JPH0698779A - ＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼをクローン化し産生する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 １）Nocardia aerocolonigenes由来の制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子を、この制限遺伝子を発現させ
得る宿主に導入し；２）NaeI制限エンドヌクレアーゼ活
性をコードし且つ発現させるプラスミドを含む宿主を発
酵させ；次いで３）NaeI制限エンドヌクレアーゼ活性を
コードし且つ発現させるプラスミドを含む発酵した宿主
からNaeI制限エンドヌクレアーゼを精製することにより
NaeI制限エンドヌクレアーゼをクローニングし且つ産生
する方法。 【効果】 実質的に純粋なNaeI制限エンドヌクレアーゼ
の組換えＤＮＡ技術による大量合成を可能とした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＮａｅＩ制限エンドヌ
クレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮ
Ａ、並びに前記組換えＤＮＡから前記酵素を産生する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】制限エ
ンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在する酵素の一種
である。制限エンドヌクレアーゼは、他の混入細菌成分
から精製して、ＤＮＡを正確なフラグメントに切断する
ために実験室で使用できる。この性質は、ＤＮＡ分子
の、唯一のものとしての同定と構成遺伝子への分別とを
可能にする。制限エンドヌクレアーゼは現代の遺伝子研
究に不可欠の道具であることが判明した。制限エンドヌ
クレアーゼは遺伝子工学及び分析の実施手段となる生化
学的「はさみ」なのである。

【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の
特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、該
ヌクレオチド配列に結合することによって作用する。こ
のようにして結合した制限エンドヌクレアーゼは認識配
列内で、又は認識配列の片側に、ＤＮＡ分子を開裂す
る。種々の制限エンドヌクレアーゼが種々の認識配列に
対して親和性を示す。これまでに調べられた数百種の細
菌のうち、ほぼ百の異なる制限エンドヌクレアーゼが同
定されている。

【０００４】細菌は、種毎に僅かの制限エンドヌクレア
ーゼしか所有しない性向を有する。エンドヌクレアーゼ
は通常、その由来源である細菌にちなんで命名される。
例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ
種は、ＨａｅＩ、ＨａｅＩＩ及びＨａｅＩＩＩという３
種類の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これ
らの酵素はそれぞれ配列（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、Ｐ
ｕＧＣＧＣＰｙ及びＧＧＣＣを認識し開裂する。これに
対し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｒ
Ｙ１３は、配列ＧＡＡＴＴＣを認識する１種類の酵素Ｅ
ｃｏＲＩしか合成しない。

【０００５】理論に拘束されたくはないが、自然界で
は、細菌細胞が安全に生存する上で制限エンドヌクレア
ーゼが保護的役割を果たしていると考えられる。制限エ
ンドヌクレアーゼは、該酵素がなければ細菌を破壊する
か又は細菌に寄生するであろうウイルス及びプラスミド
のような外来ＤＮＡ分子による感染に細菌が耐えられる
ようにする。制限エンドヌクレアーゼは、感染ＤＮＡ分
子の長さを走査して、認識配列が出現する毎に前記長さ
を開裂することにより前記耐性を与える。このようにし
て開裂が行われると、感染遺伝子の多くが失活し、ＤＮ
Ａが非特異的エンドヌクレアーゼによって更に分解され
るようになる。

【０００６】細菌保護系の第２の成分は修飾メチラーゼ
である。この種の酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補
的な関係にあり、細菌が自己のＤＮＡを保護し、該ＤＮ
Ａを外来感染ＤＮＡから判別できるようにする手段を与
える。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアー
ゼと同じヌクレオチド認識配列を認識しこれに結合する
が、ＤＮＡを開裂する代わりに、メチル基の付加によっ
て前記配列内のヌクレオチドのいずれかを化学的に修飾
する。メチル化の後は、制限エンドヌクレアーゼが認識
配列に結合することも、該認識配列を開裂することもな
い。細菌細胞のＤＮＡは常に該細菌の修飾メチラーゼの
活性によって完全に修飾される。従って、内生制限エン
ドヌクレアーゼの存在に対しては感受性を全く示さな
い。制限エンドヌクレアーゼの認識及び攻撃に対して感
受性を示すのは、未修飾の、従って識別可能な外来ＤＮ
Ａだけである。

【０００７】遺伝子工学技術の誕生により、現在では遺
伝子をクローン化し、これらの遺伝子によってコードさ
れるタンパク質及び酵素を従来の精製技術よりも大量に
産生することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子のクローンを単離するための鍵は、この種のクロー
ンを、複雑な「ライブラリー」、即ち「ショットガン」
法によって誘導されるクローン集団内で、前記クローン
が１０^-3〜１０^-4の低頻度で発生する場合に同定する簡
単で信頼できる方法を開発することにある。この方法
は、クローンの大部分を占める望ましくないクローンが
破壊され、希少な望ましいクローンが生き残るように、
選択的であるのが好ましい。

【０００８】ＩＩ型の制限−修飾系はより高い頻度でク
ローン化されている。第１のクローン化系では、バクテ
リオファージ感染が制限エンドヌクレアーゼクローンの
同定又は選択手段として使用された（ＥｃｏＲＩＩ：Ｋ
ｏｓｙｋｈら、Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ １７
８：７１７−７１９（１９８０）；ＨｈａＩＩ：Ｍａｎ
ｎら，Ｇｅｎｅ ３：９７−１１２（１９７８）；Ｐｓ
ｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．７８ １５０３−１５０７（１９８１））。細
菌中に制限−修飾系が存在すると、細菌はバクテリオフ
ァージによる感染に耐えることができ、クローン化制限
−修飾遺伝子を有する細胞が、原則として、ファージの
作用を受けたライブラリーからの生存者として選択的に
単離され得る。しかしながらこの方法の効果には限界が
あることが判明した。特に、クローン化制限−修飾遺伝
子が、選択的残存を与えるに十分なファージ耐性を常に
示すとは限らないことが判明した。

【０００９】別のクローニング方法は、プラスミドによ
って運ばれるもの（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）とし
て特徴付けられた系を大腸菌クローニングプラスミド中
に移入する操作を含む（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅ
ｒｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３６５
９−３６７６（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒ
ｓ及びＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８０：４０２−４０６（１９８３）；Ｔ
ｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ，Ｇｅｎｅ １９：３５５
−３５９（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈ
ａｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１−５
０９（１９８５））。

【００１０】第３の方法であって、より多くの系のクロ
ーニングに使用されている方法では、活性メチラーゼ遺
伝子に関する選択によってクローニングが行われている
（例えば、１９８６年９月３日公開のＥＰＯ Ｎｏ．：
１９３，４１３参照。制限遺伝子及び修飾遺伝子はしば
しば密に関係しているため、これらの遺伝子はしばしば
両方が同時にクローン化され得る。但し、この選択によ
って完全な制限系が得られるとは限らず、メチラーゼ遺
伝子のみが得られることもある（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍ
ｏｌａｎｙｉら、Ｇｅｎｅ １０：２１９−２２５（１
９８０）；Ｂｃｎ Ｉ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら、Ｇｅ
ｎｅ ２０：１９７−２０４（１９８２）；Ｂｓｕ Ｒ
Ｉ：Ｋｉｓｓ及びＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ ２１：１
１１−１１９（１９８３）；ＭｓＰ Ｉ：Ｗａｌｄｅｒ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５−１２
４１（１９８３））。

【００１１】ある系では、クローニングの問題が、修飾
によって保護されていない宿主中にエンドヌクレアーゼ
遺伝子を挿入する試みに存在し得る。メチラーゼ遺伝子
及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を共通のＤＮＡフラグメ
ント上で挿入する場合は、エンドヌクレアーゼ遺伝子が
宿主の遺伝子を開裂する前にメチラーゼ遺伝子が宿主を
修飾又は保護しなければならない。

【００１２】これらの系を大腸菌中でクローン化するた
めの別の障害が、種々のメチラーゼをクローン化するプ
ロセスで発見された。多くの大腸菌株（クローニングで
通常使用されているものを含む）はＤＮＡ含有シトシン
メチル化の導入に耐える系を有する（Ｒａｌｅｉｇｈ及
びＷｉｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ ８３：９０７０−９０７４（１９８
６））。従って、どの大腸菌株をクローニングに使用す
るかを熟慮することも必要である。

【００１３】精製した制限エンドヌクレアーゼ、そして
制限エンドヌクレアーゼほどではないが修飾メチラーゼ
は、実験室でＤＮＡの特徴付け及び再構成を行うための
有用な道具であるため、これらの酵素を大量に合成する
細菌株を組換えＤＮＡ技術によって得ることは商業的に
有利なことである。このような株は、精製操作を簡単に
すると共に商業的に有用な量で産生する手段を与えるた
め、有用と思われる。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ２３
８７０）から得ることができるＮａｅＩ制限エンドヌク
レアーゼ及び修飾メチラーゼの遺伝子をコードする組換
えＤＮＡと、前記組換えＤＮＡから前記酵素を産生する
ための方法とに関する。本発明は、制限エンドヌクレア
ーゼＮａｅＩ、即ちＤＮＡ配列５’−ＧＣＣＧＧＣ−
３’を認識し、オーバーハングを残さずに前記認識配列
の中央を第２のＣの後で開裂する酵素を発現する形質転
換宿主にも関する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．，Ｄ．Ｃｏｍ
ｂ，Ｌ．Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ及びＩ．Ｓｃｈｉｌｄｋｒ
ａｕｔ，未公開論文）。本発明の方法で産生したＮａｅ
Ｉメチラーゼ又は制限エンドヌクレアーゼは実質的に純
粋であり、実施例１のステップ１８に記載のように従来
技術によって形成した制限エンドヌクレアーゼ調製物に
通常見られる混入物を含んでいない。ＮａｅＩ制限−修
飾系をクローン化するための好ましい方法の１つは、適
当なベクターを選択し、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃ
ｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ由来ＤＮＡを含むライブラリーを
幾つか形成し、ＮａｅＩ修飾メチラーゼをコードするＤ
ＮＡを含むクローンを単離し、メチラーゼクローンを含
む大腸菌及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ株におけるエンドヌクレアーゼ活性のアッセイによ
ってエンドヌクレアーゼ遺伝子が存在していなかったこ
とを確認し、メチラーゼ遺伝子の一部分を欠失したベク
ターと、改変選択プロトコルと、宿主としての大腸菌Ａ
Ｐ１−２００（Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら）とを用いて
メチラーゼ遺伝子に隣接する染色体ＤＮＡをクローニン
グして、前記クローンのスクリーニングを行い、新しい
クローンによって産生された検出可能なエンドヌクレア
ーゼ活性が存在していなかったことを確認し、ＮａｅＩ
制限エンドヌクレアーゼの発現を求めて前記ＤＮＡをＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓにクローニ
ングする試みを行い、新しくクローン化されたＤＮＡと
ＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼのアミノ末端との配列
決定を行い、これらの配列を比較することによりエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を新しくクローン化されたＤＮＡフ
ラグメント上に局在させる操作を含む。

【００１５】本発明は、ＮａｅＩ制限エンドヌクレアー
ゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、並び
にこのような組換えＤＮＡから産生した酵素に関する。

