JPH02167074A - ＮＩａ４制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の１ 本発明はＮｌａＩＶ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メ
チラーゼのためのクローン、並びに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。

１唾へ１１ 制限エンドヌクレアーゼは細菌中で天然に産生される酵
素の１種である。制限エンドヌクレアーゼは池の汚染性
細菌成分と取り除いて精製すると、ＤＮＡ分子を正確な
フラグメントに分画するために実験室で使用することが
できる。制限エンドヌクレアーゼのこの特性により、Ｄ
ＮＡ分子を独自に同定し、その分子を構成する遺伝子に
分画することができる。制限エンドヌクレアーゼは現代
の遺伝子研究に不可欠なツールであることが証明されて
いる。制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工学及び分析に
用いられる生化学的「はさみ」である。

制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子に沿って特定のヌ
クレオチド配列（「認識配列」）を認識しこれに結合す
ることにより作用する。分子に一旦結合すると、制限エ
ンドヌクレアーゼは配列の内側又はその一端でこの分子
を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認
識配列に親和性を有する。今日までに検討されている多
数の細菌種のうちで１００種類以上の制限エンドヌクレ
アーゼが同定されている。

細菌は通常、１種につきほんの少数の制限エンドヌクレ
アーゼしか保有していない。エンドヌクレアーゼは夫々
が由来する。ｍｉに従って命名される０例えばｔｌａｅ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａｅｇｙｐｔｉｕｓ種は３種類の異
なる制限エンドヌクレアーゼ、即ちＨａｅ　Ｉ　、１Ｉ
ａｅＩ［及び１Ｉａｅｌ［を合成する。これらの酵素は
夫々配列（＾Ｔ）ＧＧＣＣ（八Ｔ）、ＰｕＧＣＧＣＰｙ
及びＧＧＣＣを認識及び切断する。これに対して大腸菌
ＲＹ１３は配列Ｇ＾＾ＴＴＣを認識するただ１種の酵素
ＥｃｏＲＩＬか合成しない。

以下の理論に拘束される意図はないが、元来、制限エン
ドヌクレアーゼは細菌細胞の繁栄において防御の役割を
果たすと考えられている。従って、細菌はウィルス及び
プラスミドのような外来ＤＮＡ分子による感染に抵抗す
ることができ、仮に制限エンドヌクレアーゼが存在しな
いならば細菌はこれらの外来ＤＮＮＡ子により破壊又は
寄生されるであろう、制限エンドヌクレアーゼは感染性
ＤＮＡ分子に結合し、認識配列が現れる箇所毎に該分子
を切断することにより耐性を与える。この結果、壊変（
ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）が生じ、感染性遺伝子
の多くが不活化し、ＤＮＡは更にエクソヌクレアーゼに
よる分解を受は易くなる。

細菌防御システムの第２の要素は修飾メチラーゼである
。これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であ
り、細菌が感染性の外来ＤＮＡから自己のＤＮＡを保護
及び区別し得る手段となる。修飾メチラーゼは対応する
制限エンドヌクレアーゼと同一のヌクレオチド認識配列
を認識してこれに結合するが、ＤＮＡを破壊する代わり
に、メチル基を付加することにより配列内のヌクレオチ
ドを１ヒ学的に修飾する。メチル化後、認識配列はもは
や制限エンドヌクレアーゼにより結合又は切断されない
、細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼの活性により
常に十分に修飾され、従って、内因性制限エンドヌクレ
アーゼの存在に完全に非感受性である。未修飾の、従っ
て、外来性であることが確認可能なりＮＡのみが制限エ
ンドヌクレアーゼ認識及び攻撃に対して感受性である。

遺伝子工学技術の出現により、今日では遺伝子をクロー
ニングし、遺伝子がコードするタンパク質及び酵素を従
来の精製技術で得られるよりも大量に製造することが可
能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを
単離する鍵は、このようなりローンが１０−３〜１０−
４程度の低い頻度で現れるときに、複雑な「ライブラリ
ー」、即ち「ショットガン」手順により得られるクロー
ンの集団から該クローンを同定するための簡単且つ確実
な方法を開発することである。好ましくは、方法は、大
多数の不要なりローンが死滅し、望ましい希少のクロー
ンが生き残るように選択的であるべきである。

