JPH022366A - ＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明のバックグラウンド 本発明は、制限エンドヌクレアーゼＡＣＣＩおよびその
修飾メヂラーゼのクローンならびに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。

制限エンドヌクレアーピは天然の細菌中にみられる酵素
の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する他
の細菌成分から′Ｖｉ製すると、実験室でＤＮＡ分子を
切断して各々相応する正確な断片を形成するのに使用す
ることができる。この性質の故に、ＤＮＡ分子はひとつ
ずつ独自に同定することができ、また分画してその構成
遺伝子を単離することができる。制限エンドヌクレアー
ゼは現代の遺伝子研究における不可欠の手段であること
が立証されている。これらの酵素は生化学的な［ハサミ
Ｊであり、これによって遺伝子の工学および解析が達成
される。

制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）をＨｎしてこれ
に結合することによって作用する。

これらの酵素はＤＮＡ分子に結合すると、その配列の内
部または一端でその分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼはそれぞれ異なる認識配列に対して親和力
をもっている。今日までに調べられた幾百種もの細菌で
百を越える数の異なる制限エンドヌクレアーぜが同定さ
れている。

細菌は、その挿出に、精々数種だけの制限エンドヌクレ
アービをもつという傾向がある。これらのエンドヌクレ
アーゼは、通常、それの由来となった細菌に因んで命名
される。たとえば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　　ａｅｇ
ｙｐｔｉｕｓはｌ−１ａｅＩ、ＨａＪおよびＨａｃｍと
よばれる３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを合成す
る。これらの酵素は、それぞれ（八Ｔ）ＧＧＣＣ（八■
）、ＰｕＧＣＧＣＰｙおよびＧＧＣＣという配列を認識
して開裂する。一方、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　ｉ
　ａｃｏｌｉ　　ＲＹ１３は１種類の酵素Ｅ（１０）Ｒ
Ｉを合成するだけであり、この酵素はＧＡ八へＴＣとい
う配列を認識する。

理論に縛られるつもりはないが、自然界で制限エンドヌ
クレアーぜは細菌細胞の繁殖に関して保護的な役割を果
たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、細
菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたはこ
れらに寄生したりするウィルスやプラスミドのような外
来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗することが可能に
なる。

制限エンドヌクレアーゼは、侵入して来るＤＮＡ分子の
端から端まで精査し、認識配列に出会う度毎にそれらの
ＤＮＡ分子を開裂することによって、細菌に抵抗性を付
与する。こうして生起する破壊の結果、浸入する遺伝子
の多くは無能となり、そのＤＮＡはエキソヌクレアーゼ
によってさらに細かく分解されるようになる。

細菌の防御系の第二の要素は＃！飾メチラーゼである。

これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり
、これによって、細菌が外来の感染性ＤＮＡから自身の
ＤＮＡを防御し区別できるようにする手段が提供される
。修飾メチラーぜは対応する制限エンドヌクレアーゼと
同じヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが
、このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加する
ことによってその配列内のヌクレオチドのいずれかを化
学的に修飾する。このメチル化が起こると、その認識配
列に制限エンドヌクレアーゼが結合することはなく、ま
た、その配列が制限エンドヌクレアーゼによって開裂さ
れることもない。細菌細胞のＤＮＡはそのｒｉ飾メチラ
ーゼの活性のおかげでいつも完全に修飾されており、し
たがって自身の内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に
対する感受性は完全に消失している。制限エンドヌクレ
アーゼの認識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾の
ＤＮＡ、したがって外来のものであることが確認できる
ＤＮＡだけである。

遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をクロ
ーニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質や
酵素を従来の精製技術で入手可能な借より天吊に生産す
ることが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローンを単離する際の鍵は、そのようなりローンの出
現頻度が１０−４〜１０−３程度に低い場合、複雑な「
ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られ
るクローンの集団の中で目的とするクローンを同定する
ための簡単で信頼のおける方法を開発することである。

好ましくは、この方法は、目的としない大多数のクロー
ンは破壊されるが珍にある望ましいクローンは生き残れ
るように、選択的であるべきである。

■型の制限−修飾系はクローニングされつつあり、その
数は次第に増加している。最初にクローニングされた系
は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択
する手段としてバクテリオファージによる感染を使用し
た［　ＥｃｏＲＩＩ　：　Ｋｏｓｙｋｈｅｔ　ａｌ、、
Ｈｏ１ｅｃ、　　ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　　１７８　
：　７１７−７１９（１９８０）：　ＨｈａＩＩ　：　
Ｈａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　　３：　９７−１
１２（１９７８）：　ＰｓｔＩ　：Ｗａｌｄｅｒ　ｅｔ
　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　ＮａｔＡｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ、　７８．１５０３−１５０７　（１９８
１）］　、細菌中にＬ１１限−修飾系が存在すると細菌
はバクテリオファージによる感染に対して抵抗できるの
で、りローニングされた制限−昨ｔｇＪ遺伝子を担持す
る細胞は、原理的に、ファージ唄暴露したライブラリー
から生えて来る（生き残る）株として選択的に単離する
ことができる。しかしこの方法は限られた系でしか価値
がないことが判明した。特定的にいうと、クローニング
された制限−修飾遺伝子は、選択的な生き残りを可能に
する程に充分なファージ耐性を常に発現するとは限らな
いことが判明したのである。

もうひとつ別のクローニング法では、最初プラスミド由
来とされていた系をＥ、ｃｏｌｉクローニングプラスミ
ド中に組み込んでいる［ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅ
ｒｅｔ　　ｅｔ　　ａｌ、　　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａ
ｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　　　１２３６５９−３６７６（
１９８４）・ＰａｅＲ７：Ｇ＋ｒ＋ｏｅｒａｓ　　ａｎ
ｄ　　ＢｒｏｏｋｓＰｒｏｃ、　　Ｎａ口、　　Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　８０：４０２−４０
６（１９８３）：丁ｈｅｒｉａｕｌｔ　　ａｎｄ　　　
Ｒｏｙ、　　Ｇｅｎｅ、　　１９：３５５−３５９　　
（１９８２）ＰｖｕＨ：　Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ　　ａ
ｔ　　ａｌ、、　　　Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉ。

