肽适用的动物饲料可配制成满足特殊动物群具体需求并提供必需的可被动物代谢的碳水化合物、脂肪、蛋白质和其它营养素。
该动物饲料优选用于猪或家禽的饲料。
如本文所使用术语“猪”指非-反刍杂食动物例如猪、猪(hog)或野猪。通常，猪饲料包括约50％碳水化合物、约20％蛋白质和约5％脂肪。高能量猪饲料的一个实例以玉米为基础，经常与饲料添加剂例如蛋白质、矿物质、维生素和氨基酸如赖氨酸和色氨酸组合。猪饲料的实例包括动物蛋白产品、海产品、奶制品、谷物产品和植物蛋白产品，所有这些均可进一步包含天然调味料、人工调味料、微量和巨量矿物、动物脂肪、植物脂肪、维生素、防腐剂或药物例如抗生素。
应当理解的是在本说明书包括权利要求中当提及“猪饲料”时指包括“过渡”或“幼雏”饲料(用于断奶小猪)和“肥育”或“生长”饲料(在过渡饲料之后用于猪生长至可出售的年龄和/或大小)。
如本文所使用术语“家禽”指家禽，例如小鸡、肉鸡、母鸡、公鸡、阉鸡、火鸡、鸭子、猎禽、小母鸡或小鸡。家禽饲料可指“完全”饲料，因为它们包含适于生长、产蛋以及鸟类健康必需的所有蛋白质、能量、维生素、矿物质和其它营养素。但是家禽饲料可进一步包含维生素、矿物质或药物例如抗球虫药(例如莫能星钠、拉沙洛西、安普罗铵、沙利霉素和磺胺喹沙啉)和/或抗生素(例如青霉素、杆菌肽、金霉素和土霉素)。
用于产肉的小鸡或肉鸡、火鸡和鸭子与用于产蛋的小母鸡饲养方法不同。肉鸡、鸭子和火鸡比产蛋型鸡的体型更大并且增重更快。因此用含有更高蛋白质和能量水平的食物饲养这些鸟类。
应当理解的是在本说明书包括权利要求中当体积“家禽饲料”时指包括“幼雏”饲料(孵化后)、“肥育”、“生长”或“发育”饲料(从6-8周至达到可屠宰体积)和“产蛋”饲料(在产蛋期间饲养)。
动物饲料应配制成满足例如产肉、产奶、产蛋、繁殖以及应激反应的动物营养需求。此外，动物饲料可配制成提高粪肥质量。
在优选方面，该动物饲料包含原材料，例如豆类，如豌豆或大豆，或谷类，例如小麦、玉米(玉蜀黍)、黑麦或燕麦。该原料可适当为马铃薯。
饲料原料
可通过将PS4变异体多肽单独或与其它成分例如食物成分组合直接或间接应用至饲料，将PS4变异体多肽用于动物消耗的饲料。
典型的食物成分包括任何一种或多种添加剂，例如动物或植物脂肪，天然或合成调味品、抗氧化剂、粘度调节剂、精油和/或香料、染料和/或着色剂、维生素、矿物质、天然和/或非天然氨基酸、营养素、附加酶(包括基因改造的酶)、粘合剂例如瓜尔胶或黄原胶，缓冲剂、乳化剂、润滑剂、佐剂、混悬剂、防腐剂、包衣剂或增溶剂等。
应用方法的实例包括但不限于用包含PS4变异体多肽的材料包裹饲料，将PS4变异体多肽喷洒至饲料表面或将饲料浸渍至PS4变异体多肽的制剂中。
优选通过将其与饲料混合或通过喷洒至动物消耗的饲料颗粒上应用PS4变异体多肽。或者，可将PS4变异体多肽包括在饲料的乳液中或通过注射或滚流包含在固体产品内部。
该PS4变异体多肽可用于分散、包裹和/或浸渍饲料。也可使用与其它成分的混合物并可单独、同时或依次使用。螯合剂、粘合剂、乳化剂和其它附加剂例如微量和巨量矿物质、氨基酸、维生素、动物脂肪、植物脂肪、防腐剂、香料、着色剂也可相似地同时(混合或单独)或依次应用至饲料。
PS4变异体多肽的量
PS4变异体多肽的最佳用量取决于被处理的饲料和/或饲料与该PS4变异体多肽接触的方法和/或其预期用途。PS4变异体多肽的量应为在摄取之后和饲料的消化中足够有效大量降解抗性淀粉的量。
在动物消耗饲料摄入之后和饲料的消化期间直至获得更完整的饲料摄入(例如该饲料释放更多的卡值)PS4变异体多肽可保持有效是有利的。
淀粉酶组合
我们特别公开了PS4变异体多肽与淀粉酶尤其是麦芽糖生成淀粉酶的组合。麦芽糖生成α-淀粉酶(葡聚糖1，4-a-麦芽糖水解酶E.C.3.2.1.133)可水解淀粉酶和支链淀粉至α-构型的麦芽糖。
可购买商品名为Novamyl(Novo Nordisk A/S，Denmark)的产品获得来自杆菌的麦芽糖生成α-淀粉酶，由于可降低淀粉凝沉其广泛应用于烘焙工业作为抗老化剂。国际专利出版物WO 91/04669详细描述了Novamyl。该麦芽糖生成α-淀粉酶Novamyl与环糊精、葡聚糖转移酶(CGT酶)具有数个相同的特点，包括序列同源性(Henrissat B，Bairoch A；Biochem.J.，316，695-696(1996))和形成转糖苷作用产物(Christophersen，C等，1997，Starch，第50卷，No.1，39-45)。
在非常优选的实施方案中，我们公开了包含PS4变异体多肽与Novamyl或其任何变异体的组合。这些组合可用于食品生产例如烘焙。Novamyl可具体包含Novamyl 1500MG。
描述Novamyl及其用途的其它文件包括Christophersen，C.，Pedersen，S.和Christensen，T.，(1993)生产麦芽糖和极限糊精的方法，该极限糊精及该极限糊精的用途(Method for production of maltose ana limit dextrin，the limit dextrin，and use of the limit dextrin)，Denmark和WO 95/10627。美国专利第4598048号和美国专利4604355号中有进一步描述。这些文件均以参考形式并于本文，其中描述的任何Novamyl多肽可与本文描述的PS4变异体多肽组合。
Novamyl的变异体、同源物和突变体可用于该组合，只要它们保留α淀粉酶活性。例如，美国专利6162628中公开的任何Novamyl变异体(其完整公开内容以参考形式并于本文)可与本文描述的PS4变异体多肽组合使用。具体而言，可使用该文件中描述的任何多肽尤其是美国专利第6162628号对应于以下一个或多个位点的SEQ IDNO：1变异体：Q13、I16、D17、N26、N28、P29、A30、S32、Y33、G34、L35、K40、M45、P73、V74、D76N77、D79、N86、R95、N99、I100、H103、Q119、N120、N131、S141、T142、A148、N152、A163、H169、N171、G172、I174、N176、N187、F188、A192、Q201、N203、H220、N234、G236、Q247、K249、D261、N266、L268、R272、N275、N276、V279、N280、V281、D285、N287、F297、Q299、N305、K316、N320、L321、N327、A341、N342、A348、Q365、N371、N375、M378、G397、A381、F389、N401、A403、K425、N436、S442、N454、N468、N474、S479、A483、A486、V487、S493、T494、S495、A496、S497、A498、Q500、N507、I510、N513、K520、Q526、A555、A564、S573、N575、Q581、S583、F586、K589、N595、G618、N621、Q624、A629、F636、K645、N664和/或T681。
氨基酸序列
本发明利用PS4变异体核酸，本发明方法和组合物涵盖该PS4变异体核酸的氨基酸序列。
如本文所使用，术语“氨基酸序列”是术语“多肽”和/或术语“蛋白质”的同义词。在一些情况下，术语“氨基酸序列”是术语“肽”的同义词。在一些情况下，术语“氨基酸序列”是术语“酶”的同义词。
可从适当来源制备/分离氨基酸序列，或合成或使用重组DNA技术制备。
本文描述的PS4变异体酶可与其它酶结合。因此我们进一步公开酶组合，其中该组合包含本文所述的PS4变异体多肽酶，其自身可为另一种PS4变异体多肽酶。
PS4变异体核苷酸序列
如上所述，我们公开编码具有所述特异性质的PS4变异体酶的核苷酸序列。
如本文所使用术语“核苷酸序列”或“核酸序列”指寡核苷酸序列或多聚核苷酸序列及它们的变异体、同源物、片段和衍生物(如它们的部分)。核苷酸序列可为基因组或合成或重组来源，其可为双链或代表正义或反义链的单链。
如本文件所使用术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。其优选为DNA，更优选编码PS4变异体多肽的cDNA。
通常可使用重组DNA技术(例如重组DNA)制备该PS4变异体核苷酸序列。但是，在可选择的实施方案中，该核苷酸序列可为使用本领域熟知的化学方法全合成或半合成(见Caruthers MH等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等，(1980)Nuc Acids ResSymp Ser 225-232)。
制备核酸序列
可从生产所述酶的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化编码具有本文定义的特异性质的酶(例如PS4变异体多肽)或适于修饰的酶的核苷酸序列。本领域熟知核苷酸序列鉴定和/或分离和/或纯化的多种方法。举例而言，一旦鉴定和/或分离和/或纯化出适当的序列则可使用PCR扩增技术制备更多的序列。
进一步举例而言，可使用来自生产该酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA。如果已知酶的氨基酸序列或部分氨基酸序列，可合成被标记的寡核苷酸探针用于鉴定从生物体制备的基因组文库中的酶编码克隆。在后一情况下，使用较低严格度的杂交和洗脱条件。
或者，可通过以下方式鉴定酶编码克隆：向表达载体例如质粒中插入基因组DNA、用所得基因组DNA文库转化酶-阴性细菌、然后将转化细菌转移至含有酶底物(例如麦芽糖)的琼脂板上藉此使得表达酶的克隆可被鉴定。
在其它备选中，可通过已建立的标准方法合成制备编码酶的核苷酸序列，例如Beucage S.L等，(1981)Tetrahedron Letters 22，第1859-1869页描述的亚磷酰胺(phosphoroamidite)方法或Matthes等，(1984)EMBO J.3，第801-805页描述的方法。在亚磷酰胺方法中，合成寡聚核苷酸(例如在自动DNA合成仪中)、纯化、退火、连接并克隆至适当的载体。
该核苷酸序列可为根据标准技术通过连接合成的、基因组的或cDNA来源(适当的)的混合基因组和合成来源、混合合成和cDNA来源或混合基因组和cDNA来源。各连接片段对应于完整核苷酸序列的多个部分。也可如美国专利4683202和Saiki R K等，(Science(1988)239，第487-491页)所述使用特异引物通过聚合酶链式反应(CR)制备DNA序列。
变异体/同源物/衍生物
我们进一步描述了酶的任何氨基酸序列或任何编码这种酶(例如PS4变异体多肽)的核苷酸序列或PS4变异体核酸的变异体、同源物和衍生物。除非本文另外指明，术语“PS4变异体核酸”应包括以下描述的各核酸实体，术语“PS4变异体多肽”应相似的包括以下描述的多肽或氨基酸实体。
本文中术语“同源物”指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。本文中术语“同源性”可与“同一性”等同。
在本文中，同源序列意指包括与主题序列至少75、80、85或90％相同，优选至少95、96、97、98或99％相同的氨基酸序列。同源物通常与主题氨基酸序列包含相同的活性位点等。虽然同源性也可理解为相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，在本文件中其更优选以序列同一性表示同源性。
在本文中同源序列意指包括与编码PS4变异体多肽酶(例如PS4变异体核酸)的核苷酸序列具有至少75、80、85或90％相同，优选至少95、96、97、98或99％相同的核苷酸序列。通常同源物包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。虽然同源性也可理解为相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，在本文件中其更优选以序列同一性表示同源性。
可通过观察或更通常在已可用的序列比对软件的辅助下进行同源性比对。这些可商业购买的计算机软件可计算两个或多个序列之间的％同源性。
可对毗邻序列(即一个序列和另一个序列对齐)计算％同源性并且一个序列中的各氨基酸与另一序列中的对应氨基酸直接对比，每次一个残基。这被称作“无空位”比对。通常仅在数量相对较短的残基中进行该无空位比对。
虽然这是一种非常简单和一致的方法，但是它没有考虑到一个事实，即在原本相同的碱基对中，插入或缺失将之后的氨基酸残基置于比对之外，因此在进行全局比对时可能引起％同源性的大幅降低。因此，绝大多数的序列比对方法均设计为可考虑可能的插入和缺失而不会不适当地降低整体同源性分数可产生最佳比对。通过在序列比对中插入“空位”以最大化局部同源性做到这一点。
但是，这些更复杂的方法对比对中出现的各空位分配“空位罚分”，这样对于相同数量的相同氨基酸而言，空位尽可能少的序列比对-反应两个对比序列之间的更高相关性-将比具有许多空位的比对分数更高。通常用“仿射空位成本(Affine gap costs)”对空位的存在进行相对较高的罚分，对空位中的后续序列进行较小的罚分。这是最常用的空位评分体系。绝大多数比对程序允许改变空位罚分。但是在使用这类软件用于序列对比时优选使用缺省值。例如当使用GCG GCGWisconsin Bestfit软件包时对氨基酸序列的空位罚分为空位-12，延伸-4。
因此最大％同源性的计算优先需要产生考虑到空位罚分的最佳比对。用于进行这类比对的适合的计算机程序为GCG WisconsinBestfit软件包(Devereux等，1984Nuc.Acids Research 12p387)。可进行序列比对的其它软件的实例包括但是不限于BLAST软件包(见Ausubel等，1999 Short Protocols in Molecular Biology，4th Ed-Chapter18)、FASTA(Altschul et al.，1990 J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比对工具组。BLAST和FASTA二者可脱机和在线搜索(见Ausubel等，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第7-58至7-60组)。
但是对于一些应用优选使用GCG Bestfit程序。一种称作BLAST2Sequence的新工具也可用于对比蛋白质和核苷酸序列(见FEMSMicrobiol Lett 1999174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
虽然可以同一性测量终％同源性，但是该比对过程本身通常不以全或无配对比较为基础。而是普遍使用标度相似性分数矩阵(scaledsimilarity score matrix)，其根据化学相似性或进化距离给各成对的对比评分。普遍使用的该类矩阵的实例为BLOSUM62矩阵-BLAST程序组的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用缺省值或如果提供的话使用自定义符号对比(更多详细内容见使用说明)。对于一些应用优选使用CGC软件包的公用缺省值，或在使用其它软件时使用缺省矩阵，例如BLOSUM62。
或者，可使用多重比对计算同源性百分比，例如以算法为基础的DNASISTM(Hitachi Software)，CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的类似物。
当该软件产生最佳比对时可计算％同源性，优选％序列同一性。该软件通常以序列对比的一部分进行该计算并生成数字结果。
该序列也可具有氨基酸残基的缺失、插入或替换，它们可产生沉默突变并得到功能相等物质。可在氨基酸性质(例如残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性)相似性的基础上进行刻意的氨基酸替换，因此其可用于以功能基团将氨基酸分类。可仅根据氨基酸的侧链将其分类。但如果包括突变数据则更有用。如此衍生的氨基酸组很可能是结构保守的。以Venn图表(Livingstone C.D.和Barton G.J.(1993)“蛋白质序列比对：残基保守性等级分析策略”(“Protein sequence alignments：a strategy for the hierarchical analysis ofresidue conservation”)Comput.Appl Biosci.9：745-756)(Taylor W.R.(1986)“氨基酸保守性的分类”(“The classification of amino acidconservation”)J.Theor.Biol.119；205-218)的形式描述这些组。例如可根据描述了被普遍接受的Venn图氨基酸分类的下表进行保守替换。
Figure A20078003052700951
我们进一步公开了包含可能发生同源替换(替换和置换二者用于本文中指现有氨基酸残基与可选择残基的交换)的序列，即相似替换，例如碱性替换碱性、酸性替换酸性、极性替换极性等。也可发生非同源替换，即从一组残基至另外一组或涉及包含非天然氨基酸例如鸟氨酸(下文中表示为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文中表示为B)、原亮氨酸鸟氨酸(下文中表示为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
变异体氨基酸序列可包括插入序列的任何两个氨基酸残基之间的合适的接头基团包括除氨基酸接头例如甘氨酸或β-甘氨酸残基之外的烷基基团例如甲基乙基或丙基基团。其它涉及类肽形式中一个或多个氨基酸残基存在的变异体形式为本领域技术人员已知。为避免疑问，“类肽形式”用于指变异体氨基酸残基，其中α-碳取代基团在残基的氮原子上而不是α-碳上。制备类肽形式的肽的方法为本领域已知，例如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
本文描述的并适用于本文所述方法和组合物的核苷酸序列(例如PS4变异体核酸)可在其中包括合成或经修饰的核苷酸。对寡聚核苷酸的多种不同类型的修饰为本领域已知。这些包括甲基膦酸酯和磷硫酰主链和/或在分子的3′和/或5′端加入吖啶或多聚赖氨酸链。对于本发明目的而言，应理解的是可通过本领域可用的方法修饰本文描述的核苷酸序列。可进行这些修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。
