JPS6030685A - 組換え体ｄνａ、その製造方法、それを含む枯草菌、及びこの枯草菌を用いたプロテア−ゼの製造方法 - Google Patents
組換え体ｄνａ、その製造方法、それを含む枯草菌、及びこの枯草菌を用いたプロテア−ゼの製造方法Info
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- JPS6030685A JPS6030685A JP13926183A JP13926183A JPS6030685A JP S6030685 A JPS6030685 A JP S6030685A JP 13926183 A JP13926183 A JP 13926183A JP 13926183 A JP13926183 A JP 13926183A JP S6030685 A JPS6030685 A JP S6030685A
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- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
この発明は、プロテアーゼをコードする遺伝子を組み込
んだ組換え体ＤＮＡ、その製造方法、それを含む枯草菌
及びこの枯草菌を用いたプロテアーゼの製造方法に関す
る。 プロテアーゼは、タンパク質やポリペプチドを分解する
能力を持った酵素であり、工業的に広く利用されている
。特に、バチルス属細菌である枯草菌又はその類縁菌の
プロテアーゼは、そのほとんどが菌体外ｌこ生産される
ため、皮革工業における皮なめし剤や、洗剤添加物など
として広く利用されている。 従来、枯草菌又はその類縁菌のプロテアーゼは、これら
菌からの発酵法で製造されている。 しかしながら、従来の発酵法では菌体量あたりの収量が
低く、夾雑する不純物が多いという欠点がある。さらに
、従来の発酵法では、複数種類のプロテアーゼ、例えば
中性プロテアーゼとアルカリ性プロテアーゼとを同時に
高収率で製造することが困難である。 この発明の目的は、菌体量あたりの収量が多く、不純物
の夾雑が少ない、プロテアーゼの製造方法を提供するこ
とである。才たこの発明の目的は、この製造方法に用い
られる組換え体ＤＮＡ及び枯草菌、並びに該組換え体Ｄ
ＮＡの製造方法を提供することである。 すなわち、この発明は、プロテアーゼをコードする遺伝
子を、枯草菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ、枯草
菌内で複製可能な組換え体ＤＮＡを提供する。また、こ
の発明は、プロテアーゼをコードする遺伝子を含む染色
体ＤＮＡを断片化する工程と、得られたＤＮＡ断片を枯
草菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んで組換え体ＤＮＡ
を作製する王権と、この組換え体ＤＮＡで枯草菌又はそ
の類縁菌を形鏑転換する工程と、形質転換された枯草菌
又はその類縁菌のうち、菌体外にプロテアーゼを産生ず
るものを選択する工程と、選択された枯草菌又はその類
縁菌から組換え体ＤＮＡを回収する工程とを含む、上述
したこの発明の組換え体ＤＮＡの製造方法を提供する。 さらにこの発明は、前記組換え体ＤＮＡを含む枯草菌を
提供する。さらにまた、この発明は、該枯Ｘ菌を培養す
る工程と、その培ｉ 物カらプロテアーゼを得る工程と
を含むプロテアーゼの製造方法を提供する。 この発明の組換え体ＤＮＡは、プロテアーゼをコードす
る遺伝子を、枯草菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ
、枯草菌内で複製可能なものである。この組換え体ＤＮ
Ａを構成する７Ｎｏツセンジヤー遺伝子は、プロテアー
ゼをフードするものであればいずれのものでもよい。好
１い遺伝子の例としで、バチルス属細菌、特に枯草菌又
はその類縁歯の中性プロテアーゼ又はアルカリ性プロテ
アーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。後述
する実施例では、これら両方のプロテアーゼの菌体外生
産が著しいバチルス・リケニホルミスＪ 株（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ Ｊ ）の、これ
ら両方のプロテアーゼをそれぞれフードする２個の遺伝
子を用いている。なお、バチルス・リケニホルミス３株
は、バチルス・リケニホルミス（ＡＴＣＣ１４５８０）
ヲニトロ゛ノグアニジン処理し、Ｄ−サイクロセリン
耐性コロニーを選択することによって得られたものであ
って、昭和５８年７月２３日に工業技術院微生物工業技
術研究所（微工研）に、受託番号微工研菌寄＠７１６７
号として寄託されている。もつとも、バチルス・リケニ
ホルミス３株以外の菌株であっても、プロテアーゼ産生
のさかんなものは好ましく用いることかできる。さらに
、Ａｓｐｅｒｇｔｌｌｕｓ ５ａｉｔｏｉやＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのようなアスペルギルスカ
ビが産生ずる酸性プロテアーゼをコードする遺伝子を用
いることもできる。 この発明の組換え体ＤＮＡに用いられるＤＮＡ導入ベク
ターは、枯草菌内で自己複製が可能であり、かつ適当な
マーカーをイイするものである。 このようなりＮＡ導入ベクターは、この分野において広
く知られている。例えば、、ＵＢ１１０プラスミド（
Ｋａｔｈｌｅｅｎ Ｍ − Ｋｅｇｇｉｎｓら、ＰｒＯ
Ｃ。 ＮａＨ 、Ａｃａｄ − Ｓｃｉ 、ＵＳＡ Ｖｏｌ．
７５ 、Ｎｏ．３ 。 ｐｐｌ ４ ２３ １ ４２ ７ 、 Ｍａｒｃｈ １
９７８ Ｅ’遺伝的
んだ組換え体ＤＮＡ、その製造方法、それを含む枯草菌
及びこの枯草菌を用いたプロテアーゼの製造方法に関す
る。 プロテアーゼは、タンパク質やポリペプチドを分解する
能力を持った酵素であり、工業的に広く利用されている
。特に、バチルス属細菌である枯草菌又はその類縁菌の
プロテアーゼは、そのほとんどが菌体外ｌこ生産される
ため、皮革工業における皮なめし剤や、洗剤添加物など
として広く利用されている。 従来、枯草菌又はその類縁菌のプロテアーゼは、これら
菌からの発酵法で製造されている。 しかしながら、従来の発酵法では菌体量あたりの収量が
低く、夾雑する不純物が多いという欠点がある。さらに
、従来の発酵法では、複数種類のプロテアーゼ、例えば
中性プロテアーゼとアルカリ性プロテアーゼとを同時に
