JPS60126085A - 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ・本発明は、新規グラスミド及びその脚製方法韮びに＃
グラスミドを含有する新規微生物に関し、代謡産物であ
るキシラナーゼの菌体外生産（分泌）ニ関与する特、定
の遺伝情報を担うデオキシ１ＪｙＪｆｔ＆′酸（ＤＮＡ
）を組み込んだ新規ゲラスミｒと、該グラスミドによっ
て形雀転換した新規像生物″ｆ提供することを目的とす
るものである。

グラスミドは、微生物の細胞内に見出さｎ、る染色体外
遺伝子で、そのＤＮＡの円形分子であり、近年、微生物
の遺伝子組み換えの手段として利用さｎ１発酵工業の分
野の研究におけるそのｌ−要件は益々増大して来ている
。

近年、アミノ酸やペグチドのｆＩｌｒＬみられるように
、微生物の生育に必要とする特定の侠求性や代謝産物の
生産能に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだグ
ラスミドについての研究がなすｎ５また若干のグラスミ
ドが宿主微生物に導入さｎ。

その形質転換株が得らｎている。

本発明者は、バチルス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　）　輌に＾
する微生物の代謝が物であるキシラナーゼの菌体外生産
（分泌）に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだ
新規テラスミドを１ＬＦＪすることに成功し、ｙ！に前
記グラスミドをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｌｃ
ｈｌａ　ｃｏｌｔ　）　ＨＢ　／　Ｑ　／株に導入して
新規且つ有用な形質転換株、エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏｌｔ　）　Ｈａ　１０　／　
（ｐＣＸ３／／）を得ることに成功して本発明を完成す
るに至った。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において用いられる宿主微生物は、エシェリヒア
属の１ラスミドとして知らｆるコリシンＥ、因子等の、
培養された細胞内で増殖し得る形式をとるグラスミド（
でフタ−ＤＮＡ）に、外来の遺伝子ＤＮＡとしてバチル
ス属に属する微生物、例えばバチルス・Ｃｌ２３菌（微
工研駒寄第７３ｑｑ号）から調製されたＤＮＡ断片を組
み込んだグラスミド會含弔させ得る、エシェリヒア・コ
リによって代表されるエシェリヒア属に和する微生９勿
である。

本発明ＶＬ使用さｎる、キシラナーゼの菌体外生産に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡを含有する微生物の例とし
、ては、バチルス・Ｃ／　２５’ｄ！Ｊ　（做工研菌寄
第７３’ｌ’１号）を挙げることができる。バチルス・
ＣＩ２！；９には埼玉県入曲利く鶴ケ島内で採取さ′ｎ
だ土壌より分離さｒした微生物であり、次の狛学的性Ｉ
Ｎを有する。なお、珈学的性負の試験及び分類方法は、
［エアロビック・スボア・ホーミング・バクテリアＪ　
（”　Ａｅｒｏｂｌｃ　Ｓｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｌｎｇＢ
ａｃｔｅｒｉａ　”　（Ｕｎｌｔａｄ　５ｔａｔｅ　Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏずＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　
Ｎｏｖ、　／　ｑ！；　、２　ｂｙ　Ｎ、Ｒ，Ｓｍ１ｔ
ｈ。

Ｒ，Ｅ、Ｇｏｒｄｏｎ　＆　Ｆ、Ｅ、Ｃ１ａｒｋ　））
及び［パージｌ−スｅマニュアル・オブ争デタミネイテ
ィブ・バクテリオロジーＪ　Ｃ／９５７年）　［Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｌｎａｔ
ｌｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌｏｇｙ　（／　９　！；　
７　）　］に基づいて行わｎた。