【００１６】Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉ
ｇｅｎｅｓ由来のＮａｅＩ制限−修飾遺伝子を大腸菌中
でクローン化することは、２つの因子の組合わせに起因
して著しく困難であることが判明した。第１に、他の多
くの制限−修飾系と異なり、ＮａｅＩ遺伝子は大腸菌中
では十分に発現しない。本発明では、メチラーゼ選択に
よるメチラーゼクローンの取得は、メチラーゼ遺伝子
を、遺伝子の出発点がクローニングベクター上のプロモ
ーターに十分に近付き且つ該プロモーターと一直線にな
るように十分に小さいフラグメント上でクローニングし
ない限り成功しないことが判明した。このようにすれ
ば、メチラーゼ遺伝子が発現され、クローンがメチラー
ゼ選択後に生き残ることができる（ＮａｅＩ消化に耐え
て生き残る能力によるメチラーゼクローンの同定）。第
２に、メチラーゼに対するＮａｅＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子の方向は、これらの遺伝子を単一プロモーターの
制御下で大腸菌中で一緒にクローン化することができな
いような方向である。エンドヌクレアーゼ遺伝子とメチ
ラーゼ遺伝子とを同一方向で読み取れば、エンドヌクレ
アーゼ遺伝子は最初メチラーゼ遺伝子に先行しているた
め（図４）、これらの遺伝子を強力なプロモーターの後
に一緒にクローニングすると、メチラーゼ遺伝子よりも
エンドヌクレアーゼ遺伝子の方がプロモーターに近い位
置に配置されて、メチラーゼ遺伝子より強く発現される
ことになり、その結果生存不可能なクローンが得られ
る。本発明では、ｐＥＶｎａｅＩＲＭ９．３（図３）の
場合のように２つの遺伝子を一緒にクローン化すること
ができるが、そのためにはこれらの遺伝子がベクター中
のプロモーターから十分に離れて該プロモーターから発
現されないようにしなければならない。あるいは、２つ
の遺伝子を別個のプロモーターの制御下で別個にクロー
ン化することもできる。

【００１７】クローニングの試みの大部分では、メチラ
ーゼをコードするフラグメントが大きすぎ及び／又は誤
った方向を有し、メチラーゼ遺伝子が発現されなかっ
た。クローンが修飾されず、従ってクローンを単離する
ように設計された選択によって破壊されたと考えられ
る。本発明では、完全エンドヌクレアーゼ遺伝子を含ま
ずに、メチラーゼ遺伝子をコードするフラグメントを正
確な方向で且つメチラーゼ発現を生起するようにプラス
ミドプロモーターに十分に接近した状態で有するライブ
ラリーが発見されるまで幾つかのライブラリーを構築し
分析することによって、ＮａｅＩメチラーゼ遺伝子をク
ローン化した。４つの異なる制限エンドヌクレアーゼを
用いてＤＮＡの部分的切断及び完全な切断を行って９つ
の異なるライブラリーを構築したところ、前述のような
フラグメント上にメチラーゼ遺伝子を有するクローンを
含んでいたのは部分的ＰｓｔＩライブラリーだけであっ
た。クローニングプロジェクトの開始時には、どのエン
ドヌクレアーゼが最適であるかは未知であった。

【００１８】部分的ＰｓｔＩライブラリーの選択後に得
られた１９のメチラーゼクローンは、総てが少なくとも
２つの同じＰｓｔＩフラグメントを有していた。これら
のクローンのうち１８のクローンはベクター中で同じ方
向にあった。これら１８のクローンは完全にメチル化さ
れていた。これらのクローンのうちの幾つかは、地図で
クローンの片側に位置する更に別のＰｓｔＩフラグメン
トを有していた（図２）。後述のように、これらのクロ
ーンはいずれも完全エンドヌクレアーゼ遺伝子を含んで
いなかった。

【００１９】エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローン化は
困難なものであった。まず、サザン分析（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって、メチラーゼ遺伝子
の一部分を含むＳａｃＩフラグメントは、エンドヌクレ
アーゼ遺伝子の大きさとメチラーゼ遺伝子の正確な位置
とに依存して、エンドヌクレアーゼ遺伝子全体をコード
するのに十分な側方ＤＮＡをメチラーゼ遺伝子の右方に
含み得ることが判明した。しかしながら、ＳａｃＩフラ
グメントだけをクローン化しても、その場合は完全なメ
チラーゼ遺伝子なしにエンドヌクレアーゼ遺伝子がクロ
ーン化されたであろうから、生存可能なクローンは得ら
れなかったであろう。問題は、宿主がエンドヌクレアー
ゼによる開裂から防護されるように、メチラーゼ遺伝子
を完全な状態に維持しながらエンドヌクレアーゼ遺伝子
をクローン化する方法にある。また、ベクターはＮａｅ
Ｉで切断できるＮａｅＩ部位を有していなければならな
い。なぜなら、ＮａｅＩは著しい部位優先性（ｓｉｔｅ
ｐｒｅｆｅｒｎｅｃｅ）を有するからである。即ち、
ＮａｅＩはある部位を別の部位よりも優先的に切断する
［Ｃｏｎｒａｄ及びＴｏｐａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９７０７−９７１１
（１９８９）］。本発明ではこの問題を、メチラーゼ遺
伝子の右半分を除去してｐＥＶｎａｅＩＭ−５９から１
つのＰｓｔＩフラグメントを欠失させることにより解決
する（図３）。その結果得られるプラスミドｐＥＶｎａ
ｅＩ７−５は、単一のＳａｃＩ部位と、幾つかの選択用
ＮａｅＩ部位と、メチラーゼ遺伝子の残部をその隣にク
ローン化して完全ＮａｅＩメチラーゼ遺伝子及びメチラ
ーゼ保護を得るようにすれば再構築できるであろうＮａ
ｅＩメチラーゼの一部分とを含んでいる。このベクター
中に構築されたＳａｃＩライブラリーの通常のメチラー
ゼ選択ではクローンは得られなかった。この結果の原因
がベクター中のアンピシリンプロモーターからのメチラ
ーゼ遺伝子の距離にあると想定して、厳密度のより低い
メチラーゼ選択と、宿主としての大腸菌ＡＰ１−２００
の使用とを試みた。前記大腸菌株は活性の、但し発現の
弱いメチラーゼクローンのスクリーニングを可能にし
た。１つのクローンｐＥＶｎａｅＩＲＭ９．３が単離さ
れた。このクローンはベクターに部分的メチラーゼ保護
を与えた。制限消化分析の結果、このクローンはメチラ
ーゼ遺伝子の右方にＤＮＡを含んでいることが判明し
た。このクローンは大腸菌中では検出可能なレベルのＮ
ａｅＩエンドヌクレアーゼを示さなかった。

【００２０】ＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
発現は更に困難なものであることが判明した。他の多く
の制限−修飾系からのメチラーゼクローンは、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏアッセイにより制限エンドヌクレアーゼ活性に
関してスクリーニングできる。しかしながら、大腸菌中
のｐＥＶｎａｅＩＲＭ９．３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッ
セイで検出可能なＮａｅＩエンドヌクレアーゼ活性を示
さなかった。Ｎｏｃａｒｄｉａ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ由来の制限−修飾系に関する過去の実験で、大腸
菌中でクローン化した場合には前記系から制限エンドヌ
クレアーゼ活性を検出することが難しい場合が多いこと
が明らかにされている。しかしながら、制限−修飾遺伝
子をより密接に関連した宿主、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ中でクローン化すると、制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を検出できることがし
ばしばある。完全制限エンドヌクレアーゼ遺伝子がｐＥ
ＶｎａｅＩＲＭ９．３上でクローン化されたかどうかを
調べるために、ｐＥＶｎａｅＩＲＭ９．３からの挿入物
をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ中でサ
ブクローン化する試みを行った。しかしながら、試みは
総て失敗に終わった。その原因はおそらく、エンドヌク
レアーゼがメチラーゼ遺伝子より高度に発現されたこと
にある。メチラーゼ遺伝子がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓ中でローコピー（ｌｏｗ ｃｏｐ
ｙ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓベクター上に別個にクロ
ーン化され、次いでエンドヌクレアーゼ遺伝子がハイコ
ピー（ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ）ベクター上で前述の予保護
された株中でクローン化されるまで、ＮａｅＩエンドヌ
クレアーゼ活性は検出されなかった。クローンｐＥＶｎ
ａｅＩＲＭ９．３上のＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子の正確な位置をみつけるために、ＤＮＡの配列決
定を行い、制限エンドヌクレアーゼタンパク質のアミノ
末端の配列をＮｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉ
ｇｅｎｅｓ由来ＮａｅＩのより高い精製度の調製物から
決定し、クローンのＤＮＡ配列をエンドヌクレアーゼの
アミノ末端の配列と比較した。エンドヌクレアーゼ遺伝
子の出発点が判明した後、ＮａｅＩ制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子の過剰発現の最善の方法を決定した（後で詳
述する）。

【００２１】ＮａｅＩ遺伝子及びメチラーゼ遺伝子を好
ましくはクローン化し且つ発現するための本明細書に記
載の方法は図１Ａ及び図１Ｂに示す通りであり、下記の
ステップを含む： １．Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅ
ｓのＤＮＡを精製する。

【００２２】２．ＮａｅＩメチラーゼ遺伝子全体を、完
全エンドヌクレアーゼ遺伝子を含まずフラグメントの一
端の近くに遺伝子の出発点を有するフラグメントに開裂
するＰｓｔＩのような制限エンドヌクレアーゼ又はその
任意のアイソシゾマーで、前記ＤＮＡを完全に及び／又
は部分的に消化する。前記フラグメントは、クローニン
グ可能な大きさ、即ち約１．５〜１３ｋｂでなければな
らない。試用した他のエンドヌクレアーゼは、ＢａｍＨ
Ｉ、ＢｃｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩ
Ｉ、ＮｓｉＩ、ＰｖｕＩＩ、Ｓａｕ３Ａ及びＸｈｏＩＩ
を含めて前述の条件を満たさなかった。

【００２３】３．ｐＢＲ３２２（又はｐＢＲ３２２中に
存在する同一テトラサイクリン耐性遺伝子を有する任意
の別のベクター）をクローニングベクターとして選択し
た。なぜなら、ｐＢＲ３２２は４つのＮａｅＩ部位を含
み、これらの部位のうち２つはＮａｅＩ制限エンドヌク
レアーゼによって容易に開裂され、１つはやや緩慢に開
裂され、残りの１つは１／５０の速度で開裂されるから
である。これは、ＮａｅＩエンドヌクレアーゼによって
開裂されないＮａｅＩ部位を有するλベースのベクター
のような、他のある種のベクターには見られない特徴で
ある。

【００２４】４．消化したＤＮＡをクローニングベクタ
ーに連結する。得られた混合物を用いて適当な宿主、即
ちｈｓｄＲ^-、ｍｃｒＢＣ株、例えば大腸菌株ＲＲ１又
はＫ８０２細胞（それぞれＡＴＣＣ ３１３４３及びＡ
ＴＣＣ ３３５２６）を形質転換する。本発明の研究で
は、Ｋ０８０２が好ましい宿主細胞であることが判明し
た。

