JPH022369A - ＨｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明のバックグラウンド 本発明は、制限エンドヌクレアーゼＨ＋ｎＰ　Ｉおよび
その修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンから
これらの酵素を製造する方法に係る。

制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中にみられる酵素
の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する他
の細菌成分から精製すると、実験室でＤＮＡ分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、ＤＮＡ分子はひとつずつ
独自に同定することができ、また分画してその構成遺伝
子を単離することができる。制限エンドヌクレアーゼは
現代の遺伝子研究における不可欠の手段であることが立
証されている。これらの酵素は生化学的な「ハサミ」で
あり、これによって遺伝子の工学および解析が達成され
る。

制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。

これらの酵素はＤＮＡ分子に結合すると、その配列の内
部または一端でその分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼはそれぞれ異なる認識配列に対して親和力
をもっている。今日までに調べられた幾百種もの細菌で
百を越える数の異なるυ１限エンドヌクレアーゼが同定
されている。

通常細菌は、その種毎に、小数の制限エンドヌフレアー
ゼをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼはそ
れの由来となった細菌に因んで命名される。たとえば、
ＨａｅｌｌｌＯｐｈｉｌＵＳ　　ａｅ（１ｙｐｔｉＬＩ
ｓはＨａｅ■、Ｈａｅｆｆおよび＠ａｅ■とよばれる３
つの異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これら
の酵素は、それぞれ（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、ＰｕＧ
ＣＧＣＰｙおよびＧＧＣＣという配列を認識して開裂す
る。一方、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
ＲＹ１３は１種類の酵素Ｅｃ。

Ｒ１を合成するだけであり、この酵素はＧＡＡＴＴＣと
いう配列を認識する。

理論に縛られるつもりはないが、自然界で制限エンドヌ
クレアーぜは細菌細胞の繁殖に関して保護的な役割を果
たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、細
菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたはこ
れらに寄生したりするウィルスやプラスミドのような外
来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗することが可能に
なる。

制限エンドヌクレアーゼは、侵入して来るＤＮＡ分子に
結合し、認識配列に出会う度毎にそれらのＤＮＡ分子を
開裂することによって、細菌に抵抗性を付与する。こう
して生起する破壊の結果、侵入する遺伝子の多くは無能
となり、そのＤＮＡはエキソヌクレアーぜによってさら
に細かく分解されることになる。

細菌の防御系の第二の要素は修飾メチラーゼである。こ
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、
これによって、細菌が外来の感染性ＤＮＡから自身のＤ
ＮＡを防御し区別できるようにする手段が提供される。

修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同
じヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、
このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加するこ
とによってその配列内のヌクレオチドのいずれかを化学
的に修飾する。このメヂル化が起こると、その認識配列
に制限エンドヌクレアーぜが結合することはなく、また
、その配列が制限エンドヌクレアーゼに開裂されること
もない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼの活性
のおかげでいつも完全に修飾されており、したがって自
身の内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全
に非感受性となっている。制限エンドヌクレアーゼの認
識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のＤＮＡ、し
たがって外来のものであることが確認できるＤＮＡだけ
である。

遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をクロ
ーニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質や
酵素を従来の精製技術で入手可能な間より大量に生産す
ることが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローンを単離する際の鍵は、そのようなりローンの出
現頻度が１０−３〜１０−４程度に低い場合、複雑な「
ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られ
るクローンの集団の中で目的とするクローンを同定する
ための簡単で信頼のおける方法を開発することである。

好ましくは、この方法は、目的としない大多数のクロー
ンは破壊されるが珍にある望ましいクローンは生き残れ
るように、選択的なものであるべきである。

■型の制限−修飾系はクローニングされつつあり、その
数は次第に増加している。最初にクローニングされた系
は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択
する手段としてバタテリオファージによる感染を使用し
た［　１−１　ｈａＩＩ　：　Ｈａｎｎｅｔ　ａｌ、、
　Ｇｅｎｅ、　　３：　９７−１１２　（１９７８）　
；　ＥｃｏＲＩＩ　：にｏｓｙｋｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｈ
ｏ１ｅｃ、　ｇｅｎ、　　Ｇｅｎｅｔ、、　１７８　：
　７１７−７１９（１９８０）；　　ＰｓｔＩ　：　Ｗ
ａｌｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　　Ｈａｔ。