０菌学的諸性質 ａ）形態 ／）大キサは０．５〜０．７μＸ３．０〜ｑ、θμの桿
菌である。

２）胞、子を形成し、大きさは０．６〜０．ざμ×１．
θ〜７．２μの卵形であって、胞子のうはふくらんでい
る。

３）ダラム染色性は陽性である。

ｂ）各培地における生育状態・ Ｃ）生理的性質 以上の諸性質全総括すると、前記バチルスＣノコ５菌は
、好気性の有胞子細菌であることから、バチルス（Ｂａ
ｃｌｌｌｕｓ　）　属に属する微生物であることは明ら
かであるが、特に生育し得る範囲がｐＨ／／、ＱとＳり
℃ま、でである点において明らかに公知の菌種と区別さ
れ、好アルカリ性細菌の新菌種と艙定することが妥当で
あると結論された。

前＠ｅ　ベクターＤＮＡに組み込まれる、バチルスＣｌ
２５菌から＃ｉＭｌ製さｆたＤＮＡ断片は、前記バチル
スＪ［ｉｉ菌の代謝産物であるキシラナーゼの菌体外生
理（分泌）に関与する遺伝情＠を担うＤＮＡであり、前
記ベクターＤＮＡとしては、天然に存在するものを抽出
したものの他、増殖に必做吹部分以外のＤＮＡの部分が
一部欠落しているものでもよく、例えばｃｏｌＥ、の系
統、＋ｐ　Ｍ　ｓ　９の系統１．１）ＢＲＪ　２２の系
統、ｐｓｃ　／　０　／の系統、Ｒ６にの系統、ラムダ
−ファージの系統等が挙げられる。

また、前記ベクターｏＮＡＫＭ記ＤＮＡ断片を組み込む
方法は、既知のいずｎの方法も適用し得る。例えば、過
当な制限＃素（Ｅｎｃｉｏｎｕｃｌ・ａｓ・）を選択、
処理してＯＮ−＾を特定部位で切断し、次いで同様に処
理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼ
によって再結合する方法が用いらｎる。このようにして
得られた前記ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡの結合物を、
形質転換法によって受容菌であるエシェリヒア属の微生
物の菌体に導入し、遺伝形質として安定するまで増殖す
ると、所望の遺伝形質とベクターＤＮＡの彬＊Ｗ併せも
つ形質転換株が得られる。

後述の実施例において得られる形責□転換株は、ベクタ
ーＤＮＡとしてｐＢＲ３２２ｆラスミドのＤＮＡを用い
、これにバチルス・Ｃｌ２Ｓ劇から調製されたＤＮＡ断
片を組み込んで得らｆ′した新規ｐＣＸ　３　／　／　
ｆラスミドを、エシェリヒア・２９８８１０１株（エシ
ェリヒア・コリに一部　２株とエシェリヒア−３９８株
のハイブリッド株）に導入して形質転換反応により得ら
ｎる新規微生物であり、工、−７エリヒアーコリＨＢ／
Ｑ／　（ｐＣＸＪ’／／）（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ　
ｃｏｌｌ　ＨＢ　／θ／（＋）ＣＸ３／／））（微工研
菌を第７３ｑｓ号（ＦＥＲＭＰ−７３１１！ｒ）と呼称
される。前記エシェリヒア・コリＨ８／　０　／　（ｐ
ＣＸ　、、’　ｔ　ｔ　）の１）ＣＸ　Ｊ　／　／　グ
ラスミドの制限酵素切断地図は、第９図に示すとおりで
ある。

第９図から明らかなように、このグラスミドは、ｐＢＲ
３２２グラスミドＤＮＡの制限サイトのＨｌ　ｎｄ［［
サイトに前舊ピパチルスーＣ１２夕菌のキシラナーゼの
菌体外生産（分路）に関与する遺伝情報？担うキシラナ
ーゼＤＮＡ断片が組み込まれているＤＮＡ円形分子、即
ちｐＢＲ３，２２ｆラスミドＤＮＡ’と釣り、Ｃ００の
塩基対のＤＮＡから成る９、０１にｂの新規なりＮＡ円
形分子である。