タイプ■の制限−修飾システムはますますさかんにクロ
ーニングされつつある。最初のクローン化システムは、
制限エンドヌクレアーゼクローンを同定又は選択する手
段としてバクテリオファージ感染を使用した（）Ｉｈａ
ｌｌ　：　Ｍａｎｎ他、Ｇｅｎｅ　３：９７−１１２．
　（１９７８）；　ＥｃｏＲＩＩ　：　Ｋｏｓｙｋｈ他
、Ｍｏ１ｅｃ、　ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ　１７８：　７１７−７１９．　（１９８０
）；　Ｐｓｔ　Ｉ　：　Ｗａｌｄｅｒ他、Ｐｒｏｃ、　
　Ｈａｔ、　　＾ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　７
８　１５０３−１５０７゜（１９８１））。細菌中に制
限−修飾システムが存在していると、細菌はバクテリオ
ファージによる感染に抵抗することができるので、クロ
ーン化制限−修飾遺伝子を有する細胞は、原則としてフ
ァージに暴露されたライブラリーからの残存物として選
択的に単離され得る。しかしなから、この方法は限られ
た価値しかないことが判明した。具体的にいうと、クロ
ーン化制限−修飾遺伝子は選択的に生き残るために十分
なファージ耐性を必ずしも発揮しないことが知見された
。

別のクローニングアプローチは、最初にプラスミドに担
持されているとして特徴付けられたシステムを大腸菌ク
ローニングプラスミドに形質転換する方法である（Ｅｃ
ｏＲＶ　：　１３ｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ他、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：３６５９−３６７
６、　（１９８４）；ＰａｅＲ７：　Ｇｉｎｇｅｒａｓ
及びＤｒｏｏｋｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＳａＯ２４０２−４０６，
（１９８３）；　Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ、　Ｇ
ｅｎｅ　１９：３５５−３５９．　（１９８２）；　Ｐ
ｖｕ［：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ他、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、　１６４：５０１−５０９（１９８５））。

第３のアプローチは、現在多数のシステムをクローニン
グするために使用されており、例えば本願の参考資料で
ある米国特許出願第７０７０７９号に記載されているよ
うに、活性なメチラーゼ遺伝子を選択する方法である。

制限及び修飾遺伝子は相互に近接して結合する傾向があ
るので、両方の遺伝子を含むクローンは多くの場合、一
方の遺伝子だけを選択することにより単離され得る。メ
チル化活性を選択しても必ずしも完全な制限−修飾シス
テムが得られるとは限らず、メチル化遺伝子しか得られ
ない場合もある（ＢｓｐＲｌ　二Ｓｚｏ＋＊ｏｌａｎｙ
ｉ他、Ｇｅｎｅ　１０：２１９−２２５．　（１９８０
）；　ＢｃｎＩ　：　Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ他、Ｇｅｎ
ｅ　２０：　１９７−２０４　（１９８２）；　Ｂｓｕ
ＲＩ　：　Ｋ１５ｓ及びＢａ１ｄａｕｆ、　Ｇｅｎｅ　
２１：　１１１−１１９．　（１９８３）；及びＭｓｐ
ｌ：Ｗａｌｄｅｒ池、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＯｌ、
　２５８：１２３５−１２４１゜（１９８３））。

制限−修飾遺伝子クローニングの潜在的な障害は、修飾
により保護されていない宿主にエンドヌクレアーゼ遺伝
子を導入しようとする試みにある。

メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子が共に
単一のクローンとして導入される場合、メチラーゼはエ
ンドヌクレアーゼが宿主ＤＮＡを切断する機会を有する
以前に該ＤＮＡを保護修飾しなければならない。従って
、場合によってはまずメチラーゼ、次にエンドヌクレア
ーゼの順に遺伝子をクローニングすることしかできない
、制限−修飾システムをクローニングする別の障害は、
大腸菌株のうちには好ましくないことにシトシン修飾と
反応するものがあり、このような株はメチル化したシト
シンを含むＤＮＡを破壊するシステムを有するという発
見に存する（Ｒａｌｅｉｇｈ及び−１ｌｓｏｎ、　Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａ１１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＩＪＳ＾８３：９
０７０−９０７４．　（１９８６））。

シトシン−特異的メチラーゼ遺伝子は、単独又は対応す
るエンドヌクレアーゼ遺伝子と共にこれらの株に容易に
クローニングすることができない。

この問題を回避するためには、これらのシステムが不備
な大腸菌の突然変異株（ＭｃｒＡ−及びＭｃｒＢ−）を
使用する必要がある。

精製制限エンドヌクレアーゼ、及びこれよりも程度は低
いが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡを特徴付は及び
再配列するために有用な道具であるので、これらの酵素
を大量に合成するＤＮＡ組換技術により細菌株を得るこ
とに対する商業的誘因がある。このような株が得られる
ならず、精製作業を簡単にできると共に商用として有用
な量を製造するための手段となるので有用であろう。

