FI86438C - Plasmider som inducerar extracellulaer sekretion av xylanas, metoder foer framstaellning av dem och metoder foer produktion av xylanas. - Google Patents

Description

1 86438

Ksylanaasin solun ulkopuolista eritystä indusoivia plasmideja, menetelmiä niiden valmistamiseksi ja menetelmiä ksylanaasin tuottamiseksi 5 Jakamalla erotettu FI-patenttihakemuksesta 840843.

Tämä keksintö koskee uusia plasmideja, plasmidien valmistusmenetelmiä ja plasmideja kantavien uusien mikro-organismien viljelymenetelmiä ksylanaasin tuottamiseksi. 10 Uudet plasmidit sisältävät DNA:ta, joka koodaa ksylanaasin solunulkopuolista eritystä. Mikro-organismeja transformoidaan plasmideilla ja viljellään ksylanaasin tuottamiseksi solun ulkopuolelle.

Plasmidi on mikro-organismin solussa esiintyvä, 15 ei-kromosomaalinen geeni, joka on rengasmaista DNA:ta.

Plasmidia käytetään yleisesti mikro-organismigeenin re-kombinaatioon, ja se on tulossa yhä tärkeämmäksi käymisteollisuuden alueella.

Viime aikoina on tehty tutkimuksia plasmideilla, 20 jotka kantavat vierasta DNA:ta, jolla on metabolisia tuotteita koskevaa geneettistä informaatiota tai jota spesifisesti tarvitaan mikro-organismin kasvuun, kuten on osoitettu aminohappojen ja peptidien valmistuksen yhteydessä. Jotkut plasmidit on siirretty isäntämikro-organis-25 meihin transformanttien saamiseksi. On suunniteltu menetelmiä suhteellisen pienimolekyylisten yhdisteiden, kuten esimerkiksi aminohappojen ja peptidien valmistamiseksi transformantteja viljelemällä. Kuitenkin plasmidien, jotka kantavat suurimolekyylisten aineiden valmistamiseen 30 tarvittavia geenejä, lisääntymisaste riippuu isäntä-mik-ro-organismien luonteesta, eikä näitä plasmideja ole tehokkaasti ekspressoitu. Sitä paitsi sellaisten transformanttien viljelemiseksi ei ole saatu aikaan mitään tehokkaita menetelmiä.

35 Ei ole ollut mahdollista selektiivisesti saada 2 86438 tiettyä solunulkoista, suurixnolekyylistä tuotetta viljelemällä mikro-organismia, joka on transformoitu plasmi-dilla, jossa on vieras DNA-pala, joka sisältää suurimole-kyylisten aineiden, jotka ovat toisten mikro-organismien 5 metabolisia tuotteita, solunulkoista tuottamista koskevaa geneettistä informaatiota. Sellaista solunulkoista tuottamista ei ole menestyksellisesti toteutettu, vaikka on käytetty tavallisesti isäntämikro-organismina käytettyjen Escherichia-laj ien transformanttia.

10 W. Gilbert et ai:n US-patentti nro 4 411 994 jul kaisee spesifisten proteiinien valmistusmenetelmän bakteereissa sekä niiden erittymisen bakteerisolusta. Tässä menetelmässä toivottua ei bakteeriperäistä proteiinia tai proteiinin osaa edustava DNA kiinnitetään yhdistelmätek-15 nilkan avulla plasmidiin tai faagigeeniin joko peri- plasmaan sisältyvän tai solun ulkopuolisen proteiinin, tässä yhteydessä myöhemmin "kantaja-proteiiniksi” mainitun proteiinin saamiseksi transformoimalla bakteeri-isäntä yhdistelmägeenillä sekä viljelemällä transformoi-20 tua isäntää proteiinin erittämiseksi. Tämän keksinnön mukainen menetelmä tarjoaa keinot valikoidun proteiinin tuottamiseksi käyttämällä geeniä kantajaproteiinin valmistamiseksi, jolla on amino-päässään hydrofobisten aminohappojen muodostama johtosekvenssi.

25 Escherichia colin solunseinämä, jota usein on käy tetty käyttökelpoisten, fysiologisesti aktiivisten aineiden valmistukseen, käsittää kolme membraanityyppiä: sisä-membraanin, peptidoglykaanin sekä ulkomembraanin. Sisä-ja ulkomembraanin välinen tila on nimeltään periplasminen 30 tila. US-patentin nro 4 411 994 mukaisessa menetelmässä on onnistuttu erittämään tuotteita periplasmiseen tilaan mutta ei elatusaineeseen ulkomembraanin kautta eli bakteerisolun ulkopuolelle. Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti, liittämällä plasmidiin DNA, joka sisältää suurimo-35 lekyylisten aineiden solunulkoista valmistusta koskevaa 3 86438 geneettistä tietoa, siten että saadaan hybridiplasmidi, sekä viljelemällä hybridiplasmidilla transformoitua isäntää on mahdollista erittää käyttökelpoisia fysiologisesti aktiivisia aineita ulkomembraanin läpi sekä saada ne suo-5 raan takaisin elatusaineesta. Täten kyseessä oleva keksintö tekee mahdolliseksi käyttökelpoisten, fysiologisesti aktiivisten aineiden massatuotannon, joka ei ole koskaan ollut mahdollista aiempien menetelmien avulla.

Sen tähden kyseessä olevan keksinnön eräänä koh-10 teenä on rekombinanttiplasmidi, jolle on tunnusomaista, että se on saatavissa: a) valmistamalla ensimmäisellä restriktioentsyy-millä, edullisesti Hind III:11a Bacillus sp. C 125 (FERM BP-469)-kannan kromosomaalinen DNA-fragmentti, joka koo- 15 daa ksylanaasin solun ulkopuolisen erityksen; b) pilkkomalla vektoriplasmidi-DNA, edullisesti pBR 322, toisella restriktioentsyymillä, joka ei sekaannu kromosomaalisen DNA-fragmentin sisältämään geneettiseen informaatioon; 20 c) käsittelemällä mainittu kromosomaalinen DNA- fragmentti ja mainittu pilkottu vektoriplasmidi-DNA DNA-ligaasilla rekombinanttiplasmidi-DNA:n muodostamiseksi; ja d) eristämällä rekombinanttiplasmidi-DNA transfor-25 moidusta isäntäsolusta, joka ilmaisee ksylanaasia tuottavan fenotyypin.