高収率で製造することが困難である。 この発明の目的は、菌体量あたりの収量が多く、不純物
の夾雑が少ない、プロテアーゼの製造方法を提供するこ
とである。才たこの発明の目的は、この製造方法に用い
られる組換え体ＤＮＡ及び枯草菌、並びに該組換え体Ｄ
ＮＡの製造方法を提供することである。 すなわち、この発明は、プロテアーゼをコードする遺伝
子を、枯草菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ、枯草
菌内で複製可能な組換え体ＤＮＡを提供する。また、こ
の発明は、プロテアーゼをコードする遺伝子を含む染色
体ＤＮＡを断片化する工程と、得られたＤＮＡ断片を枯
草菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んで組換え体ＤＮＡ
を作製する王権と、この組換え体ＤＮＡで枯草菌又はそ
の類縁菌を形鏑転換する工程と、形質転換された枯草菌
又はその類縁菌のうち、菌体外にプロテアーゼを産生ず
るものを選択する工程と、選択された枯草菌又はその類
縁菌から組換え体ＤＮＡを回収する工程とを含む、上述
したこの発明の組換え体ＤＮＡの製造方法を提供する。 さらにこの発明は、前記組換え体ＤＮＡを含む枯草菌を
提供する。さらにまた、この発明は、該枯Ｘ菌を培養す
る工程と、その培ｉ 物カらプロテアーゼを得る工程と
を含むプロテアーゼの製造方法を提供する。 この発明の組換え体ＤＮＡは、プロテアーゼをコードす
る遺伝子を、枯草菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ
、枯草菌内で複製可能なものである。この組換え体ＤＮ
Ａを構成する７Ｎｏツセンジヤー遺伝子は、プロテアー
ゼをフードするものであればいずれのものでもよい。好
１い遺伝子の例としで、バチルス属細菌、特に枯草菌又
はその類縁歯の中性プロテアーゼ又はアルカリ性プロテ
アーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。後述
する実施例では、これら両方のプロテアーゼの菌体外生
産が著しいバチルス・リケニホルミスＪ 株（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ Ｊ ）の、これ
ら両方のプロテアーゼをそれぞれフードする２個の遺伝
子を用いている。なお、バチルス・リケニホルミス３株
は、バチルス・リケニホルミス（ＡＴＣＣ１４５８０）
ヲニトロ゛ノグアニジン処理し、Ｄ−サイクロセリン
耐性コロニーを選択することによって得られたものであ
って、昭和５８年７月２３日に工業技術院微生物工業技
術研究所（微工研）に、受託番号微工研菌寄＠７１６７
号として寄託されている。もつとも、バチルス・リケニ
ホルミス３株以外の菌株であっても、プロテアーゼ産生
のさかんなものは好ましく用いることかできる。さらに
、Ａｓｐｅｒｇｔｌｌｕｓ ５ａｉｔｏｉやＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのようなアスペルギルスカ
ビが産生ずる酸性プロテアーゼをコードする遺伝子を用
いることもできる。 この発明の組換え体ＤＮＡに用いられるＤＮＡ導入ベク
ターは、枯草菌内で自己複製が可能であり、かつ適当な
マーカーをイイするものである。 このようなりＮＡ導入ベクターは、この分野において広
く知られている。例えば、、ＵＢ１１０プラスミド（
Ｋａｔｈｌｅｅｎ Ｍ − Ｋｅｇｇｉｎｓら、ＰｒＯ
Ｃ。 ＮａＨ 、Ａｃａｄ − Ｓｃｉ 、ＵＳＡ Ｖｏｌ．
７５ 、Ｎｏ．３ 。 ｐｐｌ ４ ２３ １ ４２ ７ 、 Ｍａｒｃｈ １
９７８ Ｅ’遺伝的
【こ活性なバチルスＤＮＡ断片の
枯草直円での分子クローニング及びベクタープラスミド
、ＵＢ １ １０の性質」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖ
ｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｄ
ＮＡ ｉｎＢａｃ目１ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅｖｅｃｔｏｒ
ｐｌａｓｍｉｄ ｐＵＢｌｌｏ ” ） ｆＥ照）及び
ｐＣ１９４プラスミド（ Ｓｔａｎｉｓｌａｖ Ｄ−Ｅ
ｈｒｌｉｃｂら、Ｐ ｒ ｏ ｃ。 Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ 、ＵＳＡ Ｖｏｌ 、
７５，Ｎｏ３ 。 、、１ ４．３３ − １ ４３６ 、 Ｍａｒｃｈ
１ ９ ７８ ｒ枯草菌内でのＤ Ｉｉ Ａクローニン
グＪ （ ” Ｄ Ｎ Ａ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ”）参照）を挙げるこ
とができる。これら以外【こも多くの枯草菌用ベクター
が知られており、例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｊ−Ｇｒｙｃ
ｚａｎら、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ．Ｓｃｌ
、ＵＳＡ Ｖｏｌ 、 ７５，Ｎｏ．３。 ｐｐｌ４ ２８ １ ４３２ ＝ Ｍａｒｃｈ １ ９
７ ８ ｒ枯ｆｆＬ菌内のキメラ性プラスミドの造成
及び性質（ ’ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄ ｐ
ｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｌａ
ｓｍｉｄｓ ｉｎＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ目目Ｓ″）
に記載されている。なお、、ＵＢ］１０７’ラスミドを
含有するバチルス・ズブチリスＢＤ３６６’Ｍ株が、昭
ｆ［］５５８７７月２３に微工研に、微工研菌寄１；７
１７０号の受託番号で寄託された。 上述したこの発明の組換え体ＤＮＡは、次の５つの工程
を含む方法によって製造することができる。 第１工程 第１工程では、原料となる染色体ＤＮＡを細胞から抽出
し、これを断片化する。原料となる染色体ＤＮＡは、プ
ロテアーゼをコードする遺伝子を含むものである。この
遺伝子については上述したとおりである。従って、プロ
テアーゼ産生の茗しいバチルス属細菌，例えば上述した
バチルス・リケニホルミス等の染色体ＤＮＡ％好ましく
