JPH01137984A - Ａｆｌ２制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、八ｆｔ　ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修
飾メチラーゼのためのクローンと、該クローンから酵素
を生産することとに関する。

制限エンドヌクレアーゼは細菌内に自然発生ずる種類の
酵素である。制限エンドヌクレアーゼをその他の汚染細
菌成分から精製すると、制限エン１〜ヌクレアーゼは、
ＤＮＡ分子を正確なフラグメントに切断するために実験
て使用することがてきる。

この特性によってＤＮＡ分子は独自に同定され且つ構成
遺伝子に細分化され得る。制限エンドヌクレアーセは現
代の遺伝子研究においては不可欠な道具とされている。

これらは、遺伝子工学及び分析を実施する生化学の「ハ
サミ」である。

制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿ってヌクレ
オチドの特定の配列（「認識配列」）を認識し、それに
結合することによって（慣用する。−旦結合したならは
、制限エン１〜ヌクレアーセは配列内で又は配列の一方
の側で分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼ
は異なる認識配列に対する親和性を有している。今日ま
でに調査された多数の細菌種において、１００種類に近
い種々の制限エン１〜ヌクレアーゼが同定された。

細菌は、押当たりではわずかな種類の制限エンドヌクレ
アーゼしか所有しない傾向にある。エンＩ・ヌクレアー
ゼは通常は、それらか誘導される細菌に従って名イ」け
られる。即ち、ｌｌａｅｍｏｐｈ　ｉ　ｌ　ｕｓａｅｇ
ｙｐｔｉｕｓ種は例えば、１ｌａｅ　Ｉ　、ｌ１ａｅ　
ｎ及びｌ１ａｅＩＩｌと称される３種の異なる制限エン
ドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素はそれぞれ配
列（ＡＴ）ＧＧＣＣ（八Ｔ）、ＰｕＧＣＧＣＰｙ及びＣ
ＧＣＣを認識及び切断する。

理論に制約されたくはないが、実際のところ制限エンド
ヌクレアーゼは細菌細胞の繁殖において防御の役割を果
たすと考えられる。制限エンドヌクレアーゼは、細菌を
死滅させたり又は細菌に寄生するであろうウィルス及び
プラスミドのような外来ＤＮＡ分子による感染に細菌か
抵抗てきるようにする。制限エンドヌクレアーセは、感
染ＤＮＡ分子の長さを走査し、認識配列かある毎にそれ
を切断することによって抵抗力を与える。行なわれる切
断は多くの感染遺伝子を無効にし、ＤＮＡを、非特異的
なエン１〜ヌクレアーゼによる更なる分解に対して敏感
にする。

細菌防御系の第二成分は修飾メチラーゼである。

これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼに対して相補的
であって、細菌がそれ自体のＤＮＡを防御てき且つそれ
自体のＤＮＡを外来の感染性ＤＮＡから区別できる手段
を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌ
クレアーゼと同しヌクレオヂト認識配列を認識及び結合
するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基をイ」加
することによって配列内の１つ又はそれ以」二のヌクレ
オチドを化学的に修飾する。メチル化に続いては、認識
配列は制限エンドヌクレアーゼによってそれ以上結合も
切断もされない。細菌細胞のＤＮＡは常にその修飾メチ
ラーゼの活性によって完全に修飾されており、従って内
在制限エンドヌクレアーセの存在には完全に影響されな
い。制限エンドヌクレアーゼの認識及び攻撃に敏感であ
るのは未修飾、従って同定可能な外来ＤＮＡのみである
。

遺伝子工学技術の出現とともに、通常の精製技術によっ
て得られるよりも大量に、遺伝子をクローニングしてそ
の遺伝子がコードするタンパク質及び酵素を生産するこ
とが今や可能である。制限エン１〜ヌクレアーゼ遺伝子
のクローンを単術する鍵となるのは、クローンか１０−
３〜１０−４という低頻度で発生する場合に、複合「ラ
イブラリー」、即ち「強制的」方法によって誘導される
クローン群中てこのようなりローンを同定する単純且つ
信頼性のある方法を開発することである。好ましくは、
大半の不要なりローンが破壊されながらも所望の珍しい
クローンが生き残るような選択的な方法であるへきであ
る。

タイプ■制限−修飾系は頻度を増しながらクローン化さ
れる。第一　クローン系は制限エンドヌクレアーゼクロ
ーンを同定及び選択する手段としてバクテリオファージ
感染を使用した（ＥｃｏＲＵＫｏｓｙｋｈ　ｅｔ　　ａ
ｌ、、Ｍｏ１ｅｃ４ｅｎ、Ｇｅｎｅｔ　　１７８ニア１
７−７１９゜（１９８０）；ＩＩｈａＨ：Ｍａｎｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　３：９７−１１２．（１９７８
）；Ｐｓｔ　Ｉ　　：Ｗａｌｄｅｒ　　ｅｔ　　ａｌｌ
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、７８：１５０３
−１５０７．　（１９８１）））。細菌内に制限−修飾
系が存在すると細菌はハクデリオファージによる感染に
抵抗することがてきるのて、クローン化制限−修飾遺伝
子を担持する細胞は、原則として、ファージに暴露され
たライブラリーからの生存個体として選択的に単重され
得る。しかしこの方法は限定的な価値しか持たないこと
が分かった。特に、クローン化制限−修飾遺伝子は、選
択的に生存させるのに十分なファージ抵抗を常に現すわ
けではないことが分かった。その他のクローニンク手段
には、最初にプラスミド担持と特徴付けられる系をＥ、
ｃｏｌｉクローニングプラスミドに形質転換することを
含む（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ、　ｅｔ　
ａｌ、、Ｎｕｃｌ八ｃｉへ。