Näitä plasmideja voidaan valmistaa menetelmällä, jolle on tunnusomaista, että siihen kuuluvat seuraavat vaiheet: 30 a) valmistetaan ensimmäisellä restriktioentsyymil lä Bacillus sp. C 125 (FERM BP-469)-kannan kromosomaali-nen DNA-fragmentti, joka koodaa ksylanaasin solun ulkopuolisen eristyksen; b) pilkotaan vektoriplasmidi-DNA toisella restrik-35 tioentsyymillä, joka ei sekaannu kromosomaalisen DNA- 4 86438 fragmentin sisältämään geneettiseen informaatioon; c) käsitellään mainittu kromosomaalinen DNA-frag-mentti ja mainittu pilkottu vektoriplasmidi-DNA DNA-li-gaasilla rekombinanttiplasmidi-DNA:n muodostamiseksi; ja 5 d) eristetään rekombinanttiplasmidi-DNA transfor moidusta isäntäsolusta, joka ilmaisee ksylanaasia tuottavan fenotyypin.

Kyseessä oleva keksintö tarjoaa myös menetelmän solun ulkopuolisen ksylanaasin tuottamiseksi, jossa vil-10 jellään E. coli, joka on transformoitu edellä kuvatulla rekombinanttiplasmidilla. Menetelmälle on tunnusomaista, että a) siirrostetaan alusta, joka sisältää valitun hiililähteen yhdessä epäorgaanisen suolan kanssa, joka on 15 natriumsuola tai kaliumsuola transformantilla; ja b) jatketaan transformantin viljelyä sen jälkeen, kun solukonsentraatio on saavuttanut huippunsa ja kunnes ksylanaasin tuotto ja akkumulaatio alustassa on saavuttanut huippunsa.

20 Piirustukset kuvio 1 sekä kuvio 2 esittävät bakteerikasvua sekä ksylanaasin tuottoa Eschrichia coli HB101(pCX311):llä, kuvio 3 esittää ksylanaasin tuottoa Bacillus sp. C125:llä, 25 kuvio 4 esittää plasmidin pCX311 restriktioentsyy- mipilkkoutumiskarttaa.

kuivo 5 esittää Eschrichia coli HB101(pCX311):n tuottaman ksylanaasin pH-aktiivisuuden yhtäläisyyden Bacillus sp. C125:n tuottaman entsyymin pH-aktiivisuuden 30 kanssa.

Kyseessä olevaa keksintöä selitetään seuraavassa yksityiskohtaisesti.

(a) Plasmidin sekä keksinnön mukaisten uusien plasmidien konstruktio on sellainen, että ne on muodos-35 tettu liittämällä vierasta DNA:ta plasmidiin (ekstra- 5 86438 kromosomaalista DNA:ta tai vektori-DNA:ta), kuten esimerkiksi col E,, joka esiintyy Escherichia-soluissa.

Vektori-DNA:hän, jota kyseessä olevassa keksinnössä voidaan käyttää, sisältyy luonnonlähteistä eristetty 5 vektori tai vektori, josta lisääntymiselle tarpeeton DNA-fragmentti on poistettu, kuten esimerkiksi ColE,, pMB9, pBR322, pSCIOI, R6K sekä lambda-faagi.

Vieraat DNA-fragmentit eli eksogenootit, jotka voidaan liittää vektori-DNA:hän, ovat geenejä, joilla on 10 suurimolekyylisiä aineita, kuten esimerkiksi entsyymipro-teiineja, esimerkiksi ksylanaasia, penisillinaasia, alkalista fosfataasia, B-galaktosidaasia, yms. koskevaa informaatiota. Eksogenootteihin tai DNA-fragmentteihin, joita voidaan käyttää kyseessä olevassa keksinnössä, si-15 sältyvät geenit, joilla on suurimolekyylisten aineiden solunulkoisen tuoton sekä erittymisen geneettistä informaatiota ja joita saadaan mikro-organismilta, joka kuuluu esim. Bacillus-sukuun.

Mikro-organismi, joka sisältää DNA:ta, jolla on 20 ekstrasellulaarisen ksylanaasin tuottoa koskevaa geneettistä informaatiota ja jota voidaan käyttää kyseessä olevassa keksinnössä, on Bacillus sp. C125.

Bacillus sp. C125:llä, joka on eristetty maanäyt-teestä, joka on koottu Tsurugashimassa, Saitama, Japani, 25 on seuraavat luonteenomaiset, mikrobiologiset ominaisuu det. Tämän kannan tutkiminen ja luokittelu suoritettiin "Aerobic Spore-forming Bacteria" (United State Department of Agriculture, marraskuu 1952, kirjoittajat N.R. Smith, R.E. Gordon & F.E. Clark) sekä "Bergey's Manual of Deter-30 minative Bacteriology (1957)" mukaisesti.

6 86438

Luonteenomaiset mikrobiologiset ominaisuudet: (a) Morfologia (1) Sauvoja, 0,5-0,7 μ x 3,0-4,0 μ (2) Itiöiden muodostuminen soikea, 0,6-0,8 μ x 1,0-1,2 5 μ ja itiöpesäke on turvonnut (3) Gram-positiivinen.