【００２５】５．ＤＮＡ／細胞混合物を、好ましくは、
形質転換細胞に関して選択的な抗生物質培地、例えばア
ンピシリン又はテトラサイクリンにプレートする。イン
キュベーション後、形質転換細胞コロニーを一緒に回収
して一次細胞ライブラリーを形成する。前述のように、
この種の一次細胞ライブラリーは、クローニングエンド
ヌクレアーゼ、それぞれのクローニングエンドヌクレア
ーゼによるＮｏｃａｒｄｉａ ＤＮＡの完全もしくは部
分的消化、並びに宿主株を様々に組合わせて、最終的に
９つ形成した。

【００２６】６．組換えプラスミドを一次細胞ライブラ
リーからｉｎ ｔｏｔｏで精製して一次プラスミドライ
ブラリーを形成した。

【００２７】７．次いで、精製プラスミドライブラリー
を、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅ
ｓ細胞から調製したＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ又
は任意のＮａｅＩアイシゾマー、例えばＮｇｏＭＩでｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで完全に消化する。ＮａｅＩ制限エンド
ヌクレアーゼ消化は未修飾のメチラーゼ無含有クローン
を選択的に破壊し、その結果ＮａｅＩメチラーゼ含有ク
ローンの相対頻度が増加する。メチラーゼ無含有クロー
ンの破壊を促進するために、消化にエキソヌクレアーゼ
及び／又はホスファターゼを加えてもよい。

【００２８】９．ＮａｅＩメチラーゼクローンの同定：
消化したプラスミドライブラリーＤＮＡを形質転換によ
って大腸菌株ＲＲ１又はＫ８０２のような適当な宿主に
戻し、形質転換コロニーを抗生物質プレートにプレート
することによって再び得る。コロニーを採取し、そのＤ
ＮＡを下記の方法でＮａｅＩ修飾遺伝子の存在について
分析する：コロニーに含まれているプラスミドＤＮＡを
精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮａｅＩ制限エンドヌクレ
アーゼと共にインキュベートして、前記ＤＮＡがＮａｅ
Ｉによる消化に対する耐性を有しているかどうかを調べ
る。

【００２９】１０．メチラーゼ遺伝子がクローン化され
たことが判明したら、そのクローンをＮａｅＩ制限エン
ドヌクレアーゼ活性についてアッセイする。活性が検出
されたら、ＮａｅＩ制限遺伝子をメチラーゼ遺伝子に連
結し、クローン中に存在させる。この場合は、下記のス
テップ１３にスキップすることができる。しかしながら
本発明では、制限遺伝子は存在していても発現されない
ことが判明した。制限活性の欠失は、制限遺伝子がメチ
ラーゼ遺伝子に連結されていないか、又は連結されては
いるが完全な状態でメチラーゼ遺伝子と共にクローン化
されていないか、又は完全な状態でクローン化されてい
るが発現されてはいないことを意味する。前記３つの可
能性のうちのいずれが現実のものであるかを調べるため
に、クローン化フラグメントの制限地図を作り、欠失を
形成して、クローン化フラグメント内のメチラーゼ遺伝
子の相対位置を決定する。次いでこの情報を用いて、制
限遺伝子が連結されていれば、その制限遺伝子をコード
するのに十分なＤＮＡがメチラーゼ遺伝子のいずれかの
側面に存在しているかどうかを調べる。空き（ｒｏｏ
ｍ）が十分にあれば、制限遺伝子は連結されていない
か、又はクローン中に存在していても発現されていない
と想定される（ステップ１２にスキップ）。本発明のＰ
ｓｔＩクローン、ｐＥＶｎａｅＩＭ３８の場合のよう
に、クローン化ＤＮＡのメチラーゼ遺伝子の両側に、連
結制限遺伝子をコードするのに十分な空きが存在してい
なければ、メチラーゼ遺伝子の一部分を用いてＮｏｃａ
ｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ染色体の消
化を調べ、サザンハイブリダイゼーションによって、既
存のクローン化ＤＮＡの境界を超えて延びる領域のゲノ
ム地図を形成する。このデータは、制限−修飾領域をメ
チラーゼ遺伝子とより多くの隣接ＤＮＡとを有する個々
のフラグメントに開裂する特定のエンドヌクレアーゼを
同定するのに役立つ。このようなエンドヌクレアーゼに
よって形成されたフラグメントの正確な大きさも前記デ
ータから計算される。おそらくは、制限遺伝子及び修飾
遺伝子が連結されていれば、前述のようなフラグメント
は制限遺伝子もコードするであろう。

【００３０】１１．ステップ１０で説明したフラグメン
トをゲル精製し、ｐＥＶｎａｅＩ７−５（ｐＢＲ３２２
誘導体、その構築については実施例１、ステップ１４で
述べる）のような適当なベクターに連結することによっ
て、高密度ライブラリー（ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｌｉｂｒ
ａｒｙ）を形成する。メチラーゼ遺伝子の右方にＤＮＡ
を有するクローンは、厳密度の低い（ｇｅｎｔｌｅ）メ
チラーゼ選択及び／又は大腸菌ＡＰ１−２００を用いる
メチラーゼ活性についてのスクリーニングによって単離
できる。

【００３１】１２．制限遺伝子クローンの同定：本発明
では、ＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有する
クローンは、大腸菌中での前記遺伝子の発現が低レベル
であるため、通常の粗細胞抽出物アッセイでは同定でき
ないことが判明した。しかしながら、Ｎｏｃａｒｄｉａ
及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の遺伝子はしばし
ば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ中で
クローン化すると検出可能レベルまで発現し得る。メチ
ラーゼ遺伝子を含み、場合によってはエンドヌクレアー
ゼ遺伝子も含むクローン化フラグメントをｐＩＪ４８６
のようなＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓベクター上にサブク
ローニングし、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓに形質転換する。
得られたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中のクローンをメチラー
ゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現について
調べる。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中のクローンから発現さ
れたエンドヌクレアーゼが存在していれば、エンドヌク
レアーゼ遺伝子はクローン化されたが大腸菌中では発現
されなかったことになる（ステップ１３にスキップ）。
発現がないか、又は遺伝子がクローン化できなければ
（その原因は、本発明の場合のようにクローン化される
遺伝子の致死性にあり得る）、ＮａｅＩエンドヌクレア
ーゼをＮｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎ
ｅｓからできるだけ均質に精製し、最初の２０〜４０個
のアミノ酸のアミノ末端配列を決定する。このタンパク
質配列情報をメチラーゼクローンの翻訳されたＤＮＡ配
列と比較して、エンドヌクレアーゼ遺伝子がそのクロー
ン化フラグメント上に存在するかどうかを調べ、存在し
ていれば、エンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点がフラグ
メント上のどの位置に当たるかを調べる。これと同時
に、タンパク質ゲルによって制限エンドヌクレアーゼタ
ンパク質の大きさが約３８ｋｄであると決定される。こ
れは、エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに必要
なＤＮＡの量が約１．０ｋｂであることを意味する。Ｎ
ａｅＩ制限エンドヌクレアーゼを有するクローンは、エ
ンドヌクレアーゼのアミノ末端に関連した配列を含み、
前記配列の下流の少なくとも１．０ｋｂのＤＮＡを有す
るものであると同定される。

【００３２】１３．過剰発現：制限遺伝子を含むクロー
ンを過剰発現できる方法は幾つかある。当該領域のＤＮ
Ａの配列決定、詳細な地図の作成及び欠失データは、制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現させる最良の方
法の決定に役立つ。過剰発現させる方法の１つは、ｐＡ
ＧＲ３上のＰｔａｃのような大腸菌によって強く認識さ
れるプロモーター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓのＷ．Ｊａｃｋによって構築）を制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子の開始点の前に直接挿入する操作を含
む。この操作は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始
点及び終了点の近傍に適当な制限ターゲットをみつけ、
ｐＡＧＲ３のプロモーターの近傍に相容性制限ターゲッ
トをみつけ、制限遺伝子をＰｔａｃプロモーターと一直
線に並ぶようにｐＡＧＲ３に組み込むことによって実施
し得る。使用できる別の強力プロモーターは、ｐＵＣ１
９上のＰＬ及びｐＥＴ３Ａベクター上のＴ７プロモータ
ーである（Ｕｐｔｏｎ，ＮＹのＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ
Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂのＷｉｌｌｉａｍ Ｓｔｕｄ
ｉｅｒから入手できる）。また、強力なリボソーム結合
部位（Ｓｈｉｎｅ ＆ Ｄａｌｇａｒｎｏ １９７４
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
１，１３４２−１３４６）を遺伝子の前に配置して発現
を増大させることもできる。本発明では、エンドヌクレ
アーゼを過剰発現する安定なクローンを得るために、宿
主をエンドヌクレアーゼ消化から予め保護しなければな
らない。この操作は、別個のプラスミド上でＮａｅＩメ
チラーゼ中でクローン化するか（本発明でＮａｅＩ制限
−修飾系をＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中でクローン化した時
のように）、又はＮａｅＩ制限部位と重なる部位を修飾
することによりＮａｅＩ消化から保護するＭｓｐＩのよ
うな異種メチラーゼを用いることにより実施する。

【００３３】遺伝子のＤＮＡ配列は、大腸菌中でより効
果的に使用されるコドンを使用するために、特定部位の
突然変異誘発か又は遺伝子自体の再合成により変化させ
ることができる。

【００３４】プライマーは、制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子全体を増幅するのにポリメラーゼ鎖反応を使用する
ために、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の前で、且つ制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流のある地点で、直接
ハイブリダイズするように設計し得る。その結果得られ
るＤＮＡフラグメントは、ｐＡＧＲ３のような発現ベク
ターに挿入し得る。

【００３５】１４．産生：ＮａｅＩメチラーゼ又はエン
ドヌクレアーゼは、アンピシリン含有富栄養培地を含む
発酵槽（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）中での増殖により、Ｎａ
ｅＩメチラーゼ遺伝子（又は異種メチラーゼ）及び過剰
発現制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有するクローンか
ら産生し得る。その後細胞を遠心分離によって回収し、
音波処理により破壊して、ＮａｅＩメチラーゼと制限エ
ンドヌクレアーゼ活性とを含む粗細胞抽出物を得る。

【００３６】１５．精製：ＮａｅＩメチラーゼとエンド
ヌクレアーゼとを含む粗細胞抽出物を、アフィニティク
ロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーの
ような標準的タンパク質精製方法によって精製する。

【００３７】前述の諸ステップは本発明の好ましい実施
態様を構成するものであるが、当業者には明らかなよう
に、前述の方法は当業者に公知の技術に従って変化させ
得る。

【００３８】以下の実施例は、本発明の現時点で好まし
い実施態様を説明するためのものである。尚、この実施
例は非限定的なものであり、本発明はこれに限定される
ことはない。

