JP2952003B2 - ＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの生産方法 - Google Patents
ＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの生産方法Info
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- JP2952003B2 JP2952003B2 JP2115010A JP11501090A JP2952003B2 JP 2952003 B2 JP2952003 B2 JP 2952003B2 JP 2115010 A JP2115010 A JP 2115010A JP 11501090 A JP11501090 A JP 11501090A JP 2952003 B2 JP2952003 B2 JP 2952003B2
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- xma
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- gene
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、Xma I制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メ
チラーゼのためのクローンと、該クローンから前記酵素
を生産する方法とに関する。
チラーゼのためのクローンと、該クローンから前記酵素
を生産する方法とに関する。
制限エンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在する種
類の酵素である。制限エンドヌクレアーゼを細菌の他の
夾雑物質から精製すると、それらは実験室において、DN
A分子を正確な断片に切断するために使用することがで
きる。この特性によってDNA分子を唯一に同定したり構
成遺伝子に断片化することが可能となる。制限エンドヌ
クレアーゼは最近の遺伝子研究において不可欠なツール
であることは明らかである。制限エンドヌクレアーゼ
は、それによって遺伝子工学及び遺伝子解析が実施され
る生化学的な「はさみ」である。
類の酵素である。制限エンドヌクレアーゼを細菌の他の
夾雑物質から精製すると、それらは実験室において、DN
A分子を正確な断片に切断するために使用することがで
きる。この特性によってDNA分子を唯一に同定したり構
成遺伝子に断片化することが可能となる。制限エンドヌ
クレアーゼは最近の遺伝子研究において不可欠なツール
であることは明らかである。制限エンドヌクレアーゼ
は、それによって遺伝子工学及び遺伝子解析が実施され
る生化学的な「はさみ」である。
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子に沿ったヌクレ
オチドの特定の配列（「認識配列」）を認識しそこに結
合することにより作用する。一旦結合したならば、制限
エンドヌクレアーゼは分子を配列内または配列の片側で
切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識
配列に対して親和性を示す。これまでに調査された極め
て多数の細菌において、100種以上の異なる制限エンド
ヌクレアーゼが同定されている。
オチドの特定の配列（「認識配列」）を認識しそこに結
合することにより作用する。一旦結合したならば、制限
エンドヌクレアーゼは分子を配列内または配列の片側で
切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識
配列に対して親和性を示す。これまでに調査された極め
て多数の細菌において、100種以上の異なる制限エンド
ヌクレアーゼが同定されている。
細菌は、種当たり多くともたった数種の制限エンドヌ
クレアーゼしか有さない傾向にある。エンドヌクレアー
ゼは典型的にはそれらが誘導された細菌に従って命名さ
れる。即ち、Haemophilus aegyptius種は例えばHae
I、Hae II及びHae IIIと称される３種の異なる制限エン
ドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素はそれぞれ配
列（AT）GGCC（AT）、PuGCGCPy及びGGCCを認識及び切断
する。他方で、Escherichia coli RY13は唯一種の酵素
EcoR Iを合成し、この酵素は配列GAATTCを認識する。
クレアーゼしか有さない傾向にある。エンドヌクレアー
ゼは典型的にはそれらが誘導された細菌に従って命名さ
れる。即ち、Haemophilus aegyptius種は例えばHae
I、Hae II及びHae IIIと称される３種の異なる制限エン
ドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素はそれぞれ配
列（AT）GGCC（AT）、PuGCGCPy及びGGCCを認識及び切断
する。他方で、Escherichia coli RY13は唯一種の酵素
EcoR Iを合成し、この酵素は配列GAATTCを認識する。
理論に制約されたくはないが、実際のところ制限エン
ドヌクレアーゼは細菌細胞の繁栄において保護の役割を
演じていると考えられいる。制限エンドヌクレアーゼは
細菌に、そうでなければ細菌を破壊したり細菌に寄生す
るであろうウイルス及びプラスミドのような外来DNA分
子による感染に対する耐性を与える。制限エンドヌクレ
アーゼは、長大な感染DNA分子を走査し、それらを認識
配列が存在するごとに切断することにより耐性を与え
る。破壊が行われると感染遺伝子の多くは不能となり、
DNAをエンドヌクレアーゼによる更なる分解に対して感
受性にする。
ドヌクレアーゼは細菌細胞の繁栄において保護の役割を
演じていると考えられいる。制限エンドヌクレアーゼは
細菌に、そうでなければ細菌を破壊したり細菌に寄生す
るであろうウイルス及びプラスミドのような外来DNA分
子による感染に対する耐性を与える。制限エンドヌクレ
アーゼは、長大な感染DNA分子を走査し、それらを認識
配列が存在するごとに切断することにより耐性を与え
る。破壊が行われると感染遺伝子の多くは不能となり、
DNAをエンドヌクレアーゼによる更なる分解に対して感
受性にする。
細菌保護系の第２の因子は修飾メチラーゼである。こ
の酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、細菌
がそれ自体のDNAを外来の感染DNAから保護及び区別でき
る手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エ
ンドヌクレアーゼと同じヌクレオチド認識配列を認識し
それに結合するが、DNAを切断するのではなくて、メチ
ル基を付加することにより配列内のヌクレオチドの一方
または他方を化学的に修飾する。メチル化されると、認
識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって結合も
切断もされなくなる。細菌細胞のDNAはその修飾メチラ
ーゼの活性によって常に充分に修飾されており、従って
内在制限エンドヌクレアーゼの存在に対しては完全に非
感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識及び攻撃
に感受性を示すのは、未修飾の、従って同定可能の外来
DNAのみである。
の酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、細菌
がそれ自体のDNAを外来の感染DNAから保護及び区別でき
る手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エ
ンドヌクレアーゼと同じヌクレオチド認識配列を認識し
それに結合するが、DNAを切断するのではなくて、メチ
ル基を付加することにより配列内のヌクレオチドの一方
または他方を化学的に修飾する。メチル化されると、認
識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって結合も
切断もされなくなる。細菌細胞のDNAはその修飾メチラ
ーゼの活性によって常に充分に修飾されており、従って
内在制限エンドヌクレアーゼの存在に対しては完全に非
感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識及び攻撃
に感受性を示すのは、未修飾の、従って同定可能の外来
DNAのみである。
遺伝子工学技術の出現によって今や遺伝子をクローニ
ングし、タンパク質及びタンパク質がコードする酵素を
通常の精製技術によって得られるよりも大量に生産する
ことが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のク
ローンを単離する上で鍵となるのは、錯体「ライブラリ
ー」、即ち「ショットガン」方法によって誘導されたク
ローンの集団内にかかる遺伝子が10-3〜10-4の頻度で存
在する場合に、それらを同定する単純で且つ信頼性のあ
る方法を開発することである。この方法は好ましくは、
大多数の不要なクローンを分解し、希少な所望のクロー
ンを残すような選択性を有するべきである。
ングし、タンパク質及びタンパク質がコードする酵素を
通常の精製技術によって得られるよりも大量に生産する
ことが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のク
ローンを単離する上で鍵となるのは、錯体「ライブラリ
ー」、即ち「ショットガン」方法によって誘導されたク
ローンの集団内にかかる遺伝子が10-3〜10-4の頻度で存
在する場合に、それらを同定する単純で且つ信頼性のあ
る方法を開発することである。この方法は好ましくは、