１６４・　５０１−５０９　　（１９８５）］。

第三の方法、すなわち多くの系のクローニングに使用さ
れている方法では、本発明者らの特許出願第７０７０７
９号に関連する活性なメチラーゼ遺伝子について選択す
る［Ｂｓｕｌｔｌ　：　Ｋ１５ｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ八ｃｉｄｓ　へＲｅｓ、、　１３：　６４０
３−６４２１　（１９８５）］。制限遺伝子と修飾遺伝
子とは近接して結合している傾向があるので、両者の遺
伝子を含有するクローンは一方の遺伝子について選択す
るだけで単離できることが多い。しかし、メチル化活性
による選択では常に完全な制限−修飾系が１９られるわ
けではなく、逆に、メチラーゼ遺伝子のみが得られるこ
ともある［ＢｓｐＲＩ　：　Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ　ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、　１０：２１９−２２５　（１
９８０）・ＢｃｎＩ　：　Ｊａｎｕｌａｉｔ＋ｓ　ｅｔ
　ａｌ、、Ｇｅｎｅ２０：１９７−２０４　（１９８２
）；Ｂ　ｓｕＲＩ　：にｉｓｓ　ａｎｄ　Ｂａ１ｄａｕ
ｒ。

Ｇｅｎｅ、　２１：１１１−１１９　（１９８３）・お
よびＭＳＤＩ　：　Ｗａｌｄｃｒｅｔ　ａｔ、、　、Ｊ
、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ、、２５８：１２３５−１２
４１（１０８３）］。

制限−修飾遺伝子のクローニングに対する考えられる障
害は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチ
ラーゼ遺伝子とエンドヌクレア〜ぜ遺伝子とを一緒に単
一のＤＮＡセグメントに導入すると、エンドヌクレアー
ゼが宿主ＤＮＡを開裂する機会を得る前にメチラーゼが
そのＤＮＡを修飾して保護するはずである。Ｅ、ｃｏｌ
ｉ中での制限−修飾系のクローニングに対する別の障害
が、種々のメチラーゼをクローニングする過程で発見さ
れた。すなわら、多くの旦、ｃｏｌｉ２株は、メチル化
シトシンを含有しているＤＮＡの導入に抵抗する系をも
っているのである［　Ｒａｌｅｉｇｈａｎｄ　　Ｗｌｌ
ＳＯｎ、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ口、　八ｃａｄ、　　
Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　８３９０７０−９０７４　（
１９８６）］　、したがって、どのＥ、ｃｏｌｉ株をク
ローニングに使用するかを注意深く吟味しで、修飾に対
して逆に反応するものを避ける必要がある。

精製したＬ１１限エンドヌクレアーゼ、および重要性は
それより落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡの
特性決定と再配列をするのに有用な道具であるから、こ
れらの酵素を大量に合成する細菌株をｉｌｌ換えＤＮＡ
技術によって得ることは商業的な魅力がある。そのよう
な株が得られれば、商業的に有用な吊で生産するための
手段が提供されるばかりでなく精製の作業も簡単になる
と思われるので、極めて有用なものとなるであろう。

発明の概要 本発明によって、＾ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌ
ｃｏａｃｅｔｉｃりに由来するＡＣＣＩ制限エンドヌク
レアーゼおよび修飾メチラーゼの遺伝子を含有するり日
−ン、ならびにこれら酵素の生産方法が提供される。よ
り特定すると、本発明は、５−・・ＧＴ（ＡＣ）（ＧＴ
）ＡＣ・・・３というＤＮＡ配列を認識して最初の王の
後で開裂する制限エンドヌクレアーぜＡｃｃＩを発現す
るクローンに係る。

この酵素をクローニングする好ましい方法は、Ａｃ１ｎ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ　　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに
由来するＤＮＡを含有するライブラリーを形成し、ＡＣ
ＣＩ修飾メヂラーぎをコードしているＤＮＡを含有する
クローンを単離し、これらをスクリーニングして、へｃ
ｃＩｌｌＩ限エンドヌクレアーゼ遺伝子も共に含有して
いるクローンを同定することからなる。

発明の詳細な説明 本発明は、ＡＣＣＩ制限および修飾遺伝子のクローン、
ならびにそのようなりローンによって生産される制限エ
ンドヌクレアーゼＡＣＣＩに係る。これらのＡＣＣＩ遺
伝子は、ＡｃｃＩ修飾メ修飾−チラー子を含有し発現す
ることに基づいて選択したいくつかのクローンが同時に
ＡｃｃＩ制限遺伝子も含有しているという事実を利用す
る方法によってクローニングするのが好ましい。そのよ
うなりローンのＤＮＡはＡｃｃＩ制限エンドヌクレアー
ゼによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ消化に抵抗性である。この消
化に対する抵抗性ににって、Δｃｃ■メチラーゼおよび
制限エンドヌクレアーピをコードしているクローンを選
択的に単離するための手段が得られる。

ＡＣＣＩ制限遺伝子およびメチラーピ遺伝子をクローニ
ングして発現させるための本発明の好ましい方法を第１
図に示すが、これには以下のステップが含まれる。

（１）　　　Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　　ｃａｌｃ
ｏａｃｅｔｉｃｕｓのＤＮＡを精）Ｊする。この微生物
のナンブルはＴｈｅ静ｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから八ＴＣＣ５３７０１
として入手可能である。

