JP2002306181A - 大腸菌においてＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングし製造するための方法 - Google Patents
大腸菌においてＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングし製造するための方法Info
- Publication number
- JP2002306181A JP2002306181A JP2001152388A JP2001152388A JP2002306181A JP 2002306181 A JP2002306181 A JP 2002306181A JP 2001152388 A JP2001152388 A JP 2001152388A JP 2001152388 A JP2001152388 A JP 2001152388A JP 2002306181 A JP2002306181 A JP 2002306181A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rsai
- gene
- coli
- dna
- endonuclease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】細菌ロドシュードモナス・スファエロイデス
（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏ
ｉｄｅｓ）由来の制限酵素であるＲｓａＩは、ＤＮＡ配
列５’−ＧＴＡＣ−３’を認識する。ＲｓａＩは商業的
に重要であるため、本発明者らは、ＲｓａＩ遺伝子とそ
れに付随する修飾酵素とをクローニングすることによ
り、それを過剰産生させることに努めた。 【解決手段】ＲｓａＩ ＲおよびＭ遺伝子が隣接してい
る（これは、ほとんどのＲ−Ｍ系に当てはまる）のでは
なく、未知機能の介在遺伝子により分離されていること
を見出した。この情報に基づき、メチラーゼ選択ではな
くポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＲｓａＩＲ
遺伝子をクローニングした。
（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏ
ｉｄｅｓ）由来の制限酵素であるＲｓａＩは、ＤＮＡ配
列５’−ＧＴＡＣ−３’を認識する。ＲｓａＩは商業的
に重要であるため、本発明者らは、ＲｓａＩ遺伝子とそ
れに付随する修飾酵素とをクローニングすることによ
り、それを過剰産生させることに努めた。 【解決手段】ＲｓａＩ ＲおよびＭ遺伝子が隣接してい
る（これは、ほとんどのＲ−Ｍ系に当てはまる）のでは
なく、未知機能の介在遺伝子により分離されていること
を見出した。この情報に基づき、メチラーゼ選択ではな
くポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＲｓａＩＲ
遺伝子をクローニングした。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】（発明の背景）本発明は、Ｒ
ｓａＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＲｓａＩメチラー
ゼをコードする組換えＤＮＡ、および該組換えＤＮＡか
らのＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼの製造に関する。
ｓａＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＲｓａＩメチラー
ゼをコードする組換えＤＮＡ、および該組換えＤＮＡか
らのＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼの製造に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ＩＩ
型制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に存在する
酵素のクラスである。それらが他の細菌タンパク質から
精製されている場合には、分子クローニングおよび遺伝
子の特徴づけのためにＤＮＡ分子を断片に切断するため
に、これらの制限エンドヌクレアーゼを実験室内で使用
することができる。
型制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に存在する
酵素のクラスである。それらが他の細菌タンパク質から
精製されている場合には、分子クローニングおよび遺伝
子の特徴づけのためにＤＮＡ分子を断片に切断するため
に、これらの制限エンドヌクレアーゼを実験室内で使用
することができる。
【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に
沿ったヌクレオチドの特定の配列（「認識配列」）に結
合することにより作用する。それらは、一旦結合する
と、該認識配列の内部、片側または両側で該ＤＮＡ分子
を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる
ヌクレオチド配列を認識し切断する。現在までに調べら
れている数千の細菌種において、特有の特異性を有する
２００個を超える制限エンドヌクレアーゼが同定されて
いる（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＭａｃｅｌｉｓ，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２２３−２３５（１９
９６））。
沿ったヌクレオチドの特定の配列（「認識配列」）に結
合することにより作用する。それらは、一旦結合する
と、該認識配列の内部、片側または両側で該ＤＮＡ分子
を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる
ヌクレオチド配列を認識し切断する。現在までに調べら
れている数千の細菌種において、特有の特異性を有する
２００個を超える制限エンドヌクレアーゼが同定されて
いる（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＭａｃｅｌｉｓ，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２２３−２３５（１９
９６））。
【０００４】制限エンドヌクレアーゼは、それが由来す
る細菌に基づき命名される。したがって、例えば、デイ
ノコッカス・ラジオフィルス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ）種は、ＤｒａＩ、ＤｒａＩ
ＩおよびＤｒａＩＩＩと称される3つの異なる制限エン
ドヌクレアーゼを産生する。これらの酵素は、それぞれ
配列５’−ＴＴＴＡＡＡ−３’、５’−ＰｕＧＧＮＣＣ
Ｐｙ−３’および５’−ＣＡＣＮＮＮＧＴＧ−３’を認
識し切断する。一方、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＲＹ１３は唯一の酵素ＥｃｏＲＩを産生
し、これは配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’を認識する。
る細菌に基づき命名される。したがって、例えば、デイ
ノコッカス・ラジオフィルス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ）種は、ＤｒａＩ、ＤｒａＩ
ＩおよびＤｒａＩＩＩと称される3つの異なる制限エン
ドヌクレアーゼを産生する。これらの酵素は、それぞれ
配列５’−ＴＴＴＡＡＡ−３’、５’−ＰｕＧＧＮＣＣ
Ｐｙ−３’および５’−ＣＡＣＮＮＮＧＴＧ−３’を認
識し切断する。一方、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＲＹ１３は唯一の酵素ＥｃｏＲＩを産生
し、これは配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’を認識する。
【０００５】制限エンドヌクレアーゼは、通常、メチル
トランスフェラーゼと称される１以上の同伴酵素と共に
見出され、全体として制限−修飾（Ｒ−Ｍ）系を形成す
る。メチルトランスフェラーゼは、それに伴う制限エン
ドヌクレアーゼを補完するものであり、それは、細菌が
それ自身のＤＮＡを保護しそれを外来感染性ＤＮＡから
識別するのを可能にする手段を提供する。修飾メチラー
ゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列
を認識しそれに結合するが、該ＤＮＡを切断することな
く、メチル基の付加により該配列内の或る特定のヌクレ
オチドを化学修飾して５−メチルシトシン、Ｎ４−メチ
ルシトシンまたはＮ６−メチルアデニンを形成する。メ
チル化後にはもはや、該認識配列は同族制限エンドヌク
レアーゼにより切断されることはない。細菌細胞のＤＮ
Ａは、その修飾メチラーゼの活性により常に完全に修飾
される。したがって、それは、内在性制限エンドヌクレ
アーゼの存在に対して完全に不感受性である。制限エン
ドヌクレアーゼの認識および切断に対して感受性なの
は、未修飾であり従って識別されうる外来ＤＮＡだけで
ある。
トランスフェラーゼと称される１以上の同伴酵素と共に
見出され、全体として制限−修飾（Ｒ−Ｍ）系を形成す
る。メチルトランスフェラーゼは、それに伴う制限エン
ドヌクレアーゼを補完するものであり、それは、細菌が
それ自身のＤＮＡを保護しそれを外来感染性ＤＮＡから
識別するのを可能にする手段を提供する。修飾メチラー
ゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列
を認識しそれに結合するが、該ＤＮＡを切断することな
く、メチル基の付加により該配列内の或る特定のヌクレ
オチドを化学修飾して５−メチルシトシン、Ｎ４−メチ
ルシトシンまたはＮ６−メチルアデニンを形成する。メ
チル化後にはもはや、該認識配列は同族制限エンドヌク
レアーゼにより切断されることはない。細菌細胞のＤＮ
Ａは、その修飾メチラーゼの活性により常に完全に修飾
される。したがって、それは、内在性制限エンドヌクレ
アーゼの存在に対して完全に不感受性である。制限エン
ドヌクレアーゼの認識および切断に対して感受性なの
は、未修飾であり従って識別されうる外来ＤＮＡだけで
ある。
【０００６】組換えＤＮＡ技術の出現に伴い、現在で
は、遺伝子をクローニングしそれがコードする酵素を大
量に過剰産生させることが可能となっている。制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する際に鍵とな
るのは、複雑な「ライブラリー」（すなわち、「ショッ
トガン」法により誘導されるクローンの集団）内の該ク
ローンを、それが１０−３〜１０−４の頻度でしか存在
しない場合に同定するための簡便かつ信頼しうる方法を
開発することである。好ましくは、望ましくない大部分
のクローンが破壊され、望ましい希少クローンが生存す
るように、そのような方法は選択的であるべきである。
は、遺伝子をクローニングしそれがコードする酵素を大
量に過剰産生させることが可能となっている。制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する際に鍵とな
るのは、複雑な「ライブラリー」（すなわち、「ショッ
トガン」法により誘導されるクローンの集団）内の該ク
ローンを、それが１０−３〜１０−４の頻度でしか存在
しない場合に同定するための簡便かつ信頼しうる方法を
開発することである。好ましくは、望ましくない大部分
のクローンが破壊され、望ましい希少クローンが生存す
るように、そのような方法は選択的であるべきである。
【０００７】ＩＩ型制限−修飾系がクローニングされる
頻度は益々増加しつつある。クローニングされた最初の
系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または
選択するための手段としてバクテリオファージ感染に対
する抵抗性が用いられた（ＥｃｏＲＩＩ：Ｋｏｓｙｋｈ
ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７８：７１７−７
１９，（１９８０）；ＨｈａＩＩ：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎ
ｅ ３：９７−１１２，（１９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａ
ｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７
８：１５０３−１５０７，（１９８１））。細菌内の制
限−修飾系の存在により該細菌はバクテリオファージに
よる感染に抵抗することができるため、クローン化制限
−修飾遺伝子を保持する細胞は、原則として、ファージ
にさらされたライブラリーから生存体として選択的に単
離されうる。しかしながら、この方法は、限られた価値
しか有していないことが判明している。特に、クローン
化制限−修飾遺伝子は、選択的な生存性を付与するのに
十分なファージ抵抗性を常に現すわけではないことが判
明している。
頻度は益々増加しつつある。クローニングされた最初の
系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または
選択するための手段としてバクテリオファージ感染に対
する抵抗性が用いられた（ＥｃｏＲＩＩ：Ｋｏｓｙｋｈ
ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７８：７１７−７
１９，（１９８０）；ＨｈａＩＩ：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎ
ｅ ３：９７−１１２，（１９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａ
ｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７
８：１５０３−１５０７，（１９８１））。細菌内の制
限−修飾系の存在により該細菌はバクテリオファージに
よる感染に抵抗することができるため、クローン化制限
−修飾遺伝子を保持する細胞は、原則として、ファージ
にさらされたライブラリーから生存体として選択的に単
離されうる。しかしながら、この方法は、限られた価値
しか有していないことが判明している。特に、クローン
化制限−修飾遺伝子は、選択的な生存性を付与するのに
十分なファージ抵抗性を常に現すわけではないことが判
明している。
【０００８】もう1つのクローニングアプローチは、プ
ラスミドを保持することが初めに確認された系を大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニングプラスミド中に導入する
ことを含む（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６
７６，（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓお
よびＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８０：４０２−４０６，（１９８３）；
ＴｈｅｒｉａｕｌｔおよびＲｏｙ，Ｇｅｎｅ１９：３５
５−３５９（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔ
ｈａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１−
５０９，（１９８５））。
ラスミドを保持することが初めに確認された系を大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニングプラスミド中に導入する
ことを含む（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６
７６，（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓお
よびＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８０：４０２−４０６，（１９８３）；
ＴｈｅｒｉａｕｌｔおよびＲｏｙ，Ｇｅｎｅ１９：３５
５−３５９（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔ
ｈａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１−
５０９，（１９８５））。
【０００９】Ｒ−Ｍ系をクローニングするための第３の
アプローチは、活性メチラーゼ遺伝子に関する選択によ
るものである（米国特許第５，２００，３３３号および
ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．１３：６４０３−６４２１，（１９８５））。Ｒお
よびＭ遺伝子は通常は密接に連関しているため、両遺伝
子は、しばしば、一方のみの選択により同時にクローニ
ングされうる。しかしながら、Ｍ遺伝子に関する選択
は、完全な制限系を常に与えるわけではなく、むしろメ
チラーゼ遺伝子しか与えないことが多い（ＢｓｐＲＩ：
Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら，Ｇｅｎｅ １０：２１９−２
２５，（１９８０）；ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ
ら，Ｇｅｎｅ ２０：１９７−２０４（１９８２）；Ｂ
ｓｕＲＩ：ＫｉｓｓおよびＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ
２１：１１１−１１９，（１９８３）；およびＭｓｐ
Ｉ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５
８：１２３５−１２４１，（１９８３））。
アプローチは、活性メチラーゼ遺伝子に関する選択によ
るものである（米国特許第５，２００，３３３号および
ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．１３：６４０３−６４２１，（１９８５））。Ｒお
よびＭ遺伝子は通常は密接に連関しているため、両遺伝
子は、しばしば、一方のみの選択により同時にクローニ
ングされうる。しかしながら、Ｍ遺伝子に関する選択
は、完全な制限系を常に与えるわけではなく、むしろメ
チラーゼ遺伝子しか与えないことが多い（ＢｓｐＲＩ：
Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら，Ｇｅｎｅ １０：２１９−２
２５，（１９８０）；ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ
ら，Ｇｅｎｅ ２０：１９７−２０４（１９８２）；Ｂ
ｓｕＲＩ：ＫｉｓｓおよびＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ
２１：１１１−１１９，（１９８３）；およびＭｓｐ
Ｉ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５
８：１２３５−１２４１，（１９８３））。
【００１０】もう１つのアプローチは、ある種の修飾遺
伝子が、新たな宿主内にクローニングされ適切に発現さ
れた場合に、異なる制限遺伝子の存在を該宿主が許容す
るのを可能にすることを利用することにより、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のＲ−Ｍ系をクローニングするとい
うものである（Ｗｉｌｓｏｎら；米国特許第５，２４
６，８４５号）。
伝子が、新たな宿主内にクローニングされ適切に発現さ
れた場合に、異なる制限遺伝子の存在を該宿主が許容す
るのを可能にすることを利用することにより、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のＲ−Ｍ系をクローニングするとい
うものである（Ｗｉｌｓｏｎら；米国特許第５，２４
６，８４５号）。
【００１１】より最近の方法（「エンドブルー（ｅｎｄ
ｏ−ｂｌｕｅ）法」）が、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合体
を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の指示株に基づく大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子の直接クローニングに関して記載されている（Ｆ
ｏｍｅｎｋｏｖら，米国特許第５，４９８，５３５号；
Ｆｏｍｅｎｋｏｖら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
２２：２３９９−２４０３，（１９９４））。この方法
は、制限エンドヌクレアーゼまたは非特異的ヌクレアー
ゼにより引き起こされたＤＮＡ損傷の後の大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）のＳＯＳ応答を利用するものである。多数の
耐熱性ヌクレアーゼ遺伝子（Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＢｓｏＢ
Ｉ、Ｔｆヌクレアーゼ）が、この方法によりクローニン
グされている（米国特許第５，４９８，５３５号）。
ｏ−ｂｌｕｅ）法」）が、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合体
を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の指示株に基づく大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子の直接クローニングに関して記載されている（Ｆ
ｏｍｅｎｋｏｖら，米国特許第５，４９８，５３５号；
Ｆｏｍｅｎｋｏｖら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
２２：２３９９−２４０３，（１９９４））。この方法
は、制限エンドヌクレアーゼまたは非特異的ヌクレアー
ゼにより引き起こされたＤＮＡ損傷の後の大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）のＳＯＳ応答を利用するものである。多数の
耐熱性ヌクレアーゼ遺伝子（Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＢｓｏＢ
Ｉ、Ｔｆヌクレアーゼ）が、この方法によりクローニン
グされている（米国特許第５，４９８，５３５号）。
【００１２】精製された制限エンドヌクレアーゼ、およ
びそれより低度ではあるが修飾メチラーゼは、実験室内
でＤＮＡ分子を操作するための有用な手段であるため、
これらの酵素を大量に産生する細菌株を組換えＤＮＡ技
術により得ることが商業的に強く要請されている。ま
た、そのような過剰発現株は酵素精製の負担を軽減す
る。
びそれより低度ではあるが修飾メチラーゼは、実験室内
でＤＮＡ分子を操作するための有用な手段であるため、
これらの酵素を大量に産生する細菌株を組換えＤＮＡ技
術により得ることが商業的に強く要請されている。ま
た、そのような過剰発現株は酵素精製の負担を軽減す
る。
【００１３】
【課題を解決するための手段】ロドシュードモナス・ス
ファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓ
ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（ＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））カル
チャーコレクション＃２３３（Ｌｙｎｎら，Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．１４２：３８０−３８３（１９８０））
由来のＲｓａＩメチラーゼ遺伝子（ｒｓａＩＭ）を大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドベクターｐＢＲ３２２内
にクローニングするために、メチラーゼ選択方法を用い
た。サブクローニング、欠失マッピングおよびＤＮＡ配
列決定により、挿入されたＲｓａＩメチラーゼ遺伝子
（ＯＲＦ１）の位置を確認し、第２の不完全な収束（ｃ
ｏｎｖｅｒｇｉｎｇ）オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ２）の存在が示された。
ファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓ
ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（ＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））カル
チャーコレクション＃２３３（Ｌｙｎｎら，Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．１４２：３８０−３８３（１９８０））
由来のＲｓａＩメチラーゼ遺伝子（ｒｓａＩＭ）を大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドベクターｐＢＲ３２２内
にクローニングするために、メチラーゼ選択方法を用い
た。サブクローニング、欠失マッピングおよびＤＮＡ配
列決定により、挿入されたＲｓａＩメチラーゼ遺伝子
（ＯＲＦ１）の位置を確認し、第２の不完全な収束（ｃ
ｏｎｖｅｒｇｉｎｇ）オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ２）の存在が示された。
【００１４】メチラーゼエンドヌクレアーゼ遺伝子は、
通常、細菌ＤＮＡ内で互いに並んで存在するため、ＯＲ
Ｆ２はｒｓａＩＲ遺伝子であると仮定され、ＯＲＦ２の
欠落部分をクローニングするように努めた。サザンブロ
ットは、ＢｃｌＩ、ＢｓｔＹＩおよびＰｓｔＩ断片が、
ｒｓａＩＭと、全ＯＲＦ２を含むのに十分な程度に隣接
したＤＮＡとを潜在的に含有しうることを示した。Ｂｃ