Ｒｅｓ　、　１２　：　３６５９−３６７６　、１９８
４　；　ＰａｅＲ７：Ｇ　ｉ　ｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏ
ｏｋｓ、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ　　Δｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
Ｓ八　８０：４０２−４０６゜１９８３；Ｔｌ＋ｅｒｉ
ａｕｌｔ及びＲｏｙ、Ｇｅｎｅ　１９：３５５−３５９
，１９８２；Ｐｖｕｌｌ　：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ　　
ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６４＋５
０１−５０９．１．９８５）。最後に、本発明者の特許
出願第７０７０７９号明細書によれば、活性メチラーゼ
遺伝子に対する選択によってクローン化される系の数は
増えている（ＢｓｕＲＩ　：Ｋ１５ｓ　ｅｔ　ａｌ、、
Ｎｕｃｌ、Δｃｉｄ、Ｒｅ５１３　：６４０３−６４２
１　、１９８５）。制限及び修飾遺伝子は近くて結合さ
れていることが多いので、両遺伝子はしばしば同時にク
ローン化され得る。この選択は常に完全な制限系を与え
るわけてはないが、代わりにメチラーゼ遺伝子のみを与
える（［１ｓｐＲＩ・Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｇｅｎｅ　１０：２１９−２２５．（１９８０）
；１１ｃｎ　　ｌ　　：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ　　ｅｔ
　　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　　２０：１９７−２０４゜（１
９８２）　；ｌ］ｓｕＲＩ　：Ｋ１５ｓ及びＢａ１ｄａ
ｕｆ、Ｇｅｎｅ　２］：１１ゴー］、１．９．　（１，
９８３）　、並ひにＭｓｐＪ　：Ｗａｌｄｅｒ　ｅｌ　
ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃ１＋ｅｍ、２５８：１２３５−１２４１　、　（１９
８３））。

系によっては、エンドヌクレアーゼ遺伝子を修飾によっ
てまた保護されていない宿主に導入しようとすることに
クーニンクの問題点がある。メチラーゼ遺伝子及びエン
ドヌクレアーゼ遺伝子が共通のＤＮＡフラグメン１〜」
二に導入される場合、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主
のゲノムを切断する前にメチラーゼ遺伝子は宿主を修飾
若しくは保護ぜねばならない。

Ｅ、ｃｏｌｉにおいてこれらの系をクローニングするそ
の他の障害が、種々のメチラーゼをクローニングする方
法で発見された。（クローニングに通常使用されるもの
を包含する）多くのＥ、ｃｏｌｉ株は、シ１−シンメチ
ル化を包含するＤＮへの導入に抵抗する系を有する（Ｒ
ａｌｅｉｇｂ及びＷｉｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Δｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳΔ８３：９０７０−９０７４
．１９８６）。従−ンて、クローニングにとのＥ、ｃｏ
ｌｉ株を使用するか慎重に考慮する必要がある。

精製制限エンドヌクレアーセ及び、精製制限エン１〜ヌ
クレアーゼ程ではないか修飾メチラーゼは、実験におい
てＤＮＡを特徴付けて再配列するための有効な道具であ
るのて、組換えＤＮＡ技術によってこれらの酵素を豊富
に合成する細菌の株を得ようという工業的な動機１」（
つがあるのである。このような株は、精製処理を単純化
し且つ工業的に有効な量で生産する方法を提供するのて
有益であろう。

１哩Δ］」 本発明は、Ａｎａｂａｅｎａ　ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ由
来の、へｆｐ■制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラ
ーゼのための遺伝子を含有するクローニングを提供し、
更に該酵素の生産方法に関する。更に１．１゛定すると
本発明は、制限エンドヌクレアーセＡｆｌ　ＩＩを表現
するクローンと、ＤＮＡ配列ＣＴＴΔ八Ｇへ認識してＣ
及びＴ残基間を切断する酵素とに関する。Ｗｈ　ｉ　ｔ
ｅｈｅａｄ　。

Ｐ、Ｒ，及びＢｒｏｕｕ＋　Ｎ、Ｌ、、１９８５．Ｊ、
Ｇｃｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３］９５１−９５８を
参照し、その開示内容は参照により本明細書に包含され
るものとする。本発明に従って生産されるΔｆａ■制限
酵素エンＩ・ヌクレアーゼは実質的に純性であって、１
旨Ｌ　ｅ　ｌ＋　ｅ　ａ　ｄ及び゛Ｂｒｏ田１】。

１ｌ− ｓｕｐｒａによって記述されたような通常の手法による
八ｆｔ　ＩＩ調製に通常見られる汚染物は含有しない。

この酵素をクローニングするための好ましい方法は、Ａ
ｎａｂａｅｎａ　ｆ　１ｏｓ−ａｑｕａｅ由来のＤＮＡ
を含有するライブラリーを形成し、へｆｐ■修飾メチラ
ーゼをコートするＤＮＡを含有するクローンを単離し、
これらを選別して八ｆｔ　ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子も含有するものを同定することから成る。

１吐１哩 本発明はＡｆｎ　ＩＩ制限及び修飾遺伝子のクローンと
、該クローンから生産される制限エン１〜ヌクレアーゼ
ΔｆＮＩＩとに関する。Δｆｐ■遺伝子は、Ａｆβ■修
飾若しくはメチラーゼ遺伝子を含有及び表現するかとう
かによって選択される成る種のクローンはへｆＮＩＩ制
限遺伝子も含有することを利用する方法によってクロー
ン化される。このようなりローンのＤＮＡ１ｉＡｆρ■
制限エンドヌクレアーゼによるｉｎｖ　ｉ　ｔｒｏ消化
に抵抗性がある。この消化に対する抵抗性からへｆＮＩ
Ｔメチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼをコードする
クローンを選択的に単離する手段ができる。