（２）　　このＤＮＡをＥ（１０）ＲＩのような制限エ
ンドヌクレアーゼで部分消化する。

（３）　　消化したＤＮＡを、１個以上のＡｃｃＩ部位
を含有するＩ）ＢＲ３２２（Ａ１ＣＣ３７０１７）のよ
うなりローニングベクターに連結する。連結した混合物
を用いてＥ、　ｃｏｌｉ　　ＲＲｌ　　（Ａ丁ＣＣ３１
３４３）のような適当な宿主細胞を形質転換する。

（４）　　形質転換した混合物を、形質転換細胞を選択
するためのアンピシリンのような抗生物質を含有する培
地（Ａｍｐ　ｐｌａｔｅｓ）に接種する。培養後形質転
換細胞コロニーをひとつに集めてセルライブラリーとす
る。

（５）　　このセルライブラリーから組換えプラスミド
全部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成
する。

（６）　　次にこのプラスミドライブラリーをＡｃｃＩ
制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎ（ｌｌａｎｄ　
Ｂ！０ＩａｂＳＩｎｃから市販、カタログＩ　１６１）
で完全にｉｎ　ｖｉｔｒ。

消化する。ＡＣＣＩ制限エンドヌクレアーゼ消化の拮宋
、メチラーゼを含有しない未修飾クローンの特異的開裂
が生じ、生き残る完全なプラスミド全体に対するＡＣＣ
Ｉメチラーピ担持クローンの頻度が増大する。消化後こ
のライブラリーをホスファターぜで処理して、消化され
た分子の形質転換能をさらに低下させる。

（７）　　消化したプラスミドライブラリーをＥｃｏｌ
ｉ　ＲＲｌ株のような宿主に形質転換し、抗生物質含有
培地（ＡＩＩＩＤ　Ｐｌａｔｅｄ）に接種して再度形質
転換コロニーを（ｑる。これらのコロニーを球数し、以
下の方法でＡＣＣＩ修飾遺伝子の存在について個別に分
析する。すなわち、コロニーが担持するプラスミドＤＮ
Ａを精製し、ＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼと共にｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏでインキュベートしてＡｃｃＩＭ化に対
して抵抗性か否かを決定する。また、これらのクローン
から細胞の全ＤＮＡ　（染色体およびプラスミド）も精
製し、ＡＣＣＩ制限エンドヌクレアーゼと共にインキュ
ベ−１〜するａ八〇ｃ１メヂラーゼ遺伝子を担持するク
ローンのＤＮＡは充分にメチル化されているはずであり
、プラスミドＤＮＡと全ＤＮＡは両方とも消化に対して
実質的または完全に低抗性であることが判明するはずで
ある。

（８）　　ステップ（７）で△ｃｃＩメチラーゼ遺伝子
を担持すると同定されたクローンの粗抽出物を調製し、
この粗抽出物のＡＣＣＩ制限エンドヌクレアーぜ活性を
検定することによって、Δｃｃ工制限エンドヌクレアー
ゼを担持するクローンを同定する。

粗細胞抽出物中のＡＣＣＩ制限エンドヌクレアーゼ活性
の検出は、形質転換によってプラスミドが移入されてい
る旦　匹の８８２９４株（ＡＴＣＣ３３６２５）のよう
なｅｎｄｏＡ　　株から抽出物を調製すると容易になる
。

（９）　　コピー数の多いベクターを使用して遺伝子量
を高めることによって、また活性の高い外因性プロモー
ターを使用して転写速度を上げることによって、クロー
ンのΔｃｃ■制限エンドヌクレアーゼ産生量を増大させ
ることができる。

（１０）ＡＣＣＩ制限および修飾遺伝子を担持している
クローンを醗酵槽内のアンピシリン含有富化培地中で増
殖させることによって、ＡＣＣＩ制限エンドヌクレアー
ピを生産することができる。その後遠心して細胞を集め
、音波処理で破砕すると、ＡＣＣＩ制限エンドヌクレア
ーぜ活性を３石する粗細胞抽出物が生成する。

（１１）ＡＣＣＩ制限エンドヌクレアーピ活性を含有す
る粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィー
やイオン交換クロマトグラフィーのように標準的なタン
パク質精製技術によって精製する。

上に概略を記載した手順は本発明の好ましい実施態様で
あるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変える
ことができるということは当業者には明らかであろう。

以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示する
が、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはないものと考えられたい。

実施例 ＡｃｃＩｍ＋１限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニ
ング （１）　　ＤＮＡの精製： ＾ｃ＋ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉ
ｃｕｓ　（ＡＴＣＣ５３７０１）の細胞ペースト８ｇを
３２ｍの２５％スクロース、　５０ｍＨ丁ｒｉｓ　ｐＨ
８，０中に再懸濁させた。１６７の０．２５ＨＥＤＴ八
ｐト（８，０および１０−の１０η／ｄリゾチーム（０
，２５ＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０中）を加え、混合物を２
時間氷上に放置した。４０ｔｄの１″％　ｒｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１００゜５０ＩｌｌＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０，６
２ｍＨＥＤＴＡおよび１ｄの１０％ＳＤＳを加え、得ら
れた溶液を混合して溶菌させた。得られた！ｌｉｍ液を
、新たに平衡化した（０．５８Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０
）フェノール９０戒およびクロロホルム９０ｍ１で二回
抽出した後、ＩＯＫ　ｒｐｍで３０分遠心した。粘稠な
上層を透析チューブに移し、ＤＮＡ緩衝液（１０ｍＨＴ
ｒｉｓ　ｐＨ７，５，１ｍＨＥＤＴＡ）に対しこの緩衝
液を四回交換して透析した。透析した溶液を４００−の
ビーカーに移し、容積を測定した（１５０ｄ）　。１０
ｍ９／ｌｄ　ＲＮａｓｃを　１．５戒加えて　１００埒
／ｄＲＮａＳｅとし、その溶液を１時間３７°Ｃにイン
キュベートした。この溶液中に５８　ＮａＣρを１３ｄ
混入し、頂部に９２−のイソプロパツールを重層し、ｉ
ｑられた溶液をガラス棒で掻き混ぜた。細菌のＤ　Ｎ　
Ａ　ｈ（沈澱しながらガラス棒に巻き付いたので、これ
を取り出して風乾した後６ｄのＤＮＡ緩衝液に溶解した
。