(b) Kasvu elatusaineessa

Elatusaine Kasvu pH7 pH 10 10 1) Lihaliemi kasvua hyvä 2) Lihaliemi-agar '· " 3) Glukoosi-lihaliemi vähän kasvua " 4) Glukoosi-lihaliemi- '· " agar 15 5) Tyrosiini-agar " " 6) Elatusaine I " " 7) Glukoosi-nitraatti kasvua " 8) Glukoosi-asparagii- ei yhtään " ni-agar 20 9) Elatusaine-I + 5 % kasvua "

NaCl (c) Fysiologiset ominaisuudet 1) Nitraatin pelkistyminen ei lähes ei ollenkaan 25 2) Propionaatin hyväksi- ei kyllä käyttö 3) VP-koe negatiivinen negatiivinen 4) Ureaasi-koe " neutraali 5) Tärkkelyksen hydro- positiivinen positiivinen 30 lyysi 6) Kaseiinin hydrolyysi M " 7) Kasvuolosuhteet kasvua pH 11,0:n alapuolella ja 55°C:n alapuolella 8) Kasvu hapettomissa ei vähäistä kasvua 35 olosuhteissa (elatus- aineella I) 7 86438

Edellä esitettyjen ominaisuuksien yhteenvetona on selvää, että mikro-organismi kuuluu Bacillus-sukuun, koska se on aerobinen, itiöitä muodostava bakteeri. Mikro-organismi Bacillus sp. C125:n pääteltiin olevan alkalo-5 fiilisten bakteereiden uusi kanta, koska se selvästi eroaa tunnetuista bakteereista siinä suhteessa, että se kasvaa pH ll,0:n alapuolella sekä 55°C:n alapuolella.

Kyseessä olevan menetelmän mukaisesti voidaan vieraan DNA:n liittämiseksi vektori-DNA:han käyttää mitä talo hansa tavanomaisia menetelmiä. Esimerkiksi kromosomaali-nen DNA pilkotaan sopivan restriktioentsyymin tai endo-nukleaasin avulla, jotta saadaan vieras DNA-fragmentti eli eksogenootti, joka sitten sekoitetaan vektori-DNA:n kanssa, jota on käsitelty samanlaisella restriktioentsyy-15 millä, ja seos sidotaan sopivan ligaasin avulla. Täten, kuten edellä on kuvattu, kyseessä olevan keksinnön mukaisia uusia plasmideja voidaan saada valmistamalla restrik-tio-entsyymin avulla DNA-fragmentti, joka koodaa ksyla-naasin yms. solunulkoista tuottoa, uuttamalla plasmidi-20 vektori-DNA:ta restriktioentsyymillä, joka ei sekaannu DNA-fragmentin sisältämään geneettiseen informaatioon, käsittelemällä DNA-fragmenttia sekä uutettua vektoriplas-midia DNA-ligaasilla yhditelmäplasmidin konstruoimiseksi sekä eristämällä yhdistelmäplasmidi tavanomaisella taval-25 la [katso Bolivar et ai Gene, 2, 95 (1977)].

Uusi plasmidi pCX311 voidaan konstruoida Bacillus sp. C125:n kromosomaalisesta DNA-fragment!sta sekä plasmidi pBR322:sta. Kuviossa 4 esitetään restriktioentsyymi-kartta plasmidi pCX311:lle. Kuten kuviosta 4 käy ilmi 30 plasmidi pCX311 konstruoidaan plasmidista pBR322, johon Bacillus sp. C125:n kromosomaalinen DNA, joka koodaa solunulkoista ksylanaasin tuottoa, insertoidaan plasmidin pBR322:n Hind ΙΙΙ-restriktiokohdan väliin. Täten plasmidi pCX311 on syklinen DNA-molekyyli, jonka koko on noin 9,01 35 kb:ä ja joka sisältää pBR322 DNA:n sekä Bacillus sp. C125 β 86438 DNA:n, jonka koko on noin 4,0 kb.

(b) Mikro-oraanismien valmistus

Yhdistelmäplasmidit, jotka on konstruoitu kromoso-maalisista DNA-fragmenteista sekä vektori-DNA-plasmideis-5 ta, viedään tavanomaista transformaatiotekniikkaa käyttäen Escherichia coli-isäntämikro-organismiin. Viljelyä jatketaan, kunnes saadaan aikaan stabiloitu genotyyppi, jotta saadaan transformantti, joka kantaa molempia genotyyppejä valitulla kromosomaalisella DNA:11a sekä vek-10 tori-DNA:11a. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää tavanomaista, ns. "shot gun"-menetelmää.

Tyypillinen isäntämikro-organismi, jota voidaan käyttää kyseessä olevassa keksinnössä on Escherichia coli HB101, joka on Escherichia coli K-12:n sekä Escherichia 15 coli B:n hybridi-kanta.

Transformanti11a Escherichia coli HB101 (pCX311), joka valmistetaan viemällä plasmidi pCX311 Escherichia coli HB 101:een, on samat mikrobiologiset ominaisuudet kuin isännällä Escherichia coli HB101:llä penisilliini-20 resistenssiä sekä ksylanaasin tuottamiskykyä lukuunot tamatta. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, s. 504 (1982), genotyyppi: F“, hsd S 20 (rB, mB) , rec A13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20, (Sm'), xyl-5 mtl-l, supE44X" . Escherichia colia HB101 (pCX311) luonnehtii 25 edelleen plasmidin pCX311 ominaisuus, ts. solunulkoisen ksylanaasin tuottamiskyky.

Ksylanaasin solunulkoinen tuotto Escherichia coli HB101 (pCX311):llä, kuten on esitetty myöhemmin kuvatuissa esimerkeissä, yltää enempään kuin 80 %:iin kokonais-30 tuotosta, solunsisäinen tuotto mukaanluettuna, ja se pysyy ennallaan pitkän viljelyn jälkeen. Vastakohtana tälle, Bacillus sp. C125:llä, kuten on esitetty kuviossa 3, ksylanaasin aktiivisuus sekä solunulkoinen tuotto saavuttaa maksimin hitaasti ja sitten se putoaa nopeasti. Täten 35 Bacillus sp. C125:n aikaansaamaa solunulkopuolista tuot- 9 86438 toa ei voi verrata esitetyn Escherichia colin HB101 (pCX311) aikaansaamaan solunulkopuoliseen tuottoon.

