JPH04187089A - ミンク成長ホルモン遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ミンク成長ホルモン遺伝子に関する。

〔従来の技術〕

従来、イタチ科に属するミンク由来の成長ホルモン遺伝
子の構造については、全く未知であり、また、該遺伝子
の単離すらされていないのか実情である。

成長ホルモンは動物の脳下垂体に存在する成長を促進さ
せる蛋白質ホルモンであり、精製した成長ホルモンを元
の動物に投与すると成長促進が見られることが知られて
いる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、成長ホルモン遺伝子を提供することを目的と
するものである。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、ミンク由来の成長ホルモン遺伝
子について種々検討した結果、ミンク由来の成熟成長ホ
ルモン蛋白質をコードする成長ホルモン遺伝子の単離及
びその構造を決定することに成功し、本発明を完成した
。

すなわち、本発明は、イタチ科属のミンクに由来し、下
記の制限酵素開裂地図で規定される成長ホルモン遺伝子
であり、 ＥＰ　　　　　　　　Ｓ　　　　　　　Ｐｌｌｌｌｌは
ＥａｅＩ、　ＰはＰｖｕＩＩ、　ＳはＳｍａＩを示す）
また本発明は第３図に示されるアミノ酸配列をコードす
る塩基配列であることを特徴とするミンク成長ホルモン
遺伝子である。

以下、本発明の詳細な説明する。

先ず、本発明の遺伝子のドナーとして用いられるものと
しては、例えば、イタチ科属ミンク由来の脳下垂体が挙
げられる。

上記ミンク脳下垂体組織より全−ＲＮＡを調製するには
、例えば［プロナス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、）Ｊ第７０巻、第３６４６頁
（１９７３）、　　ｒラボマニュアル遺伝子工学」村松
正實、第７０頁（１９８８）記載の方法等により得るこ
とかできる。得られたｍ−ＲＮＡよりｃ−ＤＮＡを合成
するには、例えば、１モル・セル・パイオル（Ｍｏ１．
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　）　Ｊ第２巻、第１６１頁（１
９８２）および「ジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ第２５巻、第２
６３頁（１９８３）記載の方法等により行なうことがで
きる。

次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えばプラスミド　ｐＵｃ１１９ＤＮＡ（宝酒
造社製）等に組み込み、種々の組み換え体プラスミドＤ
ＮＡを得、該プラスミドＤＮＡを用いて例えば、大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＪＭＩＯＩ（ＡＴＣＣ３３８７６）
等を「遺伝子操作の基本手技」鈴木裕行、山本徳男、第
８〜１３頁（１９８９）記載の方法により形質転換し、
種々の形質転換株を得る。

上記の種々な形質転換株よりミンク成長ホルモンをコー
ドするｃ−ＤＮＡ（以下、成長ホルモンＣ−ＤＮＡとい
う）を検出するには、以下の方法による。

コロニーハイブリダイゼーション・セレクション（アマ
ジャム社製ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）プロッティング
メンプランプロトコール）によりプラスミドｐＵｃ１１
９をベクターとして作製したｃ−ＤＮＡのシーンバンク
のライブラリーより７００ｂｐの成長ホルモンｃ−ＤＮ
Ａを得ることがてきる。そして、このようにして得られ
た組み換え体プラスミドＤＮＡよりミンク由来の成長ホ
ルモンをコードする遺伝子（以下、成長ホルモン遺伝子
という）を含有するＤＮＡを得るには、該プラスミドＤ
ＮＡに制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ［を
温度３０〜４０°Ｃ１好ましくは３７°Ｃで１〜２４時
間、好ましくは２時間作用させ、得られた反応終了液を
アガロースゲル電気泳動法〔モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５０
頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＸ１９８２）記載〕に掛けることにより行われる
。

そして、この成長ホルモン遺伝子の塩基配列の決定を後
述の実施例の第５項目に示すような方法によって行ない
（第２図参照）、次いで、前記塩基配列を有する遺伝子
によって翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を確
定する（第３図参照）。

このようにして確定されたアミノ酸配列をコードする遺
伝子が本発明の遺伝子である。

〔発明の効果〕

本発明は二ミンク成長ホルモン遺伝子を提供する。そし
て、この遺伝子を組み込んだ組み換え体ＤＮＡを含む、
例えば微生物を培地中で培養することにより、極めて短
時間のうちに、ミンク成長ホルモンを効率良く製造する
ことが可能であり、本発明は産業上極めて有用なもので
ある。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明す。