（２）　　部分消化： 粘賀したＤＮＡを８０屑含有する８００成の１０ｍＨ丁
ｒｉｓ　ｐｌ＋　７．５．１０ｍＨメルカプトエタノー
ルｍＨ　ＮａＣ１を調製し、そのうちの　１００成を８
木の別々のチューブに分注した。第１のチューブにはＥ
ｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼをｉｏ　ｕｎｉｔ加え
てＤＮＡ１．ＯＩＪ旧ｔ／ｉとした。第２のチューブに
はＥＣＯＲＩを５　ｕｎ已加えた（　０．　５　ｕ旧ｔ
／　Ｒ　）。

以下、次のチューブにはまた半分の洛のＥＣＯＲＩを入
れ、残りのチューブも同様にした。これらのチューブを
１時間３７℃にインキュベートし、次に７２°Ｃで１５
分間熱処理した後、各々の１０成をアガロースゲル電気
泳動によって分析した。適度ではあるが不完全な消化状
態を示すチューブを選んで、クローニング用の部分消化
断片源とした。（これらは０．５Ｌｌ／＃＃、０．２５
ｕ，／Ｂおよび０．１２５　ｕ／ｌｔｓのチューブであ
った。これら３つの溶液を合わせて混合し、以下に記載
するようにして使用した。〉（３）　　　連　　結　： ＥｃｏＲＩで部分消化した八．　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉ
ｃｕｓ　ＤＮＡ４、０埒（４０成）を、ＥＣＯＲＩで開
裂し脱リン酸化した　ｐＢ　Ｒ　３２２　　（八ＴＣＣ
　３７０１７）　　２．Ｏｌｌ！ｇ（２０１１１）と混
合した。５×連結用ｍｉｘ　（２５０ｍＨ　Ｔｒｉｓ　
ｐＨ　７．５５０ｍＨ　　Ｈｇｄ！２．　５０ｍＨ　Ｄ
ＴＴ，　５ｍＨ　ＡＴＰ）を２０成加え、さらに滅菌蒸
溜水を１６ｐＩｌ加えて最終容積を１００成とした。Ｔ
４ＤＮΔリガーゼを４成加え、得られた混合物を４時間
１６℃にインキュベートした。こうして連結したＤＮＡ
を用い、以下のようにしてＥ　、　ｃｏｌｉ　ＲＲＩ株
（ＡＴＣＣ　３１３４３）を形質転換した。

すなわち、連結したＤ　Ｎ　Ａ　５０成を氷上で４５０
度のＳＳＣ／ＣａＣｉ！２（５０ｍＨ　ＮａＣ！！，　
５ｍＨクエンＭＮａ３，　６７ｍＨＣａα２）とａ合し
、氷冷したＥ．　ｃｏｌｉ　ＲＲ１］ンピチンピ細胞（
ｈｓｄＲ　　Ｍ　　、ＭｃｒＢ　　）を１２００＄加え
た。４３℃で３分間の熱ショックを与えた侵、細胞を１
０ｄのＩｕｒｉａ−ブロス（　Ｌ−ｂｒｏｔｈ）中に希
釈し、飽和するまで３７℃で増殖させた。

（４）　　ｔルライブラリー； 形質転換した細胞の培養液を遠心した後、上清を捨て、
細胞を１ｄのＬｕｒｉａブロスに再懸濁させた。そのう
らの２００７＆を、アンピシリンを１００ｉ／ｄ含有す
るＬｕｒｉａ−寒天（　Ｌ−ａｇａｒ）プレート上に接
種した。３７℃で一晩培養後、各プレートに２５ｉのｉ
ｏｍＨ　丁ｒｙｓ　ｐｌ＋　７．５．　１０ｍＨ　　Ｈ
ｇＣｉ！２を満たし、形質転換したコロニーを掻き集め
、プールしてセルライブラリーを形成した。

（５）　　プラスミドライブラリー： ２、５ｄのセルライブラリーを、アンピシリンを１００
埒／ｄ含有するＬ−ｂｒｏｔｈ　５００　ｍＲ中に接種
した。

３７°Ｃで一晩振盪培養した後、４Ｋ　ｒｐｍで５分遠
心した。上清を捨て、細胞ペレッ１〜を１０ｄの２５％
スクロース、　５０ｍＨ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ　８．０に掌
濡で再懸濁させた。

０、２５Ｈ　ＥＤＴＡ，　ｐｌ＋　８．０を５ｄ加え、
次いで１０■／ｄリゾチーム（０．２５Ｈ　Ｔｒｉｓ，
　ｐＨ　８．０中）を３ｄ加えた。得られた溶液を氷上
に１時間放置した後、１２ｄの溶菌用ｍｉＸ　（ＩＸ　
Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ−ｉｏｏ，　５０ｍＨ　ｒｒｉｓ　ｐ
Ｈ８、０．　６７ｍＨ　ＥＤＴＡ）をピペットで激しく
注入すると、細胞懸濁液は穏やかに渦を巻いて溶菌が起
こった。

溶菌後混合物を５０ｄのプラスチック製遠心管に移して
１５Ｋｒｐｍ　、　４℃で４５分間遠心した。ピペット
で上清を取り出した。固体のＣｓＣＩを２００３秤吊し
て５０ｄのプラスチック製ネジブタ付きチューブに入れ
、このデユープ中に上清２２０ｇをピペットで入れて混
合した。得られた混合物に、５ｍｇ／ｄのエチジウムプ
ロミド（１０ｍＨ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ　８．０．　１ｍＨ
［ＤＴＡ，　１００ｍＨ　ＮａＣｉ！中）を１．Ｏｄ加
えた。この溶液を、５／８　ｉｎＸ３　ｉｎのｐｏｌｙ
ａｌ　ｌｏｍｅｒ遠心管２木に移して密封した。次いで
、これらをＴｉ７０ローター中４４Ｋ　ｒｐｍ　、　１
７℃で４２時間回転させた。プラスミドを集めるために
、これらの管の旧都にメスを突き通し、紫外光下２本の
ケイ光ＤＮＡバンドの下側の方を注０４Ｚで集めた。２
本の管からＷた下側のバンドをネジブタ付ガラス管の中
へ一緒に入れ、等容量の水冷ｎ−ブタノールで四回抽出
することによってエチジウムプロミドを除去した。