Kyseessä oleva keksintö, joka antaa käyttöön Escherichia coli HB101 (pCX311):n, jolla on kyky tuottaa 5 solun ulkopuolelle entsyymiproteiineja, kuten esimerkiksi ksylanaasia, ei ole ainoastaan uusi vaan myös neuvokas keksintö. E.coli HB100 (pCX311) voi tuottaa ja erittää soluista elatusaineeseen suuria määriä ksylanaasia, suuria määriä muita entsyymiproteiineja, jotka voidaan myös 10 koota. Aivan erityisesti on havaittu, että Escherichia coli HB (pCX311) tuottaa ja erittää soluista elatusaineeseen, kuten esimerkeissä myöhemmin esitetään, suuria määriä penisillinaasia, alkalista fosfataasia ksylanaasin lisäksi, jotka on aiemmin havaittu ainoastaan periplas-15 misessa tilassa.

Sellainen Escherichia HB101 (pCX311):n aikaansaama solunulkoinen tuotto osoittaa, että plasmidi pCX311:n kantama DNA, jossa on noin 4000 nukleotidiemäsparia, antaa käyttöön isännän, joka pystyy tuottamaan metabolisia 20 tuotteita solun ulkopuolelle.

(c) Mikro-organismien viljely

Vaiheessa (b) valmistettujen transformanttien viljelyyn voidaan käyttää mitä tahansa elatusainetta, joka soveltuu spesifisten aineiden, joita spesifinen geneet-25 tinen informaatio koodaa, tuottamiseen ja joka soveltuu Escherichia-suvun mikro-organismien viljelyyn. Kyseessä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä on tarpeellista viljellä mikro-organismia elatusaineessa, joka sisältää epäorgaanista suolaa, joka on tarpeellinen mikro-organis- 30 min kasvulle, tai valittua hiilenlähdettä yhdessä epäor gaanisen suolan kanssa ja jatkaa mikro-organismin viljelyä sen jälkeen, kun mikro-organismin solujen konsentraa-tio on saavuttanut maksimin ja kunnes suurimolekyylisten aineiden tuotto ja kerääntyminen elatusaineessa saavuttaa 35 maksimin.

10 86438

Esimerkkeihin epäorgaanisesta suolasta, jota voidaan käyttää kyseessä olevassa keksinnössä, kuuluu natrium- sekä kaliumsuoloja, kuten esimerkiksi natriumklori-di, natriumsulfaatti, kaliumkloridi, yms., joiden joukos-5 sa natriumkloridi on edullinen. Elatusaine, joka sisältää epäorgaanisen suolan tai valitun hiilenlähteen yhdessä epäorgaanisen suolan kanssa, voi sisältää sellaisen hiilenlähteen, kuten glukoosin, sakkaroosin, laktoosin, mal-toosin, glyserolin, leseitä, ksyleeniä yms. sekä typen 10 lähteenä ammoniakkivettä, ammoniumsuoloja yms. epäorgaanisia ioneja ja valinnaisesti sellaista ravintoainetta kuten aminohappoja, vitamiineja yms. Escherichia coli HB101 (pCX311):n viljelyssä on tärkeää ja tarpeellista lisätä elatusaineeseen hiilenlähde, joka soveltuu vali-15 tulle tuotteelle. Elatusaineet, joita voidaan käyttää kyseessä olevassa keksinnössä, ovat sellaisia, joissa on peruselatusaineena LB-lihaliemi (joka sisältää tryptonia, hiivauutetta sekä NaCl:a), BPB-lihaliemi (Difco Laboratories) sisältää polypeptonia, hiivauutetta sekä K2HP04, 20 ravinnelihaliemi (Difco 0001), tryptoni-NaCl-lihaliemi tai joku muu sellainen peruselatusaine.

Koska enemmän kuin 80 % kokonaistuotteista jää solunsisäiseen jakeeseen elatusaineessa, joka ei sisällä epäorgaanista suolaa, on tarpeellista käyttää elatusai-25 netta, joka sisältää epäorgaanisen suolan, jotta suurin osa tuotteista erittyy solujen elatusaineeseen. Käytetyn epäorgaanisen suolan määrä on alueella 0,5-3,0 paino-% elatusaineen perusteella laskettuna.

Escherichia coli HB101 (pCX311):n viljelyssä 30 on saatu erinomaisia tuloksia käyttämällä LB-lihalien- tä, johon on lisätty leseitä ja/tai ksylaania hiilenläh-teinä, mieluummin kumpaakin määrältään 0,5 paino-% elatusaineen perusteella laskettuna.

Vaikka viljelyolosuhteita, kuten esimerkiksi 35 pH:ta, lämpötilaa, hapen johtamista yms. voidaan muuttaa il 86438

Escherichia-suvun mikro-organismin maksimikasvun saamiseksi, on kyseessä olevassa keksinnössä välttämätöntä jatkaa mikro-organismin viljelyä sen jälkeen, kun mikro-organismin solujen konsentraatio on saavuttanut maksimin, 5 toisin sanoen myöhemmän logaritmisen vaiheen jälkeen sekä kunnes suurimolekyylisten aineiden tuotto sekä kerääntyminen elatusaineessa saavuttavat maksimin.

Elatusaineeseen suoritetun Escherichia-suvun mikro-organismin siirrostuksen jälkeen solujen konsentraatio 10 saavuttaa maksimin 5-20 tunnin kuluttua ja suurimolekyylisten aineiden tuotto ja kerääntyminen saavuttavat maksimin 12-48 tunnin kuluessa. Vaikka elatusaineen pH ei ole kriittinen, se on edullinen pH-alueella 5-8, erityisesti pH 7:ssä. Täten lisäämättä enempää mikro-orga-15 nismin kasvulle tarpeellista epäorgaanista suolaa, hii-lenlähteitä yms. viljelyn aikana mikro-organismi tuottaa suuria määriä solunulkoisia, suurimolekyylisiä aineita, jotka voidaan koota mukavasti.