実施例 ミンク成長ホルモンｃ−ＤＮＡのクローニング１、脳下
垂体組織の取得 屠殺されたばかりのミンク（ダーク種、蔵王ミンク牧場
より入手）１００体より、直ちに脳下垂体を取り出し、
脳下垂体組織ｔｇを得た。これを直ちに液体窒素に浸積
し、凍結させたものを一８０°Ｃディープフリーザー（
三洋電機特機社製）に保存した。

２、ＲＮＡの取得 項目１て得られた脳下垂体５０ｍｇを、２ｍｌのＲＮＡ
溶出溶液（５０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ８，４）／　
５０ｍＭＥＤＴＡ／　１％５ＤＳ）に浸積し、直ちにホ
モジナイザー（ＷＨＥＡＴＯＮ社製）にて粉砕し、直ち
に予め６５°Ｃに加温したＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス
−塩酸（ｐＨ７，５）／　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）飽和フェ
ノールを等量刑えたものをエッペンドルフチューブに移
し、時々激しく攪拌しなから６５°Ｃに１５分間放置し
た。その後更に２５°Ｃで１０分間振盪したものを微量
遠心機〔■トミー精工、ＭＲＸ−１５０）を用い、１５
．０ＯＯｒ、　ｐ、　ｍ　４５分間遠心し水層及び有機
溶媒層に分離し、水層を回収した。

この水層を上記抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰
り返して得られた水層に、等量のクロロホルムを加えよ
く攪拌した後、同様に遠心し水層を得た。更に得られた
画分に１ＺｌＯ量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）
及び、２倍量の冷エタノールを添加したものを一７０°
Ｃで１時間以上放置した後、常法により１５．００Ｏｒ
、　ｐ、　ｍ、で２０分間遠心分離し、沈殿を形成させ
た。これを７０％冷エタノールで洗い乾燥させた後、０
．３ｍｌの滅菌水に溶かし０．１ｍｌの１０Ｍ　ＬｉＣ
１を加え４°Ｃにて一晩放置後、４°Ｃにて１５．００
０ｒ、ｐ、ｍ、　３０分間遠心分離し沈殿を得た。更に
沈殿を０．３ｍｌの滅菌水に溶かし、０．６ｍｌの冷エ
タノールを加え、−７０°Ｃ１時間放置後１５．００Ｏ
ｒ、　ｐ、　ｍ。

て１５分間遠心し、沈殿を得た。沈殿を０．５ｍｌの冷
滅菌水に溶かし、４℃にて１５．０００ｒ、　ｐ、　ｍ
、で２０分間遠心し上溝に１５０μｇの全−ＲＮＡを得
た。

３、ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−ＤＮＡの合成は、ファルマシア・社・製キットを用
いて行なった。

上述の如くして得られた全−ＲＮＡ６０μｇを用いてフ
ァルマシア社の指示するジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻
、第２６３頁（１９８３）記載の方法に従い行なった結
果、７００ｎｇの２重鎖ｃ−ＤＮＡが得られた。

４、ｃ−ＤＮＡバンクの作製 プラスミドｐＵｃ１１９ＤＮＡ　（宝酒造社製）１μｇ
を、１４μｌの水に溶解したものに、２μｌのＴ緩衝液
（３３０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７，９）　／
　１００ｍＭ酢酸マグネシウム１５ｍＭジチオスレイト
ール／６６０ｍＭ酢酸カリウム〕及び２μｌの１％牛血
清アルブミンを加えた後、更にこれに２０ユニツト（２
μｌ）の制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）を添加し、温
度３７°Ｃで一晩切断処理を行なった。

次いで、この切断処理物をアガロース電気泳動にかけ、
完全に切断されたＤＮＡ断片をむアガロースゲルを切り
出した。これを透析チューブに入れ、４００μｌのＴＢ
Ｅ衝液（９０ｍＭ　）リス−はう酸／２ｍＭ　ＥＤＴＡ
）を添加した後、透析チューブをシールする。電気泳動
に掛け、ゲル中より緩衝液中にＤＮＡを溶出させ、この
緩衝液に等容量のＴＥ飽和フェノールを添加して攪拌し
、水層を回収し、常法に従ってエタノール沈殿によりＤ
ＮＡを回収した。