次に、前記エシェリヒア・コリＨＦ３１０／（ｐＣＸ　
Ｊ　／　／　）の酌学的性貴け、ＤＮＡ受答酎で耐るエ
シェリヒア・コリＨ８１０１株の性質と、ペニシリン耐
性、キシラナーゼ生産性を除いて、同一であるか［：　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ　Ａ　’Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ｐ、５０！（／９１ｒ２）
診照、遺伝形質：Ｆ、ｈｓｄｓ２０ｃｒＢ＊ｍＢ）＊ｒ
ｅｃＡＩＪＩａｒｅ　−／　ｔＩｌ　ｐｒｏＡ２　、　
ｌ５ｃＹ／　ｌ　ｇａｌに２　、　ｒｐｓＬシ（Ｓｍ’
）　、　ｘｙ４−５．　ｍｔｌ−／、　５ｕｐＥｑりλ
−〕、他の特性として、前記ｐｃＸ　ｌ？　／　／　グ
ラスミドの特性、即ちキシラナーゼ生産能の遺伝悄１Ｍ
全ｉ＋ｔうｐｃｘ　Ｊ　／　／　グラスミドによってキ
シラナーゼを菌体外に分泌し、蓄積せしめる特性を附加
して成る点がその特徴−である。

エシェリヒア・コリＨｅ　１０　／　（ｐｃｘ３／　／
　）によるキシラナーゼの菌体外選択生妬（分泌）は、
後述の実施例で示さｊ、るように、菌体内生産を含めた
全酵素生産のｇθ％以上に達し、且つ長時間その生産量
が持続さｎる。これに対し、前記バチルス、　ＣＩ、７
３；菌によるキシラナーゼの菌体外生産（分泌）は、第
３図に示すように、培養後、徐々に長時間で最為に達し
、以後、急速に活性が減少して長時間の持続性を欠く点
において全く対照的である。

従って、本発明は、前記エシェリヒア・コリＨＢｔＯ／
　（ｐｃｘ３／　／　）、すなわち、従来皆ｍであった
酵素蛋白の―体外生産（分泌）能を街し且つキシラナー
ゼｋｍめで有利に生産し得る似生物を創製、折供する点
において、新規性と有用性を具備するものである。甘た
、その生産物質は目的とする単一の高分子物債のみなら
ず、他の高分子物像や？ν数の酢素蛋白類がそれぞｎ菌
体外に著量に生産（分泌）され、併せて採増することが
でキル。シ１１チ、前記エシェリヒア・コリＨＢ１０／
（ｐＣｘ　３　／　／　）の培養によね、キシラナーゼ
と共にベニシリナーゼや従来、菌体内にのみ検出さ１て
いたアルカリホスファターゼ等が後述の実施例に記載の
如く、そｎぞれ菌体外に著量に分泌されることが明らか
にさｎた。

ごｎは、本発明によって得られる１）ＣＸ　Ｊ’　／　
／　グラスミドに含１れる約ｔｉ　、ｏｏｏの塩基対の
ＤＮＡが、代謝産物の菌体外生産（分泌）能を宿主に附
与していることを意味するものである。

以下に、本発明のグラスミドのｖＩ４製方法と該グラス
ミドを含有する前記旅装転換株、エシェリヒアａコリＨ
Ｂ１０／　（ｐｃＸＪ／／）の調製方法並ひに帥記Ｊｋ
駕転換株による効果として、キシラナーゼを王とする柚
々の酵雰彊白の菌体外生産（分泌）Ｋついて、実施例に
より説明する。

