JPH02222686A - マルトテトラオース生成酵素遺伝子 - Google Patents

マルトテトラオース生成酵素遺伝子

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JPH02222686A
JPH02222686A JP4331289A JP4331289A JPH02222686A JP H02222686 A JPH02222686 A JP H02222686A JP 4331289 A JP4331289 A JP 4331289A JP 4331289 A JP4331289 A JP 4331289A JP H02222686 A JPH02222686 A JP H02222686A
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JP
Japan
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amino acid
acid sequence
maltotetraose
gly
ala
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Pending
Application number
JP4331289A
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English (en)
Inventor
Toshiya Takano
高野　敏弥
Shoichi Kobayashi
昭一 小林
Kenka Shiyuu
建華 周
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National Food Research Institute
Original Assignee
National Food Research Institute
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Publication date
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Publication of JPH02222686A publication Critical patent/JPH02222686A/ja
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、マルトテトラオース生成酵素遺伝子情報を担
うＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ新規プラスミド、該プ
ラスミドを導入した新規な微生物、マルトテトラオース
生成酵素活性を有するポリペプチド及びポリペプチドの
分泌に用いられるシグナルペプチドに関する。
〔従来の技術〕
？ＪＬ／トチトラオース生成酵素（ＥＣ３，２，１，６
０，ｅｘａａ＋ａｌｔｏｔｅｔｒａｏｈｙｄｒｏｌａｓ
ｅ）は、１９７１年ＲｏｂｙｔとＡｃｋｅｒｍａｎによ
ってブシュ−トモナス・スツ・ンツエリ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｓｌ但ｔｚｅυつの培養液中に初めて発見
された。近１年、マルトテトラオース生成酵素はブシェ
ードモナス・サツ力ロフイラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
懸胚り二Ｗ辻堕）も産生ずる事が明らかにされた。
マルトテトラオースは臨床試薬や機能性食品素材として
需要が増大している。しかしながら、従来の微生物によ
るマルトテトラオース生成酵素産性量は低く、供給量を
増大させるためにマルトテトラオース生成酵素のアミノ
酸配列や、それをコードする遺伝子構造の解明が必要と
なってきた。
（発明が解決しよとする課題〕 本発明は、マルトテトラオース生成酵素活性を有するポ
リペプチドのアミノ酸配列、ポリペプチドの分泌に必要
なシグナル配列及びそれらをコードする遺伝子の塩基配
列を明らかにし、さらに、マルトテトラオース生成酵素
遺伝子を種々のベクターに組み込んで宿主微生物に導入
した新規組替え体微生物を提供するものである。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは、上記の目的を達成するため、マルトテト
ラオース生成酵素産生菌より、マルトテトラオース生成
酵素遺伝子をクローン化した後、ＤＮＡ全塩基配列を決
定し、そこにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
を解読した。さらに、該遺伝子を種々のベクターに組み
込んで宿主微生物に導入し、得られた組替え体微生物に
マルトテトラオース生成酵素を産生させることに成功し
、本発明を完成した。
以下に、本発明を具体的に説明する。
（１）マルトテトラオース生成酵素遺伝子のクローン化 マルトテトラオース生成酵素産生能を有する供与体微生
物のＤＮＡは、供与体微生物を培養し、得られる培養物
を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることに
よって調製することができる。
溶菌方法は、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素による処