Esimerkkeihin mikro-organismeista, joita tässä 20 keksinnössä voidaan käyttää, sisältyvät (i) Bacillus sp C125 sekä (ii) Escherichia coli HB101 (pCX311), jotka talletettiin kokoelmaan Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japani, International 25 Depository Authority (tässä yhteydessä myöhemmin nimitet ty "FERM":ksi) vastaavasti seuraavin talletusnumeroin, FERM BP-469 sekä FERM BP-470, ja ne ovat FERM:in talletuksessa, josta ne ovat rajoituksitta saatavissa.

Edellä mainittujen mikro-organismien talletus- ja 30 vastaanottonumerot ovat seuraavat:

Mikro-organismi_Talletuslaitos Talletusnumero (i) Bacillus sp. C125 FERM FERM BP-469 (ii) Escherichia coli FERM FERM BP-470 HB101 (pCX311) 35 Hakija tulee pitämään talletukset FERM BP-469 sekä i2 86 438 FERM BP-470 rajoittamattomina aina patenttiajan keston loppuun saakka, jos tälle hakemukselle myönnetään patentti, ja täten mainitut mikro-organismikannat ovat kolmannen ryhmän saatavissa milloin tahansa, patenttiajan myön-5 tämisen keston loppuun saakka.

Seuraavassa selvitetään esimerkkien avulla kyseessä olevan keksinnön mukaisten plasmidien rakentamismenetelmät, transformantti Escherichia coli HB101 (pCX311):n valmistusmenetelmät sekä ksylanaasin jne solunulkoinen 10 tuotto transformanttien avulla.

Vertailuesimerkki

Plasmidi pEAP2:n valmistaminen ia puhdistus 1. Bakteerisoluviljelmä, jossa käytetään Escherichia colia HB101 (pEAP2) (FERM BP-468) 15 Esiviljely LB:ssä Yli yön 37°C:ssa

Viljely M-9:ssä Lisätään kloramfenikolia 130

Klettin yksikön jälkeen 16 tuntia 37°C:ssa 20 /

Sentrifugointi 5000 kierrosta minuutissa, 20 min.

4°C:ssa

Solusaostuma Säilytetty -80°C:ssa 25 2. Plasmidi-DNA;n puhdistus Solusaostuma 110 ml, 20 % sakkaroosia, 50 mM Tris, ImM EDTA pH 8. Lietetty, pidetään jäissä.

30 50 ml:n polypropyleenisentrifugiputki 12 ml, 0,25 M EDTA. 1 ml, lysotsyymiä (5 mg/ml) 0,025 M Tris, pH 8) 0,1 ml, RNaasia (10 mg/ml) Solujen hajoittaminen. Varovainen sekoitus. Seisotetaan 15-30 min. jäiden päällä.

35 5 ml, 3 x Triton. Varovainen sekoitus. Seisotetaan y 15-45 min. jäiden päällä i3 80438

Sentrifugointi.17000 kierrosta minuutissa, 40 min.4°C:ssa

Supernatanttiliuos rouovisylinteriin 5 250 ml:n vetoinen lasipullo 2/3 tilavuutta DD H20 2/3 tilavuutta kylmää kyllästettyä fenolia ψ Sekoitetaan varovasti Sentrifugointi 10 ^ 6500 kierrosta minuutissa, 15 min. 4°C:ssa

Ylempi jae j, Yhtä suuri tilavuus fenolia; kloroformia Sentrifugointi ^ 6500 kierrosta minuutissa. 15 min. 4eC:ssa 15 Ylempi jae 250 ml:n pullossa 1/25 tilav. 5 M NaClra 2 tilavuutta EtOH:a -20°C:ssa y Yli yön -20°C:ssa Sentrifugointi 20 ^ 6500 kierrosta minuutissa, 60 min. -20°C:ssa DNA-saostuma. Nesteylimäärän kuivaus 5 ml A-50 puskuria, uudelleenlietetty 1 ml steriiliä 80 %:ista glyserolia, varovainen v sekoitus 25 A-50-pylväs (2x35 cm, 1 jae = 4 ml) DNA-jae (A260 huippu) 2 tilav. ETOH -20°C:ssa. Yli yön -20eC:ssa Sentrifugointi 30 J, 6500 kierrosta minuutissa, 60 min. -20°C:ssa DNA-saostuma 2,1 ml TEN-puskuria 5 ml:n vetoisessa sel-luloosanitraattiputkessa : 2,2 g CsCl:a, sekoitus (pimeässä) 35 150 μΐ Pdl (2 mg/ml). Hyvä sekoitus y 2 ml mineraaliöljyä putken yläpäähän i4 86 438

CsCl-gradienttisentrifugointi. 36000 kierrosta minuutissa, 40 h 20°C:ssa. US-valossa näkyvä Ylempi vyöhyke; kromosomaalinen leikattu DNA Y Alempi vyöhyke; kovalentisti suljettu p-DNA 5 Alemman DNA-vyöhykkeen kokoaminen tipoittain ir

Dowex 50W-X8-pylväs. UV-tarkistus ^ (valossa)

Dialyysi 2-4 litraa vastaan 10 mM Tris, 1 mM EDTA-pus-10 ^ kuria. pH 8. Yli yön 4°C:ssa 30 ml:n vetoisessa keratiinisentrifugiputkessa, | tilav. 1/25 tilav. 5 M NaCl:a. 2 tilav. EtoH y -20° C:ssa. Yli yön -20°C:ssa

Sentrifugointi 15 6500 kierrosta minuutissa, 60 min. -20°C:ssa DNA-saostumat 1-2 ml TEN-puskuria

