JPH04293489A - ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 - Google Patents
ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＮｌａＩＩＩ制限エン
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組み換
え体ＤＮＡ、及びこの組み換え体ＤＮＡから上記２酵素
を製造する方法に係わる。
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組み換
え体ＤＮＡ、及びこの組み換え体ＤＮＡから上記２酵素
を製造する方法に係わる。
【０００２】
【従来の技術】多くの細菌は外来ＤＮＡの侵入を防御す
る系を有する。細菌細胞は、侵入ＤＮＡが通常対応する
ＤＮＡメチラーゼによる修飾を予め受けていなければ該
ＤＮＡの二本鎖を切断する特異的エンドヌクレアーゼを
有する。エンドヌクレアーゼとこれに対応するメチラー
ゼとを制限−修飾系（以後“Ｒ−Ｍ系”と表記）と呼称
する。Ｒ−Ｍ系の原則的な機能はこのように防御的であ
り、Ｒ−Ｍ系によって細菌細胞は、該細胞に寄生しよう
とするバクテリオファージ及びプラスミドＤＮＡ分子の
感染に抵抗し得る。
る系を有する。細菌細胞は、侵入ＤＮＡが通常対応する
ＤＮＡメチラーゼによる修飾を予め受けていなければ該
ＤＮＡの二本鎖を切断する特異的エンドヌクレアーゼを
有する。エンドヌクレアーゼとこれに対応するメチラー
ゼとを制限−修飾系（以後“Ｒ−Ｍ系”と表記）と呼称
する。Ｒ−Ｍ系の原則的な機能はこのように防御的であ
り、Ｒ−Ｍ系によって細菌細胞は、該細胞に寄生しよう
とするバクテリオファージ及びプラスミドＤＮＡ分子の
感染に抵抗し得る。
【０００３】Ｒ−Ｍ系は、サブユニット構成、補因子の
必要性及びＤＮＡ切断のタイプに基づいて明確に３種に
分類されている。タイプＩのＲ−Ｍ系は最も複雑な系で
ある。この系のエンドヌクレアーゼは一般に３種のサブ
ユニットを有し、ＤＮＡ切断のためにはＭｇ＋＋、ＡＴ
Ｐ及びＳ−アデノシルメチオニンを必要とする。その認
識部位は複雑であり、ＤＮＡ切断は認識部位から４００
〜７０００塩基対離れた任意の位置で非特異的に起こる
。
必要性及びＤＮＡ切断のタイプに基づいて明確に３種に
分類されている。タイプＩのＲ−Ｍ系は最も複雑な系で
ある。この系のエンドヌクレアーゼは一般に３種のサブ
ユニットを有し、ＤＮＡ切断のためにはＭｇ＋＋、ＡＴ
Ｐ及びＳ−アデノシルメチオニンを必要とする。その認
識部位は複雑であり、ＤＮＡ切断は認識部位から４００
〜７０００塩基対離れた任意の位置で非特異的に起こる
。
【０００４】タイプＩＩＩのＲ−Ｍ系は、タイプＩの系
ほどは複雑でない。この系のエンドヌクレアーゼは２種
のサブユニットしか有せず、またＤＮＡ切断のためにＭ
ｇ＋＋及びＡＴＰを必要とするが、Ｓ−アデノシルメチ
オニンは酵素活性の刺激に有用であるものの必須ではな
い。ＤＮＡ切断は認識部位から約２５〜２７塩基対離れ
た位置で起こる。
ほどは複雑でない。この系のエンドヌクレアーゼは２種
のサブユニットしか有せず、またＤＮＡ切断のためにＭ
ｇ＋＋及びＡＴＰを必要とするが、Ｓ−アデノシルメチ
オニンは酵素活性の刺激に有用であるものの必須ではな
い。ＤＮＡ切断は認識部位から約２５〜２７塩基対離れ
た位置で起こる。
【０００５】タイプＩＩのＲ−Ｍ系はタイプＩ及びＩＩ
Ｉのいずれよりもはるかに単純である。エンドヌクレア
ーゼはただ１種のサブユニットしか有せず、ＤＮＡ切断
に要するのもＭｇ＋＋のみである。そのうえ、ＤＮＡ切
断位置はこの酵素の認識部位内にか、または該認識部位
に隣接して存在する。タイプＩＩのＲ−Ｍ系の制限エン
ドヌクレアーゼは分子生物学者にとって最も有用である
とされている。
Ｉのいずれよりもはるかに単純である。エンドヌクレア
ーゼはただ１種のサブユニットしか有せず、ＤＮＡ切断
に要するのもＭｇ＋＋のみである。そのうえ、ＤＮＡ切
断位置はこの酵素の認識部位内にか、または該認識部位
に隣接して存在する。タイプＩＩのＲ−Ｍ系の制限エン
ドヌクレアーゼは分子生物学者にとって最も有用である
とされている。
【０００６】細菌がその種毎に有する制限エンドヌクレ
アーゼの種類は普通少数でしかない ｅＩＩＩと命名された３種の制限エンドヌクレアーゼを
合成する。これらの酵素は（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）配
列、ＰｕＧＣＧＣＰｙ配列及びＧＧＣＣ配列をそれぞれ
認識して切断を行なう。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＲＹ１３は１種の酵素ＥｃｏＲＩしか
合成せず、この酵素はＧＡＡＴＴＣ配列を認識する。
アーゼの種類は普通少数でしかない ｅＩＩＩと命名された３種の制限エンドヌクレアーゼを
合成する。これらの酵素は（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）配
列、ＰｕＧＣＧＣＰｙ配列及びＧＧＣＣ配列をそれぞれ
認識して切断を行なう。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＲＹ１３は１種の酵素ＥｃｏＲＩしか
合成せず、この酵素はＧＡＡＴＴＣ配列を認識する。
【０００７】Ｒ−Ｍ系の第一の構成要素である制限エン
ドヌクレアーゼは、実用上ＤＮＡ分子の分解に用いられ
るため、主にその認識配列及び切断特異性で特徴付けら
れている。大部分の制限エンドヌクレアーゼは長さ４〜
６ヌクレオチドの配列を認識する。最近、認識配列の長
さがヌクレオチド７個または８個である制限エンドヌク
レアーゼが発見された。認識部位は、その総てではない
が殆どが二回転対称軸を有し、また殆どの場合認識部位
内の塩基はいずれもただ１種に特定される。制限エンド
ヌクレアーゼの認識配列の上記のような対称構造を“パ
リンドローム”と呼称している。或る種の制限エンドヌ
クレアーゼは退行した、もしくは緩やかな特異性を有し
、そのような制限エンドヌクレアーゼは同一位置で多種
の塩基を認識し得る。ＧＡＡＴＴＣ配列を認識するＥｃ
ｏＲＩは認識配列が対称性である制限エンドヌクレアー
ゼの一例であり、一方ＰｕＧＣＧＣＰｙ配列を認識する
ＨａｅＩＩは退行した、もしくは緩やかな特異性を有す
る制限エンドヌクレアーゼの典型例である。認識部位が
対称性であるエンドヌクレアーゼは通常認識部位内で、
または該部位に隣接して対称的に切断を行ない、一方非
対称部位を認識するエンドヌクレアーゼは認識部位から
普通約１〜１３塩基対離れた位置において切断を行なう
傾向を有する。
ドヌクレアーゼは、実用上ＤＮＡ分子の分解に用いられ
るため、主にその認識配列及び切断特異性で特徴付けら
れている。大部分の制限エンドヌクレアーゼは長さ４〜
６ヌクレオチドの配列を認識する。最近、認識配列の長
さがヌクレオチド７個または８個である制限エンドヌク
レアーゼが発見された。認識部位は、その総てではない
が殆どが二回転対称軸を有し、また殆どの場合認識部位
内の塩基はいずれもただ１種に特定される。制限エンド
ヌクレアーゼの認識配列の上記のような対称構造を“パ
リンドローム”と呼称している。或る種の制限エンドヌ
クレアーゼは退行した、もしくは緩やかな特異性を有し
、そのような制限エンドヌクレアーゼは同一位置で多種
の塩基を認識し得る。ＧＡＡＴＴＣ配列を認識するＥｃ
ｏＲＩは認識配列が対称性である制限エンドヌクレアー
ゼの一例であり、一方ＰｕＧＣＧＣＰｙ配列を認識する
ＨａｅＩＩは退行した、もしくは緩やかな特異性を有す
る制限エンドヌクレアーゼの典型例である。認識部位が
対称性であるエンドヌクレアーゼは通常認識部位内で、
または該部位に隣接して対称的に切断を行ない、一方非
対称部位を認識するエンドヌクレアーゼは認識部位から
普通約１〜１３塩基対離れた位置において切断を行なう
傾向を有する。
【０００８】細菌Ｒ−Ｍ系の第二の構成要素は修飾メチ
ラーゼである。この酵素は制限エンドヌクレアーゼと相
補的であり、細菌が自己ＤＮＡを外来の感染ＤＮＡと区
別して保護することを可能にする。修飾メチラーゼは、
対応する制限エンドヌクレアーゼの認識配列と同じヌク
レオチド配列を認識してこの配列と結合するがＤＮＡ切
断は行なわず、替わりに認識配列内の１個以上のヌクレ
オチドをメチル基の付加によって化学的に修飾する。メ
チル化された認識配列はもはや対応する制限エンドヌク
レアーゼによって認識または切断されない。細菌細胞の
ＤＮＡはその修飾メチラーゼの作用下に常に修飾されて
おり、従って内在する制限エンドヌクレアーゼに対して
非感受性である。制限エンドヌクレアーゼによる認識及
び切断に対して感受性であるのは、修飾されておらず、
従って確実に外来のＤＮＡのみである。
ラーゼである。この酵素は制限エンドヌクレアーゼと相
補的であり、細菌が自己ＤＮＡを外来の感染ＤＮＡと区
別して保護することを可能にする。修飾メチラーゼは、
対応する制限エンドヌクレアーゼの認識配列と同じヌク
レオチド配列を認識してこの配列と結合するがＤＮＡ切
断は行なわず、替わりに認識配列内の１個以上のヌクレ
オチドをメチル基の付加によって化学的に修飾する。メ
チル化された認識配列はもはや対応する制限エンドヌク
レアーゼによって認識または切断されない。細菌細胞の
ＤＮＡはその修飾メチラーゼの作用下に常に修飾されて
おり、従って内在する制限エンドヌクレアーゼに対して
非感受性である。制限エンドヌクレアーゼによる認識及
び切断に対して感受性であるのは、修飾されておらず、
従って確実に外来のＤＮＡのみである。
【０００９】１０００種を上回る様々な制限エンドヌク
レアーゼが細菌株から単離されており、その多くは共通
の特異性を有する。認識配列が互いに同じである制限エ
ンドヌクレアーゼを“イソシゾマー”と呼称する。イソ
シゾマーは、認識配列は同じであっても切断位置、及び
様々な位置での切断頻度に関して互いに相違し得る［切
断位置については、例えばＸｍａＩとＳｍａＩとの相違
に関してＥｎｄｏｗｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏ
ｌ． Ｂｉｏｌ．， １１２， ｐ．５２１（１
９７７）及びＷａａｌｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．， ５， ｐ
．３２３１（１９７８）を、また切断頻度についてはＸ
ｈｏＩとＰａｅＲ７Ｉとの相違に関してＧｉｎｇｅｒａ
ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０，
ｐ．４０２（１９８３）を参照されたい］。
レアーゼが細菌株から単離されており、その多くは共通
の特異性を有する。認識配列が互いに同じである制限エ
ンドヌクレアーゼを“イソシゾマー”と呼称する。イソ
シゾマーは、認識配列は同じであっても切断位置、及び
様々な位置での切断頻度に関して互いに相違し得る［切
断位置については、例えばＸｍａＩとＳｍａＩとの相違
に関してＥｎｄｏｗｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏ
ｌ． Ｂｉｏｌ．， １１２， ｐ．５２１（１
９７７）及びＷａａｌｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．， ５， ｐ
．３２３１（１９７８）を、また切断頻度についてはＸ
ｈｏＩとＰａｅＲ７Ｉとの相違に関してＧｉｎｇｅｒａ
ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０，
ｐ．４０２（１９８３）を参照されたい］。
【００１０】遺伝子工学技術の出現をみた今日では、遺
伝子をクローニングしてその遺伝子がコードするタンパ
ク質及び酵素を、それらの天然供給源から通常の精製技
術によって得られるより大量に生産することができる。
伝子をクローニングしてその遺伝子がコードするタンパ
ク質及び酵素を、それらの天然供給源から通常の精製技
術によって得られるより大量に生産することができる。
【００１１】タイプＩＩの制限−修飾系のクローニング
が次第に頻繁に行なわれるようになっている。Ｅ．
ｃｏｌｉへの導入によるＲ−Ｍ系クローニングには、（
１）天然プラスミドのサブクローニング；（２）ファー
ジ制限に基づく選択；（３）ベクター修飾に基づく選択
；及び（４）マルチステップ単離の４方法が用いられて
いる。
が次第に頻繁に行なわれるようになっている。Ｅ．
ｃｏｌｉへの導入によるＲ−Ｍ系クローニングには、（
１）天然プラスミドのサブクローニング；（２）ファー
ジ制限に基づく選択；（３）ベクター修飾に基づく選択
；及び（４）マルチステップ単離の４方法が用いられて
いる。
【００１２】初期のクローン系では、制限エンドヌクレ
アーゼクローンの同定もしくは選択手段としてバクテリ
オファージ感染が用いられた［ＨｈａＩＩ： Ｍａｎ
ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３， ｐ
ｐ．９７−１１２（１９７８）； ＥｃｏＲＩＩ；
Ｋｏｓｙｋｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ・
Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １７８， ｐｐ．７
１７−７１９（１９８０）； ＰｓｔＩ： Ｗａｌ
ｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７８， ｐｐ．１
５０３−１５０７（１９８１）］。細菌内にＲ−Ｍ系が
存在すればその細菌はバクテリオファージの感染に抵抗
し得るので、クローンＲ−Ｍ遺伝子を持つ細胞は原則と
して、ファージに暴露したライブラリーから生存細胞と
して選択的に単離することができる。この方法はしかし
限られた価値しか有しないことが判明した。特に、クロ
ーンＲ−Ｍ遺伝子は選択的生存を実現する十分なファー
ジ耐性を常に示すとはかぎらないことが明らかとなった
。
アーゼクローンの同定もしくは選択手段としてバクテリ
オファージ感染が用いられた［ＨｈａＩＩ： Ｍａｎ
ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３， ｐ
ｐ．９７−１１２（１９７８）； ＥｃｏＲＩＩ；
Ｋｏｓｙｋｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ・
Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １７８， ｐｐ．７
１７−７１９（１９８０）； ＰｓｔＩ： Ｗａｌ
ｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７８， ｐｐ．１
５０３−１５０７（１９８１）］。細菌内にＲ−Ｍ系が
存在すればその細菌はバクテリオファージの感染に抵抗
し得るので、クローンＲ−Ｍ遺伝子を持つ細胞は原則と
して、ファージに暴露したライブラリーから生存細胞と
して選択的に単離することができる。この方法はしかし
限られた価値しか有しないことが判明した。特に、クロ
ーンＲ−Ｍ遺伝子は選択的生存を実現する十分なファー
ジ耐性を常に示すとはかぎらないことが明らかとなった
。
【００１３】天然プラスミドのサブクローニングは、最
初にプラスミド上に位置すると特徴付けたＲ−Ｍ系をＥ
． ｃｏｌｉに導入してプラスミドをクローニングす
ることを含む［ＥｃｏＲＶ： Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅ
ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．， １２， ｐｐ．３６５９−３６７
６（１９８４）； ＰａｅＲ７： Ｇｉｎｇｅｒａ
ｓ ａｎｄ Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０，ｐ
ｐ．４０２−４０６（１９８３）； Ｔｈｅｒｉａｕ
ｌｔ ａｎｄ Ｒｏｙ，Ｇｅｎｅ， １９，
ｐｐ．３５５−３５９（１９８２）； ＰｖｕＩＩ：
Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６４， ｐｐ．５０１−
５０９（１９８５）］。この方法では、プラスミドを消
化及び連結反応の前に精製するので供給源ＤＮＡの複雑
さが低減する。そこで系の単離は、サブクローニングに
よって得られたライブラリーを特徴付け、選択を行なう
ことを含む。この方法も、殆どのＲ−Ｍ系が細菌のプラ
スミド上ではなく染色体上に位置することを初めとする
幾つかの限界を有する。
初にプラスミド上に位置すると特徴付けたＲ−Ｍ系をＥ
． ｃｏｌｉに導入してプラスミドをクローニングす
ることを含む［ＥｃｏＲＶ： Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅ
ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．， １２， ｐｐ．３６５９−３６７
６（１９８４）； ＰａｅＲ７： Ｇｉｎｇｅｒａ
ｓ ａｎｄ Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０，ｐ
ｐ．４０２−４０６（１９８３）； Ｔｈｅｒｉａｕ
ｌｔ ａｎｄ Ｒｏｙ，Ｇｅｎｅ， １９，
ｐｐ．３５５−３５９（１９８２）； ＰｖｕＩＩ：
Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６４， ｐｐ．５０１−
５０９（１９８５）］。この方法では、プラスミドを消
化及び連結反応の前に精製するので供給源ＤＮＡの複雑
さが低減する。そこで系の単離は、サブクローニングに
よって得られたライブラリーを特徴付け、選択を行なう
ことを含む。この方法も、殆どのＲ−Ｍ系が細菌のプラ
スミド上ではなく染色体上に位置することを初めとする
幾つかの限界を有する。
【００１４】現在最も好ましい方法であるベクター修飾
法は、各個のタイプＩＩ系の制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子と修飾メチラーゼ遺伝子とは連結しており、その際
まずメチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順で逐次発
現するという仮定に基づいている。即ち、メチラーゼポ
ジティブクローン集団内の幾つかのクローンは対応する
エンドヌクレアーゼ遺伝子をも担っているはずである。 メチラーゼ選択法として公知であるこの方法はＷｉｌｓ
ｏｎによって初めて、制限酵素ＨａｅＩＩ、ＴａｑＩ、
ＢａｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ及びＭｓｐＩの
Ｒ−Ｍ系のクローニングに有効に適用された（ヨーロッ
パ特許出願公開第０１９３４１３号）。
法は、各個のタイプＩＩ系の制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子と修飾メチラーゼ遺伝子とは連結しており、その際
まずメチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順で逐次発
現するという仮定に基づいている。即ち、メチラーゼポ
ジティブクローン集団内の幾つかのクローンは対応する
エンドヌクレアーゼ遺伝子をも担っているはずである。 メチラーゼ選択法として公知であるこの方法はＷｉｌｓ
ｏｎによって初めて、制限酵素ＨａｅＩＩ、ＴａｑＩ、
ＢａｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ及びＭｓｐＩの
Ｒ−Ｍ系のクローニングに有効に適用された（ヨーロッ
パ特許出願公開第０１９３４１３号）。
【００１５】しかし、幾つかのＲ−Ｍ系はマルチステッ
プクローニング法を必要とした。例えば、新しいＲ−Ｍ
系獲得の際に幾種かの細胞は安定性の問題に直面するこ
とが判明した。メチラーゼがエンドヌクレアーゼに優先
しないと、細胞は自己の細胞ＤＮＡが切断される危険に
晒される。Ｅ． ｃｏｌｉは、自己ＤＮＡの修復によ
ってこの問題に対処すると考えられ、明らかなトラウマ
を有することなく多くのクローンＲ−Ｍ系に順応し得る
。 しかし、総ての系に容易に順応するわけではない。例え
ば制限酵素ＤｄｅＩ及びＢａｍＨＩのＲ−Ｍ系は単一ス
テップではクローニングされ得ず、三つのクローニング
ステツプが必要であった［Ｈｏｗａｒｄｅｔ ａ１．
， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
１４， ｐｐ．７９３９−７９５１（１９８８）］
。実際、メチラーゼ遺伝子のみをクローニングしたＲ−
Ｍ系は多い。 そのような系は制限酵素ＢａｍＨＩ及びＤｄｅＩの系に
類似し得、同様のクローニング法を必要とし得る。
プクローニング法を必要とした。例えば、新しいＲ−Ｍ
系獲得の際に幾種かの細胞は安定性の問題に直面するこ
とが判明した。メチラーゼがエンドヌクレアーゼに優先
しないと、細胞は自己の細胞ＤＮＡが切断される危険に
晒される。Ｅ． ｃｏｌｉは、自己ＤＮＡの修復によ
ってこの問題に対処すると考えられ、明らかなトラウマ
を有することなく多くのクローンＲ−Ｍ系に順応し得る
。 しかし、総ての系に容易に順応するわけではない。例え
ば制限酵素ＤｄｅＩ及びＢａｍＨＩのＲ−Ｍ系は単一ス
テップではクローニングされ得ず、三つのクローニング
ステツプが必要であった［Ｈｏｗａｒｄｅｔ ａ１．
， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
１４， ｐｐ．７９３９−７９５１（１９８８）］
。実際、メチラーゼ遺伝子のみをクローニングしたＲ−
Ｍ系は多い。 そのような系は制限酵素ＢａｍＨＩ及びＤｄｅＩの系に
類似し得、同様のクローニング法を必要とし得る。
【００１６】上述の方法を一つ以上実施することによっ
て幾種かのクローンが得られる［Ｗｉｌｓｏｎ， Ｇ
ｅｎｅ， ７４， ｐｐ．２８１−２８９（１９８
８）参照］が、タイプＩＩのＲ−Ｍ系のクローニングに
困難が無いわけではない。特に、多くのＲ−Ｍ系の遺伝
学的特性は比較的複雑であることが判明したし、また例
えばベクター修飾によって得られたメチラーゼポジティ
ブクローンは対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子をもた
らさなかった［Ｗｉｌｓｏｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉ
ｎＧｅｎｅｔｉｃｓ， ４， ｐｐ．３１４−３１
８（１９８８）及びＬｕｎｎｅｎ ｅｔ ａ１．，
Ｇｅｎｅ， ７４， ｐｐ．２５−３２（１９
８８）参照］。実際、ベクター修飾を用いるＲ−Ｍ系ク
ローニングでは多大の障害が出来する。例えば、幾つか
のＲ−Ｍ系ではメチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ
遺伝子とが連結しておらず、即ち細菌ＤＮＡの断片化に
用いられるエンドヌクレアーゼがＲ−Ｍ遺伝子の一方ま
たは両方を切断する恐れが有る。また、制限酵素がＢａ
ｍＨＩ及びＤｄｅＩであるようなＲ−Ｍ系ではメチラー
ゼが、形質転換宿主での発現が不十分であるために、ま
たは固有のメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺
伝子発現制御機構のゆえに、あるいはまた未知の理由か
ら、対応するエンドヌクレアーゼによる消化を十分に防
御しない恐れが有る。修飾が形質転換のために選択した
宿主細胞に有害なことも有り得る。クローニングしよう
とするエンドヌクレアーゼがメチラーゼ選択に十分な純
度または量で得られない恐れも有る。多くのＲ−Ｍ系に
おいて、異なる細菌種の形質転換宿主細胞内でエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を発現させることでも困難が生じる。
て幾種かのクローンが得られる［Ｗｉｌｓｏｎ， Ｇ
ｅｎｅ， ７４， ｐｐ．２８１−２８９（１９８
８）参照］が、タイプＩＩのＲ−Ｍ系のクローニングに
困難が無いわけではない。特に、多くのＲ−Ｍ系の遺伝
学的特性は比較的複雑であることが判明したし、また例
えばベクター修飾によって得られたメチラーゼポジティ
ブクローンは対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子をもた
らさなかった［Ｗｉｌｓｏｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉ
ｎＧｅｎｅｔｉｃｓ， ４， ｐｐ．３１４−３１
８（１９８８）及びＬｕｎｎｅｎ ｅｔ ａ１．，
Ｇｅｎｅ， ７４， ｐｐ．２５−３２（１９
８８）参照］。実際、ベクター修飾を用いるＲ−Ｍ系ク
ローニングでは多大の障害が出来する。例えば、幾つか
のＲ−Ｍ系ではメチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ
遺伝子とが連結しておらず、即ち細菌ＤＮＡの断片化に
用いられるエンドヌクレアーゼがＲ−Ｍ遺伝子の一方ま
たは両方を切断する恐れが有る。また、制限酵素がＢａ
ｍＨＩ及びＤｄｅＩであるようなＲ−Ｍ系ではメチラー
ゼが、形質転換宿主での発現が不十分であるために、ま
たは固有のメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺
伝子発現制御機構のゆえに、あるいはまた未知の理由か
ら、対応するエンドヌクレアーゼによる消化を十分に防
御しない恐れが有る。修飾が形質転換のために選択した
宿主細胞に有害なことも有り得る。クローニングしよう
とするエンドヌクレアーゼがメチラーゼ選択に十分な純
度または量で得られない恐れも有る。多くのＲ−Ｍ系に
おいて、異なる細菌種の形質転換宿主細胞内でエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を発現させることでも困難が生じる。
【００１７】比較的複雑なタイプＩＩＲ−Ｍ系のクロー
ニングに上述のような困難が存在するにもかかわらず、
ベクター修飾選択法（Ｌｕｎｎｅｎ ｅｔ ａ１．
， ｏｐ． ｃｉｔ．参照）を改良し、及び／
またはマルチステップクローニング法を用いることによ
って幾種かのエンドヌクレアーゼ遺伝子を得ることがで
きる。上述の諸方法に、例えば多数のライブラリーを形
成すること、新しいクローニングベクターを構成するこ
と、メチラーゼ選択ステップにイソシゾマーを用いるこ
と、メチラーゼ遺伝子及び／またはエンドヌクレアーゼ
遺伝子をマッピングして対応するＤＮＡ配列を決定し、
このＤＮＡ配列をハイブリダイゼーションプローブとし
て用いること等の様々な改変を加えることによって、幾
種かの扱いにくい組み換え体Ｒ−Ｍ系を得た。
ニングに上述のような困難が存在するにもかかわらず、
ベクター修飾選択法（Ｌｕｎｎｅｎ ｅｔ ａ１．
， ｏｐ． ｃｉｔ．参照）を改良し、及び／
またはマルチステップクローニング法を用いることによ
って幾種かのエンドヌクレアーゼ遺伝子を得ることがで
きる。上述の諸方法に、例えば多数のライブラリーを形
成すること、新しいクローニングベクターを構成するこ
と、メチラーゼ選択ステップにイソシゾマーを用いるこ
と、メチラーゼ遺伝子及び／またはエンドヌクレアーゼ
遺伝子をマッピングして対応するＤＮＡ配列を決定し、
このＤＮＡ配列をハイブリダイゼーションプローブとし
て用いること等の様々な改変を加えることによって、幾
種かの扱いにくい組み換え体Ｒ−Ｍ系を得た。
【００１８】しかし、いずれのタイプＩＩＲ−Ｍ系クロ
ーニング法を実施するにせよ、任意の特定Ｒ−Ｍ系のク
ローニングに場合によって必要となり得るのが従来方法
のいずれのどのような改変もしくは改良であるかすら明
らかでない。例えば、特定系の詳細な遺伝学的特性は普
通未知である。タイプＩＩ系の制限エンドヌクレアーゼ
及び修飾メチラーゼの遺伝子はゲノム上に、４種の可能
な位置関係のいずれかで存在し得る（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｓｕｐ
ｒａ）。酵素及び対応する遺伝子の大きさは、ＤＮＡ配
列及びアミノ酸配列同様個々のＲ−Ｍ系毎にきわめて様
々である。実際、互いにイソシゾマーである制限エンド
ヌクレアーゼがさほどの類似性を示さないことが判明し
ている［ｉｄ．， ｐ．３１８及びＣｈａｎｄｒａｓ
ｅｇｅｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｖｏｌ
．Ｉ， ｐｐ．１４９−１５６， Ａｄｅｎｉｎｅ
Ｐｒｅｓｓ（１９８８）参照］。
ーニング法を実施するにせよ、任意の特定Ｒ−Ｍ系のク
ローニングに場合によって必要となり得るのが従来方法
のいずれのどのような改変もしくは改良であるかすら明
らかでない。例えば、特定系の詳細な遺伝学的特性は普
通未知である。タイプＩＩ系の制限エンドヌクレアーゼ
及び修飾メチラーゼの遺伝子はゲノム上に、４種の可能
な位置関係のいずれかで存在し得る（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｓｕｐ
ｒａ）。酵素及び対応する遺伝子の大きさは、ＤＮＡ配
列及びアミノ酸配列同様個々のＲ−Ｍ系毎にきわめて様
々である。実際、互いにイソシゾマーである制限エンド
ヌクレアーゼがさほどの類似性を示さないことが判明し
ている［ｉｄ．， ｐ．３１８及びＣｈａｎｄｒａｓ
ｅｇｅｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｖｏｌ
．Ｉ， ｐｐ．１４９−１５６， Ａｄｅｎｉｎｅ
Ｐｒｅｓｓ（１９８８）参照］。
【００１９】制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び修飾メ
チラーゼ遺伝子の発現を制御する機構も、個々のタイプ
ＩＩ系毎にきわめて様々である。例えばエンドヌクレア
ーゼ遺伝子の発現は、ＡｖａＩＩ系、ＨａｅＩＩ系、Ｈ
ｉｎｆＩ系、ＰｓｔＩ系及びＸｂａＩ系では修飾依存性
である。また、ＴａｑＩ系でそうであるように、エンド
ヌクレアーゼ遺伝子が有する該遺伝子自身の認識部位は
対応するメチラーゼ遺伝子に比べて多数である（ｉｄ．
）。
チラーゼ遺伝子の発現を制御する機構も、個々のタイプ
ＩＩ系毎にきわめて様々である。例えばエンドヌクレア
ーゼ遺伝子の発現は、ＡｖａＩＩ系、ＨａｅＩＩ系、Ｈ
ｉｎｆＩ系、ＰｓｔＩ系及びＸｂａＩ系では修飾依存性
である。また、ＴａｑＩ系でそうであるように、エンド
ヌクレアーゼ遺伝子が有する該遺伝子自身の認識部位は
対応するメチラーゼ遺伝子に比べて多数である（ｉｄ．
）。
【００２０】目的Ｒ−Ｍ系を持つクローンを得るべく細
胞を形質転換する際、細胞ＤＮＡは最初修飾されておら
ず、従って目的エンドヌクレアーゼにより消化される危
険に晒されている。形質転換宿主細胞はＤＮＡ修復系を
有するか、または目的エンドヌクレアーゼの発現を修飾
完了まで遅延させ得なければならない。形質転換宿主が
上記いずれの機構も有しなければ、クローン遺伝子を宿
主内で安定化するうえで問題が生じる。先に指摘したよ
うに、ＤｄｅＩ系及びＢａｍＨＩ系のクローニングで安
定化の問題が生じた時、形質転換宿主細胞のＤＮＡを保
護するためにメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ
遺伝子を逐次導入しなければならなかった［Ｈｏｗａｒ
ｄ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ
及びＢｒｏｏｋｓｅｔ ａ１．， Ｇｅｎｅ，
７４， ｐ．１３（１９８８）］。しかし、Ｒ−Ｍ系
の或るものはそのクローニングのあらゆる試みに抵抗し
たし、またおそらく安定化が困難であるためにメチラー
ゼ遺伝子のクローニングしかできないＲ−Ｍ系も有った
（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ， ４， ｐ．３１７）。
胞を形質転換する際、細胞ＤＮＡは最初修飾されておら
ず、従って目的エンドヌクレアーゼにより消化される危
険に晒されている。形質転換宿主細胞はＤＮＡ修復系を
有するか、または目的エンドヌクレアーゼの発現を修飾
完了まで遅延させ得なければならない。形質転換宿主が
上記いずれの機構も有しなければ、クローン遺伝子を宿
主内で安定化するうえで問題が生じる。先に指摘したよ
うに、ＤｄｅＩ系及びＢａｍＨＩ系のクローニングで安
定化の問題が生じた時、形質転換宿主細胞のＤＮＡを保
護するためにメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ
遺伝子を逐次導入しなければならなかった［Ｈｏｗａｒ
ｄ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ
及びＢｒｏｏｋｓｅｔ ａ１．， Ｇｅｎｅ，
７４， ｐ．１３（１９８８）］。しかし、Ｒ−Ｍ系
の或るものはそのクローニングのあらゆる試みに抵抗し
たし、またおそらく安定化が困難であるためにメチラー
ゼ遺伝子のクローニングしかできないＲ−Ｍ系も有った
（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ， ４， ｐ．３１７）。
【００２１】形質転換宿主細胞が外来型の修飾を制限す
る系を有する場合も有ることが判明している。例えば、
Ｅ． ｃｏｌｉでは修飾ＤＮＡを制限する２種の系、
即ちメチルシトシンを有するＤＮＡを制限するｍｃｒ系
とメチルアデニンを有するＤＮＡを制限するｍｒｒ系と
が同定された。従って普通、上記二つの系に欠けるＥ．
ｃｏｌｉ株を用いなければならない。付加的な宿主細胞
制限系の存在は、Ｒ−Ｍ系のクローニングを困難にする
一因ともなり得る。
る系を有する場合も有ることが判明している。例えば、
Ｅ． ｃｏｌｉでは修飾ＤＮＡを制限する２種の系、
即ちメチルシトシンを有するＤＮＡを制限するｍｃｒ系
とメチルアデニンを有するＤＮＡを制限するｍｒｒ系と
が同定された。従って普通、上記二つの系に欠けるＥ．
ｃｏｌｉ株を用いなければならない。付加的な宿主細胞
制限系の存在は、Ｒ−Ｍ系のクローニングを困難にする
一因ともなり得る。
【００２２】制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラー
ゼは実験室でのＤＮＡの特徴付け及び再構成に有用な道
具であるので、これら２酵素を実質的に純粋な形態で豊
富に製造することが商業的に求められている。本発明に
よる組み換え体ＤＮＡ技術を用いれば、制限エンドヌク
レアーゼＮｌａＩＩＩと対応する修飾メチラーゼとを簡
単に、かつ商業的に有用な量で製造することができる。
ゼは実験室でのＤＮＡの特徴付け及び再構成に有用な道
具であるので、これら２酵素を実質的に純粋な形態で豊
富に製造することが商業的に求められている。本発明に
よる組み換え体ＤＮＡ技術を用いれば、制限エンドヌク
レアーゼＮｌａＩＩＩと対応する修飾メチラーゼとを簡
単に、かつ商業的に有用な量で製造することができる。
【００２３】
【発明の概要】本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａ
ｃｔａｍｉｃａ（ＮＲＣＣ ２１１８）に由来する制
限酵素ＮｌａＩＩＩのタイプＩＩＲ−Ｍ系に係わる。酵
素ＮｌａＩＩＩはＤＮＡの５′ＣＡＴＧ３′配列を認識
し、Ｇの３′側を切断して四塩基３′末端延長部（５′
ＣＡＴＧ／３′）をもたらす［その開示が本明細書に参
考として含まれるＱｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌ
ｄｋｒａｕｔ， ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．， １４， ｐｐ．１９９１−１９９９（１９
８６）参照］。
ｃｔａｍｉｃａ（ＮＲＣＣ ２１１８）に由来する制
限酵素ＮｌａＩＩＩのタイプＩＩＲ−Ｍ系に係わる。酵
素ＮｌａＩＩＩはＤＮＡの５′ＣＡＴＧ３′配列を認識
し、Ｇの３′側を切断して四塩基３′末端延長部（５′
ＣＡＴＧ／３′）をもたらす［その開示が本明細書に参
考として含まれるＱｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌ
ｄｋｒａｕｔ， ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．， １４， ｐｐ．１９９１−１９９９（１９
８６）参照］。
【００２４】本発明は、Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ（
ＮＲＣＣ ２１１８）から得られる制限エンドヌクレ
アーゼＮｌａＩＩＩ及び対応する修飾メチラーゼをコー
ドする組み換え体ＤＮＡ、及びこの組み換え体ＤＮＡの
製造方法を提供する。本発明はまた、制限エンドヌクレ
アーゼＮｌａＩＩＩ及び対応する修飾メチラーゼを実質
的に純粋な形態で製造する方法も提供する。
ＮＲＣＣ ２１１８）から得られる制限エンドヌクレ
アーゼＮｌａＩＩＩ及び対応する修飾メチラーゼをコー
ドする組み換え体ＤＮＡ、及びこの組み換え体ＤＮＡの
製造方法を提供する。本発明はまた、制限エンドヌクレ
アーゼＮｌａＩＩＩ及び対応する修飾メチラーゼを実質
的に純粋な形態で製造する方法も提供する。
【００２５】
【好ましい具体例の説明】本発明は、制限エンドヌクレ
アーゼであるＮｌａＩＩＩとこれに対応する修飾メチラ
ーゼ、即ちＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＮ
ｌａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードする組み換え体ＤＮ
Ａを得る詳細方法と、前記組み換え体ＤＮＡを発現させ
て対応する酵素を得る詳細方法とを提供する。本発明の
組み換え体ＤＮＡは適当な細菌宿主細胞に導入して該細
胞の形質転換に用い得、それによってＮｌａＩＩＩエン
ドヌクレアーゼ及びＮｌａＩＩＩメチラーゼを商業用と
して実質的に純粋な形態で大量に製造することが可能と
なる。
アーゼであるＮｌａＩＩＩとこれに対応する修飾メチラ
ーゼ、即ちＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＮ
ｌａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードする組み換え体ＤＮ
Ａを得る詳細方法と、前記組み換え体ＤＮＡを発現させ
て対応する酵素を得る詳細方法とを提供する。本発明の
組み換え体ＤＮＡは適当な細菌宿主細胞に導入して該細
胞の形質転換に用い得、それによってＮｌａＩＩＩエン
ドヌクレアーゼ及びＮｌａＩＩＩメチラーゼを商業用と
して実質的に純粋な形態で大量に製造することが可能と
なる。
【００２６】本発明によれば、ＮｌａＩＩＩエンドヌク
レアーゼ及びＮｌａＩＩＩメチラーゼをコードする組み
換え体ＤＮＡは、ヨーロッパ特許出願公開第０１９３４
１３号に開示されたベクター修飾法を改良した方法を用
いることによって得られる。制限酵素ＮｌａＩＩＩのＲ
−Ｍ系は通常、上記ヨーロッパ特許出願公開に開示され
ているようなこれまでに単離されたタイプＩＩＲ−Ｍ系
より複雑であることが本発明により判明した。ＮｌａＩ
ＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラー
ゼ遺伝子とは連結していることが最終的に判明したが、
ベクター修飾を用いて得られたいずれのクローンにおい
てもエンドヌクレアーゼ遺伝子は完全な形ではなかった
。
レアーゼ及びＮｌａＩＩＩメチラーゼをコードする組み
換え体ＤＮＡは、ヨーロッパ特許出願公開第０１９３４
１３号に開示されたベクター修飾法を改良した方法を用
いることによって得られる。制限酵素ＮｌａＩＩＩのＲ
−Ｍ系は通常、上記ヨーロッパ特許出願公開に開示され
ているようなこれまでに単離されたタイプＩＩＲ−Ｍ系
より複雑であることが本発明により判明した。ＮｌａＩ
ＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラー
ゼ遺伝子とは連結していることが最終的に判明したが、
ベクター修飾を用いて得られたいずれのクローンにおい
てもエンドヌクレアーゼ遺伝子は完全な形ではなかった
。
【００２７】制限地図を調べて、ＮｌａＩＩＩメチラー
ゼ遺伝子がＮ． ｌａｃｔａｍｉｃａのゲノム上の約
１３００塩基対の領域に位置することを確認した。この
領域の上流（５′側）のメチラーゼクローンは総て、Ｎ
ｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子領域の塩基対約４１５個以
内で終っていた。
ゼ遺伝子がＮ． ｌａｃｔａｍｉｃａのゲノム上の約
１３００塩基対の領域に位置することを確認した。この
領域の上流（５′側）のメチラーゼクローンは総て、Ｎ
ｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子領域の塩基対約４１５個以
内で終っていた。
【００２８】これに対して、メチラーゼ遺伝子下流（３
′側）のクローンのＤＮＡ鎖長は３７００塩基対までで
様々であった。従って、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子とが連結する
場合、エンドヌクレアーゼ遺伝子はメチラーゼ遺伝子の
上流（５′側）に位置すると考えられた。
′側）のクローンのＤＮＡ鎖長は３７００塩基対までで
様々であった。従って、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子とが連結する
場合、エンドヌクレアーゼ遺伝子はメチラーゼ遺伝子の
上流（５′側）に位置すると考えられた。
【００２９】ゲノムの上流領域に位置する全メチラーゼ
クローンの長さが揃う現象は、タイプＩＩＲ−Ｍ系のク
ローニングではこれまで観察されなかった。これについ
ては幾つかの説明が成り立ち得る。ＮｌａＩＩＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子と
が連結しなかったのかもしれないし、あるいはまた両遺
伝子を宿主細胞に同時に導入することが致命的であった
のかもしれない。
クローンの長さが揃う現象は、タイプＩＩＲ−Ｍ系のク
ローニングではこれまで観察されなかった。これについ
ては幾つかの説明が成り立ち得る。ＮｌａＩＩＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子と
が連結しなかったのかもしれないし、あるいはまた両遺
伝子を宿主細胞に同時に導入することが致命的であった
のかもしれない。
【００３０】未知の理由から、ＮｌａＩＩＩメチラーゼ
遺伝子を持つクローンからＮｌａＩＩＩエンドヌクレア
ーゼ遺伝子を損傷無しにクローニングすることはできな
かった。従って、エンドヌクレアーゼ遺伝子の小片をク
ローニングし、組み換え技術を用いて遺伝子を再構成し
なければならなかった。
遺伝子を持つクローンからＮｌａＩＩＩエンドヌクレア
ーゼ遺伝子を損傷無しにクローニングすることはできな
かった。従って、エンドヌクレアーゼ遺伝子の小片をク
ローニングし、組み換え技術を用いて遺伝子を再構成し
なければならなかった。
【００３１】エンドヌクレアーゼ遺伝子がメチラーゼ遺
伝子に連結しているという仮定に基づき、ＮｌａＩＩＩ
メチラーゼ遺伝子から上流のＤＮＡを配列決定した。Ｎ
ｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子に隣接する５２０塩基対の
転写解読枠が見いだされた。
伝子に連結しているという仮定に基づき、ＮｌａＩＩＩ
メチラーゼ遺伝子から上流のＤＮＡを配列決定した。Ｎ
ｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子に隣接する５２０塩基対の
転写解読枠が見いだされた。
【００３２】Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡ
の制限位置の地図をサザン法で作成し、その際プローブ
としてＮｌａＩＩＩメチラーゼクローンと、５２０塩基
対転写解読枠の、エンドヌクレアーゼの推定カルボキシ
ル末端に対応する部分と相補的である合成オリゴヌクレ
オチドとを用いた。プローブとのハイブリッドを形成し
、推定エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分
なＤＮＡを含む制限断片を同定した。
の制限位置の地図をサザン法で作成し、その際プローブ
としてＮｌａＩＩＩメチラーゼクローンと、５２０塩基
対転写解読枠の、エンドヌクレアーゼの推定カルボキシ