本発明は、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　１ａｃｔａｎｉｃａ（
ＮＲＣＣ２１１８）に由来するタイプ■制限エンドヌク
レアーゼＮｌａＩＶに係る。Ｎｌａ■はＤＮＡ配列５°
ＧＧＮＮＣＣ３°を認識し、２個の不特定のヌクレオチ
ドの間の中間で配列を切断し、平滑末端を形成する（Ｇ
ＧＮ／ＮＣＣ：　Ｑｉａｎｇ及び５ｃｈｉｌｄｋｒａｕ
ｔ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：
　１９９１−１９９９、　（１９８６）、尚、この文献
の開示内容は参考資料として本願に加える）。

光泗ノと艷刀− 本発明は、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ　
（ＮＲＣＣ２１１８）に由来する旧ａｌＶ制限エンドヌ
クレアーゼ及び修飾メチラーゼの遺伝子を含むクローン
、並びにこれらの酵素の製造方法を提供するものである
。より特定的には、本発明はＤＮＡ配列５’　ＧＧＮＮ
ＣＣ３’を認識し且つＮヌクレオチドの間を切断して平
滑末端を形成する酵素である制限エンドヌクレアーゼＮ
ｌａ■を発現するクローンに係る。

この酵素をクローニングするための好適方法は、Ｎ、　
Ｉａｃｔａｍｉｃａ　（ＮＲＣＣ２１１８）からのＤＮ
Ａを含むライブラリーを形成する段階と、Ｎｌａ■修飾
メチラーゼをコードするＤＮＡを含むクローンを単離す
る段階と、これらのクローンをスクリーニングし、Ｎｌ
ａ！Ｖ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子も３むクローンを
同定する段階とを含む。

日　の　二　　　　ｔ　＝ 本発明は、ＮｌａＩＶ制限及び修飾遺伝子のクローン、
並びにこのようなりローンから産生される制限エンドヌ
クレアーゼ旧ａｌＶに係る。Ｎ１ａｌＶ遺伝子は、Ｎｌ
ａ　■修飾メチラーゼ遺伝子を含みこれを発現するとい
う基準に基づいて選択されたクローンのうちにはＮｌａ
ＩＶ制限遺伝子も含むものがあるという事実を利用する
方法によりクローニングされる。このようなりローンの
ＤＮＡは、ＮｌａＩＶ制限エンドヌクレアーゼによるｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ消化に耐性である。

この消化耐性はＮｌａＩＶメチラーゼ及び制限エンドヌ
クレアーゼをコードするクローンを選択的に単離するた
めの手段を与える。

第１図は、本発明に従ってＮｌａＩＶ制限遺伝子及びメ
チラーゼ遺伝子を好適にクローニング及び発現する方法
を示しており、以下の段階を含む。

１、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ＩａｃｔａｍｉｃａのＤＮＡ
を精製する。

２、　ＤＮＡをＨｉｎＰ　Ｉのような制限エンドヌクレ
アーゼで消化する。

３、消化したＤＮＡを、１以上のＮｌａＩＶ部位を含む
ｐＵＣ１９（ΔＴＣＣ３７２５４）のようなりローニン
グベクターに連結する。連結したＤＮＡを大腸菌株ＲＲ
Ｉ（＾ＴＣＣ３１３４３）のような適当な宿主に形質転
換する。

４、形質転換した混合物を抗生物質アンピシリンのよう
な形質転換細胞に選択的な培地に平板培養する。インキ
ュベーション後、形質転換したコロニーを集めて単一の
培養物とし、細胞ライブラリーを作成する。

５、　Ｉ胞うイブラリーから組換体プラスミドを道し４
」−精製し、プラスミドライブラリーを作成する。

６、ＷＡ準タンパク質精製技術によりＮ、　１ａｃｔａ
蕩ｉｃａから調製したＮｌａ　Ｎ制限エンドヌクレアー
ゼでプラスミドライブラリーを完全に消化する。　Ｎｌ
ａ■消化は、メチラーゼを含有しない未修飾クローンの
みを特異的に破壊し、Ｎｌａ■メチラーゼクローンの相
対頻度を増す。

７、消化したプラスミドライブラリーを大腸菌ＲＲＩの
ような適当な宿主に再形質転換し、選択培地に平板培養
することにより形質転換細胞を回収する。

コロニーを採取し、そのＤＮＡがＮｌａＩＶ修飾遺伝子
を含んでいるかどうかを分析し、コロニーに担持される
プラスミドを精製し、Ｎｌａ　Ｎ制限エンドヌクレアー
ゼと共にインキュベートし、消化に耐性であるか否かを
決定する。同様に細胞ＤＮＡ全体く染色体及びプラスミ
ド）を精製し、ＮｌａＩＶ制限エンドヌクレアーゼと共
にインキュベートする。　Ｎｌａ■修飾遺伝子を有する
クローンのＤＮＡは完全に修飾されるべきであり、プラ
スミドＤＮＡ及びＤＮＡ全体のいずれも消化に対して実
質的に耐性であるべきである。