我们进一步描述了与本文所述序列互补的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。如果该序列与其片段互补那么该序列可用做鉴定其它生物体中相似编码序列的探针。
可通过许多方法获得与PS4变异体序列非100％同源的多聚核苷酸。例如可通过探针检测来自一定范围个体(例如来自不同种群的个体)的DNA文库获得本文所述序列的其它变异体。此外可获得其它同源物并且这些同源物及它们的片段可与本文序列表中所示的序列选择性杂交。可通过探针检测来自其它物种的cDNA文库或基因组DNA文库以及在中等或高严格度条件下用包含附加序列表中任一序列的全部或部分的探针检测这些文库获得这些序列。相似的方法用于获得本文所述多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位变异体。
可使用简并PCR(其使用设计成靶向编码保守氨基酸序列的变异体和同源物中的目标序列的引物)获得变异体和/或菌株/种同源物。可通过例如比对来自数个变异体/同源物的氨基酸序列预测保守序列。可使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如GCGWisconsin PileUp程序被广泛使用。
简并PCR中使用的引物包含一个或多个简并位点并在比用于用已知序列的单个序列引物克隆序列更低的严格条件下使用。
或者，可通过对特征序列的定向突变获得这些多聚核苷酸。这可用于例如需要沉默密码子序列变化以优化表达该多聚核苷酸序列的具体宿主细胞的密码子偏好的情况下。也需要其它的序列变化以引入限制性酶识别位点或改变由该多聚核苷酸编码的多肽的性质或功能。
本文描述的多聚核苷酸(核苷酸序列)例如PS4变异体核酸可用于生产引物，例如PCR引物，用于备择性扩增反应的引物，探针，例如通过常规方法使用放射性或非放射性标记用揭示标记物(revealinglabel)标记的探针或该多聚核苷酸可克隆至载体中。这些引物、探针和其它片段至少为15优选至少20，例如至少25、30或40个核苷酸的长度，也涵盖于术语多聚核苷酸中。
可通过重组、合成或本领域技术人员可使用的任何方法生产多聚核苷酸例如DNA多聚核苷酸和探针。也可通过标准技术将它们克隆。一般而言，通过合成方法制备引物，涉及分步方法生产所需要的核苷酸序列，每次一个核苷酸。使用自动化技术完成这一任务的技术为本领域可用。
使用重组方法例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术可生产更长的多聚核苷酸。这些引物被设计成包含适当限制性酶识别位点这样可将扩增的DNA克隆至适当的载体中。变异体序列等优选至少与本文所述序列一样具有生物活性。
如本文所使用“生物活性”指与天然序列具有相似结构功能(但不一定是相同程度)和/或调节功能(但不一定是相同程度)和/或相似的生物化学功能(但不一定是相同程度)的序列。
杂交
我们进一步描述了与PS4变异体的核酸序列互补的序列，或能与PS4变异体序列或与其互补的序列杂交的序列。
本文使用的术语“杂交”包括“核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”以及如聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。因此，我们公开了可与本文所述序列互补的序列杂交的核苷酸序列及其衍生物、片段或衍生物的用途。
术语“变异体”也涵盖可与本文所述核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
术语“变异体”优选涵盖在严格条件下(例如，50℃、0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})可与本文所述核苷酸序列杂交的序列互补的序列。术语“变异体”更优选涵盖在高严格度条件下(例如，65℃，0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})可与本文所述核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
我们进一步公开可与PS4变异体(包括本文所述者的互补序列)杂交的核苷酸序列以及与可与PS4变异体(包括本文所述者的互补序列)杂交的序列互补的核苷酸序列。我们进一步描述了可在中等至最高严格度条件下与本文所述核苷酸序列杂交的多聚核苷酸序列。
在优选的方面，我们公开了可在严格条件下(例如，50℃和0.2xSSC)与PS4变异体核酸的核苷酸序列或它们的互补序列杂交的核苷酸序列。更优选这些核苷酸序列可在高度严格条件下(例如65℃和0.1xSSC)与PS4变异体的核苷酸序列或它们的互补序列杂交。
定向突变
一旦分离了酶编码核苷酸序列或鉴定出假定的酶编码核苷酸序列就可能需要突变该序列以制备酶。因此，可从母体序列制备PS4变异体序列。可使用合成寡聚核苷酸引入突变。这些寡聚核苷酸包含侧接所需突变位点的核苷酸序列。
Morinaga等，(Biotechnology(1984)2，第646-649页)描述了适当的方法。Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，第147-151页)描述了向酶编码核苷酸序列中引入突变的另一种方法。Sarkar和Sommer(Biotechniques(1990)，8，第404-407页-“Themegaprimer method of site directed mutagenesis”)描述了又一种方法。
在一方面，用于本文所述方法和组合物的序列为重组序列-即，使用重组DNA技术制备的序列。这些重组DNA技术在本领域普通技术人员的能力之内。在参考文献例如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，SecondEdition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述了这些技术。
在一方面，用于本文所述方法和组合物的序列为合成序列-即，通过体内化学或酶合成制备的序列。它包括但不限于用宿主生物体最佳密码子使用制备的序列例如甲醇营养型酵母毕赤酵母属和汉森氏酵母属。
用于本文所述方法和组合物的核苷酸序列可整合入重组可复制载体中。该载体可用于在和/或从相容宿主细胞中以酶形式复制和表达该核苷酸序列。可使用控制序列，例如调控序列控制表达。由宿主重组细胞通过表达该核苷酸序列生产的酶可分泌或包含在细胞内，取决于所用序列和/或载体。该编码序列可设计成具有信号序列，其可引导物质编码序列从具体真核或原核细胞膜分泌。
PS4核酸和多肽的表达
PS4多聚核苷酸和核酸包括合成或天然来源的DNA和RNA二者，其DNA或RNA可包含经修饰或未经修饰的脱氧或双脱氧核苷酸或核糖核酸或其类似物。该PS4核酸可以单或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链或RNA/DNA共聚物的形式存在，其中术语“共聚物”指包含核糖核酸和脱氧核糖核酸二者的单核酸链。PS4核酸甚至可经密码子优化用于进一步增强表达。
如本文所使用术语“合成的”定义为由体内化学或酶合成生产。它包括但不限于用宿主生物体(例如甲醇营养型酵母毕赤酵母属和汉森氏酵母属)最优密码子使用制备的PS4核酸。
多聚核苷酸，例如本文所述PS4变异体多聚核苷酸，可整合入重组可复制载体中。该载体可用于在相容的宿主细胞中复制核酸。将包含多聚核苷酸序列的载体转化入适当的宿主细胞。适当的宿主包括细菌、酵母、昆虫和真菌细胞。
术语“转化细胞”包括使用重组DNA技术被转化的细胞。通常通过向被转化的细胞中插入一个或多个核苷酸序列发生转化。所插入的核苷酸序列可为异源核苷酸序列(即对被转化细胞而言是非天然的序列)。此外或可选择的，所插入的核苷酸序列可为同源核苷酸序列(即对被转化细胞而言是天然的序列)，这样该细胞接受其中已存在的核苷酸序列的一个或多个拷贝。
因此，在进一步的实施方案中，我们提供通过向可复制的载体中引入多聚核苷酸，将该载体引入相容的宿主细胞并在可产生载体复制的条件下使宿主细胞生长制备PS4变异体多肽和多聚核苷酸。可从宿主细胞中回收该载体。
表达构建体
该PS4核酸可与在相关宿主细胞中具有活性的转录和翻译调控元件可操作地连接。该PS4核酸也可编码包含信号序列的融合蛋白，例如衍生自大麦进行酵母菌(Schwanniomyces occidentalis)的葡萄糖淀粉酶基因、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子交配型基因和米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA-淀粉酶的信号序列。或者，该PS4核酸可编码包含膜结合结构域的融合蛋白。
表达载体
可使用表达载体在宿主生物体中以需要的水平表达PS4核酸。
包含PS4核酸的表达载体为可在所选宿主生物体中表达编码PS4核酸基因的任何载体，载体的选择取决于其被引入的宿主细胞。因此，该载体可为自动复制载体，即可作为游离基因实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、噬菌体或游离基因元件、微型染色体或人工染色体。或者，该载体可为当引入宿主细胞时整合入宿主细胞基因组并与基因组一起复制的载体。
表达载体的组分
表达载体通常包括克隆载体的组分，例如允许载体在所选宿主生物体中自动复制的元件以及一个或多个用于筛选目的的表型检测标记。表达载体通常包含编码启动子、操作子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选阻遏基因或一个或多个激活物基因的控制核苷酸序列。此外，该表达载体可包含编码将PS4变异体多肽靶向至宿主细胞器例如过氧化物酶体或具体宿主细胞区室的氨基酸序列的序列。该靶向序列包括但不限于SKL序列。在本文中，术语“表达信号”包括任何上述控制序列、阻遏基因或激活物序列。对于控制序列引导下的表达，PS4变异体多肽的核酸序列以适当的方式与控制序列可操作地连接。
载体中的多聚核苷酸优选与可通过宿主细胞提供编码序列表达的控制序列可操作地连接，即该载体为表达载体。术语“可操作地连接”指所述组分之间的关系允许它们以预期方式发挥功能。与编码序列“可操作的连接的”调控序列以在与控制序列相容的条件下完成编码序列表达的方式连接。
可通过例如加入其它转录调控元件修饰控制序列使得控制序列引导的转录水平对转录调节子的反应性更强。该控制序列可尤其包含启动子。
启动子
在载体中，编码PS4变异体多肽的核酸序列与适当的启动子序列可操作地结合。该启动子可为在所选宿主生物体中具有转录活性的任何DNA序列并可衍生自与宿主生物体同源或异源的基因。
细菌启动子
用于引导经修饰的核苷酸序列例如PS4变异体核酸在细菌宿主中的转录的适当启动子的实例包括大肠杆菌lac操作子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因dagA启动子、藓样芽胞杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽胞杆菌麦芽糖生成淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子、枯草芽孢杆菌aprE基因的启动子以及衍生自乳球菌属-衍生启动子包括P170启动子的启动子。当编码PS4变异体多肽的基因在细菌种例如大肠杆菌中表达时可从噬菌体启动子包括T7启动子和噬菌体λ启动子中选择适当的启动子。
真菌启动子
对于真菌种的转录，可用启动子的实例为衍生自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性脂肪酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶的启动子。
酵母启动子
用于酵母种中表达的适当启动子的实例包括但不限于酿酒酵母的Gal 1和Gal 10启动子以及毕赤酵母的AOX1或AOX2启动子。
宿主生物体
(I)细菌宿主生物体
适当的细菌宿主生物体实施例为革兰氏阳性细菌属，例如芽孢杆菌包括克劳氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、迟缓芽胞杆菌、短芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、灿烂芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌和苏芸金芽胞杆菌，链霉菌属例如鼠灰链霉菌，乳酸细菌属包括乳球菌属例如乳酸乳球菌，乳酸菌属包括罗伊乳杆菌、明串珠菌属、片球菌属和链球菌属。或者，可选择属于肠杆菌科包括大肠杆菌或属于假单胞菌科的革兰氏阴性细菌属菌株作为宿主生物体。
(II)酵母宿主生物体
合适的酵母宿主生物体可选自生物技术相关酵母属，例如但不限于酵母属如毕赤酵母属、汉森酵母属或克鲁维酵母属、耶氏酵母属或酵母菌属包括酿酒酵母或属于裂殖酵母属例如稷酒酵母菌。
优选使用甲醇营养型酵母属的毕赤酵母属菌种作为宿主生物体。优选宿主生物体为汉森酵母属。
(III)真菌宿主生物体
丝状真菌中合适的宿主生物体包括曲霉属，例如黑曲霉、米曲霉、Aspergillus tubigensis、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。或者，梭霉菌属菌种例如尖孢镰刀菌，或根毛菌属例如米赫根毛霉可用作宿主生物体。其它合适的菌种包括嗜热丝孢菌和毛霉属。
合适的真菌宿主生物体还包括木霉属(特别是里氏木霉(Trichoderma reesei)曾名长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)；也称为瑞氏木霉(Hypocrea jecorina))。
蛋白质表达和纯化
包含多聚核苷酸的宿主细胞可用于表达多肽，例如变异体PS4多肽或其片段、同源物、变异体或衍生物。可在合适的允许蛋白质表达的条件下培养宿主细胞。多肽表达可为组成型这样它们可以持续表达，或为诱导型，需要刺激以起始表达。在诱导表达的情况下，在需要例如向培养基加入诱导物质(例如地塞米松或IPTG)时起始蛋白质表达。
可通过多种领域内已知技术从宿主细胞中提取多肽，包括酶法、化学法和/或渗透性溶解和物理破碎。也可在体外非细胞体系中重组表达，例如TnTTM(Promega)兔网织红细胞系统。
实施例
实施例1.PS4克隆
将嗜糖假单胞菌在LB培养基上培养过夜，用标准方法(Sambrook J，1989)分离染色体DNA。使用引物P1和P2(见表3)通过PCR从嗜糖假单胞菌染色体DNA中扩增包含PS4开放阅读框(Zhou等，1989)的2190bp片段。所得片段用作以P3和P4为引物的巢式PCR中的模板，扩增不含信号序列的PS4开放阅读框，并在该基因的5’端引入NcoI位点、在3’端引入BamHI位点。与NcoI位点一起引入N-端蛋氨酸密码子，使得可细胞内表达PS4。将1605bp片段克隆至pCRBLUNT TOPO(Invitrogen)，并用测序分析构建体的完整性。修饰大肠杆菌穿梭载体pDP66K(Penninga等，1996)使得在P32启动子和ctgase信号序列控制下表达PS4。将所得质粒pCSmta转化入枯草芽孢杆菌。
制备第二个表达构建体，其中去除了PS4的淀粉结合结构域。以P3和P6(表3)为引物在pCSmta上进行PCR，生成了mta基因的截短形式。将pCSmta中的全长mta基因与质粒pCSmta-SBD中所得截短形式交换。
实施例2.PS4定向诱变
可用两种方法将突变引入mta基因。可用以两步PCR为基础的方法，或用快速交换方法(QE)。为方便起见，将mta基因分裂为3部分：PvuI-FspI片段、FspI-PstI片段和PstI-AspI片段，以下分别简称片段1、2和3。
在以两步PCR为基础的方法中，用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)引入突变。用编码链的诱变引物(表4)和下链下游上的引物(2R或3R，表3)进行第一次PCR。反应产物与编码链上游的引物一起用作第二步PCR的引物。将上一反应的产物克隆至pCRBLUNT topo(Invitrogen)，并在测序后将该片段与pCSmta中相应片段交换。
采用快速交换方法(Stratagene)，使用PCR中两条互补的引物在包含mta基因或部分mta基因的质粒上引入突变。
为达到此目的，构建了一系列适当的质粒，包含3SDM质粒和3pCSΔ质粒。每个SDM质粒带有上述mta基因的1个片段，其中所需突变用QE引入。在测序验证之后，将片段克隆至相应受体的pCSΔ质粒中。pCSΔ质粒是pCSmta的非活性衍生物。从SDM质粒克隆相应片段以恢复活性，使得易于筛选。
表3.克隆mta基因所用引物，2步PCR方法中构建定向诱变体所用标准引物。
引物 引物序列 引入位点
  P1   5′-ATG ACG AGG TCC TTG TTT TTC
  P2   5′-CGC TAG TCG TCC ATG TCG
  P3   5′-GCC ATG GAT CAG GCC GGC AAG AGC CCG   NcoI
  P4   5′-TGG ATC CTC AGA ACG AGC CGC TGG T   BamHI
  P6   5′-GAA TTC AGC CGC CGT CAT TCC CGC C   EcoRI
  2L   5′-AGA TTT ACG GCA TGT TTC GC
  2R   5′-TAG CCG CTA TGG AAG CTG AT
  3L   5′-TGA CCT TCG TCG ACA ACC AC
  3R   5′-GAT AGC TGC TGG TGA CGG TC
表4：mta中引入定向诱变所用引物
  突变  寡序列   修饰   链   目的
  G134R  CTGCCGGCCGGCCAGcGCTTCTGGCG   +   SDM
  G134R-  cgccagaagcgctggccggccggcag   -   SDM