八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８．１５０３−１
５０７　（１９８１）］　、細菌中に制限−修飾系が存
在すると細菌はバクテリオファージによる感染に対して
抵抗できるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子
を担持する細胞は、原理的に、ファージに暴露されたラ
イブラリーから生えて来る（生き残る）株として選択的
に単離することができる。しかしこの方法は限られた価
値しかないことが判明した。特定的にいうと、クローニ
ングされた制限−修飾遺伝子は、選択的な生き残りを可
能にする程に充分なファージ耐性を常に発現するとは限
らないことが判明したのである。

もうひとつ別のクローニング法では、最初プラスミド由
来とされていた系をＥ、ｃｏｌｉクローニングプラスミ
ド中に組み込んでいる［ＥＣ０ＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅ
ｒｅｔ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａ
ｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　１２：３６５９−３６７６
（１９８４）；Ｐ　ａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ　ａｎ
ｄ　　Ｂｒｏｏｋｓ。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、
　　ＵＳＡ、　　８０：４０２−４０６（１９８３）；
Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ　ａｎｄ　　Ｒｏｙ、　　Ｇｅｎｅ
、　　１９：３５５−３５９　　（１９８２）；Ｐｖｕ
Ｉ［：　Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ　　ｅｔ　ａｌ、、　　
Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１６４：　　５０１−５０９　　（１９８５）］。

第三の方法として多くの系のクローニングに使用されて
いる方法では、本発明者らの特許出願第７０７０７９号
に関連する活性なメチラーゼ遺伝子について選択する［
　Ｂ　ｓｕＲＩ　：　Ｋ１５ｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃ
ｌｅ＋ｃＡＣｉｄＳ　　Ｒｅｓ、　１３：　６４０３−
６４２１　（１９８５）］。制限遺伝子と修飾遺伝子と
は近接して結合している傾向があるので、両者の遺伝子
を含有するクローンは一方の遺伝子について選択するだ
けで単離できることが多い。しかし、メチル化活性によ
る選択では常に完全な制限−修飾系が得られるわけでは
なく、逆に、メチラーゼ遺伝子のみが得られることもあ
る［　Ｂ　５ＩＩＲＩ　：　Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ　ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、　１０：２１９−２２５　（１
９８０）；ＢｃｎＩ　：　Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ　ｅｔ
　ａｌ、、Ｇｅｎｅ２０：１９７−２０４　（１９８２
）；ＢｓｕＲＩ　：にｉｓｓ’　ａｎｄ　Ｂａ１ｄａｕ
ｆ。

Ｇｅｎｅ　　２１：１１１−１１９　（１９８３）；お
よびＭ　ｓｐＩ　：　１４ａｌｄｅｒｅｔ　　ａｌ、　
　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：１２３５−１２４
１（１９８３）］　　。

制限−修飾遺伝子のクローニングに対する潜在的な障害
は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌク
レアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチラ
ーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒に単一
のクローンとして導入すると、エンドヌクレアーゼが宿
主ＤＮＡを開裂する機会を得る前にメチラーゼがそのＤ
ＮＡを修飾して保護するはずである。したがって、場合
によっては、これらの遺伝子は順番（すなわち、最初に
メチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順）にのみクロ
ーニングが可能となるかもしれない。

制限−修飾系のクローニングに対する別の障害は、旦、
　ｃｏｌｉの株の中にはシトシンの修飾に対して逆の反
応を示すものがあるという発見にある。すなりら、その
ような株は、メチル化シトシンを含有しているＤＮＡを
破壊する系をもっているのである［Ｒａｌｅｉｇｈ　ａ
ｎｄ　Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口、＾ｃａｄ
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８３：　９０７０−９０７４　（
１９８６）］　。シトシンに対して特異的なメチラーゼ
遺伝子は、それ単独でも、あるいはその対応するエンド
ヌクレアーゼ遺伝子と一緒にでも、これらの株中で容易
にクローニングすることができない。この問題を避ける
ためには、これらの系を欠損している旦、ｃｏｌｉ変異
株（Ｍ　ＣｒＡ　　およびＭｃｒＢ　　）を使用する必
要がある。

ｖＪｔＪした制限エンドヌクレアーゼ、および重要性は
それより落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡの
特性決定と再配列をするのに有用な道具であるから、こ
れらの酵素を大向に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術
によって得ることは商業的な魅力がある。そのような株
が得られれば、商業的に有用な最で生産するための手段
が提供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思
われるので、これらの株は極めて有用なものとなろう。

含んでいない。

発明の概要 本発明によって、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　　１ｎｆｌ
ｕｅｎｚａ　Ｐｌに由来するＨ　ｉｎｐ　Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼの遺伝子を含有する
クローン、ならびにこれらの酵素の生産方法が提供され
る。