８、段階８で同定した旧ａｌＶメチラーゼクローンの細
胞抽出物を準備し、該抽出物のＮｌａＩＶ制限エンドヌ
クレアーゼ活性をアッセイすることにより、ＮｌａＩＶ
制限エンドヌクレアーゼを有するクローンを同定する。

９、アンピシリンを含有する栄養十分な培地中で発酵槽
内で増殖することにより、ＮＩａ１％’制限及び修飾遺
伝子を有するクローンから旧ａｌ’／制限エンドヌクレ
アーゼを産生させることができる。遠心分離により細胞
を収集し、音波処理により破裂させ、Ｎ１ａｌｌ／制限
エンドヌクレアーゼ活性を有する粗細胞抽出物を精製す
る。

１０、アフィニティクロマトグラフィー及びイオン交換
クロマトグラフィーのような標準タンパク質精製技術に
より、Ｎｌａ■制限エンドヌクレアーゼ活性を有する粗
細胞抽出物を精製する。

以上に概説した段階は本発明の好適実施態様を示すもの
であるが、上記アプローチを当該技術分野で既知の方法
に従って変形できることは当業者に自明である。

以下の実施例は、現在実施するのに好適な本発明の実施
Ｒ様を説明するものである。この実施例は例示に過ぎず
、本発明は特許請求の範囲の記載内容以外には制限され
ないものと理解されたい。

ン３（ １、ＤＮＡ精製：凍結したＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｌａｃ
ｔａｍｉｃａ（ＮＲＣＣ２１１８）細胞５ｇを２０１１
の２５％スクロース、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０
に再懸濁させた。　０．２５Ｍ　ＥＤＴ八ｐへ８．０を
１０ｘｌと、　０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０中の
Ｌｏｎｇ７ｍｌのりゾチーム６ｍｌとを加えた。懸濁液
を氷上に１６時間１、Ｉｔ持した後、１％Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１００，５０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，ｏ、６
７１Ｍ　ＥＤＴ八を２４ｘ（ｌと、１０％ＳＯＳを５ｘ
ｌ力■えることにより溶解させた。溶液を（０，５Ｍ　
Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，ｏで予め平衡化した）７０ｚ（ｌの
フェノール及び６０１１のクロロホルムで抽出した。エ
マルジョンをＩＯＫ　ｒｐｍで３０分間遠心分離し、相
を分離させた。Ｄ　Ｎ　Ａ　［衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ　ｐＨ８，ｏ、１ｍＭ　ＥＤＴ＾）を４回交換して粘
性の上相を透析した。透析した溶液を次に、最終濃度が
１００１１ｙ／ｚ１となるようにＲＮアーゼで３７℃で
２時間消化した０次に最終濃度０．４Ｍまでの５８８ａ
ＣＩと、０．５５倍容量のイソプロパツールアルコール
とを加えることにより、ＤＮＡを沈降させた。沈降した
ＤＮＡをガラス棒に巻き取り、風乾した後、約３５０ｕ
＃／ｘｉ’の濃度となるようにＤ　Ｎ　Ａ　緩衝液に溶
解させ、４°Ｃで保存した。

２、　ＤＮＡの消化：　５０．、のＮ、　１ａｃｔａｎ
ｉｃａ　ＤＮＡを５００１１１のｔｌｉｎＰｌ制限エン
ドヌクレアーゼ消化ｔ−ＩＩ液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
ｐＨ８，ｏ、１０ｎ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｚ、５０１Ｍ　Ｎａ
Ｃ１）で希釈した。４単位／、ｇ　〜０．０６単位／Ｉ
ＩｇのｔｌｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼの連続希釈
液を形成し、溶液を３７°Ｃで１時間インキュベートし
た。ＨｉｎＰＩ消１ヒの程度を、各希釈液からの少量の
アリコートのゲル電気泳動により分析した。所望の寸法
（２Ｋｂ〜１５Ｋｂ）の範囲のフラグメントが得られた
希釈液をプールし、等量の平衡化フェノールで抽出後、
クロロホルムで２回抽出した。最終濃度０．４Ｍまでの
５８　ＮａＣｌと、０．５５倍容量のインプロパツール
アルコールとを加えることによりＤＮＡを沈降させた０
次に最終濃度が約１００１ｇ／ｚｌとなるようにＤＮＡ
をＤＮＡ１衝液に溶解させた。