ΔｆｌＨ制限逍伝子及びメチラーゼ遺伝子を好適にクロ
ーン化して表現する本発明の方法を第１図に示しである
。該方法は以下のステップを包含する。

１　、　Ａｎａｂａｅｎａ　ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅのＤ
ＮＡを精製する。

Ａｎａｌ〕ａｅｎａ　ｆ　Ｉｏｓ−ａｑｕａｅは参照の
ため本明細書に包含されるＷｈｉＬｅｈｅａｄ及びＢｒ
ｏｕＩｎ　、　５ｕｐｒａを含む多数の文献に記述され
ている。この藻類のサンプルはＣａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆΔ１Ｈａｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏ
ｔｏｚｏａ。

Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎ８１ａｎｄ　　ｕｎｄｅｒ　
　Δｃｃｅｓｓｉｏｎ　　ｎｏ、ＣＣ八へ　　１４０３
／１３ｆ及びＣａｍｂｉｏ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　
ｏｆ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄから入手可
能である。

２、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ　Ｕを用いて前記Ｄ
ＮＡを一部消化する。

３、前記消化ＤＮＡを、ＡｆｌＩＩ部位を含有する１１
　Ｂ　Ｒ３２２誘導体のようなりローニングヘクターに
連結する。このようなヘクターで好ましいものの１つに
は、Ｌａｂｏｆｉｎｅ　ＳΔ　ｏｆ　Ｆｅ１ｕｙ、Ｂｅ
ｌｇｉｕｍがら得られるｐ、ＩＲＤ１８４がある。得ら
れた混合物を使用してＥ、ｃｏｌｉ　Ｒ旧細胞のような
適当な宿主を形質転換する。

４、　、　ＤＮＡ／細胞混合物を、アンピシリンにょう
な改質転換細胞に対する選択性がある抗生媒体」二に置
く。インキュヘーション後、形質転換細胞コロニーを１
つの培養液、即ち主細胞ライブラリー中に一緒に回収す
る。

５、組換えプラスミドを主細胞ライブラリーがらｉｎ　
１．ｏｔｏ精製して主プラスミドライブラリーを形成す
る。

６、次いて、へｆｌＨ制限エンＩ（ヌクレアー七を用い
てグラスミ１〜ライブラリーを完全にｉｎ　ｖｉｔｒ。

消化する。前記制限エンＩ・ヌクレアー七は、Ｗｌ＋１
ｔｅｂｃａｄ及びＢｒｏ＋＋ｕ＋、□により記述された
方法にほぼ同様の方法て八ｎａｂａｅｎａ　ｆ　１ｏｓ
−ａｑｕａｅ細胞から調製したが、但し、ｉ）第一セフ
ァロース４Ｂクロマトクラフィーステップを省略した；
１ｉ）ＤＥΔＥクロマトクラフィースデップを省略した
・且つ１ｉｉ）モノＱ−ＦＰＬＣクロマトり゛ラフイー
ステップをヘパリン−セファロースクロマトクラフィー
ステップの後に実施した点が異なる。Δｆｌ■制限エン
ｌ−’ヌクレアーゼ消化は未修飾でメヂラーセ非含有の
クローンの選択的切断を引き起こし、その結果ＡｆｌＩ
Ｉメチラーセ担持クローンの相対頻度が増大する。

エキソヌクレアーゼ及び／又はホスファターゼを、非メ
ヂラーセクローンの切断を増強するために消化液に添加
することもできる。

７、消化プラスミドライブラリーＤＮＡはＥ、ｃｏｌｉ
株ＲＲＩのような便宜的な宿主に形質転換し返され、形
質転換コロニーは抗生プレー１〜上に置くことによって
ここても１６られる。コロニーをピックアップし、それ
らのＤＮＡをへｆＩ！Ｈ修飾遺伝子が存在する一］５− か次の様に分析した。即ち、それらが担持するプラスミ
ＦＤＮへを精製し、Δｆ１１１制限エンドヌクレアーセ
を用いて則ｖ　ｉ　ｔｒｏインキュへ一トシて八ｆｔ　
ＩＩによる消化に抵抗性があるがとうか決定する。クロ
ーンの全細胞ＤＮＡ（染色体びプラスミド）も精製し、
八ｆｔ！　ｎ制限エキソヌクレアーゼを用いてインギュ
ｌ＼−１〜する。へｆρ■メヂラーセ遺伝子を担持する
クローンのＤＮＡは完全に修飾されるべきてあり、プラ
スミドＤＮＡ及び全ＤＮへの両方とも実質的に又は完全
に消化に対する抵抗性が見られるべきである。

９　Δｆβ■制限エンドヌクレアーゼを担持するクロー
ンを、ＡｆｌＩＩメチラーゼ遺伝子を担持するとステッ
プ８て同定されたクローンのイ■抽出物を調製し、へｆ
ｐ■制限エンドヌクレアーゼ活性に対する抽出物を評価
することによって同定する。

１０、発酵器内アンピシリンを含有する富栄養な媒質中
で増殖させることによってへｆ１１！■制限及び修飾遺
伝子を担持するクローンからＡｆβ■制限エンドヌクレ
アーゼを生産することができる。そして細胞を遠心分画
によって採取し、音波処理により破壊して、へｒｐ■制
限エンｌ〜ヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞抽出物を
生産する。

