JP2518051B2 - ＡｃｃＩ制限エンドヌクレア―ゼの製造方法 - Google Patents
ＡｃｃＩ制限エンドヌクレア―ゼの製造方法Info
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- JP2518051B2 JP2518051B2 JP1143359A JP14335989A JP2518051B2 JP 2518051 B2 JP2518051 B2 JP 2518051B2 JP 1143359 A JP1143359 A JP 1143359A JP 14335989 A JP14335989 A JP 14335989A JP 2518051 B2 JP2518051 B2 JP 2518051B2
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- plasmid
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はAcc I制限エンドヌクレアーゼの遺伝子を含
む染色体DNA断片を組み込んでなる新しい組換えプラス
ミド、該プラスミドを導入して形質転換した宿主及び該
宿主を培養してAcc I制限エンドヌクレアーゼを製造す
る方法に関する。
む染色体DNA断片を組み込んでなる新しい組換えプラス
ミド、該プラスミドを導入して形質転換した宿主及び該
宿主を培養してAcc I制限エンドヌクレアーゼを製造す
る方法に関する。
（従来の技術） II型制限酵素はデオキシリボ核酸（DNA）鎖中のある
特定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性
の高い酵素であり、このすぐれた特異性により遺伝子工
学の分野で幅広く利用されている。
特定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性
の高い酵素であり、このすぐれた特異性により遺伝子工
学の分野で幅広く利用されている。
現在までのところ、細菌等から約100種類のII型制限
酵素が発見され、商品化されている。本発明のAcc I制
限エンドヌクレアーゼも、このII型制限酵素のひとつで
あり、DNAの塩基配列中のGT↓AGCTCTを認識し、これを
切断する酵素であり、アシネトバクター カルコアセチ
カス（Acinetobacter calcoaceticus）において生産さ
れることが知られている〔Nucleic Acids Resarch 13 P
165（1985）〕。
酵素が発見され、商品化されている。本発明のAcc I制
限エンドヌクレアーゼも、このII型制限酵素のひとつで
あり、DNAの塩基配列中のGT↓AGCTCTを認識し、これを
切断する酵素であり、アシネトバクター カルコアセチ
カス（Acinetobacter calcoaceticus）において生産さ
れることが知られている〔Nucleic Acids Resarch 13 P
165（1985）〕。
II型制限酵素を遺伝子工学の分野で利用するには最低
限次の４つの条件を満足する必要がある。
限次の４つの条件を満足する必要がある。
すなわち他の制限酵素を含まない。
フォスファターゼを含まない。
非特異的DNaseを含まない。
３′および５′−オキソヌクレアーゼを含まない。
であり、そのため市販されている制限酵素は除核酸法、
塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等を組み合わ
せることにより高純度に精製されている。本発明のAcc
I制限エンドヌクレアーゼについても、他の制限酵素と
同様の方法が試みられたが、特にAcc I制限エンドヌク
レアーゼにおいては、アシネトバクター カルコアセチ
カス（Acinetobacter calcoaceticus）はAcc I制限エン
ドヌクレアーゼ以外にCG↓CGを認識し、これを切断する
制限酵素、Acc II及びＴ↓CCGGAを認識し、これを切断
する制限酵素、Acc IIIをも同時に生産するため、これ
を除くことが非常に困難であった。
塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等を組み合わ
せることにより高純度に精製されている。本発明のAcc
I制限エンドヌクレアーゼについても、他の制限酵素と
同様の方法が試みられたが、特にAcc I制限エンドヌク
レアーゼにおいては、アシネトバクター カルコアセチ
カス（Acinetobacter calcoaceticus）はAcc I制限エン
ドヌクレアーゼ以外にCG↓CGを認識し、これを切断する
制限酵素、Acc II及びＴ↓CCGGAを認識し、これを切断
する制限酵素、Acc IIIをも同時に生産するため、これ
を除くことが非常に困難であった。
（発明の解決しようとする課題） 本発明者らは、上記方法の欠点であるAcc II制限エン
ドヌクレアーゼ及びAcc III制限エンドヌクレアーゼを
同時に生産するという点を解消し、Acc I制限エンドヌ
