JP2859000B2 - ミンク成長ホルモン遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びミンク成長ホルモンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ミンク成長ホルモン遺
伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びミンク成長ホルモン
の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ミンク成長ホルモンは、飼育され
たミンクの脳下垂体組織より分離、精製し、製造されて
る。そして、このミンク成長ホルモンは、例えば、ミン
クに投与することによりミンクの成長を促進させるもの
であって、極めて有用な生理活性物質である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記ミ
ンク成長ホルモンは、動物由来であるため、その製造に
は、飼育された多数のミンクを必要とし、多大な時間、
労力及びコストを要するものであった。先に、本発明者
等は遺伝子工学的手法によりミンク成長ホルモンを生産
することを目的として、配列番号２の塩基配列で表わさ
れるダーク種ミンク成長ホルモン遺伝子を提供した（特
願平2-315946号) 。しかし、このミンク成長ホルモン遺
伝子の形質転換体による発現は不満足なものであった。

【０００４】そこで、本発明者らは更に発現効率の高い
ミンク成長ホルモン遺伝子を得るべく鋭意研究を行い、
本発明を完成するに至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、配
列番号１の塩基配列で表わされるミンク成長ホルモン遺
伝子にある。この配列番号１の塩基配列は、上記の配列
番号２の塩基配列で表わされるダーク種ミンク成長ホル
モン遺伝子のうち、Ｎ末端部分にＡＴＧを連結し、更
に、６位のＧをＡに、９位のＣをＴに、15位のＣをＴ
に、16位のＴをＣに、18位のＧをＡに、21位のＣをＴ
に、24位のＣをＴに、27位のＧをＡに、30位のＴをＣ
に、33位のＣをＴに、39位のＣをＴに、また42位のＧを
Ｔに夫々部位特異的変異させたものである。

【０００６】さらに、本発明は配列番号１のミンク成長
ホルモン遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した新規な組み
換え体ＤＮＡにある。さらに、本発明は上記の組み換え
体ＤＮＡを含み、ミンク成長ホルモン生産能を有するエ
ッシェリシア属に属する微生物を、培地に培養し、培養
物よりミンク成長ホルモンを採取することを特徴とする
ミンク成長ホルモンの製造法にある。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。先ず、本
発明の遺伝子の供与体として用いられるものとしては、
イタチ科属ミンク例えば、ダーク種由来の脳下垂体が挙
げられる。上記ミンク脳下垂体組織よりＲＮＡを調製
は、例えば「プロナス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A.)、第70巻、第3646頁」、「ラボマニュアル遺伝子工
学、村松正實、第70頁（1988）」記載の方法等によりお
こなうことができる。

【０００８】上記ｍ-ＲＮＡよりｃ-ＤＮＡの合成は、例
えば、「モル・セル・バイオル(Mol. Cell. Biol.) 、
第２巻、第161頁（1982）」及び「ジーン（Gene）、第2
5巻、第263頁（1983）」記載の方法等により行なうこと
ができる。次いで、このようにして得られたｃ-ＤＮＡ
をベクターＤＮＡ、例えばプラスミド pUC119 ＤＮＡ
（宝酒造・社・製）等に組み込み、種々の組み換え体プ
ラスミドＤＮＡを得、該ＤＮＡを用いて例えば、大腸菌
（E.coli）JM101 (ATCC 33876)等を「遺伝子操作の基本
手技、鈴木裕行、山本徳男、第８〜13頁（1989）」記載
の方法により形質転換し、種々の形質転換株を得る。

【０００９】上記の種々な形質転換株よりミンク成長ホ
ルモンをコードするｃ-ＤＮＡ（以下、成長ホルモンｃ-
ＤＮＡという）をスクリーニングするには、コロニーハ
イブリダイゼーション・セレクション（アマシャム・社
・製 Hybond ブロッティングメンブランプロトコール）
によりプラスミド pUC119 をベクターとして作製したｃ
-ＤＮＡのジーンバンクのライブラリーより７00bpの成
長ホルモンｃ-ＤＮＡを得ることにより行われた。

【００１０】次いで、上記ミンク由来で700bpの成長ホ
ルモンをコードするｃ-ＤＮＡを制限酵素EaeＩ, BamHＩ
で処理して得られる650bp ｃ-ＤＮＡ断片、すなわち、
成熟した成長ホルモンのＮ末端より２個のアミノ酸をコ
ードする塩基配列を欠失した成長ホルモン遺伝子、プロ
モーター〔例えば、大腸菌由来のトリプ（trp)プロモー
ター等〕、ベクターＤＮＡ及びミンク成長ホルモン遺伝
子のＮ末端より２個のアミノ酸をコードする塩基配列及
びＡＴＧを有する合成ＤＮＡを用いて、制限酵素、例え
ばEaeＩ（宝酒造・社・製）等及びＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造・社・製）等によりミンク由来の成長ホルモン
遺伝子を完全にコードする塩基配列を有する組み換え体
ＤＮＡを得ることが出来る。

