JP2703786B2

JP2703786B2 - ＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。

Info

Publication number: JP2703786B2
Application number: JP63317571A
Authority: JP
Inventors: シユーツイ・チエン; ジエフリー・ウイルソン
Original assignee: ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド
Priority date: 1987-12-17
Filing date: 1988-12-15
Publication date: 1998-01-26
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: EP0321267B1; EP0321267A3; JPH022366A; US5004691A; EP0321267A2; DE3853143D1; DE3853143T2; ATE118816T1

Description

【発明の詳細な説明】発明のバックグラウンド本発明は、制限エンドヌクレアーゼAccIおよびその修
飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこれら
の酵素を製造する方法に係る。

制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中にみられる酵
素の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する
他の細菌成分から精製すると、実験室でDNA分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、DNA分子はひとつずつ独
自に固定することができ、また分画してその構成遺伝子
を単離することができる。制限エンドヌクレアーゼは現
代の遺伝子研究における不可欠の手段であることが立証
されている。これらの酵素は生化学的な「ハサミ」であ
り、これによって遺伝子の工学および解析が達成され
る。

制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。これら酵素はDNA分
子に結合すると、その配列の内部または一端でその分子
を開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼはそれぞれ
異なる認識配列に対して親和力をもっている。今日まで
に調べられた幾百種もの細菌で百を越える数の異なる制
限エンドヌクレアーゼが同定されている。

細菌は、その種毎に、精々数種だけの制限エンドヌク
レアーゼをもつという傾向がある。これらのエンドヌク
レアーゼは、通常、それの由来となった細菌に因んで命
名される。たとえば、Haemophilus aegyptiusはHaeI、H
aeIIおよびHaeIIIとよばれる３つの異なる制限エンドヌ
クレアーゼを合成する。これらの酵素は、それぞれ（A
T）GGCC（AT）、PuGCGCPyおよびGGCCという配列を認識
して開裂する。一方、大腸菌Escherichiacoli RY13は１
種類の酵素EcoRIを合成するだけであり、この酵素はGAA
TTCという配列を認識する。

理論に縛られるつもりはないが、自然界で制限エンド
ヌクレアーゼは細菌細胞の繁殖に関して保護的な役割を
果たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、
細菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたは
これらに寄生したりするウィルスやプラスミドのような
外来DNA分子による感染に対して抵抗することが可能に
なる。制限エンドヌクレアーゼは、侵入して来るDNA分
子の端から端まで精査し、認識配列に出会う度毎にそれ
らのDNA分子を開裂することによって、細菌に抵抗性を
付与する。こうして生起する破壊の結果、侵入する遺伝
子の多くは無能となり、そのDNAはエキソヌクレアーゼ
によってさらに細かく分解されるようになる。

細菌の防御系の第二の要素は修飾メチラーゼである。
これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であ
り、これによって、細菌が外来の感染性DNAから自身のD
NAを防御し区別できるようにする手段が提供される。修
飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ
ヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、こ
のDNAを破断する代わりに、メチル基を付加することに
よってその配列内のヌクレオチドのいずれかを化学的に
修飾する。このメチル化が起こると、その認識配列に制
限エンドヌクレアーゼが結合することはなく、また、そ
の配列が制限エンドヌクレアーゼによって開裂されるこ
ともない。細菌細胞のDNAはその修飾メチラーゼの活性
のおかげでいつも完全に修飾されており、したがって自
身の内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対する感受
性は完全に消失している。制限エンドヌクレアーゼの認
識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のDNA、した
がって外来のものであることが確認できるDNAだけであ
る。

遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をク
ローニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質
や酵素を従来の精製技術で入手可能な量より大量に生産
することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローンを単離する際の鍵は、そのようなクローンの
出現頻度が10^-4〜10^-3程度に低い場合、複雑な「ライブ
ラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られるクロ
ーンの集団の中で目的とするクローンを同定するための
簡単で信頼のおける方法を開発することである。好まし
くは、この方法は、目的としない大多数のクローンは破
壊されるが珍にある望ましいクローンは生き残れるよう
に、選択的であるべきである。