クレアーゼだけを産生する菌株を造成すべく鋭意研究を
行なった。その結果、前記アシネトバクター カルコア
セチカス（Acinetobacter calcoaceticus）からAcc I制
限エンドヌクレアーゼの遺伝子を含む染色体DNA断片を
抽出し、これをベクターに組み込んで組換えプラスミド
を作成し、該プラスミドの導入により形質転換させた宿
主を得るに成功するとともに、該宿主がAcc I制限エン
ドヌクレアーゼだけを生産するという事実を発見した。
本発明はこの新しい知見に基づいて完成されたものであ
る。
ドヌクレアーゼ及びAcc III制限エンドヌクレアーゼを
同時に生産するという点を解消し、Acc I制限エンドヌ
クレアーゼだけを産生する菌株を造成すべく鋭意研究を
行なった。その結果、前記アシネトバクター カルコア
セチカス（Acinetobacter calcoaceticus）からAcc I制
限エンドヌクレアーゼの遺伝子を含む染色体DNA断片を
抽出し、これをベクターに組み込んで組換えプラスミド
を作成し、該プラスミドの導入により形質転換させた宿
主を得るに成功するとともに、該宿主がAcc I制限エン
ドヌクレアーゼだけを生産するという事実を発見した。
本発明はこの新しい知見に基づいて完成されたものであ
る。
（課題を解決する手段） 即ち、本発明はアシネトバクター カルコアセチカス
（Acinetobacter calcoaceticus）由来のAcc I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素Sau3A Iで切断
された染色体DNA断片をベクタープラスミドpCU19に組み
込んだプラスミドpAcc I RM8で形質転換された微生物お
よび該微生物を培養して、該培養物からAcc I制限エン
ドヌクレアーゼ採取することを特徴とするAcc I制限エ
ンドヌクレアーゼの製造方法である。
（Acinetobacter calcoaceticus）由来のAcc I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素Sau3A Iで切断
された染色体DNA断片をベクタープラスミドpCU19に組み
込んだプラスミドpAcc I RM8で形質転換された微生物お
よび該微生物を培養して、該培養物からAcc I制限エン
ドヌクレアーゼ採取することを特徴とするAcc I制限エ
ンドヌクレアーゼの製造方法である。
本発明の上記組換えプラスミド及びこれを導入した宿
主はAcc I制限エンドヌクレアーゼだけを生産するた
め、その精製工程においてAcc II制限エンドヌクレアー
ゼ及びAcc III制限エンドヌクレアーゼを除去する必要
がなく、大量のAcc I制限エンドヌクレアーゼを容易に
製造することが可能となった。
主はAcc I制限エンドヌクレアーゼだけを生産するた
め、その精製工程においてAcc II制限エンドヌクレアー
ゼ及びAcc III制限エンドヌクレアーゼを除去する必要
がなく、大量のAcc I制限エンドヌクレアーゼを容易に
製造することが可能となった。
以下本発明につき詳細に説明する。
（ａ） プラスミド及びその調製 本発明の組換えプラスミドは、例えば、エシエリヒア
属に属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）とし
て知られるコリシンE1因子等の、培養された細胞内で増
殖しうる形式をとるプラスミドに、アシネトバクター
カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）由
来のAcc I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むDNA断片
を組み込んでなるプラスミドである。
属に属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）とし
て知られるコリシンE1因子等の、培養された細胞内で増
殖しうる形式をとるプラスミドに、アシネトバクター
カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）由
来のAcc I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むDNA断片
を組み込んでなるプラスミドである。
前記ベクターDNAとしては、天然に存在するものを抽
出したものの他、増殖に必須な部分以外のDNAの部分が
一部欠落しているものでもよく、例えばColE1の系統、p
MB9の系統、pBR322の系統、pSC101の系統、R6Kの系統、
ラムダーフアージの系統等が挙げられる。
出したものの他、増殖に必須な部分以外のDNAの部分が
一部欠落しているものでもよく、例えばColE1の系統、p
MB9の系統、pBR322の系統、pSC101の系統、R6Kの系統、
ラムダーフアージの系統等が挙げられる。
また前記ベクターDNAに前記染色体DNA断片を組み込む
方法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例えば、適