Puhdistettu plasmidi-DNA (1 mg/1 lihalientä). Varastointi -20-70°C:ssa 20 Esimerkki 1 (1) Ksylanaasin tuottamiskyvyn geneettisen informaation sisältävän kromosomaalisen DNA:n valmistus

Alkalofiilista Bacillus sp C125 (FERM BP-469), jolla on kyky tuottaa solunulkoista ksylanaasia, viljel-25 tiin ravistellen 30°C:ssa 19 tunnin ajan lihaliemessä (joka sisälsi 10,0 g leseitä, 5,0 g hiivauutetta, 5,0 g polypeptonia, 0,2 g MgS04 · 7HzO sekä 10 g Na2C03 litrassa vettä ja pH säädettynä 9,0:aan). Solut koottiin myöhemmässä logaritmisessa vaiheessa, niistä uutettiin kromoso-30 maalinen DNA fenoliuuttomenetelmällä ja puhdistettiin, jotta saatiin 5 mg kromosomaalista DNA:ta.

(2) Kromosomaalisen DNA-palan liittäminen vektori-DNA:aan.

Kromosomaalista DNA:ta (10 Mg), joka saatiin vai-35 heessa (1), uutettiin restriktioentsyymillä Hind III

is 86 438 37°C:ssa, 5, 10, 20, 30 sekä 60 minuutin ajan, jotta saatiin DNA-fragmentteja.

Plasmidia pBR322 (Bethesda Research Laboratories, Amerikan Yhdysvallat, resistentti tetrasykliinille (Tetr) 5 sekä ampisilliinille (Ampr), jota käytettiin vektorina, pilkottiin Hind III:11a, sitten kuumennettiin 65°C:ssa 5 minuutin ajan sekä sekoitettiin sitten DNA-fragmenttien kanssa. Seosta käsiteltiin T4-faagi-DNA-ligaasilla 10° C:ssa 24 tunnin ajan sekä kuumennettiin sitten 65eC:ssa 10 5 minuutin ajan.

Seokseen lisättiin kolme tilavuutta etanolia. Kro-mosomaalisia DNA-fragmentteja kantavat plasmidit seostettiin ja koottiin.

(3) Mikro-organismien transformaatio plasmideilla, 15 jotka sisältävät ksylanaasin solunulkoista tuottoa sääte levän geenin.

Escherichia coli HB101, joka on Escherichia coli K-12:n sekä Escherichia coli B:n hybridi-kanta, siirros-tettiin 10 ml:aan LB-lihalientä [joka sisälsi 10 g tryp-20 töniä (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), 5 g hiivauu-tetta, 1 g glukoosia sekä 10 g NaCl yhdessä litrassa de-ionisoitua vettä; pH oli säädetty 7,0:ksi] sekä viljeltiin 37eC:ssa ravistaen myöhempään logaritmiseen vaiheeseen saakka. Solut koottiin ja lietettiin jääkylmään 25 CaCl2-liuokseen, joka oli 0,03 M (lopullinen konsentraa-tio), jotta saatiin kompetentteja soluja. Solususpensio sekä plasmidi-liuos, joka oli saatu vaiheessa (2), yhdistettiin sekä pidettiin jäiden päällä 60 minuutin ajan. Seos kuumennettiin 42eC:een 1-2 minuutin ajaksi, jotta 30 saatiin plasmidi-DNA solujen sisälle. Tämä solususpensio siirrostettiin tuoreeseen LB-lihaliemeen, ja sitä viljeltiin 37°C:ssa 3-5 tunnin ajan ravistellen. Solut koottiin ja pestiin transformanttien saamiseksi, joista eristet-. . tiin Escherichia coli HB101 (pCX311) (FERM BP-470), jolla 35 on kyky tuottaa solunulkoista ksylanaasia sekä penisil- ie 86438 linaasia.

Esimerkki 2

Plasmidi pCX311:n valmistus ja puhdistus

Toistettiin vertailuesimerkin mukainen menetelmä, 5 paitsi että Escherichia colia HB101 (pCX311) (FERM BP- 470) käytettiin Escherichia colin HB101 (pEAP2) (FERM BP-468) tilalla.

Saatiin puhdistettua plasmidia pCX311 1 mg/1 liha- lientä.

10 Esimerkki 3

Escherichia coli HB101 (pCX311) (FERM BP-470), joka oli saatu esimerkin 1 vaiheessa (3), siirrostettiin 500 ml:n vetoisiin pulloihin, jotka sisälsivät 100 ml LB-lihalientä (sisältäen 10 g tryptonia, 5 g hiivauutetta, 15 1 g glukoosia, 2 g glyserolia, 10 g NaCl:a sekä 10 mg penisilliiniä yhdessä litrassa vettä), jossa oli 0,5 % ksylaania, sekä viljeltiin 37°C:ssa ravistellen. Solu-kasvu mitattiin optisen tiheyden avulla 660 nm:ssä. Entsyymiaktiivisuus määritettiin seuraavasti: sekoitettiin 20 0,05 ml viljelynestettä, 0,1 ml ksylaaniliuosta (Seikagaku Kogyo, Japani) sekä 0,1 ml 0,2 M Tris-ma-laattipuskuria, jonka pH oli 8,0, ja kuumennettiin 40 °C:ssa 10 minuutin ajan. Seokseen lisättiin yksi ml DNS:a (3,5-dinitrosalisyylihappoa), ja sitten seosta kuumennet-25 tiin 100 °C:ssa 5 minuutin ajan. Seokseen lisättiin neljä millilitraa vettä. Absorbanssi mitattiin 510 nm:ssä. Yksi yksikkö ksylanaasia pelkisti yhden mg ksyloosia yhdessä minuutissa.

Kuvio 1 esittää ksylanaasin solunulkoisen tuoton 30 sekä erittymisen Escherichia colilla HB101 (pCX311), jota viljeltiin 0,5 % ksylaania sisältävässä LB-lihaliemessä.

