JP3064065B2 - ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 - Google Patents
ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法Info
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- JP3064065B2 JP3064065B2 JP3299985A JP29998591A JP3064065B2 JP 3064065 B2 JP3064065 B2 JP 3064065B2 JP 3299985 A JP3299985 A JP 3299985A JP 29998591 A JP29998591 A JP 29998591A JP 3064065 B2 JP3064065 B2 JP 3064065B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＮｌａＩＩＩ制限エン
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組み換
え体ＤＮＡ、及びこの組み換え体ＤＮＡから上記２酵素
を製造する方法に係わる。
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組み換
え体ＤＮＡ、及びこの組み換え体ＤＮＡから上記２酵素
を製造する方法に係わる。
【０００２】
【従来の技術】多くの細菌は外来ＤＮＡの侵入を防御す
る系を有する。細菌細胞は、侵入ＤＮＡが通常対応する
ＤＮＡメチラーゼによる修飾を予め受けていなければ該
ＤＮＡの二本鎖を切断する特異的エンドヌクレアーゼを
有する。エンドヌクレアーゼとこれに対応するメチラー
ゼとを制限−修飾系（以後“Ｒ−Ｍ系”と表記）と呼称
する。Ｒ−Ｍ系の原則的な機能はこのように防御的であ
り、Ｒ−Ｍ系によって細菌細胞は、該細胞に寄生しよう
とするバクテリオファージ及びプラスミドＤＮＡ分子の
感染に抵抗し得る。
る系を有する。細菌細胞は、侵入ＤＮＡが通常対応する
ＤＮＡメチラーゼによる修飾を予め受けていなければ該
ＤＮＡの二本鎖を切断する特異的エンドヌクレアーゼを
有する。エンドヌクレアーゼとこれに対応するメチラー
ゼとを制限−修飾系（以後“Ｒ−Ｍ系”と表記）と呼称
する。Ｒ−Ｍ系の原則的な機能はこのように防御的であ
り、Ｒ−Ｍ系によって細菌細胞は、該細胞に寄生しよう
とするバクテリオファージ及びプラスミドＤＮＡ分子の
感染に抵抗し得る。
【０００３】Ｒ−Ｍ系は、サブユニット構成、補因子の
必要性及びＤＮＡ切断のタイプに基づいて明確に３種に
分類されている。タイプＩのＲ−Ｍ系は最も複雑な系で
ある。この系のエンドヌクレアーゼは一般に３種のサブ
ユニットを有し、ＤＮＡ切断のためにはＭｇ＋＋、ＡＴ
Ｐ及びＳ−アデノシルメチオニンを必要とする。その認
識部位は複雑であり、ＤＮＡ切断は認識部位から４００
〜７０００塩基対離れた任意の位置で非特異的に起こ
る。
必要性及びＤＮＡ切断のタイプに基づいて明確に３種に
分類されている。タイプＩのＲ−Ｍ系は最も複雑な系で
ある。この系のエンドヌクレアーゼは一般に３種のサブ
ユニットを有し、ＤＮＡ切断のためにはＭｇ＋＋、ＡＴ
Ｐ及びＳ−アデノシルメチオニンを必要とする。その認
識部位は複雑であり、ＤＮＡ切断は認識部位から４００
〜７０００塩基対離れた任意の位置で非特異的に起こ
る。
【０００４】タイプＩＩＩのＲ−Ｍ系は、タイプＩの系
ほどは複雑でない。この系のエンドヌクレアーゼは２種
のサブユニットしか有せず、またＤＮＡ切断のためにＭ
ｇ＋＋及びＡＴＰを必要とするが、Ｓ−アデノシルメチ
オニンは酵素活性の刺激に有用であるものの必須ではな
い。ＤＮＡ切断は認識部位から約２５〜２７塩基対離れ
た位置で起こる。
ほどは複雑でない。この系のエンドヌクレアーゼは２種
のサブユニットしか有せず、またＤＮＡ切断のためにＭ
ｇ＋＋及びＡＴＰを必要とするが、Ｓ−アデノシルメチ
オニンは酵素活性の刺激に有用であるものの必須ではな
い。ＤＮＡ切断は認識部位から約２５〜２７塩基対離れ
た位置で起こる。
【０００５】タイプＩＩのＲ−Ｍ系はタイプＩ及びＩＩ
Ｉのいずれよりもはるかに単純である。エンドヌクレア
ーゼはただ１種のサブユニットしか有せず、ＤＮＡ切断
に要するのもＭｇ＋＋のみである。そのうえ、ＤＮＡ切
断位置はこの酵素の認識部位内にか、または該認識部位
に隣接して存在する。タイプＩＩのＲ−Ｍ系の制限エン
ドヌクレアーゼは分子生物学者にとって最も有用である
とされている。
Ｉのいずれよりもはるかに単純である。エンドヌクレア
ーゼはただ１種のサブユニットしか有せず、ＤＮＡ切断
に要するのもＭｇ＋＋のみである。そのうえ、ＤＮＡ切
断位置はこの酵素の認識部位内にか、または該認識部位
に隣接して存在する。タイプＩＩのＲ−Ｍ系の制限エン
ドヌクレアーゼは分子生物学者にとって最も有用である
とされている。
【０００６】細菌がその種毎に有する制限エンドヌクレ
アーゼの種類は普通少数でしかない ｅＩＩＩと命名された３種の制限エンドヌクレアーゼを
合成する。これらの酵素は（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）配
列、ＰｕＧＣＧＣＰｙ配列及びＧＧＣＣ配列をそれぞれ
認識して切断を行なう。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＲＹ１３は１種の酵素ＥｃｏＲＩしか合成
せず、この酵素はＧＡＡＴＴＣ配列を認識する。
アーゼの種類は普通少数でしかない ｅＩＩＩと命名された３種の制限エンドヌクレアーゼを
合成する。これらの酵素は（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）配
列、ＰｕＧＣＧＣＰｙ配列及びＧＧＣＣ配列をそれぞれ
認識して切断を行なう。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＲＹ１３は１種の酵素ＥｃｏＲＩしか合成
せず、この酵素はＧＡＡＴＴＣ配列を認識する。
【０００７】Ｒ−Ｍ系の第一の構成要素である制限エン
ドヌクレアーゼは、実用上ＤＮＡ分子の分解に用いられ
るため、主にその認識配列及び切断特異性で特徴付けら
れている。大部分の制限エンドヌクレアーゼは長さ４〜
６ヌクレオチドの配列を認識する。最近、認識配列の長
さがヌクレオチド７個または８個である制限エンドヌク
レアーゼが発見された。認識部位は、その総てではない
が殆どが二回転対称軸を有し、また殆どの場合認識部位
内の塩基はいずれもただ１種に特定される。制限エンド
ヌクレアーゼの認識配列の上記のような対称構造を“パ
リンドローム”と呼称している。或る種の制限エンドヌ
クレアーゼは退行した、もしくは緩やかな特異性を有
し、そのような制限エンドヌクレアーゼは同一位置で多
種の塩基を認識し得る。ＧＡＡＴＴＣ配列を認識するＥ
ｃｏＲＩは認識配列が対称性である制限エンドヌクレア
ーゼの一例であり、一方ＰｕＧＣＧＣＰｙ配列を認識す
るＨａｅＩＩは退行した、もしくは緩やかな特異性を有
する制限エンドヌクレアーゼの典型例である。認識部位
が対称性であるエンドヌクレアーゼは通常認識部位内
で、または該部位に隣接して対称的に切断を行ない、一
方非対称部位を認識するエンドヌクレアーゼは認識部位
から普通約１〜１３塩基対離れた位置において切断を行
なう傾向を有する。
ドヌクレアーゼは、実用上ＤＮＡ分子の分解に用いられ
るため、主にその認識配列及び切断特異性で特徴付けら
れている。大部分の制限エンドヌクレアーゼは長さ４〜
６ヌクレオチドの配列を認識する。最近、認識配列の長
さがヌクレオチド７個または８個である制限エンドヌク
レアーゼが発見された。認識部位は、その総てではない
が殆どが二回転対称軸を有し、また殆どの場合認識部位
内の塩基はいずれもただ１種に特定される。制限エンド
ヌクレアーゼの認識配列の上記のような対称構造を“パ
リンドローム”と呼称している。或る種の制限エンドヌ
クレアーゼは退行した、もしくは緩やかな特異性を有
し、そのような制限エンドヌクレアーゼは同一位置で多
種の塩基を認識し得る。ＧＡＡＴＴＣ配列を認識するＥ
ｃｏＲＩは認識配列が対称性である制限エンドヌクレア
ーゼの一例であり、一方ＰｕＧＣＧＣＰｙ配列を認識す
るＨａｅＩＩは退行した、もしくは緩やかな特異性を有
する制限エンドヌクレアーゼの典型例である。認識部位
が対称性であるエンドヌクレアーゼは通常認識部位内
で、または該部位に隣接して対称的に切断を行ない、一
方非対称部位を認識するエンドヌクレアーゼは認識部位
から普通約１〜１３塩基対離れた位置において切断を行
なう傾向を有する。
【０００８】細菌Ｒ−Ｍ系の第二の構成要素は修飾メチ
ラーゼである。この酵素は制限エンドヌクレアーゼと相
補的であり、細菌が自己ＤＮＡを外来の感染ＤＮＡと区
別して保護することを可能にする。修飾メチラーゼは、
対応する制限エンドヌクレアーゼの認識配列と同じヌク
レオチド配列を認識してこの配列と結合するがＤＮＡ切
断は行なわず、替わりに認識配列内の１個以上のヌクレ
オチドをメチル基の付加によって化学的に修飾する。メ
チル化された認識配列はもはや対応する制限エンドヌク
レアーゼによって認識または切断されない。細菌細胞の
ＤＮＡはその修飾メチラーゼの作用下に常に修飾されて
おり、従って内在する制限エンドヌクレアーゼに対して
非感受性である。制限エンドヌクレアーゼによる認識及
び切断に対して感受性であるのは、修飾されておらず、
従って確実に外来のＤＮＡのみである。
ラーゼである。この酵素は制限エンドヌクレアーゼと相
補的であり、細菌が自己ＤＮＡを外来の感染ＤＮＡと区
別して保護することを可能にする。修飾メチラーゼは、
対応する制限エンドヌクレアーゼの認識配列と同じヌク
レオチド配列を認識してこの配列と結合するがＤＮＡ切
断は行なわず、替わりに認識配列内の１個以上のヌクレ
オチドをメチル基の付加によって化学的に修飾する。メ
チル化された認識配列はもはや対応する制限エンドヌク
レアーゼによって認識または切断されない。細菌細胞の
ＤＮＡはその修飾メチラーゼの作用下に常に修飾されて
おり、従って内在する制限エンドヌクレアーゼに対して
非感受性である。制限エンドヌクレアーゼによる認識及
び切断に対して感受性であるのは、修飾されておらず、
従って確実に外来のＤＮＡのみである。
【０００９】１０００種を上回る様々な制限エンドヌク
レアーゼが細菌株から単離されており、その多くは共通
の特異性を有する。認識配列が互いに同じである制限エ
ンドヌクレアーゼを“イソシゾマー”と呼称する。イソ
シゾマーは、認識配列は同じであっても切断位置、及び
様々な位置での切断頻度に関して互いに相違し得る［切
断位置については、例えばＸｍａＩとＳｍａＩとの相違
に関してＥｎｄｏｗｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．， １１２， ｐ．５２１（１９７７）及び
Ｗａａｌｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．， ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓ．， ５， ｐ．３２３１（１９７８）
を、また切断頻度についてはＸｈｏＩとＰａｅＲ７Ｉと
の相違に関してＧｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ， ８０， ｐ．４０２（１９８３）を参照された
い］。
レアーゼが細菌株から単離されており、その多くは共通
の特異性を有する。認識配列が互いに同じである制限エ
ンドヌクレアーゼを“イソシゾマー”と呼称する。イソ
シゾマーは、認識配列は同じであっても切断位置、及び
様々な位置での切断頻度に関して互いに相違し得る［切
断位置については、例えばＸｍａＩとＳｍａＩとの相違
に関してＥｎｄｏｗｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．， １１２， ｐ．５２１（１９７７）及び
Ｗａａｌｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．， ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓ．， ５， ｐ．３２３１（１９７８）
を、また切断頻度についてはＸｈｏＩとＰａｅＲ７Ｉと
の相違に関してＧｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ， ８０， ｐ．４０２（１９８３）を参照された
い］。
【００１０】遺伝子工学技術の出現をみた今日では、遺
伝子をクローニングしてその遺伝子がコードするタンパ
ク質及び酵素を、それらの天然供給源から通常の精製技
術によって得られるより大量に生産することができる。
伝子をクローニングしてその遺伝子がコードするタンパ
ク質及び酵素を、それらの天然供給源から通常の精製技
術によって得られるより大量に生産することができる。
【００１１】タイプＩＩの制限−修飾系のクローニング
が次第に頻繁に行なわれるようになっている。Ｅ． ｃ
ｏｌｉへの導入によるＲ−Ｍ系クローニングには、
（１）天然プラスミドのサブクローニング；（２）ファ
ージ制限に基づく選択；（３）ベクター修飾に基づく選
択；及び（４）マルチステップ単離の４方法が用いられ
ている。
が次第に頻繁に行なわれるようになっている。Ｅ． ｃ
ｏｌｉへの導入によるＲ−Ｍ系クローニングには、
（１）天然プラスミドのサブクローニング；（２）ファ
ージ制限に基づく選択；（３）ベクター修飾に基づく選
択；及び（４）マルチステップ単離の４方法が用いられ
ている。
【００１２】初期のクローン系では、制限エンドヌクレ
アーゼクローンの同定もしくは選択手段としてバクテリ
オファージ感染が用いられた［ＨｈａＩＩ： Ｍａｎｎ
ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３， ｐｐ．９７−１
１２（１９７８）； ＥｃｏＲＩＩ； Ｋｏｓｙｋｈ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ・ Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅ
ｔ．， １７８， ｐｐ．７１７−７１９（１９８
０）； ＰｓｔＩ： Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７
８， ｐｐ．１５０３−１５０７（１９８１）］。細菌
内にＲ−Ｍ系が存在すればその細菌はバクテリオファー
ジの感染に抵抗し得るので、クローンＲ−Ｍ遺伝子を持
つ細胞は原則として、ファージに暴露したライブラリー
から生存細胞として選択的に単離することができる。こ
の方法はしかし限られた価値しか有しないことが判明し
た。特に、クローンＲ−Ｍ遺伝子は選択的生存を実現す
る十分なファージ耐性を常に示すとはかぎらないことが
明らかとなった。
アーゼクローンの同定もしくは選択手段としてバクテリ
オファージ感染が用いられた［ＨｈａＩＩ： Ｍａｎｎ
ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３， ｐｐ．９７−１
１２（１９７８）； ＥｃｏＲＩＩ； Ｋｏｓｙｋｈ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ・ Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅ
ｔ．， １７８， ｐｐ．７１７−７１９（１９８
０）； ＰｓｔＩ： Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７
８， ｐｐ．１５０３−１５０７（１９８１）］。細菌
内にＲ−Ｍ系が存在すればその細菌はバクテリオファー
ジの感染に抵抗し得るので、クローンＲ−Ｍ遺伝子を持
つ細胞は原則として、ファージに暴露したライブラリー
から生存細胞として選択的に単離することができる。こ
の方法はしかし限られた価値しか有しないことが判明し
た。特に、クローンＲ−Ｍ遺伝子は選択的生存を実現す
る十分なファージ耐性を常に示すとはかぎらないことが
明らかとなった。
【００１３】天然プラスミドのサブクローニングは、最
初にプラスミド上に位置すると特徴付けたＲ−Ｍ系を
Ｅ． ｃｏｌｉに導入してプラスミドをクローニングす
ることを含む［ＥｃｏＲＶ： Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．， １２， ｐｐ．３６５９−３６７６（１９８
４）； ＰａｅＲ７： Ｇｉｎｇｅｒａｓ ａｎｄ Ｂ
ｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ， ８０，ｐｐ．４０２−４０６（１９８
３）； Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ ａｎｄ Ｒｏｙ，Ｇｅｎ
ｅ， １９， ｐｐ．３５５−３５９（１９８２）；
ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６４， ｐｐ．５０
１−５０９（１９８５）］。この方法では、プラスミド
を消化及び連結反応の前に精製するので供給源ＤＮＡの
複雑さが低減する。そこで系の単離は、サブクローニン
グによって得られたライブラリーを特徴付け、選択を行
なうことを含む。この方法も、殆どのＲ−Ｍ系が細菌の
プラスミド上ではなく染色体上に位置することを初めと
する幾つかの限界を有する。
初にプラスミド上に位置すると特徴付けたＲ−Ｍ系を
Ｅ． ｃｏｌｉに導入してプラスミドをクローニングす
ることを含む［ＥｃｏＲＶ： Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．， １２， ｐｐ．３６５９−３６７６（１９８
４）； ＰａｅＲ７： Ｇｉｎｇｅｒａｓ ａｎｄ Ｂ
ｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ， ８０，ｐｐ．４０２−４０６（１９８
３）； Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ ａｎｄ Ｒｏｙ，Ｇｅｎ
ｅ， １９， ｐｐ．３５５−３５９（１９８２）；
ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６４， ｐｐ．５０
１−５０９（１９８５）］。この方法では、プラスミド
を消化及び連結反応の前に精製するので供給源ＤＮＡの
複雑さが低減する。そこで系の単離は、サブクローニン
グによって得られたライブラリーを特徴付け、選択を行
なうことを含む。この方法も、殆どのＲ−Ｍ系が細菌の
プラスミド上ではなく染色体上に位置することを初めと
する幾つかの限界を有する。
【００１４】現在最も好ましい方法であるベクター修飾
法は、各個のタイプＩＩ系の制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子と修飾メチラーゼ遺伝子とは連結しており、その際
まずメチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順で逐次発
現するという仮定に基づいている。即ち、メチラーゼポ
ジティブクローン集団内の幾つかのクローンは対応する
エンドヌクレアーゼ遺伝子をも担っているはずである。
メチラーゼ選択法として公知であるこの方法はＷｉｌｓ
ｏｎによって初めて、制限酵素ＨａｅＩＩ、ＴａｑＩ、
ＢａｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ及びＭｓｐＩの
Ｒ−Ｍ系のクローニングに有効に適用された（ヨーロッ
パ特許出願公開第０１９３４１３号）。
法は、各個のタイプＩＩ系の制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子と修飾メチラーゼ遺伝子とは連結しており、その際
まずメチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順で逐次発
現するという仮定に基づいている。即ち、メチラーゼポ
ジティブクローン集団内の幾つかのクローンは対応する
エンドヌクレアーゼ遺伝子をも担っているはずである。
メチラーゼ選択法として公知であるこの方法はＷｉｌｓ
ｏｎによって初めて、制限酵素ＨａｅＩＩ、ＴａｑＩ、
ＢａｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ及びＭｓｐＩの
Ｒ−Ｍ系のクローニングに有効に適用された（ヨーロッ
パ特許出願公開第０１９３４１３号）。
【００１５】しかし、幾つかのＲ−Ｍ系はマルチステッ
プクローニング法を必要とした。例えば、新しいＲ−Ｍ
系獲得の際に幾種かの細胞は安定性の問題に直面するこ
とが判明した。メチラーゼがエンドヌクレアーゼに優先
しないと、細胞は自己の細胞ＤＮＡが切断される危険に
晒される。Ｅ． ｃｏｌｉは、自己ＤＮＡの修復によっ
てこの問題に対処すると考えられ、明らかなトラウマを
有することなく多くのクローンＲ−Ｍ系に順応し得る。
しかし、総ての系に容易に順応するわけではない。例え
ば制限酵素ＤｄｅＩ及びＢａｍＨＩのＲ−Ｍ系は単一ス
テップではクローニングされ得ず、三つのクローニング
ステツプが必要であった［Ｈｏｗａｒｄｅｔ ａ１．，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４，
ｐｐ．７９３９−７９５１（１９８８）］。実際、メチ
ラーゼ遺伝子のみをクローニングしたＲ−Ｍ系は多い。
そのような系は制限酵素ＢａｍＨＩ及びＤｄｅＩの系に
類似し得、同様のクローニング法を必要とし得る。
プクローニング法を必要とした。例えば、新しいＲ−Ｍ
系獲得の際に幾種かの細胞は安定性の問題に直面するこ
とが判明した。メチラーゼがエンドヌクレアーゼに優先