当な制限酵素（Endonuclease）で処理して染色体DNAを
特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNA
と混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられ
る。
方法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例えば、適
当な制限酵素（Endonuclease）で処理して染色体DNAを
特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNA
と混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられ
る。
ベクターDNAとして、pUC19プラスミドを用い、これに
アシネトバクター カルコアセチカス（Acinetobacter
calcoaceticus）から調製された染色体DNA断片を組み込
むことにより、新規プラスミドpAcc I RM8が得られる。
アシネトバクター カルコアセチカス（Acinetobacter
calcoaceticus）から調製された染色体DNA断片を組み込
むことにより、新規プラスミドpAcc I RM8が得られる。
pAcc I RM8プラスミドの調製工程及び制限酵素地図を
第１図に示す。第１図から明らかなように、このプラス
ミドはpUC19プラスミドの制限酵素サイトのBamH Iサイ
トに、アシネトバクター カルコアセチカス（Acinetob
acter calcoaceticus）のAcc I制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を含むDNA断片が組み込まれた8kbの塩基対を有す
る円形分子である。
第１図に示す。第１図から明らかなように、このプラス
ミドはpUC19プラスミドの制限酵素サイトのBamH Iサイ
トに、アシネトバクター カルコアセチカス（Acinetob
acter calcoaceticus）のAcc I制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を含むDNA断片が組み込まれた8kbの塩基対を有す
る円形分子である。
（ｂ） 微生物の調製 このようにして得られた前記染色体DNA断片とベクタ
ーDNAの結合物を既ち形質転換法、例えばショット・ガ
ン法（shot gun method）により受容菌の微生物菌体中
に導入すると、所望の遺伝形質とベクターDNAの形質を
併わせもつ形質転換株が得られる。
ーDNAの結合物を既ち形質転換法、例えばショット・ガ
ン法（shot gun method）により受容菌の微生物菌体中
に導入すると、所望の遺伝形質とベクターDNAの形質を
併わせもつ形質転換株が得られる。
受容菌としては、前記のエシェリヒア・コリHB101、
同C600、同DP、supF、同x1776、同LE392等の通常この種
の技術分野で用いられる微生物が有利に用いられる。そ
の典型的な例としてエシェリヒア・コリH101株が挙げら
れる〔モレキュラー・クローニング・エイ・ラボラトリ
ー・マニュアル、（Molecular Cloning A Laboratory M
anual P.504（1982） 参照；遺伝形質F-、hsd s20（r- B,m- B）rec A13、ara−
14、pro A2、lac Y1、gal K2、rps L20（Sm′）、xy1−
５、mtl−１、spu E44λ−〕。
同C600、同DP、supF、同x1776、同LE392等の通常この種
の技術分野で用いられる微生物が有利に用いられる。そ
の典型的な例としてエシェリヒア・コリH101株が挙げら
れる〔モレキュラー・クローニング・エイ・ラボラトリ
ー・マニュアル、（Molecular Cloning A Laboratory M
anual P.504（1982） 参照；遺伝形質F-、hsd s20（r- B,m- B）rec A13、ara−
14、pro A2、lac Y1、gal K2、rps L20（Sm′）、xy1−
５、mtl−１、spu E44λ−〕。
このエシェリヒア・コリHB101株に、前記プラスミドp
Acc I RM8を導入して形質転換法により得られる微生物
は、新規微生物であり、エシェリヒア・コリHB101（pAc
c I RM8）〔Escherichia Coli HB101（pAcc I RM8）〕
と呼称され、平成元年５月25日付にて工業技術院微生物
工業技術研究所へ寄託され、その寄託番号は、微工研寄
第10740号（FERM P−10740）である。このようにして得
られたエシェリヒア・コリHB101（pAcc I RM8）の菌学
的性質を、DNA受容菌であるエシェリヒア・コリHB101株
の性質を比較すると、前者がAcc I制限エンドヌクレア
ーゼの生産能及びアンピシリン耐性を有するのに対し、
後者がこれらの特性を有しない点以外は、全く同一であ
る。