より特定すると、本発明は、ＧＣＧＣというＤＮＡ配列
を認識して最初のＧとＣの間で開裂する酵素である制限
エンドヌクレアーゼＨｉｎＰ　Ｉを発現するクローンに
係る。５ｈｅｎ、Ｓ、、　Ｌｉ、Ｑ、、　Ｙａｎ、Ｐ、
、　２ｈｏｕ。

８、、　　ｖｅ、Ｓ、、　　　Ｌｕ、Ｙ、　　ａｎｄ　
　Ｗａｎｇ、Ｄ、、　　５ｃｉｅｎｃｅ　　Ｓｉｎ。

２３：１４３５−１４４２（１９８０）参照（その開示
内容は、ここで引用したことによって本明細書中に含ま
れるものとする）。本発明に従って生産される＠　ｉｎ
Ｐ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼは、５ｈｅｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　５ｕｐｒａに開示されているような従来の技術
によって製造された＠　ｉｎＰ　Ｉ調製物中に通常みら
れる夾雑物をこの酵素をクローニングする好ましい方法
は、ＨａｅｍＯｐｈｉｌＬＩＳ　　１ｎｆｌｕｅｎｚａ
　ＰＩに由来するＤＮＡを含有するライブラリーを形成
し、ＨｉｎＰ　Ｉ修飾メチラーゼをコードしているＤＮ
Ａを含有するクローンを単離し、これらをスクリーニン
グして、ＨｉｎＰ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子も
共に含有しているクローンを同定することからなる。

発明の詳細な説明 本発明は、ＨｉｎＰ　Ｉ制限および修飾遺伝子のクロー
ン、ならびにそのようなりローンによって生産される制
限エンドヌクレアーゼＨｉｎＰ　Ｉに係る。

コレら（７）　ＨｉｎＰ　Ｉ遺伝子は、ＨｉｎＰ　Ｉ　
ｖｉ飾メチラーゼ遺伝子を含有し発現することに基づい
て選択したある種のクローンが同時にＨｉｎＰＩ制限遺
伝子も含有しているという事実を利用する方法によって
クローニングされる。そのようなりローンのＤＮＡはＨ
ｉｎＰ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼによるｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ消化に抵抗性である。この消化に対する抵抗性によ
って、ＨｉｎＰ　Ｉメチラーゼおよび制限エンドヌクレ
アーゼをコードしているクローンを選択的に単離するた
めの手段が得られる。

ＨｉｎＰ　Ｉ制限遺伝子およびメチラーゼ遺伝子をクロ
ーニングして発現させるための本発明の好ましい方法を
第１図に示すが、これには以下のステップが含まれる。

に記載されており、この細菌のサンプルはｔｈｅ＾１１
１１３ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ｃｕｔｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎからｃａｔａｌｏｇＮｏ、　ＡＴＣＣ５
３７００として入手し得る。

（２）　　このＤＮＡをＰＳｔＩのような制限エンドヌ
クレアーゼで部分消化する。

（３）　　消化したＤＮＡを、１個以上の＠　ｉｎＰ　
Ｉ部位を含有するｐＢ　Ｒ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７
）のようなりローニングベクターに連結する。連結した
ＤＮＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＲＲ１
株（ＡＴＣＣ３１３４３）のような適当な宿主に形質転
換する。

（４）　　このＤＮＡ／細胞混合物を、形質転換細胞を
選択するためのテトラサイクリンのような抗生物質を含
有する培地に接種する。培養液形質転換細胞コロニーを
ひとつに集めてセルライブラリーとする。

（５）　　このセルライブラリーから組換えプラスミド
全部をそっくり蹟製してプラスミドライブラリーを作成
する。

（６）　　このプラスミドライブラリーを、５ｈｅｎ　
ｅｔａｌ、、　５ｕｐｒａに記載されている方法と類似
の方法によってＨ，１ｎｆｌｕｅｎｚａ　ｐｉから製造
したＨ　ｉｎＰ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼで完全に消
化する。ＨｉｎＰ■消化により、メチラーゼを含有しな
い未修飾りローンが特異的に破壊され、＠　ｉｎＰ　Ｉ
メチラーゼ担持クローンの相対頻度が増大する。