実施例１ （１）　キシラナーゼ生産能の遺伝悄情をもつＤＮＡの
調製 キシラナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力を有する好
アルカリ性のバチルス・ｃｉ２３；ｙｌ（微工研菌寄ｍ
７３４１グ号）を培地［：（Ｐ／、−ｇ）：Ｈ１Ｏ，０
，酵母エキス！；　、（：’　％　ポリヘクトンＳ　、
　θ、に、ＨＰＯ４／　、θ、　ＭＰＳＯ４・りＨ２Ｏ
０、２をＮｓ、Ｃｏ５１０でｐＨｉｓ　、　０に１整し
たもの〕中、３０℃で１９時間振盪培養を行ない、対数
増殖後期の菌体を集菌後、フェノール法によるＤＮＡ抽
出法によってＤＮＡを抽出、精製し、ＤＮＡ５■を得た
。

（２１ＤＮＡ断片のベクターへの挿入 （１１で得た染色体ＤＮＡ／θμｆ！全とり、１ｉｉｂ
限エンドヌクレアーゼ＋Ｉｎｄｌｌｌ　ｋ加え１３７℃
で５分、ＩＱ分、２０分、３０分、６０分反応させて部
分的に切断した。一方、ベクターとして用いるテトラサ
イクリン抵抗性（Ｔｓｔ’）とアンビシリン抵抗性（Ａ
ｍｐ’）をもつｐＢＲ３２２デラスミ　ド’ＯＮ−Ａ、
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ
ｔＯｒｉｅｓ社（米国）製）をＨｌｎｄ　Ｉ［ｌ　で完
全に切断して４５　”Ｃ５夕分の熱処理後、前者と混合
し、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって７０℃
、２ｑ時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行ない、６５℃、５分
の熱処理後、反応液に３倍容のエタノールを加えてＤ−
ＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを沈澱、採取した。

（３）　キシラナーゼの菌体外ＨＥ産（分泌）遺伝子を
和うグラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリＫ　−／　２株とエシェリヒア・３
１８株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリＨ８
１９１株（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｌｎｇＡ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　ｐ、！；　Ｏ’ｌ　
（／　９　ｇ　２　）参照〕（遺伝形’１ｉｆｉ’　：
　Ｆ　、　ｈｓｄ　Ｓ　２０（ｒ’ｉ＋　ｍｉ　’４ｒ
ｅｃ　Ａ　／　３．　ａｒａ−／　＋１．　ｐｒｏ　Ａ
　２１１ａｃ　Ｙ　／、　ｌｉ’ａｌＫ　、２１　ｒｐ
＄　Ｌ　、２０（Ｓｍ’　Ｌ　Ｘｙ、、ｅ−５，ｍｔｌ
−／、　、Ｓｕｐ　Ｅ＋ｌＩλ−）をＬＢ培地（純水ｌ
）当りトリプトン（Ｄｌｆｃｏ　）　／　（）　ｙ、酵
母エキス５１、グルコースｉｙ、Ｎａα　１０ｇを含み
、ｐＨ７、０に帥製したもの）ＩＣ）ｍｅＫ、接種し、
３７℃で振盪培養を行ない、対数増畑後期捷で止置させ
た後に集菌した。こｎを水冷下、最終濃度で。、０．？
ＭＣａ■２の溶液にｊ員次懸濁させてコンピテントな細
胞とした。この細胞懸濁液に、　＋２１で得たグラスミ
ドＤＮＡの溶解液を加えて水冷下で６θ分反応させ、４
ｔ２℃、７〜２分間ヒートショックを与えて前記シラス
ミドＤＮＡを細胞内に取り造管せた。次いで、この細胞
懸濁沿を別途、前記ＬＢｓ地に接種し、３７℃、３〜．
！ｉ′時間振盪培養して形質転換反応を行なった後、穿
菌、洗滌して得られた形質転換株の中から、エシェリヒ
ア・コリＨＢ１０／　（ｐｃＸ３／　／　）（機工研菌
寄第７３ダタ号）を得た。