３、連結及び形質転換：　６ｕｙ（６０ｕ１）の旧ｎＰ
Ｉで消化したＮ、　Ｉａｃｔａｍｉｃａ　ＤＮＡを３ｐ
ｙ（１５ｐｆ）の＾ＣＣＩで切断及ヒ脱リン酸化Ｌ　タ
ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）　ト混合した。連結
用１０倍緩衝液（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，
１００ｍＭＭｇＣｌ　２．１００ｍＭ　ＤＴＴ、５ｍＭ
　ＡＴｒ’）２０μｆ及び無菌蒸留水１０５．／を加え
、体積を２０ｈ１にした。７．５ｐ１（３００ＯＮＥＢ
単位）のＴ４　ＤＮＡリガーゼを加え、溶液を１７℃で
１６時間インキュベートした。２０１Ｊ＆のクロロホル
ムで抽出することにより溶液を滅菌し、次に１５秒間マ
イクロ遠心により清澄化した。６２．５ｕ１の連結溶液
を５００ｕ（のＳＳＣ／ＣａＣａＣ１２（５０ＮａＣｌ
、５ｍＭクエン酸Ｎａ、、６７ｍＭ　ＣａＣＬ）と混合
し、１．Ｏｌの氷冷したコンビテンＩ・大腸菌ＲＲＩ（
ＡＴＣＣ３１３４３）細胞を加えた。溶液を４２℃で４
分間インキュベートした後、１０ｚｆのルリアブロス（
Ｌ−グロス）を加え、３７℃で３時間インキュベーショ
ンを続けた。

４、細胞ライブラリー：形質転換培養物を弱く遠心分離
し、上清を捨て、細胞を１．０ｙｔ１のＬ−ブロスに再
懸濁した。再懸濁した細胞から２００．＆を取り出し、
１００シｇ７ａｎのアンピシリンを含有するルリアー寒
天（Ｌ−寒天）プレートに平板培養した。プレートを３
７℃で一晩インキユベートした。プレートの各々に２．
５ｍｉの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　
ＭｇＣ１ｚを注ぎ、コロニーを揉き集め、懸濁液を単一
の管にプールすることにより、プレートの表面で増殖し
た形質転換細胞を収集した。

５、プラスミドライブラリー：　１００１Ｊ９／ｚｆの
アンピシリンを含有するＬ−ブロス５００ｚＮに２．（
ｈｌの細胞ライブラリーを接種した。培養物を３７℃で
一晩振蕩後、５Ｋ　ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清
を捨て、細胞ベレットを１０１１の２５％スクロース、
５０　＋ａ　ＭＴｒｉｓ　ｐＨ８，ｏに室温で再懸濁さ
せた。これに、０．２５Ｍ　ＥＤＴ＾、ｐｌ（８，０を
５ｍｌと、０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，ｏ中の１０
Ｈａｚ１リゾチーム３１Ｎとを添加し氷上に１時間置き
、次に１２１１の１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，ｏ、６７ｍＭ　ＥＤＴ八を加
え、懸濁液を緩く渦流動させ、細胞溶解を誘導した。

溶解した混合物を容ｆｉ５０ｘｌの管に移し、１７Ｋｒ
ｐｍ、　４℃で４５分間遠心分離した。上清をビペ・ン
トで取った。２０．０．の固体ＣｓＣｌを容量５０Ｒ１
のプラスチックねじ蓋付き管に計り取り、２２．０ｇの
上清をピペットで管に取り入れ、混合した。１０１Ｍ　
ＴｒｉｓｐＨ８，０，１００ｍＭ　ＮａＣ！、１同Ｍ　
ＥＤＴＡ中のＬｏｎｇ７ｘｌｌの臭化エチジウム０．５
ｍｌを加えた。溶液を５／８ｉｎ、Ｘ　３ｉｎ。

の２本の遠心管に移し、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｔｉ７０ロー
ターで５０Ｋ　ｒｐｍ、１７℃で３０時間回転した。プ
ラスミドを収集するために管を開け、紫外線を照射し、
２つの蛍光バンドの下側のバンドを注射器で採取した。

容管からの下側のバンドを合わせ、水で飽和し、ＣｓＣ
ｌ□で飽和した等容量のイソプロパツールアルコールで
３回抽出することにより臭化エチジウムを除去した。

抽出した溶液を４倍容量のＤＮＡ緩衝液で希釈した後、
２倍容量のイソプロパツールを加えることにより核酸を
沈降させた。溶液を一７０℃で３０分間放置した後、１
５Ｋ　ｒｐｍ、　４℃で１５分間遠心分離した。

上清を捨て、ペレットを３０分間風乾した後、１ｉ＋１
の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，ｏ、１１６８　ＥＤＴ
＾に溶解させ、４℃で保存した。プラスミドＤＮＡ濃度
は約２００ｕｙ／ｚｊ’であった。