大多数の不要なクローンを分解し、希少な所望のクロー
ンを残すような選択性を有するべきである。
タイプII制限−修飾系のクローニングは益々多くなさ
れている。第１のクローン化系は制限エンドヌクレアー
ゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオ
ファージ感染を使用した（EcoR II:Kosykhら,Molec.ge
n.Genet 178,717−719（1980）、Hha II:Mannら,Gene
3,97−112（1978）並びにPst I:Walderら,Proc.Nat.Aca
d.Sci.78,1503−1507（1981））。細菌中に制限−修飾
系が存在すると細菌はバクテリオファーによる感染に対
して耐性を示すことができるので、クローン化制限−修
飾遺伝子を担う細胞は原則として、ファージに暴露され
たライブラリーから生存体として選択的に単離すること
ができる。しかしながらこの方法は値に限界があり、特
にクローン化制限−修飾遺伝子は、選択的生存を与える
のに充分なファージ耐性を常に発現するわけではないこ
とが判っている。
れている。第１のクローン化系は制限エンドヌクレアー
ゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオ
ファージ感染を使用した（EcoR II:Kosykhら,Molec.ge
n.Genet 178,717−719（1980）、Hha II:Mannら,Gene
3,97−112（1978）並びにPst I:Walderら,Proc.Nat.Aca
d.Sci.78,1503−1507（1981））。細菌中に制限−修飾
系が存在すると細菌はバクテリオファーによる感染に対
して耐性を示すことができるので、クローン化制限−修
飾遺伝子を担う細胞は原則として、ファージに暴露され
たライブラリーから生存体として選択的に単離すること
ができる。しかしながらこの方法は値に限界があり、特
にクローン化制限−修飾遺伝子は、選択的生存を与える
のに充分なファージ耐性を常に発現するわけではないこ
とが判っている。
別のクローニング方法は、当初からプラスミドを担う
ことを特徴とする系をE.coliクローニングプラスミドへ
移入すること含む（EcoR V:Bougueleretら,Nucl.Acid.R
es.12,3659−3676（1984）、PaeR7:Gingeras及びBrook
s,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,402−406（1983）、Ther
iault及びRoy,Gene 19,355−359（1982）並びにPvu II:
Blumenthalら,J.Bacteriol.164,501−509（1985））。
ことを特徴とする系をE.coliクローニングプラスミドへ
移入すること含む（EcoR V:Bougueleretら,Nucl.Acid.R
es.12,3659−3676（1984）、PaeR7:Gingeras及びBrook
s,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,402−406（1983）、Ther
iault及びRoy,Gene 19,355−359（1982）並びにPvu II:
Blumenthalら,J.Bacteriol.164,501−509（1985））。
第３の方法は徐々に多くの系をクローニングするため
に使用されるもので、活性メチラーゼ遺伝子を選択する
ことを含む（例えばBsuR I:Kissら,Nucl.Acid.Res.13,6
403−6421（1985）及びTaq I:Slatkoら,Nucl.Acid.Res.
15,9781−9796（1987）参照）。制限及び修飾遺伝子は
密接に関連する傾向にあるので、両遺伝子を含むクロー
ンは、ただ一方の遺伝子に対して選択することにより単
離され得ることが多い。メチル化活性に対する選択は常
に完全な制限−修飾系を与えるとは限らないが、その代
わりにメチラーゼ遺伝子のみを与えることがある（BspR
I:Szomolanyiら,Gene 10,219−225（1980）、Bcn I:Ja
nulaitisら,Gene 20,197−204（1982）、BsuR I:Kiss及
びBaldauf,Gene 21,111−119（1983）並びにMsp I:Wald
erら,J.Biol.Chem.258,1235−1241（1983））。制限−
修飾系のクローニングに関する全般的考察は例えばLunn
enら,Gene 74,25−32（1988）及びWilson,G.G.,Gene 7
4,281−289（1988）を参照されたい。
に使用されるもので、活性メチラーゼ遺伝子を選択する
ことを含む（例えばBsuR I:Kissら,Nucl.Acid.Res.13,6
403−6421（1985）及びTaq I:Slatkoら,Nucl.Acid.Res.
15,9781−9796（1987）参照）。制限及び修飾遺伝子は
密接に関連する傾向にあるので、両遺伝子を含むクロー
ンは、ただ一方の遺伝子に対して選択することにより単
離され得ることが多い。メチル化活性に対する選択は常
に完全な制限−修飾系を与えるとは限らないが、その代
わりにメチラーゼ遺伝子のみを与えることがある（BspR
I:Szomolanyiら,Gene 10,219−225（1980）、Bcn I:Ja
nulaitisら,Gene 20,197−204（1982）、BsuR I:Kiss及
びBaldauf,Gene 21,111−119（1983）並びにMsp I:Wald
erら,J.Biol.Chem.258,1235−1241（1983））。制限−
修飾系のクローニングに関する全般的考察は例えばLunn
enら,Gene 74,25−32（1988）及びWilson,G.G.,Gene 7
4,281−289（1988）を参照されたい。
制限−修飾遺伝子をクローニングする上での潜在的な
障害は、エンドヌクレアーゼ遺伝子をまだ修飾によって
保護されていない宿主に導入することにある。もしメチ
ラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを単一のク
ローンとして一緒に導入するならば、エンドヌクレアー
ゼが宿主DNAを切断する機会を有する前にメチラーゼは
宿主DNAを保護するように修飾せねばならない。従って
このような場合には、まずメチラーゼ遺伝子を、次いで
エンドヌクレアーゼ遺伝子を順次クローニングすること
のみが可能であろう。
障害は、エンドヌクレアーゼ遺伝子をまだ修飾によって
保護されていない宿主に導入することにある。もしメチ
ラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを単一のク
ローンとして一緒に導入するならば、エンドヌクレアー
ゼが宿主DNAを切断する機会を有する前にメチラーゼは
宿主DNAを保護するように修飾せねばならない。従って
このような場合には、まずメチラーゼ遺伝子を、次いで
エンドヌクレアーゼ遺伝子を順次クローニングすること
のみが可能であろう。
E.coliにおいて系をクローニングする別の障害は、別
種のメチラーゼ遺伝子をクローニングする方法において
判明した。（クローニングに通常使用されるものを含
む）多くのE.coli株は、メチル化シトシンを含むDNAの
導入に耐性を示す系を有する（Raleigh及びWilson,Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA 83,9070−9074（1986））。単独
であろうと対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒で
あろうと、かかるE.coli株内にシトシン特異的メチラー
ゼ遺伝子をクローニングすることは極めて難しい。従っ
てかかる遺伝子をクローニングするためには、かかる系
が欠失しているE.coli突然変異株を使用することが必要
である。
種のメチラーゼ遺伝子をクローニングする方法において
判明した。（クローニングに通常使用されるものを含
む）多くのE.coli株は、メチル化シトシンを含むDNAの
導入に耐性を示す系を有する（Raleigh及びWilson,Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA 83,9070−9074（1986））。単独
であろうと対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒で
あろうと、かかるE.coli株内にシトシン特異的メチラー
ゼ遺伝子をクローニングすることは極めて難しい。従っ
てかかる遺伝子をクローニングするためには、かかる系
が欠失しているE.coli突然変異株を使用することが必要
である。
精製した制限エンドヌクレアーゼ及び、これ程ではな
いが修飾メチラーゼは、実験室においてDNAを特性化及
び再構成するための有効なツールであるので、組換えDN
A技術によってかかる酵素を大量に合成する細菌株を得
て市販しようとする発想が生まれる。このような株は、
精製作業を単純化し、更に市販に有効な量で生産する手
段を提供することから有効であろう。
いが修飾メチラーゼは、実験室においてDNAを特性化及
び再構成するための有効なツールであるので、組換えDN
A技術によってかかる酵素を大量に合成する細菌株を得
て市販しようとする発想が生まれる。このような株は、
精製作業を単純化し、更に市販に有効な量で生産する手
段を提供することから有効であろう。
発明の概要 本発明は、Xanthomonas malvacaerum（ATCC 9924）
から誘導されるXma I制限エンドヌクレアーゼ及び修飾
メチラーゼ（Endow,S.A.及びRoberts,R.J.,J.Mol.Biol.