II型の制限−修飾系はクローニングされつつあり、そ
の数は次第に増加している。最初にクローニングされた
系は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選
択する手段としてバクテリオファージによる感染を使用
した［EcoRII:Kosykh et al.,Molec.gen.Genet.,178:71
7−719（1980）;HhaII:Mann et al.,Gene,3:97−112（1
978）;PstI:Walder et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,78,
1503−1507（1981）］。細菌中に制限−修飾系が存在す
ると細菌はバクテリオファージによる感染に対して抵抗
できるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を担
持する細胞は、原理的に、ファージに暴露したライブラ
リーから生えて来る（生き残る）株として選択的に単離
することができる。しかしこの方法は限られた系でしか
価値がないことが判明した。特定的にいうと、クローニ
ングされた制限−修飾遺伝子は、選択的な生き残りを可
能にする程に充分なファージイ耐性を常に発現するとは
限らないことが判明したのである。

もうひとつ別のクローニング法では、最初プラスミド
由来とされていた系をＥ．coliクローニングプラスミド
中に組み込んでいる［EcoRV:Bougueleret et al.,Nucle
ic Acids Res.,12:3659−3676（1984）;PaeR7:Gingeras
and Brooks,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:402−406（19
83）;Theriault and Roy,Gene,19:355−359（1982）;Pv
uII;Blumenthal at al.,J.Bacteriol.,164:501−509（1
985）］。

第三の方法、すなわち多くの系のクローニングに使用
されている方法では、本発明者らの特許出願第707079号
に関連する活性なメチラーゼ遺伝子について選択する
［BsuRI:Kiss et al.,Nucleic Acids Res.,13:6403−64
21（1985）］。制限遺伝子と修飾遺伝子とは近接して結
合している傾向があるので、両者の遺伝子を含有するク
ローンは一方の遺伝子について選択するだけで単離でき
ることが多い。しかし、メチル化活性による選択では常
に完全な制限−修飾系が得られるわけではなく、逆に、
メチラーゼ遺伝子のみが得られることもある［BspRI:Sz
omolanyi et al.,Gene,10:219−225（1980）;BcnI:Janu
laitis et al.,Gene,20:197−204（1982）;BsuRI:Kiss
and Baldauf,Gene,21:111−119（1983）；およびMspI:W
alder et al.,J.Biol.Chem.,258:1235−1241（198
3）］。

制限−修飾遺伝子のクローニングに対する考えられる
障害は、修飾によって保護されていない宿主中にエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メ
チラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒に
単一のDNAセグメントに導入すると、エンドヌクレアー
ゼが宿主DNAを開裂する機会を得る前にメチラーゼがそ
のDNAを修飾して保護するはずである。Ｅ．coli中での
制限−修飾系のクローニングに対する別の障害が、種々
のメチラーゼをクローニングする過程で発見された。す
なわち、多くのＥ．coli株は、メチル化シトシンを含有
しているDNAの導入に抵抗する系をもっているのである
［Raleigh and Wilson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:907
0−9074（1986）］。したがって、どのＥ．coli株をク
ローニングに使用するかを注意深く吟味して、修飾に対
して逆に反応するものを避ける必要がある。

精製した制限エンドヌクレアーゼ、および重要性はそ
れより落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でDNAの特定
決定と再配列をするのに有用な道具であるから、これら
の酵素を大量に合成する細菌株を組換えDNA技術によっ
て得ることは商業的な魅力がある。そのような株が得ら
れれば、商業的に有用な量で生産するための手段が提供
されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思われる
ので、極めて有用なものとなるであろう。

発明の概要本発明によって、Acinetobacter calcoaceticusに由
来するAccI制御エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラー
ゼの遺伝子を含有するクローン、ならびにこれら酵素の
生産方法が提供される。より特定すると、本発明は、
５′…GT（AC）（GT）AC…３′というDNA配列を認識し
て最初のＴの後で開裂する制限エンドヌクレアーゼAccI
を発現するクローンに係る。

この酵素をクローニングする好ましい方法は、Acinet
obacter calcoaceticusに由来するDNAを含有するライブ
ラリーを形成し、AccI修飾メチラーゼをコードしている
DNAを含有するクローンを単離し、これらをスクリーニ
ングして、AccI制御エンドヌクレアーゼ遺伝子も共にに
含有しているクローンを同定することからなる。