しないと、細胞は自己の細胞ＤＮＡが切断される危険に
晒される。Ｅ． ｃｏｌｉは、自己ＤＮＡの修復によっ
てこの問題に対処すると考えられ、明らかなトラウマを
有することなく多くのクローンＲ−Ｍ系に順応し得る。
しかし、総ての系に容易に順応するわけではない。例え
ば制限酵素ＤｄｅＩ及びＢａｍＨＩのＲ−Ｍ系は単一ス
テップではクローニングされ得ず、三つのクローニング
ステツプが必要であった［Ｈｏｗａｒｄｅｔ ａ１．，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４，
ｐｐ．７９３９−７９５１（１９８８）］。実際、メチ
ラーゼ遺伝子のみをクローニングしたＲ−Ｍ系は多い。
そのような系は制限酵素ＢａｍＨＩ及びＤｄｅＩの系に
類似し得、同様のクローニング法を必要とし得る。
【００１６】上述の方法を一つ以上実施することによっ
て幾種かのクローンが得られる［Ｗｉｌｓｏｎ， Ｇｅ
ｎｅ， ７４， ｐｐ．２８１−２８９（１９８８）参
照］が、タイプＩＩのＲ−Ｍ系のクローニングに困難が
無いわけではない。特に、多くのＲ−Ｍ系の遺伝学的特
性は比較的複雑であることが判明したし、また例えばベ
クター修飾によって得られたメチラーゼポジティブクロ
ーンは対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子をもたらさな
かった［Ｗｉｌｓｏｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎＧｅｎｅ
ｔｉｃｓ， ４， ｐｐ．３１４−３１８（１９８８）
及びＬｕｎｎｅｎ ｅｔ ａ１．， Ｇｅｎｅ， ７
４， ｐｐ．２５−３２（１９８８）参照］。実際、ベ
クター修飾を用いるＲ−Ｍ系クローニングでは多大の障
害が出来する。例えば、幾つかのＲ−Ｍ系ではメチラー
ゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とが連結しておら
ず、即ち細菌ＤＮＡの断片化に用いられるエンドヌクレ
アーゼがＲ−Ｍ遺伝子の一方または両方を切断する恐れ
が有る。また、制限酵素がＢａｍＨＩ及びＤｄｅＩであ
るようなＲ−Ｍ系ではメチラーゼが、形質転換宿主での
発現が不十分であるために、または固有のメチラーゼ遺
伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子発現制御機構のゆえ
に、あるいはまた未知の理由から、対応するエンドヌク
レアーゼによる消化を十分に防御しない恐れが有る。修
飾が形質転換のために選択した宿主細胞に有害なことも
有り得る。クローニングしようとするエンドヌクレアー
ゼがメチラーゼ選択に十分な純度または量で得られない
恐れも有る。多くのＲ−Ｍ系において、異なる細菌種の
形質転換宿主細胞内でエンドヌクレアーゼ遺伝子を発現
させることでも困難が生じる。
て幾種かのクローンが得られる［Ｗｉｌｓｏｎ， Ｇｅ
ｎｅ， ７４， ｐｐ．２８１−２８９（１９８８）参
照］が、タイプＩＩのＲ−Ｍ系のクローニングに困難が
無いわけではない。特に、多くのＲ−Ｍ系の遺伝学的特
性は比較的複雑であることが判明したし、また例えばベ
クター修飾によって得られたメチラーゼポジティブクロ
ーンは対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子をもたらさな
かった［Ｗｉｌｓｏｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎＧｅｎｅ
ｔｉｃｓ， ４， ｐｐ．３１４−３１８（１９８８）
及びＬｕｎｎｅｎ ｅｔ ａ１．， Ｇｅｎｅ， ７
４， ｐｐ．２５−３２（１９８８）参照］。実際、ベ
クター修飾を用いるＲ−Ｍ系クローニングでは多大の障
害が出来する。例えば、幾つかのＲ−Ｍ系ではメチラー
ゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とが連結しておら
ず、即ち細菌ＤＮＡの断片化に用いられるエンドヌクレ
アーゼがＲ−Ｍ遺伝子の一方または両方を切断する恐れ
が有る。また、制限酵素がＢａｍＨＩ及びＤｄｅＩであ
るようなＲ−Ｍ系ではメチラーゼが、形質転換宿主での
発現が不十分であるために、または固有のメチラーゼ遺
伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子発現制御機構のゆえ
に、あるいはまた未知の理由から、対応するエンドヌク
レアーゼによる消化を十分に防御しない恐れが有る。修
飾が形質転換のために選択した宿主細胞に有害なことも
有り得る。クローニングしようとするエンドヌクレアー
ゼがメチラーゼ選択に十分な純度または量で得られない
恐れも有る。多くのＲ−Ｍ系において、異なる細菌種の
形質転換宿主細胞内でエンドヌクレアーゼ遺伝子を発現
させることでも困難が生じる。
【００１７】比較的複雑なタイプＩＩＲ−Ｍ系のクロー
ニングに上述のような困難が存在するにもかかわらず、
ベクター修飾選択法（Ｌｕｎｎｅｎ ｅｔ ａ１．，
ｏｐ． ｃｉｔ．参照）を改良し、及び／またはマル
チステップクローニング法を用いることによって幾種か
のエンドヌクレアーゼ遺伝子を得ることができる。上述
の諸方法に、例えば多数のライブラリーを形成するこ
と、新しいクローニングベクターを構成すること、メチ
ラーゼ選択ステップにイソシゾマーを用いること、メチ
ラーゼ遺伝子及び／またはエンドヌクレアーゼ遺伝子を
マッピングして対応するＤＮＡ配列を決定し、このＤＮ
Ａ配列をハイブリダイゼーションプローブとして用いる
こと等の様々な改変を加えることによって、幾種かの扱
いにくい組み換え体Ｒ−Ｍ系を得た。
ニングに上述のような困難が存在するにもかかわらず、
ベクター修飾選択法（Ｌｕｎｎｅｎ ｅｔ ａ１．，
ｏｐ． ｃｉｔ．参照）を改良し、及び／またはマル
チステップクローニング法を用いることによって幾種か
のエンドヌクレアーゼ遺伝子を得ることができる。上述
の諸方法に、例えば多数のライブラリーを形成するこ
と、新しいクローニングベクターを構成すること、メチ
ラーゼ選択ステップにイソシゾマーを用いること、メチ
ラーゼ遺伝子及び／またはエンドヌクレアーゼ遺伝子を
マッピングして対応するＤＮＡ配列を決定し、このＤＮ
Ａ配列をハイブリダイゼーションプローブとして用いる
こと等の様々な改変を加えることによって、幾種かの扱
いにくい組み換え体Ｒ−Ｍ系を得た。
【００１８】しかし、いずれのタイプＩＩＲ−Ｍ系クロ
ーニング法を実施するにせよ、任意の特定Ｒ−Ｍ系のク
ローニングに場合によって必要となり得るのが従来方法
のいずれのどのような改変もしくは改良であるかすら明
らかでない。例えば、特定系の詳細な遺伝学的特性は普
通未知である。タイプＩＩ系の制限エンドヌクレアーゼ
及び修飾メチラーゼの遺伝子はゲノム上に、４種の可能
な位置関係のいずれかで存在し得る（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｓｕｐｒ
ａ）。酵素及び対応する遺伝子の大きさは、ＤＮＡ配列
及びアミノ酸配列同様個々のＲ−Ｍ系毎にきわめて様々
である。実際、互いにイソシゾマーである制限エンドヌ
クレアーゼがさほどの類似性を示さないことが判明して
いる［ｉｄ．， ｐ．３１８及びＣｈａｎｄｒａｓｅｇ
ｅｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎ
ｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｖｏｌ．Ｉ， ｐｐ．１
４９−１５６， Ａｄｅｎｉｎｅ Ｐｒｅｓｓ（１９８
８）参照］。
ーニング法を実施するにせよ、任意の特定Ｒ−Ｍ系のク
ローニングに場合によって必要となり得るのが従来方法
のいずれのどのような改変もしくは改良であるかすら明
らかでない。例えば、特定系の詳細な遺伝学的特性は普
通未知である。タイプＩＩ系の制限エンドヌクレアーゼ
及び修飾メチラーゼの遺伝子はゲノム上に、４種の可能
な位置関係のいずれかで存在し得る（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｓｕｐｒ
ａ）。酵素及び対応する遺伝子の大きさは、ＤＮＡ配列
及びアミノ酸配列同様個々のＲ−Ｍ系毎にきわめて様々
である。実際、互いにイソシゾマーである制限エンドヌ
クレアーゼがさほどの類似性を示さないことが判明して
いる［ｉｄ．， ｐ．３１８及びＣｈａｎｄｒａｓｅｇ
ｅｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎ
ｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｖｏｌ．Ｉ， ｐｐ．１
４９−１５６， Ａｄｅｎｉｎｅ Ｐｒｅｓｓ（１９８
８）参照］。
【００１９】制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び修飾メ
チラーゼ遺伝子の発現を制御する機構も、個々のタイプ
ＩＩ系毎にきわめて様々である。例えばエンドヌクレア
ーゼ遺伝子の発現は、ＡｖａＩＩ系、ＨａｅＩＩ系、Ｈ
ｉｎｆＩ系、ＰｓｔＩ系及びＸｂａＩ系では修飾依存性
である。また、ＴａｑＩ系でそうであるように、エンド
ヌクレアーゼ遺伝子が有する該遺伝子自身の認識部位は
対応するメチラーゼ遺伝子に比べて多数である（ｉ
ｄ．）。
チラーゼ遺伝子の発現を制御する機構も、個々のタイプ
ＩＩ系毎にきわめて様々である。例えばエンドヌクレア
ーゼ遺伝子の発現は、ＡｖａＩＩ系、ＨａｅＩＩ系、Ｈ
ｉｎｆＩ系、ＰｓｔＩ系及びＸｂａＩ系では修飾依存性
である。また、ＴａｑＩ系でそうであるように、エンド
ヌクレアーゼ遺伝子が有する該遺伝子自身の認識部位は
対応するメチラーゼ遺伝子に比べて多数である（ｉ
ｄ．）。
【００２０】目的Ｒ−Ｍ系を持つクローンを得るべく細
胞を形質転換する際、細胞ＤＮＡは最初修飾されておら
ず、従って目的エンドヌクレアーゼにより消化される危
険に晒されている。形質転換宿主細胞はＤＮＡ修復系を
有するか、または目的エンドヌクレアーゼの発現を修飾
完了まで遅延させ得なければならない。形質転換宿主が
上記いずれの機構も有しなければ、クローン遺伝子を宿
主内で安定化するうえで問題が生じる。先に指摘したよ
うに、ＤｄｅＩ系及びＢａｍＨＩ系のクローニングで安
定化の問題が生じた時、形質転換宿主細胞のＤＮＡを保
護するためにメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ
遺伝子を逐次導入しなければならなかった［Ｈｏｗａｒ
ｄ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ及びＢｒ
ｏｏｋｓｅｔ ａ１．， Ｇｅｎｅ， ７４， ｐ．１
３（１９８８）］。しかし、Ｒ−Ｍ系の或るものはその
クローニングのあらゆる試みに抵抗したし、またおそら
く安定化が困難であるためにメチラーゼ遺伝子のクロー
ニングしかできないＲ−Ｍ系も有った（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ４，
ｐ．３１７）。
胞を形質転換する際、細胞ＤＮＡは最初修飾されておら
ず、従って目的エンドヌクレアーゼにより消化される危
険に晒されている。形質転換宿主細胞はＤＮＡ修復系を
有するか、または目的エンドヌクレアーゼの発現を修飾
完了まで遅延させ得なければならない。形質転換宿主が
上記いずれの機構も有しなければ、クローン遺伝子を宿
主内で安定化するうえで問題が生じる。先に指摘したよ
うに、ＤｄｅＩ系及びＢａｍＨＩ系のクローニングで安
定化の問題が生じた時、形質転換宿主細胞のＤＮＡを保
護するためにメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ
遺伝子を逐次導入しなければならなかった［Ｈｏｗａｒ
ｄ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ及びＢｒ
ｏｏｋｓｅｔ ａ１．， Ｇｅｎｅ， ７４， ｐ．１
３（１９８８）］。しかし、Ｒ−Ｍ系の或るものはその
クローニングのあらゆる試みに抵抗したし、またおそら
く安定化が困難であるためにメチラーゼ遺伝子のクロー
ニングしかできないＲ−Ｍ系も有った（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ４，
ｐ．３１７）。
【００２１】形質転換宿主細胞が外来型の修飾を制限す
る系を有する場合も有ることが判明している。例えば、
Ｅ． ｃｏｌｉでは修飾ＤＮＡを制限する２種の系、即
ちメチルシトシンを有するＤＮＡを制限するｍｃｒ系と
メチルアデニンを有するＤＮＡを制限するｍｒｒ系とが
同定された。従って普通、上記二つの系に欠けるＥ．ｃ
ｏｌｉ株を用いなければならない。付加的な宿主細胞制
限系の存在は、Ｒ−Ｍ系のクローニングを困難にする一
因ともなり得る。
る系を有する場合も有ることが判明している。例えば、
Ｅ． ｃｏｌｉでは修飾ＤＮＡを制限する２種の系、即
ちメチルシトシンを有するＤＮＡを制限するｍｃｒ系と
メチルアデニンを有するＤＮＡを制限するｍｒｒ系とが
同定された。従って普通、上記二つの系に欠けるＥ．ｃ
ｏｌｉ株を用いなければならない。付加的な宿主細胞制
限系の存在は、Ｒ−Ｍ系のクローニングを困難にする一
因ともなり得る。
【００２２】制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラー
ゼは実験室でのＤＮＡの特徴付け及び再構成に有用な道
具であるので、これら２酵素を実質的に純粋な形態で豊
富に製造することが商業的に求められている。本発明に
よる組み換え体ＤＮＡ技術を用いれば、制限エンドヌク
レアーゼＮｌａＩＩＩと対応する修飾メチラーゼとを簡
単に、かつ商業的に有用な量で製造することができる。
ゼは実験室でのＤＮＡの特徴付け及び再構成に有用な道
具であるので、これら２酵素を実質的に純粋な形態で豊
富に製造することが商業的に求められている。本発明に
よる組み換え体ＤＮＡ技術を用いれば、制限エンドヌク
レアーゼＮｌａＩＩＩと対応する修飾メチラーゼとを簡
単に、かつ商業的に有用な量で製造することができる。
【００２３】
【発明の概要】本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃ
ｔａｍｉｃａ（ＮＲＣＣ ２１１８）に由来する制限酵
素ＮｌａＩＩＩのタイプＩＩＲ−Ｍ系に係わる。酵素Ｎ
ｌａＩＩＩはＤＮＡの５′ＣＡＴＧ３′配列を認識し、
Ｇの３′側を切断して四塩基３′末端延長部（５′ＣＡ
ＴＧ／３′）をもたらす［その開示が本明細書に参考と
して含まれるＱｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｄｋｒａ
ｕｔ， ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １
４， ｐｐ．１９９１−１９９９（１９８６）参照］。
ｔａｍｉｃａ（ＮＲＣＣ ２１１８）に由来する制限酵
素ＮｌａＩＩＩのタイプＩＩＲ−Ｍ系に係わる。酵素Ｎ
ｌａＩＩＩはＤＮＡの５′ＣＡＴＧ３′配列を認識し、
Ｇの３′側を切断して四塩基３′末端延長部（５′ＣＡ
ＴＧ／３′）をもたらす［その開示が本明細書に参考と
して含まれるＱｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｄｋｒａ
ｕｔ， ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １
４， ｐｐ．１９９１−１９９９（１９８６）参照］。
【００２４】本発明は、Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ（Ｎ
ＲＣＣ ２１１８）から得られる制限エンドヌクレアー
ゼＮｌａＩＩＩ及び対応する修飾メチラーゼをコードす
る組み換え体ＤＮＡ、及びこの組み換え体ＤＮＡの製造
方法を提供する。本発明はまた、制限エンドヌクレアー
ゼＮｌａＩＩＩ及び対応する修飾メチラーゼを実質的に
純粋な形態で製造する方法も提供する。
ＲＣＣ ２１１８）から得られる制限エンドヌクレアー
ゼＮｌａＩＩＩ及び対応する修飾メチラーゼをコードす
る組み換え体ＤＮＡ、及びこの組み換え体ＤＮＡの製造
方法を提供する。本発明はまた、制限エンドヌクレアー
ゼＮｌａＩＩＩ及び対応する修飾メチラーゼを実質的に
純粋な形態で製造する方法も提供する。
【００２５】
【好ましい具体例の説明】本発明は、制限エンドヌクレ
アーゼであるＮｌａＩＩＩとこれに対応する修飾メチラ
ーゼ、即ちＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＮ
ｌａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードする組み換え体ＤＮ
Ａを得る詳細方法と、前記組み換え体ＤＮＡを発現させ
て対応する酵素を得る詳細方法とを提供する。本発明の
組み換え体ＤＮＡは適当な細菌宿主細胞に導入して該細
胞の形質転換に用い得、それによってＮｌａＩＩＩエン
ドヌクレアーゼ及びＮｌａＩＩＩメチラーゼを商業用と
して実質的に純粋な形態で大量に製造することが可能と
なる。
アーゼであるＮｌａＩＩＩとこれに対応する修飾メチラ
ーゼ、即ちＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＮ
ｌａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードする組み換え体ＤＮ
Ａを得る詳細方法と、前記組み換え体ＤＮＡを発現させ
て対応する酵素を得る詳細方法とを提供する。本発明の
組み換え体ＤＮＡは適当な細菌宿主細胞に導入して該細
胞の形質転換に用い得、それによってＮｌａＩＩＩエン
ドヌクレアーゼ及びＮｌａＩＩＩメチラーゼを商業用と
して実質的に純粋な形態で大量に製造することが可能と
なる。
【００２６】本発明によれば、ＮｌａＩＩＩエンドヌク
レアーゼ及びＮｌａＩＩＩメチラーゼをコードする組み
換え体ＤＮＡは、ヨーロッパ特許出願公開第０１９３４
１３号に開示されたベクター修飾法を改良した方法を用
いることによって得られる。制限酵素ＮｌａＩＩＩのＲ
−Ｍ系は通常、上記ヨーロッパ特許出願公開に開示され
ているようなこれまでに単離されたタイプＩＩＲ−Ｍ系
より複雑であることが本発明により判明した。ＮｌａＩ
ＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラー
ゼ遺伝子とは連結していることが最終的に判明したが、
ベクター修飾を用いて得られたいずれのクローンにおい
てもエンドヌクレアーゼ遺伝子は完全な形ではなかっ
た。
レアーゼ及びＮｌａＩＩＩメチラーゼをコードする組み
換え体ＤＮＡは、ヨーロッパ特許出願公開第０１９３４
１３号に開示されたベクター修飾法を改良した方法を用
いることによって得られる。制限酵素ＮｌａＩＩＩのＲ
−Ｍ系は通常、上記ヨーロッパ特許出願公開に開示され
ているようなこれまでに単離されたタイプＩＩＲ−Ｍ系
より複雑であることが本発明により判明した。ＮｌａＩ
ＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラー
ゼ遺伝子とは連結していることが最終的に判明したが、
ベクター修飾を用いて得られたいずれのクローンにおい
てもエンドヌクレアーゼ遺伝子は完全な形ではなかっ
た。
【００２７】制限地図を調べて、ＮｌａＩＩＩメチラー
ゼ遺伝子がＮ． ｌａｃｔａｍｉｃａのゲノム上の約１
３００塩基対の領域に位置することを確認した。この領
域の上流（５′側）のメチラーゼクローンは総て、Ｎｌ
ａＩＩＩメチラーゼ遺伝子領域の塩基対約４１５個以内
で終っていた。
ゼ遺伝子がＮ． ｌａｃｔａｍｉｃａのゲノム上の約１
３００塩基対の領域に位置することを確認した。この領
域の上流（５′側）のメチラーゼクローンは総て、Ｎｌ
ａＩＩＩメチラーゼ遺伝子領域の塩基対約４１５個以内
で終っていた。
【００２８】これに対して、メチラーゼ遺伝子下流
（３′側）のクローンのＤＮＡ鎖長は３７００塩基対ま
でで様々であった。従って、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子とが連結
する場合、エンドヌクレアーゼ遺伝子はメチラーゼ遺伝
子の上流（５′側）に位置すると考えられた。
（３′側）のクローンのＤＮＡ鎖長は３７００塩基対ま
でで様々であった。従って、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子とが連結
する場合、エンドヌクレアーゼ遺伝子はメチラーゼ遺伝
子の上流（５′側）に位置すると考えられた。
【００２９】ゲノムの上流領域に位置する全メチラーゼ
クローンの長さが揃う現象は、タイプＩＩＲ−Ｍ系のク
ローニングではこれまで観察されなかった。これについ
ては幾つかの説明が成り立ち得る。ＮｌａＩＩＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子と
が連結しなかったのかもしれないし、あるいはまた両遺
伝子を宿主細胞に同時に導入することが致命的であった
のかもしれない。
クローンの長さが揃う現象は、タイプＩＩＲ−Ｍ系のク
ローニングではこれまで観察されなかった。これについ
ては幾つかの説明が成り立ち得る。ＮｌａＩＩＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子と
が連結しなかったのかもしれないし、あるいはまた両遺
伝子を宿主細胞に同時に導入することが致命的であった
のかもしれない。
【００３０】未知の理由から、ＮｌａＩＩＩメチラーゼ
遺伝子を持つクローンからＮｌａＩＩＩエンドヌクレア
ーゼ遺伝子を損傷無しにクローニングすることはできな
かった。従って、エンドヌクレアーゼ遺伝子の小片をク
ローニングし、組み換え技術を用いて遺伝子を再構成し
なければならなかった。
遺伝子を持つクローンからＮｌａＩＩＩエンドヌクレア