112,521−529（1977））に対する遺伝子を含むクローン
と、かかる酵素の生産方法とを提供する。特に本発明の
方法は、制限エンドヌクレアーゼXma I、即ちDNA配列
５′−CCCGGG−３′を認識し、C1とC2との間を切断して
５′末端に４ヌクレオチドを突出したまま残す酵素を発
現するクローンに関する（上記Endowらの文献を参照の
こと。尚この文献の開示内容は参照により本明細書に包
含されるものとする）。本発明に従って生産されるXma
I制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、通常
の方法で生産されたXma I産物中に通常見られる夾雑物
は含有しない。
から誘導されるXma I制限エンドヌクレアーゼ及び修飾
メチラーゼ（Endow,S.A.及びRoberts,R.J.,J.Mol.Biol.
112,521−529（1977））に対する遺伝子を含むクローン
と、かかる酵素の生産方法とを提供する。特に本発明の
方法は、制限エンドヌクレアーゼXma I、即ちDNA配列
５′−CCCGGG−３′を認識し、C1とC2との間を切断して
５′末端に４ヌクレオチドを突出したまま残す酵素を発
現するクローンに関する（上記Endowらの文献を参照の
こと。尚この文献の開示内容は参照により本明細書に包
含されるものとする）。本発明に従って生産されるXma
I制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、通常
の方法で生産されたXma I産物中に通常見られる夾雑物
は含有しない。
Xma I酵素に対する遺伝子をクローニングする好まし
い方法は、X. malvacaerum由来のDNAを含むライブラリー
を形成し、Xma I修飾メチラーゼをコードするDNAを含む
クローンを単離し、このなかからスクリーニングして更
にXma I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むものを同
定することからなる。
い方法は、X. malvacaerum由来のDNAを含むライブラリー
を形成し、Xma I修飾メチラーゼをコードするDNAを含む
クローンを単離し、このなかからスクリーニングして更
にXma I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むものを同
定することからなる。
発明の詳細 本発明は、Xma I制限及び修飾遺伝子のクローンと、
かかるクローンから生産される制限エンドヌクレアーゼ
Xma Iとに関する。Xma I遺伝子は、Xma I修飾メチラー
ゼ遺伝子を含有及び発現するとして選択された所定のク
ローンが、更にXma I制限遺伝子も含有することを利用
する方法によってクローン化されることが好ましい。か
かるクローンのDNAは、Xma I制限エンドヌクレアーゼ及
びSma I制限エンドヌクレアーゼによるin vitro消化に
耐性を示す（Sma I制限エンドヌクレアーゼはXma Iのア
イソシゾマーである）。この消化に対する耐性により、
Xma Iメチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼをコード
するクローンを選択的に単離する手段が可能となる。
かかるクローンから生産される制限エンドヌクレアーゼ
Xma Iとに関する。Xma I遺伝子は、Xma I修飾メチラー
ゼ遺伝子を含有及び発現するとして選択された所定のク
ローンが、更にXma I制限遺伝子も含有することを利用
する方法によってクローン化されることが好ましい。か
かるクローンのDNAは、Xma I制限エンドヌクレアーゼ及
びSma I制限エンドヌクレアーゼによるin vitro消化に
耐性を示す（Sma I制限エンドヌクレアーゼはXma Iのア
イソシゾマーである）。この消化に対する耐性により、
Xma Iメチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼをコード
するクローンを選択的に単離する手段が可能となる。
Xma I制限遺伝子及びメチラーゼ遺伝子を好ましくク
ローニングし発現する本明細書に記載の方法を第１図を
用いて説明する。この方法は以下のステップを含む。
ローニングし発現する本明細書に記載の方法を第１図を
用いて説明する。この方法は以下のステップを含む。
（１） X. malvacaerum（ATCC 9924）の成長及び溶菌の
ステップであって、X. malvacaerumをEndowらにより記載
の方法に従って増殖させて溶解する。
ステップであって、X. malvacaerumをEndowらにより記載
の方法に従って増殖させて溶解する。
（２） X. malvacaerumのDNAを、フェノール及びクロロ
ホルム抽出し、透析し、イソプロパノールにより沈澱す
るような標準的な方法により精製する。
ホルム抽出し、透析し、イソプロパノールにより沈澱す
るような標準的な方法により精製する。
（３） DNA制限エンドヌクレアーゼHind III、BamH I
及びEcoR Iのいずれかを用いて一部消化する。
及びEcoR Iのいずれかを用いて一部消化する。
（４） 消化したDNAを、BamH I、Hind IIIまたはEcoR
I部位を含むpBR322誘導体のようなクローニングベクタ
ーに連結する。Xma Iクローンはクローニングベクター
としてpKL19−２を使用して得られた。pKL19−２は、8b
pリン酸化リンカーｄ（pCCCCGGGG）を使用し、ヌクレオ
チド1563及び1582にあるDra I部位間のDNAを置き換え
る、第２のXma I/Sma I部位が挿入されたpUC19である
（pKL19−２の試料はATCC番号67997でATCCに寄託されて
いる）。得られた混合体を使用し、E.coli株RR1（ATCC
31343）のような適当な宿主を形質転換する。
I部位を含むpBR322誘導体のようなクローニングベクタ
ーに連結する。Xma Iクローンはクローニングベクター
としてpKL19−２を使用して得られた。pKL19−２は、8b
pリン酸化リンカーｄ（pCCCCGGGG）を使用し、ヌクレオ
チド1563及び1582にあるDra I部位間のDNAを置き換え
る、第２のXma I/Sma I部位が挿入されたpUC19である
（pKL19−２の試料はATCC番号67997でATCCに寄託されて
いる）。得られた混合体を使用し、E.coli株RR1（ATCC
31343）のような適当な宿主を形質転換する。
（５） DNA/細胞混合体を、アンピリシンのごとき形質
転換細胞に対して選択的な抗生物質培地上に移植する
（plated）。インキュベーション後、形質転換した細胞
コロニーを合わせて単一の培養に回収して初代細胞ライ
ブラリーを形成する。
転換細胞に対して選択的な抗生物質培地上に移植する
（plated）。インキュベーション後、形質転換した細胞
コロニーを合わせて単一の培養に回収して初代細胞ライ
ブラリーを形成する。
（６） 組換えプラスミド全部を初代細胞ライブラリー
から精製し、初代プラスミドライブラリーを形成する。
から精製し、初代プラスミドライブラリーを形成する。
（７） 次いでプラスミドライブラリーを、Serratiama
rcescens細胞から調製されたSma I制限エンドヌクレア
ーゼ（Endowら）を用い、アフィニティークロマトグラ
フィー及びイオン交換クロマトグラフィーのごとき標準
的なタンパク質精製方法によって完全にin vitro消化す
る。Xma I−メチル化DNAは、Xma I及びSma I制限エンド
ヌクレアーゼのいずれによる消化にも耐性を示す。消化
は、メチラーゼを含有しない未修飾のクローンの選択的
破壊を惹起し、この結果Xma Iメチラーゼを担うクロー
ンの相対頻度が増大することになる。Sma I制限エンド
ヌクレアーゼはXma Iと同じ配列を認識するが、配列
５′−CCCGGG−３′のC3及びG1間を切断してブラント末
端を残す。切断されてブラント末端を有する分子は形質
転換の際に環状をとりにくくなり、従って初代ライブラ
リーのSma I消化は恐らく、Xma I消化よりも修飾分子に
対してより選択的に行われる。
rcescens細胞から調製されたSma I制限エンドヌクレア
ーゼ（Endowら）を用い、アフィニティークロマトグラ
フィー及びイオン交換クロマトグラフィーのごとき標準
的なタンパク質精製方法によって完全にin vitro消化す
る。Xma I−メチル化DNAは、Xma I及びSma I制限エンド
ヌクレアーゼのいずれによる消化にも耐性を示す。消化
は、メチラーゼを含有しない未修飾のクローンの選択的
破壊を惹起し、この結果Xma Iメチラーゼを担うクロー
ンの相対頻度が増大することになる。Sma I制限エンド
ヌクレアーゼはXma Iと同じ配列を認識するが、配列
５′−CCCGGG−３′のC3及びG1間を切断してブラント末
端を残す。切断されてブラント末端を有する分子は形質
転換の際に環状をとりにくくなり、従って初代ライブラ
リーのSma I消化は恐らく、Xma I消化よりも修飾分子に
対してより選択的に行われる。