発明の詳細な説明本発明は、AccI制限および修飾遺伝子のクローン、な
らびにそのようなクローンによって生産される制限エン
ドヌクレアーゼAccIに係る。これらのAccI遺伝子は、Ac
cI修飾メチラーゼ遺伝子を含有し発現することに基づい
て選択したいくつかのクローンが同時にAccI制限遺伝子
も含有しているという事実を利用する方法によってクロ
ーニングするのが好ましい。そのようなクローンのDNA
はAccI制限エンドヌクレアーゼによるin vitro消化に抵
抗性である。この消化に対する抵抗性によって、AccIメ
チラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼをコードしてい
るクローンを選択的に単離するための手段が得られる。

AccI制限遺伝子およびメチラーゼ遺伝子をクローニン
グして発現させるための本発明の好ましい方法を第１図
に示すが、これには以下のステップが含まれる。

（１）Acinetobacter calcoaceticusのDNAを精製する。
この微生物のサンプルはThe American Type Culture Co
llectionからATCC 53701として入手可能である。

（２）このDNAをEcoRIのような制限エンドヌクレアーゼ
で部分消化する。

（３）消化したDNAを、１個以上のAccI部位を含有するp
BR322（ATCC 37017）のようなクローニングベクターに
連結する。連結した混合物を用いてＥ．coli RR1（ATCC
31343）のような適当な宿主細胞を形質転換する。

（４）形質転換した混合物を、形質転換細胞を選択する
ためのアンピシリンのような抗生物質を含有する培地
（Amp plates）に接種する。培養後形質転換細胞コロニ
ーをひとつに集めてセルライブラリーとする。

（５）このセルライブラリーから組換えプラスミド全部
をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成す
る。

（６）次にこのプラスミドライブラリーをAccI制限エン
ドヌクレアーゼ（New England Biolabs,Inc.から市販、
カタログ＃161）で完全にin vitro消化する。AccI制限
エンドヌクレアーゼ消化の結果、メチラーゼを含有しな
い未修飾クローンの特異的開裂が生じ、生き残る完全な
プラスミド全体に対するAccIメチラーゼ担体クローンの
頻度が増大する。消化後このライブラリーをホスファタ
ーゼで処理して、消化された分子の形質転換能をさらに
低下させる。

（７）消化したプラスミドライブラリーをＥ．coli PR1
株のような宿主に形質転換し、抗生物質含有培地（Amp
Plates）に接種して再度形質転換コロニーを得る。これ
らのコロニーを採取し、以下の方法でAccI修飾遺伝子の
存在について個別に分析する。すなわち、コロニーが担
持するプラスミドDNAを精製し、AccI制限エンドヌクレ
アーゼと共にin vitroでインキュベートしてAccI消化に
対して抵抗性か否かを決定する。また、これらのクロー
ンから細胞の全DNA（染色体およびプラスミド）も精製
し、AccI制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベート
する。AccIメチラーゼ遺伝子を担持するクローンのDNA
は充分にメチル化されているはずであり、プラスミドDN
Aと全DNAは両方とも消化に対して実質的または完全に抵
抗性であるとが判明するはずである。

（８）ステップ（７）でAccIメチラーゼ遺伝子を担持す
ると同定されたクローンの粗抽出物を調製し、この粗抽
出物のAccI制限エンドヌクレアーゼ活性を検定すること
によって、AccI制限エンドヌクレアーゼを担持するクロ
ーンを同定する。粗細胞抽出物中のAccI制限エンドヌク
レアーゼ活性の検出は、形質転換によってプラスミドが
移入されているＥ．coliのMM294株（ATCC 33625）のよ
うなendoA^-から抽出物を調製すると容易になる。

（９）コピー数の多いベクターを使用して遺伝子量を高
めることによって、また活性の高い外因性プローモータ
ーを使用して転写速度を上げることによって、クローン
のAccI制限エンドヌクレアーゼ産生量を増大させること
ができる。

（10）AccI制限および修飾遺伝子を担持しているクロー
ンを醗酵槽内のアンピシリン含有富化培地中で増殖させ
ることによって、AccI制限エンドヌクレアーゼを生産す
ることができる。その後遠心して細胞を集め、音波処理
で破砕すると、AccI制限エンドヌクレアーゼ活性を含有
する粗細胞抽出物が生成する。

（11）AccI制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細
胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィーやイオ
ン交換クロマトグラフィーのように標準的なタンパク質
精製技術によって精製する。

上に概略を記載した手順は本発明の好ましい実施態様
であるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変え
ることができるということは当業者には明らかであろ
う。

以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示す
るが、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の
範囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定
されることはないものと考えられたい。