６、プラスミドライブラリーの消化：　４ｕｙ（２０ｐ
ｆｆｉ）の１ラスミドライブラリーを１００ｐ１のＮｌ
ａＩＶ制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，４，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０Ｉ
ＩＭ　２−メルカプトエタノール（ＮＨ４）２ＳＯ４）
で希釈した。８単位（８ｕ１）の旧ａｆＶ制限エンドヌ
クレアーゼを加え、管を３７℃で２時間インキュベート
した。２０μ！のクロロホルムで抽出することにより反
応物を滅菌し、次に１５秒間マイクロ遠心分離により清
澄化した。

７、形質転換：　２０，１（０．８同）の消化ライブラ
リーを１００、１のＳＳＣ／ＣａＣ　ｌ　２（セクショ
ン３）及び２００１ｍの水冷したコンピテント大腸菌Ｒ
ＲＩと混合した．混合物を３分間で４２℃に加温し、次
に１００μｇ７ｚ１のアンピシリンな含有するし一寒天
に接種した．プレートを３７℃で一晩インキユベートし
た．旧ａＦ／で消化すると、形質転換細胞の数は未消化
のプレートによる形質転換に比較して１０４分の１に減
少した。ＮｌａＩＶ消化後に９個のコロニーが形成され
たので、アンピシリンを含有するし一プロス１０ｍＮに
各々を接種し、ミニ培養物を調製し、アンピシリンを含
有するし一寒天プレートに画線培養し、マスターストッ
クを調製した。

８、残存個体の分析：セクション７から得られた９個の
残存コロニーを１０１１の培養物に増殖させ、Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｎ及びＤｏｌｙ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ
　Ｒｅｓ．　７：　１５１３（１９７９）の方法の変形
である以下のミニブレツブ（ｎｉｎｉｐｒｅｐ）精製手
順により、これらのコロニーが担持さするプラスミドを
作成した。

ミニブレツブ手順：各培養物を８Ｋ　ｒｐｍで５分間遠
心分離し、上清を捨て、ＩＨ７ｚ１のリゾチームを含有
する１．０１の２５ｎＭ　Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ　ＥＤＴ
＾、５０ｍＭグルコース、ｐＨ８．０に細胞ベレットを
再懸濁させた。

室温で１０分間放置後、２．０１の０．２８　ＮａＯｔ
ｔ、１％ＳＯＳを容管に加え、管を振蕩して細胞を溶解
させた後、氷上に置いた。溶液が澄んだら、１．５ｚｆ
の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８を容管に加え、振蕩
した。形成された沈降物を１５Ｋ　ｒｐｍ．　４℃で１
０分間回転させた。３１．１のイソプロパツールを収容
する遠心管に各上清を注入し、混合した．室温で１０分
間放置後、管を１５Ｋ　ｒｐｍで１０分間回転させ、沈
降した核酸をベレット状にした。上清を捨て、ベレット
分室温で３０分間風乾した。ペレットが乾燥したら、１
００１１ｇ／Ｊ１ＮのＲＮアーゼを含有する５００１Ｊ
１の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍＭ　ＥＤＴ＾、ｐｌ＋８
．０に溶解させ、３７℃で１時間インキュベートし、Ｒ
ＮＡを消化した。５０１Ｊ１の５８　ＮａＣｌ、次いで
３５０ｕ１のイソプロパツールを加えることによりＤＮ
Ａをもう１回沈降させた。室温で１０分間放置後、ＤＮ
Ａを２分間遠心分離により回転させ、上清を捨てた．ペ
レットを室温で３０分間風乾した後、１５０，ｆの１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｉＭ　ＥＤＴ＾、ｐＨ８，０に再溶
解させた。

その後、プラスミドミニプレツブを旧ａｌＶ及びＨｉｎ
Ｐ　Ｉで消化することにより分析した。

９、　ＮｌａＩＶメチラーゼ遺伝子クローり二分析した
９個のプラスミドのうち１個はＮｌａＩＶ消化に対して
感受性であり、Ｎ、　ｌａｃｔａｍｉｃａ　ＤＮＡの種
々の旧ｎＰＩフラグメントを有することが判明した。こ
のプラスミドはスプリアスであるので廃棄した。残りの
８個のプラスミドは、Ｎｌａ　■消化に対して耐性であ
り、共通して１．１２Ｋｂ及び０．９０Ｋｂの旧ｎＰｌ
フラグメントを有することが判明した。プラスミドはい
ずれも別の共通フラグメントを有しており、これらのフ
ラグメントは恐ら＜　１．１２及び０．９０Ｋｂフラグ
メントに隣接する染色体であると仮定される。４個の異
なるプラスミド構築物が得られ、これらはほぼ同一量の
旧ａＦ／エンドヌクレアーゼを産生ずることが認められ
た。クローンｐＲＭ１２６ＲＭ　１２２−５はＮ。