用いることができる，、 染色体Ｄ Ｎ Ａを細胞から抽出する操作は、広く知ら
れたフェノール法（ Ｋ 、 Ｍｉｕｒａ 、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ。 Ｂｌｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ７２．、、６１９ ６２９（
１９６３）参照）ｌこよって行なうことができる。 抽出した酵素を断片化する操作は、制限耐．素又は塩基
配列特異性のないエンドヌクレアーゼによって行なうこ
とができる。さらｌこまだ、機械的処理によって染色体
ＤＮＡを断片化することもＯＴ能である。 第２工程 第２工程では、第１工程で得た染色体ＤＮＡ断片を、枯
草１用ＤＮＡ４人ベクターに組み込んで組換え体ＤＮＡ
；３作製する。第１工程において、接着宋端を生じる制
限酵素を用いた場合には、同じｆｌ＋ｌＪ限酔素で先を
こ説明したＤＮＡ導入ベクターを切断し、第１工程で得
た染色体ＤＮＡ断片とアニーリングした後、Ｔ、ＤＮＡ
リガーゼや大腸菌Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼのようなり
Ｎ Ａ ＩＪガーセでこイｔらを連結することによって
組換え体ＤＮＡを作製すること炉できる。この場合、組
換えの効小を高めるだのに、Ｄ Ｎ Ａ ６人ベクター
を制限酵素で切断した後、広く万１られたＵｌ １ ｒ
ｉ ｃｈらの方法によるアルカリホスファ′ターセ処
理をこれに施ずことが奸才しい。 第１工程において、千渭末端を生じる制限酵素又は塩基
配列特異性のないエンドヌク１ノアーゼを用いた場合、
及び機械的処理によって染色体ＤＮＡを断片化した場合
には、適当な制限酵素でベクターを切断した後、広く知
られたホモポリマー結合法（高木康敬編著「遺伝子操作
実験法」講職社すイエンテイフイク参照）によって、染
色体ＤＮＡ断片とベクターとを結合することができる。 第３工程 第３工程では、卯、２工程で得た組換え体ＤＮＡで枯草
菌又はその穎紗菌を形質転換する。ここで言う「類縁菌
」とは、枯草菌用ＤＮＡ導入ベクターの少なくともある
ものがその内部で自己複製でき、かつプロテアーゼ遺伝
子を４１する組換え体ＤＮＡで形質転換された場合には
、プロテアーゼを菌体外に生産する性實を弔゛するバチ
ルス属細菌である。このような類縁閑の例として上述し
たバチルス・リケニホルミスを挙げることができる。 形質転換は、この分野において広く知られたＳ 、Ｃｈ
ａｎｇとＳ 、 Ｎ 、 Ｃｏｈｅｎの方法（Ｍｏ１ｅ
ｃ 。 ｇｅｎ 、 Ｇｅｎｅｔ 、１６８ ｐ。１１１−１１
５（１９７９）参照）に従い、先ず形質転換すべき細菌
をリゾチーム処理してプロトプラスト化した後、ポリエ
チレングリコールの存在下でこのプロトプラストに第２
工程で得た組換え体ＤＮＡを加えることによって行なう
ことかできる。 才た、枯草菌は増殖のあ、る段階で自然にＤＮＡを取り
込みやすい、いわゆるｃｏｍｐｅｔｅｎｔな状態になり
、プラスミドＤＮＡを取り込むことが知られている。従
って、菌がｃｏｍｐｅｔｅｒｕな状態にある時に組換え
体ＤＮＡを加えるさ、プロトプラスト化処卵を施すこと
なく形質転換を行なうことができる。 第４工程 第４工程では、形質転換された細菌のうち、原料染色体
ＤＮＡ中のプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を有す
る組換え体ＤＮＡで形質転換され、その結果、著量のプ
ロテアーゼを菌体外に生産する菌を選択する。 先ず、用いたＤＮＡ導入ベクターのマーカーによって、
組換え体ＤＮＡを含有する菌を一次選択する。ベクター
としてｐＵＢＩＩＯを用いた場合には、菌をカナマイシ
ン含有培地中で培養し、カナマイシン耐性菌を集菌する
。 次に、適当なタンパク質含弔物質、例えばスキムミルク
を含む栄養寒天培地上で、−次選択した菌を培養する。 そうすると、菌体外にプロテアーゼを生産する細菌コロ
ニーでは、プロテアーゼによってスキムミルク等のタン
パク含有物質が溶かされるため、コロニーの周辺部が透
明になって、大きなハロー（透明後）を生じる。 従って、このようなハローを有するコロニーの菌を二次
選択する。 第５工程 第５工程では、第４工程で二次選択した細菌から、［４
え体ＤＮＡを回収する。この回収は、上述したフェノー
ル法及び密度勾配遠心により各品に行なうことができる
。 このようにして得られた組換え体ＤＮＡで枯草菌又はそ
の類縁菌を形質転換することによって、高いプロテアー
ゼ生産能を有する＃１ＩｉＩ菌を得ることができる。好
才しい宿主菌株の例きして、広く知られたバチルス・ズ
ブチリス・マーブルグ１６８株（Ｂａｅｉｌｌｕａ ａ
ｕｂｔ口ｉｓ Ｍａｒｂｕ、ｒｇ １６Ｂ）由来の棹々
の変異株、例えはバチルス・ズブチル７１０１２株や、
あるいは上述したバチルス・リケニホルミスを埜げるこ
とかできる。なお、バチルス・ズブチル７１０１２株は
、バチルス・ズブチリス・マーブルグ１６８株をニトロ
ソグアニジンで処理して胞子形成能を欠失させ、ＤＮＡ
の摂取能力（ｃｏｍｐｅ ｔｅｎｃｙ ）を持たせるこ
とによって得られたものであり、昭和５８年７月２３日
に機工ωト菌寄第７１６８号として微工研に冨託された
。ｌうまでもなく、このようなプロテアーゼ生産菌は、
上述したＦ １’工程ないし第４工程を含む方法によっ
てもつくることができる。 このような１株を培養すると、培地中に多量のプロテア
ーゼを生産させることができる。従って、この発明はま
た、このような菌株を培薫する工程と、その培養液から
プロテアーゼを得る工程とを含むプロテアーゼの製造方
法を枦供する。 日株の培養は、炭素源、窒素源及び微量の金属元素を含
む培地で振盪することによって行なうことができろ。炭
素源として可溶性デンプン、ラクトース、又はグルコー
スを用いることができる。炭素源の濃度は通常０．１す
いし２０服竜％、好ましくは５重′ｌＦＸ′％程度であ
る。窒素源としては、ペプトン、コーンスチープリカー
、大豆カゼイン、尿素等の有機胛窒素の他、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム等の無侵襲窒素も用いること
ができる。窒素源の濃度は通常０．５ないし５重量％、
好ましくは３重量％程度である。また、微量金属として
リン酸ナトリウムと硫酸マグネシウムをそれぞれ０．０
０１ないし２重量％、好才しくはそれデれ０．６重量％
、０．１重量％添加するとプロテアーゼの生産が高マル