【００３９】

【実施例】

実施例１ＮａｅＩ修飾メチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子のクローニング １．ＤＮＡ精製： Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌ
ｏｎｉｇｅｎｅｓのＤＮＡを調製するために、１ｇの細
胞ペーストを５ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ７．６中に、３０分間静かに
振盪することにより再懸濁させた。懸濁液を３．０ｍｌ
ずつ２つの画分に分けた。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ７．６中に１．７ｍｇ／
ｍｌのリゾチームを含む溶液３．５ｍｌを各画分に加
え、それぞれを３７℃で１５分間インキュベートした。
ＳＤＳを１％まで加え、プロテイナーゼＫを０．１３ｍ
ｇ／ｍｌまで加え、画分を更に３７℃で１時間インキュ
ベートした。１０％ＳＤＳ及び８％サルコシル溶液０．
４ｍｌを各々に加え、５５℃で２時間インキュベーショ
ンを続行した。次いで２つの画分を合わせ、ＤＮＡ緩衝
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ８．０）を４回交換して２４時間透析した。次いで
塩化セシウム−エチジウムブロミド平衡密度勾配遠心分
離する準備として、透析したＤＮＡ溶液を、ＤＮＡ緩衝
液で全容積４０ｍｌまで増量し、ＤＮＡ溶液を２つの２
０ｍｌ画分に分け、各々に２０ｇの塩化セシウム及び
０．２ｍｌの５ｍｇ／ｍｌエチジウムブロミドを加え
た。ＤＮＡ溶液を４４，０００ｒｐｍで４８時間遠心
し、得られたＤＮＡバンドをシリンジ及び１８ゲージニ
ードルを用いて取り出した。同量の氷冷水飽和Ｎ−ブタ
ノールで４回抽出することによりエチジウムブロミドを
除去し、塩化セシウムは透析によって除去した。次い
で、ＮａＣｌを０．５Ｍまで加え、０．５５容のイソプ
ロピルアルコールの層を表面に形成することによりＤＮ
Ａを沈澱させた。沈澱したＤＮＡをガラス棒上に巻き付
けた。ＤＮＡを２ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ
ＥＤＴＡ ｐＨ８．０中に溶解すると終濃度は約３８５
μｇ／ｍｌとなった。

【００４０】ステップ２〜１０の留意事項：上述したよ
うに、全部で４種の異なる制限エンドヌクレアーゼをそ
れぞれ使用してＮ．ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ染
色体を消化し、９つのライブラリーを構築及びスクリー
ニングした。メチラーゼ遺伝子は、ＰｓｔＩ以外のケー
スでは選択で残存するほど十分には発現しなかったの
で、ＰｓｔＩライブラリーについての詳細のみを記述す
る。他の１３個のライブラリーは、以下に概略を示す方
法に類似の方法で作製した。

【００４１】２．部分消化： 精製ＤＮＡを以下のよう
にＰｓｔＩで切断して部分消化を行なった。１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，５０ｍ
ＭＮａＣｌ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール緩衝
液中に３８５ｕｇ／ｍｌのＤＮＡ １１５ｕｌを含む溶
液を、１つの１００ｕｌアリコートと５つの５０ｕｌア
リコートとに分けた。１００ｕｌの試験管に１０単位の
ＰｓｔＩを加え、ＤＮＡ１ｕｇ当たり酵素１単位とし
た。１番目の試験管から５０ｕｌを取り出し、２番目の
試験管に移して０．５単位 ＰｓｔＩ／ｕｇとする等、
前の試験管の半分の量のＰｓｔＩを次の試験管に移し
た。試験管を３７℃で１時間インキュベートし、７２℃
で１５分間熱処理し、各試験管から１５ｕｌずつとって
アガロースゲル電気泳動によって分析した。中程度の、
但し不完全な消化を示す試験管を、クローニング用部分
消化フラグメント源として選択した（使用した部分消化
試験管は０．２５Ｕ／ｕｇ、０．１２Ｕ／ｕｇ、０．０
６Ｕ／ｕｇ及び０．０３Ｕ／ｕｇ試験管であった）。個
々の反応液を混合し、下記のステップ３に記載のごとく
使用した。

【００４２】３．連結： フラグメント化したＤＮＡを
ｐＢＲ３２２に以下のように連結した。６ｕｇのＰｓｔ
Ｉ部分消化Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇ
ｅｎｅｓ ＤＮＡ（６０ｕｌ）を３．０μｇのＰｓｔＩ
切断及び脱リン酸化ｐＢＲ３２２（３０ｕｌ）と混合し
た。２０ｕｌの１０×連結ミックス（５００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１００ｍ
Ｍ ＤＴＴ，５ｍＭＡＴＰ）を加え、更に１１０．５ｕ
ｌの無菌蒸留水を加えて終容積１９８ｕｌとした。７．
５ｕｌの濃厚なＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２×１０⁶Ｕ／
ｍｌ）を加え、混合液を１６℃で４時間インキュベート
し、次いで１０ｕｌのクロロホルムを加えることにより
殺菌した。約１２５ｕｌの連結ＤＮＡを使用してＥ．ｃ
ｏｌｉ株Ｋ８０２を次のように形質転換した。ＤＮＡを
１．０ｍｌのＳＳＣ／ＣａＣｌ₂（５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，５ｍＭ クエン酸三ナトリウム，６７ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂）と氷上で混合し、２．０ｍｌの氷冷コンピテント
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ８０２（ｈｓｄＲ^-Ｍ⁺，ｍｃｒＡ^-，
ｍｃｒＢＣ^- ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３５２６）細胞を加
えた。４２℃で５分間インキュベートした後、８ｍｌの
ルリアブロス（Ｌブロス）を加えることにより細胞を希
釈し、３７℃で１時間インキュベートした。

【００４３】４．一次細胞ライブラリー： 形質転換細
胞培養液を簡単に遠心し、上清は捨て、細胞を１．０ｍ
ｌのＬブロス中に再懸濁させた。２００ｕｌの画分を、
２５ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むルリア寒天
（Ｌ寒天）プレート上に塗り広げた。３７℃で一晩イン
キュベートした後、各プレートに２．５ｍｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を満た
し、形質転換コロニーを一緒に掻き取り、プールし、一
次細胞ライブラリーを形成した。

【００４４】５．一次プラスミドライブラリー： 一次
プラスミドライブラリーを以下のように作製した。２．
５ｍｌの一次細胞ライブラリーを、１０ｕｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含むＬブロス５００ｍｌ中に接種し
た。培養液を３７℃で一晩振盪し、次いで４０００ｒｐ
ｍで５分間遠心した。上清は捨て、細胞ペレットを１０
ｍｌの２５％スクロース，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０中に室温で再懸濁させた。５ｍｌの０．２５Ｍ
ＥＤＴＡ ｐＨ８．０を加え、次いで０．２５ＭＴｒｉ
ｓ ｐＨ８．０中に１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む
溶液３ｍｌを加えた。溶液を氷上に３時間放置し、次い
で１２ｍｌの溶解用ミックス（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，６７ｍＭ
ＥＤＴＡ）をピペットで強く注入し、細胞懸濁液を静
かに撹拌して溶解した。溶解後、混合液を５０ｍｌプラ
スチック遠心管に移し、１７０００ｒｐｍ，４℃で４５
分間遠心した。上清をピペットで取り出した。２０．０
ｇの固体ＣｓＣｌを計量して５０ｍｌプラスチックねじ
蓋付き試験管に入れ、更に２２．０ｇの上清をピペット
で試験管に入れ、混合した。１．０ｍｌのエチジウムブ
ロミド溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ８．０，１ｍＭ
ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ中５ｍｇ／ｍｌエチジ
ウムブロミド）を混合液に加えた。溶液を２つの５／８
インチ×３インチのポリアロマー遠心管に移し、密封し
た。これらの遠心管をＢｅｃｋｍａｎＴｉ７０ローター
において４４０００ｒｐｍ，１７℃で４２時間遠心し
た。プラスミドを回収するため、遠心管の頂部にメスで
孔をあけ、２つのＤＮＡ蛍光バンドのうち低い方を紫外
光下にシリンジによって回収した。両管から得た低い方
のバンドをねじ蓋付きガラス試験管に一緒に入れ、同量
の氷冷水飽和Ｎ−ブタノールで４回抽出することにより
エチジウムブロミドを除去した。

【００４５】抽出後の溶液を透析チューブに移し、ＤＮ
Ａ緩衝液を４回交換して２４時間透析した。透析後のＤ
ＮＡ溶液を、予め計量してある５０ｍｌ無菌遠心管に移
し、その容積を測定した。５Ｍ ＮａＣｌを終濃度０．
４Ｍまで加え、２容のイソプロパノールを加えて混合し
た。溶液を−２０℃で一晩貯蔵してＤＮＡを沈澱させ
た。沈澱後、溶液を１５０００ｒｐｍ，０℃で１５分間
遠心し、上清は捨てた。試験管をベンチ上に１５分間放
置して空気乾燥し、次いでＤＮＡペレットを５００ｕｌ
のＤＮＡ緩衝液中に溶解し、−２０℃で貯蔵した。この
ように調製したプラスミドのＤＮＡ濃度は、１００〜２
００ｕｇ／ｍｌであることが判明した。

【００４６】６．プラスミドプールの消化： ゲル精製
した一次プラスミドプールを以下のように消化して非Ｎ
ａｅＩメチラーゼクローンを破壊した。プラスミドＤＮ
ＡをＮａｅＩ緩衝液（２０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，５ｍＭ
β−メルカプトエタノール）で３０ｕｇ／ｍｌまで希
釈した。全部で２２５ｕｌを調製した。８Ｕ／ｕｇ Ｎ
ａｅＩを加え、混合液を３７℃で３時間インキュベート
した。

【００４７】７．形質転換： 各試験管から得た１２．
５ｕｌの試料を使用してＥ．ｃｏｌｉ Ｋ８０２を形質
転換した。４２℃で３分間インキュベートし、更に３７
℃のＬブロス中で４５分間増殖させた後、細胞／ＤＮＡ
混合液を、２５ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬ寒
天プレート上に塗り広げた。３７℃で一晩インキュベー
トした後、プレートを調査した。プラスミドライブラリ
ーをＮａｅＩで消化したことにより、形質転換体の数は
約１０³分の１に減少したことが判った。

【００４８】８．生存固体の分析： セクション７で得
られた４２個の生存コロニーを、テトラサイクリンを含
むＬブロス培養液１０ｍｌ中で増殖させ、それらが保有
するプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ及びＤｏｌｙ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：１５１３（１９
７９））の方法を改良した以下のミニプレッププラスミ
ド精製手順によって調製した。

【００４９】ミニプレップ手順：各培養液を８０００ｒ
ｐｍで５分間遠心した。上清は捨て、細胞ペレットを、
１ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む１．０ｍｌの２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ グルコー
ス，ｐＨ８．０中に再懸濁させた。室温で１０分後、
２．０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨ，１％ＳＤＳを各試験
管に加え、試験管を振盪して細胞を溶解させ、次いで氷
上に置いた。溶液が透明になったら、１．５ｍｌの３Ｍ
酢酸ナトリウムｐＨ４．８を各試験管に加え、振盪し
た。形成された沈澱物を１５０００ｒｐｍ，４℃で１０
分間遠心した。各上清を、３ｍｌのイソプロパノールを
含む遠心管中に注入し、混合した。室温で１０分後、遠
心管を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈澱核酸を
ペレット化した。上清は捨て、ペレットを室温で３０分
間空気乾燥した。乾燥したら、ペレットを８５０ｕｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０中
に再懸濁させた。７５ｕｌの５Ｍ ＮａＣｌを各々に加
え、溶液を、５７５ｕｌのイソプロパノールを含むエッ
ペンドルフ試験管に移し、再び室温で１０分間沈澱させ
た。次いで試験管を４５秒間遠心機内で遠心し、上清は
捨て、ペレットを空気乾燥した。次いでペレットを、１
００ｕｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む５００ｕｌの１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解
し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化し
た。まず５０ｕｌの５Ｍ ＮａＣｌを、次いで３５０ｕ
ｌのイソプロパノールを加えることにより、ＤＮＡをも
う一度沈澱させた。室温で１０分後、４５秒間遠心する
ことによりＤＮＡを遠心沈降させ、上清は捨て、ペレッ
トを、１５０ｕｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡｐＨ８．０の最終溶液中に再度溶解した。次いで、
ＮａｅＩで消化することによりプラスミドミニプレップ
を分析した。