Kuten on esitetty kuviossa 1, transformantin solu-kasvu saavutti maksimin 9-12 tunnin mittaisen viljelyn 35 jälkeen, ja solunulkoinen ksylanaasiaktiivisuus alkoi i7 8 6 4 3 8 jälkeen, ja solunulkoinen ksylanaasiaktiivisuus alkoi nousta 6 tunnin kuluttua ja saavutti maksimin (noin 0,35 yksikkö/ml) 13 tunnin mittaisen viljelyn jälkeen.

Tuotettu, solunulkoinen ksylanaasi oli hyvin sta-5 biili ja kuten on esitetty kuviossa 1, tuotto säilyi korkeana vieläpä 48 tunnin mittaisen viljelyn jälkeen sekä saavutti enemmän kuin 80 % kokonaisentsyymituotosta. Sitä vastoin solunsisäisen ksylanaasin tuoton havaittiin olevan vähäisen alkuvaiheessa (9 tunnin viljelyn jälkeen).

10 Mutta maksimi oli vain 0,13 yksikköä/ml tai noin 10 % entsyymin kokonaistuotosta ja sitä paitsi solunsisäinen tuotto väheni asteittain. Kuvio 2 esittää ksylanaasin tuoton Escherichia colilla HB101 (pCX311), jota viljeltiin LB-lihaliemessä, joka sisälsi 0,5 % leseitä ksylaa-15 nin tilalla. Kuvio 2 esittää samanlaisen suuntauksen kuin on esitetty kuviossa 1. Vertailuna viljeltiin Bacillus sp C125 (FERM BP-469), joka on DNA:n luovuttaja, ja määritettiin ksylanaasin aktiivisuus.

Bacillus sp. C125 siirrostettiin 500 ml:n vetoi-20 siin pulloihin, jotka sisälsivät 100 ml elatusainetta (joka sisälsi 10,0 g ksylaania. 5,0 g hiivauutetta, 5,0 g polypeptonia, 1,0 g K2HP04, 0,2 g MgS04*7H20 sekä 10 g Na2C03 yhdessä litrassa vettä ja pH säädettiin 6,0:ksi), ja viljeltiin 37°C:ssa ravistellen. Elatusainenesteen so-25 lunulkoinen ksylanaasiaktiivisuus tarkastettiin joka kah deksas tunti. Se alkoi nousta kahdeksan tunnin viljelyn jälkeen sekä saavutti maksimin (noin 0,5 yksikköä/ ml) 48 tunnin kuluttua, mutta se laski nopeasti (kuv. 3).

(Ksylanaasin identifiointi) 30 Ammoniumsulfaattia lisättiin esimerkin 2 vaiheessa (3) saadun transformantin viljelynesteeseen. Muodostunut saostuma liuotettiin veteen, ja liuosta dialysoitiin yön yli, virtaavaa vettä vastaan. Dialysaatti adsorboitiin CM-selluloosapylvääseen, joka oli tasapainoitettu 20 mM 35 fosforihappo-mononatriumfosfaattipuskurilla, pH 4,5.

ie 8 ό 4 3 8 tetun lineaarisen gradientin avulla. Ksylanaasi eluoitiin 0,4 M natriumkloridillä. Yhdistettiin jakeet, joissa oli ksylanaasiaktiivisuutta, ja ne pantiin Sephade^ G-100 geelisuodatukseen, jotta saatiin puhdistettua ksylanaa-5 siä.

Samalla tavalla käsiteltiin Bacillus sp C125 (FERM BP-469):n viljelynestettä, jotta saatiin puhdistettua ksylanaasia.

Escherichia coli HB101 (pCX311) ksylanaasin iden-10 tifioimiseksi Bacillus sp C125 ksylanaasin kanssa tutkit tiin pH:n vaikutus aktiivisuuteen, suoritettiin ultra-sentrifugaalinen analyysi, elektroforeesi sekä määritettiin kummankin ksylanaasin molekyylipaino. Tuloksena todettiin molempien entsyymien olevan keskenään identtisiä, 15 kuten alempana on esitetty.

(a) Valmistettiin asetaatti (pH 4-5), Tris-malaatti (pH

5-8), Tris-HCl (pH 7-9) sekä glysiini-NaOH (pH 9-11). Näiden puskuriliuosten avulla tutkittiin pH:n vaikutus aktiivisuuteen. Tulokset on esitetty kuviossa 5, joka 20 osoittaa molempien entsyymien yhtäläisyyden pH-aktiivi- suuden suhteen.

(b) Molempien entsyymien ultrasentrifuugianalyysi osoitti, että molemmilla entsyymeillä oli yksi huippu, jonka sedimentaatiovakio oli 3,5S.

25 (c) Disk-elektroforeesi pH 8,3:ssa osoitti, että molem milla entsyymeillä oli yksi vyöhyke. Ampholinen avulla suoritettu elektrofokusointi ilmaisi yhden huipun. Molempien entsyymien isoelektrinen piste oli pH 6,3.

(d) Entsyymien molekyylipainon määritys suoritettiin SDS-30 polyakryyliamidimenetelmän avulla. Molempien entsyymien molekyylipaino oli noin 40,000.

Esimerkki 4

Escherichia colia HB101, Escherichia colia HB101 (pBR322) sekä Escherichia colia HB101 pCX311 (FERM BP-35 470) viljeltiin samassa, ksylaania sisältävässä LB-liha- 19 86438 liemessä, jota käytettiin esimerkissä 3, 37°C:ssa, ravistellen noin 20 tunnin ajan (penisillinaasi) tai 15 tunnin ajan (alkalinen fosfataasi sekä β-galaktosidaasi). Alka-lisen fosfataasin sekä β-galaktosidaasin entsyymiaktiivi-5 suudet mitattiin optisen tiheyden avulias 420 nm:ssä. Tulokset esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1 ^ Mikro-organismi Tuotteet _ Aktiivisuus (U/ml)___.