ーゼ遺伝子を損傷無しにクローニングすることはできな
かった。従って、エンドヌクレアーゼ遺伝子の小片をク
ローニングし、組み換え技術を用いて遺伝子を再構成し
なければならなかった。
【００３１】エンドヌクレアーゼ遺伝子がメチラーゼ遺
伝子に連結しているという仮定に基づき、ＮｌａＩＩＩ
メチラーゼ遺伝子から上流のＤＮＡを配列決定した。Ｎ
ｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子に隣接する５２０塩基対の
転写解読枠が見いだされた。
伝子に連結しているという仮定に基づき、ＮｌａＩＩＩ
メチラーゼ遺伝子から上流のＤＮＡを配列決定した。Ｎ
ｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子に隣接する５２０塩基対の
転写解読枠が見いだされた。
【００３２】Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡの
制限位置の地図をサザン法で作成し、その際プローブと
してＮｌａＩＩＩメチラーゼクローンと、５２０塩基対
転写解読枠の、エンドヌクレアーゼの推定カルボキシル
末端に対応する部分と相補的である合成オリゴヌクレオ
チドとを用いた。プローブとのハイブリッドを形成し、
推定エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分な
ＤＮＡを含む制限断片を同定した。
制限位置の地図をサザン法で作成し、その際プローブと
してＮｌａＩＩＩメチラーゼクローンと、５２０塩基対
転写解読枠の、エンドヌクレアーゼの推定カルボキシル
末端に対応する部分と相補的である合成オリゴヌクレオ
チドとを用いた。プローブとのハイブリッドを形成し、
推定エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分な
ＤＮＡを含む制限断片を同定した。
【００３３】推定エンドヌクレアーゼ遺伝子のアミノ末
端に対応するＤＮＡを十分量単離し、分離したベクター
に導入してサブクローニングを施した。推定エンドヌク
レアーゼ遺伝子の二つの部分を結合し、予めＮｌａＩＩ
Ｉメチラーゼ遺伝子を導入した宿主細胞に導入してクロ
ーニングした。
端に対応するＤＮＡを十分量単離し、分離したベクター
に導入してサブクローニングを施した。推定エンドヌク
レアーゼ遺伝子の二つの部分を結合し、予めＮｌａＩＩ
Ｉメチラーゼ遺伝子を導入した宿主細胞に導入してクロ
ーニングした。
【００３４】この前もっての修飾操作は、有効ではある
が厳密には必要ないことが後に判明した。ＮｌａＩＩＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺
伝子との両方を有するプラスミドと共にＮｌａＩＩＩメ
チラーゼ遺伝子のみを有する第二の適合プラスミドを用
いて形質転換を行なえば、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレア
ーゼ遺伝子を未修飾の宿主細胞に、低頻度においてでは
あるが導入することが可能である。
が厳密には必要ないことが後に判明した。ＮｌａＩＩＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子とＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺
伝子との両方を有するプラスミドと共にＮｌａＩＩＩメ
チラーゼ遺伝子のみを有する第二の適合プラスミドを用
いて形質転換を行なえば、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレア
ーゼ遺伝子を未修飾の宿主細胞に、低頻度においてでは
あるが導入することが可能である。
【００３５】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子とＮｌａＩＩＩ修飾メチラーゼ遺伝子とを有する組み
換え体ＤＮＡをクローニングする好ましい方法を図１に
示し、かつ以下に詳述する。
子とＮｌａＩＩＩ修飾メチラーゼ遺伝子とを有する組み
換え体ＤＮＡをクローニングする好ましい方法を図１に
示し、かつ以下に詳述する。
【００３６】Ａ．ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子のクロ
ーニング Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａのゲノムＤＮＡを公知方法で
精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで部分的に消化
する。ゲノムライブラリーの形成に適した制限エンドヌ
クレアーゼはＨｉｎＰＩである。消化したゲノムＤＮＡ
を、いずれもＮｌａＩＩＩの認識配列を含む一つ以上の
ＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩ認識部位を有
するクローニングベクターと連結させる。ＢｓｐＨＩ認
識部位及びＳｐｈＩ認識部位はＮｌａＩＩＩ認識配列の
サブセットであり、ＮｌａＩＩＩメチル化によってブロ
ックされる。理論上は、ＮｃｏＩもＮｌａＩＩＩのサブ
セットであるので選択に用い得る。しかし、ＮｃｏＩは
ＮｌａＩＩＩメチラーゼに非感受性であり、従ってＮｌ
ａＩＩＩクローンの選択に用いることはできないことが
判明した。好ましいクローニングベクターはｐＵＣ１９
であるが、ＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩ認
識部位を有するものであれば他のクローニングベクター
を用いることも可能である。そのようなベクターとして
は、ｐＢＲ３２２とその誘導体、ｐＡＣＹＣ１７７また
は１８４等が挙げられる。得られた連結ＤＮＡをＥ．
ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴＣＣ ３１３４３）またはＥ．
ｃｏｌｉ ＥＲｌ３９８などの適当な細菌宿主に導入
し、宿主細胞を形質転換する。Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃ
ａのＤＮＡを制限しないか、またはメチラーゼ遺伝子の
クローニングを妨害しない他の細菌宿主も用い得る。形
質転換細胞を、抗生物質その他の選択圧保有物質を含有
する培地上へのプレーティングによって選択する。クロ
ーニングベクターとして例えばｐＵＣ１９を用いた場合
は、形質転換細胞の選択はアンピシリンを含有するＬｕ
ｒｉａ寒天上へのプレーティングによって行なう。
ーニング Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａのゲノムＤＮＡを公知方法で
精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで部分的に消化
する。ゲノムライブラリーの形成に適した制限エンドヌ
クレアーゼはＨｉｎＰＩである。消化したゲノムＤＮＡ
を、いずれもＮｌａＩＩＩの認識配列を含む一つ以上の
ＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩ認識部位を有
するクローニングベクターと連結させる。ＢｓｐＨＩ認
識部位及びＳｐｈＩ認識部位はＮｌａＩＩＩ認識配列の
サブセットであり、ＮｌａＩＩＩメチル化によってブロ
ックされる。理論上は、ＮｃｏＩもＮｌａＩＩＩのサブ
セットであるので選択に用い得る。しかし、ＮｃｏＩは
ＮｌａＩＩＩメチラーゼに非感受性であり、従ってＮｌ
ａＩＩＩクローンの選択に用いることはできないことが
判明した。好ましいクローニングベクターはｐＵＣ１９
であるが、ＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩ認
識部位を有するものであれば他のクローニングベクター
を用いることも可能である。そのようなベクターとして
は、ｐＢＲ３２２とその誘導体、ｐＡＣＹＣ１７７また
は１８４等が挙げられる。得られた連結ＤＮＡをＥ．
ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴＣＣ ３１３４３）またはＥ．
ｃｏｌｉ ＥＲｌ３９８などの適当な細菌宿主に導入
し、宿主細胞を形質転換する。Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃ
ａのＤＮＡを制限しないか、またはメチラーゼ遺伝子の
クローニングを妨害しない他の細菌宿主も用い得る。形
質転換細胞を、抗生物質その他の選択圧保有物質を含有
する培地上へのプレーティングによって選択する。クロ
ーニングベクターとして例えばｐＵＣ１９を用いた場合
は、形質転換細胞の選択はアンピシリンを含有するＬｕ
ｒｉａ寒天上へのプレーティングによって行なう。
【００３７】組み換え体プラスミドはアンピシリン耐性
で、かつＮ． １ａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡ由来の
挿入断片を担持するべきである。アンピシリン耐性コロ
ニーをプールして一次細胞ライブラリーを形成する。プ
ールしたコロニーにおいて、組み換え体プラスミドを形
質転換宿主のゲノムＤＮＡから、ＣｓＣＩ及びエチジウ
ムブロミドを用いる密度勾配遠心法のような公知方法で
精製分離する。精製した組み換え体プラスミドは一次プ
ラスミドライブラリーを構成する。
で、かつＮ． １ａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡ由来の
挿入断片を担持するべきである。アンピシリン耐性コロ
ニーをプールして一次細胞ライブラリーを形成する。プ
ールしたコロニーにおいて、組み換え体プラスミドを形
質転換宿主のゲノムＤＮＡから、ＣｓＣＩ及びエチジウ
ムブロミドを用いる密度勾配遠心法のような公知方法で
精製分離する。精製した組み換え体プラスミドは一次プ
ラスミドライブラリーを構成する。
【００３８】一次プラスミドライブラリーを、ＮｌａＩ
ＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩのような適当エンドヌ
クレアーゼで完全に消化する。ＮｌａＩＩＩ認識部位
（ＣＡＴＧ）はＢｓｐＨＩ認識部位（ＴＣＡＴＧＡ）及
びＳｐｈＩ認識部位（ＧＣＡＴＧＣ）に含まれている。
本発明によれば、ＮｌａＩＩＩメチラーゼでのメチル化
はエンドヌクレアーゼＢｓｐＨＩ及びＳｐｈＩでの消化
からもＤＮＡを防護することが判明した。
ＩＩ、ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩのような適当エンドヌ
クレアーゼで完全に消化する。ＮｌａＩＩＩ認識部位
（ＣＡＴＧ）はＢｓｐＨＩ認識部位（ＴＣＡＴＧＡ）及
びＳｐｈＩ認識部位（ＧＣＡＴＧＣ）に含まれている。
本発明によれば、ＮｌａＩＩＩメチラーゼでのメチル化
はエンドヌクレアーゼＢｓｐＨＩ及びＳｐｈＩでの消化
からもＤＮＡを防護することが判明した。
【００３９】即ち、エンドヌクレアーゼＮｌａＩＩＩ、
ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩでの消化はＮｌａＩＩＩメチ
ラーゼで修飾していないＤＮＡを特異的に破壊し、その
結果一次プラスミドライブラリーにおいてＮｌａＩＩＩ
メチラーゼ遺伝子を有するプラスミドの比率が高まる。
ＢｓｐＨＩまたはＳｐｈＩでの消化はＮｌａＩＩＩメチ
ラーゼで修飾していないＤＮＡを特異的に破壊し、その
結果一次プラスミドライブラリーにおいてＮｌａＩＩＩ
メチラーゼ遺伝子を有するプラスミドの比率が高まる。
【００４０】ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子に関して濃
縮したプラスミドライブラリーを再びＥ． ｃｏｌｉ
ＲＲ１などの適当な細菌宿主に導入し、宿主細胞の形質
転換を行なう。形質転換細胞を、アンピシリン含有のＬ
−寒天のような選択培地上へのプレーティングによって
回収する。生存コロニーのＤＮＡを、エンドヌクレアー
ゼＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩ及び／またはＳｐｈＩでの
消化によりＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子の存在に関し
て解析する。この解析は、精製プラスミドＤＮＡと全細
胞（ゲノム及びプラスミド）ＤＮＡとの両方について行
なう。ＮｌａＩＩＩ修飾遺伝子を持つクローンは完全に
修飾されたＮｌａＩＩＩ認識部位を有し、プラスミドＤ
ＮＡもゲノムＤＮＡもエンドヌクレアーゼＮｌａＩＩ
Ｉ、ＢｓｐＨＩ及びＳｐｈＩでの消化に実質的に耐性で
ある。
縮したプラスミドライブラリーを再びＥ． ｃｏｌｉ
ＲＲ１などの適当な細菌宿主に導入し、宿主細胞の形質
転換を行なう。形質転換細胞を、アンピシリン含有のＬ
−寒天のような選択培地上へのプレーティングによって
回収する。生存コロニーのＤＮＡを、エンドヌクレアー
ゼＮｌａＩＩＩ、ＢｓｐＨＩ及び／またはＳｐｈＩでの
消化によりＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子の存在に関し
て解析する。この解析は、精製プラスミドＤＮＡと全細
胞（ゲノム及びプラスミド）ＤＮＡとの両方について行
なう。ＮｌａＩＩＩ修飾遺伝子を持つクローンは完全に
修飾されたＮｌａＩＩＩ認識部位を有し、プラスミドＤ
ＮＡもゲノムＤＮＡもエンドヌクレアーゼＮｌａＩＩ
Ｉ、ＢｓｐＨＩ及びＳｐｈＩでの消化に実質的に耐性で
ある。
【００４１】Ｂ．Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮ
Ａの制限位置のマッピング 或る種のタイプＩＩＲ−Ｍ系に固有の遺伝学的複雑さを
免れているとして、メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレア
ーゼ遺伝子とが連結すれば、メチラーゼ遺伝子の選択に
よってエンドヌクレアーゼ遺伝子を持つクローンも得ら
れるはずである。しかし、先に指摘したように制限酵素
ＮｌａＩＩＩのＲ−Ｍ系は比較的複雑であり、完全型エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子をもたらすＮｌａＩＩＩメチラ
ーゼ＋クローンは無かった。ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺
伝子とＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝子とが連結
しているかどうか、及びＮｌａＩＩＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子がＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子との関連でど
こに位置するかを決定するには、Ｎ． ｌａｃｔａｍｉ
ｃａゲノムのメチラーゼ領域の制限マップを作成しなけ
ればならない。
Ａの制限位置のマッピング 或る種のタイプＩＩＲ−Ｍ系に固有の遺伝学的複雑さを
免れているとして、メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレア
ーゼ遺伝子とが連結すれば、メチラーゼ遺伝子の選択に
よってエンドヌクレアーゼ遺伝子を持つクローンも得ら
れるはずである。しかし、先に指摘したように制限酵素
ＮｌａＩＩＩのＲ−Ｍ系は比較的複雑であり、完全型エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子をもたらすＮｌａＩＩＩメチラ
ーゼ＋クローンは無かった。ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺
伝子とＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝子とが連結
しているかどうか、及びＮｌａＩＩＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子がＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子との関連でど
こに位置するかを決定するには、Ｎ． ｌａｃｔａｍｉ
ｃａゲノムのメチラーゼ領域の制限マップを作成しなけ
ればならない。
【００４２】サザン法での制限マップ作成にはＮｌａＩ
ＩＩメチラーゼクローンそのものを用いる。メチラーゼ
クローンはメチラーゼ遺伝子の位置決定にも用いること
ができ、なぜならメチラーゼ遺伝子はあらゆるメチラー
ゼボジティブクローンに共通の最短ＤＮＡ配列内に位置
するからである。そこで、メチラーゼクローンを配列決
定することによって、メチラーゼ遺伝子の正確な位置及
び向きを決定し、エンドヌクレアーゼであると推定され
る転写解読枠を同定し、かつ推定エンドヌクレアーゼ遺
伝子またはメチラーゼ遺伝子のＮ． ｌａｃｔａｍｉｃ
ａ ＤＮＡと厳密に相補的であるオリゴヌクレオチドプ
ライマーの合成を導く。Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａのＤ
ＮＡをＲｓａＩ、ＭｂｏＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎＰＩ、Ｂ
ｓｓＨＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ等のような様々な制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、かつプローブとしてメチラーゼ
クローンまたは合成オリゴマーを用いるサザン法を行な
うことによって、Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａのＤＮＡの
メチラーゼ遺伝子から上流（５′側）の制限マップを作
成する。
ＩＩメチラーゼクローンそのものを用いる。メチラーゼ
クローンはメチラーゼ遺伝子の位置決定にも用いること
ができ、なぜならメチラーゼ遺伝子はあらゆるメチラー
ゼボジティブクローンに共通の最短ＤＮＡ配列内に位置
するからである。そこで、メチラーゼクローンを配列決
定することによって、メチラーゼ遺伝子の正確な位置及
び向きを決定し、エンドヌクレアーゼであると推定され
る転写解読枠を同定し、かつ推定エンドヌクレアーゼ遺
伝子またはメチラーゼ遺伝子のＮ． ｌａｃｔａｍｉｃ
ａ ＤＮＡと厳密に相補的であるオリゴヌクレオチドプ
ライマーの合成を導く。Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａのＤ
ＮＡをＲｓａＩ、ＭｂｏＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎＰＩ、Ｂ
ｓｓＨＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ等のような様々な制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、かつプローブとしてメチラーゼ
クローンまたは合成オリゴマーを用いるサザン法を行な
うことによって、Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａのＤＮＡの
メチラーゼ遺伝子から上流（５′側）の制限マップを作
成する。
【００４３】Ｃ．ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝
子の単離及び同定 ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４（Ａ
ＴＣＣ ３０７３３）のようなベクターに移入すると共
にｐＵＣ１９のような、複製起点が前記ベクターと異な
るので同一細胞内で複製可能である第二のベクターにも
移入することにより、ＮｌａＩＩＩメチラーゼで予め修
飾した宿主細胞を調製する。ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺
伝子を取り込んだベクターｐＡＣＹＣ１８４をＥ． ｃ
ｏｌｉＲＲ１に導入して細菌細胞を形質転換し、上記の
ようにメチラーゼクローンを選択する。このようにして
調製したメチラーゼ保有細胞はＮｌａＩＩＩエンドヌク
レアーゼ導入前に修飾されたそのＤＮＡ内にＮｌａＩＩ
Ｉ認識配列を有し、このことは上記第二のベクターに移
入したエンドヌクレアーゼをこの細胞に導入してクロー
ニングする際に細胞が生存する機会を増す。
子の単離及び同定 ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４（Ａ
ＴＣＣ ３０７３３）のようなベクターに移入すると共
にｐＵＣ１９のような、複製起点が前記ベクターと異な
るので同一細胞内で複製可能である第二のベクターにも
移入することにより、ＮｌａＩＩＩメチラーゼで予め修
飾した宿主細胞を調製する。ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺
伝子を取り込んだベクターｐＡＣＹＣ１８４をＥ． ｃ
ｏｌｉＲＲ１に導入して細菌細胞を形質転換し、上記の
ようにメチラーゼクローンを選択する。このようにして
調製したメチラーゼ保有細胞はＮｌａＩＩＩエンドヌク
レアーゼ導入前に修飾されたそのＤＮＡ内にＮｌａＩＩ
Ｉ認識配列を有し、このことは上記第二のベクターに移
入したエンドヌクレアーゼをこの細胞に導入してクロー
ニングする際に細胞が生存する機会を増す。
【００４４】Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡを
制限酵素、好ましくはＲｓａＩで消化して、完全なエン
ドヌクレアーゼ遺伝子かまたは少なくとも該遺伝子の、
メチラーゼクローンでは失われているアミノ末端部分を