【００５０】９．メチラーゼ遺伝子クローン： １９個
のプラスミドがＮａｅＩに耐性を示し、少なくとも２つ
のＰｓｔＩフラグメントを保有する（図２）ことが判明
した。１つを除く各ケースで、フラグメントは、プラス
ミドのアンピシリン耐性遺伝子プロモーターに関して同
じ向きであった。アンピシリン耐性遺伝子プロモーター
に関して反対向きの挿入物を有する１つのクローンは、
プラスミドをＮａｅＩエンドヌクレアーゼ消化から部分
的にしか保護しなかった。種々のＥ．ｃｏｌｉクローン
から調製した抽出物におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ制限アッ
セイを以下のように実施した。

【００５１】エンドヌクレアーゼ活性について試験すべ
きクローンの培養液５０ｍｌを、２５ｕｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを含むＬブロスにおいて３７℃で一晩増殖
させた。５０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細
胞をペレット化した。上清は捨て、ペレットを３ｍｌの
超音波処理緩衝液（２０ｍＭ ＫＰＯ₄ ｐＨ７．４，
１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）中に再懸濁させ
た。細胞懸濁液にリゾチームを終濃度２００ｕｇ／ｍｌ
まで加えた。混合液を氷上に３時間維持し、−２０℃で
凍結した。混合物を氷上で溶かし、この懸濁液２ｍｌを
超音波処理緩衝液２ｍｌと混合した。懸濁液に、０．４
ｕｌの２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を加え、ピ
ペットに出し入れすることにより混合した。破壊された
細胞を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。７．５ｕ
ｌの細胞抽出物を１２０ｕｌの１× ＮａｅＩ緩衝液及
び５０ｕｇ／ｍｌ ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ（ＢｓｔＮＩ
で予め消化したもの）と一緒に３７℃で２時間インキュ
ベートすることにより、上清の制限エンドヌクレアーゼ
活性をアッセイした。電気泳動によって調べた１５ｕｌ
の試料には制限エンドヌクレアーゼ活性は認められなか
った。

【００５２】１０． １．４５及び１．６５ｋｂのＰｓ
ｔＩ挿入物内のメチラーゼ遺伝子の位置： ＮａｅＩメ
チラーゼクローンを多数の制限エンドヌクレアーゼで消
化して、クローン化ＤＮＡの制限マップを作製した。マ
ップを使用し、挿入物内の種々の領域を欠失させて、そ
のメチル化に及ぼす影響を決定した。そうして、３．１
ｋｂの挿入物内の〜１ｋｂメチラーゼ遺伝子の位置が正
確に定められ、該遺伝子の両側にあるクローン化ＤＮＡ
の長さは〜０．９及び〜１ｋｂであることが判明した。
メチラーゼクローンは、メチラーゼ遺伝子の右側には連
結制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分
なＤＮＡ（〜１ｋｂ）をもたないが、メチラーゼ遺伝子
の左側に約３．９ｋｂを有する他のより大きなクローン
を使用することにより、左側には十分な余地（ｒｏｏ
ｍ）を有し得る。しかしながら、２つの遺伝子間の距
離、これら遺伝子の正確なサイズ、及びこれらが結合し
ているか否かは明らかでないことから、クローンにおけ
るＮａｅＩエンドヌクレアーゼ活性の欠如により、制限
遺伝子がクローン中に存在しないか、または存在しても
発現しないことが考えられる。制限遺伝子が存在しても
発現しないケースに対しては、隣接ＤＮＡを含むクロー
ン化メチラーゼ遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓベク
ター中にサブクローニングし、これを使用してＳｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓを形質転換した（ス
テップ１１，１２）。更に、メチラーゼクローンのＤＮ
Ａ配列決定及びタンパク質配列決定を行って、制限遺伝
子の一部もしくは全てがクローン内に存在するのかまた
は全く存在しないのかを決定した（ステップ１８〜１
９）。制限遺伝子全体が存在しないケースに対しては、
メチラーゼ遺伝子に隣接するより大きなＤＮＡ領域をス
テップ１３〜１７に従ってクローニングした。

【００５３】１１．ＮａｅＩメチラーゼクローンのＳ．
ｌｉｖｉｄａｎｓ中へのサブクローニング： 種々のメ
チラーゼクローンを用いると、メチラーゼ遺伝子の両側
に、もしそれが結合されているのであればメチラーゼ遺
伝子の正確な位置に従って、制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子をコードするのに十分なＤＮＡがクローニングされ
るはずであった。しかしながら、いずれのクローンも制
限エンドヌクレアーゼ活性を発現することはなく、２つ
のＮａｅＩ制限−修飾遺伝子が結合されたという証拠も
ないので、Ｅ．ｃｏｌｉよりＮ．ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉ
ｇｅｎｅｓにより近縁の種であるＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ
中にメチラーゼクローンをサブクローニングすることを
試みた〔以下に記載するのはｐＥＶｎａｅＩＭ６０由来
の６．４ｋｂ Ｅ．ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメン
トのクローニングである。ｐＥＶｎａｅＩＭ５９から単
離した３ｋｂ ＫｐｎＩフラグメントを用いて同様のサ
ブクローニング実験も実施した（図２参照）。結果は同
じであり、簡潔化のため、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIサ
ブクローニングのみを詳細に記載する〕。２５ｕｌ
（１．５ｕｇ）のｐＥＶｎａｅＩＭ６０（ｐＢＲ３２２
中の８．４ｋｂ部分ＰｓｔＩメチラーゼクローン，図
２）を、２０ＵのＥｃｏＲＩ及び２０ＵのＨｉｎｄIII
を含む５０ｕｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１
０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１００ｕｇ／ｍｌウシ血清アルブ
ミン，１００ｍＭ ＮａＣｌ中，３７℃で２時間消化し
た。全部を０．７％アガロースゲル中で２時間電気泳動
させた。７．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII制限フ
ラグメントを電気泳動によってＤＥＡＥアニオン交換ペ
ーパー中に２時間かけて回収した。ペーパーを、０．１
Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０及び１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液１５０ｕｌで２回洗浄し
た。次いで、１．０Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液７５ｕ
ｌでペーパーを４回洗浄することより、ＤＮＡをペーパ
ーから溶出させた。ＤＮＡフラグメントを含む得られた
溶液を、まず３００ｕｌのフェノール／クロロホルムで
抽出し、次いで３００ｕｌのクロロホルムで抽出し、ド
ライアイス／エタノール浴中に置き１ｍｌ無水エタノー
ルを用いて１５分間沈澱させた。ＤＮＡを１４０００ｒ
ｐｍで５分間ペレット化した。ペレットを７０％エタノ
ールで濯ぎ、空気乾燥し、終容積１０ｕｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁させ
た。１０ｕｌ（０．５ｕｇ）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄII
I精製ＤＮＡフラグメントを、２ｕｌ（０．２ｕｇ）の
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII切断及び脱リン酸化ｐＩＪ４
８６〔ｐＩＪ４８６はＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ｏｆ
Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｅｎｇｌａｎｄから得たのものであ
り、文献Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２０３：４６８−４７８に記載され
ている〕に、１ｕｌＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ）
を含む終容積５０ｕｌの１×連結緩衝液中，１２℃で一
晩かけて連結した。１０ｕｌの連結ミックスを、Ｐ緩衝
液〔１０３ｇスクロース，０．２５ｇ Ｋ₂ＳＯ₄，２．
０２ｇ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ，２ｍｌ微量元素溶液、及
び蒸留水８００ｍｌまで。８０ｍｌアリコートに分配
し、オートクレーブ処理した。使用前に、各８０ｍｌア
リコートに、１ｍｌ ０．５％ＫＨ₂ＰＯ₄，１０ｍｌ
３．６８％ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ及び１０ｍｌ ５．７３
％ＴＥＳ緩衝液ｐＨ７．２を加えた。微量元素溶液１リ
ットル当たり：４０ｍｇＺｎＣｌ₂，２００ｍｇ Ｆｅ
Ｃｌ₃・６Ｈ₂Ｏ，１０ｍｇ ＣｕＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ，１０
ｍｇ ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ，１０ｍｇ Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇・
１０Ｈ₂Ｏ及び１０ｍｇ （ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ₂
Ｏ〕中の、約４×１０⁹Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２
４〔Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．から得たもの。ＴＫ２４
は、Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌに記載されている〕からＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ら
（前出）に記載のごとく調製した原形質体（ｐｒｏｔｏ
ｐｌａｓｔｓ）に加えた。原形質体／ＤＮＡ混合物に
０．５ｍｌの２５％ポリエチレングリコール１０００を
加えた。これを１ｍｌピペットに３回出し入れした。
０．１ｍｌの形質転換ミックスを６つのＲ２ＹＥプレー
トにそれぞれ塗り広げた〔１０３ｇスクロース，０．２
５ｇ Ｋ₂ＳＯ₄，１０．１２ｇ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ，
１０ｇグルコース，０．１ｇ Ｄｉｆｃｏカザミノ酸及
び８００ｍｌ Ｈ₂Ｏ。この溶液８０ｍｌを２．２ｇの
Ｄｉｆｃｏ寒天と混合し、オートクレーブ処理した。プ
レートを調製するため、ベース寒天溶液を融解し、以下
の殺菌液を加えた：１ｍＭ ０．５％ＫＨ₂ＰＯ₄，８ｍ
ｌ ３．６８％ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ，１．５ｍｌ ２０
％Ｌ−プロリン，１０ｍｌ ５．７３％ＴＥＳ緩衝液ｐ
Ｈ７．２，０．２ｍｌ微量元素溶液、及び０．５ｍｌ１
Ｎ ＮａＯＨ。プレートから殺菌液を出し、層流フード
内で１時間以上乾燥した〕。１．０ｍｌのチオストレプ
トン水溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）と一緒に３０℃で一晩
インキュベートしてから、プレートに形質転換体ミック
スを重層した。コロニーが増殖するまで３〜４日間、プ
レートを３０℃に戻した。

