JPS61265094A - 制限および修飾遺伝子のクロ−ニング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は制限酵素および／または修飾酵素を産生するク
ローン、そのようなりローンを製造する方法およびクロ
ーンから制限および／またはイじ飾酵素を製造する方法
に関連する。特に本発明はまり１」ａ　ｅ　ＩＩ　制限
エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼおよびＴａｑ
（制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼのため
のクローンおよびこわらのクローンおよび酵素の製造に
関連する方法に関する。 従来の技術 制限エンドヌクレアーゼは細菌に天然に存在する種類の
酵素である。他の夾雑する細菌利成物から精製された場
合、実験室においてＩ）ＮＡＡ分子正確なフラグメント
への開裂に使用する事ができる。この性質のためＤＮＡ
分子を同定し、その構成遺伝子に分画する事が可能であ
る。制限エンドヌクレアーゼは現代の遺伝子研究におい
て欠くことができない道具である事が明らかとなってい
る。 遺伝子工学および分析の実施の際の生化学的“手術道具
パである。 制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子に沿った特定のヌ
クレオチド配列（″認識配列”）を認識し結合する事に
より作用する。一度結合したらその配列内または１つの
部位を切断する。異った制限エンドヌクレアーゼは異っ
た認識配列に親和性を示す。現在まで調べられた数百の
細菌種から百棟近い異種の制限エンドヌクンアーゼが同
定されている。 細菌は多（でも種当り少数の制限エンドヌクレアーゼし
か持っていない。典型的なエンドヌクＶアーゼはそれが
得られた細菌に従って命名されている。すなわち、例え
ばヘモフィルスアエジブチｆｚ　２　（Ｈａｅｍｏｐｈ
ｉ　ｌｕｓ　ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）はＨ，ａｅｉ。 １−Ｊ　ａ　ｅ　■およびＨａｅｌＪｉと名付けられた
６つの異った制限エンドヌクレアーゼを合成する。これ
らの酵素は各ｋ　（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）　、　Ｐｕ
ＧｅＧＣ’Ｐｙ　　およびＧｑＣＣの配列を認識し切断
する。一方、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｌ）凡Ｙ１３は配列ＧＡＡＴＴＣを認識する唯一の酵素
、ＥＣｏＲ■、を合成する。 自然界において、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の
保護に関して防御的な役割を果たしている。これらは、
さもなければ細菌を破壊またはそれに寄生するウィルス
およびプラスミドのごとき異種Ｄ　Ｎ　Ａ分子による感
染に耐性である事を細菌に可能にさせている。この耐性
は感染１）ＮＡＡ分子長さを走奔し、認識配列が存在す
るたびに切断する事により達成される。引き起こされる
崩解は多くの感染遺伝子を無力化し、他の非特異的エキ
ソヌクレアーゼによる更なる分解に対し１）ＮＡを感受
性にしている。 細菌防御系の第２の成分は修飾メチラーゼである。こｒ
ｌらの酵素は制限エンドヌクレアーゼに対し相補性であ
り、これらが提供する手段により細菌は自株のＤＮＡを
同定する事ができ、異種感染ＤＮＡからそれを区別でき
る。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼ
と同一のヌクレオチド認識配列を認識し結合するが、し
かしＤＮＡを切断するかわりに、配列中の１つまたはほ
かのヌクレオチドにメチル基を付加させる事により化学
的に修飾する。このメチル化以降は、認識配列はもはや
制限エンドヌクレアーゼにより結合または切断されない
。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼによっていつ
も完全に修飾されており、そのため、内生の制限エンド
ヌクレアーゼの存在には先金に非感受性である。非修飾
それゆえ異種と同定できるＤ　’Ｎ　Ａのみが制限エン
ドヌクレアーゼの認識および攻撃に対し１感受性を持つ
。 遺伝子工学技術の出現により、現在遺伝子のクローン化
およびそれがコードしているタンパク質および酵素を通
常の精製技術により得る事ができる量より非電に多量に
産生する事が可能である。 制限エンドヌクレアーゼクローンの卑離θ）かぎは複雑
な°゛ライブラリー′（すなわち゛ショットガン°゛法
により誘導されたクローンの集団）中のそのようなりロ
ーンを同定する簡単で信頼できる方法の開発にある（ｂ
０−’から１０−３の低頻度で存在するう。望ましくは
その方法は、目的とするごく少ないクローンが生き残っ
ている間に不必要な多くのクローンが破壊されるという
ように選択的であるべきである。 何人かの研死者は制限エンドヌクレアーゼクローンの選
択的単離の方法としてバクテリオファージ感染を利用し
た（ワルダー［Ｗａｌｄｅｒ］も、プロシーディング　
オブ　ナショナル　アカデミーオブ　ザ　サイｘンス［
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、］二　１５０
ろ一１５０７ＣＩ９８１）、　　マン［Ｍａｎｎ］ら、
ジーン（Ｇｅｎｅ）３：９７−１１２［１９８１））。 細菌はその中の制限−修飾系の存在のため、バクテリオ
ファージによる感染に抵抗するので、クローン化制限−
修飾遺伝子を運ぶ細胞はファージに暴露されたライブラ
リーからの生き残りとして原則として選択的に単離する
事ができる。しかしながら、この方法は非電に限られた
有用性しか示さない事が観察された。爵に、クローン化
制限−修飾遺伝子は選択的生き残りを与える十分なファ
ージ抵抗性を必す発現するわけではない事がわかった。 発明が解決しようとする問題点 精製制限エンドヌクレアーゼおよび多少とも修（ｊ］） 飾メチラーゼは実験室においてＪ）　Ｎ　Ａの特徴付け
および再配列に有益な道具であるので、これらの酵素を
たくさん合成する細菌株を開発する開業的動機がある。 そのような菌株は商業的に有益な量で産生する方法を提
供するのと同様に精製の仕事を簡単にするので有益であ
ろう。 問題を解決するための手段 本発明に従うと制限酵素および／またはそれらに対応す
る修飾酵素をそれらをコードしているクローニング遺伝
子および高められた水準が期待されるような遺伝子に配
列する事により製造する新規な方法を提供する。特に、
所望の制限酵素をコードしているＩ）　Ｎ　Ａを含有す
るライブラリーを形成し、対応する修飾遺伝子を含有１
−るこれらのクローンを卑離し制限遺伝子の存在のため
に修飾遺伝子を含有するクローンなスクリーニングする
事を特徴とするこれらの酵素のクローニング法、そのよ
うにして製造されたクローンおよびそれ自身により酵素
を産生ずる方法を提供する。 ヘモフイルスアエジプチウス申朋皿臣胆カニ（］２） ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）およびテルマスアクアチヵス（Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）　　各々のｆ（ａ
ｅＪＪおよびＴａｑ）制限および修飾遺伝子への本方法
の応用が、Ｈａｅ［およびＴａｑ■制限および修飾酵素
の精製のための新規で有益な方法に基づいて得られた株
と伴に詳細に記載されている。 第１図はＨａｅ■制限／修飾遺伝子のクローニングのた
めの反応工程図を示している。 第２図は数種のＨａｅ■制限／修飾および）１．ａ　ｅ
　ＩＩ修飾クローンのＨｉｎｄｌｌｌ　　消化物のゲル
の写真の複写を示している。 第６図は本発明に従って製造されたクローンのＨ，ａｅ
ｌ’ＪおよびＨａｅ［制限および修飾遺伝子０）構成を
示している。 第４図はｐｌ−Ｉａ　ｅ　［のＨｉｎｄＩＩＴ　　２重
消化物のゲルの写真の複写とともにプラスミドｐｉ（ａ
　ｅ　ＩＩ　　制御Ｇ　／修飾遺伝子フラグメントの構
成を示している。 第５図ハｌ−１ａｅ　［の過剰発現のための第１の方法
を示している。 第６図はＨ’ａｅ［の過剰発現のための第２の方法（］
３） を示している。 第７図はＨａｅｌ制限および修飾遺伝子のための過少お
よび過剰−産生プラスミドおよび得られた酵素の表を示
している。 本発明は制限および／または修飾遺伝子のクロニングお
よびそれにより産生されるクローンからの酵素を採取す
るための新規な方法を提供する。 本方法は修飾遺伝子に対応する制限遺伝子の認識配列中
の（もしそのような配列がクローン中に存在すれば）そ
れら自身ｆｌ　Ｉ）　Ｎ　Ａをメチル化するであろう修
飾遺伝子をクローンが含有しているという事実を利用す
る。そのようなりローンはそれゆえ対応する制限エンド
ヌクレアーゼによる±ｚど）　ｑ　（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
）での消化に抵抗するであろう。 それゆえこれらのクローンの制限エンドヌクレアーゼ消
化によりメチラーゼ−コード化クローンが選択的に残存
するであろう。さらに、もしメチラーゼをコードしてい