ｌＩおよびＢｓｔＹＩならびにサイズ分画されゲル精製
されＰｓｔＩで消化された染色体ＤＮＡで作製されたド
ゥノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ライブラリー上でのメチラー
ゼ選択は、ＲｓａＩメチラーゼクローンを全く与えなか
った。このことは、これらの断片が、おそらく、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）において毒性であったことを示唆して
いる。
通常、細菌ＤＮＡ内で互いに並んで存在するため、ＯＲ
Ｆ２はｒｓａＩＲ遺伝子であると仮定され、ＯＲＦ２の
欠落部分をクローニングするように努めた。サザンブロ
ットは、ＢｃｌＩ、ＢｓｔＹＩおよびＰｓｔＩ断片が、
ｒｓａＩＭと、全ＯＲＦ２を含むのに十分な程度に隣接
したＤＮＡとを潜在的に含有しうることを示した。Ｂｃ
ｌＩおよびＢｓｔＹＩならびにサイズ分画されゲル精製
されＰｓｔＩで消化された染色体ＤＮＡで作製されたド
ゥノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ライブラリー上でのメチラー
ゼ選択は、ＲｓａＩメチラーゼクローンを全く与えなか
った。このことは、これらの断片が、おそらく、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）において毒性であったことを示唆して
いる。
【００１５】天然ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼを、
ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）細胞
抽出物から、ほぼ均一になるまで精製した。約１８ｋＤ
ａおよび２２ｋＤａの２つのタンパク質がＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル分析による調製物中に存在することが判明し
た。これらの両タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定
し、それらを用いて、ＲｓａＩＭと該収束ＯＲＦ２とを
含有する断片のＰＣＲ用のプライマーを合成した。これ
らのＰＣＲの試みもまた、所望のクローンを与えなかっ
た。
ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）細胞
抽出物から、ほぼ均一になるまで精製した。約１８ｋＤ
ａおよび２２ｋＤａの２つのタンパク質がＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル分析による調製物中に存在することが判明し
た。これらの両タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定
し、それらを用いて、ＲｓａＩＭと該収束ＯＲＦ２とを
含有する断片のＰＣＲ用のプライマーを合成した。これ
らのＰＣＲの試みもまた、所望のクローンを与えなかっ
た。
【００１６】最後に、逆ＰＣＲを用いて隣接染色体ＤＮ
Ａを単離し、この断片をｐＣＡＢ１６内およびｐＵＣ１
９内の両方にクローニングし、配列決定した。前記の第
２収束ＯＲＦ（ＯＲＦ２）および追加的なＯＲＦ（ＯＲ
Ｆ３）を含む２つの完全なオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）が、ｒｓａＩＭ遺伝子の下流に見出され
た。ＯＲＦ２およびＯＲＦ３にコードされるタンパク質
の誘導アミノ酸配列は、潜在的制限エンドヌクレアーゼ
を示すＧｅｎｂａｎｋデータベースの公知タンパク質の
いずれとも一致しなかった。しかしながら、第３ＯＲＦ
（ＯＲＦ３）の開始部分にコードされるアミノ酸配列
は、該１８ｋＤａエンドヌクレアーゼ候補タンパク質の
Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致した。ＯＲＦ２の開始
部分にコードされるアミノ酸配列は、該１８ｋＤａまた
は２２ｋＤａタンパク質のいずれのＮ末端配列とも一致
しなかった。これは、おそらく、ＯＲＦ２ではなくＯＲ
Ｆ３がｒｓａＩＲ遺伝子であること、およびＲｓａＩエ
ンドヌクレアーゼタンパク質が１８ｋＤａのサイズを有
することを示した。
Ａを単離し、この断片をｐＣＡＢ１６内およびｐＵＣ１
９内の両方にクローニングし、配列決定した。前記の第
２収束ＯＲＦ（ＯＲＦ２）および追加的なＯＲＦ（ＯＲ
Ｆ３）を含む２つの完全なオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）が、ｒｓａＩＭ遺伝子の下流に見出され
た。ＯＲＦ２およびＯＲＦ３にコードされるタンパク質
の誘導アミノ酸配列は、潜在的制限エンドヌクレアーゼ
を示すＧｅｎｂａｎｋデータベースの公知タンパク質の
いずれとも一致しなかった。しかしながら、第３ＯＲＦ
（ＯＲＦ３）の開始部分にコードされるアミノ酸配列
は、該１８ｋＤａエンドヌクレアーゼ候補タンパク質の
Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致した。ＯＲＦ２の開始
部分にコードされるアミノ酸配列は、該１８ｋＤａまた
は２２ｋＤａタンパク質のいずれのＮ末端配列とも一致
しなかった。これは、おそらく、ＯＲＦ２ではなくＯＲ
Ｆ３がｒｓａＩＲ遺伝子であること、およびＲｓａＩエ
ンドヌクレアーゼタンパク質が１８ｋＤａのサイズを有
することを示した。
【００１７】ほとんどのＲ−Ｍ系においては、制限遺伝
子および修飾遺伝子は、それらの間に他の遺伝子をはさ
まずに存在する。ＲｓａＩ Ｒ−Ｍ系は、未知機能の遺
伝子であるＯＲＦ２がＲおよびＭ遺伝子を分離している
点で特異であるらしい。少数のＲ−Ｍ系においては介在
遺伝子が見出されているが、いずれの場合にも、これら
の介在遺伝子の機能は公知である。例えば、ＢｓｕＲＩ
Ｒ−Ｍ系においては、ｖｓｒ型ミスマッチ修復（Ｖ）
遺伝子がｂｓｕＲＩ ＲおよびＭ遺伝子を分離している
（Ｊ．ＢａｒｓｏｍｉａｎおよびＧ．Ｗｉｌｓｏｎ、未
公開）。ＡｈｄＩ Ｒ−Ｍ系においては、ＤＮＡ配列特
異性（Ｓ）遺伝子がＡａｈｄＩ ＲおよびＭ遺伝子を分
離している（Ｋ．Ｌｕｎｎｅｎ，Ｔ．ＣｕｉおよびＧ．
Ｗｉｌｓｏｎ、未公開）。そしてＢａｍＨＩ Ｒ−Ｍ系
においては、調節遺伝子またはＣ遺伝子がｂａｍＨＩ
ＲおよびＭ遺伝子を分離している（Ｉｖｅｓら，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：７１９４−７２０１（１
９９２）；Ｓｏｈａｌｌら、Ｇｅｎｅ １５７：２２７
−２２８（１９９５））。ＲｓａＩ Ｒ−Ｍ系における
介在遺伝子は、これらの他の介在遺伝子とは異なり、そ
れは独特である。該遺伝子にコードされるタンパク質
は、Ｖ、ＣまたはＳタンパク質のいずれにも類似してお
らず、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の他のいずれのタ
ンパク質にも類似していない。
子および修飾遺伝子は、それらの間に他の遺伝子をはさ
まずに存在する。ＲｓａＩ Ｒ−Ｍ系は、未知機能の遺
伝子であるＯＲＦ２がＲおよびＭ遺伝子を分離している
点で特異であるらしい。少数のＲ−Ｍ系においては介在
遺伝子が見出されているが、いずれの場合にも、これら
の介在遺伝子の機能は公知である。例えば、ＢｓｕＲＩ
Ｒ−Ｍ系においては、ｖｓｒ型ミスマッチ修復（Ｖ）
遺伝子がｂｓｕＲＩ ＲおよびＭ遺伝子を分離している
（Ｊ．ＢａｒｓｏｍｉａｎおよびＧ．Ｗｉｌｓｏｎ、未
公開）。ＡｈｄＩ Ｒ−Ｍ系においては、ＤＮＡ配列特
異性（Ｓ）遺伝子がＡａｈｄＩ ＲおよびＭ遺伝子を分
離している（Ｋ．Ｌｕｎｎｅｎ，Ｔ．ＣｕｉおよびＧ．
Ｗｉｌｓｏｎ、未公開）。そしてＢａｍＨＩ Ｒ−Ｍ系
においては、調節遺伝子またはＣ遺伝子がｂａｍＨＩ
ＲおよびＭ遺伝子を分離している（Ｉｖｅｓら，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：７１９４−７２０１（１
９９２）；Ｓｏｈａｌｌら、Ｇｅｎｅ １５７：２２７
−２２８（１９９５））。ＲｓａＩ Ｒ−Ｍ系における
介在遺伝子は、これらの他の介在遺伝子とは異なり、そ
れは独特である。該遺伝子にコードされるタンパク質
は、Ｖ、ＣまたはＳタンパク質のいずれにも類似してお
らず、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の他のいずれのタ
ンパク質にも類似していない。
【００１８】メタノコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｉｉ）は、Ｍｊａ
Ｖと称されるＲｓａＩのアイソシゾマーをコードしてい
る。ＭｊａＶ Ｒ−Ｍ系のＲおよびＭ遺伝子は、Ｒｓａ
Ｉ Ｒ−Ｍ系の遺伝子とは異なる逆の配向で存在する
が、それらもまた、独特の遺伝子により分離されてい
る。この遺伝子にコードされるタンパク質は、ＲｓａＩ
系の対応介在タンパク質とは類似しておらず、それはま
た、Ｖ、ＣまたはＳタンパク質のいずれとも類似してお
らずＧｅｎＢａｎｋデータベース中の他のいずれのタン
パク質にも類似していない点で独特である（Ｂｕｌｔ
ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１０５８−１０７３、
（１９９６）；Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．，Ｐｏｓｆａｉ，
Ｊ．，Ｐａｔｔｉ，Ｊ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．，
未公開，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；
Ｒ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｋ．ＬｕｎｎｅｎおよびＧ．Ｗｉｌ
ｓｏｎ，未公開，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）。
ａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｉｉ）は、Ｍｊａ
Ｖと称されるＲｓａＩのアイソシゾマーをコードしてい
る。ＭｊａＶ Ｒ−Ｍ系のＲおよびＭ遺伝子は、Ｒｓａ
Ｉ Ｒ−Ｍ系の遺伝子とは異なる逆の配向で存在する
が、それらもまた、独特の遺伝子により分離されてい
る。この遺伝子にコードされるタンパク質は、ＲｓａＩ
系の対応介在タンパク質とは類似しておらず、それはま
た、Ｖ、ＣまたはＳタンパク質のいずれとも類似してお
らずＧｅｎＢａｎｋデータベース中の他のいずれのタン
パク質にも類似していない点で独特である（Ｂｕｌｔ
ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１０５８−１０７３、
（１９９６）；Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．，Ｐｏｓｆａｉ，
Ｊ．，Ｐａｔｔｉ，Ｊ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．，
未公開，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；
Ｒ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｋ．ＬｕｎｎｅｎおよびＧ．Ｗｉｌ
ｓｏｎ，未公開，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）。
【００１９】ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子を含有する予め
修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内への形質転換
により活性ＲｓａＩ制限遺伝子（ＯＲＦ３）をｐＲＲＳ
（Ｓｋｏｇｌｕｎｄら，Ｇｅｎｅ，８８：１−５（１９
９０））内に直接的にクローニングする試みは、失敗し
た。減少したＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を有する
２つのｐＲＲＳ−ｒｓａＩＲクローン＃１３および＃１
４だけが、ＲｓａＩメチラーゼで予め修飾された大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主から単離された。ＭｊａＶメチラ
ーゼで予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に
形質転換された同じ連結体もまた、いずれのクローンも
与えなかった。減少した活性のクローン＃１４のＤＮＡ
配列決定は、下流の遅延（ｄｅｌａｙｅｄ）ＧＴＧ開始
コドンによりＮ末端でＲｓａＩエンドヌクレアーゼを十
中八九トランケート化する開始コドン（ＡＴＧ）のＴの
欠失突然変異を示した。該トランケート化ＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼクローンは、３０℃で培養した場合には
低い活性を示すか又は全く活性を示さず、一方、３７℃
で培養した培養に関しては持続的ＲｓａＩ部分エンドヌ
クレアーゼ活性を示した。
修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内への形質転換
により活性ＲｓａＩ制限遺伝子（ＯＲＦ３）をｐＲＲＳ
（Ｓｋｏｇｌｕｎｄら，Ｇｅｎｅ，８８：１−５（１９
９０））内に直接的にクローニングする試みは、失敗し
た。減少したＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を有する
２つのｐＲＲＳ−ｒｓａＩＲクローン＃１３および＃１
４だけが、ＲｓａＩメチラーゼで予め修飾された大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主から単離された。ＭｊａＶメチラ
ーゼで予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に
形質転換された同じ連結体もまた、いずれのクローンも
与えなかった。減少した活性のクローン＃１４のＤＮＡ
配列決定は、下流の遅延（ｄｅｌａｙｅｄ）ＧＴＧ開始
コドンによりＮ末端でＲｓａＩエンドヌクレアーゼを十
中八九トランケート化する開始コドン（ＡＴＧ）のＴの
欠失突然変異を示した。該トランケート化ＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼクローンは、３０℃で培養した場合には
低い活性を示すか又は全く活性を示さず、一方、３７℃
で培養した培養に関しては持続的ＲｓａＩ部分エンドヌ
クレアーゼ活性を示した。
【００２０】ついでロドシュードモナス・スファエロイ
デス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅ
ｒｏｉｄｅｓ）染色体ＤＮＡからのｒｓａＩＲ ＰＣＲ
断片をクローニングし、ＢｓａＡＩ部位におけるｐＣＡ
Ｂ１６内への連結の後で配列決定した。ｐＣＡＢ１６
は、ｍｓｐＩＲがＰｌａｃプロモーターと同調していて
ｐＵＣ１８のポリリンカー内にクローニングされた活性
ｍｓｐＩＲ遺伝子を含有するｐＵＣ１８誘導体である。
ｐＣＡＢ１６をｍｓｐＩＲ中のＢｓａＡＩ部位において
線状化してｍｓｐＩＲ発現を遮断して（さもなければそ
れは致死的となるであろう）、該ＢｓａＡＩ部位内への
連結によるインサートに関する選択を行なった（図
７）。該ｒｓａＩＲ ＰＣＲ断片をｐＣＡＢ１６内に連
結し、ＲｓａＩメチラーゼで予め修飾された大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に形質転換した。コロニーＰＣ
Ｒを１０個のコロニー上で行なった。１つの単離体＃９
はＰＣＲ ｒｓａＩＲ断片を含有していた。配列決定
は、該１８ｋＤａタンパク質の推定Ｎ末端アミノ酸配列
と一致するｒｓａＩＲの正しいＤＮＡ配列を示した。ｐ
ＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９は、Ｐｌａｃおよびｍｓｐ
ＩＲに対して逆配向であり、アッセイを行なったとこ
ろ、それは、検出可能ではあるが部分的なＲｓａＩ制限
エンドヌクレアーゼ活性を示した。
デス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅ
ｒｏｉｄｅｓ）染色体ＤＮＡからのｒｓａＩＲ ＰＣＲ
断片をクローニングし、ＢｓａＡＩ部位におけるｐＣＡ
Ｂ１６内への連結の後で配列決定した。ｐＣＡＢ１６
は、ｍｓｐＩＲがＰｌａｃプロモーターと同調していて
ｐＵＣ１８のポリリンカー内にクローニングされた活性
ｍｓｐＩＲ遺伝子を含有するｐＵＣ１８誘導体である。
ｐＣＡＢ１６をｍｓｐＩＲ中のＢｓａＡＩ部位において
線状化してｍｓｐＩＲ発現を遮断して（さもなければそ
れは致死的となるであろう）、該ＢｓａＡＩ部位内への
連結によるインサートに関する選択を行なった（図
７）。該ｒｓａＩＲ ＰＣＲ断片をｐＣＡＢ１６内に連
結し、ＲｓａＩメチラーゼで予め修飾された大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に形質転換した。コロニーＰＣ
Ｒを１０個のコロニー上で行なった。１つの単離体＃９
はＰＣＲ ｒｓａＩＲ断片を含有していた。配列決定
は、該１８ｋＤａタンパク質の推定Ｎ末端アミノ酸配列
と一致するｒｓａＩＲの正しいＤＮＡ配列を示した。ｐ
ＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９は、Ｐｌａｃおよびｍｓｐ
ＩＲに対して逆配向であり、アッセイを行なったとこ
ろ、それは、検出可能ではあるが部分的なＲｓａＩ制限
エンドヌクレアーゼ活性を示した。
【００２１】ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９からのＲｓ
ａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｒｓａＩＲ）断片を、
ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化した後にゲル精製し、
ついでｐＲＲＳ内に連結した。ＲｓａＩまたはＭｊａＶ
メチラーゼで予め修飾された別々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）宿主内にこの連結体を形質転換しても、ｐＲＲＳ内
に活性ＲｓａＩ制限クローンを保持する形質転換体を得
ることはできなかった。
ａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｒｓａＩＲ）断片を、
ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化した後にゲル精製し、
ついでｐＲＲＳ内に連結した。ＲｓａＩまたはＭｊａＶ
メチラーゼで予め修飾された別々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）宿主内にこの連結体を形質転換しても、ｐＲＲＳ内
に活性ＲｓａＩ制限クローンを保持する形質転換体を得
ることはできなかった。
【００２２】また、ロドシュードモナス・スファエロイ
デス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅ
ｒｏｉｄｅｓ）染色体ＤＮＡからの全３個のＯＲＦ、す
なわちｒｓａＩＭ（ＯＲＦ１）、収束未知ＯＲＦ ｒｓ
ａＩＵ（ＯＲＦ２）およびｒｓａＩＲ（ＯＲＦ３）を含
有するＰＣＲ断片上のＲｓａＩ制限−修飾系をｐＵＣ１
９内に直接的にクローニングすることを試みたが、無傷
ＲｓａＩエンドヌクレアーゼを得ることはできなかっ
た。ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ消化に対して抵抗性で
あることが判明した僅か３個のｐＵＣ１９クローン＃
１、＃６および＃１２が単離され、これらは、より小さ
な欠失ＤＮＡ断片を含有していた。＃１のＤＮＡ配列決
定は、未知遺伝子ｒｓａＩＵ（ＯＲＦ２）の一部だけ及
びｒｓａＩＲ（ＯＲＦ３）の全部が欠失した無傷ｒｓａ
ＩＭ遺伝子を示した。
デス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅ
ｒｏｉｄｅｓ）染色体ＤＮＡからの全３個のＯＲＦ、す
なわちｒｓａＩＭ（ＯＲＦ１）、収束未知ＯＲＦ ｒｓ
ａＩＵ（ＯＲＦ２）およびｒｓａＩＲ（ＯＲＦ３）を含
有するＰＣＲ断片上のＲｓａＩ制限−修飾系をｐＵＣ１
９内に直接的にクローニングすることを試みたが、無傷
ＲｓａＩエンドヌクレアーゼを得ることはできなかっ
た。ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ消化に対して抵抗性で
あることが判明した僅か３個のｐＵＣ１９クローン＃
１、＃６および＃１２が単離され、これらは、より小さ
な欠失ＤＮＡ断片を含有していた。＃１のＤＮＡ配列決
定は、未知遺伝子ｒｓａＩＵ（ＯＲＦ２）の一部だけ及
びｒｓａＩＲ（ＯＲＦ３）の全部が欠失した無傷ｒｓａ
ＩＭ遺伝子を示した。
【００２３】ＲｓａＩエンドヌクレアーゼクローンを確
立するためのもう１つの試みは、高度に調節されるＴ７
プロモーターを含有するプラスミドｐＬＴ７Ｋ（ＮＥＢ
＃１２８５，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の使用を含むも
のであった。ｐＬＴ７Ｋは、ｐＳＸ２０およびｐＩＨ９
１９の両方に和合性のｃｏｌＥ１複製起点を有する。該
プラスミドは、ＩＰＴＧ調節Ｔ７プロモーターとは反対
に配向したファージラムダからのＰＲプロモーターを含
有し、それはまた、アンピシリンおよびカナマイシン耐
性遺伝子を含有する。該ＰＲプロモーターは、３０℃で
はラムダｃＩリプレッサーにより抑制される。このリプ
レッサー（ファージラムダｃＩ８５７遺伝子の産物であ
る）は温度感受性であり、３７℃を超えるとＰＲを抑制
せず、ＰＲプロモーターの発現を可能にする。Ｔｎ９０
３由来のカナマイシン遺伝子は、一方の末端のクローニ
ング部位と共にＰＲプロモーターと同調して位置する
（それは、Ｋａｎ感受性になるプラスミド上のインサー
トに関する直接的選択を可能にする）。もう一方の末端
には、ＩＰＴＧの添加により誘導されるｌａｃＩリプレ
ッサーにより調節される対向（ｏｐｐｏｓｉｎｇ）Ｔ７
プロモーターが存在する。ｐＬＴ７Ｋを使用するエンド
ヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現のための方法は以下のと
おりである。Ｔ７プロモーターと同調したエンドヌクレ
アーゼ遺伝子を含有するプラスミドを３７℃で０．８〜
１．０のＯＤ５９０まで培養して、該対向Ｔ７プロモー
ターからの該エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を妨げる
ＰＲプロモーターからのアンチセンス発現を引き起こさ
せる。該培養温度を３０℃まで低下させると、ＰＲは抑
制される。ついでＩＰＴＧを加えて、該Ｔ７プロモータ
ーおよび該エンドヌクレアーゼ遺伝子（すなわち、ｒｓ
ａＩＲ）を誘導する。
立するためのもう１つの試みは、高度に調節されるＴ７
プロモーターを含有するプラスミドｐＬＴ７Ｋ（ＮＥＢ
＃１２８５，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の使用を含むも
のであった。ｐＬＴ７Ｋは、ｐＳＸ２０およびｐＩＨ９
１９の両方に和合性のｃｏｌＥ１複製起点を有する。該
プラスミドは、ＩＰＴＧ調節Ｔ７プロモーターとは反対
に配向したファージラムダからのＰＲプロモーターを含
有し、それはまた、アンピシリンおよびカナマイシン耐
性遺伝子を含有する。該ＰＲプロモーターは、３０℃で
はラムダｃＩリプレッサーにより抑制される。このリプ
レッサー（ファージラムダｃＩ８５７遺伝子の産物であ
る）は温度感受性であり、３７℃を超えるとＰＲを抑制
せず、ＰＲプロモーターの発現を可能にする。Ｔｎ９０
３由来のカナマイシン遺伝子は、一方の末端のクローニ
ング部位と共にＰＲプロモーターと同調して位置する
（それは、Ｋａｎ感受性になるプラスミド上のインサー
トに関する直接的選択を可能にする）。もう一方の末端
には、ＩＰＴＧの添加により誘導されるｌａｃＩリプレ
ッサーにより調節される対向（ｏｐｐｏｓｉｎｇ）Ｔ７
プロモーターが存在する。ｐＬＴ７Ｋを使用するエンド
ヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現のための方法は以下のと
おりである。Ｔ７プロモーターと同調したエンドヌクレ
アーゼ遺伝子を含有するプラスミドを３７℃で０．８〜
１．０のＯＤ５９０まで培養して、該対向Ｔ７プロモー
ターからの該エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を妨げる
ＰＲプロモーターからのアンチセンス発現を引き起こさ
せる。該培養温度を３０℃まで低下させると、ＰＲは抑
制される。ついでＩＰＴＧを加えて、該Ｔ７プロモータ
ーおよび該エンドヌクレアーゼ遺伝子（すなわち、ｒｓ
ａＩＲ）を誘導する。
【００２４】Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ
を使用して、ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｒｓ
ａＩＲ）をｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９からＰＣＲ増
幅し、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩでの消化およびｐＬＴ７
Ｋ内への連結の後にクローニングした。該連結反応物
を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを欠く大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ＤＨ５α内に形質転換し、２０ｍＭグルコースを
含有するＬＢ＋Ａｍｐプレート上で３７℃でプレーティ
ングした。１８個のカナマイシン感受性コロニーからプ
ラスミドＤＮＡを単離した。１２個が、ＸｂａＩ＋Ｘｈ
ｏＩ二重消化により攻撃されたとおりの正しいサイズの
ｒｓａＩＲ断片を含有していた。これらのｐＬＴ７Ｋ−