。炭酸カルシウムを０．０５ないし０．５重量％、好ま
しくは０．２重量％程度さらに添加すると、プロテアー
ゼの生産が特に高まる。培地のｐＨは通常５．５ないし
９．０、好ましくは約６．５であり、培養温度は通常２
５ないし４５℃、好ましくは約３７℃である。 このような培養によって得られた培−＃液から、遠心分
離によって菌体を除去することにより、プロテアーゼを
高濃度に含む溶液が得られる。 プロテアーゼタンパク質の分離は、常法である、硫酸ア
ンモニウムを用いた塩析や、エタノール又はアセトンを
用いた有向溶媒処理により、容易に収率よく行なうこ吉
ができる。溶液が複数のプロテアーゼ、例えば後述する
Ｗｆ−ＭＪｊ例のように中性プロテアーゼ吉アルカリ性
プロテアーゼとを有する場合には、必要に応じ、粗プロ
テアーゼ画分を通常のカラムクロマトグラフィーによっ
て容易に分離、精梨することができる。もつとも、それ
ら１夏数のプロテアーゼｌ占性をともに有していること
が望まれる場合には、この両活性をＪ４Ｍ強せしめた培
養液の粗精製物をそのまま用いることができる。 実権列１ 、ＡＮＺ組換え体ＤＮＡ及びこれを保持する菌株の調製 バチルス・リケニホルミス１株をＬ−培地（ペプトン１
重量％、酵母エキス０．５重量％、食塩０１５重量％、
グルコース０．１重量％、精製水残部）中で対数増殖期
才で生育させた後集菌し、生理的食塩水（０，８５重量
％）で１回洗浄した。このようにして得られた菌体２．
７Ｆ（湿重量）からフェノール法によって染色体ＤＮＡ
を抽出し、約１．２ ｑのＤＮＡを得た。この染色体Ｄ
ＮＡの２μｍをＥｃｏＲＩで３７℃で３０分間処理して
断片化した。 １μノのプラスミドベクター、ＵＢＩＩＯをＥ ｃｏＲ
Ｉで３７℃で２時間処理した後、Ｕｌｌｒｉｃｈらの方
法（５ｃｉｅｎｃｅ １９６ 、ｐ１３１３−１３１９
（１９７７））でアルカリホスファターゼ処理した。こ
れを上記染色体ＤＮＡ断片と混合し、４．５単位Ｔ 、
ＤＮＡリガーゼで１０℃で１６時間処理して組換え体
ＤＮＡを調製した。 バチルス・ズブチリス１０１２をＬ −ｂｒｏｔｂ（バ
タトペブトン１０）、イーストエキス５Ｆ。 ＮａＣｌ！５Ｆ、クルコース］ｙ％邦天１２７ζこ水を
加えて１１にしたもの）で前培養し、スビセセン最小培
地（Ｋ２ＨＰＯ４１，４ｙ、 ＫＨ２Ｐ０．６ ｙ。 （ＮＨ４）、Ｓｏ、２ ｙ、クエン酸２ナトリウム】ｙ
、ＭｙＳＯ＜・７Ｈ２００，２Ｐ、グルコース５ＩＣこ
水を加えて１１にしたもの）で対数末期（２，５〜３．
５時間）まで増殖させ、さらに新たなスビゼゼン最小培
地で１，５時間振盪培養し、遠心分離により集菌した。 上述の工程で得た組換え体ＤＮＡ溶液１００μｌをこの
菌に加え、Ｌ ｂｒｏｔｈで２時間培養して形質転換を
行なった。 組換え体ＤＮＡ保持保持−次選択するため、１５０μ９
／ ｍｌのカナ−フィシンを含む培地（４％寒天２０
０ ｍｌ、１Ｍコハク酸す１−リウム（、Ｈ７，３）５
００ｄ、５％カザミノ酸１００ｍ１，１０％イーストエ
キス５０ｍＪ、３．５％リン酸２カリウムと１５％リン
酸１カリウムとの混合物１００ｄ。 １Ｍ塩化マグネシウム２０ｍ１，２％子ウシ血清アルブ
ミン５ゴを混合しく全１１１）、これに１５０Ｔｎ９の
カナマイシンを添加したもの）で３７℃で４０時間培養
した。生存菌を１重量％のスキムミルク及び１重量％の
寒天を含むＬ−培地上で３７゛Ｃで１６時間培養した。 大きなハローを周囲に廟゛するコロニーが２つ得られた
。 大きい方のハローを有するコロニーの菌株を釣菌するこ
とにより、閑体外プロテアーゼ高生産菌、すなイっち、
プロテアーゼ遺伝子を有する組換え体ＤＮＡを保持する
菌株を得た。この菌株をバチルス・ズブチリスＩ Ｕ
１２／ 、ＡＮ２と名ずけ、昭和５８年７月２３日に微
工研に寄託した（機工＠菌寄罪７１６９号）。なお、こ
の菌の菌学的性質は、プロテアーゼ生産能力か極めて高
いこと、胞子形成能がないことを除き、広く知られたバ
チルスーズブナルス・マーブルク１６８株の菌学的性質
と同じである。 バチルス・ズブチリス１０１２／、ＡＮ２からフェノー
ル法によりＤＮＡを抽出し、新顔勾配遠心で組換え体Ｄ
ＮＡを大量に集めた。この組換え体ＤＮＡを、ＡＮ２と
名ずけた。 、ＡＮ２の制御ＸＩ！酔素地図を作成した。これは図に
示されている。図中、黒く塗りつぶされている部分がバ
チルス・リケニホルミス５株の染色体断片であり、白い
部分が、ＵＢＩＩＯ由来の部分である。、ＡＩ’Ｊ２の
分子弁は５．４メガダルトン（Ｍａ）であり１．ＵＢＩ
ＩＯのＥｃｏＲＩ切断部位に２．４Ｍｄのバチルス・リ
ケニホルミス１株由来のＤＮＡｔｌｉ片が組み適才れて
いる。 このようにして得られた形質転換株、バチルス・ズブチ
リス１０１２／ｐＡＮ２の中性及びアルカリ性プロテア
ーゼ活性を調べた。各酵素活性はＳＳＰ培地（１（）重
量％可溶性デンプン、３重量％ペプトン、０．３重量％
ＫＨ２ＰＯ，，０３重量％ＭＩＳ０４・７Ｈ２０，０，
２３ｉｉ％Ｃ’ａＣＱ３、洩部鞘製水１．Ｈ６，５）で
２日間培養した時の培養液を用いて調べた。才だ、対照
として、全く同じ条件で培養したバチルス・ズブチル３
１０１２株及びバチルス・リケニホルミス５株の酵素活
性も測定した。結果を紀１表に示す。なお、酵素活性の
測定は、常法である、ジャーナルオブバイオケミストリ
ー、土５ 、 ｐ、１８５−１９４（１９５８）記載の
方法に従った。 ＠１表 実施例２ 第１表に記載の菌体を１０００ｍｇのｓｓＰ培地に接種
し、３０ ℃で５日間振盪培養した。遠心分離して菌体
を除き、培養上清を集めた。この培養上清をこ硫酸アン
モニウムを７０重号％となるように添加し、沈＃部分を
遇【心分離して鋳めた。この操作により、１０１２／ｐ
ＡＮ２株では７．２Ｆ、１０１２株では０．ＩＰ！、バ
チルス・リケニホルミス５株では５．０ ｆ／ ０．）
徂プロテアーゼタンパク質が得られた。 実施例３ 実施例２で得られた沈殿を、２ ｍＭの酢酸カルシウム
を含む２０ ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（、Ｈ８，Ｏ）
に浴かし、この緩衝液に対して１佼透析した。このよう
にして得られた粗タンパク質溶液をＤＥＡＫ−セファデ
ックスＡ−５０を用いたカラムクロマｉ・グラフィーに
かけ、中性及びアルカリ性プロテアーゼにそれぞれ分離
、精製した。これらの齢素タンパク１゛は第２表に示す
とおりであった。 第 ２ 表 実施例４ 第１表に示す３つの菌株を、６重量％乳糖、１．４重量
％大豆カゼイン、０．６重量％リン酸二水素ナトリウム