ル末端に対応する部分と相補的である合成オリゴヌクレ
オチドとを用いた。プローブとのハイブリッドを形成し
、推定エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分
なＤＮＡを含む制限断片を同定した。
【００３３】推定エンドヌクレアーゼ遺伝子のアミノ末
端に対応するＤＮＡを十分量単離し、分離したベクター
に導入してサブクローニングを施した。推定エンドヌク
レアーゼ遺伝子の二つの部分を結合し、予めＮｌａＩＩ
Ｉメチラーゼ遺伝子を導入した宿主細胞に導入してクロ
ーニングした。
端に対応するＤＮＡを十分量単離し、分離したベクター
に導入してサブクローニングを施した。推定エンドヌク
レアーゼ遺伝子の二つの部分を結合し、予めＮｌａＩＩ
Ｉメチラーゼ遺伝子を導入した宿主細胞に導入してクロ
ーニングした。
【００３４】この前もっての修飾操作は、有効ではある
が厳密には必要ないことが後に判明した。ＮｌａＩＩＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺
伝子との両方を有するプラスミドと共にＮｌａＩＩＩメ
チラーゼ遺伝子のみを有する第二の適合プラスミドを用
いて形質転換を行なえば、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレア
ーゼ遺伝子を未修飾の宿主細胞に、低頻度においてでは
あるが導入することが可能である。
が厳密には必要ないことが後に判明した。ＮｌａＩＩＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺
伝子との両方を有するプラスミドと共にＮｌａＩＩＩメ
チラーゼ遺伝子のみを有する第二の適合プラスミドを用
いて形質転換を行なえば、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレア
ーゼ遺伝子を未修飾の宿主細胞に、低頻度においてでは
あるが導入することが可能である。
【００３５】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子とＮｌａＩＩＩ修飾メチラーゼ遺伝子とを有する組み
換え体ＤＮＡをクローニングする好ましい方法を図１に
示し、かつ以下に詳述する。
子とＮｌａＩＩＩ修飾メチラーゼ遺伝子とを有する組み
換え体ＤＮＡをクローニングする好ましい方法を図１に
示し、かつ以下に詳述する。
【００３６】Ａ．ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子のクロ
ーニング Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａのゲノムＤＮＡを公知方法
で精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで部分的に消
化する。ゲノムライブラリーの形成に適した制限エンド
ヌクレアーゼはＨｉｎＰＩである。消化したゲノムＤＮ
Ａを、いずれもＮｌａＩＩＩの認識配列を含む一つ以上
のＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩ認識部位を
有するクローニングベクターと連結させる。ＢｓｐＨＩ
認識部位及びＳｐｈＩ認識部位はＮｌａＩＩＩ認識配列
のサブセットであり、ＮｌａＩＩＩメチル化によってブ
ロックされる。理論上は、ＮｃｏＩもＮｌａＩＩＩのサ
ブセットであるので選択に用い得る。しかし、ＮｃｏＩ
はＮｌａＩＩＩメチラーゼに非感受性であり、従ってＮ
ｌａＩＩＩクローンの選択に用いることはできないこと
が判明した。好ましいクローニングベクターはｐＵＣ１
９であるが、ＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩ
認識部位を有するものであれば他のクローニングベクタ
ーを用いることも可能である。そのようなベクターとし
ては、ｐＢＲ３２２とその誘導体、ｐＡＣＹＣ１７７ま
たは１８４等が挙げられる。得られた連結ＤＮＡをＥ．
ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴＣＣ ３１３４３）ま
たはＥ． ｃｏｌｉ ＥＲｌ３９８などの適当な細
菌宿主に導入し、宿主細胞を形質転換する。Ｎ． ｌ
ａｃｔａｍｉｃａのＤＮＡを制限しないか、またはメチ
ラーゼ遺伝子のクローニングを妨害しない他の細菌宿主
も用い得る。形質転換細胞を、抗生物質その他の選択圧
保有物質を含有する培地上へのプレーティングによって
選択する。クローニングベクターとして例えばｐＵＣ１
９を用いた場合は、形質転換細胞の選択はアンピシリン
を含有するＬｕｒｉａ寒天上へのプレーティングによっ
て行なう。
ーニング Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａのゲノムＤＮＡを公知方法
で精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで部分的に消
化する。ゲノムライブラリーの形成に適した制限エンド
ヌクレアーゼはＨｉｎＰＩである。消化したゲノムＤＮ
Ａを、いずれもＮｌａＩＩＩの認識配列を含む一つ以上
のＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩ認識部位を
有するクローニングベクターと連結させる。ＢｓｐＨＩ
認識部位及びＳｐｈＩ認識部位はＮｌａＩＩＩ認識配列
のサブセットであり、ＮｌａＩＩＩメチル化によってブ
ロックされる。理論上は、ＮｃｏＩもＮｌａＩＩＩのサ
ブセットであるので選択に用い得る。しかし、ＮｃｏＩ
はＮｌａＩＩＩメチラーゼに非感受性であり、従ってＮ
ｌａＩＩＩクローンの選択に用いることはできないこと
が判明した。好ましいクローニングベクターはｐＵＣ１
９であるが、ＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩ
認識部位を有するものであれば他のクローニングベクタ
ーを用いることも可能である。そのようなベクターとし
ては、ｐＢＲ３２２とその誘導体、ｐＡＣＹＣ１７７ま
たは１８４等が挙げられる。得られた連結ＤＮＡをＥ．
ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴＣＣ ３１３４３）ま
たはＥ． ｃｏｌｉ ＥＲｌ３９８などの適当な細
菌宿主に導入し、宿主細胞を形質転換する。Ｎ． ｌ
ａｃｔａｍｉｃａのＤＮＡを制限しないか、またはメチ
ラーゼ遺伝子のクローニングを妨害しない他の細菌宿主
も用い得る。形質転換細胞を、抗生物質その他の選択圧
保有物質を含有する培地上へのプレーティングによって
選択する。クローニングベクターとして例えばｐＵＣ１
９を用いた場合は、形質転換細胞の選択はアンピシリン
を含有するＬｕｒｉａ寒天上へのプレーティングによっ
て行なう。
【００３７】組み換え体プラスミドはアンピシリン耐性
で、かつＮ． １ａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡ由来
の挿入断片を担持するべきである。アンピシリン耐性コ
ロニーをプールして一次細胞ライブラリーを形成する。 プールしたコロニーにおいて、組み換え体プラスミドを
形質転換宿主のゲノムＤＮＡから、ＣｓＣＩ及びエチジ
ウムブロミドを用いる密度勾配遠心法のような公知方法
で精製分離する。精製した組み換え体プラスミドは一次
プラスミドライブラリーを構成する。
で、かつＮ． １ａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡ由来
の挿入断片を担持するべきである。アンピシリン耐性コ
ロニーをプールして一次細胞ライブラリーを形成する。 プールしたコロニーにおいて、組み換え体プラスミドを
形質転換宿主のゲノムＤＮＡから、ＣｓＣＩ及びエチジ
ウムブロミドを用いる密度勾配遠心法のような公知方法
で精製分離する。精製した組み換え体プラスミドは一次
プラスミドライブラリーを構成する。
【００３８】一次プラスミドライブラリーを、ＮｌａＩ
ＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩのような適当エンドヌ
クレアーゼで完全に消化する。ＮｌａＩＩＩ認識部位（
ＣＡＴＧ）はＢｓｐＨＩ認識部位（ＴＣＡＴＧＡ）及び
ＳｐｈＩ認識部位（ＧＣＡＴＧＣ）に含まれている。 本発明によれば、ＮｌａＩＩＩメチラーゼでのメチル化
はエンドヌクレアーゼＢｓｐＨＩ及びＳｐｈＩでの消化
からもＤＮＡを防護することが判明した。
ＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩのような適当エンドヌ
クレアーゼで完全に消化する。ＮｌａＩＩＩ認識部位（
ＣＡＴＧ）はＢｓｐＨＩ認識部位（ＴＣＡＴＧＡ）及び
ＳｐｈＩ認識部位（ＧＣＡＴＧＣ）に含まれている。 本発明によれば、ＮｌａＩＩＩメチラーゼでのメチル化
はエンドヌクレアーゼＢｓｐＨＩ及びＳｐｈＩでの消化
からもＤＮＡを防護することが判明した。
【００３９】即ち、エンドヌクレアーゼＮｌａＩＩＩ、
ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩでの消化はＮｌａＩＩＩメチ
ラーゼで修飾していないＤＮＡを特異的に破壊し、その
結果一次プラスミドライブラリーにおいてＮｌａＩＩＩ
メチラーゼ遺伝子を有するプラスミドの比率が高まる。
ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩでの消化はＮｌａＩＩＩメチ
ラーゼで修飾していないＤＮＡを特異的に破壊し、その
結果一次プラスミドライブラリーにおいてＮｌａＩＩＩ
メチラーゼ遺伝子を有するプラスミドの比率が高まる。
【００４０】ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子に関して濃
縮したプラスミドライブラリーを再びＥ． ｃｏｌｉ
ＲＲ１などの適当な細菌宿主に導入し、宿主細胞の
形質転換を行なう。形質転換細胞を、アンピシリン含有
のＬ−寒天のような選択培地上へのプレーティングによ
って回収する。生存コロニーのＤＮＡを、エンドヌクレ
アーゼＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩ及び／またはＳｐｈＩ
での消化によりＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子の存在に
関して解析する。この解析は、精製プラスミドＤＮＡと
全細胞（ゲノム及びプラスミド）ＤＮＡとの両方につい
て行なう。ＮｌａＩＩＩ修飾遺伝子を持つクローンは完
全に修飾されたＮｌａＩＩＩ認識部位を有し、プラスミ
ドＤＮＡもゲノムＤＮＡもエンドヌクレアーゼＮｌａＩ
ＩＩ、ＢｓｐＨＩ及びＳｐｈＩでの消化に実質的に耐性
である。
縮したプラスミドライブラリーを再びＥ． ｃｏｌｉ
ＲＲ１などの適当な細菌宿主に導入し、宿主細胞の
形質転換を行なう。形質転換細胞を、アンピシリン含有
のＬ−寒天のような選択培地上へのプレーティングによ
って回収する。生存コロニーのＤＮＡを、エンドヌクレ
アーゼＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩ及び／またはＳｐｈＩ
での消化によりＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子の存在に
関して解析する。この解析は、精製プラスミドＤＮＡと
全細胞（ゲノム及びプラスミド）ＤＮＡとの両方につい
て行なう。ＮｌａＩＩＩ修飾遺伝子を持つクローンは完
全に修飾されたＮｌａＩＩＩ認識部位を有し、プラスミ
ドＤＮＡもゲノムＤＮＡもエンドヌクレアーゼＮｌａＩ
ＩＩ、ＢｓｐＨＩ及びＳｐｈＩでの消化に実質的に耐性
である。
【００４１】Ｂ．Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤ
ＮＡの制限位置のマッピング 或る種のタイプＩＩＲ−Ｍ系に固有の遺伝学的複雑さを
免れているとして、メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレア
ーゼ遺伝子とが連結すれば、メチラーゼ遺伝子の選択に
よってエンドヌクレアーゼ遺伝子を持つクローンも得ら
れるはずである。しかし、先に指摘したように制限酵素
ＮｌａＩＩＩのＲ−Ｍ系は比較的複雑であり、完全型エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子をもたらすＮｌａＩＩＩメチラ
ーゼ＋クローンは無かった。ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺
伝子とＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝子とが連結
しているかどうか、及びＮｌａＩＩＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子がＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子との関連でど
こに位置するかを決定するには、Ｎ． ｌａｃｔａｍ
ｉｃａゲノムのメチラーゼ領域の制限マップを作成しな
ければならない。
ＮＡの制限位置のマッピング 或る種のタイプＩＩＲ−Ｍ系に固有の遺伝学的複雑さを
免れているとして、メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレア
ーゼ遺伝子とが連結すれば、メチラーゼ遺伝子の選択に
よってエンドヌクレアーゼ遺伝子を持つクローンも得ら
れるはずである。しかし、先に指摘したように制限酵素
ＮｌａＩＩＩのＲ−Ｍ系は比較的複雑であり、完全型エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子をもたらすＮｌａＩＩＩメチラ
ーゼ＋クローンは無かった。ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺
伝子とＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝子とが連結
しているかどうか、及びＮｌａＩＩＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子がＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子との関連でど
こに位置するかを決定するには、Ｎ． ｌａｃｔａｍ
ｉｃａゲノムのメチラーゼ領域の制限マップを作成しな
ければならない。
【００４２】サザン法での制限マップ作成にはＮｌａＩ
ＩＩメチラーゼクローンそのものを用いる。メチラーゼ
クローンはメチラーゼ遺伝子の位置決定にも用いること
ができ、なぜならメチラーゼ遺伝子はあらゆるメチラー
ゼボジティブクローンに共通の最短ＤＮＡ配列内に位置
するからである。そこで、メチラーゼクローンを配列決
定することによって、メチラーゼ遺伝子の正確な位置及
び向きを決定し、エンドヌクレアーゼであると推定され
る転写解読枠を同定し、かつ推定エンドヌクレアーゼ遺
伝子またはメチラーゼ遺伝子のＮ． ｌａｃｔａｍｉ
ｃａ ＤＮＡと厳密に相補的であるオリゴヌクレオチ
ドプライマーの合成を導く。Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃ
ａのＤＮＡをＲｓａＩ、ＭｂｏＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎＰ
Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ等のような様々な制限
エンドヌクレアーゼで消化し、かつプローブとしてメチ
ラーゼクローンまたは合成オリゴマーを用いるサザン法
を行なうことによって、Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａの
ＤＮＡのメチラーゼ遺伝子から上流（５′側）の制限マ
ップを作成する。
ＩＩメチラーゼクローンそのものを用いる。メチラーゼ
クローンはメチラーゼ遺伝子の位置決定にも用いること
ができ、なぜならメチラーゼ遺伝子はあらゆるメチラー
ゼボジティブクローンに共通の最短ＤＮＡ配列内に位置
するからである。そこで、メチラーゼクローンを配列決
定することによって、メチラーゼ遺伝子の正確な位置及
び向きを決定し、エンドヌクレアーゼであると推定され
る転写解読枠を同定し、かつ推定エンドヌクレアーゼ遺
伝子またはメチラーゼ遺伝子のＮ． ｌａｃｔａｍｉ
ｃａ ＤＮＡと厳密に相補的であるオリゴヌクレオチ
ドプライマーの合成を導く。Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃ
ａのＤＮＡをＲｓａＩ、ＭｂｏＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎＰ
Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ等のような様々な制限
エンドヌクレアーゼで消化し、かつプローブとしてメチ
ラーゼクローンまたは合成オリゴマーを用いるサザン法
を行なうことによって、Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａの
ＤＮＡのメチラーゼ遺伝子から上流（５′側）の制限マ
ップを作成する。
【００４３】Ｃ．ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝
子の単離及び同定 ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４（Ａ
ＴＣＣ ３０７３３）のようなベクターに移入すると
共にｐＵＣ１９のような、複製起点が前記ベクターと異
なるので同一細胞内で複製可能である第二のベクターに
も移入することにより、ＮｌａＩＩＩメチラーゼで予め
修飾した宿主細胞を調製する。ＮｌａＩＩＩメチラーゼ
遺伝子を取り込んだベクターｐＡＣＹＣ１８４をＥ．
ｃｏｌｉＲＲ１に導入して細菌細胞を形質転換し、上
記のようにメチラーゼクローンを選択する。このように
して調製したメチラーゼ保有細胞はＮｌａＩＩＩエンド
ヌクレアーゼ導入前に修飾されたそのＤＮＡ内にＮｌａ
ＩＩＩ認識配列を有し、このことは上記第二のベクター
に移入したエンドヌクレアーゼをこの細胞に導入してク
ローニングする際に細胞が生存する機会を増す。
子の単離及び同定 ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４（Ａ
ＴＣＣ ３０７３３）のようなベクターに移入すると
共にｐＵＣ１９のような、複製起点が前記ベクターと異
なるので同一細胞内で複製可能である第二のベクターに
も移入することにより、ＮｌａＩＩＩメチラーゼで予め
修飾した宿主細胞を調製する。ＮｌａＩＩＩメチラーゼ
遺伝子を取り込んだベクターｐＡＣＹＣ１８４をＥ．
ｃｏｌｉＲＲ１に導入して細菌細胞を形質転換し、上
記のようにメチラーゼクローンを選択する。このように
して調製したメチラーゼ保有細胞はＮｌａＩＩＩエンド
ヌクレアーゼ導入前に修飾されたそのＤＮＡ内にＮｌａ
ＩＩＩ認識配列を有し、このことは上記第二のベクター
に移入したエンドヌクレアーゼをこの細胞に導入してク
ローニングする際に細胞が生存する機会を増す。
【００４４】Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡ
を制限酵素、好ましくはＲｓａＩで消化して、完全なエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子かまたは少なくとも該遺伝子の
、メチラーゼクローンでは失われているアミノ末端部分
を含むＤＮＡ断片を調製する。ＲｓａＩ消化物は完全な
Ｒ−Ｍ遺伝子を含む２．０ｋｂ断片をもたらす。
を制限酵素、好ましくはＲｓａＩで消化して、完全なエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子かまたは少なくとも該遺伝子の
、メチラーゼクローンでは失われているアミノ末端部分
を含むＤＮＡ断片を調製する。ＲｓａＩ消化物は完全な
Ｒ−Ｍ遺伝子を含む２．０ｋｂ断片をもたらす。
【００４５】ＲｓａＩ断片を低濃度で連結反応させてＤ
ＮＡを環状にする。このＮｌａ ＤＮＡ断片と相補的
なオリゴヌクレオチドプライマーを環状ＤＮＡにハイブ
リダイズし、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードす
るＤＮＡの濃度を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のよ
うな遺伝子増幅技術を用いて高める。増幅によって、Ｎ
ｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼまたはその一部をコード
するＤＮＡの存在頻度が著しく高まり、即ち後述のよう
にそのようなクローンの同定が促進される。
ＮＡを環状にする。このＮｌａ ＤＮＡ断片と相補的
なオリゴヌクレオチドプライマーを環状ＤＮＡにハイブ
リダイズし、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードす
るＤＮＡの濃度を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のよ
うな遺伝子増幅技術を用いて高める。増幅によって、Ｎ
ｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼまたはその一部をコード
するＤＮＡの存在頻度が著しく高まり、即ち後述のよう
にそのようなクローンの同定が促進される。
【００４６】増幅したＤＮＡを制限酵素、好ましくはＳ
ａｕ３ＡＩで消化してエンドヌクレアーゼ遺伝子の、標
準的なクローニング法で得られるメチラーゼクローンで
は失われている部分を含む断片を調製する。この断片を
ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ ３７２５４）のようなベクタ
ーに移入してクローニングする。Ｓａｕ３ＡＩを用いる
のは、調製される約５００塩基対の断片がエンドヌクレ
アーゼ遺伝子のアミノ末端部分を含み、かつエンドヌク
