JP2009528839A - 大腸菌におけるStuI制限エンドヌクレアーゼ及びStuIメチラーゼのクローニング及び発現方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の1態様では、AGGCCTを認識することが可能な制限エンドヌクレアーゼをコードし、配列番号1に対して少なくとも65%の配列一致度を有するポリヌクレオチド配列を含み、制限エンドヌクレアーゼは配列番号2に対して少なくとも50%の配列一致度を有する単離ポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、このポリヌクレオチド配列は配列番号1に対して少なくとも75%の配列一致度を有し、この制限エンドヌクレアーゼは配列番号2に対して少なくとも60%の配列一致度を有する。本発明の別の態様では、このポリヌクレオチド配列は配列番号1に対して少なくとも90%の配列一致度を有し、この制限エンドヌクレアーゼは配列番号2に対して少なくとも70%の配列一致度を有する。更に、上記制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。更に、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明の該当態様はStuIR及びStuIMをコードする組換えDNAに関し、および、組換えDNAを含む大腸菌細胞におけるStuIRの発現に関する。
(a)メチラーゼ遺伝子選択の失敗
米国特許第5,200,333号に記載されているメチラーゼ選択法は制限−修飾系のクローニングに好適な最初のアプローチである。ストレプトマイセス・ツバーシディクスに由来するゲノムDNAはStuIR消化に耐性であるため、StuIMが存在すると推論された。しかし、StuIMのクローニングは問題があった。第1に、メチラーゼ選択に失敗した。この失敗は以下の原因が考えられる。
*初期ライブラリーを構築するために使用した制限酵素によるstuIM遺伝子内の開裂;
*DNAフラグメントの寸法が大きいため、ライブラリーから適切なDNAフラグメントをクローニングできない;
*大腸菌におけるstuIM遺伝子の発現率が低い;
*プラスミド上のStuIR開裂部位の修飾不良;
*両者遺伝子を同一DNAフラグメントにクローニングした場合にstuIM遺伝子の発現に比較してstuIR遺伝子が相対的に過剰発現されるため、stuIR遺伝子毒性が生じる。
StuIMをコードする遺伝子を発見する機会を増すために、プラスミドpUC19のβ−ラクタマーゼ(b/a)遺伝子(アンピシリン耐性遺伝子)に2個のStuIR開裂部位(AGGCCT)を挿入し、プラスミドpUC2iStuIを作製した(図4)。StuIMによる修飾の不在下では、このプラスミドはAmpプレートでのStuIR攻撃及び選択に耐えられない。従って、攻撃したゲノムDNAライブラリーからプラスミドにおけるstuIM遺伝子の存在を選択することができる。
(i)NlaIII及びSau3AIで部分的に消化したストレプトマイセス・ツバーシディクスゲノムDNAをpUC2iStuIにクローニングし、ゲノムDNAの重複するフラグメントを含むプラスミドライブラリーを形成した。このプラスミドライブラリーをXL10細胞(Stratagene,La JoIIa,CA)に形質転換した。全コロニーをプールし、プラスミドDNAを抽出し、StuIRで攻撃し、StuIR開裂部位の修飾が行われたか否かを調べた。部分消化ゲノムDNAを含むプラスミドがStuIRを発現したならば、形質転換細胞は生存していないと思われる。StuIM又は非エンドヌクレアーゼをコードするDNAを発現するプラスミドを含む細胞のみが生存し、これらのうちで、理論的にはstuIM遺伝子を含む細胞のみがスーパーコイルプラスミドを含むと予想される。しかし、直鎖化プラスミドのバックグラウンドは非常に高く、StuIMをコードするプラスミドを回収することはできなかった。
pACYC184に挿入したプラスミドpST2からPCRによりstuIMを増幅した。pACYC184を大腸菌ER2683(New England Biolabs,Inc.(NEB),Ipswich,MA)に形質転換した。19個のプラスミドのうち6個が適切な酵素消化により正しい寸法のインサートを含んでいた。pACYC184又はstuIMにStuIR部位は存在していなかったので、これらの株に由来するゲノムDNAを抽出し、StuIRで消化した。これらのうちでStuIR消化に耐性のものは皆無であった。高コピー数プラスミドから発現されたStuIMは宿主DNAを完全には修飾しなかった。