ｒｓａＩＲクローンの４個を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼを含有するＲｓａＩメチラーゼで予め修飾された大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６宿主内に形質転換し
た。アッセイしたところ、該ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲク
ローンは、種々の量の検出可能なＲｓａＩ制限エンドヌ
クレアーゼ活性を示した。最大のＲｓａＩエンドヌクレ
アーゼ活性を有するクローン（＃５−３ ｐＬＴ７Ｋ−
ｒｓａＩＲ）は、最大のＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活
性を示した。＃５−３ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲプレート
からの４個のコロニーを再び培養し、ついでＩＰＴＧで
誘導し、ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性に関してアッ
セイした。しかし、この場合、ＲｓａＩエンドヌクレア
ーゼ活性は全く検出されなかった。このことは、該クロ
ーンが不安定であったことを示唆している。
を使用して、ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｒｓ
ａＩＲ）をｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９からＰＣＲ増
幅し、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩでの消化およびｐＬＴ７
Ｋ内への連結の後にクローニングした。該連結反応物
を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを欠く大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ＤＨ５α内に形質転換し、２０ｍＭグルコースを
含有するＬＢ＋Ａｍｐプレート上で３７℃でプレーティ
ングした。１８個のカナマイシン感受性コロニーからプ
ラスミドＤＮＡを単離した。１２個が、ＸｂａＩ＋Ｘｈ
ｏＩ二重消化により攻撃されたとおりの正しいサイズの
ｒｓａＩＲ断片を含有していた。これらのｐＬＴ７Ｋ−
ｒｓａＩＲクローンの４個を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼを含有するＲｓａＩメチラーゼで予め修飾された大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６宿主内に形質転換し
た。アッセイしたところ、該ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲク
ローンは、種々の量の検出可能なＲｓａＩ制限エンドヌ
クレアーゼ活性を示した。最大のＲｓａＩエンドヌクレ
アーゼ活性を有するクローン（＃５−３ ｐＬＴ７Ｋ−
ｒｓａＩＲ）は、最大のＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活
性を示した。＃５−３ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲプレート
からの４個のコロニーを再び培養し、ついでＩＰＴＧで
誘導し、ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性に関してアッ
セイした。しかし、この場合、ＲｓａＩエンドヌクレア
ーゼ活性は全く検出されなかった。このことは、該クロ
ーンが不安定であったことを示唆している。
【００２５】安定な過剰発現ＲｓａＩエンドヌクレアー
ゼクローンを作製するためには、もう１つの工程、すな
わち、両方のメチラーゼ（Ｍ．ＲｓａＩおよびＭ．Ｍｊ
ａＶ）で予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主を
使用することが必要であることが判明した。これらの２
つのメチラーゼを含有する和合性ベクタープラスミドを
使用して、高度に発現するＲｓａＩエンドヌクレアーゼ
クローンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において確立した。
これを行なうために、ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子（ｒｓ
ａＩＭ）を、ＰｌａｃプロモーターとｐＵＣ１８由来の
ポリリンカーとを含有するｐＡＣＹＣ１８４の誘導体で
あるｐＩＨ９１９内にクローニングした。ＭｊａＶメチ
ラーゼ遺伝子（ｍｊａＶＭ）を、ｐＢＲ３２２とｐＡＣ
ＹＣに基づくプラスミドとの両方に和合性のｐＳＣ１０
１の誘導体であるｐＳＸ２０内にクローニングした。つ
いでｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭメチラーゼプラスミドを、
ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭプラスミドを含有するコンピ
テント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＥＲ２７４４内に形
質転換した。両方のメチラーゼを含有するこの大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＥＲ２７４４株をコンピテントに
し、前記のｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ＃５からの元のミニ
プレップＤＮＡで形質転換した。宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ＥＲ２７４４は、Ｔｈｒ Ｔ７プロモーターから
のｒｓａＩＲの発現に必要なＴ７ポリメラーゼを含有す
る。（注：Ｍ．ＲｓａＩおよびＭ．ＭｊａＶを含有する
この二重予備修飾大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内への宿主形
質転換により活性ＲｓａＩ制限遺伝子ｒｓａＩＲをｐＲ
ＲＳ内に直接的にクローニングする試みは、失敗した。
この形質転換からの１２個のコロニーのプラスミドＤＮ
Ａを単離した。いずれのクローンも、正しいサイズのｒ
ｓａＩＲインサートを含有せず、検出可能なＲｓａＩエ
ンドヌクレアーゼ活性を示さないらしかった。
ゼクローンを作製するためには、もう１つの工程、すな
わち、両方のメチラーゼ（Ｍ．ＲｓａＩおよびＭ．Ｍｊ
ａＶ）で予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主を
使用することが必要であることが判明した。これらの２
つのメチラーゼを含有する和合性ベクタープラスミドを
使用して、高度に発現するＲｓａＩエンドヌクレアーゼ
クローンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において確立した。
これを行なうために、ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子（ｒｓ
ａＩＭ）を、ＰｌａｃプロモーターとｐＵＣ１８由来の
ポリリンカーとを含有するｐＡＣＹＣ１８４の誘導体で
あるｐＩＨ９１９内にクローニングした。ＭｊａＶメチ
ラーゼ遺伝子（ｍｊａＶＭ）を、ｐＢＲ３２２とｐＡＣ
ＹＣに基づくプラスミドとの両方に和合性のｐＳＣ１０
１の誘導体であるｐＳＸ２０内にクローニングした。つ
いでｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭメチラーゼプラスミドを、
ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭプラスミドを含有するコンピ
テント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＥＲ２７４４内に形
質転換した。両方のメチラーゼを含有するこの大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＥＲ２７４４株をコンピテントに
し、前記のｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ＃５からの元のミニ
プレップＤＮＡで形質転換した。宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ＥＲ２７４４は、Ｔｈｒ Ｔ７プロモーターから
のｒｓａＩＲの発現に必要なＴ７ポリメラーゼを含有す
る。（注：Ｍ．ＲｓａＩおよびＭ．ＭｊａＶを含有する
この二重予備修飾大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内への宿主形
質転換により活性ＲｓａＩ制限遺伝子ｒｓａＩＲをｐＲ
ＲＳ内に直接的にクローニングする試みは、失敗した。
この形質転換からの１２個のコロニーのプラスミドＤＮ
Ａを単離した。いずれのクローンも、正しいサイズのｒ
ｓａＩＲインサートを含有せず、検出可能なＲｓａＩエ
ンドヌクレアーゼ活性を示さないらしかった。
【００２６】ついでこの形質転換からの５個のコロニー
を、０．８〜１．０のＯＤ５９０まで３７℃で培養し、
ついで培養温度を３０℃に低下させ、ついでＩＰＴＧ誘
導を行なった。ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性に関し
てアッセイしたところ、全５個のクローン＃５１、＃５
２、＃５３、＃５４および＃５５が種々の量のＲｓａＩ
エンドヌクレアーゼ活性を示し、最高は１０６ｕ／ｇを
超える＃５１であった（図８）。ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩ
Ｒ＃５１クローンのグリセロールストックを−７０℃で
保存し、ついで＃５１グリセロールストックを融解し、
ＬＢアンピシリン、クロラムフェニコールおよびカナマ
イシンプレート上で３７℃で再びストリークし、再度、
個々のクローンを３０℃で培養し誘導し、ＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。１個のその
ようなクローンｐＫＬ１６７−５１を含む全４個のクロ
ーンが、湿潤大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞１グラム当た
りで産生されたＲｓａＩエンドヌクレアーゼの５×１０
６単位以上でＲ．ＲｓａＩを発現した。ｐＫＬ１６７−
５１からの組換えＲｓａＩエンドヌクレアーゼは、ほぼ
均一になるまでクロマトグラフィーにより精製すること
ができる。
を、０．８〜１．０のＯＤ５９０まで３７℃で培養し、
ついで培養温度を３０℃に低下させ、ついでＩＰＴＧ誘
導を行なった。ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性に関し
てアッセイしたところ、全５個のクローン＃５１、＃５
２、＃５３、＃５４および＃５５が種々の量のＲｓａＩ
エンドヌクレアーゼ活性を示し、最高は１０６ｕ／ｇを
超える＃５１であった（図８）。ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩ
Ｒ＃５１クローンのグリセロールストックを−７０℃で
保存し、ついで＃５１グリセロールストックを融解し、
ＬＢアンピシリン、クロラムフェニコールおよびカナマ
イシンプレート上で３７℃で再びストリークし、再度、
個々のクローンを３０℃で培養し誘導し、ＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。１個のその
ようなクローンｐＫＬ１６７−５１を含む全４個のクロ
ーンが、湿潤大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞１グラム当た
りで産生されたＲｓａＩエンドヌクレアーゼの５×１０
６単位以上でＲ．ＲｓａＩを発現した。ｐＫＬ１６７−
５１からの組換えＲｓａＩエンドヌクレアーゼは、ほぼ
均一になるまでクロマトグラフィーにより精製すること
ができる。
【００２７】（図面の簡単な記載） 図１．ＲｓａＩ制限−修飾系の遺伝子体制を示す。 図２．ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子（配列番号１）および
そのコード化アミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図３．ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（配列番号
３）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号４）を
示す。 図４．ＲｓａＩ未知遺伝子（配列番号５）およびそのコ
ード化アミノ酸配列（配列番号６）を示す。 図５．ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭメチラーゼクローンの
プラスミド地図を示す。 図６．ｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭメチラーゼクローンのプ
ラスミド地図を示す。図７．ｐＣＡＢ１６のプラスミド
地図を示す。 図８．ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲエンドヌクレアーゼクロ
ーン＃５のプラスミド地図を示す。 図９．ｐＫＬ１６７−５１の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細
胞抽出物からのＲｓａＩ制限酵素活性を表す写真を示
す。
そのコード化アミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図３．ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（配列番号
３）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号４）を
示す。 図４．ＲｓａＩ未知遺伝子（配列番号５）およびそのコ
ード化アミノ酸配列（配列番号６）を示す。 図５．ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭメチラーゼクローンの
プラスミド地図を示す。 図６．ｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭメチラーゼクローンのプ
ラスミド地図を示す。図７．ｐＣＡＢ１６のプラスミド
地図を示す。 図８．ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲエンドヌクレアーゼクロ
ーン＃５のプラスミド地図を示す。 図９．ｐＫＬ１６７−５１の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細
胞抽出物からのＲｓａＩ制限酵素活性を表す写真を示
す。
【００２８】
【発明の実施の形態】該ＲｓａＩエンドヌクレアーゼを
クローンから巧く過剰産生させるためには、２つのメチ
ラーゼＭ．ＭｊａＶおよびＭ．ＲｓａＩで予め修飾され
た大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主における特別に抑制され
たプラスミドベクターｐＬＴ７Ｋの使用を含む、メチラ
ーゼ選択を超える更なる工程が必要であった。大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡをＲｓａＩ消化から完全に保護
するためには、２つのＭＴａｓｅが必要であった。２つ
の和合性プラスミド（一方はｒｓａＩＭを含有し、もう
一方はｍｊａＶＭを含有する）を使用して、それらを該
宿主に導入した。これらのプラスミドを、Ｔ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内
に形質転換し、ついでこの株を、ｒｓａＩＲ遺伝子を含
有する第３の和合性プラスミドｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ
で形質転換し、ついで全３個の組換えプラスミドを含有
するコロニーを抗生物質含有ルリアブロスプレート上で
選択した。
クローンから巧く過剰産生させるためには、２つのメチ
ラーゼＭ．ＭｊａＶおよびＭ．ＲｓａＩで予め修飾され
た大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主における特別に抑制され
たプラスミドベクターｐＬＴ７Ｋの使用を含む、メチラ
ーゼ選択を超える更なる工程が必要であった。大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡをＲｓａＩ消化から完全に保護
するためには、２つのＭＴａｓｅが必要であった。２つ
の和合性プラスミド（一方はｒｓａＩＭを含有し、もう
一方はｍｊａＶＭを含有する）を使用して、それらを該
宿主に導入した。これらのプラスミドを、Ｔ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内
に形質転換し、ついでこの株を、ｒｓａＩＲ遺伝子を含
有する第３の和合性プラスミドｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ
で形質転換し、ついで全３個の組換えプラスミドを含有
するコロニーを抗生物質含有ルリアブロスプレート上で
選択した。
【００２９】ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子およびＲｓａＩ
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を、好ましくは、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてクローニングし発現させる本
明細書に記載の方法では、以下の工程を行なう。
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を、好ましくは、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてクローニングし発現させる本
明細書に記載の方法では、以下の工程を行なう。
【００３０】１．ＡｐｏＩ部分ゲノムＤＮＡライブラリ
ーの構築 ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノム
ＤＮＡをＡｐｏＩで消化して、所望の部分消化を行なっ
た。０．５〜２０ｋｂの該ＡｐｏＩ完全および部分消化
ゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断されＣＩＰで処理さ
れたベクターｐＢＲ３２２内に１７℃で一晩連結した。
ＥＲ２４１８大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞
および連結ＤＮＡを使用して、形質転換を行なった。該
形質転換体をプールし、増幅した。該一晩細胞培養物か
ら、プラスミドＤＮＡを調製した。
ーの構築 ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノム
ＤＮＡをＡｐｏＩで消化して、所望の部分消化を行なっ
た。０．５〜２０ｋｂの該ＡｐｏＩ完全および部分消化
ゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断されＣＩＰで処理さ
れたベクターｐＢＲ３２２内に１７℃で一晩連結した。
ＥＲ２４１８大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞
および連結ＤＮＡを使用して、形質転換を行なった。該
形質転換体をプールし、増幅した。該一晩細胞培養物か
ら、プラスミドＤＮＡを調製した。
【００３１】２．ＲｓａＩ消化による該ＡｐｏＩ部分ラ
イブラリーＤＮＡの攻撃およびＲｓａＩメチラーゼ遺伝
子の単離 該ＡｐｏＩ部分ライブラリーＤＮＡをＲｓａＩで３７℃
で２時間消化した。該消化ＤＮＡをＥＲ２４１８コンピ
テント細胞内に形質転換した。個々の形質転換体の細胞
培養からプラスミドＤＮＡを単離した。消化に対する抵
抗性を検出するために、個々のプラスミドＤＮＡをＲｓ
ａＩで消化した。２つのプラスミド単離体＃１および＃
２が、ＲｓａＩ消化に対する完全な抵抗性を示した。こ
れらのクローンは該クローン化ＲｓａＩ Ｍ遺伝子を保
持していた。
イブラリーＤＮＡの攻撃およびＲｓａＩメチラーゼ遺伝
子の単離 該ＡｐｏＩ部分ライブラリーＤＮＡをＲｓａＩで３７℃
で２時間消化した。該消化ＤＮＡをＥＲ２４１８コンピ
テント細胞内に形質転換した。個々の形質転換体の細胞
培養からプラスミドＤＮＡを単離した。消化に対する抵
抗性を検出するために、個々のプラスミドＤＮＡをＲｓ
ａＩで消化した。２つのプラスミド単離体＃１および＃
２が、ＲｓａＩ消化に対する完全な抵抗性を示した。こ
れらのクローンは該クローン化ＲｓａＩ Ｍ遺伝子を保
持していた。
【００３２】３．ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子を保持する
インサートの配列決定 ＤＮＡ配列決定は、該インサート内の該挿入ＲｓａＩメ
チラーゼ遺伝子（ＯＲＦ１）の位置を証明し、部分的な
収束オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）を示し
た。ＢＬＡＳＴを使用して完全なＯＲＦ１をＧｅｎＢａ
ｎｋ中の公知遺伝子産物と比較したところ、それは、Ｎ
４−メチルシトシンメチラーゼに対する相同性を示し
た。１２３０ｂｐの完全なＯＲＦ１は、ＲｓａＩメチラ
ーゼをコードしている（４０９アミノ酸の分子量＝４
５．４ｋＤａ）。該部分的ＯＲＦ２は、Ｇｅｎｂａｎｋ
データベース中の公知タンパク質のいずれに対する一致
も示さなかった。
インサートの配列決定 ＤＮＡ配列決定は、該インサート内の該挿入ＲｓａＩメ
チラーゼ遺伝子（ＯＲＦ１）の位置を証明し、部分的な
収束オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）を示し
た。ＢＬＡＳＴを使用して完全なＯＲＦ１をＧｅｎＢａ
ｎｋ中の公知遺伝子産物と比較したところ、それは、Ｎ
４−メチルシトシンメチラーゼに対する相同性を示し
た。１２３０ｂｐの完全なＯＲＦ１は、ＲｓａＩメチラ
ーゼをコードしている（４０９アミノ酸の分子量＝４
５．４ｋＤａ）。該部分的ＯＲＦ２は、Ｇｅｎｂａｎｋ
データベース中の公知タンパク質のいずれに対する一致
も示さなかった。
【００３３】４．精製されたＲｓａＩ制限エンドヌクレ
アーゼのＮ末端アミノ酸の配列決定 該非組換えＲｓａＩエンドヌクレアーゼを、ほぼ均一に
まで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。２つのタンパ
ク質バンドが、約１８ｋＤａおよび２２ｋＤａの分子量
で検出された。該１８ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ
酸配列は、（Ｍ）ＥＲＲＦＰＬＲＷＤＥＥＥＬＡＲＡＦ
ＫＶＴＴＫ（配列番号７）と決定された。該２２ｋＤａ
タンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、（Ｍ）ＡＲＥＩＰ
ＤＬＱＡＶＶＲＴＧＴＧＫＧＡＡＲＱＡＲＸ（配列番号
８）と決定された。（該１８ｋＤａタンパク質の配列
は、第５節に記載のとおりＯＲＦ３にコードされる推定
Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致する）該２２ｋＤａ配
列は、該クローン化ＯＲＦのいずれとも一致しなかっ
た。ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼは、十中八九、該
１８ｋＤａタンパク質であると結論された。
アーゼのＮ末端アミノ酸の配列決定 該非組換えＲｓａＩエンドヌクレアーゼを、ほぼ均一に
まで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。２つのタンパ
ク質バンドが、約１８ｋＤａおよび２２ｋＤａの分子量
で検出された。該１８ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ
酸配列は、（Ｍ）ＥＲＲＦＰＬＲＷＤＥＥＥＬＡＲＡＦ
ＫＶＴＴＫ（配列番号７）と決定された。該２２ｋＤａ
タンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、（Ｍ）ＡＲＥＩＰ
ＤＬＱＡＶＶＲＴＧＴＧＫＧＡＡＲＱＡＲＸ（配列番号
８）と決定された。（該１８ｋＤａタンパク質の配列
は、第５節に記載のとおりＯＲＦ３にコードされる推定
Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致する）該２２ｋＤａ配
列は、該クローン化ＯＲＦのいずれとも一致しなかっ
た。ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼは、十中八九、該
１８ｋＤａタンパク質であると結論された。
【００３４】５．ＯＲＦ２およびＯＲＦ３をクローニン
グするための逆ＰＣＲ ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノム
ＤＮＡを、自己連結したＨｐａＩＩおよびＮＣｉＩで切
断されたＤＮＡの逆ＰＣＲにより増幅した。該逆ＰＣＲ
産物を、ＡｐｏＩおよびＰｓｔＩでの消化およびｐＵＣ
１９内への連結によってクローニングした。該連結体
を、予め修飾されたＭ．ＲｓａＩ株内に形質転換した。
プラスミドＤＮＡを８個のコロニーから単離し、Ａｐｏ
ＩおよびＰｓｔＩで消化した。ＮｃｉＩ＃７、ＨｐａＩ
Ｉ＃２、＃３、＃４および＃７は逆ＰＣＲ断片を含有し
ていた。ＮｃｉＩ＃７およびＨｐａＩＩ＃７のＤＮＡ配
列決定は、４９３ｂｐの新規ＤＮＡ配列を示した。該配
列は、ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏ
ｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅ
ｓ）の染色体上のＡｐｏＩ部位の位置を証明し、該収束
オープンリーディングフレームＯＲＦ２の配列を完全な
ものにした。該逆ＰＣＲ断片はＡｐｏＩ部位を含み、し
たがって該ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒ
ｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄ
ｅｓ）染色体上のこのＡｐｏＩ部位からＨｐａＩＩ／Ｎ
ｃｉＩ部位までの新規ＤＮＡを含有していた（該Ｈｐａ
ＩＩ部位（ＣＣ／ＧＧ）はＮｃｉＩ部位（ＣＣ／ＧＧ
Ｇ）と重複する）。該逆ＰＣＲ断片配列はまた、ｒｓａ
ＩＭと同じ方向に伸長する１０２ｂｐの新規ＯＲＦおよ
びＡＴＧ開始コドンを含有していた。この新規ＯＲＦ
（ＯＲＦ３）の産物の誘導アミノ酸配列は、該１８ｋＤ
ａ候補タンパク質の実験的に決定された配列および追加
的な１４アミノ酸を含んでいた。ＢＬＡＳＴを使用して
この新規部分的ＯＲＦ（ＯＲＦ３）をＧｅｎＢａｎｋ中
の公知遺伝子産物と比較したところ、それは、Ｇｅｎｂ
ａｎｋデータベース中の公知タンパク質とは一致しなか
った。これは、制限エンドヌクレアーゼの典型的な特徴
である。
グするための逆ＰＣＲ ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノム
ＤＮＡを、自己連結したＨｐａＩＩおよびＮＣｉＩで切
断されたＤＮＡの逆ＰＣＲにより増幅した。該逆ＰＣＲ
産物を、ＡｐｏＩおよびＰｓｔＩでの消化およびｐＵＣ
１９内への連結によってクローニングした。該連結体
を、予め修飾されたＭ．ＲｓａＩ株内に形質転換した。
プラスミドＤＮＡを８個のコロニーから単離し、Ａｐｏ
ＩおよびＰｓｔＩで消化した。ＮｃｉＩ＃７、ＨｐａＩ
Ｉ＃２、＃３、＃４および＃７は逆ＰＣＲ断片を含有し
ていた。ＮｃｉＩ＃７およびＨｐａＩＩ＃７のＤＮＡ配
列決定は、４９３ｂｐの新規ＤＮＡ配列を示した。該配
列は、ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏ
ｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅ
ｓ）の染色体上のＡｐｏＩ部位の位置を証明し、該収束
オープンリーディングフレームＯＲＦ２の配列を完全な
ものにした。該逆ＰＣＲ断片はＡｐｏＩ部位を含み、し
たがって該ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒ
ｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄ
ｅｓ）染色体上のこのＡｐｏＩ部位からＨｐａＩＩ／Ｎ
ｃｉＩ部位までの新規ＤＮＡを含有していた（該Ｈｐａ
ＩＩ部位（ＣＣ／ＧＧ）はＮｃｉＩ部位（ＣＣ／ＧＧ
Ｇ）と重複する）。該逆ＰＣＲ断片配列はまた、ｒｓａ
ＩＭと同じ方向に伸長する１０２ｂｐの新規ＯＲＦおよ
びＡＴＧ開始コドンを含有していた。この新規ＯＲＦ
（ＯＲＦ３）の産物の誘導アミノ酸配列は、該１８ｋＤ
ａ候補タンパク質の実験的に決定された配列および追加
的な１４アミノ酸を含んでいた。ＢＬＡＳＴを使用して
この新規部分的ＯＲＦ（ＯＲＦ３）をＧｅｎＢａｎｋ中
の公知遺伝子産物と比較したところ、それは、Ｇｅｎｂ
ａｎｋデータベース中の公知タンパク質とは一致しなか
った。これは、制限エンドヌクレアーゼの典型的な特徴
である。
【００３５】ｒｓａＩＭに向かって戻る該ＡｐｏＩ部位
の方向に、該収束未知ＯＲＦ２の開始部位であると考え
られるＧＴＧ開始コドンが、ＯＲＦ３の開始部位から３
１ｂｐ離れた部位に位置した。ｒｓａＩＵと称されるこ
の未知ＯＲＦ２は、元々はｒｓａＩＲであると仮定され
ていたが、前記のとおり、Ｎ末端Ｒ．ＲｓａＩエンドヌ
クレアーゼ（１８ｋＤａ）タンパク質配列は、この仮定
が誤りであることを明らかにした。なぜなら、該Ｎ末端
１８ｋＤＡタンパク質配列はＯＲＦ３の開始部位とは一
致したが、ＯＲＦ２の開始部位とは一致しなかったから
である。Ｒ．ＲｓａＩのＣ末端を同定するために、無傷
ｒｓａＩＲの潜在的な毒性発現を最小限に抑えるために
該遺伝子のＡＴＧ開始部位を排したｒｓａＩＲの３’末
端をＰＣＲするためにＰＣＲプライマーを設計した。自
己連結したＭｆｅＩ切断ＤＮＡの逆ＰＣＲにより、ゲノ
ムＤＮＡを増幅した。Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラー
ゼＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し、ＳｍａＩおよびＰｓ
ｔＩで消化されたｐＵＣ１９内にクローニングし、つい
で配列決定した。その新たに誘導された配列は、配列決
定された全ＤＮＡを２７１４ｂｐ（ＡｐｏＩ断片単離物
＃１からの及び該ＨｐａＩＩ／ＮｃｉＩ染色体断片の逆
ＰＣＲからの配列を含む）にまで拡大した。全６個のリ
ーディングフレームにおけるこの完全なＤＮＡ配列の翻
訳は、ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子の下流に２個の完全な
オープンリーディングフレーム、すなわち、未知収束ｒ
ｓａＩＵ（ＯＲＦ２）およびｒｓａＩＲ（ＯＲＦ３）が
存在することを示した（図１）。ＯＲＦ２およびＯＲＦ
３の産物の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中の公
知タンパク質のいずれとも一致しなかった。
の方向に、該収束未知ＯＲＦ２の開始部位であると考え
られるＧＴＧ開始コドンが、ＯＲＦ３の開始部位から３
１ｂｐ離れた部位に位置した。ｒｓａＩＵと称されるこ
の未知ＯＲＦ２は、元々はｒｓａＩＲであると仮定され
ていたが、前記のとおり、Ｎ末端Ｒ．ＲｓａＩエンドヌ
クレアーゼ（１８ｋＤａ）タンパク質配列は、この仮定
が誤りであることを明らかにした。なぜなら、該Ｎ末端
１８ｋＤＡタンパク質配列はＯＲＦ３の開始部位とは一
致したが、ＯＲＦ２の開始部位とは一致しなかったから
である。Ｒ．ＲｓａＩのＣ末端を同定するために、無傷
ｒｓａＩＲの潜在的な毒性発現を最小限に抑えるために
該遺伝子のＡＴＧ開始部位を排したｒｓａＩＲの３’末
端をＰＣＲするためにＰＣＲプライマーを設計した。自
己連結したＭｆｅＩ切断ＤＮＡの逆ＰＣＲにより、ゲノ
ムＤＮＡを増幅した。Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラー
ゼＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し、ＳｍａＩおよびＰｓ
ｔＩで消化されたｐＵＣ１９内にクローニングし、つい
で配列決定した。その新たに誘導された配列は、配列決
定された全ＤＮＡを２７１４ｂｐ（ＡｐｏＩ断片単離物
＃１からの及び該ＨｐａＩＩ／ＮｃｉＩ染色体断片の逆
ＰＣＲからの配列を含む）にまで拡大した。全６個のリ
ーディングフレームにおけるこの完全なＤＮＡ配列の翻
訳は、ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子の下流に２個の完全な
オープンリーディングフレーム、すなわち、未知収束ｒ
ｓａＩＵ（ＯＲＦ２）およびｒｓａＩＲ（ＯＲＦ３）が
存在することを示した（図１）。ＯＲＦ２およびＯＲＦ
３の産物の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中の公
知タンパク質のいずれとも一致しなかった。
【００３６】６．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＲｓ
ａＩメチラーゼ遺伝子の発現 Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼとｒｓａＩＭに対す
る2個のオリゴヌクレオチドプライマーとを使用して、
全ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子（１２３０ｂｐ）をゲノム
ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ産物をＫｐｎＩお
よびＢａｍＨＩで消化し、ＫｐｎＩおよびＢａｎＨＩで
消化されたｐＩＨ９１９内にクローニングし、ついで大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５０２およびＥＲ２５６６
内に形質転換した。該形質転換体をプールし、増幅し
た。プラスミドＤＮＡを一晩培養物から調製し、ついで
ＲｓａＩで３７℃で１時間消化した。その消化されたプ
ールをＥＲ２５０２およびＥＲ２５６６内に再形質転換
した。個々のプラスミドＤＮＡを精製し、ＲｓａＩで消
化してＲｓａＩ消化に対する抵抗性を検出した。４個の
単離物＃１、＃２、＃４および＃６はｒｓａＩＭ ＰＣ
Ｒ断片を含有し、それらのすべては、ＲｓａＩ消化に対
して完全に修飾されているらしかった。ついで＃８を大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６およびＥＲ２７４
４内に形質転換し、該形質転換体を標準的なＣａＣｌ２
法でコンピテントにした。
ａＩメチラーゼ遺伝子の発現 Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼとｒｓａＩＭに対す
る2個のオリゴヌクレオチドプライマーとを使用して、
全ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子（１２３０ｂｐ）をゲノム
ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ産物をＫｐｎＩお
よびＢａｍＨＩで消化し、ＫｐｎＩおよびＢａｎＨＩで
消化されたｐＩＨ９１９内にクローニングし、ついで大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５０２およびＥＲ２５６６
内に形質転換した。該形質転換体をプールし、増幅し
た。プラスミドＤＮＡを一晩培養物から調製し、ついで
ＲｓａＩで３７℃で１時間消化した。その消化されたプ
ールをＥＲ２５０２およびＥＲ２５６６内に再形質転換
した。個々のプラスミドＤＮＡを精製し、ＲｓａＩで消
化してＲｓａＩ消化に対する抵抗性を検出した。４個の
単離物＃１、＃２、＃４および＃６はｒｓａＩＭ ＰＣ
Ｒ断片を含有し、それらのすべては、ＲｓａＩ消化に対
して完全に修飾されているらしかった。ついで＃８を大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６およびＥＲ２７４
４内に形質転換し、該形質転換体を標準的なＣａＣｌ２
法でコンピテントにした。
【００３７】７．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＭｊ
ａＶメチラーゼ遺伝子の発現 ｍｊａＶＭメチラーゼ遺伝子を含有するメタノコッカス
・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎ
ｎａｓｃｈｉｉ）由来の０．９ｋｂのＰＣＲ断片をゲル
精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、ＢａｍＨ
ＩおよびＳａｌＩで切断されたｐＳＸ２０内に連結し、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換した。得られたｐ
ＳＸ２０−ｍｊａＶＭプラスミドＤＮＡを精製した。そ
れはＲｓａＩ消化に対して完全に修飾されていることが
示された。ついでｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭプラスミドを
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６内に形質転換
し、標準的なＣａＣｌ２法でコンピテントにした。ま
た、該ｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭプラスミドを、ｐＩＨ９
１９−ｒｓａＩＭプラスミドを含有するコンピテント大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７４４（第１１節）内に形
質転換した。
ａＶメチラーゼ遺伝子の発現 ｍｊａＶＭメチラーゼ遺伝子を含有するメタノコッカス
・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎ
ｎａｓｃｈｉｉ）由来の０．９ｋｂのＰＣＲ断片をゲル
精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、ＢａｍＨ
ＩおよびＳａｌＩで切断されたｐＳＸ２０内に連結し、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換した。得られたｐ
ＳＸ２０−ｍｊａＶＭプラスミドＤＮＡを精製した。そ
れはＲｓａＩ消化に対して完全に修飾されていることが
示された。ついでｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭプラスミドを
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６内に形質転換
し、標準的なＣａＣｌ２法でコンピテントにした。ま
た、該ｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭプラスミドを、ｐＩＨ９
１９−ｒｓａＩＭプラスミドを含有するコンピテント大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７４４（第１１節）内に形
質転換した。
【００３８】８．完全なＲｓａＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子のクローニング ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）染色体
ＤＮＡからのｒｓａＩＲ遺伝子（ＯＲＦ３）ののＰＣＲ
増幅用に、２つのプライマーを合成した。該ＰＣＲ産物
をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ついでＰｓｔＩ
およびＢａｍＨＩで消化されたｐＲＲＳ内に連結し、つ
いで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６［ｐＳＸ２
０−ｒｓａＩＭ］およびＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｍ
ｊａＶＭ］を形質転換した。該ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ
プラスミドは、元のメチラーゼクローンＡｐｏＩ＃１
（第２節）からのサブクローン化ＤＮＡ断片を含有して
いた。
ゼ遺伝子のクローニング ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）染色体
ＤＮＡからのｒｓａＩＲ遺伝子（ＯＲＦ３）ののＰＣＲ
増幅用に、２つのプライマーを合成した。該ＰＣＲ産物
をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ついでＰｓｔＩ
およびＢａｍＨＩで消化されたｐＲＲＳ内に連結し、つ
いで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６［ｐＳＸ２
０−ｒｓａＩＭ］およびＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｍ
ｊａＶＭ］を形質転換した。該ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ
プラスミドは、元のメチラーゼクローンＡｐｏＩ＃１
（第２節）からのサブクローン化ＤＮＡ断片を含有して
いた。
【００３９】両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株はＲｓａ
Ｉ消化に対して完全に保護されているようであったが、
ＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］細胞だけが、
ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を有するクローンを与
えた。２０個中２個のクローン、すなわち単離体＃１３
および＃１４は、コロニーＰＣＲによる検出では正しい
ｒｓａＩＲ断片を含有し、いくらかのエンドヌクレアー
ゼ活性を示した。ＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｍｊａＶ
Ｍ］は、同じ連結体からのＲｓａＩエンドヌクレアーゼ
クローンを与えなかった。また、＃１３および＃１４の
ミニプレップをＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｍｊａＶ
Ｍ］内に形質転換し、再びＲｓａＩエンドヌクレアーゼ
活性に関して再アッセイした。＃１４のいくつかの単離
体は種々の量のＲｓａＩ活性を示し、最高量のＲｓａＩ
活性は、３０℃に対して３７℃で培養した培養物から得
られた。減少した活性のクローン＃１４のＤＮＡ配列
は、より後の下流のＧＴＧコドンにおける開始につなが
るＮ末端でのＲｓａＩエンドヌクレアーゼを十中八九ト
ランケート化する開始コドン（ＡＴＧ）のＴの欠失突然
変異を示した。これらのトランケート化ＲｓａＩエンド
ヌクレアーゼクローンは、３０℃で培養した場合にはＲ
ｓａＩエンドヌクレアーゼ活性をほとんど又は全く示さ
ず、３７℃で培養した場合には部分的な活性を示した。
Ｉ消化に対して完全に保護されているようであったが、
ＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］細胞だけが、
ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を有するクローンを与
えた。２０個中２個のクローン、すなわち単離体＃１３
および＃１４は、コロニーＰＣＲによる検出では正しい
ｒｓａＩＲ断片を含有し、いくらかのエンドヌクレアー
ゼ活性を示した。ＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｍｊａＶ
Ｍ］は、同じ連結体からのＲｓａＩエンドヌクレアーゼ
クローンを与えなかった。また、＃１３および＃１４の
ミニプレップをＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｍｊａＶ
Ｍ］内に形質転換し、再びＲｓａＩエンドヌクレアーゼ
活性に関して再アッセイした。＃１４のいくつかの単離
体は種々の量のＲｓａＩ活性を示し、最高量のＲｓａＩ
活性は、３０℃に対して３７℃で培養した培養物から得
られた。減少した活性のクローン＃１４のＤＮＡ配列
は、より後の下流のＧＴＧコドンにおける開始につなが
るＮ末端でのＲｓａＩエンドヌクレアーゼを十中八九ト
ランケート化する開始コドン（ＡＴＧ）のＴの欠失突然
変異を示した。これらのトランケート化ＲｓａＩエンド
ヌクレアーゼクローンは、３０℃で培養した場合にはＲ
ｓａＩエンドヌクレアーゼ活性をほとんど又は全く示さ
ず、３７℃で培養した場合には部分的な活性を示した。
【００４０】ついで前記の未消化のＰＣＲのｒｓａＩＲ
（ＯＲＦ３）をｐＣＡＢ１６内にＢｓａＡＩ部位におい
て平滑末端連結し、ついでＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−
ｒｓａＩＭ］細胞内に形質転換した。１０個中１個の単
離物＃９は、コロニーＰＣＲによる検出では正しいｒｓ
ａＩＲ断片を含有していた。配列決定は、該１８ｋＤａ
タンパク質の推定Ｎ末端アミノ酸配列と一致するｒｓａ
ＩＲに関する正しいＤＮＡ配列を示した。クローン＃９
中のｒｓａＩＲ遺伝子は、ＰｌａｃおよびｍｓｐＩＲに
対して逆配向であり、それをアッセイしたところ、該ク
ローンは、部分ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を
示した。
（ＯＲＦ３）をｐＣＡＢ１６内にＢｓａＡＩ部位におい
て平滑末端連結し、ついでＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−
ｒｓａＩＭ］細胞内に形質転換した。１０個中１個の単
離物＃９は、コロニーＰＣＲによる検出では正しいｒｓ
ａＩＲ断片を含有していた。配列決定は、該１８ｋＤａ
タンパク質の推定Ｎ末端アミノ酸配列と一致するｒｓａ
ＩＲに関する正しいＤＮＡ配列を示した。クローン＃９
中のｒｓａＩＲ遺伝子は、ＰｌａｃおよびｍｓｐＩＲに
対して逆配向であり、それをアッセイしたところ、該ク
ローンは、部分ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を
示した。
【００４１】９．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６
［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］におけるＲｓａＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子の発現 ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９クローンは、ｒｓａＩＲ
に関する正しいＤＮＡ配列を含有していたため、このプ
ラスミドからのＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をｐ
ＲＲＳ内にサブクローニングする試みを行なった。該Ｐ
ＣＲプライマー内に設計された隣接するＰｓｔＩおよび
ＢａｍＨＩ部位を用いて、ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃
９をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたｒｓ
ａＩＲ遺伝子断片をゲル精製し、ＰｓｔＩおよびＢａｍ
ＨＩで消化されたｐＲＲＳ内に連結した。この連結反応
物をＥＲ２５６６［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］内に形
質転換し、１６個のコロニーからプラスミドＤＮＡを個
々に精製した。該ｒｓａＩＲインサートを同定するため
に、該プラスミドＤＮＡをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで
消化した。該クローンはいずれも、ｒｓａＩＲ ＤＮＡ
断片を含有していなかった。
［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］におけるＲｓａＩエンド
ヌクレアーゼ遺伝子の発現 ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９クローンは、ｒｓａＩＲ
に関する正しいＤＮＡ配列を含有していたため、このプ
ラスミドからのＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をｐ
ＲＲＳ内にサブクローニングする試みを行なった。該Ｐ
ＣＲプライマー内に設計された隣接するＰｓｔＩおよび
ＢａｍＨＩ部位を用いて、ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃
９をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたｒｓ
ａＩＲ遺伝子断片をゲル精製し、ＰｓｔＩおよびＢａｍ
ＨＩで消化されたｐＲＲＳ内に連結した。この連結反応
物をＥＲ２５６６［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］内に形
質転換し、１６個のコロニーからプラスミドＤＮＡを個
々に精製した。該ｒｓａＩＲインサートを同定するため
に、該プラスミドＤＮＡをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで
消化した。該クローンはいずれも、ｒｓａＩＲ ＤＮＡ
断片を含有していなかった。
【００４２】１０．ｐＬＴ７Ｋを使用する大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）遺伝子ＥＲ２５６６［ｐＩＨ９１９−ｒｓａ
ＩＭ］におけるＲｓａＩエンドヌクレアーゼの発現 Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して、
ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９内のＲｓａＩエンドヌク
レアーゼ遺伝子（ｒｓａＩＲ）をＰＣＲ増幅し、Ｘｂａ
ＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＬＴ７Ｋ内に連結した。
該連結反応物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α内に
形質転換した。１８個のコロニーからプラスミドＤＮＡ
を単離した。１２個が、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ二重消
化により攻撃されたとおりの正しいサイズのｒｓａＩＲ
断片を含有していた。クローン＃１、＃４、＃５および
＃１４を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有するＲｓａ
Ｉメチラーゼで予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＥＲ２５６６宿主内に形質転換した。形質転換体の数
は、ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲクローンの４個の形質転換
の間で様々であった（すなわち、＃１４では１個、＃５
では３個、＃４では１０００個、および＃１では２５０
個）。＃５および＃１４からのすべての形質転換体およ
び＃１および＃４のそれぞれの２個を接種し、再ストリ
ークし、３７℃で培養し、ついでＩＰＴＧで誘導した。
アッセイしたところ、＃１、＃４、＃５および＃１４
ｒｓａＩＲ−ｐＬＴ７Ｋクローンは、種々の量の検出可
能なＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示した。＃