、１．４Ｍ量％リン酸−水素ナトリウム、０．２重ｉ％
硫酸マグネシウム７水塩、０．２重ｉｔ％炭酸カルシウ
ム、残部精製水から成るｐ Ｈ６６５の培地で３０℃で
３日間培養し、培養上清のプロテアーゼ活性を測定した
。結果を第３表に示す。 第３表 実施例５ 実施例４に記載した方法で培養したバチルス・ズブチリ
ス１０１２／、ＡＮ２林の培養上清を悼心分離により集
め、これに２倍答のエタノールを加えて０℃で１夜放置
した。生じた沈殿を遠心分離により集めた。この操作で
４ｙの柑プロテアーゼが得られた。 この発明によると、プロテアーゼを高収惠、高純度で製
造することができる。
枯草直円での分子クローニング及びベクタープラスミド
、ＵＢ １ １０の性質」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖ
ｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｄ
ＮＡ ｉｎＢａｃ目１ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅｖｅｃｔｏｒ
ｐｌａｓｍｉｄ ｐＵＢｌｌｏ ” ） ｆＥ照）及び
ｐＣ１９４プラスミド（ Ｓｔａｎｉｓｌａｖ Ｄ−Ｅ
ｈｒｌｉｃｂら、Ｐ ｒ ｏ ｃ。 Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ 、ＵＳＡ Ｖｏｌ 、
７５，Ｎｏ３ 。 、、１ ４．３３ − １ ４３６ 、 Ｍａｒｃｈ
１ ９ ７８ ｒ枯草菌内でのＤ Ｉｉ Ａクローニン
グＪ （ ” Ｄ Ｎ Ａ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ”）参照）を挙げるこ
とができる。これら以外【こも多くの枯草菌用ベクター
が知られており、例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｊ−Ｇｒｙｃ
ｚａｎら、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ．Ｓｃｌ
、ＵＳＡ Ｖｏｌ 、 ７５，Ｎｏ．３。 ｐｐｌ４ ２８ １ ４３２ ＝ Ｍａｒｃｈ １ ９
７ ８ ｒ枯ｆｆＬ菌内のキメラ性プラスミドの造成
及び性質（ ’ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄ ｐ
ｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｌａ
ｓｍｉｄｓ ｉｎＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ目目Ｓ″）
に記載されている。なお、、ＵＢ］１０７’ラスミドを
含有するバチルス・ズブチリスＢＤ３６６’Ｍ株が、昭
ｆ［］５５８７７月２３に微工研に、微工研菌寄１；７
１７０号の受託番号で寄託された。 上述したこの発明の組換え体ＤＮＡは、次の５つの工程
を含む方法によって製造することができる。 第１工程 第１工程では、原料となる染色体ＤＮＡを細胞から抽出
し、これを断片化する。原料となる染色体ＤＮＡは、プ
ロテアーゼをコードする遺伝子を含むものである。この
遺伝子については上述したとおりである。従って、プロ
テアーゼ産生の茗しいバチルス属細菌，例えば上述した
バチルス・リケニホルミス等の染色体ＤＮＡ％好ましく
用いることができる，、 染色体Ｄ Ｎ Ａを細胞から抽出する操作は、広く知ら
れたフェノール法（ Ｋ 、 Ｍｉｕｒａ 、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ。 Ｂｌｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ７２．、、６１９ ６２９（
１９６３）参照）ｌこよって行なうことができる。 抽出した酵素を断片化する操作は、制限耐．素又は塩基
配列特異性のないエンドヌクレアーゼによって行なうこ
とができる。さらｌこまだ、機械的処理によって染色体
ＤＮＡを断片化することもＯＴ能である。 第２工程 第２工程では、第１工程で得た染色体ＤＮＡ断片を、枯
草１用ＤＮＡ４人ベクターに組み込んで組換え体ＤＮＡ
；３作製する。第１工程において、接着宋端を生じる制
限酵素を用いた場合には、同じｆｌ＋ｌＪ限酔素で先を
こ説明したＤＮＡ導入ベクターを切断し、第１工程で得
た染色体ＤＮＡ断片とアニーリングした後、Ｔ、ＤＮＡ
リガーゼや大腸菌Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼのようなり
Ｎ Ａ ＩＪガーセでこイｔらを連結することによって
組換え体ＤＮＡを作製すること炉できる。この場合、組
換えの効小を高めるだのに、Ｄ Ｎ Ａ ６人ベクター
を制限酵素で切断した後、広く万１られたＵｌ １ ｒ
ｉ ｃｈらの方法によるアルカリホスファ′ターセ処
理をこれに施ずことが奸才しい。 第１工程において、千渭末端を生じる制限酵素又は塩基
配列特異性のないエンドヌク１ノアーゼを用いた場合、
及び機械的処理によって染色体ＤＮＡを断片化した場合
には、適当な制限酵素でベクターを切断した後、広く知
られたホモポリマー結合法（高木康敬編著「遺伝子操作
実験法」講職社すイエンテイフイク参照）によって、染
色体ＤＮＡ断片とベクターとを結合することができる。 第３工程 第３工程では、卯、２工程で得た組換え体ＤＮＡで枯草
菌又はその穎紗菌を形質転換する。ここで言う「類縁菌
」とは、枯草菌用ＤＮＡ導入ベクターの少なくともある
ものがその内部で自己複製でき、かつプロテアーゼ遺伝
子を４１する組換え体ＤＮＡで形質転換された場合には
、プロテアーゼを菌体外に生産する性實を弔゛するバチ
ルス属細菌である。このような類縁閑の例として上述し
たバチルス・リケニホルミスを挙げることができる。 形質転換は、この分野において広く知られたＳ 、Ｃｈ
ａｎｇとＳ 、 Ｎ 、 Ｃｏｈｅｎの方法（Ｍｏ１ｅ
ｃ 。 ｇｅｎ 、 Ｇｅｎｅｔ 、１６８ ｐ。１１１−１１
５（１９７９）参照）に従い、先ず形質転換すべき細菌
をリゾチーム処理してプロトプラスト化した後、ポリエ
チレングリコールの存在下でこのプロトプラストに第２
工程で得た組換え体ＤＮＡを加えることによって行なう
ことかできる。 才た、枯草菌は増殖のあ、る段階で自然にＤＮＡを取り
込みやすい、いわゆるｃｏｍｐｅｔｅｎｔな状態になり
、プラスミドＤＮＡを取り込むことが知られている。従
って、菌がｃｏｍｐｅｔｅｒｕな状態にある時に組換え