１１　　Δｆρ■制限エンドヌクレアーゼ活性を含有す
る前記ｍ細胞抽出物を、アフィニティークロマ１〜クラ
フイー又はイオン交換クロマ１〜クラフイーといった標
準的なタンパク質精製法によって精製する。

上記ステップは本発明を実用化するための好ましい態様
を代表するか、」二層方法は当業界で公知の手法に従っ
て変更し招−ることは当業者には明らかてあろう。

以下の実施例によって、目下のところてブ用化に好まし
い本発明の詳細な説明する。諸実施例は説明のためのも
のであって、付随の特許請求の範囲に記述された辺外に
は本発明はこれらの実施例に制限されない。

実施例Ｉ へｆρ■制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニ乙ム １、ＤＮＡ精製・Δｎａｂａｅｎａ　　ｆ　１ｏｓ−ａ
ｑｕａｅ　　ＣＣ八へ’１４０３／１３ｆのＤＮＡを調
製するために、細胞ペース１〜１ｇｍを０、Ｉ　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｐ、０．Ｉ　Ｍ　ＥＤＴ八ｐへ７．６５ｍ
ｎ中に再懸濁させた。懸濁液を２．５ｍ＋２ずつ２つの
画分に分割した。０．Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＲ，０
，１Ｍ　ＥＤＴΔｐＨ７，６中の１．７ＩＴＬｆ９／ｍ
βリソデーム３．５ｍＲを各両分に加え、各々を３７℃
で１５分間インキュへ一トシた。ＳＤＳを１％になるま
で加え、プロテイナーゼＫをＯ，］、３ｍｙ／＋ｎｆま
て加え、次いて両分を３７℃で１時間インキュベー１〜
した。１０％ＳＯＳ及び８％ザルコシル（ｓａｒｃｏｓ
ｙｌ）溶液０．４…βを各々に加え、更に５５℃で２時
間インキュベー１へした。次に２つの画分を一緒にし、
ＤＮＡ緩衝液（１０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｆＪ）、］
＋ｎＭ　ＥＤＴ八ｐへ８．０）を４回変えて２４時間透
析した。最初の透析の後、ＤＮＡ溶液を１、７　、　Ｏ
ＯＯｒ　１１　ｍで１０分間遠心分雛して固体片を除去
した。透明な上澄みを透析試験管に戻して透析を継続し
た。透析したＤＮＡ溶液を、ＤＮΔ緩＠液を用いて容積
を４０ｍｆ／、に増やすことによって塩化セシウム−エ
ヂジウムブロミト平衡密度遠心分離のために調製し、そ
のＤＮＡ溶液を２０　ｍ　Ｉずつ２つの両分に分割し、
各々に塩化セシウム２０クラム及び５　Ｉｌｌ　ｇ　／
　ｍ　ｊ！エチジウムプロミド０．２…βを加えた。Ｄ
ＮＡ溶液をイ４，０００ｒ　ｌ］　ｍて４８時間遠心分
離し、得られたＤＮへの帯域を注射器及び１８ケージ針
を用いて除去した。塩化セシウムは透析によって除去し
た。当量の氷温の水飽和Ｎ−ブタノールを用いて４回抽
出してエヂジウムフロミトを除去した。次にイソプロピ
ルアルコールを用いてＤＮＡを沈澱させ、最終濃度的１
００μｇ　／　＋ｎ　Ｉ。

になるようにＤＮΔＫＩＷｆ液中に再溶解さぜな。

２一部消化、精製ＤＮへをＸｈｏｌｌを用いて切断し次
のように一部消化した：］ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，
５，１０ｍＭＭｇＣＬ　、　１０＋ｎＭメルカプ ）ｔｇ／ｍｌのＤＮＡ０．３…βを１つの１００μｆア
リコートと４つの５０μｌアリコ−１へとに分割した。

１００μβ試験管にはＸｈｏｌｌ６．４部を加えてＤＮ
Ａ１　）ｔ．　ｇ当たり酵素０、８部を得た。第一試験
管から５ｏＪ１．ｐを取り出して第二試験管に移してＸ
ｈｏｆｆｏ．４部／μｇを得る等、各々次の試験管は先
の試験管の半分の量のＸｂｏＩ［を受容しな。試験管を
３７°Ｃて１時間インキュベー１・し、次いて７２°Ｃ
て１５分間熱処理し、各々から１０μｐすつとってアカ
ロースケル電気泳動によって分析した。適度に不完全な
消化を示す試験管をクローニン２のための一部消化フラ
クメン１〜源として選択した。（これらは０．４１＋／
μｇ、０２ｕ／μｇ及び０、１ｕ／μｇ試験管であった
。３つの溶液を一緒に混合し下記のように使用した。） ３、連結．フラクメン１〜にされたＤＮＡを次のように
連結して１１　Ｊ　Ｒ　Ｄ　１８　４にした：Ｘｈｏｌ
Ｔー一部消化Δ．ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ　ＤＮＡ４．Ｏ
ＪＪ．ｇ（６０μＮ）をＢａｍｌｌｌ−切断及び脱リン
化ｐＪＲＤ１８４　２．Ｏｕ　ｇ（２．５μｍ）と混合
した。ＩＯＸ連＝２０− 結ミックス（５００＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７、５，１
００ｍＭ　Ｍ８ＣＬ，１００ｍＭ　ＤＴＴ，　５　ｍＭ
ΔＴＰ）１０ＪｉＮを加え、更に殺菌蒸留水２７５μｐ
を加えて最終容積１００μβとした。Ｔ４　ＤＮＡリガ
ーゼ３７５μりを加え、この混合物を１７°Ｃて４時間
インキュベー１−　してからクロロホルム１０μジを加
えて殺菌した。約８０μｐの連結ＤＮＡを使用してＥ．
ｃｏｌｉ株１１１１４を次の様に形質転換した：ＤＮＡ
を１．０…βのＳＳＣ／ＣａＣＬ（５０ｍＭ　ＮａＣＬ
、５１１１Ｍ　Ｎａ３シトレート、６７ｍＭ　ＣａＣＩ
，）と氷上て混合し、氷温のコンピデンｌＥ．ｃｏｌｉ
　ＲＲＩ（ｈｓｄ　Ｒ　Ｍ　、ΔＴＣＣ　Ｎｏ．３１３
４３）細胞２０ｍｌを加えた。４３°Ｃて６分間インキ
ュへ−１へした後にルリアブイヨン（Ｌ−ブイヨン）８
…βを加えて希釈し、３７°Ｃて４時間インキュベー１
へした。