理や超音波処理などが用いられる。さらに、必要により
プロテアーゼ、リボヌクレアーゼなどの他の酵素剤やラ
ウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用される。
また、凍結融解処理を施すこともある。このようにして
得られる溶菌物からＤＮＡを分離、精製するには、常法
にしたがってフェノール抽出、除蛋白処理、プロテアー
ゼ処理。
リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離など
の方法を適宜組み合わせることによって行うことができ
る。
ＤＮＡを切断する方法は、超音波処理、制限酵素処理な
どにより行うことができる。切断後、必要に応じてホス
ファターゼやＤＮＡポリメラーゼ等の修飾酵素が用いら
れる。また、種々のリンカ−やアダプターを用いること
によりＤＮＡ断片末端の塩基配列を変えることができる
。
切断されたさまざまな長さを持つＤＮＡ断片混合物から
、蔗ＩＪ！密度勾配遠心法や電気泳動したゲルからの抽
出等によって最適な長さの断片のみを得る。
ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るフ
ァージまたはプラスミドが適している。
ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は、ＤＮ
Ａ断片とベクター断片とをＤＮＡリガーゼの作用により
組替えＤＮＡを作成する。
宿主微生物としては、組替えＤＮＡが安定、かつ自律的
増殖が可能でその形質発現のできるものであればよい。
宿主微生物に組替えＤＮＡを導入する方法は、公知の方
法１、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合に
はカルシュラム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｅ、　Ｍ。
ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、、　１１９＋　１０７２（１９７４））な
どを採用することができる。
λフアージＤＮＡであれば、イン　ビトロ　バッゲイジ
ング法（Ｈｏｒｎ、　Ｂ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
６８、２９９　（１９７９））によりλフアージ粒子を
形成し、このλフアージ粒子をエシェリヒア・コリの培
養菌懸濁液に添加して、マルトテトラオース生成酵素生
産能を保有する特殊形質導入ファージを得ることができ
る。
組替えＤＮＡが導入された形質転換微生物の選択方法は
、液体選択培地で培養し、培養液中のマルトテトラオー
ス生成酵素活性を測定する。液体選択培地にはベクター
上のマーカーによって、最小培地や抗生物質添加培地が
適宜用いられる。
酵素活性の測定は、培養液に澱粉溶液を加え、４０℃で
保温した後、薄層クロマトグラフィーや高速液体クロマ
トグラフィーを用いて生成したマルトテトラオースの同
定や定量が行なわれる。
得られたマルトテトラオース生成酵素生産菌を液体選択
培地にて３７゛Ｃで培養し、公知の方法、例えばアルカ
リ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏ
ｌｙ。
Ｊ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｓ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　Ｌ
　１５１３　（１９７９））によってプラスミドを得る
ことができる。
（２）　　ＤＮＡ塩基配列の決定 ＤＮＡの塩基配列は、マキサム−ギルバートの化学修飾
法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒ
ｔ、　Ｗ、＋　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　６５．４９９　（１９８０））やジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、　ａｎｄ　
Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、。
Ｇｅｎｅ、　１９．２６９　（１９８２））等により決
定することができる。
ポリペプチドのアミノ酸配列は、塩基配列より解読する
ことができる。また、ポリペプチドを菌体外に分泌させ
るシグナル配列のアミノ酸配列も同様にして決定する。
（３）マルトテトラオース生成酵素活性を有する°ポリ
ペプチドの調製 マルトテトラオース生成酵素活性を有するポリペプチド
は次のようにして調製することができる。
マルトテトラオース生成酵素産住菌あるいは上記の方法
によってマルトテトラオース生成酵素産生能を獲得した
形質転換微生物を液体培養する。
培地としては、該微生物の通常の培養に用いられるもの
であればいずれでもよいが、例えば炭素源としては澱粉
、液化澱粉、グルコース、グリセリン、糖蜜、廃糖蜜な
とがあり、窒素源としては各種蛋白分解物、大豆粉、肉
エキス、ペプトン、尿素、硝酸塩、アンモニウム塩、酵
母エキス、コーンステイープリカーなどがある。その他
ビオチンなどの栄養素や微量金属、抗生物質などが適宜
使用される。
培養後、酵素が菌体内にある場合には、培養液を遠心分
離して菌体を得、超音波や細胞壁溶解酵素等で処理し、