るクローンが対応する制限遺伝子をも含有しておれはそ
のようなりローンはまた制限酵素それ自身を発現し採取
する方法をも提（］４） 供１−ろであろう。 一方学説に束縛されないとすれは、制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子は細菌染色体内で七の対応する修飾メチラー
ゼ遺伝子の近傍に存在し、２っ０）遺伝子はそれゆえク
ローニング央験の間は−Ｒに結合して残っているらしい
事が考えられる。従って、メチラーゼ遺伝子を獲得した
クローンは同時に提供さ才また対応する制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子を獲得すると考えられ、クローニングの
間に受けとるＩ）　Ｎ　Ａθ）フラグメントは虐度に太
きいであろう。 本発明に従うと、制限遺伝子およびそれらに対１；ＩＳ
する修飾遺伝子は多（の細胞のｉ）　Ｎ　Ａにおいて物
理的に接近している。本発明の実施においては、メチラ
ーゼ−含有細胞の選択がメチラーゼおよびエンドヌクレ
アーゼクローンの選択的な同時単離の簡便で信頼性ある
方法として使用できるかが問題である。簡単にいうと、
対応する制限遺伝子をコードするＩ）　Ｎ　Ａフラグメ
ントもまた含有するライブラリーからのメチラーゼ−運
搬クローンの選択は、しばしばメチラーゼおよび同一の
Ｉ）ＮＡ配列に対応する制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の両方を運搬するクローンを単離した結果となる。それ
ゆえメチラーゼ１択は制限エンドヌクレアーゼクローン
の選択の間接的方法である。 制限遺伝子が良好にクローン化され発現される本明細書
に記載された方法は以下の工程からなる：１、　クロー
ン化される細菌種のＩ）　Ｎ　Ａを精製する。 ２、通常の制限エンドヌクレアーゼでＩ）ＮＡを部分的
に消化する。 ろ、得られたフラグメントはｐＨＩ’Ｌ３２２のごとさ
クローニングベクターに連結し、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
）θ）ごとき適当な宿主細胞を形質転換するのにその混
合物を使用する。 ４、　　ＤＮＡ／帷胞混合胞混合物転換細胞に選択的な
抗生物質培地で平面培養する。インキュベーション後、
形質転換細胞コロニーを削り一斉に早−の培養液と１−
る、１次細胞ライブラリー。 ５、全体として１次細胞ライブラリーから組み換えプラ
スミドを精製し１次プラスミドライブラリー（］６） を作製する。 ６、フラスミドライブラリーを対応するメチラーゼ遺伝
子が捜されている制限酵素でインビトロで完全に消化す
る。エキソヌクレアーゼおよび／またはホスファターゼ
もまた消化物に添加し、非−メチラーゼクローンの破壊
を促進する。 Ｚ　消化されたＤＮＡで大腸菌を形質転換し、抗生物質
プＬ／）／＼の平面培養により再び形質転換コロニーを
得る。これらのコロニー（２次細胞個体）のいくつかを
選び取りそのＤＮＡを修飾および／または制限遺伝子の
存在について分析する。 残ったコロニーは一斉に削り２次細胞ライブラリーを作
製しそれらから続いて２次プラスミドライブラリーを調
製する。 ８．２次プラスミドライブラリーは制限エンドヌクレア
ーゼ（エキソヌクレアーゼまたはホスファターゼと一緒
にまたはなしで）で再消化し、選択を繰り返し、３次細
胞個体、６次細胞ライブラリーおよび６次プラスミドラ
イブラリーを回収する。 ９、　制限エンドヌクレアーゼ消化の各々のラウン（］
７） ドで非−メチラーゼクローンの選択的破壊が起き、所望
のメチラーセー運搬コロニーの相対的頻度か増加してい
る。 １０．２次および６次集団中の生き残りコロニーを迅び
とり、メチラーゼ遺伝子の存在を分析する。 もし存在が観察されたら、メチラーゼ遺伝子に結合して
いると推定される制限遺伝子の存在を同時に更に分析す
る。 １１、メチラーゼスクリーニングは４つの簡単な試験に
より実施する： （ａｌ　　クローンの組み換えプラスミド１）ＮＡ分子
を精製し、インビトロで選択した制限エンドヌクレアー
ゼに暴露し、それが消化に耐性である事を確立する。も
しプラスミドベクターがそのエンドヌクレアーゼに対す
るいくつかの部位を持つとすれば、耐性は突然変異によ
る部位欠損というより修飾を示すのであろう。 （ｂｌ　　組み換えプラスミドを供与体側５ＤＮＡの断
片化に最初に用いた酵素で消化する。クローン中に存在
するフラグメントは網羅的であり、メチジ（］８） −ゼ遺伝子をコードするのに十分に犬きく（すなわち、
１キロ塩基対以−ト）および最も重要な点は種々の別個
に生成したクローンに共通である二同−のフラグメント
またはフラグメント類は全てのクローン中に存在するで
あろう。 （ｃｌ　　クローンの全染色体１）　Ｎ　Ａは精製され
選択的制限エンドヌクレアーゼに暴露する。もしクロー
ンがメチラーゼ遺伝子を運んでいるならば、細ｌ染色体
は完全にメチル化されており、プラスミド同様消化に耐
性である事が観察されるであろう。 （ｄｉ　　クローンからの細胞抽出物を調製し、Ｉ７、
旦Ｈａでメチラーゼ活性を検定する。（メチラーゼ保護
および放射性標識。）メチラーゼ活性が観察されるであ
ろう。 １２、制限エンドヌクレアーゼスクリーニングは２つの
方法で実施される： （ａｌ　　クローンからの細胞抽出物を調製し、４ｙｅ
ヒで感受性ＩＪＮＡを消化する能力を検定′１″ろ。 制限エンドヌクレアーゼ活性が観察されるであろう。 （］９） ｆｂｌ　　細胞それ自体で４７　ｅ　１−　ｏにてファ
ージ感染に抵抗する能力を試験する。ファージ感染に対
する耐性は制限−修飾系の存在を示唆している。 上に概説した工程は本発明の実施にあたっての良好な様
式を示したか、上記の方法はこの分野での既知の技術に
従って変更できる事が当事者には明らかであろう。 ＢａｎＩ＋団１ａ［、Ｈｉｎｄｌｌ）、Ｈｉｎｆ）およ
びＩＷｓｐＪ７を制限および修飾遺伝子を含むクローン
もまた本発明に従って製造できる。上記の遺伝子を含む
ＤＮＡ源はバシラス　アイ・ウリノリチカス（Ｂａｃｉ
　ｌ　１ｕｓａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）（Ｂａ
ｎＩ）（応用微生物研究所［Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ
　Ａｐｐｌｉｅｄ　、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。 ＩＡＭ、１０７７、スギサキ（Ｓｕｇｉｓａｋｉ’）、
Ｈｏ、　−ｑｘカワ［Ｍａｅｋａｗａ）、　Ｙ、、カナ
ザワ［Ｋａｎａｚａｗａ：］、Ｓ。 およびタカナミ［Ｔａｋａｎａｍｉ）０Ｍ、　Ｃ１９８
２）　。 ヌクソイツク　アシツズ　リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、：）　１０．５；＃Ｌ７−５７５２
）、ヘモリリチカス菌（）Ｉａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈ
ａｅｍｏｌｙ１口１ｃｕｓ’）（ＨｈａｌＩ）（ＡＴＣ
Ｃ１００１４）、　　インフルエンザ則菌（Ｈａｅｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｕｚａｅ　Ｉ（ｄ）（Ｈｉ
ｎｄｌ’ＪＪ）（ＡＴＣＣろ５９２８）、　　インフル
エンザ旧菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｉｕｅｎ
ｚａｅ　１（Ｉｆ）（ｂ−ＪｉｎｆＪ）（ＡＴＣＣ１７
９４７）およびモラクセラ　スベシエズ（Ｍｏｒａｘｅ
ｌ　ｌａ　５ｐｅｃｉｅｓ）　（Ｍ、ｓｐＩ　）　（Ａ
’ｌｌ’ＣＣ５３０４３）　　である。 上記の一般的方法で場合によってメチラーゼクローンが
全く得られない事が時々ある事に注意されたい。しかし
ながら、一般的にはメチラーゼクローンが得られ、その
中の約半分がまた対応する制限遺伝子を運搬する傾向が
ある事が観察されている。現在、時々の失敗が技術的困
難さからくるのか、または非結合９発現の失敗その他θ
）ごとき基本的な生物学的問題からくるのかは明らかと
なっていない。しかしながら、制限および修飾遺伝子の
クローニングの成功に影響する事が観察された１つの重
要な因子は宿主として使用される大腸ｍの株である。大
腸菌を含め多くの＃ｌ菌が制限−修飾系を持っている。 大腸函において最も一般的な系は宿主特異性決定因子ま
たは“用ｓｄ”“糸であるが、他の糸、特にＰｌおよび
ＥｃｏＲ，−系もまた存在する（ロバーツ（Ｒｏｂｅｒ
ｔｓ）、此、Ｊ、、ヌクレツク　アシツズ　リサーチ［
Ｎｕｃｌ　、Ａｃ１ｄｓ　Ｉ（、ｅｓ、］］１２Ｓ：比
１６７−２０４ｃ１９８４］。これらの系は、形質転換
の間に摂取１）　Ｎ　Ａの破壊を起こし、その結果少数
の形質転換体および非定型のライブラリーが得られるの
でクローニングが妨害される。それゆえ、本発明の実施
には一般的に、突然変異または欠損により制限系が不活
性化されている大腸菌が良好である。これらの系が不活
性化または存在しない良好な株で一般的なりローニング
の目的に使用されるものにはＨＢ　１０１　（ｈｓｄ−
Ｍ−）ＡＴＣＣ５５６９４、Ｉ（ｂ％１（ｈｓｄ比−Ｍ
−）ＡＣＴＴ　　３１ろ４６゜Ｋ８Ｑ　２（ｈｓｄＲ−