４　主細胞ライブラリー、形質転換細胞培養液を簡単に
遠心分離し、」二澄みを廃棄し、細胞をＬ−ブイヨン１
．０…β中に再懸濁さぜな。両分２００μｌを、アミピ
シリン１００μｇ　／　ｍβを含有するルリアー寒天（
Ｌ−寒天）プレー１・上に置いた。３７℃で−晩インキ
ュべ−１・した後に、プレー１へをそれぞれ、１０　＋
ｎ　ＭＴｒｉｓ　ｐＨ７，５，］、Ｏ＋ｎＭ　ＭｇＣＬ
　２．５ｍｌに浸漬し、形質転換されたコロニーを一緒
に掻き取って集めて主細胞ライブラリーを形成した。

５　主プラスミ１へライブラリー主プラスミドライブラ
リーを次の様に調製した。主細胞ライブラリー２．５ｍ
Ｎを、１００μｇ　／　ｍ　ｎアミピシリンを含有する
Ｌ−７４３７５００ｍＮ中に接種した。培養液を３７°
Ｃて一晩震盪させてから４０００　ｒ　ｌ］　Ｉｌｌで
５分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、細胞小球を２５
％スクロース、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　１）１１８．０１
０ｍｆに室温て再懸濁さぜた。

０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐｌ＋　８．０５　＋ｎＮを加
え、続いて０．２５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８，ｏ中の１．０
　ｍ　ｇ　／　＋ｎ　１リゾデ一ム３ｍ／を加えた。

溶液を氷」−に１時間放置し、次いて溶菌ミックス（１
％Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００，５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
、ｐｌ＋８．０，６７ｍＭ　　ＥＤＴＡ）１、２　＋ｎ
　１を勢いよくピペッｌ−て滴下し、細胞懸濁液を溶菌
するまて静かに渦流動させた。溶菌後、混合物を５０　
ｍ　１１！プラスチック製遠心分術管に移し、１．７０
００　ｒ　ｐ　ｍ、４°Ｃで４５分間回転させた。ビペ
ッ１〜を用いて」二澄みを除去した。固体ＣｓＣＮ２０
．Ｏｇｍを計量して５０１ｎβプラスチツク製ねじ蓋試
験管に入れ、上澄み２２．０部ｍをその試験管にピペッ
トで滴下して混合した。エチジウムプロミド溶液（１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０
０ｍＭ　Ｎａ（Ｊり中の５　ｍｇ７ｍｌエチジウムフロ
ミド１．０ｍＮを混合物に加えた。溶液を２つの８分の
５インチ×３インチポリアロマー（ｐｏｌｙ−ａｌｌｏ
ｍｅｒ）遠心分離管に移して封止した。これらの管をＢ
ｅｃｋｍａｎ　Ｔｉ７０ローター内て４４００Ｏｒｐｍ
、１７℃て４２時間回転させた。プラスミドを回収する
ために、管の頭部にメスを突き通し、２つの蛍光ＤＮＡ
帯域の下方を紫外線下に注射器で回収した。両管から得
た下方帯域をねし蓋カラス管内に一緒に入れ、等量の氷
温の水飽和Ｎ−ブタノールを用いて４回抽出することに
よってエヂジウムブロミドを除去した。

抽出溶液を透析管に移し、ＤＮＡ緩衝液を４回変えて２
４時間透析した。次に透析ＤＮＡ溶液を予め計量しであ
る５　０　＋ｎ　１殺菌遠心分離管に移してその容積を
測定した。最終濃度０．４Ｍになるまで５Ｍ　ＮａＣβ
を加えてから、２容積のイソプロパツールを加えて混合
した。溶液を一晩−２０℃に保存してＤＮＡを沈澱させ
た。沈澱後、溶液を１５０００ｒｐＩｏ、　０℃で１５
分間回転させ、上澄みを廃棄した。管を空気乾燥するよ
うに試験管面てに１５分間放置し、次いでＤＮＡ小球を
ＤＮＡ緩街液５００μ！中に溶解して一２０℃に保存し
た。このように調製されたプラスミドのＤＮＡ濃度は１
００〜２００μｇ／ｍｌであることが分かった。

６　プラスミドプールの消化：非Ａｆｆ　ＩＩメチラー
ゼクローンを切断するために主プラスミドブールを次の
様に消化した。プラスミドＤＮＡを、１０　ｍ　ＭＴｒ
ｉｓ　ｐＨ７，５，ｌｏｍＭ　ＭｇＣｌ２．ｉｏ＋ｎＭ
メルカプトエタノール ６００μ！を調製し、３本の試験管に入れた。第一試験
管には３００ノｌｐを、残りの２本の試験管には各々ー
２４〜 １５０μｒを入れた。第一試験管にＡｆｆｆｉ　ＩＩを
加えて８部／μ．　ＤＮＡを得、得られた溶液１５０μ
！を第二試験管に移して４部／μ２ＤＮＡを得た。第三
試験管にはＡｆｔ　ＩＩは入れなかった。これらの試験
管を３７℃て２時間インキュベートした。１０分間で７
２℃に加熱することによって反応を消画させた。反応混
合物を各々１００μρずつ取り出して、イソプロパツー
ルを加えてＤＮＡを沈澱させた。遠心分離によって沈澱
ＤＮＡを回収し、それをＤＮＡ緩衝液（Ｉ］１１９．０
）２０μβ中に再懸濁させて、１ｍρ当たりＤＮＡ約１
５０μｇを得た。