含むＤＮＡ断片を調製する。ＲｓａＩ消化物は完全なＲ
−Ｍ遺伝子を含む２．０ｋｂ断片をもたらす。
制限酵素、好ましくはＲｓａＩで消化して、完全なエン
ドヌクレアーゼ遺伝子かまたは少なくとも該遺伝子の、
メチラーゼクローンでは失われているアミノ末端部分を
含むＤＮＡ断片を調製する。ＲｓａＩ消化物は完全なＲ
−Ｍ遺伝子を含む２．０ｋｂ断片をもたらす。
【００４５】ＲｓａＩ断片を低濃度で連結反応させてＤ
ＮＡを環状にする。このＮｌａ ＤＮＡ断片と相補的な
オリゴヌクレオチドプライマーを環状ＤＮＡにハイブリ
ダイズし、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする
ＤＮＡの濃度を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のよう
な遺伝子増幅技術を用いて高める。増幅によって、Ｎｌ
ａＩＩＩエンドヌクレアーゼまたはその一部をコードす
るＤＮＡの存在頻度が著しく高まり、即ち後述のように
そのようなクローンの同定が促進される。
ＮＡを環状にする。このＮｌａ ＤＮＡ断片と相補的な
オリゴヌクレオチドプライマーを環状ＤＮＡにハイブリ
ダイズし、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする
ＤＮＡの濃度を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のよう
な遺伝子増幅技術を用いて高める。増幅によって、Ｎｌ
ａＩＩＩエンドヌクレアーゼまたはその一部をコードす
るＤＮＡの存在頻度が著しく高まり、即ち後述のように
そのようなクローンの同定が促進される。
【００４６】増幅したＤＮＡを制限酵素、好ましくはＳ
ａｕ３ＡＩで消化してエンドヌクレアーゼ遺伝子の、標
準的なクローニング法で得られるメチラーゼクローンで
は失われている部分を含む断片を調製する。この断片を
ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ ３７２５４）のようなベクター
に移入してクローニングする。Ｓａｕ３ＡＩを用いるの
は、調製される約５００塩基対の断片がエンドヌクレア
ーゼ遺伝子のアミノ末端部分を含み、かつエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の先にクローニングした部分も１７８塩基
対だけ含むからである。また、Ｓａｕ３ＡＩはＰＣＲ反
応に用いるＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡを切断
せず、即ち（所望の）増幅ＤＮＡのみを切断して連結反
応に供し得る。
ａｕ３ＡＩで消化してエンドヌクレアーゼ遺伝子の、標
準的なクローニング法で得られるメチラーゼクローンで
は失われている部分を含む断片を調製する。この断片を
ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ ３７２５４）のようなベクター
に移入してクローニングする。Ｓａｕ３ＡＩを用いるの
は、調製される約５００塩基対の断片がエンドヌクレア
ーゼ遺伝子のアミノ末端部分を含み、かつエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の先にクローニングした部分も１７８塩基
対だけ含むからである。また、Ｓａｕ３ＡＩはＰＣＲ反
応に用いるＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡを切断
せず、即ち（所望の）増幅ＤＮＡのみを切断して連結反
応に供し得る。
【００４７】クローンＤＮＡの制限地図を作成し、かつ
メチラーゼクローンを用いるサザン法で作成したＮ．
ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡの制限地図と比較する
ことによって、エンドヌクレアーゼの失われたアミノ末
端部分を含むクローンを同定する。
メチラーゼクローンを用いるサザン法で作成したＮ．
ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡの制限地図と比較する
ことによって、エンドヌクレアーゼの失われたアミノ末
端部分を含むクローンを同定する。
【００４８】完全なＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ遺
伝子は、 ａ）メチラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子のカルボキ
シル末端部分とを含むクローンを、エンドヌクレアーゼ
においてただ１箇所を切断するＣｌａＩのような酵素、
及びベクターにおいて切断を行なうＰｓｔＩのような酵
素で切断し、 ｂ）エンドヌクレアーゼ遺伝子のアミノ末端部分を含む
クローンを、カルボキシル末端クローンに用いたのと同
じ酵素即ちＣｌａＩと、ベクターにおけるエンドヌクレ
アーゼ遺伝子外での切断に用いたのと同じ酵素即ちＰｓ
ｔＩとで切断し、 ｃ）エンドヌクレアーゼ遺伝子の２部分を含む断片（そ
のうち一方の断片はクローニングベクターも含む）をゲ
ル精製し、 ｄ）ゲル精製した２断片を互いに連結させ、メチラーゼ
遺伝子を取り込んだベクターにおいて損傷の無いエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を構成し、 ｅ）損傷の無いエンドヌクレアーゼ遺伝子及びメチラー
ゼ遺伝子を担った連結ベクターを、プラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１８４のような適合するベクター系に移入したＮｌａ
ＩＩＩメチラーゼで予め修飾したＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ
１などの細胞に導入し、 ｆ）制限地図作成で決定したエンドヌクレアーゼ遺伝子
の二つの断片を両方とも有すると判明したクローンの細
胞抽出物を調製することによって、ＮｌａＩＩＩエンド
ヌクレアーゼを発現させるクローンを同定することによ
って得られる。
伝子は、 ａ）メチラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子のカルボキ
シル末端部分とを含むクローンを、エンドヌクレアーゼ
においてただ１箇所を切断するＣｌａＩのような酵素、
及びベクターにおいて切断を行なうＰｓｔＩのような酵
素で切断し、 ｂ）エンドヌクレアーゼ遺伝子のアミノ末端部分を含む
クローンを、カルボキシル末端クローンに用いたのと同
じ酵素即ちＣｌａＩと、ベクターにおけるエンドヌクレ
アーゼ遺伝子外での切断に用いたのと同じ酵素即ちＰｓ
ｔＩとで切断し、 ｃ）エンドヌクレアーゼ遺伝子の２部分を含む断片（そ
のうち一方の断片はクローニングベクターも含む）をゲ
ル精製し、 ｄ）ゲル精製した２断片を互いに連結させ、メチラーゼ
遺伝子を取り込んだベクターにおいて損傷の無いエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を構成し、 ｅ）損傷の無いエンドヌクレアーゼ遺伝子及びメチラー
ゼ遺伝子を担った連結ベクターを、プラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１８４のような適合するベクター系に移入したＮｌａ
ＩＩＩメチラーゼで予め修飾したＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ
１などの細胞に導入し、 ｆ）制限地図作成で決定したエンドヌクレアーゼ遺伝子
の二つの断片を両方とも有すると判明したクローンの細
胞抽出物を調製することによって、ＮｌａＩＩＩエンド
ヌクレアーゼを発現させるクローンを同定することによ
って得られる。
【００４９】Ｄ．組み換え体ＮｌａＩＩＩエンドヌクレ
アーゼ及びメチラーゼの製造 組み換え体ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメ
チラーゼはＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
及びＮｌａＩＩＩ修飾メチラーゼ遺伝子を持つクローン
から、発酵槽内のアンピシリン含有濃厚培地中での増殖
によって製造し得る。細胞を遠心法で集め、かつ超音波
処理で破壊して、ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ
活性を有する粗細胞抽出物を調製する。
アーゼ及びメチラーゼの製造 組み換え体ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメ
チラーゼはＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
及びＮｌａＩＩＩ修飾メチラーゼ遺伝子を持つクローン
から、発酵槽内のアンピシリン含有濃厚培地中での増殖
によって製造し得る。細胞を遠心法で集め、かつ超音波
処理で破壊して、ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ
活性を有する粗細胞抽出物を調製する。
【００５０】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び
／またはメチラーゼ活性を有する粗細胞抽出物を、アフ
ィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマト
グラフィーのような標準的なタンパク質精製技術で精製
する。このようにして得られる組み換え体エンドヌクレ
アーゼは、ＮｌａＩ、ＮｌａＩＩ及びＮｌａＩＶを含め
た不純物としての他の酵素を伴わず、実質的に非特異的
ヌクレアーゼを伴わない。
／またはメチラーゼ活性を有する粗細胞抽出物を、アフ
ィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマト
グラフィーのような標準的なタンパク質精製技術で精製
する。このようにして得られる組み換え体エンドヌクレ
アーゼは、ＮｌａＩ、ＮｌａＩＩ及びＮｌａＩＶを含め
た不純物としての他の酵素を伴わず、実質的に非特異的
ヌクレアーゼを伴わない。
【００５１】先に概説した諸ステップは本発明の実施に
おける好ましい形態を示すものであるが、上述の方法を
当分野の公知技術によって変形し得ることは、当業者に
は明らかである。
おける好ましい形態を示すものであるが、上述の方法を
当分野の公知技術によって変形し得ることは、当業者に
は明らかである。
【００５２】本発明を以下、実施例によって更に詳しく
説明する。ただし、本発明は以下の実施例によって限定
されるものではない。
説明する。ただし、本発明は以下の実施例によって限定
されるものではない。
【００５３】
【実施例】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローニング １．ＤＮＡ精製：凍結したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃ
ｔａｍｉｃａ（ＮＲＣＣ２１１８）細胞５ｇを２０ｍｌ
の２５％スクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０
に再懸濁させた。１０ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ８．０及び０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中の１
０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌを添加した。懸濁液を
１６時間氷上に置き、その後２４ｍｌの１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、６７
ｍＭ ＥＤＴＡ及び５ｍｌの１０％ ＳＤＳの添加によ
って溶解させた。溶液を、（予め０．５Ｍ Ｔｒｉｓｐ
Ｈ８．０と平衡させた）７０ｍｌのフェノールと、６０
ｍｌのクロロホルムで抽出した。乳濁液を１０Ｋｒｐｍ
で３０分間遠心処理して相を分離した。粘稠な上相を、
ＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）を４回変えて透析した。透析した溶液を
３７℃で２時間、最終濃度１００μｇ／ｍｌのＲＮアー
ゼで消化した。次に、５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度が０．
４Ｍとなるように添加し、かつ０．５５容量のイソプロ
ピルアルコールを添加してＤＮＡを沈澱させた。沈澱し
たＤＮＡをガラス棒に絡ませ、自然乾燥し、その後ＤＮ
Ａ緩衝液に溶解させて濃度を約３５０μｇ／ｍｌとし、
４℃で貯蔵した。
のクローニング １．ＤＮＡ精製：凍結したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃ
ｔａｍｉｃａ（ＮＲＣＣ２１１８）細胞５ｇを２０ｍｌ
の２５％スクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０
に再懸濁させた。１０ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ８．０及び０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中の１
０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌを添加した。懸濁液を
１６時間氷上に置き、その後２４ｍｌの１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、６７
ｍＭ ＥＤＴＡ及び５ｍｌの１０％ ＳＤＳの添加によ
って溶解させた。溶液を、（予め０．５Ｍ Ｔｒｉｓｐ
Ｈ８．０と平衡させた）７０ｍｌのフェノールと、６０
ｍｌのクロロホルムで抽出した。乳濁液を１０Ｋｒｐｍ
で３０分間遠心処理して相を分離した。粘稠な上相を、
ＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）を４回変えて透析した。透析した溶液を
３７℃で２時間、最終濃度１００μｇ／ｍｌのＲＮアー
ゼで消化した。次に、５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度が０．
４Ｍとなるように添加し、かつ０．５５容量のイソプロ
ピルアルコールを添加してＤＮＡを沈澱させた。沈澱し
たＤＮＡをガラス棒に絡ませ、自然乾燥し、その後ＤＮ
Ａ緩衝液に溶解させて濃度を約３５０μｇ／ｍｌとし、
４℃で貯蔵した。
【００５４】２．ＤＮＡの消化：５０μｇのＮ． ｌａ
ｃｔａｍｉｃａＤＮＡを５００μｌのＨｉｎＰＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ消化緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ
８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ）
で稀釈した。４単位／μｇから０．０６単位／μｇまで
のＨｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼによる連続稀釈を
行ない、溶液を３６℃で１時間インキュベートした。Ｈ
ｉｎＰＩ消化の程度を、各稀釈液から得た小アリコート
のゲル電気泳動によって解析した。一連の所望サイズ
（２〜１５Ｋｂ）の断片が得られた稀釈液をプールし、
等量の平衡フェノールで抽出し、続いてクロロホルムで
２回抽出した。５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度が０．４Ｍと
なるように添加し、かつ０．５５容量のイソプロピルア
ルコールを添加することによってＤＮＡを沈澱させた。
ＤＮＡをＤＮＡ緩衝液に溶解させ、その濃度を約１００
μｇ／ｍｌとした。
ｃｔａｍｉｃａＤＮＡを５００μｌのＨｉｎＰＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ消化緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ
８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ）
で稀釈した。４単位／μｇから０．０６単位／μｇまで
のＨｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼによる連続稀釈を
行ない、溶液を３６℃で１時間インキュベートした。Ｈ
ｉｎＰＩ消化の程度を、各稀釈液から得た小アリコート
のゲル電気泳動によって解析した。一連の所望サイズ
（２〜１５Ｋｂ）の断片が得られた稀釈液をプールし、
等量の平衡フェノールで抽出し、続いてクロロホルムで
２回抽出した。５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度が０．４Ｍと
なるように添加し、かつ０．５５容量のイソプロピルア
ルコールを添加することによってＤＮＡを沈澱させた。
ＤＮＡをＤＮＡ緩衝液に溶解させ、その濃度を約１００
μｇ／ｍｌとした。
【００５５】３．連結反応及び形質転換：６μｇ（６０
μｌ）のＨｉｎＰＩ消化Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ Ｄ
ＮＡを３μｇ（１５μｌ）の、ＡｃｃＩで切断し、かつ
脱リン酸化したｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ ３７２５４）と
混合した。２０μｌの１０Ｘ連結反応緩衝液（５００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、
１００ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＡＴＰ）及び１０５μｌ
の滅菌蒸留水を添加して容量を２００μｌとした。７．
５μｌ（３０００ＮＥＢ単位）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
を添加し、溶液を１７℃で１６時間インキュベートし
た。溶液を２０μｌのクロロホルムでの抽出によって滅
菌し、次に１５秒間のマイクロ遠心分離によって清澄化
した。６２．５μｌの連結反応溶液を５００μｌのＳＳ
Ｃ／ＣａＣｌ２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｎａ３
シトレート、６７ｍＭ ＣａＣｌ２）と混合し、１．０
ｍｌの氷冷コンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴ
ＣＣ３１３４３）細胞を添加した。溶液を４２℃で４分
間インキュベートし、その後１０ｍｌのＬｕｒｉａブイ
ヨン（Ｌ−ブイヨン）を添加して、インキユベーション
を３７℃で３時間継続した。
μｌ）のＨｉｎＰＩ消化Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ Ｄ
ＮＡを３μｇ（１５μｌ）の、ＡｃｃＩで切断し、かつ
脱リン酸化したｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ ３７２５４）と
混合した。２０μｌの１０Ｘ連結反応緩衝液（５００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、
１００ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＡＴＰ）及び１０５μｌ
の滅菌蒸留水を添加して容量を２００μｌとした。７．
５μｌ（３０００ＮＥＢ単位）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
を添加し、溶液を１７℃で１６時間インキュベートし
た。溶液を２０μｌのクロロホルムでの抽出によって滅
菌し、次に１５秒間のマイクロ遠心分離によって清澄化
した。６２．５μｌの連結反応溶液を５００μｌのＳＳ
Ｃ／ＣａＣｌ２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｎａ３
シトレート、６７ｍＭ ＣａＣｌ２）と混合し、１．０
ｍｌの氷冷コンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴ
ＣＣ３１３４３）細胞を添加した。溶液を４２℃で４分
間インキュベートし、その後１０ｍｌのＬｕｒｉａブイ
ヨン（Ｌ−ブイヨン）を添加して、インキユベーション
を３７℃で３時間継続した。
【００５６】４．細胞ライブラリー：形質転換した培養
物を穏やかに遠心分離し、上澄みを捨て、細胞を１．０
ｍｌのＬ−ブイヨンに再懸濁させた。再懸濁細胞の２０
０μｌ部分を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有Ｌｕ
ｒｉａ寒天（Ｌ−寒天）プレート上に植え付けた。プレ
ートを３７℃で一晩インキュベートした。プレート表面
で増殖した形質転換細胞を、各プレートに２．５ｍｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２を注ぎ、コロニーを掻き集め、かつ懸濁液を１本の管
にプールすることによって集めた。
物を穏やかに遠心分離し、上澄みを捨て、細胞を１．０
ｍｌのＬ−ブイヨンに再懸濁させた。再懸濁細胞の２０
０μｌ部分を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有Ｌｕ
ｒｉａ寒天（Ｌ−寒天）プレート上に植え付けた。プレ
ートを３７℃で一晩インキュベートした。プレート表面