Ｍ＋）ＡＴＣＣろろ５２６．］（８０３（ｈｓｄＲ−Ｍ
−）ＡＴＣＣ２７０６５およびＭＭ２９４（ｂ（ｓｄ　
Ｒ−Ｍ十）　ＡＴｅＣろ乙６２５　が挙げられる。 特に大腸函への異種制限および／または修飾遺伝子のク
ローニングに関して、本発明の他の実施態様に従うと、
クローニングの成功を妨害する他の系がある事が観察さ
れている。その系はまくわかつていないが”　ａｇＶ系
と称されている（レーベル［Ｉ（、ｅｖｅｌ）、Ｈ，ｆ
（、、、バクテリオファージ’Ｊ’ａ。 ｐｐ１５６−１６５アメリカン　ソサイティ　オブマイ
クロバイオロジ−（Ａ、ｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔ
ｙ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）ｌ：１９３ろ〕お
よびレーベルら、アニュアル　レビュー　オブ　シェ坏
ティクス［Ａｎｎｕａｌ　１１．ｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ：］　４：１７７−１９２［１９７０：
））。特に、大腸菌Ｈ，ｇ　ｌ糸はメチル化シトシン残
基を持つＩ）　Ｎ　Ａ分子を制限し、単離されるはすの
自己−メチル化プラスミドクローンを破壊する。それゆ
えそのようなメチラーゼ遺伝子ンクローン化するために
は、Ｈｓｄ（一般的）糸およびａｇｌ（％異的）系の両
方が欠損した大腸菌宿主の使用が良好である。しかしな
がら丁べてのクローン化メチラーゼ遺伝子が敏感である
わけではない。 特に、メチル化アデニン残基はメチル化シトシン残基と
対照的に８ｇｌ糸により全く影響されないようである。 一方学説に束縛されないとすれば、ＩＩ、ｇ　ｌ糸ば°
“ｌ（、ｇ　ｌ　Ａ　”および°’１％ｇＮ３°°　と
称される２つの成分からなりたっていると考えられる。 ＲｇｌＢは多（のシトシン−メチラーゼクローンを制限
するように思われ、一方１（、ｇ　ｌ　Ａは現在ただ１
つのクローン（Ｉ−１’ｐ　ａ　■）を制限する事が知
られている。 未確認の制限−修飾系またはシトシンでメチル化される
事が知られている系の制限および／または修飾遺伝子の
クローニングに用いる宿主を選択する場合、６重に突然
変異した大腸菌株が良好である（ｆなわち、ｌ−１，ｓ
ｄ　、　ｌ：（、ｇｌＡおよびＲｇｌＢ糸が欠損したも
の）。そのような株としてばＩぐ８０２がある。一方、
もし修飾系がアテニンーメチラーゼ型系である事が既知
ならば、宿主のｌ−１，ｇ　ｌ活性は無視できる。この
ように、宿主の選択はクローン化する修飾遺伝子の性質
に依存している。当事者はそのような宿主は制限および
／または修飾遺伝子クローニングのための上記の方法に
有益であるのみならず他の既知の方法においても有益で
あろう事を評価するであろう。 このように、本発明の他の実施態様に従うと、Ｒｇｌ−
欠損大腸菌株においてのクローンの構成およびその繁殖
を特徴とするシトシン−型修飾遺伝子および／またはそ
れらの対応する制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロー
ニングの方法が提供される。表１に数々の修飾遺伝子の
クローニングのためのいくつかの大腸菌株の適合性を要
約した。 表■ アブ二ノー　ＥＣ０１（、■ Ｐｓｔ　　■　　　　適　　　　　適　　　　　適Ｓａ
ｌ　　■ Ｔａｇ　■ １；’ｎｕＤ■ ＨａｅＩＴ　　適　　　逸　　　不適 Ｈａｅ　　ｌ（ １（ｇｉＡ■ １−１１１ａ　　■ Ｍｓｐ　　■ Ｎｌａ　　■ 以下の実施例は本発明の実施態様をさらに例示するため
のものであり、現在実施するのに良好である。こ′ｉ″
１らの実施例は例示のためであり、本発明は添付の特許
請求の範囲に示されたほかは、それ蹟制限されると考え
てはならない事を理解されたい。 実　　施　　例 実施例Ｉ Ｈａ　ｅ　■制限−修飾遺伝子のクローニング第１図は
制限遺伝子クローニングのための前記の方法に従った１
、−（ａ　ｅ　ｆＩメチラーゼクローニング工程図を図
示している。 １、　　Ｄ　Ｎ　Ａ　４ｇ　製：ヘモフィルス　アエジ
プチウス（ｉ−１ａｅｍｏｐｂｉｌｕｓ　ａｅｇｙｐｔ
ｉｕｓ）（ＡＴＣｅ　　１１１１６）のＤＮＡを調製す
るには、新しく増殖した細胞ペースＩ・５ｍｇを２Ｑｍ
ｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス、ｐ　ｉ４８．０溶
液に再懸濁する。１０ｍ１の口’）５Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ８，０および６ｍｌの０．２５Ｍトリス溶Ｑ（ｐＨ８
，０）　　に１０ｍｇ　／ｍｌｊ　０）リゾチームラ溶
解した溶液を添加する。懸濁液を氷上に２１埒間放置す
る。その後、２４ｍ１の溶閉混合物（ｂ％トリｌ□　ン
Ｘ−１００，５０ｍＭ　　トリス、ｐｌ１８０．６７ｍ
ＭＥＤＴＡ）およＯ”　５　ｍｌの１０％ＳＤ　Ｓ’；
ｒ　ｉ　／Ｊｔｌ　Ｌ　（Ｍ＝　合して卸１胞を溶角了
する。７０ｍ１Ｏ）新規に平衡化したフェノールを添加
し、溶液ケ振と５（２て乳化する。 ７０ｍ１α）クロロホルムを添加り、倣とうして丙び乳
化する。混合物を１１０１（ｒｌｌ　　で６０分間遠心
分離し、Ｌ）ＮＡを含有する粘稠な上層な倉しい容器に
移し、更に２１斐フエノール／クロロホルノ・テ占抽出
する。上層の４１）　Ｎ　Ａ層を透枦チェーブに移し、
１ｘＤＮＡ緩面液に対し２４時間以上４回溶液な交換し
て透析する。 透析されたＤ　Ｎ　Ａ溶液をビーカーに移し、！／］（
ｂ０の容量の１０　ｍｇ／ｒｎｌ：　ＲＮ　ａｓｅを副
加し最終濃度１００μｇ／ｍｌ　と１−る。この溶液ケ
ろ７°Ｃにて１時間インキュベートしＩ（、ＮＡを消化
する。５Ｍ　ＮａＣｅを添加してＱ、　４　Ｍ最終濃度
となし、０５５容量のインプロパツールを溶液の上に層
積する。ＤＮＡをこの混合物からガラス棒で糸を巻くよ
うにし壬取り出し、１５ｍ１の１ｘｌ）ＮＡ緩衝液に溶
解し、４℃で貯蔵する。 ２、部分消化：以Ｆのごと（精製Ｄ　Ｎ　Ａ　ヲ１−１
ｉ　ｎｄｌｌｌで滴定し部分消化を達成する：１００μ
ｇ　／ｍｌ　のＤ　Ｎ　Ａを溶解した１０ｍＭ１リスＩ
）ｆ−１７，５、１０７７＋ＭＭｇＣ１２，５ＱｍＭ　
ＮａＣ（９，１０７７１Ｍ　　メルカプｌ−エタン−ル
緩衝ｒｊ、２　ｍｌを２００μｅづつ１０に分配する。 第１のチューブに４０牢位のＨｉｎｄｌｌＩ　’ｔ（ｍ
加し、１）ＮＡμｇ拍り２単位とする。第２のチューブ
に２０卑位のＨｉｎｄＪｌ’Ｊ（ｂ卑位／μｇ）　を添
加し、以下各々の続いてのチューブが前の量の半分の１
−１ｉｎｄｌＪ７を受けとるようにする。チューブを５
７℃にて１時間インキュベー１・し、続いて７２℃で１
５分間熱処理し、各々から１０μβ取り、アガロースゲ
ル市、気泳動により分析する。中程度で不完全な消化ヲ
示スチューブをクローニングのための部分消化フラグメ
ント源として選択する。（これらは０．１６率位／μｇ
および０．０６率位／μｇチューブであった。２つの溶
液を一緒に混合し、以下に記載するごと（使用した。う ６、結合：フラダメント化ＤＮＡをｐＢＢ３２２に以下
θ）ごとくして結合した：４，０μｇのＨｉｎｄｌ’［
部分ン肖化ヘモフィルス　アエジフ゛チウスＤＮＡ（４
，０μｅ）を２．０　ｔｔｇの山ｎ　ｄ　ｌｌｌ−切断
、脱りｙｍ化ｐ　Ｂ　Ｈ。 ろ２２（ｂ０／ｌｅ）ト混合する。１０　μ、（ｂ！　
）１０　Ｘ　ｆＡ　全混合’ＩＩ（５００ｍｌ’Ｊ　　
トリス、　　ｐｌ−１７，５、１００ｍＭＭｇ’−’６
２゜１００ｍＭＩ）ＴＴ、５ｍＭ　ＡＴＩ））を加え、
更に４０μｅの無賄蒸留水で最終容量を１００　ｔｔｅ
となす。５μｅのＴｄＤＮＡリガーゼを添加し、混合物
は１６°Ｃにて４時間インキュベー１・する。１０μｅ
の容量（て１０に分け、以下のごとく大腸菌株ｌ（・Ｒ
１を形質転換する為に使用する＝１０μａ各々を氷上で
１０Ｔｏ１６の８ＳＣ／ＣａＣ，ｉｈ　（５０ｍＭＮａ
Ｃｅ、　５ｒｎＩＸＡ　クエン酸３ナトリウム、６７ｍ
ＭＣａＣｅ２）と混合し、２００　ｔｉ、ｅの大腸閉比
凡１細胞氷冷組成物を添加１−る。４ろ℃で２分間熱衝
撃した後、細胞を５ｍｔ′のルリアーブｏ　ス（Ｌｕｒ
ｉａ−ｂｒｏｔｈ）　（Ｌ−グロス）に希釈し、飽和す
るまで６７℃で増殖せしめる。 ４、第１次細胞ライブラリー二形員転換した細胞培養液
を遠心分離し、２５０μｌ容量に再懸濁し、１００μｇ
／ｍｌ：　のアムピシリン含有ルリアー球天（Ｔ、　−
９ｐ天）プンート上で平面培養する。−夜、６７℃でイ
ンキュベート後、ブＶ−ｂ馨２．５ｍｌの１０ｙｒ＋Ｍ
トリス、　ｐｌ−１７，５、１０ｍＭ〜ｔｇｃｅ２−’
Ｑ満チｆｙ−＞ぶれさせ、形質転換したコロニーを一緒
に削り、第１次細胞ライブラリーと１−る。 ５、第１次プラスミドライブラリー二第１次プラスミド
ライブラリーは以下のごと（調製する：２、５　ｍｌの
第１次細胞ライブラリーを１００μｇ／ｍ１４アムビシ
リンを含有する５ＱＱｍ／’のＬ−ブロスに接＠する。 培養液は３７℃にて一夜振とうした後４ｉ〈−ｒｐｍで
５分間遠心分離する。上澄み液を捨て、細胞ペレットを
１０ｍ１の２５％シヨ糖、　５０ｍＭ−トリス、　ｐ　
Ｉ−１，８，ＯＫ室温で再懸／＠する。５ｍｇのＬｌ、
２５Ｍ１−２　Ｄ　’ｌ”　Ａ　、　ｐ　Ｈ８，０を添
加し、続いて５　ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ：リゾチームを