破砕菌体を遠心分離して除き、粗酵素液とする。また、
酵素が培地中にある場合には、培養液を遠心分離して菌
体を除き、以後の精製を行う。
得られた粗酵素液から塩析、透析、イオン交換樹脂、ア
フィニティクロマトグラフ処理等−ＩＩＨ的酵素精製法
によりマルトテトラオース生成酵素を単離することがで
きる。
得られた精製ポリペプチドを用いて、例えばＤＡＢＩＴ
Ｃ法（Ｃｈａｎｇ、　Ｊ、　Ｙ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｆ
ｏｃｈｅｍ、＋　１０２＋３８４　（１９８０））や気
相式ベブチドシークエンサー（アプライドバイオシステ
ム社）によって、Ｎ末端のアミノ酸配列を決定すること
ができる。
〔実施例〕
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１ マルトテトラオース生成酵素遺伝子のクローン化 ブシュ−トモナス・サッカロフィラＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ胚胚ｊμ面状匡）ＩＡＭ１５０４を可溶性澱粉を含
む液体培地（可溶性澱粉１ｇ、ポリペプトンＩｇ、　　
リン酸１カリウム０．１ｇ、　　リン酸２カリウム０．
２８ｇ、水１００ｍ１．　ｐＨ７，０）で３０°Ｃで４
８時間培養し、遠心分離にて集菌、洗浄し、得られた菌
から５ａｉｔｏ、　Ｍｉｕｒａの方法（Ｓａｉｋｏ、　
Ｈ，ａｎｄ　Ｍｉｕｒａ。
に＋ｌ　　Ｂｉｏｃｈｉｓ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　
Ａｃｔａ、　　ヱＺ、　　６１９　　（１９６４））に
よって染色体ＯＮ八を分離した。得られたＤＮＡをトリ
ス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素Ｓａｕ　３
ＡＩ（全酒造社製）を添加して、３７°Ｃで部分分解し
た後、分解物から蔗糖密度勾配超遠心法で約２Ｋｂ以上
の染色体断片を分離、取得した。
ベクターにはファージλＬ４７（アマ−ジャム社製）を
用い、ＢａｍＨＩ　（全酒造社製）で切断したλＬ４７
　ＤＮＡと前記のブシュ−トモナス・サツ力ロフィラＩ
ＡＭ１５０４株から得られた約２Ｋｂ以上の染色体断片
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造社製）を添加し
て連結処理した（Ｗｅｉｓｓ、　Ｂ、、　５ａｂｌｏｎ
、八、Ｊ、。
Ｌｉｖｅ＋　Ｔ、　Ｒ，、Ｐａｒｅｅｄ＋　Ｇ、　Ｃ，
ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ＋　Ｃ。
Ｃ，、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２４３．４５
４３　（１９６Ｂ））　。処理液を、イン　ビトロ　バ
ツケイジング　キット（全酒造社製）に添加してイン　
ビトロ　パツケイジフグ法（Ｈｏｒｎ、　Ｂ、、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｎ＋ｏｌｏｇ７’＋餞、　
２９９　（１９７９））により当該ＤＮＡをファージ粒
子に導入した。このファージ粒子をエシェリヒア・コリ
ーＬ９５の菌体懸濁液に添加し、１％可溶性澱わ）、１
．２％の寒天を含むλ培地（バタトトリプトン１゜ｇ、
Ｎａ　Ｃ１１２，５ｇを水１１に溶解）に添加して、３
７°Ｃで培養し、出現したプラークにヨウ素液を噴霧し
てヨウ素反応を起こさなかったファージをマルトテトラ
オース生成酵素生産ファージとして分離することができ
た。
得られたマルトテトラオース生成酵素生産ファージを単
離し、これをエシェリヒア・コリ札６６とともにλ培地
で３７℃で培養した。培養液を遠心分離して宿主菌体を
除き、ポリエチレングリコールを加えてファージ粒子を
凝集させたのち、遠心分離によってファージ粒子を集め
、新規なファージを得た。このファージをλＧＦ１０２
と名づけた。
このファージ粒子を、５０％ホルムアミドを含むファー
ジ懸濁用緩衝液に対して透析し、λＧＦ１０２ファージ
ＤＮＡを得た。ファージλＧＦ１０２　ＤＮＡは４６．
４Ｋｂの大きさで、そのフィジカルマツプ（制限酵素切
断地図）を第１図に示す。ここで白ぬきの部分はベクタ
ーλＬ４７由来で、黒塗りの部分は染色体断片部分であ
る。各略記号はすべて制限酵素切断認識部位である。
ここＩ；得られたＧｌ？１０２ファージＤＮＡをトリス
塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素Ｓａｕ　３Ａ
Ｉを添加し、３７゛Ｃで部分分解した６分解物からショ
糖密度勾配超遠心法で約２Ｋｂ以上の染色体断片を分離
、取得し、プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫを用いて再ク
ローン化を図った。プラスミドｐ）ｌＹ３００ＰＬに（
ヤクルト社製）は４．９Ｋｂでアンピシリン耐性（Ａｐ
’）およびテトラサイクリン耐性（Ｔｃ’）を有し、制
限酵素Ｂａｇ旧によって１箇所切断されるものである。
Ｂａｎ＋　Ｈｌで１箇所切断したｐＨＹ３００ＰＬＫを
アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）処理した後、
前記のλＧＦ１０２ファージから得られた約２Ｋｂ以上
の染色体断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加して