実施例コ 実施例１の（３）で得らｆ′した形質転換株、エシェリ
ヒア・コリＨＢ　／　０　／　（ｐＣＸ　、？　／　／
　）　（機工（ｉＪＩＩｉｉ寄第７３’ｌＳ号）　（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−’７３り５）倉、Ｌ１３培地（ｌ！尚わト
リフトン１０ハ酵母エキス５グ、グル、コース１１、グ
リセロール、！１７’、Ｎａ側／　Ｏｇ−５’−に＝　
シ１１　ン／　０　’Ｗ！を含む）１００ｍｌに・０．
５％のキシランを含むり０　に’　ｍｌ　容のフラスコ
でＬ？７℃にて撮盪培養した。細胞の生育（菌体量の測
定）は、乙６０ｎｍの吸光度（ＯＤ）で、酵素活性は、
酵素液０．０！５ｒｎｌにキシラン液（生化学工秦■ｍ
＞θ、／ｍｌ及びｐｌＨ，Ｏのθ、２Ｍトリスマｌｚイ
）９１衝ＮＯ，／ｒＬｃを７Ｊｎして’ＩＯ”Ｃで１９
分１ＩＪ１１＊、　Ｗ−１させ、Ｄ　Ｎ　９　（３、３
−ｄｌｎｌｔｒｏｓａｌｌｃ−ｙｌｌｃ　ａｃｌｄ　）
　／　ｍｌを加えて７００℃で５分間反応させた後に水
りｍｅを加えてりｌｏｍμの吸光度を測足し、１分間に
キシロースｌ■の還元力を生ずる酵素′＃をキシラナー
ゼ／単位（Ｕ）とし−★。

紀１図け、前記ＬＢ培地に０．５％キシランを加えた培
地を用いた場合のキシラナーゼの活性、ν１ｊちキシラ
ナーゼの菌体外生産（分泌）能を示すグラフである。

前記形質転換株の菌体量は接種後、９〜１２時間で蛇大
に達し、ｍ１図に示すとおり、菌体外キシラナーゼの活
性はほぼ６時間後から増大しけじめ、７３時間後に耐大
に達し、た（’−ｏ、、？りＬＪ、／ｍど）。

生産さｎたキシラナーゼは明常に安定であｈ１第１図に
示さｎるように、更・１、にぞのブ剪培養をりｇ時間ま
で継続しても生産量は減少せず、全酵雰活性のｇθ％以
上に達し１次。こｆｉに対して、菌体内キシラナーゼは
、培養初期（接種後９図間）において若干認めらｎ′ｆ
ｒ：が、その生産は全／！！１活性の／θＸ８度であり
、ｓ高で。−／３Ｕ／ｍＡに過ぎず、しが本その活性は
徐々に波少し贋。瞥た、舘２図け、前記ＬＢ培地に、キ
シランに代えて０、！９１；の皺を加えた培地を用いた
場合のキシラナーゼの活性を示すグラフであり、第１　
図（７）　場合とは埋同様の傾向が紹められた。なお、
比較として、ＤＮＡ供与菌の前記バチルス・Ｃ／コタ菌
（機工研菌寄第７３ググ号）を培養してキシラナーゼ活
性を測定した。

前記バチルス・Ｃ１，２３菌の契合は、使用培地Ｃ（ｔ
／ａ　）　：　＊シーｉン／θ、θ、酵母エキスｓ、ｏ
、ｚリペグトン５　、０％　Ｋ２ＨＰＯ４／　、　Ｑ、
ＭＰＳＯ４−りＨ２Ｏθ　−−２’ｔ−Ｎａ３ＣＯ５／
　０”’Ｃ’ｐｕｔ、、Ｑｆ−調整したもの〕１００ｍ
１を含む５０Ｏｒｕｇ答のフラスコに接種し、３７℃で
振帰培養した。ｔ＠養沿の菌体外キレラナーゼ活性會ｇ
時間毎に測足し、た。