アルカリ性細菌ボスファターゼ０、４部を各試験管に加
え、各々をパラフィン油下６８℃で２時間インキュへ−
１〜した。ＤＮＡ緩衝液８０μｐを加え、混合し、除去
した。この混合物にクロロポルム８μβを加え、震盪混
合によって乳化させ、遠心分離によって分離させた。

７　形質転換・各試験管からサンプル１２．５μｐをと
ってＥ．ｃｏｌｉ　ＲＲＩを形質転換するのに使用した
。

細胞／ＤＮＡ混合物を、中間の希釈もぜず成長もさせず
に加熱直後に、１００μｇ／１ｎＩｌ！アミピシリンを
含有するし一寒天プレート上に置いた。３７℃て−・晩
インキュベ−１〜した後にブレーＩ〜を調査した。Ａｆ
（ＩＴ及びアルカリ性細菌ホスファターセによるプラス
ミドライブラリーの消化は、形質転換細胞の数を約１０
３ファクター程減らしたことが分かった。数の減少が最
も大きかった約３０の個々のコロニーをブレートからピ
・ンクア・ンブした（へｆＮＩＩ８部／μｇ）。

各コロニーをアミピシリンを含有するし一ブイヨン１０
ｍρ中に接種してミニ培養液を調製し、且つアミピシリ
ンを含有するし一寒天プレート上に塗り付（うてマスツ
ース１〜ツクを調製した。

８、生存個体の分析：セクション７て得られた生存コロ
ニー約３０を培養液１０＋ｎβ（セクション７）中で成
長させ、それらか担持するプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｎ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ
、７：１５１３（１９７９））の方法から採用した以下
のミニ調製精製法によって調製した。

翅ご乱賢泥：各培養液を８０００　ｒ　ｐ　ｒｎて５分
間遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞小球を１ｍｙ／ｍ
ρリゾデームを含有する２５ｒｎＭ　Ｔｒｉｓ、１０ｍ
Ｍ　ＥＤＴΔ、５０ｍＭグルコース、ｐＨ８，ｏ　１．
０ｍβ中に再懸濁さぜた。室温て１０分後、０．２Ｍ　
ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ　２．０ｍＮを各試験管に加え、
その試験管を震盪させて細胞を溶解させ、氷上に置いた
。−旦溶液が透明になったならは、３Ｍ酢酸す１−リウ
ム、ｐＨ４，８１，５ｍｌを各々に加えて振盪させた。

形成された沈澱物を１５０００　ｒ　ｐ　ｍ、４℃で１
０分間回転させた。各上澄みをイソプロパツール３＋ｎ
ｐを含有する遠心分離管に注入し、混合した。室温で１
０分後、管を１５０００　ｒ　ｐ　ｒｎて１０分間回転
させて沈澱核酸を小球状にした。上澄みを廃棄し、小球
を室温で３０分間空気乾燥させた。乾燥したならは、小
球を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｒｎＭ　ＥＤＴ八、ｐＨ
８，０８５０μ１．中に再懸濁さぜな。５Ｍ　ＮａＣβ
７５μβを各々に加え、溶液をイソプロパツール５７５
μｐを含むエッペンドルフ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｔ
ｕｂｅ）に移し、再び室温で１０分間沈澱させた。その
管をマイクロフージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）内て４５秒
間回転させ、」二澄みを廃棄し、小球を空気乾燥させた
。次いで小球をＲＮａｓｅｌＯＯμｇ／ｍβを含有する
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１　ｍＭ　ＥＤＴ八、ｐＨ８，
０５００μ１．中に溶解し、ＲＮ八を消化するために３
７°Ｃで１時間インキュベー１−１．た。５Ｍ　Ｎａ（
１！　５０μｌを加え次いてインプロパツール３５０μ
βをカロえることによってＤＮＡをもう一度沈澱さぜた
。室温て１０分後、ＤＮＡを遠心分離によって４５秒間
回転させ、上澄みを廃棄し、小球を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
、１ｒｎＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０１５０ｍＭの最終溶液
中に再溶解した。続いて八ｆり■を用いた消化によって
プラスミドミニ調製を分析した。

９、メチラーゼ遺伝子クローン、分析した大部分のプラ
スミ１へは、八ｆρ■による消化に敏感てあり且つ八ｎ
ａｂａｅｎａ　ＤＮへのランダムなＸｈｏｎフラグメン
トを担持することが分かった。これらのプラスミドは擬
似生存体であり、これ以上必要ないのて廃棄した。１つ
のプラスミドは、ＩＭＮ　ＩＩに抵抗があり且つ長さ約
１０．ＩＫｂ、２．ＩＫｂの２つのＸｌ＋ｏｒＩフラク
メントを担持していることが分かった（第２図参照）。