含む０．２５Ｍトリス、　ｐｉ−（８，０を添加する４
つ溶液は氷−ヒに１時間放置した後、１２ｍ１０′）浴
酌混合物（ｂ％トリトシＸ−１００．５０７７１Ｍ　　
）リス。 ｐＨ８，０、６７ｍＭ　ｋｌ）’ｉ’Ａ）　　を激しく
ピペットで加え、細胞懸濁液は緩かに渦を巻かせ溶閉な
完成させる。 浴閑後、混合物を５０ｍ１のプラスチック遠心チュ一ブ
に移し、４℃にて４５分間ｉ　７　［ｒｐＨで回転させ
る。上澄みａをピペットで除去する。２０．０　ｇｍの
固体ｅｓｃｅを測って５ｔＪＪｍｌプラスチックねじふ
た例チューブに入れ、２２．０ｇｍθ）上げみ斂をピペ
ットでとりチューブに加え混合する。１．　Ｏｍｅのエ
チジウムプロミドｄ液（５ｍｇ／ｍｚ　　エチジウムプ
ロミドを含む１０ｍＭ）リス＋　ｐＨ８，０、１１１＋
ＭｋＤ　’Ｉ’　Ａ　。 １００ｍＭ、ＮａＣｅ）　　を混合物に添加する。溶液
を２つの５７３　ｉｎ、Ｘ　３　ｉｎ、のポリアロマ−
遠心チューブに移し、封をする。これらはＴｉ７Ｑロ一
ター中１７℃にて５０　Ｋｒｐｍで４２時間回転させる
。プラスミドを集めるには、チューブの先端を外科用メ
スで刺し通し、紫外光子下側の２つの螢光性ＤＮＡバン
ドをシリンジで集める。両方のチューブからの下側のバ
ンドをねじ山付ガラスチューブ内で混合し、等容量の氷
冷ｎ−ブタノールで４回抽出してエチジウムプロミドを
除去する。 抽出済の溶液を透析用チューブに移し、４回父換する１
ｘＤＮＡ緩衝液に対し−Ｃ２４時間透析する。 透析したＩ）　Ｎ　Ａ溶液を前もつ又秤量しである５Ｑ
ｍｇ無菌遠ノし・チューブに移しその容量を測定１−る
。最終濃度がＱ、　、ｉ　Ｍになるように５Ｍ、Ｎａｅ
ｌを添加し、その後２容量のインプロパツールを添加し
混合する。溶液は−２０“Ｃにて一夜貯蔵して１）　Ｎ
　Ａを沈殿せしめる。沈殿生成後、＃液を０℃にて１５
　Ｋｒ１ｍで１５分間遠心分離し、上澄み液を捨てる。 チューブを台θ）上に置き１５分間風乾した後７５０μ
ｌの無菌蒸留水を加える。ペレットが浴解したら、８μ
での１００×１）ＮＡ　緩衝液を添加し、浴液はエツヘ
ンド／ｌ／７　（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに移し
一２０℃で保存する。この方法で調製したプラスミドの
ｏ　Ｎ　Ａ濃度は約ｉｏｏから２ＣＪＯμｇ／ｍｌ　　
である事が観察された。 ６、　プラスミドプールの消化二り、下のごとくして第
１次プラスミドプールを消化し非−１−（ａｅｌ［メチ
ラーゼクローンを破壊した：１０ｙｒ＋Ｍトリス、ｐＨ
７、５，１０ｍＭＭｇｃ１２．１０ｍＭメルカプトエタ
ン−／’　＋　５０ｍＭＮａｅｅ　　でプラスミド１３
　Ｎ　Ａを希釈し、５０μｇ／ｍｌ：とする。全体で５
００μｌを調製し１００μＡｆつ５つのチューブに分注
する。第１のチュ一ブに７５単位のｌ」ａｅＪＩを添加
し、１５牢位／μｇ１）　ＮＡとする。６８卑位０）Ｈ
ａｅｆＪを第２０）チコーーブに添加し、以下各々のチ
ューブか前の市の半分を受けとるようにする。チコーー
ブを６７℃にて１時間インキュベートする。 ７、　形質転換：前に記載した方法により、各々のチュ
ーブからの１０μｅの試料を太ｌ１ｉＡ閑ＲＪ（ｌの形
質転換に使用する。細菌／Ｉ）ＮＡ混合物は、中間θ）
希釈および増殖をはぷい℃熱処理工程直後に１００μｇ
／ｍｌ　アムビシリン含有し一寒天フ“Ｖ−１・上で培
養する。ろ７’Ｃで一夜インキュベーンヨン後、プレー
トを試験する。トＩａ　ｅ　ＩＩによるプラスミドの消
化により約１００分の１に形質転換体の数（すなわち、
無傷のプラスミドの数）が減少した。後の実験において
は、上記（６節）の消化チューブ゛の各々に２．５率位
のエキソヌクレアーゼＩＩＩ　にューイングランド　ノ
くイオン水　インコーポレーショｙ　［Ｎｅｗ　ＦＪｎ
ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、）　　−ｆた
Ｂｌ（、Ｌおよびｌ　Ｂ　Ｉから入手可能）またはラム
ダエキンヌクレアーゼン添加すると非−メチラーセクロ
ーンの破壊を促進し、形質転換体の数が約１０３から１
０４分の１に減少した。最も大きな減少をこうむったプ
レート上に（ｂ５率位１＝ＩａｅｌＩ／μｇおよびＺ５
率位ＨａｅｆＩ／μｇ、エキソヌクレアーゼ不在または
存在下）生き残ったコロニーの中から約３０の別個のコ
ロニーを取り出す。各々コロニーをアムビシリン含有Ｉ
Ｊ−グロス１０ｍ１中に接種し、ミニ培養液を調製し、
それをアムビシリン含有１」−寒天プレート上にすしを
っけて接種しマスターとなる貯蔵物を調製する。 ８、第２次果団：残ったコロニーを削り一緒にして第２
次細胞ライブラリーを形成せしめる。これは第１次プラ
スミドライブラリーの調製で記載したものと同じ方法に
より第２のプラスミドライブラリーの調製に使用する。 ９、　第２次プラスミドライブラリーの分析：第２次Ｈ
，ａ　ｅ　ＪＪライブラリーは本特定の実験においては
更に使用されていない。しかしながら一般的法則として
消化およびゲル電気泳動による第２次プラスミドライブ
ラリーの分析は役に立つものである。　　　′そのよう
な分析は有意の比率の集団が一般的なフラグメントを運
搬しているが否かだよび制限エンドヌクレアーゼ消化に
耐性を示すが否かの決定に有益でありうる。 １０、第２次個体の分析：第２次細胞個体中の約釦の生
き残ったコロニーをＩＱｍｌ培養液中で増殖せしめ（７
宜百）それらが運ぷプラスミドはバーンポイン（Ｂｉ　
ｒｎｂｏｉｎ）およびドリー（ＪＪｏｌｙ）　　（ヌク
レイツクアシツズリサーチ（Ｎｎｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ
ｓＲ，ｅｓｅａｒｃｈ）　　７：１５１ろ［１９７９：
］　Ｃによる方法を修正した以下の少量調製梢製法によ
り調製した。 少量調製法：各々の培養液を以下のごとく処理した＝１
０ｍｌの一夜培養液を８Ｋｒｐｍ　、　５分間でぺＶッ
ト化した。上澄み液を捨て、細胞ペレットを１ｍｇ／ｒ
ｎｌのリゾチームを含有する１、Ｑ　ｍｌ：の２５ｍＭ
トリス、　ｉ　Ｑ　ｍＭ　Ｅｌ）ＴＡ　、　５　Ｑ　ｍ
Ｍ　　グルコース。 ｐＨ８，０に再懸濁する。室温に１０分分間−た後、２
、０　ｍ、Ｉ４のＱ２ＭＮａＵ［（，１％５１）Ｓを添
加し、チューブを振と５して細胞を溶解し、その後氷上
に置く。ｄ液が透明化したら１．５　ｍｌ：の５Ｍ酢酸
ナトリラム、　ｐｌ−１４，８を添加し、振と５する。 生成した沈殿？４℃にて１５ＫｒｐＩｌｌで１０分間回
転せしめて沈ませる。上澄み液を６ｍｌのインプロパツ
ールを含む遠心チューブに注ぎ混合する。室温で約１０
分後、チューブを１５ＫｒｌＴＩＮで１００間遠心し沈
殿核酸をぺＶット化する。上澄み液を莱でペレットを室
温にて６０分風乾する。乾燥したらペレットを８５０／
１．ｇの１０ｍＭトリス、　１ｍ１ｌＤＴＡ、　ｐｉ−
］ａＯ［再懸濁する。７５μｌの５１ＶＩＮａＣｅ　　
を添加し、溶液を５７５μｌθ）イソプロパツールを含
ムエッペントルフチューブに移し、室温で１０分間再び
沈殿せしめる。チューブをミクロ遠心機で４５秒回転せ
しめ、上澄み液を捨てペレットを風乾する。ぺＶットを
１００μｇ／ｍ／Ｉ！Ｒ，Ｎａ５ｅを含有する５０μｅ
の１０ｙｒ＋Ｍトリス、１ｒｎＭＥＤＴＡ、ｐＨ，８，
０に溶解し、３７℃にて１時間インキュベートしてａＮ
Ａを消化する。５０μ、６の５Ｍ、Ｎａｅ、ｄ続いてろ
５ＣＪｔｔｌＪｏ）イソプロパツールの添加によりＤＮ
Ａをもう１度沈殿せしめる。室温で１０分後Ｄ　Ｎ　Ａ
を４５秒の遠心により沈め、上澄み液を捨てペレットを
１０ｍＭ）リス、ｉ７ｉＭＩ℃Ｊ）ＴＡ　、　ｐＨ，８
，０で再溶解して最終的に１５０μｅの溶液となす。少
量調製プラスミドは続いてＨｉｎｄｌｌ’Ｊ　　および
Ｈａｅ［による消化により分析する。 １１、メチラーゼ遺伝子クローン：分析された多くのプ
ラスミドが無作為なヘモフィラスＤＮＡのＨｉｎｄ■　
　フラグメントを運びＨａｅ［による消化に感受性があ
る事が観察された。これらのプラスミドは見せかけの生
き残りものであり更なる興味はない。（後の実験におい
て１３ａｅ打消化−選択段階においてエキソヌクレアー
ゼを使用すればこれらの存在は顕著に減少する事が観察
された。）しかしながら、残りのプラスミドはＨａｅ［
耐性であり、約３．　Ｉ　Ｋｂおよび２，９　Ｋｂの長
さの少なくとも２つのＨｉｎｄｌＩＩ　　フラグメント
を運ぶ事が見い出された。 これらのプラスミドは後にＨａｅ［修飾メチラーゼおよ
び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両方を運ぶ事が示さ
れた。 平行に進行させた実験において、Ｈａｅ［メチラーゼ遺
伝子を運ぶクローンもまた選択され単離さく３８） れた（図１）。これらのクローンは約４，３　Ｋｂの１
−１ｉｎｄｌｆｆ　　フラグメントを運ぶ事が見い出さ
れている。Ｉ−（ａｅｌｌＴおよび［−１’ａ　ｅ　Ｉ
Ｉメチラーゼ遺伝子の両方を運ぶいくつかのクローンが
単離されており、これらは４．８Ｋｂフラグメントおよ
び２つの３．１　Ｋ、ｂおよび２，９Ｋｂフラグメント
を運んでいる事が観察されている。これら後者のクロー
ンの単離は、ト１゜アエジプチクスにおいてはＨａ　ｅ
　■制限および修飾遺伝子が少なくともＩ−１ａ　ｅ　
ＩＩＩメチラーゼ遺伝子と結合している事を示唆する。 ｌ−１ａ　ｅ　ＩＩＩ制限遺伝子のみを運ぶクローンは