（８） 消化されたプラスミドライブラリーDNAをE.col
i株RR1のごとき適当な宿主内に形質転換し戻し、抗生物
質プレート上に移植すことにより形質転換したコロニー
を再度得る。コロニーを採取し、それらのDNAのXma I修
飾遺伝子の存在について以下の方法で解析する。即ち、
クローンが担うプラスミドDNAを精製し、Xma I制限エン
ドヌクレアーゼを用いてin vitroインキュベートし、X
ma Iによる消化に対して耐性を示すか決定する。更にク
ローンの全細胞DNA（染色体及びプラスミド）を精製
し、Xma I制限エンドヌクレアーゼを用いてインキュベ
ートする。Xma Iメチラーゼ遺伝子を担うクローンのDNA
は修飾されているべきであり、プラスミドDNA及び全DNA
のいずれも実質的にまたは完全に消化に対して耐性を示
すと判明するべきである。
i株RR1のごとき適当な宿主内に形質転換し戻し、抗生物
質プレート上に移植すことにより形質転換したコロニー
を再度得る。コロニーを採取し、それらのDNAのXma I修
飾遺伝子の存在について以下の方法で解析する。即ち、
クローンが担うプラスミドDNAを精製し、Xma I制限エン
ドヌクレアーゼを用いてin vitroインキュベートし、X
ma Iによる消化に対して耐性を示すか決定する。更にク
ローンの全細胞DNA（染色体及びプラスミド）を精製
し、Xma I制限エンドヌクレアーゼを用いてインキュベ
ートする。Xma Iメチラーゼ遺伝子を担うクローンのDNA
は修飾されているべきであり、プラスミドDNA及び全DNA
のいずれも実質的にまたは完全に消化に対して耐性を示
すと判明するべきである。
（９） Xma I制限エンドヌクレアーゼを担うクローン
を、ステップ８でXma Iメチラーゼ遺伝子を担うと同定
されたクローンの粗抽出物を調製し、この抽出物のXma
I制限エンドヌクレアーゼ活性について解析することに
より同定する。
を、ステップ８でXma Iメチラーゼ遺伝子を担うと同定
されたクローンの粗抽出物を調製し、この抽出物のXma
I制限エンドヌクレアーゼ活性について解析することに
より同定する。
（10） Xma I制限エンドヌクレアーゼは、Xma I制限及
び修飾遺伝子を担うクローンから、アンピシリンを含有
する富養培地において発酵器内で増殖させることにより
生産することができる。次いで細胞を遠心分離により回
収し、音波処理によって破壊し、Xma I制限エンドヌク
レアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を生産する。
び修飾遺伝子を担うクローンから、アンピシリンを含有
する富養培地において発酵器内で増殖させることにより
生産することができる。次いで細胞を遠心分離により回
収し、音波処理によって破壊し、Xma I制限エンドヌク
レアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を生産する。
（11） Xma I制限エンドヌクレアーゼを含む粗細胞抽
出物を、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン
交換クロマトグラフィーのごとき標準的なタンパク質精
製方法により精製する。
出物を、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン
交換クロマトグラフィーのごとき標準的なタンパク質精
製方法により精製する。
上記概要を示した各ステップは本発明を実施する上で
の好ましい態様を表しているが、当業者には上記方法は
公知の方法に従って変更し得ることは明らかであろう。
の好ましい態様を表しているが、当業者には上記方法は
公知の方法に従って変更し得ることは明らかであろう。
以下に実用化に好ましい実施例を与えて本発明の実施
態様を説明する。この実施例は説明のためのものであ
り、本発明は、付随の特許請求の範囲に記載の外にはこ
の実施例に制限されないことを理解されたい。
態様を説明する。この実施例は説明のためのものであ
り、本発明は、付随の特許請求の範囲に記載の外にはこ
の実施例に制限されないことを理解されたい。
実施例 Xma I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング （１）DNA精製： Xanthomonas malvacaerum（ATCC 99
24）のDNAを調製するために、凍結細胞5gを25％スクロ
ース,50mM Tris,pH8.0 20ml中に氷上で１時間かけて溶
かし、0.25M EDTA,pH8 10mlを加え、次いでリゾチーム1
0mg/mlを含有する0.25M Tris,pH8.0 6mlを加えた。この
懸濁液を氷上で２時間インキュベートした。細胞を溶解
するために、溶解用ミックス（１％Triton X−100,50mM
Tris,62mM EDTA,pH5.0）24mlと10％SDS 5mlとを加え
た。試料を、まず（0.5M Tris,pH8.0を用いて予め平衡
させておいた）フェノール70mlを用いて、次いでクロロ
ホルム60mlを用いて抽出した。エマルジョンを10k rpm
で30分間遠心分離し、粘性のある上層を回収し、10mM T
ris,1mM DETA,pH8.0に対して24時間透析した（緩衝液は
４リットルずつ４回交換した）。次いで透析した溶液を
RNaseを用いて37℃で１時間消化して最終濃度100μg/ml
とした。次いで、最終濃度0.4MとなるまでNaClを加える
ことによりDNAを得て、0.55容積のイソプロピルアルコ
ールで上層を形成し、相を合わせて混合することにより
DNAをガラス棒上に巻き付けた。次いでDNAを10mM Tris,
1mM EDTA,PH8.0中に再度懸濁し、４℃で保存した。
24）のDNAを調製するために、凍結細胞5gを25％スクロ
ース,50mM Tris,pH8.0 20ml中に氷上で１時間かけて溶
かし、0.25M EDTA,pH8 10mlを加え、次いでリゾチーム1
0mg/mlを含有する0.25M Tris,pH8.0 6mlを加えた。この
懸濁液を氷上で２時間インキュベートした。細胞を溶解
するために、溶解用ミックス（１％Triton X−100,50mM
Tris,62mM EDTA,pH5.0）24mlと10％SDS 5mlとを加え
た。試料を、まず（0.5M Tris,pH8.0を用いて予め平衡
させておいた）フェノール70mlを用いて、次いでクロロ
ホルム60mlを用いて抽出した。エマルジョンを10k rpm
で30分間遠心分離し、粘性のある上層を回収し、10mM T
ris,1mM DETA,pH8.0に対して24時間透析した（緩衝液は
４リットルずつ４回交換した）。次いで透析した溶液を
RNaseを用いて37℃で１時間消化して最終濃度100μg/ml
とした。次いで、最終濃度0.4MとなるまでNaClを加える
ことによりDNAを得て、0.55容積のイソプロピルアルコ
ールで上層を形成し、相を合わせて混合することにより
DNAをガラス棒上に巻き付けた。次いでDNAを10mM Tris,
1mM EDTA,PH8.0中に再度懸濁し、４℃で保存した。
（２）DNA消化： 精製したDNAの一部をHind IIIを用い
て切断した。DNAを、50mM Tris pH7.5,100mM NaCl,10mM
MgCl2,10mM 2−メルカプトエタノール中で濃度100mg/m
lにまで希釈し、DNA1μｇ当たりHind III4.0単位を第１
の試験管に加え、次いで第２の試験管に移してHind III
2.0単位／μｇを得るというように、１つ前の酵素の量
の半分を受容することを順次繰り返した。DNAを37℃で
１時消化し、次いで10分間かけて72℃にまで加熱するこ
とにより消化を停止した。適度であるが不完全な消化を
示した試験管をクローニングのための一部消化断片源と
して選択した（これらは、0.5単位／μｇ、0.25単位／
μｇ、0.1単位／μｇ、0.05単位／μｇ及び0.02単位／
μｇの試験管であった。５つの溶液を合わせて混合し、
以下のように使用した）。
て切断した。DNAを、50mM Tris pH7.5,100mM NaCl,10mM
MgCl2,10mM 2−メルカプトエタノール中で濃度100mg/m
lにまで希釈し、DNA1μｇ当たりHind III4.0単位を第１
の試験管に加え、次いで第２の試験管に移してHind III
2.0単位／μｇを得るというように、１つ前の酵素の量
の半分を受容することを順次繰り返した。DNAを37℃で
１時消化し、次いで10分間かけて72℃にまで加熱するこ
とにより消化を停止した。適度であるが不完全な消化を
示した試験管をクローニングのための一部消化断片源と
して選択した（これらは、0.5単位／μｇ、0.25単位／
μｇ、0.1単位／μｇ、0.05単位／μｇ及び0.02単位／
μｇの試験管であった。５つの溶液を合わせて混合し、
以下のように使用した）。
（３）連結： 消化したDNAをpKL19−２に以下のように
連結した。即ち、Hind IIIで消化したX. malvacaerum DN
A（60μ）6.0μｇを、Hind IIIで切断し脱リン酸化し