レアーゼ遺伝子の先にクローニングした部分も１７８塩
基対だけ含むからである。また、Ｓａｕ３ＡＩはＰＣＲ
反応に用いるＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡを切
断せず、即ち（所望の）増幅ＤＮＡのみを切断して連結
反応に供し得る。
ａｕ３ＡＩで消化してエンドヌクレアーゼ遺伝子の、標
準的なクローニング法で得られるメチラーゼクローンで
は失われている部分を含む断片を調製する。この断片を
ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ ３７２５４）のようなベクタ
ーに移入してクローニングする。Ｓａｕ３ＡＩを用いる
のは、調製される約５００塩基対の断片がエンドヌクレ
アーゼ遺伝子のアミノ末端部分を含み、かつエンドヌク
レアーゼ遺伝子の先にクローニングした部分も１７８塩
基対だけ含むからである。また、Ｓａｕ３ＡＩはＰＣＲ
反応に用いるＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡを切
断せず、即ち（所望の）増幅ＤＮＡのみを切断して連結
反応に供し得る。
【００４７】クローンＤＮＡの制限地図を作成し、かつ
メチラーゼクローンを用いるサザン法で作成したＮ．
ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡの制限地図と比較す
ることによって、エンドヌクレアーゼの失われたアミノ
末端部分を含むクローンを同定する。
メチラーゼクローンを用いるサザン法で作成したＮ．
ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡの制限地図と比較す
ることによって、エンドヌクレアーゼの失われたアミノ
末端部分を含むクローンを同定する。
【００４８】完全なＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ遺
伝子は、 ａ）メチラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子のカルボキ
シル末端部分とを含むクローンを、エンドヌクレアーゼ
においてただ１箇所を切断するＣｌａＩのような酵素、
及びベクターにおいて切断を行なうＰｓｔＩのような酵
素で切断し、 ｂ）エンドヌクレアーゼ遺伝子のアミノ末端部分を含む
クローンを、カルボキシル末端クローンに用いたのと同
じ酵素即ちＣｌａＩと、ベクターにおけるエンドヌクレ
アーゼ遺伝子外での切断に用いたのと同じ酵素即ちＰｓ
ｔＩとで切断し、 ｃ）エンドヌクレアーゼ遺伝子の２部分を含む断片（そ
のうち一方の断片はクローニングベクターも含む）をゲ
ル精製し、 ｄ）ゲル精製した２断片を互いに連結させ、メチラーゼ
遺伝子を取り込んだベクターにおいて損傷の無いエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を構成し、 ｅ）損傷の無いエンドヌクレアーゼ遺伝子及びメチラー
ゼ遺伝子を担った連結ベクターを、プラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１８４のような適合するベクター系に移入したＮｌａ
ＩＩＩメチラーゼで予め修飾したＥ． ｃｏｌｉ
ＲＲ１などの細胞に導入し、 ｆ）制限地図作成で決定したエンドヌクレアーゼ遺伝子
の二つの断片を両方とも有すると判明したクローンの細
胞抽出物を調製することによって、ＮｌａＩＩＩエンド
ヌクレアーゼを発現させるクローンを同定することによ
って得られる。
伝子は、 ａ）メチラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子のカルボキ
シル末端部分とを含むクローンを、エンドヌクレアーゼ
においてただ１箇所を切断するＣｌａＩのような酵素、
及びベクターにおいて切断を行なうＰｓｔＩのような酵
素で切断し、 ｂ）エンドヌクレアーゼ遺伝子のアミノ末端部分を含む
クローンを、カルボキシル末端クローンに用いたのと同
じ酵素即ちＣｌａＩと、ベクターにおけるエンドヌクレ
アーゼ遺伝子外での切断に用いたのと同じ酵素即ちＰｓ
ｔＩとで切断し、 ｃ）エンドヌクレアーゼ遺伝子の２部分を含む断片（そ
のうち一方の断片はクローニングベクターも含む）をゲ
ル精製し、 ｄ）ゲル精製した２断片を互いに連結させ、メチラーゼ
遺伝子を取り込んだベクターにおいて損傷の無いエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を構成し、 ｅ）損傷の無いエンドヌクレアーゼ遺伝子及びメチラー
ゼ遺伝子を担った連結ベクターを、プラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１８４のような適合するベクター系に移入したＮｌａ
ＩＩＩメチラーゼで予め修飾したＥ． ｃｏｌｉ
ＲＲ１などの細胞に導入し、 ｆ）制限地図作成で決定したエンドヌクレアーゼ遺伝子
の二つの断片を両方とも有すると判明したクローンの細
胞抽出物を調製することによって、ＮｌａＩＩＩエンド
ヌクレアーゼを発現させるクローンを同定することによ
って得られる。
【００４９】Ｄ．組み換え体ＮｌａＩＩＩエンドヌクレ
アーゼ及びメチラーゼの製造 組み換え体ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメ
チラーゼはＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
及びＮｌａＩＩＩ修飾メチラーゼ遺伝子を持つクローン
から、発酵槽内のアンピシリン含有濃厚培地中での増殖
によって製造し得る。細胞を遠心法で集め、かつ超音波
処理で破壊して、ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ
活性を有する粗細胞抽出物を調製する。
アーゼ及びメチラーゼの製造 組み換え体ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメ
チラーゼはＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
及びＮｌａＩＩＩ修飾メチラーゼ遺伝子を持つクローン
から、発酵槽内のアンピシリン含有濃厚培地中での増殖
によって製造し得る。細胞を遠心法で集め、かつ超音波
処理で破壊して、ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ
活性を有する粗細胞抽出物を調製する。
【００５０】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び
／またはメチラーゼ活性を有する粗細胞抽出物を、アフ
ィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマト
グラフィーのような標準的なタンパク質精製技術で精製
する。このようにして得られる組み換え体エンドヌクレ
アーゼは、ＮｌａＩ、ＮｌａＩＩ及びＮｌａＩＶを含め
た不純物としての他の酵素を伴わず、実質的に非特異的
ヌクレアーゼを伴わない。
／またはメチラーゼ活性を有する粗細胞抽出物を、アフ
ィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマト
グラフィーのような標準的なタンパク質精製技術で精製
する。このようにして得られる組み換え体エンドヌクレ
アーゼは、ＮｌａＩ、ＮｌａＩＩ及びＮｌａＩＶを含め
た不純物としての他の酵素を伴わず、実質的に非特異的
ヌクレアーゼを伴わない。
【００５１】先に概説した諸ステップは本発明の実施に
おける好ましい形態を示すものであるが、上述の方法を
当分野の公知技術によって変形し得ることは、当業者に
は明らかである。
おける好ましい形態を示すものであるが、上述の方法を
当分野の公知技術によって変形し得ることは、当業者に
は明らかである。
【００５２】本発明を以下、実施例によって更に詳しく
説明する。ただし、本発明は以下の実施例によって限定
されるものではない。
説明する。ただし、本発明は以下の実施例によって限定
されるものではない。
【００５３】
【実施例】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローニング １．ＤＮＡ精製：凍結したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａ
ｃｔａｍｉｃａ（ＮＲＣＣ２１１８）細胞５ｇを２０ｍ
ｌの２５％スクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０に再懸濁させた。１０ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤ
ＴＡ ｐＨ８．０及び０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐ
Ｈ８．０中の１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌを添加
した。懸濁液を１６時間氷上に置き、その後２４ｍｌの
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０、６７ｍＭ ＥＤＴＡ及び５ｍｌの１０
％ ＳＤＳの添加によって溶解させた。溶液を、（予
め０．５Ｍ ＴｒｉｓｐＨ８．０と平衡させた）７０
ｍｌのフェノールと、６０ｍｌのクロロホルムで抽出し
た。乳濁液を１０Ｋｒｐｍで３０分間遠心処理して相を
分離した。粘稠な上相を、ＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を４回
変えて透析した。透析した溶液を３７℃で２時間、最終
濃度１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼで消化した。次に、
５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度が０．４Ｍとなるように添
加し、かつ０．５５容量のイソプロピルアルコールを添
加してＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡをガラス棒
に絡ませ、自然乾燥し、その後ＤＮＡ緩衝液に溶解させ
て濃度を約３５０μｇ／ｍｌとし、４℃で貯蔵した。
のクローニング １．ＤＮＡ精製：凍結したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａ
ｃｔａｍｉｃａ（ＮＲＣＣ２１１８）細胞５ｇを２０ｍ
ｌの２５％スクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０に再懸濁させた。１０ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤ
ＴＡ ｐＨ８．０及び０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐ
Ｈ８．０中の１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌを添加
した。懸濁液を１６時間氷上に置き、その後２４ｍｌの
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０、６７ｍＭ ＥＤＴＡ及び５ｍｌの１０
％ ＳＤＳの添加によって溶解させた。溶液を、（予
め０．５Ｍ ＴｒｉｓｐＨ８．０と平衡させた）７０
ｍｌのフェノールと、６０ｍｌのクロロホルムで抽出し
た。乳濁液を１０Ｋｒｐｍで３０分間遠心処理して相を
分離した。粘稠な上相を、ＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を４回
変えて透析した。透析した溶液を３７℃で２時間、最終
濃度１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼで消化した。次に、
５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度が０．４Ｍとなるように添
加し、かつ０．５５容量のイソプロピルアルコールを添
加してＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡをガラス棒
に絡ませ、自然乾燥し、その後ＤＮＡ緩衝液に溶解させ
て濃度を約３５０μｇ／ｍｌとし、４℃で貯蔵した。
【００５４】２．ＤＮＡの消化：５０μｇのＮ． ｌ
ａｃｔａｍｉｃａＤＮＡを５００μｌのＨｉｎＰＩ制限
エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ
ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）で稀釈した。４単位／μｇから０．０６単位／
μｇまでのＨｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼによる連
続稀釈を行ない、溶液を３６℃で１時間インキュベート
した。ＨｉｎＰＩ消化の程度を、各稀釈液から得た小ア
リコートのゲル電気泳動によって解析した。一連の所望
サイズ（２〜１５Ｋｂ）の断片が得られた稀釈液をプー
ルし、等量の平衡フェノールで抽出し、続いてクロロホ
ルムで２回抽出した。５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度が０
．４Ｍとなるように添加し、かつ０．５５容量のイソプ
ロピルアルコールを添加することによってＤＮＡを沈澱
させた。 ＤＮＡをＤＮＡ緩衝液に溶解させ、その濃度を約１００
μｇ／ｍｌとした。
ａｃｔａｍｉｃａＤＮＡを５００μｌのＨｉｎＰＩ制限
エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ
ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）で稀釈した。４単位／μｇから０．０６単位／
μｇまでのＨｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼによる連
続稀釈を行ない、溶液を３６℃で１時間インキュベート
した。ＨｉｎＰＩ消化の程度を、各稀釈液から得た小ア
リコートのゲル電気泳動によって解析した。一連の所望
サイズ（２〜１５Ｋｂ）の断片が得られた稀釈液をプー
ルし、等量の平衡フェノールで抽出し、続いてクロロホ
ルムで２回抽出した。５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度が０
．４Ｍとなるように添加し、かつ０．５５容量のイソプ
ロピルアルコールを添加することによってＤＮＡを沈澱
させた。 ＤＮＡをＤＮＡ緩衝液に溶解させ、その濃度を約１００
μｇ／ｍｌとした。
【００５５】３．連結反応及び形質転換：６μｇ（６０
μｌ）のＨｉｎＰＩ消化Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ
ＤＮＡを３μｇ（１５μｌ）の、ＡｃｃＩで切断し、
かつ脱リン酸化したｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ ３７２５
４）と混合した。２０μｌの１０Ｘ連結反応緩衝液（５
００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＡＴＰ
）及び１０５μｌの滅菌蒸留水を添加して容量を２００
μｌとした。７．５μｌ（３０００ＮＥＢ単位）のＴ４
ＤＮＡリガーゼを添加し、溶液を１７℃で１６時間
インキュベートした。溶液を２０μｌのクロロホルムで
の抽出によって滅菌し、次に１５秒間のマイクロ遠心分
離によって清澄化した。６２．５μｌの連結反応溶液を
５００μｌのＳＳＣ／ＣａＣｌ２（５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ Ｎａ３シトレート、６７ｍＭ ＣａＣ
ｌ２）と混合し、１．０ｍｌの氷冷コンピテントＥ．
ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴＣＣ３１３４３）細胞を添
加した。溶液を４２℃で４分間インキュベートし、その
後１０ｍｌのＬｕｒｉａブイヨン（Ｌ−ブイヨン）を添
加して、インキユベーションを３７℃で３時間継続した
。
μｌ）のＨｉｎＰＩ消化Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ
ＤＮＡを３μｇ（１５μｌ）の、ＡｃｃＩで切断し、
かつ脱リン酸化したｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ ３７２５
４）と混合した。２０μｌの１０Ｘ連結反応緩衝液（５
００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＡＴＰ
）及び１０５μｌの滅菌蒸留水を添加して容量を２００
μｌとした。７．５μｌ（３０００ＮＥＢ単位）のＴ４
ＤＮＡリガーゼを添加し、溶液を１７℃で１６時間
インキュベートした。溶液を２０μｌのクロロホルムで
の抽出によって滅菌し、次に１５秒間のマイクロ遠心分
離によって清澄化した。６２．５μｌの連結反応溶液を
５００μｌのＳＳＣ／ＣａＣｌ２（５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ Ｎａ３シトレート、６７ｍＭ ＣａＣ
ｌ２）と混合し、１．０ｍｌの氷冷コンピテントＥ．
ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴＣＣ３１３４３）細胞を添
加した。溶液を４２℃で４分間インキュベートし、その
後１０ｍｌのＬｕｒｉａブイヨン（Ｌ−ブイヨン）を添
加して、インキユベーションを３７℃で３時間継続した
。
【００５６】４．細胞ライブラリー：形質転換した培養
物を穏やかに遠心分離し、上澄みを捨て、細胞を１．０
ｍｌのＬ−ブイヨンに再懸濁させた。再懸濁細胞の２０
０μｌ部分を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有Ｌｕ
ｒｉａ寒天（Ｌ−寒天）プレート上に植え付けた。プレ
ートを３７℃で一晩インキュベートした。プレート表面
で増殖した形質転換細胞を、各プレートに２．５ｍｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２を注ぎ、コロニーを掻き集め、かつ懸濁液を１
本の管にプールすることによって集めた。
物を穏やかに遠心分離し、上澄みを捨て、細胞を１．０
ｍｌのＬ−ブイヨンに再懸濁させた。再懸濁細胞の２０
０μｌ部分を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有Ｌｕ
ｒｉａ寒天（Ｌ−寒天）プレート上に植え付けた。プレ
ートを３７℃で一晩インキュベートした。プレート表面
で増殖した形質転換細胞を、各プレートに２．５ｍｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２を注ぎ、コロニーを掻き集め、かつ懸濁液を１
本の管にプールすることによって集めた。
【００５７】５．プラスミドライブラリー：２．０ｍｌ
の細胞ライブラリーを５００ｍｌの１００μｇ／ｍｌア
ンピシリン含有Ｌ−ブイヨンに接種した。培養物を３７
℃で一晩振盪し、その後５Ｋｒｐｍで５分間遠心分離し
た。上澄みを捨て、細胞ペレットを１０ｍｌの２５％ス
クロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に室温
で再懸濁させた。５ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ
ｐＨ８．０、及び３ｍｌの、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０中の１０ｍｇ／ｍｌリゾチームを添加した
。溶液を１時間氷上に置き、その後１２ｍｌの１％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０、６７ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、懸濁液
に穏やかな渦流を生じさせて細胞を溶解させた。
の細胞ライブラリーを５００ｍｌの１００μｇ／ｍｌア
ンピシリン含有Ｌ−ブイヨンに接種した。培養物を３７
℃で一晩振盪し、その後５Ｋｒｐｍで５分間遠心分離し
た。上澄みを捨て、細胞ペレットを１０ｍｌの２５％ス
クロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に室温
で再懸濁させた。５ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ
ｐＨ８．０、及び３ｍｌの、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０中の１０ｍｇ／ｍｌリゾチームを添加した
。溶液を１時間氷上に置き、その後１２ｍｌの１％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０、６７ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、懸濁液
に穏やかな渦流を生じさせて細胞を溶解させた。
【００５８】溶解混合物を５０ｍｌ管に移し、４℃で４
５分間１７Ｋｒｐｍで遠心分離した。上澄みをピペット
で除去した。２０．０ｇの固体ＣｓＣｌをプラスチック
製の５０ｍｌ捩じ蓋付き管に計り入れ、２２．０ｇの上
澄みを前記管にピペットで注入して混合した。０．５ｍ
ｌの、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ｍ
ＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の１０ｍｇ／ｍｌエ
チジウムブロミドを添加した。溶液を２本の５／８ｉｎ
．×３ｉｎ．遠心分離管に移し、ＢｅｃｋｍａｎＴｉ７
０ローターにおいて１７℃で３０時間５０Ｋｒｐｍで回
転した。プラスミドを集めるために、管を開け、紫外線
を照射し、二つの蛍光帯のうちの低い方を注射器で集め
た。 各管から得られた低い方の蛍光帯を一つに合わせ、エチ