（７）　　消化したプラスミドライブラリーのＤＮＡを
Ｅ　、　ｃｏｌｉ　Ｒ１ｔ１株のような適当な宿主に形
質転換し、抗生物質プレートに接種して形質転換コロニ
ーを再度取得する。これらのコロニーを採取し、そのＤ
ＮＡをＨｉｎｐ　Ｉ修飾遺伝子の存在について以下のよ
うに分析する。すなわち、コロニーが担持するプラスミ
ドＤＮＡを精製し、ｌ−１ｉｎＰ　Ｉ制限エンドヌクレ
アーゼと共にｉｎ　ＶｉｔｒＯでインキュベートしてＨ
ｉｎＰ　Ｉ消化に対して抵抗性か否かを決定する。また
、このクローンの全細胞ＤＮＡ（染色体およびプラスミ
ド）も精製し、Ｈ＋ｎＰ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼと
共にインキュベートする。ＨｉｎＰ　Ｉメチラーゼ遺伝
子を担持するクローンのＤＮＡは充分に修飾されている
はずであり、プラスミドＤＮＡと全ＤＮＡは両方とも消
化に対して実質的または完全に抵抗性であるはずである
。

（８）　　ステップ（７）でＨｉｎｐ　Ｉメチラーゼ遺
伝子を担持していることが確認されたクローンの細胞抽
出物を調製し、この抽出物のＨｉｎＰ　Ｉ制限エンドヌ
クレアーゼ活性を検定することによって、ＨｉｎＰ　Ｉ
制限エンドヌクレアーゼを担持するクローンを同定する
。

（９）　　ＨｉｎＰ　Ｉ制限および修飾遺伝子を担持し
ているクローンを醗酵槽内のテトラサイクリン含有富化
培地中で増殖させることによって、Ｈｉｎｐ　Ｉ制限エ
ンドヌクレアーゼを生産することができる。

その後、細胞を遠心して採集し、音波処理で破砕すると
、ＨｉｎＰ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する
粗細胞抽出物が生成する。

（１０）　　ＨｉｎＰ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活性
を含有する粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグ
ラフィーやイオン交換クロマトグラフィーのように標準
的なタンパク質精製技術によって精製する。

上に概略を記載した手順は本発明の好ましい実施態様で
あるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変える
ことができるということは当業者には明らかであろう。

以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示する
が、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはないものと考えられたい。

実施例 Ｈｉｎｐ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニ
ング （１）　　ＤＮＡの精製： Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｐｉ
　（ＡＴＣＣ５３７００）の凍結した細胞１０ｇを氷上
で１時間解凍した後２０ｄの２５％スクロース、　５０
ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０中に再懸濁させた。１０ｄの
０．２５ＨＥＤＴＡ　ｐｌ−１８，０および６ｄの１０
１ＦＩ／ｘｄｌリゾデーム（０，２５ＨＴｒｉｓ　ｐＨ
８，０中）を加えた。この懸濁液を２時間氷上に保った
後、２４威の１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５０ｍＨ
Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０，６７ｍＨＥＤＴＡおよび５ｄの
１０％ＳＤＳを加えて溶菌させた。得られた溶液を、（
前ちって０．５ＨＴｒｉｓ、　ｐＨ８，０で平衡化した
）フェノール７０ｄおよびクロロホルム６０−で抽出し
た。得られた乳濁液を１０Ｋｒｐｍで３０分遠心し、粘
稠な上相を採り、１０ｍＨＴｒｙｓ　ｐＨ８，０１ｍＨ
ＥＤＴＡに対しこれを四回交換して透析した。次に、透
析した溶液を最終濃度１００埒／ｄのＲＮａｓｅにより
３７℃で１時間消化した。次に、ＤＮＡを沈澱させるた
めに、ＮａＣ１！を最終濃度０．４Ｈまで加え、０．５
５倍容量のイソプロピルアルコールを重層し、相を一緒
に混合することによってＤＮＡをガラス捧に巻き付けて
取り出した。このＤＮＡを１０ｍＨ丁ｒｉｓ　ｐｌｔ　
８．０．１ｍ）Ｉ　ＥＤＴＡに再懸濁させて４℃で貯蔵
した。

（２）　　ＤＮＡの消化： 精％１ＤＮＡを、以下のようにしているいろな程度の消
化物を得るためＰＳｔＩで開裂した。すなわち、Ｄ　Ｎ
　Ａ　８０ＪＪ！Ｉを、８００成の１０ｍＨＴｒｉｓ　
ｐＨ７，５１０ｍＨＨ（ＩＣｉ！２．５０ｍＨＮａＣＲ
、１０ｍＨメルメルトカプトエタノール中した。得られ
た溶液を２００ｐＪ！、の試料１個と　１００成の試料
６個に分けた。最初の２００成ノチ１−ブに２０　ｕｎ
ｉｔのＰＳｔＩを加えてＤＮＡｌｐｇ当たり酵素１　ｕ
ｎｉｔとした。この最初のチューブから　１００ＩＪｆ
！を取り出し、第２のチューブに移しＴＯ，５ｕｎｉｔ
／、ｉ＃とした。以下、同様にｐｓｔ工の晒が前のデユ
ープの半分になるようにした。これらのチューブを１時
間３７℃にインキュベートした後、７２°Ｃで１４分熱
処理し、各チューブから１０Ｉ１１ずつ取り出してアガ
ロースゲル電気泳動で分析した。全てのチューブの内容
物を合わせて、クローニング用の消化断片材料として使
用した。