体ＤＮＡを加えるさ、プロトプラスト化処卵を施すこと
なく形質転換を行なうことができる。 第４工程 第４工程では、形質転換された細菌のうち、原料染色体
ＤＮＡ中のプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を有す
る組換え体ＤＮＡで形質転換され、その結果、著量のプ
ロテアーゼを菌体外に生産する菌を選択する。 先ず、用いたＤＮＡ導入ベクターのマーカーによって、
組換え体ＤＮＡを含有する菌を一次選択する。ベクター
としてｐＵＢＩＩＯを用いた場合には、菌をカナマイシ
ン含有培地中で培養し、カナマイシン耐性菌を集菌する
。 次に、適当なタンパク質含弔物質、例えばスキムミルク
を含む栄養寒天培地上で、−次選択した菌を培養する。 そうすると、菌体外にプロテアーゼを生産する細菌コロ
ニーでは、プロテアーゼによってスキムミルク等のタン
パク含有物質が溶かされるため、コロニーの周辺部が透
明になって、大きなハロー（透明後）を生じる。 従って、このようなハローを有するコロニーの菌を二次
選択する。 第５工程 第５工程では、第４工程で二次選択した細菌から、［４
え体ＤＮＡを回収する。この回収は、上述したフェノー
ル法及び密度勾配遠心により各品に行なうことができる
。 このようにして得られた組換え体ＤＮＡで枯草菌又はそ
の類縁菌を形質転換することによって、高いプロテアー
ゼ生産能を有する＃１ＩｉＩ菌を得ることができる。好
才しい宿主菌株の例きして、広く知られたバチルス・ズ
ブチリス・マーブルグ１６８株（Ｂａｅｉｌｌｕａ ａ
ｕｂｔ口ｉｓ Ｍａｒｂｕ、ｒｇ １６Ｂ）由来の棹々
の変異株、例えはバチルス・ズブチル７１０１２株や、
あるいは上述したバチルス・リケニホルミスを埜げるこ
とかできる。なお、バチルス・ズブチル７１０１２株は
、バチルス・ズブチリス・マーブルグ１６８株をニトロ
ソグアニジンで処理して胞子形成能を欠失させ、ＤＮＡ
の摂取能力（ｃｏｍｐｅ ｔｅｎｃｙ ）を持たせるこ
とによって得られたものであり、昭和５８年７月２３日
に機工ωト菌寄第７１６８号として微工研に冨託された
。ｌうまでもなく、このようなプロテアーゼ生産菌は、
上述したＦ １’工程ないし第４工程を含む方法によっ
てもつくることができる。 このような１株を培養すると、培地中に多量のプロテア
ーゼを生産させることができる。従って、この発明はま
た、このような菌株を培薫する工程と、その培養液から
プロテアーゼを得る工程とを含むプロテアーゼの製造方
法を枦供する。 日株の培養は、炭素源、窒素源及び微量の金属元素を含
む培地で振盪することによって行なうことができろ。炭
素源として可溶性デンプン、ラクトース、又はグルコー
スを用いることができる。炭素源の濃度は通常０．１す
いし２０服竜％、好ましくは５重′ｌＦＸ′％程度であ
る。窒素源としては、ペプトン、コーンスチープリカー
、大豆カゼイン、尿素等の有機胛窒素の他、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム等の無侵襲窒素も用いること
ができる。窒素源の濃度は通常０．５ないし５重量％、
好ましくは３重量％程度である。また、微量金属として
リン酸ナトリウムと硫酸マグネシウムをそれぞれ０．０
０１ないし２重量％、好才しくはそれデれ０．６重量％
、０．１重量％添加するとプロテアーゼの生産が高マル
。炭酸カルシウムを０．０５ないし０．５重量％、好ま
しくは０．２重量％程度さらに添加すると、プロテアー
ゼの生産が特に高まる。培地のｐＨは通常５．５ないし
９．０、好ましくは約６．５であり、培養温度は通常２
５ないし４５℃、好ましくは約３７℃である。 このような培養によって得られた培−＃液から、遠心分
離によって菌体を除去することにより、プロテアーゼを
高濃度に含む溶液が得られる。 プロテアーゼタンパク質の分離は、常法である、硫酸ア
ンモニウムを用いた塩析や、エタノール又はアセトンを
用いた有向溶媒処理により、容易に収率よく行なうこ吉
ができる。溶液が複数のプロテアーゼ、例えば後述する
Ｗｆ−ＭＪｊ例のように中性プロテアーゼ吉アルカリ性
プロテアーゼとを有する場合には、必要に応じ、粗プロ
テアーゼ画分を通常のカラムクロマトグラフィーによっ
て容易に分離、精梨することができる。もつとも、それ
ら１夏数のプロテアーゼｌ占性をともに有していること
が望まれる場合には、この両活性をＪ４Ｍ強せしめた培
養液の粗精製物をそのまま用いることができる。 実権列１ 、ＡＮＺ組換え体ＤＮＡ及びこれを保持する菌株の調製 バチルス・リケニホルミス１株をＬ−培地（ペプトン１
重量％、酵母エキス０．５重量％、食塩０１５重量％、
グルコース０．１重量％、精製水残部）中で対数増殖期
才で生育させた後集菌し、生理的食塩水（０，８５重量
％）で１回洗浄した。このようにして得られた菌体２．
７Ｆ（湿重量）からフェノール法によって染色体ＤＮＡ
を抽出し、約１．２ ｑのＤＮＡを得た。この染色体Ｄ
ＮＡの２μｍをＥｃｏＲＩで３７℃で３０分間処理して
断片化した。 １μノのプラスミドベクター、ＵＢＩＩＯをＥ ｃｏＲ
Ｉで３７℃で２時間処理した後、Ｕｌｌｒｉｃｈらの方
法（５ｃｉｅｎｃｅ １９６ 、ｐ１３１３−１３１９
（１９７７））でアルカリホスファターゼ処理した。こ
れを上記染色体ＤＮＡ断片と混合し、４．５単位Ｔ 、
ＤＮＡリガーゼで１０℃で１６時間処理して組換え体
ＤＮＡを調製した。 バチルス・ズブチリス１０１２をＬ −ｂｒｏｔｂ（バ
タトペブトン１０）、イーストエキス５Ｆ。 ＮａＣｌ！５Ｆ、クルコース］ｙ％邦天１２７ζこ水を
加えて１１にしたもの）で前培養し、スビセセン最小培
地（Ｋ２ＨＰＯ４１，４ｙ、 ＫＨ２Ｐ０．６ ｙ。 （ＮＨ４）、Ｓｏ、２ ｙ、クエン酸２ナトリウム】ｙ
、ＭｙＳＯ＜・７Ｈ２００，２Ｐ、グルコース５ＩＣこ
水を加えて１１にしたもの）で対数末期（２，５〜３．
５時間）まで増殖させ、さらに新たなスビゼゼン最小培
地で１，５時間振盪培養し、遠心分離により集菌した。 上述の工程で得た組換え体ＤＮＡ溶液１００μｌをこの
菌に加え、Ｌ ｂｒｏｔｈで２時間培養して形質転換を
行なった。 組換え体ＤＮＡ保持保持−次選択するため、１５０μ９
／ ｍｌのカナ−フィシンを含む培地（４％寒天２０
０ ｍｌ、１Ｍコハク酸す１−リウム（、Ｈ７，３）５
００ｄ、５％カザミノ酸１００ｍ１，１０％イーストエ
キス５０ｍＪ、３．５％リン酸２カリウムと１５％リン
酸１カリウムとの混合物１００ｄ。 １Ｍ塩化マグネシウム２０ｍ１，２％子ウシ血清アルブ