たpKL19−２（7.5μ）3.0μｇと混合した。10X連結ミ
ックス（50mM Tris pH7.5,100mM MgCl2,100mM DTT,5mM
ATP）20μを加え、更に滅菌蒸留水112.5μを加えて
最終容積200μとした。T4 DNAリガーゼ7.5μを加
え、この混合物を17℃で４時間インキュベートし、クロ
ロホルム10μを加えることにより滅菌した。連結DNA
約125μを使用してE.coli株RR1を以下のように形質転
換した。即ち、DNAをSSC/CaCl2（50mM NaCl,5mM Na3ク
エン酸塩,67mM CaCl2）1.0mlと氷上で混合し、氷温のコ
ンピテントE.coli RR1（hsd R-M-、ATCC寄託番号 3134
3）細胞2.0mlを加えた。42℃で５分間インキュベートし
た後、ルリアブロス（Ｌブロス）8mlを加えることによ
り希釈し、37℃で４時間インキュベートした。
連結した。即ち、Hind IIIで消化したX. malvacaerum DN
A（60μ）6.0μｇを、Hind IIIで切断し脱リン酸化し
たpKL19−２（7.5μ）3.0μｇと混合した。10X連結ミ
ックス（50mM Tris pH7.5,100mM MgCl2,100mM DTT,5mM
ATP）20μを加え、更に滅菌蒸留水112.5μを加えて
最終容積200μとした。T4 DNAリガーゼ7.5μを加
え、この混合物を17℃で４時間インキュベートし、クロ
ロホルム10μを加えることにより滅菌した。連結DNA
約125μを使用してE.coli株RR1を以下のように形質転
換した。即ち、DNAをSSC/CaCl2（50mM NaCl,5mM Na3ク
エン酸塩,67mM CaCl2）1.0mlと氷上で混合し、氷温のコ
ンピテントE.coli RR1（hsd R-M-、ATCC寄託番号 3134
3）細胞2.0mlを加えた。42℃で５分間インキュベートし
た後、ルリアブロス（Ｌブロス）8mlを加えることによ
り希釈し、37℃で４時間インキュベートした。
（４） 初代細胞ライブラリー：形質転換細胞培液を簡
単に遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞をＬブロス1.0m
lに再度懸濁した。画分200μをアンピシリン100μg/m
lを含むルリア寒天（Ｌ寒天）プレート上に移植した。3
7℃で一晩インキュベートした後、各プレートに10mM Tr
is pH7.5,10mM MgCl2 2.5mlを注ぎ、形質転換したコロ
ニーを合わせて掻き取り、プールして初代細胞ライブラ
リーを形成した。
単に遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞をＬブロス1.0m
lに再度懸濁した。画分200μをアンピシリン100μg/m
lを含むルリア寒天（Ｌ寒天）プレート上に移植した。3
7℃で一晩インキュベートした後、各プレートに10mM Tr
is pH7.5,10mM MgCl2 2.5mlを注ぎ、形質転換したコロ
ニーを合わせて掻き取り、プールして初代細胞ライブラ
リーを形成した。
（５）初代プラスミドライブラリー： 初代プラスミド
ライブラリーを以下のように調製した。即ち、初代細胞
ライブラリー2.5mlをアンピシリン100μg/mlを含有する
Ｌブロス500ml中に接種し、この培養液を37℃で一晩振
盪し、次いで4000rpmで５分間遠心分離した。上澄みを
廃棄し、細胞ペレットを室温の25％スクロース,50mM Tr
is,pH8.0 10mlに再度懸濁させ、0.25M EDTA,pH8.0 5ml
を加え、次いでリゾチーム10mg/mlを含有する0.25M Tri
s,pH8.0 3mlを加えた。この溶液を氷上に１時間放置
し、次いで溶解用ミックス（１％Triton X−100,50mM T
ris,pH8.0,67mM EDTA）12mlを勢いよくピペットで入
れ、細胞懸濁液を静かに渦形成して溶解した。溶解後、
混合物を50mlプラスチック遠心分離管に移し、17000rp
m,4℃で45分間回転させた。上澄みをピペットを用いて
取り除いた。固体CsCl 20.0gmを測って50mlねじ蓋付き
プラスチック試験管内に入れ、上澄み22.0gmを試験管内
にピペットで移し、混合した。この混合物にエチジウム
ブロミド溶液（10mM Tris pH8.0,1mM EDTA,100mM NaCl
中にエチジウムブロミド5mg/mlを溶解したもの）1.0ml
を加えた。この溶液を２つの5/8インチ×３インチのポ
リアロマー遠心分離管に移し、密封した。これらの試験
管をBeckman Ti70ローターにおいて44000rpm,17℃で42
時間回転させた。プラスミドを回収するために、試験管
に紫外線を照射し、メスで先端部を穿孔し、２つのDNA
蛍光バンドの下側を注射器で回収した。各試験管から得
た下側のバンドをねじ蓋付きガラス管内に一緒に入れ、
氷温の水飽和Ｎ−ブタノールを同量用いて４回抽出する
ことによりエチジウムブロミドを除去した。
ライブラリーを以下のように調製した。即ち、初代細胞
ライブラリー2.5mlをアンピシリン100μg/mlを含有する
Ｌブロス500ml中に接種し、この培養液を37℃で一晩振
盪し、次いで4000rpmで５分間遠心分離した。上澄みを
廃棄し、細胞ペレットを室温の25％スクロース,50mM Tr
is,pH8.0 10mlに再度懸濁させ、0.25M EDTA,pH8.0 5ml
を加え、次いでリゾチーム10mg/mlを含有する0.25M Tri
s,pH8.0 3mlを加えた。この溶液を氷上に１時間放置
し、次いで溶解用ミックス（１％Triton X−100,50mM T
ris,pH8.0,67mM EDTA）12mlを勢いよくピペットで入
れ、細胞懸濁液を静かに渦形成して溶解した。溶解後、
混合物を50mlプラスチック遠心分離管に移し、17000rp
m,4℃で45分間回転させた。上澄みをピペットを用いて
取り除いた。固体CsCl 20.0gmを測って50mlねじ蓋付き
プラスチック試験管内に入れ、上澄み22.0gmを試験管内
にピペットで移し、混合した。この混合物にエチジウム
ブロミド溶液（10mM Tris pH8.0,1mM EDTA,100mM NaCl
中にエチジウムブロミド5mg/mlを溶解したもの）1.0ml
を加えた。この溶液を２つの5/8インチ×３インチのポ
リアロマー遠心分離管に移し、密封した。これらの試験
管をBeckman Ti70ローターにおいて44000rpm,17℃で42
時間回転させた。プラスミドを回収するために、試験管
に紫外線を照射し、メスで先端部を穿孔し、２つのDNA
蛍光バンドの下側を注射器で回収した。各試験管から得
た下側のバンドをねじ蓋付きガラス管内に一緒に入れ、
氷温の水飽和Ｎ−ブタノールを同量用いて４回抽出する
ことによりエチジウムブロミドを除去した。
抽出した溶液を透析管に移し、DNA緩衝液（10mM Tris
pH7.5,1mM EDTA）を４回替えて24時間透析した。透析
したDNA溶液を予め重量を測定してある50ml滅菌遠心分
離管に移し、その容積を測定した。5M NaClを最終濃度
0.4Mになるまで加え、次いで２容積のイソプロパノール
を加えて混合した。この溶液を−20℃で一晩保存し、DN
Aを沈澱させた。沈澱後、この溶液を15000rpm、０℃で1
5分間回転させ、上澄みを廃棄した。試験管を試験管台
に放置して15分間空気乾燥し、次いでDNAペレットをDNA
緩衝液500μ中に溶解し、−20℃で保存した。このよ
うに調製したプラスミドライブラリーのDNA濃度は100〜
200μg/mlであることが判った。
pH7.5,1mM EDTA）を４回替えて24時間透析した。透析
したDNA溶液を予め重量を測定してある50ml滅菌遠心分
離管に移し、その容積を測定した。5M NaClを最終濃度
0.4Mになるまで加え、次いで２容積のイソプロパノール
を加えて混合した。この溶液を−20℃で一晩保存し、DN
Aを沈澱させた。沈澱後、この溶液を15000rpm、０℃で1
5分間回転させ、上澄みを廃棄した。試験管を試験管台
に放置して15分間空気乾燥し、次いでDNAペレットをDNA
緩衝液500μ中に溶解し、−20℃で保存した。このよ
うに調製したプラスミドライブラリーのDNA濃度は100〜
200μg/mlであることが判った。
（６）プラスミドプールの消化： 初代プラスミドプー
ルを消化し、Xma Iメチラーゼを含まないクローンを以
下のように破壊した。即ち、Sma I消化緩衝液（6mM Tri
s・ECl,pH8.0,6mM MgCl2,6mM 2−メルカプトエタノー
ル、20mM KCl）90μ中のプラスミドライブラリー0.5
μｇをSma I制限酵素20単位（２μ）を用いて25℃で
２時間インキュベートした。消化したDNAをクロロホル
ム抽出及びミクロ遠心分離（microfuge）した。
ルを消化し、Xma Iメチラーゼを含まないクローンを以
下のように破壊した。即ち、Sma I消化緩衝液（6mM Tri
s・ECl,pH8.0,6mM MgCl2,6mM 2−メルカプトエタノー
ル、20mM KCl）90μ中のプラスミドライブラリー0.5