連結処理した。この処理液を用い、エシェリヒア・コリ
Ｃ６００株を宿主として、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ＋　Ｃｏ
ｈｅｎ法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｅ、　Ｍ、　ａｎｄ
　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、＋、Ｕ迫、　１０７２　（１９７４））　ニより
当１亥プラスミドを導入した。
得られた形質転換処理菌体を選択培地である可溶性澱粉
１％、アンピシリン５０μｇ　／ｍ１．寒天１．６％を
含むし培地（バタトトリブトンＬｏｇ。
酵母エキス５ｇ、ＮａＣｆ５ｇを１２の水に溶解）にて
３７°Ｃで培養し、アンピシリン耐性株を得た。
コノアンピシリン耐性株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ
、１％可溶性澱粉を含むＬ培地にて３７°Ｃで２４時間
培養し、培養液中のマルトテトラオース性成酵素活性の
有無を薄層クロマトグラフィーによって調べた。
薄層クロマトグラフィーは培養液をｎ−ブタノール／ｎ
−プロパツール／水（３１５／４）の溶媒系で６０℃に
て２回上昇展開を行ったのち、硫酸を噴霧してマルトテ
トラオースの有無を検索し、マルトテトラオース生成酵
素生産株を分離することができた。
得られたマルトテトラオース生成酵素生産菌株を単離し
、これをアンピシリン５ｏｌＩｇ／ＩＩｉを含むＬ培地
にて３７°Ｃで培養した。培養液を遠心分離して集菌し
、洗浄後、分離菌体からアルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、Ｊ、、　Ｎｕｃｌ
ｅｔｃＡｓｆｄｓ　Ｒｅｓ、、７．１５１３　（１９７
９））によってプラスミドを分離し、新規なプラスミド
を得た。このプラスミドをプラスミドｐＧＦ１１と名づ
けた。
プラスミドｐＧＦ１１は８．　ＯＫｂの大きさで、その
フィジカルマツプを第２図に示す。ここで白ぬきの部分
はベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ由来であり、黒塗りの部
分は染色体断片部分である。Ａｍ’はアンピシリン耐性
、Ｔｃ’はテトラサイクリン耐性を示し、他の各略記号
はすべて制限酵素の切断認識部位である。
プラスミドｐＧＰ１１で形質転換されたエシェリヒア・
コリＣ６００−ｐＧＰｌｌ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ　Ｃ６００−ｐＧＩ”ｌｌ）は工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されている（ＰＥＲＭ　Ｐ−１
０４１１）。
このｐＧＦｌｌＤＮＡをＸｈｏｌ　（宝酒造社製）で切
断し、２．３Ｋｂの断片を得る。この断片をｌｔｐでラ
ベルし、プシェードモナス・サツ力ロフィラＩＡＭ１５
０４株染色体ＤＮＡ　、工ンエリヒア・コリＣ６００株
染色体ＤＮＡ；ｂよびλＧＰ１０２　ＤＮＡのそれぞれ
のＸｈｏ１分解物とサザンハイブリダイゼーション（Ｓ
ａｕｔｈｅｒｎ＋　Ｅ、　Ｍ、、　Ｊ。
Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、　９８．５０３　（１９７５）
）を行った。エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡとは全く
ハイブリダイズしなかったが、ブシュ−トモナス・サツ
力ロフイラＩＡＭ１５０４株染色体ＤＮＡおよびλＧＦ
１０２　ＤＮＡには特異的にハイブリダイズする２、３
Ｋｂのバンドが見いだされた。このことからクローン化
したＤＮＡはブシュ−トモナス・サツ力ロフイラＩＡＭ
１５０４株由来であることが確かめられた。
実施例２ マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の
全塩基配列の決定 実施例１で得られたλＧＦ１０２ファージＤＮＡを制限
酵素Ｘｂａｒ　（宝酒造社製）にて３７°Ｃで分解した
。
この分解物とプラスミドｐＵｃ１９（宝酒造社製）を用
いてマルトテトラオース生成酵素遺伝子の再クローン化
を図った。プラスミドｐＵｃ１９は２．７にｂでアンピ
シリン耐性（Ａｐつを有し、制限酵素Ｘｂａｒによって
１箇所切断されるものである。Ｘｂａτで１箇所切断し
たｐＵｃ１９をアルカリフォスファターゼ処理した後、
前記のλＧＦ１０２ファージから得られたＸｂａＴ切断
断片を混合し、Ｔ４ＯＮＡリガーゼを添加して連結処理
した。この処理液を用い、エシェリヒア・コリＪＭ１０
９株を宿主として、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ＋　Ｃｏｈｅｎ
法により当該プラスミドを導入した。得られた形質転換
処理菌体を選択培地である可溶性澱粉１％。
アンピシリン５０μｇ　／１ｔｔｆ１．寒天１．６％を
含むし培地にて３７°Ｃで培養し、アンピシリン耐性株
を得た。このアンピシリン耐性株をアンピシリン５０μ
ｇ／ｄ、１％可溶性澱粉を含むし培地にて３７°Ｃで２
４時間培養し、培養液中のマルトテトラオース生成酵素
活性の有無を実施例１と同様薄層クロマトグラフィーに
よって調べた。その結果、マルトテトラオース生成酵素
生産菌株を分離することができた。