抽出された溶液を透析チューブに移し、ＤＮＡ綴！ｌｉ
液を四回交換しながら２４時間この緩衝液に対して透析
した。透析したＤＮＡｒＢ液を１５ｍ１のプラスチック
装ネジブタ付チューブに移した。プラスミドＤＮＡ濃度
は約　＋００ＩＩ！Ｉ／ｍｌであった。

（６）　　プラスミドライブラリーのン肖化：２００４
７！の１０ｍＨ丁ｒｉｓ　　ｐＨ７，５，１０ｍ）ｌ　
　　Ｈｇα２　、１０ｍＨメルカプトエタノール のプラスミドＤＮＡを２０　ｕｎｉｔのＡ　ｃｃ　Ｉ　
ｆａｌ！限エンドヌクレアーぜで消化した。チューブを
１時間３７℃にインキュベートした後、１０分間７２℃
に加熱して消化を停止させた。得られた溶液を等容量の
フェノールとクロロホルムで一回抽出した後、イソプロ
パツールを４００成加えてＤＮＡを沈澱させた。沈澱し
たＤＮＡを遠心して集め、ＤＮＡ緩衝液（ｐＨ９、Ｏ）
　２０ｍに再懸濁させて２５０埒／ｍｅＤＮＡとした。

細菌のアルカリ性ホスファターゼを０．４　ｕｎｉｔ加
え、６８℃で２時間チューブをインキュベートした。８
０ｇのＤＮＡ緩ｉ液と８０成のクロロホルムを加え、得
られた混合物を激しく混合して乳化し、次に遠心によっ
て透明にした。脱リン酸化したＤＮＡをイソプロパツー
ルで再沈殿させ、１００成の反応液中で１２　ｕｎｉｔ
のＡＣＣＩを用いＣ再び消化した。

（７）　　形質転換： ＡｃｃＩで浦化しホスファターゼで処理したプラスミド
ライブラリーを旦　ｃｏｌｉ　ＲＲＩ中に形質転換した
。細胞／　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ１合物を、アンピシリンを１
００埒／ｄ含有するｔ−ａｇａｒプレートに接種し、晩
３７℃にインキュベートした。プレート上で生き残った
コロニーはおよそ６０個であった。これらのうち２８個
のコロニーを、それぞれ、１０ｍｉ！のアンピシリン含
有Ｌ−ｂｒｏｔｈ中に接種してミニカルチャー（小培養
物）を調製し、アンピシリンを含有する１−ａｇａｒプ
レート上に画線してマスターストックを調製した。

（８）　　生き残った個体の解析： ２８個の生き残ったコロニーを１０ｄになるまで増殖さ
せ、これらが担持するプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ
　　ａｎｄ　　Ｄｏｌｙ，　　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａ
ｃｉｄｓ　　　Ｒｃｓ．、　　７１５１３　（１９７９
）の方法を応用した以下のｍｉｎｉｐｒｅｐ精製法によ
って調製した。

ｍｉｎｉｐｒｅｐ法： 各培養物を以下のにうに処理した。すなわち、−晩培養
した細胞１０成を８にｒｐｍで５分間ペレツ１〜化した
。上清を流し出し、（ｑられた細胞ペレットを、１■／
ｄリゾチームを含有する１０戒の２５ｍＨＴｒｉｓ　ｐ
Ｈ　８．０．　１０ｍＨ　［ＤＴ＾，　５０ｍＨグルコ
ース中に再懸濁させた。室温に１０分間装いた後、２０
瀬の０、２Ｈ　ＮａＯｌｌ，　１％ＳＤＳを加え、チュ
ーブを娠揺して細胞を溶解し、次いで氷１に置いた。溶
液が透明になってから３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８
）をＬ５　ｍ加えて振盪した。生じた沈澱を　１５にｒ
ｐｍ　。

４℃ｒｌｏ分間遠心して沈ませた。得られた上清を、イ
ソプロパツールを３ｄ含有する遠心管に流し入れて混合
した。室温で１０分経った後遠心管を１５Ｋｒｐｍで１
０分間遠心して沈澱した核酸をペレット化した。上清を
捨て、ベレットを室温で３０分風乾した。乾燥した後ベ
レッ１〜を５００成のＤＮＡ緩衝液に再懸濁し、Ｅｐｐ
ｃｎｄｏｒｆデユープに移した。この溶液をフェノール
とクロロホルムで一回抽出した後再度イソプロパツール
で沈澱させた。ヂューブをｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で２分
間回転し、上清を捨ててペレットを風乾した。このペレ
ットを、次いで、ＲＮａＳＯを１００１１．’ｌ　／　
ｎｉ含含有るＤＮＡ緩街液１００成に溶解し、１時間３
７℃にインキュベートした。インキュベーション後プラ
スミドｍ１ｎｉｐｒｅｐ　（小調製物）を−２０℃で貯
蔵し、次いでＡＣＣＩとＥ（１０）ＲＩで消化して解析
した。