（３）　　連結および形質転換： ｐｓＢでさまざまに消化したＩｆ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ
　ＰｌのＤＮＡ３／ｌＩｇ（３０成）を、ＰｓｔＩで開
裂し脱リン酸化した　Ｉ）Ｂ　Ｒ３２２（八ＴＣＣ３７
０１７）　　２ｐ３（２０成）と混合した。１０ｄの５
００ｍＨＴｒｉｓ　ＤＨ７，５，１００ｍＨＨ（＋（Ｊ
！、、　、　１００ｍＨＤＴＴ、　５ｎ＋ＨＡＴＰｌお
よび４０成の滅菌蒸溜水を加えて容積を１００成とした
。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを３．４／Ｌｅ加え、得られた溶
液を４時間１６℃にインキュベートした優、クロロホル
ム２０屑で抽出して滅菌した。連結した混合物８０成を
、１．０ｄの５０１！ｌＨＮａＣ１！、　５ｍＨクエン
酸Ｎａ　　、　　６７ｍＨＣａＣ１！２と混合し、氷冷
した旦、　ｃｏｌｉ　ＲＲＩ（ＡＴＣＣ３１３４３）コ
ンピテント細胞を２．Ｏｄ加えた。１すられた溶液を５
分間４２℃にインキュベートした後、８ｄのＬｕｒｉａ
−ブロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）を添加して３７℃で４時間
インキュベーションを続行した。

（４）　　セルライブラリー： 形質転換した細胞培養液を簡単に遠心した後、上清を捨
て、細胞を１．０ｄのＬ−ｂｒｏｔｈに再懸濁させた。

そのうちの２００成を、テトラサイクリンを３０埒／　
ｄ含有するＬｕｒｉａ−寒天（Ｌ−ａｇａｒ）プレート
上に接種した。このプレートを一晩３７℃にインキュベ
ートした後、各ブレーｉ・に２．５ｄの１０ｍＨＴｒｉ
ｓ　ｐＨ７，５，１０ｍＨＨ（ＩＱ！２を満たし、形質
転換コロニーを全部掻き集めてプールした。

（５）　　プラスミドライブラリー二 ２゜５ｍのセルライブラリーを、テトラサイクリンを３
０埒／Ｉｄ含有するＬ−ｂｒｏｔｈ　５００ｄ中に接種
した。３７℃で一晩振盪培養した優、４０００　ｒｐｍ
で５分遠心した。上清を捨て、細胞ベレットを１０ｍの
２５％スクロース、　５０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０に
室温で再懸濁させた。０．２５ＨＥｌ１丁Ａ、　ｐＨ８
，０を５ｍ、および１０η／ｄリゾデーム（０，２５Ｈ
Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０中）を３ｄ加えた。得られた溶
液を氷上に１時間放置した後、１２ｄの１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１００，５０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０６７ｍ
ＨＥＤＴ八をピペットで激しく添加し、この懸濁液に穏
やかに渦を巻かせて溶菌を誘導した。

溶菌した混合物を５０ｍのチューブに移して１７０００
　ｒＤｍ　、　４℃で４５分間遠心した。ピペットで上
清を取り出した。固体のＣ５Ｃρを２０．０　ｇ秤量し
て５０戒のプラスチック製ネジブタ付きチューブに入れ
、このチューブ中に上清２２．０７をピペットで入れて
混合した。５Ｉｎｇ／ＩＩ！ｉ！のエチジウムプロミド
（１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐｔｌ　８．０．　１０Ｏｎ＋Ｈ
ＮａＧ、　　ＩｍＨＥＤＴＡ中）を１．０ｍ加えた。こ
の溶液を、５／８１ｎＸ３　ｉｎの遠心管２本に移し、
ＢｅＣｋｍａｎ　Ｔ　ｒ　ｙｏローター中４４０００　
ｒｐｍ　、　１７℃で４２時間回転させた。プラスミド
を集めるために、これらのチューブを開き、紫外光を照
射して２本のケイ光バンドの下側の方を注射器で集めた
。各チューブから得た下側のバンドを合わせ、等容置の
、水で飽和した水冷ｎ−ブタノールで四回抽出すること
によってエチジウムプロミドを除去した。