５−３ ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲは、最大のＲｓａＩエ
ンドヌクレアーゼ活性を示した。＃５−３ ｐＬＴ７Ｋ
−ｒｓａＩＲプレートからの４個のコロニーを再び３７
℃で培養し、ついでＩＰＴＧで誘導し、ＲｓａＩエンド
ヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。ＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼ活性は全く検出されなかった。このこと
は、該クローンが非常に不安定であったことを示唆して
いる。
ｃｏｌｉ）遺伝子ＥＲ２５６６［ｐＩＨ９１９−ｒｓａ
ＩＭ］におけるＲｓａＩエンドヌクレアーゼの発現 Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して、
ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９内のＲｓａＩエンドヌク
レアーゼ遺伝子（ｒｓａＩＲ）をＰＣＲ増幅し、Ｘｂａ
ＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＬＴ７Ｋ内に連結した。
該連結反応物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α内に
形質転換した。１８個のコロニーからプラスミドＤＮＡ
を単離した。１２個が、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ二重消
化により攻撃されたとおりの正しいサイズのｒｓａＩＲ
断片を含有していた。クローン＃１、＃４、＃５および
＃１４を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有するＲｓａ
Ｉメチラーゼで予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＥＲ２５６６宿主内に形質転換した。形質転換体の数
は、ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲクローンの４個の形質転換
の間で様々であった（すなわち、＃１４では１個、＃５
では３個、＃４では１０００個、および＃１では２５０
個）。＃５および＃１４からのすべての形質転換体およ
び＃１および＃４のそれぞれの２個を接種し、再ストリ
ークし、３７℃で培養し、ついでＩＰＴＧで誘導した。
アッセイしたところ、＃１、＃４、＃５および＃１４
ｒｓａＩＲ−ｐＬＴ７Ｋクローンは、種々の量の検出可
能なＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示した。＃
５−３ ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲは、最大のＲｓａＩエ
ンドヌクレアーゼ活性を示した。＃５−３ ｐＬＴ７Ｋ
−ｒｓａＩＲプレートからの４個のコロニーを再び３７
℃で培養し、ついでＩＰＴＧで誘導し、ＲｓａＩエンド
ヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。ＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼ活性は全く検出されなかった。このこと
は、該クローンが非常に不安定であったことを示唆して
いる。
【００４３】１１．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２７
４４［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］および［ｐＳＸ２０
−ｍｊａＶＭ］におけるＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺
伝子の過剰発現 ＲｓａＩエンドヌクレアーゼを過剰発現するクローンを
単離し維持することに本発明者らが失敗したのは、Ｍ．
ＲｓａＩ ＭＴａｓｅによる不適切な保護の結果である
と判断された。アイソシゾマーメチラーゼＭ．ＭｊａＶ
ＭＴａｓｅを含有する第３のプラスミドの添加によ
り、この問題を解決した。
４４［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］および［ｐＳＸ２０
−ｍｊａＶＭ］におけるＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺
伝子の過剰発現 ＲｓａＩエンドヌクレアーゼを過剰発現するクローンを
単離し維持することに本発明者らが失敗したのは、Ｍ．
ＲｓａＩ ＭＴａｓｅによる不適切な保護の結果である
と判断された。アイソシゾマーメチラーゼＭ．ＭｊａＶ
ＭＴａｓｅを含有する第３のプラスミドの添加によ
り、この問題を解決した。
【００４４】まず、ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子（ｒｓａ
ＩＭ）をＰＣＲ増幅し、ＰｌａｃプロモーターとｐＵＣ
１８からのポリリンカーとを含有するｐＡＣＹＣ１８４
の誘導体であるｐＩＨ９１９上にクローニングした。Ｍ
ｊａＶメチラーゼ遺伝子（ｍｊａＶＭ）を、ｐＢＲ３２
２およびｐＡＣＹＣに基づくプラスミドの両方に和合性
のｐＳＣ１０１の誘導体であるｐＳＸ２０内にクローニ
ングした。それは、ｐＢＲ３２２テトラサイクリン耐性
遺伝子、ｐＳＣ１０１複製起点およびカナマイシン耐性
遺伝子を有する。ついでｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭメチラ
ーゼプラスミドを、ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭプラスミ
ドを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ
２７４４内に形質転換した。前記の両メチラーゼを含有
する得られた株をコンピテントにした。注：Ｍ．Ｒｓａ
ＩおよびＭ．ＭｊａＶを含有するこの二重予備修飾大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内への宿主形質転換により活性Ｒｓ
ａＩ制限遺伝子（ｒｓａＩＲ）（ＯＲＦ３）をｐＲＲＳ
内に直接的にクローニングする試みは、失敗した。この
形質転換からの１２個のコロニーを単離した。いずれの
クローンも、正しいサイズのｒｓａＩＲインサートを含
有していないらしかった。ｐＬＴ７Ｋを使用して、Ｒｓ
ａＩメチラーゼのみを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
株内にｒｓａＩＲをクローニングする試みは、安定なＲ
ｓａＩエンドヌクレアーゼクローンを確立しなかった。
ＩＭ）をＰＣＲ増幅し、ＰｌａｃプロモーターとｐＵＣ
１８からのポリリンカーとを含有するｐＡＣＹＣ１８４
の誘導体であるｐＩＨ９１９上にクローニングした。Ｍ
ｊａＶメチラーゼ遺伝子（ｍｊａＶＭ）を、ｐＢＲ３２
２およびｐＡＣＹＣに基づくプラスミドの両方に和合性
のｐＳＣ１０１の誘導体であるｐＳＸ２０内にクローニ
ングした。それは、ｐＢＲ３２２テトラサイクリン耐性
遺伝子、ｐＳＣ１０１複製起点およびカナマイシン耐性
遺伝子を有する。ついでｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭメチラ
ーゼプラスミドを、ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭプラスミ
ドを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ
２７４４内に形質転換した。前記の両メチラーゼを含有
する得られた株をコンピテントにした。注：Ｍ．Ｒｓａ
ＩおよびＭ．ＭｊａＶを含有するこの二重予備修飾大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内への宿主形質転換により活性Ｒｓ
ａＩ制限遺伝子（ｒｓａＩＲ）（ＯＲＦ３）をｐＲＲＳ
内に直接的にクローニングする試みは、失敗した。この
形質転換からの１２個のコロニーを単離した。いずれの
クローンも、正しいサイズのｒｓａＩＲインサートを含
有していないらしかった。ｐＬＴ７Ｋを使用して、Ｒｓ
ａＩメチラーゼのみを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
株内にｒｓａＩＲをクローニングする試みは、安定なＲ
ｓａＩエンドヌクレアーゼクローンを確立しなかった。
【００４５】過剰発現するＲｓａＩエンドヌクレアーゼ
クローンを最終的に確立するために、ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓ
ａＩＲ＃５（前記）からの元のミニプレップＤＮＡを、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含有し２つのメチラーゼ
（Ｍ．ＲｓａＩおよびＭ．ＭｊａＶ）で予め修飾された
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＥＲ２７４４内に形質転換
した。５個のコロニーを、０．８〜１．０のＯＤ５９０
まで３７℃で培養し、ついで該培養温度を３０℃まで低
下させ、ついでＩＰＴＧ誘導を行なった。ＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼ活性に関してアッセイしたところ、全５
個のクローン＃５１、＃５２、＃５３、＃５４および＃
５５が種々の量のＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を示
し、最高の活性は１０６ｕ／ｇを超える＃５１からのも
のであった（図８）。ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ＃５１ク
ローンのグリセロールストックを−７０℃で保存した。
ついで＃５１グリセロールストックを融解し、ＬＢアン
ピシリン、クロラムフェニコールおよびカナマイシンプ
レート上で３７℃で再ストリークし、再度、個々のクロ
ーンを３０℃で培養し誘導し、ＲｓａＩエンドヌクレア
ーゼ活性に関してアッセイした。１個のそのようなクロ
ーンｐＫＬ１６７−５１を含む全４個のクローンが、湿
潤大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞１グラム当たりで産生さ
れたＲｓａＩの５×１０６単位以上でＲ．ＲｓａＩを発
現した。ｐＫＬ１６７−５１からの組換えＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼは、ほぼ均一になるまでクロマトグラフ
ィーにより精製される。
クローンを最終的に確立するために、ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓ
ａＩＲ＃５（前記）からの元のミニプレップＤＮＡを、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含有し２つのメチラーゼ
（Ｍ．ＲｓａＩおよびＭ．ＭｊａＶ）で予め修飾された
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＥＲ２７４４内に形質転換
した。５個のコロニーを、０．８〜１．０のＯＤ５９０
まで３７℃で培養し、ついで該培養温度を３０℃まで低
下させ、ついでＩＰＴＧ誘導を行なった。ＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼ活性に関してアッセイしたところ、全５
個のクローン＃５１、＃５２、＃５３、＃５４および＃
５５が種々の量のＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を示
し、最高の活性は１０６ｕ／ｇを超える＃５１からのも
のであった（図８）。ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ＃５１ク
ローンのグリセロールストックを−７０℃で保存した。
ついで＃５１グリセロールストックを融解し、ＬＢアン
ピシリン、クロラムフェニコールおよびカナマイシンプ
レート上で３７℃で再ストリークし、再度、個々のクロ
ーンを３０℃で培養し誘導し、ＲｓａＩエンドヌクレア
ーゼ活性に関してアッセイした。１個のそのようなクロ
ーンｐＫＬ１６７−５１を含む全４個のクローンが、湿
潤大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞１グラム当たりで産生さ
れたＲｓａＩの５×１０６単位以上でＲ．ＲｓａＩを発
現した。ｐＫＬ１６７−５１からの組換えＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼは、ほぼ均一になるまでクロマトグラフ
ィーにより精製される。
【００４６】１２．ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼの
精製 該組換えＲｓａＩエンドヌクレアーゼを、アフィニティ
ークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
などの標準的なタンパク質精製技術により精製した。
精製 該組換えＲｓａＩエンドヌクレアーゼを、アフィニティ
ークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
などの標準的なタンパク質精製技術により精製した。
【００４７】
【実施例】つぎに実施例により本発明を更に詳しく説明
する。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために
記載するものであり、本発明を限定するものではない。
する。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために
記載するものであり、本発明を限定するものではない。
【００４８】前記および後記で引用されている参照文献
は、参照により本明細書に組入れるものとする。
は、参照により本明細書に組入れるものとする。
【００４９】実施例1 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＲｓａＩ制限−修飾系
のクローニング １．ＡｐｏＩ部分ゲノムＤＮＡライブラリーの構築 ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ＮＥ
Ｂカルチャーコレクション＃２３３（Ｌｙｎｎら，Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４２：３８０−３８３（１９８
０））からゲノムＤＮＡを調製した。７．５μｇのこの
ゲノムＤＮＡを３、１．５、０．７５、０．３７５、
０．１８、０．０９、０．０４５および０．０２５単位
／μｇのＡｐｏＩで５０℃で１時間消化して、ある範囲
の完全および部分的な消化産物を得た。該チューブを６
８℃で１０分間インキュベートして該酵素を熱失活さ
せ、ついで該消化物をプールした。ＡｐｏＩで消化され
プールされたゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断されＣ
ＩＰで処理されたベクターｐＢＲ３２２内に１７℃で一
晩連結し、ついで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２４１８
内に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）上
にプレーティングした。形質転換から約１０００個のコ
ロニーを得た。コロニー数を増加させるために、ＥＲ２
４１８細胞および連結ＤＮＡを使用して３×形質転換を
再び行なった。約５，０００個の形質転換体を得た。す
べての形質転換体をプールし、５００ｍｌのＬＢ＋Ａｍ
ｐ内に接種し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｃｓ
Ｃｌ遠心分離により該一晩培養細胞からプラスミドＤＮ
Ａを調製した。
のクローニング １．ＡｐｏＩ部分ゲノムＤＮＡライブラリーの構築 ロドシュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ＮＥ
Ｂカルチャーコレクション＃２３３（Ｌｙｎｎら，Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４２：３８０−３８３（１９８
０））からゲノムＤＮＡを調製した。７．５μｇのこの
ゲノムＤＮＡを３、１．５、０．７５、０．３７５、
０．１８、０．０９、０．０４５および０．０２５単位
／μｇのＡｐｏＩで５０℃で１時間消化して、ある範囲
の完全および部分的な消化産物を得た。該チューブを６
８℃で１０分間インキュベートして該酵素を熱失活さ
せ、ついで該消化物をプールした。ＡｐｏＩで消化され
プールされたゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断されＣ
ＩＰで処理されたベクターｐＢＲ３２２内に１７℃で一
晩連結し、ついで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２４１８
内に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）上
にプレーティングした。形質転換から約１０００個のコ
ロニーを得た。コロニー数を増加させるために、ＥＲ２
４１８細胞および連結ＤＮＡを使用して３×形質転換を
再び行なった。約５，０００個の形質転換体を得た。す
べての形質転換体をプールし、５００ｍｌのＬＢ＋Ａｍ
ｐ内に接種し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｃｓ
Ｃｌ遠心分離により該一晩培養細胞からプラスミドＤＮ
Ａを調製した。
【００５０】２．ＲｓａＩ消化によるＡｐｏＩ部分ライ
ブラリーＤＮＡへの攻撃および該ＲｓａＩメチラーゼ遺
伝子のクローニング １μｇの該ＡｐｏＩ部分的ライブラリーＤＮＡを、３０
単位のＲｓａＩで３７℃で２時間消化した。該消化ＤＮ
ＡをＥＲ２４１８内に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐプレー
ト上でプレーティングした。２つの形質転換体を得、プ
ラスミドＤＮＡを各形質転換体から単離し、１０単位／
μｇのＲｓａＩで３７℃で２時間消化して、消化に対す
る抵抗性を検出した。プラスミド＃１および＃２の両方
は、ＲｓａＩ消化に対する完全な抵抗性を有するらしか
った。両方が、約５．３ｋｂおよび６．３ｋｂのＤＮＡ
の２つのＡｐｏＩ断片を含有していた。
ブラリーＤＮＡへの攻撃および該ＲｓａＩメチラーゼ遺
伝子のクローニング １μｇの該ＡｐｏＩ部分的ライブラリーＤＮＡを、３０
単位のＲｓａＩで３７℃で２時間消化した。該消化ＤＮ
ＡをＥＲ２４１８内に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐプレー
ト上でプレーティングした。２つの形質転換体を得、プ
ラスミドＤＮＡを各形質転換体から単離し、１０単位／
μｇのＲｓａＩで３７℃で２時間消化して、消化に対す
る抵抗性を検出した。プラスミド＃１および＃２の両方
は、ＲｓａＩ消化に対する完全な抵抗性を有するらしか
った。両方が、約５．３ｋｂおよび６．３ｋｂのＤＮＡ
の２つのＡｐｏＩ断片を含有していた。
【００５１】３．ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子を保持する
インサートの配列決定 ｐＢＲ３２２ ＡｐｏＩ＃１メチラーゼクローンの欠失
マッピングおよびサブクローニングは、ｒｓａＩＭが
５．３ｋｂのＡｐｏＩ断片上に位置することを示した。
＃１プラスミドＤＮＡの欠失インサートを、Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ色素デオキシターミネー
ターシークエンシングキットとＡＢＩ３７３Ａ自動ＤＮ
Ａシークエンサーとを使用するジデオキシターミネーシ
ョン法を用いるプライマーウォーキング法により配列決
定した。ＤＮＡ配列決定は該ｒｓａＩＭ遺伝子（ＯＲＦ
１）の位置を証明し、部分的収束オープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ２）を同定した。１２３０ｂｐのＯＲ
Ｆ１は該ＲｓａＩメチラーゼ（４０９ａａ．分子量＝４
５．４ｋＤａ）をコードしていた（図２）。該部分ＯＲ
Ｆ２は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の公知タンパク
質とは一致しなかった。
インサートの配列決定 ｐＢＲ３２２ ＡｐｏＩ＃１メチラーゼクローンの欠失
マッピングおよびサブクローニングは、ｒｓａＩＭが
５．３ｋｂのＡｐｏＩ断片上に位置することを示した。
＃１プラスミドＤＮＡの欠失インサートを、Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ色素デオキシターミネー
ターシークエンシングキットとＡＢＩ３７３Ａ自動ＤＮ
Ａシークエンサーとを使用するジデオキシターミネーシ
ョン法を用いるプライマーウォーキング法により配列決
定した。ＤＮＡ配列決定は該ｒｓａＩＭ遺伝子（ＯＲＦ
１）の位置を証明し、部分的収束オープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ２）を同定した。１２３０ｂｐのＯＲ
Ｆ１は該ＲｓａＩメチラーゼ（４０９ａａ．分子量＝４
５．４ｋＤａ）をコードしていた（図２）。該部分ＯＲ
Ｆ２は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の公知タンパク
質とは一致しなかった。
【００５２】４．精製されたＲｓａＩ制限エンドヌクレ
アーゼのＮ末端アミノ酸配列決定 該非組換えＲｓａＩエンドヌクレアーゼを、ほぼ均一に
まで精製し、その精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥに付した。２つのタンパク質バンド（約１８ｋＤａ
および２２ｋＤａ）が検出された。該１８ｋＤａタンパ
ク質のＮ末端アミノ酸配列は、（Ｍ）ＥＲＲＦＱＬＲＷ
ＤＥＥＥＬＡＲＡＦＫＶＴＴＫ（配列番号７）と決定さ
れた。該２２ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ酸配列
は、（Ｍ）ＡＲＥＩＰＤＬＱＡＶＶＲＴＧＴＧＫＧＡＡ
ＲＱＡＲＸ（配列番号８）と決定された。該１８ｋＤａ
タンパク質の配列は、第５節に記載のとおり、ＯＲＦ３
の推定Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致する。該２２ｋ
Ｄａ配列は、該クローン化ＯＲＦのいずれとも一致しな
かった。ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼは、十中八
九、該１８ｋＤａタンパク質であると後に結論された。
アーゼのＮ末端アミノ酸配列決定 該非組換えＲｓａＩエンドヌクレアーゼを、ほぼ均一に
まで精製し、その精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥに付した。２つのタンパク質バンド（約１８ｋＤａ
および２２ｋＤａ）が検出された。該１８ｋＤａタンパ
ク質のＮ末端アミノ酸配列は、（Ｍ）ＥＲＲＦＱＬＲＷ
ＤＥＥＥＬＡＲＡＦＫＶＴＴＫ（配列番号７）と決定さ
れた。該２２ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ酸配列
は、（Ｍ）ＡＲＥＩＰＤＬＱＡＶＶＲＴＧＴＧＫＧＡＡ
ＲＱＡＲＸ（配列番号８）と決定された。該１８ｋＤａ
タンパク質の配列は、第５節に記載のとおり、ＯＲＦ３
の推定Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致する。該２２ｋ
Ｄａ配列は、該クローン化ＯＲＦのいずれとも一致しな
かった。ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼは、十中八
九、該１８ｋＤａタンパク質であると後に結論された。
【００５３】５．ＯＲＦ２およびＯＲＦ３をクローニン
グするための逆ＰＣＲ ＯＲＦ２の欠落部分をクローニングするために、ロドシ
ュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノムＤＮ
Ａを逆ＰＣＲにより増幅した。１０μｇのゲノムＤＮＡ
をＨｐａＩＩで切断し、更に１０μｇをＮｃｉＩで切断
した。両方の消化を３７℃で１時間行い、６５℃で１０
分間熱失活させ、ついで氷上に配置した。それらの２つ
の切断されたＤＮＡサンプルのそれぞれを低濃度（２μ
ｇ／ｍｌ）で１７℃で一晩自己連結させ、以下の２つの
プライマーを使用する逆ＰＣＲ用の鋳型として使用し
た。
グするための逆ＰＣＲ ＯＲＦ２の欠落部分をクローニングするために、ロドシ
ュードモナス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノムＤＮ
Ａを逆ＰＣＲにより増幅した。１０μｇのゲノムＤＮＡ
をＨｐａＩＩで切断し、更に１０μｇをＮｃｉＩで切断
した。両方の消化を３７℃で１時間行い、６５℃で１０
分間熱失活させ、ついで氷上に配置した。それらの２つ
の切断されたＤＮＡサンプルのそれぞれを低濃度（２μ
ｇ／ｍｌ）で１７℃で一晩自己連結させ、以下の２つの
プライマーを使用する逆ＰＣＲ用の鋳型として使用し
た。
【００５４】５’ＡＧＧＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＧ
ＡＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣ ３’（Ｃ．
ｒｓａＩＭ）（配列番号９）。 ５’ＡＧＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＣＴＴＴ
ＧＧＡＧＣＣＧＴＴＡＴＣＣ ３’（ｃ．ｒｓａＩＭ）
（配列番号1０）。
ＡＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣ ３’（Ｃ．