一般的なフェノール−クロロホルム抽出法と凍結−解凍サイクルによりストレプトマイセス・ツバーシディクスからゲノムDNAを作製した。
一次プラスミドライブラリーをStuIR消化により攻撃した。これらのDNA消化産物を次に大腸菌Rosetta 2に逆形質転換した。StuIR攻撃後の形質転換細胞に6個の生存コロニーが検出された。これらの6個のコロニーに由来するプラスミドを抽出した。これらのプラスミドをStuIRで消化した処、1個(#2)(pST2)が消化に耐性であることが判明した。
プラスミドpST2を含むRosetta 2株の細胞抽出液にエンドヌクレアーゼ活性は検出されなかった。stuIM遺伝子の下流配列は〜1724bpに及び、転写調節因子とcaaxアミノ末端プロテアーゼファミリー蛋白質のホモログをコードする。従って、エンドヌクレアーゼ遺伝子が下流配列に位置するとは思われなかった。stuIM遺伝子の上流配列は固有であり、公知遺伝子に対して相同性をもたない。従って、更に上流の配列の延長に焦点を絞った。逆PCRと逆PCR産物の直接配列決定によりDNA配列を更に延長させた。まずゲノムDNAを個々の制限酵素で消化し、自己連結させた。得られた環状DNA分子を逆PCRの鋳型として使用した。stuIM遺伝子の5’末端のDNA配列を使用して染色体DNAフラグメントの逆PCR用プライマーを設計した。BsrFI、EcoRI、HaeII、HpyCH4IV、KasI、NruI及びTsp509Iに由来する鋳型から逆PCRでPCR産物を作製した。これらのPCRフラグメントをスピンカラムにより精製し、逆PCRプライマーにより配列決定した。
メチラーゼ遺伝子の発現はエンドヌクレアーゼ遺伝子の同時発現に不可欠であった。各種大腸菌株におけるStuIMの発現を調べるために、レアtRNA遺伝子をコードするプラスミドの存在下又は不在下でプラスミドpST2をER2502、ER2683、ER2566、ER2523、BL21株に形質転換した。EMD Bioscience(Damstadt,ドイツ)から入手したpRAREを含むRosetta 2株を対照として使用した。培養後、プラスミドを抽出し、StuIR消化に対する耐性を調べた。Rosetta 2株を含む後期対数期(8時間培養)から抽出したプラスミドはStuIR消化耐性を殆ど示さなかった。静止期(24時間)からのプラスミドはStuIR消化耐性が高く、約80%保護を達成することができた。元のpST2は完全にStuIR消化耐性であった(>95%保護)。実験の不一致はいくつかの理由により説明することができる。1)未知宿主突然変異がstuIM遺伝子発現を助長した;2)細胞が複製を停止し、メチラーゼ発現が持続する条件下でpST2プラスミドを含む細胞の培養期間が延びた;3)レアtRNAの同時発現によるstuIM遺伝子発現強化が僅かであった。
pACYC又はpUCから発現させたStuIMは宿主DNAを完全には保護しなかったので、他の非コグネイトメチラーゼをDNA修飾について試験した。StuIMの認識部位はAGGCCTである。認識部位の内部配列を修飾するこれらのメチラーゼはこの配列を修飾し、StuIR消化から保護することができると考えられる。HaeIIIメチラーゼ(GGm5CC)(Slatkoら,Gene 74:45−50(1998))、FnuDIメチラーゼ(GGCC、修飾部位不明、5mCメチル化型)及びPhoIメチラーゼ(GGCC、修飾部位不明、N4mCメチル化型)遺伝子を大腸菌で発現させた。ER1398[pLJhaeIIIM101−1]、ER1398[pMMhaeIIIRM127−1、pACYC184fnuDIM]及びER2566[pET21aphoIR及びpLG339phoIM]株からゲノムDNAを作製し、StuIRで消化した。haeIIIM又はfnuDIMを含む株に由来するゲノムDNAはStuIM消化に耐性であり、phoIM宿主から単離したDNAはStuIR消化に感受性であった。推定stuIM遺伝子の発現用宿主DNAを予備修飾するためにER2683[pACYC−fnuDIM]を選択した。