μｇをSma I制限酵素20単位（２μ）を用いて25℃で
２時間インキュベートした。消化したDNAをクロロホル
ム抽出及びミクロ遠心分離（microfuge）した。
（７）形質転換： 前記試験管内の試料122.5μを使
用し、コンピテントE.coli RR1 200μを形成転換し
た。細胞/DNA混合物を、アンピシリン100μg/mlを含む
Ｌ寒天プレート上に移植した。37℃で一晩インキュベー
トした後、このプレートを調査した。Sma Iを用いたプ
ラスミドライブラリーの消化は、104より大きいファク
ターで形質転換の数を減少したことが判った。プレート
から個々のコロニーを採取し、各々をアンピシリンを含
有するＬブロス10ml中に接種し、小培養液を調製し、ア
ンピシリンを含有するＬ寒天プレート上に画線培養して
マスターストックを調製した。
用し、コンピテントE.coli RR1 200μを形成転換し
た。細胞/DNA混合物を、アンピシリン100μg/mlを含む
Ｌ寒天プレート上に移植した。37℃で一晩インキュベー
トした後、このプレートを調査した。Sma Iを用いたプ
ラスミドライブラリーの消化は、104より大きいファク
ターで形質転換の数を減少したことが判った。プレート
から個々のコロニーを採取し、各々をアンピシリンを含
有するＬブロス10ml中に接種し、小培養液を調製し、ア
ンピシリンを含有するＬ寒天プレート上に画線培養して
マスターストックを調製した。
（８）生存個体の解析： ステップ８で得られた生存コ
ロニー29個を10ml培養液に増殖し（ステップ７）、それ
らが担うプラスミドを、Birnboin及びDolyの方法（Nucl
eic Acids Res.7,1513（1979））を一部変更した以外の
プロスミド小体（plasmid miniprep）精製方法により調
製した。
ロニー29個を10ml培養液に増殖し（ステップ７）、それ
らが担うプラスミドを、Birnboin及びDolyの方法（Nucl
eic Acids Res.7,1513（1979））を一部変更した以外の
プロスミド小体（plasmid miniprep）精製方法により調
製した。
プラスミド小体精製方法： 各培養液を8000rpmで５分
間遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞ペレットを、リボ
チーム1mg/mlを含有する25mM Tris,10mM EDTA,50mMグル
コース,pH8.0 1.0ml中に再度懸濁した。室温で10分後、
0.2M NaOH,1％SDS 2.0mlを各試験管に加え、試験管を振
盪して細胞を溶解し、次いで氷上に置いた。一旦溶液が
透明になったら、3M酢酸ナトリウム,pH4.8 1.5mlをそれ
ぞれに加えて振盪した。形成された沈澱物を15000rpm,4
℃で10分間回転させた。各上澄みを、イソプロパノール
3mlを含む遠心分離管に注入し混合した。室温で10分
後、試験管を15000rpmで10分間回転させ、沈澱した核酸
をペレット状にした。上澄みを廃棄し、ペレットを室温
で30分間空気乾燥した。一旦乾燥したならば、ペレット
を10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0 850μに再度懸濁した。
5M NaCl 75μをそれぞれに加え、この溶液をイソプロ
パノール575μを含むEppendorf試験管に移し、室温で
10分間再度沈澱させた。次いで試験管をミクロ遠心分離
器内で45秒間回転させ、上澄みを廃棄し、ペレットを空
気乾燥した。次いでペレットを、RNase 100μg/mlを含
有する10mM tris,1mM EDTA,pH8.0 500μ中に溶解し、
37℃で１時間インキュベートしてRNAを消化した。5M Na
Cl 50μ、次いでイソプロパノール350μを加えるこ
とによりDNAをもう一度沈澱させた。室温で10分後、DNA
を45秒間遠心分離によって回転させ、上澄みを廃棄し、
ペレットを、10mM Tris、1mM DETA,pH8.0 150μの最
終溶液中に溶解した。次いでプラスミド小体をXma Iを
用いて消化することにより解析した。
間遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞ペレットを、リボ
チーム1mg/mlを含有する25mM Tris,10mM EDTA,50mMグル
コース,pH8.0 1.0ml中に再度懸濁した。室温で10分後、
0.2M NaOH,1％SDS 2.0mlを各試験管に加え、試験管を振
盪して細胞を溶解し、次いで氷上に置いた。一旦溶液が
透明になったら、3M酢酸ナトリウム,pH4.8 1.5mlをそれ
ぞれに加えて振盪した。形成された沈澱物を15000rpm,4
℃で10分間回転させた。各上澄みを、イソプロパノール
3mlを含む遠心分離管に注入し混合した。室温で10分
後、試験管を15000rpmで10分間回転させ、沈澱した核酸
をペレット状にした。上澄みを廃棄し、ペレットを室温
で30分間空気乾燥した。一旦乾燥したならば、ペレット
を10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0 850μに再度懸濁した。
5M NaCl 75μをそれぞれに加え、この溶液をイソプロ
パノール575μを含むEppendorf試験管に移し、室温で
10分間再度沈澱させた。次いで試験管をミクロ遠心分離
器内で45秒間回転させ、上澄みを廃棄し、ペレットを空
気乾燥した。次いでペレットを、RNase 100μg/mlを含
有する10mM tris,1mM EDTA,pH8.0 500μ中に溶解し、
37℃で１時間インキュベートしてRNAを消化した。5M Na
Cl 50μ、次いでイソプロパノール350μを加えるこ
とによりDNAをもう一度沈澱させた。室温で10分後、DNA
を45秒間遠心分離によって回転させ、上澄みを廃棄し、
ペレットを、10mM Tris、1mM DETA,pH8.0 150μの最
終溶液中に溶解した。次いでプラスミド小体をXma Iを
用いて消化することにより解析した。
（９）Xma Iメチラーゼ遺伝子クローン： 解析した17
個のプラスミドは、Xma I制限酵素による消化に充分な
耐性を示すことが判った。クローンは長さ約10.3kbのHi
nd III断片を１つ有した（第３図参照）。これらのプラ
スミドは同一であることが判り、次いでXma I修飾メチ
ラーゼ遺伝子のみでなくXma I制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子も担うことが判った。
個のプラスミドは、Xma I制限酵素による消化に充分な
耐性を示すことが判った。クローンは長さ約10.3kbのHi
nd III断片を１つ有した（第３図参照）。これらのプラ
スミドは同一であることが判り、次いでXma I修飾メチ
ラーゼ遺伝子のみでなくXma I制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子も担うことが判った。
（10）Xma I制限遺伝子クローン： 上記（ステップ
９）Xma I修飾メチラーゼ遺伝子を担うとして同定され
たプラスミドの１つをpKLXma I RM 102−２と表記し、
これはXma I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を担うこと
が判った。これは、プラスミドが形質転換によって移入
されたE.coli株K802（ATCC 33526）から調製された抽出
物の制限エンドヌクレアーゼのin vitro解析によって
立証された。
９）Xma I修飾メチラーゼ遺伝子を担うとして同定され
たプラスミドの１つをpKLXma I RM 102−２と表記し、
これはXma I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を担うこと
が判った。これは、プラスミドが形質転換によって移入
されたE.coli株K802（ATCC 33526）から調製された抽出
物の制限エンドヌクレアーゼのin vitro解析によって
立証された。
エンドヌクレアーゼ分析： エンドヌクレアーゼ活性を
解析するために、２種類の溶液を調製した。即ち、
（ｉ）10X制限エンドヌクレアーゼ緩衝液〔100mM Tris,
pH7.5,100mM MgCl2,100mM 2−メルカプトエタノール,50
0mM NaCl〕と、（ii）消化反応ミックス〔Hind III消化
λDNA（500μg/ml）55μ,10X制限エンドヌクレアーゼ
緩衝液55μ,DNA 50μg/mlを得るような蒸留水440μ
〕とである。
解析するために、２種類の溶液を調製した。即ち、
（ｉ）10X制限エンドヌクレアーゼ緩衝液〔100mM Tris,
pH7.5,100mM MgCl2,100mM 2−メルカプトエタノール,50
0mM NaCl〕と、（ii）消化反応ミックス〔Hind III消化
λDNA（500μg/ml）55μ,10X制限エンドヌクレアーゼ
緩衝液55μ,DNA 50μg/mlを得るような蒸留水440μ
〕とである。