で増殖した形質転換細胞を、各プレートに２．５ｍｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２を注ぎ、コロニーを掻き集め、かつ懸濁液を１本の管
にプールすることによって集めた。
【００５７】５．プラスミドライブラリー：２．０ｍｌ
の細胞ライブラリーを５００ｍｌの１００μｇ／ｍｌア
ンピシリン含有Ｌ−ブイヨンに接種した。培養物を３７
℃で一晩振盪し、その後５Ｋｒｐｍで５分間遠心分離し
た。上澄みを捨て、細胞ペレットを１０ｍｌの２５％ス
クロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に室温で再
懸濁させた。５ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．
０、及び３ｍｌの、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０
中の１０ｍｇ／ｍｌリゾチームを添加した。溶液を１時
間氷上に置き、その後１２ｍｌの１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、６７ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを添加し、懸濁液に穏やかな渦流を生じさ
せて細胞を溶解させた。
の細胞ライブラリーを５００ｍｌの１００μｇ／ｍｌア
ンピシリン含有Ｌ−ブイヨンに接種した。培養物を３７
℃で一晩振盪し、その後５Ｋｒｐｍで５分間遠心分離し
た。上澄みを捨て、細胞ペレットを１０ｍｌの２５％ス
クロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に室温で再
懸濁させた。５ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．
０、及び３ｍｌの、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０
中の１０ｍｇ／ｍｌリゾチームを添加した。溶液を１時
間氷上に置き、その後１２ｍｌの１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、６７ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを添加し、懸濁液に穏やかな渦流を生じさ
せて細胞を溶解させた。
【００５８】溶解混合物を５０ｍｌ管に移し、４℃で４
５分間１７Ｋｒｐｍで遠心分離した。上澄みをピペット
で除去した。２０．０ｇの固体ＣｓＣｌをプラスチック
製の５０ｍｌ捩じ蓋付き管に計り入れ、２２．０ｇの上
澄みを前記管にピペットで注入して混合した。０．５ｍ
ｌの、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ｍＭＮ
ａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の１０ｍｇ／ｍｌエチジウ
ムブロミドを添加した。溶液を２本の５／８ｉｎ．×３
ｉｎ．遠心分離管に移し、ＢｅｃｋｍａｎＴｉ７０ロー
ターにおいて１７℃で３０時間５０Ｋｒｐｍで回転し
た。プラスミドを集めるために、管を開け、紫外線を照
射し、二つの蛍光帯のうちの低い方を注射器で集めた。
各管から得られた低い方の蛍光帯を一つに合わせ、エチ
ジウムブロミドを、等量の水飽和及びＣｓＣｌ２飽和イ
ソプロピルアルコールでの３回の抽出によって除去し
た。
５分間１７Ｋｒｐｍで遠心分離した。上澄みをピペット
で除去した。２０．０ｇの固体ＣｓＣｌをプラスチック
製の５０ｍｌ捩じ蓋付き管に計り入れ、２２．０ｇの上
澄みを前記管にピペットで注入して混合した。０．５ｍ
ｌの、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ｍＭＮ
ａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の１０ｍｇ／ｍｌエチジウ
ムブロミドを添加した。溶液を２本の５／８ｉｎ．×３
ｉｎ．遠心分離管に移し、ＢｅｃｋｍａｎＴｉ７０ロー
ターにおいて１７℃で３０時間５０Ｋｒｐｍで回転し
た。プラスミドを集めるために、管を開け、紫外線を照
射し、二つの蛍光帯のうちの低い方を注射器で集めた。
各管から得られた低い方の蛍光帯を一つに合わせ、エチ
ジウムブロミドを、等量の水飽和及びＣｓＣｌ２飽和イ
ソプロピルアルコールでの３回の抽出によって除去し
た。
【００５９】抽出溶液を４容量のＤＮＡ緩衝液で稀釈
し、その後２容量のイソプロパノールの添加によって核
酸を沈澱させた。溶液を−７０℃で３０分間放置してか
ら、４℃で１５分間１５ＫｒＰｍで遠心分離した。上澄
みを捨て、ペレットを３０分間自然乾燥した後１ｍｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに
溶解させ、４℃で貯蔵した。プラスミドＤＮＡ濃度は約
２００μｇ／ｍｌであった。
し、その後２容量のイソプロパノールの添加によって核
酸を沈澱させた。溶液を−７０℃で３０分間放置してか
ら、４℃で１５分間１５ＫｒＰｍで遠心分離した。上澄
みを捨て、ペレットを３０分間自然乾燥した後１ｍｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに
溶解させ、４℃で貯蔵した。プラスミドＤＮＡ濃度は約
２００μｇ／ｍｌであった。
【００６０】６．プラスミドライブラリーの消化：４μ
ｇ（２０μｌ）のプラスミドライブラリーを１００μｌ
のＢｓｐＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（１０
ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、
１００ｍＭ ＫＣｌ）で稀釈した。１６単位（４μｌ）
のＢｓｐＨＩ制限エンドヌクレアーゼ及び８単位（２μ
ｌ）のＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼを添加し、管を
３７℃で２時間インキュベートした。反応物を２０μｌ
のクロロホルムでの抽出によって滅菌し、その後１５秒
間のマイクロ遠心分離によって清澄化した。
ｇ（２０μｌ）のプラスミドライブラリーを１００μｌ
のＢｓｐＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化緩衝液（１０
ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、
１００ｍＭ ＫＣｌ）で稀釈した。１６単位（４μｌ）
のＢｓｐＨＩ制限エンドヌクレアーゼ及び８単位（２μ
ｌ）のＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼを添加し、管を
３７℃で２時間インキュベートした。反応物を２０μｌ
のクロロホルムでの抽出によって滅菌し、その後１５秒
間のマイクロ遠心分離によって清澄化した。
【００６１】７．形質転換：２０μｌ（０．８μｇ）の
消化ライブラリーを１００μｌのＳＳＣ／ＣａＣｌ
２（上記第３項参照）、及び２００μｌの氷冷コンピテ
ントＥ．ｃｏｌｉ ＲＲ１と混合した。混合物を３分間
４２℃に暖めてから、１００μｇ／ｍｇのアンピシリン
を含有するＬ−寒天上にプレーティングした。プレート
を３７℃で一晩インキュベートした。ＢｓｐＨＩ及びＳ
ｐｈＩでの消化は形質転換細胞の数を、未消化プラスミ
ドで形質転換した場合の１／１０３に減少させた。Ｂｓ
ｐＨＩ及びＳｐｈＩ消化の後、約２００のコロニーが成
長した。そのうちの７０を１０ｍｌのアンピシリン含有
Ｌ−ブイヨンに接種してミニ培養物を得、これをアンピ
シリン含有Ｌ−寒天プレート上で画線培養してマスター
ストックとした。
消化ライブラリーを１００μｌのＳＳＣ／ＣａＣｌ
２（上記第３項参照）、及び２００μｌの氷冷コンピテ
ントＥ．ｃｏｌｉ ＲＲ１と混合した。混合物を３分間
４２℃に暖めてから、１００μｇ／ｍｇのアンピシリン
を含有するＬ−寒天上にプレーティングした。プレート
を３７℃で一晩インキュベートした。ＢｓｐＨＩ及びＳ
ｐｈＩでの消化は形質転換細胞の数を、未消化プラスミ
ドで形質転換した場合の１／１０３に減少させた。Ｂｓ
ｐＨＩ及びＳｐｈＩ消化の後、約２００のコロニーが成
長した。そのうちの７０を１０ｍｌのアンピシリン含有
Ｌ−ブイヨンに接種してミニ培養物を得、これをアンピ
シリン含有Ｌ−寒天プレート上で画線培養してマスター
ストックとした。
【００６２】８．生存個体の解析：第７項で得られた７
０の生存コロニーを増殖させて１０ｍｌの培養物とし、
培養細胞の持つプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｍａｎｄ
Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
７， ｐ．１５１３（１９７９）の方法から採用した
次のミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）精製法によって
得た。
０の生存コロニーを増殖させて１０ｍｌの培養物とし、
培養細胞の持つプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｍａｎｄ
Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
７， ｐ．１５１３（１９７９）の方法から採用した
次のミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）精製法によって
得た。
【００６３】ミニプレップ法：各培養物を５分間８Ｋｒ
ｐｍで遠心分離した。上澄みを捨て、細胞ペレットを、
１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する１．０ｍｌの２５
ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコ
ース ｐＨ８．０に再懸濁させた。室温で１０分経過
後、２．０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ ＳＤＳを
各管に添加し、管を穏やかに振盪して細胞を溶解させ、
その後氷上に放置した。溶液が澄んだら１．５ｍｌの３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を各管に添加し、管を
振盪した。生成する沈澱物を、４℃で１０分間行なう１
５Ｋｒｐｍでの回転によって落ち着かせた。各上澄みを
遠心分離管内に注ぎ、管の中の３ｍｌの２−プロパノー
ルと混合した。室温で１０分経過後、管を１０分間１５
Ｋｒｐｍで回転して、沈澱した核酸をペレット状にし
た。上澄みを捨て、ペレットを室温で３０分間自然乾燥
した。乾燥の済んだペレットを、１００μｇ／ｍｌのＲ
Ｎアーゼを含有する５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０に溶解させ、３７℃で１
時間インキュベートしてＲＮＡを消化した。溶液を１．
５ｍｌエッペンドルフ管に移し、５０μｌの５Ｍ Ｎａ
Ｃｌを添加し、次いで３５０μｌの２−プロパノールを
添加することにより再度ＤＮＡを沈澱させた。室温で１
０分経過後、ＤＮＡを、５分間の遠心分離での回転によ
って落ち着かせ、上澄みを捨てた。ペレットを室温で３
０分間自然乾燥し、次に１５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に再溶解させた。後
に、ＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ、及び／またはＮｌａＩＩ
Ｉ、及びＨｉｎＰＩでの消化によってプラスミドミニプ
レップを解析した。
ｐｍで遠心分離した。上澄みを捨て、細胞ペレットを、
１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する１．０ｍｌの２５
ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコ
ース ｐＨ８．０に再懸濁させた。室温で１０分経過
後、２．０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ ＳＤＳを
各管に添加し、管を穏やかに振盪して細胞を溶解させ、
その後氷上に放置した。溶液が澄んだら１．５ｍｌの３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を各管に添加し、管を
振盪した。生成する沈澱物を、４℃で１０分間行なう１
５Ｋｒｐｍでの回転によって落ち着かせた。各上澄みを
遠心分離管内に注ぎ、管の中の３ｍｌの２−プロパノー
ルと混合した。室温で１０分経過後、管を１０分間１５
Ｋｒｐｍで回転して、沈澱した核酸をペレット状にし
た。上澄みを捨て、ペレットを室温で３０分間自然乾燥
した。乾燥の済んだペレットを、１００μｇ／ｍｌのＲ
Ｎアーゼを含有する５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０に溶解させ、３７℃で１
時間インキュベートしてＲＮＡを消化した。溶液を１．
５ｍｌエッペンドルフ管に移し、５０μｌの５Ｍ Ｎａ
Ｃｌを添加し、次いで３５０μｌの２−プロパノールを
添加することにより再度ＤＮＡを沈澱させた。室温で１
０分経過後、ＤＮＡを、５分間の遠心分離での回転によ
って落ち着かせ、上澄みを捨てた。ペレットを室温で３
０分間自然乾燥し、次に１５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に再溶解させた。後
に、ＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ、及び／またはＮｌａＩＩ
Ｉ、及びＨｉｎＰＩでの消化によってプラスミドミニプ
レップを解析した。
【００６４】９．ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子クロー
ン：解析した７０のプラスミドのうち６１のプラスミド
は、ＢｓｐＨＩ消化に感受性であり、かつＮ． ｌａｃ
ｔａｍｉｃａ ＤＮＡの様々なＨｉｎＰＩ断片を持つこ
とが判明した。これらのプラスミドは偽であり、廃棄し
た。残る９のプラスミドは、ＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ及び
ＮｌａＩＩＩ消化に耐性であり、０．５９Ｋｂ及び０．
５４ＫｂのＨｉｎＰＩ断片を共に有することが判明し
た。６種の異なるプラスミド構築物が得られ、これらは
プラスミドをＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ及びＮｌａＩＩＩ消
化から完全に防護した。同じメチラーゼ選択技術によっ
て、ＭｂｏＩ、ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩエライブラリー
からもメチラーゼクローンを得た。これらのクローンは
いずれも、検出可能なＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ
活性は有しなかった。
ン：解析した７０のプラスミドのうち６１のプラスミド
は、ＢｓｐＨＩ消化に感受性であり、かつＮ． ｌａｃ
ｔａｍｉｃａ ＤＮＡの様々なＨｉｎＰＩ断片を持つこ
とが判明した。これらのプラスミドは偽であり、廃棄し
た。残る９のプラスミドは、ＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ及び
ＮｌａＩＩＩ消化に耐性であり、０．５９Ｋｂ及び０．
５４ＫｂのＨｉｎＰＩ断片を共に有することが判明し
た。６種の異なるプラスミド構築物が得られ、これらは
プラスミドをＢｓｐＨＩ、ＳｐｈＩ及びＮｌａＩＩＩ消
化から完全に防護した。同じメチラーゼ選択技術によっ
て、ＭｂｏＩ、ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩエライブラリー
からもメチラーゼクローンを得た。これらのクローンは
いずれも、検出可能なＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ
活性は有しなかった。
【００６５】１０．ＮｌａＩＩＩメチラーゼクローンの
配列決定：ＮｌａＩＩＩメチラーゼクローンを、Ｓａｎ
ｇｅｒのジデオキシ鎖末端決定法を用いて配列決定し
た。ＤＮＡのクローン片の端部を、クローニング部位近
傍でｐＵＣ１９ベクターにハイブリダイズしてクローン
ＤＮＡに読み込まれるユニバーサルプライマーＮＥＢ
１２０１及びＮＥＢ １２１１を用いて配列決定した。
典型的な反応において、２μｇ（２μｌ）のフェノール
／クロロホルム抽出ミニプレッププラスミドＤＮＡをｄ
Ｈ２Ｏで稀釈して総量を２０μｌとした。２μｌの２Ｍ
ＮａＯＨ、２ｍＭＥＤＴＡを添加し、溶液を室温で５
分間インキュベートした。７μｌのｄＨ２Ｏ、６μｌの
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び７５μｌのエタ
ノールを逐次迅速に添加した。ＤＮＡを２−プロパノー
ル／ドライアイス浴中で１５分間沈澱させ、エッペンド
ルフ遠心分離機での１０分間の遠心分離によりペレット
状にし、２００μｌの７０％エタノール／３０％ ｄＨ
２Ｏで洗浄し、遠心分離法によって再回収し、乾燥し
た。得られたＤＮＡを、９μｌのｄＨ２Ｏ，１．５μｌ
の１０Ｘ配列決定緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ Ｄ
ＴＴ）、及び１μｌ（１ｐｍｏｌ）の１ｕＭプライマー
溶液に再懸濁させた。反応物を３７℃で３０分間インキ
ュベートした。２μｌの［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（５０
０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）及び１μｌ（５
単位）のクレノウフラグメントを添加し、得られた混合
溶液を、適当なＮＥＢ ４０６ジデオキシ配列決定試薬
３．０μｌの入ったＡ、Ｃ、Ｇ及びＴ反応管それぞれに
３．２μｌずつ入れた。反応物を３７℃で１５分間イン
キュベートし、その後１μｌのｄＮＴＰ追跡溶液（ＮＥ
Ｂ ４０６）を添加してインキュベーションを更に１５
分間継続した。６μｌの停止溶液を添加し、反応物を８
％ビス−アクリルアミド配列決定ゲル上で電気泳動して
からオートラジオグラフィーに掛けた。
配列決定：ＮｌａＩＩＩメチラーゼクローンを、Ｓａｎ
ｇｅｒのジデオキシ鎖末端決定法を用いて配列決定し
た。ＤＮＡのクローン片の端部を、クローニング部位近
傍でｐＵＣ１９ベクターにハイブリダイズしてクローン
ＤＮＡに読み込まれるユニバーサルプライマーＮＥＢ
１２０１及びＮＥＢ １２１１を用いて配列決定した。
典型的な反応において、２μｇ（２μｌ）のフェノール
／クロロホルム抽出ミニプレッププラスミドＤＮＡをｄ
Ｈ２Ｏで稀釈して総量を２０μｌとした。２μｌの２Ｍ
ＮａＯＨ、２ｍＭＥＤＴＡを添加し、溶液を室温で５
分間インキュベートした。７μｌのｄＨ２Ｏ、６μｌの
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び７５μｌのエタ
ノールを逐次迅速に添加した。ＤＮＡを２−プロパノー
ル／ドライアイス浴中で１５分間沈澱させ、エッペンド
ルフ遠心分離機での１０分間の遠心分離によりペレット
状にし、２００μｌの７０％エタノール／３０％ ｄＨ
２Ｏで洗浄し、遠心分離法によって再回収し、乾燥し
た。得られたＤＮＡを、９μｌのｄＨ２Ｏ，１．５μｌ
の１０Ｘ配列決定緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ Ｄ
ＴＴ）、及び１μｌ（１ｐｍｏｌ）の１ｕＭプライマー
溶液に再懸濁させた。反応物を３７℃で３０分間インキ
ュベートした。２μｌの［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（５０
０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）及び１μｌ（５
単位）のクレノウフラグメントを添加し、得られた混合
溶液を、適当なＮＥＢ ４０６ジデオキシ配列決定試薬
３．０μｌの入ったＡ、Ｃ、Ｇ及びＴ反応管それぞれに
３．２μｌずつ入れた。反応物を３７℃で１５分間イン
キュベートし、その後１μｌのｄＮＴＰ追跡溶液（ＮＥ
Ｂ ４０６）を添加してインキュベーションを更に１５
分間継続した。６μｌの停止溶液を添加し、反応物を８
％ビス−アクリルアミド配列決定ゲル上で電気泳動して
からオートラジオグラフィーに掛けた。
【００６６】メチラーゼのサブクローンを作り、配列が
決定できるようにクローンの内側部分をｐＵＣ１９ユニ
バーサルプライミング部位付近に配置した。上記サブク
ローンは次のように形成した。２μｇの、第１項〜第９
項に述べたようにして得られたＨｉｎＰＩライブラリー
メチラーゼクローンｐＲＭ１２５Ｍ １２２−６４を５
０μｌ反応容器内で１時間、２０単位のＥｃｏＲＩ及び
２０単位のＰｓｔＩで消化し、次に４０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ ｐＨ８．０、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍ
Ｍ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロ
ミド中で１％ＦＭＣ ＳｅａＰｌａｑｕｅ（ｒｔ） Ｌ
ＭＰアガロースゲル上で電気泳動した。クローンＤＮＡ
の１．７ｋｂ断片をゲルから切り出した。５μｌのゲル
断片を１μｌの１０Ｘ反応緩衝液、４μｌのｄＨ２Ｏ，
及び１μｌ（５０）のＨｉｎＰＩと混合し、３７℃で