ｒｓａＩＭ）（配列番号９）。 ５’ＡＧＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＣＴＴＴ
ＧＧＡＧＣＣＧＴＴＡＴＣＣ ３’（ｃ．ｒｓａＩＭ）
（配列番号1０）。
【００５５】９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃
で３分間の２５サイクルＰＣＲ条件を用いた。Ｖｅｎｔ
（登録商標）（Ｅｘｏ−）ポリメラーゼを使用して、両
方の場合に約８５０ｂｐの逆ＰＣＲ産物を得た。１μｇ
の８５０ｂｐのＰＣＲ断片を両方の反応からゲル精製
し、ＡｐｏＩで消化して、元のメチラーゼクローン＃１
のＯＲＦ２内のＡｐｏＩ部位を確認した。ｒｓａＩＭの
下流のＯＲＦ２内のＡｐｏＩ部位は、Ｃ．ｒｓａＩＭ
ＰＣＲプライマーにより産生される約３５０ｂｐの断片
を切り離した。このＡｐｏＩ部位から外側に、約５００
ｂｐの新規ＤＮＡが、外側逆ＰＣＲプライマーｃ．ｒｓ
ａＩＭにより産生された。ついで各反応からの更に１μ
ｇのゲル精製された８５０ｂｐのＰＣＲ断片をＡｐｏＩ
およびＰｓｔＩ（ｃ．ｒｓａＩＭ ＰｓｔＩ部位）で消
化し、ＡｐｏＩおよびＰｓｔＩで切断されたｐＵＣ１９
に連結し、ついで、ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭを含有する
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６内に形質転換し、
ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｋａｎ（１００／５０μｇ／ｍｌ）上で
プレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
１６個のコロニー（すなわち、該ＨｐａＩＩ反応からの
８個および該ＮｃｉＩ反応からの８個）からプラスミド
ＤＮＡを単離した。１μｇの各プラスミドをＡｐｏＩお
よびＰｓｔＩで消化し、ゲル電気泳動により分析した。
ＮｃｉＩ＃７、ＨｐａＩＩ＃２、３、４および＃７は、
逆ＰＣＲ断片を含有していた。ＮｃｉＩ＃７およびＨｐ
ａＩＩ＃７のＤＮＡ配列決定は、４９３ｂｐの新規ＤＮ
Ａ配列を示し、ＨｐａＩＩ（ＣＣＧＧ）部位とＮｃｉＩ
（ＣＣＧＧＧ）部位とが一致することを示した。この新
規配列はＯＲＦ２を完全なものにし、ｒｓａＩＭと同じ
方向に伸長するＯＲＦ３からの１０２ｂｐの新規ＤＮＡ
オープンリーディングフレームおよびＡＴＧ開始コドン
を含有していた。この新規ＯＲＦにコードされるタンパ
ク質の最初の２０アミノ酸は、該１８ｋＤａ候補Ｒ．Ｒ
ｓａＩタンパク質の認められたＮ末端タンパク質配列
（第４節）と同一であった。このことは、これがｒｓａ
ＩＲ遺伝子の真の開始部であることを示している。
で３分間の２５サイクルＰＣＲ条件を用いた。Ｖｅｎｔ
（登録商標）（Ｅｘｏ−）ポリメラーゼを使用して、両
方の場合に約８５０ｂｐの逆ＰＣＲ産物を得た。１μｇ
の８５０ｂｐのＰＣＲ断片を両方の反応からゲル精製
し、ＡｐｏＩで消化して、元のメチラーゼクローン＃１
のＯＲＦ２内のＡｐｏＩ部位を確認した。ｒｓａＩＭの
下流のＯＲＦ２内のＡｐｏＩ部位は、Ｃ．ｒｓａＩＭ
ＰＣＲプライマーにより産生される約３５０ｂｐの断片
を切り離した。このＡｐｏＩ部位から外側に、約５００
ｂｐの新規ＤＮＡが、外側逆ＰＣＲプライマーｃ．ｒｓ
ａＩＭにより産生された。ついで各反応からの更に１μ
ｇのゲル精製された８５０ｂｐのＰＣＲ断片をＡｐｏＩ
およびＰｓｔＩ（ｃ．ｒｓａＩＭ ＰｓｔＩ部位）で消
化し、ＡｐｏＩおよびＰｓｔＩで切断されたｐＵＣ１９
に連結し、ついで、ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭを含有する
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６内に形質転換し、
ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｋａｎ（１００／５０μｇ／ｍｌ）上で
プレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
１６個のコロニー（すなわち、該ＨｐａＩＩ反応からの
８個および該ＮｃｉＩ反応からの８個）からプラスミド
ＤＮＡを単離した。１μｇの各プラスミドをＡｐｏＩお
よびＰｓｔＩで消化し、ゲル電気泳動により分析した。
ＮｃｉＩ＃７、ＨｐａＩＩ＃２、３、４および＃７は、
逆ＰＣＲ断片を含有していた。ＮｃｉＩ＃７およびＨｐ
ａＩＩ＃７のＤＮＡ配列決定は、４９３ｂｐの新規ＤＮ
Ａ配列を示し、ＨｐａＩＩ（ＣＣＧＧ）部位とＮｃｉＩ
（ＣＣＧＧＧ）部位とが一致することを示した。この新
規配列はＯＲＦ２を完全なものにし、ｒｓａＩＭと同じ
方向に伸長するＯＲＦ３からの１０２ｂｐの新規ＤＮＡ
オープンリーディングフレームおよびＡＴＧ開始コドン
を含有していた。この新規ＯＲＦにコードされるタンパ
ク質の最初の２０アミノ酸は、該１８ｋＤａ候補Ｒ．Ｒ
ｓａＩタンパク質の認められたＮ末端タンパク質配列
（第４節）と同一であった。このことは、これがｒｓａ
ＩＲ遺伝子の真の開始部であることを示している。
【００５６】ＯＲＦ３のＣ末端を同定するために、無傷
ｒｓａＩＲの潜在的な毒性発現を最小限に抑えるために
該遺伝子のＡＴＧ開始部位を排したｒｓａＩＲの３’末
端をＰＣＲするためにもう１つの逆ＰＣＲプライマー
（Ｒ．Ｒｓａ．ｃ）を設計した。
ｒｓａＩＲの潜在的な毒性発現を最小限に抑えるために
該遺伝子のＡＴＧ開始部位を排したｒｓａＩＲの３’末
端をＰＣＲするためにもう１つの逆ＰＣＲプライマー
（Ｒ．Ｒｓａ．ｃ）を設計した。
【００５７】１０μｇのゲノムＤＮＡをＭｆｅＩで３７
℃で１時間切断し、６５℃で１０分間熱失活させ、つい
で氷上に配置した。そのＭｆｅＩで切断されたＤＮＡを
低濃度（２μｇ／ｍｌ）で１７℃で一晩自己連結させ、
ついで、ｒｓａＩＭ（ＯＲＦ１）内のＭｆｅＩ部位に伸
びるｃ．ｒｓａＩＭプライマーと共に新たに設計された
プライマー（Ｒ．Ｒｓａ．ｃ）を使用する逆ＰＣＲ反応
における鋳型として使用した。
℃で１時間切断し、６５℃で１０分間熱失活させ、つい
で氷上に配置した。そのＭｆｅＩで切断されたＤＮＡを
低濃度（２μｇ／ｍｌ）で１７℃で一晩自己連結させ、
ついで、ｒｓａＩＭ（ＯＲＦ１）内のＭｆｅＩ部位に伸
びるｃ．ｒｓａＩＭプライマーと共に新たに設計された
プライマー（Ｒ．Ｒｓａ．ｃ）を使用する逆ＰＣＲ反応
における鋳型として使用した。
【００５８】５’ＡＧＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴ
ＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＣＧＴＴＡＴＣＣ ３’（ｃ．
ｒｓａＩＭ）（配列番号１１）。 ５’ＴＧＣＧＣＧＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＡＣＧＡ
Ｃ ３’（Ｒ．Ｒｓａ．ｃ）（配列番号１２）。
ＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＣＧＴＴＡＴＣＣ ３’（ｃ．
ｒｓａＩＭ）（配列番号１１）。 ５’ＴＧＣＧＣＧＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＡＣＧＡ
Ｃ ３’（Ｒ．Ｒｓａ．ｃ）（配列番号１２）。
【００５９】前記と同じ逆ＰＣＲ条件を用いた。１μｇ
のゲル精製ＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し、ＳｍａＩお
よびＰｓｔＩで切断されたｐＵＣ１９内に連結し、つい
で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２６８５および大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩ
Ｍ］内に別々に形質転換し、それぞれＬＢ＋Ａｍｐまた
はＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｋａｎプレート上でプレーティングし
た。プラスミドＤＮＡをＥＲ２６８３およびＥＲ２５６
６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］形質転換体から単離し
た。そのような２つのクローンＥＲ２６８３＃２−２お
よびＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］＃５−４
をＣｓＣｌ精製し、ついで配列決定した。＃２−２およ
び＃５−４からの新たに誘導された配列は、該全ＤＮＡ
配列を２７１４ｂｐにまで拡大し、ＯＲＦ３を完全なも
のにした。このＤＮＡ中に３個の大きなＯＲＦ、すなわ
ち、ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子ｒｓａＩＭ（ＯＲＦ
１）、未知収束遺伝子ｒｓａＩＵ（ＯＲＦ２）、および
ｒｓａＩＲとして最終的に同定された遺伝子（ＯＲＦ
３）が存在していた（図１）。ｒｓａＩＲ遺伝子（ＯＲ
Ｆ３）は４８３ｂｐ長である。それは、ＰＡＧＥにより
認められた１８ｋＤａの実測サイズと一致する１８．７
ｋＤａの推定分子量の１６０アミノ酸残基のタンパク質
をコードしている（図３）。
のゲル精製ＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し、ＳｍａＩお
よびＰｓｔＩで切断されたｐＵＣ１９内に連結し、つい
で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２６８５および大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩ
Ｍ］内に別々に形質転換し、それぞれＬＢ＋Ａｍｐまた
はＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｋａｎプレート上でプレーティングし
た。プラスミドＤＮＡをＥＲ２６８３およびＥＲ２５６
６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］形質転換体から単離し
た。そのような２つのクローンＥＲ２６８３＃２−２お
よびＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］＃５−４
をＣｓＣｌ精製し、ついで配列決定した。＃２−２およ
び＃５−４からの新たに誘導された配列は、該全ＤＮＡ
配列を２７１４ｂｐにまで拡大し、ＯＲＦ３を完全なも
のにした。このＤＮＡ中に３個の大きなＯＲＦ、すなわ
ち、ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子ｒｓａＩＭ（ＯＲＦ
１）、未知収束遺伝子ｒｓａＩＵ（ＯＲＦ２）、および
ｒｓａＩＲとして最終的に同定された遺伝子（ＯＲＦ
３）が存在していた（図１）。ｒｓａＩＲ遺伝子（ＯＲ
Ｆ３）は４８３ｂｐ長である。それは、ＰＡＧＥにより
認められた１８ｋＤａの実測サイズと一致する１８．７
ｋＤａの推定分子量の１６０アミノ酸残基のタンパク質
をコードしている（図３）。
【００６０】６．ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子のクローニ
ング 完全な全ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｒｓａＩ
Ｒ）をクローニングするために、ＲｓａＩエンドヌクレ
アーゼによる消化に対して修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）株を、ｒｓａＩＭを和合性ｐＡＣＹＣ１８４誘導
体（ｐＩＨ９１９）内にクローニングすることにより作
製した。９５℃で１分間、５４℃で１分間、７２℃で１
分間、３０サイクルのＰＣＲ条件および以下の２つのプ
ライマー（５ｍＲｓａＩ）および（３ｍＲｓａＩ）と共
にＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼを用いて、ゲノム
ＤＮＡから全メチラーゼ遺伝子（１２３０ｂｐ）を増幅
した。
ング 完全な全ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｒｓａＩ
Ｒ）をクローニングするために、ＲｓａＩエンドヌクレ
アーゼによる消化に対して修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）株を、ｒｓａＩＭを和合性ｐＡＣＹＣ１８４誘導
体（ｐＩＨ９１９）内にクローニングすることにより作
製した。９５℃で１分間、５４℃で１分間、７２℃で１
分間、３０サイクルのＰＣＲ条件および以下の２つのプ
ライマー（５ｍＲｓａＩ）および（３ｍＲｓａＩ）と共
にＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼを用いて、ゲノム
ＤＮＡから全メチラーゼ遺伝子（１２３０ｂｐ）を増幅
した。
【００６１】５’ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＣＡＡ
ＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣ
ＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＣＧＡＧＴＣ ３’（５ｍＲ
ｓａＩ）（配列番号1３）。 ５’ＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＡＧＴ
ＧＣＣＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＴＣＣＧ３’
（３ｍＲｓａＩ）（配列番号1４）。
ＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣ
ＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＣＧＡＧＴＣ ３’（５ｍＲ
ｓａＩ）（配列番号1３）。 ５’ＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＡＧＴ
ＧＣＣＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＴＣＣＧ３’
（３ｍＲｓａＩ）（配列番号1４）。
【００６２】該ＰＣＲ断片をＫｐｎＩで３７℃で１時間
消化し、フェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、イソプロパ
ノールで沈殿させた。ついで該ｒｓａＩＭ ＰＣＲ断片
を再懸濁させ、ＢａｍＨＩで３７℃で２時間消化し、フ
ェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、再び沈殿させ、つい
で、ＫｐｎおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＩＨ９１９
内に１７℃で一晩連結させた。該連結体を大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＥＲ２５０２およびＥＲ２５６６内中に形質
転換し、ＬＢ＋クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍ
ｌ）上、３７℃で一晩プレーティングした。該形質転換
体をプールし、増幅した。プラスミドＤＮＡを１０ｍｌ
の一晩培養物から調製し、ついで各プールをＲｓａＩで
３７℃で１時間消化した。該消化プールをＥＲ２５０２
およびＥＲ２５６６内に形質転換し、各形質転換からの
８個のコロニーからの個々のプラスミドＤＮＡを単離し
た。すべては、正しいサイズのプラスミドであるらしか
った。各形質転換からの４個の単離物＃１、＃２、＃４
および＃６を更に分析したところ、ｒｓａＩＭ ＰＣＲ
断片を含有することが判明し、すべては、ＲｓａＩ消化
に対して完全に修飾されているらしかった。ついで＃１
を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６およびＥＲ２
７４４内に形質転換し、標準的なＣａＣｌ２法によりコ
ンピテントにした。
消化し、フェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、イソプロパ
ノールで沈殿させた。ついで該ｒｓａＩＭ ＰＣＲ断片
を再懸濁させ、ＢａｍＨＩで３７℃で２時間消化し、フ
ェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、再び沈殿させ、つい
で、ＫｐｎおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＩＨ９１９
内に１７℃で一晩連結させた。該連結体を大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＥＲ２５０２およびＥＲ２５６６内中に形質
転換し、ＬＢ＋クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍ
ｌ）上、３７℃で一晩プレーティングした。該形質転換
体をプールし、増幅した。プラスミドＤＮＡを１０ｍｌ
の一晩培養物から調製し、ついで各プールをＲｓａＩで
３７℃で１時間消化した。該消化プールをＥＲ２５０２
およびＥＲ２５６６内に形質転換し、各形質転換からの
８個のコロニーからの個々のプラスミドＤＮＡを単離し
た。すべては、正しいサイズのプラスミドであるらしか
った。各形質転換からの４個の単離物＃１、＃２、＃４
および＃６を更に分析したところ、ｒｓａＩＭ ＰＣＲ
断片を含有することが判明し、すべては、ＲｓａＩ消化
に対して完全に修飾されているらしかった。ついで＃１
を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６およびＥＲ２
７４４内に形質転換し、標準的なＣａＣｌ２法によりコ
ンピテントにした。
【００６３】７．ＭｊａＶメチラーゼ遺伝子のクローニ
ング ｍｊａＶＭのＰＣＲ増幅用の２つのプライマーを合成し
た。９５℃で１分間、５４℃で１分間、７２℃で１分
間、２５サイクルのＰＣＲ条件および以下の２つのプラ
イマー（ｍｊ１４９８フォワード）および（ｍｊ１４９
８リバース）と共にＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ
を用いて、全ＭｊａＶメチラーゼ遺伝子（８７９ｂｐ）
をゲノムＤＮＡから増幅した。
ング ｍｊａＶＭのＰＣＲ増幅用の２つのプライマーを合成し
た。９５℃で１分間、５４℃で１分間、７２℃で１分
間、２５サイクルのＰＣＲ条件および以下の２つのプラ
イマー（ｍｊ１４９８フォワード）および（ｍｊ１４９
８リバース）と共にＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ
を用いて、全ＭｊａＶメチラーゼ遺伝子（８７９ｂｐ）
をゲノムＤＮＡから増幅した。
【００６４】５’ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＡＡＴＴＡＡ
ＧＧＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴ
ＡＡＡＡＴＣＴＡＣ ３’（ｍｊ１４９８フォワード）
（配列番号1５）。 ５’ＧＴＴＧＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡ
ＴＡＡＡＴＧＣＡＴＣ３’（ｍｊ１４９８リバース）
（配列番号1６）。
ＧＧＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴ
ＡＡＡＡＴＣＴＡＣ ３’（ｍｊ１４９８フォワード）
（配列番号1５）。 ５’ＧＴＴＧＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡ
ＴＡＡＡＴＧＣＡＴＣ３’（ｍｊ１４９８リバース）
（配列番号1６）。
【００６５】ｍｊａＶＭメチラーゼ遺伝子を含有するメ
タノコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来の約０．９ｋｂのＰ
ＣＲ断片をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消
化し、ついで、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断された
ｐＳＸ２０内に１７℃で一晩連結した。この反応物を大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換し、ＬＢ＋Ｋａｎ
（５０μｇ／ｍｌ）上でプレーティングし、３７℃で一
晩インキュベートした。該ｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭプラ
スミドＤＮＡを精製した。それは、ＲｓａＩ消化に対し
て完全に修飾されているらしかった。該ｐＳＸ２０−ｍ
ｊａＶＭプラスミドをＥＲ２７４４［ｐＩＨ９１９−ｒ
ｓａＩＭ］内に形質転換し、ＬＢ＋Ｋａｎ＋Ｃａｍ Ｋ
ａｎ（５０／２５μｇ／ｍｌ）プレート上で３７℃でプ
レーティングした。ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭおよびｐ
ＳＸ２０−ｍｊａＶＭプラスミドを含有するＥＲ２７４
４を、過剰発現のために、標準的なＣａＣｌ２法でコン
ピテントにした（第１１節）。
タノコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来の約０．９ｋｂのＰ
ＣＲ断片をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消
化し、ついで、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断された
ｐＳＸ２０内に１７℃で一晩連結した。この反応物を大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換し、ＬＢ＋Ｋａｎ
（５０μｇ／ｍｌ）上でプレーティングし、３７℃で一
晩インキュベートした。該ｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭプラ
スミドＤＮＡを精製した。それは、ＲｓａＩ消化に対し
て完全に修飾されているらしかった。該ｐＳＸ２０−ｍ
ｊａＶＭプラスミドをＥＲ２７４４［ｐＩＨ９１９−ｒ
ｓａＩＭ］内に形質転換し、ＬＢ＋Ｋａｎ＋Ｃａｍ Ｋ
ａｎ（５０／２５μｇ／ｍｌ）プレート上で３７℃でプ
レーティングした。ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭおよびｐ
ＳＸ２０−ｍｊａＶＭプラスミドを含有するＥＲ２７４
４を、過剰発現のために、標準的なＣａＣｌ２法でコン
ピテントにした（第１１節）。
【００６６】８．完全なＲｓａＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子のクローニング 全ｒｓａＩＲ遺伝子（ＯＲＦ３）のＰＣＲ増幅用の２つ
のプライマーを合成した。９５℃で１分間、５４℃で１
分間、７２℃で３分間、２５サイクルのＰＣＲ条件およ
び以下の２つのプライマー（ｒｓａ．ｒ５）および（ｒ
ｓａ．３ｒ−２）と共にＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラ
ーゼを用いて、該遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅した。
ゼ遺伝子のクローニング 全ｒｓａＩＲ遺伝子（ＯＲＦ３）のＰＣＲ増幅用の２つ
のプライマーを合成した。９５℃で１分間、５４℃で１
分間、７２℃で３分間、２５サイクルのＰＣＲ条件およ
び以下の２つのプライマー（ｒｓａ．ｒ５）および（ｒ
ｓａ．３ｒ−２）と共にＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラ
ーゼを用いて、該遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅した。
【００６７】５’ＴＴＧＴＴＣＴＧＣＡＧＴＡＡＧＧＡ
ＧＧＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴ
ＣＡＡＣＴＴＣＧＧＴＧＧ ３’（ｒｓａ．ｒ５）（配
列番号1７）。 ５’ＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＧＣＣＧＡＡＴＧＴ
ＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣ ３’（ｒｓａ．３ｒ−
２）（配列番号1８）。
ＧＧＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴ
ＣＡＡＣＴＴＣＧＧＴＧＧ ３’（ｒｓａ．ｒ５）（配
列番号1７）。 ５’ＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＧＣＣＧＡＡＴＧＴ
ＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣ ３’（ｒｓａ．３ｒ−
２）（配列番号1８）。
【００６８】該ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＰｓｔＩおよ
びＢａｍＨＩで消化し、ついでＰｓｔＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断されたｐＲＲＳ内に連結し、ついで大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａ
ＩＭ］およびＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭ］
内に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｋａｎ（１００／５０
μｇ／ｍｌ）プレート上で３７℃で一晩プレーティング
した。
びＢａｍＨＩで消化し、ついでＰｓｔＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断されたｐＲＲＳ内に連結し、ついで大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａ
ＩＭ］およびＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｍｊａＶＭ］
内に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｋａｎ（１００／５０
μｇ／ｍｌ）プレート上で３７℃で一晩プレーティング
した。
【００６９】両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株はＲｓａ
Ｉ消化に対して完全に保護されているようであるが、Ｅ
Ｒ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］細胞だけが、Ｒ
ｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を有するクローンを与え
た。２０個の単離物中２個のクローン、すなわちＥＲ２
５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］細胞からの＃１３お
よび＃１４は、正しいサイズのｒｓａＩＲ断片を含有し
ていた。これは、以下のとおり、ｐＵＣ１９汎用プライ
マー＃１２３３および１２２４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用する２０個のコロニーのコ
ロニーＰＣＲにより確認された。個々のコロニーをＬＢ
寒天プレートから拾い、１００μｌのｄＨ２Ｏ中に配置
し、５分間煮沸し、ついでそれぞれを室温で冷却した。
Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼと共に５０μｌの反
応内の２．５μｌの煮沸ＤＮＡを使用して、９５℃で１
０秒間、６２℃で１分間、７２℃で１分間、３０サイク
ルの直接的またはコロニーＰＣＲ条件を用いた。ＥＲ２
５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］からの＃１３および
＃１４だけが該ｒｓａＩＲ断片を含有し、アッセイした
ところ、低レベルのＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を
示した。配列決定したところ、＃１４は開始コドン（Ａ
ＴＧ）におけるＴの欠失突然変異を示した。
Ｉ消化に対して完全に保護されているようであるが、Ｅ
Ｒ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］細胞だけが、Ｒ
ｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を有するクローンを与え
た。２０個の単離物中２個のクローン、すなわちＥＲ２
５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］細胞からの＃１３お
よび＃１４は、正しいサイズのｒｓａＩＲ断片を含有し
ていた。これは、以下のとおり、ｐＵＣ１９汎用プライ
マー＃１２３３および１２２４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用する２０個のコロニーのコ
ロニーＰＣＲにより確認された。個々のコロニーをＬＢ
寒天プレートから拾い、１００μｌのｄＨ２Ｏ中に配置
し、５分間煮沸し、ついでそれぞれを室温で冷却した。
Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼと共に５０μｌの反
応内の２．５μｌの煮沸ＤＮＡを使用して、９５℃で１
０秒間、６２℃で１分間、７２℃で１分間、３０サイク
ルの直接的またはコロニーＰＣＲ条件を用いた。ＥＲ２
５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］からの＃１３および
＃１４だけが該ｒｓａＩＲ断片を含有し、アッセイした
ところ、低レベルのＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を
示した。配列決定したところ、＃１４は開始コドン（Ａ
ＴＧ）におけるＴの欠失突然変異を示した。
【００７０】ついでプライマーｒｓａ．ｒ５およびｒｓ
ａ．３ｒ−２からのｒｓａＩＲ ＰＣＲ断片を、Ｂｓａ
ＡＩ部位においてｐＣＡＢ１６内に平滑末端連結し、つ
いでＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］内に形質
転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｋａｎプレート上で３７℃で一
晩プレーティングした。１０個のコロニーのコロニーＰ
ＣＲは１個のクローン＃９を同定し、これは、コロニー
ＰＣＲによる検出では正しいｒｓａＩＲ断片を含有して
いた。ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９の配列決定は、該
１８．７ｋＤａタンパク質のアミノ酸配列と一致するｒ
ｓａＩＲに関する正しいＤＮＡ配列を示した。
ａ．３ｒ−２からのｒｓａＩＲ ＰＣＲ断片を、Ｂｓａ
ＡＩ部位においてｐＣＡＢ１６内に平滑末端連結し、つ
いでＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−ｒｓａＩＭ］内に形質
転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｋａｎプレート上で３７℃で一
晩プレーティングした。１０個のコロニーのコロニーＰ
ＣＲは１個のクローン＃９を同定し、これは、コロニー
ＰＣＲによる検出では正しいｒｓａＩＲ断片を含有して
いた。ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９の配列決定は、該
１８．７ｋＤａタンパク質のアミノ酸配列と一致するｒ
ｓａＩＲに関する正しいＤＮＡ配列を示した。
【００７１】９．ｐＲＲＳを使用する大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）株ＥＲ２５６６［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］に
おけるＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現 該ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９クローンは、ｒｓａＩ
Ｒに関する正しいＤＮＡ配列を含有していたため、この
ベクターからのＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をｐ
ＲＲＳ内にサブクローニングし、それを、ＲｓａＩ−メ
チラーゼで予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主
内に形質転換する試みを行なった。該ＰＣＲプライマー
内に設計された隣接するＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位
を用いて、１０μｇのｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９プ
ラスミド（第８節）をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで３７
℃で２時間消化し、該ｒｓａＩＲインサートをゲル精製
し、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＲＲＳ内
に連結した。この連結反応物をＥＲ２５６６［ｐＩＨ９
１９−ｒｓａＩＭ］内に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃ
ａｍプレート上で３７℃でプレーティングした。プラス
ミドＤＮＡを１６個のコロニーから精製し、ついでＰｓ
ｔＩおよびＢａｍＨＩで消化した。該クローンはいずれ
も、所望のｒｓａＩＲ遺伝子インサートを含有していな
かった。同じ連結反応物をＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−
ｍｊａＶＭ］内に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｋａｎプ
レート上で３７℃でプレーティングした。２０個のコロ
ニーを拾い、ｐＵＣ１９汎用プライマー＃１２３３およ
び＃１２２４を使用するコロニーＰＣＲにより分析し
た。この場合もまた、該単離体はいずれも、該ｒｓａＩ
Ｒ遺伝子インサートを含有しないことが判明した
ｌｉ）株ＥＲ２５６６［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］に
おけるＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現 該ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９クローンは、ｒｓａＩ
Ｒに関する正しいＤＮＡ配列を含有していたため、この
ベクターからのＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をｐ
ＲＲＳ内にサブクローニングし、それを、ＲｓａＩ−メ
チラーゼで予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主
内に形質転換する試みを行なった。該ＰＣＲプライマー
内に設計された隣接するＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位
を用いて、１０μｇのｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９プ
ラスミド（第８節）をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで３７
℃で２時間消化し、該ｒｓａＩＲインサートをゲル精製
し、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＲＲＳ内
に連結した。この連結反応物をＥＲ２５６６［ｐＩＨ９
１９−ｒｓａＩＭ］内に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃ
ａｍプレート上で３７℃でプレーティングした。プラス
ミドＤＮＡを１６個のコロニーから精製し、ついでＰｓ
ｔＩおよびＢａｍＨＩで消化した。該クローンはいずれ
も、所望のｒｓａＩＲ遺伝子インサートを含有していな
かった。同じ連結反応物をＥＲ２５６６［ｐＳＸ２０−
ｍｊａＶＭ］内に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｋａｎプ
レート上で３７℃でプレーティングした。２０個のコロ
ニーを拾い、ｐＵＣ１９汎用プライマー＃１２３３およ
び＃１２２４を使用するコロニーＰＣＲにより分析し
た。この場合もまた、該単離体はいずれも、該ｒｓａＩ
Ｒ遺伝子インサートを含有しないことが判明した
【００７２】１０．ｐＬＴ７Ｋを使用する大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩ
Ｍ］におけるＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現 ｐＬＴ７Ｋ内へのクローニングのためのｒｓａＩＲのＰ
ＣＲ増幅用の２つのプライマーを合成した。９５℃で１
分間、５４℃で１分間、７２℃で１分間、２５サイクル
のＰＣＲ条件および以下の２つのプライマー（Ｘｂａ５
ＲＴ７）および（Ｘｈｏ３ＲＴ７）と共にＶｅｎｔ（登
録商標）ポリメラーゼを用いて、該全ＲｓａＩ制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子（４８３ｂｐ）を鋳型ｐＣＡＢ１
６−ｒｓａＩＲ＃９から増幅した。
ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩ
Ｍ］におけるＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現 ｐＬＴ７Ｋ内へのクローニングのためのｒｓａＩＲのＰ
ＣＲ増幅用の２つのプライマーを合成した。９５℃で１
分間、５４℃で１分間、７２℃で１分間、２５サイクル
のＰＣＲ条件および以下の２つのプライマー（Ｘｂａ５
ＲＴ７）および（Ｘｈｏ３ＲＴ７）と共にＶｅｎｔ（登
録商標）ポリメラーゼを用いて、該全ＲｓａＩ制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子（４８３ｂｐ）を鋳型ｐＣＡＢ１
６−ｒｓａＩＲ＃９から増幅した。
【００７３】５’ＴＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴ
ＡＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＡＣＴ
ＴＣＧＧＴＧＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣ ３’（Ｘ
ｂａ５ＲＴ７）（配列番号1９）。 ５’ＴＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＣＧＡＡ
ＴＧＴＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＡＣＧ ３’（Ｘｈ
ｏ３ＲＴ７）（配列番号２０）。
ＡＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＡＣＴ
ＴＣＧＧＴＧＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣ ３’（Ｘ
ｂａ５ＲＴ７）（配列番号1９）。 ５’ＴＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＣＧＡＡ
ＴＧＴＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＡＣＧ ３’（Ｘｈ
ｏ３ＲＴ７）（配列番号２０）。
【００７４】ｐＣＡＢ１６−ｒｓａＩＲ＃９から生成し
たｒｓａＩＲ ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＸｂａＩおよ
びＸｈｏＩで消化し、ついでＸｂａＩおよびＸｈｏＩで
切断されたｐＬＴ７Ｋ内に１７℃で一晩連結した。該連
結反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α内に形質転
換し、２０ｍＭグルコースを含有する予め３７℃に加温
されたＬＢ＋ａｍｐプレート上で３７℃で一晩プレーテ
ィングした。プラスミドＤＮＡを１８個のアンピシリン
耐性カナマイシン感受性コロニーから単離した。１２個
が、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩでの消化により示されると
おり、正しいサイズのｒｓａＩＲ断片を含有していた。
１個のクローンｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ＃５をＥＲ２５
６６［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］内に形質転換し、Ｌ
Ｂ＋Ａｍｐ／Ｃａｍ（１００／２５μｇ／ｍｌ）プレー
ト（予め３７℃に加温されたもの）上でプレーティング
し、３７℃で一晩インキュベートした。僅か３個の形質
転換体が得られた。全３個のコロニー＃５−１、＃５−
２および＃５−３を、予め加温されたＬＢ＋Ａｍｐ／Ｃ
ａｍプレート上に再ストリークし、また、ＬＢ＋Ａｍｐ
／Ｃａｍを含有する予め加温された１０ｍｌの培養内に
接種し、３７℃で一晩培養した。０．５ｍｌの該一晩培
養物を、３７℃で培養されたＬＢ＋Ａｍｐ／Ｃａｍを含
有する予め加温された５０ｍｌの培養物内で希釈し、
０．８〜１．０のＯＤ５９０まで培養し、ＩＰＴＧを８
５ｍｇ／Ｌまで加え、３０℃で約２時間誘導した。アッ
セイしたところ、全３個のｒｓａＩＲ−ｐＬＴ７Ｋクロ
ーンは、検出可能であるが種々の量のＲｓａＩ制限エン
ドヌクレアーゼ活性を示した。ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ
＃５−３は、最大のＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を
示した。ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ＃５−３プレート（４
℃で保存したもの）からの４個のコロニーを３７℃で再
培養し、ＩＰＴＧで３０℃で誘導し、ＲｓａＩエンドヌ
クレアーゼ活性に関して再アッセイした。ＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼ活性が検出された。
たｒｓａＩＲ ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＸｂａＩおよ
びＸｈｏＩで消化し、ついでＸｂａＩおよびＸｈｏＩで
切断されたｐＬＴ７Ｋ内に１７℃で一晩連結した。該連
結反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α内に形質転
換し、２０ｍＭグルコースを含有する予め３７℃に加温
されたＬＢ＋ａｍｐプレート上で３７℃で一晩プレーテ
ィングした。プラスミドＤＮＡを１８個のアンピシリン
耐性カナマイシン感受性コロニーから単離した。１２個
が、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩでの消化により示されると
おり、正しいサイズのｒｓａＩＲ断片を含有していた。
１個のクローンｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ＃５をＥＲ２５
６６［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］内に形質転換し、Ｌ
Ｂ＋Ａｍｐ／Ｃａｍ（１００／２５μｇ／ｍｌ）プレー
ト（予め３７℃に加温されたもの）上でプレーティング
し、３７℃で一晩インキュベートした。僅か３個の形質
転換体が得られた。全３個のコロニー＃５−１、＃５−
２および＃５−３を、予め加温されたＬＢ＋Ａｍｐ／Ｃ
ａｍプレート上に再ストリークし、また、ＬＢ＋Ａｍｐ
／Ｃａｍを含有する予め加温された１０ｍｌの培養内に
接種し、３７℃で一晩培養した。０．５ｍｌの該一晩培
養物を、３７℃で培養されたＬＢ＋Ａｍｐ／Ｃａｍを含
有する予め加温された５０ｍｌの培養物内で希釈し、
０．８〜１．０のＯＤ５９０まで培養し、ＩＰＴＧを８
５ｍｇ／Ｌまで加え、３０℃で約２時間誘導した。アッ
セイしたところ、全３個のｒｓａＩＲ−ｐＬＴ７Ｋクロ
ーンは、検出可能であるが種々の量のＲｓａＩ制限エン
ドヌクレアーゼ活性を示した。ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ
＃５−３は、最大のＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を
示した。ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ＃５−３プレート（４
℃で保存したもの）からの４個のコロニーを３７℃で再
培養し、ＩＰＴＧで３０℃で誘導し、ＲｓａＩエンドヌ
クレアーゼ活性に関して再アッセイした。ＲｓａＩエン
ドヌクレアーゼ活性が検出された。
【００７５】１１．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２７
４４［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］；［ｐＳＸ２０−ｍ
ｊａＶＭ］におけるＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子
の過剰発現 ｒｓａＩＭ遺伝子またはｍｊａＶＭ遺伝子を保持する大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主におけるＲｓａＩエンドヌク
レアーゼの発現クローンを単離し維持することに本発明
者らが失敗したのは、不適切なＭＴａｓｅ保護の結果で
あると判断された。そのため、両方のＭＴａｓｅを含有
する新規大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主を調製した。そし
て、この宿主をｒｓａＩＲ遺伝子で形質転換したとこ
ろ、安定なＲ．ＲｓａＩ過剰発現クローンが最終的に得
られた。この過剰発現ＲｓａＩエンドヌクレアーゼクロ
ーンを最終的に確立するために、ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩ
Ｒ＃５（第１０節）からの元のミニプレップＤＮＡを、
２つのメチラーゼ（Ｍ．ＲｓａＩおよびＭ．ＭｊａＶ）
で予め修飾されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ含有大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＥＲ２７４４内に形質転換し、
（予め３７℃に加温された）ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃａｍ＋Ｋ
ａｎプレート（１００／２５／５０μｇ／ｍｌ）上でプ
レーティングし、３７℃で一晩配置した。５個のコロニ
ー＃５１、＃５２、＃５３、＃５４および＃５５を１０
ｍｌの（予め３７℃に加温された）ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃａ
ｍ＋Ｋａｎ内に接種し、３７℃で一晩培養した。１ｍｌ
の各一晩培養物を５０ｍｌの（予め３７℃に加温され
た）ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃａｍ＋Ｋａｎ内に接種し、０．８
〜１．０のＯＤ５９０まで培養し。ついで培養温度を３
０℃まで低下させ、ついでＩＰＴＧ（８５ｍｇ／Ｌ）で
３０℃で一晩誘導した。ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活
性に関してアッセイしたところ、全５個のクローンが種
々の量のＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を示し、最高
の活性は１０６ｕ／ｇを超える＃５１からのものであっ
た（図８）。ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ＃５１クローンの
グリセロールストックを−７０℃で保存した。ついで＃
５１グリセロールストックを融解し、予め加温されたＬ
Ｂ＋Ａｍｐ＋Ｃａｍ＋Ｋａｎプレート上で３７℃で一晩
再ストリークした。４個のコロニーを１０ｍｌの（予め
３７℃に加温された）ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃａｍ＋Ｋａｎ内
に接種し、３７℃で一晩培養した。１ｍｌの各一晩培養
物を５０ｍｌの（予め３７℃に加温された）ＬＢ＋Ａｍ
ｐ＋Ｃａｎ＋Ｋａｎ内に接種し、０．８〜１．０のＯＤ
５９０まで培養し、ついで該培養温度を３０℃まで低下
させ、ついでＩＰＴＧ（８５ｍｇ／Ｌ）で３０℃で一晩
誘導した。全４個のクローンがＲ．ＲｓａＩを１０６ｕ
／ｇ以上で発現した。そのような１個のクローンｐＫＬ
１６７−５１は、湿潤大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞１グ
ラム当たりで産生されたＲｓａＩエンドヌクレアーゼの
５×１０６単位でＲ．ＲｓａＩを発現した。このアッセ
イは、以下のとおりに行なった。ＩＰＴＧ誘導細胞を回
収し、５ｍｌの超音波処理バッファーに再懸濁させ、つ
いでリゾチームを２５μｇ／ｍｌまで加え、該懸濁液を
氷上で１時間インキュベートした。１ｍｌを３回の１０
秒間のパルスで超音波処理し、ついで４℃で１０分間の
遠心分離により清澄化した。ついで、５０μｌの反応バ
ッファー中の１μｇのλＤＮＡを１μｌの抽出物と混合
することにより、該清澄化細胞抽出物をＲｓａＩエンド
ヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。２５μｌを取
り出し、ついで一連の９本のチューブで毎回２倍希釈
し、ついで３７℃で１時間インキュベートした（図
９）。ｐＫＬ１６７−５１からの組換えＲｓａＩエンド
ヌクレアーゼは、ほぼ均一になるまでクロマトグラフィ
ーにより精製される。
４４［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ］；［ｐＳＸ２０−ｍ
ｊａＶＭ］におけるＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子
の過剰発現 ｒｓａＩＭ遺伝子またはｍｊａＶＭ遺伝子を保持する大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主におけるＲｓａＩエンドヌク
レアーゼの発現クローンを単離し維持することに本発明
者らが失敗したのは、不適切なＭＴａｓｅ保護の結果で
あると判断された。そのため、両方のＭＴａｓｅを含有
する新規大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主を調製した。そし
て、この宿主をｒｓａＩＲ遺伝子で形質転換したとこ
ろ、安定なＲ．ＲｓａＩ過剰発現クローンが最終的に得
られた。この過剰発現ＲｓａＩエンドヌクレアーゼクロ
ーンを最終的に確立するために、ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩ
Ｒ＃５（第１０節）からの元のミニプレップＤＮＡを、
２つのメチラーゼ（Ｍ．ＲｓａＩおよびＭ．ＭｊａＶ）
で予め修飾されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ含有大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＥＲ２７４４内に形質転換し、
（予め３７℃に加温された）ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃａｍ＋Ｋ