【００１１】しかし、上記組み換え体ＤＮＡを用いた形
質転換株ではミンク成長ホルモンの十分な発現が確認で
きなかった。そこで、このミンク成長ホルモンを効率的
に発現させるためには、組み換え体ＤＮＡの改良が必要
となる。次に、上記組み換え体ＤＮＡの改良について述
べる。先ず、上記組み換え体ＤＮＡを制限酵素EcoRＩ、
BamHＩで処理して得られるプロモーター及びミンク成長
ホルモン遺伝子を含む９00bpのＤＮＡ断片を例えば、pU
C119（宝酒造・社・製）を上記制限酵素で処理したＤＮ
Ａ断片に連結し、組み換え体ＤＮＡを得る。

【００１２】次いで、この組み換え体ＤＮＡを用いて、
エッシェリシア属の微生物、例えば、大腸菌 JM101（AT
CC 33876) 等を、ハナハン（Hanahan)の方法〔「ディー
エヌエイ・クローニング」（ＤＮＡ cloning) 、第１
巻、第109〜135頁（1985) 〕により形質転換し、形質転
換株を得る。この形質転換株を用いて pUC119 （宝酒造
・社・製）付属の M13KO7 及びそのプロトコール記載の
方法により１本鎖ＤＮＡを調製することが出来る。この
１本鎖ＤＮＡと上記組み換え体ＤＮＡから推定されるミ
ンク成長ホルモンをコードするＲＮＡが二次構造をとら
ないようにかつ、ミンク成長ホルモンのアミノ酸配列が
変わらないような合成ＤＮＡプライマーを用いて、Olig
onucleotide-directed in vitro mutagenesis system v
ersion2 記載の方法により、改良された組み換え体ＤＮ
Ａを得ることができる。

【００１３】次いで、上記改良された組み換え体ＤＮＡ
を用いて、エッシェリシア属の微生物、例えば、大腸菌
JM101 (ATCC 33876)、大腸菌（E.coli) DH1 (ATCC 338
49)、大腸菌（E.coli) HB101 (ATCC 33694)等を、ハナ
ハン（Hanahan)の方法〔「ディーエヌエイ・クローニン
グ」（ＤＮＡcloning) 、第１巻、第109〜135頁（198
5)〕により形質転換し、形質転換体を得る。

【００１４】あるいは、上記改良された組み換え体ＤＮ
Ａより改良されたミンク成長ホルモン遺伝子を得、該遺
伝子を、常法により特願昭63-322029号明細書記載のバ
クテリオファージベクター等のベクターＤＮＡに組み込
み、組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体ＤＮＡを用
いて「モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g) 、第256〜268頁、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー (ColdSpring Harbor Laboratory) (198
2)」記載の方法等により上記大腸菌に、形質導入するこ
とにより形質導入株を得る。

【００１５】次いで、上記微生物を培地に培養し、培養
物を SDS-PAGE(エスディーエスペイジ）により、ミンク
成長ホルモンの生産の有無を確認する。培地としては、
エッシェリシア属に属する微生物の培養に用いられるも
のであれば、如何なるものでも良く、例えば、トリプト
ン１％(W/V) 、酵母エキス0.５％(W/V) 及び NaCl 0.５
％(W/V) からなる組成の培地等が挙げられる。

【００１６】また、培養温度は、30〜40℃、好ましくは
37℃程度で、培養時間は、６〜12時間、好ましくは10時
間程度である。培養物より菌体を例えば、８,000r.p.m.
で10分程度の遠心分離処理により集菌し、得られた菌体
を、例えば、ランメリ（Laemmli)の方法〔ネイチャー
（Nature) 、第227巻、第680頁（1970）〕を用い、エス
ディーエスペイジにより分子量に依存させて蛋白質を分
離し、更に、免疫的にウエスタンブロッティング−ＥＬ
ＩＳＡ法を用いることにより確認することができる。

【００１７】上記記載のエヌディーエスペイジを行なっ
た後、例えば、「実験操作ブロッティング法、口野嘉
幸、平井久丸、櫻井郁之介、第212〜317頁（1987）」記
載の方法に従い、例えば、抗ラット成長ホルモン（ｕｃ
ｂ・社・製）を用いることにより確認することが出来
る。そして、上記菌体より、例えば、「マリンバイオ、
280頁（1989）」記載の方法によりミンク成長ホルモン
を分離、精製することができる。

【００１８】

【発明の効果】上述したことから明らかな如く、本発明
によれば、ミンク由来の成長ホルモン遺伝子を改良した
遺伝子を含有する組み換え体ＤＮＡを含むエッシェリシ
ア属に属する微生物を培地に培養することにより、極め
て短時間のうちに、ミンク成長ホルモンを効率良く製造
できるので、本発明は、産業上極めて有益である。

【００１９】以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に
説明する。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説
明する。 実施例 ミンク成長ホルモンｃ-ＤＮＡのクローニング １. 脳下垂体組織の取得 屠殺されたばかりのミンク（ダーク種、蔵王ミンク牧場
より入手）１00体より、直ちに脳下垂体を取り出し、脳
下垂体組織１ｇを得た。これを直ちに液体窒素に浸漬
し、凍結させたものを−80℃ディープフリーザー（三洋
電機特機・社・製）に保存した。