実施例 AccI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング（１）DNAの精製： Acinetobacter calcoaceticus（ATCC 53701）の細胞
ペースト8gを32mlの25％スクロース,50mM Tris pH8.0中
に再懸濁させた。16mlの0.25M EDTA pH 8.0および10ml
の10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris pH 8.0中）を加え、
混合物を２時間氷上に放置した。40mlの１％Triton X−
100,50mM Tris pH 8.0,62mM EDTAおよび1mlの10％SDSを
加え、得られた溶液を混合して溶菌させた。得られた懸
濁液を、新たに平衡化した（0.5M Tris, pH 8.0）フェ
ノール90mlおよびクロロホルム90mlで二回抽出した後、
10K rpmで30分遠心した。粘稠な上層を透析チューブに
移し、DNA緩衝液（10mM Tris pH 7.5,1mM EDTA）に対し
この緩衝液を四回交換して透析した。透析した溶液を40
0mlのビーカーに移し、容積を測定した（150ml）。10mg
/ml RNaseを1.5ml加えて100μg/ml RNaseとし、その溶
液を１時間37℃にインキュベートした。この溶液中に5M
NaClを13ml混入し、頂部に92mlのイソプロパノールを
重層し、得られた溶液をガラス棒で掻き混ぜた。細菌の
DNAが沈澱しながらガラス棒に巻き付いたので、これを
取り出して風乾した後6mlのDNA緩衝液に溶解した。

（２）部分消化：精製したDNAを80μｇ含有する800μｇの10mM Tris pH
7.5,10mMメルカプトエタノール,100mM NaClを調製し、
そのうちの100μｌを８本の別々のチューブに分注し
た。第１のチューブにはEcoRI制限エンドヌクレアーゼ
を10unit加えてDNA1.0unit/μｇとした。（第２のチュ
ーブにはEcoRIを5unit加えた（0.5unit/μｇ）。以下、
次のチューブにはまた半分の量のEcoRIを入れ、残りの
チューブも同様にした。これらのチューブを１時間37℃
にインキュベートし、次に72℃で15分間熱処理した後、
各々の10μｇをアガロースゲル電気泳動によって分析し
た。適度ではあるが不完全な消化状態を示すチューブを
選んで、クローニング用の部分消化断片源とした。（こ
れらは0.5u/μｇ、0.25u/μｇおよび0.125u/μｇのチュ
ーブであった。これら３つの溶液を合わせて混合し、以
下に記載するようにして使用した。）（３）連結： EcoRIで部分消化したA.calcoaceticus DNA4.0μｇ（4
0μｌ）を、EcoRIで開裂し脱リン酸化したpBR322（ATCC
37017）2.0μｇ（20μｌ）と混合した。５×連結用mix
（250mM Tris pH 7.5,50mM MgCl₂,50mM DTT,5mM ATP）
を20μｌ加え、さらに滅菌蒸溜水を16μｌ加えて最終容
積を100μｌとした。T4DNAリガーゼを４μｌ加え、得ら
れた混合物を４時間16℃にインキュベートした。こうし
て連結したDNAを用い、以下のようにしてＥ．coli RR1
株（ATCC 31343）を形質転換した。すなわち、連結した
DNA50μｌを氷上で450μｌのSSC/CaCl₂（50mM NaCl,5mM
クエン酸Na₃,67mMCaCl₂）と混合し、氷冷したＥ．coli
RR1コンピテント細胞（hsdR^-M^-，McrB^-）を1200μｌ加
えた。43℃で３分間の熱ショックを与えた後、細胞を10
mlのluria−ブロス（Ｌ−broth）中に希釈し、飽和する
まで37℃で増殖させた。

（４）セルライブラリー：形質転換した細胞の培養液を遠心した後、上清を捨
て、細胞を1mlのLuriaブロスに再懸濁させた。そのうち
の200μｌを、アンピシリンを100μg/ml含有するLuria
−寒天（Ｌ−agar）プレート上に接種した。37℃で一晩
培養後、各プレートに2.5mlの10mM Tris pH 7.5,10mM
（MgCl₂を満たし、形質転換したコロニーを掻き集め、
プールしてセルライブラリーを形成した。