ジウムブロミドを、等量の水飽和及びＣｓＣｌ２飽和イ
ソプロピルアルコールでの３回の抽出によって除去した
。
５分間１７Ｋｒｐｍで遠心分離した。上澄みをピペット
で除去した。２０．０ｇの固体ＣｓＣｌをプラスチック
製の５０ｍｌ捩じ蓋付き管に計り入れ、２２．０ｇの上
澄みを前記管にピペットで注入して混合した。０．５ｍ
ｌの、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ｍ
ＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の１０ｍｇ／ｍｌエ
チジウムブロミドを添加した。溶液を２本の５／８ｉｎ
．×３ｉｎ．遠心分離管に移し、ＢｅｃｋｍａｎＴｉ７
０ローターにおいて１７℃で３０時間５０Ｋｒｐｍで回
転した。プラスミドを集めるために、管を開け、紫外線
を照射し、二つの蛍光帯のうちの低い方を注射器で集め
た。 各管から得られた低い方の蛍光帯を一つに合わせ、エチ
ジウムブロミドを、等量の水飽和及びＣｓＣｌ２飽和イ
ソプロピルアルコールでの３回の抽出によって除去した
。
【００５９】抽出溶液を４容量のＤＮＡ緩衝液で稀釈し
、その後２容量のイソプロパノールの添加によって核酸
を沈澱させた。溶液を−７０℃で３０分間放置してから
、４℃で１５分間１５ＫｒＰｍで遠心分離した。上澄み
を捨て、ペレットを３０分間自然乾燥した後１ｍｌの１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａに溶解させ、４℃で貯蔵した。プラスミドＤＮＡ濃度
は約２００μｇ／ｍｌであった。
、その後２容量のイソプロパノールの添加によって核酸
を沈澱させた。溶液を−７０℃で３０分間放置してから
、４℃で１５分間１５ＫｒＰｍで遠心分離した。上澄み
を捨て、ペレットを３０分間自然乾燥した後１ｍｌの１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａに溶解させ、４℃で貯蔵した。プラスミドＤＮＡ濃度
は約２００μｇ／ｍｌであった。
【００６０】６．プラスミドライブラリーの消化：４μ
ｇ（２０μｌ）のプラスミドライブラリーを１００μｌ
のＢｓｐＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（１０
ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２
、 １００ｍＭ ＫＣｌ）で稀釈した。１６単位（
４μｌ）のＢｓｐＨＩ制限エンドヌクレアーゼ及び８単
位（２μｌ）のＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼを添加
し、管を３７℃で２時間インキュベートした。反応物を
２０μｌのクロロホルムでの抽出によって滅菌し、その
後１５秒間のマイクロ遠心分離によって清澄化した。
ｇ（２０μｌ）のプラスミドライブラリーを１００μｌ
のＢｓｐＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（１０
ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２
、 １００ｍＭ ＫＣｌ）で稀釈した。１６単位（
４μｌ）のＢｓｐＨＩ制限エンドヌクレアーゼ及び８単
位（２μｌ）のＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼを添加
し、管を３７℃で２時間インキュベートした。反応物を
２０μｌのクロロホルムでの抽出によって滅菌し、その
後１５秒間のマイクロ遠心分離によって清澄化した。
【００６１】７．形質転換：２０μｌ（０．８μｇ）の
消化ライブラリーを１００μｌのＳＳＣ／ＣａＣｌ２（
上記第３項参照）、及び２００μｌの氷冷コンピテント
Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１と混合した。混合物を３分間４
２℃に暖めてから、１００μｇ／ｍｇのアンピシリンを
含有するＬ−寒天上にプレーティングした。プレートを
３７℃で一晩インキュベートした。ＢｓｐＨＩ及びＳｐ
ｈＩでの消化は形質転換細胞の数を、未消化プラスミド
で形質転換した場合の１／１０３に減少させた。Ｂｓｐ
ＨＩ及びＳｐｈＩ消化の後、約２００のコロニーが成長
した。そのうちの７０を１０ｍｌのアンピシリン含有Ｌ
−ブイヨンに接種してミニ培養物を得、これをアンピシ
リン含有Ｌ−寒天プレート上で画線培養してマスタース
トックとした。
消化ライブラリーを１００μｌのＳＳＣ／ＣａＣｌ２（
上記第３項参照）、及び２００μｌの氷冷コンピテント
Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１と混合した。混合物を３分間４
２℃に暖めてから、１００μｇ／ｍｇのアンピシリンを
含有するＬ−寒天上にプレーティングした。プレートを
３７℃で一晩インキュベートした。ＢｓｐＨＩ及びＳｐ
ｈＩでの消化は形質転換細胞の数を、未消化プラスミド
で形質転換した場合の１／１０３に減少させた。Ｂｓｐ
ＨＩ及びＳｐｈＩ消化の後、約２００のコロニーが成長
した。そのうちの７０を１０ｍｌのアンピシリン含有Ｌ
−ブイヨンに接種してミニ培養物を得、これをアンピシ
リン含有Ｌ−寒天プレート上で画線培養してマスタース
トックとした。
【００６２】８．生存個体の解析：第７項で得られた７
０の生存コロニーを増殖させて１０ｍｌの培養物とし、
培養細胞の持つプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｍａｎｄ
Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．， ７， ｐ．１５１３（１９７９）の方法か
ら採用した次のミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）精製
法によって得た。
０の生存コロニーを増殖させて１０ｍｌの培養物とし、
培養細胞の持つプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｍａｎｄ
Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．， ７， ｐ．１５１３（１９７９）の方法か
ら採用した次のミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）精製
法によって得た。
【００６３】ミニプレップ法：各培養物を５分間８Ｋｒ
ｐｍで遠心分離した。上澄みを捨て、細胞ペレットを、
１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する１．０ｍｌの２５
ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グ
ルコース ｐＨ８．０に再懸濁させた。室温で１０分
経過後、２．０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％
ＳＤＳを各管に添加し、管を穏やかに振盪して細胞を溶
解させ、その後氷上に放置した。溶液が澄んだら１．５
ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を各管に添加
し、管を振盪した。生成する沈澱物を、４℃で１０分間
行なう１５Ｋｒｐｍでの回転によって落ち着かせた。各
上澄みを遠心分離管内に注ぎ、管の中の３ｍｌの２−プ
ロパノールと混合した。室温で１０分経過後、管を１０
分間１５Ｋｒｐｍで回転して、沈澱した核酸をペレット
状にした。上澄みを捨て、ペレットを室温で３０分間自
然乾燥した。乾燥の済んだペレットを、１００μｇ／ｍ
ｌのＲＮアーゼを含有する５００μｌの１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０に溶解させ
、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化した
。溶液を１．５ｍｌエッペンドルフ管に移し、５０μｌ
の５Ｍ ＮａＣｌを添加し、次いで３５０μｌの２−
プロパノールを添加することにより再度ＤＮＡを沈澱さ
せた。室温で１０分経過後、ＤＮＡを、５分間の遠心分
離での回転によって落ち着かせ、上澄みを捨てた。ペレ
ットを室温で３０分間自然乾燥し、次に１５０μｌの１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
に再溶解させた。後に、ＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ、及び／
またはＮｌａＩＩＩ、及びＨｉｎＰＩでの消化によって
プラスミドミニプレップを解析した。
ｐｍで遠心分離した。上澄みを捨て、細胞ペレットを、
１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する１．０ｍｌの２５
ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グ
ルコース ｐＨ８．０に再懸濁させた。室温で１０分
経過後、２．０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％
ＳＤＳを各管に添加し、管を穏やかに振盪して細胞を溶
解させ、その後氷上に放置した。溶液が澄んだら１．５
ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を各管に添加
し、管を振盪した。生成する沈澱物を、４℃で１０分間
行なう１５Ｋｒｐｍでの回転によって落ち着かせた。各
上澄みを遠心分離管内に注ぎ、管の中の３ｍｌの２−プ
ロパノールと混合した。室温で１０分経過後、管を１０
分間１５Ｋｒｐｍで回転して、沈澱した核酸をペレット
状にした。上澄みを捨て、ペレットを室温で３０分間自
然乾燥した。乾燥の済んだペレットを、１００μｇ／ｍ
ｌのＲＮアーゼを含有する５００μｌの１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０に溶解させ
、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化した
。溶液を１．５ｍｌエッペンドルフ管に移し、５０μｌ
の５Ｍ ＮａＣｌを添加し、次いで３５０μｌの２−
プロパノールを添加することにより再度ＤＮＡを沈澱さ
せた。室温で１０分経過後、ＤＮＡを、５分間の遠心分
離での回転によって落ち着かせ、上澄みを捨てた。ペレ
ットを室温で３０分間自然乾燥し、次に１５０μｌの１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
に再溶解させた。後に、ＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ、及び／
またはＮｌａＩＩＩ、及びＨｉｎＰＩでの消化によって
プラスミドミニプレップを解析した。
【００６４】９．ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子クロー
ン：解析した７０のプラスミドのうち６１のプラスミド
は、ＢｓｐＨＩ消化に感受性であり、かつＮ． ｌａ
ｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡの様々なＨｉｎＰＩ断片を持
つことが判明した。これらのプラスミドは偽であり、廃
棄した。残る９のプラスミドは、ＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ
及びＮｌａＩＩＩ消化に耐性であり、０．５９Ｋｂ及び
０．５４ＫｂのＨｉｎＰＩ断片を共に有することが判明
した。６種の異なるプラスミド構築物が得られ、これら
はプラスミドをＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ及びＮｌａＩＩＩ
消化から完全に防護した。同じメチラーゼ選択技術によ
って、ＭｂｏＩ、ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩエライブラリ
ーからもメチラーゼクローンを得た。これらのクローン
はいずれも、検出可能なＮｌａＩＩＩエンドヌクレアー
ゼ活性は有しなかった。
ン：解析した７０のプラスミドのうち６１のプラスミド
は、ＢｓｐＨＩ消化に感受性であり、かつＮ． ｌａ
ｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡの様々なＨｉｎＰＩ断片を持
つことが判明した。これらのプラスミドは偽であり、廃
棄した。残る９のプラスミドは、ＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ
及びＮｌａＩＩＩ消化に耐性であり、０．５９Ｋｂ及び
０．５４ＫｂのＨｉｎＰＩ断片を共に有することが判明
した。６種の異なるプラスミド構築物が得られ、これら
はプラスミドをＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ及びＮｌａＩＩＩ
消化から完全に防護した。同じメチラーゼ選択技術によ
って、ＭｂｏＩ、ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩエライブラリ
ーからもメチラーゼクローンを得た。これらのクローン
はいずれも、検出可能なＮｌａＩＩＩエンドヌクレアー
ゼ活性は有しなかった。
【００６５】１０．ＮｌａＩＩＩメチラーゼクローンの
配列決定：ＮｌａＩＩＩメチラーゼクローンを、Ｓａｎ
ｇｅｒのジデオキシ鎖末端決定法を用いて配列決定した
。ＤＮＡのクローン片の端部を、クローニング部位近傍
でｐＵＣ１９ベクターにハイブリダイズしてクローンＤ
ＮＡに読み込まれるユニバーサルプライマーＮＥＢ
１２０１及びＮＥＢ １２１１を用いて配列決定した
。 典型的な反応において、２μｇ（２μｌ）のフェノール
／クロロホルム抽出ミニプレッププラスミドＤＮＡをｄ
Ｈ２Ｏで稀釈して総量を２０μｌとした。２μｌの２Ｍ
ＮａＯＨ、２ｍＭＥＤＴＡを添加し、溶液を室温で
５分間インキュベートした。７μｌのｄＨ２Ｏ、６μｌ
の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び７５μｌのエ
タノールを逐次迅速に添加した。ＤＮＡを２−プロパノ
ール／ドライアイス浴中で１５分間沈澱させ、エッペン
ドルフ遠心分離機での１０分間の遠心分離によりペレッ
ト状にし、２００μｌの７０％エタノール／３０％
ｄＨ２Ｏで洗浄し、遠心分離法によって再回収し、乾燥
した。得られたＤＮＡを、９μｌのｄＨ２Ｏ，１．５μ
ｌの１０Ｘ配列決定緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、７５
ｍＭ ＤＴＴ）、及び１μｌ（１ｐｍｏｌ）の１ｕＭ
プライマー溶液に再懸濁させた。反応物を３７℃で３０
分間インキュベートした。２μｌの［α−３５Ｓ］ｄＡ
ＴＰ（５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）及び
１μｌ（５単位）のクレノウフラグメントを添加し、得
られた混合溶液を、適当なＮＥＢ ４０６ジデオキシ
配列決定試薬３．０μｌの入ったＡ、Ｃ、Ｇ及びＴ反応
管それぞれに３．２μｌずつ入れた。反応物を３７℃で
１５分間インキュベートし、その後１μｌのｄＮＴＰ追
跡溶液（ＮＥＢ ４０６）を添加してインキュベーシ
ョンを更に１５分間継続した。６μｌの停止溶液を添加
し、反応物を８％ビス−アクリルアミド配列決定ゲル上
で電気泳動してからオートラジオグラフィーに掛けた。
配列決定：ＮｌａＩＩＩメチラーゼクローンを、Ｓａｎ
ｇｅｒのジデオキシ鎖末端決定法を用いて配列決定した
。ＤＮＡのクローン片の端部を、クローニング部位近傍
でｐＵＣ１９ベクターにハイブリダイズしてクローンＤ
ＮＡに読み込まれるユニバーサルプライマーＮＥＢ
１２０１及びＮＥＢ １２１１を用いて配列決定した
。 典型的な反応において、２μｇ（２μｌ）のフェノール
／クロロホルム抽出ミニプレッププラスミドＤＮＡをｄ
Ｈ２Ｏで稀釈して総量を２０μｌとした。２μｌの２Ｍ
ＮａＯＨ、２ｍＭＥＤＴＡを添加し、溶液を室温で
５分間インキュベートした。７μｌのｄＨ２Ｏ、６μｌ
の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び７５μｌのエ
タノールを逐次迅速に添加した。ＤＮＡを２−プロパノ
ール／ドライアイス浴中で１５分間沈澱させ、エッペン
ドルフ遠心分離機での１０分間の遠心分離によりペレッ
ト状にし、２００μｌの７０％エタノール／３０％
ｄＨ２Ｏで洗浄し、遠心分離法によって再回収し、乾燥
した。得られたＤＮＡを、９μｌのｄＨ２Ｏ，１．５μ
ｌの１０Ｘ配列決定緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、７５
ｍＭ ＤＴＴ）、及び１μｌ（１ｐｍｏｌ）の１ｕＭ
プライマー溶液に再懸濁させた。反応物を３７℃で３０
分間インキュベートした。２μｌの［α−３５Ｓ］ｄＡ
ＴＰ（５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）及び
１μｌ（５単位）のクレノウフラグメントを添加し、得
られた混合溶液を、適当なＮＥＢ ４０６ジデオキシ
配列決定試薬３．０μｌの入ったＡ、Ｃ、Ｇ及びＴ反応
管それぞれに３．２μｌずつ入れた。反応物を３７℃で
１５分間インキュベートし、その後１μｌのｄＮＴＰ追
跡溶液（ＮＥＢ ４０６）を添加してインキュベーシ
ョンを更に１５分間継続した。６μｌの停止溶液を添加
し、反応物を８％ビス−アクリルアミド配列決定ゲル上
で電気泳動してからオートラジオグラフィーに掛けた。
【００６６】メチラーゼのサブクローンを作り、配列が
決定できるようにクローンの内側部分をｐＵＣ１９ユニ
バーサルプライミング部位付近に配置した。上記サブク
ローンは次のように形成した。２μｇの、第１項〜第９
項に述べたようにして得られたＨｉｎＰＩライブラリー
メチラーゼクローンｐＲＭ１２５Ｍ １２２−６４を
５０μｌ反応容器内で１時間、２０単位のＥｃｏＲＩ及
び２０単位のＰｓｔＩで消化し、次に４０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ８．０、２０ｍＭ酢酸ナトリウム
、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５μｇ／ｍｌエチジ
ウムブロミド中で１％ＦＭＣ ＳｅａＰｌａｑｕｅ（
ｒｔ） ＬＭＰアガロースゲル上で電気泳動した。ク
ローンＤＮＡの１．７ｋｂ断片をゲルから切り出した。 ５μｌのゲル断片を１μｌの１０Ｘ反応緩衝液、４μｌ
のｄＨ２Ｏ， 及び１μｌ（５０）のＨｉｎＰＩと混
合し、３７℃で３０分間消化した。反応物を１５分間加
熱して６５℃とし、次に１０μｌのクロロホルムで抽出
した。１．３μｌの１０Ｘ連結反応緩衝液を、１μｌの
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及び１μｌ（２００ｎｇ）の、
ＡｃｃＩで切断し、かつ脱リン酸化したｐＵＣ１９
ＤＮＡと共に添加し、溶液を４℃で１６時間インキュベ
ートした。連結反応物を６５℃で５分間融解してから４
２℃に冷却した。 ５μｌの溶融連結反応物を１００μｌの氷冷コンピテン
トＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１細胞と混合し、４分間４
２℃に加熱し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有
するＬＢ寒天上に植え付けた。このようにして得られた
サブクローンを、ユニバーサルプライマーＮＥＢ １
２０１及びＮＥＢ １２１１を用いて上述のように配
列決定した。上述のようなＮ． ｌａｃｔａｍｉｃａ
ＤＮＡと相補的であるプライマーを合成することに
よって更に配列決定を行ない、配列を完成した。
決定できるようにクローンの内側部分をｐＵＣ１９ユニ
バーサルプライミング部位付近に配置した。上記サブク
ローンは次のように形成した。２μｇの、第１項〜第９
項に述べたようにして得られたＨｉｎＰＩライブラリー
メチラーゼクローンｐＲＭ１２５Ｍ １２２−６４を
５０μｌ反応容器内で１時間、２０単位のＥｃｏＲＩ及
び２０単位のＰｓｔＩで消化し、次に４０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ８．０、２０ｍＭ酢酸ナトリウム
、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５μｇ／ｍｌエチジ
ウムブロミド中で１％ＦＭＣ ＳｅａＰｌａｑｕｅ（
ｒｔ） ＬＭＰアガロースゲル上で電気泳動した。ク
ローンＤＮＡの１．７ｋｂ断片をゲルから切り出した。 ５μｌのゲル断片を１μｌの１０Ｘ反応緩衝液、４μｌ
のｄＨ２Ｏ， 及び１μｌ（５０）のＨｉｎＰＩと混
合し、３７℃で３０分間消化した。反応物を１５分間加
熱して６５℃とし、次に１０μｌのクロロホルムで抽出
した。１．３μｌの１０Ｘ連結反応緩衝液を、１μｌの
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及び１μｌ（２００ｎｇ）の、
ＡｃｃＩで切断し、かつ脱リン酸化したｐＵＣ１９
ＤＮＡと共に添加し、溶液を４℃で１６時間インキュベ
ートした。連結反応物を６５℃で５分間融解してから４
２℃に冷却した。 ５μｌの溶融連結反応物を１００μｌの氷冷コンピテン
トＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１細胞と混合し、４分間４
２℃に加熱し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有
するＬＢ寒天上に植え付けた。このようにして得られた
サブクローンを、ユニバーサルプライマーＮＥＢ １
２０１及びＮＥＢ １２１１を用いて上述のように配
列決定した。上述のようなＮ． ｌａｃｔａｍｉｃａ
ＤＮＡと相補的であるプライマーを合成することに
よって更に配列決定を行ない、配列を完成した。
【００６７】１１．サザン法によるＮ． ｌａｃｔａ
ｍｉｃａゲノムＤＮＡの制限地図の作成：Ｎ． ｌａ
ｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡを濃度５０ｍｇ／ｍｌのエ
ンドヌクレアーゼ反応緩衝液で稀釈し、ＢａｎＩＩ、Ｂ
ｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈｉ
ｎｃＩＩ、ＨｉｎＰＩ、ＭｂｏＩ、ＲｓａＩ及びＰｓｔ
Ｉを含めた様々な制限エンドヌクレアーゼで切断した。 ２μｇの消化ＤＮＡを４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８
．０、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤ
ＴＡ、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロミド中で１％Ｌ
Ｅアガロースゲル上で電気泳動した。ゲルを定規と共に
紫外線照射下に写真撮影して移動距離を測定し、その後
ゲルを２５０ｍｌの０．２５Ｍ ＨＣｌに１５分間、
穏やかに撹拌しつつ浸漬した。ＨＣｌ液を除去後、ゲル
を０．２５Ｍ ＨＣｌの、やはり２５０ｍｌの第二の
アリコートに更に１５分間浸漬した。ゲルを濯ぎ、２５
０ｍｌの０．５ＭＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ中に
１５分間、穏やかに撹拌しつつ置き、緩衝液を取り替え
た後第二の１５分間浸漬を行なった。次に、ゲルを濯い
で、２５０ｍｌの１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、０．０２Ｍ
ＮａＯＨ中に３０分間、穏やかに撹拌しつつ置き、続
いてＮＨ４ＯＡｃ／ＮａＯＨ緩衝液を取り替えてから第
二の３０分間浸漬を行なった。その後、ＤＮＡを、（Ｎ
Ｈ４ＯＡｃ／ＮａＯＨで予め湿らせた）Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂａ８５ニトロセ
ルロースのシート上に毛管作用によって一晩移した。ニ
トロセルロースブロットを８０℃の真空オーブン内で２
時間熱した。ブロットを、ＭｂｏＩライブラリーｐＲＭ
１２５Ｍ１−１５から得た極小クローン１μｇを４μｌ
の０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、４μｌの０．１ｍＭ ｄ
ＧＴＰ、４μｌの０．１ｍＭ ｄＴＴＰ、１０μｌ（
８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）の［α−３
２Ｐ］ｄＣＴＰ、４μｌの０．１μｇ／ｍｌ ＤＮア
ーゼＩ、及び１μｌ（１０ＮＥＢ単位）のＥ． ｃｏ
ｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩと、総量１００μｌの５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．８、５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び
５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン中で結合させて製造
した、ニックトランスレーションしたメチラーゼクロー
ンで試験した。溶液を１５℃で３時間インキュベートし
、次に５μｌの２５０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰを添加して更に１５分間インキュベー
ションを継続した。ＤＮアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ
を、溶液を９８℃に５分間加熱することにより不活化し
た。ニトロセルロースブロットを、１５ｍｌのハイブリ
ダイゼーション溶液（１０Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶
液、６Ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、２％デキストラ
ン硫酸）が入った密閉バッグに２時間入れた。その後、
５０μｌのニックトランスレーションしたプラスミドを
添加し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行
なった。ハイブリダイゼーション溶液を除去し、フィル
ターを５分間にわたって３回、毎回６５℃の２Ｘ Ｓ
ＳＣを２５０ｍｌ用いて洗浄し、かつ続く２０分間にわ
たって更に３回、毎回６５℃の２Ｘ ＳＳＣ、０．５
％ ＳＤＳを２５０ｍｌ用いて洗浄した。洗浄したフ
ィルターをｄＨ２Ｏで濯ぎ、様々な制限断片の大きさを
示すオートラジオグラムを作成した。
ｍｉｃａゲノムＤＮＡの制限地図の作成：Ｎ． ｌａ
ｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡを濃度５０ｍｇ／ｍｌのエ
ンドヌクレアーゼ反応緩衝液で稀釈し、ＢａｎＩＩ、Ｂ
ｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈｉ
ｎｃＩＩ、ＨｉｎＰＩ、ＭｂｏＩ、ＲｓａＩ及びＰｓｔ
Ｉを含めた様々な制限エンドヌクレアーゼで切断した。 ２μｇの消化ＤＮＡを４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８
．０、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤ
ＴＡ、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロミド中で１％Ｌ
Ｅアガロースゲル上で電気泳動した。ゲルを定規と共に
紫外線照射下に写真撮影して移動距離を測定し、その後
ゲルを２５０ｍｌの０．２５Ｍ ＨＣｌに１５分間、
穏やかに撹拌しつつ浸漬した。ＨＣｌ液を除去後、ゲル
を０．２５Ｍ ＨＣｌの、やはり２５０ｍｌの第二の
アリコートに更に１５分間浸漬した。ゲルを濯ぎ、２５
０ｍｌの０．５ＭＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ中に
１５分間、穏やかに撹拌しつつ置き、緩衝液を取り替え
た後第二の１５分間浸漬を行なった。次に、ゲルを濯い
で、２５０ｍｌの１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、０．０２Ｍ
ＮａＯＨ中に３０分間、穏やかに撹拌しつつ置き、続
いてＮＨ４ＯＡｃ／ＮａＯＨ緩衝液を取り替えてから第
二の３０分間浸漬を行なった。その後、ＤＮＡを、（Ｎ
Ｈ４ＯＡｃ／ＮａＯＨで予め湿らせた）Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂａ８５ニトロセ
ルロースのシート上に毛管作用によって一晩移した。ニ
トロセルロースブロットを８０℃の真空オーブン内で２
時間熱した。ブロットを、ＭｂｏＩライブラリーｐＲＭ
１２５Ｍ１−１５から得た極小クローン１μｇを４μｌ
の０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、４μｌの０．１ｍＭ ｄ
ＧＴＰ、４μｌの０．１ｍＭ ｄＴＴＰ、１０μｌ（
８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）の［α−３
２Ｐ］ｄＣＴＰ、４μｌの０．１μｇ／ｍｌ ＤＮア
ーゼＩ、及び１μｌ（１０ＮＥＢ単位）のＥ． ｃｏ
ｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩと、総量１００μｌの５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．８、５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び
５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン中で結合させて製造
した、ニックトランスレーションしたメチラーゼクロー
ンで試験した。溶液を１５℃で３時間インキュベートし
、次に５μｌの２５０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰを添加して更に１５分間インキュベー
ションを継続した。ＤＮアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ
を、溶液を９８℃に５分間加熱することにより不活化し
た。ニトロセルロースブロットを、１５ｍｌのハイブリ
ダイゼーション溶液（１０Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶
液、６Ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、２％デキストラ
ン硫酸）が入った密閉バッグに２時間入れた。その後、
５０μｌのニックトランスレーションしたプラスミドを
添加し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行
なった。ハイブリダイゼーション溶液を除去し、フィル
ターを５分間にわたって３回、毎回６５℃の２Ｘ Ｓ
ＳＣを２５０ｍｌ用いて洗浄し、かつ続く２０分間にわ
たって更に３回、毎回６５℃の２Ｘ ＳＳＣ、０．５
％ ＳＤＳを２５０ｍｌ用いて洗浄した。洗浄したフ
ィルターをｄＨ２Ｏで濯ぎ、様々な制限断片の大きさを
示すオートラジオグラムを作成した。
【００６８】１２．ＮｌａＩＩＩメチラーゼのｐＡＣＹ
Ｃ１８４への移入：４μｇのＮｌａＩＩＩメチラーゼク
ローンｐＲＭ１２５Ｍ １２２−６４を１００μｌ量
のＰｖｕＩＩ（１０単位）で消化した。１０μｇのｐＡ
ＣＹＣ１８４を総反応量２００μｌのＰｖｕＩＩ（４０
単位）で消化した。切断したｐＡＣＹＣ１８４ ＤＮ
Ａを平衡フェノールで１回抽出した後クロロホルムで２
回抽出し、ＮａＣｌ濃度を１００ｍＭとし、２容量のエ
タノールを添加し、かつ溶液を−７０℃で３０分間イン
キュベートして、ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡ
を遠心分離によって集め、３００μｌの７０％エタノー
ル／３０％ ｄＨ２Ｏで洗浄し、遠心分離によって再
度集めて乾燥し、４３μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡに再懸
濁させた。
Ｃ１８４への移入：４μｇのＮｌａＩＩＩメチラーゼク
ローンｐＲＭ１２５Ｍ １２２−６４を１００μｌ量
のＰｖｕＩＩ（１０単位）で消化した。１０μｇのｐＡ
ＣＹＣ１８４を総反応量２００μｌのＰｖｕＩＩ（４０
単位）で消化した。切断したｐＡＣＹＣ１８４ ＤＮ
Ａを平衡フェノールで１回抽出した後クロロホルムで２
回抽出し、ＮａＣｌ濃度を１００ｍＭとし、２容量のエ
タノールを添加し、かつ溶液を−７０℃で３０分間イン
キュベートして、ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡ
を遠心分離によって集め、３００μｌの７０％エタノー
ル／３０％ ｄＨ２Ｏで洗浄し、遠心分離によって再
度集めて乾燥し、４３μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡに再懸
濁させた。
【００６９】ＰｖｕＩＩで消化したｐＡＣＹＣ１８４を
コウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して、このベ
クターが自身と連結するのを防止した。５μｌの１０Ｘ
ＣＩＰ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ９．０、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭ Ｚ
ｎＣｌ２）を、４３μｌのｐＡＣＹＣ１８４に対して添
加した。１μｌ（１単位）のＣＩＰを添加し、反応物を
、３７℃で１５分間インキュベートした後５６℃で１５
分間インキュベートした。第二の１μｌ（１単位のアリ
コート）のＣＩＰを添加し、再び３７℃で１５分間イン
キュベートした後、５６℃で１５分間インキュベートし
た。第２の１μｌ（１単位のアリコート）のＣＩＰを添
加し、再び３７℃で１５分間インキュベートした後、５
６℃で１５分間インキュベートした。反応物をフェノー
ル及びクロロホルムで抽出して、上述のようにＤＮＡを
沈澱させた。乾燥したＤＮＡを約２００μｇ／ｍｌの濃
度に再懸濁させた。１μｇのＰｖｕＩＩ消化ｐＲＭ１２
５Ｍ １２２−６４を０．５μｇの脱リン酸化したＰ
ｖｕＩＩ切断ｐＡＣＹＣ１８４と、３μｌ（３００ＮＥ
Ｂ単位）のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加した２５μｌ
量の連結反応緩衝液中で結合させ、その後１７℃で１６
時間インキュベートした。５μｌの連結ＤＮＡを２００
μｌの氷冷コンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１細
胞と混合し、続いて４２℃に４分間加熱した。１０ｍｌ
のＬｕｒｉａブイヨンを添加し、細胞を３７℃で３時間
インキュベートした。穏やかな遠心分離で細胞を集め、
テトラサイクリン５０μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天上に植
え付けた。得られたコロニーをＮｌａＩＩＩメチラーゼ
活性の存在に関してスクリーニングした。ｐＡＣＹＣ１
８４−ＮｌａＩＩＩメチラーゼ形質転換細胞から、コン
ピテント細胞を製造した。
コウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して、このベ
クターが自身と連結するのを防止した。５μｌの１０Ｘ
ＣＩＰ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ９．０、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭ Ｚ
ｎＣｌ２）を、４３μｌのｐＡＣＹＣ１８４に対して添
加した。１μｌ（１単位）のＣＩＰを添加し、反応物を
、３７℃で１５分間インキュベートした後５６℃で１５
分間インキュベートした。第二の１μｌ（１単位のアリ
コート）のＣＩＰを添加し、再び３７℃で１５分間イン
キュベートした後、５６℃で１５分間インキュベートし
た。第２の１μｌ（１単位のアリコート）のＣＩＰを添
加し、再び３７℃で１５分間インキュベートした後、５
６℃で１５分間インキュベートした。反応物をフェノー
ル及びクロロホルムで抽出して、上述のようにＤＮＡを
沈澱させた。乾燥したＤＮＡを約２００μｇ／ｍｌの濃
度に再懸濁させた。１μｇのＰｖｕＩＩ消化ｐＲＭ１２
５Ｍ １２２−６４を０．５μｇの脱リン酸化したＰ
ｖｕＩＩ切断ｐＡＣＹＣ１８４と、３μｌ（３００ＮＥ
Ｂ単位）のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加した２５μｌ
量の連結反応緩衝液中で結合させ、その後１７℃で１６
時間インキュベートした。５μｌの連結ＤＮＡを２００
μｌの氷冷コンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１細
胞と混合し、続いて４２℃に４分間加熱した。１０ｍｌ
のＬｕｒｉａブイヨンを添加し、細胞を３７℃で３時間
インキュベートした。穏やかな遠心分離で細胞を集め、
テトラサイクリン５０μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天上に植
え付けた。得られたコロニーをＮｌａＩＩＩメチラーゼ
活性の存在に関してスクリーニングした。ｐＡＣＹＣ１
８４−ＮｌａＩＩＩメチラーゼ形質転換細胞から、コン
ピテント細胞を製造した。
【００７０】１３．エンドヌクレアーゼ遺伝子の欠失部
分の増幅：Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡのサザ
ンブロットから発生したマッピング情報を用いて、逆Ｐ
ＣＲ増幅用のＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡの開裂
にＲｓａ Ｉ及びＢｓｓＨ ＩＩを選択した。２０
単位のＢｓｓＨ ＩＩ又は４０単位のＲｓａ Ｉと
の１００マイクロリットル反応物中で１０マイクログラ
ムのＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡを開裂した。Ｒ
ｓａ Ｉの場合は２０００塩基対のサイズ範囲のフラ
グメント、ＢｓｓＨ ＩＩの場合は４５００塩基対の
サイズ範囲のフラグメントを前述のステップ１０と同様
にゲル精製した。 ゲル精製したＤＮＡフラグメントを含むアガロースを６
５°Ｃで溶融し、４２°Ｃに冷却し、１Ｘ Ｔ４
ＤＮＡリガーゼバッファで１ｍｌに希釈して約１マイク
ロリットル／ｍｌの濃度にした。これは、連結プロセス
におけるＤＮＡフラグメントのサーキュラリゼーション
を促進するのに十分な低い濃度である。２０マイクロリ
ットル（１０，０００ＮＥＢ単位）のＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを加え、この反応物を１７°Ｃで１６時間インキ
ュベートした。この連結反応物を等量の平衡化フェノー
ルで抽出し、次いでクロロホルムで２回抽出し、１００
ｍＭ ＮａＣｌに加え、２つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管
に分配し、２倍容のエタノールで−７０°Ｃで１６時間
沈澱させた。沈澱したＤＮＡを遠心分離によって集め、
３００マイクロリットルの７０％エタノール／３０％ｄ
Ｈ２Ｏで洗浄し、遠心分離し且つ乾燥した。
分の増幅：Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡのサザ
ンブロットから発生したマッピング情報を用いて、逆Ｐ
ＣＲ増幅用のＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡの開裂
にＲｓａ Ｉ及びＢｓｓＨ ＩＩを選択した。２０
単位のＢｓｓＨ ＩＩ又は４０単位のＲｓａ Ｉと
の１００マイクロリットル反応物中で１０マイクログラ
ムのＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡを開裂した。Ｒ
ｓａ Ｉの場合は２０００塩基対のサイズ範囲のフラ
グメント、ＢｓｓＨ ＩＩの場合は４５００塩基対の
サイズ範囲のフラグメントを前述のステップ１０と同様
にゲル精製した。 ゲル精製したＤＮＡフラグメントを含むアガロースを６
５°Ｃで溶融し、４２°Ｃに冷却し、１Ｘ Ｔ４
ＤＮＡリガーゼバッファで１ｍｌに希釈して約１マイク
ロリットル／ｍｌの濃度にした。これは、連結プロセス
におけるＤＮＡフラグメントのサーキュラリゼーション
を促進するのに十分な低い濃度である。２０マイクロリ
ットル（１０，０００ＮＥＢ単位）のＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを加え、この反応物を１７°Ｃで１６時間インキ
ュベートした。この連結反応物を等量の平衡化フェノー
ルで抽出し、次いでクロロホルムで２回抽出し、１００
ｍＭ ＮａＣｌに加え、２つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管
に分配し、２倍容のエタノールで−７０°Ｃで１６時間
沈澱させた。沈澱したＤＮＡを遠心分離によって集め、
３００マイクロリットルの７０％エタノール／３０％ｄ
Ｈ２Ｏで洗浄し、遠心分離し且つ乾燥した。
【００７１】連結したＤＮＡフラグメントについてＰＣ
Ｒ増幅を下記のように実施した。連結し精製し乾燥した
Ｒｓａ Ｉフラグメント（約５００ｎｇ ＤＮＡ）
の入っている管に、１００マイクロリットルの１４０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．８と、４０マイクロリ
ットルの１ｍＭ ｄＮＴＰ溶液と、２マイクロリット
ルの２００ｍＭ ＭｇＣｌ２と、２マイクロリットル
の１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００と、１５マイクロリッ
トル（５００ｎｍｏｌ最終濃度）プライマー Ｎｌａ
ＩＩＩ ＃４（５’ＧＡＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＡ
ＡＣＡＴＣＣＧ ３’）と２３マイクロリットルのｄ
Ｈ２Ｏとを加えた。 この反応物を下記のように混合し且つ分割した。前記混
合物２０マイクロリットルに２マイクロリットルのプラ
イマーＮｌａ ＩＩＩ ＃９（５’ＧＣＡＡＴＴＣ
ＴＡＴＡＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＧＣＣＴＴＡＡＴＧＧ３
’）（５００ｎｍｏｌ濃度まで）と、０．２５マイクロ
リットル（０．６単位）のＴａｑ Ｉポリメラーゼと
１マイクロリットルの２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）とを加えた。この反応物は、Ｎｌａ ＩＩ
Ｉエンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＲｓａ Ｉフラグ
メントの存在に関する対照であり、増幅を発生させるた
めにＲｓａ Ｉフラグメントを環状にしておくことを
必要としなかった。残りの１６２マイクロリットルに１
３マイクロリットルのプライマーＮｌａ ＩＩＩ（５
’ＣＡＡＡＴＡＴＡＣＡＴＣＧＧＡＣＴＡＣ３’）＃７
（５００ｎｍｏｌ濃度まで）と、８マイクロリットルの
ＢＳＡと２マイクロリットル（５単位）のＴａｑ Ｉ
ポリメラーゼとを加えた。この反応物を半分に分割し、
１．８マイクロリットルの２００ｍＭ ＭｇＣｌ２を
管の１つに加えた。 これらの反応物の上に５０マイクロリットルのパラフィ
ン油を積層し、これを２５サイクルにわたってインキュ
ベートした。このサイクルは、９３°Ｃで１．５分間、
４４°Ｃで１．２分間、７０°Ｃで８．５分間の処理を
含む。次いで、試料を１６マイクロリットル採取し、６
マイクロリットルのストップダイと混合し、標準的１％
アガロースゲル中の電気泳動で分析した。同じ実験をＢ