  I157L  GACGGTGACCGCTTCcTgGGCGGCGAGTCG   +   SDM
  I151L-  cgactcgccgcccaggaagcggtcaccgtc   -   SDM
  G223A  GGCGAGCTGTGGAAAgccCCTTCTGAATATCCG   +   SDM
  G223A-  cggatattcagaaggggctttccacagctcgcc   -   SDM
  H307L  gaacGGCGGCCAGCACctgTGGGCGCTGCAG   +   SDM
  H307L-  ctgcagcgcccacaggtgctggccgccgttc   -   SDM
  S334P，D343E  GTACTGGccgCACATGTACGACTGGGGCTACGGCgaaTTCATC   +   SDM
  S334P，D343E-  gatgaattcgccgtagccccagtcgtacatgtgcggccagtac   -   SDM
表5.SDM和pCSΔ质粒的特征
  质粒   特征/构建
  SDM1   pBlueSK+480bp mta的SalI-StuI片段
  SDM2   pBlueSK+572bp mta的SacII-PstI片段
  SDM3   pBlueSK+471bp mta的SalI-StuI片段
  pCSΔ1   FseI位点填入有Klenow----＞mta中框架漂移
  pCSΔ2   mta的FspI-PstI片段用′无功能DNA′代替
  pCSΔ3   mta的PstI-AspI片段用′无功能DNA′代替
实施例3多重SDM
根据进行了所述修改的使用手册使用
Figure A20078003052701061
Multi SiteDirected Mutagenesis Kit(Stratagene)生成PS4变异体。
步骤1：突变体链合成反应(PCR)
在10ml Falcon管中将3ml LB(22g/l Lennox L Broth Base，Sigma)+抗生素(0.05μg/ml卡那霉素，Sigma)温育。
-于37℃，ca.200rpm温育
-离心使细胞沉降(5000rpm/5分钟)
-弃去培养基
-使用QIAGEN Plasmind Mini PurificationProtocol制备ds-DNA模板。
1.用于热循环的突变体链合成反应如下所示制备：
PCR混合物：
2.5μl  10X
Figure A20078003052701062
Multi反应缓冲液
0.75μl    QuickSolution
Xμl  引物
Figure A20078003052701063
1μl  dNTP混合物
Xμl  ds-DNA模板(200ng)
1μl
Figure A20078003052701064
Multi酶混合物(2.5U/μl)(Pfu TurboDNA聚合酶)
Xμl dH2O(终体积为25μl)
通过移液将所有组分混合并简单涡漩反应混合液。
2.使用如下参数循环反应：
35个循环的变性(96℃/1分钟)
引物退火(62.8℃/1分钟)
延伸(65℃/15分钟)
然后于4℃保持
在将PCR管放入仪器(eppendorf热循环仪)之前预热PCR仪的盖子至105℃，平板至95℃。
步骤2：DPNI消化
1.向各扩增反应体系加入2μl DPN I限制性内切酶(10U/μl)，移液混合并涡漩混合物。
2.37℃温育约3小时。
步骤3：转化
Figure A20078003052701071
超感受态细胞
1.在冰上解冻XL10-Gold细胞。将每诱变反应45μl等分细胞加入预冷Falcon管中。
2.打开水浴(42℃)，将含有NZY+培养基的管子置于水浴中预热。
3.向各管加入2μl β-巯基乙醇混合物。涡漩并轻轻敲击，在冰上温育10分钟，每2分钟涡漩一次。
4.向每等份细胞中加入1.5μl DPN I-处理的DNA，涡漩混匀，冰上温育30分钟。
5.在42℃水浴加热脉冲管子30秒，再置于冰上2分钟。
6.向各管加入0.5ml预热的NZY+培养基，以225-250rpm振摇于37℃温育1小时。
7.将200μl各转化反应体系置于含1％淀粉和0.05μg/ml卡那霉素的LB平板上(33，6g/l Lennox L Agar，Sigma)。
8.37℃温育转化平板过夜。
表6.pPD77d14引物表：
  突变   寡序列   修饰   链   目的
  N33Y，D34N GCGAAGCGCCCTACAACTGGTACAAC 5′磷酸 + MSDM
  K71R   CCGACGGCGGCAGGTCCGGCG   5′磷酸   +   MSDM
  G87S   CAAGAACAGCCGCTACGGCAGCGAC   5′磷酸   +   MSDM
  G121D   CACATGAACCGCGACTACCCGGACAAG   5′磷酸   +   MSDM
  G134R   CTGCCGGCCGGCCAGcGCTTCTGGCG   5′磷酸   +   MSDM
  A141P   CGCAACGACTGCGCCGACCCGGG   5′磷酸   +   MSDM
  I157L   GACGGTGACCGCTTCcTgGGCGGCGAGTCG   5′磷酸   +   MSDM
  L178F，A179T CGCGACGAGTTTACCAACCTGCG 5′磷酸 + MSDM
  G223A   GGCGAGCTGTGGAAAgccCCTTCTGAATATCCG   5′磷酸   +   MSDM
  H307L   gaacGGCGGCCAGCACctgTGGGCGCTGCAG   5′磷酸   +   MSDM
  S334P，D343E   GTACTGGccgCACATGTACGACTGGGGCTACGGCgaaTTCATC 5′磷酸 + MSDM
表7.pPD77d20引物表：
  突变   寡序列   修饰   链   目的
  N33Y，D34N GCGAAGCGCCCTACAACTGGTACAAC 5′磷酸 + MSDM
  K71R   CCGACGGCGGCAGGTCCGGCG   5′磷酸   +   MSDM
  G121D   CACATGAACCGCGACTACCCGGACAAG   5′磷酸   +   MSDM
  G134R   CTGCCGGCCGGCCAGcGCTTCTGGCG   5′磷酸   +   MSDM
  A141P   CGCAACGACTGCGCCGACCCGGG   5′磷酸   +   MSDM
  I157L   GACGGTGACCGCTTCcTgGGCGGCGAGTCG   5′磷酸   +   MSDM
  L178F，A179T CGCGACGAGTTTACCAACCTGCG 5′磷酸 + MSDM
  G223A   GGCGAGCTGTGGAAAgccCCTTCTGAATATCCG   5′磷酸   +   MSDM
  H307L   gaacGGCGGCCAGCACctgTGGGCGCTGCAG   5′磷酸   +   MSDM
  S334P，D343E   GTACTGGccgCACATGTACGACTGGGGCTACGGCgaaTTCATC 5′磷酸 + MSDM
表8.pPD77d34引物表：
  突变   寡序列   修饰   链   目的
  N33Y，D34N GCGAAGCGCCCTACAACTGGTACAAC 5′磷酸 + MSDM
  G121D   CACATGAACCGCGACTACCCGGACAAG   5′磷酸   +   MSDM
  G134R   CTGCCGGCCGGCCAGcGCTTCTGGCG   5′磷酸   +   MSDM
  A141P   CGCAACGACTGCGCCGACCCGGG   5′磷酸   +   MSDM
  I157L   GACGGTGACCGCTTCcTgGGCGGCGAGTCG   5′磷酸   +   MSDM
  L178F，A179T CGCGACGAGTTTACCAACCTGCG 5′磷酸 + MSDM
  G223A   GGCGAGCTGTGGAAAgccCCTTCTGAATATCCG   5′磷酸   +   MSDM
  H307L   gaacGGCGGCCAGCACctgTGGGCGCTGCAG   5′磷酸   +   MSDM
  S334P   GTACTGGccgCACATGTACGACTGGGGCTACGGC   5′磷酸   +   MSDM
基于pPD77的载体系统
用于pPD77的载体系统基于pCRbluntTOPOII(invitrogen)。用pmlI去除零霉素抗性盒，去除了393bp片段。来自pCC载体(P32-ssCGTase-PS4-tt)的表达盒已插入该载体中。
将PS4变异体连接入pCCMini
用限制性内切酶Nco 1和Hind III(Biolabs)剪切含相关突变(由MSDM产生)的质粒：
3μg质粒DNA、Xμl 10x缓冲液2、10单位Nco1、20单位HindIII、37℃温育2小时。
将消化物在1％琼脂糖凝胶上跑胶。从凝胶上切下长1293bp的片段(PS4基因)并用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化。
用限制性内切酶Nco 1和Hind III剪切载体pCCMini，然后将消化物在1％琼脂糖凝胶上跑胶。从凝胶上切下长3569bp的片段并用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化。
连接：使用快速DNA连接试剂盒(Roche)
使用载体两倍量的插入片段
例如，2μl插入片段(PS4基因)
1μl载体
5μl T4DNA连接缓冲液2x浓度
1μl dH2O
1μl T4DNA连接物
连接5min/RT
按照使用手册(Invitrogen)将连接物转化入One Shot TOPO感受态细胞。每次转化用5μl连接物。
将50μl转化混合物置于含1％淀粉和0.05μg/ml卡那霉素的LB平板上(33.6g/l Lennox L Agar，Sigma)。可通过淀粉平板上的卤素形成识别包含插入片段(PS4变异体)的载体。
实施例3A制备具有307位替换的PS4变异体多肽
pSac-pMD229
使用定向诱变(如实施例2所述)或多重定向诱变(如实施例3所述)并使用下表所示引物从野生型序列获得相对于野生型非麦芽糖生成外切淀粉酶包含N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307L、A309P、S334P突变的pSac-pMD229序列(SED ID NO：14)。pMD229的引物
  目的   描述  修饰   链   5′寡序列3′
  MSDM   N33Y，D34N  5′磷酸   +   GCGAAGCGCCCTACAACTGGTACAAC
  MSDM   G121F  5′磷酸   +   CCAATCACATGAACCGCttcTACCCGGACAAGGAG
  SDM   G134R   +   CTGCCGGCCGGCCAGcGCTTCTGGCG
  SDM   G134R-   -   cgccagaagcgctggccggccggcag
  MSDM   A141P  5′磷酸   +  CGCAACGACTGCGCCGACCCGGG
  MSDM   Y146G  5′磷酸   +  GATCCGGGCAACggcCCCAACGACTGCG
  SDM   I157L   +  GACGGTGACCGCTTCcTgGGCGGCGAGTCG
  SDM   I157L-   -  cgactcgccgcccaggaagcggtcaccgtc
  MSDM   S161A  5′磷酸   +  GGGCGGCGAGgcgGACCTGAACA
  MSDM   L178F，A179T  5′磷酸   +  CGCGACGAGTTTACCAACCTGCG
  MSDM   G223E(gag)  5′磷酸   +  GGCGAGCTGTGGAAAGDNCCTTCTGAATATCCGAG
  MSDM   S229P  5′磷酸   +  GCCTTCTGAATATCCGccgTGGGACTGGCGCAAC
  MSDM   H272Q  5′磷酸   +  CCGACTGGAAGcagGGCCTCAATGGC
  MSDM   G303E  5′磷酸  CCGGGCAGAACgaaGGCCAGCACCTGTG
  SDM   H307L   +  gaaacGGCGGCCAGCACctgTGGGCGCTGCAG
  SDM   H307L-   -  ctgcagcgcccacaggtgctggccgccgttc
  MSDM   A309P  5′磷酸   +  GCACCTGTGGccgCTGCAGGACG
  SDM   S334P，D343E   +  GTACTGGccgCACATGTACGACTGGGGCTACGGCgaaTTCATC
  SDM   S334P，D343E-   -  gatgaattcgccgtagccccagtcgtacatgtgcggccagtac
pSac-pMS382
使用多重定向诱变(如实施例3所述)并使用下表所示引物从pSac-pSac-pMD229获得含307K的pSac-pMS382序列(SED ID NO：22)：
pMD229--＞pMS382的引物：
Figure A20078003052701121
使用多重定向诱变(如实施例3所述)并使用下表所示引物生成307位具有其它残基的PS4变异体多肽：
  目的   描述   密码子   名称   寡序列  修饰   链
  MSDM   L307K(synt)   aaa   pMS343   CAAAATGAAGGACAACATaaaTGGCCGCTTCAAGATGGCC  5′磷酸   +
  MSDM   L307Q(synt)   cag   pMS344   GAAGGACAACATcagTGGCCGCTTCAAGATGGCC  5′磷酸   +
  MSDM   L307V(synt)   gtc   pMS345   GAAGGACAACATGTCTGGCCGCTTCAAGATGGCC  5′磷酸   +
  MSDM   L307W(synt)   tgg   pMS346   CAAAATGAAGGACAACATtggTGGCCGCTTCAAGATGGCC  5′磷酸   +
  MSDM   L307Y(synt)   tat   pMS347   CAAAATGAAGGACAACATtatTGGCCGCTTCAAGATGGCC  5′磷酸   +
  MSDM   L307C(synt)   tgc   pMS348   CAAAATGAAGGACAACATtgcTG  5′磷酸   +
  GCCGCTTCAAGATGGCC
  MSDM   L307E(synt)  gaa   pMS371   CAAAATGAAGGACAACATgaaTGGCCGCTTCAAGATGGCC  5′磷酸  +
  MSDM   L307F(synt)  ttt   pMS349   GAAGGACAACATtttTGGCCGCTTCAAGATGG  5′磷酸  +
  MSDM   L307H(synt)  cat   pMS370   GAAGGACAACATcatTGGCCGCTTCAAGATGG  5′磷酸  +
307位位点扫描所用引物：
  目的   描述   密码子   寡序列  修饰   链
  MSDM   L307NNS(synt)   NNS   CAAAATGAAGGACAACATNNSTGGCCGCTTCAAGATGGCC  5′磷酸   +
实施例4转化至枯草芽孢杆菌(原生质体转化)
根据如下方案用突变质粒转化枯草芽孢杆菌(菌株DB104A；Smith等1988；Gene 70，351-361)。
A原生质体化和转化培养基
2xSMM             每升：342g蔗糖(1M)；4.72g马来酸
                  钠(0.04M)；8：12g MgCl2·6H2O(0.04
                  M)；浓NaOH调至pH 6.5。以每份50ml
                  分装，高压灭菌10分钟。
4xYT(1/2NaCl)     每100ml 2g酵母膏+3.2g胰蛋白胨+0.5
                  g NaCl。
SMMP              混合等体积的2xSMM和4xYT。
PEG               在25ml1xSMM(高压灭菌10分钟)中
                  10g聚乙烯二醇6000(BDH)或8000
                  (Sigma)。
B平板/再生培养基
琼脂                 4％Difco最少量琼脂。高压灭菌15分钟。
丁二酸钠             270g/l(1M)，HCl调至pH 7.3。高压
                     灭菌15分钟。
磷酸盐缓冲液         每100ml 3.5g K2HPO4+1.5g KH2PO4。高
                     压灭菌15分钟。
MgCl2                每100ml 20.3g MgCl2·6H2O(1M)。
酪蛋白氨基酸         5％(w/v)溶液。高压灭菌15分钟。
酵母膏               每100ml 10g，高压灭菌15分钟。
葡萄糖               20％(w/v)溶液。高压灭菌10分钟。
DM3再生培养基：      60℃混匀(水浴；500-ml瓶)：
250ml丁二酸钠
50ml酪蛋白氨基酸
25ml酵母膏
50ml磷酸盐缓冲液
15ml葡萄糖
10ml MgCl2
100ml溶化琼脂
加入适当的抗生素：氯霉素和四环素，5μg/ml；红霉素，1μg/ml。在DM3培养基中用卡那霉素筛选会产生问题：要求浓度为250μg/ml。
C原生质体制备
1.自始至终使用不含去污剂的塑料或玻璃器皿。
2.将来自单一菌落的10ml 2xYT培养基在100-ml摇瓶中培养。在摇床上于25-30℃生长过夜(200转/分钟)。