ｌａｃＬａｍｉｃａ　ＤＮＡの量が最小、即ち３．８Ｋ
ｂであったので、更に詳細に分析（第２図）するために
選択した。他のＲ”Ｍ’クローンの寸法は４．８Ｋｂ（
ｐＲＭ１２６ＲＭ１２２−７）〜６．３Ｋｂ（ｐＲＭ１
２６ＲＭ　１２２−８）であり、夫々ｐＲＭ１２６ＲＭ
　１２２−５と同様に少なくとも２．８ＫｂのＮ。

ＩａｃＬａｍｉｃａ　ＤＮＡを含んでいた。

１０、　Ｎｌａ■制限遺伝子クローン：　ｐＲＭ１２６
ＲＭ　１２２−５及び類似のプラスミドは、プラスミド
を担持する大腸菌ＲＲＩの抽出物をアッセイすることに
より、Ｎ１ａｌＶ制限エンドヌクレアーゼをコード及び
発現することが判明した。

エンド　フレ　−ゼアッセ アッセイすべき細胞培養物２５０ｍ１を、１００μｇ７
ｘｉのアンピシリンを含有するし一ブロス中で３７℃で
一晩増殖させた。培養物を８Ｋ　ｒｐｍで５分間遠心分
離し、細胞ベレットを１０１１の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　２−メルカプトエタノ
ール、１ｍＭ　ＭｇＣｌ□に再懸濁させた。１５秒間の
バーストを３回加えることにより１．５ｚｉ’の懸濁液
を弱く音波処理し、細胞分裂させた。音波処理した抽出
物を５分６間マイクロ遠心分離し、細胞破片を除去し、
次のようにして上清のエンドヌクレアーゼ活性をアッセ
イした。

８μｇ（ｈｌ）ノ１７１　’ＩＪ　Ｌ　タフ　ｙ−ジｐ
ｈｉＸ１７４　ＲＦＩ　ＤＮＡを４００μｌの旧ａｌＶ
制限エンドヌクレアーゼ消化ＭｉＩ液くセクション６）
で希釈した。溶液を７本の管にし分配し、第１の管には
７５μ！、残りの６本の管には夫々５０．１ずつ入れた
。抽出物１３．５μｌを第１の管に加え、ＤＮ八へｇ当
たり抽出物９μｌどなるようにした。

次に第１の管から２５１１１！を取り出し、第２の管に
移し、３ｕｌ／ｌＪｇとなるようにした。２５μｌずつ
連続的に収り移し、第３の管（１μｍ７μＪ）、第４の
管（０，３μｍ／ｕｙ）、第５の管（０，１μｆｆｉ／
ｐｙ）、第６の管（０，０３μｍ７μ２）及び第７の管
（０，Ｏｂ＋／／１１ｙ）となるようにした、管を３７
°Ｃで１時間インキュベートした後、各々の管から２０
１Ｊ（ｌずつとってゲル電気泳動により分析した。

抽出物は約１×１０３単位７ｘｉの旧ａｌＹ制限エンド
ヌクレアーゼ（ｍ胞１当たり約ｌＸｌ０’単位に相当）
を含有していることが判明した。

１１、　ｐＲＭ１２６ＲＭ　１２２−５を有する大腸菌
ＲＲＩは、ＮｌａＩＶ制限エンドヌクレアーゼを精製す
ることが可能な好適な宿主である。株はアンピシリンを
含有するし一ブロス中で発酵槽内で３７℃で定常期まで
増殖すべきである。次に細胞を遠心分離により収集し、
すぐに分裂させて抽出物を調製するか、又は抽出物の調
製に都合よくなるまで一７０℃で凍結保存へきであする
。