Acc I RM8を導入して形質転換法により得られる微生物
は、新規微生物であり、エシェリヒア・コリHB101（pAc
c I RM8）〔Escherichia Coli HB101（pAcc I RM8）〕
と呼称され、平成元年５月25日付にて工業技術院微生物
工業技術研究所へ寄託され、その寄託番号は、微工研寄
第10740号（FERM P−10740）である。このようにして得
られたエシェリヒア・コリHB101（pAcc I RM8）の菌学
的性質を、DNA受容菌であるエシェリヒア・コリHB101株
の性質を比較すると、前者がAcc I制限エンドヌクレア
ーゼの生産能及びアンピシリン耐性を有するのに対し、
後者がこれらの特性を有しない点以外は、全く同一であ
る。
（ｃ） 制限エンドヌクレアーゼの生産 工程（ｂ）で得られた形質転換株を培養するには、特
定の遺伝情報によって生成される物質の生産に適した培
地であって且つ宿主微生物の生育に適した培地を用い得
るが、本発明方法では、通常、エシェリヒア・コリの生
育培地として用いられるLB培地（トリプトン、酵母エキ
ス、食塩）、BPB培地（Difco;ポリペプトン、酵母エキ
ス、リン酸カリウム）、栄養・寒天培地（Difco 0001）
トリプトン・食塩培地等を基本培地として調製したもの
を用いればよい。
定の遺伝情報によって生成される物質の生産に適した培
地であって且つ宿主微生物の生育に適した培地を用い得
るが、本発明方法では、通常、エシェリヒア・コリの生
育培地として用いられるLB培地（トリプトン、酵母エキ
ス、食塩）、BPB培地（Difco;ポリペプトン、酵母エキ
ス、リン酸カリウム）、栄養・寒天培地（Difco 0001）
トリプトン・食塩培地等を基本培地として調製したもの
を用いればよい。
その他、必要に応じて炭素源・窒素源の他にアミノ
酸、ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
酸、ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
培養方法は、pH、温度、酸素供給量等の条件として通
常のエシェリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り
得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が
生育してその菌体量が最大に達したのき、即ち対数増殖
後期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、通常30
〜37℃、pH条件は、pH5〜８の範囲、得に中性付近が適
当である。
常のエシェリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り
得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が
生育してその菌体量が最大に達したのき、即ち対数増殖
後期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、通常30
〜37℃、pH条件は、pH5〜８の範囲、得に中性付近が適
当である。
得られた菌体を集菌後、遠心分離、超音波破砕工程等
により抽出し、次いで除核酸法、塩析法・ゲル濾過法、
イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマ
トグラフィー法等を組み合わせることによりAcc I制限
エンドヌクレアーゼを得ることができる。
により抽出し、次いで除核酸法、塩析法・ゲル濾過法、
イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマ
トグラフィー法等を組み合わせることによりAcc I制限
エンドヌクレアーゼを得ることができる。
（発明の効果） 本発明のプラスミド及びこれを導入した形質転換株は
Acc I制限エンドヌクレアーゼだけを生産するため、そ
の精製工程において、Acc II制限エンドヌクレアーゼ及
びAcc III制限エンドヌクレアーゼを除去する必要がな
く、これにより大量のAcc I制限エンドヌクレアーゼを
容易に製造することが可能となった。
Acc I制限エンドヌクレアーゼだけを生産するため、そ
の精製工程において、Acc II制限エンドヌクレアーゼ及
びAcc III制限エンドヌクレアーゼを除去する必要がな
く、これにより大量のAcc I制限エンドヌクレアーゼを
容易に製造することが可能となった。
以下本発明を実施例により、更に詳細に説明するが、
本発明は何らこれらに限定されるものではない。
本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例１ （１） Acc I制限エンドヌクレアーゼの遺伝子を持つ
染色体DNAの調製 アシネトバクター カルコアセチカス（Acinetobacte
r calcoaceticus）をＬ−broth培地〔純粋１あたりト
リプトン（Difco）10g、酵母エキス5g、NaCl 10gをpH7.