単離されない。図２はいくつかのＨａｅ［制限／修飾お
よびｌ−１ａｅｌｌＪ修飾クローンのＨｉ　ｎ　ｄ　ｌ
’ｌ　　−消化物のゲルの写真の複写である。図６はこ
の事および類似の分析から推論されるいくつかの組成を
まとめである。 少なくともろ、１Ｋｂおよび２，９Ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩ
Ｔ　　７　ラ！メント（）ＩａｅｌＪ４７ｙ＋−１＋　
４−ａ、　’１９．４　１０　＋　４５　＋ａ−１１．
ａ−ｓその他ンを運ぶクローンは（ａ）　ｌ−１，ａ　
ｅ　ＩＩ制限エンドヌクＶアーゼによる消化への耐性お
よび（ｂ）　ｊ−１ａ　ｅ　ＩＩ修飾メチラーゼ活性の
４ｙｅ上ヱ検定に基つくと１−１　ａ　ｅ　（Ｊメチラ
ーゼ遺伝子を運んでいると判断された。メチラーゼ検定
は以下のごとくして実施される： メチラーゼ恢定：メチル化の検定には３つの溶液を調製
する： １０×メチル化緩衝液：０．５Ｍ＋−リス、ｐＨ７、５
、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５０　ｍＭメルカプトエ
タノール。 メチル化反応混合物＝１つのクローンの分析のたびに新
しく調製された＝１００μｅ　ラムダＩ）ＮＡ（５００
μｇ／ｍ／’）、１００μ、ｇ１０ｘメチル化緩衝液。 １μｅの１００ｙ＋＋ＭＳ−アデノシルメチオニン。 ８００μｅ蒸留水。 ２　Ｘ　ｌ−４ａｅ　（ｌ変換緩衝液：　５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１、４０７）＋ＭＭｇＣ，ｌ、　、　ｉ　５ｍＭメ
ルカプトエタノール。 細胞抽出物は以下のごと（調製された：試験するクロー
ンの１００１１１１１１！培養液を１００μｇ／ｍｌ　
　アムビシリン含有し一グロス中で一夜６７°Ｃで増殖
せしめ、細胞を４Ｋｒｐｍで５分間遠心分離してペレッ
ト化する。上澄み液は捨て、ペレットを５ｍｌの超音波
処理緩衝液（ｂ０ｍＭ）リス、　ｐＨ７，５、１０ｍＭ
　メルカプトエタノール、１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁す
る。再懸濁後１０ｍｇ／ｍ１４のリゾチームを含む０．
５Ｉｎｌの超音波処理緩衝液を添加′１−る。懸濁液に
渦を巻かせ、１時間氷上に放置する。１　ｍｌの試料を
エツペンドルフチューブに移し、２回（７”’＋　１０
秒照射で緩かに超音波処理して細胞を破壊する。チュー
ブはミクロ遠心機中で６０秒回転せしめ、上澄み液を細
胞抽出物として使用する。 抽１ｆｔ？／Ｉを検定するには、メチル化反応混合物を
５つのチューブに分注する、第１のチューブに１５０μ
１１残りの４つのチューブには各々１０２．５μｅ　Ｑ
７．５μｅの細胞抽出物を第１０）チューブに加え、混
合し、４７．５μｌを取り次のチューブに加え混合し、
以下同様にする。従って第１のチューブはＤＮＡμｇ当
り１μｌの細胞抽出物を受けており、第２のチューブは
０．６μｌ／μｇ、第６のチューブは０１μｅ／μｇ、
以下同様である。この時点で１００層を含む各々のチュ
ーブを５７℃にて１時間インキュベートし、その後７２
℃で１０分間加熱し反応（４］） を停止する。各々のチューブに１００μｅの２×変換緩
衝液および２５卑位のＨａｅ■制限酵累を酵素する。溶
液を再びろ７°Ｃにて１時間インキュベートした後者々
２０μｌの試料をゲル電気泳動により分析１−る。クロ
ーンは湿潤細胞ペーストグラム当り約５０００年位のＬ
（ａｅ［メチラーゼを合成する事が観察さｒ

【た。 １２、制限退伝子クローン：Ｈａｅ［修飾メチラーゼ遺
伝子を運んでいると前に同定されたクローンは（ｂ１節
）同様にＨａｅｌ■制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を運
んでいる事が見い出された。この事は、以下のごとく実
施された４ｙｅ上二での制限エンドヌクレアーゼ検定（
より確立された：エンドヌクレアーゼ検定：エンドヌク
Ｖアーゼ検定に２つの溶液を調製した二 １０ＸＨａｅ［制限エンドヌクレアーゼ緩衝液：１００
ｍＭ　トリス、’ｐＨ７，５、１００ｍＭＭｇＣ４，１
００ｍ”メルカプトエタノール＋　５００　ｍＭ　Ｎ　
ａ　Ｕｌ　。 消化反応混合物：１クローンの分析のたびに新しく調製
された：１００μｌ　ラムダＤＮＡ　（５００μｇ／ｍ
ｌ）　、　’Ｉ　ＯＯＡ、ｅ　のＩ　Ｑ　ｘ　１−１ａ
　ｅ　ｉＩ　１ｆｌｌ　ＩＩ上エンドクレアーゼ緩衝液
、８００μｅ蒸留水。 細胞抽出液は前ｄ己メチル化検定の方法で調製された（
ｂ１節）。抽出液を検定するには、消化反応混合物を６
つのチューブに分注し、第１のチューブに１５０μｅや
残った５つのチューブには谷々１０２５μｌとする。７
．５　ｔｔ、ｅの抽出液を第１のチューブに徐加、混合
し、７１７５μｌを取り次Ｑ）チューブに添加混合し以
下同様に行う。従って第１のチューブはＪ）Ｎｋｔｔｇ
　当り１μｅの抽出液を受けとり、第２のチューブはＯ
ｌろμｌ／μｇ、第ろのチューブは０．１μｌ／μｇ以
下同様。この時点で各々１００μｅケ含むチューブを６
７℃にて１１時間インキュベートし、各々２０μｅの試
料をゲル電気泳動により分析′１−る。 クローンは湿潤細胞ペーストのダラム当り約５０００率
位のＨａｅＪＪ制御羽エンドヌクレアーゼを合成する事
が観察された。 ファージによる試験においては、クローンはほんの少し
の程度ファージ感染に抵抗する事か観察されたニラムダ
ファージのブレーティング効率は０１およびＵ５の間で
ある事が観察された。 （クローンｌ１ｍ　−Ｉ　Ｃ第２およびろ図〕は例外で
あった。４ｍ−１ノ＼θ）ラムダファージのブＶティ／
グ効率は１０−４以下であった。） 実施例１１ （−１ａ　ｅ　ＩＩ制限および修飾遺伝子の過剰発現１
、実施例１で゛得られたｐｉ−ＪａｅｌＴ　４−１１　
（第３および４図）と称さねろ１つのクローンレ土、最
も単純な構造を持っているため、更なる分析および過剰
発現に使用した。第４図はこのクローンに挿入された２
つのｆ−（ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　フラグメントの単純化
した制限地図を示している。地図は常法θ）２重消化法
により確立された。 ２．２つの異った方法か過剰発現を達成するために考案
された（第５および６図）。画法とも強力なプロモータ
ーを含む調節要素−＼ＨｉｎｄＩＩＩ　　フラグメント
を結合せしめており、それによりプロモーターが脱抑制
された場合、制限および修飾遺伝子の転写が異常な高速
度で起こるであろう。そのような過剰発現系は以前に記
載されている。 ６、第１の方法においては、ｆ（ｉｎｄｉＪｉ　フラグ
メントを小さな末端ｐ　１３　Ｒ５２２１）ＮＡと一緒
に１つのセグメントとして切り取る為に４−１１プラス
ミドなＨａ　ｅ　ＩＩＩで切断する。ベクターｐＧＷ７
（ＡＴｅＣａｏ１６６　、ニューイングランドバイオラ
ボかラモ入手可能）をＢａ　ｍ　Ｈ■　　で消化し、Ｈ
ａｍＨＪ　付着末端をＩ）　Ｎ　Ａポリメラーゼで満た
す。１７＋　ａ　ｅ　■プラスミドには１２５μＩのプ
ラスミドＤＮＡを８０率位のＨ，ａｅｌ１７制限エンド
ヌクレアーゼと１０ｍＭ）リス。 ｐｆ（７，５、１０ｍＭＭｇＣ４、１０ｍＭ　　メルカ
プトエタン”　＋　５０　ｍＭ　ＮａＣｅ　　中で混合
し最終容量”ｔ　５００μｅ　とする。ｐＧＷ７プラス
ミドのためには同じ緩衝液中８０率位のＪ３ａｍｉ（■
　制限エンドヌクレアーゼと混合するが容量は２５０μ
ｌとする。２つの消化物を３７℃にて１時間インキュベ
ートした後７２℃で１０分間加熱して終了せしめる。Ｅ
ａｍＨｉ消化物は続いて以下のごと（して充填する＝１
００７Ｊ　＜７）消化ＷＫ　’＞０ｔｔｌｌ　ノ５ｘｄ
ＮＴＰ貯蔵＃液（２５ｍＭｄｃ’ｌ甲、２５ｍＭｄＣ３
ＴＰ、２５ｍＭｄＴＴ）’）、　５ｔｔ、ｅの１０×ポ
リメラーゼ緩衝液（ｂ００ｍＭ　　トリス＋ｐＨ７，ｂ
。 １００ｍＭＭｇ（：４．１０ｍＭＩ）ＴＴ　、５００７
ｎＭＮａＣ鷹）、７５μｅの蒸留水およびＺ５μｌのＩ
）　Ｎ　Ａポリメラーゼクレノーフラグメントな添加す
る。反応混合物を２０゛Ｃにて１５分間インキュベート
する。４５μβを取り６５μの４−１１プラスミド消化
液、１０μｅの１０×結合混合物（実施例■の５節に記
載）および５μｅのＴ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼと混合する
。結合反応では２０°Ｃにて３時間インキュベートシた
。１０μｌ童の結合反応液で大腸菌１（４梠を形質転換
せしめ、アムビシリン含有り一寒天プレートに接種する
。 プレートをろ０℃にて一夜インキュベートーｆる：全体
の結合反りで約２５０コロニー／プレートで８つのプレ
ートを得た（すなわち全部で約２０００の組み換え体）
。プレートを削り取り、第１次プラスミドライブラリー
の調製のために記載した方法（実施例■の４および５節
）によりプラスミドのライブラリーヲ調製する。ライブ
ラリーをＨａ　ｅ　ＩＩ制御恨エンドヌクンアーゼで゛
消化し、ＨａｅｌＩ修飾遺伝子な運んでいない組み換え
体プラスミドを選択的に破壊する。（各々の消化液に偽
θ）生き残りによるバックグランドを減少せしめるため
に２５牢位のエキソヌクレアーゼ川を附加Ｊ゛−る）。 大腸閉Ｉ（・ａｌ−＼の形質転換に続いて、アムビシリ