3.将过夜培养物稀释20倍至100ml新配的2xYT培养基中(250-ml摇瓶)，然后在摇床上于37℃培养至OD600＝0.4-0.5(约2h)(200-250转/分钟)。
4.离心收获细胞(9000g，20分钟，4℃)。
5.用移液管移去上清，用5ml SMMP+5mg溶菌酶重悬细胞，无菌过滤。
6.在水浴摇床中于37℃培养(100转/分钟)。
30分钟之后每间隔15分钟用显微镜检查25μl样品。继续培养直至99％的细胞原生质体化(球状形态)。离心获得原生质体(4000g，20分钟，室温)并移去上清。用1-2ml SMMP轻轻重悬沉淀。
现在原生质体已可使用。(可分装(例如0.15ml)于-80℃冷冻以备将来使用(不需要加入甘油)。尽管可能因此导致可转化性降低，用冷冻原生质体可获得每μg DNA106个转化子)。
D转化
1.将450μl PEG转移至微型管。
2.将1-10μl DNA(0.2μg)和150μl原生质体混合，将混合液与PEG加入微型管。立即轻轻混匀。
3.室温放置2分钟，然后加入1.5ml SMMP，混匀。
4.离心获得原生质体(10分钟，13,000转/分钟(10-12,000g))，弃去上清。用纸除去剩余液滴。
加入300μl SMMP(不要涡漩)并在水浴摇床中于37℃温育60-90分钟(100转/分钟)使抗生素抗性标记表达。(通过水浴振摇使原生质体充分混悬。)用1xSSM适当稀释，将0.1ml接种至DM3平板。
实施例5摇瓶发酵PS4变异体
按下表制备摇瓶底物：
  成分   ％(w/v)
  水   -
  酵母膏   2
  大豆粉   2
  NaCl   0.5
  磷酸氢二钾   0.5
  消泡剂   0.05
在高压灭菌前用4N硫酸或氢氧化钠将底物调节至pH 6.8。取100ml底物置于具有挡板的500ml摇瓶中，高压灭菌30分钟。然后，加入6ml无菌葡萄糖糖浆。通过混合1体积的50％w/v葡萄糖和1体积的水制备葡萄糖糖浆，然后高压灭菌20分钟。
将变异体接种入摇瓶，在孵箱中于35℃/180rpm温育24小时。温育后，离心分离发酵液中的细胞(10,000xg 10分钟)，最后0.2μm微孔过滤除去上清液中的细胞。无细胞上清液用于测定方法和应用检测。
实施例6淀粉酶测定法
Betamyl测定法
一个Betamyl单位定义为每分钟降解0.0351毫摩尔PNP-偶联麦芽五糖的活性，这样在测定混合物中过量α-葡萄糖苷酶每分钟可释放0.0351毫摩尔PNP。测定混合物包含50μl 50mM Na-柠檬酸盐，5mMCaCl2，pH6.5，25μl酶样品和25μl Betamyl底物(Glc5-PNP，α-葡萄糖苷酶)(购自Megazyme，Ireland(1管溶解于10ml水中))。将测定混合物于40℃温育30分钟，然后加入150μl 4％Tris终止。用ELASA酶标仪测定420nm的吸光度，基于活性＝A420*d(Betamyl单位/ml所测酶样)计算Betamyl活性。
内切淀粉酶测定法
内切淀粉酶测定法与根据说明书操作的Phadebas测定法一致(Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB)。
外切特异性
外切淀粉酶活性与Phadebas活性的比值用于评价外切特异性。
实施例7半衰期测定
t1/2定义为在给定的加热条件下一半酶活力失活所需时间(单位为分钟)。为测定酶的半衰期，将样品置恒温60℃至90℃加热1-40分钟。基于残留Betamyl测定法计算半衰期。
过程：在一Eppendorf管中，在60℃或更高温度预热1000μl缓冲液至少10分钟。在加热孵箱(Eppendorf的Termomixer comfort)中不断混合Eppendorf管的条件下，将100μl样品加入预热缓冲液以开始对样品加热处理。在温育0、2、4、6、8和9分钟后，将45μl样品转移至1000μl于20℃平衡的缓冲液以终止处理，并于20℃，1500rpm温育1分钟。用Betamyl测定法检测残留活性。
计算：基于残留Betamyl活性对温育时间的log10(以10为底的对数)斜率计算t1/2。t1/2计算为斜率(Slope)/0.301＝t1/2。
实施例8模型系统烘焙测试
在Farinograph中于30.0℃制作生面团。称取10.00g改良面粉，并加入Farinograph中；混合1分钟后，用无菌移液管通过揉面缸孔加入对照/试样(对照＝缓冲液或水，试样＝酶+缓冲液或水)。30秒后，刮去边缘的面粉-也通过揉面缸孔。将试样揉7分钟。
在进行最终对比之前，在Farinograph中检测缓冲液或水。对照的FU应为400，如果不是则需要使用例如液体量来调整。用铲取出对照/试样并放在手上(带有一次性手套)，然后将其装入小玻璃试管(约长4.5厘米)中，再放进NMR管并加塞。每个生面团放入7管。
所有试样制备完毕后，将管(可程序控制的)于33℃水浴中(不加塞)放置25分钟，此后将水浴调为33℃保持5分钟，然后在56分钟内加热至98℃(1.1℃每分钟)，最后在96℃保持5分钟。
将试管置于20.0℃恒温柜中保存。在第1、3和7天用Bruker NMS120Minispec NMR分析仪通过质子NMR测定面包心的固体含量，如图2所示用0.05、1和2ppm PSacD34制备的面包心试样。随时间而增加的固体含量表示支链淀粉凝沉作用降低。在20.0℃恒温柜中保存7天后，称取10-20mg面包心试样并放入40μl铝标准DSC胶囊并置于20℃。
这些胶囊用于在Mettler Toledo DSC 820上进行的差示扫描热量法。所用参数为每分钟升温10℃的20-95℃加热周期，气/流速：N2/80ml每分钟。分析结果并以J/g计算凝沉支链淀粉的熔化焓。
实施例9抗老化作用
按实施例8制备并测定模型面包心。如差示扫描热量法所测定，与对照相比PS4变异体显示出显著降低支链淀粉凝沉的作用。PS4变异体显示出明显的剂量效应。
实施例10烘焙试验配方
用标准白发面团面包和美国吐司生面团配方进行烘焙试验。用1400g General Mills，USA的“金牌”面粉、800g水、40g油菜籽油、7.5g GRINDSTEDTM SSL P55Veg、10g乳化剂DIMODANTM PH200以及60g压榨酵母制作发面团。用Hobart螺旋混合器以低速混合发面团1分钟，随后在速度2混合3分钟。然后在25℃，85％RH下发酵3小时。
之后，向发面团中加入600g“金牌”面粉、18g压榨酵母、5g丙酸钙、160g蔗糖、5g丙酸钙、432g水和抗坏血酸(终浓度为60ppm)和ADA(偶氮二酰胺；终浓度40ppm)。用Diosna混合器将所得生面团低速混合1分钟，然后高速混合2分钟。然后向生面团中加入30g盐。
室温醒发生面团5分钟，然后称量550g生面团切片，用设置为1∶4，2∶4，3∶15，4∶12，两面宽度8的Glimek压片机成型，并转为烘焙形式。在43℃、95％RH下放置65分钟后，用MIWE烤箱在200℃烘焙生面团26分钟。
实施例11丹麦卷体积控制
用基于2000g丹麦改良面粉(来自Cerealia)、120g压榨酵母、32g盐、32g蔗糖的生面团制备丹麦卷。根据之前的水优化将水加入生面团。
用Diosna混合仪混合生面团(低速2分钟，高速5分钟)。混合后保持生面团温度在26℃。称取1350g生面团，于30℃加热箱中静置10分钟。用Fortuna模具机使卷成形，于34℃和85％相对湿度下醒发(proof)45分钟。随后将卷置于Bago 2烤箱中于250℃烘焙18分钟，开始13秒加蒸汽。烘焙后将卷冷却25分钟，然后称重，测量体积。
评价卷的外皮表观，面包心同质性，外皮帽化，ausbund和比体积(用油菜籽置换法测量体积)。
基于这些要求，我们发现PS4变异体可提高比体积并改善丹麦卷的质量参数。因此，PS4变异体可控制烘烤产品的体积。
实施例12硬度、弹性和粘性的评价方案
面包质构剖面分析
用质构分析仪(Stable Micro Systems，UK)通过质构剖面分析测定面包切片的硬度、弹性和粘性。根据Stable Micro Systems，UK提供的当前标准计算硬度和弹性。所用探针为50mm圆形铝。
将面包切为宽12.5mm的切片。从切片中压出直径为45mm的圆形碎片并独立测定。
所用设置如下：
测试前速度：2mm/s
测试速度：2mm/s
测试后速度：10mm/s
破裂测试距离：1％
距离：40％
压力：0.098N
时间：5.00秒
计数：5
测力仪：5kg
触发型：自动-0.01N
挤压模式为标准方法AACC74-09所用模式的修改版本。测试中将样品挤压两次。图1显示了构质分析仪的曲线实施例。
实施例13硬度评价方案
在第一次挤压中挤压40％时检测硬度。此数字是指将切片压至总厚度40％时所需压力。这一数值越低，面包越柔软。硬度以压力，例如以hPa为单位。
这一测定法可称为“硬度评价方案”。
实施例14弹性评价方案
曲线下面积是测试中所施加功的量度。第一次挤压中的挤压部分(A1)和反弹部分(A2)的曲线下面积如图1所示。
A1与A2之间的比例定义为样品弹性，以弹性单位表示。真实弹性材料具有对称曲线，因为第一部分所施加压力与第二部分的压力相同。对于面包和面包类材料，因为挤压时对结构的扰乱A2一般小于A2。因此，弹性常低于1。
这一测定法可称为“弹性评价方案”。
实施例15粘性评价方案
粘性定义为第二次挤压下面积和第一次挤压下面积(A3/A1+A2)之间的比值，以粘性单位表示。它是测量在挤压过程中试样的衰退。试样在第一次挤压后恢复形状的能力越高该值越接近1。对于面包和面包类材料而言粘性通常小于1。
这一测定法也可称作“粘性评价方案”
实施例16破碎性(破碎抗性)评价方案
将两片面包置于一张纸上。将各面包片先垂直然后水平撕裂将其分成4个正方形。
用手指拉开面包心将其撕裂。首先从面包上表面的中间撕开至面包下表面的中间。之后，将原始面包的每一半从面包片的外壳面撕裂至内面。每次撕碎后通过手上下移动将各面包碎片振摇至少三分钟将从4个正方形分离的小面包心碎片去除。
测定已分离的小面包心碎片作为破碎性的量度。这一测定法可称作“破碎性评价方案”。
实施例17.可折叠性评价方案
用自动面包切片机将吐司面包切片，设定切片厚度为15mm。用手将切片的上部与下部折叠，从而使折皱的方向为从一边到另一边。
使用下列评分体系目测评价可折叠性
  分数  特征
  1  不可折叠，切片在折叠时断裂
  2  可折叠，整个切片在折叠5秒后断裂
  3  可折叠，部分切片在折叠后5秒内断裂，其它部分之后断裂
  4  可折叠，部分切片在折叠后5秒后断裂，其它部分不断裂
  5  可折叠，折叠后切片各部分均不断裂
这一测定法可称作“可折叠性评价方案”。
实施例18.PS4变异体多肽热稳定性提高
如上所述测量淀粉酶pSac-pMS382的热稳定性并与pSac-D34/pMD3(SEQ ID NO：2)和pSac-pMD229(SEQ ID NO：13)比较。
由于热失活为1级速率反应，半衰期定义为在50mM柠檬酸钠、5mM氯化钠，pH 6.5中于75、80和85℃(分别为167、176和185°F)温育1-40分钟后使用Betamyl测定法测定的残基活性50％失活的时间(以分钟计)。
结果见图2。该图显示包含307位替换成碱性或带正电荷氨基酸的PS4变异体多肽与无此突变的多肽相比热稳定性(半衰期)提高。
实施例19用PS4变异体多肽处理的食品操作性质改善：硬度
用不同含量的包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的pSac-pMS382(SEQ ID NO：21)(即20000、40000和60000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382)烘焙面包。
根据实施例13所列方案在烘焙后的不同时间检测面包的硬度。测量不含任何酶烘焙的面包的硬度作为对照。
图3显示了检测面包硬度的烘焙试验的结果。
实施例20.用PS4变异体多肽处理的食品操作性质改善：弹性
用不同含量的包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的pSac-pMS382(SEQ ID NO：21)(即20000、40000和60000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382)烘焙面包。
根据实施例14所列方案在烘焙后的不同时间检测面包的弹性。测量不含任何酶烘焙的面包的弹性作为对照。
图4显示了检测面包弹性的烘焙试验的结果。
实施例21.用PS4变异体多肽处理的食品操作性质改善：粘性
用不同含量的包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的pSac-pMS382(SEQ ID NO：21)(即20000、40000和60000Betamyl单位/千克的pSac-pMS382)烘焙面包。
根据实施例15所列方案在烘焙后的不同时间检测面包的粘性。测量不含任何酶烘焙的面包的粘性作为对照。
图5显示了检测面包粘性的烘焙试验的结果。
实施例22.用PS4变异体多肽处理的食品操作性质改善：硬度
用60000Betamyl单位/千克的包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的pSac-pMS382(SEQ ID NO：21)烘焙面包。根据实施例13所列方案在烘焙后的不同时间检测面包的硬度。
也使用60000Betamyl单位/千克的pSac-D34/pMD3(SEQ ID NO：2)和60000Betamyl单位/千克的pSac-pMD229(SEQ ID NO：13)烘焙面包，二者均不含307位至碱性或带正电荷氨基酸的替换。检测面包的硬度。
测量不含任何酶烘焙的面包的硬度作为对照。
图6显示了检测用含有和不含有307位替换的PS4变异体多肽处理的面包的硬度的烘焙试验结果。
实施例23.用PS4变异体多肽处理的食品操作性质改善：硬度、弹性和粘性
用60000Betamyl单位/千克的包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的pSac-pMS382(SEQ ID NO：21)烘焙面包。根据实施例14所列方案在烘焙后的不同时间检测面包的弹性。
也使用60000Betamyl单位/千克的pSac-D34/pMD3(SEQ ID NO：2)和60000Betamyl单位/千克的pSac-pMD229(SEQ ID NO：13)烘焙面包，二者均不含307位至碱性或带正电荷氨基酸的替换。检测面包的弹性。
测量不含任何酶烘焙的面包的弹性作为对照。
图7显示了检测用含有和不含有307位替换的PS4变异体多肽处理的面包的弹性的烘焙试验结果。
实施例24.用PS4变异体多肽处理的食品操作性质改善：粘性
用60000Betamyl单位/千克的包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的pSac-pMS382(SEQ ID NO：21)烘焙面包。根据实施例15所列方案在烘焙后的不同时间检测面包的粘性。
也使用60000单位/千克的pSac-D34/pMD3(SEQ ID NO：2)和60000Betamyl单位/千克的pSac-pMD229(SEQ ID NO：13)烘焙面包，二者均不含307位至碱性或带正电荷氨基酸的替换。检测面包的粘性。
测量不含任何酶烘焙的面包的粘性作为对照。
图8显示了检测用含有和不含有307位替换的PS4变异体多肽处理的面包的粘性的烘焙试验结果。
实施例25.用PS4变异体多肽处理的食品操作性质改善：可折叠性
烘焙用4ppm pSac-pMS382(SEQ ID NO：21，H307K替换)处理的发面团(sponge)和生面团吐司面包，检测所得面包的可折叠性并如上所述评分。
烘焙未经酶处理的发面团和生面团吐司面包并检测可折叠性并评分作为对照。
烘焙后第13天对三片切片进行检测
  应用的酶   平均可折叠性分数
  4ppm pSac-pMS382   3
  对照(无酶)   1
如上表和图所显示，用包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的PS4变异体多肽处理的发面团和生面团吐司面包与未处理的吐司面包相比可折叠性提高。
实施例26：用PS4变异体多肽处理的食品操作性质改善：可折叠性
烘焙用4ppm pSac-pMS382(SEQ ID NO：21，H307K替换)处理的发面团和生面团吐司面包，检测所得面包的可折叠性并如上所述评分。
烘焙未经酶处理的发面团和生面团吐司面包并检测可折叠性并评分作为对照。也检测用如下所示的其它酶处理的发面团和生面团吐司面包的可折叠性。
与野生型非麦芽糖生成外切淀粉酶相比酶pSac-D34(也称作pMD3)包含突变N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P，其序列如SEQ ID NO：2所示。
与野生型非麦芽糖生成外切淀粉酶相比酶pSac-pMD229包含突变N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307L、A309P、S334P，其序列如SEQ ID NO：13所示。
烘焙后第8天对三片切片进行检测
  应用的酶   平均可折叠性分数
  pSac-pMS382(SEQ ID NO：21)  5
  pSac-pMD229(SEQ IDNO：13)  3
  pSac-D34/pMD3(SEQ ID NO：2)  2
  对照(无酶)  1
如上表和图所显示，用包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的PS4变异体多肽处理的发面团和生面团吐司面包与不含该替换的酶相比可折叠性提高。
实施例27.用PS4变异体多肽和其它酶的组合处理的食品操作性质改善：可折叠性
烘焙单独用6ppm pSac-pMS382(SEQ ID NO：21，307K替换)或与如下所示的其它酶组合处理的发面团和生面团吐司面包，检测所得面包的可折叠性并如上所述评分。
组合1：6ppm pSac-pMS382+50ppm GRINDAMYLTMPOWERBake 900+15ppm GRINDAMYLTM Max-Life U4.