３０分間消化した。反応物を１５分間加熱して６５℃と
し、次に１０μｌのクロロホルムで抽出した。１．３μ
ｌの１０Ｘ連結反応緩衝液を、１μｌのＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ及び１μｌ（２００ｎｇ）の、ＡｃｃＩで切断
し、かつ脱リン酸化したｐＵＣ１９ ＤＮＡと共に添加
し、溶液を４℃で１６時間インキュベートした。連結反
応物を６５℃で５分間融解してから４２℃に冷却した。
５μｌの溶融連結反応物を１００μｌの氷冷コンピテン
トＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１細胞と混合し、４分間４２℃
に加熱し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
ＬＢ寒天上に植え付けた。このようにして得られたサブ
クローンを、ユニバーサルプライマーＮＥＢ １２０１
及びＮＥＢ １２１１を用いて上述のように配列決定し
た。上述のようなＮ． ｌａｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡと
相補的であるプライマーを合成することによって更に配
列決定を行ない、配列を完成した。
決定できるようにクローンの内側部分をｐＵＣ１９ユニ
バーサルプライミング部位付近に配置した。上記サブク
ローンは次のように形成した。２μｇの、第１項〜第９
項に述べたようにして得られたＨｉｎＰＩライブラリー
メチラーゼクローンｐＲＭ１２５Ｍ １２２−６４を５
０μｌ反応容器内で１時間、２０単位のＥｃｏＲＩ及び
２０単位のＰｓｔＩで消化し、次に４０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ ｐＨ８．０、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍ
Ｍ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロ
ミド中で１％ＦＭＣ ＳｅａＰｌａｑｕｅ（ｒｔ） Ｌ
ＭＰアガロースゲル上で電気泳動した。クローンＤＮＡ
の１．７ｋｂ断片をゲルから切り出した。５μｌのゲル
断片を１μｌの１０Ｘ反応緩衝液、４μｌのｄＨ２Ｏ，
及び１μｌ（５０）のＨｉｎＰＩと混合し、３７℃で
３０分間消化した。反応物を１５分間加熱して６５℃と
し、次に１０μｌのクロロホルムで抽出した。１．３μ
ｌの１０Ｘ連結反応緩衝液を、１μｌのＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ及び１μｌ（２００ｎｇ）の、ＡｃｃＩで切断
し、かつ脱リン酸化したｐＵＣ１９ ＤＮＡと共に添加
し、溶液を４℃で１６時間インキュベートした。連結反
応物を６５℃で５分間融解してから４２℃に冷却した。
５μｌの溶融連結反応物を１００μｌの氷冷コンピテン
トＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１細胞と混合し、４分間４２℃
に加熱し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
ＬＢ寒天上に植え付けた。このようにして得られたサブ
クローンを、ユニバーサルプライマーＮＥＢ １２０１
及びＮＥＢ １２１１を用いて上述のように配列決定し
た。上述のようなＮ． ｌａｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡと
相補的であるプライマーを合成することによって更に配
列決定を行ない、配列を完成した。
【００６７】１１．サザン法によるＮ． ｌａｃｔａｍ
ｉｃａゲノムＤＮＡの制限地図の作成：Ｎ． ｌａｃｔ
ａｍｉｃａゲノムＤＮＡを濃度５０ｍｇ／ｍｌのエンド
ヌクレアーゼ反応緩衝液で稀釈し、ＢａｎＩＩ、Ｂｓｓ
ＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈｉｎｃ
ＩＩ、ＨｉｎＰＩ、ＭｂｏＩ、ＲｓａＩ及びＰｓｔＩを
含めた様々な制限エンドヌクレアーゼで切断した。２μ
ｇの消化ＤＮＡを４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２
０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．
５μｇ／ｍｌエチジウムブロミド中で１％ＬＥアガロー
スゲル上で電気泳動した。ゲルを定規と共に紫外線照射
下に写真撮影して移動距離を測定し、その後ゲルを２５
０ｍｌの０．２５Ｍ ＨＣｌに１５分間、穏やかに撹拌
しつつ浸漬した。ＨＣｌ液を除去後、ゲルを０．２５Ｍ
ＨＣｌの、やはり２５０ｍｌの第二のアリコートに更
に１５分間浸漬した。ゲルを濯ぎ、２５０ｍｌの０．５
ＭＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ中に１５分間、穏やか
に撹拌しつつ置き、緩衝液を取り替えた後第二の１５分
間浸漬を行なった。次に、ゲルを濯いで、２５０ｍｌの
１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、０．０２Ｍ ＮａＯＨ中に３０分
間、穏やかに撹拌しつつ置き、続いてＮＨ４ＯＡｃ／Ｎ
ａＯＨ緩衝液を取り替えてから第二の３０分間浸漬を行
なった。その後、ＤＮＡを、（ＮＨ４ＯＡｃ／ＮａＯＨ
で予め湿らせた）Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕ
ｅｌｌ Ｂａ８５ニトロセルロースのシート上に毛管作
用によって一晩移した。ニトロセルロースブロットを８
０℃の真空オーブン内で２時間熱した。ブロットを、Ｍ
ｂｏＩライブラリーｐＲＭ１２５Ｍ１−１５から得た極
小クローン１μｇを４μｌの０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、４
μｌの０．１ｍＭ ｄＧＴＰ、４μｌの０．１ｍＭ ｄ
ＴＴＰ、１０μｌ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ
／ｍｌ）の［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、４μｌの０．１μ
ｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ、及び１μｌ（１０ＮＥＢ単
位）のＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩと、総量
１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．８、
５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール及び５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン中で結合さ
せて製造した、ニックトランスレーションしたメチラー
ゼクローンで試験した。溶液を１５℃で３時間インキュ
ベートし、次に５μｌの２５０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを添加して更に１５分間インキ
ュベーションを継続した。ＤＮアーゼ及びＤＮＡポリメ
ラーゼを、溶液を９８℃に５分間加熱することにより不
活化した。ニトロセルロースブロットを、１５ｍｌのハ
イブリダイゼーション溶液（１０Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ
ｓ溶液、６Ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、２％デキストラ
ン硫酸）が入った密閉バッグに２時間入れた。その後、
５０μｌのニックトランスレーションしたプラスミドを
添加し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行
なった。ハイブリダイゼーション溶液を除去し、フィル
ターを５分間にわたって３回、毎回６５℃の２Ｘ ＳＳ
Ｃを２５０ｍｌ用いて洗浄し、かつ続く２０分間にわた
って更に３回、毎回６５℃の２Ｘ ＳＳＣ、０．５％
ＳＤＳを２５０ｍｌ用いて洗浄した。洗浄したフィルタ
ーをｄＨ２Ｏで濯ぎ、様々な制限断片の大きさを示すオ
ートラジオグラムを作成した。
ｉｃａゲノムＤＮＡの制限地図の作成：Ｎ． ｌａｃｔ
ａｍｉｃａゲノムＤＮＡを濃度５０ｍｇ／ｍｌのエンド
ヌクレアーゼ反応緩衝液で稀釈し、ＢａｎＩＩ、Ｂｓｓ
ＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈｉｎｃ
ＩＩ、ＨｉｎＰＩ、ＭｂｏＩ、ＲｓａＩ及びＰｓｔＩを
含めた様々な制限エンドヌクレアーゼで切断した。２μ
ｇの消化ＤＮＡを４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２
０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．
５μｇ／ｍｌエチジウムブロミド中で１％ＬＥアガロー
スゲル上で電気泳動した。ゲルを定規と共に紫外線照射
下に写真撮影して移動距離を測定し、その後ゲルを２５
０ｍｌの０．２５Ｍ ＨＣｌに１５分間、穏やかに撹拌
しつつ浸漬した。ＨＣｌ液を除去後、ゲルを０．２５Ｍ
ＨＣｌの、やはり２５０ｍｌの第二のアリコートに更
に１５分間浸漬した。ゲルを濯ぎ、２５０ｍｌの０．５
ＭＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ中に１５分間、穏やか
に撹拌しつつ置き、緩衝液を取り替えた後第二の１５分
間浸漬を行なった。次に、ゲルを濯いで、２５０ｍｌの
１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、０．０２Ｍ ＮａＯＨ中に３０分
間、穏やかに撹拌しつつ置き、続いてＮＨ４ＯＡｃ／Ｎ
ａＯＨ緩衝液を取り替えてから第二の３０分間浸漬を行
なった。その後、ＤＮＡを、（ＮＨ４ＯＡｃ／ＮａＯＨ
で予め湿らせた）Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕ
ｅｌｌ Ｂａ８５ニトロセルロースのシート上に毛管作
用によって一晩移した。ニトロセルロースブロットを８
０℃の真空オーブン内で２時間熱した。ブロットを、Ｍ
ｂｏＩライブラリーｐＲＭ１２５Ｍ１−１５から得た極
小クローン１μｇを４μｌの０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、４
μｌの０．１ｍＭ ｄＧＴＰ、４μｌの０．１ｍＭ ｄ
ＴＴＰ、１０μｌ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ
／ｍｌ）の［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、４μｌの０．１μ
ｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ、及び１μｌ（１０ＮＥＢ単
位）のＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩと、総量
１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．８、
５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール及び５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン中で結合さ
せて製造した、ニックトランスレーションしたメチラー
ゼクローンで試験した。溶液を１５℃で３時間インキュ
ベートし、次に５μｌの２５０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを添加して更に１５分間インキ
ュベーションを継続した。ＤＮアーゼ及びＤＮＡポリメ
ラーゼを、溶液を９８℃に５分間加熱することにより不
活化した。ニトロセルロースブロットを、１５ｍｌのハ
イブリダイゼーション溶液（１０Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ
ｓ溶液、６Ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、２％デキストラ
ン硫酸）が入った密閉バッグに２時間入れた。その後、
５０μｌのニックトランスレーションしたプラスミドを
添加し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行
なった。ハイブリダイゼーション溶液を除去し、フィル
ターを５分間にわたって３回、毎回６５℃の２Ｘ ＳＳ
Ｃを２５０ｍｌ用いて洗浄し、かつ続く２０分間にわた
って更に３回、毎回６５℃の２Ｘ ＳＳＣ、０．５％
ＳＤＳを２５０ｍｌ用いて洗浄した。洗浄したフィルタ
ーをｄＨ２Ｏで濯ぎ、様々な制限断片の大きさを示すオ
ートラジオグラムを作成した。
【００６８】１２．ＮｌａＩＩＩメチラーゼのｐＡＣＹ
Ｃ１８４への移入：４μｇのＮｌａＩＩＩメチラーゼク
ローンｐＲＭ１２５Ｍ １２２−６４を１００μｌ量の
ＰｖｕＩＩ（１０単位）で消化した。１０μｇのｐＡＣ
ＹＣ１８４を総反応量２００μｌのＰｖｕＩＩ（４０単
位）で消化した。切断したｐＡＣＹＣ１８４ ＤＮＡを
平衡フェノールで１回抽出した後クロロホルムで２回抽
出し、ＮａＣｌ濃度を１００ｍＭとし、２容量のエタノ
ールを添加し、かつ溶液を−７０℃で３０分間インキュ
ベートして、ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを遠
心分離によって集め、３００μｌの７０％エタノール／
３０％ ｄＨ２Ｏで洗浄し、遠心分離によって再度集め
て乾燥し、４３μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．０、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡに再懸濁させた。
Ｃ１８４への移入：４μｇのＮｌａＩＩＩメチラーゼク
ローンｐＲＭ１２５Ｍ １２２−６４を１００μｌ量の
ＰｖｕＩＩ（１０単位）で消化した。１０μｇのｐＡＣ
ＹＣ１８４を総反応量２００μｌのＰｖｕＩＩ（４０単
位）で消化した。切断したｐＡＣＹＣ１８４ ＤＮＡを
平衡フェノールで１回抽出した後クロロホルムで２回抽
出し、ＮａＣｌ濃度を１００ｍＭとし、２容量のエタノ
ールを添加し、かつ溶液を−７０℃で３０分間インキュ
ベートして、ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを遠
心分離によって集め、３００μｌの７０％エタノール／
３０％ ｄＨ２Ｏで洗浄し、遠心分離によって再度集め
て乾燥し、４３μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．０、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡに再懸濁させた。
【００６９】ＰｖｕＩＩで消化したｐＡＣＹＣ１８４を
コウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して、このベ
クターが自身と連結するのを防止した。５μｌの１０Ｘ
ＣＩＰ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
９．０、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）
を、４３μｌのｐＡＣＹＣ１８４に対して添加した。１
μｌ（１単位）のＣＩＰを添加し、反応物を、３７℃で
１５分間インキュベートした後５６℃で１５分間インキ
ュベートした。第二の１μｌ（１単位のアリコート）の
ＣＩＰを添加し、再び３７℃で１５分間インキュベート
した後、５６℃で１５分間インキュベートした。第２の
１μｌ（１単位のアリコート）のＣＩＰを添加し、再び
３７℃で１５分間インキュベートした後、５６℃で１５
分間インキュベートした。反応物をフェノール及びクロ
ロホルムで抽出して、上述のようにＤＮＡを沈澱させ
た。乾燥したＤＮＡを約２００μｇ／ｍｌの濃度に再懸
濁させた。１μｇのＰｖｕＩＩ消化ｐＲＭ１２５Ｍ １
２２−６４を０．５μｇの脱リン酸化したＰｖｕＩＩ切
断ｐＡＣＹＣ１８４と、３μｌ（３００ＮＥＢ単位）の
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加した２５μｌ量の連結反応
緩衝液中で結合させ、その後１７℃で１６時間インキュ
ベートした。５μｌの連結ＤＮＡを２００μｌの氷冷コ
ンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１細胞と混合し、続い
て４２℃に４分間加熱した。１０ｍｌのＬｕｒｉａブイ
ヨンを添加し、細胞を３７℃で３時間インキュベートし
た。穏やかな遠心分離で細胞を集め、テトラサイクリン
５０μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天上に植え付けた。得られ
たコロニーをＮｌａＩＩＩメチラーゼ活性の存在に関し
てスクリーニングした。ｐＡＣＹＣ１８４−ＮｌａＩＩ
Ｉメチラーゼ形質転換細胞から、コンピテント細胞を製
造した。
コウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して、このベ
クターが自身と連結するのを防止した。５μｌの１０Ｘ
ＣＩＰ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
９．０、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）
を、４３μｌのｐＡＣＹＣ１８４に対して添加した。１
μｌ（１単位）のＣＩＰを添加し、反応物を、３７℃で
１５分間インキュベートした後５６℃で１５分間インキ
ュベートした。第二の１μｌ（１単位のアリコート）の
ＣＩＰを添加し、再び３７℃で１５分間インキュベート
した後、５６℃で１５分間インキュベートした。第２の
１μｌ（１単位のアリコート）のＣＩＰを添加し、再び
３７℃で１５分間インキュベートした後、５６℃で１５
分間インキュベートした。反応物をフェノール及びクロ
ロホルムで抽出して、上述のようにＤＮＡを沈澱させ
た。乾燥したＤＮＡを約２００μｇ／ｍｌの濃度に再懸
濁させた。１μｇのＰｖｕＩＩ消化ｐＲＭ１２５Ｍ １
２２−６４を０．５μｇの脱リン酸化したＰｖｕＩＩ切
断ｐＡＣＹＣ１８４と、３μｌ（３００ＮＥＢ単位）の
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加した２５μｌ量の連結反応
緩衝液中で結合させ、その後１７℃で１６時間インキュ
ベートした。５μｌの連結ＤＮＡを２００μｌの氷冷コ
ンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１細胞と混合し、続い
て４２℃に４分間加熱した。１０ｍｌのＬｕｒｉａブイ
ヨンを添加し、細胞を３７℃で３時間インキュベートし
た。穏やかな遠心分離で細胞を集め、テトラサイクリン
５０μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天上に植え付けた。得られ
たコロニーをＮｌａＩＩＩメチラーゼ活性の存在に関し
てスクリーニングした。ｐＡＣＹＣ１８４−ＮｌａＩＩ
Ｉメチラーゼ形質転換細胞から、コンピテント細胞を製
造した。
【００７０】１３．エンドヌクレアーゼ遺伝子の欠失部
分の増幅：Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡのサザ
ンブロットから発生したマッピング情報を用いて、逆Ｐ
ＣＲ増幅用のＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡの開裂に
Ｒｓａ Ｉ及びＢｓｓＨ ＩＩを選択した。２０単位の
ＢｓｓＨ ＩＩ又は４０単位のＲｓａ Ｉとの１００マ
イクロリットル反応物中で１０マイクログラムのＮ．ｌ
ａｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡを開裂した。Ｒｓａ Ｉの場
合は２０００塩基対のサイズ範囲のフラグメント、Ｂｓ
ｓＨ ＩＩの場合は４５００塩基対のサイズ範囲のフラ
グメントを前述のステップ１０と同様にゲル精製した。
ゲル精製したＤＮＡフラグメントを含むアガロースを６
５°Ｃで溶融し、４２°Ｃに冷却し、１Ｘ Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼバッファで１ｍｌに希釈して約１マイクロリ
ットル／ｍｌの濃度にした。これは、連結プロセスにお
けるＤＮＡフラグメントのサーキュラリゼーションを促
進するのに十分な低い濃度である。２０マイクロリット
ル（１０，０００ＮＥＢ単位）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
を加え、この反応物を１７°Ｃで１６時間インキュベー
トした。この連結反応物を等量の平衡化フェノールで抽
出し、次いでクロロホルムで２回抽出し、１００ｍＭ
ＮａＣｌに加え、２つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分配
し、２倍容のエタノールで−７０°Ｃで１６時間沈澱さ
せた。沈澱したＤＮＡを遠心分離によって集め、３００
マイクロリットルの７０％エタノール／３０％ｄＨ２Ｏ
で洗浄し、遠心分離し且つ乾燥した。
分の増幅：Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａゲノムＤＮＡのサザ
ンブロットから発生したマッピング情報を用いて、逆Ｐ