得られたマルトテトラオース生成酵素生産菌株を単離し
、これをアンピシリン５０μｇ／ｄを含むし培地にて３
７°Ｃで培養した。培養液を遠心分離して・集菌し、洗
浄後、分離菌体からアルカリ抽出法によってプラスミド
を分離し、新規なプラスミドを得た。このプラスミドを
プラスミドｐＧＦ４５と名づけた。
プラスミドｐＧＦ４５は５．８　Ｋｂの大きさで、その
フィジカルマツプを第３図に示す。ここで白ぬきの部分
はベクターｐＵｃ１９由来であり、黒塗りの部分は染色
体断片部分である。Ａ１はアンピシリン耐性を示し、他
の各略記号はすべて制限酵素の切断認識部位である。
プラスミドｐＧＦ４５で形質転換されたエシェリヒア・
コリＪＭ１０９−ｐＧＦ４５（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｔ　ＪＭ１０９−ｐＧＦ４５）は工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ　Ｐ−
１０４１の。
ＤＮＡ塩基配列の決定は、プラスミドｐＧＦ４５とキロ
シーフェンス用デレージョンキット（宝酒造社製）を用
い、Ｈｅｎ１ｋｏｆｆの方法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、　Ｓ
ｏｌ　Ｇｅｎｅ。
２８、３５１　（１９８４））およびジデオキシヌクレ
オチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ＋　Ｊ、　ａｎｄ　Ｖ
ｉｅｉｒａ、　Ｊ、Ｇｅｎｅ＋　ＩＬ２６９　（１９８
２））によって行った。その結果を第４図に示す。
また、ＤＮＡ塩基配列により類推されるポリペプチドの
アミノ酸配列を第５図に示す。
実施例３ マルトテトラオース生成酵素活性を有するポリペプチド
のＮ末端アミノ酸配列の決定 ブシュ−トモナス・サッカロフィラＩＡＭ１５０４　”
＆可溶性澱粉を含む液体培地（可溶性澱粉１ｇ、ポリペ
プトン１ｇ、リン酸１カリウム０．１ｇ、　　リン酸２
カリウム０．２８ｇ、水１００ｍ１ｔ、　ｐＨ７，０）
で３０°Ｃで４８時間培養し、遠心分離にて培養上清を
得た。得られた培養上清に４　’Ｃの低温で硫酸アンモ
ニウムを加え、０．３から０．５飽和で沈澱する両分を
集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解する
。この酵素液を同緩衝液に対して一晩透析した。次に、
ＤＥＡＥ−１−ヨバール６５０Ｍによるイオン交換クロ
マトグラフィーおよびトヨバールＨＷ５５Ｓによるゲル
ろ過クロマトグラフィーにより精製し、電気泳動的に単
一バンドを示すポリペプチドを得ることができた。さら
に、Ａｓａｈｉｐａｋ　Ｂ５−５０２Ｎ　（旭化学工業
社製）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
る精製を行った。
ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列の決定は、気相式ベ
プチドシークエンサー（アプライド　バイオシステム社
　４７７Ａ）によって行った。その結果を第６図に示す
。
この結果からマルトテトラオース生成酵素活性を有する
ポリペプチドのアミノ酸配列は第７図に示す通りであり
、マルトテトラオース生成酵素活性を有するポリペプチ
ドのＮ末端側に続くポリペプチドは、ポリペプチドの分
泌に関わるシグナル配列であることが判明した。
〔発明の効果〕
本発明により、マルトテトラオース生成酵素活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列、ポリペプチドの分泌に
必要なシグナル配列及びそれらをコードする遺伝子の塩
基配列が明らかとなった。
さらに、マルトテトラオース生成酵素遺伝子を種々のベ
クターに組み込んで宿主微生物に導入した新規組替え体
微生物を得、この組替え体微生物が安定的にマルトテト
ラオース生成酵素活性を有するポリペプチドを生産する
ことを見いだした。
したがって、本発明によるマルトテトラオース生成酵素
活性を有するポリペプチドの供給量の増大を図り得るこ
ととなり、その果たす意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
第１図はファージλＧＰ１０２のフィジカルマツプ、第
２図はプラスミドｐＧＦ１１のフィジカルマツプ、ドの
アミノ酸配列、第６図はペプチドシークエンサーによっ
て決定されたマルトテトラオース生成性を有するポリペ
プチドのアミノ酸配列を示している。 第 図 第 図 第４ 図（２） 第４図（１−） ！０　　　　　　　　　２０ ＧＴＣＧＡＡＧＡＣＣＣＧＧＣＣＧＧＣＧＴＴＧＣＣＧ
ＴＡＧＧＡ　　ＴＡＣＣＣＧＡＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧ
ＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＴ
ＴＣＣＣＧＣ＾ＧＡＧＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＧＴＧＣＧ
ＣＴ２＋０　　　　　　　　２２０ ＾ＴＣＣＴＣＣＡＧＧ　　ＧＣＴＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡ
ＡＣＧＡＣＴＧ　　ＧＴＡＣ＾＾（ＡＴＣＧＡＴＣＧＣ
ＧＧＣＣＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＧＴＧ　
　ＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧ　　ＣＧ
ＡＡＧＧＣＴＡＣＧＡＡＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣＡ
ＧＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＡＣＴＣＧＧＴＧＧＣＧＣＡＴ
ＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＡＧＡＴＣ
ＡＡＣＣＴＧＣＣＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＧＴ ＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡ ＴＧＣＣＧＣＣＧＴＡ ＣＴＧＧＣＣＧＡＴＣ ＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧ ＧＡＡＣＧＴＣＧＴＣ ＣＴＣＣＧＣＣＡＡＣ ＣＧＧＣＡＡＴＣＴＧ ＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣ ＴＴＣＴＧＧＣＡＣＧ ＡＣＧＣＣＣＡＧＣＴ ＣにＧＧＧＴＧＡＡＧ ＾＾ＣＣＧＣＧＧＣＴ ＧＣＣＡＧＧＧＣＴＴ ＣＣＧＧＣＧＧＣＣＴ ＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴ ＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧ ＡＣＣＣＧＧＧＣＡＡ ＣＧＡＣＧ＾＾Ａ丁Ｃ ＣＧＣＧＡＡＧＣＧＣ ＾ＧＧＣＣＴＣＧＡＣ ＧＡＴＧＣＣＧＧＴＧ ＧＧＣＧＧＣ＾＾ＧＴ ＡＣＴＴＣ＾＾ＣＡＡ ＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣ ＧＴＧＣ丁ＣＴＡＣＧ ＡＣＣＣＧＧＡＣＡＡ ＣＴＧＧＣＧＣＡＡＣ ＧＡＣＴＧＣＧＣＣＧ　　ＡＣＣＣＧＧＧＣＡＡ　　Ｃ
ＴＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧｌｍｌｏ　　
　　　　　　　６２０　　　　　　　　６３０　　　　
　　　　６４０ＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧ　　ＣＴＴＣＡＴ
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Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｈｉｓｒｐ Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ Ａｌａ　　Ｔｙｒ　　１ｌｅ Ｖａｔ　　Ｔｙｒ　　Ｔｒｐ Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｈｉｓ Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　５ｅｒ Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ Ｖａｌ　　Ａｌａ　　５ｅｒ Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ Ｔｙｒ　　Ａｌａ　　Ｖａ Ｔｒｐ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。 Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒ。 Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　１ｌｅ Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｎ Ｖａｔ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ 第７因（Ｌ） Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　５ｅｒ Ｓｅｒ　　ＨＩｓ　　Ｍｅｔ ｅ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｎ Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ ５ｅｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ Ｃｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｔ Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ Ｌｅｕ　　Ｖａｔ　　Ａｓｎ Ｖａｔ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｎ Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｖａｔ Ａｌａ　　５ｅｒ　　Ａｌａ Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｇｉｎ Ａｒｇ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ Ｔｒｐ　　Ｇｌｎ　　５ｅｒ Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ ｌｉｅ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｎ Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ Ｔｙｒ　　Ａｓｐ　　Ｔｒｐ Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｇｉｎ Ａｌａ　　Ａｓｐ　　５ｅｒ Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｐｒ。 Ｓｅｒ　　Ｃ１ｕ　　Ａｌａ Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｔｒｐ Ｃｌｙ　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ Ｍｅｔ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ Ｔｒｐ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ Ａｓｎ　　Ｖａｔ　　Ｇｌｕ Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ Ｇｌｙ　　ＧＩｙ　　Ａｓｎ Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ ＡＩＢ　　Ｔｙｒ Ｐｒｏ　　Ｖａ Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ Ｖａｌ　　Ａｒｇ Ａｌａ　　＋＋６ Ｖａｔ　　Ａｌａ Ｖａｌ　　Ｖａｌ Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ Ｖａｌ　　Ａｓｎ Ａｒｇ　　５ｅｒ ｃｒｙ　　ＧＩＹ Ａｒ、ｇ　　Ｃｙｓ Ｓｅｒ　　Ｖａｔ Ｇｌｙ　　Ａｓｎ Ｔｈｒ　　Ａｓｐ Ｓｅｒ　　１ｌｅ Ｔｒｐ　　Ｌｙｓ Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ Ａｓｎ　　Ｇｌｎ ５ｅｒ　　Ｇｌｙ 手続補正書（自発） 平成１年６月　１

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含むＤＮＡ
    。 （２）次の塩基配列を有する請求項１記載のＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 （３）部分アミノ酸配列として下記の配列から選ばれる
    １種以上の配列を有するマルトテトラオース生成酵素活
    性を有するポリペプチド。 （１）【アミノ酸配列があります】 （２）【アミノ酸配列があります】 （３）【アミノ酸配列があります】 （４）【アミノ酸配列があります】 （５）【アミノ酸配列があります】 （６）【アミノ酸配列があります】 （７）【アミノ酸配列があります】 （８）【アミノ酸配列があります】 （９）【アミノ酸配列があります】 （１０）【アミノ酸配列があります】 （１１）【アミノ酸配列があります】 （１２）【アミノ酸配列があります】 （１３）【アミノ酸配列があります】 （１４）【アミノ酸配列があります】 （１５）【アミノ酸配列があります】 （１６）【アミノ酸配列があります】 （１７）【アミノ酸配列があります】 （１８）【アミノ酸配列があります】 （１９）【アミノ酸配列があります】 （２０）【アミノ酸配列があります】 （２１）【アミノ酸配列があります】 （２２）【アミノ酸配列があります】 （２３）【アミノ酸配列があります】 （２４）【アミノ酸配列があります】 （２５）【アミノ酸配列があります】 （２６）【アミノ酸配列があります】 （２７）【アミノ酸配列があります】 （２８）【アミノ酸配列があります】 （２９）【アミノ酸配列があります】 （３０）【アミノ酸配列があります】 （３１）【アミノ酸配列があります】 （３２）【アミノ酸配列があります】 （３３）【アミノ酸配列があります】 （３４）【アミノ酸配列があります】 （３５）【アミノ酸配列があります】 （３６）【アミノ酸配列があります】 （３７）【アミノ酸配列があります】 （３８）【アミノ酸配列があります】 （３９）【アミノ酸配列があります】 （４０）【アミノ酸配列があります】 （４１）【アミノ酸配列があります】 （４２）【アミノ酸配列があります】 （４３）【アミノ酸配列があります】 （４４）【アミノ酸配列があります】 （４５）【アミノ酸配列があります】 （４６）【アミノ酸配列があります】 （４７）【アミノ酸配列があります】 （４８）【アミノ酸配列があります】 （４９）【アミノ酸配列があります】 （５０）【アミノ酸配列があります】 （５１）【アミノ酸配列があります】 （５２）【アミノ酸配列があります】 （５３）【アミノ酸配列があります】 （４）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 を、分泌されるためのシグナルペプチドとしてＮ末端側
    上流に有しているポリペプチド。
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