接種後、ｇ時間で徐々に活性が上がり、グｇ時１１ｊ＋
に至ってやっと活性は最高（中０．！；ＩＪ／ｍｌりに
達したが、以後急速に活性は減少した（第３図１照）。

なお、実施例／の形質転換株の培養液に硫酸アンモニウ
ムを加えて塩析した後、沈澱を水に溶がして一夜流水で
透析し、ｐＨ！、５の２Ｑ　ｍＭ燐酸−燐酸ｌソーダー
緩衝液で平価化した０Ｍセルロースに吸着させた後に、
食塩濃囲ｋＯ，７Ｍがら０．７Ｍまで変化ζせ、てキシ
ラナーゼ＋！Ｉ７溶出ｇせると、（７，＋ＭＩＩＴ後で
溶出ざｎる。活性のある区分を集めてセファデックス・
Ｇ　−／　００　（５ｅｐｈ　−ａｄｓｘ　Ｇ　−／　
００　）　によるグル濾過を行って精製キシラナーゼを
得た。また、前記バチルス・ＣＩ２！；＊（機工研園寄
第７３４ｔｑ号）の培養液も同様に処理して精製し、１
百１様のキシラナーゼ會得た０両者のキシラナーゼの同
−性會みるためＫ　％ｐｌＪ活性、超速／し分析、電気
泳動及び分子量等を測定したところ、次のとおり両者の
同一性が確認さｆｉた。

ａ）ｐＨ４−夕は酢酸塩、ｐ１１５〜ｇ′はトリスマレ
イド、ｐＨ７〜９はトリス塩酸、ｐＨ９−／／はグリシ
ン嵜−件ソーダを用いて夫々調整し、前記測定法によっ
てρＩの影醤を脚べた結果、第５図のと′おり、両酵素
のρＩ活性の同一性が明らかにζｎた。

ｂ）超遠心分析では、両酵素と本に沈降定数約３、りＳ
の単一ピークを示した。

Ｃ）ρＩｒ３．３のディスク電気泳動で両酵素ともに一
本のバンドになってあり、アンフオラインによるエレク
トロホーカシングで単一のピークを示し、等電点は６．
３にあった。

ｄ）分子量は、両酵素ともＬＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド法により約グθ、θ０θと測定さｎた。

実施例１３ 目１１記エシェリヒア　＃　コリＨａ／θ／　（ｐＣＸ
３／／）（機工研菌寄第り３１１３４ｇ）　（ＦＥＲＭ
　ｐ−７，３１１５）の菌体外生産物質について、ゲラ
スミ）”　（ｐＣＸ　３／　／　）　ｋ導入しないエシ
ェリヒア・コリＨ８１９７株及び１）８Ｒ３２２ｆラス
ミドを導入したエシェリヒア・コリＨＢｌ？）１株の生
産物質と比較して、キシラナーゼ以外の酵紫蛋白類を調
べた結果を第１表に示す。