（９）　　メヂラーゼ遺伝子クローン：解析したプラス
ミドのうちほぼ半分が、Ａ。

ｃａｌｃｏａｃｃｔｉｃｕｓ　Ｄ　Ｎ　Ａのランダムな
Ｅ（１０）ＲＩ断片を担持しておりΔｃｃ■消化に対し
て感受性であることが判明した。これらのプラスミドは
にせものひあるので捨てた。残りのプラスミドは、ＡＣ
ＣＩに対して抵抗性であり、長さが約３．８．２５．２
．４、Ｌ８及ヒ１．２ｋｂの５種類までのＥ（１０）Ｒ
Ｉ断片を担持していることが判明した（第２図）。５種
の断片をずべＣ含有しているプラスミドのひどツｐｓｃ
１６１ＲＨ１−８をさらに解析したところ、ＡｃｃＩ修
飾メチラーゼ遺伝子とＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を両方とも担持していることが判明した。

（１０）制限遺伝子クローン： 形質転換によってプラスミドＤＳＣ１６１１’ｔ）ｌ　
１−８を導入したＥ　、　ｃｏｌｉ　８８２９４株（Ａ
ＴＣＣ３３６２５）から調製した抽出物を検定すること
により、このプラスミドはＡＣＣＩＣＣ上ンドヌクレア
ーゼ遺伝子を担持していることが判明した。

エンドヌクレアーゼアッセイ： エンドヌクレアーゼ活性について検定するために２種の
溶液を調製した。

（１）　　１０ｘ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液：１０
０ｎ）ｌ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，１００＋ｎＨＨ（］
（１０）゜１００ｍＨメルカプトエタノール。

５００ｍＨＮａＣ１！。

（２）消化反応用ｍ　ｉ　ｘ　：　１００１１λ−ＤＮ
Ａ（５００埒／ｍ）　。

１００屑の１０×制限エンドヌクレ アーゼ緩衝液、８００屑蒸溜水 （５０刃／ｄ　ＤＮＡとする）。

以下のようにして細胞抽出物を調製した。培養したクロ
ーン５０ｄをＬ−ｂｒｏｔｈ＋１００　ｎ／　ｔｒｄｌ
アンピシリン中で一晩増殖させ、４Ｋｐｐｍで５分間遠
心して細胞をペレット化した。上清を捨て、ペレットを
３ｄの音波処理用緩衝液（１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，
５１０ｍＨメルカプトエタノール、　０．１ｍＨＥＤＴ
八）中に再懸濁ざぜた。再懸濁後、ＩＯＩＲｇ／ｄリゾ
チームを含有する音波処理用緩衝液を０．３威加えた。

得られた懸濁液を攪拌して渦を作り、１時間氷上に放置
した。サンプル１ｄをＥｐｐｅｎｄｏｒｆチコーブに移
し、１０秒ずつ三回穏やかに音波処理して細胞を破砕し
た。このデユープをｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で５分間回転
し、上清を細胞抽出物として使用した。

この抽出物を検定するために、消化反応用ｍｉｘを５本
のチューブに、最初の１本は１５０成、残りの４本は１
０２．５屑ずつ分注した。最初のチューブに抽出物７．
５庫を入れた。最初のチューブから４７．５１Ｊｉを取
り出して第二のチューブに移して混合した後再び移した
。これを繰り返して、最初のデユープが０ＮＡＩＩＩ！
１当たり抽出物１１１ｉ（ずなわち１パ／ｎ）、第二の
チューブが０．３薦／刀、第三のチューブが０．１薦／
　埒、等とした。こうして各々の内容量を１００ハとし
たチューブを１時間３７℃にインキュベートした後、各
チューブのサンプル２０度をゲル電気泳動によって分析
した。

ｐｓｃ１６１１１Ｈ１−６を担持するＥ、　ｃｏｌｉ　
　８８２９４の抽出物は、１　ｔｎＲに付き約５０　ｕ
ｎ口のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼを含有している
ことが判明した。

（１１）　　ｐｓｃ１６１ＲＨ１−８からの４．２Ｋｂ
　ＣｌａＩ　ｌＩｉ片の単離： 精製した０３Ｃ１６１ＲＨ１−８ＯＮＡ　１５０成（１
５埒）を、５００　ｍの５０ｍＨＴｒｙｓ　　ＩＩ　８
．０　５０ｍＨＨａ（ｊ！、　１０ｍＨＨ＋［２中で３
０　ｕｎｉｔ　（６，りのＣＩａＩ制限酵素を用いて３
７℃で２時間消化した。１０分間７２℃に加熱して消化
を停止させた。得られた溶液を、王ＡＥ緩衝液（４０ｍ
ＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，２，２０ｍＨｌｆｉ　ＲＮ　ａ　
、　１　ｍＨＥＤＴ八）中で調製した、０．０１％ＳＤ
Ｓと０．５埒／戒エチジウムプロミドを含む１％アガロ
ーススラブゲルにＴＡＥ緩衝液中で通して電気泳動させ
た。

Ｕｖ照射下で４．２にｂバンドを切り出した。このゲル
スライスを５成の注射器に入れ、＃２１ゲージ針を通し
て、３ｄのＴＡＥと０．０１％ＳＤＳを含有する５０ｄ
遠心管中に押し出し、細いガラス棒で穏やかに混合した
。この遠心管を１７Ｋｒｐｍで４５分間回転した。上清
を別の５０ｄの遠心管に移し、３００成の５ＨＮａＧと
６−の１００％イソプロパツールを加えた。遠心管を１
時間−７０℃に貯蔵した後、再び１７Ｋｒｐｍで１５分
間遠心した。得られたＤＮＡペレットを４００屑のＤＮ
Ａ緩衝液に懸濁させた。この溶液を、等容８のフェノー
ルとクロロホルムで一回、水で平衡化したエーテルで三
回抽出した。断片をイソプロパツール０．８１ｄで再沈
澱させた後２０１１１のＤＮＡ緩衝液中に再懸濁させた
。この断片の純度と濃度はゲル電気泳動で決定した。

（１２）　　４．２Ｋｂ　ＣｌａＩ断片のｐＵＣ１９へ
の連結：精製した断片０．５埒（７成）を、３０成の連
結用緩衝液（５０ｍＨＴｒｉｓ、　ｐＨ７，５，１０ｍ
ＨＭ（］α　、　　４０ｍＨＤＴＴ、　１ｍＨＡ１’Ｐ
）中で、ＡｃｃＩで開裂して脱リン酸化したｐＵ　Ｃ１
９（ＡＴｃｃ　３７２５４）　１埒（２成）と混合した
。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを１．５成加え、ｊりられた混
合物を４時間１６℃にインキュベートした。連結した混
合物１５ＩＩｉを旦、　四８Ｍ２９４中へ形質転換し、
アンピシリンを含有するＬ−ａ（Ｊａｒプレート上で培
養して形質転換体を回収した。ｍ１ｎｉｐｒｅｐ法（上
記第８項）によって７ｆｆ１１の形質転換体をスクリー
ニングした。これらのうち６個が所望の断片を含有して
いるようにみえた。それらのうちの１個ｐｓｃ１６１Ｒ
Ｈ１２１−２の抽出物をＡＣＣＩエンドヌクレアーゼ活
性について検定した（上記第１０項参照）。

その結果、元のクローンｐｓｃ１６１ＲＨ１−８より約
１０倍の闇、すなわち１威の抽出物当たり５００　ｕｎ
ｉｔのＡｃｃｌエンドヌクレアーぜを合成することが判
った。ｐｓｃ１６１ＲＨ１２１−２を担持しているＥ、
　ｃｏｌｉ　　ＨＨ２９４から全ＤＮＡを精製したとこ
ろ、ＡＣＣＩ消化に対して抵抗性であることが判明した
。これは、このクローンがＡｃｃＩエンドヌクレアーぜ
はもちろんＡＣＣＩメチラーゼを産生ずることを示して
いる。

（１３）　　Ａ　ＣＣＩを過剰生産するプラスミドの構
築（第４図参照）： ２０埒（２００成）のプラスミドルＧ誓１０（Ａ１ＣＣ
４０１６７）を、５００成の６ｎ＋ＨＴｒｉｓ　ｐＨ７
，９，６ｍＨＨＯＧ２，１５０ｍＨＮａＣｆ！中で８０
　ｕｎｉｔの３ａｍＨＩを用い３７℃で１時間消化した
。得られた、温度調節されるλＰＬおよびＰＲプロモー
ターを含有する４、３ｋｂ　３ａｍＨＩ断片をゲル精製
した（上記第１１項）。こうして精製した断片０．３埒
（３成）を、２５成の連結用緩衝液（上記第１２項）中
で、ＢａｍＨＩで開裂し脱リン酸化したＩ）ＳＣ１６１
ＲＨ１２１−２の０６埒（６成）と混合した。１成のＴ
４　ＤＮＡリガーゼを加えて混合物を４時間１６℃にイ
ンキュベートした。連結した混合物１５／７ｊ！をＥ、
　ｃｏｌｉ　８８２９４中に形質転換し、アンピシリン
を含有するｃ−ａｇａｒプレート上で培養することによ
って形質転換体を回収して２４時間３０℃にインキュベ
ートした。２４個の形質転換体を選択して分析した。ま
ず、アンピシリンを含有する２つのＬ−ａｇａｒプレー
トに画線し、一方のプレートを３０℃に、他方を４２℃
にインキュベー１−シて、温度に感受性のものをスクリ
ーニングした。２４個の形質転換体のうち４個は４２℃
で生育するので捨てた。

残る２０個のうら１４個の温度感受性形質転換体をｍ１
ｎｉｐｒｅｐ法（上記第８項）で分析した。これらのう
ちの１２個がＢａｍＨＩ断片を取り込んでおり、そのう
ちの１１個はある配向で（’Ｂ’）、１個はそれとは逆
の配向で（’Ａ’）あることが判明した。所望の断片を
取り込んでいなかった残りの２個のクローンは（舎てた
。

°＾゛−配向クローりｐｓｃ＋６１１１ＨＯ／Ｐ１７と
°Ｂ°−配向クローりρ５Ｃ１６１Ｒ）Ｉ　Ｏ／Ｐ９の
ひとつを、それらが合成するへＣＣＩエンドヌクレアー
ゼの苗を測定するために検定した。各培養物１００ｄを
、アンピシリンを含有するＬ−ｂｒｏｔｈ中３０　’Ｃ
で増殖させた。細胞密度が約３ｘ　１０８／　ｔｔｄ！
　（５９０ｎｍの光学密度−〇、８〜１．０）になった
時点で各培養物の５０ｄを４２℃のインキュベーション
温度に上げた。さらに３時間インキュベーションした後
、３０°Ｃと４２℃の培養物を遠心し、それから細胞抽
出物を調製して検定したく上記第１０項）。゛Ａ−配向
クローンは、４２℃では細胞抽出物１ｄ当たり約３０，
０００　ｕｎｉｔのへ〇Ｃ工エンドヌクレアーゼを合成
するが３０℃では１００　ｕｎ目／ｄ未満であることが
分った。このプラスミドではλＰ１プロモーターは時計
回りの方向で配向していることが判明した（第４図）。

プロモーターが逆の配向になっている°Ｂ゛−配向クロ
ーンは、４２℃と３０℃の両方で抽出物１ｄ当たり約３
０００　ｕｎｉｔのＡＣＣＩエンドヌクレアーゼを合成
することが判明した。Ａｃ１ｎｅ１．ｏｂａｃｔｅｒ　
　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓも、最適の条件下で培養
すると抽出物１ｄ当たり約３０００ｕｎｉｔのＡＣＣＩ
エンドヌクレアーゼを合成する。