（５）プラスミドライブラリー： 2.5mlのセルライブラリーを、アンピシリンを100μg/
ml含有するＬ−broth500ml中に接種した。37℃で一晩振
盪培養した後、4K rpmで５分遠心した。上清を捨て、細
胞ペレットを10mlの25％スクロース,50mM Tris pH 8.0
に室温で再懸濁させた。0.25M EDTA,pH 8.0を5ml加え、
次いで10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris,pH 8.0中）を3m
l加えた。得られた溶液を氷上に１時間放置した後、12m
lの溶菌用mix（１％ Triton X−100,50mM Tris pH 8.0,
67mM EDTA）をピペットで激しく注入すると、細胞懸濁
液は穏やかに渦を巻いて溶菌が起こった。溶菌後混合物
を50mlのプラスチック製遠心管に移して15Krpm,4℃で45
分間遠心した。ピペットで上清を取り出した。固体のCs
Clを20.0g秤量して50mlのプラスチック製ネジブタ付き
チューブに入れ、このチューブ中に上清22.0gをピペッ
トで入れて混合した。得られた混合物に、5mg/mlのエチ
ジウムプロミド（10mM Tris pH 8.0,1mM EDTA,100mM Na
Cl中）を、1.0ml加えた。この溶液を、5/8in×3inのpol
yallomer遠心管２本に移して密封した。次いで、これら
をTi70ローター中44Krpm,17℃で42時間回転させた。プ
ラスミドを集めるために、これらの管の頂部にメスを突
き通し、紫外光下２本のケイ光DNAバンドの下側の方を
注射器で集めた。２本の管から得た下側のバンドをネジ
ブタ付ガラス管の中へ一緒に入れ、等容量の氷冷ｎ−ブ
タノールで四回抽出することによってエチジウムプロミ
ドを除去した。

抽出された溶液を透析チューブに移し、DNA緩衝液を
四回交換しながら24時間この緩衝液に対して透析した。
透析したDNA溶液を15mlのプラスチック製ネジブタ付チ
ューブに移した。プラスミドDNA濃度は約100μg/mlであ
った。

（６）プラスミドライブラリーの消化： 200μｌの10mM Tris pH 7.5,10mM MgCl₂,10mMメルカ
プトエタノール,50mM NaCl中で、５μｇのプラスミドDN
Aを20unitのAccI制限エンドヌクレアーゼで消化した。
チューブを１時間37℃にインキュベートした後、10分間
72℃に加熱して消化を停止させた。得られた溶液を等容
量のフェノールとクロロホルムで一回抽出した後、イソ
プロパノールを400μｌ加えてDNAを沈澱させた。沈澱し
たDNAを遠心して集め、DNA緩衝液（pH9.0）20μｌに再
懸濁させて250μg/mlDNAとした。細菌のアルカリ性ホス
ファターゼを0.4unit加え、68℃で２時間チューブをイ
ンキュベートした。80μｌのDNA緩衝液と80μｇのクロ
ロホルムを加え、得られた混合物を激しく混合して乳化
し、次に遠心によって透明にした。脱リン酸化したDNA
をイソプロパノールで再沈澱させ、100μｌの反応液中
で12unitのAccIを用いて再び消化した。

（７）形質転換： AccIで消化しホスファターゼで処理したプラスミドラ
イブラリーをＥ．coli RR1中に形質転換した。細胞/DNA
混合物を、アンピシリンを100μg/ml含有するＬ−agar
プレートに接種し、一晩37℃にインキュベートした。プ
レート上で生き残ったコロニーはおよそ60個であった。
これらのうち28個のコロニーを、それぞれ、10mlのアン
ピシリン含有Ｌ−broth中に接種してミニカルチャー
（小培養物）を調製し、アンピシリンを含有するＬ−ag
arプレート上に画線してマスターストックを調製した。

（８）生き残った固体の解析： 28個の生き残ったコロニーを10mlになるまで増殖さ
せ、これらが担持するプラスミドを、Birnboin and Dol
y,Nucleic Acid Res..7:1513（1979）の方法を応用した
以下のminiprep精製法によって調製した。