【図面の簡単な説明】

第１図は旧ａｌＶ制限エンドヌクレアーゼをクローニン
グ及び産生させるためのフローチャート、第２図は旧ａ
［Ｖ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコー
ドするＮ、　Ｉａｃｔａｍｉｃａ　ＤＮＡの３，８Ｋｂ
　Ｈｉｎｒ’　ｌフラグメントの制限地図であり、フラ
グメントはｐＲＭ１２６ＲＭ　１２２−５を作成すルタ
メニｐＵＣ１９（＾ＴＣＣ３７２５４）のへｃｃ１部位
にクローニングしたものであり、第３図はｐＲＭ１２６
ＲＭ　１２２−５を担持する大腸菌ＲＲＩ（ΔＴＣＣ３
１３４３）の細胞抽出物におけるＮｌａＩＶ制限エンド
ヌクレアーゼ活性を立証するアガロースゲルの粒子写真
の写真である。尚、レーン２〜８及び１０〜１６は、基
質としてλＤＮＡくレーン２〜８）及びＰｂ１Ｘ１７４
　ＤＮＡ（レー　ン１０〜１６）を使用するコトにより
、プラスミドρＲＭ１２６ＲＭ　１２２−５を担持する
大腸菌ＲＲＩからの粗抽出物の連続希釈液（総反応容量
５０．１中のＤＮＡｕｇ当たりの抽出物μｌで表す）を
形成したものである。２ｇの細胞を１０ｍ１のＭ衝液に
懸濁させ、音波処理により破壊した０反応は３７℃で１
時間行った。レーン２及び１０は９．（１、レーン３及
び１１は３−、レーン４及び１２は１１Ｊ１、レーン５
及び１３は０．３ｕｌ、レーン６及び１４は０．１．Ｚ
、レーン７及び１５は０．０３μｌ、レーン８及び１６
は０．０１μ！である。レーン１及び９は１ＩｉｎｄＩ
［［−＾及びＨａｅｌＩ［−ＰｈｉＸの分子量標準であ
る。 手続補正書 （方式） ％式％ 事件の表示 平成１年特許願第１９６４２３号 ２゜ 発明の名称 旧１１Ｖ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造
方法 ３゜ 補正をする者 事件との関係

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＮｌａIV制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むク
   ローニングベクター。
2. （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含む形
   質転換宿主。
3. （３）ＮｌａIV遺伝子がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔ
   ａｍｉｃａ　ＮＲＣＣ２１１８から切り出されることを
   特徴とする請求項１に記載のクローニングベクター。
4. （４）ＮｌａIV修飾遺伝子を含んでいるクローニングベ
   クター。
5. （５）請求項４に記載のクローニングベクターを含む形
   質転換宿主。
6. （６）（ａ）Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａのＤＮＡからライ
   ブラリーを形成する段階と、 （ｂ）ＮｌａIV修飾遺伝子を含むクローンを単離する段
   階と、 （ｃ）修飾遺伝子を含むクローンをスクリーニングする
   段階と、 （ｄ）更にＮｌａIV制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をも
   含むクローンを単離する段階と を含む、ＮｌａIV制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロ
   ーニング方法。
7. （７）（ａ）Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ　ＮＲＣＣ２１１
   ８からＤＮＡを精製する段階と、 （ｂ）精製したＤＮＡを消化し、ＤＮＡフラグメントを
   形成する段階と、 （ｃ）フラグメントをクローニングベクターに連結する
   段階と、 （ｄ）宿主細胞を段階（ｃ）のクローニングベクターで
   形質転換させ、細胞ライブラリーを形成する段階と、 （ｅ）細胞ライブラリーから組換体ベクターを精製し、
   プラスミドライブラリーを形成する段階とによりライブ
   ラリーを形成することを特徴とする請求項６に記載の方
   法。
8. （８）クローニングベクターがｐＵＣ１９であることを
   特徴とする請求項７に記載の方法。
9. （９）宿主細胞が大腸菌株ｍｃｒＢ＾−及びｈｓｄＲ＾
   −であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
10. （１０）プラスミドライブラリーをＮｌａIVで消化して
    消化プールを形成する段階と、消化プールを宿主細胞に
    形質転換する段階と、修飾遺伝子を含むクローンを選択
    する段階とにより、ＮｌａIV修飾遺伝子を含むクローン
    を単離することを特徴とする請求項７に記載の方法。
11. （１１）（ａ）Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａからＤＮＡを精
    製する段階と、（ｂ）精製したＤＮＡを適当な制限エン
    ドヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡフラグメントを形成す
    る段階と、（ｃ）フラグメントをクローニングベクター
    に連結し、ＤＮＡ混合物を形成する段階と、 （ｄ）宿主細胞を段階（ｃ）のＤＮＡ混合物で形質転換
    させ、ライブラリーを形成する段階と、 （ｅ）ＮｌａIV修飾メチラーゼ遺伝子を含むクローンを
    単離する段階と、 （ｆ）ＮｌａIV修飾メチラーゼ遺伝子を含むクローンを
    スクリーニングし、更にＮｌａIV制限エンドヌクレアー
    ゼ遺伝子も含むクローンを単離する段階と、（ｇ）段階
    （ｆ）のクローンを含む宿主細胞を培養する段階と、 （ｈ）ＮｌａIV制限エンドヌクレアーゼを培養物から回
    収する段階と を含む、ＮｌａIV制限エンドヌクレアーゼの製造方法。
12. （１２）クローニングベクターがプラスミド又はウィル
    スＤＮＡ分子であることを特徴とする請求項１１に記載
    の方法。
13. （１３）プラスミドがｐＵＣ１９であることを特徴とす
    る請求項１２に記載の方法。