このプラスミドは次いて、肩β■修飾メチラーゼ遺伝子
のみでなく制限エンドヌクレアーゼ遺伝子も担持してい
ることか分かった。

１０、制限遺伝子クローンＡｆｌＩＩ修飾メチラーゼ遺
伝子を担持していると上記（セクション９）同定された
クローンは、Ａｆｌ　ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子を担持していることも分かった。このことは、次の様
に実施したｉｎ　ｖｉｔｒｏ制限エン１〜ヌクレアーゼ
評価によって確証された：エントヌクレアーゼ″す、エ
ン１〜ヌクレアーゼ活性を評価するために、２つの溶液
（ｉ）ＩＯＸ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液：１００ｍ
Ｍ　ＴＲ１ｓ、ｐＨ７，５，１００ｍＭ　Ｍｇ１ｌ！２
．１００　ｍ　Ｍ　２−メルカプ１〜エタノール、５０
０ｍＭ　Ｎａ（１！；及び（ｉｉ）消化反応ミックス：
４５μ（！ラノ、ター１１ｉｎｄ　■消化ＤＮＡ（６３
０μｇ／Ｊ）、５６μｐ１０χ制限エン１〜ヌクレアー
セ緩衝液、４５９μｌ蒸留水を調製して５０μｇ／　Ｉ
ｎりＤＮＡを得た。

細胞抽出物を次の様に調製した：デストされるべきクロ
ーンの培養液］、　ＯＯＩｎ　（ｌをＬ−フイツク及び
１００μｇ　／　ｍ　１アンピシリン中３７°Ｃで一晩
成長させ、４０００月）ＩＩＩで５分間の遠心分離する
ことによって細胞を小球にした。上澄みを廃棄し、小球
を音波処理緩衝液（２５［ｏＭ　ＫＰＯ４ｐＨ７，５，
］ＯｍＭ　ＢＭＥ、０．１ｍＭ　ＥＤＴΔ）３ＴｏＮ中
に再懸濁さぜな。再懸濁させてから、１０ｔｎ　ｇ　／
　Ｉｎ　、１リソチームを含有する音波処理緩衝液０．
３ｍβを加えた。Ｑｉ液を渦流動させて氷上に１時間放
置した。サンプルｌ−として１［ｏｌをエツペントルフ
管に移し、１０秒間ずつ３回静かに振動させる音波処理
を実施して細胞を破壊させた。管をマイクロヒュージ内
で５分間回転させ、上澄みを細胞抽出物として使用した
。この抽出物を評価するために、消化反応ミックスを５
木の試験管に、第一試験管には１５０μｌ、残りの４木
には各々１０２５μρずつ入れた。抽出物７．５μｌを
第一試験管に加えて混合した。第一試験管から４７．５
μ！を取り出して第二試験管に移して混合する等を行っ
た。第一試験管はＤＮＡ１μｇ当たり抽出物１μρを受
容し、第二試験管は０３μｐ／μｇ、第三試験管は０．
１μｍ７μｇ等である。今度は各々が１００μｌを包含
する試験管を３７℃でインキュベ−１〜し、各々２０μ
βのサンプルをゲル電気泳動によって分析した。抽出物
の力価は１ｍβ当たり約２ｘｌＯ’部てあって、これは
、湿潤細胞ペース＋−１グラム当たりへｆ１■制限エン
ドヌクレアーゼ約１　ｘ　］、　０５部に相当すること
が分がった（第３図参照）。

１１　　ΔＨ！ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラ
ーゼをコートする遺伝子を担持する組換えプラスミドＩ
）ＫＬ　八ｆＮＩＩ　ＲＭ　５２０−４を、形質転換に
よってＥ、ｃｏｌｉ株ＭＭ２９４（ｌ＋ｓｄ　ＲＭ　、
ＡＴＣＣＮｏ、３３６２５）に転位させて形質転換細胞
Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４（ｐＫＬΔＯ！　Ｉｔ　−Ｒ
Ｍ５２０−４）を生産した。

３１一 実施例■ Ｅ、ｃｏｏＭＭ２９４（Ｋ１、ΔＮ！　］ｌ　−５２０
−４の八ｆｌ■１　　、　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９
４（ｐＫＬ八ｆへｎ　　−ＲＭ５２０−４）を　、　３
７℃の発酵器内Ｌ−ブイヨン媒質中で増殖させた。但し
前記媒質は１リットル当たり力ゼインヒドロリヤー１−
１０クラム、１リツ■・ル当たり酵母抽出物５グラム、
１リッ１〜ル当たりＮａＣｆｆ１Ｏクラム、１リツ）〜
ル当たり塩化マグネシウム−ヘキザヒドレート１グラム
；１リッ１〜ル当たりグルコース１グラム：１リットル
当たりアンピシリン１．００ｍｇを含有する。ｐｉはＮ
　ａ　ＯＨを用いて７．２に調整した。遠心分離によっ
て細胞を回収し、細胞ペースＩ・を−７０℃に保存した
。

後続のステップは全て４℃て実施した。

２　凍結した細胞ペースｌ□、２４１！ｍを溶かし、細
胞を音波緩衝液（１０ｍＭ　ＫＰＯ４，１０ｍＭ　２−
メルカプトエタノール、０．１ｍＭ　ＥＤＴ八）１００
ｍｆ中に再懸濁させた。

３、細胞を音波処理によって破壊し、懸濁している細胞
１ｍｆ当たり可溶性タンパク質約５０拍ｇを遊離させた
。

４　、　ＩＱ、ＯＯＯｒｐｍで４５分間遠心分離して不
溶性細胞片を除去した。

５、上澄みを０．１５　Ｍ　ＮａＣＮに調整し、ホスホ
セルロースカラム（３ｃｍ　ｘ　１８ｃｍ）に適用した
。そのカラムを、０．１５　Ｍ　ＮａＣｆを含有する音
波処理緩衝液２カラム容積を用いて洗浄した。０　、１
５Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｆの線状勾配（全容積２００ｍ
ｊりをカラムに適用し、２ｍｌフラクションを回収した
。Ａｆｔ　ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の存在につ
いてフラクションを評価した。活性フラクションをプー
ルして、０．１５Ｍ　ＮａＣＮの溶液の伝導率に対する
伝導率を小さくするために音波処理緩衝液で希釈した。