Solun- Solun- Kokonainen ____ulkoinen sisäinen E. co li (2*) 1,31 (98%) KB101 i c /^-galaktosi- 0,03 (2%) 1 20 (98%) daasi (100^)

Alkalinen n 4 a E.coli fosfataasi· °,01 <2*) °/47 <«%) HB101 (pBR322) 0 80 20 /8-galaktosi- °,00 (0¾) 0,80 (100%) daasi (ίου*;

Penisilli- 9,72 naasi 0,20 (3%) 9,5 2 (97%) (100%) *'·, 0,50

Alkalinen 0,30 (60%) 0^20 (40%) . 25 E.coli fosfataasi (100%) HB101 (pCX311) , 8,16

Penisilli- 6^25 (77%) 1*91 (23%) (100%) naasi 20 86438

Esimerkki 5

Tutkittiin elatusaineen sisältämien epäorgaanisten suolojen vaikutusta ksylanaasin tuottoon Escherichia colilla HB101 (pCX311) (FERM BP470). Peruselatusaineena 5 käytettiin samaa elatusainetta kuin oli käytetty esimerkissä 3. Mikro-organismia viljeltiin 14 tai 20 tuntia pe-ruselatusaineessa, johon oli lisätty erilaisia epäorgaanisia suoloja. Tulokset esitetään taulukossa 2.

Taulukko 2

Aika (h) Epäorgaa- Epäorgaa- Ksylanaasin aktiivisuus (U/fal_ ninen nisen suo- ςπι,1η<;, suola lan kon- Soiunul_ Soiunsi- Kokonainen suoxa iän κοη koinen saanen sentraatio _(M)__ ' 15 14 Ei yhtään o 0 0

NaCl 0,08 0,07 0,11 0,18 " 0,161 0,21 0,10 0,31 " 0,32 0.38 0,10 0,48 20 0,48 0,15 0,10 0,25 KC1 0,16 0,25 0,12 0,37 • 20 Ei yhtään - 0 0 0 25 NaCl 0,03 0,06 0,07 0,13 " 0,16 0,28 0,04 0,32 " 0,32 0,40 0,13 0,53 0,48 0,25 0,10 0,35 30 KCl 0,16 0.,28 0,02 0,30 0,16 M [IaCl vastaa 1 paino-%.

Claims (12)

21 86 438

1. Rekombinanttiplasmidi, joka pystyy indusoimaan ksylanaasin solun ulkopuolisen erityksen Escherichia co- 5 lissa, joka on transformoitu mainitulla plasroidilla, tunnettu siitä, että se on saatavissa: a) valmistamalla ensimmäisellä restriktioentsyy-millä, edullisesti Hind III:11a Bacillus sp. C 125 (FERM BP-469)-kannan kromosomaalinen DNA-fragmentti, joka koo- 10 daa ksylanaasin solun ulkopuolisen erityksen; b) pilkkomalla vektoriplasmidi-DNA, edullisesti pBR 322, toisella restriktioentsyymillä, joka ei sekaannu kromosomaalisen DNA-fragmentin sisältämään geneettiseen informaatioon; 15 c) käsittelemällä mainittu kromosomaalinen DNA- fragmentti ja mainittu pilkottu vektoriplasmidi-DNA DNA-ligaasilla rekombinanttiplasmidi-DNA:n muodostamiseksi; ja d) eristämällä rekombinanttiplasmidi-DNA transfor- 20 moidusta isäntäsolusta, joka ilmaisee ksylanaasia tuottavan fenotyypin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinanttiplasmidi, tunnettu siitä, että vektoriplasmidi on plasmidi pBR 322.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinantti plasmidi, tunnettu siitä, että se on plasmidi PCX 311 (FERM BP-470).

4. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen rekom-binanttiplasmidin rakentamiseksi, tunnettu sii- 30 tä, että siihen kuuluu seuraavat vaiheet: a) valmistetaan ensimmäisellä restriktioentsyymillä Bacillus sp. C 125 (FERM BP-469)-kannan kromosomaa-linen DNA-fragmentti, joka koodaa ksylanaasin solun ulkopuolisen erityksen; 35 b) pilkotaan vektoriplasmidi-DNA toisella restrik tioentsyymillä, joka ei sekaannu kromosomaalisen DNA-fragmentin sisältämään geneettiseen informaatioon; c) käsitellään mainittu kromosomaalinen DNA-frag- 22 86438 mentti ja mainittu pilkottu vektoriplasmidi-DNA DNA-li-gaasilla rekombinanttiplasmidi-DNA:n muodostamiseksi; ja d) eristetään rekombinanttiplasmidi-DNA transformoidusta isäntäsolusta, joka ilmaisee ksylanaasia tuot-5 tavan fenotyypin.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen re-striktioentsyymi on restriktioentsyymi Hind III.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että vektoriplasmidi on pBR 322.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rekombinanttiplasmidi on plasmidi pCX 311 (FERM BP-470).

8. Menetelmä solun ulkopuolisen ksylanaasin tuot- 15 tamiseksi, jossa viljellään transformantti, joka on saatu transformoimalla Escherichia coli-isäntämikro-organismi jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisella rekombinantti-plasmidilla, tunnettu siitä, että a) siirrostetaan alusta, joka sisältää valitun 20 hiililähteen yhdessä epäorgaanisen suolan kanssa, joka on natriumsuola tai kaliumsuola transformantilla; ja b) jatketaan transformantin viljelyä sen jälkeen, kun solukonsentraatio on saavuttanut huippunsa ja kunnes ksylanaasin tuotto ja akkumulaatio alustassa on saavut- 25 tanut huippunsa.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epäorgaaninen suola on nat-riumkloridi tai kaliumkloridi.

10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetel- 30 mä, tunnettu siitä, että epäorgaanista suolaa käytetään määrässä 0,5-3,0 paino-% alustasta.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 8-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformantti viljellään 12-48 tuntia.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 8-11 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että hiililähde on lesettä tai ksylaania. 23 86438