ン含有１−・−基天へ播紳し、ろＯ″Ｃでインキュヘ−
１−Ｌ、生き残ったコロニーを取り出しそれらか運んで
いるプラスミドを少量調製法（実施例Ｉθ）１０頗）に
より梢製し、消化およびゲル電気に動により分析する。 第５図は完全な実験工程図およびいくつかθ）生り残り
物の消化物のゲル分析の結果ケ示しである。 この方法にまり単離されたｐｌ−１ａｅＩＩ　７−１１
　　と称さね、るクローンの１つは円ノプロモーターに
関して１つの方位（ｂコ）にＩ−１ａ　ｃ　ＩＩ遺伝子
を運んでいる牛カｒ３１祭さ才また。いくつかの他のク
ローン（、’ｃＦ＞代表はｐＨａｅ７−６Ｘ）は遺伝子
を他の方位（Ａ）に運んでいろ。０９０−ノ７−１１お
よび７−６Ｘはどちらも、温度により誘発される夕１都
のＰＬ　プロモーターか抑制された場合、エンドヌクレ
アーゼおよびメチラーゼか過剰発現１−るかどうかを決
定１−る検定を行った。ｄ発失験は以下の方法で実施し
た：１００μｇ／ｍｌアムビシリン含有Ｌ−グロス中１
０劇のり゛ローンの培養液留３０℃にて一夜増殖せしめ
る。次の初釜々の培養Ｗ’ｘ　５００　ｍｌの新鮮なし
一グロス中へ５０倍に希釈し、振と５しなからろＯ′Ｃ
にてインキユヘートする。約６時間のインキュベーショ
ン後者々の培養液の２０１１１ｍＪを取り、その５９０
ｎｍ（ｏＤ５，０）での光学密度を測定する。引き出し
た細胞を１０ＫｆｐＨｌで１５分間遠心分離して集める
。各々の培養液の残りは温度を４ろ°Ｃに移してＰ　Ｌ
プロモーターを脱抑制する。この温度でろ時間激しく振
と５した後者々の培養液の０Ｄ５ｏｏを再び測定し、各
々の培養液の２００ｍｌ：を再び遠心分離により集める
。細胞ペレットは検定に都合がよくなるまで一２０℃に
て保存する。 メチラーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性の検定のため
にはペレットを融解し１ｍ、９／ｍ１ｌＪゾチーム含有
の十分な超音波処理緩衝液に再懸濁すると、算出される
ｏＤ、、。は５０に達する。細胞懸濁／ＶＬを１時間氷
上に放置した後、削［記載したごと（（実施例の１１お
よび１２節）超音波処理し検定する。 クローンｐｌ−（ａｅ　７−１１　は培養液を高温度［
移行した場合＋−１ａｅｆＴ制限エンドヌクレアーゼお
よび１−１　ａ　ｅ　ＩＴ修飾メチラーゼの両方を過剰
産生する事が観察さ才した。７−１１クローンにより湿
潤細胞ペーストグラム当り１０６　単位までのエンドヌ
クレアゼおよび３Ｘ１０’　単位θ）メチラーゼが派生
された。 逆に、ｐｉ−ｆａｅ７−６ＸはＰＬプロモーターが脱抑
制された場合、両方の酵素を僅少産生する手が覗祭され
た。このプラスミドにおいて２つの遺伝子はＰｌ、、を
逆の方位で運んでいる事に僅少産生は一致する。 ｐＨａｅ　７−１１　は新規で有益なりローンでありそ
れからＨ，ａ　ｅ　ｌ’Ｊ制限エンドヌクレアーゼおよ
び修飾メチラーゼ酵素を多量に精製できる。 ４、　１−Ｊａｅｌｌ遺伝子を過剰発現プロモーター、
ＰＬに結合する第２の実験法が考案され果ｙｉ！！され
た。 この方法は削節に記載した方法より部平でより信頼でき
るが、ただ１つの方位でのクローンを得る。 上で判明したごとく、得られる方位】３が望まれるもの
である。方法を第６図に略述した。それはｐＧＷ１０発
現ベクター（ＡＴＣＣ，１１１０１６７、またニューイ
ングランドバイオラボより入手可能）を使用し、所望の
クローンはテトラサイタリン含有し一寒天プンート上で
直接選択する事により単離される。こθ）方法はい（つ
かの過剰発現プラスミドを発生せしめるか、その１つは
ｐＨ，ａｃｌＩ　１０−３　　である。温度誘発後、ク
ローン１０−６は７−１１同様に娠舞いクローン７−１
１と同じ水準力メチラーゼおよびエンドヌクレアーゼを
両方とも過剰発現する。 第７図は上記の僅少−および過剰産生プラスミドの構造
′（！１″要約し、酵素収率な表にしである。 実施例ＩＩＩ Ｔａｑ■制限−修飾遺伝子のクローニング１、　　Ｄ　
Ｎ　Ａ精製：テルマスアクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　
Ａｑｕａｔｉｃｕｓ）　ＹＴ　１　（Ａ（：ＴＴ２５１
０４）Ｑ）、Ｉ）ＮＡを調製するには、新しく増殖した
細胞ペースト５ｍｇ’ｔ２０ｒｎ１．の２５％シヨ糖、
　５０７７１Ｍトリス、ｐｉ−１：８．０溶液に再懸濁
する。１０ｍ１０）０．２５１ＶｆＥＩ）ＴＡ　、　ｐ
ｉ−１８，０および６　ｍ、１３の［Ｊ、２５１Ｖｌ）
リス。 ｐＨ８，０に１０ｍｇ／ｍのリゾチームを溶解した浴液
を添加する。懸濁液を氷上［’２１４間放置し、その後
２１１ｍ１の溶菌混合物（ｂ％トリトンＸ−１００゜５
０ｙｎＮＬ）リス、　ｐＨ８，０、０７Ｍ　Ｅｌ）ＴＡ
　）　　および５ｍｇの１０％５Ｊ）Ｓを添加し混合し
て細胞の溶解を誘発する。７０劇の新規に平衡化したフ
ェノールを添加し、溶液を振とうして乳化する。７Ｑｍ
ｌ！のクロロホルムを添加し、振とうして再び乳化する
。混合物を１０　Ｋｒ１１１１１Ｃ−ろ０分間遠心分離
し、Ｉ）ＮＡ’（＜含有する粘稠な上層を新しい容器に
移し、更に２度フェノール／クロロホルムで再抽出ｊ６
゜上層のＪＪ　Ｎ　Ａ層を透仇チェーブに移し、ｌＸＤ
ＮＡ緩衝液に対し、２４時間以上ｄ回溶液を交換して透
析する。 透析されたＤＮＡ＠液をビーカーに移し、將。。 の容量の１０ｍｇ／ｍ、ｌ　’１（Ｎａｓｅ　　を絵加
し最終濃度１００μｇ／ｍ、ｌ　　とする。この溶液を
６７℃にて１時間インキュベートし、１ｔＮＡを消化′
１″る。５Ｍｌ’Ｊ　ａ　Ｃ１を添加して０６４Ｍ最終
濃度となし、０５５（５］） 容量のインプロパツールを溶液の上に層積する。 １）ＮＡをこび）混合物からガラス棒で糸を巻くように
して取り１」コし、１５ｍＡの１×ＤＮＡ緩衝液に浴解
し、４℃で貯蔵する。 ２、部分消化：Ｊフ、下のごと（精製３Ｊ　Ｎ　Ａ　’
Ｉｇ　Ｂａｍ１−［で滴定し、部分消化を達成する＝１
０口μｇ／ｍｌｌ　の１）ＮＡ４含ム１０ｍＭ　）リス
ｐｉ−ＴＺ５　、１０ｍＭＭ−ｇＣ，（ｂ　。 １０ｍＭメルカプトエタノール、５０ｍＭ、ＮａＣｅ緩
衝液２ｍｌを２００μｅづつ１０に分装置−る。第１の
チューブに２００率位のＢａｍｆ（■を添加し、ＤＮＡ
μｙ当り１０年位とする。第２のチューブに１［］０早
位０）Ｂ　ａ　ｍＨ■を添加しく５卑位／μｇ）、以下
各々の続いてのチューブが前の量の半分のＢａｍｔ（Ｊ
を受けとるようにする。チューブをろ７°Ｃにて１時間
インキュベートし、続いて７５℃で１５分間熱処理して
反応を終結せしめ、各々のチューブから１０μｅを取り
アガロースゲル電気泳動により分析する。中程度で不完
全な消化を示すチューブをクローニングの１こめの部分
消化フラグメント源として選択する。（これらは１．２
５　、０．６ろ、Ｏ２ろ　および０．１５年位／μｇの
チューブであった。６つの溶液を一緒に混合し、以下に
記載するごとく使用した。 ） ６、結合：フラグメント化Ｌ）ＮＡを以下θ）ごとくｐ
ＢＲ３２２　に結合した：６．７ｔｔｇの１３　ａ　ｍ
ＨＩ　部分消化Ｔ、アクアチカスＩ）ＮＡ（６７μｌ）
を２．５μｇのＢ　ａ　ｍｌ−１丁−切析脱リン酸化ｐ
Ｂｌ（，３２２（２５μｅ）と混合する。２５μｅの１
０×結合混合物（５００，Ｍ）　　’Ｊ　　２　　＋　
　ｐＬ（７５、１００ｍＭＭｇｅ　ｅ２　、　１００ｍ
ＭＤＴＴ。 ５ｍＭＡＴＰ）　　を加え更に１６６μｌの無閑蒸留水
で最終容量を２５０μｌとなす。ｍｌ３当り、ｄｘｉＱ
’平位のＴＪＤＮＡ　ＩＪガーゼを５μｌ添加し、混合
物は１７℃にて４時間インキュベートする。２０μｌの
クロロホルムを添加し量率に伽と５し、遠心分離して反
応を終結せしめ、ぽ液を殺菌する。１００μｌの溶液を
１．　ＯｍｉのＳＳｅ／Ｃａｅ４　（５０ｍＭＮａＣ３
，５ｍＭクエン酸３すトリウム、６７ｍＭ（、：ａＣ１
２）　　と氷上で混合し２．　Ｑ　ｍｌの太腸菌囮卸１
胞氷冷組成物を添加する。混合物を４５℃にて５分間加
熱し１０ｍＡのルリアーブロス（Ｌ−プロス）の添加に
より希釈し、６７℃で４時間インキュベートする。 ４、第１次細胞ライブラリー：形質転換した培養液を短
時間遠１０シ上澄み液を捨てる。細胞ペレットはその後
２ｍｌのＬ−ブロスに再結濁し、２００μｅづつ１００
μｇ　／ｒｎ１３　　アムビンリン含有の１０ケのルリ
アー寒天（Ｌ−寒天）プレート上に接種する。 ３７℃にて一夜インキュベーション後、フレートを各々
２．５　ｍｌの１０７７１Ｍ、Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　、　ｐ
Ｈ７，５、１０ｍＭＭｇＣ１２で満ちあふれさせ、形質
転換コロニーを一緒に削りプールして第１次細胞ライブ
ラリーを形成する。 ５、第１次プラスミドライブラリー二第１次プラスミド
ライブラリーは以下のごとく調製する：２、５　ｍｌの
第１次細胞ライブラリーを１００　μｇ　／ｒｎｌｌア
ムビシリンを含有する５００ｍ１のｂ−グロスに接種す
る。 培養液は５７℃にて一夜振とうした後、４Ｋｆｌｌ１１
で５分間遠心分離する。上液み散を棄て、細胞ペレット
を１０ｒｎｌの２５％シヨ糖、５０ｍＭトリス、ｐＨ８
，０に室温で再懸濁する。５ｍ１３の０．２５Ｍ］うＤ
ＴＡ、ｐ）１８．０を添加い続イて５ｍｌθ）　１０　
ｍｇ　／ｍｌ：　　リゾチームケ含む０．２５Ｍトリス
、　ｐＨ８，０を添加する。溶液は氷上に１時間放置し