１）ＳＣ１６１ＲＨＯ／Ｐ１７を含有する旦　製封８８
２９４は、Ａ、ＣＣＩ制限エンドヌクレアーゼを精製づ
る際の好ましい出発原料とすることができる。この株の
培養物を３０　’Ｃで１ａｔｅ−ｌｏｇ期（対数増殖後
期）（５×１０８コ／ｄ＞まで増殖させた後３時間４２
℃に上げて増殖させてλプロモーターからの転写を誘発
する。その後、遠心して細胞を集め、その直後かまたは
一７０℃に貯蔵後細胞から抽出物を調製する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＡＣＣＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニ
ングして生産する方法の概略を示す。 第２図は、ＡＣＣＩ制限エンドヌクレアーぜ、１３よび
修飾メチラーゼをコードしているΔ　ｃａｌｃｏ−ａｃ
ｅｔｉｃｕｓ　　Ｄ　Ｎ　Ａの１１Ｋｂ　Ｅ　ｃｏＲＩ
　ｖルチフラグメント（大断片）の制限地図であり、こ
の断片は１）ＳＣ１６１ＲＨ１−８を０１作するために
ｐＢＩｔ３２２　（ＡＴＣＣ３７０１７）のＥｃｏＲＩ
部位に連結したものである。 第３図は、△ｃｃＩ制限エ制限エンドヌクレアエピ修飾
メチラーゼをコードしている４ＫｂＣ１ａＩサブフラグ
メント（小断片）の制限地図であり、この断片はｐｓｃ
１６１ｒｔＨ１２１−２を創作するために１）ＳＣ１６
１１ｔＨ１−８カら切り出Ｌ　Ｔ　ＤＵＣ１９（ＡＴＣ
Ｃ３７２５４）のＡＣＣＩ部位に連結したものである。 第４図は、１）ＧＷｌｏ（ＡＴＣＣ４０１６７）由来の
ＢａｌｎＨＩ発現調節断片をｐｓｃ１６１ＲＨ１２１−
２中に挿入することによってＡｃｃＩエンドヌクレアー
ゼ過剰生産性プラスミドｐｓｃ１６１ＲＨＯ／Ｐ９およ
びｐｓｃ１６１ＲＨＯ／Ｐ１７を構築するのに使用した
手順を示す。 第５図は、Ｉ）ＳＣ１６１１１Ｍ　Ｏ／Ｐ１７を担持し
ていて温度誘起されたＥ　、　ｃｏｌｉ　８８２９４　
（ＡＴＣＣ３３６２５＞の粗細胞抽出物中のへ〇〇Ｔ制
限エンドヌクレアーぎ活性を示すアガロースゲルの写真
である。 １（Ｊ−′１１人４１゛埋士　ｆｉＪｉＧ　　　山武

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ａｃｃ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む
   クローニングベクター。
2. （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換された宿主。
3. （３）Ａｃｃ I 遺伝子が、￥Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
   ｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔ−￥￥ｉｃｕｓ￥ＡＴＣＣ５３
   ７０１から切り出されたものである、請求項１に記載の
   クローニングベクター。
4. （４）ＡＣＣ I 修飾遺伝子を含むクローニングベクタ
   ー。
5. （５）請求項４に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換された宿主。
6. （６）（ａ）￥Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏ
   ａｃｅｔｉｃｕｓ￥に由来するＤＮＡからライブラリー
   を形成し、 （ｂ）Ａｃｃ I 修飾遺伝子を含有するクローンを単離
   し、 （ｃ）修飾遺伝子を含有するクローンをスクリーニング
   し、 （ｄ）Ａｃｃ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有
   するクローンを単離する ことからなる、Ａｃｃ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝
   子のクローニング方法。
7. （７）前記ライブラリーを、 （ａ）￥Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅ
   ｔｉｃｕｓ￥ＡＴＣＣ５３７０１に由来するＤＮＡを精
   製するステップ、 （ｂ）精製したＤＮＡを部分消化してＤＮＡ断片を形成
   するステップ、 （ｃ）この断片をクローニングベクターに連結するステ
   ップ、 （ｄ）ステップ（ｃ）のクローニングベクターで宿主細
   胞を形質転換してセルライブラリーを形成するステップ
   、 （ｅ）このセルライブラリーから組換えベクターを精製
   してプラスミドライブラリーを形成するステップ によつて形成する、請求項６に記載の方法。
8. （８）クローニングベクターがｐＢＲ３２２である、請
   求項７に記載の方法。
9. （９）宿主細胞が￥Ｅ．Ｃｏｌｉ￥ＲＲ１株である、請
   求項７に記載の方法。
10. （１０）プラスミドライブラリーをＡｃｃ I で消化し
    て消化プールを形成し、この消化プールを宿主細胞中に
    形質転換し、修飾遺伝子を含有するクローンを選択する
    ことによつて、Ａｃｃ I 修飾遺伝子を含有するクロー
    ンを単離する、請求項７に記載の方法。
11. （１１）（ａ）￥Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃ
    ｏａｃｅｔｉｃｕｓ￥に由来するＤＮＡを精製し、 （ｂ）精製したＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ
    で部分消化してＤＮＡ断片を形成し、 （ｃ）この断片をクローニングベクターに連結してＤＮ
    Ａ混合物を形成し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡ混合物で宿主細胞を形質
    転換してライブラリーを形成し、（ｅ）Ａｃｃ I 修飾
    メチラーゼ遺伝子を含有するクローンを単離し、 （ｆ）Ａｃｃ I 修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクロ
    ーンをスクリーニングし、Ａｃｃ I 制限エンドヌクレ
    アーゼ遺伝子を含有するクローンを単離し、 （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含有する宿主細胞を
    培養し、 （ｈ）この培養物からＡｃｃ I 制限エンドヌクレアー
    ゼを回収する ことからなる、Ａｃｃ I 制限エンドヌクレアーゼの製
    造方法。
12. （１２）クローニングベクターがプラスミドまたはウィ
    ルスのＤＮＡ分子である、請求項１１に記載の方法。
13. （１３）プラスミドがｐＢＲ３２２である、請求項１２
    に記載の方法。