0に調製したもの〕50mlに接種し、30℃で振盪培養を行
なった。14時間後に菌体を集めた。次に集めた菌体を10
mg/mlのリゾチーム〔太陽化学（株）製〕、20％ショ
糖、1mM EDTAを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）20m
lに懸濁し、37℃で10分間静置した。次に１％ラウロイ
ルサルコシン酸を含む0.1M EDTA溶液（pH9.6）44ml及び
5.44mg/mlのプロナーゼ溶液2.0mlを加え、50℃で30分間
静置した。
染色体DNAの調製 アシネトバクター カルコアセチカス（Acinetobacte
r calcoaceticus）をＬ−broth培地〔純粋１あたりト
リプトン（Difco）10g、酵母エキス5g、NaCl 10gをpH7.
0に調製したもの〕50mlに接種し、30℃で振盪培養を行
なった。14時間後に菌体を集めた。次に集めた菌体を10
mg/mlのリゾチーム〔太陽化学（株）製〕、20％ショ
糖、1mM EDTAを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）20m
lに懸濁し、37℃で10分間静置した。次に１％ラウロイ
ルサルコシン酸を含む0.1M EDTA溶液（pH9.6）44ml及び
5.44mg/mlのプロナーゼ溶液2.0mlを加え、50℃で30分間
静置した。
次に塩化セシウム66g、10mg/mlのエチジウムブロマイ
ド溶液3.3mlを加え、混合した後に38,000rpm40時間の遠
心分離を行なった。DNA層を注射器で抜きとり、ｎ−ブ
タノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、
1mM EDTAを含む1mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に透析す
ることにより約380μｇの染色体DNAを取得した。
ド溶液3.3mlを加え、混合した後に38,000rpm40時間の遠
心分離を行なった。DNA層を注射器で抜きとり、ｎ−ブ
タノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、
1mM EDTAを含む1mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に透析す
ることにより約380μｇの染色体DNAを取得した。
（２） 染色体DNA断片のベクターへの挿入 （１）で得られた染色体DNA3μｇについて0.02ユニット
のSau3A I制限エンドヌクレアーゼを加え、37℃１時間
の反応を行なうことにより、これを部分分解した。
のSau3A I制限エンドヌクレアーゼを加え、37℃１時間
の反応を行なうことにより、これを部分分解した。
次にベクタープラスミドpUC19〔東洋紡績（株）製〕
１μｇについて、４ユニットのBamH I制限エンドヌクレ
アーゼを加え、37℃１時間の反応を行なうことによりこ
れを完全分解し、更に１ユニットのアルカリフォファタ
ーゼを加え、37℃、１時間の反応を行なうことにより、
５′末端のリン酸を除去した。
１μｇについて、４ユニットのBamH I制限エンドヌクレ
アーゼを加え、37℃１時間の反応を行なうことによりこ
れを完全分解し、更に１ユニットのアルカリフォファタ
ーゼを加え、37℃、１時間の反応を行なうことにより、
５′末端のリン酸を除去した。
以上の方法により得られた３μｇの染色体DNA断片と
１μｇのpUC19のDNA断片を混合し、更に1mM ATP及び5mM
ジチオスレイトールの存在下に５ユニットのT4ファージ
由来のDNAリガーゼを用いて15℃、16時間の連結反応を
行なうことにより染色体DNAを組み込んだプラスミドDNA
を取得した。
１μｇのpUC19のDNA断片を混合し、更に1mM ATP及び5mM
ジチオスレイトールの存在下に５ユニットのT4ファージ
由来のDNAリガーゼを用いて15℃、16時間の連結反応を
行なうことにより染色体DNAを組み込んだプラスミドDNA
を取得した。
（３） Acc I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む組
換えプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリＫ−12株とエシェリヒア・コリＢ
株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリHB101株
（インビトロジェン社製）をLB培地〔純水１あたりト
リプトン（Difco）10g、酵母エキス5g、NaCl 10gをpH7.