抽出された溶液を、１０＋１１８　ＴｒｉＳ　Ｉ）Ｈ７
，５１１１１８ＥＤＴＡを四回交換しながらこの液に対
して透析した後、２倍容量のイソプロパツールと最終濃
度が０、４８となるのに充分な５８　ＮａＧを添加して
核酸を沈澱させた。得られた溶液を一晩−２０℃で保存
した後１５０００　ｒｐｍ、　０℃で１５分遠心した。

上清を捨て、ベレットを１５分間風乾した後、５００Ｉ
Ｊ１の１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａに溶かしチー２０℃で貯蔵した。プラスミドＤＮＡの
濃度は約１００ｉ　／　ｘｉ！であった。

（６）　　プラスミドライブラリーの消化ニブラスミド
ライブラリーをＨ；ｎｐ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ消
化用緩衝液（５０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５５ｍＨＨｇ
α２．０．５ｍＨジチオトレイトール〉中ｒ３０１１３
／ｌｄに希釈した。ＨｉｎＰ　Ｉ制限エンドヌクレアー
ゼを加えてＤＮＡＩ埒に付き３．２　ｕｎｉｔの濃度と
し、チューブを１時間３７℃にインキュベートした。

１２分間７２℃に加熱して反応を停止させた。

（７）　　形質転換： １２．５．！の消化したライブラリーをＥ、　ｃｏｌｉ
　ＲＲＩ株に形質転換し、テ［−ライブリーを３０＃　
／　ｄ含有するＬ−ａａａｒプレートに接種して一晩３
７℃にインキュベートした（上記第３項および第４項）
。

Ｈ＋ｎＰ　Ｉ消化によって、未消化のプラスミドによる
形質転換の場合と比較して形質転換体の数は約１７１０
３に減少した。２９個のコロニーを個別に採り、それぞ
れ、３０ｎ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するプレー
トと、１００埒／ｄのアンピシリンを含有するプレート
の２つのプレート上に画線して断片が組み込まれている
アンピシリン感受性のクローンを同定した。２９個のコ
ロニーのうち１４個がアンピシリン感受性であることが
判明したので、各々を１０ｄのテトラサイクリン含有１
−ｂｒｏｔｈ中に接種してミニカルチャー（小培養物）
を調製し、テトラサイクリンを含有するｌ　−ａｇａｒ
プレート上に画線してマスターストックを調製した。

（８）　　生き残った個体の解析： 上記第７項に記載した１４個のテトラサイクリン耐性で
アンピシリン感受性のコロニーを１０ｄになるまで増殖
させ、これらが担持するプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｎ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　　Ｒｅ５１，７：１５１３　（１９７９）の方法を
応用した以下のｍ１ｎｉｐｒｅｐ精製法によって調製し
た。

ｍ１ｎｉｐｒｅｐ法： 各培養物を８００Ｏｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て
て得られた細胞ベレットを、１η／ｄリゾチームを含有
する１０−の２５ｍＨＴｒｉｓ、　１０ｍＨＥＤＴＡ、
　５０ＩＩＨグルコース、　ｐｔｌ　８．０中に再懸濁
させた。室温に１０分間装いた後、各チューブに２．０
ｍｆ！の０．２８ＮａＯＨ，１％　ＳＯ３を加え、チュ
ーブを振盪して細胞を溶解し、次いで氷上に置いた。溶
液が透明になってから各々３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４
，８）を１．５ｄずつ加えて振盪した。生じた沈澱を１
５００Ｏｒｐｍ　。

４℃で１０分間遠心して沈ませた。得られた上清を各々
、イソプロパツールを３ｄ含有する遠心管に流し入れて
混合した。室温で１０分経った後遠心管を１５０００　
ｒｐｍで１０分間遠心して沈澱した核酸をベレット化し
た。上清を捨て、ベレットを室温で３０分風乾した。乾
燥した後ベレットを８５０ｐｉの１Ｏｎ＋ＨＴｒｉｓ、
　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐｔｌ　８．０に再懸濁させた
。