【００２１】２. ＲＮＡの取得 項目１で得られた脳下垂体50mgを、２mlのＲＮＡ溶出溶
液〔50mM トリス-塩酸（pH8.4)／50mM EDTA／１％SDS〕
に浸漬し、直ちにホモジナイザー（WHEATON ・社・製）
にて粉砕する。これに、直ちに予め65℃に加温したＴＥ
緩衝液〔10mMトリス-塩酸 (pH7.5)／１mM EDTA 〕飽和
フェノールを等量加えエッペンドルフチューブに移し、
時々激しく攪拌しながら65℃に15分間放置した。その後
更に25℃で10分間振盪したものを微量遠心機〔(株）ト
ミー精工、MRX-150〕で15,000r.p.m.、５分間遠心して
水層及び有機溶媒層に分離し、水層を回収した。この水
層について、さらに上記抽出及び分離操作を２回繰り返
して得られた水層をえる。これに、等量のクロロホルム
を加えよく攪拌した後、同様に遠心し水層を得た。更に
得られた画分に1/10量の３M 酢酸ナトリウム（pH４.8）
及び、２倍量の冷エタノールを添加したものを−70℃で
１時間以上放置した後、常法により15,000r.p.m.で20分
間遠心分離し、沈澱を形成させた。これを70％冷エタノ
ールで洗い乾燥させた後、0.３mlの滅菌水に溶かし0.１
mlの10M LiClを加え４℃にて一晩放置する。これを４℃
にて15,000r.p.m.、30分間遠心分離し、沈澱を得た。更
にこの沈澱を0.３mlの滅菌水に溶かし、0.６mlの冷エタ
ノールを加え、70℃１時間放置後15,000r.p.m.で15分間
遠心し、沈澱を得た。この沈澱を0.５mlの冷滅菌水に溶
かし、４℃にて15,000r.p.m.で20分間遠心し上清に 150
μg のＲＮＡを得た。

【００２２】３. ｃ-ＤＮＡの合成 ｃ-ＤＮＡの合成は、ファルマシア・社・製キットを用
いて行なった。上述の如くして得られたＲＮＡ60μg を
用いてファルマシア社の指示する「ジーン（Gene)、第2
5巻、第263頁（1983）」記載の方法に従い処理した結
果、７00ngの２本鎖ｃ-ＤＮＡが得られた。

【００２３】４. ｃ-ＤＮＡバンクの作製 プラスミド pUC119 ＤＮＡ（宝酒造・社・製）１μg
を、14μl の水に溶解したものに、２μl のＴ緩衝液
〔330mM トリス-酢酸（pH7.9)／100mM 酢酸マグネシウ
ム／5mM ジチオスレイトール／660mM 酢酸カリウム〕及
び２μl の１％牛血清アルブミンを加えた後、更にこれ
に20ユニット（２μl ）の制限酵素 SmaＩ（宝酒造・
社・製）を添加し、温度37℃で一晩切断処理を行なっ
た。

【００２４】次いで、この切断処理をアガロース電気泳
動にかけ完全に切断されたＤＮＡ断片を含むアガロース
ゲルを切り出し、透析チューブに入れた。この透析チュ
ーブに、 400μl のＴＢＥ緩衝液（90mM トリス-ほう酸
／２mM EDTA)を添加した後、透析チューブをシールし、
電気泳動に掛ける。これにより、ゲル中より緩衝液中に
ＤＮＡを溶出して得た溶液に等容量のＴＥ飽和フェノー
ルを添加して攪拌し、水層を回収し、常法に従ってエタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収した。このＤＮＡを100
μl の100mM トリス-塩酸緩衝液（pH8.０）に溶解させ
0.９ユニット（３μl ）のアルカリフォスファターゼ
（宝酒造・社・製）を添加し、温度55℃にて１時間酵素
反応処理し、切断処理物の両端の脱リン酸化を行なっ
た。これに、 100μl のＴＥ飽和フェノールを添加し徐
蛋白を行なった後、回収した水層に10μl の３M 酢酸ナ
トリウム（pH４.8）及び250μl の冷エタノールを添加
し、温度−70℃に15分間放置した。この溶液を微量遠心
機〔(株）トミー精工、MRX-150〕で15,000r.p.m.、15分
間遠心分離処理を行ないＤＮＡを回収した。

【００２５】このようにして得られた、制限酵素SmaＩ
で切断しかつ両端を脱リン酸化したプラスミドベクター
pUC119 ＤＮＡ 1μg と、項目３で調製したｃ-ＤＮＡ
700ngを混合したものと．５μl の水に懸濁した後、宝
酒造・社・製ＤＮＡライゲーションキットを用い、ライ
ゲーション反応を行ない反応物を得た。この反応物を用
いて、「遺伝子操作の基本手技、鈴木裕行、山本徳男、
第８〜13頁、(1989)」記載の方法で大腸菌 JM101 (ATCC
33876) を形質転換し、プラスミドpUC119 ＤＮＡをベ
クターとしたｃ-ＤＮＡバンクを作製した。