0に調製したもの10mlに接種し、37℃で振盪培養行な
い、対数増殖期まで生育させた後に集菌した。これを氷
冷下、最終濃度で0.03M CaCl2の溶液に懸濁させてコン
ピテントな細胞とした。この細胞混濁液に（２）で得た
プラスミドDNAの溶解液を加えて、氷冷下で60分反応さ
せ、42℃、１〜２分間ヒートショックを与えて、前記プ
ラスミドDNAを細胞内に取りこませた。次いでこの細胞
懸濁液を別途前記LB培地に接種し、37℃、３〜５時間振
盪培養して形質転換反応行なった後、アンピシリン耐性
を有し、且つAcc I制限エンドヌクレアーゼを生産する
株を分離し、エシェリヒア・コリHB101（pAcc I RM8）
（微工研菌寄第10740号）を得た。
換えプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリＫ−12株とエシェリヒア・コリＢ
株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリHB101株
（インビトロジェン社製）をLB培地〔純水１あたりト
リプトン（Difco）10g、酵母エキス5g、NaCl 10gをpH7.
0に調製したもの10mlに接種し、37℃で振盪培養行な
い、対数増殖期まで生育させた後に集菌した。これを氷
冷下、最終濃度で0.03M CaCl2の溶液に懸濁させてコン
ピテントな細胞とした。この細胞混濁液に（２）で得た
プラスミドDNAの溶解液を加えて、氷冷下で60分反応さ
せ、42℃、１〜２分間ヒートショックを与えて、前記プ
ラスミドDNAを細胞内に取りこませた。次いでこの細胞
懸濁液を別途前記LB培地に接種し、37℃、３〜５時間振
盪培養して形質転換反応行なった後、アンピシリン耐性
を有し、且つAcc I制限エンドヌクレアーゼを生産する
株を分離し、エシェリヒア・コリHB101（pAcc I RM8）
（微工研菌寄第10740号）を得た。
（４） エシェリヒア・コリHB101（pAcc I RM8）によ
るAcc I制限エンドヌクレアーゼの生産 （３）で得られた形質転換株エシェリヒア・コリHB101
（pAcc I RM8）（微工研菌寄第10740号）を前記LB培地5
00mlを含む２容のフラスコで37℃、16時間振盪培養を
行なった。これを遠心分離にて集菌、洗浄後、10mM MgC
l2、7mM 2−メルカプトエタノールを含んだ20mMのトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.5）25mlに懸濁し、０℃で10分間の
超音波破砕を行なった。更に12,000rpmで10分間の遠心
分離により酵素抽出液を得た。
るAcc I制限エンドヌクレアーゼの生産 （３）で得られた形質転換株エシェリヒア・コリHB101
（pAcc I RM8）（微工研菌寄第10740号）を前記LB培地5
00mlを含む２容のフラスコで37℃、16時間振盪培養を
行なった。これを遠心分離にて集菌、洗浄後、10mM MgC
l2、7mM 2−メルカプトエタノールを含んだ20mMのトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.5）25mlに懸濁し、０℃で10分間の
超音波破砕を行なった。更に12,000rpmで10分間の遠心
分離により酵素抽出液を得た。
次にこの酵素抽出液に硫安粉末を氷冷下添加溶解し、
30〜80％飽和画分を（飽和度はOsborne法で表示）を遠
心分離により回収した。この回収沈澱物を2mMメルカプ
トエタノール、５％グリセロルーを含んだ10mMリン酸緩
衝液（pH7.5）2mlに溶解し、更に透析チューブに入れ
て、100倍量の同緩衝液に対して１液透析した。続いて
同緩衝液にて平衡化したホスホセルロース（ワットマン
社製）のカラム（容量20ml）に吸着させた。５倍量の同
緩衝液で洗浄後０〜1.0M KClグラジエント溶出を行なっ
た。Acc I制限エンドヌクレアーゼはKCl濃度0.5M付近で
溶出された。溶出した酵素液を透析チューブに入れ、2m
Mメルカプトエタノール、50％グリセロールを含んだリ
ン酸緩衝液に透析することにより5mlの酵素液が得られ
た。得られた酵素液の酵素活性を測定したところ500ユ
ニットであった。
30〜80％飽和画分を（飽和度はOsborne法で表示）を遠
心分離により回収した。この回収沈澱物を2mMメルカプ
トエタノール、５％グリセロルーを含んだ10mMリン酸緩
衝液（pH7.5）2mlに溶解し、更に透析チューブに入れ
て、100倍量の同緩衝液に対して１液透析した。続いて
同緩衝液にて平衡化したホスホセルロース（ワットマン
社製）のカラム（容量20ml）に吸着させた。５倍量の同
緩衝液で洗浄後０〜1.0M KClグラジエント溶出を行なっ
た。Acc I制限エンドヌクレアーゼはKCl濃度0.5M付近で
溶出された。溶出した酵素液を透析チューブに入れ、2m
Mメルカプトエタノール、50％グリセロールを含んだリ
ン酸緩衝液に透析することにより5mlの酵素液が得られ
た。得られた酵素液の酵素活性を測定したところ500ユ
ニットであった。
この様にして得られた酵素液は他の制限エンドヌクレ
アーゼ、フォスファターゼ、非特異的DNaseなどを含ん
でおらず遺伝子工学の分野で移用することが可能であっ
た。
アーゼ、フォスファターゼ、非特異的DNaseなどを含ん