このＤＮＡを１００μｌの１００ｍＭ　）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）に溶解させ０．９ユニツト（３μｌ
）のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加し
、温度５５°Ｃにて１時間酵素反応処理し、切断処理物
の両端の脱リン酸化を行なっ　た。これに、　１００μ
ｍのＴＥ飽和フェノールを添加　し除蛋白を行なった後
、回収した水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（１）
Ｈ４，８）及び２５０μｌの冷エタノールを添加し、温
度−７０°Ｃに１５分間放置した。これを微量遠心機〔
■トミー精工、ＭＲＸ−１５０）で１５．００Ｏｒ、　
ｐ、　ｍ、、１５分間遠心分離処理を行ないＤＮＡを回
収した。

このようにして得られた制限酵素ＳｍａＩで切断し、か
つ両端を脱リン酸化したプラスミドベクタ−ｐＵｃ１１
９ＤＮＡ　１Ｍｇと、項目で調製したｃ−ＤＮＡ　７０
０ｎｇを混合したものを５μｍの水に懸濁した後、宝酒
造・社・製ＤＮＡライゲーションキットを用い、宝酒造
社の指示する方法によりライゲーション反応を行ない反
応物を得た。

この反応物を用いて、遺伝子操作の基本手技、鈴木裕行
、山本徳男、第８〜１３頁、（１９８９）記載の方法で
大腸菌ＪＭＩＯＩ（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換し
、プラスミドｐＵＣ１１９Ｄ　Ｎ　Ａをベクターとした
Ｃ−ＤＮＡバンクを作製した。

５、成長ホルモンｃ−ＤＮＡの断片の検索コロニーハイ
ブリダイゼーション・セレクション〔アマジャム社製ハ
イボンド　ブロッティングメンプランプロトコール〕に
従って成長ホルモンｃ−ＤＮＡの検索を行なった。以下
に、詳述する。

コロニーハイブリダイゼーション・セレクションに用い
るプローブは４５残基の合成り　Ｎ　Ａ　（ＴＴＣＣＣ
ＧＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴ
ＧＣＣＡＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＣ）であり、これはラッ
トの塩基配列をもとにしてをアプライド・パイオシ　ス
テムダ社製３０８Ｂ型ＤＮＡシンセサイザーを用いて作
製したものである。この合成りＮＡ２００　ｎｇを２μ
ｌの１０×カイネーシヨン緩衝液（５００ｍＭ　）リス
−塩酸（ｐＨ８，０）／　１００ｍＭ塩化マグネシウム
〕、２μｌの１ｍＭスペルミジン、１μｌの２００ｍＭ
　２−メルカプトエタノール、１０μｌの［γ−３２Ｐ
］　ＡＴＰ　（３７００ＫＢＱ）及び４μｌの滅菌水か
らなる溶液に溶かし、更に１μｌのＴ４−ポリヌクレオ
チドカイネース（宝酒造社製）（ｌＯユニット）を加え
、温度３７°Ｃで１時間酵素反応を行なった。

この反応産物に０．９ｍｌのＴＥ緩衝液を加え、予め１
０ｍ１のＴＥ緩衝液で平衡化しておいたナツプ−カラム
（ＮＡＰ−ｃｏｌｕｍＸファルマシア社製）に掛け、フ
ァルマシア社の指示に従い処理し、末端標識のされた２
００ｎｇのＤＮＡを得た。

項目３で得られたｃ−ＤＮＡバンク大腸菌１．５００株
について、以下の操作を行なった。アンピシリン（７５
μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ（１％ＴＲＹＰＴＯＮＢ１０．
５％ＹＥＡＳＴ　ＥＸＴＲＡＣＴ／　１％塩化ナトリウ
ム）１．５％寒天プレートに適当数の菌株を植え、−晩
温度３７°Ｃにて培養したものにナイロンメンプランの
７１イポンドエヌ（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）を置き１分間放
置後、メンプランを剥かしコロニー側が上になるように
変性溶液（１，５Ｍ塩化ナトリウム１０．５Ｍ水酸化ナ
トリウム）を浸した濾紙上に置き、７分間放置した。こ
のメンプランをペーパータオルの上に置き余分な水分を
取り、中和溶液（１，５Ｍ塩化ナトリウム１０．５Ｍ　
）リス−塩酸（ｐＨ７，２）／　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を
浸した濾紙上に３分間置き、更に新しい中和溶液を浸し
た濾紙を用いて同様の操作を繰り返した。この後２×５
ＳＣ（０，３Ｍ塩化ナトリウム１０．０３Ｍクエン酸ナ
トリウム）で洗浄し、風乾後、８０°Ｃに２時間放置し
、組み換え体ＤＮＡをメンプランに固定した。