ｓｓＨ ＩＩ連結、精製、乾燥ＤＮＡについて実施し
た。プライマー＃４及び＃７とのＲｓａ Ｉ ２ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２反応は約３マイクログラムのＤＮＡを
２０００塩基対という予想されたサイズで産生させた。 ＢｓｓＨＩＩ消化連結ＤＮＡの類似の反応は増幅ＤＮＡ
を全く産生させなかったが、ＢｓｓＨ ＩＩ対照実験
では約１２００塩基対の予期されたフラグメントが産生
された。 Ｒｓａ Ｉ増幅によって得られた増幅ＤＮＡをフェノ
ール及びクロロホルムで抽出し、前述のように沈澱させ
た。
Ｒ増幅を下記のように実施した。連結し精製し乾燥した
Ｒｓａ Ｉフラグメント（約５００ｎｇ ＤＮＡ）
の入っている管に、１００マイクロリットルの１４０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．８と、４０マイクロリ
ットルの１ｍＭ ｄＮＴＰ溶液と、２マイクロリット
ルの２００ｍＭ ＭｇＣｌ２と、２マイクロリットル
の１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００と、１５マイクロリッ
トル（５００ｎｍｏｌ最終濃度）プライマー Ｎｌａ
ＩＩＩ ＃４（５’ＧＡＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＡ
ＡＣＡＴＣＣＧ ３’）と２３マイクロリットルのｄ
Ｈ２Ｏとを加えた。 この反応物を下記のように混合し且つ分割した。前記混
合物２０マイクロリットルに２マイクロリットルのプラ
イマーＮｌａ ＩＩＩ ＃９（５’ＧＣＡＡＴＴＣ
ＴＡＴＡＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＧＣＣＴＴＡＡＴＧＧ３
’）（５００ｎｍｏｌ濃度まで）と、０．２５マイクロ
リットル（０．６単位）のＴａｑ Ｉポリメラーゼと
１マイクロリットルの２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）とを加えた。この反応物は、Ｎｌａ ＩＩ
Ｉエンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＲｓａ Ｉフラグ
メントの存在に関する対照であり、増幅を発生させるた
めにＲｓａ Ｉフラグメントを環状にしておくことを
必要としなかった。残りの１６２マイクロリットルに１
３マイクロリットルのプライマーＮｌａ ＩＩＩ（５
’ＣＡＡＡＴＡＴＡＣＡＴＣＧＧＡＣＴＡＣ３’）＃７
（５００ｎｍｏｌ濃度まで）と、８マイクロリットルの
ＢＳＡと２マイクロリットル（５単位）のＴａｑ Ｉ
ポリメラーゼとを加えた。この反応物を半分に分割し、
１．８マイクロリットルの２００ｍＭ ＭｇＣｌ２を
管の１つに加えた。 これらの反応物の上に５０マイクロリットルのパラフィ
ン油を積層し、これを２５サイクルにわたってインキュ
ベートした。このサイクルは、９３°Ｃで１．５分間、
４４°Ｃで１．２分間、７０°Ｃで８．５分間の処理を
含む。次いで、試料を１６マイクロリットル採取し、６
マイクロリットルのストップダイと混合し、標準的１％
アガロースゲル中の電気泳動で分析した。同じ実験をＢ
ｓｓＨ ＩＩ連結、精製、乾燥ＤＮＡについて実施し
た。プライマー＃４及び＃７とのＲｓａ Ｉ ２ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２反応は約３マイクログラムのＤＮＡを
２０００塩基対という予想されたサイズで産生させた。 ＢｓｓＨＩＩ消化連結ＤＮＡの類似の反応は増幅ＤＮＡ
を全く産生させなかったが、ＢｓｓＨ ＩＩ対照実験
では約１２００塩基対の予期されたフラグメントが産生
された。 Ｒｓａ Ｉ増幅によって得られた増幅ＤＮＡをフェノ
ール及びクロロホルムで抽出し、前述のように沈澱させ
た。
【００７２】１４．増幅ＤＮＡからのクローニング：Ｓ
ａｕ３Ａ Ｉを用いて増幅ＤＮＡからエンドヌクレア
ーゼ遺伝子のアミノ末端部分をクローンした。Ｓａｕ
３ＡＩを選択したのは、単一の５００塩基対Ｓａｕ
３ＡＩフラグメントがＮｌａ ＩＩＩエンドヌクレ
アーゼの欠失部分を含んでいる疑いがあり、且つＮ．ｌ
ａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡが、出発ゲノムＤＮＡで
はなく増幅ＤＮＡだけが開裂されてベクターへの連結に
使用されるように、Ｓａｕ３ＡＩの開裂を防止すべくメ
チル化されているからである。５マイクロリットルの増
幅ＤＮＡ（０．３マイクログラム）を２５マイクロリッ
トルのＳａｕ３Ａ Ｉ反応バッファ中に希釈し、１マ
イクロリットル（５単位）のＳａｕ３Ａ Ｉを加えて
３７°Ｃで１時間インキュベートした。この反応物をフ
ェノール及びクロロホルムで抽出し、前述のように沈澱
させた。沈澱したＤＮＡを１７マイクロリットルのｄＨ
２０中に懸濁させ、これに２マイクロリットルの１０Ｘ
連結バッファと、１マイクロリットル（１００ｎｇ）の
ＢａｍＨ Ｉ開裂脱ホスホリル化ｐＵＣ１９ ＤＮ
Ａと１マイクロリットル（１００単位ＮＥＢ）のＴ４
ＤＮＡリガーゼとを加えた。この反応物を１７°Ｃで
１６時間インキュベートし、次いで１０マイクロリット
ルのクロロホルムで抽出した。この連結反応物１０マイ
クロリットルを２００マイクロリットルの氷冷コンピテ
ントＥ．ｃｏｌｉ ＲＲＩ ｄａｍ−細胞（ＧＭ
２９７１ ｄａｍ１３：：ｔｎ９）と混合し、４分
間４２°Ｃに暖め、１００マイクログラム／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ−寒天プレート上に配置した。個々
のａｍｐ耐性コロニーを採取し、ミニプレプ化し（ｍｉ
ｎｉｐｒｅｐｅｄ）、そのプラドＤＮＡを制限地図作成
して分析して、先にクローンした配列決定したＤＮＡの
１７８塩基対とエンドヌクレアーゼ遺伝子の欠失部分を
コードすると思われるＤＮＡの約３２５塩基対とを含む
５００塩基対Ｓａｕ３Ａ Ｉフラグメントの存在を調
べた。分析した１４のミニプレプのうち、このようなク
ローンｐＲＭ１２５ａｍｐ １１３−１１が１つ得ら
れた。
ａｕ３Ａ Ｉを用いて増幅ＤＮＡからエンドヌクレア
ーゼ遺伝子のアミノ末端部分をクローンした。Ｓａｕ
３ＡＩを選択したのは、単一の５００塩基対Ｓａｕ
３ＡＩフラグメントがＮｌａ ＩＩＩエンドヌクレ
アーゼの欠失部分を含んでいる疑いがあり、且つＮ．ｌ
ａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡが、出発ゲノムＤＮＡで
はなく増幅ＤＮＡだけが開裂されてベクターへの連結に
使用されるように、Ｓａｕ３ＡＩの開裂を防止すべくメ
チル化されているからである。５マイクロリットルの増
幅ＤＮＡ（０．３マイクログラム）を２５マイクロリッ
トルのＳａｕ３Ａ Ｉ反応バッファ中に希釈し、１マ
イクロリットル（５単位）のＳａｕ３Ａ Ｉを加えて
３７°Ｃで１時間インキュベートした。この反応物をフ
ェノール及びクロロホルムで抽出し、前述のように沈澱
させた。沈澱したＤＮＡを１７マイクロリットルのｄＨ
２０中に懸濁させ、これに２マイクロリットルの１０Ｘ
連結バッファと、１マイクロリットル（１００ｎｇ）の
ＢａｍＨ Ｉ開裂脱ホスホリル化ｐＵＣ１９ ＤＮ
Ａと１マイクロリットル（１００単位ＮＥＢ）のＴ４
ＤＮＡリガーゼとを加えた。この反応物を１７°Ｃで
１６時間インキュベートし、次いで１０マイクロリット
ルのクロロホルムで抽出した。この連結反応物１０マイ
クロリットルを２００マイクロリットルの氷冷コンピテ
ントＥ．ｃｏｌｉ ＲＲＩ ｄａｍ−細胞（ＧＭ
２９７１ ｄａｍ１３：：ｔｎ９）と混合し、４分
間４２°Ｃに暖め、１００マイクログラム／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ−寒天プレート上に配置した。個々
のａｍｐ耐性コロニーを採取し、ミニプレプ化し（ｍｉ
ｎｉｐｒｅｐｅｄ）、そのプラドＤＮＡを制限地図作成
して分析して、先にクローンした配列決定したＤＮＡの
１７８塩基対とエンドヌクレアーゼ遺伝子の欠失部分を
コードすると思われるＤＮＡの約３２５塩基対とを含む
５００塩基対Ｓａｕ３Ａ Ｉフラグメントの存在を調
べた。分析した１４のミニプレプのうち、このようなク
ローンｐＲＭ１２５ａｍｐ １１３−１１が１つ得ら
れた。
【００７３】１５．完全形（ｉｎｔａｃｔ）ＮｌａＨＩ
ＩＩエンドヌクアーゼ遺伝子の作製：５０μｌの反応溶
液中で、２μｇのＥｃｏＲＩライブラリーメチラーゼク
ローンｐＲＭ１２５Ｍ１０１−８を、２０単位のＢａｍ
ＨＩで３７℃で１時間消化した。メチラーゼ及び全ｐＵ
Ｃ１９ベクター（ＥｃｏＲＩ部位からＢｍａＨＩ部位ま
での塩基３９６〜４１７のポリリンカーを除く）を含む
７．４ｋｂフラグメントを、１％ＬＭＰアガロースゲル
からゲル精製し、連結して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩｄ
ａｍ−細胞（１０項に前記）を形質転換した。このＢｍ
ａＨＩ欠失は、クローンから第２のＣｌａＩ部位を除去
した。ｄａｍマイナス宿主中でプラスミドを増殖させる
と、エンドヌクレアーゼ遺伝子のＣｌａＩ部位が開裂可
能になった。その理由は、オーバーラップするＭｂｏＩ
部位がＥ．ｃｏｌｉｄａｍメチラーゼによってメチル化
されなくなるからである。ＢａｍＨＩ欠失プラスミドｐ
ＲＭ１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨをミニプレップ化し
、８μｌ（約４μｇ）のこのＤＮＡを、５０μｌのＣｌ
ａＩ反応緩衝液に希釈した。１μｌ（６単位）のＣｌａ
Ｉ、１μｌ（２０単位）のＰｓｔＩ及び１μｌ（１５単
位）のＥｃｏＯ１０９Ｉを添加し、反応溶液を３７℃で
２時間インキュベートした。ＥｃｏＯ１０９Ｉを使用す
ると、同様のサイズの不要なフラグメントをより小さい
２つのフラグメントに開裂するので所望のフラグメント
のゲル精製が容易になる。ＣｌａＩは、別々にクローニ
ングされたエンドヌクレアーゼ遺伝子の２つの部分間の
オーバーラップ領域を開裂し、エンドヌクレアーゼ遺伝
子の２つの部が接合する部位である。ＰｓｔＩはベクタ
ー中にのみ発生し、メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ
遺伝子の外部のクローニングされたフラグメントの末端
をベクターに接合するために使用される。アンピシリン
プロセスから得られた１０μｌ（２μｇ）のｐＲＭ１２
５ａｍｐ１１３−１１、Ｓａｕ３ＡＩフラグメントクロ
ーンを、５０μｌのＣｌａＩ反応緩衝液に希釈し、１μ
ｌ（６単位）のＣｌａＩ及び１μｌ（２０単位）のＰｓ
ｔＩを加え、反応溶液を３７℃で２時間インキュベート
した。ｐＲＭ１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨに由来のＣ
１ａＩからＰｓｔＩまで２．９ｋｂのフラグメントとｐ
ＲＭ１２５ａｍｐ１１３−１１に由来のＣｌａＩからＰ
ｓｔＩまでの３．２ｋｂのフラグメント（ｐＵＣ１９ベ
クターを含む）とを、１％ＬＭＰアガロースから上記の
ごとくゲル精製した。ゲルスライスを６５℃で５分間融
解し、１０μｌ（約２００ｎｇ）の２．９ｋｂのｐＲＭ
１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨフラグメントを、３μｌ
（約６０ｎｇ）の３．２ｋｂのｐＲＭ１２５ａｍｐ１１
３−１１フラグメントと混合した。混合物を４２℃に冷
却し、０．５μｌ（５０単位 ＮＥＢ） Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを含む１３μｌの２×Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液を加え、かき混ぜて、反応溶液を１７℃で
１６時間インキュベートした。次いで、結合混合物を６
５℃で５分間融解し、４２℃に冷却した。１０μｌの連
結産物を、ｐＡＣＹＣ１８４−ＮｌａＩＩＩメチラーゼ
プラスミドｐＲＭ１２５Ｍ ＡＣＹＣ−４を含む２０
０μｌの氷冷コンピテントＥ．ＣｏｌｉＲＲＩ細胞と混
合し、４２℃で４分間インキュベートし、次いで１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプ
レーティングし、３０℃で２４時間インキュベートした
。増殖した８つのコロニーをミニプレップ化し、これら
のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化によって解析する
と、８つのうちの７つのプラスミドＤＮＡが所望の構築
物を含んでいることが判明した。これらのプラスミドを
ｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−１〜８と命名した。
ＩＩエンドヌクアーゼ遺伝子の作製：５０μｌの反応溶
液中で、２μｇのＥｃｏＲＩライブラリーメチラーゼク
ローンｐＲＭ１２５Ｍ１０１−８を、２０単位のＢａｍ
ＨＩで３７℃で１時間消化した。メチラーゼ及び全ｐＵ
Ｃ１９ベクター（ＥｃｏＲＩ部位からＢｍａＨＩ部位ま
での塩基３９６〜４１７のポリリンカーを除く）を含む
７．４ｋｂフラグメントを、１％ＬＭＰアガロースゲル
からゲル精製し、連結して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩｄ
ａｍ−細胞（１０項に前記）を形質転換した。このＢｍ
ａＨＩ欠失は、クローンから第２のＣｌａＩ部位を除去
した。ｄａｍマイナス宿主中でプラスミドを増殖させる
と、エンドヌクレアーゼ遺伝子のＣｌａＩ部位が開裂可
能になった。その理由は、オーバーラップするＭｂｏＩ
部位がＥ．ｃｏｌｉｄａｍメチラーゼによってメチル化
されなくなるからである。ＢａｍＨＩ欠失プラスミドｐ
ＲＭ１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨをミニプレップ化し
、８μｌ（約４μｇ）のこのＤＮＡを、５０μｌのＣｌ
ａＩ反応緩衝液に希釈した。１μｌ（６単位）のＣｌａ
Ｉ、１μｌ（２０単位）のＰｓｔＩ及び１μｌ（１５単
位）のＥｃｏＯ１０９Ｉを添加し、反応溶液を３７℃で
２時間インキュベートした。ＥｃｏＯ１０９Ｉを使用す
ると、同様のサイズの不要なフラグメントをより小さい
２つのフラグメントに開裂するので所望のフラグメント
のゲル精製が容易になる。ＣｌａＩは、別々にクローニ
ングされたエンドヌクレアーゼ遺伝子の２つの部分間の
オーバーラップ領域を開裂し、エンドヌクレアーゼ遺伝
子の２つの部が接合する部位である。ＰｓｔＩはベクタ
ー中にのみ発生し、メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ
遺伝子の外部のクローニングされたフラグメントの末端
をベクターに接合するために使用される。アンピシリン
プロセスから得られた１０μｌ（２μｇ）のｐＲＭ１２
５ａｍｐ１１３−１１、Ｓａｕ３ＡＩフラグメントクロ
ーンを、５０μｌのＣｌａＩ反応緩衝液に希釈し、１μ
ｌ（６単位）のＣｌａＩ及び１μｌ（２０単位）のＰｓ
ｔＩを加え、反応溶液を３７℃で２時間インキュベート
した。ｐＲＭ１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨに由来のＣ
１ａＩからＰｓｔＩまで２．９ｋｂのフラグメントとｐ
ＲＭ１２５ａｍｐ１１３−１１に由来のＣｌａＩからＰ
ｓｔＩまでの３．２ｋｂのフラグメント（ｐＵＣ１９ベ
クターを含む）とを、１％ＬＭＰアガロースから上記の
ごとくゲル精製した。ゲルスライスを６５℃で５分間融
解し、１０μｌ（約２００ｎｇ）の２．９ｋｂのｐＲＭ
１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨフラグメントを、３μｌ
（約６０ｎｇ）の３．２ｋｂのｐＲＭ１２５ａｍｐ１１
３−１１フラグメントと混合した。混合物を４２℃に冷
却し、０．５μｌ（５０単位 ＮＥＢ） Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを含む１３μｌの２×Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液を加え、かき混ぜて、反応溶液を１７℃で
１６時間インキュベートした。次いで、結合混合物を６
５℃で５分間融解し、４２℃に冷却した。１０μｌの連
結産物を、ｐＡＣＹＣ１８４−ＮｌａＩＩＩメチラーゼ
プラスミドｐＲＭ１２５Ｍ ＡＣＹＣ−４を含む２０
０μｌの氷冷コンピテントＥ．ＣｏｌｉＲＲＩ細胞と混
合し、４２℃で４分間インキュベートし、次いで１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプ
レーティングし、３０℃で２４時間インキュベートした
。増殖した８つのコロニーをミニプレップ化し、これら
のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化によって解析する
と、８つのうちの７つのプラスミドＤＮＡが所望の構築
物を含んでいることが判明した。これらのプラスミドを
ｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−１〜８と命名した。
【００７４】１６．ＮｌａＩＩＩ制限遺伝子クローン：
ｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４（このサンプルは、１９
９０年７月１７日、ＡＴＣＣ受託番号Ｅ．ｃｏｌｉ
ＥＲ１３９８中のＮｏ．６８３６６としてＡｍｅｒｉｃ
ａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに寄託された）及び同様のプラスミドは、これらの
プラスミドを含むＥ．Ｃｏｌｉ ＲＲＩの抽出物の検
定によってＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドし発現することが判明した。ｐＲＭ１２５ＲＭ１００
ｃ−４または、ＮｌａＩＩＩメチラーゼをコードするＤ
ＮＡを含有する。
ｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４（このサンプルは、１９
９０年７月１７日、ＡＴＣＣ受託番号Ｅ．ｃｏｌｉ
ＥＲ１３９８中のＮｏ．６８３６６としてＡｍｅｒｉｃ
ａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに寄託された）及び同様のプラスミドは、これらの
プラスミドを含むＥ．Ｃｏｌｉ ＲＲＩの抽出物の検
定によってＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドし発現することが判明した。ｐＲＭ１２５ＲＭ１００
ｃ−４または、ＮｌａＩＩＩメチラーゼをコードするＤ
ＮＡを含有する。
【００７５】エンドヌクレアーゼアッセイ：検定すべき
細胞の２５０ｍｌの培養物を、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬ−ブイヨン中で３７℃で一夜増殖させ
た。培養物を８Ｋｒｐｍで５分間遠心し、細胞ペレット
を、１０ｍｌの１０ｍＭのトリス．ＨＣｌ ｐＨ７．
５、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのＭ
ｇＣｌ２に再懸濁させた。１．５ｍｌの懸濁液を３回の
１５秒バーストで音波処理して細胞を破壊した。音波処
理した抽出物を１０分間ミクロ遠心して細胞破片を除去
し、上清のエンドヌクレアーゼ活性を以下の手順で検定
した：８μｇ（１６μｌ）の精製ファージλＤＮＡを４
００μｌのＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ消化緩
衝液（６項）に希釈した。７つの試験管を用い、第１試
験管に７５μｌ、残りの６つの試験管に各５０μｌずつ
溶液を分配した。１３．５μｌの抽出物を第１試験管に
添加して、ＤＮＡ１μｇあたり抽出物９μｌとした。次
に、第１試験管から２５μｌを取り出し、第２試験管に
移して３μｌ／μｇとした。２５μｌずつ移す系列希釈
を続行し、試験管３（１μｌ／μｇ）、４（０．３μｌ
／μｇ）、５（０．１μｌ／μｇ）、６（０．０３μｌ
／μｇ）、７（０．０１μｌ／μｇ）の濃度にした。試
験管を３７℃で１時間インキュベートし、次いで各試験
管の２０μｌをゲル電気泳動によって分析した。抽出物
は１ｍｌあたり約２×１０３ｕｎｉｔｓのＮｌａＩＩＩ
制限エンドヌクレアーゼを含有することが判明した。こ
れは細胞１ｇあたり２×１０４ｕｎｉｔｓに対応する。
細胞の２５０ｍｌの培養物を、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬ−ブイヨン中で３７℃で一夜増殖させ
た。培養物を８Ｋｒｐｍで５分間遠心し、細胞ペレット
を、１０ｍｌの１０ｍＭのトリス．ＨＣｌ ｐＨ７．
５、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのＭ
ｇＣｌ２に再懸濁させた。１．５ｍｌの懸濁液を３回の
１５秒バーストで音波処理して細胞を破壊した。音波処
理した抽出物を１０分間ミクロ遠心して細胞破片を除去
し、上清のエンドヌクレアーゼ活性を以下の手順で検定
した：８μｇ（１６μｌ）の精製ファージλＤＮＡを４
００μｌのＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ消化緩
衝液（６項）に希釈した。７つの試験管を用い、第１試
験管に７５μｌ、残りの６つの試験管に各５０μｌずつ
溶液を分配した。１３．５μｌの抽出物を第１試験管に
添加して、ＤＮＡ１μｇあたり抽出物９μｌとした。次
に、第１試験管から２５μｌを取り出し、第２試験管に
移して３μｌ／μｇとした。２５μｌずつ移す系列希釈
を続行し、試験管３（１μｌ／μｇ）、４（０．３μｌ
／μｇ）、５（０．１μｌ／μｇ）、６（０．０３μｌ
／μｇ）、７（０．０１μｌ／μｇ）の濃度にした。試
験管を３７℃で１時間インキュベートし、次いで各試験
管の２０μｌをゲル電気泳動によって分析した。抽出物
は１ｍｌあたり約２×１０３ｕｎｉｔｓのＮｌａＩＩＩ
制限エンドヌクレアーゼを含有することが判明した。こ
れは細胞１ｇあたり２×１０４ｕｎｉｔｓに対応する。
【００７６】１７．ｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４を含
むＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１３９８はＮｌａＩＩＩ制限エ
ンドヌクレアーゼの精製に使用できる好ましい宿主であ
る。使用できるその他の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＲＲｌ、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４、などで
ある。アンピシリンを含むＬ−ブイヨンを入れた発酵槽
で菌株を３７℃で後期対数増殖期まで増殖させた。次い
で、細胞を遠心によって収集し、正しい調製物を得るた
めに直ちに破壊するか、または適当な時期まで−７０℃
で凍結保存する。
むＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１３９８はＮｌａＩＩＩ制限エ
ンドヌクレアーゼの精製に使用できる好ましい宿主であ
る。使用できるその他の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＲＲｌ、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４、などで
ある。アンピシリンを含むＬ−ブイヨンを入れた発酵槽
で菌株を３７℃で後期対数増殖期まで増殖させた。次い
で、細胞を遠心によって収集し、正しい調製物を得るた
めに直ちに破壊するか、または適当な時期まで−７０℃
で凍結保存する。
【００７７】１８．組換えＮｌａＩＩＩエンドヌクレア
ーゼの精製：プラスミドｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４
を含む２５ｇのＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１３９８細胞を、
１００ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＫＰＯ４ ｐＨ７
．０、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍ
ＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させた。細胞を音波処理によっ
て破壊した。可溶性タンパク質の放出をモニターし、出
発細胞ペースト重量の６％が可溶性タンパク質として放
出されるまで音波処理を続行した。５ＭのＮａＣｌを加
えて総ＮａＣｌ濃度を０．１Ｍとし、Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｊ２−２１遠心機及びＪＡ−１４ヘッドによって４℃
で１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心することによって
溶液を清澄化した。次いで粗上清を、緩衝液Ｂ（０．１
ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａ）で平衡した２．５×１１
ｃｍのＰｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムで処理
した。カラムを１００ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した。緩衝
液Ａ中の０．１ＭのＮａＣｌから１．１ＭのＮａＣｌま
でのリニヤグラジェント６００ｍｌでカラムを処理し、
１０ｍｌ毎の分画を収集した。上記のごとくλＤＮＡで
カラム分画を検定することによってＮｌａＩＩＩ活性の
ピークを測定した。ＮｌａＩＩＩは約０．４ＭのＮａＣ
ｌに溶出した。ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼピーク
を含む分画を緩衝液Ｂに透析し、緩衝液Ｂで平衡した２
．５×４ｃｍのヘパリン−セファロースカラムで処理し
た。カラムを４０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで、緩
衝液Ａ中の０．１ＭのＮａＣｌから１．１ＭのＮａＣｌ
のリニヤグラジェント２００ｍｌで処理した。４ｍｌ毎
の分画を収集し、上記のごとく検定してＮｌａＩＩＩピ
ークの位置を決定した。ＮｌａＩＩＩは０．３Ｍ〜０．
５ＭのＮａＣｌに溶出した。ＮｌａＩＩＩ含有分画を緩
衝液Ｃ（２０ｍＭのＫＰＯ４ｐＨ６．０、１０ｍＭの２
−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．
１ＭのＮａＣｌ）に透析し緩衝液Ｃで平衡した１．５×
１０ｃｍのＣＭ−セファロースカラムで処理した。カラ
ムを３０ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄し、次いで０．１Ｍから
１．１ＭのＮａＣｌまでのリニヤグラジェント１８０ｍ
ｌで処理して３ｍｌ毎の分画を収集した。ＮｌａＩＩＩ
は約０．３ＭのＮａＣｌで溶出することが判明した。Ｎ
ｌａＩＩＩの最大活性を含む分画を、緩衝液Ｄ（２０ｍ
ＭのＫＰＯ４ｐＨ７．０、１０ｍＭの２−メルカプトエ
タノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌ
）で平衡したＧ−７５カラムで処理し、カラムに５００
ｍｌの緩衝液Ｄを加えた。ＮｌａＩＩＩの最大活性を含
む分画は２２０〜２５０ｍｌに溶出し、これをＮｌａＩ
ＩＩ保存用緩衝液（１０ｍＭのトリス．ＨＣｌ ｐＨ
７．４、２００ｍＭのＫＣ１、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
１ｍＭのＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５０％の
グリセロール）に透析し、−２０℃で保存した。この精
製から得られたＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼは実質
的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキ
ソヌクレアーゼを含まず、また、ＮｌａＩ、ＮｌａＩＩ
及びＮｌａＩＶエンドヌクレアーゼは全く混在していな
い。
ーゼの精製：プラスミドｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４
を含む２５ｇのＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１３９８細胞を、
１００ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＫＰＯ４ ｐＨ７
．０、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍ
ＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させた。細胞を音波処理によっ
て破壊した。可溶性タンパク質の放出をモニターし、出
発細胞ペースト重量の６％が可溶性タンパク質として放
出されるまで音波処理を続行した。５ＭのＮａＣｌを加
えて総ＮａＣｌ濃度を０．１Ｍとし、Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｊ２−２１遠心機及びＪＡ−１４ヘッドによって４℃
で１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心することによって
溶液を清澄化した。次いで粗上清を、緩衝液Ｂ（０．１
ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａ）で平衡した２．５×１１
ｃｍのＰｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムで処理
した。カラムを１００ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した。緩衝
液Ａ中の０．１ＭのＮａＣｌから１．１ＭのＮａＣｌま
でのリニヤグラジェント６００ｍｌでカラムを処理し、
１０ｍｌ毎の分画を収集した。上記のごとくλＤＮＡで
カラム分画を検定することによってＮｌａＩＩＩ活性の
ピークを測定した。ＮｌａＩＩＩは約０．４ＭのＮａＣ
ｌに溶出した。ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼピーク
を含む分画を緩衝液Ｂに透析し、緩衝液Ｂで平衡した２
．５×４ｃｍのヘパリン−セファロースカラムで処理し
た。カラムを４０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで、緩
衝液Ａ中の０．１ＭのＮａＣｌから１．１ＭのＮａＣｌ
のリニヤグラジェント２００ｍｌで処理した。４ｍｌ毎
の分画を収集し、上記のごとく検定してＮｌａＩＩＩピ
ークの位置を決定した。ＮｌａＩＩＩは０．３Ｍ〜０．
５ＭのＮａＣｌに溶出した。ＮｌａＩＩＩ含有分画を緩
衝液Ｃ（２０ｍＭのＫＰＯ４ｐＨ６．０、１０ｍＭの２
−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．
１ＭのＮａＣｌ）に透析し緩衝液Ｃで平衡した１．５×
１０ｃｍのＣＭ−セファロースカラムで処理した。カラ
ムを３０ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄し、次いで０．１Ｍから
１．１ＭのＮａＣｌまでのリニヤグラジェント１８０ｍ
ｌで処理して３ｍｌ毎の分画を収集した。ＮｌａＩＩＩ
は約０．３ＭのＮａＣｌで溶出することが判明した。Ｎ
ｌａＩＩＩの最大活性を含む分画を、緩衝液Ｄ（２０ｍ
ＭのＫＰＯ４ｐＨ７．０、１０ｍＭの２−メルカプトエ
タノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌ
）で平衡したＧ−７５カラムで処理し、カラムに５００
ｍｌの緩衝液Ｄを加えた。ＮｌａＩＩＩの最大活性を含
む分画は２２０〜２５０ｍｌに溶出し、これをＮｌａＩ
ＩＩ保存用緩衝液（１０ｍＭのトリス．ＨＣｌ ｐＨ
７．４、２００ｍＭのＫＣ１、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
１ｍＭのＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５０％の
グリセロール）に透析し、−２０℃で保存した。この精
製から得られたＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼは実質
的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキ
ソヌクレアーゼを含まず、また、ＮｌａＩ、ＮｌａＩＩ
及びＮｌａＩＶエンドヌクレアーゼは全く混在していな
い。
【図１】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼのクロー
ニング及び製造の手順の説明図である。
ニング及び製造の手順の説明図である。
【図２】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼのクロー
ニング及び製造の手順の説明図の続きである。
ニング及び製造の手順の説明図の続きである。
【図３】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＮｌ
ａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードするＮ． ｌａｃｔ
ａｍｉｃａのＤＮＡ断片であって、ｐＵＣ１９（ＡＴＣ
Ｃ３７２５４）のＢａｍＨＩ部位及びＰｓｔＩ部位に挿
入してｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４を作製した際に用
いた、上記ＤＮＡ断片の制限地図である。
ａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードするＮ． ｌａｃｔ
ａｍｉｃａのＤＮＡ断片であって、ｐＵＣ１９（ＡＴＣ
Ｃ３７２５４）のＢａｍＨＩ部位及びＰｓｔＩ部位に挿
入してｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４を作製した際に用
いた、上記ＤＮＡ断片の制限地図である。
【図４】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＮｌ
ａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードするＮ． １ａｃｔ
ａｍｉｃａのＤＮＡ断片であって、ｐＵＣ１９（ＡＴＣ
Ｃ３７２５４）のＢａｍＨＩ部位及びＰｓｔＩ部位に挿
入してｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４を作製した際に用
いた、上記ＤＮＡ断片の制限地図の続きである。
ａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードするＮ． １ａｃｔ
ａｍｉｃａのＤＮＡ断片であって、ｐＵＣ１９（ＡＴＣ
Ｃ３７２５４）のＢａｍＨＩ部位及びＰｓｔＩ部位に挿
入してｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４を作製した際に用
いた、上記ＤＮＡ断片の制限地図の続きである。
【図５】ｐＲＭ１２５ＲＭ １００ｃ−４を有するＥ
． ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴＣＣ３１３４３）の細
胞抽出物のＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を
示すアガロースゲルの写真を示す図である。
． ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴＣＣ３１３４３）の細
胞抽出物のＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を
示すアガロースゲルの写真を示す図である。
Claims (15)
- 【請求項１】 Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ ＮＲ
ＣＣ ２１１８によって産生されるＮｌａＩＩＩ制限
エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含
むＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ ＮＲ
ＣＣ ２１１８によって産生されるＮｌａＩＩＩメチ
ラーゼをコードするヌクレオチド配列をも含むことを特
徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項３】 プラスミドｐＲＭ１２５ＲＭ １０
０ｃ−４から得られることを特徴とする請求項１または
２に記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項４】 Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ ＮＲ
ＣＣ ２１１８によって産生されるＮｌａＩＩＩ制限
エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ断片を挿入した
ベクターを含む組み換え体ベクター。 - 【請求項５】 請求項１または２に記載のＤＮＡ断片
を挿入したベクターを含む組み換え体ベクター。 - 【請求項６】 請求項４に記載の組み換え体ベクター
で宿主細胞を形質転換して得られる形質転換細胞。 - 【請求項７】 請求項５に記載の組み換え体ベクター
で宿主細胞を形質転換して得られる形質転換細胞。 - 【請求項８】 宿主細胞がＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ
１、Ｅ． ｃｏｌｉ ＭＭ２９４またはＥ． Ｃ
ｏｌｉ ＥＲ１３９８であることを特徴とする請求項
６に記載の形質転換細胞。 - 【請求項９】 Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ ＮＲ
ＣＣ ２１１８から得られ、かつＮｌａＩ、ＮｌａＩ
Ｉ及びＮｌａＩＶを含まない、ＤＮＡのＣＡＴＧ配列を
認識する組み換え体ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアー
ゼ。 - 【請求項１０】 ＤＮＡを請求項９に記載の組み換え
体ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化から
防護する、Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ ＮＲＣＣ２
１１８から得られる組み換え体修飾メチラーゼ。 - 【請求項１１】 請求項４に記載の組み換え体ベクタ
ーで形質転換した宿主細胞をＮｌａＩＩＩ制限エンドヌ
クレアーゼの発現に適した条件下に培養することを含む
ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。 - 【請求項１２】 請求項５に記載の組み換え体ベクタ
ーで形質転換した宿主細胞をＮｌａＩＩＩ制限エンドヌ
クレアーゼの発現に適した条件下に培養することを含む
ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。 - 【請求項１３】 組み換え体ベクターがプラスミドｐ
ＲＭ１２５ＲＭ １００ｃ−４を含むことを特徴とす
る請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 宿主細胞がＥ． ｃｏｌｉ Ｒ
Ｐ１、Ｅ． ｃｏｌｉ ＭＭ２９４またはＥ．
ｃｏｌｉ ＥＲ１３９８であることを特徴とする請求
項１１に記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項１１に記載の方法で製造した
組み換え体ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US575,285 | 1990-08-30 | ||
| US07/575,285 US5278060A (en) | 1990-08-30 | 1990-08-30 | Method for producing the Nla III restriction endonuclease and methylase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04293489A true JPH04293489A (ja) | 1992-10-19 |
| JP3064065B2 JP3064065B2 (ja) | 2000-07-12 |
Family
ID=24299670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5278060A (ja) |
| EP (1) | EP0477532B1 (ja) |
| JP (1) | JP3064065B2 (ja) |
| DE (2) | DE477532T1 (ja) |
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| US6689573B1 (en) | 1999-05-24 | 2004-02-10 | New England Biolabs, Inc. | Method for screening restriction endonucleases |
| WO2007097778A2 (en) | 2005-08-04 | 2007-08-30 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, dna encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
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| US5015581A (en) * | 1989-03-15 | 1991-05-14 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Hinc II restriction endonuclease and methylase |
| US5082784A (en) * | 1990-03-20 | 1992-01-21 | Life Technologies, Inc. | Cloned kpni restriction-modification system |
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-
1990
- 1990-08-30 US US07/575,285 patent/US5278060A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-08-20 EP EP91113911A patent/EP0477532B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-08-20 DE DE91113911T patent/DE477532T1/de active Pending
- 1991-08-20 DE DE69110226T patent/DE69110226T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-08-30 JP JP3299985A patent/JP3064065B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| US5278060A (en) | 1994-01-11 |
| JP3064065B2 (ja) | 2000-07-12 |
| EP0477532A1 (en) | 1992-04-01 |
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