た後、１２ｍ１：の溶菌混合’Ｉｙｌ（ｂ％トリトンＸ
−１００，５０ｍＭ　　トリス、Ｉ）Ｈ８，０，６７ｍ
ＭＪ号ＪＪＴＡ　）を激しくピペットで加え、細胞懸濁
液は緩かに渦を巻かせ溶菌な完成させる。浴菌後、混合
物を５０ｍｇのプラスチック遠ノし・チューブに移し、
４℃にて４５分間１７Ｋｒ１１１１１で回転させる。２
２．０グラムの七澄み液をピペットで除去し、５Ｑｍｌ
のプラスチックねしぶた式チューブに移す。２０．０ｇ
ｍの固体（、’　ｓ　（−、ｅ　＋および１．　Ｑ　ｒ
ｎｌ：０５ｍｇ／ｍｌエチジウムプロミドを含む１０７
１０７７ｌリス、　ｐ）［３，Ｑ、　　１ｍ１ｘＥ　ｌ
０ＴＡ　、　１０Ｑ　ｍＩＶ　Ｎ　ａ　Ｃｅ７Ｊ添加す
る。チューブはすべてのＣ，：　ｓ　Ｃｌが浴液するま
で緩かに振とうし、ソノ？＆　溶液を２つの５７３　ｉ
ｎ、Ｘ　３　ｉｎ、のポリアロマ−超遠心チューブに移
す。チューブは封をし、Ｔ１７０ローターで４２時間（
５０Ｋｒｐ”、　１７℃）回転する。プラスミドを集め
るには、チューブの先端を、外科用メスで刺し通し紫外
光下より下側の２つの螢光性Ｄ　Ｎ　Ａバンドをシリン
ジで集める。 両方のチューブからの下１則のバンドを混合し、等容量
θ）水冷ｎ−ブタノールで４回抽出してエチジウムプロ
ミドを除去する。 抽出済の溶液を透析用チューブに移し、４回交換１−る
１ｘ、１）ＮＡ緩衝液に対して２４時間透１Ｆする（ｂ
節）、透析したＤＮＡ＃液を前もって秤量しである５０
廐遠心チユーブに移し、その容量をホｌ［定する。最終
濃度が４Ｍになるように５１ＶｉＮａＧ７を添加し、そ
の後２容重のインプロパツールを添加し混合する。溶液
を一２０°Ｃにて一夜貯蔵してＤ　Ｎ　Ａを沈殿せしめ
る。沈殿生成後、溶液Ｏ°Ｃにてｉ５に４１１＋１で１
５分間遠心し、上澄み液を捨てる。 チューブを１５分間風乾した後７５０μｅの無菌蒸留水
を加える。ペレットが溶解したら８μｅの１００ｘＤＮ
Ａ　　緩衝液を加え、溶／Ｖｉ、をエツペンドルフチュ
ーブに移し、−２０’Ｃで保存する。この方法で調製し
たプラスミドＤＮＡ濃度は１５０μＦ旬であった。 ６、　プラスミドプールの消化二以下のごと（して第１
次プラスミドブールを消化し、非−Ｔａｑ　Ｉメチラー
ゼクローンを１波壊した：１５０μβのプラスミドＤ　
Ｎ　Ａ溶液に４５ｐ、ｅＯ）１ＣＪ×’ＰａｑＩＭ＠Ｗ
（ｂ００ｍＭ　　　）　　リ　ス　、　　　ｐｆ−ｆ８
ｊｌ、６０ｙｒ＋ＭＭｇＣ：ｅ２　　．６０７７１Ｍメ
ルカプトエタノール、ｉＭＮａｅ、ｄ）　　および２５
５μｅの蒸留水を加え１ｉ５０μｌの容室まで希釈する
。溶液乞５つＱ）チューブに分′ＰＥする：最初の４つ
のチューブには各々１００μｌ入れ最後のチューブには
５０μｅ入れる。４０阜位のＴａｑＩを第１のチューブ
に加え、ＤＮＡμｇ当り８単位の酵素となるようＶＣす
る。２０率位θ）ＴａｑＩｉ第２のチューブに加え（４
卑位／μｇ　）以下同様に各々θ）チューブか前の量り
）半分を受けとるようにする。最後のチューブは対照実
験として働きＴａｑＩ酵累を酵素ない。浴液に５０μｅ
のパラフィン油を層積して蒸発を防ぎ、チューブを６５
℃にて１時間インキュベートする。 Ｚ　形質転換：各々のチューブからの１０μｌの試料を
ｍＩ記と同様の方法で大腸菌Ｈ，Ｅ（、ｌの形質転換に
使用した：各々の１０μｌ溶液を氷上で１００μｅのＳ
ＳＣ／（：ａ（Σｅｔ　（５０ｍＭＮａＣｌ、５７７１
Ｍり−ｃンｙろすトＩＪ　’）　ム、　６７ｍＭ（−１
ａｃ、ｅ２）　　と混合し、２ＤＯμｅの氷冷した光分
な大腸菌１（、ａｔ細胞を添加する。５分間４５゛Ｃの
熱衝撃を与えた後、細胞／ＪＪＩＮＡ混合物をただちに
１００μｇ／ｒｎｌｊ　アムビシリン含有り一寒天プレ
ートに播種する。ブンートは６７℃で一夜インキユベー
トした後試験する。’、Ｉ’　ａ　ｑ　Ｉによるプラス
ミドライブラリーの消化により形質転換体の数（ｂ″な
わち無傷のプラスミドの欽）が約１０３から１０４分の
１に減少した事が観察された。ブンート上の生き残りの
中から２８の別個のコロニーを取り、各々をｉＱｍＡの
アムビシリン含有１」−グロスに接種し、アムビシリン
含有Ｌ−Ｑ天プレート上へすし状に播種する。 ８、第２次集団：残ったコロニーを削り一緒にして第２
次細胞ライブラリーを形成せしめ、それは第１次プラス
ミドライブラリーの調製で記載した方法と同じ方法によ
り第２のプラスミドライブラリーの調製に使用する。 ９、　第２次プラスミドライブラリーの分析：第２次プ
ラスミドライブラリーはＢａｍ）ＩＩで消化し、ゲル電
気泳動により分析した。年−〇）顕著な５．５キロ塩基
対フラグメントが果団内に存在Ｊ−る事が企見名（され
プこ。 １０、第２次個体の分析：第２次卸１胞個体中α）２８
（ｂ＞　生キ残’）”ｌ’＝−Ｙ１０ｍｔ′培養液中（
７ｍｌ］）で増殖せしめ、それらが運ふプラスミドゲ削
記夫施例Ｔ　、　　１０　Ｎ１ｔｒｃ記載しフ、二少童
調製梢製法により調製する。少量調製法によるプラスミ
ドばｉ、’　ａ　ｑ　ＩおよびＨａ　ｍｌｉ　Ｉによる
消化により分ｖ［シた。 １１、メチラーゼ遺伝子クローン二分析さλ′またいく
つかσ゛）プラスミドが無作為な′１゛、アクアチウス
１）　Ｎ　ＡのＢａｍＨＩ　７　ラグメントを運びＴ　
ａ　ｑ　１１ｃよる消化に感受性がある事が観察された
。こス′シらのプラスミドは見せかけの生き残りであり
更なる興味はない。しかしながら残りのプラスミドは’
Ｉ”ａｑＩ耐性であり約５，５　Ｋ　ｂの長さの普通０
）Ｂａｍｌ−ＩＩフラグメントを運ぶ墨が綾祭された。 丁べてのこノ・Ｌらθ）プラスミドは後に’１．’　ａ
　ｑ　Ｉ修飾メチラーゼおよび制限エンドヌクレアーセ
遺伝子の両方を運ぶ墨が示された。ｐＴａｑＩ　１８と
称されるこれらθ）プラスミドα）１つはクローンθ）
最も単純な型の例である：それはただ１つの５．５　Ｋ
、　ｌ）　Ｈａ　ｒｎＨＩ　フラグメントをフ軍ぷ事が
Ｍｌい出さえした。ｐＴａ　ｑ　Ｉ　ｉ　８　　ケ持つ
細胞は’Ｊ、”　ａ　ｑ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼお
よび修飾メチラーゼの両方な多量に合成する事がｔＬＭ
祭された。 ４ｙビトロでＪ、’　ａ　ｑ　Ｉ修飾メチラーゼ活性を
１突出１−る検定は以下のごとく実施した：メチラーゼ
検定：メチル化の検定には６つの溶液を調製１゛る： １０×メチル化緩衝液：　０．５１ＸＡｌリス、ｐｌ」
８．０．１００ｍＭＥＤＴＡ、５Ｑ７７１Ｍ　メルカプ
トエタノール。 メチル化反応混合物：５００μｇ／ｍｌ　のラムダ１）
’ＮＡ　１００μ、ｅ　、　１００．ｃ＋、６　　の１
０Ｘメチル化緩衝液。 １μｅ　ｆｌ　１００ｍＭ　Ｓ−アデノシルメチオニン
。 ８００μｌの蒸留水。 １０×変？Ｍ　ｍ　ｔａｒ液：　０．５ＭＮａｅ、ｇ、
０．３ＭＭｇＣｅ２゜５０ｍＭメルカプトエタノール。 細胞抽出物：１００ｍ１の培養液’ｒ　１００　ｆｉ　
ｅ／ｍｔ４アムビシリン含有１」−グロス中で３７’Ｇ
Ｋで一夜渭殖せしめる。次の朝４）（ｒｐｍで５分間遠
ｌＬ・分離して細胞を採取する。上澄み液は捨て、ペノ
ソトに６６ｍ１の超音波処理緩衝液（ｂ０ｍＭトリス、
　ｐ　１−１７．５　、１０ｍＭメルカプ）・エタノー
ル、　１ｍＭ　ＥＤＴｋ）に再＠濁する。Ｉ　Ｄ７７１
ｙ　／ｍｌ　ＩＪゾチーム含有超音波処理緩衝液０．４
　ｍ、ｌを添加し、懸濁液に渦を巻かせ、氷上に１時間
放置する。１ｍ１３の試料をエツペンドルフチューブに
移し、２回の１０秒照射で緩かに超音波処理し、細胞を
破壊する。チューブをミクロ遠心機中で６０秒遠心分離
し、細胞破片をベレット化する。上げみ液を新しいエッ
ペンドルフチューブに移し、６５℃で２０分間加熱し沈
殿は６０秒のミクロ遠心分離により除去する。残った上
澄み液を細胞抽出液として使用する。 検定：抽出物を検定するにはメチル化反応混合物を５つ
のチューブに分注する。ｇｌのチューブに１５０μ１１
残りの４つのチューブには各々１０２．５μｌ　ｏ７．
５μｌの細胞抽出物を第１のチューブに加え、混合し、
４７５μｌを取り次のチューブに加え混合し、見、不同
様にする。従って第１０）チューブはＩ）ＮＡμｇ当り
１μｅの細胞抽出物を少目゛ており、第２θ）チューブ
は０．ろＩｔｅ／μ３ｑ、第ろθ）チューブは０．１μ
ｅ／μｇ、以下同様であり、各々のチューブには最終的
に杓１００μｅの溶液がはいる皇（ｃなる。蒸発を防ぐ
ため各々の溶液θ）上に５０μｅのパラフィン油を層積
し、チューブを６５°Ｃで１時間インキュベートする。 １１μｅの１０×変換緩衝液および２５卑位のＴａｑＩ
制限酵素を各々のチューブに加える。溶液は再び６５℃
ｒて１時間インキュベートした後２０μｅの試料をゲル
電気泳動により分析する。クローンは湿潤細胞ペースト
グラム当り約１　Ｘ　１０５　単位のＴａｑＩメチラー
ゼを合成する事が観察された。 １２、制限遺伝子りｏ−ン：　５．５Ｋｂ　Ｂ　ａｍＨ
Ｉ　７　ラグメントラ運ぶクローンは修飾メチラーゼ同
様ＴａｑＩ制限エンドヌクレアーゼを合成する牛が観察
された。 インビトロでＴａｑＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を検
出する検定は以下のごとく実流した：エンドヌクレアー
ゼ伎定：エノドヌクレアーゼを６伯：、０）４芙定の１
こめ２つθ）浴液を調製した＝１３ｘＴａｑＩエンドヌ
クンアーゼ緩価液：１００ｍＭ１−リス、　ｐｌ−＋８
Ｊ　、　６０ｍｌＶｌｌＶＩｇ（シｅ２＋　６０　ｍ　