細胞抽出物を以下のように調製した。即ち、クローン
培養液100mlを、アンピシリン100μg/mlを含有するＬブ
ロス中で37℃で一晩増殖させ、細胞を4000rpmで５分間
遠心分離することによりペレット状にした。上澄みを廃
棄し、ペレットを音波処理緩衝液（50mM KPO4,pH7.5,10
mM BME,0.1mM EDTA）3ml中に再度懸濁した。リゾチーム
10mg/mlを含有する音波処理緩衝液0.3mlを加え、この懸
濁液を渦形成し、氷上に１時間放置した。試料1mlをEpp
endorf試験管に移し、静かに音波処理しながら途中で10
秒間ずつ３回激しく振盪して細胞を破壊した。試験管を
ミクロ遠心分離機内で５分間回転させ、上澄みを細胞抽
出物として使用した。抽出物を分析するために、消化反
応ミックスを５本の試験管に、第１の試験管には150μ
、残りの４本の試験管にはそれぞれ100μずつ分配
した。第１の試験管には抽出物7.5μを加えて混合
し、この第１の試験管から47.5μを取り出して第２の
試験管に移入して混合する等を繰り返した。即ち、第１
の試験管はDNA1μｇ当たり抽出物1.0μを受容し、第
２の試験管は0.3μ／μｇを受容し、第３の試験管は
0.1μ／μｇを受容する等となった。各々が100μを
含む試験管を37℃で１時間インキュベートし、次いで各
々の試料20μをゲル電気泳動によって分析した。抽出
物の力価は1ml当たり約１×103単位であることが判り、
これは細胞1g当たりXma I制限エンドヌクレアーゼ約１
〜２×105単位に相当する（第４図参照）。
培養液100mlを、アンピシリン100μg/mlを含有するＬブ
ロス中で37℃で一晩増殖させ、細胞を4000rpmで５分間
遠心分離することによりペレット状にした。上澄みを廃
棄し、ペレットを音波処理緩衝液（50mM KPO4,pH7.5,10
mM BME,0.1mM EDTA）3ml中に再度懸濁した。リゾチーム
10mg/mlを含有する音波処理緩衝液0.3mlを加え、この懸
濁液を渦形成し、氷上に１時間放置した。試料1mlをEpp
endorf試験管に移し、静かに音波処理しながら途中で10
秒間ずつ３回激しく振盪して細胞を破壊した。試験管を
ミクロ遠心分離機内で５分間回転させ、上澄みを細胞抽
出物として使用した。抽出物を分析するために、消化反
応ミックスを５本の試験管に、第１の試験管には150μ
、残りの４本の試験管にはそれぞれ100μずつ分配
した。第１の試験管には抽出物7.5μを加えて混合
し、この第１の試験管から47.5μを取り出して第２の
試験管に移入して混合する等を繰り返した。即ち、第１
の試験管はDNA1μｇ当たり抽出物1.0μを受容し、第
２の試験管は0.3μ／μｇを受容し、第３の試験管は
0.1μ／μｇを受容する等となった。各々が100μを
含む試験管を37℃で１時間インキュベートし、次いで各
々の試料20μをゲル電気泳動によって分析した。抽出
物の力価は1ml当たり約１×103単位であることが判り、
これは細胞1g当たりXma I制限エンドヌクレアーゼ約１
〜２×105単位に相当する（第４図参照）。
第１図はXma I制限エンドヌクレアーゼをクローニング
及び生産するためのスキームを説明する図、第２図は第
２のXma I/Sma I部位を含むpUC19クローニングベクター
誘導体pKL19−２の制限マップの図、第３図はXma I制限
エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする1
0.3kbのHind III挿入断片の制限マップの図並びに第４
図はpKL Xma I RM102−２の粗抽出物から得られるXma I
制限エンドヌクレアーゼ活性を説明するアガロースゲル
の電気泳動で得られた粒子構造の写真である。
及び生産するためのスキームを説明する図、第２図は第
２のXma I/Sma I部位を含むpUC19クローニングベクター
誘導体pKL19−２の制限マップの図、第３図はXma I制限
エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする1
0.3kbのHind III挿入断片の制限マップの図並びに第４
図はpKL Xma I RM102−２の粗抽出物から得られるXma I
制限エンドヌクレアーゼ活性を説明するアガロースゲル
の電気泳動で得られた粒子構造の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭61−265094（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，112（３) （1977），Ｐ．521−９ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (5)
- 【請求項１】xanthomonas malvacaerum（ATCC No.992
4）由来のXma I制限エンドヌクレアーゼをコードしてい
て、図 に示されているような制限部位を有し、上記制限エンド
ヌクレアーゼがDNA配列Ｃ↓CCGGGを認識して上記DNA配
列中５′側最初のＣとＣの間の矢印により示されている
位置にて切断するものである、単離されたDNAセグメン
ト。 - 【請求項２】請求項１に記載の単離されたDNAセグメン
トが挿入されているベクターを有する組み換えDNAベク
ター。 - 【請求項３】請求項１に記載の単離されたDNAセグメン
トを有するクローニングベクター。 - 【請求項４】請求項２または３のベクターにより形質転
換された宿主細胞。 - 【請求項５】請求項２または３に記載のベクターにより
形質転換された宿主細胞を、下記制限エンドヌクレアー
ゼの発現に適した条件下に培養することを含む、Xma I
制限エンドヌクレアーゼを製造する方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/344,268 US5002882A (en) | 1989-04-27 | 1989-04-27 | Method for producing the XmaI restriction endonuclease and methylase |
| US344,268 | 1994-11-23 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0361491A JPH0361491A (ja) | 1991-03-18 |
| JP2952003B2 true JP2952003B2 (ja) | 1999-09-20 |
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ID=23349779
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2115010A Expired - Lifetime JP2952003B2 (ja) | 1989-04-27 | 1990-04-27 | ＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの生産方法 |
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|---|---|
| US (1) | US5002882A (ja) |
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| JP (1) | JP2952003B2 (ja) |
| DE (2) | DE69032630T2 (ja) |
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| US5192676A (en) * | 1991-02-05 | 1993-03-09 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same |
| US5200337A (en) * | 1991-10-25 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, apo i, obtainable from arthrobacter protophormiae and a process for producing the same |
| EP0555797A1 (en) * | 1992-02-10 | 1993-08-18 | Becton, Dickinson and Company | General buffer for restriction endonucleases |
| US5231021A (en) * | 1992-04-10 | 1993-07-27 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expressing restriction endonucleases and modification methylases from xanthomonas |