【００５４】１２．形質転換体分析： チオストレプト
ン選択から得られたコロニーを、単離コロニーに対して
５ｕｇ／ｍｌチオストレプトンを含むＲ２ＹＥプレート
を画線接種した。増殖したら、５ｕｇ／ｍｌチオストレ
プトンを含む５ｍｌのＴＳＢ，Ｏｘｏｉｄ Ｔｒｙｐｔ
ｏｎｅ Ｓｏｙａ Ｂｒｏｔｈを接種するのに使用し
た。培養液を通気しながら３０℃で２４時間インキュベ
ートした。１ｍｌの培養液にミニプレップ手順を実施し
た。この手順は、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ〔Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３（１９
７９）〕によって記載されている手順と同一であるが、
但し、ＮａＯＨ−ＳＤＳ溶液を加える前に、４ｍｇ／ｍ
ｌのリゾチーム，５０ｍＭ グルコース，２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ｐＨ８．０及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ中，３７℃
で３０分間インキュベートすることが必要であった。１
０ｕｌのミニプレップＤＮＡを、０．７％アガロースゲ
ル上で泳動させることにより分析した。５つのうち２つ
のクローンが、正しいサイズのフラグメントがｐＩＪ４
８６中に挿入されていることを示した。これら２つの単
離体由来の胞子を回収し、５ｕｇ／ｍｌのチオストレプ
トンを含む５００ｍｌのＴＳＢを接種するのに使用し
た。ＣｓＣｌプラスミドプレップを、Ｈｏｐｗｏｏｄら
（前出）のｐ９３の方法３のスケールアップ（２０倍）
方法に従って、培養液において調製した。得られたペレ
ットを１７ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，１
ｍＭ ＥＤＴＡ，１８．７ｇ ＣｓＣｌ及び０．４４ｍ
ｌ エチジウムブロミド（５ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁さ
せた。溶液を２つの５／８インチ×３インチポリアロマ
ー遠心管に移し、密封した。これらの試験管をＢｅｃｋ
ｍａｎ Ｔｉ７０ローター内で４４０００ｒｐｍ，１７
℃で４８時間遠心した。プラスミドを回収するため、試
験管の頂部にメスで孔をあけ、２つのＤＮＡ蛍光バンド
の低い方を紫外光下にシリンジによって回収した。両試
験管から得た低い方のバンドを１５ｍｌＣｏｒｅｘ試験
管に一緒に入れ、同量の水と３容のエタノールとを加え
ることによりエチジウムブロミドを除去した。−２０℃
で２時間後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心すること
によりＤＮＡをペレット化した。ペレットを、２ｍｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ中
に再懸濁させた。５０ｕｌの８Ｍ ＬｉＣｌを加え、Ｄ
ＮＡを、まずフェノール／クロロホルムで、次いでクロ
ロホルムで抽出した。上述のごとく３容のエタノールを
水溶液に加えることによりＤＮＡを沈澱させた。ペレッ
トを、５００ｕｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，
１ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁させた。精製したプラスミ
ドをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで消化して挿入物の存
在を確認し、ＮａｅＩで消化して、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ中のサブクローンがＮａｅＩメチラーゼ活性を有する
かどうか確認した。両サブクローンは、正しい構造を有
し且つメチラーゼ活性を有することで明らかに同一であ
り、従ってＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼで消化され
得なかった。ＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を試
験するため、プラスミドプレップに使用したのと同様に
増殖させた培養液５０ｍｌをペレット化した。ペレット
を１０．３％スクロースで洗浄し、−７０℃で凍結させ
た。融解してから、ペレットを、湿潤細胞重量１ｇ当た
り３ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，１０ｍＭ
β−メルカプトエタノール及び１ｍＭ ＰＭＳＦの溶
液に再懸濁させた。氷上で超音波処理した後、１６００
０ｒｐｍで４５分間遠心することにより破砕物を除去し
た。上清のＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性をアッ
セイした。ｐＥＧｎａｅＩＭ１−２１及びｐＥＧｎａｅ
Ｍ１−２２と称するこれらのサブクローンは、Ｓ．ｌｉ
ｖｉｄａｎｓにおいて検出可能なＮａｅＩエンドヌクレ
アーゼ活性を示さなかった。

【００５５】１３．サザンブロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ， Ｅ． １９７５， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．， ９
８：５０３）を使用して隣接領域のゲノムマップを決定
し、メチラーゼ遺伝子の一部分、及びメチラーゼ遺伝子
の右側にプローブとしてのＤＮＡを含んでいるメチラー
ゼクローンの一部分、特に１．６５ｋｂ断片（図２）を
ゲル精製し、α−³²ｐ−ＡＴＰでニックトランスレート
した。０．０１％ＳＤＳを含んでいる１％アガロースゲ
ル中で４時間電気泳動して、断片を精製した。ゲルを視
覚化するために長波長ＵＶを使用して、１．６５ｋｂバ
ンドをゲルから切断し、清潔なかみそりの刃でミンチ状
にした。混合物を２２ゲージシリンジから、０．０１％
ＳＤＳを含む５ｍｌの１×アガロースゲル緩衝液中に注
入して、１７ｋ ｒｐｍで４５分間遠心分離した。上清
を−７０℃で一晩０．５ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ及び１．
１ｍｌのｎ−ブタノールで沈澱させた。ＤＮＡを１５ｋ
ｒｐｍ、２０分間でペレット化した。ペレットを４００
ｕｌの１０ｍＭトリスｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡに
再度懸濁させ、フェノール／クロロホルム抽出し、三度
クロロホルム抽出し、−２０℃で３時間かけて４０ｕｌ
の５Ｍ ＮａＣｌ及び１０００ｕｌのイソプロパノール
で再度沈澱させた。ペレットを７０％イソプロパノール
で洗浄し、空気乾燥し、最終容量の１０ｍＭトリスｐＨ
８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ２０ｕｌに再度懸濁させた。
ゲル精製したプローブを以下のようにニックトランスレ
ートした。５ｕｌ（０．５ｕｇ）のＤＮＡ、１．５ｕｌ
の緩衝液（５００ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭ β
−メルカプトエタノール、５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）、１
ｕｌのＧＴＣ（５００ｐｍｏｌｅｓ／ｕｌ）、５μｌの
α−³²ｐ−ｄＡＴＰ（１００ｐｍｏｌｅｓ，８００Ｃｕ
ｒｉｅｓ／ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）、２ｕｌのＤＮＡポリ
メラーゼＩ（２０単位）及び１ｕｌのＤＮＡｓｅ Ｉ
（１ｕｇ／ｍｌ）を混合し、１６℃で２時間インキュベ
ートした。次いで混合物を１０分間沸騰させ、直後に氷
中に置いた。

【００５６】以下のようにサザンブロット法を実施し
た。Ｎ． ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ ＤＮＡを
制限エンドヌクレアーゼＡａｔＩＩ，ＢａｍＨＩ，Ｂｃ
ｌＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｌｕＩ，Ｎｃｏ
Ｉ，ＮｄｅＩ，ＮｏｔＩ，ＮｓｉＩ，ＰｖｕＩＩ，Ｓａ
ｃＩ，ＳａｌＩ，ＳｃａＩ，ＳｍａＩ，ＳｐｈＩ，Ｓｔ
ｕＩで別個に消化した。消化物を１．０％アガロースゲ
ル上で電気泳動させた。ゲルを０．２５Ｍ ＨＣｌに１
０分間、０．４Ｍ ＮａＯＨ，０．８Ｍ ＮａＣｌに３
０分間、次いで０．５ＭトリスｐＨ７．５，１．５Ｍ
ＮａＣｌに３０分間浸漬した。ニトロセルロースシート
を水に短時間、次いで５ × ＳＳＣ（０．７５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）に浸漬した。
３００ｍｌの３Ｍ ＮａＣｌ，０．３Ｍクエン酸三ナト
リウム緩衝液中の１／２インチ厚さの重ね合わせたクロ
マトグラフィー用濾紙（ワットマン）の上部にゲルを置
き、緩衝液の量は重ね合わせた濾紙の高さを僅かに下回
るようにした。ニトロセルロースシートをゲルの上部に
置き、クロマトグラフィー用濾紙（ワットマン）を裏に
付けて、吸着材として作用させた。サンドイッチ部分を
押圧して、室温で一晩ゲル内容物をニトロセルロースシ
ートに移動させた。次いでシートを０．１５ＭＮａＣ
ｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウムで１０分間洗浄し、
真空炉において８０℃で１．５時間焼いて、ニトロセル
ロースに移動したＤＮＡ断片を固定した。３ｍｌの１０
ｇ／ｌ Ｆｉｃｏｌｌ、１０ｇ／ｌポリビニルピロリド
ン、１０ｇ／ｌウシ血清アルブミンと、４．５ｍｌの３
Ｍ ＮａＣｌ，０．３Ｍクエン酸三ナトリウムと、１．
５ｍｌの１０％ＳＤＳと、３ｍｌの１０％デキストラン
スルフェートと、３ｍｌのＨ₂Ｏとからなる溶液１５ｍ
ｌを含んでいるプラスチック袋にシートを移動し、６５
℃で３時間振盪させながらインキュベートしてプレハイ
ブリッド形成した。７ｕｌの放射性プローブを袋に加え
て、６５℃で一晩振盪させながらインキュベートを継続
した。次いで、ニトロセルロースシートを０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌ，３０ｍＭクエン酸三ナトリウムで三度、それぞ
れ５分間ずつ室温で洗浄し、０．５％ＳＤＳを含んでい
る同一の緩衝液で一度６５℃で２０分間洗浄した。次い
で、シートを空気乾燥し、一晩でオートラジオグラムを
作成した。

【００５７】サザンブロット法のデータから、６種のエ
ンドヌクレアーゼをコードする断片の正確な寸法が判明
した。ＡａｔＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＭｌｕＩ，ＰｖｕＩ
Ｉ，ＳａｃＩ，ＳａｌＩ断片はメチラーゼ遺伝子の左側
にＤＮＡを有する（図４）。プローブをＡａｔＩＩ消化
物では単一２．６ｋｂバンドに、ＢａｍＨＩ消化物では
７．５ｋｂバンドに、ＭｌｕＩ消化物では４．９ｋｂバ
ンドに、ＰｖｕＩＩ消化物では２．３ｋｂバンドに、Ｓ
ａｃＩ消化物では６ｋｂバンドに、ＳａｌＩ消化物では
２ｋｂバンドにハイブリッド形成した。他のバンドはク
ローンするには大きすぎると判断した。

【００５８】１４．ｐＥＶｎａｅＩ７−５の構築：３４
ｕｌ（３０ｕｇ）のｐＥＶｎａｅＩＭ−５９を６０ｕｌ
の１０× ＮＥＢｕｆｆｅｒ ３（５０ｍＭトリスＨＣ
ｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１
ｍＭ ＤＴＴ）と混合し、６００ｕｌになるまでＨ₂Ｏ
を加えて、ｐＥＶｎａｅＩＭ−５９を部分的に消化し
た。ＤＮＡ混合物１００ｕｌを第１の管内に入れ、他の
４つの管内には５０ｕｌを入れた。管内で５ＵのＰｓｔ
Ｉを１００ｕｌのＤＮＡ混合物と混合した。この管から
５０ｕｌを取り出し、５０ｕｌを含んでいる最初の管内
に移して、酵素を１：１に希釈した。他の３つの管内で
逐次１：１に希釈した。反応物を３７℃で１時間インキ
ュベートした。７２℃で１５分間加熱して、反応を停止
させた。各反応で得られた５ｕｌを０．７％アガロース
ゲル中で電気泳動して、消化の度合いを測定した。正確
な量の消化を示すように思われる管の残りのＤＮＡを合
わせて、アガロースゲル中で電気泳動した。（ｐＢＲ３
２２と、ｐＥＶｎａｅＩＭ−５９からの１．５ｋｂ断片
と１．４５ｋｂ断片とを含んでいる）７ｋｂバンドを段
階１３で説明したようにゲル精製した。１．５ｕｌの１
０×リガーゼ緩衝液及び１ｕｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ
を加え、１６℃で５時間インキュベートして、単離した
断片１２．５ｕｌ（約５０ｎｇ）自体を連結反応させ
た。１０ｕｌの連結反応混合物を使用して、コンピテン
トＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ１を形質転換した。２５ｕｇ／
ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ−寒天上で形質転換細
胞を選択した。３２の生存コロニーを選択した。その中
の１２の生存コロニーをプラスミドミニプレップ（ｐｌ
ａｓｍｉｄ ｍｉｎｉ ｐｒｅｐｓ）用に取り出した。
取り出した１２のコロニーのうち、３つは正確な構造を
有し、即ちｐＢＲ３２２、１．５ｋｂ断片及び１．４５
ｋｂ断片を有していた（図３）。サブクローンはＮａｅ
Ｉの消化に対する感受性があり、従って完全なメチラー
ゼ遺伝子を含まないと仮定した。