【００２６】５. 成長ホルモンｃ-ＤＮＡの断片の検索 コロニーハイブリダイゼーション・セレクション〔アマ
シャム・社・製ハイボンド（Hybond) ブロッティングメ
ンブランプロトコール〕に従って成長ホルモンｃ-ＤＮ
Ａの検索を行なった。以下に、その方法について詳述す
る。コロニーハイブリダイゼーション・セレクションに
用いるプローブはラットの塩基配列をもとにして45残基
の合成ＤＮＡ（ＴＴＣＣＣＧＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＧ
ＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＧＴＧＣ
ＴＣ）をＤＮＡシンセサイザー〔アプライド・バイオシ
ステムズ・社・製 308Ｂ型〕を用いて作製した。この合
成ＤＮＡ 200ngに２μl の10×カイネーション緩衝液
〔500mM トリス- 塩酸（pH8.0)／100mM 塩化マグネシウ
ム〕、2μl の１mM スペルミジン、１μl の200mM ２-
メルカプトエタノール、10μl の［γ-32P］ＡＴＰ（37
00KBq)、４μl の滅菌水を加え、更に１μl のＴ4-ポリ
ヌクレオチドカイネース（宝酒造・社・製） (10ユニッ
ト）を加えて、温度37℃で１時間酵素反応を行なった。
この反応産物に0.９mlのＴＥ緩衝液を加え、予め10mlの
ＴＥ緩衝液で平衡化しておいたナップ-カラム（NAP-col
um)（ファルマシア・社・製）にのせ、末端標識のされ
た２00ngのＤＮＡを得た。

【００２７】項目４で得られたｃ-ＤＮＡバンク大腸菌
１,500株について、以下の操作を行なった。アンピシリ
ン（75μg/ml）を含むＬＢ（１％TRYPTONE／0.５％YEAS
T EXTRACT／１％塩化ナトリウム）1.５％寒天プレート
に適当数の菌株を植え、一晩温度37℃にて培養した。こ
れにナイロンメンブランのハイボンドエヌ（Hybond-N)
を置き１分間放置後、メンブランを剥がす。これをコロ
ニー側が上になるように変性溶液（1.５M 塩化ナトリウ
ム／0.５M 水酸化ナトリウム）を浸した濾紙上に置き、
７分間放置した後、メンブランをペーパータオルの上に
置き余分な水分を取り除く。次いで、これを中和溶液
〔1.５M 塩化ナトリウム／0.５M トリス-塩酸（pH7.2)
／１mM EDTA〕を浸した濾紙上に３分間置き、更に新し
い中和溶液を浸した濾紙を用いて同様の操作を繰り返し
た。この後２×SSC (0.3M 塩化ナトリウム／0.03M クエ
ン酸ナトリウム）で洗浄し、風乾後、80℃に２時間放置
し、組み換え体ＤＮＡをメンブランに固定した。

【００２８】次いで、ビニール袋に上で調製したメンブ
ランとメンブラン１00cm² あたり５mlのハンブリダイゼ
ーション溶液 (0.９M 塩化ナトリウム／0.09M クエン酸
ナトリウム／0.１% 牛血清アルブミン／0.１% フィコー
ル／0.１% ポリビニルピロリドン／0.5% SDS／0.１mgサ
ケ精子ＤＮＡ) を加え、温度65℃で１時間プレハイブリ
ダイゼーションを行なった。その後新しいハイブリダイ
ゼーション溶液に変え、更に20ngの標識されたＤＮＡを
加え、温度56℃にて12時間ハイブリダイゼーションを行
なった。この後、メンブランを25℃で２×SSC にて15分
間２回洗浄した後、更に温度55℃で２×SSCにて15分間
２回洗浄し、サランラップで包み、オートラジオグラフ
ィーを行ない検索を行なった所、成長ホルモンｃ-ＤＮ
Ａを有するコニローを得た。このコロニーの有する組み
換え体プラスミドＤＮＡを pMGH100と命名した。

【００２９】このプラスミドＤＮＡ pMGH100を「モレキ
ュラー・クローニング (MolecularCloning)、第86頁、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(198
2)」記載の方法により調製した。このプラスミドＤＮＡ
を制限酵素EcoRＩ, HindIIIで処理し、アガロース電気
泳動を行なった所、挿入ＤＮＡ断片の大きさは７00bpで
あることが判明した。そして、組み換え体プラスミドpM
GH100 ＤＮＡを制限酵素EaeＩ、EcoRＩ、HindIII、PvuI
I及びSmaＩの単一または二重消化を行ない、アガロース
電気泳動にて、現れた断片の大きさを分析することによ
り、組み換え体プラスミドpMGH100 ＤＮＡの制限酵素地
図を作製した。この制限酵素地図を図１に示した。

【００３０】６. 成長ホルモンｃ-ＤＮＡの塩基配列の
決定 項目５で得られた夫々の成長ホルモンｃ-ＤＮＡ断片
を、同一又は同一ののりしろの制限酵素により切断した
プラスミド pUC118 及び pUC119 ＤＮＡ (宝酒造・社・
製) にクローニングした。シークエンシングは、プラス
ミドＤＮＡを榊の方法〔ベクターＤＮＡ第70頁、講談社
(1986年) 〕に従ってアルカリ変性した後、M13 シーク
エンスキット (宝酒造・社・製) を用いて常法によりダ
イデオキシ・チェーン・ターミネーション法で行なっ
た。