| US5248605A (en) * | 1992-12-07 | 1993-09-28 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expressing restriction endonucleases from haemophilus |
| US5312746A (en) * | 1993-01-08 | 1994-05-17 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expressing restriction endonucleases and modification methylases from caryophanon |
| US5334526A (en) * | 1993-05-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expression of AluI restriction endonuclease |
| WO1996007803A1 (en) * | 1994-09-08 | 1996-03-14 | Non-Compact, Inc. | System for mounting building panels |
| EP2565267A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-03-06 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| US9085798B2 (en) | 2009-04-30 | 2015-07-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
| EP2556171B1 (en) | 2010-04-05 | 2015-09-02 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US20120258871A1 (en) | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Prognosys Biosciences, Inc. | Peptide constructs and assay systems |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| CA2907050C (en) | 2013-03-15 | 2023-09-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods for detecting peptide/mhc/tcr binding |
| DK3013983T3 (da) | 2013-06-25 | 2023-03-06 | Prognosys Biosciences Inc | Spatialt kodede biologiske assays ved brug af en mikrofluidisk anordning |
| WO2015070037A2 (en) | 2013-11-08 | 2015-05-14 | Prognosys Biosciences, Inc. | Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection |
| DK3901281T3 (da) | 2015-04-10 | 2023-01-23 | Spatial Transcriptomics Ab | Rumligt adskilt, multipleks nukleinsyreanalyse af biologiske prøver |
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| WO2020123319A2 (en) | 2018-12-10 | 2020-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods of using master / copy arrays for spatial detection |
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| WO2021091611A1 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing |
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| US11821035B1 (en) | 2020-01-29 | 2023-11-21 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods of making gene expression libraries |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
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| WO2021252499A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
| EP4165207A1 (en) | 2020-06-10 | 2023-04-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for determining a location of an analyte in a biological sample |
| WO2021263111A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-30 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of dna methylation |
| US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
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| AU2022238446A1 (en) | 2021-03-18 | 2023-09-07 | 10X Genomics, Inc. | Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample |
| EP4196605A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-06-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
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-
1989
- 1989-04-27 US US07/344,268 patent/US5002882A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-04-25 DE DE69032630T patent/DE69032630T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-25 DE DE90304413T patent/DE395367T1/de active Pending
- 1990-04-25 EP EP90304413A patent/EP0395367B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-27 JP JP2115010A patent/JP2952003B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２（３）（１９７７），Ｐ．５２１−９ |
Also Published As
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|---|---|
| JPH0361491A (ja) | 1991-03-18 |
| DE395367T1 (de) | 1994-02-03 |
| DE69032630D1 (de) | 1998-10-15 |
| US5002882A (en) | 1991-03-26 |
| EP0395367A1 (en) | 1990-10-31 |
| DE69032630T2 (de) | 1999-03-25 |
| EP0395367B1 (en) | 1998-09-09 |
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| ENDONUCLEASE | Looney et al.[45] Date of Patent: Mar. 12, 1991 | |
| ENDONUCLEASE | Barsomian et al. |
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