stuIM遺伝子に隣接するORFをPCR増幅し、HindIIIとPstIで消化し、適合可能な末端でpUC19と連結した。連結したプラスミドをpACYC−fnuDIMで予備修飾したER2683に形質転換した。コロニーを釣菌し、AmpとCamを添加したLB 4ml中で一晩増殖させた。38個のサンプルからの一晩細胞培養液10μlをNEBバッファー2(Ipswich,MA)中、37℃で30分間λDNAに対するStuIR活性について試験した。38個のサンプルのうち16個はλDNAを完全に消化し、ORFはstuIR遺伝子であることが確認された。pUC19ベクターに由来するプライマーを使用して3個のクローン(#6、#7及び#15)を配列決定した。#6と#15のインサートは野生型stuIR遺伝子であることが確認された。次に、大量培養液(細胞10mlを一晩培養液1Lから新鮮培養液1Lに継代)で株の安定性を試験した処、安定であることが判明した。プラスミドは良好に維持された。StuIRの最終発現効率は湿潤細胞1g当たり5×106単位であることが判明した。
1.ゲノムDNAの作製
ストレプトマイセス・ツバーシディクス15gから以下の段階によりゲノムDNAを作製した。
a.0.1M Tris−HCl,0.1M EDTA(pH7)35mlに細胞ペースト15gを再懸濁する。
b.0.1M Tris−HCl,0.1 MEDTA(pH7.6)に2mg/ml新鮮リゾチーム25mlを加える。37℃で1時間温置する。
c.Protease Kを0.1mg/mlまで37℃で1時間加える。
d.SDSを0.1%まで加える(10%ストック6ml)。
e.8%サルコシル溶液6mlを加える。
f.凍結解凍を3回行う。
g.55℃で1時間温置する。
h.フェノール−CHCl3抽出を3回、CHCl3抽出を2回行う。
i.緩衝液を2回交換しながらDNAを10mM Tris−HCl,pH7.5,0.1mM EDTA 4Lで4℃にて透析する。
j.RNaseA(1mM)0.5mlを37℃にて1時間加える。
k.0.8%アガロースゲルでDNA 30μlを泳動させる。この手順によりゲノムDNA640μgが得られた。ゲノムDNAの寸法はゲル上で10kbよりも著しく大きかった。
可能なメチラーゼの選択用ベクターを構築するために、プライマー:
各種単位の制限酵素ApoI(R/AATTY)、NlaIII(/CATG)及びSau3AI(/GATC)を使用してゲノムDNA 4μgを制限部分消化した。消化したDNA 0.5μgを0.8%アガロースゲルで分析した。NlaIIIとSau3AIのみから1.5kb〜10kbのDNAフラグメントの十分なスペクトルが得られた。同一酵素で消化したサンプルをプールした。1.5kb〜10kbの部分を低融点ゲルからゲル精製した。NlaIIIとSau3AIで部分消化したゲノムDNAをSphIとBamHIで消化したpUC2iStuIに夫々連結した。連結したDNAを使用してDNAse I欠損宿主XL−10(Stratagene,La JoIIa,CA)を形質転換した。各ライブラリーから約200,000個のAmpR形質転換細胞が得られた。コロニーを集めてプールし、プラスミドを抽出した。EMD Bioscience(Damstadt,ドイツ)から入手したRosetta 2株にこの混合プラスミド1μlを形質転換した。プラスミドを再び抽出し、一次プラスミドライブラリーを形成した。
各種量の一次プラスミドDNAライブラリー(1μlから1/256μl)をStuI 200単位で37℃にて1時間攻撃した。消化したDNAを大腸菌株Rosetta 2に形質転換し、混合ライブラリーから6個のAmpR生存細胞を得た。QIAprep Spin Miniprep Kit法(Qiagen,Valencia,CA)によりこれらの生存細胞からプラスミドDNAを作製した。抽出したプラスミドをStuIRで消化した。5個のコロニー(#1、#2、#4、#5、#6)はStuIR消化に耐性であることが判明した。#2(pST2)はScaIR消化にも耐性であった。他のクローンは汚染性DNAからの疑陽性であった。pST2プラスミドが確かに所望部位を含んでいることを検証するために、2種のプライマー:
ストレプトマイセス・ツバーシディクスゲノムDNA各1μgをAgeI、AluI、BfaI、BglII、BsaAI、BsaBI、BsrFI、BstYI、EcoRI、HaeII、HhaI、HincII、HpyCH4V、KasI、NlaIV、NruI、TaqI及びTsp509Iで消化した。これらの全酵素はstuIMの上流配列の近傍に1個の部位をもつという理由で選択した。消化したDNAを1×Quick Ligationバッファー(NEB,Ipswich,MA)中、T4 DNAリガーゼ200単位の存在下に2ng/μl濃度で自己連結させた。連結したDNAをスピンカラムにより50μlまで濃縮した。各々10μlを逆PCR(IPCR)の鋳型として使用した。逆PCRでは以下のプライマー:
StuIMの発現用として最初にRosetta 2株(EMD Bioscience,Damstadt,ドイツ)を選択したのは、レアtRNAの供給により遺伝子発現が増加する可能性があるためであった。この株はベースプラスミドpRARE2を含む。このプラスミドがStuIMの発現に必要であったか否かを調べるために、pRARE2を抽出し、他の大腸菌株:ER2502、ER2683、ER2566、ER2523、BL21に形質転換した。プラスミドpST2をER2502、ER2683、ER2566、ER2523及びBL21に形質転換した。ベースプラスミドpRARE2を含む宿主株と含まない宿主株をStuIR開裂部位修飾について比較した(Rosetta 2株を対照として使用)。意外にも、StuIR消化に完全に耐性であったのは元のpST2のみであった。新たに形質転換したRosetta 2株を含む他の株はStuIR消化に対して部分的に耐性のプラスミドを生じた。pRARE2プラスミドはStuIMの発現を強化しないと思われた。細胞培養物の長さはStuIR開裂部位修飾に重要な役割を果たさなかった。振盪器で細胞を>24時間温置した処、StuIR消化に対するプラスミドの耐性は増加することが判明した。(pRARE2を含まない)宿主細胞ER2502から単離したstuIM遺伝子をもつプラスミドではStuIR消化に対する約80%の耐性が達成された。stuIM遺伝子のクローニングの成功は3つの理由が考えられる。1)pRARE2同時発現プラスミドの使用(これは重要な段階でないことが判明した);2)未知宿主細胞突然変異がstuIM遺伝子発現を助長した;3)pST2を含む細胞の静止期細胞培養の延長。
stuIMに隣接するORFをPCR増幅した。
StuIRのアミノ酸配列を使用して蛋白質間(blastp)BLAST検索又は蛋白質と翻訳データベース間(tblastn)のBLAST検索を実施する。例えば、このような検索はNCBIウェブサーバー:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/を介してblastp(又はtblastn)プログラムを選択し、BLOSUM62マトリックスを使用して期待値=10、ワードサイズ=3から構成される標準設定値とExistence=11、extension=1のギャップコストを使用し、「全生物」のNR(非冗長)データベースを検索することにより実施することができる。これらのパラメーターは多少異なる検索結果が得られるように当業者が変更することができる。
Claims (7)
- AGGCCTを認識することが可能な制限エンドヌクレアーゼをコードし、配列番号1に対して少なくとも65%の配列一致度をもつヌクレオチド配列を含み、該制限エンドヌクレアーゼは配列番号2に対して少なくとも50%の配列一致度を有する単離DNA。
- StuI制限エンドヌクレアーゼ(StuIR)により認識されるヌクレオチド配列における1個以上のヌクレオチドをメチル化することが可能なメチラーゼをコードし、配列番号3に対して少なくとも65%の配列一致度を有し、該メチラーゼは配列番号4に対して少なくとも50%の配列一致度を有するDNAセグメント。
- 請求項1に記載のDNAセグメントを含む組換えベクター。
- 請求項2に記載のDNAセグメントを含む組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項2に記載のメチラーゼをコードするDNAセグメントで形質転換された請求項5に記載の宿主細胞。
- エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で請求項3に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階を含む、組換えStuIRの生産方法。
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