次いで、ビニール袋に上記の如く調製したメンプランと
メンプラン１００ｃｍ２あたり５ｍｌのハイブリダイゼ
ーション溶液（０，９Ｍ塩化ナトリウム１０．０９Ｍク
エン酸ナトリウム１０，１％牛血清アルブミン１０．１
％フィコール１０．１％ポリビニルピロリドン１０゜５
％ＳＤＳ　１０．１ｍｇサケ精子ＤＮＡ）を加え、温度
６５°Ｃで１時間プレハイブリダイゼーションを行なっ
た。その後新しいハイブリダイゼーション溶液に変え、
更に２０ｎＨの標識されたＤＮＡを加え、温度５６°Ｃ
にて１２時間ハイブリダイゼーションを行なった。この
後、メンプランを２５°Ｃで２ＸＳＳＣにて１５分間２
回洗浄した後、更に温度５６°Ｃで２　Ｘ５ＳＣにて１
５分間２回洗浄し、サランラップで包み、オートラジオ
グラフィーを行ない検索を行なった所、成長ホルモンｃ
−ＤＮＡを有するコロニーを得た。

このコロニーの有する組み換え体プラスミドＤＮＡをＩ
）ＭＧＨｌｏｏと命名した。この組み換え体プラスミド
ＤＮＡ　ｐＭＧＨｌｏｏを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、
この導入した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＭＧＨｌｏｏ）は工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。そして、そ
の寄託番号はＦＥＲＭ　Ｐ−１１８５６（微工研菌寄第
１１８５６号）である。

このプラスミドＤＮＡをモレキュラー・クローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第８６頁、
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９
８２）記載の方法により制限開裂地図を作製した。この
プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ１，Ｈｉｎｄ　Ｉ
［、で処理し、アガロース電気泳動を行なった所、挿入
ＤＮＡ断片の大きさは７００ｂｐであることが判明した
。そして、組み換え体プラスミドｐＭＧＨＩ００　ＤＮ
Ａを制限酵素ＥａｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄｌｌＩ、
ＰｖｕＩＩ及びＳｍａＩの単一または二重消化を行ない
、アガロース電気泳動にて、現れた断片の大きさを分析
することにより、組み換え体プラスミドｐＭＧＨ１００
Ｄ　Ｎ　Ａの制限酵素地図を作製し、該地図を第１図に
示した。

５、成長ホルモンｃ−ＤＮＡの塩基配列の決定項目４で
得られた夫々の成長ホルモンｃ−ＤＮＡ断片を、同−又
は同一ののりしろの制限酵素により切断したプラスミド
ｐＵｃ１１８及びｐＵｃｌ１９Ｄ　Ｎ　Ａ　（全酒造社
製）にクローニングした。シーフェンシングは、プラス
ミドＤＮＡを榊の方法〔ベクターＤＮＡ、第７０頁、講
談社（１９８６年）〕に従ってアルカリ変性した後、Ｍ
１３シークエンスキット（全酒造社製）を用いて常法に
よりダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法で行
なった。

このようにしてミンク由来の成長ホルモンｃ−ＤＮＡ断
片の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のうち、マチ
ュアーな成長ホルモンに対応する塩基配列を第２図に、
また、前記第２図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻
訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を第３図に夫々
示した。

このアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される遺伝
子が本発明の遺伝子である。

このＤＮＡ塩基配列より推測されるアミノ酸配列には精
製した成長ホルモンのＮ末端及び部分分解で得られたア
ミノ酸配列が確認された（第３図下線部）。

以上の知見より第２図に示した塩基配列は、マチュアー
な成長ホルモンのＮ末端よりＣ末端部分までをコードし
ていると結論できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドｐＭＧｆ（１００Ｄ　
ＮＡの制限酵素開裂地図を示す図であ　リ、第２図は、
実施例の５項目に記載のマチュアーな成長ホルモンに対
応する遺伝子の塩基配列を示す図であり、また、第３図
は、第２図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳され
るポリペブタイドのアミノ酸配列を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イタチ科属のミンクに由来し、下記の制限酵素開裂
   地図で規定されるミンク成長ホルモン遺伝子。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｅは￥Ｅａｅ￥ I 、Ｐは￥Ｐｖｕ￥II、Ｓは
   ￥Ｓｍａ￥ I を示す） ２、ミンク成長ホルモン遺伝子が下記に示されるアミノ
   酸配列をコードする塩基配列であることを特徴とする請
   求項１記載のミンク成長ホルモン遺伝子。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】