【００３１】このようにしてミンク由来の成長ホルモン
ｃ-ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、得られた塩基配列
のうち、マチュアーな成長ホルモンに対応する塩基配列
を配列番号２に、また、前記配列番号２に示す塩基配列
を有する遺伝子から翻訳されるポリペプタイドのアミノ
酸配列を配列番号３に夫々示した。このＤＮＡ塩基配列
より推測されるアミノ酸配列には精製した成長ホルモン
のＮ末端及び部分分解で得られたアミノ酸配列が確認さ
れた (配列番号３) 。

【００３２】以上の知見より配列番号２に示した塩基配
列は、マチュアーな成長ホルモンのＮ末端よりＣ末端部
分までをコードしていると確定できる。 ７. 組み換え体プラスミド pEXE11 ＤＮＡの構築 先ず、Ｎ末端より２個のアミノ酸をコードする塩基配列
を欠失し、ミンク由来の成長ホルモン遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片の調製について述べる。組み換え体プラスミ
ドpMGH100 ＤＮＡ 1μg を45μlの水に溶かしたもの
に、５μl のＫ緩衝液及び10ユニットのBamHＩ (宝酒造
・社・製) を添加し、温度37℃で２時間消化した。これ
に、等量の水飽和フェノールを添加し、常法による除蛋
白処理及びエタノール沈澱処理を行った後、45μl の
水、５μl のＴ緩衝液及び10ユニットのEaeＩ (宝酒造
・社・製) を加え、温度37℃で２時間消化した。得られ
る制限酵素処理物を用いて、項目４記載の方法によりア
ガロースから650bpのＤＮＡ断片100ngを調製した。

【００３３】次に、大腸菌由来のトリプ (trp)プロモー
ターを含有するベクターＤＮＡ断片の調製法について述
べる。トリププロモーターを含有するプラスミド pKN20
6 ＤＮＡ〔「アグリク・バイオル・ケム」(Agric. Bio
l. Chem.)、第50巻、第271〜279頁 (1986年) 記載のも
の〕１μg を、45μl の水に溶解し、５μl のＫ緩衝
液、10ユニットのClaＩ (宝酒造・社・製) 及び10ユニ
ットのBamHＩ (宝酒造・社・製) を添加し、温度37℃で
２時間処理した。得られた制限酵素処理物を用いて、項
目４記載の方法によりアガロースから4.２kbのＤＮＡ断
片５00ngを調製した。

【００３４】また、上記4.２kbのＤＮＡ断片に含まれる
トリププロモーターは、ＳＤとＡＴＧ間の塩基配列の一
部を欠失している。そこで、成長ホルモンのＮ末端より
２個のアミノ酸をコードする塩基配列及びトリププロモ
ーターのＳＤ−ＡＴＧ間の塩基配列を補うために、以下
の２種の合成ＤＮＡをベックマン社製のシステム１プラ
スＤＮＡ合成機を用いて合成した。

【００３５】5' ＣＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＣ 3' 5' ＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＡＴＴＧＴ 3' これらの２種の合成ＤＮＡをデュポン社製のネンソルブ
・プレプ (NENSORB PREP) を用いることにより、20μg
の精製された合成ＤＮＡを各々得た。これら２種の合成
ＤＮＡを各々45μl の水に溶解し、５μl の×10カイネ
ーション緩衝液〔0.５M トリス−塩酸 (pH7.6)／0.１M
塩化マグネシウム／50mM ジチオスレイトール／10mM Ａ
ＴＰ〕を添加し、更に、10ユニット (１μl) のＴ４ポ
リヌクレオチドカイネース (宝酒造・社・製) を添加し
た後、温度37℃で１時間処理した。さらに、常法による
除蛋白処理及びエタノール沈澱処理を行い、5'末端をリ
ン酸化した合成ＤＮＡをそれぞれ１μg ずつ得た。

【００３６】次に、ライゲーション反応により目的のプ
ラスミドＤＮＡの取得を行った。上記のＮ末端より２個
のアミノ酸をコードする塩基配列を欠失したミンク成長
ホルモン遺伝子を含む650bpのＤＮＡ断片１00ng、上記
のトリププロモーターを含むベクターＤＮＡ断片５00ng
及び上記２種のリン酸化した合成ＤＮＡ 50ng を８μl
の水に溶解した。これに１μl の×10ライゲーション緩
衝液〔200mM 塩化マグネシウム／660mM トリス−塩酸
(pH7.６)／10mM ＡＴＰ／150mM ジチオスレイトール〕
及び１ユニットのＴ４ＤＮＡライゲース (宝酒造・社・
製) (１μl) を添加し、温度16℃にて16時間反応を行
った。得られた反応液を用いて項目３に記載の方法にて
大腸菌 JM101 (ATCC 33876) へ形質転換を行った。得ら
れた形質転換体より、「モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning)、第86頁、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー (1982) 」記載の方法により
プラスミドＤＮＡを単離し、このプラスミドＤＮＡをEa
eＩ,BamHＩ及びPvuII等の制限酵素で単一又は二重消化
した。この消化物を0.７％アガロースゲル電気泳動にて
展開し、トリププロモーター及びミンク成長ホルモン遺
伝子を完全にコードするプラスミドを得た。この組み換
え体プラスミドを、 pEXE 11と命名し、また、該プラス
ミドを含有する大腸菌を大腸菌 JM101 (pEXE 11) と命
名した。