miniprep法：各培養物を以下のように処理した。すなわち、一晩培
養した細胞10mlを8Krpmで５分間ペレット化した。上清
を流し出し、得られた細胞ペレットを、1mg/mlリゾチー
ムを含有する1.0mlの25mM Tris pH 8.0,10mM EDTA,50mM
グルコース中に再懸濁させた。室温に10分間置いた後、
2.0mlの0.2M NaOH,1％SDSを加え、チューブを振盪して
細胞を溶解し、次いで氷上に置いた。溶液が透明になっ
てから3M酢酸ナトリウム（pH4.8）を1.5ml加えて振盪し
た。生じた沈澱を15Krpm,4℃で10分間遠心して沈ませ
た。得られた上清を、イソプロパノールを3ml含有する
遠心管に流し入れて混合した。室温で10分経った後遠心
管を15Krpmで10分間遠心して沈澱した核酸をペレット化
した。上清を捨て、ペレットを室温で30分風乾した。乾
燥した後ペレットを500μｌのDNA緩衝液に再懸濁し、Ep
pendorfチューブに移した。この溶液をフェノールとク
ロロホルムで一回抽出した後再度イソプロパノールで沈
澱させた。チューブをmicrofuge中で２分間回転し、上
清を捨ててペレットを風乾した。このペレットを、次い
で、RNaseを100μg/ml含有するDNA緩衝液100μｌに溶解
し、１時間37℃にインキュベートした。インキュベーシ
ョン後プラスミドminiprep（小調製物）を−20℃で貯蔵
し、次いでAccIとEcoRIで消化して解析した。

（９）メチラーゼ遺伝子のクローン：解析したプラスミドのうちほぼ半分が、Ａ．calcoace
ticusDNAのランダムなEcoRI断片を担持しておりAccI消
化に対して感受性であることが判明した。これらのプラ
スミドはにせものであるので捨てた。残りのプラスミド
は、AccIに対して抵抗性であり、長さが約3.8、2.5、2.
4、1.8及び1.2kbの５種類までのEcoRI断片を担持してい
ることが判明した（第２図）。５種の断片をすべて含有
しているプラスミドのひとつpSC161RM 1−８をさらに解
析したところ、AccI修飾メチラーゼ遺伝子とAccI制限遺
伝子が両方とも担持していることが判明した。

（10）制限遺伝子クローン：形質転換によってプラスミドpSC161RM 1−８を導入し
たE.coliMM294株（ATCC 33625）から調製した抽出物を
検定することにより、このプラスミドはAccI制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を担持していることが判明した。

エンドヌクレアーゼアッセイ：エンドヌクレアーゼ活性について検定するために２種
の溶液を調製した。

（１）10×制限エンドヌクレアーゼ緩衝液:100mM Tris
pH 7.5,100mM MgCl₂,100mMメルカプトエタノール,500mM
NaCl。

（２）消化反応用mix:100μｌλ−DNA（500μg/ml）,10
0μｌの10×制限エンドヌクレアーゼ緩衝液,800μｌ蒸
溜水（50μg/mlDNAとする）。

以下のようにして細胞抽出物を調製した。培養したク
ローン50mlをＬ−broth＋100μg/mlアンピシリン中で一
晩増殖させ、4Krpmで５分間遠心して細胞をペレット化
した。上清を捨て、ペレットを3mlの音波処理用緩衝液
（10mM Tris pH 7.5,10mMメルカプトエタノール,0.1Mm
EDTA）中に再懸濁させた。再懸濁後、10mg/mlリゾチー
ムを含有する音波処理用緩衝液を0.3ml加えた。得られ
た懸濁液を攪拌して渦を作り、１時間氷上に放置した。
サンプル1mlをEppendorfチューブに移し、10秒ずつ三回
穏やかに音波処理して細胞を破砕した。このチューブを
microfuge中で５分間回転し、上清を細胞抽出物として
使用した。

この抽出物を検定するために、消化反応用mixを５本
のチューブに、最初の１本は150μｌ、残りの４本は10
2.5μｌずつ分注した。最初のチューブに抽出物7.5μｌ
を入れた。最初のチューブから47.5μｌを取り出して第
二のチューブに移して混合した後再び移した。これを繰
り返して、最初のチューブがDNA 1μｇ当たり抽出物１
μｌ（すなわち１μl/μｇ）、第二のチューブが0.3μl
/μｇ、第三のチューブが0.1μl/μｇ、等とした。こう
して各々の内容量を100μｌとしたチューブを１時間37
℃にインキュベートした後、各チューブのサンプル20μ
ｌをゲル電気泳動によって分析した。

pSC161RM 1−６を担持するE.coil MM294の抽出物は、
1mlに付き約50unitのAccI制限エンドヌクレアーゼを含
有していることが判明した。