Ｍメルカプトエタノール、　１．ＱＩＶｌ’ＮｅＣｅ。 五とｙヌクレアーゼ反し混合物：５００μｇ／ｍ１ｄｌ
ｉｌｌＯ）ラムダＤ　Ｎ　ＡＹ　１００μｅ、　１００
μ、（ｌｊ　Ｏ）Ｉ　Ｑ　Ｘ′Ｉ″ａｑｌエンドヌクレ
アーゼ緩衝液、８００／ｉ７の蒸留水。 細胞抽出物：抽出物は前記メチラーゼ検定で記載した方
法（ｂ１ｆｆｉ）により調製した。 検定：抽１ｉ；＊を検定するには、新鮮なエンドヌクレ
アーゼ反応混合物を調製し、５つθ）チューブに分圧す
る（第１のチューブに１５０μＣｈりの４つのチューブ
に各々１０２．５μｅを加える）。 第１のチューブにＺ５μｅの細胞抽出液を加え、混合し
、４７．５μｅを取り次のチューブに加え混合し、以−
卜同様に行う。従って第１のチューブはＤ　Ｎ　Ａμｇ
当り１μｅの抽出液を受は取った事になり、第２のチュ
ーブは０５μｅ／μｇ、第６のチューブは０１μｅ／μ
ｇおよび以下同様となり、各々のチュ。 −ブは最終的に約１００μｅの溶液がはいっている事に
なる。蒸発を防ぐため５０μｅのパラフィン油を各々の
溶液の上部に層積し、チューブを６５℃にて１時間イン
キュベートする。各々２０μｅθ）試料をゲル宙１気泳
動により分析する。クローンは湿＠細胞ペーストダラム
当り約２×１０５平位のＴａｑＩ制限エンドヌクレアー
ゼを合成Ｊ−る事が観察された。ファージによる試験で
はクローンにはファージ感染への測定できる程度θ）耐
性は何ら観察されなかった。ラムダファージのプンーテ
イング効率は０５から１の間である事かわかった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨａ　ｅｆＪ制限／修飾遺伝子のクローニング
のための反応工程図を示している。 第２図は数種のＨａｅＨ制限／修飾およびＨａｅｌＪ修
飾クローンり）１１−１ｉ　ｎｄ　Ｉｌｌ消化物０）ゲ
ルの写真の複写を示している。 第ろ図は本発明に従って製造されたクローンの１７１　
ａ　ｅ　ＪＪおよびＩ−１ａ　ｅＪ７）制限および修飾
遺伝子の構成を示している。 第４図はｐＨａｅＩＪのＩ−１ｉ　ｎｄｌｌＩ　２　’
ｌｆ消化物θ）ゲルの写真の拶写とともに、プラスミド
ルｌ−１ａｅｌｌ訓限／修飾遺伝子フラダメントの構成
を示している。 第５図はＨａ　ｅ　［の過剰発現のための第１の接近方
法を示している。 第６図は［（ａｅ）ｉの過剰発現のための第２の接近方
法を示している。 第７図はＨ’、　ａ　ｅ　ｌｊ制限および修飾遺伝子の
ための過少−および過剰−産生プラスミドおよび得られ
た酵素の表を示している。 前 肉目 手　　続　　補　　正　　書 昭和にノ年丁月、７７日 ２発明の名称 ７１ヵ１３乱１４：＄　吊とτ乍遠イ乞集のフｏ−こ＞
’）ろ補正をする者 事件との関係　　特許出願人 インコーゼｌ−−テ／ｌ−゛。 ４代　理　人 ５補正の対象 出願ノ、のイー（表者名を記載した願鵜１；’）Ｑ−−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、制限遺伝子をコードしているＤＮＡを含有するライ
   ブラリーを形成し、修飾遺伝子を含有するクローンを単
   離し、および制限遺伝子の存在のための修飾遺伝子を含
   有するクローンをスクリーニングすることからなる制限
   遺伝子をクローニングする方法。 ２、ライブラリーが以下の工程で形成される特許請求の
   範囲第１項記載の方法： （ａ）制限遺伝子を含有するＤＮＡ源からＤＮＡを精製
   し； （ｂ）精製ＤＮＡを部分消化してＤＮＡフラグメントを
   形成し； （ｃ）これらのフラグメントをクローニングベクター内
   へ結合し； （ｄ）工程（ｃ）のクローニングベクターで宿主細胞を
   形質転換して第１次細胞ライブラリーを形成し；および （ｅ）第１次細胞ライブラリーから組み換えベクターを
   精製して第１次ベクターライブラリーを形成する。 ６、ＤＮＡ源が制限遺伝子を含有する細菌である特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ４、クローニングベクターがプラスミドまたはウィルス
   ＤＮＡ分子である特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、プラスミドがｐＢＲ３２２である特許請求の範囲第
   ４項記載の方法。 ６、宿主細胞がｈｓｄＲ＾−である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
   ＾ｉ）の株である特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７、修飾遺伝子に対応する制限酵素でライブラリーを完
   全に消化して消化物プールを形成し、消化物プールで宿
   主細胞を再形質転換し、および修飾遺伝子を含有するク
   ローンを選択する事により、修飾遺伝子を含有するクロ
   ーンが単離される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、修飾遺伝子に対応する制限酵素でベクターライブラ
   リーを完全に消化して消化物プールを形成し、消化物プ
   ールで宿主細胞を再形質転換しおよび修飾遺伝子を含有
   するクローンを選択する事により、修飾遺伝子を含有す
   るクローンが、単離される特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ９、消化がエキソヌクレアーゼまたはホスファターゼの
   添加により補足される特許請求の範囲第８項記載の方法
   。 １０、さらに以下の工程を含む特許請求の範囲第８項記
   載の方法： （ａ）消化物プールからさらにベクターライブラリーを
   形成し； （ｂ）工程（ａ）のベクターライブラリーを制限酵素で
   再消化して消化物プールを形成し；および （ｃ）工程（ｂ）の消化物プールから調製された修飾遺
   伝子を含有するクローンを選択する。 １１、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返して工程（ｃ）
   による選択を促進する特許請求の範囲第１０項記載の方
   法。 １２、特許請求の範囲第１項の方法に従つて製造される
   クローン。 １３、制限遺伝子がＴａｑ I をコードしている特許請
   求の範囲第１２項記載のクローン。 １４、制限遺伝子がＨａｅIIをコードしている特許請求
   の範囲第１２項記載のクローン。 １５、以下の工程からなる制限酵素および／またはその
   対応する修飾酵素を製造する方法： （ａ）制限遺伝子を含有するＤＮＡ源からＤＮＡを精製
   し； （ｂ）精製ＤＮＡを部分消化してＤＮＡフラグメントを
   形成し； （ｃ）該フラグメントをクローニングベクターに結合し
   ； （ｄ）工程（ｃ）のクローニングベクターで宿主細胞を
   形質転換してライブラリーを形成し； （ｅ）制限酵素による完全な消化により制限遺伝子に対
   応する修飾遺伝子を含有するクローンについてライブラ
   リ−のスクリーニングを行い；（ｆ）制限遺伝子の存在
   のために工程（ｅ）のクローンのスクリーニングをさら
   に行い； （ｇ）工程（ｆ）のクローンを培養し；および（ｈ）培
   養液から制限および／または修飾酵素を回収する。 １６、ＤＮＡ源が制限遺伝子を含有する細菌である特許
   請求の範囲第１５項記載の方法。 Ｉ７、クローニングベクターがプラスミドである特許請
   求の範囲第１５項記載の方法。 １８、プラスミドがｐＢＲ３２２である特許請求の範囲
   第１７項記載の方法。 １９、宿主細胞がｈｓｄＲ＾−である大腸菌株である特
   許請求の範囲第１５項記載の方法。 ２０、特許請求の範囲第１９項の方法に従つて製造され
   る制限酵素。 ２１、産生される制限酵素がＨａｅIIであり、ＤＮＡ源
   が￥ヘモフィルスアエジプチウス￥（￥Ｈａｅｍｏｈｉ
   ｌｎｓａｅｇｙｐｔｉｕｓ￥）である特許請求の範囲第
   １５項記載の方法。 ２２、特許請求の範囲第２１項記載の方法に従つて製造
   されたＨａｅII。 ２３、特許請求の範囲第２１項記載の方法に従つて製造
   されたＭ．ＨａｅII。 ２４、産生される制限酵素がＴａｑ I であり、ＤＮＡ
   源が￥テルムスアクアチクス￥（￥Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａ
   ｑｕａｔｉｃｕｓ￥）である特許請求の範囲第１５項記
   載の方法。 ２５、特許請求の範囲第２４項記載の方法に従つて製造
   されたＴａｑ I 。 ２６、特許請求の範囲第２４項記載の方法に従つて製造
   されたＭ．Ｔａｑ I 。 ２７、大腸菌のＲｇｌ−欠損株においてクローンを構成
   し、繁殖させる事を特徴とするシトシン−型修飾メチラ
   ーゼ遺伝子のクローニング法。 ２８、大腸菌の株がＲｇｌＡ−欠損である特許請求の範
   囲第２７項記載の方法。 ２９、大腸菌の株がＲｇｌＢ−欠損である特許請求の範
   囲第２７項記載の方法。 ３０、大腸菌の株がＲｇｌＡ−およびＲｇｌＢ−欠損で
   ある特許請求の範囲第２７項記載の方法。 ３１、クローンがシトシン−型修飾メチラーゼに対応す
   る制限エンドヌクレアーゼをもコードしている特許請求
   の範囲第２７項記載の方法。