【００３７】８. 組み換え体プラスミド pEXE 11-2の構
築 組み換え体プラスミドpEXE 11 ＤＮＡ１μg を18μl の
水に溶解したものに、２μl のＫ緩衝液、10ユニットの
EcoRＩ及び10ユニットのBamHＩを添加し、温度37℃で２
時間消化した。この消化物から項目４記載の方法によ
り、トリププロモーター及びミンク成長ホルモン遺伝子
を完全にコードする900bpのＤＮＡ断片を200ng得た。

【００３８】一方、プラスミド pUC119 ＤＮＡ (宝酒造
・社・製) １μg を18μl の水に溶解し、２μl のＫ緩
衝液、10ユニットのEcoRＩ及び10ユニットのBamHＩを添
加し、温度37℃にて２時間消化した。この消化物から項
目４記載の方法により、ベクターＤＮＡ ９00ngを得
た。トリププロモーター及びミンク成長ホルモン遺伝子
をコードしたＤＮＡ断片２00ngとEcoRＩ及びBamHＩで消
化した pUC119 ５00ngとを８μl の水に溶解し、更に×
10ライゲーション緩衝液１μl 及びＴ４ＤＮＡライゲー
ス１ユニット (１μl ) を添加し、温度16℃にて16時間
反応を行った。この反応液を用いて項目４記載の方法に
て大腸菌 JM101 (ATCC 33876) への形質転換を行った。
得られた形質転換体より、項目５記載の方法によりプラ
スミドＤＮＡを得た。この組み換え体プラスミドを pEX
E11-1と命名し、また該プラスミドＤＮＡを有する大腸
菌を大腸菌 JM101 (pEXE 11-1) と命名した。

【００３９】次に、この大腸菌 JM101 (pEXE 11-1)及び
プラスミド pUC119 (宝酒造・社・製) に付属の一本鎖
ＤＮＡファージ M13KO7 を用いて、付属のプロトコール
に従い、プラスミドＤＮＡ pEXE 11-1の一本鎖ＤＮＡ 5
μg を得た。また、サイトダイレクトミュータージェネ
シィスを用いて、発現され得る形にするために、以下の
合成ＤＮＡをベックマン社製のシステム１プラスＤＮＡ
合成機を用いて作製した。

【００４０】 5' ＣＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＴＡＴＣＴＡＧＴ ＣＴＡＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧＣＡ この作製した合成ＤＮＡを項目７記載の方法により精製
し、精製物20μg 得た。次に、この合成ＤＮＡ 40pmol
を項目７記載の方法によりカイネーションを行った。

【００４１】次に、上記一本鎖ＤＮＡ 5μg 及び合成Ｄ
ＮＡ4pmolを用いて、Oligonucleotide-directed in vit
ro mutagenesis system version2 (Amersham ・社・製)
記載の方法によりプラスミドＤＮＡを作製し、このプ
ラスミドＤＮＡを項目４記載の方法により、大腸菌 JM1
01 (ATCC 33876) に形質転換した。得られた形質転換体
より、項目５記載の方法により、プラスミドＤＮＡを
得、この組み換え体プラスミド pEXE 11-2と命名し、ま
た該プラスミドＤＮＡを有する大腸菌を大腸菌JM101 (p
EXE 11-2) と命名した。この組み換え体プラスミド pEX
E 11-2の制限酵素地図は、図２の通りである。

【００４２】この大腸菌 JM101 (pEXE 11-2)より、項目
５記載の方法にて４00mlの培養液より１mgの組み換え体
プラスミドを得た。次に、この組み換え体プラスミド 5
μgを27μl の水に溶解し、３μl のＫ緩衝液、10ユニ
ットのHpaＩ (宝酒造・社・製) 及び10ユニットのBamH
Ｉ (宝酒造・社・製) を添加し、温度37℃で２時間消化
した。この制限酵素処理物を用いて、項目４記載の方法
によりアガロースから７00bpのＤＮＡ断片５00ngを得
た。