【００５９】１５．段階２〜８と同一の手順で、但し段
階２，４では以下のように変更して、ＳａｃＩライブラ
リーを構築し、選択した。３０ｕｌ（３０ｕｇ）のＮ．
ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ染色体ＤＮＡを、Ｓ
ａｃＩ（２０Ｕ）を含んでいる３００ｕｌの１× ＮＥ
Ｂｕｆｆｅｒ ２（１０ｍＭトリスｐＨ７．５，１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）中において３７℃で３時間完全に消化した。０．０
１％ＳＤＳを含んでいる１％アガロースゲル中で全容量
を５時間電気泳動した。ゲルを視覚化するために長波長
ＵＶを使用して、メチラーゼ遺伝子を有する断片の公知
の寸法の範囲内にある断片をゲルから切断し、清潔なか
みそりの刃でミンチ状にした。段階１３と同一の手順で
断片を精製した。１２００Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
含んでいる７０ｕｌの１×連結反応用緩衝液中でＳａｃ
Ｉ開裂して、脱リン酸化した２ｕｌ（０．８ｕｇ）のｐ
ＥＶｎａｅＩ７−５に１５ｕｌ（０．８ｕｇ）を１６℃
で４時間連結反応させた。７０ｕｌ全てをＥ． ｃｏｌ
ｉ ＲＲ１，Ｋ８０２に形質転換し、テトラサイクリン
を含むＬ−寒天上でプレート化した。３７℃で一晩イン
キュベートした後に、各プレートに２．５ｍｌの１０ｍ
ＭトリスｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を注ぎ、形
質転換したコロニーをかきとって、プールし、一次細胞
ライブラリーを形成した。段階５で説明したように一次
プラスミドライブラリーを一次細胞ライブラリーから製
造した。

【００６０】１６．ＮａｅＩメチラーゼ遺伝子の上流の
領域を有するクローンの単離：（段階６〜７で説明した
ように）ＳａｃＩ一次プラスミドライブラリーの通常の
メチラーゼ選択を使用してＮａｅＩメチラーゼクローン
を単離しようとする全ての試みで生存コロニーは得られ
なかったので、ＳａｃＩ一次プラスミドライブラリーの
厳密度の小さいメチラーゼ選択を実施した。更には、
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＰ１−２００を宿主として使用した。
ＡＰ１−２００はｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合を有し、宿
主に含まれる他の突然変異の存在下でこの融合は活性メ
チラーゼの存在を示し得る（Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：１８３１
−１８３５（１９９１））。２．５ｕｌのＳａｃＩ一次
プラスミドライブラリー（〜０．１ｕｇのＤＮＡ）を、
５０ｕｌの１× ＮＥＢｕｆｆｅｒ１（１０ｍＭビスト
リスプロパンＨＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１ｍＭ
ＤＤＴ）中において、３７℃で３０分間０．５ｕｌのＮ
ａｅＩ（２Ｕ）で消化した。反応混合物２０ｕｌを使用
して、コンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＡＰ１−２００を
形質転換した。テトラサイクリン及び４０ｕｇ／ｍｌの
ｘ−ｇａｌを含むＬ−寒天上に細胞をプレーティングし
た。プレートを４３℃で一晩、３０℃で３時間、次いで
再度４３℃で２時間インキュベートした。ライブラリー
から１つのコロニーを得た。このコロニーは青色のよう
にみえ、活性メチラーゼの存在の可能性を示していた。
ＳａｃＩクローンから精製したプラスミド、即ちｐＥＶ
ｎａｅＩＲＭ９．３の制限マッピングによって、６．０
ｋｂのＳａｃＩ断片がクローニングベクターｐＥＶｎａ
ｅＩ７−５内に挿入されたことが判明した（図３）。こ
のクローンはＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ消化から
部分的に保護された。しかしながら、ｐＥＶｎａｅＩＲ
Ｍ９．３を含む任意のＥ．ｃｏｌｉ株からＮａｅＩ制限
エンドヌクレアーゼ活性は検出されなかった。

【００６１】１７．ＳａｃＩ断片をＮａｅＩメチラーゼ
を含むｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓベクターにクローン化
して、又はＮａｅＩメチラーゼ、及びメチラーゼ遺伝子
の上流の少なくとも２．６ｋｂのＤＮＡを含んでいるＭ
ｌｕＩ断片（図３）をｐＩＪ４８６にクローン化してｐ
ＥＶｎａｅＩＲＭ９．３をｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌ
ｉｖｉｄａｎｓにサブクローンしようとする全ての試み
は不成功に終わった。従って、エンドヌクレアーゼ遺伝
子がｐＥＶｎａｅＩＲＭ９．３上に存在するが、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ中で検出するのにきわめて十分な量で発現されな
いかどうかを、又はエンドヌクレアーゼ遺伝子がメチラ
ーゼ遺伝子に結合されず、従ってクローン化されないか
どうかをこの方法で決定することは不可能であった。

【００６２】１８．エンドヌクレアーゼ遺伝子がクロー
ン化した断片上に存在するかどうかを決定するために、
また存在する場合には、ＮａｅＩ制限エンドヌクレアー
ゼを以下の方法に従ってできるだけ均質になるように精
製した。

【００６３】９６０ｇのＮｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃ
ｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓから得た３．３リットルの未精製
細胞抽出物を、ＤＥＡＥセファロース、Ａｆｆｉ−ｇｅ
ｌＢｌｕｅ、ヘパリン−セファロース、ホスホセルロー
ス、ＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣ、ヘパリンＴＳＫ ＦＰＬＣ
のカラム上に順番に置いて、純度が〜５０％のＮａｅＩ
制限エンドヌクレアーゼ調製物を得た。

【００６４】１００ｕｌ（２．５ｕｇ）の精製ＮａｅＩ
制限エンドヌクレアーゼを使用して、アプライドバイオ
システムのモデル４７０Ａの気相タンパク質シーケンサ
ー上でアミノ末端タンパク質の配列を決定した。制限エ
ンドヌクレアーゼの最初の２１個のアミノ酸残基を決定
した（ＳＥＱ ＩＤ：ＮＯ．２）。

【００６５】１９．領域のＤＮＡ配列の決定によって、
制限遺伝子がＳａｃＩクローンｐＥＶｎａｅＩＲＭ９．
３上に存在し、制限遺伝子がメチラーゼ遺伝子の上流に
存在し、それがメチラーゼ遺伝子と同一方向に転写され
ることが判明した（図４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１）。配列によって更に、Ｅ．ｃｏｌｉのクローン化制
限遺伝子の発現を引き起こす組み換え体プラスミドのそ
の後の操作の基準として使用するためのデータが得られ
た。

【００６６】２０．NaeＩ制限エンドヌクレアーゼの過
剰発現：DNA及び蛋白質シークエンスデータを使用して
２本のオリゴヌクレオチドプライマーを作成した。一方
のプライマー（24量体）は、シークエンス（図４及びSE
Q ID NO:1）に知見されるXhoI部位を含むエンドヌクレ
アーゼ遺伝子のカルボキシ末端の下流の約500ヌクレオ
チドと予測されるシークエンスを含んでいた。もう一方
のプライマー（27量体）は、トレオニン〜アラニンのエ
ンドヌクレアーゼの第２のアミノ酸を変える付加NcoI部
位と一緒に、蛋白質シークエンシングによりエンドヌク
レアーゼ遺伝子の開始部分であることが示されているAU
Gコドンと重複するシークエンスを含んでいた。これら
の２本のプライマーを、ポリメラーゼ鎖反応で鋳型（pU
C19中のpEVnaeIRM9.3のMluIサブクローン）としてpEGna
eIRM6-1と一緒に使用して約1.4kb DNAフラグメントを産
生した。このＰＣＲ産物を１×NE緩衝液４中、XhoI及び
NcoIで消化し、BioRad Prep-A-Geneキットを製造業者の
使用説明書に従って使用してアガロースゲルから精製し
た。精製したフラグメント（〜0.1μg）を、XhoI及びNc
oIで消化したＰ_tacベクター、pAGR3（アンピシリン耐性
遺伝子、laqI^qの単一コピー、Ｐ_tacプロモーター、必要
以上の読取（read-through）転写を防ぐためのＰ_tacプ
ロモーターの上流のrrn_bターミネーターの４倍繰り返し
部分（4 fold direct repeat）、及びlacリボソーム結
合部位の下流のNcoI部位を含むpBR322ベースのベクタ
ー；W.Jack，New England Biolabsによって構築され
た）（〜0.05μg）にT4 DNAリガーゼ400Uを含む全容量4
0ul中、37℃で２時間連結した。透析（drop dialysis）
後、連結物10μlを使用して、染色体中に組み込まれたM
spIメチラーゼ遺伝子を有するE.coli K802を電気泳動し
た（MspIメチル化認識部位、CCGGはNaeI制限エンドヌク
レアーゼ認識部位と重複し、宿主をNaeI消化から保護す
る）。電気泳動した細胞を37℃で30分生長させ、アンピ
シリン（100μg/ml）を含むL-寒天にプレートした。120
コロニー以上が生存し、この内70コロニーを取り出し
て、単離したコロニー毎にアンピシリンを含むL-寒天に
画線培養した。プラスミドを個々のコロニーから取り出
し、コロニーをSTET（8% 蔗糖，5% Triton X-100，50mM
EDTA及び50mM Tris-HCl pH8.0）25μlに再懸濁させる
ことにより単離した。フェノール25μl（0.1M Tris-HCl
pH8.0で平衡化させた）をSTET-細胞混合物に添加し
た。試験管を撹拌し、エッペンドルフ遠心分離機で回転
させた。上清を染料（loading dye）2μlと混合し、0.7
%アガロースゲルに直接装填した。試験した70コロニー
の内12コロニーがベクターpAGR3より長いプラスミドを
含んでいた。これらの12コロニーをアンピシリンを含む
L-ブイヨン10ml中で37℃で一晩生長させた。ミニプラス
ミド調製物を、段階８で記載の如くこれらの培地から作
成した。各ミニプレップ（mini-prep）10μlのNcoI及び
XhoI消化物を、pAGR3のNcoI及びXhoIの消化物と比較し
た。12のクローンの内、７つは正しい構造を有している
ことが知見された。これらの７つのクローンを、60 Kle
tt（中間対数期（mid log phase））までアンピシリン
を含むL-ブイヨン500ml中で生長させ、１mM IPTGで誘導
した。培地50mlを誘導後０、１、２、３及び15（一晩）
時間で取り出した。細胞を遠心分離して集め、冷超音波
緩衝液（50mM Tris pH8.0、10mM β-メルカプトエタノ
ール、1mM PMSF及び0.1mMアジ化ナトリウム）中で１回
洗浄し、ペレットを−70℃で冷凍した。30分後、ペレッ
トを氷上で融解させ、細胞１g当たり超音波緩衝液３ml
に再懸濁させ、氷上で超音波処理した。超音波処理した
細胞抽出物を16k rpmで１時間遠心分離した。上清、粗
細胞抽出物の５〜１：１希釈液25μlを、12μl pBR322
（12μg）、90μl 10×NE緩衝液１、22.5μlPstI（20U/
μl）を含むDNA混合物25μlと混合し、水で900μlとし
た。反応を37℃で１時間インキュベートした。50μl全
部を0.7%アガロースゲル上で泳動した。粗細胞抽出物か
らの力価（titer）を精製したNaeI制限エンドヌクレア
ーゼからの公知の力価と比較した（図５）。７つのクロ
ーン中３つが、検出可能なNaeI制限エンドヌクレアーゼ
活性を殆どまたは全く持っていなかった。しかしなが
ら、４つのクローンは、1mM IPTGで一晩誘導後、細胞１
グラム当たりNaeI制限エンドヌクレアーゼ活性約7.7×1
0⁴Uを有していた（図５）。このレベルは、Nocardia ae
rocolonigenesの粗抽出物中に知見された細胞１g当たり
のNaeI制限エンドヌクレアーゼ活性の約50倍であった。
これらのクローンの内１個を次の特徴付けのために選択
し、pCTnaeIR16-1（ATCC#68949）のプラスミドと一緒に
NEB#777の株消化に使用した。