ａｎプレート（１００／２５／５０μｇ／ｍｌ）上でプ
レーティングし、３７℃で一晩配置した。５個のコロニ
ー＃５１、＃５２、＃５３、＃５４および＃５５を１０
ｍｌの（予め３７℃に加温された）ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃａ
ｍ＋Ｋａｎ内に接種し、３７℃で一晩培養した。１ｍｌ
の各一晩培養物を５０ｍｌの（予め３７℃に加温され
た）ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃａｍ＋Ｋａｎ内に接種し、０．８
〜１．０のＯＤ５９０まで培養し。ついで培養温度を３
０℃まで低下させ、ついでＩＰＴＧ（８５ｍｇ／Ｌ）で
３０℃で一晩誘導した。ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活
性に関してアッセイしたところ、全５個のクローンが種
々の量のＲｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を示し、最高
の活性は１０６ｕ／ｇを超える＃５１からのものであっ
た（図８）。ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ＃５１クローンの
グリセロールストックを−７０℃で保存した。ついで＃
５１グリセロールストックを融解し、予め加温されたＬ
Ｂ＋Ａｍｐ＋Ｃａｍ＋Ｋａｎプレート上で３７℃で一晩
再ストリークした。４個のコロニーを１０ｍｌの（予め
３７℃に加温された）ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃａｍ＋Ｋａｎ内
に接種し、３７℃で一晩培養した。１ｍｌの各一晩培養
物を５０ｍｌの（予め３７℃に加温された）ＬＢ＋Ａｍ
ｐ＋Ｃａｎ＋Ｋａｎ内に接種し、０．８〜１．０のＯＤ
５９０まで培養し、ついで該培養温度を３０℃まで低下
させ、ついでＩＰＴＧ（８５ｍｇ／Ｌ）で３０℃で一晩
誘導した。全４個のクローンがＲ．ＲｓａＩを１０６ｕ
／ｇ以上で発現した。そのような１個のクローンｐＫＬ
１６７−５１は、湿潤大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞１グ
ラム当たりで産生されたＲｓａＩエンドヌクレアーゼの
５×１０６単位でＲ．ＲｓａＩを発現した。このアッセ
イは、以下のとおりに行なった。ＩＰＴＧ誘導細胞を回
収し、５ｍｌの超音波処理バッファーに再懸濁させ、つ
いでリゾチームを２５μｇ／ｍｌまで加え、該懸濁液を
氷上で１時間インキュベートした。１ｍｌを３回の１０
秒間のパルスで超音波処理し、ついで４℃で１０分間の
遠心分離により清澄化した。ついで、５０μｌの反応バ
ッファー中の１μｇのλＤＮＡを１μｌの抽出物と混合
することにより、該清澄化細胞抽出物をＲｓａＩエンド
ヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。２５μｌを取
り出し、ついで一連の９本のチューブで毎回２倍希釈
し、ついで３７℃で１時間インキュベートした（図
９）。ｐＫＬ１６７−５１からの組換えＲｓａＩエンド
ヌクレアーゼは、ほぼ均一になるまでクロマトグラフィ
ーにより精製される。
【００７６】［ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭ、ｐＳＸ２０
−ｍｊａＶＭ、ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ］（ＮＥＢ＃１
２４２）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７４
４のサンプルは、ブダペスト条約の条項および条件に基
づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに２０００年５月２６日に寄託さ
れており、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１９２６が付与さ
れている。
−ｍｊａＶＭ、ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲ］（ＮＥＢ＃１
２４２）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７４
４のサンプルは、ブダペスト条約の条項および条件に基
づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに２０００年５月２６日に寄託さ
れており、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１９２６が付与さ
れている。
【００７７】１０．ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼの
精製 該組換えＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼは、アフィニ
ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどの標準的なタンパク質精製技術により精製され
る。
精製 該組換えＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼは、アフィニ
ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどの標準的なタンパク質精製技術により精製され
る。
【図１】ＲｓａＩ制限−修飾系の遺伝子体制を示す。
【図２Ａ】ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子（配列番号１）お
よびそのコード化アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
よびそのコード化アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ｂ】ＲｓａＩメチラーゼ遺伝子（配列番号１）お
よびそのコード化アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
よびそのコード化アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】ＲｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（配列番号
３）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号４）を
示す。
３）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号４）を
示す。
【図４】ＲｓａＩ未知遺伝子（配列番号５）およびその
コード化アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
コード化アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図５】ｐＩＨ９１９−ｒｓａＩＭメチラーゼクローン
のプラスミド地図を示す。
のプラスミド地図を示す。
【図６】ＳＸ２０−ｍｊａＶＭメチラーゼクローンのプ
ラスミド地図を示す。
ラスミド地図を示す。
【図７】ｐＣＡＢ１６のプラスミド地図を示す。
【図８】ｐＬＴ７Ｋ−ｒｓａＩＲエンドヌクレアーゼク
ローン＃５のプラスミド地図を示す。
ローン＃５のプラスミド地図を示す。
【図９】ｐＫＬ１６７−５１の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
細胞抽出物からのＲｓａＩ制限酵素活性を表す写真を示
す。
細胞抽出物からのＲｓａＩ制限酵素活性を表す写真を示
す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年７月１９日（２００１．７．１
９）
９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】４．精製されたＲｓａＩ制限エンドヌクレ
アーゼのＮ末端アミノ酸の配列決定 該非組換えＲｓａＩエンドヌクレアーゼを、ほぼ均一に
まで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。２つのタンパ
ク質バンドが、約１８ｋＤａおよび２２ｋＤａの分子量
で検出された。該１８ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ
酸配列は、（Ｍ）ＥＲＲＦＱＬＲＷＤＥＥＥＬＡＲＡＦ
ＫＶＴＴＫ（配列番号７）と決定された。該２２ｋＤａ
タンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、（Ｍ）ＡＲＥＩＰ
ＤＬＱＡＶＶＲＴＧＴＧＫＧＡＡＲＱＡＲＸ（配列番号
８）と決定された。（該１８ｋＤａタンパク質の配列
は、第５節に記載のとおりＯＲＦ３にコードされる推定
Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致する）該２２ｋＤａ配
列は、該クローン化ＯＲＦのいずれとも一致しなかっ
た。ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼは、十中八九、該
１８ｋＤａタンパク質であると結論された。
アーゼのＮ末端アミノ酸の配列決定 該非組換えＲｓａＩエンドヌクレアーゼを、ほぼ均一に
まで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。２つのタンパ
ク質バンドが、約１８ｋＤａおよび２２ｋＤａの分子量
で検出された。該１８ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ
酸配列は、（Ｍ）ＥＲＲＦＱＬＲＷＤＥＥＥＬＡＲＡＦ
ＫＶＴＴＫ（配列番号７）と決定された。該２２ｋＤａ
タンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、（Ｍ）ＡＲＥＩＰ
ＤＬＱＡＶＶＲＴＧＴＧＫＧＡＡＲＱＡＲＸ（配列番号
８）と決定された。（該１８ｋＤａタンパク質の配列
は、第５節に記載のとおりＯＲＦ３にコードされる推定
Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致する）該２２ｋＤａ配
列は、該クローン化ＯＲＦのいずれとも一致しなかっ
た。ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼは、十中八九、該
１８ｋＤａタンパク質であると結論された。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 リチヤード・デイー・モーガン アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01949、ミドルトン、ドノバンズ・ウエ イ・31 (72)発明者 テイモシー・ミキセル アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01983、トツプスフイールド、パーキン ズ・ロウ・235 (72)発明者 ジエフリー・ジー・ウイルソン アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01915、ビバリー、ラントウール・ストリ ート・ナンバー・706・エヌ・60 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA11 AA20 BA10 BA11 CA03 CA20 DA06 EA04 GA11 GA19 HA08 HA09 4B050 CC01 CC03 DD02 EE01 LL03 LL05 4B065 AA01Y AA26X AA58X AA72X AA90X AB01 AC14 BA02 BB40 BC03 BD01 BD15 BD46 CA29 CA31 CA46
Claims (6)
- 【請求項１】 ロドシュードモナス・スファエロイデス
（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏ
ｉｄｅｓ）から入手可能な、ＲｓａＩ制限エンドヌクレ
アーゼをコードする単離されたＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡセグメントが挿入されているベクターを含
んでなる組換えＤＮＡベクター。 - 【請求項３】 ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１９２６から入手
可能な、ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラ
ーゼをコードする単離されたＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３に記載の単離されたＤＮＡを含
んでなるクローニングベクター。 - 【請求項５】 請求項２または４に記載のクローニング
ベクターで形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 ＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼの製造
方法であって、請求項２または４に記載のベクターで形
質転換された宿主細胞を該エンドヌクレアーゼの発現に
適した条件下で培養することを含んでなる製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/587,066 US6210945B1 (en) | 2000-06-02 | 2000-06-02 | Method for cloning and producing the RsaI restriction endonuclease in E. coli and purification of the recombinant RsaI restriction endonuclease |
| US587066 | 2000-06-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002306181A true JP2002306181A (ja) | 2002-10-22 |
Family
ID=24348199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001152388A Pending JP2002306181A (ja) | 2000-06-02 | 2001-05-22 | 大腸菌においてＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングし製造するための方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6210945B1 (ja) |
| EP (1) | EP1164189B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002306181A (ja) |
| DE (1) | DE60141553D1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6210945B1 (en) * | 2000-06-02 | 2001-04-03 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the RsaI restriction endonuclease in E. coli and purification of the recombinant RsaI restriction endonuclease |
| JP5088034B2 (ja) * | 2006-08-14 | 2012-12-05 | ソニー株式会社 | 物質の検出等に有用な核酸鎖とその方法 |
| US9051563B2 (en) | 2011-01-14 | 2015-06-09 | Zymo Research Corporation | Nucleic acid purification |
| EP2770056B1 (en) | 2012-07-18 | 2017-05-31 | Zymo Research Corporation | Nucleic acid purification |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265094A (ja) * | 1985-02-06 | 1986-11-22 | ニユ−・イングランド・バイオラブズ・インコ−ポレ−テツド | 制限および修飾遺伝子のクロ−ニング |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5200333A (en) | 1985-03-01 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Cloning restriction and modification genes |
| US5246845A (en) | 1990-07-23 | 1993-09-21 | New England Biolabs, Inc. | Heterospecific modification as a means to clone restriction genes |
| US5498535A (en) | 1994-05-24 | 1996-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for direct cloning of nuclease genes in E. coli |
| US6210945B1 (en) * | 2000-06-02 | 2001-04-03 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the RsaI restriction endonuclease in E. coli and purification of the recombinant RsaI restriction endonuclease |
-
2000
- 2000-06-02 US US09/587,066 patent/US6210945B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-05-22 JP JP2001152388A patent/JP2002306181A/ja active Pending
- 2001-06-01 DE DE60141553T patent/DE60141553D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-01 EP EP01202104A patent/EP1164189B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265094A (ja) * | 1985-02-06 | 1986-11-22 | ニユ−・イングランド・バイオラブズ・インコ−ポレ−テツド | 制限および修飾遺伝子のクロ−ニング |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6010065236, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８０，１４２（２），ｐ．３８０−３ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1164189A1 (en) | 2001-12-19 |
| EP1164189B1 (en) | 2010-03-17 |
| US6210945B1 (en) | 2001-04-03 |
| DE60141553D1 (de) | 2010-04-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4108173B2 (ja) | ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローン化及び作製する方法 | |
| US5334526A (en) | Cloning and expression of AluI restriction endonuclease | |
| JP4825383B2 (ja) | ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングする方法及び製造する方法 | |
| JP2002306181A (ja) | 大腸菌においてＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングし製造するための方法 | |
| JP3889098B2 (ja) | 大腸菌によりＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングし生産する方法 | |
| EP0931835B1 (en) | Method for cloning and producing the PmeI restriction endonuclease | |
| US5885818A (en) | Method for cloning and producing ageI restriction endonuclease in E. coli | |
| JP4601264B2 (ja) | 大腸菌におけるＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＢｓａＩメチラーゼのクローニング及び発現方法 | |
| JP4498496B2 (ja) | ＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニングおよび製造並びに組換えＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼの精製のための方法 | |
| JPH06205683A (ja) | ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及び該制限エンドヌクレアーゼを製造するための方法 | |
| US6869786B1 (en) | Method for cloning and expression of BsrGI restriction endonuclease and BsrGI methyltransferase in E. coli | |
| US5516678A (en) | Method for producing the SSPI restriction endonuclease and methylase | |
| US5849558A (en) | Discovery of and method for cloning and producing the PspGI restriction endonuclease | |
| EP1225219B1 (en) | Method for cloning and expression of BstYI restriction endonuclease and BstYI methylase in E. coli and purification of BstYI and M.BstYI enzymes | |
| US6673588B2 (en) | Method for cloning and expression of MspA1l restriction endonuclease and MspA1l methylase in E. coli | |
| US5824529A (en) | Method for cloning and producing the PshAI restriction endonuclease | |
| JP4115248B2 (ja) | Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍｂｉ制限エンドヌクレアーゼとｂｓｍｂｉメチラーゼのクローニング及び発現の方法、並びにｂｓｍｂｉエンドヌクレアーゼの精製方法 | |
| US6387681B1 (en) | Method for cloning and expression of NHEI restriction endonuclease in E. coli. | |
| US5616484A (en) | Cloning and expression of the ApaLI restriction endonuclease | |
| US6919194B2 (en) | Method for cloning and expression of Tth111II restriction endonuclease-methylase in E. coli | |
| WO2003072760A2 (en) | Method for cloning and expression of bsawi restriction endonuclease and bsawi methylase in e. coli | |
| MFYYY | US Patent Feb. 15, 2000 Sheet 6,025,179 | |
| JP2005506843A (ja) | 大腸菌におけるＴｓｐＲＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＴｓｐＲＩメチラーゼのクローニング及び発現方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080321 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101116 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110107 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110113 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111025 |