５８　ＮａＣｌを７５ｇ＞ずつ加え、得られた溶液を、
５１５屑のイソプロパツールを含有するＥｐｐｅｎｄｏ
ｒｆチューブに移し、室温で１０分かけて再度沈澱させ
た。

次に、チューブをｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で４５秒間回転
し、上清を捨ててベレットを風乾した。このベレットを
、次イテ、ＲＮａｓｅを１１００ｐ／　Ｉｌｌ！含有す
る５００／Ｊの１０ｍＨＴｒｉｓ、１ｍＨＥＤＴＡ、　
ｐＨ８，０に溶解し、１時間３７℃にインキュベートし
てＲＮＡを消化した。５０成の５ＨＮａＧ、次いで３５
０／Ｊのイソプロパツールを添加してＤＮＡをもう一度
沈澱させた。室温で１０分後、４５秒間遠心してＤＮＡ
を沈ませ、上清を捨て、得られたベレツを１５０１１１
の１０ｍＨＴｒｉｓ、　１ｍＨＥＤＴ＾、　ｐＨ８，０
に再溶解した。次いで、プラスミドｍ１ｎｉｐｒｅｐ　
（小調製物）をＨｉｎＰ　Ｉとｐｓｔ工で消化して解析
した。

（９）　　ＨｉｎＰ　Ｉメチラーゼ遺伝子クローン：解
析した１４個のプラスミドのうち１２個が、ｌ−１＋ｎ
ＰＩに対して感受性でありＨ，１ｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｐ
ｌのＤＮＡのさまざまな断片を担持していることが判明
した。これらのプラスミドはにせものであるので捨てた
。残りの２個のプラスミドは、＠　ｉｎＰ　Ｉに対して
耐性であり、４．６ｋｂと　１．５ｋｂの長さの２個の
ＰｓｔＩ断片を担持していることが判明した（第２図）
。これらのプラスミドは同一であるように思われた。こ
れらを１）ＪＢ１２４ＲＨ４−１１および＋）ＪＢ１２
４ＲＨ４−２０と命名した。これらは両方ともＨｉｎＰ
Ｉ修飾メチラーゼ遺伝子を担持しているばかりでなく、
ＨｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子も担持してい
ることが示された。

（１０）　　ＨｉｎＰ　Ｉ制限遺伝子クローン：ｐＪＢ
１２４ｆｔＨ４−１１およびＩ）ＪＢ１２４ＲＨ４−２
０は、これらのプラスミドを担持しているＥ、　ｃｏｌ
ｉ　ＲＩｔｌから調製した抽出物を検定することにより
、＠　ｉｎＰ　ｌ１１１限エンドヌクレアーゼ遺伝子を
担持していることが判明した。

細胞抽出物を調製するために、この培養物５０ｄを、３
０ｏ　／−テ１〜ラサイクリンを含有するＬ−ｂｒｏｔ
ｈ中３１℃で一晩増殖させた。この細胞を４Ｋｒｐｎ＋
で５分間遠心してベレット化し、上清を捨てて得られた
ベレットを３ｒｄの音波処理用緩衝液（１０ｍＨＴｒｉ
ｓ　ｐＨ８，０，１Ｏｎ＋Ｈメルカプトエタノール０、
１ｍＨ　ＥＤ丁へ中に再懸濁させた。再懸濁後１０η／
−のりゾチームを含有する音波処理用緩衝液を０．３ｄ
加えた。得られた懸濁液をかき混ぜ、３時間氷上に放置
した。この懸濁液を一２０℃で一晩凍結した。凍結した
懸濁液を氷−りで解凍し１−をｅｐｐｅｎｄｏｒｆチュ
ーブに移した。、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を５ｐ
ｉ加えて最終濃度を０．　００５％とし、よく混合した
。得られた混合物を４℃で１０分間軽く遠心し、上清を
細胞抽出物として使用した。

線状のｐＵｃ１９　Ｄ　Ｎ　Ａ　２５Ａ９を、５００１
１１のＨ　ｉｎＰ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ消化用緩
衝液（上記第６項）中に希釈した。この溶液を４本のチ
ューブに、最初の１本には１５０／ｌｉ！、残りの３木
には１０２．５ＪＩＩｌずつ分注した。最初のチューブ
に細胞抽出物７．５成を入れて混合した。最初のチュー
ブから４７．５屑を取り出して第二のチューブに移して
混合した。