【００４３】なお、大腸菌 JM101 (pEXE 11-2)は、工業
技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌条寄第3494号
(FERM BP-3494) として寄託されている。 ９. 大腸菌 JM101 (pEXE 11-2)の培養及びエスディーエ
スペイジ、ウエスタンブロッティング−ＥＬＩＳＡによ
るミンク成長ホルモン生産の確認 大腸菌 JM101 (pEXE 11-2)を、ＴＹ-amp 培地〔バクト
トリプトン１％(W/V),酵母エキス0.５％(W/V), NaCl 0.
５％(W/V) 及びアンピシリン (50μg/ml) 〕10mlにて温
度37℃で３時間振盪培養を行った後、この培養液１mlを
Ｍ9-amp 培地〔0.6％(W/V) リン酸水素二ナトリウム,
0.3％(W/V) リン酸二水素カリウム, 0.１％(W/V) 塩化
アンモニウム, 0.05％(W/V) NaCl, 0.２％(W/V) グルコ
ース, 0.５％(W/V) カザミノ酸及びアンピシリン (50μ
g/ml) 〕に接種し、温度37℃にて３時間培養した。更に
この培養液に３インドールアクリル酸を終濃度１μg/ml
になるように添加し、更に２時間培養を行った。この培
養液を集菌した後、0.５mlの100mM トリス−塩酸緩衝液
(pH８.0) に懸濁したものを氷上で冷却下、超音波破砕
器(Ultrasonicgenerator)(Nissei・社・製) を用いて２
分間処理した。これをエッペンドルフチューブに入れ、
微量遠心機を用いて12,000r.p.m.10分間遠心し、上清画
分と沈澱画分とに分離した。上清を別のエッペンドルフ
チューブに移し変え、沈澱を0.5mlの100mMトリス−塩酸
緩衝液 (pH８.0) に懸濁した。それぞれの画分を各々10
μl ずつをサンプルとし、エスディーエスペイジを行っ
た。エスディーエスペイジは、第一化学薬品社製のプレ
ートを用いて、付属の用紙記載の方法に従った。続い
て、ゲルよりニトロセルロース膜 (Schleicher & Schue
ll・社・製) にブロッティングした。このウエスタンブ
ロッティングはトランスブロットＳＤセル (ＢＩＯ-Ｒ
ＡＤ・社・製) を用い、指示している方法を用いて行っ
た。

【００４４】次に、ＥＬＩＳＡについて説明する。この
ニトロセルロース膜を乾かさない状態で、30mlのブロッ
キング緩衝液〔３％(W/V) ゼラチン, 20mM トリス−塩
酸 (pH7.5), 500mM 塩化ナトリウム〕に浸し、室温で１
時間振盪した。次にこの膜を水で濯いだ後、15mlの１次
抗体溶液〔 Antiserum to ratGrowth Hormone (ｕｃｂ
・社・製) 50μl , １％(W/V) ゼラチン20mM トリス−
塩酸 (pH７.5), 500mM塩化ナトリウム〕に浸し、一晩室
温にて振盪させた。次にこの膜を水で濯いだ後、30mlの
ＴＴＢＳ緩衝液〔0.05％(V/V) Tween-20, 20mM トリス
−塩酸 (pH７.5), 500mM 塩化ナトリウム〕に浸し、室
温で10分間振盪させた。この後、ＴＴＢＳ緩衝液を新し
いものにかえ、更に室温で10分間振盪を行った。次にこ
の膜を30mlの２次抗体溶液〔affinity purified Goat a
nti Rabbit IgG(H+L) AlkalineＰｈｏｓｐａｈａｔａｓ
ｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｈｕｍｍａｎ ＩｇＧ Ａｄ
ｓｏｒｂｅｄ （Ａｍｅｒｓｈａｍ ・社・製) 10μl
, １％(W/V) ゼラチン, 20mM トリス−塩酸 (pH７.5),
500mM 塩化ナトリウム〕に浸し、室温で１時間振盪さ
せ、水で濯いだ後、30mlのＴＴＢＳ緩衝液で２回、室温
で振盪させた。その後、膜を25mlのディテクション緩衝
液〔100mM トリス−塩酸 (pH８.8),100mM塩化ナトリウ
ム, 5mM 塩化マグネシウム〕に12.5μl の7.５％(W/V)
ニトロブルーテトラゾリウム, 70％ホルムアミド溶液と
35μl の５％(W/V) ５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリ
ルフォスフェイト, 無水ジメチルホルムアミド溶液を加
えたものに浸し、５分間室温にて振盪させた。その結
果、宿主では確認されない分子量約22,000の成長ホルモ
ンのバンドが pEXE 11-2を持つ JM101の上清画分及び沈
澱画分で確認された。上清画分に確認されているという
ことは、つまり可溶化した状態で生産されていると言う
ことである。以上より明らかな如く、本発明により得ら
れる菌体には、可溶化が確認されているため、本発明に
従い上記したエッシェリシア属に属する大腸菌を培養す
ることにより、菌体内にミンク成長ホルモンが生産され
ていることが判明した。