６、活性プールをヘパリンセファロースカラム（２ｃｍ
　ｘ　１２ｃｍ）に適用し、０．１５　Ｍ　ＮａＣｆを
含有する音波処理緩衝液２カラム容積を用いて洗浄した
。

０．１５Ｍ　〜１．ＯＮのＮａＣ１の線状勾配（全容積
１５０ｍｎ）をカラムに適用し、２ｍＮフラクションを
ここでも回収しな。八Ｈ！　ＩＩ制限エンＦヌクレアー
ゼ活性の存在についてフラクションを評価した。活性フ
ラクションをプールして、Ｉｔ）！街液（５０ｍＭ　Ｋ
（Ｊ！；２０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｐ、ｐＨ８，０：
１０ｍＭ　２−メルカプトエタノール）１ｏＯ容積に対
する透析を行った。

７　透析物を１ｍ！モノーＱ　ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃ　ｉａ）に適用し、Ｈ緩衝液を用いて洗浄した
。１Ｉｉｉ街液中の５０ｍＭ　ＫＣＩ！〜０．６Ｍ　Ｋ
ＣＮの線状勾配４０１ｎβをカラムに適用し、１１フラ
クシヨンをここでも回収した。Ａｆｆ　ＩＩ制限エンド
ヌクレアーゼ活性の存在についてフラクションを評価し
た。２つの最も活性なフラクションをプールして、グリ
セリン２＋ｃｉ！及びウシ血清アルブミン８００μｇを
加えた。精製した調合剤を一２０°Ｃに保存した。

【図面の簡単な説明】

第１図は八ｆｆ　ＩＩ制限エンドヌクレアーゼをクロー
ニング及び生産するための図式てあり、第２図はＡｆｌ
　ＩＩ制限エンＩ・ヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼを
コ−１くするゴ２．４Ｋｂ　ＸｂｏＩ［フラグメント挿
入の制限マツプであり、第３図はｐＫＬΔｆｆ　ＩＩ　
ＲＭ５２０−４の粗抽出物から得られる八ｒ（ＩＩ制限
エンドヌクレアーゼ活性を、示すアガロースゲルて得ら
れた粒子＼ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ＡｆｌII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有す
   るクローニングベクター。 （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換宿主。 （３）ＡｆｌII遺伝子がＡｎａｂａｅｎａ　ｆｌｏｓ−
   ａｑｕａｅから切り出される請求項１に記載のクローニ
   ングベクタ（４）ＡｆｌII修飾遺伝子を含有するクロー
   ニングベクター。 （５）請求項４に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換宿主。 （６）（ａ）Ａｎａｂａｅｎａ　ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ
   由来のＤＮＡからライブラリーを形成し；（ｂ）Ａｆｌ
   II修飾遺伝子を含有するクローンを単離し：及び（ｃ）
   該修飾遺伝子を含有するクローンを選別し、ＡｆｌII制
   限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有するクローンを単離
   することから成るＡｆｌII制限エンドヌクレアーゼ遺伝
   子をクローニングする方法。 （７）前記ライブラリーを、 （ａ）Ａｎａｂａｅｎａ　ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ由来の
   ＤＮＡを精製し、（ｂ）精製ＤＮＡを一部消化してＤＮ
   Ａフラグメントを形成し、 （ｃ）該フラグメントをクローニングベクター内に連結
   し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のクローニングベクターを用いて
   宿主細胞を形質転換して細胞ライブラリーを形成し、 （ｅ）該細胞ライブラリー由来の組換えベクターを精製
   してプラスミドライブラリーを形成することから形成す
   る請求項６に記載の方法。 （８）クローニングベクターがｐＪＲＤ１８４である請
   求項７に記載の方法。 （９）宿主細胞がｈｓｄＲであるＥ．ｃｏｌｉ株である
   請求項７に記載の方法。 （１０）プラスミドライブラリーをＡｆｌIIで消化して
   消化プールを形成し、前記消化プールを宿主細胞に形質
   転換し、修飾遺伝子を含有するクローンを選択すること
   によってＡｆｌII修飾遺伝子を単離する請求項７に記載
   の方法。 （１１）（ａ）Ａｎａｂａｅｎａ　ｆｌｏｓ−ａｑｕａ
   ｅ由来のＤＮＡを精製し、 （ｂ）適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて精製ＤＮ
   Ａを一部消化してＤＮＡフラグメントを形成し、（ｃ）
   前記フラグメントをクローニングベクター内に連結して
   ＤＮＡ混合物を形成し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡ混合物を用いて宿主細胞
   を形質転換してライブラリーを形成し、 （ｅ）ＡｆｌII修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクロー
   ンを単離し、 （ｆ）ＡｆｌII修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクロー
   ンを選別し、ＡｆｌII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を
   含有するクローンを単離し、 （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含有する宿主細胞を
   培養し、 （ｈ）培養物からＡｆｌII制限エンドヌクレアーゼを回
   収する ことから成るＡｆｌII制限エンドヌクレアーゼを生産す
   る方法。 （１２）クローニングベクターがプラスミド又はウィル
   スＤＮＡ分子である請求項１１に記載の方法。 （１３）プラスミドがｐＪＲＤ１８４である請求項１２
   に記載の方法。