このようにして、最初のチューブはＤＮＡ１埒当たり抽
出物１成、第２のチューブは０．３Ｉｄ／埒、第３のチ
ューブは０．　１／１１／　埒、および第４のチューブ
は０．　０３／ｌｌｊ！　／　埒とした。各々　１００
成ずつ含有するこれらのチューブを１時間３７℃にイン
キュベートした後、各チューブのサンプル２０Ｉｉｉを
ゲル電気泳動によって分析した。この抽出物の力価は、
１ｄに付ぎ約１０００　ｕｎｉｔのＨ　ｉｎＰ　Ｉ制限
エンドヌクレアーゼであることが判明した。これは、湿
潤細胞ペースト１ｇ当たり約１　Ｘ　１０４ｕｎｉｔに
相当する（第３図）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｈｉ口ＰＩ制限エンドヌクレアーゼをクロー
ニングおよび生産する方法の概略を示す。 第２図は、ＨｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼおよび修
飾メチラーゼをコードしているＨｌｎｒｌｕｅｎｚａ　
ＰｌのＤＮＡの６．ＩＫｂ　Ｐｓｔ工ｖルチフラグメン
ト（大断片）の制限地図であり、この断片を１）ＢＲ３
２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のＰＳｔＩ部位に挿入して
１）ＪＢ１２４ＲＨ４−１１およびｐＪＢ１２４ＲＨ４
−２０を０１作した。 第３図は、ｐＪＢ１２４１ｔＨ４−１１および１）ＪＢ
１２４１ｔＨ４−２０を担持するＥ　、　ｃｏｌｉ　Ｒ
Ｒｌ　（ＡＴＣＣ３１３４３＞の粗抽出物中のｌ」１ｎ
ＰＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲル
の写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ＨｉｎＰ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含
   むクローニングベクター。 （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換された宿主。 （３）ＨｉｎＰ I 遺伝子が、￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
   ｓｉｎｆｌｕｅｎｚａ￥Ｐ１ＡＴＣＣ５３７００から切
   り出されたものである、請求項１に記載のクローニング
   ベクター。（４）ＨｉｎＰ I 修飾遺伝子を含むクロー
   ニングベクター。 （５）請求項４に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換された宿主。 （６）（ａ）￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎ
   ｚａ￥Ｐ１に由来するＤＮＡからライブラリーを形成し
   、 （ｂ）ＨｉｎＰ I 修飾遺伝子を含有するクローンを単
   離し、 （ｃ）修飾遺伝子を含有するクローンをスクリーニング
   し、 （ｄ）ＨｉｎＰ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を同
   時に含有しているクローンを単離する ことからなる、ＨｉｎＰ I 制限エンドヌクレアーゼ遺
   伝子のクローニング方法。 （７）前記ライブラリーを、 （ａ）￥Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ￥Ｐ１ＡＴＣＣ５３７
   ００に由来するＤＮＡを精製するステップ、 （ｂ）精製したＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成する
   ステップ、 （ｃ）この断片をクローニングベクターに連結するステ
   ップ、 （ｄ）ステップ（ｃ）のクローニングベクターで宿主細
   胞を形質転換してセルライブラリーを形成するステップ
   、 （ｅ）このセルライブラリーから組換えベクターを精製
   してプラスミドライブラリーを形成するステップ によつて形成する、請求項６に記載の方法。 （８）クローニングベクターがｐＢＲ３２２である、請
   求項７に記載の方法。 （９）宿主細胞が￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥のｍｃｒＢ＾−およ
   びｈｓｄＲ＾−株である、請求項７に記載の方法。 （１０）プラスミドライブラリーをＨｉｎＰ I で消化
   して消化プールを形成し、この消化プールを宿主細胞中
   に形質転換し、修飾遺伝子を含有するクローンを選択す
   ることによって、ＨｉｎＰ I 修飾遺伝子を含有するク
   ローンを単離する、請求項７に記載の方法。 （１１）（ａ）￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅ
   ｎｚａ￥Ｐ１に由来するＤＮＡを精製し、 （ｂ）精製したＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ
   で消化してＤＮＡ断片を形成し、（ｃ）この断片をクロ
   ーニングベクターに連結してＤＮＡ混合物を形成し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡ混合物で宿主細胞を形質
   転換してライブラリーを形成し、（ｅ）ＨｉｎＰ I 修
   飾メチラーゼ遺伝子を含有するクローンを単離し、 （ｆ）ＨｉｎＰ I 修飾メチラーゼ遺伝子を含有するク
   ローンをスクリーニングし、ＨｉｎＰ I 制限エンドヌ
   クレアーゼ遺伝子を同時に含有しているクローンを単離
   し、 （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含有する宿主細胞を
   培養し、 （ｈ）この培養物からＨｉｎＰ I 制限エンドヌクレア
   ーゼを回収する ことからなる、ＨｉｎＰ I 制限エンドヌクレアーゼの
   製造方法。 （１２）クローニングベクターがプラスミドまたはウィ
   ルスのＤＮＡ分子である、請求項１１に記載の方法。 （１３）プラスミドがｐＢＲ３２２である、請求項１２
   に記載の方法。