【００４５】このミンク成長ホルモンのアミノ酸配列
は、配列番号４に示す通りである。

【００４６】

【配列表】

１．配列番号１ （１）配列の長さ： 573 （２）配列の型： 核酸 （３）鎖の数： ２本鎖 （４）トポロジー： 直鎖状 （５）配列の種類： 他の核酸 合成ＤＮＡ及びｃＤＮ
Ａ （６）配列： ATGTTCCCAG CTATGCCTCT ATCTAGTCTA TTCGCTAACG CTGTTCTCCG GGCCCAGCAC 60 CTGCACCAGC TGGCTGCCGA CACCTACAAA GACTTTGAGC GGGCGTACAT CCCCGAGGGC 120 CAGAGGTACT CCATCCAGAA CGCGCAGGCT GCCTTCTGCT TCTCGGAGAC CATCCCGGCG 180 CCCACCGGCA AGGACGAGGC CCAGCAGAGA TCCGACATGG AGCTGCTCCG CTTCTCGCTG 240 CTGCTCATCC AGTCGTGGCT GGGGCCCGTG CAGTTCCTCA GCAGGGTCTT CACCAACAGC 300 CTGGTGTTCG GCACCTCGGA CCGAGTCTAC GAGAAGCTGA AGGACCTGGA GGAAGGCATC 360 CAAGCGCTGA TGCGGGAGCT GGAAGACGGC AGCCCCCGGG CCGGGCCGAT CCTGAAGCAA 420 ACCTACGACA AGTTTGACAC AAACCTGCGC AGCGACGACG CGCTGCTCAA GAACTATGGG 480 CTGCTCTCCT GCTTCAAGAA GGACCTGCAC AAGGCCGAGA CGTATCTGCG GGTCATGAAG 540 TGTCGCCGCT TCGTGGAAAG CAGCTGTGCC TTC ２．配列番号２ （１）配列の長さ： 570 （２）配列の型： 核酸 （３）鎖の数： ２本鎖 （４）トポロジー： 直鎖状 （５）配列の種類： ｃＤＮＡ （６）起源： 生物名： ダーク種ミンク （７）配列： TTCCCGGCCA TGCCCTTGTC CAGCCTGTTT GCCAACGCCG TGCTCCGGGC CCAGCACCTG 60 CACCAGCTGG CTGCCGACAC CTACAAAGAC TTTGAGCGGG CGTACATCCC CGAGGGCCAG 120 AGGTACTCCA TCCAGAACGC GCAGGCTGCC TTCTGCTTCT CGGAGACCAT CCCGGCGCCC 180 ACCGGCAAGG ACGAGGCCCA GCAGAGATCC GACATGGAGC TGCTCCGCTT CTCGCTGCTG 240 CTCATCCAGT CGTGGCTGGG GCCCGTGCAG TTCCTCAGCA GGGTCTTCAC CAACAGCCTG 300 GTGTTCGGCA CCTCGGACCG AGTCTACGAG AAGCTGAAGG ACCTGGAGGA AGGCATCCAA 360 GCGCTGATGC GGGAGCTGGA AGACGGCAGC CCCCGGGCCG GGCCGATCCT GAAGCAAACC 420 TACGACAAGT TTGACACAAA CCTGCGCAGC GACGACGCGC TGCTCAAGAA CTATGGGCTG 480 CTCTCCTGCT TCAAGAAGGA CCTGCACAAG GCCGAGACGT ATCTGCGGGT CATGAAGTGT 540 CGCCGCTTCG TGGAAAGCAG CTGTGCCTTC ３．配列番号３ （１）配列の長さ： 190 （２）配列の型： アミノ酸 （３）鎖の数： ── （４）トポロジー： 直鎖状 （５）配列の種類： 蛋白質 （６）起源； 生物名： ダーク種ミンク （７）配列： Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu Phe Ala Asn Ala Val Leu 15 Arg Ala Gln His Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Thr Tyr Lys Asp 30 Phe Glu Arg Ala Tyr Ile Pro Glu Gly Gln Arg Tyr Ser Ile Gln 45 Asn Ala Gln Ala Ala Phe Cys Phe Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Met Glu Leu Leu 75 Arg Phe Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Gly Pro Val Gln 90 Phe Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Gly Thr Ser 105 Asp Arg Val Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln 120 Ala Leu Met Arg Glu Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Ala Gly Pro 135 Ile Leu Lys Gln Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Thr Asn Leu Arg Ser 150 Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 165 Lys Asp Leu His Lys Ala Glu Thr Tyr Leu Arg Val Met Lys Cys 180 Arg Arg Phe Val Glu Ser Ser Cys Ala Phe ４．配列番号４ （１）配列の長さ： 191 （２）配列の型： アミノ酸 （３）鎖の数： ── （４）トポロジー： 直鎖状 （５）配列の種類： 蛋白質 （６）配列： Met Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu Phe Ala Asn Ala Val 15 Leu Arg Ala Gln His Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Thr Tyr Lys 30 Asp Phe Glu Arg Ala Tyr Ile Pro Glu Gly Gln Arg Tyr Ser Ile 45 Gln Asn Ala Gln Ala Ala Phe Cys Phe Ser Glu Thr Ile Pro Ala 60 Pro Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Met Glu Leu 75 Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Gly Pro Val 90 Gln Phe Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Gly Thr 105 Ser Asp Arg Val Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile 120 Gln Ala Leu Met Arg Glu Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Ala Gly 135 Pro Ile Leu Lys Gln Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Thr Asn Leu Arg 150 Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe 165 Lys Lys Asp Leu His Lys Ala Glu Thr Tyr Leu Arg Val Met Lys 180 Cys Arg Arg Phe Val Glu Ser Ser Cys Ala Phe

【図面の簡単な説明】

【図１】組み換え体プラスミドpMGH100 ＤＮＡの制限酵
素開裂地図。

【図２】組み換え体体プラスミドpEXE 11-2 ＤＮＡの制
限酵素開裂地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の塩基配列で表わされるミン
   ク成長ホルモン遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載のミンク成長ホルモン遺伝
   子をベクターＤＮＡに挿入した新規な組み換え体ＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 請求項２記載の組み換え体ＤＮＡを含
   み、ミンク成長ホルモン生産能を有するエッシェリシア
   属に属する微生物を、培地に培養し、培養物よりミンク
   成長ホルモンを採取することを特徴とするミンク成長ホ
   ルモンの製造法。