组合2.6ppm pSac-pMS382+50ppm GRINDAMYLTMPOWERBake 900
组合3.6ppm pSac-pMS382+50ppm GRINDAMYLTMPOWERBake 900+150ppm GRINDAMYLTM POWERBake 4050
GRINDAMYLTM POWERBake 900为可从Danisco A/S商业购买的木聚糖酶。GRINDAMYLTM Max-Life U4为可从Danisco A/S商业购买的细菌α-淀粉酶。GRINDAMYLTM POWERBake 4050为可从Danisco A/S商业购买的脂肪酶。
烘焙未经酶处理的发面团和生面团吐司面包并检测可折叠性并评分作为对照。
烘焙后第5天对三片切片进行检测
  应用的酶   平均可折叠性分数
  6ppm pSac-pMS382   4
  6ppm pSac-pMS382+50ppm POWERBake 900+15ppm Max-Life U4   5
  6ppm pSac-pMS382+50ppm POWERBake 900   5
  6ppm pSac-pMS382+50ppm POWERBake 900+150ppm POWERBake 4050   5
  对照(不含酶)   1
如上表和图所显示，用包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的PS4变异体多肽单独处理或与其它酶例如细菌α-淀粉酶、脂肪酶和木聚糖酶组合处理的发面团和生面团吐司面包的可折叠性提高。
实施例28.用PS4变异体多肽处理的食品操作性质改善：破碎性检测
烘焙用4ppm pSac-pMS382(SEQ ID NO：21，H307K替换)处理的发面团和生面团吐司面包，检测所得面包的破碎性并如上所述评分。
烘焙未经酶处理的发面团和生面团吐司面包并检测可折叠性并评分作为对照。
烘焙后第13天进行检测
  应用的酶   分离面包心的重量(mg)
  对照(不含酶)   23
  4ppm pSac-pMS382   13
如上表和图所显示，用包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的PS4变异体多肽处理的发面团和生面团吐司面包在烘焙后第13天破碎性降低。
实施例29.用PS4变异体多肽处理的食品操作性质改善：破碎性检测
烘焙用4ppm pSa-pMS382(SEQ ID NO：21，H307K替换)处理的发面团和生面团吐司面包，检测所得面包破碎性并如上所述评分。
烘焙未经酶处理的发面团和生面团吐司面包并检测可折叠性并评分作为对照。
烘焙后第15天进行检测
  应用的酶   分离面包心的重量(mg)
  对照(不含酶)   41
  4ppm pSac-pMS382   9
如上表示，用包含307位至碱性或带正电荷氨基酸替换的PS4变异体多肽处理的发面团和生面团吐司面包在烘焙后第15天破碎性降低。
实施例30.具有307K位替换的PS4变异体多肽
制备具有307位替换成赖氨酸的下列多肽并如上所述检测它们的性质。这些多肽的序列包含具有所指明替换的SEQ ID NO：2序列。
  变异体   突变(SEQ ID NO：2)
  SSM471C04   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307K、A309P、S334P
  pMS343   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307K、A309P、S334P
  pMS358   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS361   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307K、A309P、S334P
  pMS364   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS366   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS368   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307K、A309P、S334P
  pMS359   N33Y、D34N、D68C、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307K、A309P、S334P
  pMS360   N33Y、D34N、D68C、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS362   N33Y、D34N、D68C、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307K、A309P、S334P
  pMS363   N33Y、D34N、D68C、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307K、A309P、S334P
  pMS365   N33Y、D34N、D68C、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS367   N33Y、D34N、D68C、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、
  I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307K、A309P、S334P
  pMS369   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、G303E、H307K、A309P、S334P
  pMS380   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P、S334P
  pMS383   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P、S334P
  pMS384   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS385   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS372   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、Y198W、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS381   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS391   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS382   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P、S334P
  pMS386   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、Y198W、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS387   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS388   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、Y198W、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS390   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS392   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS393   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、Y198W、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS382   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P、S334P
  pMS389   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS390   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS380   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、
  I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P、S334P
  pMS383   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P、S334P
  pMS384   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS385   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS372   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、Y198W、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS381   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS391   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS382   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P、S334P
  pMS386   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、Y198W、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS387   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、
  A309P、S334P
  pMS388   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、Y198W、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS390   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS392   N33Y、D34N、N145D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS393   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、Y198W、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS382   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P、S334P
  pMS389   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
  pMS390   N33Y、D34N、G70K、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307K、A309P、S334P
实施例31.具有307H位替换的PS4变异体多肽
制备具有307位替换成组氨酸以及其它突变的下列多肽并如上所述检测它们的性质。这些多肽的序列包含具有所指明替换的SEQID NO：2序列。
  变异体   突变(SEQ ID NO：2)
  pMS375   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、
  I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307H、A309P、S334P
  pMS376   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307H、A309P、S334P
  pMS379   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307H、A309P、S334P
  pMS394   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307H、A309P、S334P
  pMS395   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、Y198W、G223E、S229P、H272Q、H307H、A309P、S334P
  pMS396   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307H、A309P、S334P
  pMS397   N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307H、A309P、S334P
  pMS396   N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、H307H、A309P、S334P
实施例32.生成具有L307R和L307K突变的PS4多肽
使用多位点定向突变(如实施例3所述)生成具有307位(L307R，L307K)其它残基的SSM 471B10和SSM 471C04，使用下表中的引物。
用于307位位点扫描的引物：
  目标   描述   密码子   寡序列  修饰   链
  MSDM   L307NNS(synt)   NNS   CAAAATGAAGGACAACATNNSTGGCCGCTTCAAGATGGCC  5′磷酸   +
测序来自位点扫描文库的96个克隆，鉴定出两个在307位分别含有氨基酸R和K的变异体SSM 471B10和SSM 471C04。
SSM 471B10的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示，而SSM 471B10的核酸序列如SEQ ID NO：28所述。
SSM471C04的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示，而SSM471C04的核酸序列如SEQ ID NO：30所示。
其它衍生自母体多肽并具有L307R或L307K突变的PS4变异体多肽也相似地使用Multi Site Directed Mutagenesis(如实施例3所述)并使用下表中的引物生成。
用于307位位点扫描的引物
用于307位位点扫描的引物：
  目标   描述   密码子   寡序列  修饰   链
  MSDM   L307NNS(synt)   NNS   CAAAATGAAGGACAACATNNSTGGCCGCTTCAAGATGGCC  5′磷酸   +
对于在301至306或308至313区域具有其它突变的多肽而言，可通过Multi Site Directed Mutagenesis(根据实施例3所述的方法)生成其它突变。
测序来自位点扫描文库的96个克隆并藉此鉴定出在307位分别含有氨基酸R和K的变异体。
实施例33玉米饼试验
按照以下配方烘焙玉米饼：
Figure A20078003052701341
Figure A20078003052701351
操作
生面团的温度必须为30℃。将所有的干成分放入Kemper混合仪中缓慢混合1分钟。加入水缓慢混合12分钟。称量：1350g。成形：Glimek：挤压时间3，0-成圆时间(rounding time)：3.0。生面团于30℃静置10分钟。将生面团球通过CFO40玉米饼机。
设定：
挤压：热压生面团球
顶盘：205℃；底盘：200℃
传送带：
顶：230℃；中：225℃；底：160℃
冷却：20℃，12分钟，80％RH
包装：具CO2真空
设定：真空41；CO2：41；温度：82℃
实施例34：烘焙后第8天可折叠性检测结果
根据实施例17在烘焙后第8天进行可折叠性检测。
图9显示了用400ppm Novamyl(TM)1500和50BMK/kgpSac-pMS382(SEQ ID NO：21)烘焙玉米饼后第8天可折叠型检测的结果。图10显示了用NovamylTM 1500和50BMK/kg pSac-pMS382(SEQ ID NO：21)烘焙玉米饼后第8天可折叠型检测的结果。
当折叠含有400ppm of NovamylTM 1500的10个玉米饼时，折叠中的所有破碎显示于图9和10。
当折叠含有50BMK/kg pSac-pMS382(SEQ ID NO：21)的10个玉米饼时，折叠中的所有破碎显示于图9和10。
实施例35.使用SSM 471B10(SEQ ID NO：27，307R)和SSM471C04(SEQ ID NO：29，307K)的烘焙试验
将根据实施例10所述的发面团和生面团操作制作的US吐司用于在40BMK/kg剂量检测含有307R的变异体SSM 471B10(SEQ IDNO：27)和含有307K的变异体SSM 471C04(SEQ ID NO：29)。
如实施例12-14所述评价吐司的硬度和弹性。
图11显示了用SSM 471B10(SEQ ID NO：27)和SSM 471C04(SEQ ID NO：29)制作的美国吐司的硬度检测的结果。图12显示了用SSM 471B10(SEQ ID NO：27)和SSM 471C04(SEQ ID NO：29)制作的美国吐司的弹性检测的结果。
两种变异体均观察到硬度的显著降低(图11)和弹性的显著增加(图12)，表明307R和307K变异体具有显著的抗老化作用。
实施例36.用PMS 370(SEQ ID NO：31，307H)和SSM 471C04(SEQ ID NO：29，307K)的烘焙试验
使用如实施例3所述的Multi Site Directed Mutagenesis生成PMS370。PMS 370序列如SEQ ID NO：31所示。
将根据实施例10所述的发面团和生面团操作制作的美国吐司用于在20、40和60BMK/kg剂量检测含有307H的变异体PMS 370和含有307K的SSM 471C04。
如实施例12-14所述评价吐司的弹性。
图13显示了用pMS 370(SEQ ID NO：31)和SSM 471C04(SEQID NO：29)制作的美国吐司的弹性检测的结果。
两种变异体均显示随着剂量的增加弹性显著增加(图13)，表明307R和307K变异体的弹性作为剂量的函数显著提高。但是307K变异体剂量的作用本质上强于307H变异体剂量的作用。
参考文献
Penninga，D.，van der Veen，B.A.，Knegtel，R.M.，van Hijum，S.A.，Rozeboom，H.J.，Kalk，K.H.，Dijkstra，B.W.，Dijkhuizen，L.(1996).来自环状芽胞杆菌株251的环糊精葡萄糖基转移酶的生淀粉结合结构域(The raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferasefrom Bacillus circulans strain 251).J.Biol.Chem.271，32777-32784.
Sambrook J，F.E.M.T.(1989).分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)第2版Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY.
Zhou，J.H.，Baba，T.，Takano，T.，Kobayashi，S.，Arai，Y.(1989).来自嗜糖假单胞菌的麦芽四糖水解酶基因的核苷酸序列(Nucleotidesequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonassaccharophila).FEBS Lett.255，37-41.