（11）pSC161RM 1−８からの4.2kb ClaI断片の単離：精製したpSC161RM 1−8 DNA 150μｌ（15μｇ）を、5
00μｌの50mM Tris pH 8.0,50mM NaCl,10mM MgCl₂中で3
0unit（６μｌ）のClaI制御酵素を用いて37℃で２時間
消化した。10分間72℃に加熱して消化を停止させた。得
られた溶液を、TAE緩衝液（40mM Tris pH 8.2,20mM酢酸
Na,1mM EDTA）中で調製した。0.01％SDSと0.5μg/mlエ
チジウムブロミドを含む１％アガローススラブゲルにTA
E緩衝液中で通して電気泳動させた。UV照射下で4.2Kbバ
ンドを切り出した。このゲルスライスを5mlの注射器に
入れ、＃21ゲージ針を通して、3mlのTAEと0.01％SDSを
含有する50ml遠心管中に押し出し、細いガラス棒で穏や
かに混合した。この遠心管を17Krpmで45分間回転した。
上清を別の50mlの遠心管に移し、300μｌの5M NaClと6m
lの100％イソプロパノールを加えた。遠心管を１時間−
70℃に貯蔵した後、再び17Krpmで15分間遠心にた。得ら
れたDNAペレットを400μｌのDNA緩衝液に懸濁させた。
この溶液を、等容量のフェノールとクロロホルムで一
回、水で平衡化したエーテルで三回抽出した。断片をイ
ソプロパノール0.8mlで再沈澱させた後20μlnoDNA緩衝
液安価に再懸濁させた。この断片の純度と濃度はゲル電
気泳動で決定した。

（12）4.2Kb ClaI断片のpUC19への連結：精製した断片0.5μｇ（７μｌ）を、30μｌの連結用
緩衝液（50mM Tris,pH 7.5,10mM MgCl₂,40mM DTT,1mM A
TP）中で、AccIで開裂して脱リン酸化したpUC19（ATCC
37254）１μｇ（２μｌ）と混合した。T4DNAリガーゼを
1.5μｌ加え、得られた混合物を４時間16℃にインキュ
ベートした。連結した混合物15μｌをＥ．coli MM294中
へ形質転換し、アンピシリンを含有するＬ−agarプレー
ト上で培養して形質転換体を回収した。miniprep法（上
記第８項）によって７個の形質転換体をスクリーニング
した。これらのうち６個が所望の断片を含有しているよ
うにみえた。それらのうちの１個pSC161RM 121−２の抽
出物をAccIエンドヌクレアーゼ活性について検定した
（上記第10項参照）。その結果、元のクローンpSC161RM
1−８より約10倍の量、すなわち1mlの抽出物当たり500
unitのAccIエンドヌクレアーゼを合成することが判っ
た。pSC161RM 121−２を担持しているE.coli MM294から
全DNAを精製したところ、AccI消化に対して抵抗性であ
ることが判明した。これは、このクローンがAccIエンド
ヌクレアーゼはもちろんAccIメチラーゼを産生すること
を示している。

（13）AccIを過剰生産するプラスミドの構築（第４図参
照）： 20μｇ（200μｌ）のプラスミドpGW10（ATCC 40167）
を、500μｌの6mM Tris pH 7.9,6mM MgCl₂,150mM NaCl
中で80unitのBamHIを用い37℃で１時間消化した。得ら
れた、温度調節されるλP_LおよびP_Rプロモーターを含有
する4.3kb BamhI断片をゲル精製した（上記第11項）。
こうして精製した断片0.3μｇ（３μｌ）を、25μｌの
連結用緩衝液（上記第12項）中で、BamHIで開裂し脱リ
ン酸化したpSC161RM 121−２の0.6μｇ（６μｌ）と混
合した。１μｌのT4DNAリガーゼを加えて混合物を４時
間16℃にインキュベートした。連結した混合物15μｌを
Ｅ．coli MM294中に形質転換し、アンピシリンを含有す
るＬ−agarプレート上で培養することによって形質転換
体を回収して24時間30℃にインキュベートした。24個の
形質転換体を選択して分析した。まず、アンピシリンを
含有する２つのＬ−agarプレートに画線し、一方のプレ
ートを30℃に、他方を42℃にインキュベートして、温度
に感受性のものをスクリーニングした。24個の形質転換
体のうち４個は42℃で生育するので捨てた。残る20個の
うち14個の温度感受性形質転換体をminiprep法（上記第
８項）で分析した。これらのうちの12個がBamHI断片を
取り込んでおり、そのうちの11個はある配向で
（‘B'）、１個はそれとは逆の配向で（‘A'）あること
が判明した。所望の断片を取り込んでいなかった残りの
２個のクローンは捨てた。