ミン５ゴを混合しく全１１１）、これに１５０Ｔｎ９の
カナマイシンを添加したもの）で３７℃で４０時間培養
した。生存菌を１重量％のスキムミルク及び１重量％の
寒天を含むＬ−培地上で３７゛Ｃで１６時間培養した。 大きなハローを周囲に廟゛するコロニーが２つ得られた
。 大きい方のハローを有するコロニーの菌株を釣菌するこ
とにより、閑体外プロテアーゼ高生産菌、すなイっち、
プロテアーゼ遺伝子を有する組換え体ＤＮＡを保持する
菌株を得た。この菌株をバチルス・ズブチリスＩ Ｕ
１２／ 、ＡＮ２と名ずけ、昭和５８年７月２３日に微
工研に寄託した（機工＠菌寄罪７１６９号）。なお、こ
の菌の菌学的性質は、プロテアーゼ生産能力か極めて高
いこと、胞子形成能がないことを除き、広く知られたバ
チルスーズブナルス・マーブルク１６８株の菌学的性質
と同じである。 バチルス・ズブチリス１０１２／、ＡＮ２からフェノー
ル法によりＤＮＡを抽出し、新顔勾配遠心で組換え体Ｄ
ＮＡを大量に集めた。この組換え体ＤＮＡを、ＡＮ２と
名ずけた。 、ＡＮ２の制御ＸＩ！酔素地図を作成した。これは図に
示されている。図中、黒く塗りつぶされている部分がバ
チルス・リケニホルミス５株の染色体断片であり、白い
部分が、ＵＢＩＩＯ由来の部分である。、ＡＩ’Ｊ２の
分子弁は５．４メガダルトン（Ｍａ）であり１．ＵＢＩ
ＩＯのＥｃｏＲＩ切断部位に２．４Ｍｄのバチルス・リ
ケニホルミス１株由来のＤＮＡｔｌｉ片が組み適才れて
いる。 このようにして得られた形質転換株、バチルス・ズブチ
リス１０１２／ｐＡＮ２の中性及びアルカリ性プロテア
ーゼ活性を調べた。各酵素活性はＳＳＰ培地（１（）重
量％可溶性デンプン、３重量％ペプトン、０．３重量％
ＫＨ２ＰＯ，，０３重量％ＭＩＳ０４・７Ｈ２０，０，
２３ｉｉ％Ｃ’ａＣＱ３、洩部鞘製水１．Ｈ６，５）で
２日間培養した時の培養液を用いて調べた。才だ、対照
として、全く同じ条件で培養したバチルス・ズブチル３
１０１２株及びバチルス・リケニホルミス５株の酵素活
性も測定した。結果を紀１表に示す。なお、酵素活性の
測定は、常法である、ジャーナルオブバイオケミストリ
ー、土５ 、 ｐ、１８５−１９４（１９５８）記載の
方法に従った。 ＠１表 実施例２ 第１表に記載の菌体を１０００ｍｇのｓｓＰ培地に接種
し、３０ ℃で５日間振盪培養した。遠心分離して菌体
を除き、培養上清を集めた。この培養上清をこ硫酸アン
モニウムを７０重号％となるように添加し、沈＃部分を
遇【心分離して鋳めた。この操作により、１０１２／ｐ
ＡＮ２株では７．２Ｆ、１０１２株では０．ＩＰ！、バ
チルス・リケニホルミス５株では５．０ ｆ／ ０．）
徂プロテアーゼタンパク質が得られた。 実施例３ 実施例２で得られた沈殿を、２ ｍＭの酢酸カルシウム
を含む２０ ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（、Ｈ８，Ｏ）
に浴かし、この緩衝液に対して１佼透析した。このよう
にして得られた粗タンパク質溶液をＤＥＡＫ−セファデ
ックスＡ−５０を用いたカラムクロマｉ・グラフィーに
かけ、中性及びアルカリ性プロテアーゼにそれぞれ分離
、精製した。これらの齢素タンパク１゛は第２表に示す
とおりであった。 第 ２ 表 実施例４ 第１表に示す３つの菌株を、６重量％乳糖、１．４重量
％大豆カゼイン、０．６重量％リン酸二水素ナトリウム
、１．４Ｍ量％リン酸−水素ナトリウム、０．２重ｉ％
硫酸マグネシウム７水塩、０．２重ｉｔ％炭酸カルシウ
ム、残部精製水から成るｐ Ｈ６６５の培地で３０℃で
３日間培養し、培養上清のプロテアーゼ活性を測定した
。結果を第３表に示す。 第３表 実施例５ 実施例４に記載した方法で培養したバチルス・ズブチリ
ス１０１２／、ＡＮ２林の培養上清を悼心分離により集
め、これに２倍答のエタノールを加えて０℃で１夜放置
した。生じた沈殿を遠心分離により集めた。この操作で
４ｙの柑プロテアーゼが得られた。 この発明によると、プロテアーゼを高収惠、高純度で製
造することができる。
図はｐＡＮ２の制限酵素切断地図を示す。
出願人イーリ人 プル埋土 鈴 江 武 彦手続補正書
昭和５ｂ年゛、・５月゛１゛１日
特許庁長官 若 杉 和 夫 殿
■、事件の表示
特願昭５８−１３９２６１号
３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
（６７６） ライオ／株式会社
４、代理人
６、補正の刻象
委任状、明細書全文
７、補正の内容
（１）委任状を別紙の通電補正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） プロテアーゼをコードする遺伝子を、枯草菌用
ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ、枯草菌内で複製可能
な組換え体ＤＮＡ０ （２） 前記遺伝子は、バチルス属細菌の染色体中ζこ
存在し、該細菌によって菌体外に生産される中性プロテ
アーゼ又はアルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝子
である特許請求の範囲第１項記載の組換え体ＤＮＡ０ （３） 前記遺伝子は、バチルス属細菌の染色体中に存
在し、該細菌によって菌体外に生産される中性プロテア
ーゼとアルカリ性プロテアーゼとをそれぞれコードする
２個の遺伝子である特許請求の範囲第１項記載の組換え
体ＤＮＡ。 （４） 前記バチルス属細菌はバチルス・リケニホルミ
スである１１￥許請求の範囲第３項記載の組換え体ＤＮ
Ａ。 （５） 、ＡＮ２である特許請求の範囲第４項記載の組
換え体ＤＮＡ。 （６） プロテアーゼをコードする遺伝子を含む染色体
ＤＮＡを断片化する工程と、得られたＤＮＡ断片を枯草
菌用ＤＮＡ；ｌ入ベクターに組み込んで組換え体ＤＮＡ
を作製する工程と、該組換え体ＤＮＡで枯草菌又はその
類縁菌を形質転換する工程と、形質転換された枯草菌又
はその類縁菌のうち、菌体外にプロテアーゼを産生ずる
ものを選択する工程と、選択された枯草菌又はその類縁
菌から前記組換え体ＤＮＡを回収する工程とを含む組換
え体ＤＮＡの製造方法。 （７） 前記染色体ＤＮＡは、菌体外に中性プロテアー
ゼ及びアルカリ性プロテアーゼを産生ずるバチルス属細
菌のものである特許請求の範囲第６項記載の方法。 （８）前記バチルス属細菌はバチルス・リケニホルミス
である特許請求の範囲第６項記載の方法。 （９） 前記ＤＮＡ導入ベクターは、ＵＢＩＩＯである