本文件提到的各申请和专利，以及上述申请和专利所引用或参考的各文件，包括各申请和专利审查中的各文件(“申请所引用的文件”)以及这些申请和专利以及任何该申请引用的文件中引用和提及的任何产品的任何使用说明或目录均以参考形式并于本文。而且，本文引用的所有文件、本文所引用文件中引用和参考的所有文件以及本文中引用或提及的任何产品的使用说明或目录均以参考形式并于本文。
本发明所述方法和体系的各种修改和变体对于本领域技术人员而言是显而易见的并不偏离本发明的范围和精神。虽然与具体的优选实施方案一起描述本发明，但应理解的是所要求的本发明不受这些具体实施方案的限制。事实上，对于分子生物学或相关领域的技术人员而言显而易见的所述实施本发明各种方式的修改涵盖于权利要求范围之内。
序列表
<110>DANISCO A/S
<120>POLYPEPTIDE
<130>P026334WO
<140>PCT/IB2007/002056
<141>2007-06-19
<150>US 60/814,851
<151>2006-06-19
<160>82
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>530
<212>PRT
<213>嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)
<400>1
Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Asn Asp Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg
                85                  90                  95
Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Gly Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Gly Gln Gly Phe Trp Arg Asn Asp Cys Ala Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Ile Gly Gly Glu
145                 150                 155                 160
Ser Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp
                165                 170                 175
Glu Leu Ala Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Gly Pro
    210                 215                 220
Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe
                245                 250                 255
Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His
            260                 265                 270
Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr
        275                 280                 285
Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly
    290                 295                 300
Gln His His Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Ser His Met
                325                 330                 335
Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
            340                 345                 350
Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly
        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
    370                 375                 380
Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp
                405                 410                 415
Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly Glu Gly Gly
            420                 425                 430
Leu Val Asn Val Asn Phe Arg Cys Asp Asn Gly Val Thr Gln Met Gly
        435                 440                 445
Asp Ser Val Tyr Ala Val Gly Asn Val Ser Gln Leu Gly Asn Trp Ser
    450                 455                 460
Pro Ala Ser Ala Val Arg Leu Thr Asp Thr Ser Ser Tyr Pro Thr Trp
465                 470                 475                 480
Lys Gly Ser Ile Ala Leu Pro Asp Gly Gln Asn Val Glu Trp Lys Cys
                485                 490                 495
Leu Ile Arg Asn Glu Ala Asp Ala Thr Leu Val Arg Gln Trp Gln Ser
            500                 505                 510
Gly Gly Asn Asn Gln Val Gln Ala Ala Ala Gly Ala Ser Thr Ser Gly
        515                 520                 525
Ser Phe
    530
<210>2
<211>429
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>2
Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Trp Thr Asp Pro Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg
                85                  90                  95
Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Asp Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu
145                 150                 155                 160
Ser Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp
                165                 170                 175
Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Ala Pro
    210                 215                 220
Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe
                245                 250                 255
Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His
            260                 265                 270
Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr
        275                 280                 285
Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly
    290                 295                 300
Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met
                325                 330                 335
Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
            340                 345                 350
Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly
        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
    370                 375                 380
Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp
                405                 410                 415
Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly
            420                 425
<210>3
<211>429
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>3
Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Trp Thr Asp Pro Gly Arg Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg
                85                  90                  95
Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Asp Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu
145                 150                 155                 160
Ser Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp
                165                 170                 175
Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser
        195                 200                 205
Asp Ser A1a Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Ala Pro
    210                 215                 220
Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe
                245                 250                 255
Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His
            260                 265                 270
Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr
        275                 280                 285
Phe Val Asp ASn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly
    290                 295                 300
Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met
                325                 330                 335
Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Glu Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
            340                 345                 350
Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly
        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
    370                 375                 380
Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser GIy
385                 390                 395                 400
Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp
                405                 410                 415
Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly
            420                 425
<210>4
<211>429
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>4
Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Trp Thr Asp Pro Gly Arg Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Asn Lys Asn Ser Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg
                85                  90                  95
Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Asp Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu
145                 150                 155                 160
Ser Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp
                165                 170                 175
Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Ala Pro
    210                 215                 220
Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe
                245                 250                 255
Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His
            260                 265                 270
Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr
        275                 280                 285
Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly
    290                 295                 300
Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met
                325                 330                 335
Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Glu Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
            340                 345                 350
Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly
        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
    370                 375                 380
Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp
                405                 410                 415
Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly
            420                 425
<210>5
<211>551
<212>PRT
<213>嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)
<400>5
Met Ser His Ile Leu Arg Ala Ala Val Leu Ala Ala Val Leu Leu Pro
1               5                   10                  15
Phe Pro Ala Leu Ala Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg
            20                  25                  30
Tyr His Gly Gly Asp Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val
        35                  40                  45
Val Arg Glu Ala Pro Asn Asp Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala
    50                  55                  60
Ser Thr Ile Ala Ala Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro
65                  70                  75                  80
Trp Arg Asp Phe Ser Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly
                85                  90                  95
Glu Gly Tyr Phe Trp His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser
            100                 105                 110
Asp Ala Gln Leu Arg Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val
        115                 120                 125
Lys Val Leu Tyr Asp Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Gly Tyr Pro
    130                 135                 140
Asp Lys Glu Ile Asn Leu Pro Ala Gly Gln Gly Phe Trp Arg Asn Asp
145                 150                 155                 160
Cys Ala Asp Pro Gly Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg
                165                 170                 175
Phe Ile Gly Gly Glu Ser Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr
            180                 185                 190
Gly Met Phe Arg Asp Glu Leu Ala Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala
        195                 200                 205
Gly Gly Phe Arg Phe Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val
    2l0                 215                 220
Asp Ser Trp Met Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu
225                 230                 235                 240
Leu Trp Lys Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr
                245                 250                 255
Ala Ser Trp Gln Gln Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys
            260                 265                 270
Pro Val Phe Asp Phe Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val
        275                 280                 285
Ala Asp Trp Lys His Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg
    290                 295                 300
Glu Val Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro
305                 310                 315                 320
Gly Gln Asn Gly Gly Gln His His Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Gln Ala Tyr Ala Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val
            340                 345                 350
Tyr Trp Ser His Met Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln
        355                 360                 365
Leu Ile Gln Val Arg Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile
    370                 375                 380
Ser Phe His Ser Gly Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser
385                 390                 395                 400
Gln Gln Thr Leu Val Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly
                405                 410                 415
Gln Val Ala Ser Gly Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly
            420                 425                 430
Gln Val Arg Val Trp Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp
        435                 440                 445
Gly Gly Glu Gly Gly Leu Val Asn Val Asn Phe Arg Cys Asp Asn Gly
    450                 455                 460
Val Thr Gln Met Gly Asp Ser Val Tyr Ala Val Gly Asn Val Ser Gln
465                 470                 475                 480
Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Ser Ala Val Arg Leu Thr Asp Thr Ser
                485                 490                 495
Ser Tyr Pro Thr Trp Lys Gly Ser Ile Ala Leu Pro Asp Gly Gln Asn
            500                 505                 510
Val Glu Trp Lys Cys Leu Ile Arg Asn Glu Ala Asp Ala Thr Leu Val
        515                 520                 525
Arg Gln Trp Gln Ser Gly Gly Asn Asn Gln Val Gln Ala Ala Ala Gly
    530                 535                 540
Ala Ser Thr Ser Gly Ser Phe
545                 550
<210>6
<211>3050
<212>DNA
<213>嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)
<400>6
gatcggcgta ggtttcgcat tcgttgccca ggcgatattt cgccggtgcg ccagcagcct      60
ggaagcaggc ctggtcgccg ccgccggccg tggcgccgac gcccgaacgc agatagccgt     120
ggaaatcgac cgccagggcc gggccgccga ccagcagggc ggcaagcagg caggcgggtt     180
ttaggacgaa cagggggtgc gcggtgtgct tcatgacgag gtccttgttt ttcttgttaa     240
tgccgaatcg atcacgcctt cgctgcgtgt cgcagggcgc agctcggtgg cgaaagcctc     300
ggggatggct ccgctggcgg catcctcccg accagagatt tcgctggcgc agctcgaggg     360
cgtaatcagg atgagtgcgg cgtaatccct ggggtggggc tacgcccggc agggcgcaga     420
tgattgccag gggccttcgg cctggccact acgccgcctg caactgggcg ggggaggttg     480
gtggtcgggg cgtgcagggg cagcctgcgg gtgccggtcg aagacccggc cggcgttcat     540
cctcgtccgg cggccttgcc gtaggatacc cgaacaagca caagaaccgg agtattgcga     600
tgagccacat cctgcgtgcc gccgtattgg cggcggtcct gctgccgttt cccgcactgg     660
ccgatcaggc cggcaagagc ccggccgggg tgcgctacca cggcggcgac gaaatcatcc     720
tccagggctt ccactggaac gtcgtccgcg aagcgcccaa cgactggtac aacatcctcc     780
gccaacaggc ctcgacgatc gcggccgacg gcttctcggc aatctggatg ccggtgccct     840
ggcgtgactt ctccagctgg accgacggcg gcaagtccgg cggcggcgaa ggctacttct     900
ggcacgactt caacaagaac ggccgctacg gcagcgacgc ccagctgcgc caggccgccg     960
gcgcactcgg tggcgccggg gtgaaggtgc tctacgatgt ggtgcccaat cacatgaacc    1020
gcggctaccc ggacaaggag atcaacctgc cggccggcca gggcttctgg cgcaacgact    1080
gcgccgaccc gggcaactac cccaacgact gcgacgacgg tgaccgcttc atcggcggcg    1140
agtcggacct gaacaccggc catccgcaga tttacggcat gtttcgcgac gagcttgcca    1200
acctgcgcag cggctacggc gccggcggct tccgcttcga cttcgttcgc ggctatgcgc    1260
ccgagcgggt cgacagctgg atgagcgaca gcgccgacag cagcttctgc gttggcgagc    1320
tgtggaaagg cccttctgaa tatccgagct gggactggcg caacacggcg agctggcagc    1380
agatcatcaa ggactggtcc gaccgggcca agtgcccggt gttcgacttc gctctcaagg    1440
agcgcatgca gaacggctcg gtcgccgact ggaagcatgg cctcaatggc aaccccgacc    1500
cgcgctggcg cgaggtggcg gtgaccttcg tcgacaacca cgacaccggc tattcgcccg    1560
ggcagaacgg cggccagcac cactgggcgc tgcaggacgg gctgatccgc caggcctacg    1620
cctacatcct caccagcccg ggcacgccgg tggtgtactg gtcgcacatg tacgactggg    1680
gctacggcga cttcatccgc cagctgatcc aggtgcggcg caccgccggc gtgcgcgccg    1740
attcggcgat cagcttccat agcggctaca gcggtctggt cgctaccgtc agcggcagcc    1800
agcagaccct ggtggtggcg ctcaactccg atctggccaa ccccggccag gttgccagcg    1860
gcagcttcag cgaggcggtc aacgccagca acggccaggt gcgcgtctgg cgcagcggta    1920
gcggcgatgg cggcgggaat gacggcggcg agggtggctt ggtcaatgtg aactttcgct    1980
gcgacaacgg cgtgacgcag atgggcgaca gcgtctacgc ggtgggcaac gtcagccagc    2040
tcggcaactg gagcccggcc tccgcggtac ggctgaccga caccagcagc tatccgacct    2100
ggaagggcag catcgccctg cctgacggtc agaacgtgga atggaagtgc ctgatccgca    2160
acgaggcgga cgcgacgctg gtgcgtcagt ggcaatcggg cggcaacaac caggtccagg    2220
ccgccgccgg cgcgagcacc agcggctcgt tctgacgaca tgcccgcccg gcctcggcta    2280
cgcctacgcc gggcggctcc tcccgaccca gggtgggcag ggaggaggcc ggcgacgggc    2340
cgggccgccg atgctggcac gacaaccata aaagccttcg cgctgcgctg tcgtatcagg    2400
agctgttcat gttggcccag acccgctcga cccctttccg gcttggcttc ctggcccggc    2460
tgtacctgct gatcgccgca ctggtggcct tgctgatgct ggtagccggc accagcctgg    2520
ttgccatcgg ccgcctgcaa ggcaatgccg agcaaatctc gtcgaccgcg tcgcgtctgc    2580
tggtcagcga gagcttcttc ggtacgttgc agagcctgac gcagaacctg tccgacgccc    2640
tggccgagga ccggcctgac cagctcgacg gctatgtcgg ccggcatcgc acgctgcagg    2700
accaggccct cgagctgttc gcccagctgg agcgggtgac gccggcacat gccgagacca    2760
agcaagcctg gcggcgctgt tgccggagct cgaccgccgc agcctggcgc tgatcgatgc    2820
gcacgcgacc tgctcgcgcg tggggcgcaa cgccgtcgcc tgcgcgatct gcagctgcag  2880
ttctcgcggc tcaagcagga cctgctgcag gcgcagttcg tgacgggcga cgagctggtc  2940
gcctattcca tcaagcagtt catcatcccg ctcgagcagg tcgagcgctg ctgttcgatg  3000
ccatcggcgt gtcttcgatc aaggcactcg atgaagcggg tgcgcagatc             3050
<210>7
<211>527
<212>PRT
<213>施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400>7
Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Asn Ala Val Arg Tyr His Gly Gly Asp
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Asn Asp Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ala Thr Ile Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Trp Ser Asp Gly Ser Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg
                85                  90                  95
Gln Ala Ala Ser Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Gly Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Gly Gln Gly Phe Trp Arg Asn Asp Cys Ala Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Ile Gly Gly Asp
145                 150                 155                 160
Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Val Tyr Gly Met Phe Arg Asp
                165                 170                 175
Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asn Ser Trp Met Thr
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Asp Asn Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Gly Pro
    210                 215                 220
Ser Glu Tyr Pro Asn Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe
                245                 250                 255
Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Ile Ala Asp Trp Lys His
            260                 265                 270
Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr
        275                 280                 285
Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly
    290                 295                 300
Gln His His Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Ser His Met
                325                 330                 335
Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
            340                 345                 350
Arg Ala Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly
        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
    370                 375                 380
Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Gly Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp
                405                 410                 415
Arg Ser Gly Thr Gly Ser Gly Gly Gly Glu Pro Gly Ala Leu Val Ser
            420                 425                 430
Val Ser Phe Arg Cys Asp Asn Gly Ala Thr Gln Met Gly Asp Ser Val
        435                 440                 445
Tyr Ala Val Gly Asn Val Ser Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Ala
    450                 455                 460
Ala Leu Arg Leu Thr Asp Thr Ser Gly Tyr Pro Thr Trp Lys Gly Ser
465                 470                 475                 480
Ile Ala Leu Pro Ala Gly Gln Asn Glu Glu Trp Lys Cys Leu Ile Arg
                485                 490                 495
Asn Glu Ala Asn Ala Thr Gln Val Arg Gln Trp Gln Gly Gly Ala Asn
            500                 505                 510
Asn Ser Leu Thr Pro Ser Glu Gly Ala Thr Thr Val Gly Arg Leu
515                 520                 525
<210>8
<211>527
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>8
Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Asn Ala Val Arg Tyr His Gly Gly Asp
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ala Thr Ile Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Trp Ser Asp Pro Ser Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg
                85                  90                  95
Gln Ala Ala Ser Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Asp Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Asp
145                 150                 155                 160
Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Val Tyr Gly Met Phe Arg Asp
                165                 170                 175
Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asn Ser Trp Met Thr
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Asp Asn Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Ala Pro
    210                 215                 220
Ser Glu Tyr Pro Asn Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe
                245                 250                 255
Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Ile Ala Asp Trp Lys His
            260                 265                 270
Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr
        275                 280                 285
Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly
    290                 295                 300
Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met
                325                 330                 335
Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
            340                 345                 350
Arg Ala Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly
        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
    370                 375                 380
Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Gly Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp
                405                 410                 415
Arg Ser Gly Thr Gly Ser Gly Gly Gly Glu Pro Gly Ala Leu Val Ser
            420                 425                 430
Val Ser Phe Arg Cys Asp Asn Gly Ala Thr Gln Met Gly Asp Ser Val
        435                 440                 445
Tyr Ala Val Gly Asn Val Ser Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Ala
    450                 455                 460
Ala Leu Arg Leu Thr Asp Thr Ser Gly Tyr Pro Thr Trp Lys Gly Ser
465                 470                 475                 480
Ile Ala Leu Pro Ala Gly Gln Asn Glu Glu Trp Lys Cys Leu Ile Arg
                485                 490                 495
Asn Glu Ala Asn Ala Thr Gln Val Arg Gln Trp Gln Gly Gly Ala Asn
            500                 505                 510
Asn Ser Leu Thr Pro Ser Glu Gly Ala Thr Thr Val Gly Arg Leu
        515                 520                 525
<210>9
<211>527
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>9
Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Asn Ala Val Arg Tyr His Gly Gly Asp
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ala Thr Ile Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Trp Ser Asp Pro Ser Arg Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg
                85                  90                  95
Gln Ala Ala Ser Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Asp Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Asp
145                 150                 155                 160
Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Val Tyr Gly Met Phe Arg Asp
                165                 170                 175
Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asn Ser Trp Met Thr
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Asp Asn Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Ala Pro
    210                 215                 220
Ser Glu Tyr Pro Asn Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe
                245                 250                 255
Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Ile Ala Asp Trp Lys His
            260                 265                 270
Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr
        275                 280                 285
Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly
    290                 295                 300
Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met
                325                 330                 335
Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Glu Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
            340                 345                 350
Arg Ala Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly
        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
    370                 375                 380
Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Gly Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp
                405                 410                 415
Arg Ser Gly Thr Gly Ser Gly Gly Gly Glu Pro Gly Ala Leu Val Ser
            420                 425                 430
Val Ser Phe Arg Cys Asp Asn Gly Ala Thr Gln Met Gly Asp Ser Val
        435                 440                 445
Tyr Ala Val Gly Asn Val Ser Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Ala
    450                 455                 460
Ala Leu Arg Leu Thr Asp Thr Ser Gly Tyr Pro Thr Trp Lys Gly Ser
465                 470                 475                 480
Ile Ala Leu Pro Ala Gly Gln Asn Glu Glu Trp Lys Cys Leu Ile Arg
                485                 490                 495
Asn Glu Ala Asn Ala Thr Gln Val Arg Gln Trp Gln Gly Gly Ala Asn
            500                 505                 510
Asn Ser Leu Thr Pro Ser Glu Gly Ala Thr Thr Val Gly Arg Leu
        515                 520                 525
<210>10
<211>527
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>10
Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Asn Ala Val Arg Tyr His Gly Gly Asp
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ala Thr Ile Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Trp Ser Asp Pro Ser Arg Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Asn Lys Asn Ser Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg
                85                  90                  95
Gln Ala Ala Ser Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Asp Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Asp
145                 150                 155                 160
Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Val Tyr Gly Met Phe Arg Asp
                165                 170                 175
Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asn Ser Trp Met Thr
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Asp Asn Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Ala Pro
    2l0                 215                 220
Ser Glu Tyr Pro Asn Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe
                245                 250                 255
Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Ile Ala Asp Trp Lys His
            260                 265                 270
Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr
        275                 280                 285
Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly
    290                 295                 300
Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met
                325                 330                 335
Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Glu Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
            340                 345                 350
Arg Ala Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly
        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
    370                 375                 380
Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Gly Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp
                405                 410                 415
Arg Ser Gly Thr Gly Ser Gly Gly Gly Glu Pro Gly Ala Leu Val Ser
            420                 425                 430
Val Ser Phe Arg Cys Asp Asn Gly Ala Thr Gln Met Gly Asp Ser Val
        435                 440                 445
Tyr Ala Val Gly Asn Val Ser Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Ala
    450                 455                 460
Ala Leu Arg Leu Thr Asp Thr Ser Gly Tyr Pro Thr Trp Lys Gly Ser
465                 470                 475                 480
Ile Ala Leu Pro Ala Gly Gln Asn Glu Glu Trp Lys Cys Leu Ile Arg
                485                 490                 495
Asn Glu Ala Asn Ala Thr Gln Val Arg Gln Trp Gln Gly Gly Ala Asn
            500                 505                 510
Asn Ser Leu Thr Pro Ser Glu Gly Ala Thr Thr Val Gly Arg Leu
        515                 520                 525
<210>11
<211>548
<212>PRT
<213>施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400>11
Met Ser His Ile Leu Arg Ala Ala Val Leu Ala Ala Met Leu Leu Pro
1               5                   10                  15
Leu Pro Ser Met Ala Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Asn Ala Val Arg
            20                  25                  30
Tyr His Gly Gly Asp Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val
        35                  40                  45
Val Arg Glu Ala Pro Asn Asp Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala
    50                  55                  60
Ala Thr Ile Ala Ala Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro
65                  70                  75                  80
Trp Arg Asp Phe Ser Ser Trp Ser Asp Gly Ser Lys Ser Gly Gly Gly
                85                  90                  95
Glu Gly Tyr Phe Trp His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser
            100                 105                 110
Asp Ala Gln Leu Arg Gln Ala Ala Ser Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val
        115                 120                 125
Lys Val Leu Tyr Asp Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Gly Tyr Pro
    130                 135                 140
Asp Lys Glu Ile Asn Leu Pro Ala Gly Gln Gly Phe Trp Arg Asn Asp
145                 150                 155                 160
Cys Ala Asp Pro Gly Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg
                165                 170                 175
Phe Ile Gly Gly Asp Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Val Tyr
            180                 185                 190
Gly Met Phe Arg Asp Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gln Tyr Gly Ala
        195                 200                 205
Gly Gly Phe Arg Phe Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val
    210                 215                 220
Asn Ser Trp Met Thr Asp Ser Ala Asp Asn Ser Phe Cys Val Gly Glu
225                 230                 235                 240
Leu Trp Lys Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Asn Trp Asp Trp Arg Asn Thr
                245                 250                 255
Ala Ser Trp Gln Gln Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys
            260                 265                 270
Pro Val Phe Asp Phe Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Ile
        275                 280                 285
Ala Asp Trp Lys His Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg
    290                 295                 300
Glu Val Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro
305                 310                 315                 320
Gly Gln Asn Gly Gly Gln His His Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Gln Ala Tyr Ala Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val
            340                 345                 350
Tyr Trp Ser His Met Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln
        355                 360                 365
Leu Ile Gln Val Arg Arg Ala Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile
    370                 375                 380
Ser Phe His Ser Gly Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser
385                 390                 395                 400
Gln Gln Thr Leu Val Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Gly Asn Pro Gly
                405                 410                 415
Gln Val Ala Ser Gly Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly
            420                 425                 430
Gln Val Arg Val Trp Arg Ser Gly Thr Gly Ser Gly Gly Gly Glu Pro
        435                 440                 445
Gly Ala Leu Val Ser Val Ser Phe Arg Cys Asp Asn Gly Ala Thr Gln
    450                 455                 460
Met Gly Asp Ser Val Tyr Ala Val Gly Asn Val Ser Gln Leu Gly Asn
465                 470                 475                 480
Trp Ser Pro Ala Ala Ala Leu Arg Leu Thr Asp Thr Ser Gly Tyr Pro
                485                 490                 495
Thr Trp Lys Gly Ser Ile Ala Leu Pro Ala Gly Gln Asn Glu Glu Trp
            500                 505                 510
Lys Cys Leu Ile Arg Asn Glu Ala Asn Ala Thr Gln Val Arg Gln Trp
        515                 520                 525
Gln Gly Gly Ala Asn Asn Ser Leu Thr Pro Ser Glu Gly Ala Thr Thr
    530                 535                 540
Val Gly Arg Leu
545
<210>12
<211>2082
<212>DNA
<213>施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400>12
gatcggcctt tacggaaagt gatagagctt ctcttccggc aaactttgtt ccccagtgac     60
agagggttag tatcggatcg cttcctcttt gggtttggta gatcaggagc gccgagagca    120
ggatgaaatc ctgcggccag aaggtcgcgc cgaagatgtg gaactgctgc tggccgagat    180
ccggccggcg ttcatcctcg tccggcggcc ttgccgccag ctacccgaac aagcacaaga    240
accggagtat tgcgatgagc cacatcctgc gagccgccgt attggcggcg atgctgttgc    300
cgttgccgtc catggccgat caggccggca agagccccaa cgctgtgcgc taccacggcg    360
gcgacgaaat cattctccag ggctttcact ggaacgtcgt ccgcgaagcg cccaacgact    420
ggtacaacat cctgcgccag caggccgcga ccatcgccgc cgacggcttc tcggcgatct    480
ggatgccggt gccctggcgc gacttctcca gctggagcga cggcagcaag tccggcggcg    540
gtgaaggcta cttctggcac gacttcaaca agaacggccg ctatggcagt gacgcccagc    600
tgcgtcaggc cgccagcgcg ctcggtggcg ccggcgtgaa agtgctttac gacgtggtgc    660
ccaaccacat gaaccgtggc tatccggaca aggagatcaa cctcccggcc ggccagggct    720
tctggcgcaa cgactgcgcc gacccgggca actaccccaa tgattgcgac gacggcgacc    780
gcttcatcgg cggcgatgcg gacctcaaca ccggccaccc gcaggtctac ggcatgttcc    840
gcgatgaatt caccaacctg cgcagtcagt acggtgccgg cggcttccgc ttcgactttg    900
ttcggggcta tgcgccggag cgggtcaaca gctggatgac cgatagcgcc gacaacagct    960
tctgcgtcgg cgaactgtgg aaaggcccct ctgagtaccc gaactgggac tggcgcaaca   1020
ccgccagctg gcagcagatc atcaaggact ggtccgaccg ggccaagtgc ccggtgttcg   1080
acttcgccct caaggaacgc atgcagaacg ctcgatcgcc gactggaagc acgcctgaac   1140
ggcaatcccg acccgcgtgg cgcgaggtgg cggtgacctt cgtcgacaac cacgacaccg  1200
gctactcgcc cgggcagaac ggtgggcagc accactgggc tctgcaggac gggctgatcc  1260
gccaggccta cgcctacatc ctcaccagcc ccggtacgcc ggtggtgtac tggtcgcaca  1320
tgtacgactg gggttacggc gacttcatcc gtcagctgat ccaggtgcgt cgcgccgccg  1380
gcgtgcgcgc cgattcggcg atcagcttcc acagcggcta cagcggtctg gtcgccaccg  1440
tcagcggcag ccagcagacc ctggtggtgg cgctcaactc cgacctgggc aatcccggcc  1500
aggtggccag cggcagcttc agcgaggcgg tcaacgccag caacggccag gtgcgcgtgt  1560
ggcgtagcgg cacgggcagc ggtggcggtg aacccggcgc tctggtcagt gtgagtttcc  1620
gctgcgacaa cggcgcgacg cagatgggcg acagcgtcta cgcggtcggc aacgtcagcc  1680
agctcggtaa ctggagcccg gccgcggcgt tgcgcctgac cgacaccagc ggctacccga  1740
cctggaaggg cagcattgcc ttgcctgccg gccagaacga ggaatggaaa tgcctgatcc  1800
gcaacgaggc caacgccacc caggtgcggc aatggcaggg cggggcaaac aacagcctga  1860
cgccgagcga gggcgccacc accgtcggcc ggctctagcc cgggcggcaa ctcggccgtc  1920
tcgcggatgt gaggcggctg gtctcggcgg cggtatcgtt gcgctggggg cggggccgcc  1980
gttcacgcgc cctgctatcg ctagttttcg gcgctccgcg catcggccag ttgccagcga  2040
atcgcctgcg cttcggcctg gtgcaggtcg tcgagcagcg ct                     2082
<210>13
<211>430
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>13
Met Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly
1               5                   10                  15
Asp Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala
            20                  25                  30
Pro Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala
        35                  40                  45
Ala Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe
    50                  55                  60
Ser Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe
65                  70                  75                  80
Trp His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu
                85                  90                  95
Arg Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr
            100                 105                 110
Asp Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Ile
        115                 120                 125
Asn Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro
    130                 135                 140
Gly Asn Gly Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly
145                 150                 155                 160
Glu Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg
                165                 170                 175
Asp Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg
            180                 185                 190
Phe Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met
        195                 200                 205
Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Glu
    210                 215                 220
Pro Ser Glu Tyr Pro Pro Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln
225                 230                 235                 240
Gln Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp
                245                 250                 255
Phe Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys
            260                 265                 270
Gln Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val
        275                 280                 285
Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Glu
    290                 295                 300
Gly Gln His Leu Trp Pro Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr
305                 310                 315                 320
Ala Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His
                325                 330                 335
Met Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val
            340                 345                 350
Arg Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser
        355                 360                 365
Gly Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu
    370                 375                 380
Val Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val
                405                 410                 415
Trp Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly
            420                 425                 430
<2l0>14
<211>1293
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>变异体核苷酸序列
<400>14
atggatcagg ccggcaagag cccggccggg gtgcgctacc acggcggcga cgaaatcatc    60
ctccagggct tccactggaa cgtcgtccgc gaagcgccct acaactggta caacatcctc   120
cgccaacagg cctcgacgat cgcggccgac ggcttctcgg caatctggat gccagtgccc   180
tggcgtgact tctccagctg gaccgacggc ggcaagtccg gcggcggcga aggctacttc   240
tggcacgact tcaacaagaa cggccgctac ggcagcgacg cccagctgcg ccaggccgcc   300
ggcgcactcg gtggcgccgg ggtgaaggtg ctctacgatg tggtgcccaa tcacatgaac   360
cgcttctacc cggacaagga gatcaacctg ccggccggcc agcgcttctg gcgcaacgac   420
tgcccggatc cgggcaacgg ccccaacgac tgcgacgacg gtgaccgctt cctgggcggc   480
gaggcggacc tgaacaccgg ccatccgcag atttacggca tgtttcgcga cgagtttacc   540
aacctgcgca gcggctacgg cgccggcggc ttccgcttcg acttcgttcg cggctatgcg   600
cccgagcggg tcgacagctg gatgagcgac agcgccgaca gcagcttctg cgttggcgag   660
ctgtggaaag agccttctga atatccgccg tgggactggc gcaacacggc gagctggcag   720
cagatcatca aggactggtc cgaccgggcc aagtgcccgg tgttcgactt cgctctcaag   780
gagcgcatgc agaacggctc ggtcgccgac tggaagcagg gcctcaatgg caaccccgac   840
ccgcgctggc gcgaggtggc ggtgaccttc gtcgacaacc acgacaccgg ctattcgccc   900
gggcagaacg aaggccagca cctgtggccg ctgcaggacg ggctgatccg ccaggcctac   960
gcctacatcc tcaccagccc gggcacgccg gtggtgtact ggccgcacat gtacgactgg  1020
ggctacggcg acttcatccg ccagctgatc caggtgcggc gcaccgccgg cgtgcgcgcc  1080
gattcggcga tcagcttcca tagcggctac agcggtctgg tcgctaccgt cagcggcagc  1140
cagcagaccc tggtggtggc gctcaactcc gatctggcca accccggcca ggttgccagc  1200
ggcagcttca gcgaggcggt caacgccagc aacggccagg tgcgcgtctg gcgcagcggt  1260
agcggcgatg gcggcgggaa tgacggcggc tga                               1293
<210>15
<211>430
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>15