‘A'−配向クローンpSC161RM 0/P17と‘B'−配向クロ
ーンpSC161RM 0/P9のひとつを、それらが合成するAccI
エンドヌクレアーゼの量を測定するために検定した。各
培養物100mlを、アンピシリンを含有するＬ−broth中30
℃で増殖させた。細胞密度が約３×10⁸/ml（590nmの光
学密度＝0.8〜1.0）になった時点で各培養物の50mlを42
℃のインキュベーション温度に上げた。さらに３時間イ
ンキュベーションした後、30℃と42℃の培養物を遠心
し、それから細胞抽出物を精製して検定した（上記第10
項）。‘A'−配向クローンは、42℃では細胞抽出物1ml
当たり約30,000unitのAccIエンドヌクレアーゼを合成す
るが30℃では100unit/ml未満であることが分った。この
プラスミドではλP_Lプロモーターは時計回りの方向で配
向していることが判明した（第４図）。プロモーターが
逆の配向になっている‘B'−配向クローンは、42℃と30
℃の両方で抽出物1ml当たり約3000unitのAccIエンドヌ
クレアーゼを合成することが判明した。Acinetobacter
calcoaceticusも、最適の条件下で培養すると抽出物1ml
当たり約3000unitのAccIエンドヌクレアーゼを合成す
る。

pSC161RM 0/P17を含有するＥ．coli MM294は、AccI制
御エンドヌクレアーゼを精製する際の好ましい出発原料
とすることができる。この株の培養物を30℃でlate−lo
g期（対数増殖後期）（５×10⁸コ/ml）まで増殖させた
後３時間42℃に上げて増殖させてλプロモーターからの
転写を誘発する。その後、遠心して細胞を集め、その直
後かまたは−70℃に貯蔵後細胞から抽出物を調製する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、AccI制限エンドヌクレアーゼをクローニング
して生産する方法の概略を示す。第２図は、AccI制御エンドヌクレアーゼおよび修飾メチ
ラーゼをコードしているＡ．calcoaceticus DNAの11Kb
EcoRIマルチフラグメント（大断片）の制限地図であ
り、この断片はpSC161RM 1−８を創作するためにpBR322
（ATCC 37017）のEcoRI部位に連結したものである。第３図は、AccI制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチ
ラーゼをコードしている4Kb ClaIサブフラグメント（小
断片）の制限地図であり、この断片はpSC161RM 121−２
を創作するためにpSC161RM 1−８から切り出してpUC19
（ATCC 37254）のAccI部位に連結したものである。第４図は、pGW10（ATCC 40167）由来のBamHI発現調節断
片をpSC161RM 121−２中に挿入することによってAccIエ
ンドヌクレアーゼ過剰生産性プラスミドpSC161RM 0/P9
およびpSC161RM 0/P17を構築するのに使用した手順を示
す。第５図は、pSC161RM 0/P17を担持していて温度誘起され
たＥ．coli MM294（ATCC 33625）の粗細胞抽出物中のAc
cI制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの
写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列５′…GT（AC）（GT）AC…３′を認識
してその最初のＴの後で開裂する、アシネトバクター・
カルコアセチクス（Acinetobacter calcoaceticus）由
来のAccI制限エンドヌクレアーゼをコードし、以下に示
すような制限部位を有する、単離DNAセグメント。
【請求項２】請求項１記載の単離DNAセグメントが挿入
されたクローニングベクター。
【請求項３】請求項２記載のベクターによって形質転換
された原核宿主細胞。
【請求項４】DNA配列５′…GT（AT）（GT）AC…３′を
認識してその最初のＴの後で開裂する、アシネトバクタ
ー・カルコアセチクス（Acinetobacter calcoaceticu
s）由来のAccl制限エンドヌクレアーゼの製造方法であ
って、請求項２記載のベクターで形質転換した原核宿主
細胞を、前記エンドヌクレアーゼを発現する条件下で培
養することを含む、前記方法。