でおらず遺伝子工学の分野で移用することが可能であっ
た。
なお、Acc I制限エンドヌクレアーゼの活性の測定
は、１μｇのλ−DNAを20mMトリス塩酸緩衝液、10mM塩
化マグネシウム溶液、50mM硫酸アンモニウム、7mM2−メ
ルカプトエタノールからなる反応液45μに溶解し、そ
の混合液に５μの酵素液を加えて、37℃で１時間の反
応を行なった後、アガロース電気泳動を行なうことによ
り測定する。酵素活性における１単位は、37℃ pH7.5に
おいて１時間に１μｇのλ−DNAを完全に分解する酵素
活性をいう。
は、１μｇのλ−DNAを20mMトリス塩酸緩衝液、10mM塩
化マグネシウム溶液、50mM硫酸アンモニウム、7mM2−メ
ルカプトエタノールからなる反応液45μに溶解し、そ
の混合液に５μの酵素液を加えて、37℃で１時間の反
応を行なった後、アガロース電気泳動を行なうことによ
り測定する。酵素活性における１単位は、37℃ pH7.5に
おいて１時間に１μｇのλ−DNAを完全に分解する酵素
活性をいう。
第１図はpAcc I RM8の調製工程および制限酵素地図を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (2)
- 【請求項１】アシネトバクター カルコアセチカス（Ac
inetobacter calcoaceticus）由来のAcc I制限エンドヌ
クレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素Sau3A Iで切断され
た染色体DNA断片をベクタープラスミドpCU19に組み込ん
だ、下記に示されるプラスミドpAcc I RM8で形質転換さ
れた微生物。 - 【請求項２】アシネトバクター カルコアセチカス（Ac
inetobacter calcoaceticus）由来のAcc I制限エンドヌ
クレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素Sau3A Iで切断され
た染色体DNA断片をベクタープラスミドpCU19に組み込ん
だ、下記に示されるプラスミドpAcc I RM8で形質転換さ
れた微生物を培養し、該培養物からAcc I制限エンドヌ
クレアーゼを採取することを特徴とするAcc I制限エン
ドヌクレアーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1143359A JP2518051B2 (ja) | 1989-06-06 | 1989-06-06 | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレア―ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1143359A JP2518051B2 (ja) | 1989-06-06 | 1989-06-06 | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレア―ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH037584A JPH037584A (ja) | 1991-01-14 |
| JP2518051B2 true JP2518051B2 (ja) | 1996-07-24 |
Family
ID=15336953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1143359A Expired - Lifetime JP2518051B2 (ja) | 1989-06-06 | 1989-06-06 | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレア―ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2518051B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69733540T2 (de) | 1996-03-13 | 2006-05-11 | Takara Bio Inc., Otsu | Plasmid |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH022366A (ja) * | 1987-12-17 | 1990-01-08 | New England Biolabs Inc | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。 |
-
1989
- 1989-06-06 JP JP1143359A patent/JP2518051B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH022366A (ja) * | 1987-12-17 | 1990-01-08 | New England Biolabs Inc | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH037584A (ja) | 1991-01-14 |
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