Met Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly
1               5                   10                  15
Asp Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala
            20                  25                  30
Pro Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala
        35                  40                  45
Ala Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe
    50                  55                  60
Ser Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe
65                  70                  75                  80
Trp His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu
                85                  90                  95
Arg Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr
            100                 105                 110
Asp Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Ile
        115                 120                 125
Asn Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro
    130                 135                 140
Gly Asp Gly Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly
145                 150                 155                 160
Glu Ser Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg
                165                 170                 175
Asp Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg
            180                 185                 190
Phe Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met
        195                 200                 205
Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Glu
    210                 215                 220
Pro Ser Glu Tyr Pro Pro Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln
225                 230                 235                 240
Gln Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp
                245                 250                 255
Phe Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys
            260                 265                 270
Gln Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val
        275                 280                 285
Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Glu
    290                 295                 300
Gly Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr
305                 310                 315                 320
Ala Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His
                325                 330                 335
Met Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val
            340                 345                 350
Arg Arg Thr Ala G1y Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser
        355                 360                 365
Gly Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu
    370                 375                 380
Val Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val
                405                 410                 415
Trp Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly
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<210>16
<211>1293
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
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<223>变异体多肽序列
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Gln Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val
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Phe Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met
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<212>PRT
<213>人工
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<223>变异体多肽序列
<400>23
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Glu Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg
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Asp Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg
            180                 185                 190
Phe Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met
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<400>24
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<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>25
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<223>变异体核苷酸序列
<400>26
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ccggacccgg gaaatggacc gaatgattgc gatgatggcg atagatttct gggcggcgaa   480
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caaaatggag gacaacatca ctggccgctt caagatggcc ttatcagaca ggcgtatgcc   960
tatatcctta catcaccggg aacaccggtt gtttattggc cgcatatgta tgattggggc  1020
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            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser
        195                 200                 205
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Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Glu Gly
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Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
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Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly
        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
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Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly
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cgcatgcaaa atggaagcgt cgccgattgg aaacaaggcc tgaacggaaa tccggacccg   840
agatggagag aagtcgccgt cacgtttgtc gataaccatg acacaggata tagcccggga   900
caaaatgaag gacaacatcg gtggccgctt caagatggcc ttatcagaca ggcgtatgcc   960
tatatcctta catcaccggg aacaccggtt gtttattggc cgcatatgta tgattggggc  1020
tatggcgatt tcatccgcca actgatccag gttagaagaa cagcaggagt cagagcggat  1080
agcgccatta gctttcatag cggctatagc ggacttgtcg ctacagttag cggcagccaa  1140
caaacactgg tcgtcgccct gaatagcgat ctggcaaatc cgggacaagt tgctagcggc  1200
agctttagcg aagcagtcaa tgccagcaat ggccaagtca gagtctggag aagcggaagc  1260
ggagatggag gaggaaatga cggaggataa                                   1290
<210>29
<211>429
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>29
Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg
                85                  90                  95
Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Asn Gly Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu
145                 150                 155                 160
Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp
                165                 170                 175
Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Glu Pro
    210                 215                 220
Ser Glu Tyr Pro Pro Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe
               245                 250                 255
Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys Gln
            260                 265                 270
Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr
        275                 280                 285
Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Glu Gly
    290                 295                 300
Gln His Lys Trp Pro Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met
                325                 330                 335
Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
            340                 345                 350
Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly
        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
    370                 375                 380
Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp
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Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly
            420                 425
<210>30
<211>1290
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>变异体核苷酸序列
<400>30
gatcaagcag gaaaaagccc ggcaggcgtc agatatcatg gcggcgatga aatcatcctt    60
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agagatttta gcagctggac ggatggaggc aaaagcggag gcggcgaagg atatttttgg   240
catgacttta acaaaaacgg ccgctatgga agcgatgctc aactgagaca agcagcagga   300
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ttttatccgg acaaagaaat caatctgccg gcaggccaaa gattttggag aaacgattgc   420
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tatatcctta catcaccggg aacaccggtt gtttattggc cgcatatgta tgattggggc  1020
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<210>31
<211>429
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>变异体多肽序列
<400>31
Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg
                85                  90                  95
Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Asn Gly Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu
145                 150                 155                 160
Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp
                165                 170                 175
Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Glu Pro
    2l0                 215                 220
Ser Glu Tyr Pro Pro Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln
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Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe
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Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr
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Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Glu Gly
    290                 295                 300
Gln His His Trp Pro Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala
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Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met
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Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg
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        355                 360                 365
Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val
    370                 375                 380
Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp
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Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly
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<210>32
<211>1290
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>变异体核苷酸序列
<400>32
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tatggcgatt tcatccgcca actgatccag gttagaagaa cagcaggagt cagagcggat  1080
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caaacactgg tcgtcgccct gaatagcgat ctggcaaatc cgggacaagt tgctagcggc  1200
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<210>33
<211>21
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<213>嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)
<400>33
Met Ser His Ile Leu Arg Ala Ala Val Leu Ala Ala Val Leu Leu Pro
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Phe Pro Ala Leu Ala
            20
<210>34
<211>101
<212>PRT
<213>嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)
<400>34
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<213>人工
<220>
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<213>人工
<220>
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<213>人工
<220>
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<212>DNA
<213>人工
<220>
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<210>39
<211>25
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<213>人工
<220>
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<212>DNA
<213>人工
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<211>20
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<213>人工
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<213>人工
<220>
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<211>20
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<213>人工
<220>
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<213>人工
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<213>人工
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<213>人工
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<213>人工
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<213>人工
<220>
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<211>31
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<213>人工
<220>
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<210>51
<211>31
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<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
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<210>52
<211>43
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<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
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<211>43
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<213>人工
<220>
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<211>21
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<213>人工
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<211>25
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<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
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<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
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<210>59
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<221>misc feature
<222>(18)..(18)
<223>n为a，c，g或t
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<213>人工
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<213>人工
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<222>(19)..(20)
<223>n为a，c，g或t
<400>82
caaaatgaag gacaacatnn stggccgctt caagatggcc      40

Claims (70)

1.可衍生自具有淀粉酶活性的母体多肽的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽包含307位替换成赖氨酸(K)或精氨酸(R)的氨基酸替换，参考SEQ ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列的位置编号。
2.根据权利要求1的PS4变异体多肽，其可衍生自具有外切淀粉酶活性，优选非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽。
3.根据权利要求1的PS4变异体多肽，其中307位的氨基酸替换为替换成赖氨酸(307K)，优选H307K，或替换成精氨酸(307R)，优选H307R的替换。
4.根据权利要求1、2或3的PS4变异体多肽，其进一步包含70位的氨基酸替换。
5.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中70位的氨基酸替换为替换成天冬氨酸(70D)，优选G70D的替换。
6.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽序列的272位的氨基酸为组氨酸(H)。
7.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽序列的303位的氨基酸为甘氨酸(G)。
8.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽进一步包含一个或多个选自以下位置的突变：33、34、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、309或334。
9.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽的其它突变选自33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、309P、334P，优选N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、A309P和S334P。
10.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽与SEQ ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列相比包含以下替换：33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307K、309P、334P，优选N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P、S334P。
11.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽包含SEQ ID NO：21(pSac-pMS382)序列。
12.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽与SEQ ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列相比包含以下替换：33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307R、309P、334P，优选N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307R、A309P、S334P。
13.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽包含SEQ ID NO：23(pSac-pMS382R)序列。
14.可衍生自具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽与SEQ ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列相比包含以下替换：33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、309P、334P，优选N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、A309P、S334P。
15.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述PS4变异体多肽包含SEQ ID NO：25(pSac-pMS382H)序列。
16.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述母体多肽包含非麦芽糖生成外切淀粉酶，优选葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)。
17.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述母体多肽为或可衍生自假单胞菌，优选嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌。
18.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中所述母体多肽为来自具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5所示序列的嗜糖假单胞菌外切淀粉酶的非麦芽糖生成外切淀粉酶。
19.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其具有至少75％与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5相同的氨基酸序列。
20.根据权利要求1-8中任一项的PS4变异体多肽，其中所述母体多肽为来自具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11所示序列的施氏假单胞菌的非麦芽糖生成外切淀粉酶。
21.根据权利要求1-8或11任一项的PS4变异体多肽，其具有至少75％与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5相同的氨基酸序列。
22.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其包含说明书、权利要求书或附图所列的序列。
23.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其包含选自SEQ ID NO：21(pSac-pMS382)、SEQ ID NO：23(pSac-pMS382R)和SEQ ID NO：25(pSac-pMS382H)的序列。
24.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中当在相同条件下检测时所述PS4变异体多肽与母体多肽或野生型多肽相比具有更高的热稳定性。
25.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中与母体多肽或野生型多肽相比所述半衰期(t1/2)，优选于60摄氏度，增加了15％或更多，优选50％或更多，最优选100％或更多。
26.根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽，其中用PS4变异体多肽处理的食品与用母体多肽或野生型多肽处理的产品相比具有一个或多个，优选全部以下性质：(a)硬度更低；(b)弹性更高；(c)粘性更高；(d)破碎性更低以及(e)可折叠性更高。
27.根据权利要求26的PS4变异体多肽，其中与使用母体多肽或野生型多肽处理的食品相比所述食品的弹性、粘性或可折叠性独立增加15％或更多，优选50％或更多，最优选100％或更多。
28.根据权利要求26或27的PS4变异体多肽，其中与使用母体多肽或野生型多肽处理的食品相比用所述PS4变异体多肽处理的食品的弹性、粘性和可折叠性均增加。
29.根据权利要求26的PS4变异体多肽，其中与使用母体多肽或野生型多肽处理的食品相比所述食品的硬度或破碎性独立降低15％或更多，优选50％或更多，最优选100％或更多。
30.根据权利要求26或29的PS4变异体多肽，其中与使用母体多肽或野生型多肽处理的食品相比用所述PS4变异体多肽处理的食品的硬度和破碎性均增加。
31.包含至少20个根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽残基的多肽，其中所述多肽具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性。
32.通过在PS4变异体多肽序列的一个或多个残基处突变可衍生自根据之前权利要求任一项的PS4变异体多肽的多肽，其中所述多肽与PS4变异体多肽的母体多肽或野生型多肽相比具有更高的热稳定性或更高的外切特异性或二者，或其中用PS4变异体多肽处理的食品与用母体多肽或野生型多肽处理的产品相比具有一个或多个，优选全部以下性质：(a)硬度更低；(b)弹性更高；(c)粘性更高；(d)破碎性更低以及(e)可折叠性更高。
33.之前权利要求任一项所列PS4变异体多肽用作食品或饲料添加剂的用途。
34.处理淀粉的方法，其包含将所述淀粉与权利要求1-32中任一项所列多肽接触使得所述多肽从淀粉中生成一种或多种线性产物。
35.权利要求1-32中任一项所列多肽用于制备食品或饲料产品的用途。
36.制做食品或饲料产品的方法，其包含将权利要求1-32中任一项所列多肽与食品或饲料成分混合。
37.根据权利要求35的用途或根据权利要求36的方法，其中所述食品包含生面团或生面团产品，优选被加工的生面团产品。
38.根据权利要求35-37中任一项的用途或方法，其中所述食品为烘烤产品。
39.制作烘烤产品的方法，其包含：(a)提供淀粉介质；(b)向淀粉介质中加入权利要求1-32中任一项所列多肽；(c)在步骤(b)中或之后加热淀粉介质以生产烘烤产品。
40.通过根据权利要求35-39中任一项的方法得到的食品、饲料产品、生面团产品或烘烤产品。
41.生面团改进剂组合物，其中所述改进剂组合物包含权利要求1-32中任一项所列多肽和至少一种其它生面团成分或生面团添加剂。
42.包含面粉和权利要求1-32中任一项所列多肽的组合物。
43.权利要求1-42中任一项所列PS4变异体多肽在生面团产品中使用以推迟或降低生面团产品的老化，优选有害凝沉的用途。
44.权利要求1-42中任一项所列PS4变异体多肽在生面团产品中使用以改善生面团产品的硬度、弹性、粘性、破碎性或可折叠性之一或更多中的用途。
45.之前权利要求所列PS4变异体多肽与以下之一或更多的组合：
(a)来自嗜热脂肪芽胞杆菌的麦芽糖生成α-淀粉酶(也称作葡聚糖1，4-α-淀粉水解酶(EC 3.2.1.133))或其具有麦芽糖生成α-淀粉酶活性的变异体、同源物或突变体；
(b)来自例如芽胞杆菌、曲霉、嗜热真菌或木霉的烘焙木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；
(c)来自淀粉液化芽孢杆菌的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)及其具有α-淀粉酶活性的变异体、同源物或突变体；以及
(d)来自异孢镰孢菌的脂肪酶例如糖脂酶。
46.根据权利要求45的组合在根据之前权利要求任一项的应用中的用途。
47.用根据权利要求31的组合处理生产的食品或饲料产品。
48.可编码根据权利要求1至32中任一项的多肽的核酸。
49.根据权利要求48的核酸，其具有至少75％与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12相同的核酸序列。
50.包含至少60个根据权利要求48或49的核酸残基的片段的核酸，其可编码具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的多肽。
51.可衍生自母体序列的核酸序列，所述母体序列可编码非麦芽糖生成外切淀粉酶，其核酸序列包含一个或多个残基处的替换从而使所述核酸在307位编码赖氨酸(R)或精氨酸(K)残基，任选同时包含一个或多个其它突变从而使所述核酸编码一个或多个选自33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、309P、334P的残基，参考SEQ ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列的位置编码。
52.根据权利要求48-52中任一项的PS4核酸序列，其可通过一个或多个核苷酸残基的替换衍生自编码非麦芽糖生成外切淀粉酶的母体序列。
53.根据权利要求48-52中任一项的核酸序列，其选自：SEQ IDNO：22(pSac-pMS382)、SEQ ID NO：24(pSac-pMS382R)和SEQ IDNO：26(pSac-pMS382H)。
54.包含根据权利要求48-53中任一项的PS4核酸的质粒。
55.包含根据权利要求48-54中任一项的PS4核酸或可表达根据权利要求1-32中任一项的多肽的表达质粒。
56.包含优选转化有根据权利要求54的质粒或根据权利要求55的表达载体的宿主细胞。
57.可表达根据权利要求1-32中任一项的多肽的细胞。
58.根据权利要求56的宿主细胞或根据权利要求57的细胞，其为细菌、真菌或酵母细胞。
59.表达PS4变异体多肽的方法，所述方法包括获得宿主细胞或根据权利要求56、57或58的细胞并从该细胞或宿主细胞表达所述多肽并任选纯化所述多肽。
60.改变多肽优选非麦芽糖生成外切淀粉酶的序列的方法，其方式为将70位替换成碱性或带正电荷残基的氨基酸替换，任选与一个或多个其它选自33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272H、303G、309P、334P的突变一起(参考SEQ ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列的位置编码)引入具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽。
61.根据权利要求60的方法，其中所述碱性或带正电荷残基包含赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)。
62.根据权利要求60或61的方法，其中通过改变编码非麦芽糖生成外切淀粉酶的核酸的序列改变所述非麦芽糖生成外切淀粉酶的序列。
63.生产PS4多肽变异体的方法，该方法包含向具有非麦芽糖生成外切淀粉酶活性的母体多肽引入氨基酸替换，所述氨基酸替换选自33Y、34N、70K/R/H、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272H、303G、309P、334P，参考SEQ ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列的位置编码。
64.根据权利要求62或63的方法，其中改变编码母体肽的核酸序列以引入氨基酸替换。
65.改变编码非麦芽糖生成外切淀粉酶的核酸序列的方法，该方法包括向序列中引入编码选自33Y、34N、70K/R/H、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272H、303G、309P、334P的氨基酸残基的密码子，参考SEQ ID NO：1所示嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列的位置编码。
66.增加多肽的热稳定性或外切特异性或二者的方法，该方法包括权利要求58-65所列步骤。
67.根据权利要求58-66中任一项的方法，其中所述多肽是分离或纯化的或二者。
68.根据权利要求58-67中任一项的方法获得的多肽。
69.根据权利要求58-68中任一项的方法获得的多肽。
70.参考或如附图中所示基本如前文所述的PS4变异体多肽、用途、方法、食品、饲料产品、生面团产品、烘烤产品、改进剂组合物、组合物、核酸、载体或宿主细胞。
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