特許請求の範囲８１！６項記載の方法。 Ｑｏ プロテアーゼをコードする遺伝子を、枯草菌用Ｄ
ＮＡ導入ベクターに組込んだ、枯草菌内で複製可能な組
換え体ＤＮＡを含有する枯草菌。 αυ バチルス・ズブチリス１０１２／、ＡＮ２である
特許請求の範囲第１０項記載の枯草菌。 （６） プロテアーゼをコードする遺伝子を、枯草菌用
ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ、枯草菌内で複製可能
な組換え体ＤＮＡを含有する枯草菌又はその類縁菌を培
養する工程と、その培養物からプロテアーゼを得る工程
とを含むプロテアーゼの製造方法。 ０ 前記組換え体ＤＮＡを含有する枯草菌はバチルス・
ズブチリス１０１２／ｐＡＮ ２である特許請求の範囲
第１２項記載の方法。 α◆ プロテアーゼをコードする遺伝子を含む染色体Ｄ
ＮＡを断片化する工程と、得られたＤＮＡ断片を枯草菌
用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んで組換え体ＤＮＡを作
製する工程と、該組換え体ＤＮＡで枯草菌又はその類縁
菌を形質転換する工程と、形質転換された枯草菌れた枯
草菌又はその類縁菌を培養する工程と、その培養物から
プロテアーゼを得る工程とを含むプロテアーゼの製造方
法。 （へ）前記染色体ＤＮＡは、菌体処暑こ中性プロテアー
ゼ及びアルカリ性プロテアーゼを産生ずるバチルス属細
菌のものである特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ００ 前記バチルス属細菌はバチルス・リケニホルミス
である特許請求の範囲第１５項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13926183A JPS6030685A (ja) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | 組換え体ｄνａ、その製造方法、それを含む枯草菌、及びこの枯草菌を用いたプロテア−ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13926183A JPS6030685A (ja) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | 組換え体ｄνａ、その製造方法、それを含む枯草菌、及びこの枯草菌を用いたプロテア−ゼの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6030685A true JPS6030685A (ja) | 1985-02-16 |
Family
ID=15241165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13926183A Pending JPS6030685A (ja) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | 組換え体ｄνａ、その製造方法、それを含む枯草菌、及びこの枯草菌を用いたプロテア−ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6030685A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60239324A (ja) * | 1984-02-20 | 1985-11-28 | ロ−ヌ−プ−ラン・スペシアリテ・シミ−ク | 新規な形態的特徴をもつ酸化第二セリウムの製造方法 |
| EP0214435A2 (de) * | 1985-08-03 | 1987-03-18 | Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien | Alkalische Protease, Verfahren zur Herstellung von Hybridvektoren und genetisch transformierte Mikroorganismen |
| EP0261009A1 (fr) | 1986-08-18 | 1988-03-23 | Institut Pasteur | Sequence d'ADN exercant une fonction se manifestant par une surproduction de protéines exocellulaires par diverses souches de bacillus, et vecteurs contenant cette séquence |
-
1983
- 1983-07-29 JP JP13926183A patent/JPS6030685A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60239324A (ja) * | 1984-02-20 | 1985-11-28 | ロ−ヌ−プ−ラン・スペシアリテ・シミ−ク | 新規な形態的特徴をもつ酸化第二セリウムの製造方法 |
| JPH0324411B2 (ja) * | 1984-02-20 | 1991-04-03 | Roonu Puuran Supeshiarite Shimiiku | |
| EP0214435A2 (de) * | 1985-08-03 | 1987-03-18 | Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien | Alkalische Protease, Verfahren zur Herstellung von Hybridvektoren und genetisch transformierte Mikroorganismen |
| EP0261009A1 (fr) | 1986-08-18 | 1988-03-23 | Institut Pasteur | Sequence d'ADN exercant une fonction se manifestant par une surproduction de protéines exocellulaires par diverses souches de bacillus, et vecteurs contenant cette séquence |
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