ＣＲ増幅用のＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡの開裂に
Ｒｓａ Ｉ及びＢｓｓＨ ＩＩを選択した。２０単位の
ＢｓｓＨ ＩＩ又は４０単位のＲｓａ Ｉとの１００マ
イクロリットル反応物中で１０マイクログラムのＮ．ｌ
ａｃｔａｍｉｃａ ＤＮＡを開裂した。Ｒｓａ Ｉの場
合は２０００塩基対のサイズ範囲のフラグメント、Ｂｓ
ｓＨ ＩＩの場合は４５００塩基対のサイズ範囲のフラ
グメントを前述のステップ１０と同様にゲル精製した。
ゲル精製したＤＮＡフラグメントを含むアガロースを６
５°Ｃで溶融し、４２°Ｃに冷却し、１Ｘ Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼバッファで１ｍｌに希釈して約１マイクロリ
ットル／ｍｌの濃度にした。これは、連結プロセスにお
けるＤＮＡフラグメントのサーキュラリゼーションを促
進するのに十分な低い濃度である。２０マイクロリット
ル（１０，０００ＮＥＢ単位）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
を加え、この反応物を１７°Ｃで１６時間インキュベー
トした。この連結反応物を等量の平衡化フェノールで抽
出し、次いでクロロホルムで２回抽出し、１００ｍＭ
ＮａＣｌに加え、２つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分配
し、２倍容のエタノールで−７０°Ｃで１６時間沈澱さ
せた。沈澱したＤＮＡを遠心分離によって集め、３００
マイクロリットルの７０％エタノール／３０％ｄＨ２Ｏ
で洗浄し、遠心分離し且つ乾燥した。
【００７１】連結したＤＮＡフラグメントについてＰＣ
Ｒ増幅を下記のように実施した。連結し精製し乾燥した
Ｒｓａ Ｉフラグメント（約５００ｎｇ ＤＮＡ）の入
っている管に、１００マイクロリットルの１４０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．８と、４０マイクロリットル
の１ｍＭ ｄＮＴＰ溶液と、２マイクロリットルの２０
０ｍＭ ＭｇＣｌ２と、２マイクロリットルの１０％Ｔ
ｒｉｔｏｎ−Ｘ１００と、１５マイクロリットル（５０
０ｎｍｏｌ最終濃度）プライマー Ｎｌａ ＩＩＩ ＃
４（５’ＧＡＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＡＡＣＡＴＣＣＧ
３’）と２３マイクロリットルのｄＨ２Ｏとを加えた。
この反応物を下記のように混合し且つ分割した。前記混
合物２０マイクロリットルに２マイクロリットルのプラ
イマーＮｌａ ＩＩＩ ＃９（５’ＧＣＡＡＴＴＣＴＡ
ＴＡＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＧＣＣＴＴＡＡＴＧＧ３’）
（５００ｎｍｏｌ濃度まで）と、０．２５マイクロリッ
トル（０．６単位）のＴａｑ Ｉポリメラーゼと１マイ
クロリットルの２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）とを加えた。この反応物は、Ｎｌａ ＩＩＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を含むＲｓａ Ｉフラグメントの存
在に関する対照であり、増幅を発生させるためにＲｓａ
Ｉフラグメントを環状にしておくことを必要としなか
った。残りの１６２マイクロリットルに１３マイクロリ
ットルのプライマーＮｌａ ＩＩＩ（５’ＣＡＡＡＴＡ
ＴＡＣＡＴＣＧＧＡＣＴＡＣ３’）＃７（５００ｎｍｏ
ｌ濃度まで）と、８マイクロリットルのＢＳＡと２マイ
クロリットル（５単位）のＴａｑ Ｉポリメラーゼとを
加えた。この反応物を半分に分割し、１．８マイクロリ
ットルの２００ｍＭ ＭｇＣｌ２を管の１つに加えた。
これらの反応物の上に５０マイクロリットルのパラフィ
ン油を積層し、これを２５サイクルにわたってインキュ
ベートした。このサイクルは、９３°Ｃで１．５分間、
４４°Ｃで１．２分間、７０°Ｃで８．５分間の処理を
含む。次いで、試料を１６マイクロリットル採取し、６
マイクロリットルのストップダイと混合し、標準的１％
アガロースゲル中の電気泳動で分析した。同じ実験をＢ
ｓｓＨ ＩＩ連結、精製、乾燥ＤＮＡについて実施し
た。プライマー＃４及び＃７とのＲｓａ Ｉ ２ｍＭ
ＭｇＣｌ２反応は約３マイクログラムのＤＮＡを２００
０塩基対という予想されたサイズで産生させた。Ｂｓｓ
ＨＩＩ消化連結ＤＮＡの類似の反応は増幅ＤＮＡを全く
産生させなかったが、ＢｓｓＨ ＩＩ対照実験では約１
２００塩基対の予期されたフラグメントが産生された。
Ｒｓａ Ｉ増幅によって得られた増幅ＤＮＡをフェノー
ル及びクロロホルムで抽出し、前述のように沈澱させ
た。
Ｒ増幅を下記のように実施した。連結し精製し乾燥した
Ｒｓａ Ｉフラグメント（約５００ｎｇ ＤＮＡ）の入
っている管に、１００マイクロリットルの１４０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．８と、４０マイクロリットル
の１ｍＭ ｄＮＴＰ溶液と、２マイクロリットルの２０
０ｍＭ ＭｇＣｌ２と、２マイクロリットルの１０％Ｔ
ｒｉｔｏｎ−Ｘ１００と、１５マイクロリットル（５０
０ｎｍｏｌ最終濃度）プライマー Ｎｌａ ＩＩＩ ＃
４（５’ＧＡＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＡＡＣＡＴＣＣＧ
３’）と２３マイクロリットルのｄＨ２Ｏとを加えた。
この反応物を下記のように混合し且つ分割した。前記混
合物２０マイクロリットルに２マイクロリットルのプラ
イマーＮｌａ ＩＩＩ ＃９（５’ＧＣＡＡＴＴＣＴＡ
ＴＡＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＧＣＣＴＴＡＡＴＧＧ３’）
（５００ｎｍｏｌ濃度まで）と、０．２５マイクロリッ
トル（０．６単位）のＴａｑ Ｉポリメラーゼと１マイ
クロリットルの２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）とを加えた。この反応物は、Ｎｌａ ＩＩＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を含むＲｓａ Ｉフラグメントの存
在に関する対照であり、増幅を発生させるためにＲｓａ
Ｉフラグメントを環状にしておくことを必要としなか
った。残りの１６２マイクロリットルに１３マイクロリ
ットルのプライマーＮｌａ ＩＩＩ（５’ＣＡＡＡＴＡ
ＴＡＣＡＴＣＧＧＡＣＴＡＣ３’）＃７（５００ｎｍｏ
ｌ濃度まで）と、８マイクロリットルのＢＳＡと２マイ
クロリットル（５単位）のＴａｑ Ｉポリメラーゼとを
加えた。この反応物を半分に分割し、１．８マイクロリ
ットルの２００ｍＭ ＭｇＣｌ２を管の１つに加えた。
これらの反応物の上に５０マイクロリットルのパラフィ
ン油を積層し、これを２５サイクルにわたってインキュ
ベートした。このサイクルは、９３°Ｃで１．５分間、
４４°Ｃで１．２分間、７０°Ｃで８．５分間の処理を
含む。次いで、試料を１６マイクロリットル採取し、６
マイクロリットルのストップダイと混合し、標準的１％
アガロースゲル中の電気泳動で分析した。同じ実験をＢ
ｓｓＨ ＩＩ連結、精製、乾燥ＤＮＡについて実施し
た。プライマー＃４及び＃７とのＲｓａ Ｉ ２ｍＭ
ＭｇＣｌ２反応は約３マイクログラムのＤＮＡを２００
０塩基対という予想されたサイズで産生させた。Ｂｓｓ
ＨＩＩ消化連結ＤＮＡの類似の反応は増幅ＤＮＡを全く
産生させなかったが、ＢｓｓＨ ＩＩ対照実験では約１
２００塩基対の予期されたフラグメントが産生された。
Ｒｓａ Ｉ増幅によって得られた増幅ＤＮＡをフェノー
ル及びクロロホルムで抽出し、前述のように沈澱させ
た。
【００７２】１４．増幅ＤＮＡからのクローニング：Ｓ
ａｕ３Ａ Ｉを用いて増幅ＤＮＡからエンドヌクレアー
ゼ遺伝子のアミノ末端部分をクローンした。Ｓａｕ ３
ＡＩを選択したのは、単一の５００塩基対Ｓａｕ ３Ａ
ＩフラグメントがＮｌａ ＩＩＩエンドヌクレアーゼの
欠失部分を含んでいる疑いがあり、且つＮ．ｌａｃｔａ
ｍｉｃａゲノムＤＮＡが、出発ゲノムＤＮＡではなく増
幅ＤＮＡだけが開裂されてベクターへの連結に使用され
るように、Ｓａｕ３ＡＩの開裂を防止すべくメチル化さ
れているからである。５マイクロリットルの増幅ＤＮＡ
（０．３マイクログラム）を２５マイクロリットルのＳ
ａｕ３Ａ Ｉ反応バッファ中に希釈し、１マイクロリッ
トル（５単位）のＳａｕ３Ａ Ｉを加えて３７°Ｃで１
時間インキュベートした。この反応物をフェノール及び
クロロホルムで抽出し、前述のように沈澱させた。沈澱
したＤＮＡを１７マイクロリットルのｄＨ２０中に懸濁
させ、これに２マイクロリットルの１０Ｘ連結バッファ
と、１マイクロリットル（１００ｎｇ）のＢａｍＨ Ｉ
開裂脱ホスホリル化ｐＵＣ１９ ＤＮＡと１マイクロリ
ットル（１００単位ＮＥＢ）のＴ４ ＤＮＡリガーゼと
を加えた。この反応物を１７°Ｃで１６時間インキュベ
ートし、次いで１０マイクロリットルのクロロホルムで
抽出した。この連結反応物１０マイクロリットルを２０
０マイクロリットルの氷冷コンピテントＥ．ｃｏｌｉ
ＲＲＩ ｄａｍ−細胞（ＧＭ ２９７１ ｄａｍ１
３：：ｔｎ９）と混合し、４分間４２°Ｃに暖め、１０
０マイクログラム／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−寒
天プレート上に配置した。個々のａｍｐ耐性コロニーを
採取し、ミニプレプ化し（ｍｉｎｉｐｒｅｐｅｄ）、そ
のプラドＤＮＡを制限地図作成して分析して、先にクロ
ーンした配列決定したＤＮＡの１７８塩基対とエンドヌ
クレアーゼ遺伝子の欠失部分をコードすると思われるＤ
ＮＡの約３２５塩基対とを含む５００塩基対Ｓａｕ３Ａ
Ｉフラグメントの存在を調べた。分析した１４のミニ
プレプのうち、このようなクローンｐＲＭ１２５ａｍｐ
１１３−１１が１つ得られた。
ａｕ３Ａ Ｉを用いて増幅ＤＮＡからエンドヌクレアー
ゼ遺伝子のアミノ末端部分をクローンした。Ｓａｕ ３
ＡＩを選択したのは、単一の５００塩基対Ｓａｕ ３Ａ
ＩフラグメントがＮｌａ ＩＩＩエンドヌクレアーゼの
欠失部分を含んでいる疑いがあり、且つＮ．ｌａｃｔａ
ｍｉｃａゲノムＤＮＡが、出発ゲノムＤＮＡではなく増
幅ＤＮＡだけが開裂されてベクターへの連結に使用され
るように、Ｓａｕ３ＡＩの開裂を防止すべくメチル化さ
れているからである。５マイクロリットルの増幅ＤＮＡ
（０．３マイクログラム）を２５マイクロリットルのＳ
ａｕ３Ａ Ｉ反応バッファ中に希釈し、１マイクロリッ
トル（５単位）のＳａｕ３Ａ Ｉを加えて３７°Ｃで１
時間インキュベートした。この反応物をフェノール及び
クロロホルムで抽出し、前述のように沈澱させた。沈澱
したＤＮＡを１７マイクロリットルのｄＨ２０中に懸濁
させ、これに２マイクロリットルの１０Ｘ連結バッファ
と、１マイクロリットル（１００ｎｇ）のＢａｍＨ Ｉ
開裂脱ホスホリル化ｐＵＣ１９ ＤＮＡと１マイクロリ
ットル（１００単位ＮＥＢ）のＴ４ ＤＮＡリガーゼと
を加えた。この反応物を１７°Ｃで１６時間インキュベ
ートし、次いで１０マイクロリットルのクロロホルムで
抽出した。この連結反応物１０マイクロリットルを２０
０マイクロリットルの氷冷コンピテントＥ．ｃｏｌｉ
ＲＲＩ ｄａｍ−細胞（ＧＭ ２９７１ ｄａｍ１
３：：ｔｎ９）と混合し、４分間４２°Ｃに暖め、１０
０マイクログラム／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−寒
天プレート上に配置した。個々のａｍｐ耐性コロニーを
採取し、ミニプレプ化し（ｍｉｎｉｐｒｅｐｅｄ）、そ
のプラドＤＮＡを制限地図作成して分析して、先にクロ
ーンした配列決定したＤＮＡの１７８塩基対とエンドヌ
クレアーゼ遺伝子の欠失部分をコードすると思われるＤ
ＮＡの約３２５塩基対とを含む５００塩基対Ｓａｕ３Ａ
Ｉフラグメントの存在を調べた。分析した１４のミニ
プレプのうち、このようなクローンｐＲＭ１２５ａｍｐ
１１３−１１が１つ得られた。
【００７３】１５．完全形（ｉｎｔａｃｔ）ＮｌａＨＩ
ＩＩエンドヌクアーゼ遺伝子の作製：５０μｌの反応溶
液中で、２μｇのＥｃｏＲＩライブラリーメチラーゼク
ローンｐＲＭ１２５Ｍ１０１−８を、２０単位のＢａｍ
ＨＩで３７℃で１時間消化した。メチラーゼ及び全ｐＵ
Ｃ１９ベクター（ＥｃｏＲＩ部位からＢｍａＨＩ部位ま
での塩基３９６〜４１７のポリリンカーを除く）を含む
７．４ｋｂフラグメントを、１％ＬＭＰアガロースゲル
からゲル精製し、連結して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩｄａ
ｍ−細胞（１０項に前記）を形質転換した。このＢｍａ
ＨＩ欠失は、クローンから第２のＣｌａＩ部位を除去し
た。ｄａｍマイナス宿主中でプラスミドを増殖させる
と、エンドヌクレアーゼ遺伝子のＣｌａＩ部位が開裂可
能になった。その理由は、オーバーラップするＭｂｏＩ
部位がＥ．ｃｏｌｉｄａｍメチラーゼによってメチル化
されなくなるからである。ＢａｍＨＩ欠失プラスミドｐ
ＲＭ１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨをミニプレップ化
し、８μｌ（約４μｇ）のこのＤＮＡを、５０μｌのＣ
ｌａＩ反応緩衝液に希釈した。１μｌ（６単位）のＣｌ
ａＩ、１μｌ（２０単位）のＰｓｔＩ及び１μｌ（１５
単位）のＥｃｏＯ１０９Ｉを添加し、反応溶液を３７℃
で２時間インキュベートした。ＥｃｏＯ１０９Ｉを使用
すると、同様のサイズの不要なフラグメントをより小さ
い２つのフラグメントに開裂するので所望のフラグメン
トのゲル精製が容易になる。ＣｌａＩは、別々にクロー
ニングされたエンドヌクレアーゼ遺伝子の２つの部分間
のオーバーラップ領域を開裂し、エンドヌクレアーゼ遺
伝子の２つの部が接合する部位である。ＰｓｔＩはベク
ター中にのみ発生し、メチラーゼ及びエンドヌクレアー
ゼ遺伝子の外部のクローニングされたフラグメントの末
端をベクターに接合するために使用される。アンピシリ
ンプロセスから得られた１０μｌ（２μｇ）のｐＲＭ１
２５ａｍｐ１１３−１１、Ｓａｕ３ＡＩフラグメントク
ローンを、５０μｌのＣｌａＩ反応緩衝液に希釈し、１
μｌ（６単位）のＣｌａＩ及び１μｌ（２０単位）のＰ
ｓｔＩを加え、反応溶液を３７℃で２時間インキュベー
トした。ｐＲＭ１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨに由来の
Ｃ１ａＩからＰｓｔＩまで２．９ｋｂのフラグメントと
ｐＲＭ１２５ａｍｐ１１３−１１に由来のＣｌａＩから
ＰｓｔＩまでの３．２ｋｂのフラグメント（ｐＵＣ１９
ベクターを含む）とを、１％ＬＭＰアガロースから上記
のごとくゲル精製した。ゲルスライスを６５℃で５分間
融解し、１０μｌ（約２００ｎｇ）の２．９ｋｂのｐＲ
Ｍ１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨフラグメントを、３μ
ｌ（約６０ｎｇ）の３．２ｋｂのｐＲＭ１２５ａｍｐ１
１３−１１フラグメントと混合した。混合物を４２℃に
冷却し、０．５μｌ（５０単位 ＮＥＢ） Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼを含む１３μｌの２×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
緩衝液を加え、かき混ぜて、反応溶液を１７℃で１６時
間インキュベートした。次いで、結合混合物を６５℃で
５分間融解し、４２℃に冷却した。１０μｌの連結産物
を、ｐＡＣＹＣ１８４−ＮｌａＩＩＩメチラーゼプラス
ミドｐＲＭ１２５Ｍ ＡＣＹＣ−４を含む２００μｌの
氷冷コンピテントＥ．ＣｏｌｉＲＲＩ細胞と混合し、４
２℃で４分間インキュベートし、次いで１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレーティ
ングし、３０℃で２４時間インキュベートした。増殖し
た８つのコロニーをミニプレップ化し、これらのプラス
ミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化によって解析すると、８つ
のうちの７つのプラスミドＤＮＡが所望の構築物を含ん
でいることが判明した。これらのプラスミドをｐＲＭ１
２５ＲＭ１００ｃ−１〜８と命名した。
ＩＩエンドヌクアーゼ遺伝子の作製：５０μｌの反応溶
液中で、２μｇのＥｃｏＲＩライブラリーメチラーゼク
ローンｐＲＭ１２５Ｍ１０１−８を、２０単位のＢａｍ
ＨＩで３７℃で１時間消化した。メチラーゼ及び全ｐＵ
Ｃ１９ベクター（ＥｃｏＲＩ部位からＢｍａＨＩ部位ま
での塩基３９６〜４１７のポリリンカーを除く）を含む
７．４ｋｂフラグメントを、１％ＬＭＰアガロースゲル
からゲル精製し、連結して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩｄａ
ｍ−細胞（１０項に前記）を形質転換した。このＢｍａ
ＨＩ欠失は、クローンから第２のＣｌａＩ部位を除去し
た。ｄａｍマイナス宿主中でプラスミドを増殖させる
と、エンドヌクレアーゼ遺伝子のＣｌａＩ部位が開裂可
能になった。その理由は、オーバーラップするＭｂｏＩ
部位がＥ．ｃｏｌｉｄａｍメチラーゼによってメチル化
されなくなるからである。ＢａｍＨＩ欠失プラスミドｐ
ＲＭ１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨをミニプレップ化
し、８μｌ（約４μｇ）のこのＤＮＡを、５０μｌのＣ
ｌａＩ反応緩衝液に希釈した。１μｌ（６単位）のＣｌ
ａＩ、１μｌ（２０単位）のＰｓｔＩ及び１μｌ（１５
単位）のＥｃｏＯ１０９Ｉを添加し、反応溶液を３７℃
で２時間インキュベートした。ＥｃｏＯ１０９Ｉを使用
すると、同様のサイズの不要なフラグメントをより小さ
い２つのフラグメントに開裂するので所望のフラグメン
トのゲル精製が容易になる。ＣｌａＩは、別々にクロー
ニングされたエンドヌクレアーゼ遺伝子の２つの部分間
のオーバーラップ領域を開裂し、エンドヌクレアーゼ遺
伝子の２つの部が接合する部位である。ＰｓｔＩはベク
ター中にのみ発生し、メチラーゼ及びエンドヌクレアー
ゼ遺伝子の外部のクローニングされたフラグメントの末
端をベクターに接合するために使用される。アンピシリ
ンプロセスから得られた１０μｌ（２μｇ）のｐＲＭ１
２５ａｍｐ１１３−１１、Ｓａｕ３ＡＩフラグメントク
ローンを、５０μｌのＣｌａＩ反応緩衝液に希釈し、１
μｌ（６単位）のＣｌａＩ及び１μｌ（２０単位）のＰ
ｓｔＩを加え、反応溶液を３７℃で２時間インキュベー
トした。ｐＲＭ１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨに由来の
Ｃ１ａＩからＰｓｔＩまで２．９ｋｂのフラグメントと
ｐＲＭ１２５ａｍｐ１１３−１１に由来のＣｌａＩから
ＰｓｔＩまでの３．２ｋｂのフラグメント（ｐＵＣ１９
ベクターを含む）とを、１％ＬＭＰアガロースから上記
のごとくゲル精製した。ゲルスライスを６５℃で５分間
融解し、１０μｌ（約２００ｎｇ）の２．９ｋｂのｐＲ
Ｍ１２５Ｍ１０１−８ｄＢａｍＨフラグメントを、３μ
ｌ（約６０ｎｇ）の３．２ｋｂのｐＲＭ１２５ａｍｐ１
１３−１１フラグメントと混合した。混合物を４２℃に
冷却し、０．５μｌ（５０単位 ＮＥＢ） Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼを含む１３μｌの２×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
緩衝液を加え、かき混ぜて、反応溶液を１７℃で１６時
間インキュベートした。次いで、結合混合物を６５℃で
５分間融解し、４２℃に冷却した。１０μｌの連結産物
を、ｐＡＣＹＣ１８４−ＮｌａＩＩＩメチラーゼプラス
ミドｐＲＭ１２５Ｍ ＡＣＹＣ−４を含む２００μｌの
氷冷コンピテントＥ．ＣｏｌｉＲＲＩ細胞と混合し、４
２℃で４分間インキュベートし、次いで１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレーティ
ングし、３０℃で２４時間インキュベートした。増殖し
た８つのコロニーをミニプレップ化し、これらのプラス
ミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化によって解析すると、８つ
のうちの７つのプラスミドＤＮＡが所望の構築物を含ん
でいることが判明した。これらのプラスミドをｐＲＭ１
２５ＲＭ１００ｃ−１〜８と命名した。
【００７４】１６．ＮｌａＩＩＩ制限遺伝子クローン：
ｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４（このサンプルは、１９
９０年７月１７日、ＡＴＣＣ受託番号Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅ
Ｒ１３９８中のＮｏ．６８３６６としてＡｍｅｒｉｃａ
ｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに
寄託された）及び同様のプラスミドは、これらのプラス
ミドを含むＥ．Ｃｏｌｉ ＲＲＩの抽出物の検定によっ
てＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードし発現
することが判明した。ｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４ま
たは、ＮｌａＩＩＩメチラーゼをコードするＤＮＡを含
有する。
ｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４（このサンプルは、１９
９０年７月１７日、ＡＴＣＣ受託番号Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅ
Ｒ１３９８中のＮｏ．６８３６６としてＡｍｅｒｉｃａ
ｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに
寄託された）及び同様のプラスミドは、これらのプラス
ミドを含むＥ．Ｃｏｌｉ ＲＲＩの抽出物の検定によっ
てＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードし発現
することが判明した。ｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４ま
たは、ＮｌａＩＩＩメチラーゼをコードするＤＮＡを含
有する。
【００７５】エンドヌクレアーゼアッセイ：検定すべき
細胞の２５０ｍｌの培養物を、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬ−ブイヨン中で３７℃で一夜増殖させ
た。培養物を８Ｋｒｐｍで５分間遠心し、細胞ペレット
を、１０ｍｌの１０ｍＭのトリス．ＨＣｌ ｐＨ７．
５、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのＭ
ｇＣｌ２に再懸濁させた。１．５ｍｌの懸濁液を３回の
１５秒バーストで音波処理して細胞を破壊した。音波処
理した抽出物を１０分間ミクロ遠心して細胞破片を除去
し、上清のエンドヌクレアーゼ活性を以下の手順で検定
した：８μｇ（１６μｌ）の精製ファージλＤＮＡを４
００μｌのＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ消化緩
衝液（６項）に希釈した。７つの試験管を用い、第１試
験管に７５μｌ、残りの６つの試験管に各５０μｌずつ
溶液を分配した。１３．５μｌの抽出物を第１試験管に
添加して、ＤＮＡ１μｇあたり抽出物９μｌとした。次
に、第１試験管から２５μｌを取り出し、第２試験管に
移して３μｌ／μｇとした。２５μｌずつ移す系列希釈
を続行し、試験管３（１μｌ／μｇ）、４（０．３μｌ
／μｇ）、５（０．１μｌ／μｇ）、６（０．０３μｌ
／μｇ）、７（０．０１μｌ／μｇ）の濃度にした。試
験管を３７℃で１時間インキュベートし、次いで各試験
管の２０μｌをゲル電気泳動によって分析した。抽出物
は１ｍｌあたり約２×１０３ｕｎｉｔｓのＮｌａＩＩＩ
制限エンドヌクレアーゼを含有することが判明した。こ
れは細胞１ｇあたり２×１０４ｕｎｉｔｓに対応する。
細胞の２５０ｍｌの培養物を、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬ−ブイヨン中で３７℃で一夜増殖させ
た。培養物を８Ｋｒｐｍで５分間遠心し、細胞ペレット
を、１０ｍｌの１０ｍＭのトリス．ＨＣｌ ｐＨ７．
５、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのＭ
ｇＣｌ２に再懸濁させた。１．５ｍｌの懸濁液を３回の
１５秒バーストで音波処理して細胞を破壊した。音波処
理した抽出物を１０分間ミクロ遠心して細胞破片を除去
し、上清のエンドヌクレアーゼ活性を以下の手順で検定
した：８μｇ（１６μｌ）の精製ファージλＤＮＡを４
００μｌのＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ消化緩
衝液（６項）に希釈した。７つの試験管を用い、第１試
験管に７５μｌ、残りの６つの試験管に各５０μｌずつ
溶液を分配した。１３．５μｌの抽出物を第１試験管に
添加して、ＤＮＡ１μｇあたり抽出物９μｌとした。次
に、第１試験管から２５μｌを取り出し、第２試験管に
移して３μｌ／μｇとした。２５μｌずつ移す系列希釈
を続行し、試験管３（１μｌ／μｇ）、４（０．３μｌ
／μｇ）、５（０．１μｌ／μｇ）、６（０．０３μｌ
／μｇ）、７（０．０１μｌ／μｇ）の濃度にした。試
験管を３７℃で１時間インキュベートし、次いで各試験
管の２０μｌをゲル電気泳動によって分析した。抽出物
は１ｍｌあたり約２×１０３ｕｎｉｔｓのＮｌａＩＩＩ
制限エンドヌクレアーゼを含有することが判明した。こ
れは細胞１ｇあたり２×１０４ｕｎｉｔｓに対応する。
【００７６】１７．ｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４を含
むＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１３９８はＮｌａＩＩＩ制限エン
ドヌクレアーゼの精製に使用できる好ましい宿主であ
る。使用できるその他の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＲＲｌ、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４、などである。ア
ンピシリンを含むＬ−ブイヨンを入れた発酵槽で菌株を
３７℃で後期対数増殖期まで増殖させた。次いで、細胞
を遠心によって収集し、正しい調製物を得るために直ち
に破壊するか、または適当な時期まで−７０℃で凍結保
存する。
むＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１３９８はＮｌａＩＩＩ制限エン
ドヌクレアーゼの精製に使用できる好ましい宿主であ
る。使用できるその他の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＲＲｌ、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４、などである。ア
ンピシリンを含むＬ−ブイヨンを入れた発酵槽で菌株を
３７℃で後期対数増殖期まで増殖させた。次いで、細胞
を遠心によって収集し、正しい調製物を得るために直ち
に破壊するか、または適当な時期まで−７０℃で凍結保
存する。
【００７７】１８．組換えＮｌａＩＩＩエンドヌクレア
ーゼの精製：プラスミドｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４
を含む２５ｇのＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１３９８細胞を、１
００ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＫＰＯ４ ｐＨ７．
０、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ
のＥＤＴＡ）に再懸濁させた。細胞を音波処理によって
破壊した。可溶性タンパク質の放出をモニターし、出発
細胞ペースト重量の６％が可溶性タンパク質として放出
されるまで音波処理を続行した。５ＭのＮａＣｌを加え
て総ＮａＣｌ濃度を０．１Ｍとし、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ
２−２１遠心機及びＪＡ−１４ヘッドによって４℃で１
２，０００ｒｐｍで３０分間遠心することによって溶液
を清澄化した。次いで粗上清を、緩衝液Ｂ（０．１Ｍの
ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ）で平衡した２．５×１１ｃｍ
のＰｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムで処理し
た。カラムを１００ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した。緩衝液
Ａ中の０．１ＭのＮａＣｌから１．１ＭのＮａＣｌまで
のリニヤグラジェント６００ｍｌでカラムを処理し、１
０ｍｌ毎の分画を収集した。上記のごとくλＤＮＡでカ
ラム分画を検定することによってＮｌａＩＩＩ活性のピ
ークを測定した。ＮｌａＩＩＩは約０．４ＭのＮａＣｌ
に溶出した。ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼピークを
含む分画を緩衝液Ｂに透析し、緩衝液Ｂで平衡した２．
５×４ｃｍのヘパリン−セファロースカラムで処理し
た。カラムを４０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで、緩
衝液Ａ中の０．１ＭのＮａＣｌから１．１ＭのＮａＣｌ
のリニヤグラジェント２００ｍｌで処理した。４ｍｌ毎
の分画を収集し、上記のごとく検定してＮｌａＩＩＩピ
ークの位置を決定した。ＮｌａＩＩＩは０．３Ｍ〜０．
５ＭのＮａＣｌに溶出した。ＮｌａＩＩＩ含有分画を緩
衝液Ｃ（２０ｍＭのＫＰＯ４ｐＨ６．０、１０ｍＭの２
−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．
１ＭのＮａＣｌ）に透析し緩衝液Ｃで平衡した１．５×
１０ｃｍのＣＭ−セファロースカラムで処理した。カラ
ムを３０ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄し、次いで０．１Ｍから
１．１ＭのＮａＣｌまでのリニヤグラジェント１８０ｍ
ｌで処理して３ｍｌ毎の分画を収集した。ＮｌａＩＩＩ
は約０．３ＭのＮａＣｌで溶出することが判明した。Ｎ
ｌａＩＩＩの最大活性を含む分画を、緩衝液Ｄ（２０ｍ
ＭのＫＰＯ４ｐＨ７．０、１０ｍＭの２−メルカプトエ
タノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣ
ｌ）で平衡したＧ−７５カラムで処理し、カラムに５０
０ｍｌの緩衝液Ｄを加えた。ＮｌａＩＩＩの最大活性を
含む分画は２２０〜２５０ｍｌに溶出し、これをＮｌａ
ＩＩＩ保存用緩衝液（１０ｍＭのトリス．ＨＣｌ ｐＨ
７．４、２００ｍＭのＫＣ１、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
１ｍＭのＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５０％の
グリセロール）に透析し、−２０℃で保存した。この精
製から得られたＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼは実質
的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキ
ソヌクレアーゼを含まず、また、ＮｌａＩ、ＮｌａＩＩ
及びＮｌａＩＶエンドヌクレアーゼは全く混在していな
い。
ーゼの精製：プラスミドｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４
を含む２５ｇのＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１３９８細胞を、１
００ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＫＰＯ４ ｐＨ７．
０、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ
のＥＤＴＡ）に再懸濁させた。細胞を音波処理によって
破壊した。可溶性タンパク質の放出をモニターし、出発
細胞ペースト重量の６％が可溶性タンパク質として放出
されるまで音波処理を続行した。５ＭのＮａＣｌを加え
て総ＮａＣｌ濃度を０．１Ｍとし、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ
２−２１遠心機及びＪＡ−１４ヘッドによって４℃で１
２，０００ｒｐｍで３０分間遠心することによって溶液
を清澄化した。次いで粗上清を、緩衝液Ｂ（０．１Ｍの
ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ）で平衡した２．５×１１ｃｍ
のＰｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムで処理し
た。カラムを１００ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した。緩衝液
Ａ中の０．１ＭのＮａＣｌから１．１ＭのＮａＣｌまで
のリニヤグラジェント６００ｍｌでカラムを処理し、１
０ｍｌ毎の分画を収集した。上記のごとくλＤＮＡでカ
ラム分画を検定することによってＮｌａＩＩＩ活性のピ
ークを測定した。ＮｌａＩＩＩは約０．４ＭのＮａＣｌ
に溶出した。ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼピークを
含む分画を緩衝液Ｂに透析し、緩衝液Ｂで平衡した２．
５×４ｃｍのヘパリン−セファロースカラムで処理し
た。カラムを４０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで、緩
衝液Ａ中の０．１ＭのＮａＣｌから１．１ＭのＮａＣｌ
のリニヤグラジェント２００ｍｌで処理した。４ｍｌ毎
の分画を収集し、上記のごとく検定してＮｌａＩＩＩピ
ークの位置を決定した。ＮｌａＩＩＩは０．３Ｍ〜０．
５ＭのＮａＣｌに溶出した。ＮｌａＩＩＩ含有分画を緩
衝液Ｃ（２０ｍＭのＫＰＯ４ｐＨ６．０、１０ｍＭの２
−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．
１ＭのＮａＣｌ）に透析し緩衝液Ｃで平衡した１．５×
１０ｃｍのＣＭ−セファロースカラムで処理した。カラ
ムを３０ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄し、次いで０．１Ｍから
１．１ＭのＮａＣｌまでのリニヤグラジェント１８０ｍ
ｌで処理して３ｍｌ毎の分画を収集した。ＮｌａＩＩＩ
は約０．３ＭのＮａＣｌで溶出することが判明した。Ｎ
ｌａＩＩＩの最大活性を含む分画を、緩衝液Ｄ（２０ｍ
ＭのＫＰＯ４ｐＨ７．０、１０ｍＭの２−メルカプトエ
タノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣ
ｌ）で平衡したＧ−７５カラムで処理し、カラムに５０
０ｍｌの緩衝液Ｄを加えた。ＮｌａＩＩＩの最大活性を
含む分画は２２０〜２５０ｍｌに溶出し、これをＮｌａ
ＩＩＩ保存用緩衝液（１０ｍＭのトリス．ＨＣｌ ｐＨ
７．４、２００ｍＭのＫＣ１、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
１ｍＭのＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５０％の
グリセロール）に透析し、−２０℃で保存した。この精
製から得られたＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼは実質
的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキ
ソヌクレアーゼを含まず、また、ＮｌａＩ、ＮｌａＩＩ
及びＮｌａＩＶエンドヌクレアーゼは全く混在していな
い。
【図１】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼのクロー
ニング及び製造の手順の説明図である。
ニング及び製造の手順の説明図である。
【図２】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼのクロー
ニング及び製造の手順の説明図の続きである。
ニング及び製造の手順の説明図の続きである。
【図３】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＮｌ
ａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードするＮ． ｌａｃｔａ
ｍｉｃａのＤＮＡ断片であって、ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ
３７２５４）のＢａｍＨＩ部位及びＰｓｔＩ部位に挿入
してｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４を作製した際に用い
た、上記ＤＮＡ断片の制限地図である。
ａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードするＮ． ｌａｃｔａ
ｍｉｃａのＤＮＡ断片であって、ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ
３７２５４）のＢａｍＨＩ部位及びＰｓｔＩ部位に挿入
してｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４を作製した際に用い
た、上記ＤＮＡ断片の制限地図である。
【図４】ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＮｌ
ａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードするＮ． １ａｃｔａ
ｍｉｃａのＤＮＡ断片であって、ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ
３７２５４）のＢａｍＨＩ部位及びＰｓｔＩ部位に挿入
してｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４を作製した際に用い
た、上記ＤＮＡ断片の制限地図の続きである。
ａＩＩＩ修飾メチラーゼをコードするＮ． １ａｃｔａ
ｍｉｃａのＤＮＡ断片であって、ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ
３７２５４）のＢａｍＨＩ部位及びＰｓｔＩ部位に挿入
してｐＲＭ１２５ＲＭ１００ｃ−４を作製した際に用い
た、上記ＤＮＡ断片の制限地図の続きである。
【図５】ｐＲＭ１２５ＲＭ １００ｃ−４を有するＥ．
ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴＣＣ ３１３４３）の細胞抽
出物のＮ１ａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示す
アガロースゲルの電気泳動を示す写真である。
ｃｏｌｉ ＲＲ１（ＡＴＣＣ ３１３４３）の細胞抽
出物のＮ１ａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示す
アガロースゲルの電気泳動を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:36） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 1/21 C12N 9/10 C12N 9/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】 Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ ＮＲＣＣ
２１１８によって産生されるＮｌａＩＩＩ制限エンドヌ
クレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ
断片。 - 【請求項２】 Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ ＮＲＣＣ
２１１８によって産生されるＮｌａＩＩＩメチラーゼを
コードするヌクレオチド配列をも含むことを特徴とする
請求項１に記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項３】 プラスミドｐＲＭ１２５ＲＭ １００ｃ
−４から得られることを特徴とする請求項１または２に
記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項４】 Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ ＮＲＣＣ
２１１８によって産生されるＮｌａＩＩＩ制限エンドヌ
クレアーゼをコードするＤＮＡ断片を插入したベクター
を含む組み換え体ベクター。 - 【請求項５】 請求項１または２に記載のＤＮＡ断片を
插入したベクターを含む組み換え体ベクター。 - 【請求項６】 請求項４に記載の組み換え体ベクターで
宿主細胞を形質転換して得られる形質転換細胞。 - 【請求項７】 請求項５に記載の組み換え体ベクターで
宿主細胞を形質転換して得られる形質転換細胞。 - 【請求項８】 宿主細胞がＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１、
Ｅ． ｃｏｌｉ ＭＭ２９４またはＥ． ｃｏｌｉ Ｅ
Ｒ１３９８であることを特徴とする請求項６に記載の形
質転換細胞。 - 【請求項９】 請求項４に記載の組み換え体ベクターで
形質転換した宿主細胞をＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレ
アーゼの発現に適した条件下に培養することを含むＮｌ
ａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。 - 【請求項１０】 請求項５に記載の組み換え体ベクター
で形質転換した宿主細胞をＮｌａＩＩＩ制限エンドヌク
レアーゼの発現に適した条件下に培養することを含むＮ
ｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。 - 【請求項１１】 組み換え体ベクターがプラスミドｐＲ
Ｍ１２５ＲＭ １００ｃ−４を含むことを特徴とする請
求項９に記載の方法。 - 【請求項１２】 宿主細胞がＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１、
Ｅ． ｃｏｌｉ ＭＭ２９４またはＥ． ｃｏｌｉ Ｅ
Ｒ１３９８であることを特徴とする請求項９に記載の方
法。
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|---|
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