なお、培養条件は、実施例ユのキシランを加えた１Ｂ培
地で、被二シリナーゼについては、３７℃にて２０時間
振盪培養し、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクト
シダーゼについテハ、１５時間それぞれ培養した結果で
ある。また、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクト
シダーゼの酵素活性は、波長グ２０ｎｍにおける吸光度
（ＯＤ）を測定して表わしたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図及び泥ユ図は、本発明方法で用いたエシェリヒア
　−：ＩすＨＢ　／　０　／　（ｐＣＸ　、？　／　／
　）によるキシラナーゼ生産活性を、第３図は、バチル
ス・Ｃ／２ｇ菌によるキシラナーゼ生産活性全それぞれ
示すグラフである。第グ図は、エシェリヒア・：ｌ　Ｉ
Ｊ　ＨＢ　／　０　／　（ｐＣＸ　３　／　／　）のプ
ラスミド（ｒＩｃｘ　、３　／　／　）の制限酵素切断
地図であり、第５図は、エシェリヒア−コリＨＢ　／　
０　／　（ｐＣＸ、？／／）とバチルス・ＣＩ２に菌の
産生するキシラナーゼのＰＢ活性の同一性を示すグラフ
である。 特許出願人　理　化　学　研　究　所 鬼３図 Ｉ 培　１　時　間（にｒ） 第４図 ：　ｐＢＲ３２２ブラ又ミドＤＮＡ Ｑ区酩公郡図湖：　Ｒｆ）ｔｔス・ｃ　ｔｚｓｏＮＡ　
Ｋ片（キシラチー乞’ＤＮＡ断片） 特許庁長官　若杉和夫　殿 １．事イろ１の表示　昭和５８年特許願第２３２５０８
号３、補正をする者 事件との関係　出願人 名称　（６７９）理化学研究所 ４、代理人 図面中、第１図および第２図を別紙の通り訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　宿主にキシラナーゼの菌体外生産能を与えるグ
   ラスミドであって、その制限サイトのＨｌ　ｎｄｌｌサ
   イトにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　属に属する微
   生物のキシラナーゼの菌体外生産に関与する遺伝情＠を
   担うデオキシリポ核酸（ＤＮＡ）断片を却み込んだグラ
   スミド。 （２１グラスミドがｐＣＸ　、３　／　／　グラスミド
   である特許請求の範囲第（１１項記載のグラスミド。 （３）　グラスミドのベクターがｐＢＲＪ　２２　グラ
   スミドのＤＮＡである特許請求の範囲第＋１１項記載の
   １ラスミド。 （４）　バチルス属ＶｔＪｆ４する微生物がノｆチルス
   ”　（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　）・Ｃ／　２５　’ｅｌＪ　
   （微工研菌寄第ｑａｔＩｔＩ号）である特許請求の範囲
   第＋１１１１項記載ラスミド。 （５）　宿主がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ
   　）私に楓ｔ４微ヶ物苓ああ特許、え。１第（ｎ　＊　
   ｌｅ　＊’Ｆ）グラスミド。 （６）　エシェリヒア属に属する微生ｉがエシェリヒア
   ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏｌｔ　）　であ
   る特許請求の範囲第（６）項記載のグラスミド。 （７）　キシラナーゼの菌体外生産能を与えるＤＮＡ断
   片を制限酵素を用いて調製すること、前記ＤＮＡ断片の
   キシラナーゼの画体外生産に関与する遺伝情報を妨害し
   ない制限酵素を用いてグラスミドのベクターＤＮＡを制
   限すること、制限さｎた前記グラスミドのベクターＤＮ
   Ａの制限サイトのＨｌｎｄ　ｍ　サイトに前記ＤＮＡ断
   片を縮み換えること及び組換えらｎたグラスミド會抽出
   することから成るキシラナーゼの―体外生版に関与する
   遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込んだグラスミドの調
   製方法。 （８１グラスミドがｐＣＸ　３／　／　グラスミドであ
   る特許請求の範囲第（７）項記載の調製方法。 （９）　グラスミドのベクターとして、ρＢＲＪ２２ｆ
   ラスミドのＤＮＡ’ｉ用いる特許請求の範囲第（））項
   記載のグラスミドの調製方法。 α（Ｉ　ＤＮＡ断片が共チルス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　）
   　１１４に属する微生物のＤＮＡから調製されたＤＮＡ
   である竹許稍求の範囲第（７）項記載のグラス−ミドの
   調製方法。 ０１１　バチルス属に属する微生物がバチルス（Ｂａｃ
   ｌｌｌｕｓ　）−ＣＩ’２５　菌’（微工研―寄第り３
   ダ弘号）である特許請求の範囲第（１（Ｉ項記載のグラ
   スミドの調製方法。二 ０Ｘ５　キシラナ・÷ゼの菌体外生産能を有するエシェ
   リヒア・コリＨ８１０１（ｐＣｘ３／１）（Ｅｓｃｈｅ
   ｒｌｃｈｌａ　ｃａｌｌ　Ｈａ１０／　（ｐＣＸ　３／
   　／　）　〕。