【００６７】２１．NaeI制限エンドヌクレアーゼは、ア
ンピシリンを含む栄養培地中、発酵器中で、中間対数期
まで増殖させることによりNEB#777から産生し得る。培
地に1mMIPTGを添加して誘導し、約12時間または一晩連
続生長させた。次いで細胞を遠心分離により集めた。

【００６８】２２．NEB#777からのNaeI制限エンドヌク
レアーゼの精製：次の総ての手順は、氷上または４℃で
実施した。細胞32.22gを緩衝液Ａ（20mM リン酸カリウ
ムpH6.9，50mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM β-メルカプト
エタノール，5% グリセロール）150mlに再懸濁させ、設
定９、50%サイクルで15分超音波処理した（Heat System
s-Ultrasonics Cell Disruptor）。抽出物を10k rpm、4
℃で20分間遠心分離し、得られた上清を緩衝液Ａで平衡
化させたDEAEセファロースCL-6Bのカラム（2.6×14cm）
に充填した。素通り液を集め、緩衝液Ａで平衡化させた
ヘパリンセファロースCL-6Bのカラム（1.6×13cm）にす
ぐに載置した。カラムを緩衝液Ａ 80ml、次いで緩衝液
Ａ125mlと1M NaClを含む緩衝液Ａ125mlで形成した塩化
ナトリウムの直線勾配液で洗浄した。画分（2ml）を流
速２ml/分で集めた。酵素活性のピークをプールし、0.5
〜0.65M NaClでカラムから溶離した。一晩緩衝液Ａで透
析後、プールしておいた酵素を緩衝液Ｂ（20mM リン酸
カリウムpH6.9，50mM NaCl，1mMβ-メルカプトエタノー
ル，5% グリセロール）で平衡化させたMonoS HR 5/5（1
ml）カラムに充填した。素通り液を集め、緩衝液Ｂで平
衡化させたMonoQ HR 5/5（1ml）カラムにすぐに載置し
た。再び素通り液を集め、緩衝液Ｂで平衡化させたDNA
セルロースカラム（0.5×5cm）に充填した。カラムを緩
衝液Ｂ２mlで洗浄し、緩衝液Ｂ25mlと、0.6M NaClを含
む緩衝液Ｂ25mlで形成した塩化ナトリウムの直線勾配液
を適用した。画分１mlを流速0.15ml/分で集めた。酵素
活性ピークは、0.17〜0.24M NaClで溶離した。活性部分
を含む画分をプールし、緩衝液Ｃ（10mM Tris pH7.4，5
0mM 塩化ナトリウム，0.1mM EDTA，1mM DTT，50% グリ
セロール）に対して透析して濃縮した。この精製スキー
ムから酵素が全部で384,000単位、収率16%及びSDS-PAGE
から約95%の純度で得られた。

【００６９】この精製段階から得られたNaeI制限エンド
ヌクレアーゼは実質的に純粋で、非-特異的なエンドヌ
クレアーゼ及びエキソヌクレアーゼは含んでいなかっ
た。NaeI制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度を以下の
標準方法に従ってチェックした。

【００７０】１）連結：アデノ-2 DNAの10倍過剰消化
後、産生したDNAフラグメントの90%以上をT4 DNAリガー
ゼに連結した（1〜2μMの5'末端濃度,16℃）。これらの
連結したフラグメントの内、95%は再切断し得た。

【００７１】２）長い消化：アデノ-2 DNA 1μg及び酵
素50単位を含む50μl反応液を16時間インキュベーショ
ン後、DNAバンドの同一パターンが酵素１単位で反応を
１時間実施したときに得られた。

【００７２】３）エンドヌクレアーゼ活性：超音波処理
した³H DNA（10⁵ cpm/μg）1μgを含む50μl反応液中、
37℃で4時間、酵素60単位をインキュベーション後、放
射活性0.07%未満が放出された。

【００７３】４）エンドヌクレアーゼ汚染：1μg ΦX17
4 RFI DNAを含む50μl反応液中、酵素60単位を37℃で４
時間インキュベーション後、5%未満がRF IIに転換し
た。

【００７４】総ての試験は、反応緩衝液（10mM Bis Tri
s プロパン-HCl pH7.0，10mM MgCl₂，1mM DTT）で実施
した。

【００７５】注意：pAGR3（実施例１、段階20）中のＰ
_tacプロモーターのすぐ下流のNaeI制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子のクローニングを可能にするために、制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子のシークエンスをNcoI部位を作
成するためにプライマー及びPCRを使用して変えた。こ
のDNAシークエンスで１個の塩基対が変わると、得られ
たクローンから産生されたNaeI制限エンドヌクレアーゼ
の第２のアミノ酸が、トレオニンからアラニンに変化す
る。この組換え制限エンドヌクレアーゼの全ての機能的
な分析により、Nocardia aerocolonigenesから単離した
NaeI制限エンドヌクレアーゼと同一の特異性及び特性を
有していることが明らかになった。組換体NaeI制限エン
ドヌクレアーゼ中の第２のアミノ酸を変えるために、ト
レオニンに変換された。実験１の段階２０と同一の実験
をNcoI部位の代わりにBspHI部位を含むオリゴヌクレオ
チドで実施し得る。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のAU
G開始コドンと重複するBspHI部位は、NcoI部位を使用す
る場合と異なり第２のコドンを変化させない。この新し
く構築したオリゴヌクレオチドを、制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子内のBglII部位に広がるもう一つの新しく構
築したオリゴヌクレオチド（図４及びSEQ ID NO:1）と
一緒に使用すると、0.55kb DNA フラグメントがポリメ
ラーゼ鎖反応により得られる。得られたフラグメントを
BspHI及びBglIIで消化して、クローニングするために付
着末端を作成し得る。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
修正アミノ酸末端を含むこのフラグメントを、ベクター
及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のカルボキシ部分を
含むpCTnaeIR16-1の大きなBglII-NcoIフラグメントに連
結し得る。連結混合物を、染色体中に組み込まれたMspI
メチラーゼ遺伝子を含むE.coli宿主中に電気穿孔法で導
入し得る。これにより第２のアミノ酸としてトレオニン
を含むNaeI制限エンドヌクレアーゼを産生できる。

【００７６】

【配列表】

配列番号（SEQ ID NO）:１ 配列の長さ：3664塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：CDS （Ｂ）存在位置：146…1099 配列：

【００７７】

【表１】

【００７８】

【表２】

【００７９】

【表３】

【００８０】

【表４】

【００８１】

【表５】

【００８２】

【表６】

【００８３】

【表７】 配列番号２ 配列の長さ：317アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列：

【００８４】

【表８】

【００８５】

【表９】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニ
ング及び産生の好ましい方法を決定するための方法を簡
単に示す説明図である。

【図１Ｂ】図１Ａに示す実際の結果に基づくＮａｅＩ制
限エンドヌクレアーゼのクローニング及び産生の好まし
い方法の説明図である。クローニングプロジェクトの開
始時には、ＮａｅＩ制限−修飾系のクローニングにどの
エンドヌクレアーゼ又は条件が適しているかは未知であ
り、これらのクローン中で制限遺伝子及び修飾遺伝子が
存在する場所も未知であった。図１Ａ及び実施例１に記
載のクローニングの結果と、その後のＤＮＡ配列決定、
地図の作成及びクローンの特徴付けとによって、Ｎａｅ
Ｉ制限−修飾系をクローニングし発現するための以前に
は知られていなかった直接的経路が明らかになった。

【図２】ＰｓｔＩライブラリーのメチラーゼ選択によっ
て得たＰｓｔＩ部分的クローンのうちの幾つかのクロー
ンのマップである。

【図３】ｐＥＶｎａｅＩ７−５の構築と、その後のｐＥ
ＶｎａｅＩＲＭ９．３のクローニングとを簡単に示す説
明図である。

【図４】クローン化した１２．８ｋｂのＮｏｃａｒｄｉ
ａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ ＤＮＡ全体の制
限地図である。ｐＣＴｎａｅＩＲ１６−１の構築に使用
した１．４ｋｂフラグメントの位置が図示されている。
図面を簡明にするために、ここでは当該特許に関連した
制限部位のみを図示した。

【図５】ＮＥＢ＃７７７の細胞抽出物から得たＮａｅＩ
制限エンドヌクレアーゼ活性の誘導を示すアガロースゲ
ルの写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/54 //(Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:365） (72)発明者 エリザベス・メリル・バン・コツト アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02148、マールダン、サマー・ストリー ト・10 (72)発明者 クリストフアー・ヘンリー・ターロン アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01945、マーブルヘツド、ワシントン・ス トリート・102

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プラスミドｐＣＴｎａｅＩＲ１６−１か
   ら得ることができる、ＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ
   をコードする単離ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
   ドするＤＮＡを挿入したベクターからなる組換えベクタ
   ー。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の単離ＤＮＡを含む組換
   えベクター。
4. 【請求項４】 ベクターがプラスミドｐＣＴｎａｅＩＲ
   １６−１を含む請求項３に記載の組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項２、３又は４に記載の組換えベク
   ターで形質転換した宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項２、３又は４に記載の組換えベク
   ターで形質転換した宿主細胞をＮａｅＩ制限エンドヌク
   レアーゼの発現に適した条件で培養することからなるＮ
   ａｅＩ制限エンドヌクレアーゼの産生方法。
7. 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含んでいる請
   求項１に記載の単離ＤＮＡ。